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• Aufgaben der Toxikologie • Kontakte mit Stoffen • Arten der Einwirkung von Chemikalien • Einteilung von Giftstoffen und ihrer biologischen Wirkung • Untersuchungsmethoden in der Toxikologie • Schließen vom Experiment auf den Menschen

Inhalte

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• Akute Schadwirkung - Akute Toxizität - Hautreizung - Schleimhautreizung

• Sensibilisierende Eigenschaften • Effekte bei wiederholter oder chronischer Einwirkung

- Subakut - Subchronisch - Chronisch

• Mutagenität • Kanzerogenität • Teratogenität

Inhalte

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• Schutzziele - Arbeitnehmer - Verbraucher - Über die Umwelt indirekt exponierte

Bevölkerungsgruppen

• Anwendungsbereiche - Neue Chemikalien - Altstoffe - Neue Produkte

Schutzziele und Anwendungsbereiche

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• Hautkontakt - Hautschädigung - Kontaktallergie - Resorption

• Augenkontakt - Augenschädigug - Resorption

• Inhalation - Lungenschädigung - Allergisches Asthma - Resorption

• Ingestion oder Resorption - Akute Vergiftung - Chronische Vergiftung

• Systemische Intoxikation • Organspezifische

Schädigungen • Akkumulation • Erbgutschädigungen • Kanzerogenität • Embryotoxizität • Fertilitätsstörungen • Neurotoxizität • Immuntoxizität

Exposition und Risiken

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• Chemische Struktur • Physikalisch-chemische Eigenschaften

• Struktur-Wirkungs-Beziehungen

• Informationen über chemisch verwandte Stoffe

• Experimentelle Daten

Grundlagen der Bewertung von Chemikalien

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• Ziel Ermittlung der akuten toxischen Eigenschaften eines Stoffes nach einmaliger oraler Applikation (oder mehrmaliger Applikation innerhalb von 24 Stunden)

• Testsystem Versuchstiere (Ratte, Maus; 5 Tiere / Dosisgruppe / Geschlecht)

• Durchführung (OECD 401, 1987) - Applikation - Beobachtungszeit mindestens 14 Tage - Sektion nach Versuchsende

Akute Toxizität - oral (1)

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• Parameter – Klinische Symptome – Körpergewicht – Makroskopische und histologische Befunde

• Angabe der Ergebnisse als mediane letale Dosis LD in mg/kg Körpergewicht

Auswertung

Bewertung Einstufung LD oral Ratte (mg/kg) sehr giftig 25 giftig 25 200 mindergiftig 200 2000

Besonderheiten • Fixed -Dose-Methode (OECD 420, 1991):

- Festgelegte Dosierungen (5, 50, 500, 2000 mg/kg) - Beginn mit einer Dosierung - Je nach Toxizitätssymptomen Fortsetzung mit der

nächsthöheren bzw. nächstniedrigeren Dosis

Akute Toxizität - oral (2)

50

50 <

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• Ziel Ermittlung der akuten toxischen Eigenschaften eines Stoffes nach einmaliger dermaler Applikation

• Testsystem Versuchstiere (bevorzugt Ratte; Kaninchen oder Meerschweinchen möglich; 5 Tiere / Dosisgruppe / von einem Geschlecht)

• Durchführung (OECD 402, 1987) - Applikation - Beobachtungszeit mindestens 14 Tage - Sektion nach Versuchsende

Akute Toxizität - dermal (1)

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• Parameter - Klinische Symptome - Körpergewicht - Makroskopische und histologische Befunde

• Angabe der Ergebnisse als mediane letale Dosis LD in mg/kg Körpergewicht

Auswertung

Bewertung Einstufung LD dermal Ratte , Kaninchen (mg/kg) sehr giftig 50 giftig 50 400 mindergiftig 400 2000

Besonderheiten • Ausführung als Limit-Test:

- 2000 mg/kg - Applikation auf mindestens 10% der Körperoberfläche

• Keine Prüfung bei ätzenden Eigenschaften des Stoffes

Akute Toxizität - dermal (2)

50

50 <

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• Ziel Ermittlung der akuten toxischen Eigenschaften eines Stoffes nach kurzzeitiger inhalativer Applikation

• Testsystem Versuchstiere (Ratte, 5 Tiere / Dosisgruppe / Geschlecht)

• Durchführung (OECD 403) - Applikation über 4 Stunden - Beobachtungszeit mindestens 14 Tage - Sektion nach Versuchsende

Akute Toxizität - inhalativ (1)

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• Parameter - Klinische Symptome - Körpergewicht - Makroskopische und histologische Befunde

• Angabe der Ergebnisse als mediane letale Konzentration LC

Auswertung

Bewertung Einstufung LC inhalativ Ratte (mg/l x 4h) sehr giftig 0,5 giftig 0,5 2,0 mindergiftig 2,0 20

Akute Toxizität - inhalativ (2)

50

50 <

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Reizung und Ätzung

• Test auf akute Hautreizung (OECD 404) Prinzip: Die Testsubstanz wird auf die Haut von Albino-Kaninchen für 4 Stunden unter semi-okklusiven Bedingungen aufgetragen. Der Grad der Hautreizung über einen Zeitraum von 72 Stunden wird bewertet (Rötung- und Ödembildung). Nachbeobachtung bis 14 Tage.

• Validierte in vitro-Methoden: z.B. 3D-Hautmodelle (OECD 431)

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3D-Hautmodelle

• Kultivierung der Hautzellen auf einer speziellen Matrix

• Physiologisch stabil für Tage - Wochen

• Biologische Antwort vergleichbar zu menschlicher Haut

Normale menschliche Haut 3D-Hautmodell

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Reizung und Ätzung (2)

• Test auf akute Augenreizung (OECD 405)

Prinzip: Die Testsubstanz wird in den Bindehautsack von Albino-Kaninchen appliziert. Die Effekte auf Cornea, Iris und Konjunktiva werden beobachtet und der Schweregrad bewertet.

• In vitro-Alternative: e.g. Hühnerei-Test (HET-CAM)

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HET-CAM Test

CAM unbehandelt

CAM 10 Sek nach 10 % SDS

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Vergleich 3 Stoffe in 24 Laboren...

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Hautsensibilisierung

• Typ 4 Allergie : Spätreaktionstyp • Tritt erst 12 bis zu 72 Stunden nach dem

Allergenkontakt auf. • Irreversibel, einmal erworbene Allergie besteht

lebenslang. • Oft gegenüber Konservierungsmitteln,

Parfüminhaltsstoffen, Farbstoffen und Ni- bzw. Cr-Verbindungen Typ I-Allergie

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Hautsensibilisierung

• Traditionell Test am Meerschweinchen (OECD 406): – GMPT – Bühler-Test

• Neue Alternative: Local Lymph Node Assay an Mäusen (OECD 429); weniger Tiere, Informationen über sensibilisierende Potenz

• Test am Menschen: Human Repeat Insult Patch Test

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• Ziel Erkennen des sensibilisierenden Potentials eines Stoffes

• Testsystem Versuchstiere (Meerschweinchen)

• Durchführung - Vergleich von behandelten und unbehandelten Kollektiven - Induktion

- intra- oder epicutan - mit oder ohne Adjuvans

- Ruheperiode - Auslösung

- nicht-reizende Konzentration • Auswertung

- Beurteilung der Hautreaktionen (Rötung, Schwellung) - Vergleich der Häufigkeit der Reaktionen bei behandelten und unbehandelten Tieren

Sensibilisierung (Haut)

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Sensibilisierende Potenz

Schneider und Akkan, 2004

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• Ziel Erkennen des chronischen Schädigungspotentials eines Stoffes

• Testprinzip Vergleich der Effekte zwischen behandelten und unbehandelten Kollektiven

• Testsystem Versuchstiere (meist Ratten oder Mäuse)

• Durchführung - Applikation (oral, dermal, inhalativ) in der Regel täglich - unbehandelte Kontrollgruppe, eine oder mehrere Dosisgruppen) - klinische Beobachtung - Laboruntersuchungen (Klinische Chemie, Hämatologie) während und am Ende der Prüfung - Sektion am Versuchsende

Effekte bei wiederholter oder chronischer Einwirkung (1)

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Art der Prüfung Versuchsdauer Zeitbedarfbis zur Auswertung

subakut 4 Wochen 7 bis 8 Monate

subchronisch 3 Monate 9 bis 10 Monate

chronisch 1 Jahr ca. 20 Monate

Effekte bei wiederholter oder chronischer Einwirkung (2)

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• Auswertung Vergleich der Parameter zwischen behandelten und unbehandelten Kollektiven (biometrische Auswertung)

- Futteraufnahme - Wasseraufnahme - Körpergewichtsentwicklung - Klinische Symptome - Mortalität - Hämatologie - Klinische Chemie - Pathologie (makroskopisch und mikroskopisch)

• Bewertung

- NEL (No-Effect-Level) - NOEL (No-Observed-Effect-Level) - in mg/kg tägliche Dosis

Effekte bei wiederholter oder chronischer Einwirkung (3)

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Definitionen

• Mutation Veränderungen in der genetischen Information

• Punktmutation Veränderungen im molekularen Aufbau der DNA

• Chromosomenmutation Strukturelle Veränderungen der Chromosomen

• Genommutation Veränderungen in der Chromosomenzahl

Mutagenität

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(Salmonella typhimurium / Säugermikrosomen - Rückmutationstest)

• Ziel Erkennen eines erbgutverändernden Potentials von Stoffen

• Testsystem Bakterien (Salmonella thyphimurium)

• Verschiedene Stämme z.B.: TA 100 Basenpaaraustausch

TA 1535 TA 98 Leserastermutationen TA 1537 TA 1538

Mutagenität - Punktmutation: Ames-Test (1)

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Testprinzip

Durch mutagene Agenzien induzierte Rückmutation von Histidin-abhängigen zu Histidin-unabhängigen Bakterien Durchführung

• verschiedene Stämme, mit und ohne metabolische Aktivierung, Negativ- und Positivkontrollen, Konzentrationsreihe mit Prüfsubstanz

• Inkubation der Bakteriensuspension mit entsprechenden Zusätzen • Inkubation auf Minimalagarplatten • Auswertung

Mutagenität - Punktmutation: Ames-Test (2)

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• Bewertung der Ergebnisse

- Negativ: Kein mutagenes Agens • Keine Erhöhung der Revertantenrate im Vergleich zur Negativkontrolle

- Positiv: Bakterielles Mutagen • Erhöhung der Revertantenrate im Vergleich zur Negativkontrolle

– dosisabhängig und/oder – reproduzierbar und/oder – mindestens Verdoppelung oder Verdreifachung der Revertantenrate

(abhängig vom Teststamm) • in mindestens einem Teststamm ohne und/oder mit metabolischer

Aktivierung

• Schlußfolgerungen Untersuchter Stoff induziert Genmutationen an bakterieller DNS Überprüfung des Potentials für Punktmutationen an Säugerzellen Überprüfung des Potentials für Chromosomenmutationen an Säugerzellen

Mutagenität - Punktmutation: Ames-Test (4)

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• Ziel

Erkennen eines erbgutverändernden Potentials von Stoffen an Säugerzellen

• Testsystem

Etablierte Zellkulturen oder Primärkulturen vom Säuger z.B.: - Humanlymphozyten - Zellen von Geweben des chinesischen Hamsters

(V79 - Lungenfibroblasten, CHO - Ovarialzellen)

Mutagenität - Chromosomen- und Genommutation: Zytogenetik in vitro (1)

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• Testprinzip Behandlung der Zellkulturen mit den zu prüfenden Stoffen während verschiedener Phasen des Zellzyklus. Zytogenetische Diagnose struktureller Veränderungen (Chromosomenaberrationen) an Zellen, die in der Metaphase arretiert wurden.

• Durchführung - Unterschiedliche Behandlungszeit und -dauer, mit und ohne metabolische

Aktivierung, Negativ- und Positivkontrollen, Konzentrationsreihe mit Prüfsubstanz, 2 Zellkulturen pro Testpunkt

- Vorkultivierungsphase und Toxizitätsvortest - Zelleinsaat und Anwachsen der Zellen - Inkubation der Zellkultur mit entsprechenden Zusätzen - Arretierung der Zellen in der Metaphase durch das Spindelgift Colcemid - Aufarbeitung der Zellen (Zellen abernten, Fixieren, Ausstriche, Anfärben) - Mikroskopische Auswertung

Mutagenität - Chromosomen- und Genommutation: Zytogenetik in vitro (2)

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• Negativ: Kein mutagenes Agens - Keine Erhöhung der Aberrationsrate im Vergleich zur Negativkontrolle

• Positiv: Mutagenes Agens an Säugerzellen - Erhöhung der Aberrationsrate im Vergleich zur Negativkontrolle

- dosisabhängig und/oder - reproduzierbar und/oder - biologisch und statistisch signifikant (außerhalb des Bereiches historischer

Kontrollwerte)

Bewertung der Ergebnisse

Schlußfolgerungen Untersuchter Stoff induziert Chromosomenmutationen an Säugerzellen bei Exposition in vitro Überprüfung des Potentials zur Induktion von Chromosomenmutationen an Säugerzellen bei Exposition in vivo

Toxikologie für Chemiker WS 1994/95: Untersuchungsmethoden in der Toxikologie ##

Mutagenität - Chromosomen- und Genommutation: Zytogenetik in vitro (4)

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• Chemische Struktur

• Hinweise aus Mutagenitätstests

• Tierexperimentelle Ergebnisse

• Epidemiologie

Kanzerogenität: Daten zur Beurteilung der krebserzeugenden Wirkung von Chemikalien

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• Ziel Erkennen eines krebserzeugenden Potentials von Stoffen

• Testsystem Versuchstiere (In der Regel Ratten und Mäuse);

mindestens 50 Tiere pro Dosisgruppe und Geschlecht

• Durchführung (OECD 451, 1981) - Lebenslange Behandlung mit der Prüfsubstanz (meist täglich) - Applikationswege: oral, dermal, inhalativ; in Sonderfällen Injektion - Dauer: 24 Monate (Ratten), 18 Monate (Mäuse) - Mindestens 3 Dosierungen + Kontrollgruppe(n) - Dosierungen unterhalb der chronisch-toxischen Dosis - Substanzanalytik (Stabilität, Dosis, Bioverfügbarkeit) - Klinische Beobachtung - Zwischenuntersuchungen - Enduntersuchung und Sektion bei Versuchsende

Kanzerogenität (1)

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Kanzerogenität (2)

Auswertung • Entwicklungsverlauf (Futter- und Wasseraufnahme, Körpergewichtsentwicklung) • Klinische Beobachtung • Hämatologie und klinische Chemie • Sektion • Histologie aller wichtigen Organe und Gewebe • Auftreten von Tumoren im Vergleich zu den Kontrollgruppen

- Häufigkeit - Lokalisation - Induktionszeit - benigne / maligne - Dosisabhängigkeit - Vergleich mit historischen Kontrolldaten - Statistische Auswertung aller Parameter

Bewertung Bei statistisch signifikanten Unterschieden im Auftreten von Tumoren im Vergleich zu den Kontrollgruppen Einstufung als kanzerogen im Tierversuch

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Reproduktionstoxizität, Segment I/II/III Studie

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• Ziel Erkennen des Potentials von Stoffen, während der embryonalen Entwicklung strukturelle und funktionale Veränderungen zu induzieren

• Testsystem Versuchstiere (bevorzugt Ratten; Kaninchen); 20 Tiere pro Dosisgruppe

• Durchführung (OECD 414, 1981) - Behandlung 6.-15. Tag der Trächtigkeit - 3 Dosisgruppen, 1 Kontrollgruppe - Applikation in der Regel oral - Substanzanalytik - Klinische Beobachtung - 20. Tag der Trächtigkeit Entnahme der Feten (Sectio)

Embryotoxizität / Teratogenität (1)

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Embryotoxizität / Teratogenität (2)

Auswertung • Maternale Toxizität (Körpergewicht, Futteraufnahme,

Klinische Beobachtung, Sektion) • Uterus- und Plazentagewichte • Zahl der Corpora lutea • Zahl und Gewicht der Feten • Lebend-/Tot- und Geschlechtsverhältnis der Feten • Veränderte oder untergewichtige Feten • Resorptionen • Untersuchung der Feten

- Skelett (Alizarin-Färbung) - Weichgewebe (Wilson-Technik)

• Vergleich mit historischen Daten

Bewertung Bei Unterschieden in den entsprechenden Parametern im Vergleich zu den Kontrollgruppen Potential zur Erzeugung von Mißbildungen