Isolierung, Identifizierung und funktionelle ... · Deuteromycota oder Fungi imperfecti bezeichnet. Aufgrund genetischer Verwandschafts-analysen können die Deuteromycota nun den

Isolierung, Identifizierung und funktionelle Charakterisierung der Metallo-Aminopeptidase CaApe2

—

Ein experimenteller Beitrag zur Beurteilung des kariogenen Potentials von Candida albicans

I N A U G U R A L D I S S E R T A T I O N

zur Erlangung des doctor medicinae dentariae (Dr. med. dent.)

der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus

der Technischen Universität Dresden

vorgelegt von

Roman Pönisch

aus Dresden

Dresden 2008

1. Gutachter: Prof. Dr. med. habil. H. Wolfgang Klimm

2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. habil. Thomas M. Kriegel

Tag der mündlichen Prüfung: 9. Dezember 2008

gez. Prof. Dr. med. H. Zwipp

Vorsitzender der Promotionskommission

Teile dieser Dissertationsschrift wurden in den beiden folgenden Arbeiten publiziert:

KLINKE, H. T.; PÖNISCH, R.; RUMP, A.; SCHELLENBERGER, W.; MÜLLER, E.-C.; OTTO, A.; KLIMM,

H. W.; KRIEGEL, T. M.: Identification and characterization of CaApe2 - a neutral arginine/

alanine/leucine-specific metallo-aminopeptidase from Candida albicans. FEMS Yeast Res. 8 (6), 858-869, 2008.

KLINKE, H. T.; PÖNISCH, R.; KRIEGEL, T. M.; KLIMM, H. W.: Immunohistochemical Detection of

the Collagenolytic Candida albicans Sap2 Proteinase in Caries Lesions. Caries Res. 37 (54th

ORCA Congress), 287, #53, 2007.

Doch Forschung strebt und ringt, ermüdend nie, Nach dem Gesetz, dem Grund, Warum und Wie.

Johann Wolfgang von Goethe

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................... 1

1.1 Gruppe der Pilze ............................................................................................ 1

1.2 Candida albicans: Einordnung und Morphologie ........................................... 2

1.3 Medizinische Bedeutung von Candida albicans ............................................ 3

1.3.1 Epidemiologie der Candida-Infektionen ......................................................... 4 1.3.2 Candida in der Mundhöhle ............................................................................. 5 1.3.3 Weitere klinisch relevante Candida-Spezies .................................................. 6 1.3.4 Klinik der Candida-Infektionen ....................................................................... 7 1.3.5 Diagnostik der Candida-Infektionen ............................................................... 9 1.3.6 Therapie der Candida-Infektionen ................................................................. 9

1.4 Virulenzfaktoren von Candida albicans ......................................................... 10

1.4.1 Zellwand und Adhäsion von Candida albicans .............................................. 11 1.4.2 Phänotypenwechsel ....................................................................................... 13 1.4.3 Dimorphismus ................................................................................................ 14 1.4.4 Thigmotropismus ........................................................................................... 15 1.4.5 Hydrolytische Enzyme von Candida albicans ................................................ 15

1.5 Peptidasen ..................................................................................................... 17

1.5.1 Funktionen von Peptidasen ........................................................................... 17 1.5.2 Klassifikation der Peptidasen ......................................................................... 17 1.5.3 Aminopeptidasen ........................................................................................... 19 1.5.4 Metallopeptidasen .......................................................................................... 19 1.5.5 Sezernierte Aspartylproteinasen (Saps) von Candida albicans ..................... 20

1.6 Kollagen-Struktur ........................................................................................... 24

1.7 Kollagenolyse ................................................................................................. 25

1.8 Zusammensetzung von Dentin ...................................................................... 26

1.9 Candida albicans und Dentinkariogenese ..................................................... 27

2 Zielsetzung der Arbeit ................................................................................. 30

3 Material und Methoden ................................................................................ 31

3.1 Geräte und Materialien .................................................................................. 31

3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien ................................................................ 31 3.1.2 Chemikalien ................................................................................................... 34 3.1.3 Kulturmedien-Bestandteile ............................................................................. 36 3.1.4 Enzyme und Antikörper .................................................................................. 36 3.1.5 Candida-albicans-Stämme ............................................................................. 37

3.2 Methoden ....................................................................................................... 37

3.2.1 Stammhaltung ................................................................................................ 37 3.2.2 Zellkultivierung von Candida albicans ............................................................ 37 3.2.3 Peptidase-Aktivitäts-Bestimmung .................................................................. 40 3.2.4 Methoden zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand ....................................... 41 3.2.5 Zellaufschluss ................................................................................................ 42 3.2.6 Enzymreinigung aus Zellwandlysat von Candida albicans ............................ 43 3.2.7 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ......................................................... 45 3.2.8 Proteinkonzentrationsbestimmung ................................................................. 47 3.2.9 Peptididentifizierung mittels Massenspektrometrie ........................................ 48 3.2.10 Datenbankrecherche ...................................................................................... 49 3.2.11 Charakterisierung der isolierten Peptidase .................................................... 49 3.2.12 Albuminabbau-Test ........................................................................................ 52 3.2.13 Kollagenabbau-Tests ..................................................................................... 53 3.2.14 Dentinscheibengewinnung und Dentinabbau-Test ........................................ 56

Inhaltsverzeichnis II

4 Ergebnisse .................................................................................................... 58

4.1 Versuche zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand ........................................ 58

4.1.1 Vergleich von verschiedenen Methoden zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand ............................................................................................ 58 4.1.2 Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien .............. 59 4.1.3 Vergleich Zellaufschluss - Zellwandlyse ........................................................ 59

4.2 Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus Zellwandlysat ....................... 60

4.2.1 HiLoad 26/10 Q Sepharose HP ..................................................................... 60 4.2.2 Mono Q HR 5/5 .............................................................................................. 61 4.2.3 Superdex 200 10/300 GL ............................................................................... 63 4.2.4 RESOURCE TM ETH ...................................................................................... 64 4.2.5 Zusammenfassung der Enzymreinigung ....................................................... 65

4.3 Charakterisierung des peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von Candida albicans ..................................................................................... 68

4.3.1 Molekulare und funktionelle Identifizierung der Peptidase ............................. 68 4.3.2 Vergleichende Sequenzanalyse der isolierten Peptidase mit homologen Proteinen der Ascomycota .......................................................... 69 4.3.3 pH-Optimum der Enzymaktivität der isolierten Peptidase .............................. 70 4.3.4 Substratspezifität und Enzymkinetik der isolierten Peptidase ........................ 71 4.3.5 Wirkung von Proteinaseinhibitoren und Metallkationen auf die L-Alanin-7-amido-4-methylcoumarin-Hydrolyse durch die Peptidase ............ 74 4.3.6 Temperaturoptimum der Enzymaktivität ........................................................ 77

4.4 Endopeptidase-Aktivität enzymhaltiger Proben von Candida albicans .......... 78

4.4.1 Albuminabbau durch enzymhaltige Proben von Candida albicans ................ 79 4.4.2 Kollagenhydrolytische Aktivität enzymhaltiger Proben von Candida albicans ..................................................................................... 79 4.4.3 Dentinhydrolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans ............. 82

5 Diskussion .................................................................................................... 83

5.1 Substrate zum Nachweis kollagenolytischer Aktivität .................................... 83

5.2 Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von Candida albicans ..................................................................................... 83

5.2.1 Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien .............. 84 5.2.2 Vergleich der Methoden Zellwandlyse und Zellaufschluss ............................ 84 5.2.3 Fünfstufige Reinigung des Zellwandlysats.......................................................... 86

5.3 Proteinidentifizierung und BLASTp-Suche ..................................................... 87

5.4 Diskussion der Eigenschaften der Metallo-Aminopeptidase .......................... 89

5.4.1 pH-Optimum der Enzymaktivität .................................................................... 89 5.4.2 Substratspezifität und Enzymkinetik .............................................................. 89 5.4.3 Inhibitionsprofil ............................................................................................... 90 5.4.4 Temperaturoptimum ....................................................................................... 91

5.5 Bedeutung der Metallo-Aminopeptidase ........................................................ 91

5.5.1 Wirkungsort und Aktivitätszustand der Metallo-Aminopeptidase ................... 91 5.5.2 Kollagenolytische Wirksamkeit der Metallo-Aminopeptidase ......................... 92 5.5.3 Funktionen der Metallo-Aminopeptidase ....................................................... 94

5.6 Kollagenolyse durch Candida albicans im neutralen Milieu ........................... 95

5.7 Kollagenolyse durch Candida albicans im sauren Milieu ............................... 96

5.7.1 Kollagenolytische Aktivität des Kulturüberstandes ........................................ 96 5.7.2 Kollagenolytische Aktivität des Zellaufschlusses ........................................... 98 5.7.3 Hypothetische Rolle der sezernierten Aspartylproteinasen in der Dentinkariogenese ............................................................................... 99

Inhaltsverzeichnis III

6 Ausblick ........................................................................................................ 101

7 Zusammenfassung ...................................................................................... 102

8 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 103

9 Anhang .......................................................................................................... 121

9.1 Tabellenverzeichnis ....................................................................................... 121

9.2 Abbildungsverzeichnis ................................................................................... 122

9.3 Abkürzungsverzeichnis .................................................................................. 123

9.4 Danksagung ................................................................................................... 125

9.5 Tabellarischer Lebenslauf .............................................................................. 126

9.6 Erklärung ........................................................................................................ 127

1. Einleitung Die Demineralisation der Zahnhartsubstanz durch die säurebildenden Plaquemikro-

organismen wurde bereits umfangreich beschrieben. Hingegen ist die Proteolyse der

organischen Dentinmatrix noch weitgehend ungeklärt. An der Formation kariöser

Dentinläsionen könnten sezernierte mikrobielle Proteinasen beteiligt sein. Die vorliegende

Arbeit untersucht eine mögliche pathogene Funktion des Hefepilzes Candida albicans bei

der Entstehung der Dentinkaries. Zunächst wird in die Bedeutung des Hefepilzes als

Krankheitserreger eingeführt und ein Überblick zu seinen bekannten Virulenzfaktoren

gegeben. Für das Verständnis der zahlreichen Peptidasen des Mikroorganismus ist die

Kenntnis der Klassifikation der Peptidasen hilfreich, die hier ebenso dargestellt wird.

1.1 Gruppe der Pilze Die Gruppe der Pilze umfasst eine heterogene Gruppe von Eukaryoten, die nach

verschiedenen Gesichtspunkten klassifiziert werden können.

Die biologisch-mykologische Einteilung basiert auf der unter bestimmten Bedingungen

kurzzeitig auftretenden teleomorphen (geschlechtlichen) Entwicklungsform im Lebenszyklus

eines Pilzes. So unterteilt die Botanik die Gruppe der Pilze in Zygomycota („Jochpilze“),

Ascomycota („Schlauchpilze“) und Basidiomycota („Basidienpilze“) anhand der morpho-

logischen Charakteristik der Hauptfruchtform. Die entwicklungsgeschichtlich ältesten

Vertreter, die Zygomycota, werden aufgrund ihres unseptierten Myzels als niedere Pilze

bezeichnet.

Pilze, die nur nach ihrem anamorphen (asexuellen) Zustand beurteilt werden können, weil

nur diese Form bekannt ist oder diese Pilze noch nicht vollständig erforscht sind, werden als

Deuteromycota oder Fungi imperfecti bezeichnet. Aufgrund genetischer Verwandschafts-

analysen können die Deuteromycota nun den drei oben genannten Gruppen zugeordnet

werden. Dies berücksichtigt die aktuelle Nomenklatur der klinisch relevanten Pilze [DE HOOG

et al., 2000].

Morphologisch lassen sich die anamorphen Formen der Pilze in Sprosspilze (Blastomyzeten)

und Fadenpilze (Hyphomyzeten) differenzieren. Sprosspilze werden im englischen

Sprachraum als „yeasts“ (Hefen) bezeichnet. Die Gruppe der Sprosspilze setzt sich aus

Vertretern der biologischen Abteilungen Ascomycota und Basidiomycota zusammen.

Biochemische Eigenschaften ermöglichen die Unterscheidung. Basidiomycota bilden das

Enzym Urease und sind nicht zur Zuckerfermentation fähig. Ascomycota zeigen umgekehrte

Eigenschaften. Die Gruppe der Fadenpilze umfasst Pilze aus allen drei biologischen

Einleitung 2

Abteilungen. Einige Pilzarten kommen in Abhängigkeit von den äußeren Bedingungen

sowohl als Spross- als auch als Fadenpilz vor. Diese Eigenschaft wird als Dimorphismus

bezeichnet.

Die biologische Nomenklatur hat für die Medizin wenig Bedeutung, da von vielen medizinisch

relevanten Pilzen nur die asexuelle Entwicklungsform auftritt. Im deutschen klinischen

Sprachgebrauch ist die Einteilung in Dermatophyten, Hefen und Schimmelpilze (DHS-

System nach RIETH, Tabelle 1.1) viel gebräuchlicher, wobei die Gruppe der Schimmelpilze

hier alle Fadenpilze, außer den Dermatophyten, enthält. Die obligat pathogenen

Dermatophyten sind Fadenpilze, die eine Affinität zu Keratin aufweisen. Sie bilden daher

eine eigenständige Gruppe und besiedeln Haut, Haare und Nägel.

Tabelle 1.1: Das DHS-System mit einigen klinisch wichtigen Vertretern

Dermatophyten Hefen Schimmelpilze

Trichophyton mentagrophytes Candida albicans Aspergillus fumigatus

Microsporum canis Cryptococcus neoformans Penicillium marneffei

Epidermophyton floccosum Geotrichum capitatum Scopulariopsis brevicaulis

1.2 Candida albicans: Einordnung und Morphologie Domäne Eukaryota

Reich Fungi Abteilung Ascomycota Klasse Saccharomycetes Ordnung Saccharomycetales Gattung Candida Spezies albicans

Die Gattung Candida umfasst etwa 200 Arten [DE HOOG et al., 2000], von denen C. albicans

am besten untersucht ist. Genetische Verwandschaftsanalysen ermöglichten die Zuordnung

von Candida albicans in die Gruppe der Ascomycota („Schlauchpilze“). Eine teleomorphe

Entwicklungsform konnte bei Candida albicans bisher nicht kultiviert werden. Allerdings

lieferte die vergleichende Genanalyse mit Saccharomyces cerevisiae Hinweise auf einen

sexuellen Zyklus [TZUNG et al., 2001]. Der dimorphe Hefepilz Candida albicans tritt als

Sprosspilz und auch als Fadenpilz auf. Der Sprosspilz vermehrt sich vegetativ über

Knospung. An einer Stelle der Mutterzelle wölbt sich die Zellwand zu einer Ausstülpung, die

zu einer so genannten Tochterzelle heranwächst. Nachdem das Erbgut durch Mitose geteilt

Einleitung 3

wurde, schließt sich die Zellwand, und beide Zellen sind getrennt, haften aber meist noch

aneinander. Das Genom von Candida albicans ist immer diploid. Eine Sprosspilzzelle

(Synonyme: Blastokonidie, Blastospore) von C. albicans misst 2 bis 7 µm in der Breite und 3

bis 10 µm in der Länge und weist eine ellipsoide Form auf.

Auf nährstoffarmen Reisagarplatten zeigt sich die Formenvielfalt von Candida albicans im

Auftreten von Blastosporen, die als „ball like clusters“ an Pseudohyphen liegen, und

Chlamydosporen als Dauerorgane auf Mangelmedien. Die dickwandigen, runden

Chlamydosporen befinden sich an Hyphen und Pseudohyphen, die jeweils durch eine

dazwischen liegende pseudohyphale „Suspensor-Zelle“ getrennt sind. Chlamydosporen

kommen nur in vitro vor. Während bei echten Hyphen (Synonym Keimschläuche) die

Quersepten erst nachträglich entstehen, sind Pseudohyphen lang gestreckte Sprosszellen.

Hyphen zeigen keine sichtbaren Einschnürungen an den Septen. Die Bildung von Hyphen

kann künstlich durch Serum in einer Konzentration von 5 bis 20 % [GOW & GOODAY, 1982;

ODDS, 1988] induziert werden. Myzel bezeichnet ein Geflecht der Hyphen und entsteht bei

lateraler Ausstülpung von Hyphen. Die beiden filamentösen Formen sind in der Lage, durch

Knospung wieder Blastosporen zu bilden.

Candida albicans kann unter guten Bedingungen schnell wachsen, die Generationszeit von

Sprosszellen liegt dann bei 20 Minuten. Außerdem verkraftet der Hefepilz Milieu-

schwankungen gut und wächst innerhalb eines breiten Temperatur- und pH-Bereichs. Durch

die Aktivierung einer H+-ATPase in der Zellmembran bei Glukoseaufnahme und der Bildung

von organischen Säuren sorgt er für ein Absinken des pH-Wertes [MONK et al., 1993;

SAMARANAYAKE, 1983]. Candida bevorzugt ein dunkles, feuchtes und warmes Milieu,

welches in den schleimhautausgekleideten Körperhöhlen der Menschen zu finden ist.

Candida albicans baut über den aeroben Stoffwechsel ein breites Spektrum an

Kohlenhydraten ab. Eingeschränkt ist die Vergärung. Glukose und Maltose werden schnell

umgesetzt, während Galaktose nur sehr langsam und Laktose gar nicht anaerob

metabolisiert werden können [SCHAUER & HANSCHKE, 1999]. Diese Merkmale werden zur

biochemischen Differenzierung der Hefen herangezogen.

1.3 Medizinische Bedeutung von Candida albicans

Candida albicans ist ein ernstzunehmender fakultativ humanpathogener Keim, der

besonders bei immungeschwächten Patienten rezidivierende oberflächliche Candidosen,

aber auch schwere systemische Infektionen mit infauster Prognose verursacht. Prä-

disponierende Faktoren für eine Candida-Infektion sind in Tabelle 1.2 zusammengefasst.

Einleitung 4

Tabelle 1.2: Prädisponierende Faktoren für eine Mykose, modifiziert nach SANDERINK et al. [2004]

Erkrankungen Iatrogene Maßnahmen Gefährdete Bevölkerungsgruppen

Langzeitantibiose (Breitband-) Gravide Zytostatikamedikation Früh- und Neugeborene

Immundefekte (angeboren oder erworben, z.B. HIV-Infektion)

Immunsuppressiva-Einnahme Greise Strahlentherapie Leukopenie und andere

hämatologische Erkrankungen Glukokortikoidmedikation konsumierende Erkrankungen Organtransplantation Diabetes mellitus Dialyse

maschinelle Beatmung chronische gastroenterologische Erkrankungen

intensivmedizinische Behandlung

Alkoholabusus, Drogenabusus Ernährungssonden großflächige Verbrennungen Harnblasenkatheter Polytrauma Infusionskatheter Herzklappenprothesen

1.3.1 Epidemiologie der Candida-Infektionen

Candida albicans kommt nicht ubiquitär in der freien Natur vor, deshalb erfolgt eine

Übertragung als Kontakt- oder Schmierinfektion auf direktem oder indirektem Wege von

Mensch zu Mensch oder von Tier zu Mensch.

Candida spp. gehören nicht zur physiologischen Standortflora des Menschen [SANDERINK et

al., 2004]. Als kommensaler Keim kommt der Hefepilz in der Mikroflora der Schleimhäute im

Mund, Gastrointestinaltrakt und Urogenitalbereich vor. Candida wird hier durch die

Wirtsabwehr und auch von Vertretern der physiologischen Keimflora an der Ausbreitung

gehindert. Die Betroffenen tragen Candida als kommensalen Keim in sich, es kommt nicht

zur Ausbildung eines Krankheitsbildes. Befindet sich die Wirtsabwehr in einem defizitären

Zustand (Tabelle 1.2), kann es dem opportunistischen Keim C. albicans gelingen, sich rasant

zu verbreiten. Es wurde beobachtet, dass kleine Änderungen des Abwehrstatus genügen,

um das sensible Gleichgewicht zwischen virulenten und defensiven Faktoren zu stören, und

der harmlose Kommensale wird zu einem aggressiven Pathogen [FIDEL et al., 1999].

Die meisten symptomatischen Candida-albicans-Infektionen sind endogenen Ursprungs, die

aufgrund einer Schwächung des Immunsystems oder einer Gleichgewichtsstörung in der

Mikroflora des Wirts zum Ausbruch kommen [PFALLER, 1996]. Daneben wurden vereinzelt

auch exogene Schmierinfektionen beschrieben. Ein hoher Prozentsatz des Krankenpflege-

personals wurde als Träger von Candida-Spezies identifiziert.

In den USA ist die Candida-Sepsis die vierthäufigste Form aller Infektionen der Blutbahnen

[BECK-SAGUE & JARVIS, 1993].

Einleitung 5

Die Mykosehäufigkeit steigt weltweit an. Die Ursachen liegen in einem größeren Kreis an

prädisponierten Patienten und der intensiveren medizinischen Behandlung der

Grunderkrankungen der Patienten. Zwischen 1980 und 1990 ermittelten die Centers for

Disease Control and Prevention einen Anstieg der Pilzinfektionen um 90 % von 2,0 auf 3,8

pro 1000 Fälle in Krankenhäusern, die am US National Nosocomial Infection Surveillance

Program teilgenommen haben [BECK-SAGUE et al., 1993].

Candida albicans wird auch als problematischer Hospitalismus-Keim angesehen. Gefährdet

sind vor allem immunkomprimierte Intensivpatienten mit intravenösen Kathetern, die dann

eine systemische Candidose erleiden. Drei Viertel aller nosokomialen Pilzinfektionen werden

auf C. albicans zurückgeführt.

1.3.2 Candida in der Mundhöhle Bei 31 bis 55 % der gesunden Bevölkerung können Candida-Spezies in der Mundhöhle

nachgewiesen werden [ODDS, 1988]. Die orale Isolierungshäufigkeit von Candida-Spezies ist

bei Diabetes-mellitus-Patienten [ODDS et al., 1978; BELAZI et al., 2005] und AIDS-Patienten

[SÁNCHEZ-VARGAS et al., 2005] gegenüber einer gesunden Kontrollgruppe deutlich erhöht.

Bei 70 % der Patienten mit Prothesenstomatitis konnten Hefepilze aus Abstrichen von

prothesenbedeckter Schleimhaut isoliert werden, wovon in 75 % der Fälle Candida albicans

auftrat [McMullan-Vogel et al., 1999]. Candida albicans wurde auf der Mundschleimhaut, im

Speichel, in der Plaque, in kariösen Läsionen und auch im infizierten Wurzelkanal

nachgewiesen. Das Auftreten von C. albicans in der oralen Flora kann durch Mundspülung

mit einer Testlösung ermittelt werden. Die Keimzahlen, die meist in Koloniebildenden

Einheiten (KBE) Candida albicans pro Milliliter Mundspüllösung der Probanden angegeben

werden, variieren in den einzelnen Arbeiten sehr stark. Allerdings liegen die Keimzahlen von

C. albicans etwa vier Zehnerpotenzen unter denen von Streptococcus mutans [ALMSTÅHL &

WIKSTRÖM, 1999; HINTAO et al., 2007; KUMAR et al., 2005]. WETZEL et al. fanden 1993

C. albicans im Speichel bei 71,7 % der Kinder mit fortgeschrittener Karies und nur bei 17,5 %

der Probanden der kariesfreien Kontrollgruppe. Die quantitativen Angaben zur Belastung von

Speichel variieren ebenfalls sehr. Plaqueproben von Kindern mit aktiver Karies wiesen in

71,8 % der Fälle Candida spp. auf [SCHULZ-WEIDNER et al., 2005]. Die Frequenz von

Candida albicans in der Plaque bei Kindern mit frühkindlicher Karies war mit 50 % signifikant

höher als in den Plaqueproben der Kontrollgruppe (13,4 %). Bei Kindern mit geschädigten

Milchgebissen war kariöses Dentin in 81,5 % [SZIEGOLEIT et al., 1999] bzw. 96,8 % [SCHULZ-

WEIDNER et al., 2005] der Fälle mit Candida-Spezies besiedelt. In kariösem Dentin wurde

überwiegend ein massenhaftes Vorkommen von Candida albicans nachgewiesen

Einleitung 6

[WETZEL et al., 1993]. Auch die Angaben zur Isolierungshäufigkeit von Candida-Spezies in

infizierten Wurzelkanälen schwanken sehr stark zwischen 7 % [WALTIMO et al., 1997] und

55 % [NAJZAR-FLEGER et al., 1992]. Die Besiedelung von Kariesläsionen wird als Reservoir

für Candida-Spezies gesehen, rezidivierende orale Candidosen auszulösen. Außerdem

wurde gezeigt, dass die Besiedelung der Mundhöhle mit C. albicans nach umfangreicher

Gebisssanierung deutlich zurückgeht, nicht aber durch lokale Verabreichung von

Antimykotika [SZIEGOLEIT et al., 1999].

1.3.3 Weitere klinisch relevante Candida-Spezies Durch Candida spp. werden 80 % aller Mykosen hervorgerufen [PFALLER, 1996]. C. albicans

wurde in 70 bis 80 % der Candidosen isoliert. C. glabrata und C. tropicalis haben einen

Anteil von je 5 bis 8 % der Isolate, während andere Nicht-albicans-Candida-Arten spärlich

gefunden werden [BECK-SAGUE et al., 1993; ODDS, 1988].

In den letzten Jahren wird über eine Zunahme von Infektionen mit Nicht-albicans-Candida-

Arten berichtet. Da Nicht-albicans-Arten teilweise gegen die am häufigsten angewendete

Antimykotika-Gruppe der Azole resistent sind, kommt es zu dem Selektionsdruck unter der

antimykotischen Therapie und damit zu einer Veränderung der Besiedelung [FIDEL et al.,

1999; KULLBERG & OUDE-LASHOF, 2002].

Tabelle 1.3: Übersicht medizinisch relevanter Nicht-albicans-Candida-Arten

Candida spp. Medizinische Merkmale

Candida glabrata

urogenitale Infektionen, disseminierte Infektionen, oft Fluconazol-resistent

Candida krusei systemische Infektionen, intrinsisch Fluconazol-resistent

Candida tropicalis disseminierte Infektionen bei Krebspatienten

Candida parapsilosis häufig katheterassoziierte Infektionen

Candida dubliniensis

orale Candidiasis bei HIV-Patienten, Morphologie und Biochemie wie C. albicans, kein Wachstum bei 45 °C

Candida guilliermondii systemische Infektionen nach chirurgischen Eingriffen

Candida lusitaniae lokale und systemische Infektionen bei Karzinompatienten

Einleitung 7

1.3.4 Klinik der Candida-Infektionen Eine durch Candida spp. verursachte Erkrankung heißt Candidose (Synonym Candidiasis).

Unterschieden werden die mukokutane (superfizielle) von der systemischen Candidose.

Candida albicans besiedelt neben dem Oro-Intestinaltrakt auch den Respirationstrakt,

Genitaltrakt, Harntrakt und Körperoberflächen. Die Candidosen der Haut und Schleimhäute

werden auch als Soor bezeichnet. Nach einer Fungämie kann es zu multiplem Organbefall

mit Organabszessen kommen. Exemplarisch werden die orale Candidose, die Candida-

Ösophagitis und die systemische Candidose näher beschrieben.

Tabelle 1.4: Klinische Formen der Infektion mit Candida albicans

Oberflächliche Formen (kutane und mukokutane)

Tiefe Formen (isolierter Organbefall oder Dissemination)

Haut- und Nagelinfektionen Zystitis, Pyelitis, Nierenabszesse Windeldermatitis Pneumonie Vulvovaginitis Meningitis Balanitis Perikarditis, Endokarditis Stomatitis Peritonitis Ösophagitis Fungämie, Septikämie Gastritis, Enteritis Uveitis

Orale Candidose Der Nachweis von Candida albicans in der Mundhöhle zeigt lediglich eine Kolonisation mit

dem Hefepilz an. Erst wenn entsprechende klinische Symptome hinzukommen, wird von

einer Candida-Infektion mit Ausbildung einer oralen Candidose gesprochen. Oropharyngeale

Candidiasis ist die häufigste Erkrankung bei Patienten mit AIDS [VARGAS & JOLY, 2002].

Über 90 % aller HIV-Infizierten entwickeln einmal eine orale Candidose während der

Progression zur AIDS-Erkrankung [OLLERT et al., 1995].

Candidiasis mucoseae oris tritt akut oder chronisch auf. Akute Formen lassen sich

differenzieren in die pseudomembranöse Form und die seltener auftretende erythematöse

Form. Bei der akuten pseudomembranösen Form zeigen sich stippchenförmige, später

konfluierende, weißliche, abstreifbare Beläge, unter denen sich eine hochrote, leicht

blutende Schleimhaut befindet [SCHALLER, 2006]. Die typischen weißen Beläge fehlen bei

der erythematösen Form, hier ist nur eine diffuse Rötung erkennbar. Chronische orale

Candidose kann verschiedene klinische Bilder zeigen. Beschrieben werden hyperplastische,

noduläre, plaqueartige und pseudomembranöse Formen. Weiße Beläge sind in den meisten

Fällen zu finden.

Einleitung 8

Die weißen Auflagerungen sind mechanisch durch Abwischen entfernbar, was aber zu

Schleimhauterosionen und -blutungen führt. Der Mundsoor tritt oft am Gaumen und an der

Wangenschleimhaut auf, kann aber im Prinzip alle Mundschleimhautareale befallen.

Subjektiv bestehen leichte Missempfindungen oder auch Beschwerdefreiheit [SCHALLER,

2006]. Von Prothesenbasis bedeckte Gaumenschleimhaut zeigt häufig eine Prothesen-

stomatitis, die oft mit Candida albicans assoziiert ist. Eine weitere Sonderform stellt die

anguläre Candida-Cheilitis (Synonyme: Perlèche, Faulecken) dar, die typisch für ältere

Patienten mit abgenutzten Prothesen und damit einhergehender zu geringer vertikaler

Dimension ist. Eine Candida-Glossitis zeigt ein „lackzungenähnliches“ Bild mit

Papillenverlust. Die schwarze Haarzunge ist auch in vielen Fällen mit Candida assoziiert.

Candida-Ösophagitis Ein Befall der Speiseröhre ist meist die Folge von Mundsoor. Endoskopisch wurde bei 2,1 %

aller untersuchten Patienten eine ösophageale Candidose diagnostiziert. Dieser Wert hat

sich indessen auf 3,5 % erhöht [SANDERINK et al., 2004]. Bei einer Gruppe von HIV-positiven

Patienten wurde durch endoskopischen Abstrich in 42 % ein Candida-Nachweis erbracht.

Die Ösophagusschleimhaut zeigt die typischen Entzündungszeichen wie Rötung und

Schwellung sowie weiße Auflagerungen. Die Candida-Ösophagitis verläuft entweder

asymptomatisch oder mit Schluckbeschwerden und retrosternalen Schmerzen. Soor-

Ösophagitis ist häufig mit fortgeschrittener AIDS-Erkrankung und hämatologischen

Erkrankungen assoziiert. Eine Candida-Gastritis kann ebenso vergesellschaftet sein.

Candidämie und systemische Candidose Eine systemische Candidose entsteht entweder endogen durch Invasion einer

oberflächlichen Candidose oder exogen durch Katheterbesiedelung, parenterale

Ernährungssonden oder Infusionslösungen. Bei verstärkter Kolonisation oder Mukosa-

schäden infolge Radiatio oder Chemotherapie kann eine oberflächliche Candidose invasiv

werden und in die Blutbahn einbrechen. Die Mehrheit der systemischen Candidosen geht

endogen aus einer Candida-Besiedelung des Magen-Darm-Traktes hervor [NUCCI &

ANAISSIE, 2001]. Gastro-Intestinal-Chirurgie gilt als Risikofaktor für eine disseminierte

Candidiasis, weil die Integrität der Darmmukosa unterbrochen wurde. Candida-besiedelte

intravenöse Katheter stellen eine weitere häufige Ursache für eine Einschwemmung in die

Blutbahn dar. Die resultierende Fungämie wird von immunabwehrstarken Patienten limitiert.

Bei gestörter Immunabwehr, insbesondere bei Neutropenie, Verbrennungen,

intraabdominellen Operationen, können Keime in andere Organe streuen, und es entstehen

multiple Mikroabszesse. Man spricht auch von Candida-Sepsis. Systemische Candidosen

Einleitung 9

treten überwiegend stationär als Komplikation von laufenden Therapiemaßnahmen auf.

Nosokomiale Pilzinfektionen sind zu 72 % von Candida-Spezies ausgelöst [JARVIS, 1995].

Systemische Candidosen weisen eine Mortalitätsrate von etwa 35 % auf [WENZEL, 1995].

1.3.5 Diagnostik der Candida-Infektionen

Sprosspilze der Gattung Candida lassen sich oft schon mikroskopisch aus Abstrichen als

Nativpräparat oder als Gramfärbung nachweisen. Je nach Lokalisation der Infektion eignen

sich Abstriche, Punktate, Respirationssekrete, Urin, Blut und Liquor zum kulturellen

Nachweis. Die Anzucht erfolgt bei 37 °C auf Sabouraud-Glukose-Agar und nährstoffarmem

Reis- oder Kartoffelwasseragar, auf denen sich die für Candida charakteristischen

Pseudomyzelien und Clamydosporen ausbilden. Eine eindeutige Differenzierung kann auch

über die biochemische Charakterisierung erfolgen. Mannane der Zellwand werden als

Candida-Antigene über den indirekten Latexagglutinationstest mit Serum oder Bronchial-

lavage nachweisbar. Körpereigene Candida-Antikörper können im Serum mittels

Komplementbindungsreaktion (KBR), Enzymimmunoassay (EIA), Hämagglutinationshemm-

test, Immunofluoreszenztest sowie eines Candida-Präzipitationstests bestimmt werden.

Diese Tests haben klinisch einen geringen Stellenwert, da sich eine systemische nicht von

einer lokalen Infektion unterscheiden lässt. Der Nachweis von Candida-DNA ist mittels PCR

oder Gen-Chips möglich und gewinnt für die Diagnostik zunehmend an Bedeutung. Diese

Tests ermöglichen auch den Nachweis von Candida albicans in der Mundhöhle und können

somit zur Bestimmung des Kariesrisikos beitragen.

1.3.6 Therapie der Candida-Infektionen

Die Pilzzellwand, Zellmembran und die Proteinsynthese sind wichtige Angriffsorte der

Antimykotika. Die Wirkung der Antimykotica kann fungistatisch oder fungizid sein.

Eine oropharyngeale oder vulvovaginale Candidose wird lokal und oder systemisch durch

Polyene oder Azole therapiert. Antimykotika können oral als Suspensionen oder

Lutschtabletten angewendet werden [SCHALLER, 2006]. Zur Therapie der so genannten

Prothesenstomatitis hat sich auch Chlorhexidindiglukonat als Spüllösung bewährt. Bei

Formen der systemischen Candidose oder bei Versagen der topischen Therapie bei lokaler

Candidose kommen Polyene, Azole oder Echinocandine systemisch zum Einsatz.

Katheterassoziierte Infektionen erfordern die Entfernung des besiedelten Fremdmaterials.

Zu den Polyenen zählen unter anderem Amphotericin B, Nystatin und Natamycin. Sie

zeichnen sich durch eine hohe Affinität zum Ergosterin, dem dominierenden Membranlipid

Einleitung 10

der Pilze, aus. Früher wurde Amphotericin B als Goldstandard bei der Behandlung

verschiedener Formen der Candidose angesehen, aber wegen der hohen Oto- und Nephro-

toxizität von dieser Position durch Fluconazol verdrängt. Fluconazol, Itraconazol und

Voriconazol sind Triazole und gehören zur Gruppe der Azole. Die zweite Untergruppe der

Azole bilden die Imidazole mit den beispielhaft genannten Vertretern Clotrimazol und

Ketokonazol. Azole bewirken eine Hemmung der Ergosterinsynthese. Fluconazol weist gute

pharmakologische Eigenschaften auf. Es kann oral oder parenteral verabreicht werden, ist

gut verträglich, wasserlöslich und erreicht hohe Plasmaspiegel. Fluconazol wirkt allerdings

nicht gegen Candida krusei. Echinocandine hemmen die Synthese von Glukan, das ein

wichtiger Bestandteil der Pilzzellwand ist. Durch diesen selektiven Wirkungsmechanismus

zeigt das zurzeit einzige Präparat Caspofungin eine gute Verträglichkeit.

Alle Antimykotika sind wesentlich länger einzusetzen als Antibiotika. Eine mindestens

14-tägige bis monatelange Einnahme ist notwendig.

Resistenzentwicklung Die Resistenzentwicklung gegen Antimykotika bei Pilzen ist viel seltener als bei Bakterien

gegen Antibiotika. Pilze können den Zugang zum Angriffspunkt des Medikaments

einschränken oder die Zielstruktur verändern. Sie können die antimikrobielle Substanz nicht

enzymatisch attackieren, wie das bei Bakterien häufig geschieht. Außerdem verfügen Pilze

nicht über Plasmide oder Transposons, die zur genetischen Kodierung der Resistenzen

dienen könnten.

1.4 Virulenzfaktoren von Candida albicans

Candida albicans verfügt über ein interessantes Arsenal an Virulenzfaktoren, die zwar eine

intakte Wirtsabwehr nicht zu Fall bringen können, aber dem Pilz eine dauerhafte Einordnung

in die Wirtsstandortflora ermöglichen. Erfolgt eine Schwächung des Wirtsorganismus, kann

es zu einer progressiven Ausbreitung von Candida albicans kommen. Die Adhärenz von

Pilzzellen an Epithelzellrezeptoren und anderen Wirtsstrukturen geschieht über eine Vielzahl

von Proteinen. Durch Sekretion von lytischen Enzymen gelingt Candida albicans die

Zerstörung der Epithelintegrität. Der Dimorphismus trägt entscheidend zur Epithelpenetration

und Invasion in tiefer gelegene Schichten bei. Durch Änderung des Phänotyps, dem so

genannten „phenotypic switching“, gelingt es Candida albicans, das Immunsystem vor eine

neue Situation mit neuen Antigenen zu stellen.

Einleitung 11

1.4.1 Zellwand und Adhäsion von Candida albicans

Früher nahm man an, die Zellwand ist eine träge und inaktive Struktur, die dem Protoplasten

Stabilität und Schutz bietet. Heute ist bekannt, dass die Zellwand essentiell an vielen

Zellvorgängen beteiligt ist. Die Zellwand stellt das äußerste Kompartiment der Hefezelle dar

und fungiert als Kontaktorgan zwischen dem Mikroorganismus und seiner Umgebung,

insbesondere dem Wirt. Die Untersuchung der Zellwand liefert wichtige Erkenntnisse über

Pathomechanismen, die in innovative Diagnose- und Therapieverfahren münden können.

Die Zellwand ist die formgebende Struktur der Pilzzelle, stellt eine Permeabilitätsgrenze dar

und bietet osmotische Stabilität. Nach vollständiger Entfernung der Zellwand entstehen

Protoplasten, die in Medien ohne osmotische Stabilisatoren lysieren [WALKER, 1999]. Die

Zellwand ermöglicht die Zell-Zell-Adhäsion zwischen Hefezellen untereinander und zur

Wirtszelle. Die Candida-albicans-Zellwand bestimmt die wesentlichen Faktoren der

Interaktion zwischen Wirt und Parasit durch Ausprägung von Adhäsionsfaktoren und

Auslösen der Wirts-Immunantwort, die gezielt aktiviert oder unterdrückt werden kann

[MARTINEZ et al., 1998].

Die Candida-albicans-Zellwand besteht zu 75 bis 90 % aus Kohlenhydraten. Darunter fallen

β-Glukane, Chitin und Mannan, das nur in Verknüpfung mit Proteinen zu Mannoproteinen

(Glykoproteinen) vorkommt. Außerdem enthält die Zellwand 6 bis 25 % Proteine und 1 bis

7 % Lipide [CHAFFIN et al., 1998]. β-Glukane und Chitin bilden das feste Grundskelett der

Zellwand, in das die anderen Bestandteile eingelagert sind. Die verschiedenen

phänotypischen Formen der Candida-albicans-Zelle weisen jeweils spezielle

Zellwandstrukturen auf. Filamente enthalten die dreifache Menge an Chitin gegenüber der

Sprosspilzzelle. Inzwischen sind viele Morphologie-spezifische Proteine identifiziert worden

[CHAFFIN et al., 1998].

Durch Transmissions-Elektronen-Mikroskopie mit speziellen cytochemischen und

kontrastschaffenden Agenzien konnten verschiedene Schichten differenziert werden, die

aber von Stamm zu Stamm und in Abhängigkeit von Kulturbedingungen variieren.

Verschiedene Autoren beschrieben drei bis acht verschiedene Schichten. Zwischen

Zellmembran und Zellwand liegt der perizelluläre Raum („periplasm“). In diesem Raum

befinden sich zahlreiche sezernierte Proteine, die meist die Zellwand nicht durchdringen

können [WALKER, 1999]. Die inneren Zellwandschichten enthalten mehr Glukan und Chitin,

die für eine rigide Struktur sorgen. Die äußeren Schichten erscheinen als ein dichtes

fibrilläres oder globuläres Netzwerk von radial ausgerichteten Fimbrien und enthalten mehr

Proteine und Glykoproteine [MARTINEZ et al., 1998]. Zellwand und Zellmembran sind eng

verflochten, was durch zahlreiche Membran-Invaginationen offensichtlich wird. Das Auftreten

verschiedener Schichten der Pilz-Zellwand scheint mehr durch quantitative Unterschiede der

Einleitung 12

verschiedenen Zellwandbestandteile in der jeweiligen Schicht, als durch qualitative

Unterschiede geprägt zu sein [CHAFFIN et al., 1998]. Im Proteinanteil der Zellwand sind auch

zahlreiche hydrolytische Enzyme nachgewiesen worden. Darunter fallen auch alle

sezernierten Enzyme, weshalb eine Unterteilung dieser Enzyme nach Funktion sinnvoll

erscheint. Enzyme wie Exo-β-(1,3)-Glukanase oder Chitinase, die Bestandteile der Zellwand

spalten, sind von Enzymen wie sezernierte Aspartylproteinasen, Phospholipasen und

Hyaluronidase zu differenzieren, die extrazelluläre Substrate hydrolysieren. Viele Enzyme

mit extrazellulären Substraten stellen transiente Proteine der Zellwand dar, deren

Bestimmung der extrazelluläre Raum ist [CHAFFIN et al., 1998].

Die Adhäsion von Candida albicans an Epithel- oder Endothelzellen und Strukturen der

extrazellulären Matrix wird als wichtiger initialer Schritt in der Virulenz eingeschätzt. Die

„agglutinin like sequence“ (ALS)-Genfamilie mit acht Mitgliedern kodiert glykosylierte

Zelloberflächenproteine, von denen für Als1p, Als3p und Als5p eine adhäsive Funktion zu

humanen Wangenschleimhautzellen und Fibronektin nachgewiesen werden konnte [FU et

al., 1998; ZHAO et al., 2004].

Ein ebenso glykosylphosphatidylinositol-verankertes Adhäsin ist das „hyphal wall protein 1“

(Hwp1). Der Aminoterminus von Hwp1 ist ein Substrat für die Transglutaminasen der

Säugetiere. So gelingt es der Candida-Zelle, stabile Verbindungen mit Epithelzellen

einzugehen [SUNDSTROM, 2002]. Ein weiteres Oberflächenprotein von Candida albicans ist

das Int1p, das Sequenzähnlichkeiten zu Integrinen von humanen Leukozyten aufweist und

an die extrazelluläre Matrix binden kann. Die Unterbrechung des Genes INT1 senkt die

Adhäsionsfähigkeit an humane Epithelzellen um 40 % und reduziert die Virulenz im

Mausmodell für eine systemische Candidose erheblich [GALE et al., 1998].

Auch für die Mannosyltransferase 1 von C. albicans, die Protein-Mannosyltransferase 1 und 6

sowie für Sap-Proteine konnte eine Bedeutung bei der Adhärenz von Candida albicans

nachgewiesen werden.

Ein erst in den letzten Jahren beleuchtetes Thema ist die Fähigkeit von C. albicans, an

implantierte medizintechnische Materialien zu adhärieren und widerstandsfähige Biofilme zu

bilden [DOUGLAS, 2003]. In Biofilmen organisierte Candida-Kulturen sind deutlich

antimykotikaresistent [AL-FATTANI & DOUGLAS, 2006]. Es wurde eine Korrelation zwischen

dem Grad der Virulenz und der Fähigkeit zur Biofilmbildung gefunden [CHANDRA et al., 2001;

DOUGLAS, 2003].

Einleitung 13

1.4.2 Phänotypenwechsel

Ein reversibles Wechseln des sichtbaren Phänotyps der Zell- und Koloniemorphologie in

C. albicans bezeichnet man als „phenotypic switching“. Es erfolgt spontan bei Einzelzellen

mit einer Frequenz von 10-4 bis 10-1 Hz und geht mit Veränderungen von Stoffwechsel-

prozessen, in der Antigen-Expression, Adhäsion und Gewebeaffinität einher [SOLL, 1997].

Durch bestimmte Umweltreize kann der Phänotypenwechsel auch künstlich erzeugt und ein

Massenwechsel der Zellen einer Kultur erzielt werden. Am besten untersucht ist das so

genannte „white-opaque-switching“ des WO-1-Stammes [SOLL, 1997], der lediglich zwischen

zwei Phänotypen wechselt (Abbildung 1.1). Während die „white“-Form dieses Stammes

glatte und weiße Kolonien und runde bis ovale Zellen aufweist, zeigt die „opaque“-Form eine

flache gräuliche Kolonieform und elongierte stäbchenförmige Zellen mit einer großen

Vakuole und als „pimple“ bezeichnete Ausstülpungen [ANDERSON et al., 1990].

Abbildung 1.1: Unterschiede zwischen der „white“ und „opaque“ Form des Candida-albicans- Stamms WO-1 (aus SOLL [1997], mit Genehmigung des Verlages) Legende: w - „white“ Kolonie; op - „opaque“ Kolonie; p - Zellwandausstülpungen; Pfeilköpfe zeigen auf Knospungsstellen. Bei anderen Stämmen konnte aber eine deutlich größere Vielfalt an Phänotypen gefunden

werden. Stamm 3153A zeigt beispielsweise bis zu fünf verschiedene Kolonieformen („star“;

„stippled“; „hat“; „irregular wrinkle“; „fuzzy“) [SOLL, 1992]. Jeder Kolonietyp kann sich spontan

in einen anderen umwandeln und auch Mischformen werden beobachtet. Damit ist die

experimentelle Analyse dieses komplexen Phänotypenwechsels nahezu unmöglich. Der

Phänotypenwechsel ermöglicht eine Immunevasion der Candida-Zellen. Die Bedeutung des

Einleitung 14

Phasenwechsels für die Virulenz von C. albicans zeigt sich an einer erhöhten Wechselrate

von frischen klinischen Isolaten [SOLL, 1992].

1.4.3 Dimorphismus

Die Fähigkeit von Candida albicans, zwischen Sprosspilzzelle und Hyphenform zu wechseln,

wird als bedeutende Komponente der Virulenz angesehen (Abbildung 1.2). Der Hyphenform

wird bei Candidosen hinsichtlich der Adhäsion und der Invasion eine besondere Virulenz

zugesprochen [CUTLER, 1991]. Klinische Isolate enthalten in der Regel sowohl Blastosporen

als auch Filamente. Hyphale Elemente sind in der Lage, Epithelien zu durchwachsen. Die

Bildung von Hyphen ermöglicht es C. albicans, in vitro aus phagozytierenden Makrophagen

und Neutrophilen auszubrechen [VAZQUEZ-TORRES & BALISH, 1997].

Abbildung 1.2: Wechselmöglichkeiten zwischen den morphologischen Formen von Candida albicans (aus ERNST [2000], mit Genehmigung des Verlages) Die Hyphenbildung kann durch verschiedene Reize induziert werden. Eine Temperatur von

37 °C und ein neutraler pH-Wert begünstigen die Entwicklung echter Hyphen [BUFFO et al.,

1984]. Nährstoffmangel führt auch als Einzelfaktor zur Hyphenbildung. Als Standard in der

Diagnostik von C. albicans wird zur Induktion der Hyphenform Serum in einer Konzentration

von 5 bis 20 % eingesetzt [ERNST, 2000].

Candida albicans benutzt ein Netzwerk aus vielen Signal-Transduktionswegen, um die

Transformation von der Sprosspilzzelle zur Hyphenzelle zu kontrollieren. Durch

Einleitung 15

verschiedene Transkriptionsfaktoren wird die Expression eines typischen Musters von

hyphenspezifischen Genen kontrolliert, von denen viele als bekannte Virulenzfaktoren

agieren [LIU, 2001].

1.4.4 Thigmotropismus

Thigmotropismus, der im Englischen auch als „contact sensing“ bezeichnet wird, beschreibt

die Fähigkeit des Pilzes, sein Hyphenwachstum nach den Oberflächenstrukturen des Wirts

auszurichten. Neben dem Wachsen entlang von Zellgrenzen wurde beobachtet, dass die

Fadenstrukturen zielgerichtet mikroskopisch kleine Diskontinuitäten des Epithels finden und

so Schwachstellen im Gewebe für eine leichtere Penetration des Wirtsepithels nutzen

[SCHALLER, 2006].

1.4.5 Hydrolytische Enzyme von Candida albicans

Die drei bedeutendsten von Candida albicans produzierten extrazellulären Hydrolasen sind

sezernierte Aspartylproteinasen (Saps), Phospholipase B und Lipasen.

Peptidasen und Proteinasen von Candida albicans

Die bereits umfangreich untersuchten sezernierten Aspartylproteinasen werden gesondert im

Abschnitt 1.5.5 abgehandelt.

Die bekannten intrazellulären Peptidasen von Candida albicans sind oft unzureichend

charakterisiert. In mehreren Arbeiten wurde nicht erwähnt, ob die Enzyme auch extrazellulär

nachgewiesen werden können. Eine umfangreiche Analyse der Aminopeptidase-Aktivitäten

verschiedener Pilze beinhaltet eine 1975 veröffentlichte Arbeit von LEE und Mitarbeitern. Bei

C. albicans wurden hohe Aminopeptidase-Aktivitäten für L-alanyl-, L-leucyl-, L-methionyl- und

L-prolylhaltige Peptidsubstrate bestimmt. Geringere Aktivitäten wurden unter anderem für

L-Arginyl-, L-Lysyl- und L-Phenylalanyl-β-naphthylamid nachgewiesen.

PORTILLO und GANCEDO fanden 1986 bei der Untersuchung von Zellaufschluss eine

Aspartylproteinase mit einem pH-Optimum von etwa 5, eine Aminopeptidase und eine

Dipeptidase mit Aktivitätsmaxima im leicht basischen pH-Bereich. Da damals noch nicht die

Vielfalt der Saps bekannt war, kann die 1986 gefundene proteolytische Aktivität bei saurem

pH-Wert nach heutigem Erkenntnisstand als intrazelluläre Form einer Sap gedeutet werden.

Die Arbeitsgruppe um PORTILLO untersuchte nicht, ob die gefundene Aktivität auch im

Kulturüberstand einer Candida-albicans-Kultur nachweisbar ist.

Beschrieben wird auch die Proteinase B (ycaB). Diese Serinproteinase kommt sowohl in

C. albicans als auch in Saccharomyces cerevisiae vor [FARLEY et al., 1986]. BAUTISTA-

Einleitung 16

MUNOZ et al. [2005] zeigten, dass Candida albicans ein Gen zur Expression der Dipeptidyl-

Aminopeptidase A trägt. OROZCO et al. entdeckten 2002 das Gen PRB1, welches eine neue

Endoprotease B verschlüsselt. NISHIMURA et al. konnten 2002 eine zellassoziierte Spaltung

von 2-Furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) bei physiologischem pH-Wert nachweisen.

Von der Arbeitgruppe um RODIER wurden mehrere gelatinolytische Serin-Proteinase-

aktivitäten durch Zymographie mit gelatinehaltigen Gelen gefunden [RODIER et al., 1994].

Weiterhin beschrieb diese Arbeitsgruppe die Entdeckung einer hauptsächlich in der Zellwand

lokalisierten Metallopeptidase. Bei neutralem pH-Wert konnte für dieses Enzym

elektrophoretisch die vollständige Spaltung von Typ-I-Kollagen und Fibronektin sowie der

partielle Abbau von Typ-IV-Kollagen und Laminin gezeigt werden [RODIER et al., 1999].

Mittels Zymogramms untersuchte eine weitere Arbeitsgruppe das gelatinolytische Potential

von konzentrierten Kulturüberständen aus BHI-Flüssigkultur von Candida-albicans-Isolaten

HIV-positiver Patienten [BRITO COSTA et al., 2003]. Durch Inhibitionsversuche wurden zwei

dieser Peptidase-Aktivitäten als Serinproteinasen und zwei als Metalloproteinasen

identifiziert. In einer neueren Arbeit dieser Gruppe wurde für eine Serinproteinaseaktivität

und eine Metalloproteinaseaktivität in BHI-Kulturüberstandkonzentraten durch

Elektrophorese der Abbau von RSA, Hämoglobin, Fibronektin und Laminin bei

physiologischem pH-Wert gezeigt [SANTOS et al., 2006].

Lipasen

Hierzu zählen Esterasen und Lipasen. Beide können Esterbindungen von Mono-, Di- oder

Triacylglycerolen oder Phospholipiden spalten. Lipasen arbeiten an der Grenze zwischen der

unlöslichen Triacylglycerol-Phase und Wasser, während Esterasen an löslichen Substraten

angreifen. Extrazelluläre Lipase-Aktivität wurde bereits 1966 entdeckt und eine sezernierte

Esterase von TSUBOI et al. [1996] beschrieben. Mittels Analyse der genomischen DNA

konnte eine Familie mit zehn lipolytischen Genen (LIP1-LIP10) gefunden werden, von denen

neun eine N-terminale Signalsequenz enthalten [HUBE et al., 2000]. Diese Vielfalt an

LIP-Genen zeigt möglicherweise die breite lipolytische Aktivität, die zur Virulenz und

Persistenz von Candida albicans beisteuert. Die Bedeutung und Funktion der Lipasen bleibt

aber noch aufzuklären.

Phospholipase B

Phospholipasen bilden eine Gruppe von Enzymen, die eine oder mehrere Esterbindungen in

Glycerophospholipiden in Zellmembranen spalten können. Es wurden verschiedene Gruppen

von Phospholipasen bei C. albicans entdeckt, eingeteilt in Phospholipasen A, B, C und D.

Heute sind zwei Gene für extrazelluläre Phospholipasen (Gruppe B) entdeckt: CaPLB1

[LEIDICH et al., 1998] und CaPLB2. Die Funktion der Phospholipasen in der Candida-Virulenz

Einleitung 17

ist noch nicht ausreichend untersucht. Es gibt Hinweise, dass Phospholipasen die

Wirtszellpenetration ermöglichen, die Adhäsion an Epithelzellen verbessern, eine Rolle bei

der Invasion von rekonstruierter humaner Mundschleimhaut spielen und mit der Wirts-

Signaltransduktion interferieren [SCHALLER et al., 2005].

1.5 Peptidasen

Im Folgenden werden wichtige Aspekte der Enzymgruppe der Peptidasen dargestellt. Im

Speziellen wird ausführlich auf die sezernierten Aspartylproteinasen (Saps) von C. albicans

eingegangen.

1.5.1 Funktionen von Peptidasen

Peptidasen gewährleisten verschiedene wichtige Funktionen der Zelle bzw. des Organismus.

Um adäquat auf verschiedenste Umweltbedingungen oder rezeptorvermittelte Informationen

reagieren zu können, muss die Zelle in der Lage sein, ihr Proteinmuster zeitnah zu

verändern. Der kontrollierte Proteinabbau ist ebenso wichtig wie deren Biosynthese. Der

Abbau von chemisch geschädigten, fehlerhaft translatierten oder missgefalteten Proteinen

liefert Bausteine für neue Polypeptide und wichtige Metabolite für diverse Stoffwechselwege.

Dadurch werden falsche Syntheseleistungen ausgeglichen und Ablagerungen von Proteinen

verhindert, die zu einer Störung des sensiblen intrazellulären Milieus führen könnten.

Sezernierte Peptidasen bauen extrazelluläre makromolekulare Substrate zu Aminosäuren

ab, die dann dem intrazellulären Aminosäurepool zugeführt werden können. Durch den

spezifischen Abbau von Enzymen kann die Zelle Stoffwechselprozesse regulieren. Viele

Enzyme werden durch limitierte Proteolyse der inaktiven Vorstufen (Zymogene) in die

katalytisch aktive Form überführt.

1.5.2 Klassifikation der Peptidasen

Nach der Nomenklatur der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-

IUBMB) [http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/EC34] werden Enzyme, die hydrolytisch

Peptidbindungen spalten, als Peptidasen bezeichnet und in die Klasse der Hydrolasen EC 3

eingeordnet. Der Unterpunkt EC 3.4 enthält die Gruppe der Peptidasen, die abhängig von

ihrem Angriffspunkt im Substratmolekül in Endo- und Exopeptidasen unterteilt werden

(Abbildung 1.3).

Einleitung 18

Endopeptidasen, kurz auch als Proteinasen bezeichnet, spalten Peptidbindungen im Inneren

von Proteinketten. Nach dem Aufbau des katalytischen Zentrums werden die Serin-,

Threonin-, Cystein-, Aspartat-, Metalloproteinasen und Proteinasen unbekannten Typs

unterschieden.

Die Exopeptidasen werden am C- oder N-terminalen Ende der Peptidketten wirksam und

können durch Unterschiede in ihrem Spaltungsort, Substrat oder Reaktionsprodukt in

Untergruppen (EC 3.4.11.n bis EC 3.4.19.n) eingeteilt werden. Aminopeptidasen greifen an

der N-terminalen Aminosäure an und erhalten ihren Namen nach der bevorzugt

abgespaltenen Aminosäure. Di- und Tripeptidylpeptidasen trennen Peptide, die aus zwei

bzw. drei Aminosäuren bestehen, ab. Am C-Terminus eines Peptids angreifende

Exopeptidasen spalten einzelne Aminosäuren (Carboxypeptidasen) oder Dipeptide

(Peptidyl-Dipeptidasen) ab. Den Abbau von Dipeptiden realisieren spezifische Dipeptidasen.

Omegapeptidasen können Isopeptidbindungen auftrennen sowie terminal substituierte oder

zyklische Aminosäuren abspalten.

Abbildung 1.3: Einteilung der Peptidasen (aus MCDONALD [1986], mit Genehmigung des Verlages) Neben der Klassifikation der IUBMB für Peptidasen existieren noch weitere Einteilungen.

Hervorzuheben ist die von RAWLINGS und BARRETT [1993] angegebene Ordnung.

Entsprechend dem katalytischen Typ werden Peptidasen erst in die zuvor genannten

Einleitung 19

Gruppen eingeteilt und diese nach Verwandtschaft der Primärstruktur des aktiven Zentrums

in Familien unterteilt. Diese Einteilung wird aufgrund signifikanter Ähnlichkeit ihrer

Aminosäuresequenz im aktiven Zentrum oder ihrer cDNA-Sequenz vorgenommen. Die

Ergebnisse sind in der MEROPS-Datenbank [RAWLINGS & BARRETT, 1999 und 2000;

http://www.merops.co.uk/] zusammengetragen. Zeigen Familien eine ähnliche Tertiärstruktur

des katalytischen Zentrums, werden sie in so genannten Clans zusammengefasst. Die

Mitglieder eines Clans haben sich evolutionär so weit auseinander entwickelt, dass eine

Ähnlichkeit nicht mehr über die Primärstruktur, sondern nur noch über die Tertiärstruktur des

katalytischen Zentrums feststellbar ist. Für die Mitglieder eines Clans kann so ein

gemeinsames Vorläuferenzym bestimmt werden [BARRETT et al., 2004].

Die Spaltung einer Peptidbindung geht mit deren Polarisierung durch einen nukleophilen

Angriff auf den Carbonylkohlenstoff einher. Die einzelnen Proteinasegruppen unterscheiden

sich in der Ausbildung der nukleophilen Gruppe. Bei Serin-, Threonin- und

Cysteinproteinasen wirkt direkt der Hydroxylrest bzw. die Sulfhydrylgruppe der Aminosäure

im aktiven Zentrum als Nukleophil, während Aspartyl- und Metalloproteinasen über ein

aktiviertes Wassermolekül funktionieren, das im deprotonierten Zustand die Peptidbindung

spalten kann. Die letztgenannten Proteinasen gehen keine kovalente Bindung mit dem

Substrat ein.

1.5.3 Aminopeptidasen

Aminopeptidasen kommen sowohl in tierischen als auch bei pflanzlichen Organismen vor. In

zahlreichen humanen Geweben sind sie nachgewiesen worden, exprimiert auf der

Zelloberfläche, innerhalb von Zellorganellen, im Zytosol und, als sezernierte Form, in

Körperflüssigkeiten [BARRETT et al., 2004]. Die meisten Aminopeptidasen gehören nach

ihrem katalytischen Typ zu den Metallopeptidasen [TAYLOR, 1993].

1.5.4 Metallopeptidasen

Die Metallopeptidasen tragen in ihrem katalytischen Zentrum ein zweifach positiv geladenes

Metallion. Bei der Mehrheit der Enzyme handelt es sich um ein Zinkion oder seltener um

zwei Zinkionen [TAYLOR, 1993]. Kobalt- oder Mangan-enthaltende Enzyme benötigen immer

zwei dieser Ionen im katalytischen Zentrum [BARRETT et al., 2004]. Die positive Ladung der

Metallionen ermöglicht die Aktivierung eines Wassermoleküls, und dieses greift die zu

hydrolysierende Peptidbindung an. Eine weitere Unterteilung der Metallopeptidasen erfolgt

nach den an der Bindung des Metallions beteiligten Aminosäureresten. Die Funktion als

Einleitung 20

Metallligand können die Aminosäuren Histidin, Glutamat, Aspartat und Lysin übernehmen

[BARRETT et al., 2004].

Die Bindung des Zinkions der Monozinkenzyme im katalytischen Zentrum geschieht über

drei Aminosäuren. Die Zink-Bindungsdomäne enthält das typische Motiv

Histidin-Glutamat-X-X-Histidin (HEXXH), wobei die beiden mit X markierten Positionen durch

ungeladene Aminosäuren besetzt werden. Die beiden Histidin-Reste der Zinkbindungs-

domäne sowie ein weiter C-terminal gelegener Glutaminsäure-Rest fungieren als

Bindungsliganden und positionieren das Zinkion im Proteinmolekül. Metallopeptidasen mit

dieser Struktur sind zum Clan MA zusammengefasst. Insgesamt wurden acht Clans

innerhalb der Gruppe der Metallopeptidasen gefunden. Das zuerst entdeckte Enzym des

Clans MA war das Thermolysin vom Bakterium Bacillus thermoproteolyticus. Die

Tertiärstruktur konnte von COLMAN [1972] aufgeklärt werden. Seitdem gilt das Enzym als

Prototyp der MA-Enzyme.

Bei einer anderen wichtigen Gruppe des Clans MA der Metallopeptidasen, den Matrix-

Metalloproteinasen (MMPs) [NAGASE & WOESSNER, 1999], konnte durch Röntgenstruktur-

analyse gezeigt werden, dass der Glutamatrest im HEXXH-Motiv vermutlich als Base wirkt,

die bei der Aktivierung des Wassermoleküls ein Proton bindet.

Die Zink-Bindungsdomänen anderer Clans sind oft nur geringfügig gegenüber der von

Clan MA verändert. Clan MB trägt zum Beispiel auch das HEXXH-Motiv und unterscheidet

sich lediglich im dritten Liganden. Clan ME zeigt das leicht modifizierte Zink-Bindungsmotiv

HXXEH-Motiv. Hier ist aber wie bei MA das Glutamat der dritte Ligand.

1.5.5 Sezernierte Aspartylproteinasen (Saps) von Candida albicans

Eine proteolytische Aktivität wurde erstmals 1965 entdeckt, die es dem Pilz ermöglicht,

Protein abzubauen, wenn es die einzige Stickstoffquelle darstellt. Isoliert und charakterisiert

wurde sie erstmals 1968 von REMOLD und Mitarbeitern. Die Sap-Proteine nehmen eine

Schlüsselstellung in der Virulenz des Keimes ein [HUBE & NAGLIK, 2001].

Gruppe der sezernierten Aspartylproteinasen

Es konnten die in Abbildung 1.4 dargestellten zehn SAP-Gene identifiziert werden, deren

„open reading frames“ (ORF) eine Länge von 1173 bis 1764 bp aufweisen und auf fünf

verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind [NAGLIK et al., 2003; HUBE & NAGLIK, 2001].

Die Proteine Sap1 bis Sap3 tragen bis zu 67 % identische, die Untergruppe Sap4 bis Sap6

bis zu 89 % identische Aminosäuresequenzen, während Sap7 nur zu 20 bis 27 %

Übereinstimmung zu den anderen Sap-Aminosäuresequenzen aufweist [HUBE & NAGLIK,

2001].

Einleitung 21

Abbildung 1.4: Dendrogramm der Sap-Familie (aus STEHR et al. [2000], mit Genehmigung des Verlages) Alle zehn Sap-Proteine werden als Präproenzyme synthetisiert und über die zellulären

Membransysteme zur Sekretion gebracht.

Die zehn Saps zeigen zwei hochkonservierte Abschnitte mit Aspartylproteinase-Funktion, die

ein pepsinähnliches aktives Zentrum bilden, und eine dritte konservierte Region am

C-Terminus des Proteins. Am umfangreichsten wurde Sap2 charakterisiert. Von diesem

Enzym ist die dreidimensionale Struktur bereits aufgeklärt [ABAD-ZAPATERO et al., 1996].

Eigenschaften der Sap-Proteine

Sap-Proteine haben Molekülmassen von 35 bis 48 kDa. Der pH-Bereich der proteolytischen

Aktivität reicht von 2 bis 7, wobei Sap1 bis Sap3 die höchste Aktivität bei einem pH-Wert von

3,5 und Sap4 bis Sap6 bei 5,0 aufweisen [SMOLENSKI et al., 1997; BORG-VON ZEPELIN et al.,

1998]. Sap2 und die Gruppe Sap4 bis Sap6 sind stabil und aktiv auch bei neutralem pH-Wert

[WAGNER et al., 1995; SCHALLER et al., 2005]. Die Wirksamkeit der Saps über diesen breiten

pH-Bereich ermöglicht der Candida-Zelle eine proteolytische Aktivität bei der Besiedelung

der vaginalen Schleimhaut mit ihrem sauren Milieu und der Mundhöhle bei neutralem pH-

Wert. Sap2 denaturiert bei pH-Werten oberhalb von etwa 8,4 irreversibel [WAGNER et al.,

1995]. Die Enzymaktivität der Saps kann in vitro sehr effizient mit dem Aspartylproteinase-

inhibitor Pepstatin A, einem Hexapeptid von Streptomyces, inhibiert werden [PICHOVA et al.,

2001].

Einleitung 22

Substrate der Saps - Wechselwirkungen mit dem Wirtsorganismus

Das Substratspektrum von Sap2 wurde umfangreich untersucht. Sap2 verfügt über ein

breites Substratspektrum, das viele humane Proteine beinhaltet. Hierzu zählen Bestandteile

der extrazellulären Matrix wie Kollagen, Keratin, Fibronektin, Laminin und Vimentin [HUBE,

1996; RAY & PAYNE, 1990]. Durch den Abbau der äußeren Schutzschichten des Körpers wird

es Candida albicans möglich, in tiefer gelegene Schichten vorzudringen, eventuell in das

Gefäßsystem einzubrechen und eine disseminierte Infektion zu verursachen. Der Abbau der

extrazellulären Bestandteile liefert nicht nur wichtige Nährstoffe für Candida albicans,

sondern ermöglicht auch die verbesserte Anheftung der Zellen an körpereigene Strukturen.

Selbst Zahnhartsubstanz ist von Sap abbaubar. KAMINISHI und Mitarbeiter zeigten 1986 den

Abbau von demineralisiertem Dentin im sauren Milieu durch ein sezerniertes Enzym, das

nach langer Inkubation von Candida mit Dentinpulver aus dem Kulturüberstand gewonnen

wurde [KAMINISHI et al., 1995]. Das beschriebene Enzym weist viele Merkmale einer

sezernierten Aspartylproteinase auf, was eine Gruppenzugehörigkeit nahe legt. Viele

körpereigene Abwehrfaktoren werden hydrolysiert wie Muzin, sekretorisches

Immunglobulin A und andere Immunglobuline, Laktoferrin des Speichels, Laktoperoxidase,

Cathepsin D (ein intrazelluläres lysosomales Enzym der Leukozyten), Complement-Faktoren

[KAMINISHI et al., 1995], der Proteinaseinhibitor α2-Makroglobulin des Plasmas und der

Cysteinproteinaseinhibitor Cystatin A der Epidermis. Sap2 sorgt auch für eine Verstärkung

der Entzündungsreaktion durch proteolytische Spaltung der Präcursoren von Interleukin-1β

und Hageman-Faktor, der als Serinproteinase des Kallikrein-Kinin-Systems fungiert. Durch

die Aktivierung der Faktoren X, XII (Hageman-Faktor) und Prothrombin interagiert Sap2 auch

mit der Gerinnungskaskade des Blutes [NAGLIK et al., 2003].

Saps sorgen vermutlich auch für ein Anfachen der Entzündungsreaktion in der Schleimhaut.

In einem In-vitro-Modell der vaginalen Candidose mit rekonstruiertem humanem

Vaginaepithel konnte ein Anstieg von proinflammatorischen Cytokinen nachgewiesen

werden [SCHALLER et al., 2005].

Diese Ergebnisse deuten auf eine eminente Bedeutung von Sap2 bei der Manipulation der

lokalen und systemischen Wirtsabwehr durch Candida albicans hin. Über das Substrat-

spektrum der anderen Sap-Proteine ist noch nicht viel bekannt. Es wird angenommen, dass

die anderen Mitglieder der Sap-Familie ein ähnliches Substratspektrum bei jeweils

bestimmten Umweltfaktoren hydrolysieren. Damit wird es Candida albicans ermöglicht, die

verschiedenen Körperregionen zu kolonisieren. Allerdings werden auch Unterschiede im

Substratspektrum vermutet, da die Sap-Familie nicht durchweg homogen ist. So sind Sap9

und Sap10 durch den GPI-Anker membrangebunden und haben deshalb eine andere

Funktion inne als die restlichen Sap-Proteine [NAGLIK et al., 2003].

Einleitung 23

Katalytischer Mechanismus der Saps

Den Kern des aktiven Zentrums bilden zwei Aspartatreste, die für die Spaltung der

Peptidbindung wichtig sind [ABAD-ZAPATERO et al., 1996]. Die Spaltung erfolgt durch den

nukleophilen Angriff eines Wassermoleküls. Das deprotonierte Aspartat polarisiert das

Wassermolekül, während der andere Aspartatrest eine Wasserstoffbrücke zur Carbonyl-

gruppe der zu spaltenden Peptidbindung ausbildet.

Dadurch wird die C=O-Bindung des Peptids polarisiert und der nukleophile Angriff am

Kohlenstoff erleichtert. Im tetraedrischen Übergangszustand ist das Wassermolekül

intermediär an die Amidgruppe gebunden [BÖHM et al., 1996].

Expression in Abhängigkeit der Umgebung

In vitro wird SAP2 am häufigsten exprimiert [HUBE et al., 1994; SCHALLER et al., 2005]. Die

Expression von SAP9 und SAP10 scheint unabhängig von Umgebungsfaktoren zu sein.

Sap9 und Sap10 sind konstitutive Enzyme aller Wachstumsformen [SCHALLER et al. 2005].

Die Sekretion von Sap1 und Sap3 ist nur bei der opaken Form des WO-1-Stammes

nachweisbar. Einige Stämme exprimieren allerdings auch Sap3 in der „white“-Form

(Abbildung 1.5). Die Sap4- bis Sap6-Unterfamilie ist assoziiert mit der Hyphenform und

neutralem pH-Wert [HUBE et al., 1994]. Das zeigten auch Studien mit polyklonalen

Antikörpern. Während Sap4 bis Sap6 nur auf der Oberfläche von hyphalen Zellen zu finden

waren, konnten Sap1 bis Sap3 auf beiden morphologischen Formen nachgewiesen werden

[FELK et al., 2002; SCHALLER et al., 1998].

Abbildung 1.5: Expression der SAP-Gene der einzelnen phänotypischen Formen in vitro (aus HUBE et al. [1994], mit Genehmigung des Verlages) Unter der „yeast“-Form ist die „white“-Form zu verstehen.

Virulenzfaktor Sap

An rekonstruierter menschlicher Mukosa (reconstituted humane epithelium, RHE) wurde in

vitro gezeigt, dass die Anheftung und Epithelzerstörung durch Candida albicans mit

Einleitung 24

Pepstatin A gehemmt werden kann [RAY & PAYNE, 1988; SCHALLER et al., 2000]. Das

pathogene Potential der Sap-Enzyme wurde mittels Sap-defizitären Stämmen im Ratten-

Vaginal-Candidose-Modell untersucht. Defizitäre Stämme, die ein oder mehrere Saps nicht

bilden können, waren dennoch virulent. Es konnte nachgewiesen werden, dass stattdessen

alternative SAP-Gene oder andere Faktoren stärker exprimiert werden [SCHALLER et al.,

2005]. Sehr geringe Virulenz zeigte eine Sap2-defizitäre Singlemutante, geringere Sap1- und

Sap3-Singlemutanten und unveränderte Virulenz eine Sap4, 5, 6-Dreifach-Mutante [DE

BERNARDIS et al., 1999]. Am Maus-Modell wurde auch die Virulenz der Sap-Mutanten für die

disseminierte Candida-Infektion getestet. Sap1, 2, 3-Dreifach-Mutanten zeigten kaum

abgesenkte Virulenz, während Sap4, 5, 6-Dreifach-Mutanten deutlich herabgesetzt pathogen

waren [SANGLARD et al., 1997]. Diese Daten sprechen für die hohe Bedeutung von Sap4,

Sap5 und Sap6 bei invasiver Candidose.

Die Sap-Aktivität frischer Candida-Isolate oraler Candidose-Patienten war signifikant höher

als die der Isolate aus gesunden Mundhöhlen [OLLERT et al., 1995]. In vivo werden meist

hohe Titer von Sap2-IgG im Serum und Sap2-IgA in der Schleimhaut von Candidose-

Patienten nachgewiesen, wobei bei etwa 20 % der Patienten mit systemischer Candidiasis

nur geringe Antikörpertiter gemessen werden können, was vermutlich mit einer allgemeinen

Abwehrschwäche in Verbindung steht [NAGLIK et al., 2003]. Eine schützende Rolle von

Antikörpern gegen Sap2 wurde für das Vaginitis-Ratten-Modell festgestellt [DE BERNARDIS et

al., 1997].

Sezernierte Aspartylproteinasen anderer Candida-Arten

SAP-Aktivität konnte auch bei den Candida-Spezies Candida dubliniensis, Candida tropicalis

und Candida parapsilosis nachgewiesen werden.

1.6 Kollagen-Struktur

Beim Menschen wurden bisher 25 verschiedene Kollagen-Gene und 19 verschiedene

Kollagentypen gefunden [WATANABE, 2004]. Kollagen hat einen Anteil von 30 % am

Gesamtprotein des menschlichen Körpers. Kollagenmoleküle bestehen immer aus drei

Polypeptidketten, die identisch oder verschieden sein können und stabförmige (tripelhelikale)

und globuläre Abschnitte bilden. Drei linksgängige helikale Einzelketten bilden eine

rechtsgängige Superhelix mit einem Molekulargewicht von etwa 300 kDa. Diese Formation

basiert auf der Aminosäuresequenz (Gly-X-Y)n der Einzelstränge [GALLOP et al., 1972]. Jede

dritte Aminosäure liegt im Zentrum der Helix und muss aus sterischen Gründen Glycin sein,

da hier kein Raum für eine Seitenkette vorhanden ist [VAN-DER-REST & GARRONE, 1991]. An

Einleitung 25

X-Position steht meist Prolin, an Y-Position Hydroxyprolin oder seltener Hydroxylysin. Die

drei Einzelketten der Superhelix werden durch Wasserstoffbrückenbindungen und

hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten. An beiden Enden der Tripelhelix

befinden sich nichttripelhelikale Telopeptide bestehend aus etwa 20 Aminosäuren.

Typ-I-Kollagen besteht aus zwei α1(I)-Ketten und einer α2(I)-Kette. Die römische Zahl in

Klammern gibt die Zugehörigkeit zum Kollagen-Typ an. Typ-II- und Typ-III-Kollagen sind

Homotrimere der α1(II)- bzw. α1(III)-Kette. Typ-I- bis Typ-III-Kollagen zeigen quergestreifte

Mikrofibrillen im transmissionselektronenmikroskopischen Bild und gehören deshalb in die

Gruppe der fibrillären Kollagene. Diese Kollagene sind mechanisch auf Zugkräfte sehr

belastbar, da bei Zug die Einzelketten gegeneinander gepresst werden. Typ-IV-Kollagen

stellt ein flächiges Netzwerk dar. Es zählt zu den nichtfibrillären Kollagenen und besteht aus

den Einzelketten α1(IV) bis α6(IV). Die tripelhelikale Domäne ist hier durch zahlreiche

nichthelikale Domänen unterbrochen, die sich zu Tetrameren anordnen und das

Typ-IV-Kollagenmolekül um ein vielfaches flexibler werden lassen. Die globulären Domänen

des Typ-IV-Kollagens interagieren miteinander und können Kollagenplatten bilden [VAN-DER-

REST & GARRONE, 1991]. Typ-V-Kollagen wird aus den Einzelketten α1(V) bis α4(V)

zusammengesetzt und bildet mit Typ-I-Kollagen Fibrillen. Bei fibrillären Kollagenen sind

tripelhelikale Moleküle im Bereich der Telopeptide kovalent verbunden und bilden so

Mikrofibrillen. Mehrere Mikrofibrillen lagern sich wiederum zu Fibrillen zusammen. Die

Kollagen-Typen sind meist gewebespezifisch.

1.7 Kollagenolyse

Kollagenabbau findet unter verschiedenen physiologischen und pathologischen

Bedingungen statt wie bei fetaler Knochenentwicklung, Embryonalentwicklung, Invasion

maligner Tumoren, intestinalen Ulzerationen, Wundheilung, rheumatoider Arthritis, Invasion

pathogener Mikroorganismen und bei chronisch entzündlichen Prozessen [WATANABE,

2004]. Aufgrund der äußerst festen Struktur der Kollagene können diese nur von wenigen

Proteinasen gespalten werden. Auf der anderen Seite gibt es eine Vielzahl von Proteinasen,

die globuläre Kollagenstrukturen oder denaturierte Kollagenmoleküle spalten können und so

auch zum Kollagenabbau beitragen. Wegen der Vielfalt der Kollagenstrukturen ist es äußerst

schwierig, Proteinasen von echten Kollagenasen zu differenzieren [HARRINGTON, 1996].

Echte Kollagenasen sind definiert als Enzyme, die tripelhelikale Domänen von Kollagen bei

physiologischem pH-Wert und Körpertemperatur spalten können [HARPER, 1980;

HARRINGTON, 1996]. Sie kommen in Mikroorganismen und auch in humanen Geweben vor.

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) stellen eine Gruppe von derzeit 26 Enzymen dar

[CHAUSSAIN-MILLER et al., 2006], die für den Kollagenabbau im Körper sorgen. Sie wurden

Einleitung 26

auch bei anderen Organismen nachgewiesen. Kollagenolytische Proteinasen von

Mikroorganismen sind oft nur unzureichend molekularbiologisch analysiert, was

hauptsächlich auf Schwierigkeiten in der Handhabung der Enzyme zurückzuführen ist

[WATANABE, 2004]. Kollagenolytische Enzyme sind meist Metalloproteinasen. Sehr gut

wurden die enzymatischen Eigenschaften der Kollagenasen ColH und ColG von Clostridium

histolyticum untersucht. Typisch für kollagenolytische Enzyme ist eine Kollagenbindungs-

domäne. Während MMPs Kollagen nur eines bestimmten Typs an einer spezifischen Stelle

binden können, kann von mikrobiellen Kollagenasen oft eine Vielzahl von Kollagenen an

variablen Stellen gespalten werden. Die Hydrolyse durch Kollagenasen findet meist an der

Peptidbindung zwischen der Aminosäure an X-Position und der darauf folgenden

Gly-Pro-Sequenz der Kollagen-Helix statt [VAN-WART & STEINBRINK, 1981].

Aufwendig gestaltet sich die Detektion von Kollagenasen. Als Testsubstrate zum

Kollagenasenachweis werden verschiedene Oligopeptide wie 4-Phenylazobenzyloxy-

carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (PZ-PLGPR) oder 2-Furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala

(FALGPA) eingesetzt. Aber nicht alle kollagenolytischen Enzyme spalten diese

synthetischen Peptide. Außerdem gibt es Enzyme, die nur die Testsubstrate, aber kein

natives Kollagen spalten können. Diese Enzyme sind dennoch wichtig für die

Kollagendegradation. Sie spalten Kollagenfragmente und werden als Thimet-

Oligopeptidasen oder Metalloendopeptidasen (EC 3.4.24.15) bezeichnet [BARRETT &

BROWN, 1990].

1.8 Zusammensetzung von Dentin

Dentin ähnelt in seiner Zusammensetzung dem Wurzelzement und Knochen [KLIMM, 2003].

Es setzt sich zu 50 bis 70 % aus einer anorganischen Phase, zu 10 bis 20 % aus Wasser

und zu 20 bis 30 % aus einer organischen Matrix zusammen. Unter den Mineralien

überwiegen Kalzium und Phosphat, die in Form von Hydroxylapatitkristallen Ca10(PO4)6(OH)2

vorliegen. Im Dentin wurden viele Spurenelemente nachgewiesen: z.B. Fluor, Natrium,

Kalium, Barium, Eisen, Kupfer, Zinn und Zink [DERISE et al., 1974]. Die organische Matrix

wird mit 91 bis 92 % hauptsächlich von Kollagen gebildet, wobei Typ-I-Kollagen überwiegt

und weniger als 3 % Typ-V-Kollagen hinzukommt [BUTLER & RITCHI, 1995]. Kollagen bildet

ein dichtes Netzwerk, in das Hydroxylapatitkristalle eingebettet sind. Posttranslationell

werden im Kollagen einige Aminosäuren modifiziert, die dann zur Ausbildung von

Quervernetzungen (cross-links) dienen können. Hydroxylysylpyridinolin wird in vielen

Geweben gefunden, während Lysylpyridinolin spezifisch für Knochen und Dentin ist [AÇIL et

al., 2002]. Kontrovers wird die Zunahme der Quervernetzungen mit dem Alter diskutiert

[MARTIN-DE LAS HERAS et al., 1999; MIGUEZ et al., 2004].

Einleitung 27

Das noch nicht mineralisierte Prädentin ähnelt in der Zusammensetzung stark dem Osteoid,

das von Osteoblasten sezerniert wird [BUTLER & RITCHI, 1995]. Die nichtkollagene Grund-

substanz beinhaltet Proteoglykane, Phosphoproteine, Gla-Proteine (carboxyglutaminsäure-

haltige Proteine), Matrix-Gla-Proteine, Osteonektin, Glykoproteine, Plasmaproteine, Lipide,

Zitronen- und Milchsäure [LINDE, 1989; KLIMM, 2003]. Nur sehr wenige Dentinmatrixproteine

sind dentinspezifisch und können nicht im Knochen nachgewiesen werden [BUTLER et al.,

2003].

1.9 Candida albicans und Dentinkariogenese

Eine Beteiligung von C. albicans an der Entstehung der Karies wird schon viele Jahrzehnte

diskutiert. Candida albicans wurde regelmäßig in kariösen Dentinläsionen nachgewiesen

[ROSENSTENGEL et al., 1978; JACOB et al., 1998]. Insbesondere bei frühkindlicher Karies

zeigte sich eine hohe Isolierungshäufigkeit [WETZEL et al., 1993; DE CARVALHO et al., 2006].

Sprosspilzzellen und hyphale Filamente besiedeln die demineralisierte Dentinoberfläche und

Dentintubuli. Das konnte in vivo [JACOB et al., 1998] und in vitro [KLINKE & KLIMM, 2003]

gezeigt werden. Mehrere Publikationen konnten eine Korrelation zwischen dem Ausmaß des

Kariesbefalls und der Quantität der Besiedelung mit C. albicans nachweisen [GÁBRIS et al.,

1999; MOALIC et al., 2001]. Die potentielle Rolle der Candida albicans im Kariesgeschehen

als Resultat eines mikroökologischen Ungleichgewichtes in der Plaque (Dysbiose) bedarf

noch der endgültigen Klärung [KLIMM, 1999]. Ein direkter Nachweis der Beteiligung von

Candida albicans an der Dentinkariogenese ist bisher nicht erbracht.

Säurebildung durch Candida albicans Für die Entstehung von Dentinläsionen ist zunächst die Demineralisation des Dentins

erforderlich, die zur Exposition des Dentinkollagengeflechts führt und hauptsächlich durch

mikrobielle Säurefreisetzung geschieht. C. albicans kann der Gruppe der säurebildenden

Plaquemikroorganismen zugeordnet werden. Die Aufnahme von Kohlenhydraten ist an die

Freisetzung von Protonen gekoppelt. [MONK et al., 1993; VAN DEN BROEK et al., 1997].

C. albicans sezerniert des Weiteren zahlreiche organische Säuren. Bei Kultur in

kohlenhydratreichem Medium bildet C. albicans vor allem Acetat, aber auch Formiat, Pyruvat

und Propionat [SAMARANAYAKE, 1983 und 1986]. Wird die gebildete Säuremenge pro

Trockengewicht zum Vergleich herangezogen, bildet C. albicans eine vergleichbar große

Säuremenge wie Laktobazillen [KLINKE et al., 2006].

Während die Demineralisation von Zahnhartsubstanz schon recht ausführlich untersucht

wurde, lassen die Erkenntnisse über den Abbau der organischen Bestandteile noch viele

Fragen offen. Bisher ist nicht geklärt, welche Enzyme die Zerstörung der organischen

Einleitung 28

Dentinmatrix verursachen. Diskutiert werden mikrobielle Enzyme und auch körpereigene

Matrix-Metalloproteinasen [TJADERHANE et al., 1998; CHAUSSAIN-MILLER et al., 2006].

Candida albicans in der dentalen Plaque

Arbeiten über die Zusammensetzung der dentalen Plaque zeigen ein Vorkommen von

C. albicans gemeinsam mit anderen Mikroorganismen wie Streptokokken und Laktobazillen.

Plaqueproben von Kindern mit aktiver Karies wiesen zu 71,8 % Candida spp. auf und

kariöses Dentin solcher Kinder enthielt in 81,5 % bis 96,8 % der Fälle Candida spp.

[SZIEGOLEIT et al., 1999; SCHULZ-WEIDNER et al., 2005]. Die Rolle von C. albicans in der

dentalen Plaque ist noch unzureichend geklärt. In vitro konnte gezeigt werden, dass sich

C. albicans nur bei Glukoseüberschuss in die Gemeinschaft der Mundflora integrieren kann

[BASSON, 2000]. Die verschiedenen Mikroorganismen der Plaque kooperieren miteinander

und sind von einer Matrix aus extrazellulären Polysacchariden umgeben [DOUGLAS, 2003].

Im Biofilm existiert ein primitives Zirkulationssystem. Die Matrix schützt die Mikroorganismen

vor Faktoren der unspezifischen und spezifischen Immunabwehr und auch vor Pharmaka

wie Antibiotika. In der Plaque herrscht ein eigenes Mikroklima je nach Zusammensetzung

und Reifezustand der Plaque. Es existieren zahlreiche Arbeiten zur Biofilmbildung von

C. albicans in vitro. Die Untersuchung der Biofilmbildung auf künstlichen Materialien wie

Kathetern aus Kunststoff ergab, dass C. albicans als alleinige Spezies und auch mit anderen

Bakterien in der Lage ist, einen komplexen Biofilm zu formieren [DOUGLAS, 2003].

Milieu der Plaque und in kariösen Dentinläsionen Für das Verständnis der Vorgänge bei der Dentinkariogenese ist ein Blick auf die

Milieuverhältnisse in der Plaque und im kariösen Dentin hilfreich. In der Plaque auf der

Zahnoberfläche herrscht vorwiegend ein neutraler pH-Wert [STEPHAN, 1944]. Nach der

Zufuhr von kariogener Nahrung sinkt dieser für etwa eine halbe Stunde in den sauren

Bereich ab [STEPHAN, 1944; ENGLANDER et al., 1956]. Hauptsächlich durch die im Speichel

enthaltenen Puffersysteme (Hydrogenkarbonatpuffersystem, Phosphatpuffersystem, Protein-

puffersystem) kommt es zu einem Ausgleich des pH-Abfalls. Einfluss auf den pH-Verlauf

nimmt die Struktur der Plaque, die im reifen Zustand als Biofilm organisiert ist. In welcher

Weise die Biofilmmatrix die Säureeinwirkung auf die Zahnoberfläche beeinflusst, wird

kontrovers diskutiert. Mehrere aktuelle Arbeiten zeigen eine verzögerte Moleküldiffusion

durch in vitro gezüchtete dentale Plaque [THURNHEER et al., 2003; MARSH, 2003]. Die

verzögerte Diffusion wird auf die Interaktion der mikrobiellen Säuren mit extrazellulärer

Matrix zurückgeführt. Dies halten die Autoren für eine Grundbedingung der Entstehung von

kariösen Läsionen. Diese Ergebnisse widersprechen früheren Studien, die eine nahezu freie

Einleitung 29

Diffusion von organischen Säuren durch junge Plaque ermittelten [DIBDIN, 1981]. Die

Aufrechterhaltung des sauren pH-Werts in der Plaque wird auch durch das beachtliche

Puffervermögen der Plaque im pH-Bereich von 4,0 bis 5,5 realisiert [SHELLIS & DIBDIN, 1988].

Es ist bekannt, dass die Stärke des pH-Abfalls von der mikrobiellen und biochemischen

Zusammensetzung der Plaque abhängt. Patienten mit aktiver Karies zeigen einen stärkeren

und längeren pH-Abfall in der Plaque als kariesresistente Patienten [STEPHAN, 1944;

MARGOLIS et al., 1985].

Ein anderes Mikroklima herrscht in kariösen Dentinläsionen. Die pH-Kurve der Plaque in

Kavitäten ist wegen der schlechten Zugänglichkeit nicht direkt untersucht worden. Allerdings

gibt es Publikationen zum pH-Wert in kariösem Dentin. Der pH-Wert aktiver kariöser

Dentinläsionen liegt im Vergleich zu dem von chronifizierten Läsionen signifikant niedriger

[HOJO et al., 1994]. In Dentinkavitäten herrscht in der Tiefe des kariösen Dentins ein deutlich

niedrigerer pH-Wert als an der Oberfläche der Dentinläsion [DIRKSEN et al., 1962; DIRKSEN et

al., 1963]. Besonders niedrige pH-Werte wurden in Läsionen mit kleiner Eröffnung und dicker

Schicht kariösen Dentins gefunden. Der Speichel kann so nicht seine neutralisierende

Wirkung entfalten. Auch viele Stunden nach der Nahrungsaufnahme konnte ein niedriger

pH-Wert in der Tiefe der kariösen Dentinläsion gemessen werden.

Im Laufe weniger Tage organisiert sich die Plaque zu einem komplexen Biofilm, der einen

tieferen pH-Abfall und auch ein längeres Vorherrschen eines pH-Wertes unter der für das

Mineralisationsgleichgewicht kritischen Marke von 5,5 zu ermöglichen scheint. Auf der von

Plaque bedeckten Zahnhartsubstanz kommt es zu einem unregelmäßigen Wechsel von

sauren und neutralen Milieuverhältnissen, während in der Tiefe aktiver kariöser Dentin-

läsionen vorwiegend ein saurer pH-Wert vorherrscht. Bisher ist nicht geklärt, unter welchen

Bedingungen die enzymatische Degradation von exponiertem Dentinkollagen abläuft.

Neben sezernierten Aspartylproteinasen, die nur im sauren Milieu Aktivität zeigen, wurde

einer neutralen 95-kDa-Metallopeptidase aus Zellaufschluss ein erhebliches Virulenz-

potential zugeschrieben [RODIER et al., 1999]. Die Fähigkeit von C. albicans zur Hydrolyse

von Kollagen und der nachgewiesene Zusammenhang zwischen dem Kariesbefall und der

Besiedelung der Mundhöhle mit C. albicans [WETZEL et al., 1993; MOALIC et al., 2001] regte

die im Folgenden dargestellte Isolierung, Identifizierung und funktionelle Charakterisierung

eines peptidolytischen Enzyms von C. albicans an.

2. Zielsetzung der Arbeit

Die bisher verfügbare Literatur zeigt, dass Peptidasen von Candida albicans erheblich zur

Virulenz des Pilzes beitragen. Einige epidemiologische Studien wiesen eine Korrelation

zwischen Ausmaß des Kariesbefalls und der Quantität der Besiedelung mit Candida albicans

nach. Der Beitrag von Candida albicans an der Kariogenese wird vorwiegend in der

Fähigkeit zur Säurebildung gesehen, während eine Beteiligung an der Dentinhydrolyse

bisher unbeleuchtet blieb.

Im Mittelpunkt der Untersuchungen stand die Isolierung, Identifizierung und funktionelle

Charakterisierung eines peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von Candida albicans.

Um einen hohen Reinheitsgrad des Proteins zu erreichen, war die Entwicklung eines

speziellen Isolierungsverfahrens erforderlich. Die vermutete Lokalisation der Peptidase in der

Zellwand regte ein Herauslösen des Enzyms aus dieser an, um ein gutes Verhältnis von

Zielprotein zu Fremdprotein für die anschließende Chromatographie zu erhalten. Ziel der

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie war die Gewinnung eines hochgradig gereinigten

Enzyms, das anschließend für eine molekulare und funktionelle Identifizierung eingesetzt

werden konnte. Eine Funktion der Peptidase an der Dentinkariogenese sollte durch Versuche

zur kollagenolytischen Wirksamkeit geklärt werden.

Ziel der vorliegenden Arbeit war weiterhin die Untersuchung von aufgeschlossenen Zellen

und Kulturüberstand aus Flüssigkultur von Candida albicans auf kollagen- und

dentinhydrolytische Aktivität. Die schon umfangreich beschriebene sezernierte Aspartyl-

proteinase 2 sollte als Referenz eingesetzt werden.

3. Material und Methoden Nachfolgend wird die Isolierung und Charakterisierung eines peptidolytischen Enzyms aus

der Zellwand von Candida albicans beschrieben. Der Begriff Peptidase soll als Synonym für

das zu isolierende peptidolytische Enzym verstanden werden.

3.1 Geräte und Materialien

In diesem Abschnitt sind tabellarisch alle eingesetzten Geräte, Materialien, Chemikalien,

Bestandteile der Kulturmedien, Enzyme, Antikörper und Candida-albicans-Stämme aufgeführt.

3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien

Alle verwendeten Geräte und Materialen werden in Tabelle 3.1 aufgeführt.

Tabelle 3.1: Geräte und Verbrauchsmaterialien

Gerät / Material Typ Hersteller, Firmensitz Software Autoklav Varioklav 400 H+P Labortechnik GmbH,

München, Deutschland

Chromatographiesäulen HiLoad 26/10 Q Sepharose HP

Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden

Mono Q HR 5/5 Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden

PD-10 Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden

Superdex 200 10/300 GL

Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden

RESOURCE TM ETH Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden

LC Packings 75 µm PepMap C18

Dionex, Idstein, Deutschland

Cryobank™ 291704 MAST Diagnostica GmbH, Reinfeld, Deutschland

Dialyseschlauch 12-14.000 Da Medicell International Ltd London, Großbritannien

Elektrophoresekammer Electrophorese Einheit SE 600

Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA, USA

Feinwaagen MC1 Analytic AC 210 S

Sartorius AG, Göttingen, Deutschland

MC1 Laboratory LC 2200 S

Sartorius AG, Göttingen, Deutschland

Fluoreszenz-Plattenreader

Fluostar Optima BMG Labtech Offenburg, Deutschland

Fluostar Optima Version 1.32

Glasperlen 11079105 (d = 0,5 mm)

BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK, USA

Material und Methoden 32

Gerät / Material Typ Hersteller, Firmensitz Software Heizmagnetrührer IKAMAG® RH Janke & Kunkel GmbH & Co.

KG - IKA-Labortechnik Staufen, Deutschland

RH basic 2 IKAMAG®

IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland

HPLC-System ÄKTA explorer Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden

Unicorn Version 3.10

Inkubationsbad F25-ED Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Deutschland

Inkubator für Flüssigkulturen

Thermoshake THL 500

C. Gerhardt GmbH & Co. KG, Königswinter, Deutschland

Inkubator für Reaktionsgefäße

Thermomixer comfort

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Küvetten 1,5 ml Plastbrand® Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland

Massenspektrometer Q-Tof Premier™ Quadrupole Orthogonal Acceleration Time-Of-Flight Tandem-Massenspektrometer

Waters Corporation, Manchester, UK

Mikroskop Axioskop 20 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland

Mikroplatte 96-Well, Nr. 655160 Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich

Mikroröhrchen 2 ml, Nr. 72.693 SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland

Mischer/Vortexer MS 2 Minishaker IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland

Reax 2000 Heidolph Elektro GmbH & Co. KG, Kelheim, Deutschland

Multipipette 25-200 µl Bibby Dunn Labortechnik GmbH, Asbach, Deutschland

PC-Software Matrix Science, London, Großbritannien

Mascot-Software

Microsoft® Corporation Redmond, WA USA

Windows® XP Professional

Microsoft® Corporation Redmond, WA, USA

Microsoft® Office 2003

Systat Software, Inc. Point Richmond, CA, USA

SigmaPlot 9.0

pH-Messelektrode CTW 711 Thermo Electron, Auchtermuchty, Großbritannien

pH-Meter Portamess® 910 Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG, Berlin, Deutschland

Pipetten Eppendorf Reference Variable Volumen

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland


Gerät / Material Typ Hersteller, Firmensitz Software Pipetman P2, P10,

P20, P100, P200, P1000, P5000, P10ml

Gilson, Middleton, WI, USA

Platteninkubator Wellwarm 1 Denley Instruments Ltd, Billingshurst, West Sussex, UK

Polypropylen-Röhrchen 15 ml - 188 261 50 ml - 210 270

Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich

Präzisionsküvetten SUPRASIL® (Quarzglas)

Hellma GmbH & Co. KG, Müllheim, Deutschland

Präzisionstrennmaschine Accutom 50 Struers A/S, Ballerup, Dänemark Reaktionsgefäße 1,5 ml, 2 ml Eppendorf AG, Hamburg,

Deutschland

Scanner PowerLook 1000 UMAX Data Systems, Inc. Dallas, TX, USA

MagicScan32, Version V4.71

Spannungsversorgung Elektrophoresekammer

PowerPac 3000 Bio-Rad, Hercules, CA, USA

Spektralphotometer GeneQuant™ pro Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

Specord 200 (UV/VIS)

Analytik Jena AG, Jena, Deutschland

Winaspekt Version 2.1

UV-Mini 1240 (UV/VIS)

Shimadzu Corporation, Analytical Instruments Division, Kyoto, Japan

Sterilarbeitsbank Hera safe Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland

Sterilfilter SCGPT01RE (d = 0,22 µm)

Millipore Corp., Billerica, MA, USA

Spritzenvorsatzfilter Qualilab 0,22 µm Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Vakuum-Konzentrator Concentrator 5301 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Vakuumsauganlage PC 2004 VARIO VACUUBRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland

Verschlussclips für Reaktionsgefäße

Rotilabo® Nr. 217.1 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Wasseraufbereitungs-anlage

Purelab Plus ELGA LabWater, Siershahn, Deutschland

Zellhomogenisator Mini-Beadbeater™ - 1

BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK, USA

Zentrifugen (mit Kühlung)

3K18 SIGMA Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Deutschland

3K30 SIGMA Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Deutschland

Avanti HP-25 Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA

Heraeus Biofuge fresco

Kendro Laboratory Products, Hanau, Deutschland


3.1.2 Chemikalien

In Tabelle 3.2 sind alle eingesetzten Chemikalien zusammengestellt. Sie wurden in Analyse-

qualität oder in reinerem Zustand eingesetzt.

Tabelle 3.2: Chemikalien

Chemikalie Katalog - Nr. Hersteller, Firmensitz

Acrylamid/Bisacrylamidstammlösung: Rotiphorese® Gel 30

3029.2 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Albumin Fraktion V (vom Rind) 8076.2 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

7-Amino-4-methylcoumarin (AMC) A-9891 Sigma, St. Louis, MO, USA

Ammoniumacetat 32301 Riedel-de Haën AG, Seelze-Hannover, Deutschland

Ammoniumperoxodisulfat (APS) 9592.3 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Ammoniumsulfat A-4418 Sigma, St. Louis, MO, USA

Bradford-Reagenz: Roti®-Nanoquant

K880.1 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Bromphenolblau 18040 Fluka AG, Buchs, Schweiz

Calciumchlorid-Dihydrat C-5080 Sigma, St. Louis, MO, USA

Chloramin-T-Hydrat C-9887 Sigma, St. Louis, MO, USA

Coomassie Brilliant Blau R250 161-0400 Bio-Rad, Hercules, CA, USA

Dimethylsulfoxid (DMSO) D-2650 Sigma, St. Louis, MO, USA

Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat

106580 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

EDTA-Entkalker Osteosoft 101728 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Essigsäure 100063 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Ethanol vergällt, min 96% 1641 M Berkel AHK, Ludwigshafen, Deutschland

Ethylendiamin-N,N,N’,N’,-tetraessigsäuredinatriumsalz-Dihydrat (EDTA)

E-5134 Sigma, St. Louis, MO, USA

Glycerol 104094 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Glycin 3908.2 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Kaliumdihydrogenphosphat P-5379 Sigma, St. Louis, MO, USA

Kollagen I (säureunlöslich) aus Achillessehne Rind

17439 SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland

Kollagen I (säurelöslich) aus humaner Plazenta

-- zur Verfügung gestellt von Prof. P. Grellier, Museum National d'Histoire Naturelle, Paris


Chemikalie Katalog - Nr. Hersteller, Firmensitz

Kollagen IV (säurelöslich) aus humaner Plazenta

C-7521 Sigma, St. Louis, MO, USA

L-Alanin-7-amido-4-methylcoumarin (L-Ala-AMC)

I-1410 Bachem AG, Bubendorf, Schweiz

L-Arginin-7-amido-4-methylcoumarin Hydrochlorid (L-Arg-AMC)

A-2027 Sigma, St. Louis, MO, USA

L-Leucin-7-amido-4-methylcoumarin-Hydrochlorid (L-Leu-AMC)

L-2145 Sigma, St. Louis, MO, USA

β-Mercaptoethanol M-7154 Sigma, St. Louis, MO, USA

Methanol 106009 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Natriumacetat-Trihydrat S-7670 Sigma, St. Louis, MO, USA

Natriumcarbonat 106392 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Natriumchlorid 106404 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Natriumdodecylsulfat (SDS) S-4509 Sigma, St. Louis, MO, USA

Natriumhydrogencarbonat 6329/106329 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat

106346 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Natriumhydroxid S-8045 Sigma, St. Louis, MO, USA

N,N,N’,N’-Tetraethylmethylendiamin (TEMED)

161-0800 Bio-Rad, Hercules, CA, USA

p-Dimethylaminobenzaldehyd D-8904 Sigma, St. Louis, MO, USA

Pepstatin A P-5318 Sigma, St. Louis, MO, USA

Perchlorsäure 70% 31142-1 Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA

1,10-Phenanthrolin-Monohydrat P-9375 Sigma, St. Louis, MO, USA

Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) P-7626 Sigma, St. Louis, MO, USA

Salzsäure, rauchend 37% 100317 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

SDS-PAGE-Standard Low Range ungefärbt

161-0304 Bio-Rad, Hercules, CA, USA

t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100)

X-100 Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA

trans-4-Hydroxy-L-prolin H5440-9 Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA

Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan (TRIS)

5429.3 Carl Roth GmbH + CO KG, Karlsruhe, Deutschland

Trypsin (Sequenzierungsgrad) -- Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen, Deutschland

Zinkchlorid 108816 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Zitronensäure-Trinatriumsalz C-3674 Sigma, St. Louis, MO, USA


3.1.3 Kulturmedien-Bestandteile

Die Komponenten zur Herstellung der verschiedenen Kulturmedien enthält Tabelle 3.3.

Tabelle 3.3: Bestandteile der Kulturmedien

Bestandteil Katalog - Nr. Hersteller, Firmensitz

Agar Agar 101614 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Albumin Fraktion V 8076.2 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Brain-Heart-Infusion (BHI) 237400 BD, Franklin Lakes, NJ, USA

Chloramphenicol (Paraxin pro injekt.)

-- Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen, Deutschland

Glukose 108337 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Hefeextrakt 212750 BD, Franklin Lakes, NJ, USA

Pepton 211677 BD, Franklin Lakes, NJ, USA

Sabouraud-Agar (Sabouraud-2%-Glukose-Agar)

TN 1252 Sifin Institut für Immunpräparate und Nährmedien GmbH, Berlin, Deutschland

Yeast Carbon Base (YCB) 239110 BD, Franklin Lakes, NJ, USA

Yeast Nitrogen Base (YNB) 239210 BD, Franklin Lakes, NJ, USA

3.1.4 Enzyme und Antikörper

Die angewendeten Enzyme und der verwendete Antikörper sind in der Tabelle 3.4 bzw. in

der Tabelle 3.5 aufgelistet.

Tabelle 3.4: Enzyme

Enzym Katalog - Nr. Hersteller, Firmensitz

Kollagenase A von Clostridium histolyticum

C-0773 Sigma, St. Louis, MO, USA

Lyticase von Arthrobacter luteus L-4025 Sigma, St. Louis, MO, USA

Sezernierte Aspartylproteinase 2 von Candida albicans

MG002 TaKaRa BIO INC., Otsu, Shiga, Japan

Tabelle 3.5: Antikörper

Antikörper Katalog - Nr. Hersteller, Firmensitz

Anti-Sap2 (monoklonal) M166 TaKaRa BIO INC., Otsu, Shiga, Japan


3.1.5 Candida-albicans-Stämme

In der vorliegenden Arbeit wurden zwei unterschiedliche Stämme von Candida albicans ver-

wendet (Tabelle 3.6). Tabelle 3.6: Stämme von Candida albicans

Bezeichnung Referenz

ATCC 2091 Pasteur-Institut Paris, Frankreich; freundlichst zur Verfügung gestellt von Marie-Hélène Rodier, Laboratoire de Parasitologie et Mycologie Medicales, Centre Hospitalier Universitaire La Milétrie, Poitiers Cedex, France.

OMZ 1066 Referenzstamm der Züricher Stammsammlung Ursprung: klinisches Isolat aus kariöser Dentinläsion, Dr. Thomas Klinke, Universitätsklinikum der TU-Dresden

3.2 Methoden

3.2.1 Stammhaltung

Die Candida-albicans-Stämme wurden mit dem CryobankTM-System nach Herstellerangaben

bei -80 °C gelagert.

3.2.2 Zellkultivierung von Candida albicans

Im Folgenden werden die Herstellung der Kulturmedien, die Kultivierung der Hefezellen, die

Zellernte sowie die Kulturüberstandsgewinnung beschrieben.

Yeast-Carbon-Base (YCB) YCB-Stammlösung: 11,7 % YCB (w/v) in destilliertem Wasser, sterilfiltriert (Porengröße 0,22 µm) Yeast-Nitrogen-Base (YNB) YNB-Stammlösung: 11,7 % YNB (w/v) in destilliertem Wasser, sterilfiltriert (Porengröße 0,22 µm) Rinder-Serum-Albumin (RSA) RSA-Stammlösung: 10 % Albumin Fraktion V (w/v) in destilliertem Wasser, sterilfiltriert (Porengröße 0,22 µm) Glukose-Stammlösung: 20 % Glukose (w/v) in deionisiertem Wasser, autoklaviert Flüssigmedien:

YCB-RSA-Medium: 10 % YCB-Stammlösung (v/v) 2 % RSA-Stammlösung (v/v) in sterilem destilliertem Wasser, RSA-Endkonzentration: 0,2 %


YNB-Glc-Medium: 10 % YNB-Stammlösung (v/v) 5,7 % Glukose-Stammlösung (v/v) mit sterilem destilliertem Wasser, Glukose-Endkonzentration: 3,5 % YPD-Medium: 2 % Glukose (w/v) 0,2 % Hefeextrakt (w/v) 0,2 % Pepton (w/v) in deionisiertem Wasser, pH 4,0 mit HCl eingestellt autoklaviert Brain-Heart-Infusion (BHI)-Medium: 3,7 % Brain-Heart-Infusion (w/v) in deionisiertem Wasser autoklaviert Festmedium:

Sabouraud-Glc-Agar: 42 % Sabouraud-2 %-Glukose-Agar (w/v) 5 % Agar Agar (w/v) in deionisiertem Wasser autoklaviert Zugabe von 0,5 % Chloramphenicol-Lösung (20 % Chloramphenicol (w/v) in sterilem Wasser), Abfüllen in Platten bei 50 °C, 18 ml je Platte PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, zur Herstellung der Hefezellsuspension): NaCl 150 mM NaH2PO4 × H2O 1,59 mM Na2HPO4 × 2 H2O 10,56 mM pH 7,0, autoklaviert

Kultivierung und Zellernte von Candida albicans

Je 100 ml YCB-RSA-Medium, YNB-Glc-Medium und BHI-Medium in 200 ml-Glaskolben

wurden mit Zellen des C.-albicans-Stammes ATCC 2091 beimpft und 24 h bei 37 °C und

180 rpm im Wärmeraum aerob kultiviert. Sabouraud-Glc-Agar-Platten wurden mit 0,8 ml

Candida-albicans-Zellsuspension (Absorption bei 600 nm (A600) von 0,6 bis 0,8) beimpft. Die

Verteilung der Zellsuspension erfolgte gleichmäßig mit einem Drigalski-Spatel. Die beimpften

Platten trockneten kurz an und wurden 24 h bei 37 °C im Wärmeraum inkubiert. Das

Beimpfen der Kulturmedien und Kulturplatten geschah an der Sterilarbeitsbank.


Für die Zellernte von Sabouraud-Glc-Agar-Platten wurden etwa 1,3 ml steriles destilliertes

Wasser auf die Agar-Platte gegeben und die Zellen mit einem Drigalski-Spatel vom Agar

gelöst. Die entstandene Zellsuspension wurde mit einer Pipette abgenommen und in ein

Polypropylen-Röhrchen gefüllt. Die Zellernte bei Flüssigkulturen erfolgte durch Zentri-

fugation. Die Flüssigkulturen wurden bei 1.000 × g für 8 min bei 5 °C zentrifugiert, und der

Kulturüberstand wurde verworfen. Die gewonnenen Hefezellen aus Fest- oder Flüssig-

kulturen wurden zweimal mit sterilem Aqua destillata gewaschen, das Waschwasser wurde

verworfen. Das Feuchtvolumen der Zellen wurde bestimmt und anschließend eine

Zellsuspension, die aus einem Teil Zellen und zwei Teilen PBS, 0,33 g Zellen/ml, bestand,

hergestellt. Diese Zellsuspension wurde umgehend in den Versuchen zur Enzymfreisetzung

aus der Zellwand (Abschnitt 3.2.4) verwendet.

Anzucht für die Präparation eines peptidolytischen Enzyms von Candida

albicans und Gewinnung eines Kulturüberstandes Um eine große Menge an peptidolytischem Enzym für die anschließende Präparation zu

gewinnen, wurde das im Folgenden beschriebene Kultivierungsschema entwickelt.

Eine Glasperle aus dem CryobankTM-System eines C.-albicans-Stammes wurde in 8 ml YPD-

Medium aerob bei 26 °C und 95 rpm inkubiert. Das Kulturwachstum wurde durch Messung

der Absorption bei 600 nm im Spektralphotometer bestimmt. Nach 60 h wurde eine

Zelldichte von 3,8 bis 4,8 × 107 Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) erreicht

(A600 1,3 bis 1,5). Für die frühe exponentielle Phase wurde eine Verdopplungszeit von 4,5 h

bestimmt. Die Bestimmung der Absorption wurde in Einweg-Küvetten mit 10 mm Schicht-

dicke und bei 600 nm im Spektralphotometer GeneQuant™ pro durchgeführt. 1 ml dieser

Startkultur wurde in 100 ml YPD-Medium als Vorkultur gegeben und 30 h, wie zuvor

beschrieben, bis zu einer Zelldichte von 3,0 bis 3,8 × 107 KBE/ml (A600 1,1 bis 1,3) inkubiert.

Danach wurden die Zellen bei 1.000 × g für 8 min zentrifugiert und zweimal mit sterilem

Aqua destillata gewaschen. Die Zellen wurden in 100 ml YCB-RSA-Medium (Mangel-

medium) resuspendiert und 20 h bei 26 °C und 95 rpm aerob inkubiert. Die resultierende

Zelldichte variierte je nach verwendetem C.-albicans-Stamm von 6 bis 11 × 107 KBE/ml

(A600 1,7 bis 2,2).

Für die im Abschnitt 3.2.6 dargestellte Präparation der Peptidase-Aktivität wurde eine 80 ml

Startkultur mit 12 Glasperlen angesetzt. 75 ml dieser Startkultur wurde in 5 l Vorkultur

gegeben. Das Volumen der Expressionskultur betrug ebenfalls 5 l. Die Expressionskultur

wurde bei 1.000 × g für 8 min bei 5 °C zentrifugiert und der Kulturüberstand abgegossen.

Aus den gewonnenen Zellen wurde eine Zellsuspension mit 0,33 g Zellen/ml hergestellt und


umgehend den Versuchen zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand zugeführt (Abschnitt

3.2.4). Der für die Albumin- und Kollagenabbau-Tests (Abschnitte 3.2.12 und 3.2.13)

vorgesehene Kulturüberstand von YCB-RSA-Medium wurde bei 5.000 × g für 8 min bei 5 °C

zentrifugiert, um eine klare Flüssigkeit zu erhalten. Für die Sicherung der Zellfreiheit des

Kulturüberstandes wurde 50 ml des Zentrifugats durch einen Spritzenvorsatzfilter mit

0,22 µm Porengröße filtriert und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C tiefgefroren. Der

Kulturüberstand wird im Kapitel 4 bei der Darstellung der Ergebnisse mit CF (für culture fluid)

abgekürzt.

3.2.3 Peptidase-Aktivitäts-Bestimmung

Das fluorogene Substrat L-Arginin-7-amido-4-methylcoumarin (L-Arg-AMC) wurde zur

Detektion und Bestimmung der Aktivität der Aminopeptidase verwendet, wie von RODIER et

al. 1999 beschrieben.

Fluorimetriepuffer (TBS-Puffer): 50 mM TRIS + 150 mM NaCl

pH-Wert mit HCl auf 7,4 eingestellt

Substrat-Stammlösung: Die hydrophobe Festsubstanz L-Arg-AMC wurde nach Herstellerangaben in Dimethylsulfoxid

(DMSO) gelöst. Es resultierte eine 4 mM Substrat-Stammlösung.

Substratlösung: Die Substrat-Stammlösung wurde mit Fluorimetriepuffer zur Einstellung unterschiedlicher

Konzentrationen verdünnt und der pH-Wert erneut mit HCl auf 7,4 eingestellt. Die Substrat-

lösung war bei 2 °C etwa vier Wochen verwendbar. Die Substratkonzentration im Reaktions-

ansatz betrug 20 µM zum Screening der Chromatographiefraktionen, 100 µM bei allen

Versuchen zur Enzymcharakterisierung, ausgenommen die Erstellung der Michaelis-Menten-

Kurve.

7-Amino-4-methylcoumarin (AMC)-Standard: AMC wurde als Standard verwendet. Es wurde eine Stammlösung mit 1 mM AMC gelöst in

DMSO hergestellt. Die AMC-Standardreihe, die aus 5, 10, 20, 30 und 40 µM AMC besteht,

wurde aus der Stammlösung und Fluorimetriepuffer hergestellt.


Standardmessbedingungen: In einer 96-Well-Platte wurden 5 µl Probe mit 50 µl Substratlösung gemischt. Nach einer

Inkubationszeit von 15 min im Platteninkubator bei 37 °C erfolgte das Stoppen der Reaktion

durch Zugabe von 250 µl Ethanol 96 %. Für die Ermittlung des Leerwertes wurden 50 µl der

jeweiligen Substratlösung ohne Probe mit inkubiert. Die Probe wurde nach Zugabe des

Stoppreagenzes pipettiert. Die Fluoreszenz wurde bei Raumtemperatur im Fluoreszenz-

Plattenreader (Fluostar Optima) bei 538 nm mit einer Anregung bei 355 nm bestimmt. Als

Standard wurde die AMC-Verdünnungsreihe von 5 bis 40 µM AMC nach der Inkubation in

jede Platte pipettiert. Eine Enzymeinheit (Unit, U) wurde als die Freisetzung von 1 µmol AMC

aus dem jeweiligen Testsubstrat pro Minute bei 37 °C definiert.

3.2.4 Methoden zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand

Aufgrund der Lokalisation der von EL MOUDNI et al. [1997] beschriebenen Metallopeptidase

in der Zellwand wurde ein Herauslösen von Enzymen aus der Zellwand mit verschiedenen

Agenzien angestrebt. Dadurch sollte ein besseres Verhältnis von Enzym zu Gesamtprotein

erreicht werden.

Die Freisetzung von Enzymen aus der Zellwand kann durch chemische Agenzien oder durch

enzymatischen Verdau der Pilzzellwand unter Verwendung von Lyticase von Arthrobacter

luteus (Zellwandlyse) geschehen. Lyticase hydrolysiert Poly(β-1,3-Glukose), die in der

Zellwand von Hefen als Glukan vorkommt. Es entstehen Hefezellen mit teilweise abgebauter

Zellwand, so genannte Spheroplasten.

Vergleich verschiedener Methoden zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand

Die Zellen des C.-albicans-Stammes ATCC 2091, kultiviert auf Sabouraud-Glc-Agar-Platten,

wurden verschiedenen Agenzien ausgesetzt. Je 150 µl Zellsuspension mit 0,33 g Zellen/ml

wurde mit 3,4 mM Triton X-100, 46 mM β-Mercaptoethanol oder für die Zellwandlyse mit

20 U/ml Lyticase von Arthrobacter luteus inkubiert (angegeben sind Endkonzentrationen im

Reaktionsansatz). Als Kontrolle wurde Zellsuspension mit 3,3 % PBS versetzt. Die Ansätze

verweilten 24 h bei 25 °C im Inkubator für Reaktionsgefäße (Thermomixer comfort) bei

500 rpm. Danach wurden die Ansätze bei 100 × g für 10 min zentrifugiert und der Überstand

abgenommen. Der Überstand wurde bei 5.000 × g zentrifugiert, erneut abgenommen und der

Peptidase-Aktivitäts-Bestimmung zugeführt.


Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien

Zellsuspensionen mit 0,33 g Zellen/ml des C.-albicans-Stammes ATCC 2091, gewonnen aus

den Flüssigkulturen in YCB-RSA-Medium, YNB-Glc-Medium, BHI-Medium und der Festkultur

von Sabouraud-Glc-Agar-Platten, wurden mit 80 U/ml Lyticase versetzt und 13 h bei 25 °C im

Inkubator für Reaktionsgefäße mit 500 rpm inkubiert. Die hohe Lyticase-Konzentration von

80 U/ml wurde aufgrund der kürzeren Inkubationszeit gewählt. Um eine Ruptur der entstan-

denen Spheroplasten zu vermeiden, wurden die Reaktionsansätze schonend bei 100 × g für

10 min zentrifugiert und das Pellet verworfen. Der abgenommene Überstand wurde bei

5.000 × g zentrifugiert und anschließend eine Peptidase-Aktivitäts-Bestimmung vorge-

nommen.

Zellwandlyseschema für Enzympräparation

Vorversuche zeigten, dass sich durch wiederholte Zellwandlyse ein größerer Anteil der

Aminopeptidase herauslösen lässt. Eine Hefezellsuspension mit einer Konzentration von

0,33 g Zellen pro ml PBS wurde viermal nacheinander bei einer Lyticase-Endkonzentration

von 15 U/ml im Reaktionsansatz für 20h bei 26 °C und 65 rpm inkubiert. Nach jeder

Lysestufe wurde der Ansatz mit 100 × g für 10 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen

und das Pellet für die nächste Lysestufe erneut suspendiert. Der gewonnene Überstand wies

mit steigender Lysestufe eine zunehmende Trübung durch Zellfragmente auf. Ein klarer

Überstand konnte durch Zentrifugation bei 600 × g, 3.500 × g und 5.000 × g für je 10 min bei

5 °C erzielt werden. Die Bodensätze wurden verworfen.

Die Zellsuspensionen wurden nach jeder Lysestufe der mikroskopischen Kontrolle unter-

zogen und der Anteil der freien Zellkerne bestimmt. Es erfolgte dann die Protein-

konzentrations- und Peptidase-Aktivitäts-Bestimmung der vier Lysate mit dem Testsubstrat

L-Arg-AMC. Die Lysate der Lysestufen zwei, drei und vier wurden gepoolt und durch

Spritzenvorsatzfilter mit 0,22 µm Porengröße filtriert. Das erste Lysat wurde aufgrund zu

geringer Enzymaktivität verworfen. Die Lysate und der Zellwandlysatepool wurden bis zur

kurz darauf folgenden Enzymaufreinigung (Abschnitt 3.2.6) auf Eis gelagert.

3.2.5 Zellaufschluss

Zellaufschluss und Zellextrakt wurde bei den Kollagenabbau-Tests eingesetzt. Der

Aufschluss der Hefezellen wurde in TRIS/HCl-Puffer vorgenommen.

TRIS/HCl-Puffer: 20 mM TRIS pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert


Das Feuchtvolumen der mit sterilem destillierten Wasser gewaschenen Hefezellen wurde

bestimmt und anschließend eine Zellsuspension mit 0,5 g Zellen/ml, die aus einem Teil

Zellen und einem Teil TRIS/HCl-Puffer besteht, hergestellt. Der Zellaufschluss erfolgte im

Zellhomogenisator Mini-Beadbeater™ mit Glasperlen (d=0,5 mm) dreimal 30 s unter

intermittierender Kühlung der Zellsuspension im Eisbad für jeweils 1 min.

Der gewonnene Zellaufschluss wurde mit und ohne weitere Aufbereitung mit Kollagen

inkubiert (Abschnitt 3.2.13). Der Zellaufschluss ohne weitere Aufbereitung wird fortan als

„Zellaufschluss“ bezeichnet und mit „CD“ (cells disrupted) abgekürzt. Die weitere

Aufbereitung bestand in der Zentrifugation bei 45.000 × g für 45 min bei 5 °C und

anschließender Sterilfiltration durch einen Spritzenvorsatzfilter mit 0,22 µm Porengröße. Der

aufbereitete Zellaufschluss wird im Folgenden als „Zellextrakt“ bezeichnet und mit „CEx“

abgekürzt.

3.2.6 Enzymreinigung aus Zellwandlysat von Candida albicans

Chromatographiepuffer: TRIS/HCl-Puffer: 20 mM TRIS pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert TRIS/HCl-NaCl-Puffer: 20 mM TRIS + 1 M NaCl pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert Ammoniumacetat-Puffer: 0,1 M Ammoniumacetat pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert Kaliumphosphat-Puffer: 50 mM Kaliumphosphat pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert Kaliumphosphat/AS-60S%-Puffer: 50 mM Kaliumphosphat Ammoniumsulfatsättigung 60 % (AS-60S%) pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert

Das dargestellte Chromatographie-Schema basiert auf der Veröffentlichung von RODIER et

al. [1999]. Es wurde aber erweitert und modifiziert. Alle Chromatographie-Schritte wurden mit

dem Chromatographie-System ÄKTA explorer durchgeführt.

Zum Pufferaustausch wurde das Zellwandlysat vor dem ersten Reinigungsschritt 12 h in

einem Dialyseschlauch mit der Porengröße von 12 bis 14 kDa zweimal gegen das 50fache

des Probenvolumens dialysiert. Hierzu wurde der Chromatographiepuffer TRIS/HCl-Puffer

verwendet, welcher zwischenzeitlich einmal gewechselt wurde.

Nach jedem Reinigungsschritt wurde eine Teilmenge des Poolvolumens zur Untersuchung

und Dokumentation des Reinigungsverlaufes abgenommen. Dazu erfolgten die Bestimmung

der Proteinkonzentration, L-Arg-AMC-Hydrolyse und SDS-Gelelektrophorese. Vor jedem

Chromatographieschritt wurde die Probe mit einem Spritzenvorsatzfilter mit 0,22 µm Poren-


größe filtriert. TRIS/HCl-Puffer wurde für alle Ionenaustausch-Chromatographieschritte als

Puffer A verwendet.

HiLoad 26/10 Q Sepharose HP

Mit der Ionenaustausch-Chromatographie können Proteine anhand ihrer unterschiedlichen

elektrischen Ladung getrennt werden. Im ersten Chromatographieschritt wurden 136,5 ml

Dialysat auf eine Ionenaustausch-Chromatographie-Säule HiLoad 26/10 Q Sepharose HP

mit einem Säulenvolumen von 53 ml aufgetragen, die zuvor mit vier Säulenvolumina

TRIS/HCl-Puffer äquilibriert wurde. Das gebundene Protein wurde mit zwei Säulenvolumina

TRIS/HCl-Puffer gewaschen und dann mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M

(TRIS/HCl-NaCl-Puffer) über drei Säulenvolumina eluiert. Die Flussgeschwindigkeit betrug

2 ml/min und das Fraktionsvolumen 1,5 ml. Die Peptidaseaktivität des Reaktionsansatzes

wurde unter Standardmessbedingungen ermittelt. Anschließend wurden sieben Fraktionen

gepoolt und der resultierende Pool erneut mit TRIS/HCl-Puffer über zweimal 2 h dialysiert

gegen das 400fache des Probenvolumens.

Mono Q HR 5/5

Der zweite Reinigungsschritt bestand in einer Ionenaustausch-Chromatographie an einer

Mono Q HR 5/5-Säule mit einem Säulenvolumen von 1 ml. Das Dialysat wurde mit

TRIS/HCl-Puffer verdünnt und mit einem Gesamtvolumen von rund 19 ml aufgetragen. Die

Säule wurde mit drei Säulenvolumina TRIS/HCl-Puffer äquilibriert. Das gebundene Protein

wurde mit fünf Säulenvolumina TRIS/HCl-Puffer gewaschen und nachfolgend mit einem

NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M (TRIS/HCl-NaCl-Puffer) über 20 Säulenvolumina eluiert.

Die Flussgeschwindigkeit betrug 0,75 ml/min und das Fraktionsvolumen 150 µl. Die

Enzymaktivität von neun Fraktionen wurde gepoolt. Die Entsalzung des Pools wurde an

einer PD-10-Säule (Trennmedium Sephadex G-25M) mit TRIS/HCl-Puffer durchgeführt.

Es wurden 4,8 ml Eluat an einer Mono Q HR 5/5-Säule unter beibehaltenen Parametern

rechromatographiert. Die Elution erfolgte allerdings über 25 Säulenvolumina. Die Enzym-

aktivität von sieben Fraktionen wurde gepoolt.

Superdex 200 10/300 GL

Die Gelfiltration ermöglicht die Trennung eines Proteingemisches nach der Molekülgröße.

Um eine gute Trennung mit der Gelfiltration zu erzielen, sollten geringe Proteinmengen in

geringen Volumina aufgetragen werden. Die Trennung nach Molekülgröße erfolgte an einer


Superdex 200 10/300 GL-Säule mit einem Säulenvolumen von 23,65 ml. Als Chromato-

graphiepuffer diente Ammoniumacetat-Puffer. Aufgetragen wurden 4 × 200 µl Pool nach

Mono Q HR 5/5. Beim letzten Lauf betrug das Auftragsvolumen nur 135 µl Probe. Die

Flussgeschwindigkeit betrug 0,75 ml/min und das Fraktionsvolumen 200 µl. Die

Enzymaktivität von sechs Fraktionen wurde gepoolt. Der Pool wurde mit Ammoniumsulfat

versetzt, so dass eine 60%ige Ammoniumsulfatsättigung resultierte. Das Gesamtpool-

volumen betrug nun 15 ml.

RESOURCE TM ETH

Als letzter Reinigungsschritt wurde eine Hydrophobe-Wechselwirkungs-Chromatographie

durchgeführt. Die Trennung der Proteine basiert auf reversiblen Interaktionen zwischen

hydrophoben Proteinoberflächen und dem Trennmaterial. Als Matrix diente eine

RESOURCE TM ETH-Säule mit 1 ml Volumen. Die Säule wurde mit zehn Säulenvolumina

Kaliumphosphat/AS-60S%-Puffer äquilibriert. Bei drei Läufen wurden je 5 ml Probe

aufgetragen. Das gebundene Protein wurde mit zwei Säulenvolumina Kaliumphosphat/AS-

60S%-Puffer gewaschen und dann mit einem Ammoniumsulfat-Gradienten von 60 % bis 0 %

Ammoniumsulfatsättigung über 20 Säulenvolumina eluiert. Die Flussgeschwindigkeit betrug

1,0 ml/min und das Fraktionsvolumen 150 µl. Die wieder gefundene Enzymaktivität war über

sieben Fraktionen verteilt. Die drei Läufe ergaben ähnliche Chromatogramme und

Aktivitätsprofile. Die sich entsprechenden Einzelfraktionen der drei Läufe wurden separat

gepoolt, und jeder der sechs Einzelpools wurde separat dialysiert. Die Dialyse erfolgte über

zweimal 2 h in TRIS/HCl-Puffer gegen das 1000fache des Probenvolumens.

3.2.7 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Zur Protein-Gelelektrophorese wurde das Verfahren nach HAMES und RICKWOOD [1990] in

der nachfolgend beschriebenen Weise angewendet.

Sammelgel (Endkonzentrationen):

Acrylamid 3,75 % (w/v) N,N'-Methylenbisacrylamid 0,1 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat 0,08 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) TEMED 0,2 % (v/v) TRIS-HCl 0,125 M (pH 6,8)


Trenngel (Endkonzentrationen):

Acrylamid 10,0 % (w/v) N,N'-Methylenbisacrylamid 0,27 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat 0,08 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) TEMED 0,05 % (v/v) TRIS-HCl 0,375 M (pH 8,8)

Laufpuffer/Elektrodenpuffer:

TRIS 0,025 M Glycin 0,192 M SDS 0,1 % (w/v) Probenpuffer pH 6,8 (5fach konzentriert):

TRIS-HCl 0,32 M SDS 5 % (w/v) Bromphenolblau 0,025 % (w/v) Glycerol 50 % (v/v) Proteinstandard für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese:

Der Proteinstandard „Low Range“ bestand aus:

Phosphorylase b 97,4 kDa Serum albumin 66,2 kDa Ovalbumin 45,0 kDa Carbonic anhydrase 31,0 kDa Trypsin inhibitor 21,5 kDa Lysozyme 14,4 kDa Der Proteinstandard wurde 1:20 verdünnt mit 5 % (v/v) β-Mercaptoethanol und 95 % (v/v)

Probenpuffer und anschließend denaturiert bei 95 °C für 5 min.

Färbelösung:

0,1 % (w/v) Coomassie-Brilliantblau R250 in 50 % (v/v) Methanol und 8 % (v/v) Eisessig,

filtriert

Entfärberlösung:

10 % (v/v) Methanol, 15 % (v/v) Eisessig

Für die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

(SDS-PAGE) wurden 14 cm breite, 12 cm hohe und 0,75 mm dicke Trenngele in der


Gießvorrichtung einer Elektrophoreseeinheit gegossen. Nach dem Gießen des Sammelgels

konnte das Polyacrylamid mindestens 2 h polymerisieren.

Zur Einengung von Proben mit niedriger Proteinkonzentration diente ein Vakuum-

Konzentrator. Alle Proben wurden mit 20 % Probenpuffer und 4 % β-Mercaptoethanol

versetzt und anschließend bei 95 °C für 5 min denaturiert.

Nach Auftragen der Proben erfolgte das Sammeln der Proben mit 17 mA pro Gel für 45 min

und danach der Trennvorgang mit 35 mA. Die Elektrophoresekammer war an ein Kühl-

system angeschlossen. Der Lauf wurde beendet, wenn das Bromphenolblau am Gelende

angelangt war.

Die Gele wurden in die Färbelösung überführt und 45 min bei moderater Bewegung und bei

Raumtemperatur gefärbt. Nach dem Abgießen der Färbelösung wurden die Gele mit

deionisiertem Wasser gespült und anschließend mit Entfärberlösung für zweimal 20 min

entfärbt.

Das Digitalisieren erfolgte mit dem Scanner (PowerLook 1000) und der dazugehörigen

Computersoftware (MagicScan32, Version V4.71). Zur Bestimmung des Molekulargewichts

der Proteinbanden diente eine anhand der Markerproteine erstellte Eichgerade in halb-

logarithmischer Darstellung.

3.2.8 Proteinkonzentrationsbestimmung

Das Roti®-Nanoquant-Assay diente zur Bestimmung der Proteinkonzentration in Proben. Mit

Roti®-Nanoquant, einer modifizierten Form des Bradford-Protein-Assay, ist es möglich,

geringere Proteinkonzentrationen als beim konventionellen Bradford-Assay zu bestimmen

[BRADFORD, 1976; ZOR & SELINGER, 1996].

Roti®-Nanoquant-Arbeitslösung: 20 % Roti®-Nanoquant mit deionisiertem Wasser (v/v)

RSA-Standard: Ausgegangen wurde von einer Albumin-Stammlösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml.

Als Lösungsmittel diente 0,9%ige NaCl-Lösung (w/v). Durch Verdünnen dieser Stammlösung

mit physiologischer Kochsalzlösung entstanden die Standard-Lösungen mit 0, 2, 5, 10, 20,

50 und 100 µg/ml RSA.

Vorbereitung der Proben: Die Proben wurden bei Bedarf mit 0,9%iger NaCl-Lösung (w/v) verdünnt, um den Proben-

Messbereich von 0-100 µg/ml Protein einzuhalten.


Reaktionsansätze: In 1,5 ml-Reaktionsgefäßen wurden 200 µl Standard oder Probe mit 800 µl Roti®-Nano-

quant-Arbeitslösung versetzt, gemischt und nach Herstellerangaben bei Raumtemperatur für

5 min inkubiert. Die Proteinkonzentrationsbestimmung wurde als Dreifachbestimmung für

Standards und Proben durchgeführt.

Photometrische Auswertung: Die Absorption wurde bei den Wellenlängen 590 und 450 nm sowie einer Schichtdicke von

10 mm mit dem Spektralphotometer Specord 200 bei Raumtemperatur gemessen. Als

Referenz diente deionisiertes Wasser. Mit der Software Winaspekt, Version 2.1, konnte der

Quotient A590 nm/A450 nm berechnet und graphisch dargestellt werden. Es ergab sich ein

linearer Zusammenhang zwischen den Proteinkonzentrationen der Standards und dem

Quotienten A590 nm/A450 nm.

Abbildung 3.1: Eichgerade für die Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem Roti®-

Nanoquant-Kit (repräsentatives Beispiel) Angegeben ist die Proteinkonzentration in der Probe.

In Abbildung 3.1 ist die Linearität der Abhängigkeit des Quotienten A590 nm/A450 nm von der

Proteinkonzentration im Proteinkonzentrationsbereich von 0 bis 100 µg/ml in der einge-

setzten Probe (n = 3) dargestellt.

3.2.9 Peptididentifizierung mittels Massenspektrometrie

Die Proteinanalytik mittels Massenspektrometrie erfordert Spezialkenntnisse und aufwendige

Technik und wurde deshalb von der Abteilung Neuroproteomforschung des Max-Delbrück-

Centrums für Molekulare Medizin in Berlin durchgeführt (siehe Danksagung und Erklärung).

Die mittels SDS-PAGE erhaltene Enzymbande der D1-Fraktion nach RESOURCE TM ETH


(Spur 6 in Abbildung 4.8) wurde im SDS-Gel einer limitierten Proteolyse (In-Gel Digestion)

mit Trypsin zugeführt. Die erhaltenen tryptischen Peptide wurden auf einer LC Packings

75 µm PepMap C18–Reverse-Phase-Säule getrennt, die an ein Flüssigchromatographie-

System (capillary liquid chromatography system) angeschlossen war. Die Trennung der

Peptide erfolgte unter Anwendung eines Acetonitril-Gradienten von 5 bis 50 % (v/v). Die

eluierten Peptide wurden nach Elektrospray-Ionisation (ESI) in einem Q-TOF-Hybrid-

Massenspektrometer mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) analysiert. Die

erhaltenen Fragmentionen wurden unter Verwendung von Kollisionsenergie-Profilen unter

Berücksichtigung der Masse/Ladungs-Quotienten (m/z ratio) und des Ladungszustandes des

Mutterions charakterisiert. Fragmentionenmassen und Intensitäten wurden mithilfe der

Mascot-Software [PERKINS et al., 1999] mit der Protein-Datenbank NCBInr korreliert.

3.2.10 Datenbankrecherche

Die vergleichende Sequenzanalyse wurde am Institut für Klinische Genetik der

Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden mithilfe der

unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ zugänglichen BLASTp software (Basic Local

Alignment Search Tool for Proteins, ALTSCHUL et al., 1997) unter Benutzung voreingestellter

Standardparameter vorgenommen (siehe Danksagung und Erklärung). Durchsucht wurden

die Datenbank NCBInr sowie die Proteindatenbanken PDB (Protein Data Bank;

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), Swiss-Prot (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/), die

Datenbank PIR (Protein Information Resource; http://pir.georgetown.edu/) und die

Proteindatenbank PRF (Protein Research Foundation; http://www.prf.or.jp/en/index.html).

Der Begriff „signifikante Ähnlichkeit“ ist definiert als jede das Hintergrundniveau

übersteigende Ähnlichkeit, die durch Wiederholung der BLASTp-Suche mit einer

randomisierten Version der ursprünglichen Suchsequenz bestimmt wird.

Die Sequenzrandomisierung wurde mithilfe des „Random protein sequence generator“

(http://www.expasy.org/tools/randseq.html) vorgenommen. Zum Vergleich von multiplen

Sequenzen wurde das Programm CLUSTALW [THOMPSON et al., 1994;

http://www.ebi.ac.uk/clustalw/] angewendet.

3.2.11 Charakterisierung der isolierten Peptidase

Alle Versuche zur Charakterisierung der gereinigten Aminpeptidase aus der Zellwand

wurden mit der nach RESOURCE TM ETH erhaltenen hochreinen Fraktion D1 durchgeführt

(Spur 6 in Abbildung 4.8).


Einfluss des pH-Wertes

Zur Ermittlung des pH-Optimums wurde die Aktivität der gereinigten Peptidase bei unter-

schiedlichen pH-Werten im Reaktionsansatz bestimmt. Um einen großen pH-Bereich optimal

abzudecken, kamen verschiedene Puffersysteme zum Einsatz (Tabelle 3.8).

Tabelle 3.7: Puffersysteme

pH-Bereich Reaktionspuffer (Puffersystem)

3 - 5,6 50 mM Na-Acetat-Puffer + 150 mM NaCl

5,9 - 9 50 mM TRIS-Puffer + 150 mM NaCl

9,5 - 11 50 mM Carbonat-Bicarbonat-Puffer + 150 mM NaCl

Es wurde für jeden pH-Messpunkt eine L-Arg-AMC-Substratlösung und eine Enzym-

verdünnung (2,2 µg/ml) mit Reaktionspuffer des entsprechenden pH-Wertes hergestellt.

Dazu wurde Substratstammlösung bzw. Enzymfraktion D1 mit dem entsprechenden

Puffersystem gemischt und der pH-Wert mit HCl und NaOH eingestellt. Im Reaktionsansatz

betrug die Substratkonzentration 100 µM und die Enzymkonzentration 0,2 µg/ml. Die

Peptidaseaktivität des Reaktionsansatzes wurde für Standardmessbedingungen ermittelt.

Der Mittelwert jedes Messpunktes wurde aus vier bis zehn Einzelmessungen berechnet.

Substratspektrum und enzymkinetische Untersuchungen

Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration wurde für die

synthetischen Substrate L-Arg-AMC und L-Ala-AMC ermittelt. Die Testsubstrate bestanden

aus einer Aminosäure gekoppelt an die potentiell fluoreszierende 7-Amido-4-

methylcoumarin-Gruppe, wobei die Aminosäuren N-terminal lokalisiert waren. Die

Festsubstanzen L-Arg-AMC und L-Ala-AMC wurden nach Herstellerangaben in DMSO

gelöst. Die Konzentrationen der so hergestellten Substrat-Stammlösungen betrugen 4 mM.

Außerdem wurde die Aktivität der Peptidase für L-Leu-AMC ermittelt. L-Leu-AMC wurde zur

Herstellung einer Substrat-Stammlösung von 20 mM in Methanol gelöst. Für jeden

Messpunkt wurde die Substratlösung durch Verdünnen der entsprechenden Substrat-

stammlösung mit Fluorimetriepuffer hergestellt und der pH-Wert mit HCl und NaOH auf 7,4

adjustiert.

Die Konzentration der gereinigten Peptidase der Fraktion D1 im L-Arg-AMC-Reaktionsansatz

und L-Leu-AMC-Reaktionsansatz betrug 0,2 µg/ml, im L-Ala-AMC-Reaktionsansatz 1,0 µg/ml.

Die Peptidaseaktivität des Reaktionsansatzes wurde unter Standardmessbedingungen

ermittelt.


Mithilfe des Datenanalyse-Programms SigmaPlot 9.0 wurden die Parameter , und

die Hemmkonstanten und aus den Messdaten durch nichtlineare Regression unter

Verwendung kinetischer Modellgleichungen berechnet. Das Programm verwendet den

Marquardt-Levenberg-Algorithmus [MARQUARDT, 1963] und liefert neben den berechneten

kinetischen Konstanten auch Grenzen für eine valide Schätzung dieser Größen sowie

verschiedene Maßzahlen für die Beurteilung der Qualität der erreichten Anpassung.

MaxV MK

IK IIK

Eine Enzymhemmung kann durch das Substratlösungsmittel, vom Substrat selbst

(Substrathemmung) oder durch eine Kombination beider Effekte verursacht sein. Bei der

Untersuchung der kinetischen Daten wurde zunächst ein Datenvergleich mit Modell-

gleichungen für eine gemischte Hemmung, eine kompetitive, eine nichtkompetitive und eine

unkompetitive Hemmung vorgenommen. Mit keiner der Modellgleichungen konnte eine

zufrieden stellende Beschreibung der experimentellen Daten erreicht werden. Eine

ausreichende Beschreibung konnte erst mit einer Verallgemeinerung der Gleichung für eine

nichtkompetitive Hemmung (1) erreicht werden.

( ) ( )Max

nII M

V [S]v1 ([I] K ) [S] K/

= ∗+ +

(1)

Die Güte der Anpassung des Regressionsmodells wurde mithilfe des AIC (Akaike’s

information criterion) eingeschätzt [AKAIKE, 1974]. Die Qualität der Ausgleichsrechnung

wurde durch die Konfidenzintervalle für die geschätzten Modellparameter mit einem

Signifikanzniveau von 95 % und durch das übliche Residuum (Quadratmittelabweichung)

charakterisiert.

Die korrigierten Messwerte und eine korrigierte Kurve erhält man durch Multiplikation der gemessenen oder der aus Gleichung (1) berechneten Geschwindigkeiten mit dem Faktor . ( )n

II1 ([I] K )/+

Durch weiterführende Versuche mit geringerem DMSO-Gehalt in den Reaktionsansätzen konnte der Einfluss von DMSO deutlich reduziert werden [KLINKE et al., 2008]. Die Beschreibung der v/S-Kinetik gelang hier durch Einfügen des Faktors ( )+ I1 1 [S] K// , der eine Substrathemmung beschreibt.

Einfluss von Proteinaseinhibitoren und Metallkationen

Zum Test der Inhibitoren wurde der Reaktionsansatz modifiziert. Der Inhibitoren-

Reaktionsansatz bestand hier aus 25 µl Enzymverdünnung, 25 µl Inhibitor-Verdünnung und

5 µl L-Arg-AMC-Substratlösung, die hier eine Konzentration von 1,1 mM aufwies. Die

Substratkonzentration im Inhibitoren-Reaktionsansatz betrug 100 µM, die Konzentration der

gereinigten Peptidase 0,275 µg/ml. Es wurde zunächst Enzym mit Inhibitor für 15 min bei


Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Inhibitoren-Reaktionsansatz wie der

Standard-Reaktionsansatz behandelt und die Peptidaseaktivität unter Standardmess-

bedingungen ermittelt. Kontrollproben mit Methanol bzw. Ethanol ermöglichten die Korrektur

der Werte. In Tabelle 3.9 sind die eingesetzten Inhibitoren mit ihren Lösungsmitteln

zusammengefasst.

Tabelle 3.8: Getestete Proteinaseinhibitoren und Metallkationen

Inhibitorkonzentration im Ansatz Lösungsmittel (Konzentration im Ansatz)

EDTA 0 – 1 mmol/l Fluorimetriepuffer

1,10-Phenanthrolin 0 – 1 mmol/l Methanol (0 – 55 mmol/l)

Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) 1 mmol/l Ethanol (0 – 39 mmol/l)

Pepstatin 1 mmol/l Methanol (0 – 55 mmol/l)

Zinkchlorid 1 mmol/l Fluorimetriepuffer

Calciumchlorid 0,5 – 1 mmol/l Fluorimetriepuffer

Die Inhibitor-Stammlösungen wurden mit Fluoriemetriepuffer bis zur gewünschten Inhibitor-

Verdünnung gebracht. Wenn es erforderlich war, wurde der pH-Wert neu adjustiert.

Einfluss der Temperatur

Für die Bestimmung des Temperaturoptimums wurde das Inkubationsbad F25-ED mit

integrierter Temperaturregeltechnik verwendet. Hierfür wurde das Volumen des

Reaktionsansatzes verdoppelt. In 1,5 ml-Reaktionsgefäßen wurde 100 µl Substratlösung

vorgelegt, im Inkubationsbad 1 min temperiert, anschließend 10 µl Enzymverdünnung

zugegeben, gemischt und den Ansatz für 15 min inkubiert. Im Reaktionsansatz betrug die

Substratkonzentration 100 µM und die Enzymkonzentration 0,2 µg/ml. Zum Stoppen der

Reaktion diente 500 µl Ethanol 96 %. Die Ansätze wurden bei -20 °C aufbewahrt. In der

Folge wurden 305 µl des gestoppten Ansatzes in eine 96-Well-Platte gegeben. Die

Peptidaseaktivität des Reaktionsansatzes wurde unter Standardmessbedingungen ermittelt.

3.2.12 Albuminabbau-Test

Basierend auf der Vorschrift von SMOLENSKY et al. [1997] wurde die proteolytische Aktivität

der gereinigten Peptidase (Fraktion D2 nach RESOURCE TM ETH), von Kulturüberstand und

Zellextrakt mit Rinder-Serum-Albumin (RSA) als Substrat spektralphotometrisch bestimmt.

Der Albuminabbau-Test sollte zwei verschiedene pH-Bereiche umfassen. Die verwendeten


Lösungen hatten folgende Zusammensetzung:

Natrium-Citrat-Puffer: 50 mM Natrium-Citrat, pH-Wert 3,5 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert

RSA-Lösung 1: RSA 2 % in Natrium-Citrat-Puffer, pH auf 3,5 mit HCl eingestellt

RSA-Lösung 2: RSA 2 % in TRIS-Puffer, pH auf 7,4 mit HCl eingestellt

Pro Ansatz wurden 600 µl RSA-Lösung mit 150 µl Probe gemischt. Die gereinigte Peptidase

aus der Zellwand und der Zellextrakt wurden mit der neutralen RSA-Lösung 2, die

Kulturüberstände mit der sauren RSA-Lösung 1 inkubiert. Die Konzentration der gereinigten

Peptidase im Reaktionsansatz betrug 4,4 µg/ml. Die Ansätze wurden 1 h bei 37 °C und

600 rpm inkubiert. Das Stoppen der Reaktion erfolgte durch Zugabe von 200 µl

Perchlorsäure 2 M je Ansatz. Dadurch kommt es zum Denaturieren und Ausfällen der

großen Proteinmoleküle, während abgespaltene Peptide in Lösung bleiben. Für die

Leerwerte erfolgte die Zugabe von Probe und Perchlorsäure unmittelbar nacheinander am

Ende der Inkubationszeit. Nach einer Inkubation auf Eis für 10 min wurden die denaturierten

Proben 10 min bei 16.000 × g zentrifugiert. Der abgenommene Überstand wurde 5 min bei

25 °C temperiert. Die Bestimmung der Absorption erfolgte bei Raumtemperatur in

Quarzküvetten mit 10 mm Schichtdicke bei 280 nm im Spektralphotometer UV-Mini 1240.

Der Albuminabbau-Test wurde für alle Proben und Leerwerte als Doppelbestimmung durch-

geführt.

3.2.13 Kollagenabbau-Tests

Die kollagenolytische Aktivität der gereinigten Peptidase (Fraktion D2 nach

RESOURCE TM ETH), von Kulturüberstand, Zellaufschluss und Zellextrakt wurde mit

säureunlöslichem und säurelöslichem Kollagen als Substrat mithilfe der Hydroxyprolin-

Bestimmung und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese untersucht.

Nachweis mittels Hydroxyprolin-Bestimmung

Wie in der Vorschrift von KAMINISHI et al. [1988] angegeben, wurde säureunlösliches

Typ-I-Kollagen aus der Achilles-Sehne des Rindes für den Nachweis der Kollagenolyse bei

neutralem und saurem pH-Wert verwendet. Für die unterschiedlichen pH-Bereiche kamen

zwei verschiedene Puffersysteme zum Einsatz. Nach der Suspension von Kollagen in

TRIS/HCl-Puffer bzw. Natrium-Citrat-Puffer traten leichte pH-Verschiebungen auf, die ein

Adjustieren des pH-Wertes auf 7,4 bzw. 3,5 mit NaOH bzw. HCl erforderten. Der

Reaktionssnsatz enthielt je 1,2 mg Kollagen (Trockengewicht). Zugesetzt wurde eine der

folgenden enzymhaltigen Proben: gereinigte Peptidase (Fraktion D2 nach RESOURCE TM

ETH), Kulturüberstand (siehe Abschnitt 3.2.2), Zellaufschluss (Abschnitt 3.2.5), Zellextrakt


(Abschnitt 3.2.5) und Sap2 (Fa. TaKaRa). Als Negativkontrollen dienten Pufferlösungen oder

denaturierte Probe, Sap2 repräsentierte die Positivkontrolle. Die Denaturierung erfolgte bei

95 °C für 5 min. Vor der Zugabe zum Kollagen wurde der pH-Wert der enzymhaltigen Proben

überprüft und gegebenenfalls mit HCl oder NaOH auf 3,5 bzw. 7,4 adjustiert. Das

Probevolumen betrug 120 µl, bei Zellaufschluss 150 µl, um aufgrund des höheren

Pelletvolumens etwa gleiche Überstandsmengen zu erhalten. Die Reaktionsansätze wurden

24 h bei 37 °C und 600 rpm inkubiert. Der Kollagenabbau wurde mindestens als Doppel-

bestimmung durchgeführt.

Die Reaktionsansätze waren wie folgt zusammengesetzt:

Kollagen 1,2 mg + Enzymlösung bzw. Kontrolllösung (1) – (12)

(1) gereinigte Peptidase (5 µg/ml) in TRIS/HCl-Puffer, pH 7,4 (2) TRIS-Puffer 20 mM, pH 7,4 (Kontrolle) (3) Zellextrakt, pH 7,4 (4) Zellextrakt denaturiert, pH 7,4 (Kontrolle) (5) Zellaufschluss, pH 7,4 (6) Zellaufschluss denaturiert, pH 7,4 (Kontrolle) (7) Zellaufschluss, pH 3,5 (8) Zellaufschluss denaturiert, pH 3,5 (Kontrolle) (9) Kulturüberstand von C. albicans ATCC 2091 oder OMZ 1066, pH 3,5 (10) Kulturüberstand von C. albicans ATCC 2091 oder OMZ 1066, denaturiert, pH 3,5 (Kontrolle) (11) Sap2 (5 µg/ml; Fa. TaKaRa) in Natrium-Citrat-Puffer, pH 3,5 (12) Natrium-Citrat-Puffer, pH 3,5 (Kontrolle)

Nach der Inkubation wurden die Reaktionsansätze bei 16.000 × g für 15 min zentrifugiert und

der Überstand abgenommen. Die Überstände der Proben mit Zellaufschluss wurden erneut

wie zuvor zentrifugiert. Die Überstände wurden der Hydroxyprolin-Bestimmung zugeführt.

Hydroxyprolin-Bestimmung

Mithilfe der Hydroxyprolin-Bestimmung kann Kollagenspaltung über den Hydroxyprolingehalt

von Kollagenfragmenten nachgewiesen werden. Angewendet wurde das Protokoll nach

REDDY und ENWEMEKA [1996]. Die verwendeten Lösungen hatten folgende Zusammen-

setzung:

Azetat-Citrat-Puffer:

0,88 M Natriumazetat-Trihydrat 0,24 M Citronensäure 0,21 M Essigsäure 0,85 M Natriumhydroxid in deionisiertem Wasser, pH-Wert auf 6,5 eingestellt.


Chloramin-T-Reagenz:

0,056 M Chloramin T und 1,33 M n-Propanol in Azetat-Citrat-Puffer

Ehrlichs Reagenz:

1 M p-Dimethylaminobenzaldehyd in n-Propanol/Perchlorsäure (2:1 v/v)

Für die Freisetzung des Hydroxyprolins aus den Kollagenfragmenten wurden 30 µl Probe mit

20 µl 5 M NaOH versetzt und durch Autoklavieren bei 121 °C für 20 min hydrolysiert. Dazu

wurden die 1,5 ml-Reaktionsgefäße mit Rotilabo® -Verschlussclips versehen, um einen

dichten Verschluss sicherzustellen. Durch Zugabe von 450 µl frisch hergestelltem Chloramin-

T-Reagenz und 25 min Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte eine Oxidation des

freigesetzten Hydroxyprolins. Die anschließende Zugabe von 500 µl frisch hergestelltem

Ehrlich-Reagenz und eine 20-minütige Inkubation bei 65 °C und 600 rpm bewirkten eine

Chromophorbildung. Die Absorption wurde bei den Wellenlängen 550 und 655 nm und einer

Schichtdicke von 10 mm mit dem Spektralphotometer Specord 200 bei Raumtemperatur

gemessen. Als Referenz diente bideionisiertes Wasser. Mit der Software Winaspekt,

Version 2.1, konnte die Differenz A550 nm - A655 nm berechnet und graphisch dargestellt werden.

Zur Kalibrierung wurde eine Hydroxyprolin-Verdünnungsreihe aus einer Hydroxyprolin-

Stammlösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt. Es bestand eine lineare

Korrelation zwischen der Absorptionsdifferenz A550 nm - A655 nm und einem Hydroxyprolin-

Gehalt von 0 bis 4,5 µg im Standardansatz. Die Hydroxyprolin-Bestimmung wurde als

Doppelbestimmung für Standards und Proben durchgeführt. Die Berechnung der

gespaltenen Kollagenmenge beruht auf dem durchschnittlichen Hydroxyprolingehalt von

12,5 % in Kollagen [EDWARDS & O' BRIEN, 1980].

Abbildung 3.2: Eichgerade für die Hydroxyprolin-Bestimmung (repräsentatives Beispiel)

In Abbildung 3.2 ist die lineare Beziehung zwischen der Absorptionsdifferenz A550 nm - A655 nm

und dem Hydroxyprolin-Gehalt im Standardansatz von 0 bis 4,5 µg dargestellt.


Nachweis mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Für den Nachweis der Kollagenolyse mithilfe der SDS-PAGE bildete die Veröffentlichung von

RODIER et al. [1999] die Grundlage. Für die Ansätze wurden zwei verschiedene Kollagen-

Stammlösungen mit 1 mg/ml aus säurelöslichem Typ-I-Kollagen und Typ-IV-Kollagen

hergestellt. Während Typ-I-Kollagen in 1 % Essigsäure und Fluorimetriepuffer gelöst werden

konnte, wurde aufgrund der schlechteren Löslichkeit bei Typ-IV-Kollagen 5 % Essigsäure

und Fluorimetriepuffer eingesetzt. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,2 eingestellt.


(1) 18 µl Typ-I- oder Typ-IV-Kollagen-Stammlösung + 26 µl gereinigte Peptidase + 76 µl TBS (Gesamtprotein: 18,6 µg)

(2) 18 µl Typ-I- oder Typ-IV-Kollagen-Stammlösung + 102 µl TBS (Gesamtprotein: 18 µg) (3) 26 µl gereinigte Peptidase + 94 µl TBS (Gesamtprotein: 0,6 µg) (4) 18 µl Typ-I- oder Typ-IV-Kollagen-Stammlösung + 30 µl Kollagenase A (20µg/ml) +

72 µl TBS (Gesamtprotein: 18,6 µg)

Das Volumen pro Reaktionsansatz betrug 120 µl, die Endkonzentration der Kollagene im

Ansatz 150 µg/ml.

Die Konzentration der gereinigten Peptidase und der Kollagenase A (Clostridium

histolyticum) im Reaktionsansatz war 5 µg/ml. Die Ansätze wurden 20 h bei 37 °C und

600 rpm inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit 20 % Probenpuffer und 4 %

β-Mercaptoethanol versetzt, bei 95 °C für 5 min denaturiert und auf eine SDS-PAGE

aufgetragen (siehe Abschnitt 3.2.7).

3.2.14 Dentinscheibengewinnung und Dentinabbau-Test

Zur Untersuchung der Fähigkeit von Candida albicans zur Dentinkollagenhydrolyse diente

humanes Dentin. Für die Gewinnung von Dentinkernen aus Weisheitszähnen, gelagert in

physiologischer Kochsalzlösung, wurden der gesamte Zahnschmelz, das Wurzelzement und

die Pulpakammerwände großzügig mittels diamantierter Schleifer hochtourig und unter

Wasserkühlung entfernt. Zum Einspannen in eine Schneidemaschine war das Einbetten der

Wurzelbereiche der Dentinkerne in einem PMMA-Kunststoff erforderlich. Anschließend

erfolgte das Scheibenschneiden mit der automatischen Präzisionstrennmaschine und

Präzisionsschleifmaschine Accutom 50. Die 0,4 mm dünnen Dentinscheiben aus dem

Kronenbereich der Zähne wurden gründlich mit destilliertem Wasser gespült, um

Schleifmittelrückstände zu entfernen. Eine optische Kontrolle stellte sicher, dass die

Scheiben keine an das Dentin angrenzenden Gewebe beinhalteten. Anschließend

inkubierten die Scheiben in EDTA-Entkalker Osteosoft nach Angaben des Herstellers für


eine Woche. Die demineralisierten Scheiben wurden mit sterilem Aqua destillata gewaschen

und in kleine Stücke von etwa 1,5 mg geteilt. Die Dentinscheibenstücke wurden mit

unterschiedlichen enzymhaltigen Proben von Candida albicans bzw. Kontrolllösungen 24 h

lang bei 37 °C und 600 rpm inkubiert. Als Kontrollen wurden Pufferlösungen oder

denaturierte Probe eingesetzt. Die Denaturierung erfolgte bei 95 °C für 5 min. Der pH-Wert

wurde überprüft und gegebenenfalls mit HCl oder NaOH auf 3,5 bzw. 7,4 adjustiert. Der

Dentinabbau-Test wurde mindestens als Doppelbestimmung durchgeführt. Nach der

Inkubation wurden die Proben vorsichtig bei 800 × g für 3 min zentrifugiert, der Überstand

abgenommen und der Hydroxyprolin-Bestimmung zugeführt.


3 Dentinscheibenstücke + Enzymlösung bzw. Kontrolllösung 100 µl (1) – (6)

(1) gereinigte Peptidase in TRIS-Puffer 20 mM, pH 7,4 (5 µg/ml und 22,02 µg/ml) (2) TRIS-Puffer 20 mM, pH 7,4 (Kontrolle) (3) Kulturüberstand von C. albicans ATCC 2091 oder OMZ 1066, pH 3,5 (4) Kulturüberstand von C. albicans ATCC 2091 oder OMZ 1066, denaturiert, pH 3,5 (Kontrolle) (5) Sap2 (5 µg/ml; Fa. TaKaRa) in 50 mM Natrium-Citrat-Puffer, pH 3,5 (6) 50 mM Natrium-Citrat-Puffer, pH 3,5 (Kontrolle)

4. Ergebnisse

4.1 Versuche zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand

Aufgrund des Nachweises einer Metallopeptidase von Candida albicans in der Zellwand [EL

MOUDNI et al., 1997] wurde ein Herauslösen des peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand

angestrebt. Das Ziel war die Gewinnung eines Zellwandextraktes mit einem hohen Enzym-

anteil am Gesamtprotein.

4.1.1 Vergleich von verschiedenen Methoden zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand

Zellen des Candida-albicans-Stammes ATCC 2091 wurden zum Herauslösen des Enzyms

aus der Zellwand mit verschiedenen Agenzien nach im Abschnitt 3.2.4 beschriebener

Methode inkubiert. Mercaptoethanol, ein SH-Reagenz, spaltet Disulfidbrücken von Proteinen

reduktiv und löst so Proteingefüge. Triton X-100 ist ein nichtionisches Detergenz (Tensid),

das nicht denaturierend wirkt und elektrostatische Bindungen verändern kann. Weiterhin

wurde versucht, die Pilzzellwand enzymatisch anzugreifen. Glukane bilden einen

Hauptbestandteil der Pilzzellwand und können durch Lyticase, die eine β-1,3-Glukanase

enthält, gespalten werden [CHAFFIN et al., 1998]. Dadurch werden in der Zellwand integrierte

Proteine freigesetzt. Jeder Ansatz enthielt gleichgroßes Hefezellfeuchtgewicht.

0

0,5

1

1,5

2

Kontrolle Triton X-100 2-ME Lyticase

Vol

umen

aktiv

ität [

mU

/ml]

Abbildung 4.1: Volumenaktivität verschiedener Zellwandextrakte und Zellwandlysat

Die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch die aus der Zellwand von Candida albicans gewonnenen Extrakte ist dargestellt. Die Hefezellen wurden in PBS-Puffer (Kontrolle), Triton X-100 3,4 mM, β-Mercaptoethanol (2-ME) 46 mM oder Lyticase 20 U/ml inkubiert. Es wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt (n = 3).

Ergebnisse 59

4.1.2 Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien

Candida-albicans-Zellen des Stammes ATCC 2091 wurden in verschiedenen Nährmedien

kultiviert und die gewonnenen Zellsuspensionen mit Lyticase inkubiert, wie im Abschnitt 3.2.4

beschrieben. Anschließend wurde die L-Arg-AMC-Aktivität der Zellwandlysate verglichen.

Wie in Abbildung 4.2 dargestellt ist, war die L-Arg-AMC-Aktivität der Zellwandlysate

gewonnen aus Flüssigkulturen höher als die vom Festmedium Sabouraud-Glukose-Agar.

0

1

2

3

4

5

Sabouraud BHI YNB-Glc YCB-RSA

Vol

umen

aktiv

ität [

mU

/ml]

Abbildung 4.2: Volumenaktivität der Zellwandlysate aus verschiedenen Kulturmedien

Dargestellt ist die Aktivität verschiedener Zellwandlysate von Candida albicans mit L-Arg-AMC als Substrat. Die Hefezellen wurden in Brain-Heart-Infusion (BHI), Yeast Carbon Base mit 0,2 % Rinder-Serum-Albumin (YCB-RSA), Yeast Nitrogen Base mit 3,5 % Glukose (YNB-Glc) oder auf Sabouraud-Glukose-Agar kultiviert. Pro Ansatz wurde gleiches Hefezellfeuchtgewicht eingesetzt. Die Zellsuspensionen mit einer Zell-dichte von 0,33 g Zellen/ml wurden mit 80 U/ml Lyticase versetzt und 13 h inkubiert. Es erfolgten Doppelbestimmungen (n = 2).

Die hohe Aktivität der in RSA-haltigem Medium gezüchteten Zellen war allerdings mit der

niedrigsten Hefezellausbeute assoziiert. Eine Ordnung der Zelldichte im Flüssigmedium vom

höchsten zum niedrigsten Wert ergibt folgende Reihenfolge: BHI > YNB-Glc > YCB-RSA.

4.1.3 Vergleich Zellaufschluss - Zellwandlyse

Ziel war eine Verbesserung der Aufarbeitung des biologischen Ausgangsmaterials (Hefe) zur

Enzymisolierung. Die Wirkung der Lyticase an der Zellwand konnte durch mikroskopische

Untersuchung der Hefezellen beobachtet werden. Mit andauernder Lyticaseeinwirkung

wurden eine dünner werdende Zellwand und eine Zunahme von freien Zellkernen

beobachtet. Nach der vierten Lysestufe des Zellwandlyseschemas der Enzympräparation

(Abschnitt 3.2.4) waren 10 bis 20 % der Zellen lysiert. Die spezifische Aktivität des Zell-

extraktes (zentrifugierter und sterilfiltrierter Zellaufschluss) und der gepoolten Zellwandlysate

Ergebnisse 60

wurde aus der Volumenaktivität mit L-Arg-AMC als Substrat und dem Proteingehalt

bestimmt. Der Zellwandlysatepool des Vorversuchs erreichte eine etwa 17fach höhere

spezifische Aktivität als Zellextrakt (Tabelle 4.1). Die spezifische Aktivität des Lysatepools für

die im Abschnitt 3.2.6 dargestellte Enzymreinigung lag allerdings nur knapp über der des

Zellextrakts. Der Lysatepool konnte bis zur weiteren Verwendung bei - 80 °C mit vernach-

lässigbaren Aktivitätsverlusten gelagert werden.

Tabelle 4.1: Vergleich von Zellextrakt und Zellwandlysat

Volumenaktivität[U/ml]

Proteinkonzentration [mg/ml]

spezifische Aktivität[U/mg]

Zellextrakt 0,427 8,487 0,050

Zellwandlysatepool Vorversuch 0,058 0,060 0,971

Zellwandlysatepool Enzympräparation 0,024 0,448 0,053

Der Zellextrakt wurde aus einer Zellsuspension mit 0,5 g Zellen/ml und Zellwandlysat aus

Zellsuspension mit 0,33 g Zellen/ml gewonnen.

4.2. Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus Zellwandlysat

Ziel war die Gewinnung eines hochgradig gereinigten Enzyms, das anschließend molekular

und funktionell charakterisiert werden sollte. Jeder Reinigungsschritt wurde einzeln bilanziert

(Tabelle 4.2). Der Reinigungsfortschritt wurde außerdem mittels SDS-Gelelektrophorese

optisch dargestellt (Abbildung 4.8).

4.2.1 HiLoad 26/10 Q Sepharose HP

Nach Dialyse und Sterilfiltration des Zellwandlysatepools wurde ein Volumen von 138 ml

erhalten, von dem 136,5 ml auf eine HiLoad 26/10 Q Sepharose HP-Säule aufgetragen

wurden. Jede der 1,5 ml-Fraktionen wurde auf L-Arg-AMC-Hydrolyse untersucht und ein

Aktivitätsprofil erstellt. Das ungebundene Protein (gekennzeichnet in Abbildung 4.3) zeigte

keine Spaltung von L-Arg-AMC. Im Eluat konnte ein Aktivitätspeak, der sich über 12 Frak-

tionen erstreckte, gemessen werden. Etwa 90 % der in den Fraktionen gefundenen Aktivität

wurde gepoolt. Das Poolvolumen betrug 10,6 ml. Abbildung 4.3 zeigt das Chromatogramm

für den ersten Reinigungsschritt mit eingezeichneter Enzymaktivität und den Poolgrenzen.

Ergebnisse 61

Abbildung 4.3: Chromatographie des Zellwandlysats an HiLoad 26/10 Q Sepharose HP Dargestellt ist das Elutionsprofil der Zellwandlysat-Proteine nach Trennung anhand elektrischer Ladungsunterschiede. Die Elution erfolgte bei einem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M. Zum Nachweis der Peptidase diente das Substrat L-Arg-AMC (siehe Abschnitt 3.2.3). Die unterbrochenen vertikalen Linien im Chromatogramm begrenzen die zur weiteren Reinigung vereinigten Fraktionen (blau gefüllte Balken im Aktivitätsprofil).

4.2.2 Mono Q HR 5/5

Das Volumen des entsalzten Pools nach Chromatographie-Schritt 1 wurde mit TRIS/HCl-

Puffer auf 20 ml ergänzt, von dem 18,8 ml auf eine Mono Q HR 5/5-Säule aufgetragen

wurden. In 16 der 150 µl-Fraktionen konnte L-Arg-AMC-Hydrolyse gemessen werden.

Gepoolt wurden neun Fraktionen, die 89 % der wieder gefundenen Enzymaktivität

beinhalteten und ein Poolvolumen von 1,34 ml ergaben. Abbildung 4.4 zeigt das

Chromatogramm für den zweiten Reinigungsschritt mit eingezeichneter Enzymaktivität und

den Poolgrenzen. Zur Entsalzung des erhaltenen Pools wurde das Volumen mit TRIS/HCl-

Puffer auf 2,5 ml ergänzt und auf eine PD-10-Säule aufgetragen. Das Elutionsvolumen

betrug 3,5 ml und wurde mit TRIS/HCl-Puffer zu 5 ml aufgefüllt. Durch die Entsalzung kam

es zu einem geringen Verlust an totaler Aktivität von maximal 5%.

Ergebnisse 62

Abbildung 4.4: Chromatographie an Mono Q HR 5/5 Dargestellt ist das Elutionsprofil einer Mono Q HR 5/5-Säule nach Auftragen des HiLoad 26/10 Q Sepharose HP-Pools. Die Elution erfolgte bei einem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M. Zum Nachweis der Peptidase diente das Substrat L-Arg-AMC (siehe Abschnitt 3.2.3). Die unterbrochenen vertikalen Linien im Chromatogramm begrenzen die zur weiteren Reinigung vereinigten Fraktionen (blau gefüllte Balken im Aktivitäts- profil). Für die Rechromatographie an einer Mono Q HR 5/5-Säule wurden 4,8 ml aufgetragen. Der

Anstieg des NaCl-Gradienten von 0 auf 0,5 M wurde gestreckt. Die Aktivität war über elf

Fraktionen verteilt, von denen sieben gepoolt wurden (Abbildung 4.5). Das Poolvolumen

betrug 1,03 ml und beinhaltete 86 % der wieder gefundenen Enzymaktivität. Das

Chromatogramm der Rechromatographie mit eingezeichneter Enzymaktivität und den

Poolgrenzen ist in Abbildung 4.5 gezeigt. Durch den niedrigeren Anstieg des NaCl-

Gradienten konnte eine geringfügig bessere Trennung erreicht werden. Die Poolgrenzen

wurden bewusst eng gewählt, um das Probevolumen für die nachfolgende Gelfiltration gering

zu halten.

Ergebnisse 63

Abbildung 4.5: Chromatogramm nach Rechromatographie an Mono Q HR 5/5 Dargestellt ist das Elutionsprofil nach Rechromatographie an einer Mono Q HR 5/5- Säule. Die Elution erfolgte bei einem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M. Zum Nachweis der Peptidase diente das Substrat L-Arg-AMC (siehe Abschnitt 3.2.3). Die unterbrochenen vertikalen Linien im Chromatogramm begrenzen die zur weiteren Reinigung vereinigten Fraktionen (blau gefüllte Balken im Aktivitätsprofil).

4.2.3 Superdex 200 10/300 GL

Die Gelfiltration an einer Superdex 200 10/300 GL-Säule ergab eine Verteilung der

Peptidase-Aktivität über 12 Fraktionen (Abbildung 4.6). Die ersten vier Läufe zeigten ein

nahezu deckungsgleiches Chromatogramm, das exemplarisch für den ersten Lauf in

Abbildung 4.6 dargestellt ist. Der fünfte Lauf wich quantitativ etwas von den vorhergehenden

ab, da hier ein geringeres Probenvolumen und damit eine geringere Proteinmenge

eingesetzt wurde. Gepoolt wurden pro Lauf sechs Fraktionen und die Pools der einzelnen

Läufe anschließend vereinigt. Der 6 ml große Pool beinhaltete 82,6 % der wieder

gefundenen Enzymaktivität.

Ergebnisse 64

Abbildung 4.6: Chromatographie an Superdex 200 10/300 GL Dargestellt ist das Elutionsprofil einer Superdex 200 10/300 GL-Säule nach Auf- tragen des Mono Q HR 5/5-Pools. Zum Nachweis der Peptidase diente das Substrat L-Arg-AMC (siehe Abschnitt 3.2.3). Die unterbrochenen vertikalen Linien im Chromatogramm begrenzen die zur weiteren Reinigung vereinigten Fraktionen (blau gefüllte Balken im Aktivitätsprofil).

4.2.4 RESOURCE TM ETH

Der Gelfiltrations-Pool wurde mit Ammoniumsulfat versetzt, so dass eine 60%ige

Ammoniumsulfatsättigung resultierte und das Volumen auf 15 ml anstieg. Die drei Läufe auf

einer RESOURCE TM ETH-Säule mit je 5 ml Probe zeigten ein qualitativ und quantitativ

vergleichbares Aktivitätsprofil und Chromatogramm (Abbildung 4.7). Die Abbildung stellt den

repräsentativen ersten Lauf dar. Der Aktivitätspeak war über sieben Fraktionen verteilt. Die

sich entsprechenden Einzelfraktionen der drei Läufe wurden separat gepoolt und jeder der

Einzelpools separat dialysiert. Die Enzymcharakterisierung wurde mit den Fraktionen D1 und

D2 nach RESOURCE TM ETH durchgeführt, wobei D2 zur Untersuchung der Endopeptidase-

Aktivität diente.

Ergebnisse 65

Abbildung 4.7: Chromatographie an RESOURCE TM ETH

Dargestellt ist das Elutionsprofil einer RESOURCE TM ETH-Säule nach Auftragen des

Superdex 200 10/300 GL-Pools. Die Elution erfolgte bei einem Ammoniumsulfat- Gradienten von 60 bis 0 % Ammoniumsulfatsättigung. Zum Nachweis der Peptidase diente das Substrat L-Arg-AMC (siehe Abschnitt 3.2.3).

4.2.5 Zusammenfassung der Enzymreinigung

Tabelle 4.2: Bilanz der Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand 1 U entspricht der Menge an Enzym, die 1 µmol AMC pro Minute durch Hydrolyse von L-Arg-AMC unter Standardmessbedingungen freisetzt.

Reinigungs-schritt

Volumen [ml]

Protein-gehalt [mg/l]

Gesamt-protein

[mg]

Volumen-aktivität

[U/ml]

Totale Aktivität

[U]

Spezif. Aktivität [U/mg]

Reini-gungs-faktor

Aus-beute

[%]

Zellwandlysat 138,00 425,35 58,698 0,022 3,034 0,05 1,00 100,0

HiLoad 26/10 Q Sepharose HP * 19,60 348,94 6,839 0,121 2,369 0,35 6,70 78,1

Mono Q HR 5/5 * 5,00 309,85 1,549 0,356 1,779 1,15 22,2 58,6

Mono Q HR 5/5 * 1,03 571,89 0,589 1,173 1,208 2,05 39,7 39,8

Superdex 200 10/300 GL * 6,00 39,46 0,237 0,091 0,547 2,31 44,7 18,0

RESOURCE TM

ETH * 0,98 22,02 0,022 0,056 0,055 2,56 49,5 1,8

Ergebnisse 66

Die mit (*)-gekennzeichneten Daten beziehen sich auf das Protein bzw. Enzym in den

gepoolten Fraktionen nach dem jeweiligen Reinigungsschritt und gegebenenfalls Entsalzung.

In Tabelle 4.2 ist der Reinigungsverlauf des peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand

zusammengefasst und bilanziert. Abbildung 4.8 zeigt den Fortschritt der Enzymreinigung

durch die Darstellung des Proteinmusters der verschiedenen Reinigungsstufen in der SDS-

PAGE. Abbildung 4.9 stellt die Fraktionen nach RESOURCE TM ETH mit dem höchsten

Peptidase-Gehalt dar.

Abbildung 4.8: Proteinmuster der Reinigungsschritte in der SDS-PAGE Spur 1: Zellwandlysatepool nach Dialyse (26 µg) Spur 2: Pool nach HiLoad 26/10 Q Sepharose HP-Chromatographie, dialysiert (19 µg) Spur 3: Pool nach Mono Q HR 5/5-Chromatographie, entsalzt mittels PD-10 (9,6 µg) Spur 4: Pool nach Mono Q HR 5/5-Rechromatographie, dialysiert (14 µg) Spur 5: Pool nach Superdex 200 10/300 GL-Chromatographie (7,9 µg) + Spur 6: Fraktion D1 nach RESOURCE

TM ETH-Chromatographie (4,4 µg) + Rechte Spur: Molekularmassenstandard (Low Range, 9 µg) Die mit (+)-gekennzeichneten Proben wurden von 200 µl mittels Vakuum- Konzentrators eingeengt. Zur Färbung des Gels diente Coomassie-Blau. In Klammern ist die aufgetragene Proteinmenge pro Spur angegeben.

Ergebnisse 67

Abbildung 4.9: Proteinmuster der RESOURCE

TM ETH-Fraktionen C15 bis D3 Spur 1: Fraktion C15 (4,6 µg) Spur 2: Fraktion D1 (4,4 µg) Spur 3: Fraktion D2 (6,3 µg■) Spur 4: Fraktion D3 (6,0 µg■) Rechte Spur: Molekularmassenstandard (Low Range, 9 µg) Die mit (■)-gekennzeichneten Angaben wurden aus dem Flächenintegral des RESOURCE

TM ETH-Chromatogramms geschätzt. Zur Färbung des Gels diente Coomassie-Blau. In Klammern ist die aufgetragene Proteinmenge pro Spur angegeben. Die Isolation eines L-Arg-AMC-hydrolysierenden Enzyms aus Zellwandlysat des Candida-

albicans-Stammes ATCC 2091 ergab ein Präparat mit einer Reinheit von etwa 95 %. Die

spezifische katalytische Aktivität des isolierten Enzyms von 2,56 U/mg für L-Arg-AMC

(Tabelle 4.2) stellt nicht das Maximum der katalytischen Aktivität dar, da die verwendete

Substratkonzentration von 100 µM unter Standardmessbedingungen keine Substratsättigung

gewährleistete. Detaillierte Angaben zu kinetischen Eigenschaften beinhaltet Abschnitt 4.3.4.

Ergebnisse 68

4.3. Charakterisierung des peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von Candida albicans Nachfolgend werden die Ergebnisse der Identifizierung sowie molekularen und funktionellen

Charakterisierung der in Fraktion D1 nach RESOURCE TM ETH enthaltenen Peptidase aus

der Zellwand von Candida albicans dargestellt. Diese Fraktion zeigte den höchsten

Proteingehalt und die größte Reinheit in der SDS-PAGE.

4.3.1 Molekulare und funktionelle Identifizierung der Peptidase

Die Identifizierung des isolierten Enzyms erfolgte durch vollständigen tryptischen Verdau

einer aus einem SDS-Polyacrylamidgel ausgeschnittenen Proteinbande (In-gel digestion)

und nachfolgender Peptididentifizierung mithilfe der Massenspektrometrie (Einzelheiten

enthält Abschnitt 3.2.9). Die durch Peptididentifizierung erhaltenen Aminosäuresequenzen

passen zur Aminosäuresequenz des hypothetischen Proteins mit dem ORF CaO19.12664

(GenBank RefSeq XM 705313, Candida albicans SC5314). Das Resultat ist in der

Abbildung 4.10 gezeigt. Die rot und fett gedruckten identifizierten tryptischen Peptide

entsprechen einer Sequenzabdeckung (sequence coverage) von 63 %. Gemäß

entsprechendem NCBI-Eintrag EAK91143 ist das Enzym als Aminopeptidase ausgewiesen

und wird als Candida-albicans-Aminopeptidase 2 (CaApe2) bezeichnet. Die Übersetzung

des ermittelten ORF ergibt ein aus 954 Aminosäuren zusammengesetztes Protein mit einer

berechneten nominellen Molekularmasse von 107,361 kDa. Der größte Teil des Proteins,

bestehend aus den Aminosäuren 88 bis 954, wird von identifizierten Peptidsequenzen

abgedeckt und entspricht einer berechneten Molekularmasse von 97,607 kDa. Die Differenz

zum Wert von rund 90 kDa, der über die elektrophoretische Mobilität des CaApe2-Proteins in

der SDS-PAGE bestimmt wurde, wird im Abschnitt 5.3 ausführlich diskutiert.

Ergebnisse 69

1 MFSTARKGVI SSTGKYRPKL YHGITILNIN KSFFSKIALT HDMVGKTPNS 51 VNKNTNRHIF PFHKISNSGF SSGGQKLSYS KMCHHSRSSD NSASVVNQER 101 EVLPTNVKPL HYDLTIEPIF DNFTFKGEET IDFQVNEKTN FITLNSLEIE 151 VQEAKIDGKS VTDISFDAGK QTVTFKFDDD LSTGSIAKLY IKFTGELNDK 201 MAGFYRASYQ EDGKTKYMAT TQMEPTDCRR AFPSYDEPAA KSKFTISLIA 251 DKELVCLSNS SEKETVSLDG NKKKVTFQTT PLMSTYLVAF IVGDLRYISN 301 DNYRVPIRVY STPGTEHLGE YSANIAAQTL KFFDQQFGID YPYDKLDMVA 351 VPSFSAGAME NCGLVTFRTV DLLIDADNAN VNTKQRVTEV VMHELAHQWF 401 GDLVTMEFWD GLWLNEGFAT WMSWYACNSL YPDWKVWESY VSDSLQHALT 451 LDALRASHPI EVPVKRADEI NQIFDAISYS KGSSLLRMIS KWLGEDVFVK 501 GVSNYLKKHK WGNTKTSDLW EALSEASGED VVKVMDIWTK NIGFPIVKVE 551 EIGNGEIKVT QNRFLATGDV KESEDKTLYP VFLGLKTSEG VDESSVLETR 601 SKTIKLPTSD DFFKINGDQS GIYRTAYEPA RWTKLGKAGV EGKLSVEDRV 651 GLVADAGSLA SSGFIKTSSL LDLVKSWSKE SNYVVWNEIL TRIGSIKAAL 701 MFEDEATKKA LEIFTRDLIS EKLKETGWEF SADDSFADQQ LKSSLFASAA 751 NAEDPEAVAF AKEAFAKFIA GDKKAIHPNL RASIFNTNAK YGDEKTFDEL 801 YNIYRNPSSV EEKIAALRSF GRFTKPEILD KVTGLLLQTD IVKQQDIYIP 851 MQGLRAHKLG VEKLWTWLSE NWDQIYILLP PGLSMLGSVV TLGTSGFTKE 901 EQKKKVEEFF AQKDNKGYDQ SLAQSLDIIT AKSKWTDRDA KSIYEWLEAN 951 EYTK Abbildung 4.10: Identifizierung der isolierten Peptidase von Candida albicans Die Korrelation der Fragmente (rot und fett gedruckt) mit der Protein-Datenbank NCBInr unter Verwendung der Mascot-Software [PERKINS et al. 1999] ergab das hypothetische Protein CaO19.12664 (Candida albicans SC5314) mit einer Sequenz- abdeckung von 63 %. Das Protein weist eine nominelle Molekularmasse von 107,361 kDa auf, wird als Aminopeptidase ausgewiesen und erhält in dieser Arbeit die Bezeichnung Candida-albicans-Aminopeptidase 2 (CaApe2).

4.3.2 Vergleichende Sequenzanalyse der isolierten Peptidase mit homologen Proteinen der Ascomycota

Die vergleichende Sequenzanalyse wurde mithilfe des Programms CLUSTALW [THOMPSON

et al., 1994; http://www.ebi.ac.uk/clustalw/] vorgenommen. Die BLAST-Suche mit der

Sequenz von Ca_hp EAK91143 gegen alle verfügbaren Proteinsequenzen der Ascomycota

identifizierte 53 homologe Proteine. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind die den höchsten

Übereinstimmungsgrad aufweisenden ersten sechs Sequenzen dargestellt (Abbildung 4.11).

Bindestriche wurden von CLUSTALW eingefügt, um Aminosäuren an der jeweils homologen

Position zu platzieren. Sternchen zeigen identische Aminosäuren an, Doppelpunkte

markieren konservierte Substitutionen und Punkte symbolisieren semi-konservierte

Substitutionen.

Ergebnisse 70

Ca_hp MFSTARKGVISSTGKYRPK--LYHGITILNINKSFFSKIALTHDMVGKTPNSVNKNTNRH 58 Ps_Aap ------------------------------------------------------------ Dh_hp --KMSRYLLVNCKNRLTPLRASFNKASPNTRNHIYQQNRRISFSHAPHKFKSYLPSVNGL 58 Af_Ape --------MRRFSSARLPLVLNSARPPLSSPSTKPLLLLSRSASLFSSSPSTSVNRIAPR 52 An_hp ------------------------------------------------------------ Nc_hp ------------------------------------------------------------ Ca_hp IFPFHKISNSGFSSGGQKLSYSK-MCHHSRSSDNSASVVNQ-EREVLPTNVKPLHYDLTI 116 Ps_Aap ------------------------MCRHS-SSD-SSLVVPA-DREVLPTNVKPLHYDLTL 33 Dh_hp TSLFKSIALRFKRNHHSQLSLIKSMCRNNTESS-SSQVVPQ-DREVLPTNVKPLHYDLTL 116 Af_Ape RFPLSQVAKRYCSYRR--------MCMSRRTDVPSGSTNVTHGREVLPTNVKPVHYDLTL 104 An_hp ------------------------MCGTRRAEA-AGSTNVP-GREVLPTNVKPTHYDLTL 34 Nc_hp ------------------------MCRTQAQADVASGVNIQ-GRELLPTNVIPKHYHITL 35 ** :. . **:***** * **.:*: Ca_hp EPIFDNFTFKGEETIDFQVNEKTNFITLNSLEIEVQEAKIDG-----KSVTDISFDAGKQ 171 Ps_Aap EPIFSTFKFNGQETIDFHVNEDTDYITLNSLEIEIQEAIING-----SAVSDISFNVDKQ 88 Dh_hp EPNFETFKFDGQVIIDLHVNEYSDYVTLNCLEIDIHEAKIND-----VETKKIEFNEDQQ 171 Af_Ape EPNFEKFTYDGTVIIDLEVAEDTTSISLNTNEIDIHEAVVSSQGSVVTSSPDISINKDNQ 164 An_hp EPNFETFKYDGTVIIDLQVAEDTTSISLNSTEIDIHTATVSAQGSVVSSSPEILLNKDKQ 94 Nc_hp EPDFQKLTFDGTVVIDLDVEEDSKSISLHTLEIDIHNAKITSGGQTVSSSPKVSYNETTQ 95 ** *..:.:.* **:.* * : ::*: **::: * : .: : * Ca_hp TVTFKFDDDLSTGSIAKLYIKFTGELNDK 200 Ps_Aap TVTFKLPQPLAQGSNAKLALKFTGDLNNK 117 Dh_hp SVTFKFADHLVSGADARLSIKFTGELNDK 200 Af_Ape TATIKFAKTIPAGSSAQLKLTFSGILNDN 193 An_hp EATIKFSETISAGSSAQLKLTFTGTLNDN 123

Abbildung 4.11: Vergleich der N-terminalen Aminosäuresequenzen der Aminopeptidase CaApe2 aus Candida albicans mit homologen Proteinen anderer Ascomycota

Die Suchsequenz Ca_hp ist blau dargestellt. Aminosäuren, die durch Massenspektrometrie identifiziert wurden, sind in roter Farbe gezeigt. Nähere Erläuterungen sind dem Text zu entnehmen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen bedeuten: Ca_hp = hypothetisches Protein EAK91143 aus Candida albicans; Ps_Aap = Alanin/Arginin-Aminopeptidase XP_001385797 aus Pichia stipitis; Dh_hp = hypothetisches Protein XP_459061 aus Debaryomyces hansenii; Af_ap = Aminopeptidase XP_751922 aus Aspergillus fumigatus; An_hp = hypothetisches Protein EAA64758 aus Aspergillus nidulans; Nc_hp = hypothetisches Protein EAA29936 aus Neurospora crassa.

4.3.3 pH-Optimum der Enzymaktivität der isolierten Peptidase

Die spezifische katalytische Aktivität der isolierten Peptidase für das Substrat L-Arg-AMC bei

einer Konzentration von 100 µM wurde für den pH-Bereich von 3 bis 11 untersucht. Drei

verschiedene Puffersysteme dienten zur Abdeckung dieses breiten pH-Bereichs. Die pH-

Aktivitäts-Kurve ist in Abbildung 4.12 dargestellt. Die maximale Aktivität des gereinigten

Enzyms für das Testsubstrat L-Arg-AMC wurde bei einem pH-Wert von 7,2 bestimmt.

CaApe2 wird somit der Gruppe der neutralen Aminopeptidasen zugeordnet.

Ergebnisse 71

Abbildung 4.12: pH-Abhängigkeit der Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 Der pH-Bereich von 3 bis 11 wurde mit 3 verschiedenen Puffersystemen abgedeckt. Es wurde je pH-Wert mindestens eine Vierfachbestimmung durchgeführt (n ≥ 4).

4.3.4 Substratspezifität und Enzymkinetik der isolierten Peptidase

Die Zuordnung von CaApe2 zur Unterklasse der Alanin/Arginin-spezifischen Amino-

peptidasen legte den Einsatz von Peptidsubstraten zur Analyse der Enzymkinetik nahe. Die

verwendeten Substrate verfügten über einen N-terminalen Aminosäurerest. Untersucht

wurde die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration bei der

enzymatischen Hydrolyse von L-Arg-AMC und L-Ala-AMC durch die gereinigte Peptidase.

Das isolierte Enzym akzeptierte noch ein drittes Substrat, L-Leu-AMC. Die Hydrolyse von

makromolekularen Substraten wird in Abschnitt 4.4 beschrieben.

Enzymkinetik für das Substrat L-Arginin-7-amido-4-methylcoumarin

Der Zusammenhang von Hydrolysegeschwindigkeit des L-Arg-AMC-Substrates und der

L-Arg-AMC-Konzentration ist in Abbildung 4.13 dargestellt. Der Kurvenverlauf zeigt zunächst

die Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Substratkonzentration, fällt aber

bei hohen Substratkonzentrationen unerwartet wieder ab (grüne Linie in der Abbildung 4.13).

Die letztgenannte Beobachtung konnte unter Berücksichtigung der Tatsache, dass

L-Arg-AMC in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst wurde, experimentell untersucht werden.

Dazu wurde eine Substratlösungsreihe mit gleichbleibender Substratkonzentration von

100 µM und ansteigender DMSO-Konzentration hergestellt. Die Messreihe ergab ein

Ergebnisse 72

Abfallen der Enzymaktivität mit steigender DMSO-Konzentration (Daten nicht gezeigt).

Mithilfe dieser Daten konnte die beobachtete biphasische v/S-Kinetik des Enzyms korrigiert

werden. Die Korrektur wurde mit dem Programm Sigma Plot durchgeführt und ist als

schwarze fettgedruckte Linie in Abbildung 4.13 dargestellt. Das zur Berücksichtigung des

DMSO-Hemmeffektes zugrunde gelegte Inhibitions-Modell ist im Abschnitt 3.2.11 ausführlich

beschrieben.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 100 200 300 400 500 600Konzentration von L-Arg-AMC [µM]

Spe

zifis

che

Akt

ivitä

t [U

/mg]

Abbildung 4.13: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der L-Arg-AMC-Konzentration

Die grüne Linie zeigt die biphasische v/S-Kinetik, die schwarze Linie die den DMSO-Hemmeffekt berücksichtigende v/S-Kinetik. Für jede Substratkonzentration erfolgte mindestens eine Dreifachbestimmung (n ≥ 3).

Die Daten nach der Korrektur des DMSO-Einflusses ermöglichten eine Berechnung der

charakteristischen kinetischen Parameter und für das Substrat L-Arg-AMC

(Tabelle 4.3).

MaxV MK

Tabelle 4.3: Zusammenstellung kinetischer Parameter von CaApe2 Legende: = maximale Reaktionsgeschwindigkeit MaxV = Michaelis-Menten-Konstante MK = Hemmkonstante für DMSO IIK

Kennwert L-Arg-AMC L-Ala-AMC

MaxV [U/mg] 2,92 ± 0,063 4,25 ± 0,576

MK [µM] 1,48 ± 0,077 32,40 ± 4,520

IIK [M] 0,07 ± 0,001 0,04 ± 0,003

Ergebnisse 73

Enzymkinetik für das Substrat L-Alanin-7-amido-4-methylcoumarin

Der Zusammenhang von Hydrolysegeschwindigkeit des Substrates L-Ala-AMC und der

L-Ala-AMC-Konzentration ist in Abbildung 4.14 dargestellt. Auch für das synthetische Sub-

strat L-Ala-AMC zeigt sich der schon für L-Arg-AMC gefundene Abfall der Reaktionsge-

schwindigkeit bei hohen Substratkonzentrationen. Für die Korrektur der Substrat-

abhängigkeitskurve für L-Ala-AMC wurde ebenfalls der DMSO-Hemmeffekt auf das Enzym

untersucht. Zwei Messreihen bei 100 µM und 300 µM L-Ala-AMC und steigender DMSO-

Konzentration ergaben jeweils ein Abfallen der Enzymaktivität (Daten nicht gezeigt). Die

Korrektur der Substratabhängigkeitskurve durch die DMSO-Hemmkurven wurde ebenfalls

mit dem Programm Sigma Plot vorgenommen. Die um den DMSO-Hemmeffekt korrigierte

v/S-Kinetik zeigt die schwarze fettgedruckte Linie in Abbildung 4.14.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 200 400 600 800 1000 1200

Konzentration von L-Ala-AMC [µM]

Spez

ifisc

he A

ktiv

ität [

U/m

g]

Abbildung 4.14: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der L-Ala-AMC-Konzentration

Die grüne Linie zeigt die biphasische v/S-Kinetik, die schwarze Linie die den DMSO-Hemmeffekt berücksichtigende v/S-Kinetik. Es wurde für jede Substratkonzentration mindestens eine Vierfachbestimmung durchgeführt (n ≥ 4).

Die Daten nach Korrektur des DMSO-Einflusses ermöglichten eine Berechnung der

charakteristischen kinetischen Parameter VMAX und KM für das Substrat L-Ala-AMC

(Tabelle 4.3). Darüber hinaus ist die Hemmkonstante für DMSO aufgeführt. Der Einfluss des

Substratlösungsmittels auf die Enzymaktivität wird in Abschnitt 5.4.2 diskutiert.

Ergebnisse 74

Hydrolyse von L-Leu-AMC

Die Aktivität der Peptidase wurde auch für das Substrat L-Leu-AMC bestimmt. Die Ab-

bildung 4.15 zeigt die Enzymaktivität für zwei verschiedene L-Leu-AMC-Konzentrationen. Der

niedrigere Wert für die höhere Substratkonzentration lässt sich vermutlich durch die

Hemmung der Peptidase durch Methanol, in dem das Substrat L-Leu-AMC gelöst war,

erklären. Eine Substrathemmung könnte ebenfalls beteiligt sein. In weiterführenden

Versuchen wurde für das Substrat L-Leu-AMC die Abhängigkeit der Reaktions-

geschwindigkeit von der L-Leu-AMC-Konzentration genauer untersucht und die Kennwerte

der Michaelis-Menten-Kinetik bestimmt [KLINKE et al., 2008].

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

100 300Konzentration von L-Leu-AMC [µM]

Spe

zifis

che

Akt

ivitä

t [U

/mg]

Abbildung 4.15: Spezifische Aktivität der gereinigten Peptidase mit L-Leu-AMC als Substrat Es wurden Vierfachbestimmungen durchgeführt (n = 4).

4.3.5 Wirkung von Proteinaseinhibitoren und Metallkationen auf die L-Alanin-7-amido-4-methylcoumarin-Hydrolyse durch die Peptidase

Die hydrolytische Aktivität von Peptidasen kann durch gruppenspezifische Inhibitoren

gehemmt werden. Die spezifische Aktivität der gereinigten Peptidase für das Substrat

L-Arg-AMC in der Konzentration von 100 µM wurde im Inhibitoren-Reaktionsansatz bei

Anwesenheit von Phenanthrolin, EDTA, Pepstatin und PMSF bestimmt (siehe Abschnitt

3.2.11). Die Bestimmung der Peptidaseaktivität des Inhibitoren-Reaktionsansatz erfolgte wie

für den Standard-Reaktionsansatz bei Standardmessbedingungen. Der Einfluss von Metall-

kationen auf die Enzymaktivität wurde mit Kalziumchlorid und Zinkchlorid untersucht.

Ergebnisse 75

Einfluss von Phenanthrolin auf die Enzymaktivität

Die Wirkung von Phenanthrolin auf die L-Arg-AMC-Hydrolyse durch das isolierte peptido-

lytische Enzym ist in Abbildung 4.16 dargestellt. Phenanthrolin bildet speziell mit Zink

Chelate. Eine Hemmung der Enzymaktivität um 50 % trat bei einer Phenanthrolin-

Konzentration von 83 µM auf. Bei einer Phenanthrolin-Konzentration von 1 mM betrug die

prozentuale Hemmung unter Standardmessbedingungen 96 %. Das Phenanthrolin-

Lösungsmittel Methanol bewirkte ebenfalls eine Hemmung der Enzymaktivität. Methanol-

Kontrollproben dienten zur Korrektur der Werte.

Abbildung 4.16: Phenanthrolin-Einfluss auf die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 Die Abszissenachse wurde logarithmisch eingeteilt. Für jede Phenanthrolin-Konzentration wurde mindestens eine Vierfachbestimmung durchgeführt (n ≥ 4).

Einfluss von EDTA auf die Enzymaktivität

EDTA inhibiert Metalloenzyme mit zweiwertigen Metallionen durch Chelatbildung. Für EDTA

konnte ebenfalls eine Hemmung der L-Arg-AMC-Hydrolyse festgestellt werden (Ab-

bildung 4.17). EDTA zeigt schon bei sehr geringen Konzentrationen eine deutliche Wirkung.

Eine Hemmung der Enzymaktivität um 50 % trat bei einer EDTA-Konzentration von 2,2 µM

auf. Bei 0,5 mM wurde die Enzymaktivität um 75 % gehemmt. Bei steigender EDTA-

Konzentration wurde keine vollständige Hemmung der Enzymaktivität erreicht.

Ergebnisse 76

Abbildung 4.17: EDTA-Einfluss auf die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2

Die Abszissenachse wurde logarithmisch eingeteilt. Für jede EDTA-Konzentration wurde mindestens eine Fünffachbestimmung durchgeführt (n ≥ 5).

Einfluss von Pepstatin A auf die Enzymaktivität

Pepstatin A ist ein spezifischer Inhibitor der Aspartylproteinasen. Die spezifische Aktivität der

gereinigten Peptidase für das Substrat L-Arg-AMC in der Konzentration von 100 µM wurde in

Anwesenheit von Pepstatin A unter Standardmessbedingungen bestimmt. Die Enzymaktivität

wurde durch Pepstatin A bei einer Konzentration von 1 mM nicht beeinträchtigt. Aus einer

Dreifachbestimmung (n = 3) ergab sich das Konfidenzintervall zum empirischen Mittelwert für

die spezifische Aktivität der Peptidase von 2,154 U/mg mit der unteren Konfidenzgrenze von

2,107 und der oberen Konfidenzgrenze von 2,201 bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 %.

Einfluss von Phenylmethylsulfonylfluorid auf die Enzymaktivität

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) gilt als Inhibitor von Serinproteinasen und einigen

Cysteinproteinasen. Die spezifische Aktivität der gereinigten Peptidase für das Substrat

L-Arg-AMC in der Konzentration von 100 µM wurde in Anwesenheit von PMSF unter

Standardmessbedingungen bestimmt. Die Enzymaktivität wurde durch PMSF bei einer

Konzentration von 1 mM nicht beeinträchtigt. Aus einer Sechsfachbestimmung (n = 6) ergab

sich das Konfidenzintervall zum empirischen Mittelwert für die spezifische Aktivität der

Peptidase von 2,129 U/mg mit der unteren Konfidenzgrenze von 2,061 und der oberen

Konfidenzgrenze von 2,197 bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 %.

Ergebnisse 77

Einfluss von Metallkationen auf die Enzymaktivität

Die nach der Dissoziation von Metallsalzen entstehenden Ionen können die Enzymaktivität

beeinflussen. Während der Enzymreinigung wurde eine starke Abnahme der Volumen-

aktivität nach Ionenaustausch-Chromatographie festgestellt, die nach Dialyse gegen

TRIS/HCl-Puffer reversibel war. Die Abnahme der Enzymaktivität bei 400 mM Natriumchlorid

betrug 65 %. Beim Erstellen des Aktivitätsprofils nach Ionenaustausch-Chromatographie

konnte somit nur eine verringerte L-Arg-AMC-Hydrolyse gemessen werden.

Die Aminosäure-Sequenz des hypothetischen Proteins enthält eine mögliche Zink-

Bindungsdomäne. Dies legte die Untersuchung der Wirkung von zweiwertigen Metallionen,

insbesondere von Zink auf die Peptidase-Aktivität nahe. Exemplarisch wurde Kalziumchlorid

und Zinkchlorid eingesetzt (Abbildung 4.18). Für Kalziumchlorid in der Konzentration von

1 mM konnte eine minimale Abnahme der Enzymaktivität unter Standardmessbedingungen

festgestellt werden. Entgegen den Erwartungen bewirkte Zinkchlorid eine starke Abnahme

der Enzymaktivität, die in Abschnitt 5.4.3 diskutiert wird. Die prozentuale Hemmung bei

1 mM Zinkchlorid betrug 96 %.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Kontrolle 1 mM 1 mMCaCl2 ZnCl2

spez

ifisc

he A

ktiv

ität [

U/m

g]

Abbildung 4.18: Einfluss von Metallkationen auf die Enzymaktivität

Dargestellt wurden der Kalziumchlorid-Einfluss und der Zinkchlorid-Einfluss auf die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch die gereinigte Peptidase. Es wurde je eine Fünffachbestimmung durchgeführt (n = 5).

4.3.6 Temperaturoptimum der Enzymaktivität

Die spezifische Aktivität der gereinigten Peptidase für das Substrat L-Arg-AMC in der

Konzentration von 100 µM wurde über den Temperaturbereich von 10 °C bis 60 °C unter

Standardmessbedingungen untersucht (Abbildung 4.19). Die maximale Aktivität der

gereinigten Peptidase wurde bei einer Temperatur von 30 °C gemessen. Bei physiologischer

Ergebnisse 78

Körpertemperatur von 37 °C zeigt das Enzym etwa 85 % seiner maximalen katalytischen

Aktivität.

Abbildung 4.19: Temperaturabhängigkeit der Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 Der Temperaturbereich von 10 bis 60 °C wurde bei Standardmessbedingungen untersucht. Für jeden Temperaturwert wurde eine Dreifachbestimmung durchgeführt (n = 3).

4.4 Endopeptidase-Aktivität enzymhaltiger Proben von Candida albicans

Im Folgenden werden die Ergebnisse der Untersuchungen zur Einwirkung der gereinigten

Peptidase, des Kulturüberstandes, des Zellextraktes und des Zellaufschlusses (zusammen

als enzymhaltige Proben bezeichnet) auf verschiedene physiologische Substrate dargestellt.

Die enzymhaltigen Proben wurden aus C.-albicans-Zellen der Stämme ATCC 2091 und

OMZ 1066, kultiviert in YCB-RSA-Medium, gewonnen, wie in den Abschnitten 3.2.2, 3.2.5

und 3.2.6 beschrieben. Zellextrakt ist zentrifugierter und sterilfiltrierter Zellaufschluss.

Eingesetzt wurden Albumin, das von vielen Proteinasen hydrolysiert wird, und verschiedene

Kollagene, die aufgrund ihrer rigiden Struktur nur von wenigen Proteinasen gespalten

werden können. In den Versuchen wurden Typ-I-Kollagen, Typ-IV-Kollagen und

demineralisiertes humanes Dentin, das vorwiegend aus Typ-I-Kollagen besteht, verwendet.

Ergebnisse 79

4.4.1 Albuminabbau durch enzymhaltige Proben von Candida albicans

Die proteolytische Aktivität der gereinigten Peptidase, des Kulturüberstandes und des

Zellextraktes mit Rinder-Serum-Albumin (RSA) als Substrat wurde spektralphotometrisch

bestimmt (Abbildung 4.20). Die Kulturüberstände wurden aufgrund der erwarteten Sap-

Aktivität bei einem pH-Wert von 3,5 inkubiert. Die gereinigte Peptidase und der Zellextrakt

wurden bei neutralem pH-Wert untersucht. Die Spaltung von Albumin konnte für die

Kulturüberstände und für Zellextrakt gezeigt werden, nicht aber für die gereinigte Peptidase.

Abbildung 4.20: Albuminabbau durch enzymhaltige Proben von Candida albicans

Eingesetzte Proben mit entsprechendem pH-Wert im Reaktionsansatz: CF (2091) = Kulturüberstand des Stammes ATCC 2091, pH 3,5 CF (1066) = Kulturüberstand des Stammes OMZ 1066, pH 3,5 CWP = Zellwand-Peptidase (gereinigt), 4,4 µg/ml im Ansatz, pH 7,4 CEx (2091) = Zellextrakt des Stammes ATCC 2091, pH 7,4 Pro Reaktionsansatz wurden 600 µl RSA-Lösung mit 150 µl Probe 1 h bei 37 °C inkubiert (siehe Abschnitt 3.2.12). Nach Denaturieren durch Perchlorsäure und Zentrifugation des Reaktionsansatzes wurde die Absorption bei 280 nm der im Überstand enthaltenen freigesetzten Peptide bestimmt. Die aufgetragenen Absorptionen stellen die um Kontrollwerte verminderten Mittelwerte einer Doppel-bestimmung dar (n = 2).

4.4.2 Kollagenhydrolytische Aktivität enzymhaltiger Proben von Candida albicans Nur wenige Mikroorganismen können die stabilen tripelhelikalen Domänen der Kollagene

hydrolysieren. Die proteolytische Aktivität enzymhaltiger Proben von Candida albicans

gegenüber säurelöslichem und unlöslichem Typ-I-Kollagen wurde im Folgenden untersucht.

Der Nachweis der Degradation von unlöslichem Kollagen erfolgte durch die Bestimmung von

freigesetztem Hydroxyprolin, für säurelösliches Kollagen durch Darstellung mithilfe der SDS-

Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Ergebnisse 80

Nachweis mithilfe der Hydroxyprolin-Bestimmung

Die proteolytische Aktivität der enzymhaltigen Proben gegenüber unlöslichem Kollagen ist in

Abbildung 4.21 dargestellt. Die Hydrolyse von unlöslichem Typ-I-Kollagen aus der Achilles-

Sehne des Rindes wurde bei neutralem und saurem pH-Wert untersucht, wie im Abschnitt

3.2.13 beschrieben. Bei saurem pH-Wert wurde eine Aktivität der Saps erwartet, wobei diese

auch bei neutralem pH-Wert noch gering wirksam sind. Bei neutralem pH-Wert wurde eine

neutrale kollagenolytische Aktivität der enzymhaltigen Proben erwartet. Als Positivkontrollen

wurden für pH-Wert 3,5 das kommerziell gereinigte Sap2 (Fa. TaKaRa) und für pH-Wert 7,4

Collagenase A von Clostridium histolyticum, die zum Zellextrakt gegeben wurde, eingesetzt.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CF (1066) CF (2091) Sap 2 CD (2091) CF (2091) CWP CEx (2091) CD (2091) CD + CC

freig

eset

ztes

Kol

lage

n [µ

g]

pH 3,5 7,4

Abbildung 4.21: Kollagenhydrolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans Eingesetzte Proben mit entsprechendem pH-Wert im Reaktionsansatz: CF (1066) = Kulturüberstand des Stammes OMZ 1066, pH 3,5 CF (2091) = Kulturüberstand des Stammes ATCC 2091, pH 3,5 Sap2 = Sap2-Enzym (Fa. TaKaRa), 5 µg/ml, pH 3,5 CWP = Zellwand-Peptidase (gereinigt), 5 µg/ml, pH 7,4 CD (2091) = Zellaufschluss (Stamm ATCC 2091), pH 7,4 CEx (2091) = Zellextrakt (Stamm ATCC 2091), pH 7,4 CD + CC = Zellaufschluss (Stamm ATCC 2091) mit Collagenase A von Clostridium histolyticum, pH 7,4 1,2 mg unlösliches Typ-I-Kollagen (Trockengewicht) wurde mit enzymhaltiger Probe 24 h bei 37 °C inkubiert (siehe Abschnitt 3.2.13). Die Menge des freigesetzten Kollagens im Überstand wurde mittels Hydroxyprolin-Bestimmung nach REDDY und ENWEMEKA [1996] ermittelt. Die aufgetragenen Kollagenmengen stellen die um Kontrollwerte verminderten Mittelwerte einer Vierfachbestimmung dar (n = 4).

Eine Kollagendegradation im sauren Milieu konnte für die Kulturüberstände, Sap2 (Fa.

TaKaRa) und Zellaufschluss gezeigt werden. Kollagen wurde stark im Überschuss

eingesetzt. Es wurde maximal 7 % des Gesamtkollagens abgebaut. Bei neutralem pH-Wert

zeigte der Kulturüberstand geringe Kollagenspaltung, die gereinigte Peptidase, der

Zellextrakt und der Zellaufschluss keine Kollagenolyse.

Ergebnisse 81

Abbildung 4.22: Analyse des Kollagenabbaus durch die gereinigte Peptidase mittels SDS-PAGE

Die gereinigte Peptidase (5 µg/ml im Ansatz) wurde mit Typ-I- und Typ-IV-Kollagen (150 µg/ml im Ansatz) 24 h bei pH 7,4 und 37 °C inkubiert. Die Ansätze wurden anschließend mithilfe der SDS-PAGE nach HAMES und RICKWOOD [1990] analysiert (siehe Abschnitt 3.2.7 und 3.2.13). Zur Färbung des Gels diente Coomassie-Blau.

Spur 1: Typ-I-Kollagen ohne weitere Zusätze (18 µg) Spur 2: gereinigte Peptidase ohne weitere Zusätze (0,6 µg) Spur 3: Typ-I-Kollagen mit gereinigter Peptidase (18,6 µg) Spur 4: Typ-IV-Kollagen ohne weitere Zusätze (18 µg) Spur 5: Typ-IV-Kollagen mit gereinigter Peptidase (18,6 µg) Spur 6: Typ-IV-Kollagen mit Collagenase A von Clostridium histolyticum (18,6 µg) Rechte Spur: Molekularmassenstandard (Low Range, 9 µg) In Klammern ist die aufgetragene Gesamtproteinmenge angegeben.

Bestimmung des Kollagenabbaus durch die gereinigte Peptidase mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Mit der SDS-PAA-Gelelektrophorese kann der Abbau von säurelöslichen Kollagenen

dargestellt werden. Zum Einsatz kam hier auch Typ-IV-Kollagen als Vertreter der

nichtfibrillären Kollagene. Die gereinigte Peptidase wurde mit säurelöslichem Kollagen vom

Typ I und Typ IV inkubiert und das Gemisch anschließend auf das Gel aufgetragen (siehe

Ergebnisse 82

Abschnitt 3.2.13). Als Positivkontrolle wurde auch hier Collagenase A von Clostridium

histolyticum mit Kollagen angesetzt. Für die gereinigte Peptidase konnte keine

kollagenolytische Aktivität abgelesen werden (Abbildung 4.22). Clostridium-Collagenase

verdaute Typ-I-Kollagen vollständig (nicht dargestellt) und Typ-IV-Kollagen weitgehend.

4.4.3 Dentinhydrolyse durch enzymhaltige Proben von

Candida albicans Der Abbau von demineralisiertem Dentin durch enzymhaltige Proben von Candida albicans

wurde mithilfe der Hydroxyprolin-Bestimmung untersucht. Auch hier wurde bei saurem pH-

Wert eine Aktivität der Saps erwartet. Bei neutralem pH-Wert wurde die gereinigte Peptidase

auf eine neutrale dentinhydrolytische Aktivität untersucht. Als Positivkontrolle wurde für pH-

Wert 3,5 die kommerziell gereinigte Sap2 eingesetzt.

0

5

10

15

20

25

30

CF (2091) CF (1066) Sap 2 CWP

freig

eset

ztes

Kol

lage

n [µ

g]

pH 3,5 3,5 3,5 7,4

Abbildung 4.23: Dentinhydrolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans Eingesetzte Proben mit entsprechendem pH-Wert im Reaktionsansatz: CF (2091) = Kulturüberstand des Stammes ATCC 2091, pH 3,5 CF (1066) = Kulturüberstand des Stammes OMZ 1066, pH 3,5 Sap2 = Sap2-Enzym (Fa. TaKaRa), 5 µg/ml, pH 3,5 CWP = Zellwand-Peptidase (gereinigt), 5 µg/ml und 22 µg/ml, pH 7,4 4,5 mg demineralisierte Dentinscheibenstücke wurden mit enzymhaltiger Probe 24 h bei 37 °C inkubiert (siehe Abschnitt 3.2.14). Die Menge des freigesetzten Kollagens im Überstand wurde mittels Hydroxyprolin-Bestimmung nach REDDY und ENWEMEKA [1996] ermittelt. Die aufgetragenen Kollagenmengen stellen die um Kontrollwerte verminderten Mittelwerte dar. Es wurde mindestens eine Doppelbestimmung je Probe durchgeführt (n ≥ 2).

Ein Abbau des demineralisierten Dentins wurde für die Kulturüberstände und das kommer-

ziell gereinigte Sap2 gezeigt (Abbildung 4.23). Demineralisiertes Dentin wurde stark im

Überschuss eingesetzt, wobei maximal 0,5 % des Gesamtdentinkollagens abgebaut wurden.

Die gereinigte Peptidase aus der Zellwand wies keine dentinhydrolytische Aktivität auf.

5. Diskussion In der vorliegenden Arbeit sollte die Beteiligung von Candida albicans an der

Dentinkariogenese beleuchtet werden. Die Entstehung einer Dentinkavität geht mit der

Degradation der organischen Dentinmatrix einher. In welchem Milieu die Hydrolyse des

Dentinkollagens abläuft, ist eine bisher ungeklärte Frage. Es galt, die Fähigkeit von

C. albicans zum Abbau der organischen Dentinmatrix bei neutralem und auch bei saurem

pH-Wert zu untersuchen. Im Speziellen sollte ein peptidolytisches Enzym auf

kollagenolytische Wirksamkeit geprüft werden. Bestandteile der vorliegenden Arbeit, ergänzt

um die Reinigung des Enzyms aus Zellextrakt und weiterführende Untersuchungen, wurden

in der Publikation KLINKE et al. [2008] zusammengefasst.

5.1 Substrate zum Nachweis kollagenolytischer Aktivität

Zur Detektion von enzymatischer Aktivität im Eluat nach Chromatographie bedarf es

einfacher und schneller Testverfahren. Der komplexe Vorgang der Kollagenolyse ist schwer

in Schnelltests umsetzbar. Die verfügbaren künstlichen Substrate werden meist nicht nur von

Kollagenasen gespalten, es mangelt an Spezifität. Oft verwendete Peptidsubstrate sind

PZ-PLGPA und FALGPA. Candida albicans verfügt über eine zytosolische FALGPA-Aktivität

[NISHIMURA et al., 2001; KLINKE & KLIMM, 2003]. Das mithilfe von FALGPA isolierte Enzym

wies aber in eigenen Versuchen keine kollagenolytische Aktivität auf (Daten nicht gezeigt).

Auch die in Zellaufschluss von Gruppe-B-Streptokokken gefundene FALGPA-Aktivität konnte

einer Oligopeptidase zugeordnet werden [LIN et al., 1996].

In Anlehnung an die von RODIER et al. [1999] erschienene Publikation wurde in der

vorliegenden Arbeit L-Arg-AMC als Testsubstrat verwendet.

5.2 Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von Candida albicans

Es wird angenommen, dass proteolytische Enzyme eine Schlüsselfunktion bei der Invasion

von C. albicans in menschliche Gewebe innehaben [NAGLIK et al., 2003]. Die von Rodier et

al. 1999 beschriebene Metallopeptidase, welche das bisher einzige Enzym von C. albicans

mit nachgewiesener kollagenolytischer Wirksamkeit ist, regte zur Untersuchung des

Einflusses von C. albicans an der Dentinkariogenese an. In der vorliegenden Arbeit wurde

ein peptidolytisches Enzym aus der Zellwand von C. albicans mithilfe des von Rodier et al.

Diskussion 84

[1999] angegebenen L-Arg-AMC-Tests gereinigt, identifiziert und funktionell charakterisiert.

Tests zur kollagenolytischen Wirksamkeit sollten eine Einschätzung der Funktion der

isolierten Peptidase in der Dentinkariogenese ermöglichen.

5.2.1 Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien

Bei dem Vergleich der Candida-albicans-Kultur in verschiedenen Nährmedien wurden große

Unterschiede in der freigesetzten L-Arg-AMC-Volumenaktivität deutlich (Abschnitt 4.1.1). Es

zeigte sich, dass die Zellwandlysate der Zellen aus Flüssigkulturen eine deutlich höhere

L-Arg-AMC-Aktivität aufwiesen als die Zellwandlysate der Kultur auf dem Festmedium

Sabouraud-Glukose-Agar. Diese Beobachtung lässt sich mit der besseren Verfügbarkeit von

Nährstoffen in Flüssigmedien erklären. Bei Plattenkulturen ist immer mit Substratlimitation

der oberen Zellschichten zu rechnen. Die Anzucht in YCB-RSA-Flüssigmedium ergab eine

90 % höhere L-Arg-AMC-Volumenaktivität des Zellwandlysats als die des Lysats aus

YNB-Glc-Medium. Allerdings war die Zellausbeute der YCB-RSA-Kultur von allen

Flüssigkulturen am geringsten. Um diesen Nachteil auszugleichen, wurde ein

Anzuchtschema entwickelt, das zuerst die Kultivierung in einem Vollmedium (YPD) und

anschließend die Fortführung der Kultur in dem Mangelmedium YCB-RSA vorsah (Abschnitt

3.2.2). Mit der Kultur der Zellen im YCB-RSA-Medium konnte der Kulturüberstand für den

Nachweis der proteolytischen Aktivität und die Hefezellen für die Gewinnung der Peptidase

eingesetzt werden.

5.2.2 Vergleich der Methoden Zellwandlyse und Zellaufschluss

Im Folgenden werden Methoden zur Freisetzung der L-Arg-AMC-Aktivität diskutiert. Der

hohe Proteingehalt im Zellextrakt erschwert die Reinigung eines mengenmäßig gering

vertretenen Proteins erheblich. Um das Verhältnis von Enzym zu Gesamtprotein zu

verbessern, wurden Versuche zum Herauslösen des Zielproteins aus der Zellwand

unternommen.

Unterschieden werden muss die Enzymfreisetzung mittels chemischer Substanzen von dem

enzymatischen Verdau der Zellwand, der Zellwandlyse. Die Agenzien Triton X-100 und

β-Mercaptoethanol lösen Proteine aus der Zellwand heraus, während Enzyme wie Lyticase

die Zellwandstruktur auflösen und so die Zellwandproteine freisetzen. Triton X-100 verändert

elektrostatische Bindungen in der Zellwand und wurde von einigen Autoren erfolgreich zur

Proteinfreisetzung verwendet [REISER & GASPERIK, 1995; LODDER et al., 1999]. Das zur

Zellwandfraktionierung eingesetzte β-Mercaptoethanol spaltet Disulfidbrücken von Proteinen

reduktiv [CHAFFIN et al., 1998].

Diskussion 85

Die Substanzen SDS und DTT werden auch von einigen Autoren mit Erfolg zum

Herauslösen von Zellwandbestandteilen angewendet [PITARCH et al., 2002; PONTON &

JONES, 1986]. Für die Freisetzung des L-Arg-AMC-spaltenden Enzyms aus der Zellwand

konnten die letztgenannten Substanzen nicht eingesetzt werden, da sie die Enzymaktivität

inhibieren (Daten nicht gezeigt).

Zur Gewinnung von Spheroplasten aus Hefezellen wird oft das Enzymgemisch Zymolyase

verwendet [MCCOURTIE & DOUGLAS, 1984; OVALLE et al., 1998]. Für das Herauslösen der

gesuchten L-Arg-AMC-Aktivität aus der Zellwand konnte Zymolyase nicht eingesetzt werden,

da vermutet wurde, dass die enthaltene Protease mit Affinität zu Mannoproteinen das

Zielprotein modifizieren könnte.

Ende der 70er Jahre wurde ein Enzymsystem von Arthrobacter spp. entdeckt, dass die Lyse

der Hefezellwand bewirkt [SCOTT & SCHEKMAN, 1980]. Lyticase wird zur Gewinnung von

Spheroplasten [HAZEN & LEMELLE, 1990; CAVALHEIRO et al., 2004] oder zur Zelllyse

eingesetzt. Einige Autoren verwenden die Kombination Lyticase und DTT [PONTON & JONES,

1986] oder Lyticase mit β-Mercaptoethanol [BLASI et al., 1995]. Aufgrund der Empfindlichkeit

des zu isolierenden L-Arg-AMC-spaltenden Enzyms gegen die sonst erfolgreich zur

Zellwandlyse eingesetzten Substanzen wurde ein mehrstufiges Lyse-Verfahren auf alleiniger

Basis von Lyticase entwickelt (siehe Abschnitt 3.2.4). Die Konzentration der Lyticase von 15

bis 20 U/ml wurde bewusst niedrig gewählt, da höhere Konzentrationen zu verstärkter

Zelllyse des verwendeten C.-albicans-Stammes ATCC 2091 führten. Das enzymatische

Herauslösen des peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von C. albicans sollte eine

Proteinlösung gewährleisten, die nur einen geringen Anteil an intrazellulären Proteinen

beinhaltet. Durch das zur Zellwandlyse verwendete Proteingemisch Lyticase wurde

allerdings eine Beimischung von Fremdproteinen in Kauf genommen. Die mikroskopische

Verlaufskontrolle der Zellwandlyse zeigte die Unversehrtheit von etwa 90 % der Hefezellen

nach Lyticase-Behandlung. In den Vorversuchen wurde eine etwa 17fach höhere spezifische

Aktivität des Zellwandlysatepools als des Zellextraktes erreicht. Bei der Adaptation der

Lyticase-Behandlung auf die Gewinnung eines großen Volumens des Zellwandlysats zeigte

sich ein Absinken der spezifischen Aktivität auf das Niveau des durch Zellaufschluss

gewonnenen Zellextraktes. Während der Zellwandlyse für die in dieser Arbeit dargestellten

Präparation rupturierten mehr Hefezellen, was zu einer höheren Proteinkonzentration des

Zellwandlysats führte. Die Gewinnung eines großen Volumens an Zellwandlysat bedarf der

weiteren methodischen Verbesserung, da die Maßstabsveränderung bei biologischen

Materialen oft zu unerwarteten Problemen führt. In weiterführenden Versuchen konnte

gezeigt werden, dass die Enzymreinigung mit Zellextrakt als Ausgangsmaterial einen

geringeren Reinigungsgrad erreicht, vergleicht man die Reinheit nach Gelfiltration [KLINKE et

al., 2008].

Diskussion 86

5.2.3 Fünfstufige Reinigung des Zellwandlysats

Das von RODIER et al. 1999 vorgestellte dreistufige Reinigungsschema wurde als Grundlage

für die in dieser Arbeit vorgestellte Enzymreinigung übernommen. Um ein hochgradig

aufgereinigtes Enzym zu erhalten, war es erforderlich, die Reinigungsschritte nach dem

etablierten Schema „capture“, „intermediate purification“ und „polishing“ [JANSON, 1998] zu

ordnen. Mit drei Trennschritten auf zwei verschiedenen Ionenaustausch-Materialien konnte

ein Höchstmaß an Auftrennung nach elektrischen Ladungsunterschieden der Proteine erzielt

werden. Aufgrund einer verbleibenden Verunreinigung nach Gelfiltration wurde das Schema

um die Trennung nach hydrophoben Wechselwirkungen erweitert.

Durch die fünfstufige Reinigung des Zellwandlysats wurde ein Enzym mit einer Reinheit von

etwa 95 % erhalten (siehe Abbildung 4.8). Das RESOURCE TM ETH-Chromatogramm zeigte

einen großen Peak des Zellwandenzyms, der in der absteigenden Schulter einige

Fremdproteine enthält (Abbildung 4.7). Diese Verunreinigungen stellten sich im SDS-Gel als

wenige vernachlässigbare Banden dar (Abbildung 4.9). Die Fraktionen C15, D1 und D2

wiesen im SDS-Gel nahezu keine Verunreinigungen auf. In den nachfolgenden Fraktionen

stieg der Anteil an Verunreinigung an. Aufgrund des Überlappens des Zellwandenzyms mit

den Verunreinigungen wurde kein Aktivitätspool erstellt. Die Fraktionen kamen einzeln für die

Charakterisierung des Enzyms zum Einsatz. Die Summe der verunreinigungsarmen

Fraktionen C15, D1 und D2 ergab eine Ausbeute an totaler Aktivität von 4,7 %.

Nach Gelfiltration und auch nach Hydrophober-Wechselwirkungs-Chromatographie war ein

überdurchschnittlicher Verlust an totaler Enzymaktivität zu verzeichnen, was sich negativ auf

die Ausbeute auswirkte. Obwohl die Gesamtproteinmenge durch die letzten beiden

Reinigungsschritte deutlich verringert wurde, stieg die spezifische Enzymaktivität nur sehr

moderat. Möglicherweise wirkte sich der Verzicht auf NaCl in den Chromatographiepuffern

negativ auf die Enzymaktivität aus.

Anhand des Proteinmusters des Zellwandlysats im SDS-Gel wird offensichtlich, dass der

Anteil des zu reinigenden Enzyms am Gesamtprotein sehr gering war (Abbildung 4.8). Die

Priorität der Enzymreinigung wurde auf Reinheit des Zielproteins gelegt, um eine sichere

Proteinidentifizierung mittels Massenspektrometrie zu gewährleisten. Die erzielte Ausbeute

ist angesichts der aufwendigen Reinigung, die fünf Teilschritte beinhaltete, durchaus

zufrieden stellend.

Diskussion 87

5.3 Proteinidentifizierung und BLASTp-Suche

Die Korrelation der Peptidsequenzen mit der Protein-Datenbank NCBInr unter Verwendung

der Mascot-Software [PERKINS et al., 1999] identifizierte das hypothetische Protein

CaO19.12664 (GenBank RefSeq XM 705313, Candida albicans SC5314) mit einer Sequenz-

abdeckung von 63 % [KLINKE et al., 2008]. Die ermittelte Primärstruktur (siehe Abbildung

4.10) und die funktionelle Charakterisierung zeigten, dass es sich bei dem isolierten Enzym

um eine Metallo-Aminopeptidase handelt. Aufgrund der Orthologie zum APE2-Gen von

S. cerevisiae (siehe Abbildung 4.11) und der funktionellen Ähnlichkeit beider Enzyme erhält

die isolierte Metallo-Aminopeptidase den Namen C.-albicans-Aminopeptidase 2 (CaApe2).

Beachtet werden muss, dass das Protein aus dem C.-albicans-Stamm ATCC 2091 isoliert

wurde, von dem das Genom noch nicht bekannt ist. In weiteren Versuchen sollte untersucht

werden, ob das Protein auch aus C. albicans SC5314 isoliert werden kann und ähnliche

funktionelle Eigenschaften aufweist. EL MOUDNI und Mitarbeiter konnten die Hydrolyse von

L-Arg-AMC auch bei anderen Candida-albicans-Isolaten und weiteren Candida-Spezies

nachweisen [EL MOUDNI et al. 1995].

Die identifizierte Aminosäuresequenz beinhaltet von Position 393 bis 416 das

HEXXH(X)18E-Motiv, das als Zink-Bindungsstelle fungieren kann und die Zuordnung zur

Gruppe der Metallopeptidasen auf primärstruktureller Ebene ermöglicht. Die Sequenz

HEXXH ist in einem identifizierten Fragment des gereinigten Proteins enthalten. Die beiden

mit X gekennzeichneten variablen Stellen sind mit den ungeladenen Aminosäuren Alanin

und Leucin besetzt.

Das dem ORF CaO19.12664 entsprechende hypothetische CaApe2-Protein besteht aus 954

Aminosäuren und weist eine berechnete Molekularmasse von 107,4 kDa auf [KLINKE et al.,

2008]. Diese Molekularmasse ist signifikant größer als der anhand der elektrophoretischen

Mobilität des Enzyms in der SDS-PAGE ermittelte Wert von ca. 90 kDa. Trotz des

Vorhandenseins von Schnittstellen für Trypsin konnte den ersten 87 Aminosäuren des

vorausgesagten N-Terminus des hypothetischen CaApe2-Proteins keines der massen-

spektrometrisch identifizierten tryptischen Peptide zugeordnet werden (Abbildung 4.10). Über

die vorliegende Arbeit hinausgehende Untersuchungen lieferten Erkenntnisse zur Aufklärung

der Diskrepanzen. Eine Analyse der DNA-Region, die dem ORF CaO19.12664 vorgelagert

ist, legt eine 2-Exon-Struktur des CaAPE2-Gens nahe. Zusammengesetzt kodieren beide

Exons ein hypothetisches Präproprotein mit einem N-terminalen Signalpeptid, das auf eine

Sekretion des CaApe2-Enzyms hinweist. Exon 2 beginnt mit dem Codon für Serin-88 gemäß

ORF CaO19.12664. Diese Aminosäure stellt vermutlich den N-Terminus der katalytisch

aktiven Aminopeptidase dar. Die durch die Analyse der DNA-Sequenz der Protein-

primärstruktur des ORF CaO19.12664 bzw. des hypothetischen CaApe2-Proteins erhaltenen

Diskussion 88

Resultate werden durch die Ergebnisse der Proteinanalytik bestätigt. Das mittels Tandem-

Massenspektrometrie ermittelte N-terminale Peptid von CaApe2 beginnt mit Serin-88. Auch

mithilfe des Edman-Abbaus der nicht acetylierten Form des CaApe2-Proteins wurde Serin-88

als die N-terminale Aminosäure identifiziert [KLINKE et al., 2008]. Die korrespondierende

Molekularmasse von 97,607 kDa (Aminosäuren 88-954) stimmt in ausreichendem Maße mit

dem mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmten Wert von etwa 90 kDa

überein.

Hinweise auf die genetische Verwandtschaft dieses Proteins mit Proteinen anderer Spezies

konnten durch BLASTp-Suche [ALTSCHUL et al., 1997] erzielt werden. Die Suche ergab viele

Treffer mit Aminopeptidasen verschiedener Organismen. BLASTp-Suche erzielte in allen

verfügbaren Genomen der Gruppe der Saccharomycotina (z.B. Candida albicans, Candida

glabrata, Debaryomyces hansenii, Eremothecium gossypii, Kluyveromyces lactis,

Saccharomyces cerevisiae und Yarrowia lipolytica) einen Treffer mit signifikanter

Sequenzähnlichkeit pro Spezies. Entsprechend dem NCBI-Datenbank-Eintrag EAK91143, ist

das CaO19.5197 kodierende Gen als APE2 klassifiziert [KLINKE et al., 2008]. Dies deutet

darauf hin, dass das Candida-albicans-Gen mit dem ORF CaO19.5197 das orthologe Gen

zum S. cerevisiae-APE2-Gen (Synonym: Leucin-Aminopeptidase 1, LAP1) darstellt. Die

wahre Situation ist aber komplexer. Das CaO19.5197-Protein zeigt 54 % Übereinstimmung

mit dem Ape2-Protein von S. cerevisiae, besitzt aber eine ebenso hohe Übereinstimmung

mit einer als Aap1 bezeichneten Aminopeptidase von S. cerevisiae [KLINKE et al., 2008]. Auf

der anderen Seite ergibt die separate BLASTp-Suche mit jedem einzelnen der beiden

Aminopeptidasen von S. cerevisiae gegen das gesamte Candida-albicans-Proteom ein und

denselben Treffer: das CaO19.5197-Protein. Deshalb ist anzunehmen, dass das

phylogenetische Vorläuferprotein von CaO19.5197 in S. cerevisiae dupliziert [WOLFE &

SHIELDS, 1997; SEOIGHE & WOLFE, 1999] und beide einzelnen Kopien subfunktionalisiert

wurden [KLINKE et al., 2008]. ScApe2 spaltet spezifisch N-terminales Leucin [HIRSCH et al.,

1988], während die Alanin/Arginin-spezifische Aminopeptidase ScAap1 L-Leu-AMC nicht

akzeptiert [CAPRIOGLIO et al., 1993]. Die Beobachtung, dass CaApe2 fähig zur Spaltung von

L-Ala-, L-Arg- und L-Leu-AMC ist, stützt diese Hypothese. Weil das Genom von C. albicans

vermutlich keine Duplikation erfuhr [LANGKJAER et al., 2003], kombiniert CaApe2 die unter-

schiedlichen Aktivitäten der beiden Aminopeptidasen von S. cerevisiae [KLINKE et al., 2008].

In Proteomen von Aspergillus spp. wurden auch Sequenzen gefunden, die eine hohe

Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz der isolierten Aminopeptidase aufweisen.

Eine Lysin-Aminopeptidase (AspA) aus Aspergillus niger wurde von BASTEN et al. [2001]

überexprimiert und charakterisiert. Sie wurde in die Gruppe der Metallopeptidasen

eingeordnet und zeigt Aktivität gegen Arg-, Met- und Ala-p-Nitroanilid. Sie weist außerdem

Diskussion 89

hohe Aminosäuresequenzähnlichkeiten mit dem LAP1-Protein von S. cerevisiae auf [BASTEN

et al., 2001]. Diese Publikation weist nach, dass auch Schimmelpilze ähnliche

Aminopeptidasen ausbilden.

5.4 Diskussion der Eigenschaften der Metallo-Aminopeptidase

Im Folgenden sollen die grundlegenden Eigenschaften der identifizierten

Arginin/Alanin/Leucin-spaltenden Metallo-Aminopeptidase diskutiert werden.

5.4.1 pH-Optimum der Enzymaktivität

Die Bestimmung der Enzymaktivität über den pH-Bereich von 3 bis 11 wurde in drei

verschiedenen Puffersystemen durchgeführt. CaApe2 hydrolysierte L-Arg-AMC in einem

pH-Intervall von 6 bis 9 mit einem pH-Optimum von 7,2 (Abbildung 4.12). Die Enzymaktivität

bei dem physiologischen pH-Wert von 7,4 betrug 97 %, während das Enzym bei pH 4,0

nahezu keine Aktivität zeigte. Die maximale Aktivität bei neutralem pH-Wert deutet auf eine

Funktion in Umgebungen mit physiologischem pH-Wert hin. Bei Absenkung des pH-Wertes

durch Säureproduktion von Candida albicans, die bei In-vitro-Kultur auftritt, liegt das

sezernierte Enzym inaktiv vor. Die Funktion der Aminopeptidase wird in Abschnitt 5.5.3

diskutiert.

Kritisch anzumerken ist, dass der pH-Bereich des TRIS/HCl-Puffer deutlich ins saure Milieu

bis pH 5,9 ausgedehnt wurde. Üblicherweise wird TRIS/HCl-Puffer in einem Pufferbereich

von 7,2 bis 9,0 verwendet. Es wurde versucht, den pH-Bereich von 6 bis 7 durch

Inositol/HCl-Puffer abzudecken. Allerdings kam es durch Inositol zu einer nahezu

vollständigen Enzyminhibition (Daten nicht gezeigt). Das weitere Absenken des pH-Wertes

des TRIS/HCl-Puffers und der damit verbundenen geringeren Pufferkapazität führte zu

keiner Veränderung der pH-Kurve. Die Hydrolyse von L-Arg-AMC weist eine neutrale

Protonenbilanz auf.

5.4.2 Substratspezifität und Enzymkinetik

Die gereinigte Aminopeptidase zeigte Exopeptidase-Aktivität gegenüber den synthetischen

Peptiden L-Ala-AMC, L-Arg-AMC und L-Leu-AMC. L-Ala-AMC wurde mit einer höheren

maximalen Reaktionsgeschwindigkeit gespalten als L-Arg-AMC (Tabelle 4.3). Der KM-Wert

für L-Ala-AMC lag signifikant über dem für L-Arg-AMC. Die Affinität des Enzyms zu

L-Arg-AMC war deshalb deutlich größer als zu L-Ala-AMC.

Diskussion 90

Der hemmende Einfluss des Substratlösungsmittels DMSO auf die Enzymaktivität zeigte sich

in einer biphasischen Enzymkinetik für L-Ala-AMC und L-Arg-AMC. Durch rechnerische

Elimination des DMSO-Effektes mittels Verallgemeinerung der Gleichung für eine

nichtkompetitive Hemmung wurden typische Verläufe einer Michaelis-Menten-Kinetik

ermittelt. Mit steigenden Substratkonzentrationen erreichte auch die DMSO-Konzentration im

Reaktionsansatz hohe Werte von bis zu 25 % (bei 1000 µM L-Ala-AMC). Diese hohe

DMSO-Konzentration resultierte aus dem Lösen des hydrophoben Substratpulvers nach

Herstellerangaben. Gleichung (1) im Abschnitt 3.2.11 beschreibt eine kooperative Hemmung

des Enzyms durch den Inhibitor und geht von der mechanistischen Vorstellung aus, dass für

die nichtkompetitive Hemmung des Enzyms DMSO-Komplexe verantwortlich sein könnten.

Hinweise auf eine Substrathemmung gab es in der vorliegenden Arbeit nicht. In weiter-

führenden Versuchen wurden konzentriertere Substratstammlösungen hergestellt, die den

Einfluss von DMSO im Reaktionsansatz in den Hintergrund treten ließen [KLINKE et al., 2008].

Die Abnahme der Aktivität der Aminopeptidase bei einer Konzentration von 300 µM im

Vergleich zu 100 µM L-Leu-AMC ist vermutlich auf eine Hemmung durch das Substrat-

lösungsmittel Methanol zurückzuführen (Abbildung 4.15), was sich aus den Methanol-

Kontrollproben ableiten ließ (Daten nicht gezeigt). Eine Substrathemmung könnte für

L-Leu-AMC ebenfalls vorliegen.

Es wurde keine Endopeptidase-Aktivität für CaApe2 gefunden. Die Tests auf Hydrolyse von

Albumin, Typ-I-Kollagen und Typ-IV-Kollagen waren negativ. Im Abschnitt 5.5.3 wird

ausführlich auf die möglichen Funktionen von CaApe2 eingegangen.

5.4.3 Inhibitionsprofil

Das gereinigte Zellwandenzym wurde von den Proteinaseinhibitoren Phenanthrolin und

EDTA wirkungsvoll gehemmt. Weiterführende Versuche ermittelten eine fast vollständige

Hemmung für den Aminopeptidaseinhibitor Bestatin in mikromolaren Konzentrationen

[KLINKE et al., 2008]. Zusammengenommen lassen die Inhibitionsergebnisse auf eine Zuge-

hörigkeit von CaApe2 zur Untergruppe der Metallo-Aminopeptidasen schließen, in die auch

die orthologen Aminopeptidasen ScAap1 und ScApe1 eingeordnet werden. Metallo-Amino-

peptidasen sind der Familie M1 der MEROPS-Datenbank zugeordnet [BARRETT et al., 2004].

Das Zinkion zählt zu den Schwermetallionen und hemmte die Enzymaktivität des gereinigten

Zellwandenzyms bei einer Konzentration von 1 mM vollständig. Möglicherweise kann die

hemmende Wirkung auf die metallkatalysierte Oxidation der freien SH-Gruppen sowie auf

die Bildung von stabilen Komplexen mit der Beteiligung von SH-Gruppen zurückgeführt

werden [JOCELYN 1972].

Diskussion 91

5.4.4 Temperaturoptimum

Das gereinigte Zellwandenzym zeigte die maximale Aktivität bei einer Temperatur von 30 °C

(Abbildung 4.19). Damit liegt das Temperaturoptimum von CaApe2 in der Nähe der

optimalen Kulturtemperatur für die Sprosszellform. Im Temperaturbereich von 25 bis 30 °C

zeigt C. albicans die kürzeste Verdopplungszeit [BUFFO et al., 1984]. Die einzelnen Enzyme

von C. albicans haben verschiedene Temperaturoptima. Der Bereich der Temperaturoptima

der Enzymaktivitäten von Candida albicans erstreckt sich von 28 °C bei Adenosin-

Monophosphat-Deaminase, über 40 °C bei N-Acetyltransferase, 45 °C bei Chitinase und bis

zu 55 °C bei Phosphatidylinositol-Synthase.

5.5 Bedeutung der Metallo-Aminopeptidase

CaApe2 wurde als neutrale Arginin/Alanin/Leucin-spaltende Metallo-Aminopeptidase

identifiziert. Im Folgenden wird die Rolle der Aminopeptidase im Zusammenhang mit ihrer

Lokalisation und ihren Eigenschaften diskutiert; im Speziellen wird auf eine mögliche

humanpathogene Bedeutung eingegangen.

5.5.1 Wirkungsort und Aktivitätszustand der Metallo-Aminopeptidase

Eine L-Arg-AMC-Hydrolyse durch Kulturüberstand konnte in der vorliegenden Arbeit nicht

nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Dagegen zeigte Zellextrakt und Zellwandlysat

eine hohe L-Arg-AMC-Aktivität. Die Versuche zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand ließen

die Vermutung zu, dass das gesuchte Enzym in der Zellwand lokalisiert ist. Dies steht nicht

in Widerspruch zum Nachweis der Aminopeptidase in Zellextrakt. Es kann davon

ausgegangen werden, dass durch die Gewinnung des Zellaufschlusses mittels Mini-

Beadbeater™ eine ausreichende Enzymfreisetzung aus der Zellwand stattfindet.

Zellaufschluss und Zellextrakt (zentrifugierter und sterilfiltrierter Zellaufschluss) enthalten

somit neben intrazellulären Proteinen auch Zellwandproteine. Die Analyse der DNA-Sequenz

ermittelte eine dem ORF CaO19.5197 vorgelagerte Signalpeptidsequenz, die auf eine

Sekretion und damit verbundene extrazelluläre Funktion von CaApe2 hinweist [KLINKE et al.,

2008]. In der Literatur wurde das Vorkommen einer L-Arg-AMC-Aktivität von C. albicans in

konzentriertem Kulturüberstand beschrieben [IMBERT et al., 2006]. In dieser Veröffentlichung

wurde allerdings die von RODIER et al. [1999] angegebene Messvorschrift abgeändert.

Besiedelt C. albicans Wirtsregionen mit physiologischem pH-Wert, könnte CaApe2 ihre

Aktivität im Extrazellularraum, zu dem die Zellwand hinzugezählt werden kann, entfalten.

Besonders hohe L-Arg-AMC-Aktivität konnte bei Zellen aus YCB-RSA-Kultur gemessen

werden. Im Kulturmedium selbst herrscht durch die Freisetzung von Säuren durch

Diskussion 92

Candida albicans ein saures Milieu, in diesem liegt das Enzym inaktiv vor. Es bleibt nun zu

diskutieren, wie das Enzym dennoch wirksam werden könnte. Sollte das Enzym in der

Zellwand und insbesondere im Perizellularraum nahe der Zellwand lokalisiert sein, muss dort

ein neutraler pH-Wert vorherrschen, damit das Enzym arbeiten kann. Es existieren keine

Untersuchungen über den pH des Perizellularraums. Vorstellbar ist ein Schutzsystem der

Candida-albicans-Zelle ähnlich Helicobacter pylori, das ein Überleben in einer sauren

Umgebung möglich macht. Zentrale Bedeutung in der Säureresistenz von H. pylori hat das

Urease-System, das hauptsächlich für die Aufrechterhaltung des zytoplasmatischen und

perizellulären neutralen Milieus verantwortlich ist [PFLOCK et al., 2006]. Zusätzlich verfügt

dieses Pathogen über ein Amidase-System, das an Bedeutung gewinnt, wenn Harnstoff

kaum verfügbar ist. Einige andere Mikroorganismen verfügen über Mechanismen, die eine

Adaptation an saures Milieu ermöglichen, dazu zählen Yersinia enterocolitica, Vibrio cholera,

Escherichia coli und Salmonella typhimurium [VALENZUELA et al., 2003]. Bei C. albicans wird

seit mehr als 20 Jahren der transmembranöse Protonentransport untersucht. Beschrieben

wurde ein Na+/H+-Antiporter, der an der Regulation des intrazellulären pH-Wertes beteiligt

sein soll [SOONG et al., 2000]. Bei der zellulären Aufnahme von Kohlenhydraten, wie z.B.

Glukose, kommt es zur Protonenfreisetzung durch die Plasmamembran-ATPase [MONK et

al., 1993]. Für Candida utilis konnte ein stöchiometrisches Verhältnis bei Protonen zu

Zuckermolekülen von 1:1 ermittelt werden [VAN DEN BROEK et al., 1997]. Speziellere

Säuretoleranz-Mechanismen wurden noch nicht beschrieben.

5.5.2 Kollagenolytische Wirksamkeit der Metallo-Aminopeptidase

Die Anpassung des Reinigungsschemas einer zytosolischen 95-kDa-Metallopeptidase von

Candida albicans aus Zellaufschluss [RODIER et al., 1999] auf die Isolation der Peptidase aus

Zellwandlysat führte zur Reinigung eines Enzyms, das funktionell charakterisiert und als

neutrale Ala/Arg/Leu-spaltende-Aminopeptidase (CaApe2) identifiziert wurde. Diese

Einordnung erfolgte auf Basis der identifizierten Primärstruktur und der funktionellen

Eigenschaften. CaApe2 zeigte im Gegensatz zur Metallopeptidase der französischen

Arbeitsgruppe keine kollagenolytische Aktivität.

Es ist zu diskutieren, ob die Zellwandlyse oder das verwendete Reinigungsschema zu dem

Verlust der kollagenolytischen Aktivität des Enzyms geführt haben könnte. Die zur

Zellwandlyse eingesetzte Lyticase besteht nach Herstellerangaben aus einem Gemisch von

Proteinen des Bakteriums Arthrobacter luteus. Die Literatur beschreibt eine in der Lyticase

enthaltene alkalische Proteinase, die die Wirkung der β-1,3-Glukanase ermöglicht [SCOTT &

SCHEKMAN, 1980]. In weiterführenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass CaApe2 auch

aus Zellextrakt unter Anwendung der für Zellwandlysat angegebenen Reinigungsprozedur

Diskussion 93

gewonnen werden kann. Die aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien gewonnenen

Enzyme zeigten sich in der Proteinanalytik identisch [KLINKE et al., 2008]. Somit erscheint

eine Veränderung der Proteinstruktur während der Zellwandlyse mit Lyticase

unwahrscheinlich.

Während der Enzymreinigung kann es theoretisch zu einem Verlust der

Endopeptidase-Aktivität von CaApe2 kommen. Durch Abspaltung eines Proteinbestandteils

könnte die Molekülstruktur und damit auch Substratbindungsdomänen oder aktive Zentren

modifiziert worden sein. Die Reinigung kann zur Abtrennung eines Co-Substrates führen,

das für die Endopeptidase-Aktivität unbedingt erforderlich ist. Durch die Modifizierung einer

funktionellen Gruppe des Enzyms könnte das aktive Zentrum ebenfalls in seiner

Bindungsfähigkeit von Substraten beeinträchtigt worden sein. Im Zuge der Alterungs-

prozesse der Moleküle kommt es zu verschiedensten Modifikationen an Proteinen, die zu

einer Inaktivität oder einer veränderten Enzymaktivität führen können. Um zu prüfen, ob die

Kollagenase-Aktivität bei der Enzymreinigung verloren ging, wurde Zellaufschluss in den

Kollagenabbau-Test einbezogen. Auch frisch gewonnener Zellaufschluss zeigte keine

kollagenolytische Wirksamkeit bei einem pH-Wert von 7,4. Dabei wurde nativer

Zellaufschluss, gewonnen aus Zellsuspension mit einer Zelldichte von 0,5 g/ml, in direkten

Kontakt mit säureunlöslichem Kollagen gebracht und über einen langen Zeitraum inkubiert,

siehe Abschnitt 3.2.13. Eine Positivkontrolle zeigte an, dass der Test an sich funktionierte.

Wurde dem Aufschluss Kollagenase A zugesetzt, konnte eine deutliche Kollagenspaltung

beobachtet werden (Abbildung 4.21).

Das hier isolierte Enzym wurde als neutrale Metallo-Aminopeptidase identifiziert. Eine

Endopeptidase-Akivität einer Aminopeptidase ist ungewöhnlich, wurde aber für Kathepsin K

nachgewiesen [Garnero et al., 1998].

Die Reinigung von CaApe2 aus Zellwandlysat wurde initial an die von RODIER et al. [1999]

verwendeten Methoden angelehnt. Die französische Arbeitsgruppe isolierte eine 95-kDa-

Metallopeptidase aus Zellextrakt desselben Candida-albicans-Stammes. Ein Vergleich von

CaApe2 mit der 95-kDa-Metallopeptidase ist aufgrund spärlicher Datenlage von Seiten der

französischen Arbeitsgruppe schwer durchführbar. So können nur die offensichtlichen

Unterschiede hinsichtlich der fehlenden Kollagendegradation und des Mangels an

experimentellen Beweisen für eine limitierte Proteolyse von CaApe2 betont werden. Eine

52-kDa-Form von CaApe2 war weder bei den zahlreichen Chromatographieläufen noch auf

einem SDS-Gel nachweisbar. Weiterhin spricht für die Vermutung der Verschiedenheit

beider Enzyme, dass das Genom von Candida albicans noch eine dritte hypothetische

Metallopeptidase codiert, die eine zu den beiden jetzt bekannten Enzymen ähnliche

Molekularmasse zeigt [KLINKE et al., 2008]. Die Untersuchungen der Arbeitsgruppe um

RODIER werden im Abschnitt 5.6 genauer dargestellt. Die angeführten Ergebnisse sprechen

Diskussion 94

dafür, dass die Metallopeptidase der französischen Arbeitsgruppe und CaApe2 vermutlich

verschiedene Enzyme sind.

5.5.3 Funktionen der Metallo-Aminopeptidase

Die Exopeptidase-Aktivität von CaApe2 bewirkt die Spaltung von synthetischen Substraten

mit N-terminaler Aminosäure. Es ist anzunehmen, dass die Aminopeptidase in vivo

spezifisch endständige Aminosäuren von Proteinen oder Peptiden abspaltet und damit zum

Abbau von ganzen Proteinen oder Proteinfragmenten beiträgt. Der Abbau von Proteinen ist

notwendig für die Beseitigung von schadhaften Proteinmolekülen, für die Regulierung von

Protein- und Enzymkonzentrationen in einem bestimmten Kompartiment und den Erhalt

eines Aminosäurepools. Die durch CaApe2 freigesetzten Aminosäuren können der

Hefepilzzelle zur Synthese neuer Proteine oder zur Energiegewinnung dienen. Es liegen

wenige Erkenntnisse über die Funktionen der Aminopeptidasen Ape2 und Aap1 von

S. cerevisiae vor. Ein Zusammenhang zwischen dem AAP1-Gen und dem Glykogen-

Haushalt der Hefezelle wurde beschrieben [CAPRIOGLIO et al., 1993]. Die Inaktivierung des

AAP1-Gens bewirkte eine Abnahme der Glykogen-Speicherung der Zelle, während die

Überexpression des AAP1-Gens zu einer erheblichen Zunahme der Glykogen-Akkumulation

führte. Möglicherweise besitzt CaApe2 auch eine regulatorische Funktion.

Neben einer das Wachstum und die Vermehrung des Hefepilzes unterstützenden Funktion

ist auch eine humanpathogene Wirkung nicht auszuschließen. Vorstellbar ist, dass es durch

die Abspaltung N-terminaler Arginin-, Alanin- oder Leucinreste von humanen Proteinen zu

Strukturveränderungen kommt und Antikörper oder andere Abwehrfaktoren funktionsunfähig

gemacht werden. Im Zusammenspiel mit anderen Proteinasen könnte CaApe2 zum Abbau

von humanen Proteinen wie Extrazellularsubstanz beitragen. Auch an eine Beteiligung bei

der Aktivierung von Proenzymen durch Abspaltung von Peptiden muss gedacht werden.

Inaktive körpereigene Matrix-Metalloproteinasen, die konstitutionell im Dentin vorkommen,

werden möglicherweise durch bakterielle Proteinasen aktiviert [CHAUSSAIN-MILLER et al.,

2006]. Ob CaApe2 eine aktivierende Wirkung auf MMPs ausübt, sollte in weiteren Versuchen

geklärt werden.

Das Vorkommen von zum identifizierten Aminopeptidase-Gen ähnlichen Gensequenzen bei

allen Saccharomycotina mit aufgeklärtem Genom deutet auf die Expression einer ähnlichen

Aminopeptidase in dieser Gruppe hin. Die Funktion der Aminopeptidase in vivo, die

möglicherweise essentiell für die Pilzzelle ist, sollte mit APE2-defizitären Candida-albicans-

Mutanten untersucht werden.

Diskussion 95

5.6 Kollagenolyse durch Candida albicans im neutralen Milieu

Im Folgenden soll die Expression von Kollagenasen durch C. albicans diskutiert werden. Der

Nachweis eines neutralen kollagenolytischen Enzyms von C. albicans wäre von enormer

Bedeutung für die Aufklärung der Virulenz des Keimes. Die Gewebeinvasion durch

Candida-Zellen wäre nachvollziehbar. Auch bei der Entstehung der Dentinkaries könnte eine

neutrale kollagenolytische Aktivität von C. albicans beteiligt sein.

Proteolyse und Kollagenolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans

Wurde Kollagen in Kulturüberstand bei neutralem pH-Wert inkubiert, konnte ein geringer

Kollagenabbau nachgewiesen werden (Abschnitt 4.4.2). Diese geringe Aktivität ist vermutlich

auf die Wirkung von Sap2 bei neutralem pH-Wert zurückzuführen [WAGNER et al., 1995;

SCHALLER et al., 2005]. Da die höchste Aktivität der im Kulturüberstand enthaltenen

Aspartylproteinasen im sauren pH-Bereich liegt, werden die Saps in Abschnitt 5.7 diskutiert.

Kollagenasen sind definiert als Enzyme, die tripelhelikale Domänen von Kollagen bei

physiologischem pH-Wert und Körpertemperatur spalten können [HARPER, 1980;

HARRINGTON, 1996]. Nach dieser Definition handelt es sich bei Enzymen wie z.B. den Saps,

die im sauren Milieu kollagenolytisch wirken, nicht um echte Kollagenasen.

Frisch hergestellter Zellaufschluss und auch Zellextrakt zeigten keinerlei neutrale

kollagenolytische Aktivität (Abbildung 4.21). Dies spricht dafür, dass die im Kulturüberstand

nachgewiesene Aktivität von sezernierten Proteinasen stammt. Die proteolytische Aktivität

der intrazellulären Saps bei neutralem pH, die überwiegend in sekretorischen Vesikeln

lokalisiert sind [NAGLIK et al., 2003], lag somit unterhalb der Nachweisgrenze.

Es existieren nur sehr wenige Arbeiten, die sich mit proteolytischen Enzymen von

C. albicans, wirksam in neutraler Umgebung, beschäftigen. PORTILLO und GANCEDO

untersuchten 1986 Zellaufschluss auf proteolytische Aktivität und fanden die im

Abschnitt 1.4.5 beschriebene Aspartylproteinase mit saurem pH-Optimum. Die französische

Arbeitsgruppe um RODIER beschreibt in mehreren Arbeiten das Vorkommen intrazellulärer

Peptidaseaktivitäten. In einer 1994 veröffentlichten Arbeit wurden mehrere gelatinolytische

Serinproteinase-Aktivitäten durch Zymographie mit gelatinehaltigen Gelen gefunden. Ein

Jahr später isolierte diese Arbeitsgruppe eine 52-kDa-Metallopeptidase aus Zellextrakt, die

zur Katalyse des synthetischen Substrates L-Arg-AMC fähig war, aber keine gelatinolytische

Aktivität zeigte. In einem 1997 erschienenen Artikel wies diese Arbeitsgruppe die

Lokalisation der Metallopeptidase durch indirekte Immunofluoreszenz und Immun-

Elektronenmikroskopie in der Zellwand nach [EL MOUDNI et al., 1997]. Aufgrund einer

Diskussion 96

Kreuzreaktion des polyklonalen Antikörpers mit einem 95-kDa-Protein schlussfolgerte

El Moudni, dass die 52-kDa-Metallopeptidase ein Fragment des größeren Proteins ist.

Mithilfe der SDS-PAA-Gelelektrophorese zeigten RODIER et al. [1999} eine neutrale

kollagenolytische Aktivität der 95-kDa-Metallopeptidase. Bisher liegen keine weiteren

Erkenntnisse zu Enzymen von Candida albicans, die im neutralen Milieu kollagenolytisch

wirken, vor.

5.7 Kollagenolyse durch Candida albicans im sauren Milieu

Kollagenolytisch wirksame Enzyme können entweder in den Extrazellularraum sezerniert

werden oder zellassoziiert vorliegen. Um beide Enzymlokalisationen in die Versuche

einzuschließen, wurde zum einen Kulturflüssigkeit und zum anderen Zellaufschluss und

Zellextrakt eingesetzt.

5.7.1 Kollagenolytische Aktivität des Kulturüberstandes

In der vorliegenden Arbeit konnte die Hydrolyse von Albumin für den zellfreien Überstand der

YCB-RSA-Kultur im sauren Milieu nachgewiesen werden. Weiterhin wurde Kulturüberstand

bei den Kollagenabbau-Tests eingesetzt (Abschnitte 3.2.13 und 4.4.2). Säureunlösliches

Kollagen und demineralisiertes Dentin wurden direkt mit Kulturüberstand über einen langen

Zeitraum inkubiert. Es zeigte sich eine deutliche Hydrolyse von Typ-I-Kollagen und von

humanem Dentinkollagen in saurem Milieu. Die Kulturüberstände des klinischen Isolates von

Candida albicans aus kariöser Dentinläsion und des Referenzstammes Candida albicans

ATCC 2091 prägten einen Kollagenabbau in vergleichbarer Höhe aus. Die Hydrolyse von

säureunlöslichem Kollagen und demineralisiertem humanen Dentin wurde auch für

kommerziell gereinigte Sap2 gezeigt, die als Positivkontrolle eingesetzt wurde.

Die nachgewiesene kollagenolytische Proteinaseaktivität des Kulturüberstands bei saurem

pH-Wert ist mit hoher Wahrscheinlichkeit auf sezernierte Aspartylproteinasen (Saps)

zurückzuführen, die in den Extrazellularraum sezerniert werden. Die Expression der Saps ist

essentiell für das Wachstum des Hefepilzes Candida albicans, wenn Protein die einzige

Stickstoffquelle darstellt [HUBE et al., 1994]. Auf andere kollagenolytische Proteinasen finden

sich in der Literatur keine Hinweise. Die Saps stellen einen wichtigen Virulenzfaktor von

C. albicans dar und wurden in der Literatur umfangreich charakterisiert [NAGLIK et al., 2003].

Saps werden in der deutschsprachigen Literatur auch als saure Aspartylproteinasen

bezeichnet, weil sie vorwiegend im unteren pH-Bereich wirken.

Diskussion 97

Es bleibt zu klären, welche von Candida albicans sezernierte Aspartylproteinase im Kultur-

überstand die Hydrolyse der eingesetzten Kollagene verursacht hat. Die Hypothese, dass

Sap2 die wesentliche proteolytische Aktivität im Kulturüberstand repräsentiert, wird gestützt

durch den Fakt, dass in vitro am häufigsten Sap2 exprimiert wird [HUBE et al., 1994;

SCHALLER et al., 2005]. Der Abbau von Typ-I-Kollagen durch Sap2 im sauren Milieu wurde

zuvor beschrieben von RAY und PAYNE [1990] und HUBE [1996]. Die eigenen Versuche mit

kommerziell gereinigtem Sap2 (Abschnitte 4.4.2 und 4.4.3) bestätigen diese Beobachtung.

Die zuvor aufgestellte Hypothese wird durch Ergebnisse des Einsatzes eines kommerziellen

Sap2-Antikörpers gestützt. Im Kulturüberstand konnte Sap2 durch immunohistochemische

Färbung mit einem monoklonalen Sap2-Antikörper nachgewiesen werden. Abbildung 5.1

zeigt gewaschene eosingefärbte Zellen des Stammes C. albicans ATCC 2091, die mit einem

monoklonalen Antikörper gegen Sap2 inkubiert wurden. Die Zellen links stammen aus

YCB-RSA-Kultur (Mangelmedium zur Sap-Expression), die Zellen rechts wurden in

YPD-Medium (Vollmedium) kultiviert, das nicht zur Bildung von Sap2 führt.

Abbildung 5.1: Candida albicans ATCC 2091 mit monoklonalem Antikörper gegen Sap2 Eosinfärbung links: YCB-RSA-Kultur Sap2-Antikörper erkennbar an dunkelblauem Saum um die Zellen rechts: YPD-Kultur (Präparate freundlichst überlassen von Dr. Klinke)

Das Substratspektrum der anderen Saps ist noch nicht ausreichend charakterisiert.

Möglicherweise sind weitere Sap-Isoenzyme zur Kollagenolyse im sauren Milieu fähig.

Bislang ist keine kollagenolytische Aktivität der anderen Saps bekannt.

KAMINISHI und Mitarbeiter zeigten 1986 den Abbau von demineralisiertem Dentin im sauren

Milieu durch ein sezerniertes Enzym, das nach langer Inkubation von Candida albicans mit

Diskussion 98

Dentinpulver aus dem Kulturüberstand gewonnen wurde. Zum Nachweis der Hydrolyse von

säurelöslichem Kollagen und humanem Dentinkollagen diente die Hydroxyprolin-

Bestimmung. Diese Arbeitsgruppe belegte die Degradation von Dentinkollagen mit

elektronenmikroskopischen Aufnahmen in einer weiteren Publikation [HAGIHARA et al., 1988].

Nach dem heutigen Kenntnisstand über die Familie der sezernierten Aspartylproteinasen von

Candida albicans kann nur vermutet werden, dass KAMINISHI und Mitarbeiter [1986] entweder

Sap2 oder ein anderes Enzym der Sap-Familie beschrieben haben. Das von KAMINISHI et al.

angegebene pH-Optimum von 3,5 bis 4,0 entspricht nicht ganz dem für Sap2 ermittelten von

3,2 bis 3,5. In der Literatur differieren die Angaben zum Molekulargewicht für Sap2 von 40

bis 49 kDa [NAGLIK et al., 2003], die von KAMINISHI et al. beschriebene Proteinase besitzt ein

Molekulargewicht von 46 kDa. Beide Proteine weisen ihren isoelektrischen Punkt bei einem

pH-Wert von 4,2 auf. Diese Arbeitsgruppe zeigte auch den Abbau von bovinem Kollagen

durch ein Enzym, das aus dem Überstand einer Candida-albicans-Kultur mit 2 %

Rinderachillessehnenkollagen gewonnen wurde [KAMINISHI et al., 1988]. Diese Proteinase

wurde nicht weiter charakterisiert und es bleibt offen, ob es sich um dasselbe Enzym handelt

wie in den Arbeiten mit Dentinkollagen. Unbeleuchtet blieben auch das Substratspektrum der

Aspartylproteinase und die Frage, ob die Bildung des Enzyms auch durch RSA als alleinige

Stickstoffquelle im Kulturmedium induziert wird.

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Degradation von humanem Dentinkollagen

durch Überstand aus YCB-RSA-Kultur von Candida albicans sowie durch gereinigte Sap2

(Fa. TaKaRa) gezeigt. Außerdem wurde unlösliches Typ-I-Kollagen aus der Rinder-

achillessehne durch Kulturüberstand und Sap2 gespalten, siehe auch KLINKE et al., [2007].

Die hydrolytische Aktivität im Kulturüberstand war sowohl bei Candida albicans, isoliert aus

kariöser Dentinläsion, als auch bei dem Referenzstamm Candida albicans ATCC 2091

nachweisbar. Die vorliegende Arbeit liefert somit einen Beitrag zur Aufklärung des

Substratspektrums von Sap2.

5.7.2 Kollagenolytische Aktivität des Zellaufschlusses

Wurde Zellaufschluss mit Kollagen bei saurem pH inkubiert, konnte ebenfalls eine deutliche

Kollagendegradation gemessen werden. Allerdings betrug die Kollagenhydrolyse durch

Zellaufschluss etwa 50 % der von Kulturüberstand. Das deutet auf eine deutlich geringere

zellassoziierte kollagenolytische Aktivität hin. Es kann geschlussfolgert werden, dass diese

kollagenolytische Wirkung wahrscheinlich von zytoplasmatischen Saps, die intrazellulär

bereits aktiv vorliegen, und von perizellulären Saps der Zellwand verursacht wurde. Die

zytoplasmatischen Saps wurden von HOMMA et al. [1992] beschrieben. Sie sind Vorstufen

Diskussion 99

der sezernierten Form. Die Saps erhalten im Golgi-Apparat durch die Abspaltung eines

Propeptids ihre reife und aktive Form und werden anschließend in Vesikeln zur Zellmembran

transportiert [NAGLIK et al., 2003]. PORTILLO und GANCEDO fanden 1986 bei der Unter-

suchung von Zellaufschluss eine Aspartylproteinase mit einem pH-Optimum von etwa 5. Da

damals noch nicht die Vielfalt der Saps bekannt war, kann die 1986 gefundene

proteolytische Aktivität heute als intrazelluläre Form einer Sap gedeutet werden. Die

Arbeitsgruppe um PORTILLO untersuchte nicht, ob die gefundene Aktivität auch im

Kulturüberstand nachweisbar war. Nichtsezernierte Enzyme mit kollagenolytischer Aktivität

wurden bei Candida albicans bisher nicht gefunden.

5.7.3 Hypothetische Rolle der sezernierten Aspartylproteinasen in der Dentinkariogenese Im Folgenden soll diskutiert werden, ob die gezeigte sezernierte proteolytische Aktivität von

Candida albicans eine Funktion in der Pathogenese der Dentinkaries ausübt. Zunächst muss

geklärt werden, ob C. albicans in der Nähe des Substrates Dentin nachgewiesen werden

kann.

Zahlreiche Arbeiten, die sich mit der Plaqueflora beschäftigen, zeigen ein gemeinsames

Auftreten von Candida albicans mit anderen Plaquemikroorganismen. In mehreren Studien

konnte C. albicans aus Kavitäten kariöser Zähne isoliert werden [ROSENSTENGEL et al., 1978;

JACOB et al., 1998]. Die Fähigkeit von C. albicans, Dentintubuli zu besiedeln, konnte in vivo

[JACOB et al., 1998] und in vitro [KLINKE & KLIMM, 2003; Sen et al., 1997] gezeigt werden.

Für die Entstehung von Dentinläsionen ist zunächst die Demineralisation des Dentins

erforderlich, die zur Exposition des Dentinkollagengeflechts führt und durch die säure-

bildenden Plaquemikroorganismen herbeigeführt wird [ARENDS et al., 1989; VAN-STRIJP et

al., 1997]. Auch Candida albicans kann den pH-Wert des umgebenden Milieus durch eine

H+-ATPase der Zellmembran und die Sekretion zahlreicher organischer Säuren erheblich

absenken [MONK et al., 1993; SAMARANAYAKE, 1983 und 1986; KLINKE et al., 2006].

Während die Demineralisation von Zahnhartsubstanz schon recht ausführlich untersucht

wurde, ist bisher nicht geklärt, welche Enzyme die Zerstörung der organischen Dentinmatrix

verursachen. Diskutiert werden mikrobielle Enzyme und auch körpereigene Matrix-

Metalloproteinasen [TJADERHANE et al., 1998; CHAUSSAIN-MILLER et al., 2006].

Seit langer Zeit wird ein Einfluss von C. albicans an der Entstehung der Karies diskutiert.

Bereits 1940 isolierten FOSSDICK und WESSINGER Hefepilze aus der Mundhöhle und zeigten

ihre Fähigkeit zur Dekalzifikation. Mehrere Publikationen konnten eine Korrelation zwischen

Ausmaß des Kariesbefalls und Quantität der Besiedelung mit Candida albicans nachweisen

Diskussion 100

[GÁBRIS et al., 1999; MOALIC et al., 2001]. Diese Ergebnisse und die hohe Isolierungs-

häufigkeit von C. albicans aus kariösen Kavitäten weisen auf eine mögliche Bedeutung von

C. albicans in der Pathogenese der Dentinkaries hin.

Ein direkter Nachweis der Beteiligung von C. albicans an der Dentinkaries wurde bisher nicht

erbracht. C. albicans ist sowohl in der Lage, Säuren zu produzieren, als auch Saps zu

sezernieren. Die in dieser Arbeit durchgeführten Kollagenabbau-Tests zeigten, dass die

kollagenolytische Aktivität von C. albicans ihre Wirkung insbesondere im sauren pH-Bereich

entfaltete, während bei physiologischem pH-Wert nur 20 % der Hydrolyse bei pH 3,5 erreicht

wurde. Für Sap2 wurde die höchste proteolytische Aktivität bei einem pH-Wert von 3,5

[SMOLENSKI et al., 1997], aber auch noch geringe Aktivität bei neutralem pH nachgewiesen

[WAGNER et al., 1995; SCHALLER et al., 2005].

Wie im Abschnitt 1.9 ausgeführt, kommt es auf der von Plaque bedeckten Zahnhartsubstanz

zu einem unregelmäßigen Wechsel von sauren und neutralen Milieuverhältnissen

[STEPHAN, 1944; MARGOLIS et al., 1985], während in der Tiefe aktiver kariöser Dentinläsionen

vorwiegend ein saurer pH-Wert vorherrscht [HOJO et al., 1994; DIRKSEN et al., 1963].

Überwiegen neutrale oder nur leicht saure Verhältnisse im Dentin der Kavität, wäre nur eine

sehr langsame Sap-bedingte Dentindegradation möglich. Im Zeitfenster des sauren Milieus

findet zum einen die Demineralisation der Zahnhartsubstanz statt, zum anderen könnten an

exponiertem Dentinkollagen die Saps von C. albicans ihre Wirkung zeigen. Es ist vorstellbar,

dass durch die Ansäuerung des Dentins in unmittelbarer Nähe der Hefezelle die Saps

besonders wirksam werden.

Wie hier unter In-vitro-Bedingungen gezeigt wurde, ist eine Hydrolyse von Dentinkollagen

durch Candida albicans in vivo unter den genannten Gegebenheiten denkbar.

6. Ausblick Zur vollständigen Erforschung der proteolytischen und insbesondere der kollagenolytischen

Enzyme des Hefepilzes Candida albicans und dessen Beteiligung am Kariesgeschehen sind

noch einige Forschungsanstrengungen zu unternehmen.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Reinigung, Identifizierung und funktionelle

Charakterisierung einer sezernierten Metallo-Aminopeptidase namens CaApe2 mit bisher

unbekannter extrazellulärer Funktion beschrieben. Das Klonen und Überexprimieren von

CaApe2 in Candida albicans würde eine leichtere Enzymreinigung und die Bereitstellung

größerer Mengen an CaApe2 für eine noch ausführlichere Enzymcharakteristik gewähr-

leisten. Es sollte geklärt werden, ob CaApe2 eine aktivierende Wirkung auf im Dentin

enthaltene Matrix-Metalloproteinasen entfalten kann.

In weiteren Versuchen sollten die Expressionsbedingungen der in dieser Arbeit isolierten

Aminopeptidase in vivo untersucht werden. Versuche mit CaApe2-defizitären oder

CaApe2-überexprimierenden Mutanten könnten Hinweise auf die Funktionen der CaApe2

geben. Mithilfe von Antikörpern gegen CaApe2 oder mittels RT-PCR könnte die Expression

von CaApe2 in Gewebeproben, und speziell in kariöser Zahnhartsubstanz, auf Proteinebene

bzw. auf mRNA-Ebene untersucht werden.

Um den Umfang der Kollagenolyse durch Candida albicans im sauren Milieu zu erfassen, ist

es notwendig, alle Sap-Isoenzyme auf kollagenolytische Aktivität zu untersuchen. Die pH-

Abhängigkeit der Kollagendegradation durch Aspartylproteinasen von Candida albicans

könnte mittels biochemischer Nachweisverfahren umfangreich analysiert werden.

Offen ist, ob die Virulenzfaktoren Säure und Sap2 von Candida albicans im besiedelten

Dentin der Kariesläsion synergistisch wirken und hohe Konzentrationen erreichen können,

geschützt vor dem neutralisierenden und verdünnenden Einfluss des Speichels.

Weitere Forschung ist auch auf dem Gebiet der Säuretoleranz-Mechanismen von C. albicans

erforderlich. Untersucht werden sollte, über welche speziellen Mechanismen der Hefepilz

zum Schutz vor dem sauren Milieu des Extrazellularraums verfügt.

Welche mikroökologischen Bedingungen der Hefepilz in vivo benötigt, um sich in der Plaque

zu etablieren und wie Candida albicans an der kariesfördernden Dysbiose [KLIMM, 1999]

beteiligt ist, sollte zukünftig aufgeklärt werden.

7. Zusammenfassung Die Hefe Candida albicans ist ein fakultativ humanpathogener Mikroorganismus, der insbe-

sondere bei immungeschwächten Patienten schwere Erkrankungen der Haut und Schleim-

häute sowie der inneren Organe hervorrufen kann. Seit langer Zeit wird eine Beteiligung des

Hefepilzes an der Ätiopathogenese der Zahnkaries diskutiert, vor allem aufgrund der Säure-

bildung, die zur Demineralisation der Zahnhartsubstanz beitragen kann. Hydrolytische

Enzyme ermöglichen vermutlich die Gewebeinvasion von Candida albicans.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein sezerniertes peptidolytisches Enzym aus der Zellwand

des Mikroorganismus isoliert, identifiziert und funktionell charakterisiert. Die mittels massen-

spektrometrischer Analyse der tryptischen Peptide und Datenbankrecherche ermittelte

Primärstruktur und die Ergebnisse der funktionellen Charakterisierung ließen eine Identifi-

zierung des peptidolytischen Enzyms als neutrale Arginin/Alanin/Leucin-spaltende Metallo-

Aminopeptidase (CaApe2) zu, die durch den ORF CaO19.5197 (GenBank RefSeq XM

705313) kodiert wird. Mithilfe der Proteinanalytik wurde Serin-88 als N-terminale Aminosäure

ermittelt. Die Aminosäuren 88 bis 954 des hypothetischen Genprodukts ergeben eine

nominale Molekularmasse von 97,607 kDa. CaApe2 weist gleich hohe Ähnlichkeit mit den

paralogen Genprodukten ScAap1 und ScApe2 auf, was eine Duplikation und

Subfunktionalisierung des phylogenetischen Vorläufergens in Saccharomyces cerevisiae

nahe legt. Die fehlende kollagenolytische Wirksamkeit von CaApe2 spricht gegen eine

direkte Rolle des Enzyms in der Pathogenese der Dentinkaries von Candida albicans,

schließt aber eine unterstützende Funktion nicht aus.

Die Kollagendegradation durch aufgeschlossene Zellen und Kulturüberstand einer

Flüssigkultur von Candida albicans wurde im sauren und neutralen Milieu mithilfe der

Hydroxyprolin-Bestimmung untersucht. Dabei war keine Kollagenolyse mit Aktivitäts-

maximum im neutralen Bereich nachweisbar. Im sauren pH-Bereich konnte eine deutliche

Hydrolyse von säureunlöslichem Typ-I-Kollagen und auch von demineralisierter Dentinmatrix

durch Kulturmedium gezeigt werden. Diese Kollagenolyse kann auf die bereits umfangreich

charakterisierten sezernierten Aspartylproteinasen zurückgeführt werden. Die in der Literatur

beschriebene Korrelation zwischen dem Ausmaß des Kariesbefalls und der Quantität der

Besiedelung mit Candida albicans legt eine Beteiligung des Hefepilzes an der Kariogenese

nahe. Auch die in der vorliegenden Arbeit gezeigte Fähigkeit von Candida albicans zur

Dentinkollagendegradation unterstützt die Hypothese einer Kariogenität der Hefe.

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9. Anhang

9.1 Tabellenverzeichnis

1.1 Das DHS-System mit einigen klinisch wichtigen Erregern ............................. 2 1.2 Prädisponierende Faktoren für eine Mykose .................................................. 4 1.3 Übersicht medizinisch relevanter Nicht-albicans-Candida-Arten ................... 6 1.4 Klinische Formen der Infektion mit Candida albicans .................................... 7

3.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien ................................................................ 31 3.2 Chemikalien ................................................................................................... 34 3.3 Bestandteile der Kulturmedien ....................................................................... 36 3.4 Enzyme .......................................................................................................... 36 3.5 Antikörper ....................................................................................................... 36 3.6 Stämme von Candida albicans ...................................................................... 37 3.7 Puffersysteme ................................................................................................ 50 3.8 Getestete Proteinaseinhibitoren und Metallkationen ..................................... 52

4.1 Vergleich von Zellextrakt und Zellwandlysat .................................................. 60 4.2 Bilanz der Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand ....... 65 4.3 Zusammenstellung kinetischer Parameter von CaApe2 ................................ 72

Anhang 122

9.2 Abbildungsverzeichnis

1.1 Unterschiede zwischen der „white“ und „opaque“ Form des Candida-albicans- Stammes WO-1 ............................................................................................. 13 1.2 Wechselmöglichkeiten zwischen den morphologischen Formen von Candida albicans ........................................................................................... 14 1.3 Einteilung der Peptidasen .............................................................................. 18 1.4 Dendrogramm der Sap-Familie ...................................................................... 21 1.5 Expression der SAP-Gene der einzelnen phänotypischen Formen in vitro ... 23 3.1 Eichgerade für die Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem Roti®- Nanoquant-Kit (repräsentatives Beispiel) ...................................................... 48 3.2 Eichgerade für die Hydroxyprolin-Bestimmung (repräsentatives Beispiel) .... 55 4.1 Volumenaktivität verschiedener Zellwandextrakte und Zellwandlysat ........... 58 4.2 Volumenaktivität der Zellwandextrakte aus verschiedenen Kulturmedien ..... 59 4.3 Chromatographie des Zellwandlysats an HiLoad 26/10 Q Sepharose HP .... 61 4.4 Chromatographie an Mono Q HR 5/5 ............................................................ 62 4.5 Chromatogramm nach Rechromatographie an Mono Q HR 5/5 .................... 63 4.6 Chromatographie an Superdex 200 10/300 GL ............................................. 64 4.7 Chromatographie an RESOURCE

TM ETH ..................................................... 65 4.8 Proteinmuster der Reinigungsschritte in der SDS-PAGE .............................. 66 4.9 Proteinmuster der RESOURCE

TM ETH-Fraktionen C15 bis D3 .................... 67 4.10 Identifizierung der isolierten Peptidase von Candida albicans ....................... 69 4.11 Vergleich der N-terminalen Aminosäuresequenzen der Aminopeptidase CaApe2 aus Candida albicans mit homologen Proteinen anderer Ascomycota 70 4.12 pH-Abhängigkeit der Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 .................... 71 4.13 Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der L-Arg-AMC-Konzentration 72 4.14 Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der L-Ala-AMC-Konzentration 73 4.15 Spezifische Aktivität der gereinigten Peptidase mit L-Leu-AMC als Substrat 74 4.16 Phenanthrolin-Einfluss auf die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 ..... 75 4.17 EDTA-Einfluss auf die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 .................. 76 4.18 Einfluss von Metallkationen auf die Enzymaktivität ....................................... 77 4.19 Temperaturabhängigkeit der Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 ...... 78 4.20 Albuminabbau durch enzymhaltige Proben von Candida albicans ................ 79 4.21 Kollagenhydrolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans ......... 80 4.22 Analyse des Kollagenabbaus durch die gereinigte Peptidase mittels SDS-PAGE .................................................................................................. 81 4.23 Dentinhydrolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans ............. 82 5.1 Candida albicans ATCC 2091 mit monoklonalem Antikörper gegen Sap2 .... 97

Anhang 123

9.3 Abkürzungsverzeichnis

L-Ala-AMC L-Alanin-7-Amido-4-Methylcoumarin

ALS Agglutinin-ähnliche Sequenz

AMC 7-Amino-4-Methylcoumarin

APE2 Aminopeptidase-2-Gen

APS Ammoniumperoxodisulfat

L-Arg-AMC L-Arginin-7-Amido-4-Methylcoumarin

AS Ammoniumsulfat

ATP Adenosintriphosphat

BHI Brain-Heart-Infusion

BLASTp Basic Local Alignment Search Tool for Proteins

bp Basenpaar

RSA Rinder-Serum-Albumin

CaApe2 Candida-albicans-Aminopeptidase 2

CaPLB Candida-albicans-Phospholipase-Gen der Gruppe B

CD Zellaufschluss (cells disrupted)

CEx Zellextrakt (cell extract)

CF Kulturüberstand (culture fluid)

CWP Zellwandpeptidase (cell wall peptidase)

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamin-N,N,N’,N’,-tetraessigsäure

ESI Elektrospray-Ionisation

FALGPA 2-Furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala

g Gravitationskonstante mit 9,81 m/s2

Glc Glukose

GPI-Anker Glycosylphosphatidylinositol-Anker

KBE Koloniebildende Einheit

kDa Kilodalton

LAP1 Leucin-Aminopeptidase-1-Gen

LIP Lipase-Gen

L-Leu-AMC L-Leucin-7-Amido-4-Methylcoumarin

Anhang 124

β-ME β-Mercaptoethanol

MMP Matrix-Metalloproteinase

MS/MS Tandem-Massenspektrometrie

mRNA Messenger-Ribonukleinsäure

NCBI National Center for Biotechnology Information

ORF offener Leserahmen

PAA Polyacrylamid

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung

PCR Polymerasekettenreaktion

PD-10 Entsalzungssäule

PDB Protein Data Bank

PIR Protein Information Resource

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PRF Protein Research Foundation

PZ-PLGPA 4-Phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg

RHE rekonstruiertes menschliches Epithel

rpm Rotationen in der Minute

RT-PCR Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription

S% Sättigungsprozent

Sap sezernierte Aspartylproteinase

ScAap1 Alanin/Arginin-spezifische Aminopeptidase 1 von S. cerevisiae

SDS Natriumdodecylsulfat

SH-Gruppe Sulfhydryl-Gruppe

spp. Spezies

TEMED N,N,N’,N’-Tetraethyl-Methylen-Diamin

TRIS Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan

U Unit

v/v Verhältnis Volumen/Volumen

w/v Verhältnis Masse/Volumen

YCB Yeast Carbon Base

YNB Yeast Nitrogen Base

YPD Hefeextrakt-Pepton-Glukose-Medium

ZWL Zellwandlysat

Anhang 125

9.4 Danksagung

Sehr herzlich möchte ich Herrn Prof. Dr. med. habil. H. Wolfgang Klimm für die interessante

Themenstellung, die Bereitstellung der Forschungsmittel, die Organisation der Forschungs-

tätigkeit und Hilfe bei der Abfassung der Arbeit danken. Mein ausgesprochener Dank gilt

Herrn Dr. med. H. Thomas Klinke für die sehr hilfreiche theoretische und praktische Unter-

stützung, für die konstruktive Diskussion und für das gründliche Korrekturlesen des

Manuskriptes. Herrn Prof. Dr. rer. nat. habil. Thomas M. Kriegel möchte ich gleichermaßen

sehr herzlich für das große Engagement an dem fachbereichsfremden Thema, die

Bereitstellung des Laborarbeitsplatzes, der Betreuung der zahlreichen Enzymreinigungen

sowie für die andauernde Diskussionsbereitschaft und für das kritische Korrekturlesen der

Arbeit danken. Besonderer Dank geht auch an Herrn Dr. Christian Lück und Frau Jutta

Paasche aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Medizinischen

Fakultät Carl Gustav Carus für die Betreuung des mikrobiologischen Anteils des Forschungs-

themas sowie für die Möglichkeit der Nutzung der Technik zur Anzucht der Kulturen.

Mein besonderer Dank richtet sich auch an Frau Dr. Eva-Christina Müller und Herrn Dr.

Albrecht Otto vom Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in Berlin für die Protein-

analytik mittels Massenspektrometrie sowie an Herrn Dr. Andreas Rump vom Institut für

Klinische Genetik der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität

Dresden für die Ergebnisse der DNA-Sequenzanalyse und an Herrn Prof. Dr. Wolfgang

Schellenberger vom Institut für Biochemie der Medizinischen Fakultät an der Universität

Leipzig für die enzymkinetischen Berechnungen.

Großer Dank gilt auch Frau Petra Strämel und Frau Dr. Karina Kettner aus dem Institut für

Physiologische Chemie für die Einweisung in die biochemischen Arbeitsmethoden und

Benutzung der Laborgeräte. Für die freundliche Hilfe bei der Suche nach selten benutzten

Chemikalien und die Diskussion von methodischen Problemen möchte ich mich bei Frau Dr.

Brigitte Bernard aus dem Institut für Physiologische Chemie bedanken.

Der Poliklinik für Mund-Kiefer-Gesichtschirurgie danke ich für die freundliche Bereitstellung

von extrahierten Weisheitszähnen zur Gewinnung von Dentin. Bedanken möchte ich mich

ebenso bei Herrn Prof. Dr. P. Grellier vom Museum National d'Histoire Naturelle in Paris für

die freundliche Sendung von säurelöslichem Kollagen aus humaner Plazenta.

Zu guter Letzt möchte ich meiner Familie und meiner Freundin Roswitha Nitzsche herzlichen

Dank für die treue Begleitung sowie für die materielle und insbesondere seelische

Umsorgung in der Zeit während meiner Arbeit an der Dissertation aussprechen.

Anhang 126

9.5 Tabellarischer Lebenslauf

Name: Roman Pönisch Anschrift: Ehrlerstraße 1 73479 Ellwangen (Jagst) Geburtsdatum: 13. Juni 1980 Geburtsort: Dresden Eltern: Dr. Gerd Pönisch, Mathematiker Elisabeth Pönisch, Zahnärztin Geschwister: Christin Pönisch, cand. med. Staatsbürgerschaft: deutsch Familienstand: ledig

Schulausbildung: September 1987 bis Juni 1992 138. Polytechnische Oberschule in Dresden August 1992 bis Juli 1999 Andreas-Schubert-Gymnasium Dresden Schulabschluss: 1999, Abitur Wehrdienst: August 1999 bis Ende Juni 2000 Zivildienst bei der Volkssolidarität Dresden Studium der Zahnmedizin: Oktober 2000 bis Dezember 2005 Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden Zahnmedizinische Vorprüfung: März 2003 Auslandspraktikum: Juni bis Juli 2004 University of Alberta (Edmonton, Kanada) Staatsexamen: August bis Dezember 2005 Tag der Approbation: 6. Dezember 2005 Promotionsstudium: Januar 2006 bis Ende August 2006

Assistenzzahnarzt: seit September 2006 in Ellwangen (Jagst)

Anhang 127

9.6 Erklärung

Ich erkläre, dass ich die vorliegende Dissertation „Isolierung, Identifizierung und funktionelle

Charakterisierung der Metallo-Aminopeptidase CaApe2 – Ein experimenteller Beitrag zur

Beurteilung des kariogenen Potentials von Candida albicans“ unter der wissenschaftlichen

Betreuung von Herrn Prof. Dr. med. habil. H. Wolfgang Klimm und unter Mitwirkung von

Herrn Dr. med. H. Thomas Klinke und Herrn Prof. Dr. rer. nat. habil. Thomas M. Kriegel in

Dresden selbständig verfasst habe. Die Proteinanalytik mittels Massenspektrometrie wurde

von Frau Dr. Eva-Christina Müller und Herrn Dr. Albrecht Otto vom Max-Delbrück-Centrum

für Molekulare Medizin in Berlin durchgeführt, die vergleichende Sequenzanalyse führte Herr

Dr. Andreas Rump vom Institut für Klinische Genetik der Medizinischen Fakultät Carl Gustav

Carus der Technischen Universität Dresden durch und Herr Prof. W. Schellenberger vom

Institut für Biochemie der Medizinischen Fakultät an der Universität Leipzig nahm die

enzymkinetischen Berechnungen vor.

Andere als die angegebenen Hilfsmittel und Quellen wurden von mir nicht benutzt. Alle

angeführten Zitate wurden kenntlich gemacht. Die Dissertation in dieser oder ähnlicher Form

wurde an keiner anderen Stelle zum Zwecke eines Promotions- oder anderen

Prüfungsverfahrens eingereicht. Es haben bisher keine erfolglosen Promotionsversuche

stattgefunden.

Dresden, den 30. Juli 2008 Roman Pönisch

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Isolierung, Identifizierung und funktionelle ... · Deuteromycota oder Fungi imperfecti bezeichnet. Aufgrund genetischer Verwandschafts-analysen können die Deuteromycota nun den