Immunogenität dezellularisierter Rattennieren als Biomatrices im

Tissue Engineering

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der

Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen

Grades eines Doktors der Medizin genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Prof. Dr. Ernst J. Rummeny

Prüfer der Dissertation:

1. apl. Prof. Dr. Martijn van Griensven

2. Prof. Dr. Dr. h.c. Uwe Heemann

Die Dissertation wurde am 20.02.2019 bei der Fakultät für Medizin der

Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am

14.08.2019 angenommen.

Kira Katharina Florian

Experimentelle Unfallchirurgie

(apl. Prof. Dr. Martijn van Griensven)

&

Klinik und Poliklinik für Unfallchirurgie

(Prof. Dr. Peter Biberthaler)

I

I Inhaltsverzeichnis

I Inhaltsverzeichnis ...................................................................................................... I

II Abbildungsverzeichnis ............................................................................................ III

III Tabellenverzeichnis ............................................................................................... IV

IV Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... V

1 Einleitung .............................................................................................................. 1

1.1 Regenerative Medizin und Tissue Engineering ............................................ 1

1.2 Tissue Engineering im Bereich der Orthopädie und Unfallchirurgie ............. 2

1.3 Scaffolds im Tissue Engineering .................................................................. 3

1.3.1 Eigenschaften eines idealen Scaffolds im Tissue Engineering

von Knochengewebe ............................................................................. 4

1.3.2 Biologische Scaffolds ............................................................................. 5

1.4 Sauerstoff- und Nährstoffversorgung des Gewebes im Tissue

Engineering ................................................................................................ 12

1.4.1 Lösungsansätze zur Verbesserung der Sauerstoff-

und Nährstoffversorgung im Tissue Engineering ................................. 12

1.4.2 Benutzen ganzer Organe mit vorhandenem Gefäßsystem .................. 14

1.5 Immunreaktion im Tissue Engineering ....................................................... 15

1.5.1 Immunreaktion bei xenogener Organtransplantation ........................... 16

1.5.2 Anwendung xenogener EZM-Scaffolds im Tissue Engineering ........... 16

1.5.3 Immunreaktion auf xenogene EZM-Scaffolds im Tissue Engineering .. 17

2 Hintergrund und Zielsetzung der Arbeit .............................................................. 19

3 Material und Methoden ....................................................................................... 20

3.1 Material ...................................................................................................... 20

3.1.1 Geräte .................................................................................................. 20

3.1.2 Verbrauchsmaterialien ......................................................................... 21

3.1.3 Chemikalien ......................................................................................... 22

3.1.4 Zellkulturmedien, Puffer und Zusätze .................................................. 23

3.1.5 Zusammensetzung der Zellkulturmedien und Puffer ............................ 24

3.1.6 Perfusionslösungen zur Dezellularisierung .......................................... 26

3.1.7 Färbelösungen ..................................................................................... 26

II

3.1.8 ELISA-Sets .......................................................................................... 27

3.1.9 Software ............................................................................................... 28

3.2 Methoden ................................................................................................... 29

3.2.1 Isolation von humanen mononukleären Zellen des peripheren

Blutes (PBMCs) ................................................................................... 29

3.2.2 Isolation von primären humanen Osteoblasten .................................... 29

3.2.3 Isolation von Rattenosteoblasten ......................................................... 30

3.2.4 Zellkultur .............................................................................................. 30

3.2.5 Gewinnung der Rattennieren ............................................................... 32

3.2.6 Dezellularisierung ................................................................................ 33

3.2.7 Untersuchung der Immunantwort auf die Bioscaffolds ......................... 34

3.2.8 Evaluierung der Viabilität und Funktionalität der Osteoblasten ............ 35

3.2.9 Statistik ................................................................................................ 39

4 Ergebnisse .......................................................................................................... 40

4.1 Feststellung der Dezellularisierung anhand der

makroskopischen Erscheinung .................................................................. 40

4.2 Immunogenität der Bioscaffolds ................................................................. 40

4.2.1 TNF-a .................................................................................................. 40

4.2.2 Interleukin-10 ....................................................................................... 42

4.3 Einfluss der Bioscaffolds auf die Proliferation und Funktion

differenzierter Zellen eines anderen Gewebetyps ...................................... 44

4.3.1 Messung der Zellzahl und -viabilität mittels Alamar Blue Assay .......... 44

4.3.2 Evaluierung der Zellviabilität mittels Hoechst- und

Calcein AM-Fluoreszenzfärbung .......................................................... 47

4.3.3 Funktionsnachweis der Rattenosteoblasten ........................................ 48

4.4 Einfluss der Bioscaffolds auf die Proliferation und Funktion

differenzierter Zellen einer anderen Spezies .............................................. 51

4.4.1 Messung der Zellzahl und –viabilität mittels Alamar Blue Assay.......... 52

4.4.2 Evaluierung der Zellviabilität mittels Hoechst- und

Calcein AM-Fluoreszenzfärbung .......................................................... 54

4.4.4 Funktionsnachweis der humanen Osteoblasten .................................. 55

5 Diskussion .......................................................................................................... 59

III

5.1 Dezellularisierung ganzer Organe .............................................................. 59

5.2 Immunogenität der Bioscaffolds aus dezellularisierten Rattennieren ......... 62

5.3 Einfluss der Bioscaffolds auf die Proliferation und Funktion

differenzierter Zellen eines anderen Gewebetyps und einer anderen

Spezies ...................................................................................................... 66

5.4 Konklusion.................................................................................................. 70

5.5 Limitationen und Ausblick........................................................................... 71

6 Zusammenfassung ............................................................................................. 72

7 Literatur .............................................................................................................. 74

8 Abstract .............................................................................................................. 85

9 Selbstständigkeitserklärung ................................................................................ 86

10 Danksagung ....................................................................................................... 87

II Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Modell des Diamond-Konzeptes für die Regeneration von Knochengewebe

..................................................................................................................... 3

Abb. 2: Schematisches Diagramm der Dezellularisierung ganzer Organe und ihrer

klinischen Anwendungen............................................................................ 15

Abb. 3: Dezellularisierung einer Rattenniere. ......................................................... 40

Abb. 4: Relative TNF-a Konzentration normiert auf hPBMCs + LPS ...................... 41

Abb. 5: Relative TNF-a Konzentration dezellularisierte Rattennieren normiert auf

hPBMCs + LPS .......................................................................................... 42

Abb. 6: Relative IL-10 Konzentration normiert auf hPBMCs + LPS ........................ 43

Abb. 7: Relative IL-10 Konzentration dezellularisierte Rattennieren normiert auf

hPBMCs + LPS .......................................................................................... 44

Abb. 8: Alamar Blue Assay Rattenosteoblasten ..................................................... 45

Abb. 9: Alamar Blue Assay Rattenosteoblasten und dezellularisierte Rattennieren

0,66% SDS ................................................................................................. 46

Abb. 10: Alamar Blue Assay Rattenosteoblasten und dezellularisierte Rattennieren

3% SDS...................................................................................................... 46

Abb. 11: Alamar Blue Assay Rattenosteoblasten und dez. Rattennieren Tag 14 ..... 47

Abb. 12: Calcein AM- und Hoechst-Färbung Rattenosteoblasten und dezellularisierte

Rattenniere ................................................................................................. 48

IV

Abb. 13: Alkalische Phosphatase-Aktivität (AP-Aktivität) Rattenosteoblasten und

dezellularisierte Rattennieren ..................................................................... 49

Abb. 14: Alkalische Phosphatase-Aktivität (AP-Aktivität) Rattenosteoblasten und

dezellularisierte Rattennieren Tag 14 ......................................................... 50

Abb. 15: Alkalische Phosphatase-Färbung (AP-Färbung) Rattenosteoblasten und

dezellularisierte Rattenniere ....................................................................... 51

Abb. 16: Alamar Blue Assay humane Osteoblasten ................................................. 52

Abb. 17: Alamar Blue Assay humane Osteoblasten und dezellularisierte

Rattennieren 3% SDS ................................................................................ 53

Abb. 18: Alamar Blue Assay humane Osteoblasten und dezellularisierte

Rattennieren 0,66% SDS ........................................................................... 53

Abb. 19: Alamar Blue Assay humane Osteoblasten und Rattennieren Tag 14 ........ 54

Abb. 20: Calcein AM- und Hoechst-Färbung humane Osteoblasten und

dezellularisierte Rattenniere ....................................................................... 55

Abb. 21: Alkalische Phosphatase-Aktivität (AP-Aktivität) humane Osteoblasten und

dezellularisierte Rattennieren ..................................................................... 56

Abb. 22: Alkalische Phosphatase-Aktivität (AP-Aktivität) humane Osteoblasten und

dezellularisierte Rattennieren Tag 14 ......................................................... 57

Abb. 23: Alkalische Phosphatase-Färbung (AP-Färbung) humane Osteoblasten und

dezellularisierte Rattenniere ....................................................................... 58

III Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Geräte ........................................................................................................ 21

Tab. 2: Verbrauchsmaterialien ............................................................................... 22

Tab. 3: Chemikalien ............................................................................................... 23

Tab. 4: Zellkulturmedien, Puffer und Zusätze. ........................................................ 24

Tab. 5: Zusammensetzung der Zellkulturmedien und Puffer .................................. 25

Tab. 6: Perfusionslösungen zur Dezellularisierung ................................................ 26

Tab. 7: Färbelösungen ........................................................................................... 27

Tab. 8: ELISA Sets und Lösungen ......................................................................... 28

Tab. 9: Software ..................................................................................................... 28

Tab. 10: Dezellularisierungsprotokoll ....................................................................... 34

V

IV Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Beschreibung

a-MEM Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification

Abb. Abbildung

AP Alkalische Phosphatase

BSA Bovines Serumalbumin

BMP bone morphogenic protein (knochenmorphogenetisches Protein)

CaCl2 Calciumchlorid

CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA (DNS) Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

ddH2O Doppelt destilliertes Wasser

(D)PBS (Dulbecco’s) Phosphate buffered saline (Phosphatgepufferte

Salzlösung)

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

EZM Extrazellulärmatrix

FBS (FKS) Fetal bovine serum (Fetales Kälberserum)

FGF Fibroblast Growth Factor (Fibroblasten Wachstumsfaktor)

GAGs Glykosaminoglykane

HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung

IL-10 Interleukin-10

KI Konfidenzintervall

LSM Lymphozyten-Separationsmedium

LPS Lipopolysaccharid

MgCl2 Magnesiumchlorid

mmHg Millimeter Quecksilbersäule

NaOH Natriumhydroxid

NTIRE Non-thermal irreversible electroporation

Pen/Strep Penicillin/Streptomycin

(h)PBMC

(human) Peripheral blood mononuclear cell ((humane) Mononukleäre

Zelle des peripheren Blutes)

PAA Peracetic acid (Peressigsäure)

RT Raumtemperatur

VI

SDS Sodium dodecyl Sulfate (Natriumdodecylsulfat)

SEM standard error of the mean (Standardfehler)

SIS-ECM small intestinal submucosa extracellular matrix (EZM-Scaffold aus

Schweinedünndarmmukosa)

Tab. Tabelle

TEP Totalendoprothese

TGF-β Transforming Growth Factor (Transformierender Wachstumsfaktor)

TNF-α Tumornekrosefaktor alpha

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

UV ultraviolett

WHO World Health Organization (Weltgesundheitsorganisation)

1

1 Einleitung

1.1 Regenerative Medizin und Tissue Engineering

Erkrankungen, Verletzungen und Traumata können Gewebe des menschlichen

Körpers schädigen und zu einer Degeneration führen. Je nach Ausmaß der

entstandenen Defekte ist eine Reparatur, ein Ersatz oder die Regeneration des

Gewebes erforderlich. Üblicherweise werden zur Defektüberbrückung

und -rekonstruktion Gewebe autolog oder allogen transplantiert. Vor allem bei der

Gewinnung von Autografts ist man jedoch aufgrund anatomischer Limitationen und

einer nicht unerheblichen Morbidität im Spenderbereich durch Infektionen, Hämatome

und persistierende Schmerzen eingeschränkt. Allografts sind durch die begrenzte

Verfügbarkeit, die Gefahr einer Infektionsübertragung, sowie aufgrund einer

Transplantatabstoßung durch den Empfänger ebenfalls nur bedingt verwendbar

(Langer 2000, Atala 2004).

Auch aufgrund der altersdemographischen Entwicklung, sowie der größer

werdenden Erwartungen der Patienten und der sich folglich immer komplexer

darstellenden klinischen Situationen sind neue verlässliche Regenerationsstrategien

notwendig (Black, Goriainov et al. 2015). Einen Lösungsansatz bietet das Tissue

Engineering, dessen Zielsetzung die Regeneration des geschädigten Gewebes durch

Entwicklung und Transplantation biologischer Ersatzgewebe ist.

Obwohl das Gebiet des Tissue Engineerings ein relativ neues Gebiet der

Forschung darstellt, ist die Idee fehlendes oder krankes Gewebe zu ersetzen schon

im 16. Jahrhundert dokumentiert worden. Gasparo Tagliocozzi (1546-99), Professor

der Chirurgie und Anatomie der Universität Bologna, beschrieb in seiner 1597

publizierten Arbeit ´De Custorum Chirurgia per Insitionem´ bereits eine

Nasenrekonstruktion mittels Unterarmlappen (O'Brien 2011).

Heute ist das Fachgebiet der regenerativen Medizin und des Tissue

Engineerings multidisziplinär und macht die Zusammenarbeit von Experten aus der

klinischen Medizin und unterschiedlichsten Disziplinen des Ingenieurwesens und der

Naturwissenschaften notwendig (O'Brien 2011).

2

1.2 Tissue Engineering im Bereich der Orthopädie und Unfallchirurgie

Speziell auf dem Gebiet der Orthopädie und Unfallchirurgie sind die Zielgewebe der

regenerativen Medizin Knochen und Knorpel, aber auch Bänder, Sehnen, Menisci,

Bandscheiben, Muskeln, Nerven und Fettgewebe (Muschler, Nakamoto et al. 2004).

Der Schwerpunkt der folgenden Arbeit liegt auf dem Bereich der Knochenregeneration.

Knochengewebe als dynamisches und gut vaskularisiertes Gewebe unterliegt ein

Leben lang einem Umbauprozess, sodass Läsionen wie Frakturen gerade bei

jüngeren Patienten ohne größere Interventionen heilen können. Trotzdem treten

beispielsweise aufgrund von ausgedehnten Tumorresektionen, Infekten oder

Pseudarthrosen große Defekte auf, die eine chirurgische Intervention erforderlich

machen.

Die Knochendefekte können als kritisch angesehen werden, wenn ihre Länge,

abhängig von dem betroffenen Skelettabschnitt, eine bestimmte Größe überschreitet:

3 cm für den Unterarm, 5 cm für Femur und Tibia und 6 cm für den Humerus (Calori,

Mazza et al. 2011). Neben bekannten Techniken wie Kallusdistraktion, Autografts,

Arthrodesen oder Endoprothesen kann hier die Anwendung von biotechnologischen

Therapien nützlich sein.

Als Voraussetzung für die Regeneration von Knochengewebe sind primär drei

Grundelemente notwendig: i) ein strukturelles Gerüst (Scaffold/Matrix), ii) Zellen und

iii) chemische (z.B. durch Wachstumsfaktoren) oder alternativ mechanische

Stimulation. Die Kombination dieser drei Elemente wird als das trianguläre Konzept

des Tissue Engineerings bezeichnet (Martin, Wendt et al. 2004, Soucacos, Johnson

et al. 2008, O'Brien 2011). Dieses trianguläre Konzept ist im Rahmen des Diamond-

Konzeptes durch den Faktor der mechanischen Umgebung erweitert worden

(Giannoudis, Einhorn et al. 2007).

3

Abb. 1: Modell des Diamond-Konzeptes für die Regeneration von Knochengewebe modifiziert nach (Giannoudis, Einhorn et al. 2007)

1.3 Scaffolds im Tissue Engineering

Als obligater Bestandteil des Tissue Engineerings spielen dreidimensionale Scaffolds

eine entscheidende Rolle. Ihre Aufgabe ist es, eine gewebespezifische Umgebung zu

schaffen (Kneser, Schaefer et al. 2002), die eine Adhäsion, Proliferation und

Differenzierung von Stamm- und Progenitorzellen ermöglicht und fördert (Langer and

Vacanti 1993, Laurencin, Ambrosio et al. 1999, Hutmacher 2000). Idealerweise dienen

die Scaffolds zudem der Vaskularisierung des Neugewebes (Deporter, Komori et al.

1988, Murata, Huang et al. 1999).

Als Materialien für Scaffolds zur Züchtung von Knochengewebe werden

biologische Polymere (z.B. Kollagen, Hyaluron, Fibrin), synthetische Polymere

(wasserunlösliche Polymere, verschiedene Kopolymere, synthetische gel-ähnliche

Polymere), Matrices auf Mineralbasis (z.B. Trikalziumphosphat, Hydroxyapatit,

Kalziumsulfat), Metalle (z.B. Titan, Tantal), Allografts oder Kombinationen aus

mehreren Materialien verwendet (Griffith and Grodzinsky 2001).

Unabhängig von dem Design und den verwendeten Materialien finden

azelluläre Scaffolds oder Matrices, die zuvor mit Zellen des Patienten besät wurden,

Verwendung (Lichte, Pape et al. 2011).

Strukturelles Gerüst (Matrix) Osteogene Zellen

Wachstumsfaktoren Mechanische Umgebung

Diamond-Konzept

4

1.3.1 Eigenschaften eines idealen Scaffolds im Tissue Engineering von Knochengewebe

Um die oben genannten Aufgaben erfüllen zu können, sollte ein ideales Scaffold für

das Tissue Engineering von (Knochen-) Gewebe neben der dreidimensionalen

Struktur folgende Eigenschaften besitzen:

- Als vorrangiges Kriterium muss das Scaffold biokompatibel sein. Sowohl die

Zelladhäsion (Osteokonduktion) als auch die Zellaktivität (Osteoinduktion) und

die Integration in das umgebende Knochengewebe (Osseointegration) sollten

angeregt werden (Stevens 2008, Lichte, Pape et al. 2011, O'Brien 2011). Die

Implantation des Scaffolds darf keine erhebliche Immunreaktion zur Folge

haben, da diese eine Kompromittierung der Heilung bis hin zur Abstoßung des

Transplantates zur Folge haben kann (O'Brien 2011).

- Scaffolds im Tissue Engineering sind nicht als permanente Implantate

vorgesehen und sollen den körpereigenen Zellen im Verlauf ermöglichen, ihre

eigene Extrazellulärmatrix zu produzieren und das implantierte Konstrukt zu

ersetzen. Hierzu müssen Scaffolds biologisch abbaubar sein (Babensee,

Anderson et al. 1998). Die Resorptionskinetik des Scaffolds sollte der

Knochenreparaturrate ähnlich sein, um einen optimalen Transfer der Last auf

den neu gebildeten Knochen zu gewährleisten und ein „stress-shielding" zu

verhindern. Sowohl die Abbau- als auch die Nebenprodukte dürfen nicht

zelltoxisch sein und sollten schnell aus dem Körper ausgeschieden werden

(Lichte, Pape et al. 2011).

- Wichtig sind zudem mechanische Eigenschaften, die vergleichbar mit nativem

Knochengewebe sind. Die mechanische Integrität sollte von der Implantation

bis zum Abschluss des Remodeling-Prozesses gegeben sein (Hutmacher

2000). Problematisch kann hierbei die Balance zwischen ausreichender

mechanischer Stabilität und der für die Vaskularisierung erforderlichen porösen

Struktur sein. Die Architektur des Scaffolds muss grundsätzlich eine vernetzte

Porenstruktur enthalten, die das Eindringen von Zellen, die adäquate Diffusion

von Nährstoffen und Sauerstoff und den Abtransport der Abbauprodukte erlaubt

(O'Brien 2011).

- Des Weiteren muss das Scaffold eine Sterilisation nach dem erforderlichen

internationalen Standard tolerieren.

5

- Optimaler Weise sollte das Scaffold je nach Größe und Form des

Knochendefekts patientenindividualisiert hergestellt werden können und in

ausreichender Menge kostengünstig verfügbar sein (Griffith and Grodzinsky

2001).

1.3.2 Biologische Scaffolds

Für dreidimensionale Scaffolds für die Knochenregeneration stehen vorrangig drei

verschiedene Materialgruppen zur Verfügung: Keramik, synthetische Polymere und

biologische Polymere (O'Brien 2011). Im Hinblick auf die in den Experimenten dieser

Dissertation verwendeten Materialien beschränken sich die folgenden Ausführungen

auf die biologischen Scaffolds.

Biologische Materialien wie Kollagen, verschiedene Proteoglykane,

Trägermaterialien auf Alginatbasis und Chitosan wurden bereits in der Produktion von

Scaffolds eingesetzt. Sie sind biologisch aktiv und gewährleisten eine sehr gute

Zelladhäsion und ein exzellentes Zellwachstum. Als biologisch abbaubare Materialien

ermöglichen sie den Wirtszellen die Produktion einer eigenen Extrazellulärmatrix

(O'Brien 2011). Sie sind jedoch aufgrund ihrer schwachen mechanischen

Eigenschaften zur Regeneration lasttragender Gewebe weniger geeignet. Eine

Herausforderung stellt zudem die Herstellung von homogenen und reproduzierbaren

Scaffolds aus biologischem Material dar (Stevens 2008, O'Brien 2011).

1.3.2.1 Die Extrazellulärmatrix als Bioscaffold

Biologische Scaffolds aus der natürlich vorkommenden Extrazellulärmatrix (EZM)

haben aufgrund ihrer bioinduktiven Eigenschaften in letzter Zeit zunehmend an

Beachtung gewonnen (Badylak 2007). Die EZM wird durch die für ein bestimmtes

Gewebe charakteristischen Zellen gebildet. Die Zusammensetzung und Mikrostruktur

unterscheidet sich deshalb in Abhängigkeit der beherbergten Zellart, um die idealen

chemischen und mechanischen Anforderungen des jeweiligen Gewebetyps zu

erfüllen. Die EZM steht in einem dynamischen Gleichgewicht mit ihrer Mikroumgebung

(Bissell and Aggeler 1987). Einflussfaktoren auf die EZM sind neben den ansässigen

Zellen die mechanische Belastung, das biochemische Milieu, die

Sauerstoffversorgung, der pH-Wert und die inhärenten Genexpressionsmuster.

6

Umgekehrt beeinflusst die EZM ebenfalls die ansässigen Zellen und fungiert als

Informationsstraße oder Medium zwischen den Zellen (Bissell, Hall et al. 1982, Ingber

1991, Boudreau, Myers et al. 1995).

Das Ziel bei der Herstellung eines EZM-Scaffolds ist es, die Bestandteile und

dreidimensionale Struktur, und damit die Funktionalität der natürlichen Matrix,

weitgehend zu bewahren. Bereits in der klinischen Anwendung befinden sich EZM-

Scaffolds aus Teilen der Dermis, des Perikards oder der Dünndarmmukosa (Badylak

2007).

1.3.2.2 Zusammensetzung der Extrazellulärmatrix

Die wichtigsten Bestandteile der Extrazellulärmatrix konnten bereits beschrieben

werden, wobei die komplexe dreidimensionale Organisation der strukturellen und

funktionellen Moleküle derzeit noch nicht vollständig charakterisiert ist (Badylak 2007).

Das am häufigsten vorkommende Protein in der Extrazellulärmatrix ist Kollagen.

Es macht über 90% des Trockengewichts der EZM der meisten Organe oder Gewebe

aus (van der Rest and Garrone 1991). Unter den Kollagenen ist der Typ I als

wesentliches Strukturprotein ubiquitär vorhanden und bietet die notwendige

mechanische Festigkeit, um uni- und multiaxialen Belastungen standzuhalten (Badylak

2004). Andere Kollagene enthält die EZM in wesentlich geringerer Menge und

unterschiedlicher Zusammensetzung in Abhängigkeit der gewebespezifischen

mechanischen und physikalischen Eigenschaften. Beispielsweise findet sich Kollagen

Typ III vor allem im Bereich der Submukosa der Harnblase, die eine gewisse Flexibilität

benötigt. Kollagen vom Typ VI ist ein sehr kleines Molekül und funktioniert als

verbindendes Molekül zwischen Glykosaminoglykanen und beispielsweise Kollagen I.

Des Weiteren verleiht Kollagen Typ VI der EZM eine gelartige Konsistenz. Typ IV

Kollagen ist vor allem in der Basalmembran der meisten vaskulären Strukturen und

Geweben vorhanden, die eine epitheliale Zellkomponente enthalten (Badylak 2004). Als zweithäufigstes Protein der Extrazellulärmatrix ist Fibronektin nachzuweisen. Das

dimere Molekül besitzt Liganden für viele Zelltypen und ist daher ein wichtiger

Bestandteil der Zell-Matrix-Kommunikation (Schwarzbauer 1991, Miyamoto, Katz et al.

1998, Schwarzbauer 1999).

Ein weiterer wichtiger Bestandteil der EZM ist das trimere Adhäsionsprotein

Laminin, das überwiegend im Bereich der Basalmembran vorhanden ist

7

(Schwarzbauer 1999). Vor allem bei der Bildung und dem Erhalt von vaskulären

Strukturen spielt Laminin eine entscheidende Rolle und sollte im Hinblick auf die

Verwendung der EZM als Scaffold insofern besonders berücksichtigt werden (Ponce,

Nomizu et al. 1999, Werb, Vu et al. 1999).

Außerdem sind in der EZM zahlreiche Glykosaminoglykane (GAGs) vorhanden,

die je nach Gewebelokalisation, Alter und Mikroumgebung variieren. Sie binden

Wachstumsfaktoren und Zytokine, fördern die Wasserretention und tragen zu den

gelartigen Eigenschaften der EZM bei. In der EZM vorhandene GAGs umfassen

Chondroitinsulfat A und B, Heparin, Heparansulfat und Hyaluronsäure (Entwistle,

Zhang et al. 1995, Hodde, Badylak et al. 1996).

Zudem können in der EZM in Abhängigkeit der Prozessierungmodalität in

geringer Konzentration bioaktive Moleküle wie Wachstumsfaktoren enthalten bleiben.

Dies unterscheidet die intakte Extrazellulärmatrix von anderen Scaffolds. In der

Extrazellulärmatrix konnten unter anderem der vascular endothelial growth factor

(VEGF), der epithelial growth factor (EGF), der transforming growth factor beta (TGF-

beta), der platelet derived growth factor (PDGF) und das bone morphogenic protein

(BMP) nachgewiesen werden (Roberts, Gallagher et al. 1988, Kagami, Kondo et al.

1998, Bonewald 1999).

1.3.2.3 Herstellung eines EZM-Scaffolds durch Dezellularisierung

Die Herstellung eines EZM-Scaffolds kann durch die Dezellularisierung

verschiedenster Gewebe erfolgen. Ziel der Dezellularisierung ist der Erhalt einer

zellfreien, jedoch strukturell und funktionell weitgehend erhaltenen Extrazellulärmatrix.

Die Art der Dezellularisierung, sowie die des Gewebes haben einen entscheidenden

Einfluss auf die biochemische Zusammensetzung, die Ultrastruktur und konsekutiv auf

die mechanischen Eigenschaften der erhaltenen Extrazellulärmatrix (Gilbert, Sellaro

et al. 2006). Zur Dezellularisierung können physikalische, chemische und enzymatische

Verfahren genutzt werden. Oft ist auch eine Kombination dieser Methoden sinnvoll

oder notwendig, um Zellen effektiv zu entfernen.

8

1.3.2.3.1 Physikalische Methoden

Zur Dezellularisierung können die Ausgangsgewebe verschiedenen physikalischen

Faktoren (wie beispielsweise Druck, Kälte, etc.) ausgesetzt werden. Hierdurch werden

die Zellmembranen lysiert. Die freigesetzten Zellbestandteile müssen jedoch im

Anschluss mit Hilfe chemischer und enzymatischer Methoden entfernt werden (Gilbert,

Sellaro et al. 2006).

Für die Dezellularisierung von Sehnen und Bändern (Jackson, Grood et al.

1987, Jackson, Grood et al. 1991), sowie Nervengewebe wird beispielsweise

wiederholtes Einfrieren und Auftauen angewendet (Gulati 1988). Die Zellmembranen

werden hierbei durch die intrazelluläre Bildung von Eiskristallen geschädigt. Um eine

zusätzliche Lyse der Extrazellulärmatrix zu verhindern, muss jedoch auf eine

kontrollierte Temperaturänderung geachtet werden (Gilbert, Sellaro et al. 2006).

Durch direkte Druckeinwirkung kann die Zelllyse nur in Geweben mit weniger

dichter Extrazellulärmatrix ausgelöst werden. So konnten beispielweise porcine

Korneas oder Blutgefäße durch hydrostatischen Druck vollständig dezellularisiert

werden. Bei dieser Methode ist ebenfalls zu beachten, dass es durch die Bildung von

Eiskristallen zu einer Schädigung der Ultrastruktur der EZM kommen kann (Sasaki,

Funamoto et al. 2009, Funamoto, Nam et al. 2010).

1.3.2.3.2 Chemische Methoden

Die chemische Dezellularisierung basiert vor allem auf der Verwendung saurer und

alkalischer Lösungen und Detergentien. Je nach verwendeter Lösung kann die

Struktur und Zusammensetzung der EZM unterschiedlich stark beeinflusst

beziehungsweise geschädigt werden.

Saure und alkalische Lösungen können die zytoplasmatischen Bestandteile der

Zellen auflösen und Nukleinsäuren wie RNA und DNA entfernen. Hierzu gehören unter

anderem Essigsäure (Probst, Dahiya et al. 1997), Peressigsäure (peracetic acid, PAA)

(Freytes, Badylak et al. 2004), Salzsäure, Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid (De Filippo, Yoo et al. 2002, Falke, Yoo et al. 2003).

Peressigsäure - als bewährtes Desinfektionsmittel und vor allem zur

Dezellularisierung von Schweinedünndarmmukosa vielgenutztes

Dezellularisierungsagens - weist einen vergleichsweise geringen Effekt auf die

9

Zusammensetzung und Mikrostruktur der EZM auf. Es konnte gezeigt werden, dass

verschiedene Glykosaminoglykane wie Hyaluronsäure, Heparin und Chondroitinsulfat

A (Hodde, Badylak et al. 1996), sowie die wichtigen Proteine Fibronektin und Laminin

(Hodde, Record et al. 2002, Brown, Lindberg et al. 2006) nach Dezellularisierung mit

PAA in der EZM erhalten bleiben. Ebenso konnten funktionstüchtige

Wachstumsfaktoren, wie TGF-b oder VEGF nachgewiesen werden (Voytik-Harbin,

Brightman et al. 1997, Hodde, Record et al. 2001).

Bei der Anwendung von Essigsäure zur Dezellularisierung muss beachtet

werden, dass hierdurch Kollagene aus der Extrazellulärmatrix herausgelöst werden

können und dies mit einer verminderten Festigkeit der Scaffolds einhergeht (Dong,

Wei et al. 2009).

Basen, wie beispielsweise Calciumhydroxid oder Natriumsulfid werden vor

allem zur Entfernung von Haaren der Dermis verwendet. Auch Basen sind aggressiv

genug, um Wachstumsfaktoren vollständig zu eliminieren und die mechanischen

Eigenschaften der Scaffolds durch Spaltung der Kollagenfibrillen und Destruktion der

Kollagen-Querverbindungen nachhaltig zu schwächen (Gorschewsky, Puetz et al.

2005, Prasertsung, Kanokpanont et al. 2008, Reing, Brown et al. 2010).

Nicht-ionische Detergentien greifen Lipid-Lipid- und Lipid-Protein-Verbindungen

an, wobei Protein-Protein-Verbindungen intakt bleiben sollen (Seddon, Curnow et al.

2004).

Trition X-100 wurde als nicht-ionisches Detergens bereits in vielen Studien zur

Dezellularisierung verwendet und zeigt insgesamt unterschiedliche Ergebnisse

hinsichtlich der Effektivität der Dezellularisierung und der unerwünschten

Nebeneffekte auf die Struktur der EZM. Beispielsweise konnte nach Anwendung an

porcinen Herzklappen schon nach 24 Stunden eine vollständige Entfernung der

Zellkerne nachgewiesen werden, während sich dagegen im Myokard und der

Aortenwand noch zelluläres Material befand. Zudem kam es zu einer fast vollständigen

Elimination der GAGs und zu einer Reduktion des Laminin- und Fibronektingehalts in

der Herzklappe (Grauss, Hazekamp et al. 2005).

Ionische Detergentien können sowohl nukleäre als auch zytoplasmatische

Zellmembranen solubilisieren, greifen jedoch auch Protein-Protein-Verbindungen an

(Seddon, Curnow et al. 2004). Am häufigsten werden SDS (Sodium dodecyl Sulfate /

Natriumdodecylsulfat), Natriumdeoxycholat oder Triton X-200 verwendet.

10

Vorteil der Dezellularisierung mit SDS gegenüber anderer Detergentien ist eine

effektivere Entfernung von Zellresten und zytoplasmatischen Proteinen, wie z.B.

Vimentin auch aus dichtem Gewebe (Woods and Gratzer 2005). Hierbei kann es

jedoch ebenfalls zu einer Reduktion der Konzentration von GAGs und

Wachstumsfaktoren kommen (Reing, Brown et al. 2010). Natriumdeoxycholat zeigt bei

ähnlicher Effektivität bei der Dezellularisierung eine größere Beeinträchtigung der

Gewebearchitektur als SDS (Gilbert, Sellaro et al. 2006).

Das zwitterionische Detergens CHAPS (3-[(3-

Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) wurde erfolgreich zur

Dezellularisierung dünner Gewebe, wie beispielswiese der Lunge genutzt (Petersen,

Calle et al. 2010). Es tendiert zu einer stärkeren Denaturierung von Proteinen als nicht-

ionische Detergentien. Nach Anwendung an arteriellem Gewebe zeigte sich eine

Verringerung des Berstdrucks, sowie der maximalen Belastbarkeit ohne Reduktion des

Kollagengehaltes und der –morphologie (Dahl, Koh et al. 2003).

Hyper- und hypotone Lösungen, wie deionisiertes Wasser oder Lösungen mit

niedriger Ionenstärke werden vor allem im Wechsel verwendet, um durch maximale

osmotische Effekte Zellen zu lysieren (Goissis, Suzigan et al. 2000, Gilbert, Sellaro et

al. 2006, Xu, Chan et al. 2007).

Bei der Anwendung chemischer Substanzen zur Dezellularisierung eines

Gewebes muss insbesondere darauf geachtet werden, dass die Chemikalien nach der

Dezellularisierung wieder vollständig aus dem Scaffold ausgewaschen werden und

somit eine Zelltoxizität des Scaffolds vermieden wird (Feil, Christ-Adler et al. 2006,

Cebotari, Tudorache et al. 2010).

1.3.2.3.3 Enzymatische Methoden

Im Rahmen der enzymatischen Dezellularisierung von Geweben werden vor allem

Proteasen, Kalziumkomplexbildner und Nukleasen eingesetzt (Bader, Schilling et al.

1998, Teebken, Bader et al. 2000, Gamba, Conconi et al. 2002, McFetridge, Daniel et

al. 2004).

Proteasen, wie das hochspezifische proteolytische Enzym Trypsin werden

häufig zur Dezellularisierung benutzt. Im Vergleich zu den Detergentien greift Trypsin

vermehrt das in der EZM enthaltene Elastin und Kollagen an. Gleichzeitig ist es

langsamer und ineffektiver in der Zellentfernung. Vorteil ist jedoch die Erhaltung eines

11

höheren Anteils an GAGs in der Extrazellulärmatrix (Kasimir, Rieder et al. 2003,

Rieder, Kasimir et al. 2004, Grauss, Hazekamp et al. 2005, Yang, Chen et al. 2009).

Die Beeinträchtigung der EZM korreliert hierbei mit den mechanischen Eigenschaften

der Matrix (Yang, Chen et al. 2009).

Nukleasen wie DNasen und RNasen werden häufig eingesetzt, um restliche

Nukleinsäuren aus der Matrix zu eliminieren. Sie können DNA in sehr kleine

Fragmente spalten und so nach der Zelllyse bei der Entfernung von verbliebenen

Nukleotiden hilfreich sein (Petersen, Calle et al. 2010, Yang, Zhang et al. 2010).

1.3.2.4 EZM-Bioscaffolds und Remodeling

Da Scaffolds im Tissue Engineering nicht als permanente Implantate vorgesehen sind,

müssen körpereigene Zellen im Verlauf das implantierte Konstrukt abbauen und

ersetzen. Der Umbau (Remodeling) des Gewebes wird durch die EZM-Scaffolds

aufgrund ihrer bioinduktiven und mechanischen Eigenschaften wesentlich unterstützt

(Badylak 2007).

Zum Remodeling gehören unter anderem das Einwandern von Wirtszellen in

das Scaffold, die Zelldifferenzierung, die Angiogenese, der Abbau des Scaffolds, sowie

die Ablagerung und Organisation neuer Extrazellulärmatrix. Vor allem die

Angiogenese und Zelldifferenzierung werden durch die während des Abbaus der EZM-

Scaffolds freigesetzten und aktivierten Wachstumsfaktoren, wie VEGF oder TGF-b,

unterstützt (Voytik-Harbin, Brightman et al. 1997, Hodde, Record et al. 2001, Hodde,

Record et al. 2002, McDevitt, Wildey et al. 2003).

In der Verwendung von EZM-Scaffolds aus Schweinedünndarmmukosa (small

intestinal submucosa extracellular matrix, SIS-ECM) als Gefäßtransplantat im

Hundemodell konnte beispielswiese schon vor über 20 Jahren ein extensives

Remodeling dieser Scaffolds nachgewiesen werden (Badylak, Lantz et al. 1989). Das

ursprünglich implantierte EZM-Material wurde vollständig resorbiert und durch

Wirtsgewebe ersetzt. In der neu gebildeten Gefäßwand konnten die Intimastruktur,

charakteristisch organisierte glatte Muskelbündel und eine vollständige Auskleidung

des Gefäßlumens mit Endothelzellen nachgewiesen werden (Badylak, Coffey et al. ,

Badylak, Lantz et al. 1989).

12

1.4 Sauerstoff- und Nährstoffversorgung des Gewebes im Tissue Engineering

Eines der führenden Probleme, das die klinische Anwendung des Tissue Engineerings

zur Regeneration von Gewebe in größerem Umfang verhindert, ist die fehlende

Vaskularisierung des gezüchteten Gewebes. Deshalb stellen Forschungen hierzu

derzeit eine der Hauptaufgaben im Bereich des Tissue Engineerings dar (Rouwkema

and Khademhosseini 2016).

Ohne vorhandenes suffizientes Gefäßsystem muss die Versorgung des

gezüchteten Gewebes zunächst durch Diffusion erfolgen. In stoffwechselaktivem

Gewebe wie Knochenmark oder trabekulärem Knochen beträgt die Diffusionsstrecke

zwischen Kapillargefäß und Zellmembran physiologischerweise nie mehr als 40 bis

200 µm (Chow, Wenning et al. 2001, Chow, Wenning et al. 2001). Die Strecke bis zur

Mitte eines Scaffolds in der klinischen Anwendung beträgt jedoch meist mindestens

5 mm. Dies entspricht fast dem fünfzigfachen der physiologischen Diffusionsstrecke.

Folglich kann nur ein Bruchteil der Zellen ausreichend mit Sauerstoff und Nährstoffen

versorgt werden. Es kommt je nach Konzentration und Verteilung der Zellen, des

Zelltyps und weiteren Variablen, wie der Sauerstoffausschöpfung der Zellen und der

Konzentration von Sauerstoff auf der Oberfläche des Scaffolds zu einer mehr oder

weniger ausgeprägten Nekrose im Zentrum des Scaffolds (Muschler, Nakamoto et al.

2004).

1.4.1 Lösungsansätze zur Verbesserung der Sauerstoff- und Nährstoffversorgung im Tissue Engineering

Zur Verbesserung der Sauerstoff- und Nährstoffversorgung wurden bereits viele

Lösungsansätze entwickelt (Rouwkema, Rivron et al. 2008). Beispielsweise kann

während der Kultivierung in vitro die Verteilung der Nährstoffe über einen

Perfusionsbioreaktor erfolgen (Salter, Goh et al. 2012). Nach Transplantation des

Gewebes in vivo ist die suffiziente Versorgung aller Zellen jedoch wiederum auf ein

Gefäßsystem angewiesen. Zwar kommt es innerhalb von Tagen bis Wochen nach der

Transplantation des Gewebes in vivo zu einem Einsprossen von Gefäßen, bis dahin

sind jedoch wiederum vor allem die Zellen in der Mitte des Transplantats mit Sauerstoff

und Nährstoffen unterversorgt (Butt, Carruth et al. 2007). Um die Zeit der

Unterversorgung zu verkürzen, wurde versucht, ein Gefäßsystem in vitro zu

generieren und dieses anschließend direkt mit den Blutgefäßen des Patienten zu

13

verbinden (Levenberg, Rouwkema et al. 2005). Einige Studien zeigten, dass

Endothelzellen ein Gefäßsystem in gezüchtetem Gewebe bilden können (Koike,

Fukumura et al. 2004, Levenberg, Rouwkema et al. 2005, Rouwkema, Westerweel et

al. 2009, Chen, Lin et al. 2012). Die Anordnung der Gefäße war jedoch aufgrund der

unkontrollierten Angiogenese zufällig. Vor dem Remodeling durch die Wirtszellen

überstieg auch der Abstand zwischen den vaskulären Strukturen die Grenze der

Diffusionsstrecke von 200 µm, sodass eine vollständige Versorgung aller Zellen initial

nach Implantation des Gewebes nicht gewährleistet war. Aufgrund des geringen

Durchmessers der gezüchteten Blutgefäße stellte die fehlende Möglichkeit einer

chirurgischen Anastomosierung ein weiteres Problem dieses Verfahrens dar

(Rouwkema and Khademhosseini 2016).

Als Lösungsansatz wurde das Patterning von Endothelzellen entwickelt. Hiermit

sollte die Herstellung von Gefäßsystemen mit größerem Durchmesser ermöglicht

werden. Innerhalb der Scaffolds wurden zunächst Hohlräume präpariert, die in der

Folge mit Endothelzellen besät werden, um ein vorgefertigtes Muster für die

vaskulären Strukturen zu schaffen. Zudem kann ein direktes Patterning der

Gefäßzellen beispielsweise durch die Verwendung der Bioprint-Technologie (Hoch,

Tovar et al. 2014) oder des photopatternings (Nikkhah, Eshak et al. 2012, Chaturvedi,

Stevens et al. 2015) erfolgen. Chaturvedi et al. zeigten, dass durch Patterning

hergestellte Gefäße mit einem Durchmesser zwischen 25 und 250 µm im Rattenmodell

anastomosiert und zu funktionellen, perfundierten Gefäßen werden können. Durch das

Remodeling wurden jedoch die Durchmesser wieder auf 10-15 µm reduziert

(Chaturvedi, Stevens et al. 2015). Diese Studie zeigt, dass obwohl die initiale

Organisation und der Durchmesser der Gefäße kontrolliert werden kann, das

vaskuläre Remodeling diese Anordnung sowohl in vivo als auch in vitro wieder

verändern wird.

Grundsätzlich stellt die ausreichende Perfusion von gezüchteten

Gefäßsystemen und die korrekte Verteilung des Blutes im Gewebe weiterhin eine

große Herausforderung dar. Ein optimales Gefäßsystem sollte bis hin zu den Venolen,

Kapillaren und Arteriolen speziell organisiert sein. Außerdem sollten die Gefäße

funktionell intakt sein, um beispielsweise auch die natürliche Barrierefunktion von

vaskulären Strukturen zu erhalten. Erstrebenswert wären zudem makrovaskuläre

Strukturen, die eine mikrochirurgische Anastomose mit dem Gefäßsystem des

Patienten und somit eine direkte Perfusion nach Implantation, ermöglichen. Zu

14

berücksichtigen ist außerdem das Remodeling der Gefäßsysteme, das sowohl in vitro

als auch in vivo nach Implantation des vaskularisierten Gewebes, stattfindet. Falls

hierbei keine zusätzlichen Signale vorhanden sind, die den Remodelingprozess

lenken, ist es wahrscheinlich, dass der Umbau in zufällig organisierten vaskulären

Strukturen resultiert (Rouwkema and Khademhosseini 2016).

1.4.2 Benutzen ganzer Organe mit vorhandenem Gefäßsystem

2004 präsentierten Jagodzinski et al. eine vielversprechende Idee als Lösungsansatz

für die fehlende Vaskularisierung im Bereich des Tissue Engineerings, indem sie

Dünndarmarkaden mit dem dazugehörigen Gefäßsystem dezellularisierten. Nach

Entfernung der Endothelzellen konnte das Gefäßsystem anschließend mit humanen

Stromazellen erfolgreich rezellularisiert werden und somit ein proof of principle

erbracht werden (Jagodzinski, Cebotari et al. 2004). Anschließend wurde die

Perfusionsdezellularisierung über das vorhandene Gefäßsystem zu einer effizienten

Methode entwickelt, um Dezellularisierungsagentien in dreidimensionalem Gewebe

oder ganzen Organen zu verteilen und zelluläres Material zu entfernen. Über das

erhaltene Gefäßsystem kann im Anschluss an die Dezellularisierung eine

Rezellularisierung des Organes sowie die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen

erfolgen (He and Callanan 2013) (siehe Abb. 2).

In den letzten Jahren konnten verschiedene solide Organe, unter anderem das

Herz (Ott, Matthiesen et al. 2008), die Leber (Uygun, Soto-Gutierrez et al. 2010) oder

die Lunge (Ott, Clippinger et al. 2010, Petersen, Calle et al. 2010) erfolgreich

dezellularisiert, rezellularisiert und bereits im Rattenmodel reimplantiert werden. Die

Rezellularisierung erfolgte in den meisten Forschungsgruppen mit einer

Mischpopulation an organspezifischen neonatalen oder fetalen Zellen. Einige Gruppen

verwendeten zur Rezellularisierung auch embryonale Stammzellen oder humane

Zellpopulationen. Unabhängig von der für die Rezellularisierung verwendeten Zellart,

war das vorrangige Ziel, das Ursprungsorgan zu regenerieren (Ott, Matthiesen et al.

2008, Ott, Clippinger et al. 2010, Petersen, Calle et al. 2010, Uygun, Soto-Gutierrez et

al. 2010, Song, Guyette et al. 2013).

In vorangegangenen Experimenten wurde in unserer Arbeitsgruppe bereits ein

standardisiertes, zeiteffektives Protokoll zur Perfusionsdezellularisierung von

Rattennieren entwickelt (Burgkart, Tron et al. 2014). Diese Bioscaffolds sollten jedoch

15

nicht zur Regeneration des ursprünglichen Gewebes einsetzt werden, sondern als

Biomatrices im Knochen Tissue Engineering dienen. Das Endziel ist es, ein universell

einsetzbares Bioscaffold zu schaffen, das zudem das Problem der Vaskularisierung

im Tissue Engineering adressiert.

Abb. 2: Schematisches Diagramm der Dezellularisierung ganzer Organe und ihrer klinischen Anwendungen modifiziert nach (He and Callanan 2013); EZM=Extrazellulärmatrix

1.5 Immunreaktion im Tissue Engineering

Wie bereits unter Punkt 1.3.1 dargelegt, ist die Biokompatibiliät eines der vorrangigen Kriterien, das ein biologisches Scaffold im Tissue Engineering erfüllen muss (Stevens

2008, Lichte, Pape et al. 2011, O'Brien 2011). Eine erhebliche Immunreaktion des

Empfängerorganismus würde letztendlich zur Narbenbildung und Abstoßung des

Scaffolds führen (O'Brien 2011) und somit das Ziel des Tissue Engineerings im Sinne

der Regeneration neuen funktionellen Gewebes verhindern.

16

1.5.1 Immunreaktion bei xenogener Organtransplantation

Die Immunantwort auf xenogene Organtransplantationen ist hinreichend erforscht

worden und macht die derzeitigen Limitationen von Zell-, Gewebe- und

Organtransplantationen deutlich (Badylak 2004). Diese Immunantwort führt zu einer

hyperakuten oder akuten Abstoßung des Transplantates, weswegen Xenografts

(Gewebe- oder Organtransplantationen zwischen unterschiedlichen Spezies) klinisch

keine Anwendung finden (Keane and Badylak 2015).

Die Zerstörung des transplantierten Gewebes resultiert aus verschiedenen

Mechanismen der Immunreaktion. Es kann zu einer Aktivierung des

Komplementsystems mit konsekutiver Lyse der Zellen, einer direkt durch T-Zellen

vermittelten Zelllyse, einer Aktivierung von T-Helferzellen und/oder der Produktion von

Allo-Antikörpern kommen (Ingulli 2010).

Als dominante Mediatoren einer Abstoßungsreaktion bei Xenotransplantationen

konnten vor allem Antikörper gegen das terminale Galactose-alpha-1,3-Galactose

Epitop (gal-Epitop) identifiziert werden. Diese Epitope befinden sich auf der Oberfläche

fast aller Zellen von Nicht-Primaten und Neuweltaffen, nicht jedoch auf menschlichen

Zellen (Galili 2001, Yang and Sykes 2007). Aufgrund einer ständigen Exposition

gegenüber α-gal-Epitop-tragenden Darmbakterien (Naso, Gandaglia et al. 2012)

werden im menschlichen Organismus anti-Gal-Antikörper gebildet, die bis zu 1-8% der

Immunglobuline M und 1-2,4% der Immunglobuline G ausmachen (McMorrow,

Comrack et al. 1997). Nach xenogener Transplantation kommt es durch die

Anwesenheit der α-gal-Epitope auf den Spenderzellen zu einer Komplementbindung

(Good, Cooper et al. 1992, Koren, Kujundzic et al. 1994, Goldberg, Lee et al. 1996,

Schussler, Shen et al. 2001, Farivar, Filsoufi et al. 2003) und einer

antikörperabhängigen zell-vermittelten Zytotoxizität (Galili 1993, Koren, Kujundzic et

al. 1994, Schussler, Shen et al. 2001) und somit zu einer hyperakuten oder

verzögerten Abstoßung der Xenotransplantate.

1.5.2 Anwendung xenogener EZM-Scaffolds im Tissue Engineering

Xenogene EZM-Scaffolds wurden bereits in Bereichen wie der Urologie

(Harnröhrenplastik) (Mantovani, Tondelli et al. 2011) oder der Hernienchirurgie

(Ansaloni, Cambrini et al. 2007) erfolgreich klinisch angewendet.

17

Die Präparation von EZM-Biomaterialien für den therapeutischen Gebrauch

beinhaltet die Dezellularisierung eines Gewebes. Aufgrund der daraus resultierenden

Abwesenheit zellulären Materials und der zellassoziierten Epitope wird dem

Empfängerorganismus nun eine andere Art des Gewebetransplantats präsentiert als

es bei der Transplantation von xenogenen Organen der Fall ist. Ein EZM-Scaffold ohne

Zellen enthält als potentielle Antigene oder Stimulatoren einer Entzündungsreaktion

nur die Proteine der EZM und ihre Abbauprodukte (Badylak 2004). Da die

Extrazellulärmatrix in der Entwicklung und der Physiologie von Säugetieren eine

zentrale Rolle spielt, ist die Sequenz der Aminosäuren und die Quartärstruktur vieler

Bestandteile der EZM auch über die Artgrenzen hinaus hoch konserviert (van der Rest

and Garrone 1991). Aufgrund dieser Übereinstimmung der Sequenzen könnte die

xenogene Anwendung von EZM-Scaffolds sinnvoll sein.

1.5.3 Immunreaktion auf xenogene EZM-Scaffolds im Tissue Engineering

Im Gegensatz zu der gut erforschten angeborenen und erworbenen Immunantwort auf

Organtransplantationen, ist die Immunantwort auf azelluläre xenogene (oder allogene)

biologische Scaffoldmaterialien bisher nur unzureichend erforscht und verstanden. Die

erfolgreiche Anwendung eines EZM-Scaffolds ist jedoch abhängig von der auf die

Transplantation folgenden Wirtsreaktion.

Neben einigen erfolgreichen klinischen Anwendungen von EZM-Bioscaffolds

(Ansaloni, Cambrini et al. 2007, Mantovani, Tondelli et al. 2011) zeigten sich in

anderen Fällen niedrige Level einer Immunantwort des Empfängers, die an kritischen

Stellen des Körpers wie beispielsweise an Herzklappen zu einem Funktionsverlust

und/oder der Destruktion der Transplantate führen können (Human and Zilla 2001,

Manji, Zhu et al. 2006, Sandor, Xu et al. 2008). An dieser Immunreaktion des

Empfängerorganismus sind sowohl das angeborene als auch das erworbene

Immunsystem beteiligt. Da die EZM-Scaffolds per definitionem frei von Zellen sein

sollen, spielen hier weitere Variablen eine Rolle. Zu diesen immunmodulierenden

Variablen gehören die Implantationsstelle, der Ursprung des EZM-Scaffolds und die

Prozessierungsschritte bei der Herstellung der Scaffolds (Keane and Badylak 2015).

Zunächst geht die Implantation des Scaffolds mit einer Gewebeverletzung

einher. Hierdurch wird die standardisierte Reaktion des Empfängerorganismus auf

eine Gewebeschädigung ausgelöst. Diese umfasst die Hämostase, eine Inflammation

18

sowie die Proliferation von Zellen und schließlich das Remodeling des Gewebes.

Letzteres kann hierbei in der Bildung eines dichten fibrotischen Gewebes im Sinne

einer Narbenbildung resultieren (Guo and Dipietro 2010). Der klinische Erfolg bei der

Verwendung eines EZM-Bioscaffolds ist weitgehend auch davon abhängig, ob diese

standardisierte Wundheilungsreaktion in Richtung der Neubildung von spezifischem

funktionellem Gewebe (konstruktives Remodeling) und weg von der Bildung des

Narbengewebes moduliert werden kann (Badylak and Gilbert 2008). Die Mechanismen

dieses konstruktiven Remodelings sind jedoch bisher nur partiell verstanden.

19

2 Hintergrund und Zielsetzung der Arbeit

Die fehlende Vaskularisierung ist eines der Probleme, das die klinische Anwendung

des Tissue Engineerings derzeit nur bedingt möglich macht. Neben einigen anderen

Methoden gilt die Dezellularisierung ganzer Organe mit dem Ziel, eine Biomatrix mit

natürlicher Gefäßstruktur zu erhalten, als vielversprechender Lösungsansatz dieses

Problems. In unserer Arbeitsgruppe konnte bereits eine standardisierte und

zeiteffektive Methode zur Perfusionsdezellularisierung solider Organe entwickelt

werden (Burgkart, Tron et al. 2014). Die Möglichkeit, die auf diese Weise erhaltenen

dreidimensionalen Bioscaffolds über Art- und Gewebegrenzen hinaus zu verwenden,

sollte nun im Rahmen dieser Dissertation evaluiert werden.

Die Herstellung der Bioscaffolds erfolgte durch Dezellularisierung von

Rattennieren mit unterschiedlich konzentrierter SDS-Lösung. Anschließend wurden

die Matrices mit humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (hPBMCs),

primären humanen Osteoblasten oder Rattenosteoblasten besät. Hierbei wurden im

ersten Teil der Versuche Marker untersucht, die die Immunreaktion der hPBMCs auf

das xenogene Material aufzeigen. Im zweiten Teil der Experimente wurden die

Viabilität und Funktionalität sowohl der humanen als auch der Rattenosteoblasten

während verschiedener Zeitpunkte der in vitro Kultur analysiert. Die Experimente

sollten folgende Fragen klären:

1. Ist eine Biomatrix aus dezellularisierten Rattennieren immunogen für humane

Zellen?

2. Lässt sich die Immunogenität durch Benutzung unterschiedlich hoher

SDS Konzentration reduzieren?

3. Welchen Einfluss hat das Bioscaffold aus dezellularisierten Rattennieren auf die

Proliferation und Funktion von differenzierten Zellen eines anderen Gewebetyps?

4. Welchen Einfluss hat das Bioscaffold aus dezellularisierten Rattennieren auf die

Proliferation und Funktion von differenzierten Zellen einer anderen Spezies?

20

3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Geräte

Die verwendeten Geräte werden in Tab. 1 aufgelistet.

Name Firma Modell Analysenwaage KERN & SOHN GmbH,

Deutschland

ABS 220-4

Arthroskopiepumpe

Arthrex Medizinische

Instrumente GmbH,

Deutschland

AR-6450

Einkanal-Pipette 0,5 ml, 10

ml, 100 ml, 1000 ml

Eppendorf AG,

Deutschland

Research plus

Fluoreszenzmikroskop Keyence GmbH,

Deutschland

BZ 9000

Hohlmeißelzange nach

Luer

Aesculap AG,

Deutschland

Inkubator Thermo Fisher Scientific

BV & Co KG, Deutschland

Heracell 150

Kryostat Microm, Deutschland Cryo-Star HM 560

Sicherheitswerkbank

Klasse II

Weiss Pharmatechnik

GmbH, Deutschland

BDK-1200

Laminar-flow Werkbank

Kendro, Germany Herasafe HS12

Lichtmikroskop Carl Zeiss Microscopy

GmbH, Deutschland

Axiovert 40 CFL

Mikroplatten-Reader BMG LABTECH GmbH,

Deutschland

FLUOstar Omega

Pipettierhilfe, akku-

betrieben

Hirschmann Laborgeräte

GmbH & Co. KG,

Deutschland

Pipetus

21

Stickstofftank Air Liquide GmbH,

Deutschland

Wasserbad Memmert GmbH + Co.KG,

Deutschland

WNB 14

Zentrifuge Eppendorf AG,

Deutschland

5804

Tab. 1: Geräte

3.1.2 Verbrauchsmaterialien

Die verwendeten Materialien sind in Tab. 2 dargestellt.

Name Firma Pumpenschlauch AR-6420 Arthrex Medizinische Instrumente GmbH,

Deutschland Pumpenschlauch AR-6425

Chirurgisches Nahtmaterial Prolene 5-0 Ethicon LLC, USA

Einmal-Skalpell Nr. 21 Feather Safety Razor Co., Ltd., Japan

Mikrotom-Klinge Nr. 35

Glasflaschen 500 ml, 1000 ml Schott AG, Germany

Mikrotiterplatte: Nunc Immuno Plates

Maxi Sorp Nr. 439454

Nunc GmbH & Co. KG, Deutschland

Deckgläser für Zählkammer 22 x 22 mm

Carl Roth GmbH und Co. KG,

Deutschland Pasteurpipetten, ohne Wattestopfen

230mm

Zählkammer Neubauer improved Pipettenspitzen Eppendorf AG, Deutschland

Röhrchen 50 ml

Greiner Bio-one GmbH, Deutschland

Serologische Pipetten 5 ml, 10 ml, 25

ml, 50 ml

Filtropur S 0,2 µm Spritzenvorsatzfilter

Röhrchen 15 ml

S-Monovette 9 ml, Lithium-Heparin

22

SafeSeal-Reagiergefäß 0,5 ml, 1 ml, 1,5

ml

Sarstedt AG und Co., Deutschland

Safety-Multifly-Kanüle 21G mit langem

Schlauch und montiertem Multi-Adapter

Zellkulturflaschen 175 cm²

Zellkulturschalen 10 cm²

Schere steril Aesculap AG, Deutschland Discofix® 3-Wege-Hahn

B.Braun Melsungen AG, Deutschland

Injekt® Einmalspritzen 2, 20 ml

Original-Perfusor®-Leitungen PVC

Vasofix® Venenverweilkanüle 20 G

Pinzette stumpf gerade OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG, Deutschland

Zellkulturflaschen 75 cm² BD Bioscience, Deutschland

Zellkultur Multiwellplatten SPL Life Sciences, Korea Tab. 2: Verbrauchsmaterialien

3.1.3 Chemikalien

Tab. 3 zeigt die verwendeten Chemikalien.

Substanz Firma ABTS (2,2'-Azino-bis(3-

ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid))

Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deutschland

Albumin, from bovine serum (BSA)

Calcein AM

Dimethylformamid 99,9%

Dulbecco`s phosphate buffered saline

(DPBS)

Echtblau-Salz

Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342

trihydrochloride)

Lipopolysaccharid (LPS) aus E.coli

0127:B8

MgCl2

23

Naphtol-AS-MX-Phosphat

4-Nitrophenylphosphat-Dinatriumsalz-

Hexahydrat

4-Nitrophenollösung

Tris-Base

Tween-20

Alamar Blue BIOZOL Diagnostica Vertrieb GmbH,

Deutschland

Aqua ad iniectabilia B.Braun Melsungen AG, Deutschland

Aqua Ecotainer® 1.000 ml

Ethanol 70% MRI Apotheke

Formaldehyd 3,7%

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Carl Roth GmbH und Co. KG,

Deutschland

Glycin

NaOH

SDS ultra pure

Lymphozyten Separationsmedium 1077

(LSM)

PAA Laboratories / GE Healthcare

Europe GmbH, Deutschland

Octeniderm farblos, Hautantiseptikum Schülke & Mayr GmbH, Deutschland

Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek GmbH, Germany

Trypanblau 0,5% Biochrom GmbH, Deutschland Tab. 3: Chemikalien

3.1.4 Zellkulturmedien, Puffer und Zusätze

Eine Übersicht über die Zellkulturmedien, Puffer und Zusätze gibt Tab. 4.

Substanz Firma CaCl2 Carl Roth GmbH und Co. KG,

Deutschland

HEPES

Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification (a-MEM)

24

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, low

glucose (DMEM)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deutschland

Fetal bovine serum (FBS)

Dexamethason

Penicillin/Streptomycin

RPMI-1640 Medium

Trypsin-EDTA 10 X

(5.0 g/l porcine trypsin and 2.0 g/l

EDTA)

β-Glycerolphosphat-Dinatriumsalz-Hydrat

AppliChem GmbH, Deutschland

Primocin Invivogen, USA Tab. 4: Zellkulturmedien, Puffer und Zusätze.

3.1.5 Zusammensetzung der Zellkulturmedien und Puffer

Die Zusammensetzung der Zellkulturmedien und Puffer ist in Tab. 5 abgebildet.

Kulturmedium für humane Osteoblasten Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, low glucose

(DMEM) (mit 1000 mg/L Glucose, L-Glutamin,

Natriumbikarbonat und Phenolrot)

500 ml

FBS 50 ml

Penicillin/Streptomycin 5 ml

L-Ascorbat-2-phosphat 0,05 M 125 µl

Differenzierungsmedium für humane Osteoblasten Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, low glucose

(DMEM) (mit 1000 mg/L Glucose, L-Glutamin,

Natriumbikarbonat und Phenolrot)

500 ml

FBS 25 ml

Penicillin/Streptomycin 5 ml

L-Ascorbat-2-phosphat 0,2 mM 500 µl

Dexamethason 100 nM 500 µl

HEPES 0,025 M 12,5 ml

25

CaCl2 1,56 mM 152 mg

β-Glycerolphosphat 10 mM 1,18 g

Kulturmedium für Rattenosteoblasten

a-MEM mit Phenolrot 500 ml

FBS 75 ml

L-Ascorbat-2-phosphat 2,8 µM 2500 µl

Dexamethason 10 nM 100 µl

L-Glutamin 2 mM 5 ml

Primocin 100 mg/l 1 ml

MEM Vitamine 5 ml

Tris-Puffer 0,1 M pH 8,5 Tris-Base 6,05 g

ddH2O 450 ml

NaOH Zum Einstellen des pH 8,5

Aqua (ddH2O) Bis 500 ml

Gesamtvolumen

Alkalische Phosphatase (AP) Färbepuffer pH 8,5 Dimethylformamid 99,9% 2,5 ml

MgCl2 203,5 mg

Tris-Puffer 0,1 M pH 8,5 500 ml

Alkalische Phosphatase (AP) Puffer 0,1 M pH 10,5 Glycine 3,75 g

Tris-Base 12,11 g

MgCl2 203 mg

ddH2O Bis 900 ml

NaOH Bis pH 10,5

Aqua (ddH2O) Bis 1 l Gesamtvolumen Tab. 5: Zusammensetzung der Zellkulturmedien und Puffer

26

3.1.6 Perfusionslösungen zur Dezellularisierung

Die Zusammensetzung der Perfusionslösungen zur Dezellularisierung ist in Tab. 6

dargestellt.

Sodium dodecyl sulfate (SDS) Lösungen (Natriumdodecylsulfat) SDS 5 g 6,6 g 10 g 30 g

Aqua 1000 ml 1000 ml 1000 ml 1000 ml

Konzentration 0,5% 0,66% 1% 3%

Phosphate buffered saline Lösung (Phosphatgepufferte Salzlösung) Phosphate buffered saline, pH 7,4 1 Päckchen

Aqua 1000 ml Tab. 6: Perfusionslösungen zur Dezellularisierung

3.1.7 Färbelösungen

Tab. 7 zeigt die Zusammensetzung der benutzten Färbelösungen.

Alkalische Phosphatase (AP) Färbelösung Echtblau Salz 6 mg

Naphthol-AS-MX-Phosphate 1 mg

AP Färbepuffer 10 ml

Hoechst Fluoreszenz Stammlösung Hoechst 33342 100 mg

DMSO 100 ml

Hoechst Fluoreszenz Färbelösung Hoechst Stammlösung 2,5 µl

DPBS 7,5 µl

Alkalische Phosphatase Substratlösung 4-Nitrophenylphosphat-Dinatriumsalz-

Hexahydrat

1,3 mg

AP Puffer 0,1 M pH 10,5 1 ml

Calcein AM Stammlösung 4 mM Calcein AM 1 mg

DMSO 250 µl

Calcein AM Färbelösung

27

Calcein AM Stammlösung 4 mM 5 µl

DPBS 10 ml Tab. 7: Färbelösungen

3.1.8 ELISA-Sets

In Tab. 8 werden die für die ELISAs verwendeten Sets und Lösungen dargelegt.

Human IL-10 Mini ELISA Development Kit 900 M21

PeproTech, Deutschland

Capture-Antikörper (Endkonzentration 100 µg/ml) Anti-hIL-10 21 µg

D-Mannitol 0,5 mg

Aqua ad iniectabilia 210 µl

Detection-Antikörper (Nachweis-Antikörper) (Endkonzentration 100 µg/ml) Anti-hIL-10 11 µg

D-Mannitol 0,5 mg

Aqua ad iniectabilia 110 µl

Standard (Endkonzentration 1 µg/ml) Rekombinantes hIL-10 1 µg

BSA 2,2 mg

D-Mannitol 11,0 mg

Aqua ad iniectabilia 1 ml

Waschpuffer Tween-20 0,05% in DPBS

Blocking-Puffer BSA 1% in DPBS

Verdünnungsmittel (Diluent) Tween-20 0,05%

BSA 0,1% in DPBS

Avidin-HRP-Konjugat Lösung Avidin-HRP-Konjugat 5,5 µl Diluent 11 ml

28

Human TNF-α ELISA Development Kit 900-K25

PeproTech, Deutschland

Capture-Antikörper (Endkonzentration 100 µg/ml) Anti-hTNF-α 21 µg

D-Mannitol 0,5 mg

Aqua ad iniectabilia 210 µl

Detection-Antikörper (Nachweis-Antikörper) (Endkonzentration 100 µg/ml) Anti-hTNF-α 11 µg

D-Mannitol 0,5 mg

Aqua ad iniectabilia 110 µl

Standard (Endkonzentration 1 µg/ml) Rekombinantes hTNF-α 1 µg

BSA 2,2 mg

D-Mannitol 11,0 mg

Aqua ad iniectabilia 1 ml

Avidin-HRP-Konjugat Lösung Avidin-HRP-Konjugat 6 µl Verdünnungsmittel 12 ml

Tab. 8: ELISA Sets und Lösungen

3.1.9 Software

Die verwendete Software wird in Tab. 9 genannt.

Software Firma EndNote X6 Japone / Team LnDL, Thomson Reuters, San

Francisco, CA, USA

Microsoft Excel 2010 Microsoft Corporation, Redmond, USA

OMEGA Software für FLUOstar V1.10 BMG Labtech, Deutschland

SPSS 24 IBM GmbH, Deutschland Tab. 9: Software

29

3.2 Methoden

3.2.1 Isolation von humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs)

Das Blut der humanen Spender (2x männlich (33 Jahre, 26 Jahre), 1x weiblich (24

Jahre), westeuropäisch, immunkompetent) wurde durch venöse Punktion mittels einer

Safety-Multifly-Kanüle am Unterarm gewonnen. Die Studie wurde von der

Ethikkommission der Technischen Universität München genehmigt. Die

Einverständniserklärungen der Spender zur Probenentnahme liegen vor.

Aus den heparinisierten Monovetten wurde das abgenommene Blut vorsichtig

in ein mit Lymphozyten-Separationsmedium (LSM) gefülltes 50 ml Röhrchen (15 ml

LSM/ 35 ml Blut) pipettiert. Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 1000 g und 22 °C

konnten die PBMCs als mittlere Schicht zwischen dem Blutplasma und der

Lymphozyten-LSM-Lösung abpipettiert und in einem neuen 50 ml Röhrchen

gesammelt werden. Die Röhrchen wurden mit steriler DPBS-Lösung aufgefüllt und es

folgte die Zentrifugation für 10 Minuten bei 630 g und 22°C. Nach Absaugen des

Überstandes folgte die erneute Resuspension in DPBS und Zentrifugation für 10

Minuten (630 g, 22°C). Der Überstand wurde erneut vorsichtig entfernt und die PBMCs

wurden in 10 ml im Wasserbad vorgewärmtem DMEM low glucose mit 0,2% Primocin

resuspendiert (Islam and Wilkinson 1989). Die Quantifizierung der Zellen erfolgte mit

Hilfe der Neubauer Zählkammer (3.2.4.1 Quantifizierung der Zellen).

3.2.2 Isolation von primären humanen Osteoblasten

Die Isolation der primären humanen Osteoblasten erfolgte aus humanen

Femurköpfen, die bei endoprothetischer Versorgung des Hüftgelenks (HTEP) in der

Abteilung für Unfallchirurgie im Klinikum rechts der Isar entnommen wurden. Die

Femurköpfe wurden unter sterilen Bedingungen entfernt, verpackt und in das Labor

überführt. Die Einverständniserklärungen der Patienten zur Probenentnahme sowie

ein durch die Ethikkommission der Technischen Universität München genehmigter

Ethikantrag liegen vor.

Mit Hilfe einer sterilen Hohlmeißelzange nach Luer konnten unter der sterilen

Werkbank kleine Spongiosastückchen (Durchmesser 3-5 mm) gewonnen werden.

Diese wurden in einem 50 ml Röhrchen mit DPBS mehrmals gewaschen bis sie eine

30

elfenbeinähnliche Farbe erhielten. Anschließend wurden die Spongiosastückchen in

einer 175 cm2 Zellkulturflasche verteilt (Explant-Methode) (Jonsson, Frost et al. 1999).

Als Nährmedium verwendeten wir Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (mit 1000

mg/L Glucose, L-Glutamin und Natriumbikarbonat), versetzt mit 10% FBS,

1% Penicillin/Streptomycin (bestehend aus 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml

Streptomycin) und 12,5 mg L-Ascorbat-2-phosphat pro 500 ml. Die ersten beiden Medienwechsel erfolgten jeweils nach einer Woche, dabei sollten die

Spongiosastückchen innerhalb der Zellkulturflasche möglichst wenig bewegt werden,

um ein Auswachsen von Zellen aus den Knochenstückchen zu ermöglichen. Nach

Erreichen der Konfluenz der ausgewachsenen Zellen wurden die Spongiosastückchen

entfernt. Die adhärenten Zellen wurden mit Hilfe von Trypsin/EDTA (siehe 3.2.4.3

Subkultivierung der humanen und Rattenosteoblasten) von dem Boden der

Kulturflasche gelöst, quantifiziert (siehe 3.2.4.1 Quantifizierung der Zellen) und

zur weiteren Kultur und Proliferation in mehrere 175 cm² Zellkulturflaschen gesät. Ab

der dritten Woche erfolgte der Mediumwechsel zweimal pro Woche.

3.2.3 Isolation von Rattenosteoblasten

Die Isolation der Rattenosteoblasten erfolgte ebenfalls mittels Explant-Methode (siehe

3.2.2 Isolation von primären humanen Osteoblasten) (Jonsson, Frost et al. 1999) aus

Femura von Wildtyp-Wistar-Ratten aus anderen Experimenten. Die

Knochenstückchen wurden auf 75 cm² Zellkulturflaschen verteilt und analog zu den

humanen Osteoblasten kultiviert. Als Nährmedium für die Kultivierung der

Rattenosteoblasten benutzten wir a-MEM versetzt mit FBS, Glutamin, MEM-

Vitaminen, L-Ascorbat-2-phosphat, Dexamethason und Primocin.

3.2.4 Zellkultur

3.2.4.1 Quantifizierung der Zellen

Die Quantifizierung der Zellen wurde mit Hilfe einer verbesserten Neubauer

Zählkammer durchgeführt. Diese besteht aus einer 4 mm dicken rechteckigen

(30 x 70 mm) Grundplatte aus Glas und einem dünnen Deckglas. In der Mitte der

Grundplatte befindet sich eine H-förmige Einkerbung, die die zwei Zählbereiche

voneinander trennt. Jeder Zählbereich ist in neun 1 mm² große Quadrate unterteilt. Die

31

vier äußeren Quadrate sind nochmals in 16 kleinere Quadrate mit jeweils 0,0625 mm²

unterteilt. Die Grund- und Deckplatte wurden zunächst mit 70% Ethanol gereinigt.

Nach Anhauchen der beiden Platten wurde die Deckplatte 0,1 mm über den

Zählbereichen platziert. Die Newton Ringe mussten zu sehen sein. Nach

enzymatischer Ablösung der Zellen mit Trypsin/ EDTA (siehe 3.2.4.3

Subkultivierung der humanen und Rattenosteoblasten) oder Gewinnung der

PBMCs (siehe 3.2.1 Isolation von humanen mononukleären Zellen des

peripheren Blutes (PBMCs)) wurden 50 µl Zellsuspension mit 50 µl Trypanblau-Lösung

(Trypan-Blau 0,5% : DPBS = 1:3) in einem SafeSeal-Reagiergefäß gemischt. Davon

wurden 10 µl in jede Zählkammer pipettiert und unter dem Lichtmikroskop die Zellen

in den vier äußeren Quadraten gezählt. Die Quantifizierung der vitalen Zellen 1 ml

Zellsuspension erfolgte nach Anleitung des Herstellers nach folgender Formel:

Anzahl vitaler Zellen / ml = x 104 x Verdünnungsfaktor

3.2.4.2 Kultivierung der primären humanen und Rattenosteoblasten

Nach Isolation der primären humanen und Rattenosteoblasten wurden die Zellen in

Zellkulturflaschen (175 cm²/75 cm²) im Inkubator bei 37°C und einer CO2-

Konzentration von 5% kultiviert. Die unterschiedliche Zusammensetzung der

Zellkultur- bzw. Differenzierungsmedien ist unter Punkt 3.1.5

Zusammensetzung der Zellkulturmedien und Puffer aufgelistet. Die

Nährmedien wurden zunächst einmal pro Woche und ab der dritten Woche der

Kultivierung alle drei bis vier Tage gewechselt. Dies geschah durch steriles Absaugen

und Auffüllen der Zellkulturflaschen mit der entsprechenden Menge an Medium unter

der sterilen Werkbank. Das Ascorbat wurde vor jedem Mediumwechsel frisch

hinzugefügt. Bei der Herstellung des Differenzierungsmediums wurden das CaCl2 und

das β-Glycerolphosphat in DMEM aufgelöst, steril filtriert und anschließend dem

Medium hinzugefügt. Nach Erreichen von ca. 80% der Konfluenz wurden die Zellen

entweder für die Versuche benutzt oder subkultiviert.

8Anzahl

32

3.2.4.3 Subkultivierung der humanen und Rattenosteoblasten

Die Subkultivierung der humanen und Rattenosteoblasten erfolgte nach Erreichen

einer ausreichenden Zelldichte (ca. 80% Konfluenz) in den Zellkulturflaschen (175 cm²

/ 75 cm²). Um die Zellen weiter zu kultivieren bzw. zu passagieren wurde zunächst das

Nährmedium unter der sterilen Werkbank abgesaugt und die Zellen mit sterilem DPBS

gewaschen, um eine Aktivitätshemmung des Trypsins durch Bestandteile des

Mediums zu verhindern. Nach Absaugen des DPBS gaben wir Trypsin/EDTA hinzu

und inkubierten die Zellen 5-10 Minuten bei 37°C, um die Zellen von dem Boden der

Zellkulturflaschen ab zu lösen. Nach leichtem Beklopfen des Randes der

Kulturflaschen lösten sich die restlichen Zellen, was unter dem Lichtmikroskop

kontrolliert werden konnte. Das Trypsin wurde anschließend durch Zugabe von

Medium inaktiviert und die Zellsuspension in ein 50 ml Röhrchen pipettiert. Nach

Zentrifugation für 10 Minuten mit 650 g bei 22°C konnte der Überstand abgesaugt und das sich am Boden der Röhrchen befindliche Zellpellet in frischem Medium

resuspendiert werden, bis eine homogene Zellsuspension entstand. Die Zellen in der

Suspension wurden anschließend mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer quantifiziert

(siehe 3.2.4.1 Quantifizierung der Zellen) und die gewünschte Anzahl von Zellen entweder auf neue Zellkulturflaschen verteilt oder direkt für die Experimente verwendet

(El-Amin, Botchwey et al. 2006).

3.2.5 Gewinnung der Rattennieren

Die Rattennieren wurden aus 16 männlichen Wildtyp-Wistar-Ratten mit einem Gewicht

zwischen 300 und 600 g gewonnen. Die Ratten wurden nach den üblichen Richtlinien

für Labortiere gehalten und im Rahmen anderer Versuche schließlich in

Allgemeinanästhesie mittels intrakardialer Injektion einer Überdosis Pentobarbital

(80 mg/kg) euthanisiert. Die Bauchregion der Ratten wurde zunächst mit 70% Ethanol

desinfiziert, die Bauchhöhle anschließend mit einer Längsinzision eröffnet. Die Nieren

konnten mittels stumpfer Präparation dargestellt und mit intakter Gefäßversorgung

proximal sowie distal an der Aorta abdominalis abgesetzt werden. Die Aufbewahrung

der Nieren erfolgte in einem mit DPBS gefüllten 50 ml Röhrchen bei –80° C.

33

3.2.6 Dezellularisierung

3.2.6.1 Präparation der Rattenniere

Nach langsamem Auftauen der Rattennieren bei Raumtemperatur wurden diese in

einer mit PBS gefüllten Zellkulturschale präpariert. Das umgebende Fettgewebe und

die Kapsel wurden vorsichtig entfernt ohne das Nierengewebe oder die Gefäße zu

verletzen. Die A. und V. renalis sowie der Ureter wurden dargestellt. In der A. renalis

wurde eine Venenverweilkanüle G20 platziert und mit Prolene 5-0 fixiert. Die korrekte

Platzierung der Venenverweilkanüle und die Durchgängigkeit der Nierengefäße

wurden durch manuelle Spülung mit PBS kontrolliert.

3.2.6.2 Perfusionssystem und Dezelluarisierung der Rattennieren

Als Perfusionssystem diente die Arthroskopiepumpe AR 6450 der Firma Arthrex sowie

das dazu gehörige sterile Standardschlauchsystem bestehend aus zwei

zusammengesetzten Teilschläuchen. Um das Gefäßsystem der Niere mit der

Arthroskopiepumpe verbinden zu können, wurde die in der A. renalis befestigte

Venenverweilkanüle an eine Perfusorleitung angeschlossen und diese über einen

Drei-Wege-Hahn mit dem Arthroskopieschlauchsystem verbunden. Als Reservoir für

die Spülflüssigkeiten dienten sterilisierte 1000 ml bzw. 500 ml Glasflaschen.

Nach der Vorbereitung und Entlüftung des Schlauchsystems der

Arthroskopiepumpe wurde die Niere über die Venenverweilkanüle und die

Perfusorleitung an das Perfusionssystem angeschlossen. Mit einem Druck von

100 mmHg und einem Flow von 10% wurde die Niere mit den

Dezellularisierungslösungen gespült.

Der Ablauf eines Dezellularisierungsprogramms ist in Tab. 10 dargestellt.

34

Schritt Lösung Dauer 1 Aqua 10 Minuten

2 SDS-Lösung 30 Minuten

3 Aqua 10 Minuten

4 SDS-Lösung 30 Minuten

5 Aqua 60 Minuten

6 * Aqua mit 5% Pen/Strep 60 Minuten Tab. 10: Dezellularisierungsprotokoll Pen/Strep: Penicillin und Streptomycin, SDS: Sodium dodecyl Sulfate (Natriumdodecylsulfat)

*Schritt 6 wurde unter der Sterilwerkbank mit steriler Spüllösung durchgeführt.

Für die Untersuchung der Immunantwort von humanen PBMCs im ersten

Teilversuch benutzen wir 0,5%-, 0,66%-, 1%- und 3%-SDS-Lösungen. Da sich

bezüglich der Immunantwort der humanen Zellen kein signifikanter Unterschied

zwischen den verschiedenen Konzentrationen der SDS-Lösungen gezeigt hatte,

wurden die Rattennieren für die weiteren Versuche mit 0,66%- oder 3%-SDS-Lösung

dezellularisiert.

Nach Abschluss des Dezellularisierungsvorgangs wurde die A. renalis der

dezellularisierten Niere unter sterilen Kautelen durchtrennt und die Niere in einem

sterilen 50 ml Röhrchen bei -80° C aufbewahrt (Burgkart, Tron et al. 2014).

3.2.7 Untersuchung der Immunantwort auf die Bioscaffolds

3.2.7.1 Inkubation der Bioscaffolds mit humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (hPBMCs)

Für diesen Teilversuch wurden Rattennieren, die mit 0,5%-, 0,66%-, 1%- und 3%iger

SDS-Lösung dezellularisiert worden sind, verwendet (vgl. 3.2.6.2 Perfusionssystem

und Dezelluarisierung der Rattennieren). Die Nieren wurden zunächst unter sterilen

Kautelen längs halbiert und die Hälften in den Wells einer 48 Well-Zellkulturplatte

platziert. Ebenso wurden native Rattennieren unter der sterilen Werkbank von

Bindegewebe und Kapsel frei präpariert, halbiert und auf die Wells verteilt. Nach

Isolation der hPBMCs, wurden die Nierenscaffolds und die nativen Nierenhälften mit

3x10⁶ humanen mononukleären Zellen pro Well besät und die Wells mit DMEM low

35

glucose und 0,2% Primocin bis auf 550 µl aufgefüllt. Zum Vergleich wurden

dezellularisierte und native Nieren ohne PBMCs und die mononukleären Zellen alleine

inkubiert. Als Positivkontrolle dienten PBMCs, die mit 5,5 µl LPS pro Well zu einer

Immunantwort stimuliert wurden. Die Inkubationszeit betrug 6 Stunden bei 37°C und

5% CO2. Danach wurde der Überstand der Wells abpipettiert und in 0,5 ml

Reaktionsgefäßen bei -80°C bis zur Durchführung des ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay) aufbewahrt.

3.2.7.2 ELISA: TNF-a, Interleukin-10

Um die Immunogenität der dezellularisierten Rattennieren zu untersuchen, wurden die

von humanen PBMCs gebildeten Konzentrationen von TNF-a und Interleukin-10

(IL-10) mittels ELISA quantifiziert. Die bei der Inkubation der Nieren mit humanen

PBMCs gewonnen Proben (vgl.3.2.7.1 Inkubation der Bioscaffolds mit humanen

mononukleären Zellen des peripheren Blutes (hPBMCs)) wurden nach dem Auftauen

zunächst 1:1 mit DMEM low glucose und 0,2% Primocin verdünnt. Beide Immunassays

(TNF-a, IL-10) wurden anschließend in Dreifachbestimmung nach Anleitung des

Herstellers durchgeführt.

3.2.8 Evaluierung der Viabilität und Funktionalität der Osteoblasten

3.2.8.1 Anfertigung von Gefrierschnitten

Die Anfertigung von Gefrierschnitten der Nieren war notwendig, um möglichst dünne

Gewebeproben für die Färbungen zu erhalten. In Vorversuchen hatte sich gezeigt,

dass dickere Schnitte des Nierengewebes die Darstellung beispielsweise der

alkalischen Phosphatase fast unmöglich machten, da die Anfärbung in dem dichten

Gewebe unter dem Mikroskop nicht zu erkennen war.

Für diesen zweiten Teilversuch benutzten wir Rattennieren, die mit 0,66% und

3% SDS-Lösung dezellularisiert wurden. Die dezellularisierten und nativen

Rattennieren wurden bei Raumtemperatur angetaut und mit einem sterilen Skalpell

quer halbiert. Anschließend wurden die Hälften einmalig in flüssigen Stickstoff

getaucht und mit O.C.T.-Compound Klebstoff auf der Probenplatte fixiert. Nach

Platzierung der Probe in der vorgesehenen Fassung des Kryostats, konnten dünne

36

Gefrierschnitte hergestellt werden. Die Temperatur des Objektes betrug -14°C, die des

Messers -16°C. Die Schnitte hatten eine Dicke von 60 µm und wurden mosaikartig auf

dem Boden der Wells einer bei -80°C vorgekühlten 48 Well-Zellkulturplatte verteilt. Zur

Vermeidung einer Kontamination wurden sterile Pinzetten benutzt und die restlichen

Arbeitsutensilien wiederholt mit 70% Ethanol desinfiziert. Außerdem wurden die

Multiwellplatten anschließend für 15 Stunden unter UV-Licht in der sterilen Werkbank

belassen, bevor sie versiegelt und bei -80°C gelagert wurden.

3.2.8.2 Besäen der Gefrierschnitte mit Osteoblasten

Die Herstellung der Gefrierschnitte und ihre Verteilung auf die 48 Well-Zellkulturplatten

wurden in Abschnitt 3.2.8.1 Anfertigung von Gefrierschnitten beschrieben. Die

auf diese Weise vorbereiteten Zellkulturplatten wurden zunächst bei Raumtemperatur

wieder aufgetaut und nochmals für 5 Stunden unter UV-Licht in der sterilen Werkbank

belassen. Anschließend wurde in jedes Well 100 µl Osteoblastenkulturmedium (siehe

3.1.4 Zellkulturmedien, Puffer und Zusätze) mit 0,2% Primocin gegeben und bei 37°C

inkubiert.

Die Ratten- und humanen Osteoblasten Passage 3-4 wurden von dem Boden der Zellkulturflasche abgelöst (siehe Punkt 3.2.4.3 Subkultivierung der humanen

und Rattenosteoblasten), zentrifugiert und in Osteoblastenkulturmedium mit 0,2%

Primocin resuspendiert. Nach Quantifizierung der Zellen wurde die entsprechende

Menge Zellsuspension auf die bereits inkubierten 48 Well-Platten verteilt und

gegebenenfalls mit Osteoblastenkulturmedium / Primocin auf 500 µl Gesamtvolumen

pro Well aufgefüllt. Im Folgenden wird die Kultur der Zellen mit Gefrierschnitten als 3D-

Zellkultur bezeichnet, die Zellkultur in den Wells ohne Gefrierschnitte als 2D-

Kontrollkultur.

Für die Bestimmung der Zellviabilität mittels Alamar Blue Assay wurden

5,0 x 103 Zellen pro Well gesät und zweimal wöchentlich ein Wechsel des

Kulturmediums durchgeführt. Für die Färbungen benutzten wir 1,0 x 104 Zellen pro

Well. Hierbei erfolgte der Wechsel des Osteoblastenkulturmediums auf das

Osteoblastendifferenzierungsmedium bereits an Tag 1. Anschließend wurde ebenfalls

zwei Mal wöchentlich das Differenzierungsmedium gewechselt.

37

3.2.8.3 Histologie / Histochemie

3.2.8.3.1 Alamar Blue Assay

Um die Zellzahl und die Viabilität der Zellen zu evaluieren, wurde das Alamar Blue

Assay verwendet. Das in dem Reagenz enthaltene blaue, nicht-fluoreszierende

Resazurin wird im Zytosol von lebenden Zellen zu Resorufin reduziert. Dabei kommt

es zu einem Farbumschlag und zur Emission von Fluoreszenz (Ahmed, Gogal et al.

1994, Dienstknecht, Ehehalt et al. 2010). Die Redoxreaktion kann sowohl quantitativ

durch kolorimetrische oder fluorometrische Messungen und qualitativ durch den

Farbumschlag detektiert werden, wobei die Messung der Fluoreszenz die genaueste

Methode darstellt (Rampersad 2012).

Zu den in 48 Well-Platten ausplattierten Zellen / Gefrierschnitten der Nieren (vgl.

3.2.8.2 Besäen der Gefrierschnitte mit Osteoblasten) wurde unter sterilen

Kautelen jeweils 40 µl Alamar Blue-Reagenz, entsprechend 1/10 des

Mediumvolumens, gegeben. Die Multiwellplatten wurden sofort für zwei Stunden bei

37°C inkubiert. Anschließend wurde unter der sterilen Werkbank der Überstand

abpipettiert und die Fluoreszenzmessung in dreifacher Bestimmung (3 x 100 µl des

Überstandes) mit einer Anregungswellenlänge von 544 nm und einer

Emissionswellenlänge von 590 nm durchgeführt. Die Zellen / Nierenschnitte wurden

anschließend wieder mit Kulturmedium / Primocin inkubiert und bis Tag 14 weiter

kultiviert.

3.2.8.3.2 Alkalische Phosphatase-Färbung

Die alkalische Phosphatase (AP) ist ein in der Leber, in Knochen und der Plazenta

produziertes Enzym, das in hohen Konzentrationen vor allem in proliferierenden

Osteoblasten nachzuweisen ist und als wichtiger Osteoblastenmarker gilt (Harris 1990,

Lian and Stein 1995). Deshalb benutzten wir die Anfärbung der alkalischen

Phosphatase zur Charakterisierung und Untersu