In vitro Untersuchungen zur toxikologischen und immunmodulatorischen Wirkung nanoskaliger Wolframcarbidpartikel

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades

Dr.med.

an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig

eingereicht von

Ulrike Trahorsch geboren am 29.09.1981 in Belzig angefertigt am

Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung GmbH (UFZ) Leipzig in Kooperation mit dem Institut für Klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig betreut von

Prof. Dr. U. Sack, Frau Dr. I. Lehmann Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom 23.02.2011

We have to remember that what we see is not nature herself, but nature exposed to our

method of questioning

(Werner Karl Heisenberg, 1958)

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Bibliographische Beschreibung

In vitro Untersuchungen zur toxikologischen und immunmodulatorischen Wirkung

nanoskaliger Wolframcarbidpartikel

Trahorsch, Ulrike

Universität Leipzig, Dissertation

97 S., 156 Lit., 37Abb., 4 Tab., 3 Anlagen

Referat:

Inhalative Partikel können gesundheitsschädigende Wirkungen im Respirationstrakt

ausüben. Für Hartmetallstäube aus Wolframcarbidcobaltpartikeln wurden in epi-

demiologischen Studien Zusammenhänge mit dem Auftreten einer chronisch fibro-

tischen Lungenerkrankung aufgezeigt, der Hard Metal Lung Disease (HMLD). Zur Auf-

klärung ihrer Pathogenese wurden die biologischen Effekte mikroskaliger Wolfram-

carbidpartikel erforscht. Seit einigen Jahren werden zunehmend Pulver zur Her-

stellung von Hartmetall verwendet, deren Partikel Durchmesser im Nanometerbereich

aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wurden daher in vitro die Effekte nanoskaliger

Wolframcarbidpartikel an humanen Zellen untersucht. Dabei wurden Partikelsuspen-

sionen mit unterschiedlichen Partikelgrößen und –zusammensetzungen verglichen.

Beurteilt wurden die Aufnahme der Partikel in die Zellen, ihre toxikologische Wirkung

und inflammatorische Mediatoren, die die exponierten Zellen als Reaktion auf die

Partikel sezernierten. In Bezug zur Exposition durch Inhalation wurden eine Lungen-

epithelzelllinie, eine Monozytenzelllinie und primäre mononukleäre Zellen aus dem

Blut untersucht. Es zeigte sich, dass die beobachteten Effekte sowohl partikelspezifisch

als auch zelltypspezifisch variierten. Dabei wurden die Partikel in alle Zelltypen

aufgenommen mit den stärksten Internalisierungsraten in humanen primären Mono-

zyten. Die Wolframcarbidcobalt-Partikel wirkten im Allgemeinen am stärksten

vitalitätsmindernd. Alle Partikelarten bewirkten in primären Monozyten eine stark

erhöhte Produktion von Zytokinen und Chemokinen. Untersuchungen zum

Mechanismus der Partikeleffekte wiesen auf die Beteiligung reaktiver

Sauerstoffspezies hin. Es konnten in der vorliegenden Arbeit bestehende Erkenntnisse

zur Toxizität von Wolframcarbidcobaltpartikeln bestätigt werden und Hinweise auf

die Beeinflussung biologischer Effekte durch verschiedene Partikelgrößen und

Oberflächeneigenschaften von Nanopartikeln gefunden werden.

vii

Abkürzungsverzeichnis

# Signifikante Hemmung * Signifikante Stimulation °C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter A549 humane Lungenepithelzelllinie ah anti human Ak Antikörper ca. Circa CB Kohlenstoff (engl. Carbon Black) CD Klassifizierung von Oberflächen-Antigenen (engl. cluster of differentiation) CO2 Kohlendioxid DMF N,N’-Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzym-Immunassay (engl. enzyme-linked mmunosorbent assay) FiTC Fluoresceinisocyanat FKS Fetales Kälberserum HMLD Hartmetall-Lunge (engl. Hard Metal Lung Disease) IFN Interferon IL Interleukin LPS Lipopolysaccharid M Molar MCP engl. monocyte chemoattractant protein mg Milligramm min Minute NAC N-Acetylcystein ng Nanogramm NHMP Natriumhexametaphosphat PBMC Periphere mononukleäre Zellen im Blut (engl. peripheral blood mononuclear cells) PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (engl. phophate buffered saline) PMA Phorbol-12-Myristat-13-Acetat ROS Reaktive Sauertsoffspezies (engl. reactive oxygen species) RPMI Zellkulturmedium (Roswell Park Memorial Insitute) RT Raumtemperatur

SDS Natriumdodecylsulfat (engl. sodium dodecyl sulfate)

THP-1 Humane Makrophagenzelllinie

viii

TMB 3,3‘,5,5‘-Tetramethylbenzidin TNF Tumornekrosefaktor u.a. unter anderem

WC Wolframcarbid WC-Co Wolframcarbid-Cobalt

UFP Ultrafeine Partikel

ix

Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ____________________________________________________ VII 

INHALTSVERZEICHNIS __________________________________________________________ IX 

1  EINLEITUNG ________________________________________________________________ 1 

1.1  WOLFRAMCARBIDE AM ARBEITSPLATZ UND IM LABOR ________________________________ 1 1.1.1  Herstellung und Anwendung _______________________________________________ 1 1.1.2  Gesundheitsrisiken durch Hartmetallaerosole __________________________________ 1 1.1.3  Untersuchungen zur Pathogenese der Hartmetall-Lunge _________________________ 2 

1.2  NANOPARTIKEL, NANOPRODUKTE UND NANOTOXIKOLOGIE ____________________________ 3 1.2.1  Die besonderen Eigenschaften der Nanopartikel ________________________________ 3 1.2.2  Die Nanotoxikologie fußt auf der Toxikologie der Ultrafeinpartikel _________________ 6 

1.3  DIE LUNGE ALS BARRIERE GEGENÜBER INHALATIVEN NANOPARTIKELN __________________ 7 1.3.1  Alveolarmakrophagen ____________________________________________________ 8 1.3.2  Zur Rolle des Alveolarepithels und den Wechselwirkungen mit anderen Zellen ________ 9 

1.4  MECHANISMEN PARTIKELINDUZIERTER BIOLOGISCHER EFFEKTE _______________________ 12 1.4.1  Reaktive Sauerstoffspezies und Oxidativer Stress ______________________________ 12 1.4.2  Redoxsensitive Signalwege _______________________________________________ 13 

1.5  ZIELSETZUNG DER ARBEIT _____________________________________________________ 14 

2  MATERIAL UND METHODEN ________________________________________________ 16 

2.1  ZELLKULTURARBEITEN _______________________________________________________ 16 2.1.1  Kultivierung der humanen Lungenepithel-Zellinie A549 _________________________ 16 2.1.2  Kultivierung und Differenzierung der humanen Monozytenlinie THP-1 _____________ 17 2.1.3  Präparation peripherer mononukleärer Zellen aus Spenderblut ___________________ 17 2.1.4  Verwendete Wolframcarbidpartikelsuspensionen ______________________________ 18 2.1.5  Exposition der Zellen ____________________________________________________ 19 

2.2  MIKROSKOPISCHE AUFNAHMEN UND ENERGIEDISPERSIVE RÖNTGENSPEKTROSKOPIE _______ 21 2.2.1  Lichtmikroskopische Aufnahmen ___________________________________________ 21 2.2.2  Elektronenmikroskopische Aufnahmen und Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX, Röntgenspektralanalyse) ________________________________________________________ 21 

2.3  DURCHFLUSSZYTOMETRIE _____________________________________________________ 22 2.4  DER MTT-TEST _____________________________________________________________ 24 2.5  DER ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY ______________________________________ 25 2.6  STATISTISCHE AUSWERTUNG ___________________________________________________ 28 

3  ERGEBNISSE _______________________________________________________________ 29 

3.1  DIE LOKALISATION DER PARTIKEL IN DEN UNTERSUCHTEN ZELLEN _____________________ 29 3.1.1  Lichtmikroskopische Aufnahmen ___________________________________________ 29 3.1.2  Rasterelektronische Aufnahmen und Röntgenspektralanalysen ____________________ 32 

3.2  DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR FRAGE DER AUFNAHME IN BZW. ANLAGERUNG DER PARTIKEL AN DIE ZELLEN ___________________________________________ 35 3.2.1  Veränderungen der Granularität durch Partikelexposition _______________________ 35 3.2.2  Untersuchungen zu verschiedenen Einflussfaktoren auf die Partikeleffekte __________ 39 

3.3  EINFLUSS DER PARTIKEL AUF DIE ZELLVITALITÄT ___________________________________ 42 3.3.1  Partikeleffekte auf die A549-Zellen _________________________________________ 42 3.3.2  Partikeleffekte auf die THP-1-Zellen ________________________________________ 43 3.3.3  Partikeleffekte auf die PBMC _____________________________________________ 44 

3.4  IMMUNMODULATORISCHE EFFEKTE DER WOLFRAMCARBIDPARTIKEL ____________________ 45 3.4.1  Reaktionen der A549-Zellen _______________________________________________ 46 3.4.2  Reaktionen der THP-1-Zellen _____________________________________________ 47 

x

3.4.3  Reaktionen der PBMC ____________________________________________________ 48 3.4.4  Untersuchungen zum Mechanismus der Partikeleffekte __________________________ 50 

3.4.4.1  Reaktion von PBMC auf inerte Latexpartikel ________________________________________ 50 3.4.4.2  Einfluss einer Vorstimulation mit LPS _____________________________________________ 50 3.4.4.3  Einfluss von Cobaltionen auf den Effekt der WC-Co-Partikel ___________________________ 51 3.4.4.4  Beteiligung von reaktiven Sauerstoffradikalen an den Partikeleffekten ____________________ 52 3.4.4.5  Der CD14-Rezeptor ____________________________________________________________ 54 

4  DISKUSSION ________________________________________________________________ 57 

4.1  ALLGEMEINE METHODOLOGISCHE ASPEKTE ________________________________________ 57 4.1.1  Zu den Partikelsuspensionen _______________________________________________ 57 4.1.2  Zu den in vitro Zellkulturmodellen __________________________________________ 59 

4.2  PARTIKELAUFNAHME _________________________________________________________ 60 4.2.1  Lungenepithelzelllinie ____________________________________________________ 61 4.2.2  Aufnahmeverhalten der THP-1-Zellen und der primären Monozyten aus dem peripheren Blut 62 4.2.3  Einfluss spezieller Partikeleigenschaften auf die zelluläre Aufnahme. _______________ 63 

4.3  PARTIKELEFFEKTE AUF DIE VITALITÄT ____________________________________________ 64 4.3.1  Toxische Effekte der Partikel auf A549-Zellen _________________________________ 64 4.3.2  Toxizität der Partikel gegenüber den THP-1-Zellen _____________________________ 65 4.3.3  Partikelspezifische toxische Effekte auf die PBMC ______________________________ 66 

4.4  EINFLUSS DER WOLFRAMCARBIDPARTIKEL AUF DIE PRODUKTION VON IMMUNMODULATORISCHEN STOFFEN ________________________________________________________________________ 67 4.4.1  Partikeleinfluss auf die Zytokinproduktion von A549-Zellen ______________________ 68 4.4.2  Partikelspezifische Immunreaktionen der THP-1-Zellen _________________________ 69 4.4.3  Partikelinduzierte Stimulation der Zytokin- und Chemokinproduktion an PBMC ______ 70 

4.5  MECHANISMEN DER PARTIKELWIRKUNG ___________________________________________ 72 4.5.1  Einfluss der Partikelgröße und -zusammensetzung ______________________________ 72 4.5.2  Reaktive Sauerstoffspezies und N-Acetylcystein ________________________________ 73 4.5.3  LPS-Wirkungen und der CD14-Rezeptor _____________________________________ 74 

4.6  SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK ___________________________________________ 76 

5  ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT ___________________________________________ 78 

6  LITERATURVERZEICHNIS ___________________________________________________ 83 

ANHÄNGE _______________________________________________________________________ 96 

xi

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abbildungen

1.1 Darstellung Größenordnung der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Nanopartikel

1.2 Vorhergesagte partielle Ablagerung inhalierter Partikel in den Atemwegen in Abhängigkeit von der Partikelgröße

1.3 Schematische Darstellung der Partikeleffekte im Respirationstrakt 1.4 Schematische Darstellung der oxidativen Hierarchie der Partikeleffekte 2.1 Schematische Darstellung des Messprinzips eines Durchflusszytometers 2.2 Prinzip des Sandwich-ELISA 2.3 Schema der Durchführung des ELISA unter Verwendung von OptEIA™-Kits 3.1 Lichtmikroskopische Abbildung der untersuchten Zellarten in Medium und

aqua dest. bzw. NHMP nach 24 Stunden Inkubation 3.2 Lichtmikroskopische Darstellung aller Zellarten nach 24stündiger Exposition

mit 30 µg/ml WC 100 3.3 Konzentrationsreihe der WC 100-Partikel auf THP-1-Zellen im

Lichtmikroskop nach 24stündiger Inkubation (Vergrößerung 100x) 3.4 Lichtmikroskopische Details der THP-1-Zellen nach 24stündiger Inkubation

mit Partikelsuspensionen 3.5 Lichtmikroskopische Darstellung von PBMC, für 24 Stunden exponiert mit

WC 100, Cytochalasin D und LPS (Vergr. 50x) 3.6 Rasterelektronenmikroskopische und röntgenspektralanalytische Darstellung

von PBMC nach 24stündiger Inkubation mit WC 100- und WC 10-Partikeln 3.7 Rasterelektronenmikroskopische und röntgenspektralanalytische Darstellung

von THP-1 nach 24stündiger Inkubation mit WC 100 bzw. WC 10 3.8 Veränderung der Granularität aller Zelltypen nach 20stündiger

Partikelexposition 3.9 Granularitätsänderungen in Abhängigkeit von unterschiedlichen

Partikelgrößen und Zelltypen sowie deren Beeinflussbarkeit durch Cytochalasin D

3.10 Granularität der PBMC nach 1, 3 bzw. 20 Stunden Inkubationszeit mit den Partikeln und verschiedenen Konzentrationen Cytochalasin D

3.11 Granularitätsänderungen durch unterschiedliche Partikelkonzentrationen 3.12 Veränderungen der Granularität von PBMC in Abhängigkeit von

unterschiedlichen Inkubationszeiten 3.13 Granularitätsveränderungen an unstimulieren und mit LPS vorstimulierten

PBMC eines Spenders nach Exposition mit 30 µg/ml WC 100 3.14 Ergebnisse des MTT-Tests an unstimulierten A549-Zellen 3.15 Partikeleffekte auf die Vitalität der THP-1-Zellen 3.16 Ergebnisse des MTT-Tests nach Exposition unstimulierter PBMC mit

Partikeln und CoCl2 3.17 Untersuchung der Partikeleffekte auf die Zytokinkonzentrationen im ELISA 3.18 Beeinflussung der Produktion von MCP-1 in A549-Zellen durch die Partikel 3.19 Partikeleffekte von WC 100 und WC-Co auf die Konzentrationen von MCP-1

und TNF-α im Kulturüberstand von THP-1-Zellen

xii

3.20 Zytokinkonzentrationen (IL-6, MCP-1, TNF-α) nach Partikelexposition auf PBMC

3.21 Vergleich der Partikeleffekte auf die IL-6-Konzentration an zwei Spendern 3.22 Partikeleffekte auf vorstimulierten PBMC 3.23 Vergleich der Wirkung von CoCl2 und WC-Co-Partikeln auf unstimulierte

PBMC 3.24 Auswirkung verschiedener NAC-Konzentrationen auf die MCP-1-Sekretion

partikelexponierter PBMC 3.25 Einfluss des Radikalfängers N-Acetylcystein auf die Partikeleffekte an

unstimulierten und stimulierten Zellen 3.26 Einfluss des Ausmaßes der Vorstimulation von PBMC auf die Wirkung von

N-Acetylcystein 3.27 LPS-Konzentrationsreihe und die Effekte eines monoklonalen anti-CD14-

Antikörpers Tabellen

2.1 Angabe der Konzentration und Größe der Partikel in den Suspensionen

2.2 Partikelcharakteristika, berechnet aus den nach verschiedenen Methoden ermittelten Durchmessern der Partikel bei einer Massenkonzentration von 0,1 mg/ml

2.3 Verwendete Konzentrationsreihe der Partikelsuspensionen als Massen-konzentration und Oberflächenkonzentration

3.1 Wirkung des anti-CD14-Antikörpers auf die Zytokinproduktion nach Partikelexposition

1

1 EINLEITUNG

Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des Projektes „Identifizierung und

Bewertung von Gesundheits- und Umweltauswirkungen von technischen

nanoskaligen Partikeln (INOS)“ durchgeführt, das vom Bundesministerium für

Bildung und Forschung gefördert wurde. Untersucht wurden die Effekte

verschiedener nanoskaliger Wolframcarbidpartikel auf humane Zellen.

1.1 Wolframcarbide am Arbeitsplatz und im Labor

1.1.1 Herstellung und Anwendung

Als Wolframcarbid (WC) wird eine nichtoxidische Keramik bezeichnet, die unter

anderem zur Werkzeugfertigung in der Hartmetallindustrie verwendet wird. Zur

Herstellung von Wolframcarbid wird Wolframoxid reduziert. Das entstandene

Wolfram-Metallpulver reagiert dann unter Hitze mit Kohlenstoff (carbon black, CB) zu

Wolframcarbid. Für den Einsatz als Hartmetall werden Wolframcarbid ca. 6

Massenprozent Cobalt als Bindephase zugegeben. Das Produkt, Wolframcarbid-Cobalt

(WC-Co), wird gepresst, hitzebehandelt und schließlich, beispielsweise durch

Schleifen, in seine endgültige Form gebracht. Hartmetalle sind gekennzeichnet durch

ihre außergewöhnliche Korrosionsbeständigkeit und ihre Härte, die im Gegensatz zu

anderen Metallen bei steigender Temperatur zunimmt. Dabei gilt: je feiner das Pulver

ist, aus dem der Werkstoff gefertigt ist, umso härter wird dieser (Fang et al. 2009).

Daher werden zunehmend Pulver mit nanoskaligen Partikeln verwendet,

beispielsweise zur Herstellung von hitzebeständigen Beschichtungen (Mohan und

Strutt 1996). Aus nanoskaligen Pudern gefertigte Hartmetallstücke zeichnen sich

insgesamt durch bessere Formbarkeit und mechanische Eigenschaften bei einer

homogenen Mikrostruktur aus (Dagani 1992).

1.1.2 Gesundheitsrisiken durch Hartmetallaerosole

Bei der Herstellung von Werkzeugen aus Hartmetall besteht die Möglichkeit, dass die

Partikel der verarbeiteten Pulver eingeatmet werden. Hinweise auf eine Gesundheits-

gefährdung durch Hartmetallstäube gibt es bereits seit vielen Jahren (Bech et al. 1962).

Im Jahresbericht der Deutschen Forschungsgemeinschaft (2004) wurden

2

wolframcarbid- und cobalthaltige Hartmetalle auf der Basis von epidemiologischen

Daten beim Menschen als Krebs erzeugend bewertet. Die Karzinogenität von Cobalt ist

bereits länger anerkannt (International Agency for Research of Cancer 1991). Diese

Bewertungen haben eine hohe Relevanz hinsichtlich der notwendigen Maßnahmen,

die zu ergreifen sind, um das Risiko für exponierte Arbeiter zu minimieren (Bochmann

et al. 2008). Das Einatmen von Stäuben während der Produktion von Hartmetallen

wird mit der Entstehung von berufsbezogenem Asthma, der sogenannten Hartmetall-

Pneumopathie (Hard Metal Lung Disease, HMLD) und Lungenkrebs in Verbindung

gebracht (Lasfargues et al. 1994). Die HMLD ist eine entschädigungspflichtige,

anerkannte Berufskrankheit, bei der die Patienten unter den Symptomen einer

restriktiven Lungenkrankheit mit reduzierter Diffusionskapazität leiden. Klinisch

äußert sich dies meist als chronischer Husten und Luftnot, häufig im Zusammenhang

mit Schwäche und Gewichtsverlust. Dabei zeigen manche Patienten eine subakute

Symptomatik, die nur während der Arbeit auftritt, während die Krankheit in anderen

Fällen schnell bis zur Lungenfibrose fortschreitet. Die HMLD kann bereits nach einer

sehr kurzen Expositionszeit autreten. Daher wird vermutet, dass die individuelle

Anfälligkeit eine größere Rolle spielt als die kumulative Belastung mit Hartmetall-

partikeln (Nemery et al. 2001). Umso bedeutsamer ist es, Grenzwerte für die

Staubbelastung der exponierten Arbeiter festzulegen und einzuhalten.

1.1.3 Untersuchungen zur Pathogenese der Hartmetall-Lunge

Das pathohistologische Bild der HMLD ist einzigartig. Als pathognomonisch gilt die

Anwesenheit ‚kannibalistischer’ vielkerniger Riesenzellen im Alveolarraum bzw. in

der bronchoalveolären Spülflüssigkeit Betroffener, weshalb die Erkrankung auch als

Giant Cell Interstitial Pneumonia bezeichnet wird (Nemery et al. 2001). Moriyama et al.

(2007) beschrieben, dass Wolfram im Lungengewebe von HMLD-Patienten stets in Ko-

Lokalisation mit Monozyten bzw. Makrophagen auftrat, die sich zu Riesenzellen

entwickelt hatten.

Die genaue Pathogenese der HMLD ist allerdings noch nicht bekannt. Die einzelnen

Bestandteile des Hartmetalls, Cobalt und WC-Partikel, kommen als pathogenetische

Faktoren in Frage (Bech et al. 1962, Lison et al. 1996). Es wird vermutet, dass u.a.

reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) die pathologischen Effekte

vermitteln. Dafür spricht, dass Cobaltionen die Bildung von ROS induzieren (Lewis et

3

al. 1991). In Anwesenheit von WC-Partikeln ist dieser Effekt deutlich verstärkt (Lison

et al. 1995). Durch WC-Co-induzierte ROS zeigten Effekte auf die Regulation von

Genen, die in apoptotische Prozesse und die Immunantwort invoviert sind (Lombaert

et al. 2004, 2008). Aus den Untersuchungen zu ROS im Zusammenhang mit der HMLD

wurde gefolgert, dass die individuelle Ausprägung antioxidativer Mechanismen die

Pathogenese der HMLD beeinflussen könnte (Nemery und Abraham 2007). Viele

Patienten mit HMLD beklagen zusätzlich zu den respiratorischen Symptomen einen

unverhältnismäßig starken Gewichtsverlust. Daher liegt die Vermutung nahe, dass

inflammatorische Mediatoren, wie der Tumornekrose-Faktor-α (TNF-α), ebenfalls eine

Rolle in der Pathogenese der HMLD spielen (Rolfe et al. 1992).

Die HMLD ist also eine Erkrankung, die aufgrund der bekannten epidemiologischen

Zusammenhänge eine wichtige Rolle bei der Erforschung möglicher pathogenetischer

Effekte inhalierbarer Partikel spielt. Die bisherigen experimentellen Untersuchungen

wurden vorwiegend an Partikeln mit Durchmessern im Mikrometerbereich durch-

geführt. Durch die zunehmende Exposition gegenüber Wolframcarbidpartikeln mit

Partikeldurchmessern im Nanometerbereich wächst der Bedarf an der Erforschung

ihrer biologischen Effekte.

Die Erzeugung nanoskaliger Wolframcarbidpartikel kann der Nanotechnologie

zugeordnet werden, die schon heute zu den Schlüsseltechnologien des 21. Jahr-

hunderts zählt. Es handelt sich hierbei nicht um eine spezifische Technik, sondern ein

breites Feld unterschiedlichster Anwendungen. Ihr gemeinsames Merkmal ist die

„Manipulation, die präzise Einbringung, Messung, Modellierung und Erzeugung von

Materialien kleiner als 100 nm“ (Meyer et al. 2001, S. 7). Unter dem Oberbegriff der

Nanotechnologie werden also neue Technologiebereiche zusammengefasst, die Nano-

partikel und Nanomaterialien produzieren und verwenden.

1.2 Nanopartikel, Nanoprodukte und Nanotoxikologie

1.2.1 Die besonderen Eigenschaften der Nanopartikel

Die American Society for Testing and Materials, eine internationale Standardisierungs-

organisation, definiert Nanopartikel als eine Untergruppe der ultrafeinen Partikel

(UFP), deren Längen in zwei oder drei Dimensionen mehr als 1 nm, aber weniger als

100 nm betragen. (ASTM International 2006). Die metrische Vorsilbe ‚nano’ kommt aus

4

dem Griechischen und bedeutet ‚Zwerg’. Zur Veranschaulichung der Größen-

verhältnisse kann folgender Vergleich dienen: Atome haben einen Durchmesser von

etwa 0,15 - 0,5 nm, Moleküle sind einige Nanometer und Makromoleküle einige 10 nm

groß. Ein Blatt Papier hingegen ist 100 000 nm dick. In Abbildung 1.1 sind die

Größenverhältnisse in Bezug zu den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Partikeln

dargestellt.

Nanopartikel können Eigenschaften aufweisen, die sich von denen makroskaliger

Partikel deutlich unterscheiden. Die Hauptursachen hierfür sind die erhöhte relative

Oberfläche pro Masseeinheit und das Auftreten von Quanteneffekten. Erstere führt zu

einer erhöhten chemischen Reaktivität, da bei linearer Abnahme des Partikeldurch-

messers exponentiell mehr Atome an der Oberfläche des Stoffgemisches liegen und so

mit der Umgebung reagieren können. Quanteneffekte können die optischen,

magnetischen und elektrischen Eigenschaften von Partikeln, die 30 nm und kleiner

sind, stark verändern (Borm et al. 2006; The Royal Society of Engineering 2004).

Viele Nanoprodukte haben bereits den Weg in unser tägliches Leben gefunden. Bereits

2006 gab es auf dem Markt mehr als 300 Produkte, die auf Nanotechnologie basieren.

Diese finden sich sowohl in der Automobilindustrie und der Elektronik, als auch in der

Biologie, der Umwelttechnik oder der Pharmazie. Ein wichtiges Gebiet der

Anwendung von Nanopartikeln umfasst die Entwicklung neuartiger Medikamente. So

Abb. 1.1: Größenordnung der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Nanopartikel Geändert nach „Nanoscience and nanotechnologies: opportunities and uncertainties.” The Royal Society and the Royal Academy of Engnieering (2004), d: Durchmesser, WC: Wolframcarbid

5

sollen Nanopartikel als Transportvehikel die Blut-Hirn-Schranke überwinden (Kreuter

et al. 2002) oder mittels Hyperthermie Krebszellen zerstören (Jordan et al. 2006). Je

häufiger Nanopartikel im Alltag verwendet werden, umso dringender stellt sich die

Frage nach ihren Wechselwirkungen mit dem menschlichen Körper und daraus

eventuell erwachsenden Risiken. Obwohl die Nanotechnologie vielfältige

Möglichkeiten bietet, bleibt also die Frage zu klären, welche potentiellen Gefahren für

Gesundheit und Umwelt sich aus der weitreichenden Anwendung dieser Partikel

ergeben.

Menschen waren gegenüber kleinsten Partikeln bereits exponiert, lange bevor die

Technik sich diesen Raum eroberte. Während Sporen, Pollen, Pilze und Bakterien als

biogene Partikel auf den Menschen einwirken, verursachen Sandstürme oder Vulkan-

ausbrüche eine Exposition mit mineralischen Stäuben, deren Partikel ebenfalls Durch-

messer im Mikro- und Nanometerbereich aufweisen. Seitdem der Mensch das Feuer

beherrscht, ist er regelmäßig feinsten inhalativen Rußpartikeln ausgesetzt. Die

industrielle Revolution brachte eine enorme Zunahme dieser anthropogenen Partikel

durch die vielfältigen Verbrennungsprozesse von Motoren und Fabriken.

Im 20. Jahrhundert wurde man sich zunehmend möglicher Gesundheitsgefährdungen

durch feinste Partikel in der Atemluft bewusst. Die Partikeltoxikologie begann, diese

Risiken genauer zu erforschen. Im Zusammenhang mit den vielfältigen Anwendungen

von Nanopartikeln erschien 2004 eine Veröffentlichung von Donaldson, in der das

Arbeitsfeld der Nanotoxikologie als Unterkategorie der Toxikologie seine Namens-

gebung und breite wissenschaftliche Aufmerksamkeit erlangte (Donaldson et al. 2004).

Definiert wurde die Nanotoxikolgie kurz darauf als „Wissenschaft von hergestellten

Nanostrukturen und –Materialien, die sich mit deren Effekten im lebenden

Organismus beschäftigt“ (Oberdörster et al. 2005, S. 824). Im Jahr 2006 wurden dann

von führenden Wissenschaftlern fünf große Herausforderungen an die

Nanotoxikologie formuliert. Darunter fand sich die Exploration neuer Teststrategien,

die auf die Besonderheiten von Nanopartikeln abgestimmt sind. Dadurch sollen eine

Überprüfung neuer Nanomaterialien ermöglicht und Alternativen zu in vivo Tests

aufgezeigt werden. Das wichtigste Ziel der Nanotoxikologie sei es demnach,

Vorhersagen zu den Gefahrenpotentialen von Nanopartikeln auf die menschliche

Gesundheit zu treffen (Maynard et al. 2006). Dieses Ziel verfolgt auch das INOS-

Projekt.

6

1.2.2 Die Nanotoxikologie fußt auf der Toxikologie der Ultrafeinpartikel

Mit den Effekten von nanoskaligen Partikeln im Atmungstrakt beschäftigt sich die

Partikeltoxikologie schon seit geraumer Zeit. Dies geschieht im Rahmen der Forschung

zu Gesundheitseffekten anthropogener inhalativer Partikel, des Feinstaubs, zu dessen

Bestandteilen ultrafeine Partikel (UFP) zählen (Oberdörster et al. 1996). UFP sind nano-

partikuläre Luftverunreinigungen, die im Gegensatz zu industriell eingesetzten Nano-

partikeln nicht kontrolliert oder bewusst technologisch hergestellt wurden

(Oberdörster 2005). Sie stellen chemisch heterogene Gemische dar. Ihr toxikologisches

Potential könnte Hinweise auf Gesundheitsgefährdungen durch industriell hergestellte

Nanopartikel geben. Die Toxikologie der Ultrafeinpartikel beschäftigt sich vorwiegend

mit Effekten, die Partikel auf Zellen der Atemwege ausüben. Das Spektrum der

untersuchten Zellmodelle wurde erweitert, als sich Hinweise mehrten, dass inhalierte

feinste Partikel die Alveolar-Blut-Schranke überwinden können (Nemmar et al. 2002).

Die systematische Forschung zu inhalativen Partikeln im Größenbereich von 1-100 nm

und ihren Auswirkungen auf die Gesundheit begann in den 80er Jahren des 20.

Jahrhunderts (Oberdörster et al. 1990). In epidemiologischen Studien wurde nach-

gewiesen, dass eine erhöhte Feinstaubkonzentration in der Atemluft mit deutlichen

Mortilitäts- und Morbiditätsrisiken einherging (Dockery 1993). Auch im arbeits-

medizinischen Bereich wurden seit langem Zusammenhänge zwischen der Exposition

gegenüber Stäuben und pulmonalen Erkrankungen untersucht. Beispiele hierfür sind

die Pneumokoniosen bei Bergleuten im Kohlebau und die oben beschriebene HMLD

bei Industriearbeitern (Heppleston 1992, Sprince et al. 1984).

In vivo Studien an inhalierbaren Partikeln führten zu der Erkenntnis, dass im All-

gemeinen nicht die Gesamtdosis der Stäube, sondern vielmehr die Partikelgröße bzw.

ihre Struktur die biologischen Effekte bedingten (Oberdörster 2001). Dabei gilt zumeist:

je kleiner ein Partikel, desto toxischer wirkt es (Oberdörster et al. 2005). Dies ist eine

der grundlegenden Hypothesen der Nanotoxikologie. Da mit abnehmendem Durch-

messer der Partikel ihre Oberflächenausdehnung und damit die Wahrscheinlichkeit

von Interaktionen mit der biologischen Umgebung stark zunimmt, wird die Relation

der Oberfläche zur Masse als ein möglicher Prädiktor für die Toxizität von

Nanopartikeln angesehen (Oberdörster 2000).

7

1.3 Die Lunge als Barriere gegenüber inhalativen Nanopartikeln

Für Expositionsversuche mit Nanopartikeln werden üblicherweise Partikelkonzen-

trationen von 1-100 µg/ml auf 106 Zellen verwendet. Ein Literaturbeispiel zeigt, dass

diese Konzentrationen praxisrelevant sein könnten. Stefaniak et al. ermittelten die

Konzentration und Zusammensetzung von Stäuben in der Raumluft an verschiedenen

Arbeitsplätzen einer Hartmetallfabrik. Dabei fanden sie überwiegend 1-3 µm große W,

Co und WC-Co-Partikel in Konzentrationen zwischen 128 und 4.031 µg/m3 (Stefaniak

et al. 2007). Bei einem Hartmetallarbeiter dieser Fabrik könnten sich die inhalierten

Partikel innerhalb von 24 Stunden zu einer Gesamtmenge von 900µg bis zu mehreren

Gramm akkumulieren. Da die Epithelflüssigkeit der Lunge bei einem Erwachsenen ein

geschätztes Volumen von 40-50ml hat (Hofer et al. 2004), betrüge die akkumulierte

Partikelmasse ungefähr 90-400 µg/ml, was im Rahmen der experimentell eingesetzten

Massenkonzentrationen liegt.

Diese sehr hohen errechneten Partikelkonzentrationen ergeben sich aus der

Schwankungsbreite der ermittelten Partikelkonzentrationen des Literaturbeispiels und

der rechnerischen Annahme, dass alle eingeatmeten Partikel sich in der Lunge

ablagern. Dies entspricht jedoch nicht der physiologischen Realität. Bei der

Betrachtung der Ablagerung von Partikeln in der Lunge müssen mehrere

physikalische Prozesse unterschieden werden. Die Partikel unterliegen, je nach ihrem

Durchmesser, der Diffusion und/oder der Sedimentation (Oberdörster et al. 2005). Vor

diesem Hintergrund wurden mathematische Modelle entwickelt, die Voraussagen zum

Ort der Ablagerung von Partikeln im Respirationstrakt treffen (International Commission

on Radiological Protection 1994). Partikel, die größer sind als 10 µm, kommen laut der

Modellrechnungen kaum über die Verzweigungen der Bronchien hinaus. Dort

sedimentieren sie, werden durch das Flimmerepithel wieder in den oberen Atemtrakt

transportiert und zumeist verschluckt. In der Alveolarregion lagern sich vor allem

Partikel mit einem Durchmesser zwischen 10 nm und 2,5 µm ab (Asgharian und Price

2007, Oberdörster et al. 2005) (s. Abb. 1.2). Es konnte experimentell nachgewiesen

werden, dass die Partikelablagerung in der menschlichen Lunge mit sinkendem

Durchmesser der Partikel zunimmt (Jaques und Kim 2000). In der Alveole kommen die

Partikel unmittelbar mit dem proteinhaltigen Surfactant in Kontakt (Schürch et al.

1990). Dabei ist es möglich, dass sich die Proteine zusammen mit den inhalierten

8

Partikeln zu Komplexen verbinden. Dies kann die Translokation der Nanopartikel

durch die Alveolarwand hindurch beeinflussen (Borm et al. 2006). Außerdem können

Proteine durch die Interaktion mit den Partikeln ihre Funktionalität und ihre

Konformation verändern – bis hin zur Denaturierung (Lynch et al. 2006).

1.3.1 Alveolarmakrophagen

Der Respirationstrakt verfügt über verschiedene Mechanismen, um mit der Atemluft

aufgenommene Partikel zu eliminieren. In der Alveolarregion geschieht dies vorrangig

durch die Aufnahme von Partikeln in Alveolarmakrophagen. Nanopartikel werden im

Vergleich zu größeren Partikeln weniger effizient phagozytiert, können die Beweglich-

keit der Alveolarmakrophagen verringern und zusätzlich zur Schwächung nach-

folgender Phagozytoseprozesse führen (Lundborg et al. 2001, Möller et al. 2002).

Werden proteinumhüllte Partikel von Makrophagen aufgenommen, können die Zellen

als Reaktion darauf ROS und proinflammatorische Botenstoffe sezernieren (Park 2003,

Vanhee et al. 1995, Driscoll und Maurer 1991). Diese Mediatoren dienen beispielsweise

der Aktivierung weiterer Entzündungszellen und können somit eine lokale

inflammatorische Reaktion auslösen (Li et al. 1997, Brown et al. 2004). Die Aufnahme

von Partikeln kann des Weiteren aufgrund der Belastung mit ROS dazu führen, dass

die Makrophagen in Apoptose gehen (Li et al. 2003). Unter physiologischen

Umständen können diese apoptotischen Zellen durch vitale Makrophagen

phagozytiert werden, die daraufhin antiinflammatorische Mediatoren sezernieren und

damit die Entzündungsprozesse eindämmen (Savill 1997). Wenn allerdings die

Phagozytosefähigkeit der Makrophagen insgesamt zu stark beeinträchtigt ist, werden

Abb.1.2: Vorhergesagte partielle Ablagerung inhalierter Partikel in den Atemwegen in Abhängig-keit von der Partikelgröße Abhängigkeit der Ablagerung von Partikeln im Nasopharyngealtrakt (links), in der Luftröhre bzw. den Bronchien (Mitte) und in der Alveolarregion (rechts) von der Größe der Partikel. Basierend auf Daten der International Commission on Radiological Protection 1994 (nach Oberdörster 2005)

9

die apoptotischen Zellen nicht mehr aufgenommen und gehen sekundär in Nekrose.

Hierin kann eine Ursache für überschießende und lang anhaltende Entzündungs-

prozesse nach Partikelexposition liegen (Stern et al. 1996, Duffield 2003). Chronisch

inflammatorische Reaktionen können ihre Ursache auch darin haben, dass die

Makrophagen die Partikel nicht verdauen können. Die Partikel können bis zu 700

Tagen in den Makrophagen verbleiben (Oberdörster et al. 2005). Wenn diese dann in

Apoptose gehen, liegen die Partikel erneut frei in der Alveole vor, müssen wieder

aufgenommen werden und erhöhen so den oxidativen Stress in der Lunge.

Die Monozyten und Makrophagen besitzen auf der Zelloberfläche ein spezifisches

Membranprotein – den CD14-Rezeptor (cluster of differentiation). Dieser multi-

funktionelle Rezeptor dient u.a. der Bindung von Lipopolysaccharid (LPS), einem

Bestandteil der Zellwand gramnegativer Bakterien. Durch die Bindung des LPS

werden intrazelluläre Prozesse ausgelöst, die u.a. die Bildung entzündlicher

Botenstoffe bewirken (Ulevitch et al. 1995). Das CD14-Molekül besitzt außerdem eine

wichtige Funktion bei der Induktion der Apoptose und der Erkennung apoptotischer

Zellen durch monozytäre Zellen (Heidenreich 1999).

Wenn die inhalierte Partikelmenge so groß ist, dass die Alveolarmakrophagen nicht

alle Partikel aufnehmen können oder sich die Nanopartikel durch bestimmte Eigen-

schaften der Phagozytose entziehen, steigt die Wahrscheinlichkeit, dass sie mit den

Alveolarepithelzellen direkt in Kontakt kommen (Oberdörster et al. 2005, Brown et al.

2004).

1.3.2 Zur Rolle des Alveolarepithels und den Wechselwirkungen mit anderen Zellen

Dass das alveoläre Epithel keine rein passive Barriere für Partikel darstellt, wird

zunehmend anerkannt und seine Rolle in der Abwehr erforscht (Bals und Hiemstra

2004). In der Alveolarwand der menschlichen Lunge existieren verschiedene Zell-

populationen. Epithelzellen vom Typ-I bilden aufgrund ihrer flachen und lang-

gestreckten Struktur den Großteil der Alveolaroberfläche. Im Gegensatz dazu tragen

die kuboidalen Typ-II-Epithelzellen trotz ihrer höheren Gesamtzahl nur ca. 7 % zur

alveolären Oberfläche bei. Sie können jedoch zu Typ-I-Epithelzellen differenzieren.

Dadurch haben sie eine wichtige Rolle bei der Regeneration des Alveolarepithels und

können in vivo geschädigte Typ-I-Epithelzellen ersetzen.

10

Für die Aufnahme von Partikeln in Alveolarepithelzellen gibt es verschiedene

Erklärungsmodelle. Im Allgemeinen existieren in jeder Zelle unterschiedliche

Mechanismen, um Makromoleküle und kleinere Partikel aufzunehmen. Ein Vorgang,

der keine spezifischen Rezeptoren benötigt, ist die Pinozytose mit nachfolgender Endo-

und Lysosomenbildung. Andere Mechanismen setzen eine spezifische Erkennung

voraus, so zum Beispiel die Clathrin-abhängige Aufnahme von Substanzen oder

diejenige durch Caveolae, flaschenförmige Einstülpungen der Zellmembran. Diese

Vorgänge kommen abhängig von der Partikelgröße zum Einsatz (Rejman et al. 2004).

Geiser et al. (2005) beschreiben für kleine hydrophobe Partikel einen nichtphago-

zytischen Mechanismus durch adhäsive Prozesse oder absorptive Endozytose, wobei

die Partikel nach ihrer Aufnahme in direktem Kontakt zu Zellorganellen stehen und

diese schädigen können. Ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal verschiedener

Aufnahmeprozesse ist die Beteiligung zellulärer Aktinfilamente. Diese spielen nach

neueren Erkenntnissen sowohl bei der Phagozytose als auch bei der Endozytose eine

wichtige Rolle (Kaksonen et al. 2006), allerdings nicht bei Clathrin- oder Caveolae-

abhängigen Vorgängen. Aktin-abhängige Prozesse können durch den Einsatz eines

Pilzmetaboliten, des Cytochalasin D, gehemmt werden (Schliwa 1982). Der Einsatz

dieses Stoffes ermöglicht also eine grundlegende Aussage zu Aufnahmemechanismen

von Nanopartikeln in Zellen (Stringer et al. 1995).

Die Bindung und Aufnahme von Partikeln durch die Epithelzellen ist eine wichtige

Voraussetzung für deren biologische Wirkung und abhängig von verschiedenen

Partikeleigenschaften (Griese und Reinhardt 1998). Die zytotoxische und immun-

modulatorische Wirkung verschiedener Nanopartikel auf das Lungenepithel wurde

bereits verschiedentlich aufgezeigt (Renwick et al. 2004, Wottrich et al. 2004, Singh et

al. 2007). Internalisierte Partikel können eine dosis- und zeitabhängige Freisetzung

verschiedener immunregulatorischer Botenstoffe, wie Zytokine und Chemokine,

bewirken (Calcabrini et al. 2004), wobei die Zytokinproduktion in Abhängigkeit von

der Partikelgröße variieren kann (Hetland et al. 2004).

Die Produktion spezifischer Zytokine durch Epithelzellen bewirkt die Anlockung von

Granulozyten und Monozyten aus dem peripheren Blut in den Alveolarraum. Mit der

Rekrutierung dieser Entzündungszellen ist eine Freisetzung von reaktiven Sauerstoff-

spezies und lysosomalen Enzymen verbunden, die das Lungenepithel schädigen

können. Hierüber kann es bei chronischer Einwirkung zu Fibrosierung und Tumor-

11

genese kommen. Da die Anlockung der Granulozyten und Monozyten aus dem

peripheren Blut erfolgt und der Übertritt nanoskaliger Partikel in die Blutbahn

nachgewiesen wurde (Nemmar et al. 2002), ist auch die Interaktion von Nanopartikeln

mit Zellen des peripheren Blutes möglich.

Die Aufnahme nanoskaliger Partikel in primäre Monozyten des peripheren Blutes

wurde bereits mehrfach nachgewiesen (z.B. Thiele et al. 2001, Lombaert et al. 2004).

Außerdem wurde gezeigt, dass WC-Co-Partikel in mononukleären Zellen des

peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) einen apoptogenen Einfluss

ausüben, die Regulation von Genen (Lombaert et al. 2004, 2008) und die Produktion

von Zytokinen induzieren (Shin et al. 2007, Drumm et al. 2000). Abbildung 1.3 stellt die

Partikelwirkungen an der Luft-Blut-Schranke schematisch dar.

Abb. 1.3: Schematische Darstellung der Partikeleffekte im Respirationstrakt Abgebildet ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme der Alveolarwand (aus Gehr et al. 1978) mit einem Alveolarmakrophagen (Ma), der Filopodia (FP) und eine undulierende Membran (U) ausbildet. Zu sehen sind außerdem eine Epithelzelle Typ II (EPII) und mehrere Kapillaren (C). In den Schemata um das elektronenmikroskopische Bild herum sind die Partikeleffekte und mögliche Interaktionen der beteiligten Zellarten aufgeführt. ROS: reaktive Sauertstoffspezies

12

1.4 Mechanismen partikelinduzierter biologischer Effekte

1.4.1 Reaktive Sauerstoffspezies und Oxidativer Stress

Die Erzeugung von ROS durch Nanopartikel und den bei chronischer Exposition

damit einhergehenden oxidativen Stress beschrieben Nel et al. (2006) als best-

entwickeltes Paradigma für die Toxizität von Nanopartikeln. Die direkte Verbindung

zwischen reaktiven Sauerstoffradikalen und der Inflammation durch Zell-Partikel-

Interaktionen ist noch nicht vollständig erforscht. Von vielen nanoskaligen Partikeln

(z.B. Kohlenstoff, Cobalt und Nickel) ist jedoch bereits bekannt, dass sie ROS

generieren können (z.B. Stone et al. 1998). Bei vergleichenden Studien an Partikeln mit

unterschiedlichen Durchmessern zeigte sich, dass Nanopartikel im Vergleich zu

größeren Partikeln in zellfreiem Medium pro Masseeinheit mehr ROS erzeugten

(Brown et al. 2001, Stone et al. 1998). ROS entstehen auch, wenn Nanopartikel mit

Makrophagen und Epithelzellen interagieren. Vor allem Makrophagen geben nach

Aufnahme von Partikeln ROS in die Umgebung ab (Karnovsky und Sbarra 1960).

Der Begriff ‚Oxidativer Stress‘ bezeichnet eine Stoffwechsellage, bei der die Menge

gebildeter reaktiver Sauerstoffspezies die Kapazität antioxidativer Enzyme über-

schreitet. Ein typisches Merkmal der antioxidativen Abwehr der Lunge ist die hohe

Gluthationkonzentration im Flüssigkeitsfilm der Lungenepithelien, der etwa 140fach

höher ist als im peripheren Blut (Cantin et al. 1987). Gluthation ist ein nieder-

molekulares Thiol, das im Zellplasma, im Zellkern und in den Mitochondrien vieler

Zellen vorkommt. Reduziertes Gluthation ist ein Tripeptid mit einer freien Thiol-

Gruppe. Bei der Reduktion bestimmter reaktiver Sauerstoffspezies wird Glutathion zu

Gluthationdisulfid oxidiert. Als Marker für den oxidativen Stress gelten also die

Menge an ROS oder das zelluläre Gleichgewicht zwischen den Konzentrationen von

Glutathion und Glutathiondisulfid. Diese können direkt in speziellen Testsystemen

ermittelt werden. Eine indirekte Aussage über die Rolle von ROS in partikel-

induzierten Effekten kann über den Einsatz von N-Acetylcystein (NAC) erfolgen.

Dieser Radikalfänger verhindert unmittelbar die Bildung von ROS und dient zusätz-

lich als Vorläufer des Glutathions (Gosset et al. 1999). Ein hemmender Einfluss von

NAC auf partikelinduzierte biologische Effekte spricht dafür, dass reaktive Sauerstoff-

spezies an deren Zustandekommen beteiligt waren.

13

1.4.2 Redoxsensitive Signalwege

Es wird vermutet, dass durch partikelinduzierten oxidativen Stress redoxsensitive

Signalwege aktiviert werden und damit die Transkription von Genen proinflamma-

torischer Zytokine und Chemokine in der Zielzelle erzielt wird (Oberdörster et al.

2005). Xiao et al. (2003) erstellten hierzu eine Hypothese zur hierarchischen Ordnung

zellulärer Reaktionen auf oxidativen Stress, die in Abbildung 1.4 dargestellt ist.

Demnach werden zunächst antioxidative und detoxifizierende Enzyme vermehrt

gebildet. Die Gene, die diese Enzyme kodieren, stehen unter der Kontrolle des Trans-

kriptionsfaktors Nrf-2. Defekte oder Abweichungen in diesem protektiven Signalweg

können zu erhöhter Anfälligkeit gegenüber inhalierbaren Nanopartikeln führen. Bei

einem höheren Grad an oxidativem Stress wird die protektive Antwort durch

inflammatorische Reaktionen überlagert, die durch die Aktivierung bestimmter Signal-

kaskaden, z. B. über mitogen-aktivierte Proteinkinasen und den Nuklear-FaktorkB

initiiert werden. Der programmierte Zelltod bei weiter verstärktem oxidativem Stress

kann durch die Störung der mitochondrialen Integrität und die Freigabe pro-

apoptotischer Mediatoren ausgelöst werden (Xiao et al. 2003).

Abb. 1.4: Schematische Darstellung der oxidativen Hierarchie der Partikeleffekte (Nach Xiao 2003), GSH: Glutathion, GSSG: Glutathiondisulfid

14

Für die meisten Parameter der zellulären Reaktionen auf den verschiedenen Stufen des

hierarchischen Modells sind spezielle Messmethoden etabliert. So kann der oxidative

Stress durch die Messung der GSSG-Konzentration, inflammatorische Reaktionen

durch die Konzentration von Zytokinen und apoptotische Vorgänge durch Vitalitäts-

parameter quantifiziert werden. Zusammen mit der ausführlichen physiko-chemi-

kalischen Charakterisierung der untersuchten Nanopartikel bildet dies eine solide

Grundlage für die Beurteilung biologischer Partikeleffekte (Nel et al. 2006, Warheit et

al. 2008).

1.5 Zielsetzung der Arbeit

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit Partikeln aus verschleißfesten Werkstoffen:

den Wolframcarbiden. In mikrokristalliner Form werden diese mit gesundheitlichen

Risiken in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit wurden in vitro die Effekte

nanoskaliger Wolframcarbidpartikel auf verschiedene Zelltypen untersucht, wobei

sowohl Vergleiche zwischen Partikeln verschiedener Zusammensetzung als auch

zwischen Partikeln unterschiedlicher Größenverteilungen gezogen wurden. Die

Auswirkung der Partikel auf die Zellen wurde anhand folgender Parameter analysiert:

- Verteilung der Partikel, Aufnahmemechanismen

Die Verteilung der Partikel in der Zellkultur und mögliche Aufnahme-

mechanismen wurden untersucht. Hierbei kamen verschiedene Techniken

(Lichtmikroskopie, Elektronenmikroskopie, Röntgenspektralanalyse,

Durchflusszytometrie) zum Einsatz.

- Zytotoxizität

Zur Untersuchung der toxischen Wirkung der Nanopartikel wurde die Vitalität

der Zellen nach Exposition mit den Partikeln beurteilt.

- Immunmodulation und Entzündung

Von Nanopartikeln können inflammatorische und immunmodulatorische

Effekte ausgehen. Zum Nachweis derartiger Effekte wurde die Freisetzung

inflammatorischer Botenstoffe (IL-6, MCP-1, IFN-γ, TNF-α) durch exponierte

Zellen analysiert.

Der relevante Aufnahmepfad für Wolframcarbidpartikel in den menschlichen

Organismus ist die Inhalation. Da Lungenepithelzellen und Alveolarmakrophagen mit

15

inhalierten Partikeln in Kontakt kommen, wurden in dieser Arbeit die Lungenepithel-

zelllinie A549 als Modell für Alveolarepithelzellen vom Typ II sowie die Monozyten-

Zelllinie THP-1 als Modellsystem für Alveolarmakrophagen verwendet. Da die Trans-

lokation von Partikeln in den Blutkreislauf nachgewiesen ist, wurden auch Partikel-

effekte auf periphere mononukleäre Blutzellen untersucht.

16

2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 Zellkulturarbeiten

Alle Zellkulturarbeiten wurden unter sterilen Bedingungen ausgeführt. Die

Auszählung der Zellen zur Einstellung der gewünschten Zellzahl in Kultur erfolgte bei

allen Zelltypen nach der Anfärbung der Zellkerne mit Türk’s Reagenz (Merck,

Darmstadt, Deutschland) in einer Neubauer Zählkammer.

2.1.1 Kultivierung der humanen Lungenepithel-Zellinie A549

Die A549-Zellen (American Type Culture Collection (ATCC) Nr. CCL-185, LGC,

Promochem, Wesel, Deutschland) wurden 1972 aus dem Lungenkarzinom eines

Mitteleuropäers gewonnen (Lieber et al. 1976) und ähneln Alveolarepithelzellen vom

Typ II. Die adhärent wachsenden Zellen wurden mit RPMI 1640 Medium (Biochrom

AG, Berlin, Deutschland) und 5 Vol.-% Fötales Kälberserum (FKS, Biochrom AG,

Berlin, Deutschland) kultiviert. Nach 2-3tägiger Inkubationszeit im Brutschrank

(Unitherm 190, Uni Equip Leipzig, Deutschland) bei 37,5°C, 5% v/v Kohlendioxid

(CO2) und wasserdampfgesättigter Atmosphäre wurde das Wachstum der Zellen unter

dem Lichtmikroskop (Inverses Mikroskop Axiovert 25, Carl Zeiss GmbH, Jena,

Deutschland) kontrolliert. Bei Vorliegen eines konfluenten Zellteppichs wurden die

Zellen passagiert. Hierfür wurde das Medium aus der 550ml Gewebekulturflasche mit

Filterdeckel (175 cm2 Wachstumsfläche, Greiner Bio-One, Solingen, Deutschland)

entfernt. Anschließend wurden die Zellen mit PBS (Dulbecco, Biochrom AG, Berlin,

Deutschland) gewaschen und mit 5 ml Trypsin/EDTA (0,05%/0,02%, PAN Biotech,

Aidenbach, Deutschland) abgelöst. Die Einwirkzeit wurde durch mikroskopische

Kontrolle des Ablösevorgangs optimiert und lag bei ca. 2 Minuten. Nach Aufnahme

der Zellen in RPMI / 5% FKS standen die Zellen für in vitro Experimente zur

Verfügung. Für die Weiterkultivierung wurden die Lungenepithelzellen in RPMI

1640/5% FKS in einer 550 ml Gewebekulturflasche ausgesät und wiederum 2-3 Tage

bei 37°C, 5% v/v CO2 und wasserdampfgesättigter Atmosphäre inkubiert. Für einzelne

Experimente wurden Zellen durch die Zugabe von 1 ng/ml Tumor-Nekrose-Faktor-

alpha (rh-TNF-a; ALImmunoTools, Friesoythe, Germany) vor der Partikelexposition

vorstimuliert.

17

2.1.2 Kultivierung und Differenzierung der humanen Monozytenlinie THP-1

Die THP-1 Zellen (ATCC; Rockville, MD, USA) wurden ursprünglich aus dem Blut

eines einjährigen Jungen mit akuter monozytischer Leukämie isoliert, besitzen in

vielerlei Hinsicht monozytischen Charakter (Tsuchiya et al. 1980) und können durch

die Stimulation mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA, 99% TLC, Sigma,

Deutschland) zu Makrophagen differenziert werden (Tsuchiya et al. 1982). Die

Kultivierung erfolgte in RPMI 1640 Medium mit 5% FKS. Adhärente Zellen wurden für

die Versuche mit Accutase (PAA Laboratories, Deutschland) aus den Zellkultur-

flaschen abgelöst. Die Differenzierung zu Makrophagen durch 10 ng/ml PMA erfolgte

für 72 Stunden bei 37°C, 5% v/v CO2 und wasserdampfgesättigter Atmosphäre. Das

Medium wurde vor der Aufbringung der Partikelsuspensionen durch frisches RPMI

1640/5% FKS ersetzt.

2.1.3 Präparation peripherer mononukleärer Zellen aus Spenderblut

Zu den peripheren mononukleären Zellen gehören Monozyten und Lymphozyten.

Diese können aufgrund ihrer spezifischen Dichte mit Hilfe eines Ficoll-Dichte-

Gradienten von den restlichen zellulären Blutbestandteilen getrennt werden. Ficoll ist

ein ungeladenes Polymer, dessen Dichte (1,077 g/ml) so eingestellt ist, dass rote

Blutkörperchen und tote Zellen höherer Dichte die Ficoll-Schicht beim Zentrifugieren

passieren können. Granulozyten sammeln sich in der Ficollphase, mononukleäre

Zellen in der Interphase an.

Die Isolierung der PBMC aus dem Buffy Coat (Leukozytenfilm) von gesunden

Blutspendern erfolgte unter sterilen Bedingungen. Dabei wurden 50 ml PBS und 50 ml

Spenderblut vermischt. In Zentrifugenröhrchen wurden je 12,5 ml Ficoll Paque®

(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala Schweden) vorgelegt und anschließend

mit ca. 25 ml der verdünnten Zellsuspension vorsichtig überschichtet. Es folgte eine

20minütige Zentrifugation (Rotanta 460R, Hettich Zentrifugen, Tuttlingen,

Deutschland) bei 670 g und Raumtemperatur (RT). Der entstandene Interphasering

(wurde mit einer sterilen Pasteurpipette abgesaugt und in neue Zentrifugenröhrchen

überführt. Nach zwei weiteren Waschschritten mit PBS (Zentrifugation jeweils für 10

min bei 340 g und RT) wurde die Zelldichte bestimmt. Nach der Einstellung auf die

gewünschte Zellzahl wurden die Zellen erneut zentrifugiert und das Pellet nach

18

Tab.2.1: Angabe der Konzentration und Größe der Partikel in den Suspensionen d: Durchmesser, dBET: Durchmesser berechnet nach der BET-Methode zur Berechnung der spezifischen Oberfläche poröser Stoffe. Dieser Wert bezieht sich auf die Primärpartikel; xPCS: Durchmesser ermittelt durch die Dynamische Lichtstreuung (DLS). Der hierbei ermittelte hydrodynamische Durchmesser stellt ein Maß für die Größe der Partikelagglomerate dar. NHMP: Natrium-Hexa-Metaphosphat bzw. Graham`s Salt.

Dekantieren des Überstandes in RPMI 1640/5% FKS aufgenommen, resuspendiert und

in die Zellkulturplatten verteilt. Für einige Versuche wurden die PBMC 1 Stunde vor

der Exposition mit den Partikelsuspensionen mit 100 pg/ml Lipopolysaccharid (LPS,

aus E.coli O55:B5, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) stimuliert.

2.1.4 Verwendete Wolframcarbidpartikelsuspensionen

Die Partikelsuspensionen wurden vom Fraunhofer-Institut für keramische

Technologien und Systeme (IKTS) in Dresden charakterisiert und bereitgestellt. Für die

Versuche wurden folgende Partikelsuspensionen verwendet (s. Tabelle 2.1)

Neben der Massekonzentration können Partikelsuspensionen anhand anderer

Parameter verglichen werden. Hierfür kommen beispielsweise die Oberflächen-

konzentration oder die Partikelkonzentration in Frage. In Tabelle 2.2 ist dargestellt, wie

stark diese Parameter in Abhängigkeit von der gewählten Messmethode zur

Bestimmung der Partikelgröße variieren können.

Suspension Konz. der

Stammlösung

[mg/ml]

d=dBET

[nm]

d=xPCS

[nm]

Dispersionsmittel

Wolframcarbid 100 (WC 100) 0,3 56 145 aqua dest.

Wolframcarbid 10 (WC 10) 0,3 9 115

aqua dest.

Wolframcarbid-Cobalt (WC-Co) 0,33 62 145 NHMP

Im Rahmen des INOS-Projektes wurde vorwiegend die Massenkonzentration zur

Darstellung der Partikeleffekte verwendet. Die Partikel wurden als Suspension in aqua

dest. bzw. Natrium-Hexa-Metaphosphat (NHMP bzw. Graham`s Salt, Merck KGaA,

Darmstadt, Germany, CAS-No.: 10361-03-25) bereitgestellt. Nach Erhalt wurden sie

autoklaviert, eine Stunde im Ultraschallbad (USR 30H, Merck, Darmstadt,

Deutschland) resuspendiert und in Glasflaschen bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt.

19

d = xPCS d = dBET

Tab. 2.2: Partikelcharakteristika, berechnet aus den nach verschiedenen Methoden ermittelten Durchmessern der Partikel bei einer Massenkonzentration von 0,1 mg/ml dBET, xPCS: Durchmesser berechnet nach verschiedenen Methoden, s. Tab. 3.1 (Nach: Teeguarden 2007)

Nach dem Autoklavieren konnten die Partikelsuspensionen 3-4 Wochen lang unter

sterilen Bedingungen verwendet werden. Tabelle 2.3 zeigt die verwendeten

Konzentrationsreihen auf, bezogen auf die Masse und die Oberfläche der Partikel.

2.1.5 Exposition der Zellen

Vor der Aufbringung auf die Zellkultur wurden die Partikelsuspensionen

aufgeschüttelt und für 15 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Innerhalb einer

Stunde nach dem Ultraschallbad wurden die Suspensionen mit dem jeweiligen Puffer

verdünnt und jeweils 100 µl auf die Zellkultur gegeben. Um die Wirkungen des Puffers

auf die Zellen von der Partikelwirkung zu unterscheiden, wurde jeweils eine Kontrolle

ohne Partikel, aber mit Puffer mitgeführt sowie eine Kontrolle nur mit RPMI 1640/ 5%

FKS.

Die A549-Zellen wurden in 24well-Kulturplatten mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen

ausgesät und in RPMI 1640/5% FKS über Nacht im Brutschrank inkubiert. Am

nächsten Tag wurde das Medium abgesaugt und frisches Medium sowie die Partikel-

suspensionen aufgetragen. Ähnlich behandelt wurden auch die THP-1-Zellen. Von

ihnen wurden 5 x 105 Zellen/ml in 24well-Kulturplatten ausgesät. Nach der

Differenzierungszeit wurden die Partikel aufgetragen. Die PBMC wurden nach der

Bestimmung der Zelldichte in RPMI 1640/ 5% FKS aufgenommen, zu je 1x106

Zellen/ml in Kulturplatten pipettiert und anschließend exponiert. Die Inkubation der

exponierten Zellen erfolgte im Brutschrank (bei 37°C, 5% CO2, wasserdampfgesättigte

Atmosphäre). Um die Wirkung von Cobaltionen auf die untersuchten Zellkultur-

Partikel-

Suspension

Oberflächenkonz.

[cm2/ml]

Partikelkonz.

[109/ml]

Oberflächenkonz.

[cm2/ml]

Partikelkonz.

[109/ml]

WC 100 6,8 69 2,6 7,9

WC 10 42,5 16700 3,3 3,9

WC-Co 6,6 55 2,8 4,2

20

modelle zu eruieren, wurden die Zellen mit einer Cobaltchloridlösung (Fluka Aldrich,

Deutschland) exponiert. Die Stammlösung (20 mM) wurde im Medium verdünnt

wobei 51 µM Cobaltchlorid der Cobaltkonzentration in 33 µg/ml WC-Co entsprach.

Um die Reaktion der phagozytierenden Zellen auf inerte Partikel zu testen, wurden

farblose Latexpartikel (Plano, W. Plannet GmbH, Wetzlar, Deutschland) mit einem

durchschnittlichen Durchmesser von 120 nm verwendet. Diese Partikel wurden bei 4°C

aufbewahrt und vor der Exposition in aqua dest. auf Partikelkonzentrationen von 107-

1010 Partikel/ml verdünnt. Es wurden jeweils 100 µl der Latexpartikelsuspension auf

die Zellkulturen gegeben.

Partikel-

suspension

Massekonzentration

[µg/ml]

Oberflächenkonzentration

[cm2/ml]

WC 100 0,3 0,0207

3,0 0,207

6,0 0,414

15 1,035

30 2,07

WC 10 0,3 0,1296

3,0 1,296

6,0 2,592

15 6,48

30 12,96

WC-Co 0,33 0,02178

3,3 0,2178

6,6 0,4356

16,5 1,089

33 2,178

Tab. 2.3: Verwendete Konzentrationsreihe der Partikelsuspensionen als Massenkonzentration und Oberflächenkonzentration (Umrechnung nach Teeguarden 2007)

21

Bei einigen Experimenten wurde vor der Partikelexposition der Radikalfänger N-

Acetylcystein (NAC, Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland) auf die Zellen gegeben.

Die Stammlösung (1M = 163,2 g/l) wurde in RPMI 1640 auf 800 mM eingestellt. Der

pH-Wert wurde mit Natrium-Hydroxid (NaOH) auf 7,4 titriert. Je nach verwendeter

Konzentration wurde die Lösung mit dem Kulturmedium verdünnt und eine Stunde

vor der Partikelexposition auf die Zellen gegeben.

2.2 Mikroskopische Aufnahmen und Energiedispersive Röntgenspektroskopie

2.2.1 Lichtmikroskopische Aufnahmen

Nach 24stündiger Inkubation mit den Partikelsuspensionen wurden licht-

mikroskopische Aufnahmen der Zellkulturen angefertigt. Hierzu wurden die Zell-

kulturplatten unter dem Mikroskop (Leica Microsystems, CMS, GmbH) betrachtet und

die Aufnahmen durch den Deckel der Zellkulturplatte hindurch angefertigt, um die

Proben nicht zu kontaminieren. Die Bearbeitung der Aufnahmen erfolgte mit Hilfe des

Programms Leica Application Suite (Leica, Microsystems, Jülich, Deutschland)

2.2.2 Elektronenmikroskopische Aufnahmen und Energiedispersive Röntgen-spektroskopie (EDX, Röntgenspektralanalyse)

Primäre chemische Fixierung (Aldehydfixierung)

In Vorbereitung auf die Elektronenmikroskopie bzw. die Röntgenspektralanalyse

wurden die Zellen nach Partikelexposition mit PBS (mit Ca2+und Mg2+, Dulbecco,

Biochrom AG, Berlin, Deutschland) von der Zellkulturplatte abgelöst, gewaschen und

in Eppendorf-Röhrchen überführt. Nach einem Zentrifugationsschritt (2000 rpm, 3-5

min) wurde der Überstand dekantiert und verdünntes Glutaraldehyd (2% in PBS,

Serva, Heidelberg, Deutschland) auf das Pellet gegeben. Die gut verschlossenen

Eppendorf-Gefäße wurden für 4-24 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach dieser Zeit wurde

das Glutaraldehyd gewechselt und die Inkubation bei 4°C wiederholt. Anschließend

wurde das Glutaraldehyd abpipettiert und PBS auf das Pellet gegeben. Nach einer

Inkubationszeit von 2-4 Stunden bei 4°C wurde das PBS gewechselt und die

Inkubation für 24 Stunden fortgesetzt. Nach dieser Fixierung war das Pellet bei 4 °C

für mehrere Wochen haltbar und wurde an das Max-von-Bergmann-Zentrum für

22

Biomaterialien (MBZ) der Technischen Universität Dresden versandt, wo die folgenden

Arbeitsschritte erfolgten:

- sekundäre chemische Fixierung (komplementäre Schwermetallfixierung)

- Entwässerung (Dehydratation)

- Infiltration mit niederviskösem Epoxidharz nach Spurr (1969)

- Härtung (Polymerisation)

- Ultramikrotomie der polymerisierten Proben

- Zur Untersuchung mit dem Rasterelektronenmikroskop:

o Montierung auf REM-Träger

o Bedampfung mit Kohlenstoff

o Untersuchung im REM (Philips XL 30 FG-ESEM) unter Verwendung

geeigneter Detektoren

- Zur Röntgenspektralanalyse

o Die jeweiligen Bedingungen, die zur Identifizierung der Elemente

herangezogen wurden, sind den jeweiligen EDX-Spektren zu

entnehmen

2.3 Durchflusszytometrie

Prinzip der Methode

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie können verschiedene Parameter gleichzeitig an

einer Zelle und an vielen tausenden Zellen innerhalb kurzer Zeit untersucht werden.

Zu diesen Parametern zählen morphologische Zelleigenschaften wie die Größe und die

Granularität der Zelle. Zusätzlich können Oberflächenantigene und intrazelluläre

Strukturen mittels fluorochrom-konjugierter Antikörper markiert und die

resultierende Fluoreszenz quantifiziert werden. Zur Untersuchung werden die Zellen

einer hydrodynamischen Fokussierung zugeführt und gleich einer Perlenkette an

einem Laserstrahl vorbeigeführt. Das in einem geringen Winkel (3-17°) zum Laser-

Strahl durch die Zelle abgelenkte Licht wird im Forward Scatter (FSC) dargestellt.

Dieser korreliert mit der Zellgröße. Die Streuung des Laserlichtes nach Einstrahlung im

rechten Winkel (90 +/- 26°) entspricht dem Sideward Scatter (SSC) und korreliert mit

der Granularität (s. Abb. 2.1).

23

Abb. 2.1: Schematische Darstellung des Messprinzips eines Durchflusszytometers

Bei der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen regt der Laserstrahl die Elektronen

der verwendeten Farbstoffe an und hebt sie auf höhere Energieniveaus. Wenn diese

Elektronen auf ihr energetisches Ausgangsniveau zurückfallen, geben sie Energie in

Form von Licht ab. Dessen Intensität wird gemessen und Schlussfolgerungen auf die

Menge an gebundenen Antikörpern je Zelle gezogen.

Vorbereitung und Durchführung der Durchflusszytometrie

Ablösen der Zellen

Nach Ablauf der Expositionszeit mit den Partikelsuspensionen wurden 750 µl des

Kulturmediums entnommen und zur späteren Verwendung bei -70°C in Masterblocks

(Greiner, Bio-One, Solingen, Deutschland) eingefroren. Mit dem restlichen Medium

wurden die Zellen in der Kulturplatte resuspendiert und in ein Zentrifugenröhrchen

aufgenommen. Anschließend wurde die Kavität mit 1 ml PBS gespült, um restliche

Zellen aufzunehmen. Bei den THP-1-Zellen war es zuweilen nötig, 100 µl Accutase

(Serva, Heidelberg, Deutschland) aufzutragen und die Platte 10 min im Brutschrank zu

inkubieren, bevor die Zellen sich mit PBS ablösen ließen. Nach Auffüllen des

Zentrifugenröhrchens mit PBS wurden die Zellen bei 1300 rpm und 4°C für 5 Minuten

abzentrifugiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt mit PBS durchgeführt.

Fixieren der Zellen

Nach einem erneuten Zentrifugationsschritt wurde der Überstand dekantiert und das

Zellpellet auf Eis für 10 Minuten mit 500 µl ICS Fixier Puffer (4% Paraformaldehyd in

PBS/1 % FKS, Serva, Heidelberg) inkubiert. Dann wurden die Ansätze noch zwei Mal

24

mit 3 ml des Waschpuffers (PBS Dulbecco (Ca2+, Mg2+-frei, pH 7,4) + 1% FKS)

gewaschen.

Permeabilisierung und Färbung

Die Zellen wurden in 2 ml des Permeabilisierungspuffers (50 g Saponin + 119 g

HEPES-Puffer in 500 ml aqua dest.) aufgenommen und nach zehnminütiger Inkubation

bei RT zentrifugiert (1200 U/min, 5 min). Anschließend wurden sie in

Permeabilisierungspuffer aufgenommen und in Durchflusszytometer-Röhrchen

überführt, in denen 2,5 µl der entsprechenden Antikörper vorgelegt waren. Die

Ansätze wurden nun für 30 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert und es erfolgten zwei

weitere Waschvorgänge mit je 3 ml Permeabilisierungspuffer. Die Überstände wurden

dekantiert und die Zellen mit 300 µl PBS/ 1% Formol (Serva, Heidelberg, Deutschland)

fixiert.

Die verwendeten Antikörper wurden von den Firmen Coulter Immunotech und

Pharmingen bezogen. Sie waren an folgende Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt:

Fluoresceinisocyanat (FiTC, Emission: 520 nm), R-Phycoerythrin (PE, Emission: 578

nm) und R-Phycoerythrin-Cyanin (PE-CY 5, Emission: 668 nm). Die Anregung erfolgte

mit einem Argonlaser bei 488 nm.

Messung und Auswertung

Die Messung und Auswertung des FSC, des SSC sowie der Fluoreszenzsignale erfolgte

mit einem Calibur-Durchflusszytometer von Becton Dickinson und der Software

CellQuestTM. Pro Probe wurden 10 000 Zellen gemessen.

2.4 Der MTT-Test

Prinzip der Methode

Dieser Vitalitätstest, der nach dem Protokoll von Mosmann (1983) durchgeführt

wurde, trifft eine Aussage über die Stoffwechselaktivität der untersuchten Zellen.

Verschiedene zytoplasmatische und mitochondriale Dehydrogenasen (Berridge 1993,

Mosmann 1983, Benizot und Lang 1986) spalten den gelben Farbstoff 3-(4,5-

Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) in einer irreversiblen

Reaktion in ein violett gefärbtes wasserlösliches Formazan. Die Färbung bleibt nach

dem Lysieren der Zellen erhalten und wird spektralphotometrisch vermessen. Die

25

Stärke der Absorption ist proportional zur Aktivität der Dehydrogenasen und damit

sowohl ein Maß für die Vitalität der Zellen als auch für die Zellzahl.

Durchführung

Nach Abnahme von 750 µl Kulturüberstand wurden zu den restlichen 250 µl Medium

25 µl der MTT-Lösung (5 mg/ml, Serva, Heidelberg, Deutschland) gegeben und die

Platte kurz geschwenkt, bevor sie für 4 h bei 37°C, 5% v/v CO2 und wasserdampf-

gesättigter Atmosphäre im Brutschrank inkubiert wurde. Danach wurden die

enzymatischen Vorgänge gestoppt und die Zellen lysiert, indem in jedes Well 300 µl

des MTT-Stopp-Reagenz (10% m/v Natriumdodecylsulfat, SDS, Serva, Heidelberg,

Deutschland) in 50%iger v/v wässriger N,N’-Dimethylformamid-Lösung (DMF, Serva,

Heidelberg, Deutschland) gegeben wurde. Nachdem die Platten über Nacht bei 37°C

inkubiert wurden, erfolgte die Messung der Absorption in den Zellkulturplatten (s.

Abb. 2.4). Dafür wurde die Extinktion am Photometer (Infinite F200, Tecan, Crailsheim,

Deutschland) unter Verwendung eines 570nm-Filters gemessen. Als Leerwert diente

eine zellfreie Probe mit dem Zellkulturmedium, die ebenfalls mit SDS und DMF

behandelt wurde. Die Ergebnisse wurden als Prozent der Vitalität/Proliferation im

Vergleich zur Kontrolle mit dem jeweiligen Lösungsmittel dargestellt [% Vitalität/-

Proliferation = 100% x Mittelwert-OD (optische Dichte) des Partikel-Ansatzes/-

Mittelwert-OD der Kontrolle].

2.5 Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Prinzip der Methode

Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) stellt ein immunologisches

Nachweisverfahren dar, das auf einer enzymatischen Farbreaktion basiert. Mit Hilfe

dieser Methode können Proteine und Viren, aber auch niedermolekulare Verbin-

dungen wie Hormone oder Toxine nachgewiesen werden. Da die Signalstärke eine

Funktion der Antigenkonzentration darstellt, kann der ELISA auch für quantitative

Analysen verwendet werden. Die Basis jedes ELISAs stellen drei chemisch-

physikalische Prozesse dar: die spezifische Interaktion eines Antigens mit Antikörpern,

die Bindung von Antikörper oder Antigen an eine spezielle Oberfläche (meist Plastik)

und die enzymatische Nachweisreaktion. Als Antigen dienten in der vorliegenden

Arbeit die von den Zellen produzierten Zytokine und Chemokine im Zellkultur-

medium. Die Messung der Zytokin- bzw. Chemokinkonzentration in den Zellkultur-

26

Abb. 2.2 Prinzip des Sandwich-ELISA (modizifizert nach: biosystemdevelopment.com)

überständen erfolgte mit einem sogenannten indirekten Sandwich-ELISA. Hierbei

werden zwei Antikörper verwandt, die beide an das Antigen binden (s. Abb. 2.5). Zur

Messung der Zytokinkonzentration wurden OptEIA™-ELISA-Kits von Pharmingen

für IL-6, MCP-1, TNF-α und IFN-γ verwendet. Als feste Phase zur Bindung der

Beschichtungsantikörper dienten 384er Nunc maxi Sorp-Immunoplatten.

Durchführung Die Beschichtung erfolgte mit einem Beschichtungsantikörper, der vorher mit PBS auf

die optimale Konzentration eingestellt wurde: 1:1500 für IL-6 und TNF-α, 1:1000 für

IFN-γ und MCP-1. Die ELISA-Platten wurden mit 50 µl der Beschichtungsantikörper-

lösung gefüllt und in einer feuchten Kammer über Nacht bei 4°C inkubiert. Um nicht

gebundene Beschichtungsantikörper zu entfernen, erfolgten Waschschritte mit 3 x 150

µl/ Kavität PBS/0,1% Tween®*20 (Merck, Darmstadt) mit dem ELISA-Platten-Washer

Columbus (Tecan, Crailsheim). Um Waschpufferreste vor dem nächsten Schritt zu

entfernen, wurden die Platten direkt nach dem Absaugen der Flüssigkeit kräftig auf

Zellstoff ausgeschlagen. Das Blocken freier Bindungsstellen für Proteine erfolgte durch

die Zugabe von 100 µl eines Assay-Puffers (5% FKS in PBS) in jede Kavität und die

Platten wurden anschließend für 1 Stunde in einer feuchten Kammer bei RT inkubiert.

Im Anschluss an die Blockung erfolgte erneut ein Waschvorgang mit PBS/0,1%

Tween®* 20 (3 x 150µl/ Kavität). Während der Inkubationszeit des Blockschrittes

wurde mit Zytokinstandards bekannter Konzentration eine 12-stufige Standard-

27

verdünnungsreihe für die einzelnen Zytokine durch eine serielle 1:2-Verdünnung

hergestellt. Deren Auftragung erfolgte in Duplikaten. Sofort nach dem Waschen

wurden 10 µl Assay-Puffer/Kavität vorgelegt, um Trocknungsartefakte durch

verzögerte Probenauftragung zu verhindern. Anschließend wurden die Standards und

die Proben mit je 100µl/Kavität aufgetragen. Nach einer erneuten Inkubationszeit von

mindestens 2 Stunden in der feuchten Kammer wurden weitere Waschschritte mit

PBS/0,1% Tween®*20 (5 x 150 µl/ Kavität) durchgeführt. Der biotinylierte Antikörper

und das Avidin-POD-Konjugat wurden in den jeweils erforderlichen Konzentrationen

durch Verdünnung mit Assay-Puffer hergestellt: 1:1750 für IL-6, 1:200 für MCP-1,

1:1000 für IFN-γ und 1: 1500 für TNF-α. Davon wurden je 50 µl pro Kavität in die Platte

gegeben und in der feuchten Kammer für 1 h bei RT inkubiert. Nach dem letzten

Waschschritt mit PBS/0,1% Tween®*20 (7 x 150 µl/Kavität) wurden 50 µl des

vorbereiteten Substrates (TMB, Becton Dickinson, Heidelberg)/Kavität zugegeben und

die Platte einige Minuten im Dunkeln inkubiert. Der Substratumsatz wurde dann

durch die Zugabe von 50 µl 1 M H2SO4 (Merck, Darmstadt)/Kavität abgestoppt. Zur

besseren Übersicht ist der Versuchsablauf in Abb. 2.6 noch einmal schematisch

dargestellt.

Messung und Auswertung

Das Messen der optischen Dichte zur Bestimmung der Zytokinkonzentration erfolgte

am ELISA-Reader (TECAN, Crailsheim) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer

Referenzwellenlänge von 750 nm. Die Ergebnisse wurden als Prozent der Zytokin-/-

Chemokinfreisetzung im Vergleich zur Kontrolle mit dem jeweiligen Partikelpuffer

dargestellt [% Zytokin-/Chemokinfreisetzung = 100% x OD des Partikel-Ansatzes/

Mittelwert-OD der Kontrolle]. Die Auswertung der Daten erfolgte mittels EasyWin

Kinetics 32 (EasyWin-Software, Tecan, Crailsheim) und die Berechnung der auf die

Kontrolle normierten Proteinkonzentrationen mittels Excel XP (Microsoft Deutschland,

Unterschleißheim).

28

Abb. 2.5: Schema der Durchführung des ELISA unter Verwendung von OptEIA™-Kits (Pharmingen, Produktinformation)

2.6 Statistische Auswertung

Mit statistischen Methoden wurde überprüft, ob Unterschiede in den gemessenen

Werten als zufällig oder nichtzufällig anzusehen sind. Soweit nicht anders angegeben,

erfolgte die statistische Auswertung der Daten mit den Programmen Excel 2003

(Microsoft Deutschland, Unterschließheim) und Statistica 8 (StatSoft Inc., USA). Die

Daten wurden mit Hilfe des Student t-Tests für unabhängige Gruppen analysiert und

als Mittelwert und Standardfehler angegeben. Die Analyse der Versuchsergebnisse,

deren Ergebnisse nicht normalverteilt waren, erfolgte anhand des nicht-

parametrischen Mann-Whitney-U-Tests. Statistische Signifikanz, das heißt der

Grenzwert für die Entscheidung wo die zufallsbedingten Unterschiede aufhören,

wurde jeweils bei 5% (p < 0,05) angenommen.

29

3 ERGEBNISSE

Durch die Anwendung verschiedener Methoden konnte ein Einblick in die

Interaktionen nanoskaliger Wolframcarbidpartikel mit verschiedenen Zelltypen

humanen Ursprungs gewonnen werden. Dazu zählten die Lungenepithelzelllinie

A549, die Monozyten-Zelllinie THP-1 sowie PBMC. Die angewandten Techniken

ergänzten einander bei der Beurteilung der Lokalisation der Partikel in den Zellen, der

Aufnahmemechanismen, der Beeinflussung der Zellvitalität und schließlich der

immunologischen Reaktion der Zellen auf die Partikelexposition.

3.1 Die Lokalisation der Partikel in den untersuchten Zellen

3.1.1 Lichtmikroskopische Aufnahmen

Die Zellen wurden nach Exposition zunächst lichtmikroskopisch betrachtet. Beurteilt

wurden hierbei die Verteilung der Partikel in der Zellkulturplatte, die Darstellung von

Partikelagglomeraten in Relation zu den Zellen bei verschiedenen Partikel-

konzentrationen, Unterschiede zwischen den Partikelsuspensionen und eventuelle

Anzeichen für induzierte Zellschäden. Als solche wurden z.B. frei flottierende A549-

Zellen im Medium, Zellen mit defekter Zellmembran und die Anwesenheit von

Zelltrümmern angesehen.

Nicht exponierte A549-Zellen stellten sich dar als polygonale Zellen, die z.T. Ausläufer

besaßen und in Kultur einen konfluierenden Zellteppich ausbildeten. Die THP-1-Zellen

nahmen unterschiedliche Größen und Formen an und PBMC bildeten eine homogene

Zellmenge, in der nicht zwischen Lymphozyten und Monozyten unterschieden

werden konnte. Um zu untersuchen, ob die Applikation der Partikelpuffer bereits die

Morphologie der Zellen beeinflusst, wurde zunächst jeweils eine Gruppe der Zellen

nur mit Nährmedium behandelt und eine weitere zusätzlich mit den Puffern aqua

dest. bzw. NHMP ohne Partikel exponiert. Zwischen diesen Gruppen zeigten sich

lichtmikroskopisch keine Unterschiede in Zellform, Zelldichte und Konfluenz. In

Abbildung 3.1 sind die Zellen nach der Exposition mit dem Kulturmedium und dem

Partikelpuffer dargestellt.

30

Abb. 3.2: Lichtmikroskopische Darstellung aller Zellarten nach 24stündiger Exposition mit 30 µg/ml WC 100 (Vergrößerung 50x) A) A549-Zellen (Vergr. 100x), B) THP-1-Zellen (Vergr. 100x) , C) PBMC

A) C) B)

Anschließend wurden die Zellen mit den Partikelsuspensionen in unterschiedlichen

Konzentrationen exponiert und Aufnahmen nach einer Inkubationszeit von 24

Stunden angefertigt. Bei allen Zellarten zeigte sich eine inhomogene Verteilung von

Partikelagglomeraten in der Kulturplatte (s. Abb. 3.2). Das Auftreten der Partikel-

agglomerate war in seinem Ausmaß abhängig von der aufgebrachten Partikel-

konzentration, wie am Beispiel der THP-1-Zellen in Abbildung 3.3 gezeigt wird.

Es traten bei allen untersuchten Zellarten und Partikelsuspensionen sowohl Über-

lagerungen von Partikelagglomeraten und Zellkörpern als auch Agglomerate

unabhängig von den Zellen im Medium auf. Durch die Partikelexposition induzierte

Zellschäden zeigten sich anhand von defekten Zellmembranen, geschwollenen Zellen

und Zellfragmenten bei den A549-Zellen und der Monozyten-Zelllinie, v.a. nach der

Exposition mit WC-Co (s. Abb.3.4).

Abb. 3.1.: Lichtmikroskopische Abbildung der untersuchten Zellarten in Medium und aqua dest. bzw. NHMP nach 24 Stunden Inkubation

A) A549-Zellen (Vergr. 100x), B) THP-1-Zellen (Vergr. 100x) und C) PBMC (Vergr. 50x)

A) C)B)

31

Abb. 3.3: Konzentrationsreihe der WC 100-Partikel auf THP-1-Zellen im Lichtmikroskop nach 24stündiger Inkubation (Vergrößerung 100x) v.l.n.r. obere Reihe: Kontrolle mit aqua dest., 0,3 µg/ml, 3 µg/ml WC 100; untere Reihe: 6 µg/ml, 15 µg/ml, 30 µg/ml WC 100

Abb. 3.4: Lichtmikroskopische Details der THP-1-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit Partikelsuspensionen THP-1-Zellen nach Exposition mit A) 30 µg/ml WC 10-Partikeln, B) 30 µg/ml WC 100-Partikel und C) 6,6 µg/ml WC-Co-Partikeln, Blockpfeile deuten auf Ko-Lokalisationen von Partikeln und Zellsomata, einfache Pfeile auf Anzeichen für Zellschäden/Zelluntergang

A) B) C)

Bei den PBMC erschien die Ko-Lokalisation der Partikel in Relation zu den Zellkörpern

ähnlich ausgeprägt wie bei der Monozyten-Zelllinie. Allerdings waren an den PBMC

keine morphologischen Veränderungen nach Partikeleinwirkung zu erkennen. Nur bei

32

Abb. 3.5: Lichtmikroskopische Darstellung von PBMC, exponiert mit WC 100, Cytochalasin D und LPS nach 24stündiger Inkubation (Vergrößerung 50x) PBMC nach Exposition mit A) 30 µg/ml WC 100, B) 30 µg WC 100 und Vorinkubation mit 2 µM Cytochalasin D sowie C) 30 µg/ml WC 100 und Vorinkubation mit 100 pg/ml LPS

A) B) C)

den stimulierten Zellen zeigten sich Zellkonglomerate, die häufig auch mit Partikel-

agglomeraten überlagert erschienen (s. Abb.3.5).

Lichtmikroskopisch konnte eine passive, schwerkraftbedingte Verteilung der Partikel

nicht von einer Anlagerung an bzw. einer Aufnahme in die Zellen unterschieden

werden. Um einen Anhaltspunkt dafür zu bekommen, ob die Partikel in die Zellen

aufgenommen werden, wurden weitergehende Versuche mit Cytochalasin D

durchgeführt. Dieser Phagozytosehemmer wurde in verschiedenen Konzentrationen

(5 µM bei A549, 2 µM bei PBMC und THP-1) eine Stunde vor der Partikelauftragung

auf die Zellen gegeben. Ein Effekt dieser Behandlung wurde nur bei den PBMC

deutlich. Hier erschienen die Partikel in den cytochalasin-behandelten Proben diffuser

verteilt, als in den Kontrollen (Abb. 3.5). Um weiterführende Erkenntnisse zur

Lokalisation der Partikel an bzw. in den Zellen zu erhalten, wurden elektronen-

mikroskopische und röntgenspektralanalytische Aufnahmen angefertigt.

3.1.2 Rasterelektronische Aufnahmen und Röntgenspektralanalysen

THP-1-Zellen und PBMC wurden nach 24stündiger Inkubation mit den Puffern bzw.

den Partikelsuspensionen WC 100 und WC 10 nach einem standardisierten Protokoll

aufbereitet (s. Kap. 2.2.2) und an das Max-von-Bergmann-Zentrum in Dresden

verschickt. Dort wurden elektronenmikroskopische und röntgenspektralanalytische

Aufnahmen angefertigt, um die genaue Lokalisation der Partikel in den Zellen zu

untersuchen. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Armin Springer können diese

33

Abbildungen hier vorgestellt werden.

In den rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen waren keine einzelnen Partikel,

sondern nur Partikelagglomerate detektierbar, die sich als helle Bereiche darstellten.

Bestätigt wurde die intrazelluläre Anwesenheit des Elementes Wolfram anhand eines

spezifischen Peaks in der Röntgenspektralanalyse über den untersuchten Zellen. Bei

den PBMC wurde anhand morphologischer Kriterien eine Unterscheidung zwischen

Monozyten und Lymphozyten getroffen. Beurteilt wurden die Form des Zellkerns und

die Kern-Plasma-Relation, die bei Lymphozyten größer ist als bei Monozyten. Es zeigte

sich in den untersuchten Proben eine Ansammlung der Partikel nur in den Monozyten.

Im Vergleich zu den Kontrollzellen fanden sich in den exponierten Zellen vergrößerte

Vesikel im Zellplasma. In den THP-1 konnten analog zu den PBMC Wolframpartikel

im Zellplasma nachgewiesen werden, während bei beiden Zellarten keine Partikel im

Zellkern lokalisiert waren. In den Abbildungen 3.6 und 3.7 sind diese Ergebnisse

zusammengefasst dargestellt.

B)

Rasterelektronenmikroskopie

A)

N

M

L

Röntgenspektralanalyse (EDX)

34

Abb. 3.6: Rasterelektronenmikroskopische und röntgenspektralanalytische Darstellung von PBMC nach 24stündiger Inkubation mit WC 100- und WC 10-Partikeln Linke Spalte: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (Vergrößerung 2000x) der PBMC nach Exposition mit A) aqua dest., B) 30 µg/ml WC 100 und C) 30 µg/ml WC 10. Schwere Elemente (z.B. Wolfram) erscheinen als helle Areale. rechte Spalte: röntgenspektralanalytische Auswertungen der untersuchten Zellen (Vergrößerung 16.000x). Das Spektrum der Röntgenspektralanalyse zeigt über den hellen Punkten zwei prominente Röntgen-Peaks mit der charakteristischen Energie für Röntgenquanten der Wolfram-Mα (WM) und Wolfram-Lα (WL) Atomschalen. Andere Peaks repräsentieren weitere Elemente in der untersuchten Region und lassen sich auf das Einbettungsmedium (ClK, Chlorid Kα; OK, Sauerstoff Kα), die Umhüllung (CKα, Kohlenstoff Kα) oder die Färbung (OsM, osmium Mα und UM, Uranium Mα) zurückführen. N: Zellkern (Nukleus), M: Monozyt, L: Lymphozyt, dünne Pfeile: Wolframpartikelagglomerate, Ellipsen: Röntgen-Peaks der Wolframpartikel, Kasten: TiK: Titan-Peak (Abrieb von Ultraschallsonde bei Vorbereitung der WC 10- Suspensionen).

C)

N

B)

A)

Rasterelektronenmikroskopie Röntgenspektralanalyse (EDX)

35

3.2 Durchflusszytometrische Untersuchungen zur Frage der Aufnahme in bzw. Anlagerung der Partikel an die Zellen

Die Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchungen wurden hinsichtlich der

möglichen Aufnahme oder Anlagerung von Partikeln an die Zellen ergänzt durch

durchflusszytometrische Untersuchungen. Im Durchflusszytometer können zwei

morphologische Zellcharakteristika bestimmt werden: die Größe der Zellen stellt sich

anhand des Vorwärtsstreulichtes (Forwards scatter, FSC) dar und ihre Granularität

anhand des Seitwärtsstreulichtes (Sidewards Scatter, SSC). Darüber hinaus kann mit

Hilfe fluoreszenzmarkierter Antikörper die Identifikation einzelner Zellpopulationen

erfolgen. Dies war in der vorliegenden Arbeit wichtig zur Beurteilung der spezifischen

Partikeleffekte auf Lymphozyten bzw. Monozyten im peripheren Blut. Die Partikel-

effekte wurden an allen drei Zellreihen bei verschiedenen Partikelkonzentrationen und

verschiedenen Inkubationszeiten untersucht, und zusätzlich wurde der Einfluss eines

Phagozytosehemmers auf die Partikeleffekte beurteilt.

3.2.1 Veränderungen der Granularität durch Partikelexposition

Um zu beurteilen, ob sich die Granularität der Zellen allein aufgrund der Exposition

mit Partikeln veränderte, wurde jede Zellart für 20 Stunden mit farblosen Latex-

partikeln inkubiert. Wie in Abbildung 3.8 zu sehen ist, führte die Exposition mit Latex-

partikeln zu keiner deutlichen Änderung der Granularität. Nach der Exposition mit

den Wolframcarbidpartikeln wiesen hingegen alle untersuchten Zelltypen nach 20

Stunden eine Erhöhung ihrer Granularität auf.

Abb. 3.7: Rasterelektronenmikroskopische und röntgenspektralanalytische Darstellung von THP-1 nach 24stündiger Inkubation mit WC 100 bzw. WC 10 A) Puffer, B) 30 µg/ml WC 100 und C) 30 µg/ml WC 10 Erklärungen siehe Bildunterschrift zu Abb. 3.6, a: nähere Bezeichnung der Atomschale (in Bildunterschrift zu Abb. 3.6 als Alpha gekennzeichnet)

C)

36

In Abbildung 3.8 sind diese Veränderungen im SSC für alle Zellreihen aufgetragen.

Wie in dieser Abbildung ebenfalls zu erkennen ist, waren bei den PBMC von den

dargestellten Partikeleffekten ausschließlich die Monozyten/Makrophagen betroffen,

wobei die Ausmaße der Partikeleffekte interindividuell stark variierten. Die Granulari-

tätsänderungen der A549- und der THP-1-Zellen fielen im Vergleich zu den PBMC

geringer aus und betrafen eher diffus einen Großteil der untersuchten Zellen als eine

spezifische Zellgruppe.

Kontrolle 30 µg/ml WC 100 Latexpartikel

Abb. 3.8 : Veränderung der Granularität aller Zelltypen nach 20stündiger Partikelexposition Durchflusszytometrische Analyse der zellulären Granularität nach Exposition mit aqua dest. (Kontrolle, linke Spalte), 30 µg/ml WC 100-Partikeln (mittlere Spalte) bzw. 109 Latexpartikeln/ml (rechte Spalte). Die abgebildeten Ergebnisse stammen jeweils aus einem Experiment mit 10.000 Zellen/Probe

Monozytenzelllinie (THP-1)

Lungenepithelzellen (A549)

Monozyten Monozyten

Monozyten

Primäre Monozyten und Lymphozyten (PBMC) aus Spenderblut

37

Abb. 3.9 : Granularitätsänderungen in Abhängigkeit von unterschiedlichen Partikelgrößen und Zelltypen sowie deren Beeinflussbarkeit durch Cytochalasin D Veränderungen der zellulären Granularität (gemessen als SSC im Durchflusszytometer), dargestellt als Prozent der jeweiligen Kontrolle mit und ohne Cytochalasin D (2µM für PBMC und THP-1, 5 µM für A549) Die Messungen erfolgten nach einer 20stündigen Inkubationszeit mit 30µg/ml WC 100 bzw. WC 10. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 4 unabhängigen Experimenten als Mittelwert und Standardfehler in Prozent der Kontrolle. * kennzeichnet den signifikanten Einfluss von Cytochalasin D (p<0,05) Die Daten zu dieser Abbildung wurden erhoben mit Unterstützung von Wibke Busch, UFZ Leipzig und dürfen mit ihrer freundlichen Genehmigung hier abgebildet werden.

A549 THP-1 PBMC

Sid

e Sc

atte

r Wer

t [%

Kon

trolle

]

0

200

400

600

800ohne Cytochalasin Dmit Cytochalasin DKontrolle

*

WC 100

A549 THP-1 PBMC

Side

Sca

tter W

ert [

% K

ontro

lle]

0

100

200

300

400ohne Cytochalasin Dmit Cytochalasin DKontrolle

*

*

WC 10

In Abbildung 3.9 werden die Granularitätsänderungen anhand der drei Zellarten noch

einmal quantitativ dargestellt. Die hier nicht dargestellten WC-Co-Partikel zeigten in

Bezug auf das Ausmaß ihrer Effekte ein sehr ähnliches Verhalten wie die WC 100-

Partikel. Bei den PBMC beispielsweise betrug der Mittelwert des SSC aus vier

unabhängigen Experimenten 595,90% vs. 573, 97% der Kontrolle für 30 µg/ml WC 100

bzw. 33 µg/ml WC-Co. Anhand der beiden Diagramme in Abb. 3.9 ist zu erkennen,

dass die relativen Änderungen der Granularität bei den WC 10-Partikeln deutlich

geringer ausfielen als bei den WC 100-Partikeln.

Der Einsatz des Phagozytosehemmers Cytochalasin D diente der Untersuchung von

zwei Aspekten der partikelspezifischen Effekte. Zum Einen ermöglicht er die Unter-

scheidung zwischen Granularitätsänderungen durch die extrazelluläre Bindung von

Partikeln an die Zellmembran und solchen, die durch Partikelaufnahme verursacht

werden. Zum Zweiten hemmt Cytochalasin D aktin-abhängige Aufnahmeprozesse

und lässt so einen Schluss auf mögliche partikel- oder zellspezifische Aufnahme-

mechanismen zu. Es zeigte sich, dass bereits Cytochalasin D allein zu leichten

Veränderungen der Granularität führte (Daten nicht gezeigt). Daher wurden in den

weiterführenden Versuchen die Zellen der Kontrollgruppen auch mit der

entsprechenden Konzentration Cytochalasin D im Nährmedium behandelt. Bei den

A549-Zellen wurden 5 µM Cytochalsin zugegeben, bei den PBMC und den THP-1-

Zellen 2 µM. Das Cytochalasin D führte nur bei den primären Monozyten zu einer

38

signifikanten Verminderung der partikelinduzierten Granularitätsänderungen. Die

Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Abbildung 3.9. dargestellt. Bei den PBMC

verringerten sich die Granularitätsänderungen signifikant, für WC 100 um 331,3% und

für WC 10 um 130,8 % auf 107,5% der Kontrolle. Bei den THP-1 verminderte das

Cytochalasin D die Granularitätsänderungen um 48,4% bzw. 14.2% bei WC 100 bzw.

WC 10. Am geringsten war der Effekt bei den Epithelzellen (Differenz von 24,9% bzw.

4,7% für WC 100 bzw. WC 10).

Um zu klären, inwiefern die Wirkungen des Cytochalasin D abhängig waren von der

eingesetzten Konzentration, wurde an den PBMC beispielhaft auch die Wirkung

höherer Cytochalasin D-Konzentrationen (5µM und 10µM) untersucht. Hierbei zeigte

sich, dass die Fähigkeit zur Phagozytosehemmung bei 2 µM Cytochalasin D noch nicht

voll ausgeschöpft war. In Abbildung 3.10 sind die Ergebnisse für die drei Partikel-

suspensionen dargestellt.

Abb. 3.10: Die Granularität der PBMC nach 1, 3 bzw. 20 Stunden Inkubationszeit mit den Partikeln und verschiedenen Konzentrationen Cytochalasin D PBMC wurden mit A) 30 µg/ml WC 100, B) 30 µg/ml WC 10 und C) 33 µg/ml WC-Co inkubiert. Variiert wurden die Inkubationszeiten, die Cytyochalasin-Konzentrationen und eine Gruppe wurde mit 100 pg/ml LPS vorstimuliert. Dargestellt sind die Daten aus einer Einzelmessung als Mediane des SSC

WC 100 WC 10 WC-Co

Konzentration Cytochalasin D [µM]2 5 10

Med

ian

SSC

0

50

100

150

200

250

300

350

Konzentration Cytochalasin D [µM]2 5 10

Med

ian

SSC

0

100

200

300

Konzentration Cytochalasin D [µM]2 5 10

Med

ian

SS

C

0

100

200

3001 h unstimuliert3 h unstimuliert20 h unstimuliert20 h stimuliert

WC 100 WC 10

Konzentration Cytochalasin D [µM]0 2 5 10

Med

ian

SSC

0

200

400

600

800

Konzentration Cytochalasin D [µM]0 2 5 10

Med

ian

SS

C

0

200

400

600

800

Konzentration Cytochalasin D [µM]0 2 5 10

Med

ian

SSC

0

200

400

600

800 1 h unstimuliert3 h unstimuliert20 h unstimuliert20 h stimuliert

WC-Co

39

Abb. 3.11: Granularitätsänderungen durch unterschiedliche Partikelkonzentrationen Für die A549- und THP-1-Zellen stammen die Daten aus einer Einzelmessung. Für die PBMC sind die zusammengefassten Ergebnisse aus drei unabhängigen Versuchen als Mittelwert und Standardabweichung dargestellt. Abgebildet sind die Mediane des SSC. Für die WC 100 bzw. die WC 10 Partikel gelten stets die erstgenannten, für die WC-Co-Partikel die zweitgenannten Konzentrationen.

WC 100 WC 10 WC-Co

Med

ian

SSC

0

200

400

600

800

Kontrolle15 bzw. 16,5 µg/ml30 bzw. 33 µg/ml

PBMC

WC 100 WC 10 WC-Co

Med

ian

SSC

0

50

100

150

200

250

Kontrolle6 bzw. 6,6 µg/ml30 bzw. 33 µg/ml

THP-1

WC 100 WC 10 WC-Co

Med

ian

SSC

0

50

100

150

200

250

Kontrolle7,5 bzw. 8,25 µg/ml15 bzw. 16,5 µg/ml30 bzw. 33 µg/ml

A549

3.2.2 Untersuchungen zu verschiedenen Einflussfaktoren auf die Partikeleffekte

Partikelkonzentration

Bei allen Zellen zeigten sich mit steigenden Partikelkonzentrationen zunehmende

Granularitätsveränderungen (s. Abb. 3.11).

Inkubationszeit

An den PBMC wurde weiterhin untersucht, inwiefern die Granularitätsänderungen

abhängig von der Inkubationszeit waren, wofür die Partikeleffekte nach Inkubations-

zeiten von 1, 3 und 20 Stunden untersucht wurden. Mit steigenden Inkubationszeiten

erhöhte sich der SSC zunehmend. In Abbildung 3.12 ist dieser Zusammenhang

graphisch dargestellt, wobei die PBMC auf CD14-positive Monozyten gegatet wurden,

so dass nur die Granularität für diese Zellfraktion dargestellt ist. Die Verschiebung der

Kurven nach rechts, also zu höheren SSC-Werten, zeigt, dass die Zellen stärker

granulär erschienen, je länger sie mit den Partikeln inkubiert wurden. Die Granularität

war bei Exposition mit 30 µg/ml WC 100 nach 1Stunde auf 193%, nach 3 Stunden auf

460% und nach 20 Stunden auf 792% angestiegen. 30 µg/ml WC 10 erhöhten die

Granularität nach 1 Stunde auf 114%, nach 3 Stunden auf 148% und nach 20 Stunden

auf 341% der jeweiligen Kontrolle. Die WC-Co-Partikel erhöhten die SSC-Mediane auf

236, 554 und 641% der jeweiligen Kontrollen nach einer Inkubationszeit von respektive

1, 3 und 20 Stunden. Es zeigte sich auch hier, dass die Effekte bei den WC 100-Partikeln

im Vergleich zu den WC 10-Partikeln wesentlich stärker ausfielen.

40

In Abb. 3.10 wurden die Ergebnisse der Experimente mit unterschiedlichen

Cytochalasin-Konzentrationen und verschiedenen Inkubationszeiten zusammen-

getragen. Es sind auch hier die bereits beschriebenen partikelspezifischen Effekte zu

erkennen. Die Granularitätsanderungen sind bei den WC 100 und den WC-Co-

Partikeln deutlicher ausgeprägt als bei den WC 10-Partikeln. Eine längere Inkubations-

zeit beeinflusste trotz des Einsatzes von Cytochalasin D die Ausprägung der

Granularitätsänderungen. Höhere Konzentrationen als die eingesetzten 2 µM Cyto-

chalasin D hatten einen additiv hemmenden Effekt. Die Unterschiede zwischen 2, 5

und 10 µM Cytochalasin D fielen bei den Suspensionen mit den größeren

Primärpartikeln (WC 100 und WC-Co) stärker aus als bei den WC 10-Partikeln.

Stimulation mit Endotoxin

Schließlich wurde der Einfluss einer Vorstimulation mit LPS auf die Granularität der

PBMC untersucht. Die erste Frage war, ob bereits eine unspezifische Stimulation der

Sekretion von Zytokinen, wie sie für LPS auf PBMC bekannt ist, zu einer signifikanten

Granularitätsänderung führt. Außerdem wurde beurteilt, inwiefern das LPS die Zell-

Partikel-Interaktionen beeinflusst und welchen Einfluss unterschiedliche Versuchs-

parameter auf stimulierte Zellen haben. Die PBMC wurden eine Stunde vor der

Partikelauftragung mit 100 pg/ml LPS stimuliert. Das LPS veränderte die Granulari-

tätswerte der Monozyten in der nicht partikelexponierten Kontrollgruppe nur

A) B) C)

Abb. 3.12: Veränderungen der Granularität von PBMC in Abhängigkeit von unterschiedlichen Partikeln und Inkubationszeiten Dargestellt sind die SSC-Werte einer durchflusszytometrischen Analyse der PBMC eines Spenders. Es sind nur die CD14-positiven Zellen dargestellt. Die untersuchten Inkubationszeiten mit A) 30 µg/ml WC 100, B) 30 µg/ml WC 10 und C) 33 µg/ml WC-Co betrugen 1 Stunde (hellgrau), 3 Stunden (mittelgrau) und 20 Stunden (dunkelgrau). Die Kontrolle ohne Partikel ist schwarz dargestellt (1 Stunde Inkubation)

41

Abb. 3.13 : Granularitätsveränderungen an unstimulieren und mit LPS vorstimulierten PBMC eines Spenders nach Exposition mit 30 µg/ml WC 100 Dargestellt sind die Ergebnisse der Durchflusszytometrie für mononukleäre Zellen, die entweder mit dem Puffer (linke Spalte) oder 30µg/ml WC 100 (rechte Spalte) für 20 Stunden inkubiert wurden. Eine Gruppe der PBMC wurde vor der Exposition für 1 Stunde mit 100 pg/ml LPS stimuliert (B)

Unstimulierte Zellen

A)

Ohne Partikel 30µg/ml WC 100

CD 14 FITC CD 14 FITC

CD 14 FITC CD 14 FITC

vorstimuliert mit 100 pg/ml LPS

B)

schwach. Bei drei Spendern stiegen die SSC-Werte im Mittel auf 142% der Kontrolle.

Nach Partikelexposition war auch in den stimulierten Zellen eine Änderung der

Granularität analog zu den unstimulierten Zellen zu erkennen, wie es in Abb. 3.13

exemplarisch anhand WC 100 dargestellt wurde. In Relation zu den unstimulierten

Zellen verringerte die Vorstimulation das Ausmaß der Granularitätsänderungen

deutlich: bei den WC 100-Partikeln von 645% auf 467% der Kontrolle, bei den WC 10-

Partikeln von 341% auf 210% der Kontrolle und bei den WC-CoPartikeln von 641% auf

326% der Kontrolle (Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten).

42

3.3 Einfluss der Partikel auf die Zellvitalität

Der Einfluss der Partikelsuspensionen auf die Vitalität der Zellen wurde mittels des

MTT-Tests untersucht. In Vorversuchen konnte nachgewiesen werden, dass die

Partikel im zellfreien Medium mit den MTT-Testsubstanzen die spektralphoto-

metrische Messung nicht beeinflussten (Daten nicht gezeigt). Die Darstellungen der

Resultate der Vitalitätsuntersuchungen beziehen sich auf die Vitalitätswerte der mit

dem Puffer exponierten Kontrollen. Die Inkubation mit unterschiedlichen Konzen-

trationen der Partikelsuspensionen erfolgte für 24 Stunden bzw. für die A549-Zellen

und die PBMC noch zusätzlich für 72 Stunden.

3.3.1 Partikeleffekte auf die A549-Zellen

Bei den Lungenepithelzellen zeigten die untersuchten Partikelarten deutlich konzen-

trationsabhängige, vitalitätsmindernde Effekte, die nach Exposition mit WC-Co-

Partikeln am stärksten ausfielen (s. Abb. 3.14). So senkten beispielsweise 0,33µg/ml

WC-Co die Vitalität von A549-Zellen auf 90% (p = 0,03). Bei WC 100 wirkte diese

Konzentration noch nicht toxisch (99,7%, p=0,94), bei WC 10 nur nach 72 Stunden

Inkubationszeit (89,1%, p=0,01). Eine Verlängerung der Expositionszeit von 24 auf 72

Stunden führte im Allgemeinen nicht zu einer Verstärkung der toxischen Effekte. Bei

den WC-Co-Partikeln war die toxische Wirkung nach der längeren Inkubation sogar

etwas geringer (bei 33 µg/ml 41% nach 24 Stunden vs. 54,2% nach 72 Stunden). Diese

Ergebnisse sind in Abbildung 3.14 dargestellt. Eine Stimulation der Zellen mit 1 ng/ml

TNF-α beeinflusste die Partikeleffekte nicht (Daten nicht gezeigt).

Bei den obigen Ausführungen wurde stets die Massekonzentration der Partikel

betrachtet, wonach die WC 10-Partikel einen stärkeren toxischen Effekt ausübten als

die WC 100-Partikel. Das änderte sich jedoch, wenn die Oberflächenkonzentrationen

als Bezugsparameter gewählt wurden (s. Abb. 3.14 untere Reihe). Dann zeigte sich

nach 24 Stunden Inkubationszeit eine leicht höhere Toxizität von WC 100 im Vergleich

zu WC 10 (s. Abb. 3.14B). Nach 72 Stunden war kein Unterschied zwischen den beiden

Partikelarten WC 100 und WC 10 mehr detektierbar (s. Abb. 3.14C). Unabhängig vom

Konzentrationsmaß beeinträchtigten die WC-Co-Partikel am stärksten die Vitalität.

43

Massekonzentration [µg/ml]0,33 3,3 6,6 16,5 33

Vita

lität

[% K

ontro

lle]

0

20

40

60

80

100

120

140 24 h72 h

###

#

##

### #

Massekonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30

0

20

40

60

80

100

120

140 24 h72 h

##

#######

WC 10 WC-Co

Massekonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30

Vita

lität

[% K

ontro

lle]

0

20

40

60

80

100

120

140 24 h72 h

#####

WC 100

Abb. 3.14 Ergebnisse des MTT-Tests an unstimulierten A549-Zellen Obere Zeile: Darstellung der Zellvitalität als % der mit dem jeweiligen Puffer exponierten Zellen nach Inkubation für 24 bzw. 72 h. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten als Mittelwerte und Standardfehler. Signifikante Verminderungen sind durch # gekennzeichnet (p<0,05) Untere Zeile: Vergleich der Darstellung der Vitalität in Bezug auf unterschiedliche Konzentrationsmaße A) Massenkonzentration B) und C) Oberflächenkonzentration mit unterschiedlicher Inkubationszeit. Aufgetragen sind die Messwerte als Mittelwerte aus 3 unabhängigen Experimenten.

nach 72 Stunden Inkubation

Oberflächenkonzentration [cm2/ml]

0,01 0,1 1 10 1000

20

40

60

80

100

120WC 100WC 10WC-Co

24 Stunden Inkubation

Oberflächenkonzentration [cm2/ml]0,01 0,1 1 10 100

0

20

40

60

80

100

120WC 100WC 10WC-Co

B) 24 Stunden Inkubation

Massekonzentration [µg/ml]0 5 10 15 20 25 30 35

Vita

lität

[% K

ontro

lle]

0

20

40

60

80

100

120WC 100WC 10WC-Co

A) C)

3.3.2 Partikeleffekte auf die THP-1-Zellen

Auf die Monozytenzelllinie bewirkten alle untersuchten Konzentrationen der drei

Partikelsuspensionen statistisch signifikante Vitalitätsminderungen. Am stärksten war

dieser Effekt, wie auch bei den A549-Zellen, nach Exposition mit der WC-Co-

Partikelsuspension. Während bei 33 µg/ml WC-Co-Partikelsuspension nur noch 28%

(p < 0,001) der Zellen vitale Reaktionen zeigten, waren es bei WC 100 noch 68% (p <

0,005) und bei WC 10 noch 74% (p < 0,001) der Zellen. Bei der Auftragung der

Oberflächenkonzentrationen der Partikel gegen die Vitalität änderten sich die relativen

Partikeleffekte nicht. WC-Co zeigte weiterhin die stärksten toxischen Effekte, während

WC 100 nur leicht und WC 10 noch weniger toxisch wirkte, wie in Abbildung 3.15

dargestellt.

44

3.3.3 Partikeleffekte auf die PBMC

Bei den PBMC zeigten die WC 10-Partikel die stärksten toxischen Effekte (s. Abb. 3.16).

Bereits die niedrigste eingesetzte Konzentration von 0,3 µg/ml verringerte die

Zellvitalität nach 24 Stunden auf 93% (p = 0,02). Bei der höchsten untersuchten

Massenkonzentration zeigten bei den WC 10-Partikeln noch 56% (p < 0,001) der Zellen

vitale Zeichen, bei WC-Co waren es 77% (p = 0,001) (s. Abb. 3.16A). Bei der Auftragung

der Vitalität gegen die Oberflächenkonzentrationen der Partikel zeigten die WC-Co-

Partikel dagegen eine stärkere toxische Wirkung als die WC 10-Partikel (s. Abb. 3.16B).

Die WC 100-Partikel bewirkten keine signifikanten Veränderungen in der Vitalität der

Zellen. Sie betrug nach 24stündiger Inkubation mit 30 µg/ml noch 95% (p = 0,5).

Bei einer Vorstimulation der PBMC mit 100 pg/ml LPS wirkten die WC 10-Partikel

ebenfalls vitalitätsmindernd, was für die anderen Partikelsuspensionen nicht der Fall

war (Daten nicht gezeigt). Analog zu den A549-Zellen war der toxische Effekt der WC-

Co-Partikel nach 72 Stunden weniger stark ausgeprägt als nach 24 Stunden. 33 µg/ml

der Partikelsuspension verringerten die Vitalität nach 24 Stunden auf 77% (p = 0,001)

und nach 72 Stunden auf 88,3% (p = 0,51). CoCl2 und WC-Co unterschieden sich nicht

signifikant in ihrer vitalitätsmindernden Wirkung (s. Abb. 3.16C). Beide Suspensionen

verringerten jedoch in den beiden höchsten Konzentrationen die Vitalität

unstimulierter und stimulierter PBMC im Vergleich zur Kontrolle signifikant.

Massenkonzentration [µg/ml]0 5 10 15 20 25 30 35

Vita

lität

[% K

ontro

lle]

0

20

40

60

80

100

120

WC 100WC 10WC-Co

A)

Oberflächenkonzentration [cm2/ml]0,01 0,1 1 10 100

Vita

lität

[% K

ontro

lle]

0

20

40

60

80

100

120

WC 100WC 10WC-Co

B)

Abb. 3.15: Partikeleffekte auf die Vitalität der THP-1-Zellen Die Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen der Partikelsuspensionen (WC 100, WC 10 und WC-Co) exponiert.. In A) sind Vitalitätswerte gegen die Massenkonzentration und in B) gegen die Oberflächenkonzentration aufgetragen. Dargestellt sind die Mittelwerte der zusammengefassten Ergebnisse aus einer Einzelmessung (n=6). In A) sind die Standardabweichungen aufgetragen. Alle Messpunkte waren statistisch signifikant zur Kontrolle (p< 0,05). Auf die Markierung der Signifikanz wurde der besseren Übersichtlichkeit wegen verzichtet.

45

Abb. 3.16: Ergebnisse des MTT-Tests nach Exposition unstimulierter PBMC mit Partikeln und CoCl2 obere Reihe: Einflüsse der Partikel auf die PBMC nach 24 bzw. 72 Stunden Inkubation. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 5 unabhängigen Versuchen als Mittelwerte und Standardabweichungen, signifikante Verminderungen (p < 0,05) sind mit einem # gekennzeichnet; untere Reihe: In A und B sind die Messwerte für die 24stündige Inkubation mit allen drei Partikelarten zusammengefasst dargestellt. In A) erfolgte die Auftragung der Vitalität gegen die Massenkonzentration und in B) gegen die Oberflächenkonzentration. In C) sind vergleichend die Vitalitätswerte nach 24stündiger Exposition von WC-Co bzw. CoCl2 auf unstimulierte PBMC aufgezeigt. Dargestellt sind hier die zusammengefassten Ergebnisse aus 5 unabhängigen Versuchen als Mittelwert und Standardabweichung.

Massekonz. WC-Co [µg/ml] bzw. Kobaltäquivalent0,33 3,3 6,6 16,5 33

Vita

lität

[% K

ontro

lle]

40

60

80

100

120

140

WC-CoCoCl2

Massenkonzentration [µg/ml]0 5 10 15 20 25 30 35

Vita

lität

[% K

ontro

lle]

50

60

70

80

90

100

110

WC 100WC 10WC-Co

A)

Oberflächenkonzentration [cm2/ml]

0,01 0,1 1 10 100

Vita

lität

[% K

ontro

lle]

50

60

70

80

90

100

110

WC 100WC 10 WC-Co

B) C)

Massenkonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30

Vita

lität

[% K

ontro

lle]

0

20

40

60

80

100

120

14024 h72 h

WC 100

Massenkonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30

Vita

lität

[% K

ontro

lle]

0

20

40

60

80

100

120

14024 h72 h

# #

##

#

###

WC 10

Massenkonzentration [µg/ml]0,33 3,3 6,6 16,5 33

Vita

lität

[% K

ontro

lle]

0

20

40

60

80

100

120

14024 h72 h

# #

#

WC-Co

3.4 Immunmodulatorische Effekte der Wolframcarbidpartikel

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern A549- und THP-1-

Zellen sowie PBMC auf die Exposition mit nanoskaligen Wolframcarbidpartikeln mit

der Bildung von Zytokinen bzw. Chemokinen reagierten. Im Rahmen vorbereitender

Versuche wurden unterschiedliche Partikelkonzentrationen für 24 Stunden mit

definierten Verdünnungsreihen von Zytokinen inkubiert und anschließend die

Zytokinkonzentrationen im ELISA gemessen. Die Ergebnisse sind beispielhaft für

MCP-1 in Abb. 3.17 aufgeführt. Die Partikel bewirkten durchgängig eine Verringerung

der gemessenen Zytokinkonzentration. Dieser Effekt war vor allem im Bereich höherer

Zytokinkonzentrationen zu erkennen. Es war keine Abhängigkeit der Partikeleffekte

von den eingesetzten Partikelkonzentrationen zu detektieren. Da die Zytokin-

konzentrationen gleichmäßig unterschätzt wurden, wurden die Partikel-Zytokin-

Interaktionen bei der Interpretation der Daten berücksichtigt.

46

Abb. 3.17: Untersuchung der Partikeleffekte auf die Zytokinkonzentrationen im ELISA Nach 24stündiger Inkubation verschiedener Partikelkonzentrationen von WC 100, WC 10 und WC-Co mit einer Standard-Verdünnungsreihe (jeweils 1:2 mit Medium verdünnt) wurden die Zytokinkonzen-trationen bestimmt. Dargestellt sind die Ergebnisse aus einer Einzelmessung in Triplikaten als Mittelwerte der Zytokinkonzentrationen in pg/ml.

Standard-Verdünnungen1 2 3 4 5 6

MC

P-1

[pg/

ml]

0

2x103

4x103

6x103

8x103

104

Standardreihe30 µg/ml WC 1006 µg/ml WC 1000,3 µg/ml WC 100

WC 100

Standard-Verdünnungen1 2 3 4 5 6

0

2x103

4x103

6x103

8x103

104

Standardreihe30 µg/ml WC 106 µg/ml WC 100,3 µg/ml WC 10

WC 10

Standard-Verdünnungen1 2 3 4 5 6

0

2x103

4x103

6x103

8x103

104

Standardreihe33 µg/ml WC-Co6,6 µg/ml WC-Co0,33 µg/ml WC-Co

WC-Co

3.4.1 Reaktionen der A549-Zellen

Es wurde untersucht, wie die Epithelzellen auf die Exposition mit unterschiedlichen

Konzentrationen der Partikelsuspensionen für 24 bzw. 72 Stunden reagierten.

Gemessen wurden die Konzentrationen von IL-6 und MCP-1 im Überstand der

Zellkultur. Am deutlichsten waren die Effekte des WC 10 zu beobachten, das eine

Erhöhung der MCP-1-Konzentration bewirkte (bei 15µg/ml auf 134% der Kontrolle,

p=0,03). Die Steigerung der MCP-1-Sekretion nach Exposition mit WC 100-Partikeln

fiel dagegen deutlich schwächer aus. 30 µg/ml der Partikelsuspension bewirkten

lediglich eine Steigerung der Zytokinkonzentration auf 112% der Kontrolle (p < 0,002)

(s. Abb. 3.18). Die Exposition mit WC-Co für 24 Stunden hingegen verringerte die

MCP-1-Konzentration bereits ab der niedrigsten Konzentration (0,33µg/ml, 94%, p <

0,05). Nach 72 Stunden war dieser hemmende Effekt nicht mehr nachweisbar (s. Abb.

3.18). Keines der Partikel führte zu signifikanten Beeinflussungen der IL-6-Produktion

(Daten nicht gezeigt). Die Stimulation der A549-Zellen mit 1 ng/ml TNF-α vor der

Partikelexposition hatte nur einen geringen Einfluss auf die Partikeleffekte. Lediglich

die Verminderung der MCP-1-Konzentration nach WC-Co-Exposition fiel stärker aus

als bei den unstimulierten Zellen. Nach 24 Stunden Inkubation mit 33 µg/ml WC-Co

betrug die MCP-1-Konzentration bei unstimulierten Zellen noch 79% und bei den

stimulierten nur noch 51% der Kontrolle (p < 0,001).

47

Massenkonzentration [µg/ml]0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33

MC

P-1

[% K

ontro

lle]

0

50

100

150

200WC 100WC-Co

##

#

#

MCP-1

Massenkonzentration [µg/ml]0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33

TNF-

α [%

Kon

trolle

]

0

50

100

150

200

250

300

350WC 100WC-Co

#####

*

*

TNF-α

Abb. 3.19: Partikeleffekte von WC 100 und WC-Co auf die Konzentrationen von MCP-1 und TNF-α im Kulturüberstand von THP-1-Zellen Zytokinkonzentrationen im ELISA nach Exposition von THP-1 für 24 Stunden. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus einer Einzelmessung (n=6). Sigifikante. Erhöhungen sind mit *, signifikante Verminderungen mit # gekennzeichnet (p<0,05)

3.4.2 Reaktionen der THP-1-Zellen

Bei den THP-1 Zellen wurde die Konzentration von MCP-1 und TNF-α nach

24stündiger Exposition mit den Partikelsuspensionen untersucht. Die Exposition mit

WC 10-Partikeln hatte keinen Einfluss auf die Sekretion der Zytokine (Daten nicht

gezeigt). WC 100-Partikel beeinflussten die MCP-1-Konzentration ebenfalls nicht.

Allerdings erhöhten sie die Produktion des TNF-α signifikant (bei 30 µg/ml auf 247%

der Kontrolle, p < 0,001). WC-Co hingegen verminderte die Bildung der untersuchten

Zytokine. Bei der MCP-1-Konzentration erreichte dieser inhibitorische Effekt

statistische Signifikanz bereits ab einer Partikelkonzentration von 3,3 µg/ml (71% der

Kontrolle, p = 0,001). Der Einfluss auf die TNF-α-Produktion fiel deutlich geringer aus

(bei 33µg/ml auf 81% der Kontrolle, p = 0,003). Die Ergebnisse sind in Abbildung 3.19

zusammengefasst.

Abb. 3.18: Beeinflussung der Produktion von MCP-1 in A549-Zellen durch die Partikel Darstellung der im ELISA gemessenen Zytokinproduktion. Die Zellen wurden für 24 bzw. 72 Stunden mit den Partikeln inkubiert. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 3 unabhängigen Experimenten als Mittelwert und Standardfehler. Signifikant erhöhte Werte im Vergleich zur Kontrolle wurden mit *, signifikant verringerte Werte mit # gekennzeichnet (p < 0,05)

Massenkonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30

0

20

40

60

80

100

120

140

160

18024 h72 h

* *

**

* *

WC 10

Massenkonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30

MC

P-1

[% K

ontro

lle]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

18024 h 72 h

* * * * *

WC 100

Massenkonzentration [µg/ml]0,33 3,3 6,6 16,5 33

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

24 h72 h

# # # #

WC-Co

48

3.4.3 Reaktionen der PBMC

Die Monozyten und Leukozyten, die aus dem venösen Blut anonymer Blutspender

isoliert wurden, zeigten zum Teil sehr starke Reaktionen auf die 24stündige bzw.

72stündige Exposition mit den Partikelsuspensionen. Es wurden die Partikeleffekte auf

die Sekretion der Zytokine und Chemokine IL-6, MCP-1, IFN-γ und TNF-α untersucht.

In Abbildung 3.20 sind die Auswirkungen der Partikelexposition auf IL-6, MCP-1 und

TNF-α zusammenfassend dargestellt. Da keine der Partikelsuspensionen einen

Einfluss auf die Konzentration des Zytokins IFN-γ ausübte, ist dieses Zytokin nicht

abgebildet. Insgesamt zeigten die WC 100-Partikel die stärksten Effekte, gefolgt von

WC-Co und WC 10. Die Partikelexposition erhöhte nach 24 Stunden die Freisetzung

von IL-6 und MCP-1 sehr stark und zunehmend mit steigender Partikelkonzentration.

Bei den höchsten WC-Co-Konzentrationen kam es bei MCP-1 wieder zu einem Abfall

der Zytokinkonzentration. Die TNF-α−Freisetzung wurde durch WC 100 und die WC-

Co deutlich, durch WC 10 jedoch nicht beeinflusst. Die Partikeleffekte auf IL-6 und

MCP-1 zeigten keine Abhängigkeit von den unterschiedlichen Inkubationszeiten.

Daher werden nur die Ergebnisse der Experimente dargestellt, bei denen die Zellen für

24 Stunden mit den Partikeln exponiert wurden. Bei TNF-α war nach 72stündiger

Exposition kein Partikeleffekt mehr nachweisbar. Das Ausmaß der Zytokinkonzentra-

tionsänderungen unterlag starken interindividuellen Schwankungen.

Einfluss der individuellen Disposition auf die Partikeleffekte

Zur Verdeutlichung der Abhängigkeit der Partikeleffekte von der individuellen

Disposition der Spender wurden die PBMC verschiedener Spender an einem Tag mit

allen Partikelsuspensionen exponiert. In Abbildung 3.21 sind exemplarisch die

Ergebnisse für zwei Spender und das Zytokin IL-6 aufgeführt. Die PBMC beider

Spender wurden am selben Tag präpariert und mit den gleichen Chargen der Partikel

exponiert. Während WC 10 bei Spender 125 mit Abstand die stärksten Effekte in Bezug

auf die IL-6-Konzentration auslöste (s. Abb. 3.21A), zeigten sich bei Spender 126 keine

signifikanten Unterschiede im Effekt der unterschiedlichen Partikelarten (s. Abb.

3.21B). Auch die Stärke der Zytokinproduktion unterschied sich stark im Vergleich der

beiden Spender. Bei Spender 125 erhöhten 30µg/ml WC 10 die IL-6-Konzentration

beispielsweise auf 4821% der Kontrolle. Dieselbe Partikelkonzentration bewirkte bei

49

Abb. 3.21 Vergleich der Partikeleffekte auf die IL-6-Konzentration an zwei Spendern Darstellung der IL-6-Konzentration im Überstand der Zellkultur. Die PBMC von A) Spender 125 und B) Spender 126 wurden jeweils für 24 Stunden mit den Partikelsuspensionen inkubiert. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus drei Bestimmungen als Mittelwerte und Standardabweichung

Massenkonzentration [µg/ml]0,3 / 0,33 3 / 3,3 6 / 6,6 15 / 16,5 30 / 33

IL-6

[% K

ontro

lle]

0

1000

2000

3000

4000WC 100WC 10WC-Co

A)

Massenkonzentration [µg/ml]0,3 / 0,33 3 / 3,3 6 / 6,6 15 / 16,5 30 / 33

IL-6

[% K

ontro

lle]

0

50

100

150

200

250

300

350WC 100WC 10WC-Co

B)

Spender 126 eine wesentlich geringere Erhöhung der IL-6-Konzentration auf 481% der

Kontrolle (s. Abb. 3.21).

Abb. 3.20: Zytokinkonzentrationen (IL-6, MCP-1, TNF-α) nach Partikelexposition auf PBMC Zytokinproduktion unstimulierter PBMC, die für 24 Stunden mit Partikelsuspensionen in verschiedenen Konzentrationen exponiert wurden. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus sechs unabhängigen Experimenten (jeweils in Triplikaten). Die Box-Plots repräsentieren den Median und den Interquartilabstand. Die Ergebnisse wurden dargestellt als Prozent der Kontrollen (100%), die y-Achse ist zur besseren Darstellung logarithmisch eingeteilt. * bezeichnet eine signifikante Erhöhung der Zytokinkonzentration (p<0,05).

0,3 3 6 15 30101

102

103

104

105

106

***

0,3 3 6 15 30101

102

103

104

105

106

WC 10

Massenkonzentration [µg/ml]

0,3 3 6 15 30101

102

103

104

105

0,3 3 6 15 30101

102

103

104

105

106

***

*

*

WC 100

MC

P-1

[% K

ontr

olle

] IL

-6

[% K

ontr

olle

]

Massenkonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30

101

102

103

104

105

TNF-

α

[% K

ontr

olle

]

0,3 3 6 15 30101

102

103

104

105

106

****

*

0,33 3,3 6,6 16,5 33101

102

103

104

105

*

*

**

WC-Co

0,33 3,3 6,6 16,5 33100

101

102

103

104

Massenkonzentration [µg/ml]0,33 3,3 6,6 16,5 33

101

102

103

104

105

50

3.4.4 Untersuchungen zum Mechanismus der Partikeleffekte

3.4.4.1 Reaktion von PBMC auf inerte Latexpartikel

Es wurde untersucht, ob eine Exposition von PBMC mit Latexpartikeln die Zytokin-

sekretion der Zellen beeinflusst. Dafür wurden die gleichen Latexpartikel wie bei den

durchflusszytometrischen Untersuchungen verwendet. Die Partikeldichte betrug bei

der höchsten eingesetzten Massenkonzentration etwa 1- 2x109 Partikeln/ml. Ihre

Berechnung erfolgte nach Teeguarden et al. (2007), wobei die Partikeldurchmesser

berücksichtigt wurden, die die Größe der Partikelagglomerate beschreiben (s. Tab. 2.2).

Die Latexpartikel führten bei drei unabhängigen Experimenten zu keiner signifikanten

Erhöhung der Produktion von IL-6, MCP-1 oder TNF-α. Nach der Exposition mit

109Latexpartikeln/ml betrug die IL-6 Konzentration 104% der Kontrolle (p = 0,58), die

MCP-1-Konzentration 139% der Kontrolle (p = 0,19) und die TNF-α-Konzentration 97%

der Kontrolle (p = 0,58).

3.4.4.2 Einfluss einer Vorstimulation mit LPS

Das Ausgangsniveau der Zytokinkonzentration war im Vergleich zu unstimulierten

Zellen erwartungsgemäß stark erhöht, wenn die PBMC eine Stunde vor der Partikel-

exposition mit 100 pg/ml LPS stimuliert wurden (Daten nicht gezeigt). Nach

Exposition stimulierter Zellen mit WC 100- und WC 10-Partikeln zeigten sich die

Zytokinkonzentrationen nicht zusätzlich erhöht. Lediglich die WC-Co-Partikel führten

auch bei vorstimulierten Zellen zu einer vermehrten Produktion von IL-6 und TNF-

α. Eine 24stündige Inkubation stimulierter PBMC mit 16,5 µg/ml WC-Co erhöhte die

Konzentration von IL-6 auf 151 % (p = 0,02) und die des TNF-α auf 458% der Kontrolle

(p<0,01). Die MCP-1-Konzentration im Überstand mit 33 µg/ml WC-Co exponierter

stimulierter Zellen sank hingegen nach 24 Stunden auf 47% der Kontrolle (p = 0,005).

Diese Ergebnisse sind in Abbildung 3.22 dargestellt.

51

3.4.4.3 Einfluss von Cobaltionen auf den Effekt der WC-Co-Partikel

Um den Anteil der Cobaltionen an den Partikeleffekten des WC-Co auf die PBMC zu

untersuchen, wurden die Zellen von 5 Spendern für 24 Stunden mit WC-Co und CoCl2

inkubiert und die Zytokinkonzentration von IL-6, MCP-1 und TNF-α im Überstand

ermittelt. Die eingesetzten Konzentrationen an Cobaltchlorid entsprachen den Cobalt-

konzentrationen in den jeweiligen WC-Co-Suspensionen (z.B. 51µM Co bei 33µg/ml

WC-Co). Die Exposition der PBMC mit Cobaltchlorid führte im Vergleich zu WC-Co-

Partikeln nicht zu signifikanten Veränderungen der Zytokin-bzw. Chemokin-

konzentrationen (s. Abb. 3.23).

Abb. 3.23: Vergleich der Wirkung von CoCl2 und WC-Co-Partikeln auf unstimulierte PBMC Konzentration von IL-6, MCP-1 und TNF-α nach 24stündiger Inkubation mit WC-Co bzw. CoCl2 im Kulturüberstand der PBMC. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 5 unabhängigen Experimenten als Median und Interquartilabstand. Signifikante Unterschiede zwischen den WC-Co und den CoCl2-Effekten sind mit einem * gekennzeichnet (p<0,05)

Massenkonzentration WC-Co [µg/ml] 0,33 3,3 6,6 16,5 33IL

-6 -K

onze

ntra

tion

[% K

ontro

lle]

101

102

103

104

105

WC-CoCoCl2

*

**

IL-6

Massenkonzentration WC-Co [µg/ml] 0,33 3,3 6,6 16,5 33M

CP-

1-K

onze

ntra

tion

[% K

ontro

lle]

101

102

103

104

105

WC-CoCoCl2

MCP-1

Massenkonzentration WC-Co [µg/ml] 0,33 3,3 6,6 16,5 33TN

F-α

-Kon

zent

ratio

n [%

Kon

trolle

]

101

102

103

104

105

WC-CoCoCl2

*

*

TNF-α

Abb. 3.22: Partikeleffekte an vorstimulierten PBMC Darstellung der Zytokinproduktion durch PBMC als Reaktion auf die 24stündige Exposition mit unter-schiedlichen Konzentrationen der Partikelsuspensionen. Die stimulierten PBMC wurden eine Stunde vor der Partikelzugabe mit 100 pg/ml LPS behandelt. Dargestellt sind die zusammen gefassten Ergebnisse aus 5 unabhängigen Experimenten als Median

Massenkonzentration [µg/ml]0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33

IL-6

-Kon

zent

ratio

n [%

Kon

trolle

]

90

100

110

120

130

140

150

160WC 100WC 10WC-Co

Massenkonzentration [µg/ml]0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33

MC

P-1

-Kon

zent

ratio

n [%

Kon

trolle

]

20

40

60

80

100

120

140

160

WC 100WC 10WC-Co

Massenkonzentration [µg/ml]0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33

TNF-

α-K

onze

ntra

tion

[% K

ontro

lle]

0

100

200

300

400

500

WC 100WC 10WC-Co

IL-6 MCP-1 TNF-α

52

Massenkonzentration WC 100 [µg/ml]0 5 10 15 20 25 30 35

MC

P-1

-Kon

zent

ratio

n [%

Kon

trolle

]

0

1000

2000

3000

4000

50005 mM NAC10 mM NAC15 mM NAC25 mM NAC

WC 100

Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]0,33 3,3 6,6 16,5 33

MC

P-1

-Kon

zent

ratio

n [%

Kon

trolle

]

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

5 mM10 mM15 mM25 mM

WC-Co

Abb. 3.24 : Auswirkung verschiedener NAC-Konzentrationen auf die MCP-1-Sekretion partikelexponierter PBMC Jeweils ein Spender wurde für 24 Stunden mit WC 100- bzw. WC-Co-Partikeln und NAC-Konzentrationen von 5, 10 15 oder 25mM exponiert. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse als Mittelwert und Standardabweichung aus Triplikaten.

3.4.4.4 Beteiligung von reaktiven Sauerstoffradikalen an den Partikeleffekten

In vielen Studien zu Nanopartikeln wird auf den Zusammenhang zwischen Partikel-

effekten und reaktiven Sauerstoffspezies hingewiesen. Um indirekt deren Einfluss auf

die Partikeleffekte in der vorliegenden Arbeit zu untersuchen, wurden die PBMC vor

der Partikelexposition mit N-Acetylcystein (NAC) inkubiert. Dies ist ein Radikalfänger,

der auf unterschiedlichen Wegen die Bildung von ROS verhindern kann. Zum Einen

kann das NAC ROS direkt abfangen und zum Anderen fungiert es als Vorläufer von

Gluthation, einem physiologischen zellulären Antioxidans.

An jeweils einem Spender wurden zunächst verschiedene NAC-Konzentrationen und

ihre Auswirkungen auf die Zytokinbildung getestet. Das NAC wirkte in den

eingesetzten Konzentrationen nicht zelltoxisch auf die PBMC (Daten nicht gezeigt).

Wie in Abbildung 3.24 anhand des MCP-1 dargestellt ist, hemmten 25 mM NAC die

partikelinduzierte Zytokinproduktion fast vollständig. Diese Konzentration wurde im

Folgenden in 5 unabhängigen Experimenten an unstimulierten und stimulierten PBMC

verwendet, um die Wirkung von NAC auf die Partikeleffekte zu untersuchen. Einen

Überblick über die partikel- und zytokinspezifischen Wirkungen des NAC an

unstimulierten und stimulierten PBMC soll Abbildung 3.25 vermitteln.

In Abbildung 3.25 ist zu erkennen, dass die immunstimulatorische Wirkung der

Partikel durch 25 mM NAC im Allgemeinen gehemmt wurde. Die NAC-Wirkungen

stellten sich zytokinspezifisch dar – an unstimulierten Zellen zeigten sich die MCP-1-

53

Konzentrationen am stärksten beeinflusst, bei den stimulierten Zellen die TNF-α-

Konzentrationen. Auffallend war die starke stimulatorische Wirkung des NAC auf die

MCP-1-Sekretion nach Exposition mit den WC-Co-Partikeln (s. Abb. 3.25). Bei einem

Vergleich der absoluten Zytokinkonzentrationen zeigte sich eine an den unstimulierten

Zellen eine stimulatorische Wirkung des NAC, die mit steigender Partikelkonzen-

tration abnahm (Daten nicht gezeigt). Bei allen Versuchen mit dem N-Acetylcystein

traten große interindividuelle Schwankungen auf.

Im Folgenden sollte daher ermittelt werden, inwiefern eine variable Vorstimulation der

exponierten Zellen die NAC-Wirkung beeinflusst. Dafür wurden die PBMC jeweils

dreier Spender mit LPS-Konzentrationen zwischen 0,1 und 10000 pg/ml stimuliert und

mit 25mM NAC exponiert. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Abbildung

3.26 dargestellt und zeigen zum Einen, dass die Wirkung des NAC auf die Zytokin-

konzentration stark abhängig war vom Ausmaß der Vorstimulation der Zellen. Zum

Anderen schienen auch hier wieder, besonders beim MCP-1, interindividuelle Unter-

schiede in der Reaktion auf die Stimuli eine große Rolle zu spielen.

Abb. 3.25: Einfluss des Radikalfängers N-Acetylcystein auf die Partikeleffekte an unstimulierten und stimulierten Zellen Vor der 24stündigen Inkubation mit den Partikelsuspensionen wurden die Zellen mit 25 mM NAC inkubiert. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 5 unabhängigen Experimenten an unstimulierten (obere Reihe) und stimulierten (untere Reihe) PBMC. Auf der y-Achse sind die Differenzen der Mediane abgetragen (% Kontrolle mit NAC - % Kontrolle ohne NAC).

stim

ulie

rt

unst

imul

iert

IL-6

Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]

0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33

IL-6

[Diff

. % K

ontro

lle]

-400

-200

0

200

WC 100WC 10 WC-Co

Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]

0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33

MC

P-1

[Diff

. % K

ontro

lle]

-2000

-1500

-1000

-500

0

500

WC 100WC 10 WC-Co

Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]

0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33

TNF-

α[D

iff. %

Kon

trolle

]

-400

-200

0

200

WC 100WC 10 WC-Co

Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]

0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33

IL-6

[Diff

. % K

ontro

lle]

-100

-50

0

50

100

150

200WC 100WC 10 WC-Co

Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]

0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33

MC

P-1

[Diff

. % K

ontro

lle]

-100

-50

0

50

100

150

200WC 100WC 10 WC-Co

Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]

0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33

TNF-

α [D

iff. %

Kon

trolle

]

-300

-200

-100

0

100

200

300WC 100WC 10 WC-Co

MCP-1 TNF-α

54

Abb. 3.27: LPS-Konzentrationsreihe und die Effekte eines monoklonalen anti-CD14-Antikörpers PBMC wurden für 24 Stunden mit steigenden Konzentrationen von LPS und 1 µg/ml eines anti-CD14-Antikörpers inkubiert. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 3 unabhängigen Versuchen als Mittelwerte und Standardabweichungen

LPS-Konzentration [pg/ml]0,1 1 10 100 1000 10000

Zyto

kink

onze

ntra

tion

[% K

ontro

lle]

101

102

103

104

105

106

LPSLPS + CD14 Antikörper

IL-6

LPS-Konzentration [pg/ml]0,1 1 10 100 1000 10000

Zyto

kink

onze

ntra

tion

[% K

ontro

lle]

100

101

102

103

104

105

LPSLPS + CD14 Antikörper

MCP-1

LPS-Konzentration [pg/ml]0,1 1 10 100 1000 10000

Zyto

kink

onze

ntra

tion

[% K

ontro

lle]

101

102

103

104

105

106

LPSLPS + CD14 Antikörper

TNF-a

3.4.4.5 Der CD14-Rezeptor

Abschließend wurde die Rolle des Oberflächenmoleküls CD14 bei der Vermittlung der

Partikeleffekte untersucht. Bei der Exposition der PBMC mit einer Konzentrationsreihe

LPS (0,1-10.000 pg/ml) hemmte ein eingesetzter ani-CD14-Antikörper die Produktion

aller untersuchten Zytokine (s. Abb. 3.27).

Während diese Hemmung bei IL-6 und TNF-α mit steigenden LPS-Konzentrationen

geringer wurde, blieb sie in Bezug zum MCP-1 über die gesamte Konzentrationsreihe

relativ konstant. Es wurde zudem deutlich, dass die in den Versuchen zur

Vorstimulation eingesetzte LPS-Konzentration von 100 pg/ml in dem Bereich lag, in

dem die LPS-Wirkung auf die Zytokinproduktion zu einem großen Teil durch den

CD14- Rezeptor vermittelt und daher auch durch den Antikörper gehemmt wurde. Die

LPS-Konzentrationen

0,1 1 10 100 1000 10000

% Z

ytok

ine

rela

tiv z

u P

robe

ohn

e N

AC

0

100

200

300

400

500

Spender 30 Spender 31Spender 32

IL-6

LPS-Konzentrationen

0,1 1 10 100 1000 10000

% Z

ytok

inko

nz. r

elat

iv z

u P

robe

ohn

e N

AC

0

20

40

60

80

100

120

Spender 30Spender 31Spender 32

TNF-a

LPS-Konzentrationen

0,1 1 10 100 1000 10000

% Z

ytok

ine

rela

tiv z

u P

robe

ohn

e N

AC

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Spender 30Spender 31Spender 32

MCP-1

Abb. 3.26: Einfluss des Ausmaßes der Vorstimulation von PBMC auf die Wirkung von N-Acetylcystein Abgebildet sind die relativen Änderungen in den Zytokinkonzentrationen der NAC-exponierten Proben im Vergleich zu den Kontrollen ohne NAC. Die Versuche wurden in Triplikaten durchgeführt und sind als Mittelwerte aufgetragen.

55

IL-6 Konzentration nach Antikörper-Exposition betrug in Bezug auf den Effekt von 100

pg/ml LPS nur noch 2%, die des MCP-1 noch 19% und die des TNF-α 3%.

Der eingesetzte monoklonale anti-CD14-Antikörper schwächte die immunmodulato-

rischen Partikeleffekte an den PBMC deutlich, jedoch nicht vollständig. Die Effekte des

Antikörpers waren abhängig von der eingesetzten Partikelkonzentration. In Tab. 3.1

sind die ermittelten Zytokinkonzentrationen nach Antikörpereinsatz für zwei Partikel-

konzentrationen dargestellt.

Tab. 3.1: Wirkung des anti-CD14-Antikörpers auf die Zytokinproduktion nach Partikelexposition Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten als Mittelwerte in % Kontrolle

WC 100 WC 10 WC-Co

antiCD14Ak 30 µg/ml 15 µg/ml 30 µg/ml 15 µg/ml 30 µg/ml 15 µg/ml

IL-6 - 4617 1668 2941 1056 335 185

+ 717 270 665 329 181 173

MCP-1 - 23023 12320 14711 5738 85 225

+ 322 350 298 281 52 107

TNF-α - 1124 520 1133 534 418 202

+ 471 324 493 317 287 157

56

57

4 DISKUSSION

In der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkungen verschiedener nanoskaliger

Wolframcarbid-Suspensionen auf drei Zellkulturmodelle untersucht. Deren Auswahl

erfolgte anhand des wahrscheinlichsten Expositionswegs der Wolframcarbidpartikel –

der Inhalation. Untersucht wurden A549-Zellen, die phänotypisch Alveolarepithel-

zellen vom Typ II ähneln, differenzierte THP-1 Zellen stellten ein Modell für die

Alveolarmakrophagen dar, und die Partikeleffekte auf primäre Immunzellen wurden

anhand mononukleärer Zellen aus Spenderblut beobachtet. In den verschiedenen

Monokultursystemen wurde untersucht, inwiefern die Partikel in die Zellen

aufgenommen wurden oder sich an die Zellen anlagerten. Des Weiteren wurde der

Partikeleinfluss auf die Zellvitalität und auf die Produktion immunmodulatorischer

Stoffe gemessen. Mögliche Interaktionen zwischen den verwendeten Testsystemen und

Nanopartikeln (Stone et al. 2009, Jones and Grainger 2009) werden in den

entsprechenden Abschnitten diskutiert. Zunächst sollen jedoch einige wichtige

Aspekte im Hinblick auf die verwendeten Wolframcarbid-Suspensionen und die Zell-

kultursysteme erwähnt werden, die die Interpretation aller biologischen Endpunkte

der vorliegenden Arbeit beeinflussten.

4.1 Allgemeine methodologische Aspekte

4.1.1 Zu den Partikelsuspensionen

Die Wolframcarbidpartikel wurden im Rahmen des INOS-Projektes ausführlich

charakterisiert (Bastian et al. 2009, Meissner et al. 2010), wie es in den letzten Jahren

von vielen Autoren ausdrücklich gefordert wurde (z.B. Teeguarden et al. 2007, Warheit

et al. 2008). WC 100 und WC-Co unterschieden sich kaum im Hinblick auf ihr

Verhalten in physiologischen Medien. Bei dem Vergleich von WC 100- und WC 10-

Partikeln sind in Bezug auf die vorliegende Arbeit folgende Aspekte von Bedeutung:

- Die kristalline Phase von WC 100-Partikeln besteht aus Wolframcarbid-

kristallen, WC 10 hingegen aus W2C-Kristallen mit einem deutlich erhöhten

Anteil an Kohlenstoff, der als Carbon Black (CB) vorliegt (Meissner et al. 2010).

Es ist möglich, dass die Partikeleffekte der WC 10-Partikel durch den erhöhten

Kohlenstoffanteil beeinflusst wurden (Sydlik et al. 2006, Drumm et al. 2000).

58

- Nach der Ultraschallbehandlung lagen die WC 10-Partikel im Gegensatz zu den

WC 100-Partikeln hochgradig aggregiert vor. Als Aggregate werden Partikel

bezeichnet, die durch sehr starke Kräfte, wie z.B. kovalente Bindungen,

miteinander verbunden sind. Für die Wechselwirkungen mit biologischen

Systemen steht daher unter Umständen eine kleinere reaktive Oberfläche zur

Verfügung als die Summe der Oberflächen der Einzelpartikel (BSI 2007). Diese

Eigenschaft der WC 10-Partikel kann dazu führen, dass sich trotz der kleineren

Primärpartikel ihre biologisch aktive Oberfläche nicht deutlich von der der

größeren Partikel unterscheidet.

- Sowohl die WC 100- als auch die WC 10-Partikel zeigten in RPMI-Medium eine

starke Neigung zur Agglomeration (Meissner et al. 2010). Agglomerate sind

lose verbundene Partikel oder Aggregate, bei denen die resultierende Ober-

fläche ungefähr so groß ist, wie die Summe der Einzeloberflächen (BSI 2007).

Durch Zugabe von Serum zum Medium konnte die Agglomerationsneigung

der Partikel deutlich vermindert werden. Dennoch entstanden Partikel-

agglomerate, die bei beiden Partikelarten ähnliche Durchmesser aufwiesen. Für

die Stabilisierung der WC-10-Partikelsuspension wurde allerdings weniger

Serum benötigt. Verantwortlich dafür könnten die geringere Porengröße oder

der erhöhte Anteil an CB der WC 10-Partikel sein (Meissner et al. 2010). Die

Stabilisierung von Nanopartikeln durch Serum wird mit einer Umhüllung der

Partikel durch Serumproteine erklärt (Cedervall et al. 2007, Lynch et al. 2006).

Die Anzahl und die Art der umhüllenden Proteine können die zelluläre

Aufnahme und die biologische Aktivität von Nanopartikeln beeinflussen

(Dutta et al. 2007). Da sich die Proteinumhüllung der WC 100- von der der WC

10-Partikel unterschied, liegt hierin eine mögliche Ursache für unterschiedlich

ausgeprägte Effekte der Partikelarten. In der vorliegenden Arbeit wurden die

beiden Partikelsuspensionen allerdings mit einheitlichen Serumkonzen-

trationen im Zellmedium verwendet, da Bestandteile des Serums einen

partikelunabhängigen Einfluss auf die Zellkulturen ausüben können.

Wie aus diesen Ausführungen zu ersehen ist, gibt es trotz der gemeinsamen Grund-

struktur relevante Unterschiede zwischen den WC 100- und den WC 10-Partikeln. Ihre

biologischen Effekte müssen daher in diesem Kontext interpretiert werden.

59

Bei der Verwendung von Partikelsuspensionen in in vitro Versuchen gibt es viele

Möglichkeiten, die Konzentration anzugeben. Zu den nominalen Konzentrations-

maßen gehören beispielsweise die Masse pro Volumen (Massenkonzentration), die

Partikelanzahl pro Volumen (Partikeldichte) sowie die Oberfläche pro Volumen (Ober-

flächenkonzentration). Im Gegensatz zu effektiven Konzentrationsmaßen (Teeguarden

et al. 2007), wie z.B. der Partikelanzahl pro exponierter Zelle, setzt die Verwendung der

nominalen Konzentrationsmaße voraus, dass der Großteil der aufgebrachten Partikel

mit den exponierten Zellen in Kontakt kommt. In der vorliegenden Arbeit wurde mit

submersen Zellkulturen gearbeitet und die Partikel wurden als Suspensionen

aufgetragen. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass der größte Teil der

Partikel durch konvektive Vorgänge in der Suspension die exponierten Zellen erreichte

(Lison et al. 2008). Zum Vergleich der Partikeleffekte wurde in der vorliegenden Arbeit

vorrangig die Massenkonzentration in µg/ml eingesetzt, da dies eine etablierte Vor-

gehensweise darstellt. Für den Vergleich von Partikeln unterschiedlicher Primär-

partikelgröße wird allerdings von einigen Autoren die Verwendung der Oberflächen-

konzentration als Bezugsmaß empfohlen (Oberdörster 2005, Stoeger et al. 2006). In

Bezug auf die WC 100- und WC 10-Partikel wurde daher in der vorliegenden Arbeit

zusätzlich betrachtet, inwiefern die Verwendung unterschiedlicher Konzentrations-

maße die Interpretation der Partikeleffekte beeinflusste.

4.1.2 Zu den in vitro Zellkulturmodellen

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zelltypen sollten dazu beitragen, die

biologische Wirkung der untersuchten Nanopartikel nach Inhalation und Trans-

lokation in die Blutbahn zu bewerten. Sowohl die A549- als auch die THP-1-Zellen

wurden ursprünglich aus Tumoren gewonnen. Sie dienen als Modell primärer Zellen,

unterscheiden sich von diesen aber aufgrund ihrer Herkunft im Hinblick auf die

zelluläre Differenzierung und die Immortalisation. Diese Aspekte haben eine

besondere Bedeutung bei der Reaktivität auf Noxen, wie beispielsweise reaktive

Sauerstoffspezies (ROS) (Stone et al. 2009) und müssen bei der Bewertung der

toxikologischen Daten berücksichtigt werden.

Die Sensitivität von Zellen in Zellkultur gegenüber Mikroorganismen und anderen

externen Stimuli kann durch Antibiotikazusätze im Kulturmedium verändert werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde daher auf den Einsatz von Antibiotika verzichtet,

60

was die Vergleichbarkeit mit Studien, bei denen Antibiotika verwendet wurden,

einschränkt. Die Effekte von Nanopartikeln können außerdem durch geringfügige

Unterschiede in der Handhabung der Zellkulturen beeinflusst werden (Veranth et al.

2008). In der vorliegenden Arbeit wurden die Kulturarbeiten stets nach einem

einheitlichen Protokoll von derselben Person durchgeführt, um interindividuelle

Variabilitäten möglichst zu vermeiden.

4.2 Partikelaufnahme

Die direkten Partikel-Zell-Interaktionen wurden in der vorliegenden Arbeit anhand

licht- und elektronenmikroskopischer Aufnahmen, Röntgenspektralanalyse und

Durchflusszytometrie beurteilt. Bereits in den lichtmikroskopischen Aufnahmen

zeigten sich bei allen Zelltypen Überlagerungen von Partikelagglomeraten mit den

Zellkörpern. Elektronenmikroskopisch wurde die Aufnahme der Partikel in das

Zytoplasma der A549-Zellen, der THP-1-Zellen und der monozytären Zellen der

PBMC nachgewiesen. Die Partikel lagen in Agglomeraten teils membrangebunden,

teils frei im Zytoplasma vor. Die primären Monozyten bildeten nach der Partikel-

exposition große zytoplasmatische Vesikel aus. Durch die Röntgenspektralanalyse

konnte die intrazelluläre Anwesenheit der Partikel zusätzlich bestätigt werden.

Die Durchflusszytometrie bot neben den mikroskopischen Methoden eine weitere

Möglichkeit zur Beurteilung der zellulären Partikelaufnahme. Die Granularität von

Zellen wird im Durchflusszytometer bestimmt durch die Streuung des Seitwärtslichtes

(SSC) an intrazellulären Organellen oder Partikeln. Wenn Partikel in Zellen aufge-

nommen werden, erhöhen sie daher deren Granularität. Die Quantifizierung des SSC

als Parameter der zellulären Partikelaufnahme wurde von Stringer et al. (1995) etabliert

und in weiteren Studien angewendet und ausgebaut (Palecanda und Kobzik 2000,

Haberzettl et al. 2007). In der vorliegenden Arbeit erhöhten alle Partikel die Granu-

larität der exponierten Zellen. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede zwischen

den Zelltypen und den Partikelarten. Die Exposition mit farblosen Latexpartikeln

verursachte keine Granularitätsänderung, ebenso wenig wie eine Vorstimulation der

PBMC mit Lipopolysaccharid (LPS).

Um Aussagen zum möglichen Aufnahmemechanismus der Partikel in die Zellen zu

treffen, wurde in der vorliegenden Arbeit der Pilzmetabolit Cytochalasin D verwendet.

61

Da dieser an Aktinfilamente bindet und deren Polymerisation inhibiert (Schliwa 1982),

ermöglicht er eine Unterscheidung zwischen aktinabhängigen und aktinunabhängigen

Partikel-Zell-Interaktionen.

4.2.1 Lungenepithelzelllinie

Dass A549-Zellen im Allgemeinen zur Aufnahme von Nanopartikeln fähig sind, wurde

bereits in verschiedenen Studien nachgewiesen (Stearns et al. 2001, Geiser et al.2005,

Wottrich et al. 2004). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der vorliegenden

Arbeit und der INOS-Studie (Bastian et al. 2009) wurden keine einzelnen, sondern

agglomerierte Partikel (Stearns et al. 2001, Singh et al. 2007, Wottrich et al. 2004) in

membrangebundenen Strukturen (Stearns et al. 2001, Kato et al. 2003, Wottrich et al.

2004) sowie in den Lysosomen der Zellen (Singh et al. 2007, Kim et al. 2006) detektiert.

In der vorliegenden Arbeit erhöhte sich nach Partikelexposition die Granularität der

A549-Zellen. Dies steht in Übereinstimmung mit den Experimenten von Stringer et al.

(1995) an epithelialen Zellen. Neben der Partikelaufnahme, die in der vorliegenden

Arbeit durch die elektronenmikroskopischen Aufnahmen nachgewiesen wurde, kann

diese Granularitätserhöhung seine Ursache auch in einer Anlagerung von Partikeln an

die Zellmembran haben. Mikroskopisch wurde eine solche Anlagerung an A549-Zellen

in mehreren Studien nachgewiesen (Stearns et al. 2001, Jordan et al. 2009). Für eine

Anlagerung von Partikeln in der vorliegenden Arbeit spricht, dass die Anwendung des

Cytochalasin D kaum einen hemmenden Effekt auf die Granularitätsänderungen

ausübte (Stringer et al. 1995).

Zum Aufnahmemechanismus der Partikel in die Lungenepithelzellen konnten im

Rahmen der vorliegenden Arbeit und des INOS-Projektes nur bedingt Aussagen

getroffen werden. Die Ko-Lokalisation der Wolframcarbidpartikel mit Lysosomen der

A549-Zellen (Busch et al., in Vorbereitung) sowie ihr Vorkommen membrangebunden

im Zellplasma (Bastian et al. 2009) können als Hinweise auf einen endozytotischen

Aufnahmevorgang gedeutet werden. Dieser wird im Zusammenhang von Partikeln

und A549-Zellen von mehreren Autoren vorgeschlagen (Kim et al. 2006, Huang et al.

2002, Stearns et al. 2001). Dafür spricht, dass die endozytotische Aufnahme von

Partikeln in Lysosomen nur bei anionischen Partikeln auftritt (Harush-Frenkel et al.

2008), zu denen auch die untersuchten Wolframcarbide gehören. Dagegen spricht

allerdings, dass das Cytochalasin D nur einen sehr geringen hemmenden Effekt auf die

62

Granularitätsänderungen der A549-Zellen hatte und die Endozytose aktin-abhängig

verläuft (Kaksonen et al. 2006) Dies wiederum deutet auf ein mögliches passives

Einsinken der Partikel in die A549-Zellen hin (Geiser et al.2005).

4.2.2 Aufnahmeverhalten der THP-1-Zellen und der primären Monozyten aus dem peripheren Blut

Die THP-1-Zellen gehören, genauso wie die primären Monozyten, zur Gruppe der

professionellen Phagozyten (Rabinovitch 1995). Dass beide Zelltypen, wie in der vor-

liegenden Arbeit gezeigt, nanoskalige Partikel aufnehmen können, steht daher in Über-

einstimmung mit zahlreichen Studien (z. B. Wottrich et al. 2004, Thiele et al. 2001, Kato

et al. 2003, Lison und Lauwerys 1990). Die Exposition der Zellen mit farblosen Latex-

partikeln hingegen führte nicht zu Granularitätsänderungen, obwohl bekannt ist, dass

Leukozyten aus dem peripheren Blut Latexpartikel phagozytieren können (Kawaguchi

et al. 1986). Dies spricht dafür, dass die in der vorliegenden Arbeit beobachteten

Granularitätsänderungen auch durch optische Eigenschaften der Partikel, wie

beispielsweise deren Farbe, beeinflusst sein könnten (Johnsen und Widder 1999).

Auffällig war in der vorliegenden Arbeit, dass die Granularitätsänderungen der THP-

1-Zellen wesentlich geringer ausfielen als die der primären Monozyten. Zum Einen

muss hierfür die unterschiedliche Herkunft der Zellen in Betracht gezogen werden.

Das Verhalten einer Tumorzelllinie kann von dem primärer Zellen in vieler Hinsicht

abweichen (Stone et al. 2009). Auf der anderen Seite kann allein die Präparation der

primären Monozyten und ihre Kultivierung unter nicht-physiologischen Umständen

apoptotische Vorgänge auslösen (Hodge et al. 2000), die sich in einem erhöhten SSC

widerspiegeln können (Vermes et al. 2000). Auch die Aufnahme apoptotischer Zellen

durch vitale Phagozyten kann mit einer Erhöhung der zellulären Granularität einher-

gehen (Savill 1998). Also können die starken Granularitätserhöhungen sowohl auf die

Partikelaufnahme als auch auf apoptotische und phagozytotische Vorgänge zurück-

zuführen sein. Dafür spricht die in der vorliegenden Arbeit elektronenmikroskopisch

nachgewiesene Ausbildung von Vesikeln in den primären Monozyten nach Partikel-

exposition. Solche Vesikel werden auch in Monozyten nach der Phagozytose

apoptotischer Zellen beobachtet (Savill 1998).

Die unterschiedlich ausgeprägte Wirkung von Cytochalasin D auf die Granularitäts-

veränderungen der beiden Zellarten lässt vermuten, dass es bei den THP-1-Zellen

63

neben der Aufnahme auch zu einer Anlagerung von Partikeln an die extrazelluläre

Membran gekommen sein kann. Dafür spricht, dass das Cytochalasin D hier nur einen

schwachen Einfluss auf die Granularitätsänderungen hatte. Eine solche Anlagerung

wurde in verschiedenen Studien beschrieben (z.B. Stringer et al. 1995, Pulskamp et al.

2007). Bei den PBMC hingegen verringerte die Anwendung von Cytochalasin D die

Granularitätsveränderungen stark, was einen Hinweis auf eine aktin-abhängige

Aufnahme von Partikeln in die primären Monozyten darstellt (Stringer et al. 1995).

4.2.3 Einfluss spezieller Partikeleigenschaften auf die zelluläre Aufnahme.

Die WC 10-Partikel bewirkten in der vorliegenden Arbeit unabhängig vom Zelltyp

deutlich schwächere Granularitätserhöhungen als die größeren Partikel WC 100 und

WC-Co. Entweder bedingten die WC10-Partikel allein durch ihre geringere Primär-

partikelgröße eine geringere Streuung des Laserlichtes oder sie wurden weniger gut

von den Zellen aufgenommen. Zum genauen Einfluss der Partikelgröße auf die

Aufnahme in A549-Zellen finden sich in der Literatur widersprüchliche Aussagen.

Während im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit bei Foster et al. (2001) kleinere

Partikel verstärkt einer zellulären Aufnahme unterlagen, konstatierten Singh et al.

(2007), dass die Primärpartikelgröße keinen Einfluss habe. An Monozyten und Makro-

phagen wurde im Einklang mit der vorliegenden Arbeit in verschiedenen Studien

beobachtet, dass kleinere Partikel weniger gut phagozytiert wurden (z.B. Oberdörster

2001).

Einschränkend muss in diesem Zusammenhang jedoch beachtet werden, dass laut

Stringer et al. (1995) anhand des SSC ein direkter Vergleich zwischen zwei unter-

schiedlichen Partikelarten nicht möglich ist, da weitere Partikeleigenschaften die

Aufnahme der Partikel zusätzlich beeinflussen können. So bewirkte in verschiedenen

Studien eine erhöhte Konzentration an Kohlenstoffpartikeln eine Inhibition der Phago-

zytose durch Makrophagen (Lundborg et al. 2001). Wie bereits erläutert wurde, ist der

Kohlenstoffanteil der WC 10-Partikel wesentlich höher als bei den anderen Partikel-

arten (Meissner et al. 2010). Die Ursache der beobachteten partikelspezifischen Effekte

könnte also neben der unterschiedlichen Primärpartikelgröße auch durch den erhöhten

CB-Gehalt der WC 10-Partikel bedingt sein.

64

4.3 Partikeleffekte auf die Vitalität

Der MTT-Test wird in der Nanotoxikologie häufig zur Erfassung vitalitätsmindernder

Partikeleffekte verwendet (Stone et al. 1998, Lanone et al. 2009). Beim Vergleich

verschiedener Studien gilt es jedoch zu beachten, dass das ursprünglich von Mosmann

(1983) erstellte Protokoll zur Durchführung des MTT häufig variiert und angepasst

wurde, was die Vergleichbarkeit verschiedener Studien einschränkt. Bei der

Beurteilung der Ergebnisse des MTT-Tests mussten in der vorliegenden Arbeit

folgende Aspekte berücksichtigt werden:

Zum Ersten wird im MTT die Aktivität zellulärer Dehydrogenasen anhand einer Farb-

reaktion dargestellt, die sowohl mit der metabolischen Aktivität der Zellen als auch mit

der Zellzahl korreliert. Da die Zellzahl in der vorliegenden Arbeit präparationsbedingt

schwanken konnte, wurden die Experimente in Triplikaten durchgeführt, um diesen

systematischen Fehler zu verringern. Zweitens können viele Nanopartikel im MTT

eine Veränderung der Absorption verursachen, indem sie mit den Testsubstanzen oder

dem Zellmedium interagieren (Stone et al. 2009). Für die in der vorliegenden Arbeit

verwendeten Partikel konnte dieser Effekt ausgeschlossen werden. Es ist allerdings

bekannt, dass Partikel mit einer großen reaktiven Oberfläche das Formazan, welches

durch die Wirkung der Dehydrogenasen entsteht, adsorbieren und damit zu einer

Unterschätzung der Vitalität führen können. Dies wurde für kohlenstoffhaltige Nano-

partikel nachgewiesen (Wörle-Knirsch et al. 2006, Monteiro-Riviere et al. 2009). Es

könnte also in Bezug auf die Effekte des WC 10 eine Rolle spielen und konnte in der

vorliegenden Arbeit nicht ausgeschlossen werden. Drittens ist der MTT-Test ein redox-

sensitives System. Nanopartikel können sowohl unmittelbar im Zellmedium als auch

durch die Wechselwirkung mit Lungenzellen oder Makrophagen ROS erzeugen (Nel et

al. 2006). Die dadurch veränderte oxidative Umgebung kann im MTT zu einer

Überschätzung der Vitalität führen (Stone et al. 2009).

4.3.1 Toxische Effekte der Partikel auf A549-Zellen

Bei den Lungenepithelien verringerten alle Partikelsuspensionen die Vitalität leicht.

Bei der vergleichenden Betrachtung der vitalitätsmindernden Effekte der WC 100- und

WC 10-Partikel fiel auf, dass das verwendete Konzentrationsmaß (Massen- oder

Oberflächenkonzentration) beeinflusste, welche Partikelart als toxischer angesehen

65

wurde. Dies deutet daraufhin, dass die Oberfläche eine wichtige Rolle bei der

Vermittlung der toxischen Effekte der WC-Partikel spielte (Duffin et al. 2007). Nach

72stündiger Inkubation wirkten die WC 10-Partikel jedoch unabhängig vom Konzen-

trationsmaß toxischer als die WC 100-Partikel. Die Ursache hierfür liegt möglicher-

weise im erhöhten CB-Anteil der WC 10-Partikel, denn Kohlenstoffpartikel können

einen späten, aber prolongierten inhibitorischen Effekt auf die metabolische Aktivität

von A549-Zellen ausüben (Stone et al. 1998).

Unabhängig vom Testsystem und vom Konzentrationsmaß zeigten die WC-Co-Partikel

die stärksten vitalitätsmindernden Effekte auf die A549-Zellen. Diese toxische Wirkung

war nach 72 Stunden Inkubationszeit im Vergleich zur 24stündigen Inkubation

verringert. Das könnte dadurch bedingt sein, dass nanoskaliges WC-Co neben den

akut toxischen Effekten auch proliferative Wirkungen besitzt (Ding et al. 2009). Im

Gegensatz zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit konnten Bastian et al. (2009) im

Rahmen der INOS-Studie mit denselben Partikelsuspensionen an A549-Zellen weder

für WC 100 noch für WC-Co eine signifikant toxische Wirkung zeigen. Diese Dis-

krepanz kann seine Ursache zum Einen in unterschiedlichen Testsystemen und zum

Anderen in unterschiedlichen Kulturbedingungen der Zellen haben (Veranth et al.

2008).

4.3.2 Toxizität der Partikel gegenüber den THP-1-Zellen

In der vorliegenden Arbeit erschienen die THP-1-Zellen im Vergleich zu den Alveolar-

epithelzellen stärker anfällig gegenüber den Nanopartikeln. Diese Beobachtung findet

sich in mehreren Studien bestätigt (Lanone et al. 2009, Roesems et al. 1997, Wottrich et

al. 2004). Eine mögliche Erklärung hierfür liegt in der unterschiedlichen Proliferations-

fähigkeit der Zellarten. Die THP-1 wurden durch die PMA-induzierte Differenzierung

in ihrer Proliferationsfähigkeit gehemmt (Traore et al. 2005), was die Empfindlichkeit

gegenüber pathogenen Noxen erhöhen kann. Die Differenzierung der THP-1-Zellen

durch PMA wird über ROS vermittelt, die in diesem Zusammenhang zu einer

Verringerung des Zellmetabolismus führen (Traore et al. 2005). Wenn nun durch die

Exposition mit Partikeln zusätzlich ROS entstehen (Nel et al. 2006) wird die

inhibierende PMA-Wirkung gesteigert und kann sich in den Vitalitätswerten der

vorliegenden Arbeit widerspiegeln. Dafür spricht, dass WC-Co den stärksten Effekt

zeigt und von diesen Partikeln bekannt ist, dass sie mehr ROS generieren als WC-

66

Partikel (Lison et al. 1995). Soto et al. (2007) stellten im Gegensatz dazu die relative

Sensitivität zwischen Epithelzellen und Makrophagen genau andersherum dar. In

dieser Studie wurden die THP-1 allerdings nicht differenziert, was die Vergleichbarkeit

der Ergebnisse zur vorliegenden Studie einschränkt und wie oben erläutert, die

Partikeleffekte beeinflussen kann.

4.3.3 Partikelspezifische toxische Effekte auf die PBMC

Im MTT erschienen die PBMC von allen untersuchten Zelltypen am wenigsten anfällig

für zytotoxische Partikeleffekte. Hier bewirkten allein die WC 10-Partikel eine konzen-

trationsabhängige Vitalitätsminderung. Cobaltchlorid zeigte ähnlich starke toxische

Effekte wie WC-Co. Die Stimulation der PBMC mit LPS hatte im MTT-Test keinen

Einfluss auf die Vitalität. Diese toxikologischen Ergebnisse müssen im Zusammenhang

mit den weiter oben besprochenen Einschränkungen des MTT-Tests betrachtet werden.

Vor allem seine Redoxsensitivität kann die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit beein-

flusst haben, da die primären Monozyten nach Partikelaufnahme in hohem Ausmaß

ROS produzieren (Vanhee et al. 1995). Die toxische Wirkung der WC 10-Partikel kann

zum Einen durch Ergebnisse erklärt werden, laut denen Partikel mit einer geringeren

Primärpartikelgröße eine stärkere oxidative Belastung der exponierten Zellen auslösen

können (Monteiller 2007). Zum Anderen kann jedoch auch der erhöhte Anteil an CB zu

einer Unterschätzung der Vitalität im MTT-Test geführt haben (Monteiro-Riviere et al.

2009).

Die Ergebnisse des MTT-Tests der vorliegenden Arbeit stehen im Widerspruch zu

vorliegenden Arbeiten, in denen WC-Co-Partikel toxischer auf Monozyten wirkten als

WC-Partikel (Lombaert et al. 2004, 2008). Auch Erkenntnisse von Ashwood et al.

(2007), die Konjugaten aus LPS und Partikeln eine sehr starke apoptogene Wirkung

zuschreiben, konnten durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt

werden. Um näher auf diese Widersprüche einzugehen, hätte es des Einsatzes eines

weiteren Testsystems zur Einschätzung von nanopartiklären Effekten in den in vitro

Systemen bedurft (Stone et al. 2009). Dies war im Rahmen der vorliegenden Arbeit

leider nicht möglich.

67

4.4 Einfluss der Wolframcarbidpartikel auf die Produktion von immun-modulatorischen Stoffen

Laut Driscoll et al. (1997) basiert der Mechanismus der partikelinduzierten pulmonalen

Inflammation auf Zell-Zell- und Zell-Zytokin-Interaktionen. In der vorliegenden Arbeit

wurden daher die Konzentrationen von Zytokinen und Chemokinen ermittelt, die für

die Interaktionen der untersuchten Zelltypen bedeutsam sind. Der Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay (ELISA) ist eine etablierte, sensitive Methode zur Quantifizierung

von Proteinkonzentrationen. Bei der Interpretation der ELISA-Ergebnisse muss im

Rahmen von Untersuchungen an Nanopartikeln jedoch beachtet werden, dass die

Zytokine und Chemokine sich an die Oberfläche der Partikel binden können (Lynch et

al. 2007). Die Anlagerung von Serumproteinen wurde für die in der vorliegenden

Arbeit verwandten Partikel nachgewiesen (Meißner et al. 2010). Dies ließ vermuten,

dass es auch zu einer Interaktion mit den Zytokinen kommen könnte. In Vorversuchen

konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass im zellfreien Medium die

Zytokinkonzentration in Anwesenheit von Partikeln unterschätzt wurde, was die

Beobachtungen anderer Autoren bestätigt (Kocbach et al. 2008). Da die Zytokinkonzen-

trationen jedoch durchgängig unterschätzt wurden, unabhängig von den Partikelarten

und –konzentrationen, wurde diese Methode trotz der Interaktion angewendet und die

Partikeleinflüsse bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt.

Eine weitere wichtige Fragestellung bei der Einschätzung immunologischer Effekte

von Nanopartikeln ist die Möglichkeit einer Verunreinigung der Partikel mit Bakterien

oder bakteriellen Zellbestandteilen, wie dem LPS (Gorbet und Sefton 2005). Dies ist

von Bedeutung, da sowohl A549-Zellen als auch Makrophagen auf Endotoxine mit der

Bildung immunmodulatorischer Stoffe auf LPS reagieren (Stone et al. 2009). In der

vorliegenden Arbeit wurden die Partikel vor ihrer Verwendung autoklaviert, um

Mikroorganismen abzutöten (Schulze et al. 2008). Das LPS ist jedoch nicht hitzesensitiv

und konnte daher durch die Autoklavierung nicht unschädlich gemacht werden. Zur

Testung von Partikelsuspensionen auf eine Endotoxinkontamination existieren

verschiedene Testsysteme, wie beispielsweise der weit verbreitete Limulus Amebocyte

Lysate Test. Allerdings sind auch hier Partikel-Interaktionen mit dem Testsystem

bekannt (Schulze et al. 2008) und es steht generell in Frage, ob dieser Test partikel-

gebundenes Endotoxin nachweisen kann oder nur solches in Lösung (Jones und

68

Grainger 2009). In der vorliegenden Arbeit wurde daher auf die direkte Testung auf

Endotoxin verzichtet. Dafür wurde, beispielsweise durch den Einsatz eines CD14-

Antikörpers, versucht, partikelinduzierte Effekte von LPS-induzierten Wirkungen zu

differenzieren

4.4.1 Partikeleinfluss auf die Zytokinproduktion von A549-Zellen

An den A549-Zellen bewirkten die Wolframcarbidpartikel leichte, partikelspezifische

Effekte auf die Produktion des MCP-1. Die WC 10 Partikel wirkten hierbei stärker

stimulatorisch als die WC 100-Partikel, während die WC-Co-Partikel die Sekretion von

MCP-1 verminderten. Das MCP-1 spielt im Zusammenspiel zwischen Epithelzellen

und Immunzellen eine wichtige Rolle, da es Monozyten an den Ort der Pathogen-

wirkung rekrutiert (Driscoll et al. 1997). Die Reaktion der A549-Zellen könnte also im

physiologischen Rahmen eine Entzündungsreaktion initiieren. Dass Alveolarepithel-

zellen auf die Exposition mit Nanopartikeln oder Fasern mit der Produktion von

Chemokinen reagieren, wurde bereits häufig nachgewiesen (z.B. Wottrich et al. 2004,

Monteiller et al. 2007).

In der vorliegenden Arbeit bewirkten die WC 10-Partikel eine stärkere Induktion der

Zytokinproduktion als die WC 100-Partikel. Von niedrig-toxischen, schlecht-löslichen

Nanopartikeln, zu denen auch die WC-Partikel gezählt werden können, wird

vermutet, dass sie in der Lunge allein über ihre große Oberfläche inflammatorische

Reaktionen auslösen können (Stöger 2006). Da bei Partikeln mit abnehmendem

Durchmesser die Oberfläche stark zunimmt, würde diese Hypothese die Ergebnisse

der vorliegenden Arbeit unterstützen. Ebenso wurde in weiteren Studien aufgezeigt,

dass kleinere Partikel an Epithelzellen stärkere inflammatorische Reaktionen auslösten

(Oberdörster 2000, Monteiller 2007, Ding et al. 2009). Zusätzlich muss jedoch in der

vorliegenden Arbeit in Betracht gezogen werden, dass der erhöhte Anteil an Carbon

Black in den WC 10 Partikeln einen Einfluss auf die Induktion der MCP-1-Produktion

ausgeübt haben könnte, wie es in verschiedenen Studien beschrieben wurde (Stone et

al. 1998).

Der inhibierende Effekt der WC-Co-Partikel allerdings steht im Widerspruch zu in

vivo-Studien, in denen WC-Co-Partikel eine wesentlich stärkere pulmonale Entzün-

dung auslösten als WC-Partikel (Lison et al. 1995). In der vorliegenden Arbeit müssen

die Ergebnisse in Bezug zu den Toxizitätsdaten interpretiert werden. Im MTT-Test

69

zeigte WC-Co die stärksten vitalitätsmindernden Effekte. Allerdings besitzen die A549-

Zellen regenerative Fähigkeiten. Die Vitalität der Zellen zeigte sich nach 72 Stunden

schwächer beeinträchtigt, und nach dieser Zeit unterscheidet sich die MCP-1-

Produktion der partikelexponierten Zellen nicht mehr von der der Kontrollen. Es kann

also vermutet werden, dass die akuten Effekte der WC-Co-Partikel durch die Zell-

toxizität des Cobalt bestimmt wurden, während der Partikeleinfluss des WC nach

längerer Inkubationszeit möglicherweise auch die MCP-1-Produktion induziert hätte.

Für die im Allgemeinen schwachen immunmodulatorischen Reaktionen der Epithel-

zellen gibt es mehrere mögliche Erklärungen. Zum Einen muss die bereits erwähnte

Partikel-Zytokin-Wechselwirkung in Betracht gezogen werden. Dies spielt bei den

Alveolarepithelzellen umso mehr eine Rolle, als aufgrund der geringen Partikelauf-

nahme noch viele Partikel im Zellmedium oder an der Membran der Zellen vorliegen

können und so mit den Zytokinen in Kontakt kommen. Zum Anderen wurden die in

der vorliegenden Arbeit verwendeten Partikel durch Zugabe von Serum zum Kultur-

medium stabilisiert. Das Serum erhöhte die Ruhezytokinproduktion der A549-Zellen

stark, was geringfügige Immunreaktionen auf die Partikel verdeckt haben könnte.

Allerdings waren die Zellen trotz des Serums noch fähig zur Steigerung der Zytokin-

produktion durch die Positivkontrolle TNF-α.

4.4.2 Partikelspezifische Immunreaktionen der THP-1-Zellen

Die WC 10-Partikel zeigten, im Gegensatz zu den A549-Zellen, an den THP-1 keinen

Effekt auf die Produktion der untersuchten Zytokine. Die WC 100-Partikel stimulierten

die TNF-α-Produktion, während WC-Co-Partikel sowohl die Konzentration des TNF-α

als auch die des MCP-1 verminderten.

Der in der vorliegenden Arbeit beobachtete stimulatorische Effekt der WC 100-Partikel

auf die Sekretion von TNF-α bestätigt Ergebnisse einer Studie an Makrophagen, die

u.a. mit nanoskaligen Kohlenstoffpartikeln exponiert wurden (Van Eeden et al. 2001).

TNF-α ist ein proinflammatorisches Zytokin, das vorrangig von monozytären Zellen

gebildet wird. Es besitzt eine wichtige Funktion bei der Vermittlung von Partikel-

effekten in der Lunge, indem es epitheliale Zellen, endotheliale Zellen und weitere

Monozyten zur Freisetzung von Chemokinen stimuliert (Driscoll et al. 1997). Die

erhöhte Freisetzung nach Partikelkontakt spricht also dafür, dass die WC 100-Partikel

in physiologischer Umgebung eine akute inflammatorische Reaktion auslösen könnten.

70

Die WC-Co-Partikel hingegen verringerten in THP-1-Zellen, ähnlich wie bei den

Lungenepithelzellen, die Konzentrationen der untersuchten Zytokine. Wie bei den

A549-Zellen kann zur Erklärung die toxische Wirkung der Partikel in Erwägung

gezogen werden. Allerdings wurden in der vorliegenden Arbeit keine Messungen nach

72 Stunden vorgenommen. Somit konnte der Effekt der längeren Inkubationszeit nicht

beurteilt werden. In physiologischer Umgebung werden apoptotische Zellen von

vitalen Makrophagen aufgenommen, um sekundär nekrotische Reaktionen zu

verhindern (Fadok et al. 1998). Dieser Mechanismus wird beispielsweise durch die

Sekretion von MCP-1 durch Monozyten gesteuert (Martin und Frevert 2005). Von

diesem Chemokin ist außerdem bekannt, dass THP-1-Zellen es in Reaktion auf die

Phagozytose von Bakterien oder Partikeln verstärkt sezernieren (Friedland et al. 1993).

In der vorliegenden Arbeit konnte eine Stimulation der MCP-1-Produktion bei keiner

Partikelart nachgewiesen werden. Dies könnte sowohl der Zytokin-Partikel-Bindung

geschuldet sein, als auch den vitalitätsmindernden Effekten der Partikel. Sie könnte

allerdings ebenfalls ein Hinweis darauf sein, dass die Partikel in den Experimenten

nicht mit größeren Mengen Endotoxin kontaminiert waren, da die THP-1-Zellen auf

eine LPS-Stimulation stark mit der Bildung von MCP-1 reagieren (Matsushima et al.

1989). Um differenziertere Aussagen zu den Partikeleffekten auf den THP-1-Zellen zu

machen müssten jedoch zusätzliche Versuche durchgeführt werden, da die aus-

gewertete Probenzahl nur gering war.

4.4.3 Partikelinduzierte Stimulation der Zytokin- und Chemokinproduktion an PBMC

Im Gegensatz zur THP-1-Zelllinie reagierten die primären Monozyten auf die Partikel-

exposition im Allgemeinen sehr stark mit der Produktion von IL-6, MCP-1 und TNF-α.

Unabhängig von der Partikelart wurde die Zytokinsekretion in Abhängigkeit von der

Partikelkonzentration stimuliert. Die WC 100- und WC-Co-Partikel zeigten einen

deutlicheren Effekt als die WC-10-Partikel. Die Interferon-γ-Produktion wurde

hingegen durch keine der Partikelsuspensionen beeinflusst, was gegen eine

Beteiligung der Lymphozyten an der Immunreaktion spricht. Auffallend war bei den

primären Zellen die große interindividuelle Schwankungsbreite der immun-

modulatorischen Partikeleffekte, die nicht nur das Ausmaß der Reaktion betraf,

sondern auch die Grundniveaus der Zytokinproduktion und die Partikelspezifität der

71

Effekte. Diese interindividuellen Unterschiede sind ein bekannter Aspekt in der

Verwendung von Primärzellen in in vitro-Untersuchungen und wurden u.a. auch in

einer anderen Studie an Wolframcarbidpartikeln beobachtet (De Boeck et al. 2003).

Dass die monozytären Zellen des peripheren Blutes, wie in der vorliegenden Arbeit,

als Reaktion auf Wolframcarbidpartikel vermehrt Zytokine und Chemokine produ-

zieren, bestätigt die Ergebnisse anderer Studien an PBMC (z.B. Shin et al. 2007, Monn

und Becker 1999). Untersuchungen zum Mechanismus der Immunreaktion nach

Partikelexposition durch Lombaert et al. (2008) deuten darauf hin, dass durch

mikroskalige WC-Co-Partikel Gene beeinflusst werden, die in der der Immun- und

Stressantwort eine wichtige Rolle spielen. Da eines der herrunterregulierten Gene,

TNFAIP6, eine Rolle in anti-inflammatorischen Prozessen spielt und entzündliche

Reaktionen begrenzen soll (Park et al. 2006), wurden die Partikeleffekte als Hinweis

auf die Induktion einer starken Inflammation durch WC-Co interpretiert (Lombaert et

al. 2008).

Diese Vermutung wird durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigt. IL-6

und TNF-α sind potente proinflammatorische Mediatoren mit Auswirkungen auf den

gesamten Organismus. Ihre Ausschüttung könnte erklären, warum inhalierte Partikel

sowohl lokale pulmonale, als auch systemische Effekte bewirken (Nemmar et al. 2004).

Das Chemokin MCP-1 wurde ebenfalls von den partikelexponierten Monozyten im

hohen Maß sezerniert. Es wird im physiologischen Rahmen sowohl nach Partikel-

exposition von Epithelzellen der Lunge gebildet, als auch von Alveolarmakrophagen

als Reaktion auf phagozytierte Pathogene (Friedland et al. 1993). Seine Funktion

besteht vorrangig darin, Monozyten an den Ort der Pathogenwirkung zu locken. Dabei

bewirkt das MCP-1 allein zwar keine inflammatorischen Reaktion der Leukozyten, die

angelockten Zellen exprimieren jedoch verstärkt CD14-Rezeptoren und sezernieren

TNF-α. Daher sind sie zum Einen anfällig für starke Reaktionen gegenüber anderen

inflammatorischen Stimuli (Maus et al. 2001, Gunn et al. 1997). zum Anderen führt

TNF-α auf parakrinen Wegen zur weiteren Bildung von MCP-1 durch Monozyten

(Driscoll et al. 1997).

In Bezug auf das MCP-1 existieren wichtige Unterschiede zwischen primären

Monozyten und den THP-1-Makrophagen Die Differenzierung der THP-1-Zellen führt

zu einer verminderten Expression von MCP-1 (Gruss et al. 1994) bzw. zu einer

Herunterregulation der Rezeptoren für das MCP-1 (Tangirala et al. 1997), wodurch

72

diese Zellen schwächer als primäre Monozyten auf MCP-1 reagieren können (Vaddi et

al. 1994). Diese komplexen Wechselwirkungen zwischen den Zytokinen und Chemo-

kinen könnten also die vergleichsweise starke Reaktion der primären Zellen gegenüber

den THP-1-Makrophagen verursacht haben.

4.5 Mechanismen der Partikelwirkung

4.5.1 Einfluss der Partikelgröße und -zusammensetzung

In der vorliegenden Arbeit wurden biologische Effekte von Partikeln miteinander

verglichen, die sich sowohl in der Größe ihrer Primärpartikel (WC 10 vs. WC 100) als

auch in ihrer Zusammensetzung (WC 100 vs. WC-Co) unterschieden. Dabei war es

durch das in den WC 10-Partikeln vorhandene CB nur bedingt möglich, den Einfluss

der Partikelgröße auf die Partikelwirkungen zu beurteilen.

Auffällig war in der vorliegenden Arbeit, dass von allen untersuchten biologischen

Parametern die Granularitätsänderungen am deutlichsten unabhängig von der

untersuchten Zellart durch die Partikelgröße beeinflusst schienen. Im INOS-Projekt

bestätigte sich dieser Zusammenhang auch an weiteren Zelltypen (Busch et al.in

Vorbereitung). Im Hinblick auf die immunologischen Reaktionen der PBMC ähnelten

sich die WC 100 und WC-Co-Effekte ebenfalls deutlich im Vergleich zu den geringeren

Effekten der WC 10-Partikel. Dieser Zusammenhang könnte darauf schließen lassen,

dass bei den primären Monozyten die zelluläre Partikelaufnahme mit der immuno-

logischen Reaktion darauf korreliert. Dafür spricht, dass die Phagozytose von Partikeln

die ROS-Bildung durch Monozyten/Makrophagen induzieren kann und die

Produktion der untersuchten Zytokine auf redoxsensitiven Signalwegen beruht. Die in

der vorliegenden Arbeit erhobenen Beobachtungen zur Abhängigkeit der

Inflammation von der Partikelgröße werden in vielen Studien unterstützt, wobei

jedoch beim Vergleich von mikro- mit nanoskaligen Partikeln im Allgemeinen bei den

kleineren Partikeln die stärkeren inflammatorischen Reaktionen beobachtet werden

(Madl und Pinkerton 2009).

Die Wolframcarbidpartikel wurden in der vorliegenden Arbeit vor dem Hintergrund

ihrer arbeitsmedizinischen Bedeutung untersucht. Daher lag ein Hauptaugenmerk auf

den Partikeleffekten der WC-Co- im Vergleich mit den WC 100-Partikeln. In einigen

Studien wurden die Wechselwirkungen zwischen den Wolframcarbidpartikeln und

73

dem Cobaltanteil untersucht und verschiedene mögliche Mechanismen beschrieben

(z.B. Lison et al. 1995, Bastian et al. 2009). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit

bestätigten bei allen Zelltypen Erkenntnisse zur erhöhten Toxizität von WC-Co im

Vergleich zu WC-Partikeln (Lison und Lauwerys 1990, Roesems et al. 1997). Bei der

Untersuchung der Aufnahme der Partikel unterschieden sich WC 100- Partikel nicht

von den WC-Co-Partikeln. Die inflammatorische Reaktion der primären Monozyten

auf WC 100 fiel sogar stärker aus als die auf die WC-Co-Partikel. Allerdings muss bei

diesem Vergleich der toxische Einfluss der WC-Co-Partikel mit in Betracht gezogen

werden. Ein Hinweis darauf, dass beide Bestandteile des WC-Co für die inflamma-

torische Reaktion nötig sind, zeigte sich in der geringen Immunreaktion der primären

Monozyten auf die Exposition mit Cobaltchlorid, was die Ergebnisse anderer Studien

zu WC-Co-Partikeln bestätigt (Lasfargues et al. 1992). Dass die primären Monozyten

allerdings nicht per se auf eine Exposition mit partikulären Stimuli mit der erhöhten

Sekretion von Immunstoffen reagierten, zeigte sich in der fehlenden Reaktion auf

Latexpartikel in äquivalenten Partikelkonzentrationen.

4.5.2 Reaktive Sauerstoffspezies und N-Acetylcystein

Eine der vorherrschenden Theorien zur Wirkung von Nanopartikeln in zellulären

Systemen beschäftigt sich mit der Rolle von reaktiven Sauerstoffspezies (Nel et al. 2006,

Li et al. 2008). Als Reaktion auf eine Belastung mit ROS reagieren biologische Systeme

im Sinne einer oxidativen Hierarchie (Xiao et al. 2003) zunächst mit antioxidativen

Abwehrmechanismen. Wird die Fähigkeit der exponierten Zellen zur antioxidativen

Abwehr überlastet, können inflammatorische Mediatoren gebildet werden (Nel et al.

2006). Schließlich kann oxidativer Stress zur Apoptose von Leukozyten (Splettstoesser

und Schuff-Werner 2002) und zu Gewebsschäden der Lunge führen (Nakashima et al.

1991).

In Bezug zu den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Partikeln ist bekannt, dass

Wechselwirkungen zwischen Cobalt und den Wolframcarbidpartikeln im Zellkultur-

medium direkt die Bildung von ROS induzieren können (Lison et al. 1995). Es ist aber

allein aufgrund der geringen Partikelgröße wahrscheinlich, dass auch WC 100- und

WC 10-Partikel die Bildung von ROS in zellfreier Umgebung induzieren können (Li et

al. 2008). Eine größere reaktive Oberfläche von Nanopartikeln wird in diesem

Zusammenhang häufig mit einer erhöhten Fähigkeit zur Erzeugung von ROS

74

assoziiert (Nel et al. 2006, Li et al. 2003). Diese Erkenntnisse ließen sich in der

vorliegenden Arbeit nicht bestätigen, da die WC 10-Partikel sowohl weniger toxisch als

auch weniger inflammatorisch wirksam waren als die größeren Partikel. Eventuell

kann dies im Zusammenhang mit einer geringeren zellulären Aufnahme der WC 10-

Partikel erklärt werden. Denn die Aufnahme von Partikeln führt zur Bildung von ROS

durch die phagozytierenden Zellen (Karnovsky und Sbarra 1960), wobei das Ausmaß

der Partikelaufnahme mit der ROS-Induktion korreliert (Nkamgueu et al. 2000). Die

geringere Aufnahme der WC 10-Partikel könnte also die weiteren biologischen Effekte

beeinflusst haben.

In der vorliegenden Arbeit sollten die Effekte der reaktiven Sauerstoffspezies indirekt

beurteilen werden. Dafür wurde N-Acetylcystein (NAC) eingesetzt und seine Wirkung

auf die Zytokinproduktion der Zellen untersucht. Dieser Radikalfänger kann ROS

direkt neutralisieren, dient aber auch als Vorläufer von Glutathion, das die Zelle zur

Regulation des Oxidantienhaushaltes benötigt (van Zandwijk 1995). In der

vorliegenden Arbeit hemmte die Anwendung von NAC die partikelinduzierte

Produktion beinahe aller untersuchten Zytokine an den unstimulierten Monozyten.

Dies bestätigt die Erkenntnisse von Ding et al. (2009) an epidermalen Zellen. In

weiterführenden Versuchen zeigte sich, dass das Ausmaß der Vorstimulation der

PBMC einen deutlichen Einfluss auf die NAC-Effekte hatte. Sowohl eine Exposition

der PBMC mit gramnegativen Bakterien als auch partikelgebundenes Endotoxin

könnte also die Wirkung des NAC beeinflusst haben. Zur weiteren Untersuchung des

Einflusses von ROS auf Effekte von Nanopartikeln wäre es nützlich, Tests

durchzuführen, mit denen die ROS quantitativ bestimmt werden können.

4.5.3 LPS-Wirkungen und der CD14-Rezeptor

Das Lipopolysaccharid (LPS) aus der Zellwand gramnegativer Bakterien ist ein

bekannter Auslöser inflammatorischer Reaktionen. Es wirkt an Monozyten und

Makrophagen vorrangig über die Bindung an den Oberflächenrezeptor CD14. Nach

dieser Bindung werden in den Zellen Prozesse in Gang gesetzt, die sowohl zur Akti-

vierung inflammatorischer als auch apoptotischer Signalwege führen können

(Heidenreich et al. 1997). Das LPS wirkt an Monozyten dabei über die Erzeugung von

Superoxid, einer reaktiven Sauerstoffspezies (Landmann et al. 1995). In der vor-

liegenden Arbeit wurde es als Positivkontrolle für die Zytokinproduktion der

75

primären Monozyten und der THP-1-Zellen verwendet. Beide Zellarten reagierten auf

die Stimulation mit 100 pg/ml LPS erwartungsgemäß mit deutlich erhöhten Grund-

spiegeln der untersuchten Zytokine. Wurden die vorstimulierten PBMC allerdings

zusätzlich mit Partikeln exponiert, zeigten sich bei den WC 100- und den WC 10-

Partikeln keine immunologischen Partikeleffekte. Die Vorstimulation schien also die

Aufnahme der Partikel, gemessen als Granularitätsänderung in der Durchfluss-

zytometrie, kaum beeinträchtigt zu haben, wohl aber die Reaktion darauf.

Dieser fehlende Partikeleffekt an vorstimulierten Zellen könnte dadurch bedingt sein,

dass die Zytokinproduktion der PBMC durch die Vorstimulation bereits vor der

Exposition mit den Partikeln erschöpft war. Um dies zu überprüfen, wurden die PBMC

steigenden LPS-Konzentrationen (1 pg/ml – 100 ng/ml) ausgesetzt. Die Ergebnisse

dieser Versuche zeigten, dass LPS-Konzentrationen höher als 100 pg/ml die Zytokin-

bildung weiter verstärken konnten. Bei der Beurteilung der Partikeleffekte an

vorstimulierten Zellen muss des Weiteren bedacht werden, dass das LPS u.a. über die

Erzeugung von ROS auf die Zellen wirkt. Zusammen mit den ROS, die die Partikel

selbst verursachen, könnte die oxidative Abwehr der Zellen überfordert gewesen sein

und die toxische Wirkung der Partikel die Bildung zusätzlicher Zytokine verhindert

haben. Dagegen spricht der Fakt, dass die WC-Co-Partikel auch an vorstimulierten

Zellen die Produktion von IL-6 und TNF-α steigerten. Die Ursachen der Partikeleffekte

an vorstimulierten Zellen konnten in der vorliegenden Arbeit nicht abschließend

geklärt werden. Die Unterschiede in der Wirkung der verschiedenen Partikel konnten

nicht auf einzelne Partikeleigenschaften zurückgeführt werden. Wahrscheinlich

spielten neben den komplexen Zell-Partikel-Interaktionen auch die Wirkung der

Cobaltionen und die Art der gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies eine wichtige

Rolle.

Das CD14-Ober-flächenmolekül wird spezifisch auf Monozyten und Makrophagen

exprimiert und besitzt, wie bereits in der Einleitung beschreiben, viele unterschiedliche

Funktionen bei der Vermittlung LPS-spezifischer Reaktionen, bei der Induktion

apoptotischer Prozesse und der Phagozytose apoptotischer Zellen. Wahrscheinlich ist

das CD14-Molekül überdies ein wichtiger Rezeptor zur Erkennung spezifischer Muster

im Rahmen der angeborenen Immunabwehr (Pugin et al. 1994). Zur Untersuchung der

Rolle des CD14-Rezeptors an den Partikeleffekten wurde in der vorliegenden Arbeit

ein monoklonaler Antikörper verwendet. Dieser bindet sich an die Aminosäuren des

76

CD14, die für die LPS-vermittelte Wirkung mitverantwortlich sind (Stelter et al. 1997)

und sollte LPS-induzierte Effekte somit unterdrücken.

In Vorversuchen ohne Partikel konnte eine LPS-induzierte Zytokinproduktion

gehemmt werden, wobei die LPS-Wirkung bei sehr hohen Konzentrationen nicht mehr

über den CD14-Rezeptor vermittelt wurde. An unstimulierten partikelexponierten

PBMC verminderte der eingesetzte anti-CD14-Antikörper die partikelinduzierte

Zytokinproduktion. Diese Hemmung trat bei allen untersuchten Partikeln und

Zytokinen auf, war aber bei weitem nicht vollständig. Auch nach der Antikörper-

Anwendung war noch ein konzentrationsabhängiger Partikeleffekt messbar. Eine

Mitbeteiligung von LPS an den gemessenen Partikeleffekten konnte also durch diese

Versuche nicht vollständig ausgeschlossen werden. Die inkomplette Hemmung der

Zytokinproduktion durch den anti-CD14-Antikörper spricht allerdings gegen einen

alleinigen LPS-induzierten Effekt. Aufgrund der vielfältigen Funktion des CD14-

Rezeptors im Rahmen von Inflammation, Apoptose und Phagozytose bedürfte es zu

einer umfassenden Beurteilung der Partikeleffekte weiterführender Untersuchungen.

4.6 Schlussfolgerungen und Ausblick

In der vorliegenden Arbeit wurden die Interaktionen zwischen verschiedenen

nanoskaligen Wolframcarbidpartikeln und humanen Zellen untersucht. Die

beobachteten Effekte stellten sich sowohl partikelspezifisch als auch zelltypspezifisch

dar. Neben der Erfassung der Partikeleffekte wurden auch Überlegungen zu verant-

wortlichen Partikeleigenschaften und Mechanismen der Partikel-Zell-Interaktionen

angestellt. Im Hinblick auf die Aufnahme der Partikel in die verschiedenen Zelltypen,

die Zytotoxizität und die inflammatorische Reaktion schienen unterschiedliche Primär-

partikelgrößen, die besonderen Oberflächeneigenschaften der WC 10-Partikel und die

Cobaltionen in den WC-Co-Partikeln eine wichtige Rolle zu spielen. Da Nanopartikel

mit verschiedenen Testsystemen interagieren können, wurden Vorversuche zur

Erfassung dieser Interaktionen durchgeführt. Eine wichtige Fragestellung bei der

Arbeit mit Nanopartikeln ist die Möglichkeit ihrer Kontamination mit Bakterien oder

bakteriellen Zellbestandteilen, wie dem LPS, da sie aufgrund der geringen Partikel-

durchmesser eine große Oberfläche aufweisen, an die sich vermehrt Proteine binden

können (Ashwood et al. 2007). Diese Möglichkeit konnte in der vorliegenden Arbeit

77

nicht ausgeschlossen werden, Untersuchungen mit einem monoklonalen anti-CD14-

Antikörper sprachen jedoch für partikelspezifisch induzierte biologische Effekte.

In weiterführenden Versuchen wäre es möglich, die untersuchten Zelltypen in

Kokulturen mit den Wolframcarbidsuspensionen zu exponieren, um eine bessere

Annäherung an die biologische Realität schaffen zu können. Des Weiteren wäre es

wünschenswert, die nach Partikelexposition gebildeten ROS direkt zu messen, um ihre

Rolle im Rahmen der Partikeleffekte besser beurteilen zu können. Zur Aufklärung von

partikelinduzierten Signalwegen könnten in weiteren Untersuchungen die beteiligten

Transkriptionsfaktoren und regulierte Gene untersucht werden, womit im Rahmen des

INOS-Projektes bereits begonnen wurde (Busch et al. 2010).

Das Ziel des INOS-Projektes war eine Untersuchung des toxikologischen Potentials

von Nanopartikeln, um Vorhersagen zu schädigenden Wirkungen auf Mensch und

Umwelt treffen zu können. Die vorliegende Arbeit bestätigte an nanoskaligen Partikeln

viele bestehende Erkenntnisse zur toxischen und immunmodulatorischen Wirkung

mikroskaliger Hartmetallpartikel, deren Assoziation mit fibrotischen und allergischen

Atemwegserkrankungen als gesichert gilt (Nemery und Abraham 2007). Damit wird

die Vermutung bekräftigt, dass die Verwendung nanoskaliger Pulver bei der

Herstellung von Hartmetall und die damit mögliche Inhalation nanoskaliger Partikel

eine Ursache für inflammatorische pulmonale Erkrankungen sein könnte.

Erkenntnisse, die an in vitro-Zellkultursystemen gewonnen wurden, können nur

eingeschränkt auf physiologische Verhältnisse übertragen werden. Die Ergebnisse der

vorliegenden Arbeit lassen jedoch vermuten, dass es ungeachtet der Partikelgröße

wichtig ist, Vorkehrungen zu treffen, um Arbeiter der Hartmetallindustrie vor der

Inhalation von Wolframcarbidpartikeln zu schützen.

78

5 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. In vitro Untersuchungen zur toxikologischen und immunmodulatorischen Wirkung nanoskaliger Woframcarbidverbindungen eingereicht von Ulrike Trahorsch Geboren am 29.09.1981 in Belzig angefertigt am Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung (UFZ) Leipzig im Rahmen des vom BMBF geförderten INOS-Projektes in Kooperation mit dem Institut für Klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig betreut von Prof. Dr. U. Sack und Frau Dr. I. Lehmann eingereicht im Juli 2010

Die hier vorgestellte Arbeit wurde im Rahmen des Projektes „Identifizierung und

Bewertung von Gesundheits- und Umweltauswirkungen von technischen

nanoskaligen Partikeln (INOS)“ durchgeführt, das vom Bundesministerium für

Bildung und Forschung gefördert wurde. Untersucht wurden in der vorliegenden

Arbeit konkret die Effekte verschiedener nanoskaliger Wolframcarbidpartikel auf

humane Zellen. Wolframcarbide sind Mischkristalle aus Wolfram und Kohlenstoff,

denen zur Herstellung des sogenannten Hartmetalls noch Cobalt als Bindephase

zugegeben wird. Hartmetall zeichnet sich durch eine außergewöhnliche Korrosions-

beständigkeit und eine hohe Härte aus. Daher wird es vor allem in der Werkzeug-

fertigung verwendet, kommt aber auch in den Kugeln von Kugelschreibern und in

Bohrwerkzeugen vor. Die einzelnen Bestandteile des Hartmetalls werden als Pulver

verarbeitet, wobei gilt: je feiner das verarbeitete Pulver, umso härter ist das

Endprodukt. Eine Freisetzung der Pulverteilchen und damit eine mögliche Exposition

von Mensch und Umwelt ist prinzipiell in der gesamten Fertigungskette des

Hartmetalls möglich.

Seit Beginn der Hartmetallerzeugung Anfang des 20. Jahrhunderts wurden wiederholt

Fälle von Arbeitern in Hartmetallfabriken beschrieben, die an respiratorischen

Erkrankungen litten. Im Rahmen epidemiologischer Studien wurde ein Zusammen-

hang zwischen der Hartmetallexposition und einer fibrotischen Lungenerkrankung

79

konstatiert, die aus diesem Grund die Bezeichnung Hartmetall-Pneumopathie erhielt

(Hard Metal Lung Disease, HMLD). Es handelt sich hierbei um eine chronisch restriktive

Erkrankung, bei der im Lungengewebe der Betroffenen charakteristische ‚kanni-

balistische’ Riesenzellen nachgewiesen werden können, die jedoch nur einen geringen

Teil der exponierten Arbeiter betrifft. Im 20. Jahrhundert wurden viele Studien zur

biologischen Wirkung mikroskaliger Wolframcarbidpartikel durchgeführt, ohne dass

die genaue Pathogenese der HMLD geklärt werden konnte.

Seit einigen Jahren werden in der Hartmetallindustrie Pulver hergestellt und

verwendet, die Partikel enthalten, deren Durchmesser weniger als 100 nm beträgt –

also Nanopartikel. Somit kann diese Industrie zur Nanotechnologie gezählt werden,

deren Merkmal eben u.a. die Erzeugung von Materialien kleiner als 100 nm ist (Meyer

et al. 2001). Die Nanotechnologie gilt allgemein als eine der Schlüsseltechnologien des

21. Jahrhunderts. Es handelt sich hierbei nicht um eine spezifische Technik, sondern

ein breites Feld unterschiedlichster Anwendungen. Die Besonderheit der Nanotechno-

logie besteht darin, dass Nanopartikel sich in vielen Eigenschaften von den gleichen

Partikeln mit mikroskaligem Durchmesser unterscheiden können. Somit eröffnen sich

viele Anwendungsgebiete in allen Lebensbereichen. Allerdings verbinden sich mit der

Nanotechnologie nicht nur Hoffnungen, sondern auch Befürchtungen bezüglich

gesundheitlicher Risiken. Daher beschäftigt sich das rapide wachsende Forschungs-

gebiet der Nanotoxikologie mit den Effekten von Nanopartikeln im lebenden

Organismus. Um diese biologischen Effekte zu erforschen werden häufig in vitro

Untersuchungen an kultivierten Zellen eingesetzt. Diese bieten den Vorteil definierter

Versuchsbedingungen mit gut charakterisierten Zellarten, können jedoch die

physiologische Umgebung nur ungenau abbilden.

In der vorliegenden Arbeit wurden nanoskalige Wolframcarbidpartikel verschiedener

Größen (WC 10 und WC 100) sowie Wolframcarbid-Cobalt-Partikel (WC(100)-Co) auf

ihre Effekte untersucht. Da der wahrscheinlichste Expositionsweg dieser Partikel die

Inhalation darstellt, wurden Zellkulturmodelle gewählt, die mögliche Zielzellen

repräsentieren: A549-Lungenepithelzellen als Modell für Alveolarepithelzellen vom

Typ II, differenzierte THP-1-Zellen als Modell für Alveolarmakrophagen und

mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC) als primäre Immunzellen.

Untersucht wurde, ob die Partikel in die Zellen aufgenommen wurden oder sich

80

extrazellulär an die Zellen anlagerten, ob sie die Vitalität der Zellen beeinträchtigten

und ob die Zellen als Reaktion auf die Partikelexposition immunmodulatorische Stoffe

bildeten. Die eingesetzten Methoden umfassten Lichtmikroskopie, Rastelelektronen-

mikroskopie, Röntgenspektralanalyse, Durchflusszytometrie, den MTT-Vitalitätstest

und den Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Mit den Fortschritten in der

nanotoxikologischen Forschung wurden in den letzten Jahren zunehmend Inter-

aktionen zwischen etablierten Testsystemen und Nanopartikeln aufgedeckt. Diese

wurden in der vorliegenden Arbeit teilweise bestätigt und bei der Interpretation der

Ergebnisse berücksichtigt.

Es zeigte sich, dass alle untersuchten Zellarten die Partikel aufnahmen. Die intra-

zelluläre Aufnahme konnte durch röntgenspektralanalytische Verfahren nachgewiesen

werden. In den Zellen stellten sich die Partikel als Agglomerate dar und kamen

zumeist membrangebunden vor. Die primären Monozyten zeigten zudem die Bildung

großer intrazellulärer Vesikel nach Partikelexposition. In der Durchflusszytometrie

stellte sich die Partikelaufnahme als eine Zunahme der Granularität bei allen

untersuchten Zelltypen dar. Hierbei fiel auf, dass die kleineren Partikel durchgängig

einen geringeren Effekt auf die Granularität zeigten, was auf eine Abhängigkeit der

Aufnahme von der Partikelgröße hindeuten könnte.

Der Aufnahmemechanismus der Partikel wurde untersucht, indem der Phagozytose-

hemmer Cytochalasin D eingesetzt wurde. Dieser hemmte nur bei den primären

Monozyten die Partikelaufnahme deutlich. Dies spricht dafür, dass die primären

Monozyten die Partikel über einen aktinabhängigen Prozess aufnahmen, während bei

den anderen Zellarten wahrscheinlich viele Partikel an der extrazellulären Membran

angelagert oder über aktin-unabhängige Prozesse aufgenommen wurden.

Die Vitalität war bei allen Zellen nach Partikelexposition beeinträchtigt. Im

Allgemeinen zeigten die WC-Co-Partikel die stärksten vitalitätsmindernden

Wirkungen.

Die Bildung immunmodulatorischer Mediatoren (Zytokine und Chemokine) war bei

den Lungenepithelzellen und den THP-1-Zellen nur schwach beeinflusst. Vor allem die

Exposition mit WC-Partikeln führte aber bei diesen beiden Zelltypen zu einer

vermehrten Sekretion von MCP-1 und TNF-α, was auf eine mögliche Induktion

inflammatorischer Vorgänge hindeutete. Die PBMC reagierten mit Abstand am

deutlichsten auf die Partikelexposition mit einer erhöhten Zytokinsekretion, wobei

81

diese Reaktion starken interindividuellen Schwankungen unterlegen war. Hier

wiederum zeigten die Partikeleffekte eine starke Abhängigkeit von der Partikelgröße,

denn die Wirkungen der WC 10-Partikel fielen bei allen Zytokinen schwächer aus als

die der größeren Partikel. Untersuchungen zum Wirkmechanismus der Partikel mit

dem Radikalfänger N-Acetylcystein deuteten auf eine Beteiligung reaktiver Sauerstoff-

spezies an den Partikeleffekten hin. Allerdings konnte auch eine Bindung von Lipo-

polysaccharid, einem Zellwandbestandteil gramnegativer Bakterien, an die Partikel

und eine damit verbundene Mitbeteiligung an den Effekten nicht endgültig aus-

geschlossen werden.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen in vieler Hinsicht vorliegende

Erkenntnisse zur erhöhten Toxizität von WC-Co-Partikeln im Vergleich mit WC-

Partikeln. Außerdem zeigte sich, dass die biologischen Effekte der untersuchten

Partikel abhängig von der Primärpartikelgröße und von der Oberflächenbeschaffenheit

waren, wobei die Einflüsse dieser beiden Partikeleigenschaften nicht konkret unter-

schieden werden konnten. Im arbeitsmedizinischen Kontext der HMLD spricht vieles

dafür, dass auch die Exposition mit nanoskaligen Wolframcarbidpartikeln zu

Entzündungsprozessen in der Lunge führen kann. Daher müssen die notwendigen

Vorkehrungen getroffen werden, um die gefährdeten Arbeiter vor der Inhalation

dieser Partikel zu schützen.

82

83

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ANHÄNGE

DANKSAGUNG

Ich möchte an dieser Stelle den Menschen danken, die auf ganz unterschiedliche Art

und Weise dazu beigetragen haben, dass diese Arbeit durchgeführt und zu Papier

gebracht werden konnte.

Das wäre nicht möglich gewesen, hätten mir Frau Dr. Irina Lehmann und Prof. Dr.

Ulrich Sack nicht das Thema zur Promotion angeboten.

Viele Mitstreiter im INOS-Projekt haben mir bereitwillig meine zahlreichen Fragen

beantwortet, mir Mut gemacht oder die Arbeit anderweitig unterstützt. Dazu gehörten

Dr. Dana Kühnel und Dr. Wibke Busch vom UFZ sowie Tobias Meißner vom IKTS und

Dr. Armin Springer vom MBZ.

Der Alltag im Labor wurde mir sehr erleichtert durch die Mitarbeit und den Humor

von Anne Hain, Denise Hinze und Pierre Kruber.

Hier zuletzt erwähnt, aber auch enorm wichtig war, dass meine Familie und meine

Freunde mich auch in den schwierigen Phasen der Promotion begleitet haben, wofür

ich beispielhaft besonders Dr. Oliver Arendt und Anne-Sophie Trahorsch danken

möchte. Diejenigen, die hier unerwähnt bleiben, hören das Dankeschön persönlich von

mir.

97

ERKLÄRUNG

Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige

Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. ich

versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte

Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der

vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch

im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum

Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles

aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene Material, das in der

Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches

kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt an der

Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.

(Ort, Datum) (Unterschrift)

98

LEBENSLAUF Persönliche Daten

Name: Ulrike Trahorsch

Geburtsdatum: 29.09.1981

Geburtsort: Belzig

Schulbildung:

1994-1998 Musikgymnasium „Schloss Belvedere“, Weimar

1998-1999 Preston High School, Preston, Idaho, USA

1999-2002 Hermann-von-Helmholtz-Gymnasium Postdam

Studium

2002-2009 Studium der Humanmedizin, Universität Leipzig

2002-2009 Stipendiatin der Studienstiftung des deutschen Volkes

08/2004 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

08-12/2005 Auslandsaufenthalt Kampala, Uganda

01-04/2006 ERASMUS-Semester Lissabon, Portugal

11/2009 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

PJ

08/2008-12/2008 Innere Medizin, Hämatologie/Onkologie (Vogtland-Klinikum

Plauen)

12/2008-04/2009 Traumatologie, Thoraxchirurgie (Klinikum St. Georg, Leipzig)

04/2009-07/2009 HNO (Universitätsklinikum Leipzig)

Promotion

07/2007-08/2008 wissenschaftliche Tätigkeit am Helmholtz-Zentrum für

Umweltforschung (UFZ) Leipzig

Berufliche Tätigkeit

Seit 05/2010 Ärztin in Weiterbildung Allgemeinmedizin, Krankenhaus St.

Elisabeth und St. Barbara, Halle

Veröffentlichung

Bold A, Wurth R, Keller T, Trahorsch U, Voigt P, Schubert S, Sack U: Low-cost

enumeration of CD4+ T cells using a density-based negative selection method

(RosetteSep) for the monitoring of HIV-infected individuals in non-OECD countries.

Cytometry A. 2008 Jan;73(1):28-35

Leipzig, den 30.06.2010 Ulrike Trahorsch