CWKERNFORSCHUNGSANLAGE JÜLICH GmbH

Institut für Chemie 4 : Angewandte physikalische Chemie

Jü1-2212Juli 1988

ISSN 0366-0885

Über den Rückstand biologischerMaterialien nach Druckaufschlußmit Salpetersäure

- Identifizierung der Reaktionsprodukte undderen Einfluß auf die inversvoltammetrischeElementbestimmung -

von

Michael Würfels

Ausgeechieden aus ~arn'

s..~ nd

ciel

arn-, .Q .

..~:

0,

. . . . ..-

;

:

116133202557/1

AutobahnAutobahn im BauBundesstraßeSchnellzugstreckeNebenstreckeRughafenKernforschungsanlageJülich

MotorwayMotorway in ConstructionMain RoadMain Railway LineBranch-LinieAirportJülich Nuclear ResearchCentre

Berichte der Kernforschungsanlage Jülich - Nr. 2212Institut für Chemie 4: Angewandte physikalische Chemie Jül-2212

Zu beziehen durch : ZENTRALBIBLIOTHEK der Kernforschungsanlage Jülich GmbHPostfach 1913 - D-5170 Jülich (Bundesrepublik Deutschland)

Telefon : 02461/610 - Telex : 833556-0 kf d

KFA-ZENTRALBIBLIOTHEK3 _ 0

Über den Rückstand biologischerMaterialien nach Druckaufschlußmit Salpetersäure

- Identifizierung der Reaktionsprodukte undderen Einfluß auf die inversvoltammetrischeElementbestimmung -

von

Michael Würfels

D 294 (Univ . Bochum)

KFAzentralbibllothek

iülich

Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen einer wissenschaft-lichen Kooperation zwischen der Arbeitsgruppe für Mikro- undSpurenanalyse der Fakultät für Chemie der Ruhr-UniversitätBochum und dem Institut für Angewandte Physikalische Chemieder Kernforschungsanlage Jülich in der Zeit von März 1985bis März 1988 durchgeführt .

Herrn Prof . Dr . E . Jackwerth danke ich für die Betreuungund Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit .

Für die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes und fürden Gedankenaustausch bedanke ich mich bei Herrn Dr .M . Stoeppler und Herrn Dr . H .W . Dürbeck .

Für weitere Anregungen und Diskussionen möchte ich michbei den Herren G . Wolters, H .D . Narres und Dr . P . Gardinerbedanken . Herrn G . Wolters danke ich zusätzlich für seinenEinsatz bei technischen Fragen des Druckaufschlusses undfür die Bereitstellung von Druckaufschlußgeräten .

Für durchgeführte Analysen danke ich Frau B . Telin, HerrnE . Pascher, den Mitarbeitern der Zentralabteilung fürchemische Analysen der Kernforschungsanlage Jülich undbesonders Herrn Dr . W . Dietrich und den Mitarbeitern derArbeitsgruppe Kernresonanzspektroskopie am Lehrstuhl füranalytische Chemie der Ruhr-Universität Bochum .

Schließlich möchte ich Herrn Prof . Dr . C .J . Soeder fürdie Bereitstellung des Coulomaten und Frau A . Lorke fürihre Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts danken .

Inhalt

Seite

1 . Einleitung 1

2 . Ausgangsposition und Zielsetzung 4

3 . Theoretische Aspekte 123 .1 Aufschlußmethoden für biologisches

Material 123 .1 .1 Naßaufschluß 123 .1 .1 .1 Naßaufschluß in offenen Systemen 123 .1 .1 .2 Naßaufschluß in geschlossenen Systemen 133 .1 .2 Aufschluß durch Verbrennung 163 .2 Coulometrie 173 .3 Inverse Voltammetrie 19

4 . Experimenteller Teil 254 .1 Auswahl und Charakterisierung der

Probenmaterialien 254 .2 Aufschlußbedingungen 264 .2 .1 Druckaufschluß in PTFE-Gefäßen

bis zu 200 0C 264 .2 .1 .1 Beschreibung der verwendeten

Druckaufschlußapparatur 274 .2 .1 .2 Hinweise zur Durchführung der

Druckaufschlüsse 294 .2 .2 Hinweise zur Nachbehandlung organischer

Rückstände mit Perchlorsäure 304 .2 .3 Druckaufschluß bei Temperaturen

bis zu 300 0C 324 .2 .3 .1 Apparatur 324 .2 .3 .2 Aufschluß 354 .3 Behandlung der aufgeschlossenen Proben 364 .3 .1 Kohlenstoffbestimmung 364 .3 .1 .1 Kohlenstoffbestimmung nach Abrauchen

der Säure 364 .3 .1 .2 Bestimmung von organisch gebundenem

Kohlenstoff in sauren Aufschlußlösungen 37

Seite

4 .3 .2 Voltammetrie 394 .4 Coulometrische Kohlenstoffbestimmung 404 .5 Voltammetrische Meßverfahren 474 .6 Untersuchungen zur Kohlenstoffbilanz 484 .6 .1 Druckaufschluß bei Temperaturen

bis zu 2000C 484 .6 .2 Nachbehandlung von Druckaufschluß-

Rückständen mit Perchlorsäure 514 .6 .3 Druckaufschluß in abgeschmolzenen

Ampullen bei Temperaturen bis zu 300°C 534 .6 .4 Einfluß der Einwaage auf den Rest-

kohlenstoffgehalt nach Druckauf-schlüssen bei 180°C 54

4 .7 Voltammetrische Untersuchungen 584 .7 .1 Voltammetrische Untersuchungen an

Aufschlußlösungen von Algen und Leber 584 .7 .2 Voltammetrische Messungen nach Druck-

aufschluß weiterer Materialien ;Vergleich mit den Ergebnissen derAlgen- und Leber-Untersuchungen 75

4 .8 Kohlenstoffbilanz und voltammetrischeUntersuchungen an Aufschlußlösungendefinierter organischer Verbindungen 83

4 .8 .1 Auswahl der untersuchten Verbindungen ;Aufschlußbedingungen 83

4 .8 .2 Kohlenstoffbilanz 854 .8 .3 Restkohlenstoffgehalte nach Aufschluß

biologischer Proben und Probenkompo-nenten 98

4 .8 .4 Voltammetrische Untersuchungen an Auf-schlußlösungen organischer Substanzen 105

4 .9 Identifizierung der AufschlußrUckstande 1224 .9 .1 Identifizierung der Rückstände aus Auf-

schlüssen definierter Substanzen 1224 .9 .2 Vergleich der NMR-Spektren von Rück-

ständen nach Aufschluß biologischerMaterialien mit denen von Aufschluß-Rückständen aus definierten Substanzen 139

4 .9 .2 .1 Linolsäure und natürliche Fette 1394 .9 .2 .2 Weitere biologische Materialien 1394 .9 .3 Vergleich der voltammetrischen Signale

des Aufschlußrückstandes von Phenylala-nin mit den Signalen identifizierterReaktionsprodukte 142

Seite

4 .10 Zum elektrochemischen Verhaltennitrierter Benzoesäuren 146

4 .11 Schwefel-, Phosphor- und Stickstoff-bilanz beim Druckaufschluß biologischerMaterialien 148

4 .11 .1 Schwefelbilanz 1484 .11 .2 Phosphorbilanz 1494 .11 .3 Stickstoffbilanz 150

5 . Diskussion 152

6 . Zusammenfassung 175

7 . Literaturverzeichnis 180

B . Anhang 191

1 . Einleitung

Die Bestimmung toxischer Schwermetalle in biologischenMaterialien zählt zu den Routineaufgaben der analytischenChemie, seit die Umweltbelastung durch Emissionen dieserStoffe sowie die Kenntnisse über deren gesundheitsgefähr-dende Wirkungen und Einflüsse auf biologische Prozesse zueiner systematischen Kontrolle betroffener Stoffsysteme undOrganismen zwingen . Von ähnlichem Interesse sind Informa-tionen über Elemente, bei denen lebensnotwendige (essen-tielle) Funktionen in biologischen Systemen erkannt wordensind . In vielen Fällen konnte inzwischen sogar nachgewiesenwerden, daß Elemente - je nach Konzentration, Wertigkeitund Bindungszustand - sowohl essentielle als auch toxischeWirkungen ausüben können . Da die Konzentrationsunterschiedebeim Übergang von einer essentiellen zur toxischen Wirkungbei manchen Elementen vielfach nur sehr gering sind, sindpräzise und richtige Daten erforderlich, um deren Einflüsseauf biologische Systeme (Umwelt, Nahrung, Körperflüssigkei-ten, Gewebe) sicher beurteilen zu können . Die interessantenKonzentrationen liegen allerdings in vielen Fällen imGrenzbereich des Nachweisvermögens selbst der leistungs-fähigsten Methoden ; dementsprechend sind Analysenverfahrenerforderlich, die auch bei extrem niedrigen Konzentrationeneine Elementbestimmung unter weitgehendem Ausschluß syste-matischer Fehler ermöglichen .

Wegen ihrer leichten Handhabbarkeit und der geringen Konta-minationsanfälligkeit bieten sich zunächst die sogenannten"Direktmethoden" an, also Methoden, die einen unmittelbarenEinsatz des Probenmaterials ohne wesentliche Vorbehandlungerlauben .

Hier sind neben der Inversvoltammetrie (1-5) und der Atom-absorptionsspektrometrie (AAS) (6-9) von Elementspuren inKörperflüssigkeiten besonders die atomabsorptionsspektrome-trische Analyse fester Proben (12) sowie die Röntgenfluor-eszensanalyse (RFA) (11) zu nennen . Allen diesen Methodenist allerdings gemeinsam, daß die Bestimmung der Spurendurch den hohen Matrixüberschuß im Probenmaterial erschwertwird : Bei der Voltammetrie werden neben den Elementspurenauch organische Bestandteile an der Arbeitselektrode umge-setzt . Der dadurch bedingte Strom kann mit dem Signal desAnalyten interferieren . In der AAS fester Proben oder vonKörperflüssigkeiten läßt sich die organische Matrix durchVerflüchtigen vor dem eigentlichen Bestimmungsschritt oftnicht genügend vollständig abtrennen, was zu einer Signal-depression oder zu hohen, teilweise unkompensierbarenUntergrundsignalen führen kann . Ein weiterer Nachteil derAAS fester Proben liegt darin, daß die zulässigen geringenEinwaagen bei der unvollkommenen Homogenität vieler Proben-materialien oft nicht ausreichen, um eine repräsentativeAussage treffen zu können . Wesentlicher Nachteil der RFA inder Spurenanalyse ist ihr gegenüber der AAS und der inver-sen Voltammetrie geringeres Nachweisvermögen .

Allen Methoden gemeinsam ist das Problem, daß in Proben-und Eichmaterialien die zu bestimmenden Elemente in derRegel nicht streng in der gleichen Bindungsform vorliegen .Daraus resultieren Probleme bei der Kalibrierung, häufigverbunden mit beträchtlichen systematischen Fehlern . Umalle genannten Störungen zu umgehen, bleibt deshalb oftkeine andere Möglichkeit, als die organische Matrix ineinem der Bestimmung vorgeschalteten Schritt von den inter-essierenden Spuren zu trennen . Eine Möglichkeit hierzu istdie Mineralisierung der Probeneinwaagen . Der zu diesemZweck durchzuführende Aufschluß übernimmt dabei mehrereAufgaben-.

die weitgehende Mineralisierung der organischen Matrix,die Überführung der Spurenverbindungen in eine löslicheForm,die Isoformierung von Proben- und Eichmaterialien zuartgleichen Spurenkonzentraten .

Die Mehrzahl der bekannten Aufschlußverfahren ermöglichtden Einsatz von Probenmengen -~-t100 mg, wodurch Homogenitäts-probleme bei vielen Materialien ausgeschlossen werden kön-nen . Für die nachfolgende Anreicherung von Elementspuren(12) ist ein Aufschluß der Proben hilfreich, bei dem dieSpuren als Ionen in Lösung gebracht werden : Da die Bin-dungsformen von Schwermetallen in biologischen Materialien,selbst in natürlichen Wässern, oft undefiniert bzw . unbe-kannt sind, schafft der Aufschluß definierte chemische Ver-hältnisse und eliminiert so eine der wesentlichen Quellenfür Analysenfehler .

Die Auswahl des jeweiligen Aufschlußprozesses als Teileines spurenanalytischen Verbundverfahrens muß sich u .a . anfolgenden Gegebenheiten orientieren :- Zusammensetzung des Probenmaterials,- erforderliche bzw . mögliche Einwaage,- Reaktivität von Probenmateial und Aufschlußreagenz,- Art der zu bestimmenden Spuren und ihr Verhalten imAuf schluß,

- Blindwertbelastung der Analyse,- Erfordernisse des nachfolgenden Bestimmungsverfahrens .

Allgemein gilt für ein Verbundverfahren, daß die Spurenbe-stimmung um so zuverlässigere Meßergebnisse liefert, jevollständiger die Elemente von der umgebenden Matrix abge-trennt wurden .

2. Ausgangsposition und Zielsetzung

Die Mehrzahl aller Analysenprobleme im Bereich der Element-spurenanalytik biologischer Probenmaterialien erfordert ausden zuvor genannten Gründen einen möglichst vollständigenAufschluß, verbunden mit einer Abtrennung der organischenMatrix .

Für den Aufschluß biologischer Probenmaterialien haben die"Naßveraschungsverfahren" eine besondere Bedeutung . DieProbe wird dabei mit einem Oxidationsmittel, meist miteiner oxidierenden Säure oder einem Säuregemisch versetztund nach einem Temperaturprogramm erhitzt, wobei der Koh-lenstoff der organischen Matrix in Kohlendioxid überführtund abgetrennt wird . Die wichtigsten zu diesem Zweck be-nutzten Säuren sind Salpetersäure und Perchlorsäure . Siewerden entweder allein oder als Mischung eingesetzt ; auchGemische mit anderen Säuren, z .B . mit Schwefelsäure undPhosphorsäure, werden angewendet .

Unter den gebräuchlichen Aufschlußreagenzien ist Perchlor-säure wohl das stärkste Oxidationsmittel für organischesMaterial ; ohne ihren Einsatz kann in den meisten Fälleneine vollständige Veraschung nicht erreicht werden . Unvoll-ständig aufgeschlossene Proben verursachen in manchenFällen so starke Störungen bei der Bestimmung der inter-essierenden Elementspuren, daß die zugrundeliegenden analy-tischen Probleme' durch Naßaufschluß ohne den Einsatz vonPerchlorsäure nicht zu lösen sind . Die Anwendung von Per-chlorsäure bringt jedoch auch einige Nachteile : Ihre hoheReaktivität gegenüber organischem Material liefert zwargute Aufschlußergebnisse, bei unmittelbarem Einwirken aufdas Probenmaterial können jedoch unkontrollierbar explo-sionsartige Reaktionen mit hoher Brisanz auftreten (13-18) .Perchlorsäure sollte deshalb allenfalls in Gemischen mitanderen Säuren, meist mit Salpetersäure, eingesetzt werden,was die Gefahr zwar vermindert, aber nicht völlig besei-

tigt, wie Unfälle zeigen (13,18,19) . Unbedingt zu beachtenist, daß Perchlorsäure erst nach vollständigem Umsatz desaufzuschließenden organischen Materials abgeraucht wird . Umzu verhindern, daß Perchlorsäuredämpfe ins Abluftsystem ge-langen, wo sie mit organischen Dämpfen und Rückständen ex-plosive Gemische bilden können, dürfen nur spezielle Abzügeverwendet werden, in denen die Abluft durch Berieselung mitWasser von Perchlorsäuredämpfen weitgehend befreit wird .Ein weiterer Nachteil handelsüblicher Perchlorsäure liegtdarin, daß sie, verglichen mit Salpetersäure, meist deut-lich stärker kontaminiert ist (20) . Die weitere Rufreini-gung "analysenreiner" Säure durch Destillation ist zwarmöglich, sie muß aber unter besonderer Vorsicht erfolgen(14,17) . Schließlich sollte mit Perchlorsäure aufgrund derExplosionsgefahr nicht in geschlossenen Aufschlußsystemengearbeitet werden, so daß Verluste an bestimmten Elementendurch Verflüchtigung oft nicht zu vermeiden sind .

Wesentlich sicherer ist das Arbeiten mit Salpetersäure ;eine explosionsartige Zersetzung beim Kontakt auch 69%igerHN03 mit organischem Material ist im allgemeinen nicht zubefürchten . Ihr Oxidationsvermögen reicht allerdings oftnicht aus, um biologische Probenmaterialien für eine stö-rungsfreie Spurenanalyse genügend vollständig zu minerali-sieren . Die handelsübliche analysenreine Säure ist leichtdurch isotherme Destillation aufzureinigen (21) . Da ihreReaktivität geringer ist als die der Perchlorsäure, kannSalpetersäure auch in geschlossenen Systemen eingesetztwerden . Elementverluste durch Verflüchtigung beim Aufschlußwerden so verhindert . Um dies auszunutzen, wurden in derVergangenheit Druckaufschlußsysteme entwickelt, die dieAnwendung von Salpetersäure auch bei Temperaturen oberhalbihres normalen Siedepunktes ermöglichen . Man erzielt da-durch eine Verbesserung des Oxidationsvermögens, ohne daßes bei der Mehrzahl aller Probenmaterialien zu gefährlichenReaktionen kommt .

Die für den Druckaufschluß organischer Stoffe mit 69%igerSalpetersäure als optimal ermittelten Arbeitsparameter- 170°C und 3 h Aufschlußzeit - sind praktisch unabhängigvon der Art des aufzuschließenden Materials (22,23) . Diezum Aufschluß notwendige Säuremenge hängt stark vom Proben-material ab, jedoch können mit 2 .0 ml 69%iger Salpetersäurefür eine Einwaage, die 100 mg Kohlenstoff entspricht, inallen Fällen optimale Aufschlußergebnisse erreicht werden .Dabei werden Kohlenhydrate praktisch quantitativ, Pflanzen-öl und eiweißhaltige Stoffe jedoch nur unvollständig abge-baut . Der im Rückstand noch verbleibende Gehalt an orga-nischem Material wurde jeweils durch Verbrennung und coulo-metrische Titration des gebildeten COz als "% C" ermittelt .

Untersuchungen dieser Art wurden bereits von STOEPPLER,MÜLLER und BACKHAUS (24), sowie von MÜLLER (25) durchge-führt . Der Kohlenstoffumsatz wurde dabei durch Messen desCOZ-Gehaltes der Gasphase bestimmt ; eventuell entstandeneflüchtige organische Verbindungen wurden nicht miterfaßt .Von den Autoren konnte zwar gezeigt werden, daß der Kohlen-stoff in der organischen Matrix beim Druckaufschluß mitSalpetersäure nicht quantitativ zu COZ umgesetzt wird, dader Restkohlenstoffgehalt im Aufschlußrückstand selbstnicht gemessen wurde, blieben die Aussagen über die Voll-ständigkeit von Aufschlüssen allerdings sehr unsicher . Ur-sache dafür ist, daß als Reaktionsprodukte außer COZ auchbei Raumtemperatur flüchtige organische Verbindungen denk-bar sind, die beim Öffnen des Druckgefäßes entweichen unddas Ergebnis verfälschen .

Messungen zur Vollständigkeit von Aufschlüssen mit Salpe-tersäure-Perchlorsäure-Mischungen wurden von MARTINIE undSCHILT (26) durchgeführt . Dabei wurden die Restkohlenstoff-gehalte nach Aufschluß einer Vielzahl biologischer und an-derer organischer Probenmaterialien durch Elementaranalysebestimmt . Die Untersuchungen zeigen, daß auch mit Perchlor-

säure nicht in allen Fällen eine vollständige Mineralisie-rung gelingt .

Die in diesem Zusammenhang zitierten Arbeiten (22-26) be-fassen sich hauptsächlich mit der Frage, ob unter den ge-wählten Aufschlußbedingungen eine Oxidation des Kohlen-stoffs organischer Probenmaterialien möglich ist und inwelchem Umfang unzersetzte Reste im Rückstand verbleiben .Nicht untersucht wurde jeweils der Einfluß unzersetzterReste oder von Zersetzungsprodukten auf die Elementsignaleder Spurenbestimmung, noch wurde die Identität der Rück-stände aufgeklärt . Lediglich MARTINIE und SCHILT konntenzeigen, daß Alanin und Glutamin von Salpetersäure-Perchlor-säure-Gemischen zu Essigsäure, Methionin zu Methansulfon-säure umgesetzt werden . Bei anderen biologisch relevantenStoffen wurden entweder keine meßbaren Rückstände oder abernur unzersetzte Ausgangsstoffe festgestellt .

Organische Zersetzungsprodukte in Spurenkonzentraten könnendie Elementsignale sowohl der spektroskopischen als auchder elektroanalytischen Spurenbestimmung durch vielfältigeadditive und multiplikative systematische Fehler beein-trächtigen . Besonders schwerwiegend sind solche Störungenbei der inversen Voltammetrie . Einflüsse unzersetzter orga-nischer Stoffe auf voltammetrische Schwermetallsignale nachAufschluß biologischer Materialien wurden von BAUMGARDT(27), KOTZ et al . (28), OEHME und LUND (29) sowie HERTZ undPANI (30) beschrieben . BAUMGARDT vergleicht die durchdifferentielle Puls-Inversvoltammetrie (DPASV) 1 ) erhaltenenSignale der Elemente Zn, Cd, Pb und Cu nach dem Aufschlußvon Kohlmeisenfedern mit Hilfe verschiedener Aufschlußver-fahren . Die Abb .l-3 zeigen, daß nur der Aufschluß mit Sal-peter- und Perchlorsäure zu störungsfreien Voltammogrammenführt . Beim Aufschluß im offenen System sowie beim Druck-aufschluß mit Salpetersäure hinterbleiben organische Rück-

1 >DPASV ist die in der Literatur gebräuchliche Bezeichnungfür "Differential Pulse Anodic Stripping Voltammetry" .

stände, die zu Störungen der Voltammogramme durch Fremd-signale und erhöhten Untergrund führen . Auch OEHME und LUNDbeobachten störende Signale nach Druckaufschluß von Blutmit Salpetersäure und Analyse durch DPASV (siehe Abb . 50) .KOTZ et al . kommen ebenfalls zu dem Schluß, daß nach Druck-aufschluß biologischer Materialien bei Temperaturen bis200°C Lösungen hinterbleiben, deren organische BestandteileStörsignale bei der Bestimmung von Cd, Pb und Cu durch

DPASV liefern . Da in der zitierten Arbeit die Meßbedin-gungen aber nicht näher angegeben werden, ist eine Inter-pretation der Ergebnisse über den oben erwähnten Schlußhinaus nicht möglich . Die Autoren vermuten, daß die stören-

CUA

-1.05 -0.85 -0.65 -0.45 -Q25 -0.05 "015

Potential (V) vs . gesatt . Ag/AgCl

Abb .l : Voltammogramm (DPASV) des Rückstandes von Kohl-meisenfedern nach Aufschluß im offenen Gefäß mitSalpetersäure (nach BAUMGARDT (27))

i I 1

'

1 I I , I

,

I

'

I 1

-1.05 -0,85 -0.65 -0,45 -Q25-0.05 +015Potential (V) vs . gesätt . Ag/AgC l

Abb .2 : Voltammogramm (DPASV) des Rückstandes von Kohlmei-senfedern nach Druckaufschluß mit Salpetersäure(nach BAUMGARDT (27))

CuIt-lio nd

T

1 1

1

1

,

i

.

1

,

1

,

1

, -,L-I-1,1 -0,9 -0,7 -0,5 -0,3 -01 -01 -0.3

Potential (V) vs . gesätt . Ag/AgCl

Abb .3 : Voltammogramm (DPASV) des Rückstandes von Kohl-meisenfedern nach Aufschluß mit Salpeter- undPerchlorsäure im offenen Gefäß (nach BAUMGARDT (27))

1 0

den Substanzen beim Aufschluß gebildete organische Nitro-verbindungen sowie nicht umgesetzte organische Makromole-küle sind, ohne diese Aussage jedoch durch Experimente oderLiteraturhinweise zu belegen . OEHME und LUND kommen zu dergleichen Aussage und belegen dies mit Literaturhinweisen(31-34) . In den zitierten Arbeiten sind jedoch keine Infor-mationen enthalten, die auf die Art der infrage kommendenVerbindungen hindeuten . HERTZ und PANI (30) geben an, daßes sich bei den störenden Substanzen um aromatische Nitro-verbindungen handelt und stützen diese Aussage darauf, daßRückstände nach Druckaufschluß von Olivenblättern imMassenspektrometer eine NO-Abspaltung erleiden . Auch dieseAutoren identifizieren die zugrundeliegenden Verbindungennicht näher .

Die durch organische Rückstände hervorgerufenen Störungenatomspektrometrischer Verfahren sind im allgemeinen wenigergravierend als die der Voltammetrie . Besonders zu erwähnensind jedoch systematische Fehler, die durch den unter-schiedlichen Bindungszustand von Elementspuren in Proben-und Eichlösungen entstehen können . Dies gilt beispielsweisebei Vorhandensein nicht mineralisierter metallorganischerVerbindungen von Spuren, die mit der Hydrid-Technik der AASbestimmt werden sollen . Organische Zersetzungsprodukte sindaußerdem eine häufige Quelle für Untergrundsignale in derGraphitrohr-AAS, wenn deren Abtrennung in der "Veraschungs-phase" des Temperaturprogramms unvollständig bleibt .Schließlich muß man bei allen lösungsspektrometrischenMethoden mit Probenansaugung und -zerstäubung damit rech-nen, daß organische Stoffe Änderungen in der Viskosität undOberflächenspannung bewirken, so daß im Vergleich zu denwäßrigen Kalibrierlösungen unter Umständen beträchtlicheUnterschiede in den Ansaugraten, den Aerosolausbeuten unddamit in der Empfindlichkeit der Analysensignale auftreten .

In dieser Arbeit werden vor allem die Einflüsse der nachDruckaufschluß biologischer Materialien zurückbleibendenorganischen Verbindungen auf den Stromverlauf inversvoltam-metrischer Spurensignale untersucht . Folgende Teilaufgabenbilden dabei den Schwerpunkt :

1 . Optimierung der Parameter für den Druckaufschluß mitSalpetersäure bei Temperaturen bis zu 200°C anhand aus-gewählter Probenmaterialien .

2 . Versuche zur Nachbehandlung organischer Rückstände mitPerchlorsäure .

3 . Versuche zum Druckaufschluß mit Salpetersäure bei Tem-peraturen bis zu 300°C unter Verwendung eines selbstge-bauten Systems sowie des kommerziellen Hochdruckveraschers nach KNAPP (11,35) .

4 . Untersuchung der Voltammogramme von Aufschlußlösungen imHinblick auf Störungen bei der Bestimmung von Zn, Cd, Pbund Cu .

5 . Versuche zur Isolierung der Aufschlußrückstände unter-schiedlicher Probenmaterialien sowie zur Identifizierungder unzersetzten Stoffe .

6 . Untersuchungen zum Mechanismus der Störung elektroche-mischer Reaktionen durch Aufschlußrückstände .

7 . Untersuchungen zum Mechanismus des Abbaus biologischerMaterialien im Druckaufschluß durch Salpetersäure .

3. Theoretische Aspekte

Im Folgenden werden gebräuchliche Aufschlußverfahren fürbiologische Materialien sowie die Grundlagen der coulome-trischen Analyse und der Voltammetrie beschrieben .

3_1-Aufschlu23methoden -für-biolo2isches_Material

3 .1 .1 Naßaufschluß

1 2

Als Reagenz für den Naßaufschluß in offenen oder geschlos-senen Systemen verwendet man im allgemeinen oxidierendeSäuren oder Wasserstoffperoxid .

3 .1 .1 .1 Naßaufschluß in offenen Systemen

Im einfachsten Fall können biologische Proben durch Erhit-zen mit geeigneten oxidierenden Reagenzien in Bechern,Schalen oder Kolben aufgeschlossen werden . Um Verluste anOxidationsmittel durch Abdampfen zu vermeiden, empfiehlt essich, unter Rückfluß zu arbeiten . Hierzu wurde eine Reihevon Apparaturen entwickelt (36-41) . Von KNAPP (42) wurdeein automatisiertes, kontinuierlich arbeitendes Systembeschrieben . Als Oxidationsmittel finden Salpetersäure,Perchlorsäure, sowie deren Gemische mit Schwefel- oderPhosphorsäure Verwendung (16,34,39,43-48) . Perchlorsäuredarf nur im Gemisch mit anderen Säuren angewendet werden,um unkontrollierbare heftige Reaktionen zu vermeiden (13) .In einigen Fällen wird auch Chlorsäure zum Aufschluß biolo-gischer Materialien vorgeschlagen (49-53) . Eine weitereMethode der Naßveraschung ist der Umsatz mit Wasserstoff-peroxid, das entweder im Gemisch mit Salpeter- oder Schwe-felsäure oder unter Zusatz von zweiwertigem Eisen als Kata-lysator eingesetzt wird (54) . Ein gravierender Nachteil des

1 3

offenen Aufschlusses liegt im Verlust einiger Elementedurch Verflüchtigung .

3 .1 .1 .2 Naßaufschluß in geschlossenen Systemen

Bereits 1860 untersuchte CARIUS das Aufschlußverhalten or-ganischer Stoffe, indem er sie mit Salpetersäure in abge-schmolzenen Glasampullen bei Temperaturen von 200-320°Coxidierte (55,56) . Bei den neueren Verfahren wird die Probezusammen mit den Aufschlußreagenzien in einem druckdichtenAufschlußgefäß temperaturprogrammiert erhitzt .

Gegenüber dem Aufschluß in offenen Gefäßen bietet dasArbeiten in geschlossenen Systemen Vorteile :- Es entstehen keine Elementverluste durch Verflüchtigung .- Die Aufschlußzeit wird verkürzt, die Aufschlußleistung

wird durch Anwendung von Temperaturen oberhalb des nor-malen Siedepunktes der Aufschlußreagenzien verbessert .

- Durch den geringeren Reagenzienbedarf wird die Blindwert-belastung des Aufschlußprozesses vermindert .

- Kontaminationen von außen sind weitgehend ausgeschlossen .

Als Gefäßmaterialien dienen heute im allgemeinen Polytetra-fluorethylen (PTFE) (24,33,57-68), Glaskohlenstoff (28) undQuarz (11,35) . Beschrieben wurde auch die Anwendung vonGefäßen aus V4A-Stahl zum Aufschluß mit Wasserstoffperoxid(151) . Die Aufschlußtemperaturen werden vor allem durch diemechanischen Eigenschaften des Gefäßmaterials begrenzt .PTFE läßt, je nach Qualität, Temperaturen von 160-200°C zu,bevor es zu erweichen beginnt (28,46,67,68) . Gefäße ausGlaskohlenstoff erlauben Druckaufschlüsse bei Temperaturenbis etwa 250°C (28), solche aus Quarz können noch höhererhitzt werden . Zum wesentlichen Problem werden dann aberdie Dichtungen .

1 4

Die zu Beginn der Entwicklung beschriebenen Druckaufschluß-systeme dienten hauptsächlich zum Aufschluß geologischerProben mit Flußsäure (57-59,69-72) . Die Mehrzahl der heutegebräuchlichen Geräte verschiedener Herstellerfirmen leitetsich von den u .a . durch BERNAS (59), sowie TÖLG et al . (68)beschriebenen Apparaturen ab . Ein Druckaufschlußsystemdieser Art ("Aufschlußbombe") besteht danach aus einemPTFE-Tiegel, der von einer Edelstahl-Ummantelung umgebenist . Durch Federdruck wird der PTFE-Deckel zum Abdichtenfest auf das Gefäß gepreßt . Steigt der Innendruck über denzugelassenen Wert an, so wird der Deckel gegen den Feder-druck geöffnet, wobei die Reaktionsgase entweichen . Daherkann es nicht zum Zerbersten in Folge eines zu starkenDruckanstiegs kommen . Beheizt wird das Aufschlußsystem inHeizblock- oder Luftthermostaten . Es kann auch durch Mikro-wellen beheizt werden (73-77), wobei jedoch Sicherheits-druckbehälter aus Metall nicht eingesetzt werden können .Statt der Überdrucksicherung durch eine Feder besitzenmanche Druckaufschlußbomben Berstscheiben ; diese Funktionkann auch der Deckel des Aufschlußgefäßes übernehmen (33,78) . Bei Systemen für den gleichzeitigen Aufschluß mehrererProben (33,58,78,79), sind jeweils mehrere Tiegel in einemgemeinsamen Heizblock angeordnet .

Wie sich gezeigt hat, kann PTFE in manchen Fällen der ex-tremen Spurenanalyse aufgrund von nestartig eingeschlosse-nen Verunreinigungen nicht eingesetzt werden (28) : Die ausder Herstellung des Kunststoffes herrührenden Staubein-schlüsse werden bei vielfacher Verwendung der Gefäße vonder Säure schließlich freigelegt und verursachen zum Teilbeträchtliche Blindwerte . Auch diffundieren einige Elementebei hohen Temperaturen und Drucken in die Gefäßwandung hin-ein, was Verluste sowie "Memoryeffekte" und somit systema-tische Fehler zur Folge hat (11) . Solche Vorgänge hängenjedoch stark von der Qualität des PTFE und von dessen Ver-arbeitung ab . Die merkliche Gasdurchlässigkeit des Gefäß-materials führt schließlich auch zu einer gewissen Passage

1 5

Allgemein muß die Probeneinwaage dem Gefäßvolumen und demmaximal tolerierbaren Innendruck angepaßt werden . DasAufschlußverhalten eines Probenmaterials kann dabei durchSteigerung der Einwaage untersucht werden . Eine strikteBegrenzung der Probenmenge vor allem der erwähnten sehrreaktiven organischen Materialien auf 150-300 mg ist auchaus Sicherheitsgründen unbedingt erforderlich .

nitroser Gase, was in ungünstigen Fällen eine Korrosion desMetallmantels bewirken kann .

Probleme dieser Art treten bei der Benutzung dicht ver-schlossener Quarzgefäße nicht auf . KNAPP (11,35) hat einentsprechendes "Hochtemperaturveraschungsgerät" entwickelt,mit dem Proben in Quarzgefäßen bei Temperaturen bis zu320°C unter Druck aufgeschlossen werden können . Der imReaktionsverlauf entstehende Innendruck wird durch Vorgabeeines äußeren Druckes kompensiert, so daß bis zu 100 bartoleriert werden können .

Beim Naßaufschluß in geschlossenen Systemen hat sich Salpe-tersäure als oxidationsmittel für biologisches Materialbewährt (11,22-24,28,33,68,79-81) . Müssen Silikate gelöstwerden, kann zusätzlich Flußsäure verwendet werden (68,82-88) . Der Einsatz von Perchlorsäure im geschlossenen Systemist aus Sicherheitsgründen grundsätzlich nicht zu empfeh-len . Eventuelle brisante Reaktionen können zur Detonationführen, wobei die Sicherheitssysteme der Druckaufschluß-geräte oft zu träge sind, um der Druckwelle nachzugeben .Dies gilt auch für Mischungen aus Salpeter- und Schwefel-säure, die z .B . zum Aufschluß von Fett im geschlossenenSystem auf keinen Fall eingesetzt werden dürfen (89) .

Eine Übersichtsarbeit zum Thema "Säureaufschluß unter Druckin der Spurenanalyse" wurde von JACKWERTH und GOMISCEK ver-öffentlicht (80) .

1 6

3 .1 .2 Aufschluß~durch Verbrennung

Da die zahlreichen auf Verbrennung basierenden Aufschluß-verfahren nicht unmittelbar Gegenstand dieser Arbeit sind,werden sie hier nur kurz beschrieben . Weitere Informationensind der zitierten Literatur zu entnehmen .

Folgende Verfahren werden heute hauptsächlich eingesetzt :- Verbrennung durch Luftzufuhr im Muffelofen bei etwa 500°Cmit und ohne Zusatz von Oxidationshilfen (15,16,39,48),teilweise auch in Kombination mit einem Naßaufschluß(90-94) . Die Gefahr der Verflüchtigung von Spurenelemen-ten ist hier besonders groß (15,95,96) .

- Verbrennung unter "dynamischen Bedingungen" im Sauer-stoffstrom ; flüchtige Verbindungen werden an einem Kühl-finger zurückgehalten (97) .

- Die Verbrennung nach SCHÖNIGER in einem geschlossenen,sauerstoffgefüllten Kolben erlaubt nur geringe Einwaagen(98) .

- Verbrennung mit Sauerstoff unter Druck in Edelstahl-Bomben . Zwar lassen sich relativ hohe Einwaagen auf-schließen (99-103), es ist aber mit Kontaminationen durchdas Gefäßmaterial zu rechnen .

- WICKBOLD-Verbrennung organischer Proben in einer Knall-gasflamme, meist zur Bestimmung von Chlor und Schwefel(83,104-106) .

- Veraschung mit angeregtem Sauerstoff bei 1 - 5 torr 02 .Im Mikrowellen- oder Hochfrequenzfeld entsteht ein Sauer-stoffplasma, mit dem bei Temperaturen unterhalb von 150°Cselbst Materialien wie PTFE oder Graphit aufgeschlossenwerden können . Flüchtige Verbindungen werden an Kühlvor-richtungen kondensiert (11,51,86,107-109) .

3 .2 Coulometrie

Die coulometrische Analyse (110) nutzt die Gültigkeit desFARADAY-Gesetzes zur Bestimmung elektrolytischer Reaktions-produkte aus . Es gilt :

G =M " Q

F " z

1 7

G = umgesetzte StoffmasseM = Mol- bzw . AtommasseF = Faraday-KonstanteQ = gemessene Ladungz = Wertigkeit bzw . Zahl der Elektronen pro

Formelumsatz

Die elektrolytisch umgesetzte Stoffmenge wird aus der zurReaktion benötigten und gemessenen Ladungsmenge berechnet .Voraussetzung für die Richtigkeit der Analyse ist eine100%ige Stromausbeute für die elektrolytische Reduktionbzw . Oxidation der zu bestimmenden Probenkomponente . Es istalso wichtig, daß an der Arbeitselektrode allein die ana-lytisch interessierende Reaktion abläuft ; Nebenreaktionenjeder Art müssen verhindert werden . Die Anwendung der ge-bräuchlichen Elektrodenmaterialien Platin bzw . Quecksilberrichtet sich nach dem analytischen Problem, da beide Metal-le nicht universell eingesetzt werden können . Man unter-scheidet, je nach Wahl der Parameter und Meßgrößen, zweicoulometrische Methoden : die "potentiostatische" und die"galvanostatische" Coulometrie .

1 . Potentiostatische Coulometrie

Die an den Elektroden anliegende Spannung wird im Verlaufder Elektrolyse konstant gehalten . Die Konzentration des zu

1 8

bestimmenden Stoffes nimmt mit zunehmender Elektrolysezeitab . Dadurch bedingt, verringert sich die Stromdichte, bissie am Ende der Elektrolyse praktisch gleich Null ist . Dieumgesetzte Ladungsmenge kann mit einem Coulometer bestimmtwerden .

2 . Galvanostatische Coulometrie

Auch bei diesem Verfahren wird die umgesetzte Ladung alsProdukt aus der Stromstärke und der Zeit bestimmt . Es gilt :

Q = I " t

Q = umgesetzte LadungI = Stromstärket = Zeit

Da hier die Stromstärke mit Hilfe eines Galvanostatenkonstant gehalten wird, dient die Zeit, während der derStrom fließt, als Meßgröße . Bei dieser Technik verläuft derelektrolytische Stoffumsatz ähnlich wie in der Maßanalyse ;anstelle der Maßlösung wird hier jedoch der elektrischeStrom zur Titration benutzt ("Coulometrische Titration") .

Der Endpunkt, bei dem die Elektrolyse unterbrochen wird,kann konventionell mit Hilfe von Farbindikatoren oderpotentiometrisch über ein zusätzliches Meßelektrodensystemermittelt werden . Häufig wird auch die "Dead-Stop-Methode"angewandt, ein potentiostatisches Indikationsverfahren mitzwei polarisierbaren Elektroden . Das Verfahren ähnelt alsoeiner üblichen Titration, mit dem Unterschied, daß dasReagenz nicht zugegeben, sondern im Elektrolyten derProbenlösung erzeugt wird . Ein typisches Anwendungsbeispielfür diese heute meist mit Titrierautomaten durchgeführtecoulometrische Technik ist die alkalimetrische Bestimmungvon Kohlenstoff nach Verbrennung zu COZ (111) .

3 .3 Inverse Voltammetrie

19

r z v

Die inverse Voltammetrie gehört zu den nachweisstärkstenMethoden zur Bestimmung einer Reihe von Ionen ("Depolarisa-toren") in wäßriger Lösung . Einer der Gründe für das hoheNachweisvermögen ist die Anreicherung der zu bestimmendenElemente an einer stationären Arbeitselektrode durch Elek-trolyse bei konstantem Potential . Der bei anschließenderWiederauflösung der Elektrolyseprodukte registrierte Stromist bei geeigneter Wahl der Arbeitsparameter proportionalzur Konzentration der betreffenden Ionenart in der Lösung .Die Signale sind peakförmig, da nach primärem Stromanstiegeine zunehmende Verarmung an der Elektrodenoberfläche ein-setzt . Der Spitzenstrom gehorcht bei reversiblen Reaktionenan einer stationären Quecksilber-Tropfenelektrode der vonNICHOLSON (112) abgeleiteten Gleichung :

I= 602 Z3/2 q D1i2 v1/20 .16 D

(0 .4463 +

) 0 .7516

mit I = Peak-Spitzenstrom (A)q = Elektrodenoberfläche (cm2 )D = Diffusionskoeffizient (cm2 " s - 1)v = Spannungsanstiegsrate (V.s -1)c = Depolarisatorkonzentration (mol" cm-3 )r = Tropfenradius (cm)z = pro Formeleinheit umgesetzte Elektronenzahl

Der Ablauf einer inversvoltammetrischen Metallbestimmungist in Abbildung 4 dargestellt .

20

Abb .4 : Stromverlauf bei der inversvoltammetrischenBestimmung von Metallionen (112)

Die Anreicherung beginnt bei to , die Lösung wird beikonstantem Potential bis t1 unter Rühren elektrolysiert .Während der anschließenden "Ruhezeit", in der nicht gerührtwird, verteilen sich die Elektrolyseprodukte homogen imQuecksilber der Mikroelektrode, wobei der Stromfluß starkabfällt . Anschließend wird der für die Elementbestimmunginteressierende Spannungsbereich bis zur Quecksilberauf-lösung durchfahren . Analysengerät ist im einfachsten Fallein Gleichstrom-Polarograph . Bei den leistungsfähigerenVerfahren der differentiellen Puls-Inversvoltammetriewerden den Spannungsrampen zusätzliche Impulse überlagert .Dabei erhält man die für die jeweilige Methode charak-teristischen Voltammogramme .

Das gegenüber der Polarographie stark erhöhte Nachweisver-mögen der inversen Voltammetrie ist, wie erwähnt, auf diehohe Konzentration an angereichertem Depolarisator an derArbeitselektrode zurückzuführen . Das Nachweisvermögen wird

dabei durch Anwendung impulspolarographischer Technikenweiter verbessert : Überlagert man der Gleichspannungsramperechteckförmige Spannungsimpulse, so steigen sowohl Diffu-sions- als auch Kapazitätsstrom bei Anlegen jedes Impulsesstark an ; ausgenutzt wird das unterschiedliche Abklingver-halten von Faraday- und störendem Kapazitätsstrom . Dazumißt man den Strom jeweils am Ende der Impulse und erzieltein verbessertes Verhältnis von Signal zu Untergrund, weilder Faraday-Strom (Signal) langsamer abklingt als derKapazitätsstrom (Untergrund) . Es resultieren Signale, diein ihrer Form Gleichstrom-Polarogrammen ähnlich sind .

Eine weitere Verbesserung des Nachweisvermögens erreichtman durch Anwenden der "differentiellen Puls-Inversvoltam-metrie (DPASV)" zur Ermittlung der Auflösungsströme, einerTechnik, die heute bei der Bestimmung von Schwermetall-spuren das bevorzugte voltammetrische Verfahren ist . DasMeßprinzip ist in Abb .5 dargestellt .

21

DE

Abb .5 : Impulsverlauf und Lage der Meßintervalle bei derdifferentiellen Puls-Inversvoltammetrie (DPASV)

22

Der Strom wird unmittelbar vor Anlegen des Spannungsimpul-ses sowie nach weitgehendem Abklingen des Kapazitätsstromsgemessen . Die Stromdifferenz, aufgetragen gegen das Poten-tial, liefert Voltammogramme mit peakförmigem, weitgehendsymmetrischem Verlauf .

Ähnlich arbeitet auch die Square-Wave-Inversvoltammetrie(SWASV) 2 ) : Die Gleichspannungsrampe wird mit einer recht-eckförmigen Wechselspannung von hoher Frequenz moduliert .Das Meßprinzip ist in Abb .6 dargestellt .

AE = Impulshöhe

AEs = Rampenanstieg

Abb .6 : Impulsverlauf und Lage der Meßintervalle bei derSquare-Wave-Inversvoltammetrie (SWASV)

Gemessen wird jeweils am Ende der Impulse, um auch hier dasunterschiedliche Abklingverhalten von Faraday- und Kapazi-tätsstrom auszunutzen . Analysensignal ist das aus den Dif-ferenzen der Ströme am Ende jeweils zusammengehöriger posi-tiver und negativer Impulse resultierende Voltammogramm .SWASV und DPASV sind sehr ähnliche Meßmethoden ; da dieImpulsfolge der SWASV jedoch wesentlich schneller ist (etwa100 s-1 bei der SWASV gegenüber etwa 1 s-2- bei der DPASV),wird bei reversiblen Redoxsystemen hier ein Faraday-Strom

2) "Square Wave Anodic Stripping Voltammetry"

2 3

auch für die Rückreaktion des Elektrodenprozesses gemessen,und zwar im Meßintervall des "negativen Impulses" . Bei derDPASV wird aufgrund der erheblich längeren Zeitabständezwischen den Impulsen ein Strom für die Rückreaktion rever-sibler Systeme nicht beobachtet, da dieser vor Beginn desnächsten Impulses bereits praktisch auf Null abgefallenist . Hieraus wird ein weiterer Vorteil der SWASV ersicht-lich : Das Verhältnis von Signalen aus reversiblen Reaktio-nen zu denen aus irreversiblen Reaktionen ist bei der SWASVgünstiger als bei der DPASV, hängt jedoch stark von den je-weiligen Meßparametern ab . Reversible Reaktionen, die ihremPotential nach benachbart zu irreversiblen Prozessen ab-laufen, können also mit deutlich verminderten Störungenregistriert werden (113) . Meßsignal bei der SWASV ist derWechselstromanteil des Diffusionsstromes . Aufgrund derhohen Impulsfrequenz ist die Aufnahme von Voltammogrammenmit einem Spannungsvorschub von 200 mV.s-1 möglich . DieDPASV erlaubt im allgemeinen nur 2-5 mV " s -1 . Das Nach-weisvermögen der SWASV für Zn, Cd, Pb und Cu entsprichtetwa dem der DPASV . Zn, Cd, Pb und Cu können durch inverseVoltammetrie in wäßrigen Lösungen simultan bestimmt werden,wenn sie in vergleichbaren Konzentrationen vorliegen . BeiKonzentrationsunterschieden, die zu Signalinterferenzenführen, kann die Bestimmung bei unterschiedlichen Elektro-lysepotentialen und Anreicherungszeiten sequentiell erfol-gen . Der analytisch nutzbare Spannungsbereich beträgt inwäßrigen Lösungen bei Benutzung einer Quecksilber-Arbeits-elektrode etwa -1 .2 V bis +0 .3 V, bezogen auf die gesät-tigte Ag/AgCl-Elektrode . Oberhalb von 0 .3 V wird Quecksil-ber aufgelöst (Hg --> Hg2-'- ), unterhalb von etwa -1 .2 Vwerden, abhängig vom pH-Wert, H -1--Ionen zu Wasserstoffentladen . Die Wasserstoffreduktion kann durch organischeStoffe, insbesondere durch Stickstoffbasen, katalysiert undin einen positiveren Potentialbereich verschoben werden ;der nutzbare Spannungsbereich wird dadurch verringert, dieZink-Bestimmung bei etwa -1 V unter Umständen erschwert .NÜRNBERG (114) gibt dazu den folgenden Mechanismus an :

24

H30+ + RN

-Z- RNH+

+ H20adsorbiert adsorbiert

RNH+

+ e-adsorbiert adsorbiert

RNH

2 RNH

2 RN

+ H2adsorbiert adsorbiert

Stickstoffbasen RN überführen also die sonst nur unter Auf-wendung einer hohen Überspannung an Quecksilber abscheidba-ren H30+-Ionen in das ammoniumanaloge Kation RNH+, das einwesentlich positiveres Entladungspotential hat . Als Depola-risator wirken somit nicht die H30+-, sondern RNH+-Ionen("Katalytische Wasserstoffstufen") . Neben den bereits er-wähnten Störeffekten durch organische Stoffe (siehe Kap .2),die nach oxidativen Abbaureaktionen biologischer Probenma-terialien in der Aufschlußlösung hinterbleiben, werdenzahlreiche weitere Einflüsse oberflächenaktiver und kom-plexierender Verbindungen auf die inversvoltammetrischenSignale der Metallionen beschrieben . Als besonders bei derAnalyse natürlicher Wässer häufig vorkommendes Problem istz .B . die Maskierung von Analyt-Ionen durch organischeKomplexbildner zu nennen . Die komplexierten Elemente sindauf Grund ihres veränderten elektrochemischen Verhaltensnicht mehr erfaßbar oder ihre Signale erscheinen - u .U .gestört - bei anderen Potentialen als die der "freien"Metallionen (115) . Auch oberflächenaktive Stoffe könnenbeträchtliche Störungen bei der inversen Voltammetrie vonMetallionen bewirken . Durch die Adsorption solcher Stoffewird die Oberfläche der Quecksilber-Elektrode mit einemFilm belegt, der eine Depression der Elementsignale verur-sacht (116, 117) .

Schließlich sind Elektrodenreaktionen elektrochemischaktiver organischer Substanzen zu erwähnen, die zu Signalenführen, welche die Voltammogramme interessierender Stoffeüberlagern . Eine Übersicht über derartige Verbindungen, dieaufgrund ihrer elektrochemischen Eigenschaften natürlich

4. Experimenteller Teil

25

auch voltammetrisch bestimmt werden können, findet sich beiZUMAN und PERRIN (118) .

4_1_Auswahl _und_Charakterisierung_der_Probenmaterialien

Für erste orientierende Untersuchungen wurden zwei biolo-gische Materialien von unterschiedlicher Zusammensetzungausgewählt .

Rinderleber als Vertreter für eiweißreiche, jedoch fett-und kohlenhydratarme Materialien tierischer Herkunft .Braunalgen (Fucus vesiculosus) als Vertreter für eiweiß-und fettarme, jedoch kohlenhydratreiche Materialienpflanzlicher Herkunft, die einen hohen Mineralstoffgehaltund einen hohen Silikat-Anteil aufweisen .

Beide Stoffe wurden gefriergetrocknet und gemahlen . DerFettgehalt dieser Materialien ist jeweils gering (zu Unter-suchungen an Fetten siehe Kap .4 .8) . Beide Stoffe wurdenzunächst in ihrer Zusammensetzung charakterisiert . DieSchwermetallbestimmungen (Zn, Cd, Pb und Cu) wurden inmehreren Laboratorien, durch verschiedene Analytiker undmit unabhängigen Verfahren durchgeführt (Voltammetrie,Atomabsorptionsspektrometrie, Atomemmissionsspektrometriemit dem induktiv gekoppelten Plasma, Instrumentelle Neutro-nenaktivierungsanalyse) . Während Kenntnisse über dieSchwermetallgehalte für die Untersuchung von Störungenvoltammetrischer Elementsignale notwendig sind, sind Datenüber die anderen Bestandteile zum Verständnis von Auf-schlußreaktionen von Interesse .

2 6

Algen

Leber

Cd

0 .99

±

0.08

gg" g-1

1 .53

±

0 .05 gg" g- zPb

1 .78 ± 0 .05 gg" g-1

0 .65 ± 0 .05 gg. g-1

Tab .l : Zusammensetzung der untersuchten Probenmaterialien

4_2-Aufschlu2bedin2un2en

4 .2 .1 Druckaufschluß in PTFE-Ge fäßen bis zu 200°C

Die Druckaufschlüsse wurden mit Aufschlußapparaturen"PRAWOL" (Fleischhacker, Schwerte) durchgeführt .

Cu 4 .01Zn 113

t 0 .14± 3

ug " g-~~

9909--L

67 ± 3 11909-3-

125 ± 6 ~Lg. g-1

C 35 .2 % 51 .5N 3 .11 % 11 .5Na 3 .15 % 0 .21 %K 2 .75 % 1 .05 %Ca 1 .34 % 0 .20 %Mg 0 .80 % 0 .06 %C1 3 .05 % 0 .25 %P 0 .32 % 1 .23 %S 2 .42 % 0 .83 %Si 1 .24 % ee 0 .01 %

Eiweiß 18 .7 % 65Fett 2 .5 % 12 .6Kohlenhydrat 53 % 19 .6

apparatur

2 7

4 .2 .1 .1 Beschreibung der verwendeten Druckaufschluß-

Die Druckaufschlußapparatur "PRAWOL" (67) besteht aus einemMagnetheizrührer, auf den ein Aluminium-Heizblock aufge-setzt ist, der mit einer durchgehenden zylindrischen Boh-rung zur Aufnahme der Druckbombe sowie einer Bohrung fürein Kontaktthermometer versehen ist . Das angeschlosseneKontaktthermometer ermöglicht es, die eingestellte Auf-schlußtemperatur konstantzuhalten (Abb .7) .

1 : Kontaktthermometer2 : Verschlußkopf3 : Druckzylinder4 : Heizblock5 : Magnetheizrührer

Abb .7 : Schematischer Aufbau der Druckaufschlußapparatur"PRAWOL"

Die eigentliche Druckvorrichtung ist in Abb .8 dargestellt .Sie setzt sich zusammen aus einem verschließbaren Edel-stahlzylinder mit Bajonettverschluß und Federspannkopf, dieebenfalls aus Edelstahl gefertigt sind . In den Federspann-kopf ist eine Edelstahlfeder eingepaßt, die über einen mit

28

PTFE beschichteten Deckelhalter den PTFE-Deckel auf dasAufschlußgefäß preßt . Diese Feder ermöglicht ein gefahr-loses Abblasen bei zu hohem Innendruck . Die Feder ist so

gewählt, daß bei Innendrucken bis zu 25 bar gearbeitetwerden kann . Das Gerät ist jedoch noch mit einem zweitenSicherheitssystem ausgerüstet . Der Boden des zylindrischenDruckgefäßes besteht aus einer herausnehmbaren Aluminium-scheibe, die als schwächster Punkt des Systems eine Soll-bruchstelle darstellt, falls das durch Deckel und Feder

gebildete Sicherheitssystem versagen sollte . Das eigent-

liche Reaktionsgefäß aus dickwandigem PTFE ist so konstru-

iert, daß es in kaltem Zustand beim Einsetzen in den

Druckzylinder nur auf seinen oberen Rändern aufliegt und

zwischen der Aluminium-Bodenplatte und dem Boden des PTFE-

Gefäßes Spielraum besteht . Auf diese Weise wird sicherge-

stellt, daß das PTFE beim Erwärmen genügend Raum zur Aus-dehnung hat, ein Stauchen des PTFE-Gefäßes also vermiedenwird . Bei den von uns benutzten Gefäßen konnte ein Stauchenauch nach mehr als 200-maligem Gebrauch nicht beobachtet

werden . Da die Bodenplatte aus Aluminium gefertigt ist,kann die Probe während des Aufschlußes mit Hilfe einesPTFE-Magnetrührstäbchens gerührt werden . Der Deckel des Ge-

fäßes besteht ebenfalls aus PTFE . Seine Funktion läßt sich

aus Abb .8 erkennen . Die Abdichtung erfolgt sowohl über dieSeitenflächen des in das Gefäß hineinragenden Teils desDeckels als auch über einen PTFE-Ring, der in den Deckel

eingepaßt ist und der aus einem etwas weicheren PTFE-Mate-

rial besteht als Deckel und Gefäß . Der Austritt von nitro-

sen Gasen wurde, außer beim Abblasen in Folge eines zu

hohen Innendruckes, nicht beobachtet . Für das Gerät sind

Gefäße der Volumina 25, 35 und 45 ml erhältlich . Die Unter-

suchungen dieser Arbeit wurden in 35-ml-Gefäßen durchge-

führt .

2 9

1 : Druckzylinder

9 :2 : Bodenverschluß

10 :3 : PTFE-Becher

11 :4 : PTFE-Rührkern

12 :5 : PTFE-Dichtring

13 :6 : PTFE-Deckel

14 :7 : Deckelhalter

15 :8 : Federlager

16 :

Abb .8 : Druckvorrichtung "PRAWOL"

MantelverschlußkopfDruckfederFederspannkopfVerschlußhebelPTFE-FederklemmeAnschlagstiftPTFE-SchutzbuchseÜberdrucksicherung

4 .2 .1 .2 Hinweise zur Durchführung der Druckaufschlüsse

200 mg Leber bzw . 300 mg Algen (jeweils etwa 100 mg C ent-sprechend) wurden in 35-ml-Gefäßen mit konzentrierter Sal-petersäure aufgeschlossen (69 %ige HN03 ; isotherm destil-liert) .

3 0

Die Aufschlußmischungen wurden nicht gerührt . Die durch dasSystem vorgegebene Aufheizzeit bis zum Erreichen der Auf-schlußtemperatur betrug in allen Fällen 40 min . Die sichdaran anschließende Zeit wird im folgenden mit "Aufschluß-zeit" bezeichnet . Die Säure wurde portionsweise unterSchwenken des Gefäßes zugesetzt, um das trockene Materialgleichmäßig zu benetzen . Hierdurch wird eine Verkohlung derProben vermieden, die zu völlig anderen organischen Rück-ständen führt . Beim Aufschluß von Algen wurde in manchenFällen Flußsäure (40 zig, "Suprapur", Merck, Darmstadt,Art .Nr .335) zum Lösen der enthaltenen Silikate zugegeben .In einigen Versuchen wurden die Lösungen nach dem Aufschlußbei 130°C zur Trockene abgeraucht, um flüchtige organischeStoffe und Stickoxide zu entfernen . Bei Algen-Aufschlüssenunter Flußsäure-Zusatz war dieser Vorgang notwendig, umgebildetes Calciumfluorid und Fluorosilikate zu zerstörenund eine klare Lösung zu erhalten .

4 .2 .2 Hinweise zur Nachbehandlunq organischer Rückständemit Perchlorsäure

Zum weiteren Umsatz organischer Verbindungen, die nachDruckaufschluß mit Salpetersäure im PTFE-Gefäß zurückblei-ben, können die Aufschlußlösungen unmittelbar im offenenPTFE-Gefäß mit Perchlorsäure bei Temperaturen bis zu 200°Cnachbehandelt werden . Diese Nachbehandlung ist weitgehendgefahrlos, da die zurückbleibenden organischen Verbindungenim allgemeinen wenig reaktionsfreudig sind und - verglichenmit der Einwaage - nur noch wenig Material vorhanden ist .Dampft man die Aufschlußlösungen vor der Nachbehandlung mitPerchlorsäure zur Trockene ein, so wird bereits ein be-trächtlicher Teil an organischen Subsanzen verflüchtigt

(siehe auch Kap .4 .6 .1) . Zur Nachbehandlung wurde die Lösungnach Öffnen des PTFE-Gefäßes zum Sieden erhitzt (Heizblock-

temperatur : 130°C) . Nach Ablauf der Aufheizzeit (40 min,vergleiche Kap .4 .2 .1 .2) wurde 70 %ige Perchlorsäure

("Suprapur", Merck, Darmstadt, Art .Nr .517) in die siedendeAufschlußlösung gegeben (vgl . Kap .4 .6 .2) . Leichtflüchtigeorganische Stoffe sind dann bereits aus der Lösung ver-dampft, so daß deren Reaktion mit Perchlorsäure vermiedenwird . Die Probe wurde langsam bei 130°C abgedampft . BeimEntstehen von Perchlorsäure-Nebeln wurde das PTFE-Gefäßsofort mit einem Uhrglas abgedeckt, um ein Entweichen vonSäure zu verhindern . Die anschließende Nachbehandlung wurdeunter verschiedenen Bedingungen (Temperatur, Zeit, Säurezu-satz) durchgeführt .

Es zeigte sich, daß diese Art der Nachbehandlung unter be-stimmten Bedingungen zu nur wenig reproduzierbaren orga-nischen Restgehalten führt . Sowohl bei der Nachbehandlungvon Algen als auch von Leber (180°C, 3h) wurden in Paral-lelversuchen Streuungen im Restkohlenstoffgehalt bis um denFaktor 2 gemessen, wie das folgende Beispiel belegt :

Algen, Restkohlenstoffgehalte 0 .08 - 0 .17 % CMittelwert : 0 .118 % CAnzahl der Aufschlüsse : 15Anzahl der Bestimmungen pro Aufschluß : 3s : 0 .033 % Cs r : 0 .28

Zur Erklärung wird angenommen, daß beim Abdampfen derDruckaufschlußlösung ein einziger Tropfen verbleibt, in dempraktisch die gesamten Probenbestandteile gelöst oder insuspendierter Form vorliegen . Die Güte der Nachbehandlunghängt nun davon ab, ob dieser Rückstand auf dem planen Bo-den des Gefäßes von der vom Uhrglas abtropfenden Perchlor-säure "getroffen" wird oder nicht . Ist dies nicht der Fall,so verdampft die geringe Menge an eingesetzter Perchlor-säure erneut, ohne mit dem Probenmaterial in Berührung ge-kommen zu sein . Die Folge ist ein unvollständigerer Umsatzdes organischen Materials .

3 1

4 .2 .3 .1 Apparatur

3 2

Für den Druckaufschluß mit Perchlorsäure-Nachbehandlungwurden daher PTFE-Gefäße angefertigt, bei denen der Bodenkonvex ausgedreht wurde, ohne das Gesamtvolumen zu verän-dern . Das Abtropfen der kondensierten Säure wurde durchAnbringen einer Glasspitze an der Unterseite der Uhrgläsererleichtert, um die Menge an Perchlorsäure so gering wiemöglich zu halten . An der Außenseite der Uhrgläser wurdenzur einfachen und kontaminationsfreien Handhabung kurzeGlasstäbe angeschmolzen . Unter den veränderten Bedingungenwurde die Reproduzierbarkeit der Nachbehandlung erheblichverbessert (vgl . Kap .4 .6 .2) . Die modifizierte Gefäßform hatauf das Ergebnis des Salpetersäure-Druckaufschlusses keinenmeßbaren Einfluß .

4 .2 .3 Druckaufschluß bei Temperaturen bis zu 300°C

Die speziell für diese Experimente angefertigte Aufschluß-apparatur ermöglicht Druckaufschlüsse bei Temperaturen auchoberhalb von 200°C, bei denen PTFE aufgrund seines Fließ-verhaltens nicht mehr eingesetzt werden kann . Das Druckge-fäß ist in Abbildung 9 dargestellt .

Das aus V4A-Stahl gefertigte und mitringes abgedichtete Druckgefäß kannWandstärke 2,2 mm, Außendurchmesser4 .6 ml, Länge nach Abschmelzen 93 -den . Duran als Werkstoff ist zur Bestimmung des Restkohlen-stoffgehaltes brauchbar, für Schwermetalluntersuchungenmüssen jedoch entsprechend dimensionierte Quarzampulleneingesetzt werden, um Kontaminationen zu vermeiden .Ampullen wurden jeweils mit PTFE-Band umwickelt, umhindern, daß sie sich beim Aufheizen infolge der Ausdehnungdes Stahls verkanten . In das Druckgefäß wurden 25 ml Wasser

Hilfe eines Kupfer-mit 6 Ampullen (Duran,13 mm, Volumen 4 .2 -98 mm) beschickt wer-

Diezu ver-

~- 60 mm

3 3

Verschlußschraube, insges . 8 Stück

Kupferdichtung

Bohrung zur Aufnahme desThermoelementes

Abb .9 : Druckgefäß zur Durchführung von Aufschlüssen inabgeschmolzenen Ampullen

gegeben, um den im Inneren der Ampullen entstehenden Druckzu kompensieren . Die Temperatur wurde mit einem in dieBohrung des T-förmigen Deckels eingeführten Thermoelementsunterhalb der Wasseroberfläche gemessen . Die Meßstelleliegt dabei so weit im Inneren des Gefäßes, daß die gemes-senen Werte die tatsächliche mittlere Temperatur im Gefäßgut wiedergeben sollten . Die Aufschlüsse erfolgten im Be-reich zwischen 180 und 300°C . Dazu wurde das Druckgefäß ineinen ähnlich Abb .7 konstruierten und vorgeheizten Blockeingesetzt . Für die Temperaturvorgabe und -regelung wurdeein Kontaktthermometer verwendet . Die Aufheizzeit desSystems liegt bei 20 min und ist praktisch unabhängig vonder vorgegebenen Aufschlußtemperatur .

Das System wurde aus Sicherheitsgründen in einer für Druck-aufschlüsse vorgesehenen Betonbox (119) im Freien betrie-ben . Das Aufschlußgefäß kann mit einem Seil durch eineBohrung im Dach der Box aus dem Heizblock gezogen werden .Durch Fixieren des Seilendes an einem außen angebrachten

3 4

Haken wurde das heiße Druckgefäß jeweils vor einen Ventila-tor gehängt, der oberhalb des Heizblocks im Inneren der Boxmontiert ist und von außen eingeschaltet werden kann . Aufdiese Weise läßt sich das Druckgefäß innerhalb von 20 minabkühlen . Die Box kann dann geöffnet und das abgekühlteDruckgefäß gefahrlos entnommen werden . Die Innentemperaturdes Gefäßes wurde mit einem Thermoelement gemessen und imLabor registriert . Auf diese Weise können sowohl der Tempe-raturverlauf als auch die Dichtigkeit des Systems ständiggefahrlos kontrolliert werden : Bei plötzlich auftretenderUndichtigkeit sinkt die Tempertur im Drucksystem stark ab,da das eingefüllte Wasser verdampft . In diesem Fall wirddas Heizsystem von außen abgeschaltet .

Bei 300°C betragen die Dampfdrucke für Wasser 87 .6 bar(120) sowie für 69 %ige Salpetersäure 65 bar (120) . Demnachkönnen die Ampullen von außen maximal mit einem Überdruckvon 22,6 bar belastet sein, wenn sie mit 69 Eiger Salpeter-säure beschickt sind . Je verdünnter die Säure ist, destohöher wird der Innendruck, bis bei Beschickung mit Wasserkeine Druckunterschiede an der Ampulle mehr vorhanden sind .Glasrohre, aus denen die Ampullen gefertigt sind, halteneinem Außendruck von mehr als 500 bar (!) stand (121), dermaximal mögliche Innendruck liegt jedoch nur bei 25 bar(122) .

Bei den in dieser Arbeit eingesetzten Probenmengen ist derdurch Salpetersäure und Wasser aufgebaute Dampfdruck injedem Fall höher als der Druck der durch die Reaktion ent-stehenden Gase C02 und NO. . Der Gesamtdruck wird also über-wiegend durch die Dampfdrucke der Flüssigkeiten bestimmt .

4 .2 . 3 .2 - .-Aufschluß

3 5

Die Proben wurden durch Differenzwägung mit Hilfe einesMikrospatels mit Genauigkeiten von ± 0 .1 mg eingewogen undin die Ampullen überführt . Die Einwaagen betrugen jeweilsfür Leber 20 .0 ± 0 .2 mg, für Algen 30 .0 ± 0 .2 mg . NachZugabe von 200 ul 69 Eiger Salpetersäure (siehe auch Kap .4 .6 .1) wurden die Ampullen abgeschmolzen und die Probenaufgeschlossen . Nach dem Probenaufschluß können die abge-kühlten Ampullen folgendermaßen geöffnet werden :

1 . Ampullen aus Duran :a) Nach Reduzierung des Innendrucks durch Abkühlen mit

flüssigem Stickstoff .Bei -196°C liegen alle Reaktionsprodukte in fester Formvor . Wird der gesamte organische Kohlenstoff nach derformalen (S) Reaktionsgleichung 3 "C" + 4 HN033 CO2 + 4 NO + 2 H2O umgesetzt, so herrscht im Innerender Ampulle - ideales Verhalten der Gase und Dämpfevorausgesetzt - bei 25°C und 4 .2 ml Volumen ein Druckvon 12 bar .

b) Durch Anritzen der Ampulle und Sprengen mit einem in derFlamme des Bunsenbrenners erhitzten Glasstab .

2 . Ampullen aus Quarz :Durch Abkühlen mit Stickstoff und Brechen an einer vor-verjüngten Stelle in der Ampullenmitte nach Anritzen miteinem Glasschneidemesser .

Die Probe wird nach Erwärmen auf Raumtemperatur mit Wasserin einen kleinen Meßkolben oder direkt in eine Meßzelle zurvoltammetrischen Metallbestimmung überführt . Zur Bestimmungdes Restkohlenstoffgehaltes wird sie quantitativ mit Wasserin ein Verbrennungsschiffchen (vgl . Kap .4 .3 .1) gefüllt .

3 6

4 .3 Behandlun der auf eschlossenen Proben

4 .3 .1 Kohlenstoffbestimmung

4 .3 .1 .1 Kohlenstoffbestimmung nach Abrauchen der Säure

Nach Öffnen der abgekühlten PTFE-Druckaufschlußgefäße wurdedie Aufschlußmischung mit Wasser (Wasseraufbereitung :Milli-RO-15-System mit Aufreinigungsanlage Milli-Q ; Milli-pore, Bedford, USA) zu 10 .0 ml ergänzt .

Alternativ dazu wurde folgendermaßen verfahren : Nach Öffnender Druckgefäße wurde bei 130°C zur Trockene eingedampft .Dabei verdampfen die Stickoxide, flüchtige organische Ver-bindungen sowie Wasser und Salpetersäure . Bei Aufschlüssenunter Zusatz von Flußsäure werden so auch entstandeneschwerlösliche Fluoride und überschüssige Flußsäure ent-fernt . Die Rückstände wurden in beiden Fällen mit je 0 .5 ml69 Eiger Salpetersäure und mit Wasser zu 10 .0 ml aufgenom-men . Es ergaben sich ausnahmslos klare, rückstandsfreieLösungen .

Einschließlich 40 min Aufheizzeit bis auf 130°C dauerte dergesamte Vorgang etwa 2 h . Es ist nicht sinnvoll, bei höhe-ren Temperaturen abzurauchen, da die Proben dann teilweiseverspritzen . Im Anschluß an Perchlorsäure-Nachbehandlungenwurde nicht abgeraucht . Die verbleibende Perchlorsäure unddarin enthaltene Probenbestandteile wurden mit Wasser zu10 .0 ml gelöst . Aus diesen Lösungen wurden je 0 .5 ml ent-nommen und in Porzellan-Verbrennungsschiffchen (zuvor bei1000°C ausgeglüht) überführt . Aus den nach Perchlorsäure-Behandlung erhaltenen Lösungen wurde mit Rücksicht auf diezu erwartenden geringen Kohlenstoffgehalte je 1 .0 ml ent-nommen . Nach Aufschlüssen in Glas- und Quarzampullen wurdendie erhaltenen Lösungen jeweils quantitativ mit Wasser inPorzellanschiffchen überführt . Die zur Kohlenstoffbestim-mung benutzte coulometrische Titration basiert auf der pH-

3 7

Änderung einer wäßrigen Lösung nach Einleiten des bei derVerbrennung gebildeten CO2 . Um Störungen zu vermeiden, müs-sen Säurereste aus den Aufschlußlösungen entfernt werden .Die Lösungen wurden dazu auf einer Heizplatte (160 ± 1°COberflächentemperatur ; effektive Temperatur im Inneren desSchiffchens 130 ± 5°C) zur Trockene abgeraucht . Da dieseTemperatur bei perchlorsäurehaltigen Lösungen nicht aus-reicht, wurde folgendermaßen verfahren : Um die in 1-ml-Ali-quoten der aufgefüllten Aufschlußlösungen enthaltenen etwa0 .02 ml 70 %ige Perchlorsäure zu entfernen, wurde Natrium-chlorid-Lösung im Überschuß zugesetzt (27 mg NaC1) . Dienach HCl04 + NaC1 - -- NaC104 + HC1 entstehende Salzsäurewird bei 130°C vollständig aus der Lösung verdampft . Dasgleichzeitig gebildete Natriumperchlorat und das überschüs-sige Natriumchlorid stören die Kohlenstoffbestimmung nicht,da bei der Verbrennung dieser Stoffe keine sauer reagieren-den Gase entstehen .

4 .3 .1 .2 Bestimmung von organisch gebundenem Kohlenstoffin sauren Aufschlußlösungen

Bei dem in Kap .4 .3 .1 .1 beschriebenen Verfahren wird nurderjenige Kohlenstoffanteil erfaßt, der in Form organischerVerbindungen vorliegt, die bei 130°C noch nicht flüchtigsind . Die Werte, die nach Abrauchen bei 130°C erhaltenwerden, geben den tatsächlichen Kohlenstoffgehalt beiAlgen-Aufschlußlösungen wieder, wenn, wie beschrieben,schwerlösliche Fluoride durch Abrauchen zersetzt wordensind . Nicht abgerauchte Aufschlußlösungen enthalten ver-mutlich noch flüchtige organische Verbindungen . Auch beider Perchlorsäure-Nachbehandlung (vgl . Kap .4 .2 .2) könnenleicht flüchtige organische Spezies gebildet werden, dieaber - zumindest teilweise - am Uhrglas kondensieren undzurück in die Lösung gelangen .

3 8

Zur Erfassung des Gesamtkohlenstoffgehaltes von Aufschluß-lösungen ist die Oxidation unter UV-Bestrahlung geeignet,analog zur Bestimmung des gelösten organischen Kohlenstoffsin Wässern (123) . Dazu werden 250 ml Wasser unter Zusatzvon Kaliumperoxodisulfat und Kupfer-(II)-sulfat bei pH 2-3unter Einleiten von gereinigtem Sauerstoff mit Hilfe einerQuecksilber-Niederdruck-Tauchlampe (Gräntzel, Karlsruhe) imUV-Bereich 180 - 240 nm bestrahlt . Die Lösung wird währendder Bestrahlung auf 40°C thermostatisiert und kräftig ge-rührt .

Organische Verbindungen werden zu CO2 oxidiert, das mitSauerstoff aus der Lösung ausgetrieben und coulometrischtitriert wird . Diese "Naßverbrennung" gelingt bei einerVielzahl organischer Stoffe (123) . Aliquote Teile von Auf-schlußlösungen lassen sich analog vermessen, wenn man siemit Wasser auf 250 ml verdünnt . Störende Gase, wie CO2-Eigengehalte des verwendeten Wassers oder Stickoxide in derAufschlußlösung, werden vor Einschalten der UV-Lampe ausge-trieben . Während der Bestrahlung wurde eine Neubildung stö-render Gase nicht mehr beobachtet . Die mit der Aufschlußlö-sung eingebrachten Anteile an Salpeter- bzw . Perchlorsäurehaben keinen Einfluß auf die Reaktionszeiten und Meßergeb-nisse . Dies wurde an Glucose-Lösungen mit bekannten C-Ge-halten unter Zusatz von Salpeter- bzw . Perchlorsäure unter-sucht . Die Reaktionszeit für die vollständige Oxidation derhier untersuchten Proben beträgt 7 min, die Gesamtdauereiner Analyse 12 min . Die Vollständigkeit der UV-Oxidationwurde anhand definierter Glucose-Zusätze sichergestellt .Überprüft wurde auch, daß zumindest die schwerflüchtigenorganischen Anteile der Aufschlußrückstände zu CO2 umge-setzt werden (vgl . Kap .4 .6) .

3 9

Arbeitszyklus :1 . Probe in den Einfülltrichter geben ;2 . 5 ml Reaktionsbeschleuniger zusetzen 3 ) ;3 . 0 .15 ml konzentrierte Schwefelsäure ("Suprapur",

Darmstadt, Art .Nr .714) zusetzen ;4 . Mischung mit 250 ml Wasser in die Reaktionszelle5 . Gelöste Gase mit Sauerstoff unter Rühren austreiben ;6 . Einschalten der UV-Lampe ; Messung des Kohlenstoff-

gehaltes ;7 . Ausschalten der Lampe ; Ablassen der Lösung .

4 .3 .2 Voltammetrie

3 )Reaktionsbeschleuniger : 50 g CuS04 " 5 H2O und 33 gK2S20e (zur Analyse, (Merck, Darmstadt, Art .Nr .2790und 5091) werden mit Wasser zu 1 1 gelöst .

Merck,

spülen ;

Für die voltammetrischen Untersuchungen wurden von den zu10 .0 ml aufgefüllten Aufschlußlösungen jeweils 1 .0 ml ent-nommen und mit 5 .0 ml Wasser in eine voltammetrische Meß-zelle gegeben . So konnte sichergestellt werden, daß bei derAnalyse eines der Probenmaterialien jeweils Lösungen glei-cher Metallionenkonzentrationen in der Meßzelle vorlagen,deren Voltammogramme unmittelbar miteinander verglichenwerden konnten . Zusätzlich wurden 20 mg Leber in Ampullenaufgeschlossen . Um auch hier die den übrigen Leber-Auf-schlußlösungen entsprechenden Metallionenkonzentrationen zuerhalten, wurde der Inhalt einer Ampulle mit wenig Wasserin einen Quarztiegel überführt, bei 130°C zur Trockene ein-geengt und mit 0 .05 ml Salpetersäure sowie 5 .95 ml Wassermit Hilfe einer Pipette in die Meßzelle gespült .

4 0

4_4__Coulometrische_Kohlenstoffbestimmun2

Das durch Verbrennung oder durch photolytische Oxidationder organischen Stoffe gebildete Kohlendioxid wurde coulo-metrisch titriert (Coulomat Modell 702, Ströhlein, Kaarst) .

Abb .10 gibt schematisch Aufbau und Funktion der Verbren-nungseinrichtung wieder (124) . Der aus einer Druckgas-flasche entnommene Sauerstoff wird zunächst zur Reinigungdurch 3 Absorptionsrohre geleitet . Wasser wird an Kalium-hydroxid (Nr .l), organische Verbindungen werden an Aktiv-kohle (Nr .2) gebunden . Im dritten Absorptionsrohr wird CO2an Natronasbest (Nr .3) gebunden . Der so vorgereinigteSauerstoffstrom passiert ein Verbrennungsrohr (Nr .4), des-sen Temperatur mit der eines entsprechenden Rohres für dieProben übereinstimmt, da sich beide Rohre im gleichen Ofen(Nr .6) befinden . Hier werden organische Verunreinigungen,die an Aktivkohle nicht adsorbiert werden können, ver-brannt . Entstehendes Kohlenmonoxid wird am Platindrahtnetz(Nr .5) zu Kohlendioxid oxidiert . Dieses wird anschließendan Natronasbest gebunden (Nr .7) .

Der so gereinigte Sauerstoffstrom gelangt über eine Gas-schleuse (Nr .8) in das Probenverbrennungsrohr (Nr .9) . Etwa90 % des Sauerstoffs strömen hier nach außen, wodurch dasVerbrennungsrohr gegen eindringende Luft geschützt wird .Der restliche Sauerstoff wird von einer Pumpe (Nr .14) an-gesaugt . Die zu analysierenden Proben werden über die Gas-schleuse in die Reaktionszone geschoben, in der die orga-nischen Substanzen bei 1300°C verbrennen . Dabei entstehtneben CO2 auch CO, da bei dieser Temperatur das Gleichge-wicht bezüglich der Reaktion C + CO2 ' 2 CO weitgehendauf Seiten des CO liegt . Die Ofentemperatur ist bis 1400°Cregelbar und kann somit an andere Analysenprobleme angepaßtwerden . Die Verbrennungsgase passieren bei 400°C einenKontaktofen mit Silberwolle (Nr .10) . Hier werden Halogeneund Halogenwasserstoffe als Silberhalogenide gebunden . Das

4 1

Abb .10 : Verbrennungseinrichtung zum Coulomaten

vorhandene CO wird anschließend an einem Platindrahtnetz(Nr .ll) bei 700°C zu COZ oxidiert . Schwefeloxide werden alsSchwefelsäure an Perhydrit (Nr .13), Stickoxide an verschie-denen Absorptionsmitteln (vgl . weiter unter) gebunden .

10

1 : Kaliumhydroxid

9 : Verbrennungsrohr (Probe)

6 : Ofeneinheit

14 . Ansaugpumpe7 : Natronasbest

15 : Teilerpumpe8 : Probeneinlaßöffnung

Über die bereits erwähnte Pumpe (Nr .14) gelangt der Gas-strom in die Meßzelle . Die Ansaugleistung der Pumpe beträgt368 ml/min . Alternativ können aus dem Gasstrom mit Hilfeeiner Gasteilerpumpe exakt 90 % des Gasstroms abgepumptwerden, so daß nur 10 % davon in die Meßzelle gelangen .Dies ist bei hohen Kohlenstoffgehalten der Proben sinnvoll,um die Analysenzeit zu verkürzen und den Verbrauch derAbsorptionslösung zu verringern . Probleme machte dieAbsorption bei der Verbrennung gebildeter Stickoxide . Diese

2 : Aktivkohle3 : Natronasbest

10 : Silberwolle (400°C)11 : Platindrahtnetz (700°C)

4 : Verbrennungsrohr 12 : Absorptionsvorrichtungen(Gasreinigung) für NO.

5 : Platindrahtnetz 13 : Perhydrit

4 2

entstehen aus Metallnitraten und führen, wenn sie in dieMeßzelle gelangen, wie alle sauren Gase zur pH-Änderung undsomit zur Vortäuschung von C02 . Organische Stoffe, auchNitroverbindungen, verbrennen hingegen nicht unter Bildungvon Stickoxiden, sondern liefern ausschließlich elementarenStickstoff . In diesem Zusammenhang war die Frage zu klären,welche Aufschlußrückstände Nitrat enthalten und ggf . i nwelchen Mengen . Bei der Bilanzierung geht man davon aus,daß die im Aufschluß vorhandenen Kationen Na-'- , K-1- , Ca 2-1- undMg 2+ beim Eindampfen zunächst in die schwerflüchtigen Sul-fate und Phosphate überführt werden ; nur die überschüssigverbleibenden Kationenanteile bilden Nitrate . Sulfate undPhosphate sind dabei die Reaktionsprodukte organischer bzw .anorganischer Schwefel- und Phosphorverbindungen im Auf-schlußprozeß (vgl . Kap .4 .11) . Die Zuordnung der äquimolarenIonenanteile ergab, daß bei Leberproben allein der Sulfat-Anteil ausreicht, um alle Kationen als Sulfat zu binden, imFalle der Algen kann jedoch nur etwa die Hälfte der Katio-nen als Sulfat und Phosphat gebunden werden . Dampft man dieLösungen zur Trockene ein, so enthält der Leber-Rückstandkeine Nitrate, bei Algen sind jedoch etwa 50 % der Kationenan Nitrat gebunden . Stickoxide entstehen folglich bei derVerbrennung der Aufschlußrückstände von Algen, nicht aberbei denen der Leber .

Diese Bilanz kann leicht aus den Analysenergebnissen (sieheSeite 26) erstellt werden (zur Bildung von Sulfat und Phos-phat : vgl . Kap .4 .11) . Ebenso konnte gezeigt werden, daßnach dem Abrauchen kein Chlorid mehr vorhanden ist, daSalzsäure noch leichter flüchtig ist als Salpetersäure .Chlorid spielt also in der Bilanz keine Rolle .

Die Absorption von Stickoxiden aus einem CO2-haltigenSauerstoffstrom erfolgt zweckmäßig an mit Wasserdampf beiRaumtemperatur gesättigtem, aktiviertem Mangandioxid(Merck, Darmstadt, Art .Nr .5953) unter Bildung von Mangan-nitrat (125) . Dieses Verfahren wurde bereits ausführlich

4 3

beschrieben (2.2) ; in der Vorschrift der zitierten Arbeitreicht das Absorptionsvermögen des Mangandioxids für diehohen Stickoxid-Anteile aus Algen-Rückständen jedoch nichtaus . Lediglich etwa 95 % der Stickoxide können aus demTrägergasstrom abgetrennt werden . Eine Verbesserung wurdenun dadurch erreicht, daß dem Mangandioxid eine mit 80 mlPufferlösung von pH 5 beschickte 100-ml-Gaswaschflasche mitFritte vorgeschaltet wurde, in der bereits 80 % der Stick-oxide absorbiert werden, ohne daß COZ zurückgehalten wird .Bei diesem Verfahren bleibt das Mangandioxid stets feucht,was wichtig ist, da sein Absorptionsvermögen für NO. beimAustrocknen, wie es in einem nicht angefeuchteten Sauer-stoffstrom geschieht, schnell nachläßt, gleichzeitig aberCO2 festgehalten wird (126,127) . Mit Pufferlösung undMangandioxid wurden insgesamt etwa 98 % der entstehendenStickoxide absorbiert . Aus dem ionenchromatographischermittelten Nitratgehalt der Algen-Rückstände wurde dernicht absorbierte Stickoxidanteil durch Kalibrieren mitKaliumnitrat ("zur Analyse", Merck, Darmstadt, Art .Nr .5063)ermittelt und am Analysenergebnis korrigiert . Die Präzisiondes Gesamtverfahrens wird dadurch nicht meßbar verschlech-tert (vgl . Kap .4 .6 .1) .

Nach Perchlorsäure-Aufschlüssen ist eine Stickoxid-Absorp-tion nicht erforderlich, weil beim Abrauchen alles Nitratin Form flüchtiger Salpetersäure entfernt wird . Bei Algenwird der als Nitrat vorliegende Metallionenanteil dabei inPerchlorat überführt, was rechnerisch einen Mehrverbrauchvon etwa 50 gl 70 Skiger Perchlorsäure erfordert . Bei derNachbehandlung von Algen-Rückständen muß demnach etwas mehrPerchlorsäure als bei Leber eingesetzt werden, um einenoptimalen Umsatz der organischen Verbindungen zu erzielen(siehe auch Kap .4 .6 .2) .

4 4

Die Nachweisgrenze für die coulometrische Kohlenstoffbe-stimmung beträgt m.-- = 2 .4 gg C . Der Ermittlung wurdefolgende Definition zugrundegelegt :

x

=

T6.

-f-3

sx,

Mit : x = Meßwert an der Nachweisgrenzex,, = mittlerer Blindwertm. = Kohlenstoffmasse an der Nachweisgrenzesb = Schätzwert der Standardabweichung der

Blindwerte

Die Garantiegrenze für Reinheit bezüglich des Restkohlen-stoffgehaltes von Aufschlußrückständen wurde analog unterBerücksichtigung der Einwaagen und Aliquotierungsfaktorenaus G = x,, + 6 sb berechnet (128) .

Arbeitsvorschrift zur coulometrischen C02-Titration

Der Trägergasstrom, der neben Sauerstoff nur noch das zu

chloratlösung gefüllt ist, sowie dem Anodenraum (Nr .2), derdie gleiche Lösung sowie einen Bodenkörper aus Bariumcarbo-nat enthält . Beide Räume sind durch ein Diaphragma (Nr .3)voneinander getrennt . Zur Indikation des Titrationsendpunk-tes sowie zur Kontrolle des pH-Arbeitspunktes dient einepH-Einstabmeßkette (Nr .4) . Anode (Nr .5) und Kathode (Nr .6)sind Platinbleche . Der pH-Wert der Absorptionslösung imKathodenraum wird so eingestellt, daß sowohl eine vollstän-dige Absorption als auch eine genügend empfindliche Bestim-mung des eingeleiteten CO2 ermöglicht wird . Beide Effektesind gegenläufig : Bei steigendem pH-Wert wird die Absorp-tion des CO2 zwar begünstigt, gleichzeitig nimmt die

bestimmende CO2 enthält, wird in die coulometrische Meß-zelle geleitet (Abb .ll) (124) . Sie besteht aus dem Katho-denraum (Nr .l), der mit einer 15 eigen wäßrigen Bariumper-

Empfindlichkeit jedoch ab . Der pH-Arbeitspunkt ist also einKompromiß ; er liegt bei pH 10 ± 0 .1 . Dieser Wert wird zuBeginn eines Arbeitstages eingestellt, indem durch Elektro-lyse H+- bzw . OH--Ionen erzeugt werden, je nachdem, ob dieAbsorptionslösung zu sauer oder zu alkalisch ist .

4 5

1 : Kathodenraum

6 : Kathode2 : Anodenraum

7 : Gaseinleitungsrohr3 : Diaphragma

8 : Rührer4 : pH-Meßkette

9 : Gasaustrittsrohr5 : Anode

10 : Glasmantel

Abb .11 : Meßzelle zur coulometrischen Titration von CO2

Wichtig ist, daß der einmal eingestellte pH-Wert konstant-gehalten wird . Dazu wird der gesamte Kathodenraum auf 36°Cgehalten, was durch Zufuhr von thermostatisiertem Wasser ineinem Glasmantel (Nr .10) erfolgt .

46

Der Gasstrom gelangt über das Gaseinleitungsrohr (Nr .7) indie Absorptionslösung und wird durch einen Rührer (Nr .8) infeine Bläschen zerteilt, um eine vollständige Absorptiondes CO2 sicherzustellen . Der überschüssige Sauerstoff ge-langt über das Austrittsrohr (Nr .9) nach außen .

Vor jeder Kohlenstoffbestimmung muß zunächst die Verbren-nungszeit über einen Zeitgeber eingestellt werden . Diesevom Analysenproblem abhängende Zeit ist so auszuwählen, daßin der jeweiligen Probe eine vollständige Umsetzung desKohlenstoffs zu CO2 gewährleistet ist . Nach Ablauf der Ver-brennungszeit beginnt die Titration des absorbiertenKohlendioxides in der gemäß Gleichung 1 zu niedrigeren pH-Werten veränderten Lösung .

Ba 2+ + CO2 + 2 OH-

BaC03 + H20

Es wird solange elektrolysiert, bis der Ausgangs-pH-Wertwieder erreicht ist . Dabei laufen folgende Reaktionen ab :

+2eAn der Kathode :

2 H2O ,-- H2 + 2 OH-(2)

Durch die coulometrisch gebildeten OH- -Ionen wird der pH-Wert wieder ins Alkalische zurückverschoben .

-4eAn der Anode : 2 H2O

4 H+ + 02

(3)

4 H+ + 2 BaC03

-2,

2 Ba2-4- +

2 H20 +

2 C02

(4)

Die erforderlichen Titrationsströme können vorgewähltwerden . Dazu ist das Gerät mit zwei Meßeinschüben ausge-stattet, von denen einer mit Stromstärken von 10-300 mA,der andere mit Werten von 1-30 mA arbeitet . Die Wahl desEinschubs richtet sich nach der zu bestimmenden CO2-Menge .

Zur Ladungsermittlung wird ein Integrationsmotor in einedem Elektrolysestrom proportionale Umdrehungsgeschwindig-

4 7

keit gebracht ; die Drehzahl wird mit Hilfe einer Lochschei-be in elektrische Impulse überführt, die digital angezeigtwerden . Für die Umrechnung auf den Kohlenstoffgehalt gilt :

- "Feiner Einschub" : 1 Digit = 20 ng Kohlenstoff- "Grober Einschub" : 1 Digit = 200 ng Kohlenstoff .

Diese Werte gelten, wenn ohne Teilerpumpe gearbeitet wird ;werden Anteile des Gasstromes verworfen, so nimmt dieEmpfindlichkeit proportional dazu ab . Jeder Einschub ver-fügt über 3 Stromstufen . Der Titrationsstrom wird selbstä-tig vorgewählt ; er richtet sich nach der eingeleiteten C02-Menge . Gegen Titrationsende kommt aber in jedem Fall dieFeinstufe zum Einsatz, um Übertitrieren zu vermeiden . Eineständige Kalibrierung des Verfahrens ist zwar nicht nötig,es empfiehlt sich jedoch, gelegentlich die Richtigkeit derBestimmung durch Analyse von Materialien mit bekanntemKohlenstoffgehalt zu kontrollieren .

4 .5 Voltammetrische Me verfahren

Die voltammetrischen Messungen wurden mit dem "Polaro-graphic Analyzer" Modell 384 B sowie der Elektrode Modell303A (stationäre und tropfende Quecksilberelektrode) durch-geführt (EG&G, Princeton Applied Research, Princeton, USA) .Als Bezugselektrode diente eine gesättigte Silber/Silber-chlorid-Elektrode .

Folgende Meßbedingungen wurden gewählt :

Square-Wave-Voltammetrie, invers (SWASV) :Spannungsvorschub : 200 mV s - -LImpulsfrequenz : 100 s-1Impulshöhe : 20 mVStufenhöhe : 2 mV

Spannungsvorschub : 5 mV s -1Impulshöhe : 50 mVImpulsabstand : 0 .4 s

Für beide Verfahren :

4 8

Differentielle Pulsvoltammetrie, invers (DPASV) :

Spülen der Meßlösung mit Argon, 1 min

Anreicherungspotentiale :Zn : -1 .2 VCd, Pb, Cu : -0 .75 V

Anreicherungszeiten :Algen-Aufschlußlösungen : Zn 10 s

Cd, Pb, Cu 180 sLeber-Aufschlußlösungen : Zn 10 s

Cd, Pb 180 sCu 10 s

Beruhigungszeit nach der Anreicherung : 5 s

4_6_Untersuchungen_zur -Kohlenstoffbilanz

4 .6 .1 Druckauf schluß bei Temperaturen bis zu 200°C

200 mg Leber bzw . 300 mg Algen wurden im 35-ml-PTFE-Gefäß

aufgeschlossen . Folgende optimale Bedingungen bezüglich des

Kohlenstoffumsatzes wurden ermittelt :

Temperatur : 180°CAufschlußzeit : 3 hSäure : Algen : 1 .5 ml 69 %ige Salpetersäure

Leber : 2 .0 ml 69 %ige Salpetersäure

4 9

Bei Erhöhung der Parameterwerte (Temperatur bis auf 200OC,Aufschlußzeit bis auf 24 h, Säuremenge bis auf 5 ml) wirdder Aufschluß bezüglich des Kohlenstoffumsatzes nicht nen-nenswert weiter verbessert . Die Einflußdiagramme sind denin (22,23) dargestellten Abhängigkeiten ähnlich . Interes-sant ist hier besonders der Einfluß der Temperatur auf denRestkohlenstoffgehalt4 ) der bei 130°C abgedampften Auf-schlußlösungen (Abb .12) .

Unter den oben angegebenen Bedingungen erhält man für Algeneinen RKG-Wert von 1 .10 %, für Leber einen Wert von 3 .6 % .Verzichtet man auf das Eindampfen der Aufschlußlösung, soerhält man 2 .6 % RKG für Algen, sowie 6 .6 % RKG für Leber .Die Werte belegen, daß ein wesentlicher Teil der nachDruckaufschluß vorliegenden organischen Verbindungen bei130°C flüchtig ist . Ferner fällt auf, daß der Druckauf-schluß für Algen vollständiger abläuft als der für Leber,wobei das Verhältnis der Kohlenstoffanteile in leicht-flüchtigen und in schwerflüchtigen Verbindungen in beidenFällen etwa gleich ist . Die resultierenden Aufschlußlö-sungen sind praktisch farblos und klar, bei Algen bleibtlediglich ungelöstes Silikat zurück .

Um Algen vollständig in Lösung zu bringen, müssen vor demDruckaufschluß neben 1 .5 ml HN03 mindestens 0 .15 ml 40 %igeFlußsäure zugesetzt werden . Zur Zerstörung des ausfallendenCalciumfluorids und zur Entfernung überschüssiger Flußsäurewurde nach dem Aufschluß bei 130°C zur Trockene eingeengt,wobei zur vollständigen Abtrennung der Fluorverbindungenvor dem Abrauchen weitere 1 .0 ml 69 %ige Salpetersäure zu-gesetzt wurden .

4)

Kohlenstoff im RückstandRestkohlenstoffgehalt =

100 %,Kohlenstoff in der Einwaage

im folgenden mit RKG abgekürzt .

b

0

43

an44440

N

w

4-3

0xN

a

4 .3

5 0

Temperatur (°C)

Abb .12 : Druckaufschluß ; Temperaturabhängigkeit des Rest-

kohlenstoffgehaltes (RKG) im Bereich von 100-200°C(Aufschlußzeit 3 h)

Der verbleibende Rückstand kann anschließend mit 0 .5 ml

69 Eiger Salpetersäure und Wasser klar zu 10 .0 ml gelöst

werden . Die Leberproben wurden - ohne Zusatz von Flußsäure

- analog behandelt, um mit den Algen-Aufschlüssen verglei-

chen zu können . Die Restkohlenstoffgehalte stimmen gut mit

den zuvor angegebenen Werten sowie mit denen der W-Photo-

lyse (Kap .4 .3 .1 .2) überein .

ProbenmaterialRestkohlenstoffgehalt

Verbrennung W-Photolyse

Algen

1 .07 1 .18

Leber

3 .6 3 .6

Tab .2 : Vergleich von RKG-Werten nach Druckaufschluß und

Abrauchen bei 130°C im PTFE-Gefäß

5 1

Nach Aussage der Tabellenwerte ist die UV-Photolyse zumin-dest für die schwerflüchtigen Stoffe im Aufschlußrückstandquantitativ ; ähnliches sollte auch für die leichtflüchtigenVerbindungen gelten, da diese vermutlich aus kleinerenMolekülen bestehen . Ferner fällt auf, daß es für die RKG-Werte unerheblich ist, ob die Probe ein- oder zweimal mitHN03 abgeraucht wird, da beide Prozesse bei der gleichenTemperatur ablaufen . Auch der Zusatz von Flußsäure hatkeinen Einfluß auf den Kohlenstoffumsatz .

Die Streuung des Restkohlenstoffgehaltes nach Aufschluß vor:Leber und Algen mit sowie ohne Abrauchen des Rückstandes imPTFE-Gefäß wurde an jeweils 5 Ansätzen (insgesamt 20 Auf-schlüsse) ermittelt . Dazu wurden aus jeder Aufschlußlösung5 aliquote Teile zu je 1 .0 ml bei 130°C im Porzellanschiff-chen abgeraucht und analysiert . Die Werte für die relativeStandardabweichung der aus 20, Aufschlüssen je 5 ml wieder-holten Kohlenstoffbestimmung liegen zwischen 0 .029 und0 .099 . Die Reproduzierbarbeit des Aufschlusses selbst er-gibt sich aus den Werten für die relative Standardabwei-chung der aus je 5 Aliquotierungen gebildeten 5 Mittel-werte : Sie liegen im Bereich zwischen 0 .024 und 0 .035 .

4 .6 .2 Nachbehandlung von Druckaufschluß-Rückständen mitPerchlorsäure

Die Perchlorsäure-Nachbehandlung von Druckaufschluß-Rück-ständen wurde in Kap .4 .2 .2 bereits beschrieben . Die zu-grundeliegenden Druckaufschlüsse erfolgten unter den inKap .4 .6 .1 mitgeteilten Bedingungen . Algen wurden unterZusatz von 0 .15 ml 40 Eiger Flußsäure aufgeschlossen . DieArbeitsparameter wurden im Hinblick auf eine möglichstweitgehende Verminderung der Restkohlenstoffgehalte opti-miert . Die RKG-Werte wurden nach Abrauchen der Aufschluß-lösung bei 130°C (Verbrennungsschiffchen, Zusatz von NaC1,

52

vgl . Kap .4 .3 .1) bestimmt . Folgende optimale Arbeitsbedin-gungen wurden ermittelt : Temperatur : 180°C ; Zeit für dieNachbehandlung : 3 h ; Leber : 0 .20 ml 70 %ige Perchlorsäure ;Algen : 0 .25 ml 70 %ige Perchlorsäure . Zur Erfassung auch derflüchtigen Kohlenstoffanteile wurden Kohlenstoffbestimmungendurch UV-Photolyse unmittelbar an nicht eingedampften Auf-schlußlösungen durchgeführt . Die RKG-Werte sind gegenüberden nach Abrauchen erhaltenen Ergebnissen nur geringfügigerhöht (Tab .3) und zeigen damit, daß die Rückstände imwesentlichen aus schwerflüchtigen organischen Verbindungenbestehen . Die Streuung des Restkohlenstoffgehaltes und dieReproduzierbarkeit des Aufschlusses wurde entsprechendKap .4 .6 .1 ermittelt . Die Werte für die relative Standardab-weichung der aus 10 Aufschlüssen je 5 mal wiederholtenKohlenstoffbestimmung liegen zwischen 0 .028 und 0 .095 . DieWerte für die relative Standardabweichung der aus 5 Aliquo-tierungen gebildeten 5 Mittelwerte (Reproduzierbarkeit desAufschlusses) liegen in beiden Fällen bei 0 .068 .

ProbenmaterialRestkohlenstoffgehalt

Algen

0 .10 0 .12Leber

0 .36 0 .45

Nach Abrauchen Unmittelbarbei 130°C

in der Lösung

Tab .3 : RKG-Werte nach Perchlorsäure-Behandlung vonDruckaufschluß-Rückständen

Es fällt auf, daß auch Perchlorsäure unter den hier be-schriebenen Bedingungen nicht in der Lage ist, die nach demDruckaufschluß bei 180°C zurückbleibenden organischen Ver-bindungen vollständig abzubauen . Gegenüber einem Druckauf-schluß mit Salpetersäure kann durch nachfolgende HC104-Be-handlung jedoch eine beträchtliche Verringerung des orga-nischen Materials in der Aufschlußlösung erreicht werden .

4 .6 .3 Druckaufschluß in abgeschmolzenen Ampullen bei

20 mg Leber bzw . 30 mg Algen wurden unter Zusatz von 0 .2 ml69 %iger Salpetersäure 1 h (+20 min Aufheizzeit) in abge-schmolzenen Glasampullen mit Hilfe der in Kap .4 .2 .3 .1 be-schriebenen Apparatur aufgeschlossen . Die Temperaturab-hängigkeit des nach Abrauchen der Lösung im Verbrennungs-schiffchen bei 130°C erhaltenen RKG ist in Abb .13 darge-stellt . Nach Aufschluß bei 300°C erhält man demnach fürbeide Materialien Restkohlenstoffgehalte unterhalb derGarantiegrenze für Reinheit (RKG e5 0 .04 %) . Algen erreichendiesen Wert bereits bei etwa 270°C . Weitere Versuche wurdenbei 300°C unter den oben angegebenen Bedingungen durchge-führt . Die nach W-Photolyse unmittelbar in den Aufschluß-lösungen ermittelten RKG-Werte liegen für Algen ebenfallsunterhalb der Garantiegrenze für Reinheit, für Leber bei0 .14

0

43

4-44-40

0

0x0x

Temperaturen bis zu 300°C

5 3

Temperatur (°C)

Abb .13 : Druckaufschluß ; Temperaturabhängigkeit des Rest-kohlenstoffgehaltes (RKG) im Bereich von 180-300°C(Aufschlußzeit 1 h)

5 4

Versuche ergaben, daß diese Ergebnisse auf den von KNAPP(11,35) entwickelten Hochdruckverascher "HPA" (Paar, Graz ;Lieferant : Kürner, Rosenheim) übertragbar sind . Mit diesemGerät können Aufschlüsse bei Temperaturen bis zu 320°Cdurchgeführt werden . Die von uns bereits publizierten Er-gebnisse zeigen (129), daß mit dem Hochdruckverascher prak-tisch alle biologischen Materialien mit Salpetersäure bisauf RKG-Werte !!E 0 .08 % aufgeschlossen werden können, so daßeine störungsfreie voltammetrische Bestimmung von Zn, Cd,Pb und Cu in der Aufschlußlösung von Leber möglich ist .

Auch nach HASSE et al . ist die störungsfreie inversvoltam-metrische Bestimmung von Schwermetallspuren in biologischenMaterialien möglich (130) ; die Autoren verwendeten aller-dings neben HN03 einen Zusatz von Perchlorsäure . Die in(129) beschriebenen Ergebnisse und die im Rahmen dieser Ar-beit (vgl . Kap .4 .7 .1) gewonnenen Resultate zeigen dagegen,daß Perchlorsäurezusätze unnötig sind, da bei 300°C auchmit Salpetersäure allein ein praktisch vollständiger Abbaubiologischer Materialien gelingt .

4 .6 .4 Einfluß der Einwaage auf den Restkohlenstoffgehaltnach Druckaufschlüssen bei 180°C

Die Versuche wurden unter folgenden Bedingungen durchge-führt :

Aufschlußart :

Druckaufschluß, PTFE-Tiegel, keinAbrauchen

Temperatur : 180°CZeit :

3 hEinwaage : variiertSäuremenge : variiertTiegelvolumen :

35 mlKohlenstoffbestimmung : Abrauchen bei 130°C, Verbrennung,

coulometrische C02-Titration

5 5

Tab .4 enthält die Einwaagen und die zugehörigen Säuremengenfür den Aufschluß von Algen sowie die ermittelten Restkoh-lenstoffgehalte .

Tab .4 : Algen ; Einfluß von Einwaage und Säurezusatz auf denRestkohlenstoffgehalt

Verringert man Einwaage und Säuremenge im gleichen Verhält-nis, so steigt der RKG unterhalb von etwa 100 mg deutlichan . Hält man dagegen die Säuremenge bei 1 .50 ml konstant,so beobachtet man einen entsprechenden Anstieg erst beideutlich geringeren Einwaagen . Einen analogen Befund erhältman auch bei Leber als Probenmaterial ; unterschiedlich istnur die Höhe des jeweiligen RKG-Wertes . Beispielsweisewerden 200 mg Leber mit 2 .0 ml Salpetersäure zu einem RKG-Wert von 3 .6 % aufgeschlossen, 67 mg mit 0 .67 ml Salpeter-säure jedoch zu RKG = 6 .0 % .

Als Erklärung wird angenommen, daß mit abnehmender Proben-einwaage der Druck im Aufschlußgefäß abnimmt . Wie im fol-genden noch gezeigt wird, kann die bei sinkendem Gesamt-druck abnehmende Konzentration an N02 in der flüssigenPhase für die Verschlechterung des Aufschlusses verant-wortlich gemacht werden . Unklar bleibt jedoch, warum derAufschluß bei Verringerung der Einwaage, aber unter Beibe-

Probenein--waage (mg)

Säurezu-satz (ml)

RKG (%) Säurezu-satz (ml)

RKG (%)

300 1 .50 1 .10 - -200 1 .00 1 .11 1 .50 1 .09150 0 .75 1 .10 1 .50 1 .05100 0 .50 1 .37 1 .50 1 .0450 0 .25 1 .74 1 .50 1 .1525 0 .125 4 .1 1 .50 2 .1

5 6

halten des Säurevolumens, erst mit kleineren Probenmengenschlechter wird . Vermutlich wird fehlendes NO2 hier durchden hohen Salpetersäure-Überschuß teilweise ersetzt . DerEinfluß von Stickstoffdioxid beim Aufschluß organischerMaterialien mit Salpetersäure läßt sich nachweisen, wennman bei sonst gleichen Arbeitsbedingungen Aufschlußgefäßevon unterschiedlichem Volumen verwendet (Tab .5) .

Tab .5 : Druckaufschluß ; Abhängigkeit des RKG-Wertes vomGefäßvolumen

Reduziert man Probeneinwaage und Säurezusatz jeweils auf1/3, hält das Gefäßvolumen von 35 ml aber bei, so folgt dieoben genannte Aufschlußverschlechterung . Verringert manjedoch gleichzeitig auch das Gefäßvolumen um denselben Be-trag, so bleibt der Innendruck unverändert und man erhältdie optimalen RKG-Werte zurück .

Zur weiteren Bestätigung wurde der nach 3 "C" + 4 HN0 3 -->3 CO2 + 2 H2O + 4 NO zu erwartende Reaktionsdruck (idealesVerhalten vorrausgesetzt) durch Zusatz leicht verdampfbarerVerbindungen erhöht . Folgende Stoffe wurden zugesetzt :

Probenmaterial Säurezusatz(69 %ige HN03)

Aufschlußtiegel RKG (%)

Algen, 67 mg 0 .33 ml 35 ml 2 .4Algen, 67 mg 0 .33 ml 11 .5 ml 1 .05Algen, 200 mg 1 .0 ml 35 ml 1 .11

Leber, 67 mg 0 .67 ml 35 ml 6 .0Leber, 67 mg 0 .67 ml 11 .5 ml 3 .6Leber, 200 mg 2 .0 ml 35 ml 3 .6

5 7

CO2 als Trockeneis, etwa 700 mgC2F4C12, d = 1 .5 (Herstellerangabe), 1 .8 ml (pipettierenbei -20°C) NO2, d = 1 .4905 (131), 0 .5 ml (pipettieren alsN204 bei 0°C (132))

67 mg Probenmaterial wurden dazu im 35-ml-Tiegel mit0 .33 ml (bei Algen) bzw . 0 .67 ml 69 Eiger Salpetersäure(bei Leber) zu folgenden RKG-Werten aufgeschlossen :

C02-Zusatz C2F4C12-Zusatz N02-Zusatz

Algen

2 .6 %

2 .3 %

0 .67Leber

5 .9 %

4 .8 %

2 .7

Tab .6 : RKG-Werte nach Zusatz verschiedener Gase zumDruckaufschluß

Wie die Werte zeigen, führt eine Erhöhung des Druckes durchCO2 zu keiner Verbesserung des Aufschlusses ; da CO2 jedochals Reaktionsprodukt an einem thermodynamischen Gleichge-wicht beteiligt sein kann, wurde C2F4C12 als Inertgas zuge-setzt . Jedoch konnte auch hier eine Verbesserung des Auf-schlusses nicht erzielt werden . C2F4C12 ist unter denBedingungen des Druckaufschlusses stabil . Dies kann daranerkannt werden, daß unmittelbar nach dem Öffnen des abge-kühlten Aufschlußgefäßes eine zweite, aus kondensiertemC2F4C12 bestehende flüssige Phase vorliegt, die dann aberinnerhalb weniger Sekunden verdampft .

Erst der Zusatz von NO2 führt zu einer Verbesserung derAufschlüsse . Aufgrund der sehr hohen NO2-Konzentrationwerden die bisherigen optimalen RKG-Werte von 1 .1 % (beiAlgen) bzw . 3 .6 % (bei Leber) sogar deutlich unterschrit-ten . Durch Zusatz von Salpetersäure ist eine solche Verbes-serung nicht zu erreichen . Dieses Experiment zeigt deut-lich, daß dem Stickstoffdioxid beim Druckaufschluß biolo-

5 8

gischer Materialien eine besondere Funktion zukommt .Schließlich kann der Aufschluß von 67 mg Algen bzw . Leberunter den Bedingungen der Tab .5 (35-ml-Aufschlußtiegel)auch dadurch auf RKG-Werte von 1 .03 bzw . 3 .2 % verbessertwerden, daß die Aufschlußzeit auf 24 h verlängert wird . DieAufschlußreaktion wird also vermutlich kinetisch beein-flußt : Bei abnehmender Stickstoffdioxid-Konzentration lau-fen die Reaktionen zwar ab, sind jedoch deutlich verlang-samt . Für die Praxis folgt aus diesen Untersuchungen, daßein Verhältnis von Probeneinwaage (bezogen auf C) zuTiegelvolumen von etwa 1 .4 - 2 .8 mg C/ml eingehalten werdensollte, um innerhalb von 3 h einen optimalen Aufschluß zuerreichen . Ferner folgt aus den Ergebnissen dieser Untersu-chungen, daß bei undichten Aufschlußsystemen, aus denen N02entwichen ist, mit einer Verschlechterung des Kohlenstoff-umsatzes gerechnet werden muß .

4_7_Voltammetrische_Untersuchun2en

4 .7 .1 Voltammetrische Untersuchungen an Aufschlußlösungenvon Algen und Leber

Dieser Abschnitt beschäftigt sich mit dem Einfluß orga-nischer Aufschlußrückstände auf die Signale von Zn, Cd, Pbund Cu bei ihrer Bestimmung durch inverse Square-Wave-Voltammetrie (SWASV) . Zur Vorbereitung der Proben sieheKap .4 .3 .2 ; die Meßparameter enthält Kap .4 .5 . Die Ergebnissevon Vergleichsmessungen durch Differential-Puls-Inversvol-tammetrie (DPASV) werden hier im Einzelnen nicht mit auf-geführt, da sie qualitativ mit denen der SWASV übereinstim-men . Zunächst kann vorweggenommen werden, daß die Auflö-sungspotentiale der Metallionen durch organische Stoffeoder durch gelöste Stickoxide allenfalls um Werte :!5 20 mVverschoben werden . Dies gilt für alle in dieser Arbeitdurchgeführten Metallbestimmungen . Lediglich die Art unddie Konzentration der aus den Aufschlußlösungen herrühren-

5 9

den und als Leitelektrolyt dienenden Säure haben Einflußauf die Potentiallage der Schwermetallsignale . Tab .7 gibteine Übersicht über die in verschiedenen Lösungen gemesse-nen Potentiale . Dazu wurden aus der zu 10 .0 ml aufgefülltenAufschlußlösung jeweils 1 .0 ml entnommen und zur Messungmit 5 .0 ml Wasser versetzt .

Tab .7 : SWASV ; Potentiale der Schwermetallsignale in ver-schiedenen Lösungen

In der DPASV liegen alle Potentiale gegenüber der SWASV um40 ± 6 mV negativer . Zum Vergleich wurden wäßrige Modell-Lösungen hergestellt, die in den Metallionenkonzentrationenund Aciditäten den Aufschlußlösungen entsprachen . Die Ele-mentbestimmungen wurden mit Hilfe der Standard-Additions-methode anhand wäßriger Spurenlösungen kalibriert . Für dieAufnahme der Voltammogramme wurden jeweils 1 .0 ml der imfolgenden angegebenen Lösungen zu 6 .0 ml Meßvolumen mitWasser ergänzt .

1 . Algen

Zusatz, Abrauchen bei 130°C im PTFE-Gefäß,Aufnehmen mit 0 .5 ml 69 Eiger Salpetersäure,ergänzen mit Wasser zu 10 .0 ml

Aufschlußlösung Potential

Zn

(mV)

Cd

vs . ges .

Pb

Ag/AgC1

Cu

0 .2 ml 70 %ige HC104/10 ml -968 -564 -348 +1030 .5 ml 69 %ige HN03 /10 ml -980 -562 -369 +451 .25 ml 69 %ige HN03 /10 ml -994 -582 -394 +22

a) Modell-Lösung : 0 .2 ml HCl04/10 mlb) Modell-Lösung : 0 .5 ml HN03 /10 mlc) Druckaufschluß bei 180°C unter Flußsäure-

6 0

d) Druckaufschluß bei 180°C mit Flußsäure-Zusatz,Perchlorsäure-Nachbehandlung, Rest-Säure :0 .2 ml HCl04/10 ml

Beim Aufschluß von Algen bleiben in beiden Fällen Silikatezurück, die nur mit Flußsäure nach Abrauchen der Aufschluß-lösung entfernt werden können .

2 . Leber a) Modell-Lösung : 0 .2 ml HCl04/10 mlb) Modell-Lösung : 0 .5 ml HN03 /10 mlc) Druckaufschluß bei 180°C, Abrauchen bei 130°C

im PTFE-Gefäß, Aufnehmen mit 0 .5 ml 69 %igerSalpetersäure, ergänzen mit Wasser zu 10 .0 ml

d) Druckaufschluß bei 180°C, Perchlorsäure-Nach-behandlung, Rest-Säure : 0 .2 ml HCl04/10 ml

Zusätzlich wurden folgende Lösungen untersucht :

e) Modell-Lösung : 1 .25 ml HN03 /10 mls)f) Druckaufschluß bei 180°C ohne Abrauchen,

Rest-Säure : 1 .25 ml HN03/10 mlg) Aufschluß von 20 mg Leber bei 300°C (Quarz-

ampulle), Abrauchen bei 130°C und quantitiveÜberführung in die Meßzelle (Säure : 0 .05 mlHN03/6 ml, Acidität entsprechend Lösungen2 b und c)

Die Voltammogramme von Modell- und Aufschlußlösungen sindin den Abb.14-24 dargestellt .

5 )Dies entspricht der Acidität einer Leber-Aufschlußlösung,bei der die Säure nicht abgeraucht wurde : Von 2 ml zuge-setzter Salpetersäure bleiben 1 .25 ml zurück

Cd Pb

3.9F-

2.0-

0.J

Cu

6 1

3.1ä-

2.tr

4.

2.

O.j

I-,,- O.j

Modell

Aufschlug

HC104 Druckaufschluß, HNO3 Druckaufschluß,Modell

HC104-Nachbe-

Modell

Abrauchen beihandlung

130°C

Abb .14 : Algen ; Zn-Signale der Aufschluß- und Modell-Lösungen (-1 .2 > -0 .8 V)

Abb .15 : Algen ; Signale für Cd, Pb und Cu nach Druckauf-schluß und Abrauchen ; Vergleich mit Modell-Lösung(-0 .75 -- 0 .25 V)

1 . Zink

6 2

e .Cd

Pb

Modell

Aufschluß

Cu

Abb .16 : Algen ; Signale für Cd, Pb und Cu nach Behandlungeines Druckaufschluß-Rückstandes mit Perchlorsäure ;Vergleich mit Modell-Lösung (-0 .75 -> 0 .25 V)

Charakterisierung der Voltammogramme von Algen-Aufschluß-16sungen

Signale und Grundstrom :- deutliche Signaldepression beim Perchlorsäure-Aufschlußgegenüber der Modell-Lösung, aber unveränderter Stromdurch Wasserstoffabscheidung bei -1 .2 V ;

- starke Signaldepression beim Druckaufschluß verbunden miteiner beträchtlichen Erhöhung des Wasserstoffstromes bei-1 .2 V, verursacht durch organische Stoffe .Das Signal/Untergrund-Verhältnis wird durch beide Stör-einflüsse verschlechtert .

Analysenergebnisse :- Die Zink-Bestimmung in den Aufschlußlösungen führt zumrichtigen Ergebnis .

2 . Cadmium, Blei__und Kupfer

6 3

Grundstrom :- Druckaufschluß und Abrauchen : stark erhöhter Grundstrom,verursacht durch organische Rückstände ;

- Perchlorsäure-Nachbehandlung : vergleichbar mit der Basis-linie im Voltammogramm der Modell-Lösung .

Störsignale :- Nach Druckaufschluß (Abb .15) ist ein intensives Störsig-

nal zu erkennen ;- Das Voltammogramm nach Perchlorsäure-Behandlung (Abb .16)

ist störungsfrei .

Signale :- Bei Cd und Pb erhält man in beiden Fällen eine Signalde-

pression, beim Cu nur nach Druckaufschluß ohne Perchlor-

säure-Nachbehandlung . Die Erhöhung des Cu-Signals nachPerchlorsäure-Behandlung ist auf Reste an Salpetersäurein der Meßlösung zurückzuführen, die zu einer Verbesse-rung der Empfindlichkeit führt . Ursache ist also einEinfluß des Anions, nicht der Acidität, wie auch durchVergleich der Voltammogramme der Modell-Lösungen deutlichwird .

Analysenergebnisse :- Die Bestimmung von Cd führt in beiden Fällen, die von Cu

nur nach Perchlorsäure-Behandlung, die von Pb nur beimDruckaufschluß ohne Perchlorsäure-Nachbehandlung, zumrichtigen Ergebnis . Cu kann nach Druckaufschluß aufgrunddesDasnurderman15 % vermindertes Pb-Signal . Der Gehalt der Lösung anvoltammetrisch erfaßbarem Pb nimmt innerhalb von 3 Tagen

erwähnten Störsignals nicht bestimmt werden .Bleisignal nach Perchlorsäure-Behandlung entsprichtetwa einem Drittel des zu erwartenden BleigehaltesProbe, obwohl das Signal ungestört ist . Analysiertunmittelbar nach dem Aufschluß, so erhält man ein um

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die nach Druck-aufschluß mit Abrauchen der Lösung verbleibenden orga-nischen Stoffe (Restkohlenstoffgehalt 1 .1 %) deutlich Stö-rungen bei der Elementbestimmung verursachen . Nach Behand-lung des Rückstandes mit Perchlorsäure (RKG 0 .12 %) sinddie Störungen behoben .

jedoch kontinuierlich bis auf 1/3 seines Wertes ab undbleibt danach über Monate unverändert . Die Ursache istvermutlich in einer chemischen Reaktion der Pb-Ionen mitanorganischen Bestandteilen der Aufschlußlösung zusuchen ; bei vergleichbaren Leber-Lösungen wurden ent-sprechende Vorgänge nicht beobachtet .

4.0-

4.01-

4.0-

6 4

4.0-

2 .

O. d

HCl04 Druckaufschluß, HN03 Druckaufschluß,Modell

HC104-Nachbe-

Modell

Abrauchen beihandlung

130°C

Abb .17 : Leber ; Zn-Signale der Aufschluß- und Modell-Lösungen (-1 .2 > -0 .8 V)

0 .

Abb .l$ : Leber ; Signale für Cd und Pb nach Druckaufschlußund Abrauchen ; Vergleich mie,Modell-Lösung(-0 .75 -> -0 .1 V)

Cd

Modell

Aufschlug

Cd

Pb

6 5

0.Cd

Modell

Aufschlup

Abb .19 : Leber ; Signale für Cd und Pb nach Behandlungeines Druckaufschluß-Rückstandes mit Perchlorsäure ;Vergleich mit Modell-Lösung (-0 .75 --> -0 .1 V)

2 .

0.0

Modell

Aufschlug

Abb .20 : Leber ; Cu-Signal nach Druckaufschluß und Abrauchen ;Vergleich mit Modell-Lösung (-0 .75

> 0.25 V)

AI (uA )~

2.1

2.1

Abb .21 : Leber ; Cu-Signal nach Behandlung eines Druckauf-schluß-Rückstandes mit Perchlorsäure ; Vergleichmit Modell-Lösung (-0 .75 --> 0 .25 V)

Charakterisierung der Voltammogramme von Leber-Aufschluß-

16sungen

1 . Zink

6 6

Modell

Aufschlug

Bei der Zn-Bestimmung werden die gleichen Störungen beob-achtet, wie sie bei den Voltammogrammen der Algen (vgl .S . 61) beschrieben wurden . Zusätzlich fällt auf, daß derWasserstoffstrom bei -1 .2 V sowohl nach der Perchlorsäure-Behandlung als auch nach Druckaufschluß und Abrauchen wegendes gegenüber Algen erhöhten Restkohlenstoffgehaltes höherausfällt als bei vergleichbaren Algen-Aufschlüssen .

Analysenergebnisse :- Die Zn-Bestimmung führt in beiden Lösungen zum richtigen

Ergebnis, sie ist aber für die allein durch Druckauf-schluß erhaltenen Rückstände aufgrund des gegenüber Algendeutlich verschlechterten Signal/Untergrund-Verhältnissesungenau .

2 . Cadmium und Blei

Grundstrom:

- Druckaufschluß und Abrauchen : stark erhöhter Grundstrom,verursacht durch organische Rückstände ;

- Perchlorsäure-Nachbehandlung : vergleichbar mit der Basis-linie im Voltammogramm der Modell-Lösung .

Stör .; ignal e :

- Druckaufschluß mit Abrauchen des Rückstandes : Es ent-steht, wie bei Algen, ein Störsignal,das unmittelbarhinter dem Pb-Signal beginnt .

- Perchlorsäure-Nachbehandlung : Unmittelbar hinter dem Pb-Signal liegt ein durch eine organische Komponente her-vorgerufenes, sehr intensitätsschwaches Störsignal (vgl .Cu-Voltammogramm) .

Signale :

- Für Cd und Pb tritt, wie auch bei Algen, eine leichteSignaldepression auf . Nach Druckaufschluß mit nachfol-gendem Abrauchen bei 130°C ist das Pb-Signal durch dasbenachbarte Störsignal so stark verzerrt, daß die Aus-wertung unmöglich ist .

Analysenergebnisse :

- Die Bestimmung von Cd führt in beiden Fällen, die von Pbnur im Anschluß an eine Perchlorsäure-Behandlung zumrichtigen Ergebnis . Nach Druckaufschluß ohne Nachbehandlung des Rückstandes mit HCl04 ist eine Bleibestimmungnicht möglich .

3 . Kupfer

6 7

Um mit den Voltammogrammen der Algen-Rückstände vergleichenzu können, wurde zur Cu-Bestimmung eine Anreicherungszeitvon nur 10 s gewählt, so daß etwa gleiche Cu-Mengen am

Quecksilbertropfen abgeschieden wurden . Die Intensität derPb- und Cd-Signale ist in diesen Voltammogrammen deshalbnur gering .

Grundstrom :

68

- Vergleichbar den Voltammogrammen von Cd und Pb .

Störsignale :- Nach Druckaufschluß und Abrauchen bei 130°C sind im Vol-tammogramm Störsignale bei etwa -0 .55 und bei -0 .05 V zuerkennen . Das zweite, sehr intensive Signal verhinderteine Cu-Bestimmung . Es tritt bei Algen ebenfalls an die-ser Stelle auf, während das erste, schwächere Signal beiAlgen zwar vorhanden ist, aufgrund der langen Anreiche-rungszeit durch die Signale von Cd und Pb aber überlagertwird .

- Durch Perchlorsäure-Behandlung des Rückstandes wird dieorganische Matrix zwar weitgehend zerstört (RKG-Wert 0 .45%), unmittelbar neben dem Cu-Signal ist jedoch noch einkleines Störsignal zu erkennen, das die Bestimmung desKupfers aber nicht beeinträchtigt . Dabei ist zu beachten,daß das Cu-Signal bei Verlängerung der Anreicherungszeitintensiver wird, während die Intensität des Störsignalsdavon unabhängig ist .

Analysenergebnisse :- Die Cu-Bestimmung nach Druckaufschluß ist nicht möglich ;

nach Behandlung mit Perchlorsäure führt die Analyse zumrichtigen Gehalt .

Die Ergebnisse der voltammetrischen Untersuchungen anAlgen- und Leber-Rückständen lassen sich folgendermaßenzusammenfassen : Nach Druckaufschluß bei 180°C mit nachfol-gendem Abrauchen bei 130°C treten in den Voltammogrammender Algen- und der Leber-Aufschlußlösungen zwei in derPotentiallage identische Störsignale auf ; das Signal derAlgen-Lösung (RKG 1 .1 %) ist dabei niedriger als das der

6 9

Leber-Lösung (RKG 3 .6 %) . Analoges gilt für die Wasser-stoffabscheidung in beiden Lösungen bei -1 .2 V . Aufgrundder Störsignale ist die Cu-Bestimmung unmöglich, Pb und Cdkönnen jedoch, abhängig von ihrer Konzentration und von derIntensität der Störsignale, in vielen Fällen noch bestimmtwerden . Die Zink-Bestimmung wird durch Wasserstoffentwick-lung erschwert, ist jedoch möglich . Die geringfügige Sig-naldepression bei Pb und Cd ist ohne wesentliche Bedeutung .Lediglich das Zn-Signal wird bei Algen um 56 %, bei Leberum 78 % gegenüber der Modell-Lösung vermindert . Auch hiermacht sich der höhere Kohlenstoffgehalt der Leber-Auf-schlußlösung bemerkbar .

Nach Behandlung der Rückstände mit Perchlorsäure erhält manproblemlos auswertbare Voltammogramme, die keine (Algen ;RKG 0 .12 %) bzw . nur schwache Störsignale (Leber ; RKG0 .45 %) enthalten .

Mit Leber als Probenmaterial wurde weiterhin der Einflußflüchtiger Komponenten auf die Voltammogramme der Element-spuren untersucht . Abb .23 enthält die Voltammogramme einerAufschlußlösung, die nach Druckaufschluß bei 180°C ohneabzurauchen erhalten wurde (RKG 6 .6 %, gelöste Stickoxide,Rest-Säure : 1 .25 ml HN03/10 ml) .

Die Voltammogramme einer Modell-Lösung von gleicher Acidi-tät sind in Abb .22 aufgeführt . Vergleicht man die Voltammo-gramme dieser Lösung mit denen der Modell-Lösung, die le-diglich 0 .5 ml Salpetersäure in 10 ml Gesamtvolumen enthält(Abb .17,19,21), so fällt auf, daß das Cu-Signal infolge derhöheren Salpetersäure-Konzentration verstärkt, dasSignal/Untergrund-Verhältnis beim Zink durch den hohenWasserstoffstrom jedoch deutlich verschlechtert ist .

7 0

e . Ei-

C d

1. d-

Abb .22 : Voltammogramme einer Modell-Lösung (Leber) mit1 .25 ml 69 Eiger Salpetersäure in 10 ml(-1 .2 --> -0 .8 ; -0 .75 --> -0 .1 ; -0 .75 ---> 0 .25 V)

CUA

Abb .23 : Leber ; Voltammogramme nach Druckaufschluß bei 180°Cohne Abrauchen des Rückstandes(-1 .2 --> -0 .8 ; -0 .75 > -0 .1 ; -0 .75 -* 0 .25 V)

2.11- 4.t~-

1.SI- a.1-

1.$- 2.fi~'

Die Voltammogramme der nicht abgerauchten Aufschlußlösungvon Leber (Abb .23) zeigen gegenüber denen der zugehörigenModell-Lösung (Abb .22) sowie im Vergleich zu den Untersu-chungen an abgerauchten Leber-Rückständen (Abb .17,18,20)einen durch flüchtige organische Stoffe deutlich erhöhtenWasserstoffstrom . Ebenfalls erhöht ist der Grundstrom,verursacht durch gelöste Stickoxide . Das Störsignal bei-0 .55 V wird durch ein zusätzliches Signal bei -0 .35 Vüberlagert . Unverändert bleibt hingegen die Störung bei-0 .05 V . Das Signal bei -0 .35 V wird durch flüchtige orga-nische Stoffe verursacht (vgl . Kap .5) . Insgesamt kann kei-nes der vier untersuchten Elemente ohne Abrauchen des Rück-standes bestimmt werden . Der Aufschluß bei 300°C lieferthingegen gut auswertbare Voltammogramme, wenn die Lösungbei 130°C zur Trockene abgeraucht und mit Salpetersäure undWasser in die Meßzelle überführt wird (Abb .24) .

Cd

7 1

Abb .24 : Leber ; Voltammogramme nach Druckaufschluß bei 300°Cund Abrauchen der Aufschlußlösung(-1 .2 --> -0 .8 ; -0 .75 > -0 .1 ; -0 .75 --> 0 .25 V)

AI (pA)

4 . O- Z n 2 . 4 . *-

3 . 1 . 3 . 0-

2. 1.0-.

1 . 0.5 1 .*-

7 2

Ein Vergleich mit der entsprechenden Modell-Lösung (0 .5 mlSalpetersäure in 10 ml Lösung; Abb .17,18,20) zeigt, daßkeine Störungen auftreten, da die Lösung praktisch frei vonorganischen Stoffen (RKG e0 .04 %) ist . Die geringe Signal-depression bei Zn, Cd und Pb ist entweder auf Spuren orga-nischer Stoffe oder - was wahrscheinlicher ist - auf dieanorganischen Bestandteile der Lösung zurückzuführen . Ent-scheidend für den Analysenerfolg ist jedoch, daß die Lösungabgeraucht wird, da andernfalls neben organischen Stoffen(RKG 0 .14 %) auch merkliche Mengen an Stickoxiden gelöstsind . Besonders letztere führen vor allem im Potentialbe-reich der Wasserstoffentwicklung zu einer so starken Erhö-hung des Grundstroms, daß eine Elementspuren-Bestimmungnicht möglich ist (Abb .25) . Die in der Lösung vorhandenenorganischen Stoffe liefern dabei Störsignale, die eine Cd-Bestimmung verhindern und die Cu-Bestimmung erschweren(Abb . 25) .

Abb .25 : Leber ; Voltammogramme nach Druckaufschluß bei 300°Cohne Abrauchen der Aufschlußlösung(-1 .2 > -0 .8 ; -0 .75 > -0 .1 ; -0 .75 > 0 .25 V)

7 3

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die Voltammo-gramme, die aus einem Aufschluß bei 300°C und Abrauchen derLösung resultieren, keine Störungen aufweisen . Der Auf-schluß ist also dem Druckaufschluß bei 180°C mit Perchlor-säure-Nachbehandlung überlegen . Die hohe Temperatur von300°C ist allerdings notwendig, da auch noch bei 280°Ctrotz des Abrauchens der Lösung bei Leberproben Störsignaleauftreten, was ebenso der RKG-Wert von 0 .11 % andeutet(vgl . Abb .13) . Unumgänglich ist außerdem, die Aufschluß-lösungen abzudampfen, da vor allem gelöste Stickoxide zugravierenden Störungen wegen der Erhöhung des Stromes imnegativen Potentialbereich führen, so daß die Bestimmungder Elemente Zn, Cd und Pb erschwert oder unmöglich gemachtwird . Ein Beispiel dafür, welchen Einfluß gelöstes N02 aufden Stromverlauf haben kann, zeigt Abb .26 .

Dazu wurden 0 .5 ml 69 %ige Salpetersäure, 0 .5 ml flüssigesN02 (bei 0°C pipettiert) und 9 .5 ml Wasser in einem ge-schlossenen Druckaufschlußgefäß etwa 30 min geschüttelt .1 .0 ml wurden entnommen, mit 5 ml Wasser in eine voltamme-trische Meßzelle überführt, mit den einer Algen-Aufschluß-lösung entsprechenden Mengen an Zn, Cd, Pb und Cu versetztund anschließend vermessen . Die Signalstörungen sind denenvon Lösungen aus einem nicht abgerauchten Druckaufschlußbei 300°C ähnlich, es fehlen hier allerdings die auf orga-nische Stoffe zurückzuführenden Signale .

Im folgenden werden die flüchtigen organischen Verbindungenin der Aufschlußlösung nicht weiter berücksichtigt, da sieohnehin vor der Analyse beim Abrauchen der Stickoxide mitentfernt werden und somit keine Störungen verursachen kön-nen . Dies gilt auch für die Graphitrohr-AAS, wo dieseStoffe meist schon während der Trocknungs-, spätestens je-doch bei der Veraschungsperiode abgetrennt werden . Ebensoist eine Identifizierung organischer Rückstände nur für denDruckaufschluß im PTFE-Gefäß bei 180°C von Interesse, weildie nach einer Perchlorsäure-Behandlung bzw . nach Druckauf-

7 4

schluß bei 300°C zurückbleibenden Stoffe die voltamme-trische Metallbestimmung nur unerheblich stören ; sie wurdendaher nicht weiter untersucht .

Cu

Abb .26 : Einfluß von NOZ auf Voltammogramme einer Algen-Vergleichslösung (-1 .2 -- -0 .8 ; -0 .75 --> 0 .25 V)

Die vielfältige Anwendung von Druckaufschlüssen in PTFE-Gefäßen zur Analyse biologischer Materialien macht es

interessant und notwendig, die im Rückstand verbleibendenStoffe näher zu untersuchen, um die Ursachen für die oftbeschriebenen Störungen bei der voltammetrischen Element-bestimmung aufzuklären . Dies gilt, obwohl es - wie auchhier gezeigt wurde - Möglichkeiten gibt, Aufschlußrück-stände so weit zu mineralisieren, daß solche Störungenvermieden werden : Druckaufschlüsse bei Temperatuen um300°C, etwa mit Hilfe des Hochdruckveraschers nach KNAPP,

erfordern aber einen hohen apparativen Aufwand ; diechemische Nachbehandlung des Rückstandes mit Perchlorsäureerhöht den Zeitbedarf eines Probenaufschlusses ganz be-trächtlich .

7 5

Die nachfolgend beschriebenen Untersuchungen beziehen sichdaher ausschließlich auf den Druckaufschluß bei 180°C imPTFE-Gefäß, wobei die nach dem Aufschluß erhaltenenLösungen jeweils bei 130°C unmittelbar im PTFE-Gefäß abge-raucht und mit 0 .5 ml 69 Eiger Salpetersäure und Wasser zu

10 .0 ml aufgenommen wurden .

4 .7 .2 Voltammetrische Messungen nach Druckaufschlußweiterer Materialien ; Vergleich mit den Ergebnisssender Algen- und Leber-Untersuchungen

Die bei der inversvoltammetrischen Spurenbestimmung nachDruckaufschluß biologischer Materialen bei 180°C auftreten-den Störeffekte (erhöhter Wasserstoffstrom bei -1,2 V ;Störsignale bei -0 .55 und -0 .05 V) sind in ihrer Intensitätunabhängig von der Anreicherungszeit für die Spuren ; dieHöhe der Schwermetallsignale nimmt dagegen mit ansteigenderAnreicherungszeit zu . Zur näheren Untersuchung dieser Stör-einflüsse könnte also auch ohne Voranreicherungsschrittgearbeitet werden . Bei den im folgenden beschriebenen Mes-sungen wurde allerdings die bei der Analyse von Leber-Auf-schlußlösungen gewählte Anreicherungszeit von 10 s beibe-halten . Für die Untersuchungen wurden die in Tab .8 zusam-mengestellten Probenmaterialien ausgewählt, von denenjeweils eine 90 mg Kohlenstoff entsprechende Einwaage mitüberschüssiger Salpetersäure (3 ml 69 %ige HN03) über 3 hbei 180°C im 35-ml-Tiegel aufgeschlossen wurde . Nach Ab-rauchen bei 130°C wurde der Rückstand mit 0 .5 ml Salpeter-säure und Wasser zu 10 .0 ml aufgenommen . Alle Ergebnissesind also miteinander vergleichbar, da sie unter gleichenAufschlußbedingungen erhalten wurden . In Tab .9 sind eben-falls die durch Verbrennung der Aufschlußrückstände ermit-telten RKG-Werte aufgeführt . Wie man sieht, korrelierendiese gut mit dem Stickstoffgehalt des Probenmaterials(r = 0 .93) (Abb .27) . Der Gehalt an Stickstoff kann dabei

7 6

Tab .8 : Restkohlenstoffgehalte biologischer Materialien nachDruckaufschluß bei 180°C ; C- und N-Gehalte der Aus-gangsstoffe6

00144w0

N

Ox

ma

Stickstoffgehalt (%)

Abb .27 : Abhängigkeit des RKG-Wertes vom Stickstoffgehaltder untersuchten Probenmaterialien

Probenmaterial C-Gehalt (%) N-Gehalt (%) RKG

Weizenmehl 43 .0 2 .5 1 .0Braunalgen 35 .2 3 .1 1 .1Magermilchpulver 41 .3 5 .6 1 .7Spinat 37 .8 6 .3 2 .6Fischfilet 50 .6 11 .1 4 .0Rinderleber 51 .5 11 .5 3 .6Hühnerei (Eiklar) 46 .0 13 .3 4 .5Haemoglobin 46 .3 14 .9 6 .0Casein 48 .8 15 .0 3 .7Albumin 48 .6 16 .0 3 .9Schweineblut 50 .6 16 .0 5 .8

7 7

weiterhin als Maß für den Eiweißgehalt der Proben angesehenwerden . Reine Kohlenhydrate, die keinen meßbaren Stick-stoffgehalt aufweisen, werden praktisch vollständig aufge-schlossen (RKG-55 0 .08 %) (Abb .27) . Da es sich bei allen hieruntersuchten Stoffen um fettarme Materialien handelt, undKohlenhydrate wie Stärke (z .B . in Mehl), Cellulose (z .B . inPflanzen) und Disaccharide (z .B . in Milch) praktisch voll-ständig abgebaut werden (22,23), kann festgehalten werden,daß der Restkohlenstoffgehalt proportional zum Eiweißgehaltder Proben ansteigt . offensichtlich sind es also Bestand-teile von Proteinen, die beim Aufschluß zu Rückständen füh-ren . Geht man davon aus, daß nur einiage der natürlich vor-kommenden Aminosäuren unvollständig zersetzt werden, soläßt sich erklären, daß die Korrelation zwischen Stick-stoffgehalt und Restkohlenstoffgehalt nicht höher ist :Eiweißstoffe unterscheiden sich, je nach Art und Herkunft,in den sie aufbauenden Aminosäuren .

Die voltammetrischen Untersuchungen unter Anwendung derSWASV unter den in Kap .4 .7 .1 angegebenen Bedingungen führ-ten bei allen in Tab .8 aufgeführten Substanzen zu iden-tischen Störsignalen . Für vier der untersuchten Materialien(Algen, Milchpulver, Leber, Schweineblut) sind die Voltam-mogramme im Bereich zwischen -0 .75 und 0 .25 V in Abb .28dargestellt . Alle Voltammogramme enthalten auch hier zweiStörsignale, ein intensives bei -0 .05 V sowie ein relativflach verlaufendes bei -0 .55 V (vgl . Kap .4 .71) . DPASV-Messungen führen zu gleichen Störsignalen . Das wenigerintensive Signal bei Algen wird trotz der kurzen Anreiche-rungszeit von den Signalen der in relativ hohen Konzentra-tionen enthaltenen Schwermetalle Cd und Pb überlagert . DieAbhängigkeit der Signalhöhen beider Störpeaks vom Stick-stoffgehalt der Proben (vgl . Abb .28) ist in Abb .29 und 30dargestellt .

Leber

2.

Abb .28 : Square-Wave-Voltammogramme von Druckaufschlußlö-sungen verschiedener biologischer Materialien(-0 .75 --> 0 .25 V)

nA/mg

nA/mg

7 9

Abb .29 : Störsignal 1 ; Abhängigkeit der Peakhöhe vom Stick-stoffgehalt der untersuchten Materialien (SWASV)

Stickstoffgehalt (%)

Stickstoffgehalt (%)

Abb .30 : Störsignal 2 ; Abhängigkeit der Peakhöhe vom Stick-stoffgehalt der untersuchten Materialien (SWASV)

80

Tab .9 belegt die gute Korrelation von Signalhöhe undStickstoffgehalt .

Signal

r (SWASV)

r (DPASV)

1 0 .965 0 .9752 0 .988 0 .993

Tab .9 : Korrelationskoeffizient r für die Abhängigkeit derHöhe der Störsignale 1 und 2 (Abb .28) vom Stick-stoffgehalt der Ausgangsprobe

Der Wasserstoffstrom I .L bei -1 .2 V wurde auf den Stromeiner rein wäßrigen Modell-Lösung gleicher Acidität 1 2 so-wie auf die Einwaage E normiert . Der Quotient I 2 /I2 " Ewurde gegen den Stickstoffgehalt der Ausgangssubstanz auf-getragen (Abb .31) . Danach nimmt der Wasserstoffstrom mitsteigendem Stickstoffgehalt zu, die Korrelation (SWASV :r = 0 .93 ; DPASV : r = 0 .90) ist zwar schlechter als die derStörsignale, sie reicht aber wohl aus, um auch die Erhöhung

des Wasserstoffstromes auf Eiweißbestandteile zurückzufüh-ren . Die Reproduzierbarkeit der Störsignale 1 und 2 sowiedie des Wasserstoffstromes wurde an 5 Leber-Aufschlußlö-sungen durch SWASV untersucht . Aus jeder Lösung wurden 5aliquote Teile analysiert . Die Ergebnisse sind Tab .10 zuentnehmen . Für den an wäßriger Vergleichslösung gemessenenWasserstoffstrom wurden folgende Daten ermittelt :k = 4 .0 gA; s= = 0 .05 ; N = 10 .

I2 " E

2 4 6

8 1

8

Stickstoffgehalt

I 1 = Wasserstoffstrom Probe ;12 = Wasserstoffstrom Vergleichslösung ;E = Einwaage in g

Abb .31 : Wasserstoffstrom bei -1 .2 V ; Abhängigkeit vomStickstoffgehalt des untersuchten Materials (SWASV)

U)

Ln r` aoer kO O0 0 0

r1 NC1 M OO o r1

0 o O

LnN M %D

82

U

44

Nä

a)a)

ro

Ä

CoN

A - A3

02'd 41 bb

b 3 b

44

9, rl

Li.

Id a) to

(1)$

4j N 4-3

S-1N

V) r4 U2

:O$4ta

ra

O

o

O

0

O

A

a):O

to fl

"rl0 Wa)~

11tuz

r.a)~+1tuä

41V2

N.d

41

Ixr, oN r1 %D

wt~ tr x

O N 111rf 'OL) P 'd (0 'd Ä

a) "O y

NN ~~ ~ "N 3O r3i I~4j W

N .I~""

N 'rfM Ü

xr~icd

N

-fto

U)4444 >O

4-),i Lnx., N

0C3 44u :it12 Q',

Mc3utn

p4 Ma) :ia

. C!

444-1a)

r," ri(0

$Z"riU)

NN)-I r1O 1

II 11 ü

..O

fa

+1:O :O N " r14-) +3 1d a)u2 u2 A

I ~ "rl

m

I~

Hto

A1dE-1

0 0 0

N

N

N t0Nrl tC r`

o 0

0 ö ö N ~ H

Nd' CY) M1-1 O 0

~O O O a) a)~ ~O

Ch C% N 44.d

Ln 111 to 4.10 0 0

ö0 0 0

02 c:

83

4 .8 Kohlenstoffbilanz und voltammetrische Untersuchun en anAufschlu lösun en definierter or anischer Verbindun en

Um festzustellen, welche in Biomaterialien vorkommendenorganischen Stoffe beim Druckaufschluß mit Salpetersäurebei 180°C nicht oder nur unvollständig abgebaut werden, undum einen Einblick zu gewinnen, welche dieser Stoffe bzw .ihrer Zersetzungsprodukte zu den im vorangehenden Abschnittbeschriebenen Störeffekten bei der inversen Voltammetriebeitragen, wurde eine Reihe definierter Verbindungen aufge-schlossen und untersucht .

4 .8 .1 Auswahl der untersuchten Verbindungen ;Aufschlußbedingungen

Die Auswahl der untersuchten Stoffe orientiert sich anLiteraturangaben über ihr Vorkommen in Biomaterialien(133,134), wobei drei Gesichtspunkte berücksichtigt wurden :

1 . Die Substanz ist in biologischen Materialien in so hoherKonzentration vorhanden, daß ihr Kohlenstoffanteil beider Betrachtung des RKG-Wertes berücksichtgt werden muß .

2 . Die Substanz ist interessant, da ihr AufschlußverhaltenHinweise auf den Mechanismus des Druckaufschlusses er-warten läßt .

3 . Die Substanz hat gleiche oder ähnliche Strukturelementewie eine in Biomaterialien vorkommende Verbindung, diejedoch aus Kostengründen nicht zugänglich ist .

Der Aufschluß wurde unter den bereits mitgeteilten Bedin-gungen (180°C, 3 h, 3 ml 69 %ige HN03, 35-ml-Tiegel) durch-geführt, wobei die Proben mit Einwaagen entsprechend 90 mgKohlenstoff eingesetzt wurden . Die einheitliche Begrenzungauf 90 mg C war notwendig, um das bei einigen Verbindungenbei höheren Einwaagen auftretende "Abblasen" der Reaktions-gase zu vermeiden . Dazu wurden die Kohlenstoffgehalte der

Aufschluß 1 ohne Abrauchenim PTFE-Gefäß

Aufschluß 2 mit Abrauchenim PTFE-Gefäßbei 130°C

1 .2 .

8 4

unzersetzten Ausgangsstoffe durch Elementaranalyse be-stimmt . Von jeder Substanz wurden 2 Aufschlüsse durchge-führt ; die Rückstände wurden folgendermaßen untersucht :

Abrauchen 130°CC-BestimmungVerbrennung

Abrauchen 130°CC-BestimmungVerbrennung

VergleichRKG-Werte

der

Die Reproduzierbarkeit der Aufschlüsse wurde durch Ver-gleich der Restkohlenstoffgehalte in den resultierendenLösungen überprüft . Für die voltammetrischen Untersuchungenwurden nur die Lösungen aus Aufschluß 2 verwendet .

Unlösliche Rückstände, die beispielsweise nach Aufschlußvon Phenylalanin und Benzoesäure zurückbleiben, wurdendurch kräftiges Rühren so gut dispergiert, daß sie beimAliquotieren mit aufgenommen werden konnten .

Zur Reaktivität der Substanzen wurde angenommen, daß derprimär ablaufende Schritt beim Aufschluß eines biologischenMaterials eine saure Hydrolyse ist, von der folgende Bin-dungen betroffen sind :

Peptidbindungen in Proteinen .Esterbindungen in Fetten und Phosphorsäureestern .Glykosidische Bindungen in Kohlenhydraten, Nucleosiden,usw . Es wird erwartet, daß die Hydrolyseprodukte ausdieser Primärreaktion (Aminosäuren, Fettsäuren, Gly-

cerin, Monosaccharide, Stickstoffbasen, usw .) an-schließend als isolierte Moleküle unabhängig von ihrenehemaligen Bindungspartnern weiterreagieren . DieseAnnahme erscheint sinnvoll, da Peptidketten bereits mit6-N-Salzsäure bei 110°C gespalten werden (135) und auchdie Ester-Hydrolyse unter relativ milden Bedingungenabläuft (136) .

4 .8 .2 Kohlenstoffbilanz

Die folgende Tabelle gibt die untersuchten Stoffe, ihreHerkunft und die ermittelten Restkohlenstoffgehalte nachAufschluß wieder . Die Angabe "Restkohlenstoffgehalt unter-halb der zu !e 0 .08% C ermittelten Garantiegrenze für Rein-heit" wird vereinfacht durch "GR" ersetzt . Die Herkunft derSubstanzen wird durch die Lieferfirma (M = Merck, Darm-stadt ; F = Fluka, Buchs) und die Artikel-Nummer belegt .

Tab .ll : Ermittelte Restkohlenstoffgehalte der untersuchtenVerbindungen

Verbindung

1 . Aminosäuren und Peptide

8 5

Lieferant

% Rest-Art .Nr . Kohlenstoff

Alanin M 1007 GRAlanyl-alanin F 5250 GRAlanyl-glycin F 5270 GRAlanyl-tryptophan F 5400 5 .7Arginin M 1542 0 .14Asparagin M 1565 GRAsparaginsaure M 126 GRCystein M 2838 GRCystin M 2837 GR3,4-Dihydroxyphenylalanin M 4196 0 .14

86

Glutamin M 289 GRGlutaminsdure M 291 GRGlycin M 4201 GRGlycyl-glycin F 50200 GRGlycyl-histidin F 50280 16Glycyl-leucin F 50300 GRGlycyl-phenylalanin F 50370 43

Glycyl-tyrosin F 50471 GR

Histidin M 4351 31

Hydroxyprolin M 4506 GR

Isoleucin M 5362 GR

Leucin M 5360 GR

Leucyl-glycin F 61970 GR

Lysin, Monochlorid M 5700 GR

Methionin M 5707 10

Phenylalanin M 7256 57Phenylalanil-phenylalanin F 78120 57

Prolin M 7434 0 .12

Serin M 7769 GR

Threonin M 8411 GRTriglycin F 50240 GR

Tryptophan M 8374 12 .2

Tyrosin M 8371 GR

Valin M 8495 GR

2 . N-Methylierte Aminosäuren

Betain F 14290 81N,N-Dimethylglycin F 40360 GR

Sarcosin (N-Methylglycin) F 84530 GR

87

3 . Kohlenhydrate

Cellulose M 2330 GRDesoxyribose M 7606 GRFructose M 5321 GRGlucose M 8342 E GRInosit M 4731 GRLactose M 7660 E GRRibose M 7605 GRSaccharose M 7653 GRStarke M 1252 GR

4 . Fette und Fettbausteine

Glycerin M 4093 GRGlycerinmonopalmitat F 76184 GRGlycerindipalmitat F 42553 GRGlycerintripalmitat M 4099 GRÖlsaure (cis-9-Octadecensdure) M 481 GRLinolsdure (cis,cis-9,12- M 5353 10 .3Octadecadiensaure)Linolensaure (cis,cis,cis- F 62160 11 .49,12,15-Octadecatriensdure)Palmitinsdure (gesdttigte M 509 GRCarbonsäure Cx6)

Margarinsdure (gesattigte M 398 GRCarbonsäure CX7)Stearinsdure (gesdttigte M 674 GRCarbonsäure Cm e)

Nonadecansdure (gesattigte M 6840 GRCarbonsäure C,.s)Arachinsäure M 124 GR(gesattigte Carbonsäure C2o)

88

Carbonsäuren

Ascorbinsäure M 127 GRBrenztraubensäure F 15940 GRLiponsäure M 5645 GRMalonsäure M 800387 GRMilchsäure M 366 GROxalsäure M 495 GRTetradecandisäure F 87150 GRWeinsäure M 804 GRZitronensäure M 244 GR

7 . Stickstoffbasen ausMucleinsäuren

a . Purinderivate

Adenin M 838 0 .34Guanin M 4221 0 .18Hypoxanthin M 4517 0 .68

b . . Pyrimidinderivate

Cytosin M 2326 14 .1Thymin M 8209 0 .21Uracil M 8460 39

5 . Kurzkettige gesättigteMonocarbonsluren

Ameisensäure M 264 GREssigsäure M 55 GRButtersäure F 19210 GRCaprinsäure (gesättigte F 71407 GRCarbonsäure Cxo)

6 . Weitere nichtaromatische

89

9 . Nucleinsäuren

Desoxyribonucleinsäure M 24013 0 .41(aus Kalbsthymus)Ribonucleinsäure M 24018 0 .37(aus Bäckerhefe)

10 . Coenzyme, Vitamineund Zuckerphosphate

Adenosinmonophosphat, M 1428 0 .46DinatriumsalzAdenosintriphosphat, M 1432 0 .59DinatriumsalzDihydronicotinamid-adenin- M 24644 5 .8dinucleotidGlucose-l-phosphat M 8345 GRGlucose-6-phosphat M 8341 GRNicotinamid-adenin-dinucleotid M 24542 26Nicotinamid-adenin-dinucleotid- M 24541 25phosphat, DinatriumsalzNicotinsaure M 6817 95Nicotinsaureamid M 6818 96Riboflavinmonophosphat F 83810 2 .8

8 . Nucleoside

Adenosin M 862 0 .53Cytidin F 30270 GRInosin M 4723 0 .64Uridin F 94320 GR

90

11 . Steroide

epi-Androsteron M 3697 3 .1Cholesterin M 24622 2 .0

12 . Porphyrinsysteme

Haematoporphyrin F 51240 0 .08Haeminchlorid F 51280 0 .86

13 . Lecithine

Cholin (als Base) F 26980 0 .83Dipalmitoylecithin F 42556 GRLecithin aus Eiern F 61755 2 .7

14 . Amine und Harnstoff

1,2-Bis-(3-aminopropylamino)- F 14525 0 .28ethan1,6-Diaminohexan F 33000 GRDimethylamin-Hydrochlorid F 38960 GREthanolamin F 2400 GREthylendiamintetraessigsäure M 8417 GRHarnstoff M 8488 GRMethylamin-Hydrochlorid F 65600 GRTrimethylamin-Hydrochlorid F 92270 GR

9 1

Die bei zahlreichen Substanzen sehr niedrigen RKG-Wertesind wohl nicht in allen Fällen auf die Hauptkomponente,sondern auf Verunreinigungen in der Ausgangssubstanzzurückzuführen . Stoffe mit RKG - 1 % werden als genügendvollständig aufgeschlossen betrachtet, da ihre Konzentra-tion in Biomaterialien selbst so gering ist, daß die Rück-stände keinen nennenswerten Beitrag zum Gesamt-RKG liefern .Dies gilt auch für Cholesterin, Androsteron, Riboflavin undLecithin, die zwar RKG-Werte zwischen 2 und 3 % liefern, inbiologischen Materialien aber in so geringen Konzentra-tionen auftreten, daß die RKG-Beiträge keine Rolle spielen .Auch der Nicotinsäuregehalt (freie und gebundene Säure)biologischer Stoffe ist ebenfalls sehr gering (137), wieauch die Analyse einiger Materialien (Natec, Hamburg)zeigt : Milchpulver : 7 .6 Fege g-]. ; Algen : 19 .9 ug. g-1 ; Leber :327 gg .g-1 ; Schweineblut : 10 .7 gg.g- 1 . Die Werte stimmen

15 . Sonstige aromatischeVerbindungen

4-Aminohippursaure M 84 5 .2Benzoesaure M 135 72Hippursdure (N-Benzoyl-glycin) F 53280 582-Hydroxybenzoesäure F 84210 GR3-Hydroxybenzoesäure F 54610 GR4-Hydroxybenzoesäure F 54630 GR

16 . Sonstige nichtaromatischeVerbindungen

Cyclododecan F 28710 GREicosan (Alkan C2o) F 44820 GREicosanol (Alkohol C2o) F 44860 GRPolyethylen (Pulver) M 4722 GR

9 2

mit Angaben aus (137) gut überein . Leber ist danach einesder nicotinsäurereichsten Biomaterialien ; der Beitrag derNicotinsäure am Restkohlenstoffgehalt des Rückstandes einerLeberprobe errechnet sich zu 0 .03 % . Gemessen an dem tat-sächlich gefundenen Wert von 3 .6 % ist dies zu vernachläs-sigen . Das Verhalten von Nicotinsäure und ihrer Derivateliefert jedoch interessante Hinweise auf den Reaktionsme-chanismus des Druckaufschlusses (siehe Kap .5) . Auf dieUntersuchung halogenhaltiger Aminosäuren wurde verzichtet,da ihre Gehalte in biologischen Materialien ebenfalls nurgering sind, was durch die Bestimmung von Gesamt-Brom undGesamt-Jod in Algen und Leber bestätigt wurde (SCHÖNIGER-Aufschluß, Ionenchromatographie) . Der Bromgehalt von Algenbeträgt demnach etwa 250 gg.g-1 , die übrigen Werte liegenunter 100 gg.g- l . Rechnet man daraus auf mögliche Anteilean halogenhaltigen Aminosäuren im Probenmaterial, so istauch hier kein nennenswerter Beitrag zum RKG-Wert zu er-warten .

Interessant ist, daß Cytosin und Uracil nur teilweisemineralisiert werden, während die entsprechenden NucleosideCytidin und Uridin (Verbindungen aus Base und Zucker) voll-ständig aufzuschließen sind . Nach dem Aufschluß von Cytosinund Uracil findet man praktisch kein Stickstoffdioxid, beiCytidin und Uridin ist jedoch, wie beim Aufschluß allerKohlenhydrate, eine starke Bildung von NO2 zu beobachten .Wie in Kap .4 .6 .4 für Algen und Leber bereits gezeigt werdenkonnte, reicht das verfügbare NO2 zum optimalen Aufschlußvon Cytosin und Uracil offensichtlich nicht aus . Anders istdies bei den Nucleosiden : Hier wird der an die Basen gebun-dene Zuckeranteil nach Hydrolse vollständig unter NO2-Bil-dung zersetzt ; dies reicht dann aus, um auch die Basenquantitativ abzubauen . Man kann diesen Vorgang, bei dem derim Molekül enthaltene Zuckeranteil den Aufschluß verbes-sert, auch simulieren . Verringert man die Einwaage an Cyto-sin und Uracil bei gleichzeitigem Zusatz von Glucose, sogelingt bei sonst unveränderten Bedingungen ebenfalls ein

9 3

vollständiger Aufschluß der Basen . Auch bei Betain kann derRKG-Wert durch Zusatz von Glucose von 81 % auf etwa 1verringert werden (siehe Abb .35) . Aus diesen Befunden kannalso wohl geschlossen werden, daß die Anteile an Betain,Cytosin und Uracil in biologischen Materialien - soferngleichzeitig genügend NOZ-liefernde Stoffe enthalten sind,stets quantitativ abgebaut werden .

Die an den schwierig abbaubaren Basen gewonnenen Ergebnisselegten es nahe, die Wirksamkeit von Glucose als "Aufschluß-hilfe" auch an anderen Materialien zu erkunden . Dazu wurdenAufschlüsse durchgeführt, bei denen die zu untersuchendeSubstanz jeweils nur zu einer 9 mg C entsprechenden Ein-waage (also zu 1/10 der ursprünglichen Menge) eingesetztwurde . Der an 90 mg C fehlende Kohlenstoff wurde jeweils inForm von Glucose zugesetzt, die im Aufschluß vollständigmineralisiert wird . Die in Tab .12 angegebenen RKG-Werte be-ziehen sich auf den Kohlenstoffanteil, der durch die schwerabbaubare Substanz eingebracht wurde . Die Werte liegen beiGlucose-Zusatz in fast allen Fällen niedriger als ohne Glu-cose gefunden wird . Dieser Einfluß ist erwartungsgemäß beidenjenigen Stoffen am größsten, die die höchsten RKG-Werteaufweisen, die also selbst zu wenig reaktiv sind, um genü-gend Stickoxid zum optimalen Aufschluß liefern zu können .

Daß tatsächlich die Glucose und nicht das bei Verringerungder Substanzeinwaage veränderte Säure/Probe-Verhältnis fürdie Verbesserung des Aufschlusses verantwortlich ist,zeigen die auch bei Säure-Erhöhung unverändert bleibendenRKG-Werte (vgl . Kap .4 .6 .1) . Eine zur Glucose analoge Wir-kung beim Aufschluß reaktionsträger Probenbestandteile läßtsich auch bei "realen" Matrixkomponenten nachweisen : Mischtman Algenpulver mit Phenylalanin (4 - 15 mg) zu einem Ver-hältnis, bei dem die Gesamtkohlenstoffmenge der Probe un-verändert bei 90 mg bleibt, so findet man für Phenylalanin- unabhängig von der eingesetzten Menge - RKG-Werte von

9 4

45 ± 4 % (N = 6) . Der entsprechende Wert bei Glucose-Zusatz

'`)Berechnet aus der Garantiegrenze für Reinheitdes RKG-Wertes

Tab .12 : Vergleich von Restkohlenstoffgehalten beim Druck-aufschluß definierter Stoffe mit und ohne Zusatzvon Glucose

Nach Aussage von Tab .11 und 12 und unter Berücksichtigungder zu erwartenden Probengehalte liefern beim Aufschlußbiologischer Materialien nur folgende Stoffe nennenswerteorganische Rückstände :

beträgt 44 % (Tab .12) .

Stoff RKG ohne Glucose- RKG mit Glucose-Zusatz (%) Zusatz (%)

Methionin 10 ± 3 9 ± 2Tryptophan 12 .2 9 .8Linolsäure 10 .3 10 .0Linolensäure 11 .4 7 .5Cytosin 14 .1 ie 0 .8 -Uracil 39 2E 0 .8")Betain 81 0 .9Nicotinsäure 91 70NAD 26 23Histidin 31 25Benzoesäure 72 41Hippursäure 58 33Phenylalanin 57 44

1 . Phenylalanin2 . Methionin3 . Tryptophan4 . Histidin5 . Linolsaure .

9 5

Linolensäure ist in natürlichen Fetten nur in geringen Kon-zentrationen (Oliven-, Maiskeim- und Sonnenblumenöl : 1 % ;Natec, Hamburg) enthalten . Hippursäure, Benzoesäure, Amino-hippursäure und Hydroxybenzoesäuren kommen in biologischenMaterialien praktisch nicht vor . Ihr Verhalten liefert aberHinweise auf den Reaktionsmechanismus des Druckaufschlus-ses . Cytosin, Uracil und Betain werden in realer Matrixvollständig abgebaut, und auch Nicotinsäure und -derivatespielen aufgrund ihrer niedrigen Konzentrationen bei derKohlenstoffbilanz keine Rolle . Die Annahme, daß primärgebildete Hydrolyseprodukte unabhängig voneinander weiter-reagieren, wird durch das Aufschlußverhalten der Dipeptide,des Triglycins, der Nicotinsäurederivate sowie von Glyce-rinmonopalmitat, Glycerindipalmitat und Glycerintripalmitaterhärtet . Daraus lassen sich folgende Regeln ableiten :

Reqel 1

Reagieren ein Stoff A bzw . ein Stoff B im Druckaufschlußquantitativ, so wird auch die Verbindung A-B vollständigaufgeschlossen, sofern A und B durch Ester-, Peptid- oderGlykosidbindung verknüpft sind . Beispiele : Di- und Polysac-charide, Fette und Fettbausteine mit gesättigten Seiten-ketten, einige Dipeptide und Triglycin .

Regel 2

Reagiert ein Stoff A im Druckaufschluß quantitativ, einStoff B dagegen unvollständig, so wird auch die VerbindungA-B unvollständig aufgeschlossen . Dabei reagieren die Kom-

ponenten A und B nach Spaltung der Bindung unabhängig von-einander und es resultiert ein von B bestimmter Restkohlen-stoffgehalt . Kennt man den RKG-Wert des Aufschlußrückstan-des von B, so kann man denjenigen der Verbindung A-B ausder Stöchiometrie berechnen .

Beispiele :

9 6

a . Berechnet aus dem Gehalt an Nicotinsäure (RKG 96 %) :

Derivat

RKG berechnet

RKG gemessen

Nicotinsdureamid

96 %

95 %Nicotinamid-adenin-dinucleotid-

26 %

25 %phosphatNicotinamid-adenin-dinucleotid-

26 %

25 %

b . Berechnet aus dem Gehalt an Phenylalanin (RKG 57 %) :

Derivat

RKG berechnet

RKG gemessen

Phenylalanyl-phenylalanin

57 %

57 %Glycil-phenylalanin

47 %

43 %

c . Berechnet aus dem Gehalt an Tryptophan (RKG 12 .2 %) undHistidin (RKG 31 %) :

Derivat

RKG berechnet

RKG gemessen

Alanyl-tryptophan

9 .5 %

5 .7Glycil-histidin

23 %

16

Regel 3

9 7

d . Berechnet aus dem Gehalt an Benzoesäure (RKG 72 %) :

Derivat

RKG berechnet

RKG gemessen

Hippursaure

56 %

58 %

Die gemessenen RKG-Werte stimmen mit den Erwartungswertengut überein ; in einigen Fällen liegen die Meßwerte niedri-ger, da die reaktive Komponente der Verbindung die N02-Kon-zentration im System erhöht und somit einen vollständigerenAbbau des schwer abbaubaren Teils ermöglicht .

Reagieren ein Stoff A bzw . ein Stoff B im Druckaufschlußunvollständig, so wird auch die Verbindung A-B unvollstän-dig aufgeschlossen . Der Restkohlenstoffgehalt ergibt sichaus den Einzelwerten der Komponenten A und B sowie aus derStöchiometrie der Verbindung A-B .

Zur Überprüfung von Regel 3 wurden sechs aus den Aminosäu-ren Methionin, Phenylalanin, Tryptophan und Histidin aufge-baute Dipeptide (Serva, Heidelberg) untersucht . Dazu wurdenjeweils 10 mg unter Zusatz von Glucose (insgesamt 90 mg C)mit 3 ml 69 Eiger Salpetersäure aufgeschlossen . In Tab .13sind die berechneten RKG-Werte den gemessenen Werten gegen-übergestellt ; sie zeigen eine befriedigende Übereinstim-mung . Die Bezugsdaten für die RKG-Werte der einzelnenAminosäuren wurden Tab .12 entnommen .

9 8

Tab .13 : Aufschluß von Dipeptiden ; Vergleich der berechnetenund der gemessenen RKG-Werte

4 .8 .3 Restkohlenstoffgehalte nach Aufschluß biologischerProben und Probenkomponenten

In einer Reihe biologischer Probenmaterialien wurden dieGehalte an den als unvollständig abbaubar erkannten Kompo-nenten ermittelt (Tab .14) .

Die Gehalte an mehrfach ungesättigten Fettsäuren in denfettarmen pflanzlichen und tierischen Materialien sind da-bei vernachlässigbar gering (137) . Dies gilt auch für dieAminosäure-Gehalte in Ölen und geklärter Butter, derenStickstoffgehalte jeweils unterhalb von 0 .2 % liegen . DieLinolsäure-Gehalte in Maiskeimöl 2 und Sonnenblumenöl 2sind Herstellerangaben .

Um das Abbauverhalten der Aminosäuren in Gegenwart leichtaufschließbarer Matrixkomponenten zu simulieren, wurdenzunächst auch hier Mischungen mit Glucose eingesetzt . DieEinwaagen wurden dabei so gewählt, daß bei unveränderterGesamtkohlenstoffmenge von 90 mg C der Glucose-Anteil derMischungen erniedrigt wurde . In Abb.32-35 ist der Verlaufder Restkohlenstoffgehalte in diesen Mischungsreihen dar-

Dipeptid RKG berechnet RKG gemessen

Methionyl-tryptophan 10 .4 8 .4Methionyl-histidin 17 .7 23 .0Methionyl-phenylalanin 31 .5 29 .2Tryptophyl-phenylalanin 25 .9 25 .3Histidyl-phenylalanin 36 .4 31 .2Histidyl-tryptophan 15 .9 16 .0

9 9

gestellt . Bei Methionin (wie auch bei Linolsäure) ist derRKG-Wert vom Glucose-Zusatz unabhängig .

Tab .14 : Zusammensetzung biologischer Materialien bezüglichder unvollständig abbaubaren Bestandteile

Mit : Phe = Phenylalanin

Met = MethioninHis = Histidin

Lin = LinolsdureTry = Tryptophan

Probenmaterial Phe( %) His(%) Try(%) Met(%) Lin( %)

Algen 0 .66 0 .97 0 .2 0 .23Milchpulver 1 .46 2 .50 0 .2 -,!!E0 .5Leber 3 .63 3 .02 0 .7 1 .41Schweineblut 5 .29 7 .28 1 .2 'E 0 .5

Olivenöl 8 .2Maiskeimöl 1 43 .7Maiskeimöl 2 55Sonnenblumenöl 1 57 .8Sonnenblumenöl 2 60Butterfett 1 .1

v

01w4404.3

40

20 0

9

18

27

36

45

54

63

72

81

90

C als Histidin (mg)

Abb .32 : Histidin ; Abhängigkeit des RKG von der Einwaage bei

40

10 0

0 9 18 27 36 45 54 63 72 81 90

C als Phenylalanin (mg)

Abb .33 : Phenylalanin ; Abhängigkeit des RKG von der Einwaagebei Zusatz von Glucose (ergänzt zu 90 mg C gesamt)

Zusatz von Glucose (ergänzt zu 90 mg C gesamt)

80

+J

10a) 7001w4-40

60-

0x

ä 501

40

4-44-40

am

0xmWx

Abb .34 : Tryptophan ; Abhängigkeit des RKG von der Einwaagebei Zusatz von Glucose (ergänzt zu 90 mg C gesamt)

v

44440-P

am

0x+)a)x

100

80

60

40

20

00

9 18

9 18

27

27

36

36 45

45 54 63 72 81 90

C als Tryptophan (mg)

54 63 72 81 90

C als Betain (mg)

Abb .35 : Betain ; Abhängigkeit des RKG von der Einwaage beiZusatz von Glucose (ergänzt zu 90 mg C gesamt)

Bei Phenylalanin, Histidin und Tryptophan gehen die RKG-Werte mit abnehmenden Anteilen in der Probeneinwaage zu-rück ; auch in den entsprechenden realistischen Bereichen,die ihre Konzentration in biologischen Materialien Wieder-spiegeln, ändern sich die RKG-Werte nur wenig . Daher können

die in diesen Bereichen beobachteten Werte durch Mittelungzu dem für biologische Proben realistischen RKG zusammen-gefaßt werden . Es ergeben sich folgende realistische Rest-

- )Aus Tab .12 übernommen

10 2

Während der RKG-Wert bei den erstgenannten drei Aminosäurenauch mit ansteigender NO2 -Konzentration im Reaktionsgemischnur langsam auf einen nicht weiter unterschreitbaren Wertabfällt, wird Betain schon durch Zusatz von wenig Glucosepraktisch vollständig aufgeschlossen : Setzt man einer 90 mg

Kohlenstoff entsprechenden Betain-Einwaage vor dem Auf-schluß neben 3 ml 69 %iger Salpetersäure 50 g1 flüssiges

NOZ zu, so wird der RKG von sonst 81 auf 7 % verringert .Die kleine Menge NO2 reicht offensichtlich aus, um dieReaktion "anspringen" zu lassen . Setzt man an Stelle von

NO2 ein Gas wie CO2 oder C2F4C12 zu, so wird dieser Effekt

nicht beobachtet . Die alleinige Druckerhöhung im Systemscheidet als Ursache also aus . Die Stickstoffbasen Uracilund Cytosin verhalten sich gegenüber NO2 analog .

In den nachfolgend beschriebenen Versuchen wurden die inTab .14 aufgeführten aminosäurehaltigen Materialien mit Ein-waagen eingesetzt, die jeweils 90 mg C entsprechen . Die

kohlenstoffgehalte :1 . Phenylalanin : 44 %2 . Histidin : 27 %3 . Tryptophan : 11 %4 . Methionin : 9 % w>

5 . Linolsäure : 10 % "~

10 3

darin enthaltenen Aminosäure-Mengen - berechnet aus denWerten der Tab .14 - sind in Tab .15 zusammengestellt .

Tab .15 : In 90 mg C entsprechenden Einwaagen biologischerMaterialien enthaltene Aminosäure-Mengen

Aus den Tabellenwerten und aus den für jede einzelne Amino-säure in biologischen Materialien zu erwartenden RKG-Werten(vgl . 5 .102) können die Gesamt-Restkohlenstoffgehalte abge-schätzt werden . In Tab .16 sind solche Werte für vier unter-schiedliche Probenmaterialien den entsprechenden Meßergebnissen gegenübergestellt .

Tab .16 : Berechnete und beobachtete Gesamt-RKG-Werte beimDruckaufschluß biologischer Materialien

Bei Algen und bei Milchpulver konnten die Beiträge vonTryptophan, bei Milchpulver und Blut die von Methionin

Probenmaterial Einwaage(mg)

Phe/mg His/mg Try/mg Met/mg

Algen 256 1 .7 2 .5 0 .5 0 .6Milchpulver 218 3 .2 5 .5 X0 .5 -!-= 1Leber 175 6 .4 5 .3 1 .2 2 .5Schweineblut 178 9 .4 13 .0 2 .1 2251

Stoff RKG berechnet (%) RKG gemessen (%)

Algen 0 .9 1 .1Milchpulver 1 .7 1 .7Leber 3 .0 3 .6Schweineblut 5 .0 5 .8

nicht berücksichtigt werden, da deren Gehalte nicht zugäng-lich waren . Die entsprechenden RKG-Werte können jedochdurch Tryptophan maximal um 0 .04 %, durch Methionin maximalum 0 .05 % erhöht sein, was für die Bilanz von nur unterge-ordneter Bedeutung ist . Die gute Übereinstimmung belegtauch hier die Richtigkeit der zugrundeliegenden Annahmen .

In Abb .36 ist die Abhängigkeit des Restkohlenstoffgehaltesvom Linolsäure-Gehalt bei Fetten dargestellt . Der RKG-Wertfür reine Linolsäure beträgt 10 .3 % (Tab .12) . Die Auf-schlüsse konnten aus den erwähnten Gründen ohne Zusatz vonGlucose durchgeführt werden, wobei die in Tab .14 angegebe-nen linolsäurehaltigen Fette als Probenmaterialien einge-setzt wurden . Die Linolsäure-Gehalte der untersuchten Fettekönnen ebenfalls Tab .14 entnommen werden . Der experimentellermittelte Restkohlenstoffgehalt beim Aufschluß von Butter-fett mit einem Linolsäure-Gehalt von 1 .1 % beträgt 0 .11 ~ .Das Butterfett wurde durch Erhitzen von Butter gewonnen,wobei die enthaltenen Proteine ausflocken und abgetrennt

12

am01444-i0

a)

0x+J

a)x

10 4

Abb .36 : Fette ; Abhängigkeit des RKG-Wertes vomLinolsäure-Gehalt

Linolsäure-Gehalt (%)

10 5

wurden . Das Ergebnis des Aufschlusses zeigt deutlich, daßdie gesättigten Fettsäuren der Butter vollständig abgebautwerden und der Rückstand ausschließlich auf Linolsäure zu-rückgeführt werden kann .

4 .8 .4 Voltammetrische Untersuchungen an Aufschlußlösungenorganischer Substanzen

Für die square-wave-inversvoltammetrischen Untersuchungenwurden Lösungen aus den Aufschlüssen der in Tab .11 aufge-führten Verbindungen ohne Glucose-Zusatz (vgl . Kap .4 .8 .2)verwendet . Das Meßverfahren wurde in Kap .4 .5 beschrieben .Je 1 .0 ml einer Aufschlußlösung wurde mit 5 ml Wasser versetzt . Nach Entlüften wurde 10 s bei -1 .2 bzw . -0 .75 Velektrolytisch angereichert . Die Signale der Substanzenkönnen in eine Reihe ansteigender Intensitäten eingeordnetwerden, wenn jeweils das intensivste Störsignal berück-sichtigt wird . Wird im Bereich zwischen -0 .75 und 0 .25 Vmehr als ein Peak beobachtet, so wird dies nachfolgend inKlammern vermerkt . Es ergibt sich folgende Rangordnung :

1 . Verbindungen mit Signalen X 10 nA- alle Kohlenhydrate- alle Fette und Fettbausteine außer ungesättigteFettsäuren

- alle nichtaromatischen Carbonsäuren- Prolin und alle vollständig aufschließbaren Aminosäurenund Peptide, außer Tyrosin und seine Derivate

- Glucosephosphate- Eicosanol- Methylamine- Harnstoff, Ethanolamin, Ethylendiamintetraessigsäure- Palmitoyllecithin und Cholin- Methylierte Glycine- Cytidin, Uridin, Guanin- Methionin

10 6

2 . Verbindungen mit Signalen 10-100 nA- Ölsäure- Eicosan- Arginin, Tyrosin, Glycil-tyrosin- Adenin- Linolsäure- Hypoxanthin- AdenosinDiaminohexan

- Linolensäure

3 . Verbindungen mit Signalen 100-500 nA- Desoxyribonucleinsäure, Ribonucleinsäure- Adenosinmonophosphat, Adenosintriphosphat- Nicotinsäure und -amid- Dihydroxyphenylalanin- Lecithin aus Eiern (2 Signale)- Haematoporphyrin- 1,2-Bis-(3-aminopropylamino)-ethan- Thymin, Inosin- Cholesterin- Androsteron (2 Signale)- Dihydronicotinamid-adenin-dinucleotid

4 . Verbindungen mit Signalen .:~!t 500 nA- Haeminchlorid 780 nA- Aminohippursäure 3700 und 700 nA (2 Signale)- Nicotinamid-adenin-dinucleotid 600 nA- Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat 600 nA- Histidin 2500 nA- Cytosin 82000 nA- Glycil-histidin 530 nA- Riboflavin 6000 nA- Tryptophan 2300 nA- Alanyl-tryptophan 1500 nA

107

- Uracil 88600 nA 6>

- Glycil-phenylalanin 27000 und etwa 2000 nA (2 Signale) 6 )- Phenylalanin 32000 und etwa 3000 nA (2 Signale) 6 )- Phenylalanil-phenylalanin 32000 und etwa 3000 nA

(2 Signale) 6 )- Benzoesäure 40000 und etwa 3000 nA (2 Signale) 6 )- Hippursäure 43000 und etwa 3000 nA (2 Signale) 6 )

Die Lösungen von Cyclododecan, Polyethylen und die der dreiHydroxybenzoesäuren wurden nicht voltammetrisch untersucht .Stoffe, die praktisch vollständig abgebaut werden, liefernkeine oder nur geringfügige Störsignale, die unter Umstän-den auch auf Verunreinigungen der Ausgangsproben zurückzu-führen sind . Die in biologischen Materialien zu erwartendenGehalte der untersuchten Stoffe machen deutlich, daß nurdie Aminosäuren Phenylalanin, Histidin und Tryptophan einennennenswerten Beitrag zu Störsignalen bei der Analysesolcher Stoffe leisten .

Uracil und Cytosin liefern zwar intensive Signale, die ent-sprechenden Nucleoside Uridin und Cytidin werden jedochvollständig abgebaut und verursachen deshalb keine nennens-werten Störungen (vgl . Kap .4 .8 .2) . Benzoe-, Hippur- undAminohippursäure kommen in biologischen Materialien prak-tisch nicht vor .

Die aus den Aufschlußlösungen von Benzoe- und Hippursäureresultierenden Signale stimmen mit denen nach Aufschluß vonPhenylalanin und seiner Derivate überein . Eine quantitativeBewertung der Signale ist bei den letztgenannten Verbin-dungen aufgrund der hohen unlöslichen Anteile im Aufschluß-rückstand nicht möglich . Neben den Störsignalen wurde bei

6 >Die zu 10 .0 ml aufgenommenen Aufschlußrückstände konntennicht vollständig in Lösung gebracht werden . Zur voltam-metrischen Untersuchung wurde nur die überstehende Lösungeingesetzt . Die unter Analysenbedingungen auftretendenStörsignale sind also weit intensiver, da in allen Fällenbedeutende Rückstände hinterbleiben .

10 8

den Aufschlußlösungen der tabellierten Verbindungen auchder Wasserstoffstrom bei -1 .2 V ermittelt . Bildet man denQuotienten aus den Wasserstoffströmen der ProbelösungenI H2 (Pr) sowie einer Modell-Lösung von gleicher AciditätIH2 (Mod), so können die untersuchten Verbindungen in einerReihe ansteigender Verhältniszahlen geordnet werden :

1 . IH2 (Pr)/IH2 (Mod) : 1-1 .5- alle Aminosäuren, außer Tryptophan, Histidin undPhenylalanin

- alle Peptide, die keine dieser drei Aminosäurenenthalten

- alle Kohlenhydrate- alle Fette und Fettbausteine- alle nichtaromatischen Carbonsäuren- Glucosephosphate- Methylamine- alle Nucleoside- Eicosan, Eicosanol- Palmitoyllecithin- Adenosinmonophosphat und Adenosintriphosphat- Methylierte Glycine- Ethylendiamintetraessigsäure- Cholin, Ethanolamin, Diaminohexan- alle Purinbasen und Thymin

2 . 1112 (Pr)/IH2 (Mod) : 1 .5-2- 1,2-Bis-(3-aminopropylamino)-ethan- Cholesterin und Androsteron- Ribonucleinsäure

3 . IH2 (Pr)/IH2 (Mod) : 2- Harnstoff 3 .4- Haematoporphyrin 2 .7- Desoxyribonucleinsäure 2 .8- Haeminchlorid 2 .9- Lecithin aus Eiern 4 .3

10 9

Dihydronicotinamid-adenin-dinucleotid 5 .3Aminohippursäure 7 .2Nicotinamid-adenin-dinucleotid 30Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat 28Histidin 4 .4Cytosin 4 .0Nicotinsdure 60Nicotinsäureamid 58Glycil-histidin 2 .8Alanyl-tryptophan 9 .5Tryptophan 8 .8Riboflavin 16Uracil 5 .0 6)

Glycil-phenylalanin 4 .6 6)

Phenylalanin 4 .1 6>

Phenylalanil-phenylalanin 4 .3 6)

Benzoesaure 4 .3 6>

Hippursaure 3 .3 6)

Alle Verbindungen, die eine Erhöhung des Wasserstoffstromesum den Faktor 1-2 bewirken, sind - auch aufgrund ihrergeringen Konzentrationen in biologischen Materialien - fürdie Abschätzung der Bilanz des Wasserstoffstromes belang-los . Da die Aufschlußlösungen durch überschüssige Salpeter-säure ohnehin stark sauer sind, fallen beim Aufschluß ge-bildete anorganische Säuren (Schwefelsäure aus S-haltigenAminosäuren, Phosphorsäure aus ihren Estern) nicht ins Ge-wicht . Der Aufschluß von Harnstoff zeigt, daß entstehendeAmmonium-Ionen ebenfalls zu einer Erhöhung des Wasserstoff-stromes führen . Die Frage, ob und aus welchen AminosäurenAmmonium gebildet wird, wird zusammen mit der Phosphor- undSchwefel-Bilanz behandelt (Kap .4 .11) .

6 )vgl . Fußnote 6) auf Seite 107

Nicotinsäure und ihre Derivate verursachen - verglichen mitden anderen Substanzen - einen besonders stark erhöhtenWasserstoffstrom . Dies steht mit den von NÜRNBERG (114)mitgeteilten Ergebnissen in Einklang, nach denen organischeStickstoffbasen eine katalytische Erhöhung des Wasserstoff-stromes bewirken (vgl . Kap .3 .3) .

Der erhöhte Wasserstoffstrom und die Tatsache, daß Nicotin-säure praktisch nicht abgebaut wird, deuten deshalb daraufhin, daß das aromatische System der Verbindung beim Auf-schluß erhalten bleibt . Dennoch spielen diese Verbindungenbei der Bilanz aufgrund ihrer niedrigen Konzentrationen inbiologischen Materialien keine Rolle . Für die Gesamtbilanzder Erzeugung von Wasserstoffströmen sind aus dieser letzt-genannten Gruppe wiederum nur die Aminosäuren Phenylalanin,Histidin und Tryptophan von Bedeutung .

Benzoesäure und Hippursäure führen zu Wasserstoffströmen inähnlicher Höhe wie Phenylalanin und dessen Derivate . Dahier auch übereinstimmende Störsignale im Bereich -0 .75 -0 .25 V beobachtet werden, ist zu vermuten, daß beim Auf-schluß gleiche oder ähnliche Verbindungen gebildet werden .

Festzustellen ist schließlich, daß die genannten Störungenin gleichem Maße auch bei der inversen Differential-Puls-Voltammetrie auftreten, und zwar sowohl die Wasserstoff-ströme, die in ihrer Höhe gut mit denen der inversenSquare-Wave-Voltammetrie übereinstimmen, als auch die Stör-signale, die, analog den Metallsignalen, hier wenigerintensiv sind . Entsprechendes gilt auch für den Grundstrom,was an Phenylalanin, Histidin, Tryptophan, Nicotinsäure undBenzoesäure überprüft wurde . Eine quantitative Abschätzungder Beiträge einzelner Reaktionsprodukte zum Wasserstoff-strom nach Aufschluß biologischer Materialien erfolgte anAminosäuren in den für biologische Materialien relevantenKonzentrationsbereichen unter Zusatz von Glucose .

Als unzersetzte Verbindungen verursachen Phenylalanin,Tryptophan und Histidin in salpetersaurer Lösung keinenennenswerten Störsignale, sofern diese Aminosäuren in fürBiomaterialien relevanten Mengen eingesetzt werden . Ledig-lich Histidin (1 .0 mg Histidin + 50 g1 69 %ige HN03 in6 ml Meßlösung) erhöht den Wasserstoffstrom bei -1 .2 V umden Faktor 3 .0, wenn man mit einer wäßrigen Lösung dersel-ben Acidität vergleicht ; Phenylalanin und Tryptophan gebenden Effekt nicht, der wohl darauf zurückzuführen ist, daßHistidin als Stickstoffbase die Wasserstoffabscheidungkatalysiert . Die bei der Analyse von Aufschlußlösungendieser Stoffe beobachteten Störungen sind folglich aufUmsetzungsprodukte zurückzuführen .

Quantitative Untersuchung der inversvoltammetrischenStörungen

Unter Zusatz von Glucose als "Hilfsmatrix" wurden Trypto-phan, Phenylalanin und Histidin in wechselnden Einwaagenaufgeschlossen, wobei die Kohlenstoff-Gesamtmenge jeweilskonstant bei 90 mg C gehalten wurde . Eingesetzt wurden :Phenylalanin : 0 .217-11 .00 mg ; Histidin : 1 .73-11 .12 mg ;Tryptophan : 0 .168-9 .61 mg . Die Verbindungen wurden unterdiesen Bedingungen zu klaren, rückstandsfreien Lösungenaufgeschlossen . Aus den Aufschlußlösungen des Phenylalaninsaus höheren Einwaagen - auch bei Schweineblut - fällt nachwenigen Tagen ein weißer Niederschlag aus, so daß dieseLösungen nur begrenzt haltbar sind . Die Reaktionsproduktedes Phenylalanins sind also, zumindestens teilweise, inverdünnter Säure schlecht löslich . Aufschlußlösungen desTryptophans liefern das in Abb .37, solche des Histidins dasin Abb .38 dargestellte Störsignal . Die Abhängigkeit derPeakhöhe von der Aminosäure-Einwaage ist aus Abb .39 und 40ersichtlich .

Abb .37 : Störsignal nach Druckaufschluß von Tryptophan unterGlucose-Zusatz (-0 .75 -- 0 .25 V) (SWASV)

Abb .38 : Störsignal nach Druckaufschluß von Histidin unterGlucose-Zusatz (-0 .75 -> 0 .25 V) (SWASV)

0

xw

Abb .39 : Tryptophan (Aufschluß unter Glucose-Zusatz) ; Ab-hängigkeit der Signalhöhe von der Einwaage (SWASV)

Einwaage Tryptophan (mg)

Abb .40 : Histidin (Aufschluß unter Glucose-Zusatz) ; Ab-hängigkeit der Signalhöhe von der Einwaage (SWASV)

Die mit der Konzentration ansteigenden Signale des Histi-dins (-0 .1 V) und des Tryptophans (0 V) sind in ihrer Formunabhängig von der Einwaage . Das Signal des Histidin-Rück-standes ist allerdings deutlich weniger intensiv . Der Rück-stand aus Tryptophan liefert ein zusammengesetztes Signal,was darauf hinweist, daß mindestens zwei Elektrodenreak-tionen ablaufen, beim Aufschluß vermutlich also verschie-dene Oxidationsprodukte gebildet werden . Der Beitrag desdurch den Histidin-Rückstand verursachten Signals zum"Störsignal 2" beim Aufschluß biologischer Materialien(Abb .49) ist gering ; analoges gilt für Tryptophan . BeimAufschluß von Schweineblut kann der Rückstand des Trypto-phans maximal 3 %, der des Histidins maximal 2 % zur Peak-höhe des "Signals 2" (Abb .49) beitragen . Das nach Aufschlußbiologischer Materialien beobachtete "Störsignal l" istalso auschließlich, das "Signal 2" zu etwa 95 % auf Reak-tionsprodukte des Phenylalanins zurückzuführen . Die Voltam-mogramme für Aufschlußlösungen aus verschiedenen Einwaagenvon Phenylalanin sind in Abb .41 dargestellt .

Bemerkenswert an Abb .41 ist, daß sich mit der Konzentrationnicht nur die Höhe der Signale ändert, sondern auch dieForm der Voltammogramme . Während der Aufschluß von 0 .217 mgPhenylalanin zu den bei biologischen Materialien beobachte-ten Störpeaks führt, steigt der Strom im Spannungsbereichzwischen Peak 1 und Peak 2 mit steigender Einwaage an, bisschließlich ein neues Signal an dieser Stelle erscheint .Dieses Verhalten wird bei Aufschlüssen biologischer Proben-materialien nicht beobachtet (vgl . Abb .28) . Die verschiede-nen Signale der Voltammogramme können also nicht miteinan-der verglichen werden . Verdünnt man die Phenylalanin-Auf-schlußlösung höchster Konzentration (9 .11 mg) bei konstan-ter Acidität (50 g1 HN03/6 ml), so erreicht man den glei-chen Effekt wie bei abnehmender Einwaage : Mit zunehmenderVerdünnung nimmt das mittlere Störsignal ab und verschwin-det schließlich ganz . Der Effekt ist folglich konzentra-tionsabhängig und kann nicht auf unterschiedliche Reak-

n

(-0 .75 -, 0 .25 V) (SWASV)

3.

2

0.0

2 .43 mgPhenylalanin

9 .11 mgPhenylalanin n

Abb .41 : Aufschlüsse von Phenylalanin unter Glucose-Zusatz ;Abhängigkeit der Signalform von der Einwaage

tionsprodukte beim Aufschluß zurückgeführt werden . Zur nä-

heren Untersuchung dieses Verhaltens wurden die Gleichspan-

nungs-Polarogramme derselben Lösung gemessen (Tropfzeit0 .5 s, Spannungsvorschub 4 mV " s - '-) . Dabei wurde ausgenutzt,

I( " l0uA)

0.5

0.0

Abb .42 : Leber ; Gleichspannungs-Polarogramm der Aufschluß-lbsung (0 .25 -> -0 .85 V)

daß mit dieser Methode infolge der Reaktion der organischenLösungsbestandteile zwar Stufen erhalten werden, dieSchwermetallsignale aufgrund der niedrigen Konzentrationenund wegen der hier fehlenden elektrolytischen Voranreiche-rung jedoch noch nicht auftreten . Der für biologische Mate-rialien charakteristische Stromverlauf ist in Abb .42 amBeispiel des Polarogramms der Leber-Aufschlußlösung darge-stellt . Man beobachtet eine intensive polarographischeStufe bei -0 .07 V und eine zweite, weniger intensive beietwa -0 .35 V . Die Stufe bei -0 .35 V ist durch ein Maximumüberhöht, dessen Intensität jedoch so gering ist, daß es imSquare-Wave- und im Differential-Puls-Inversvoltammogrammnicht sichtbar ist . Der Stromverlauf in Abb .42 wird auchbei Aufschlußlösungen von Algen, Milchpulver und Schweine-blut beobachtet ; hier ändern sich lediglich die Stufenhöhenin Abhängigkeit vom Stickstoffgehalt der Ausgangsproben .

In Übereinstimmung mit dem durch Square-Wave-Voltammetrieerhaltenen Befund ist das Polarogramm der Lösung aus demAufschluß von 0 .217 mg Phenylalanin (Abb .43) mit der Kurveaus Aufschlußlösungen biologischer Materialien bezüglichder Stufenform identisch . Bei 2 .43 mg Phenylalanin ist dasbeschriebene polarographische Maximum jedoch bereits inten-siver als bei Aufschlußlösungen biologischer Materialien .Dabei nimmt das Maximum mit steigender Phenylalanin-Ein-waage zu (Abb .43) .

Nach Aussage der Polarogramme kann man also folgern, daßdie Rückstände aus Phenylalanin zweistufig umgesetzt wer-den ; bei hoher Konzentration der Reaktionsprodukte wird diezweite polarographische Stufe bei -0 .35 V von einem Maximumüberlagert . Dieses Maximum tritt in der SWASV und DPASV alszusätzlicher Peak auf, jedoch nicht bei Aufschlußlösungenbiologischer Materialien . In der Aufschlußlösung eines ent-sprechenden biologischen Materials - z .B . von Leber - mußalso eine Substanz vorhanden sein, die dieses Maximum weit-gehend unterdrückt . Dies wurde zunächst für die anorga-nischen Bestandteile überprüft : 175 mg Leber (etwa 90 mg C)wurden bei 300°C mit dem Hochdruckverascher nach KNAPP(siehe Kap .4 .6 .3) mit 2 ml 69 %iger Salpetersäure vollstän-dig aufgeschlossen . Dampft man die erhaltene Lösung zurTrockene ab (130°C), so hinterbleiben praktisch keine orga-nischen Stoffe (RKG2-=0 .08 %) (129) . Die der Leber-Einwaageentsprechende Menge an Phenylalanin (6 .4 mg) wurde unterZusatz von Glucose parallel dazu bei 180°C im PTFE-Gefäßaufgeschlossen . Anschließend wurden beide Lösungen vereintund zur Trockene eingeengt . Der Rückstand wurde mit 0 .5 mlSalpetersäure und Wasser zu 10 .0 ml aufgenommen . Im Polaro-gramm der resultierenden Meßlösung tritt das Maximum unver-ändert auf . Das Square-Wave-Voltammogramm ist entsprechendgestört .

I( " 100nA)~

8.10 .217 mgPhenylalanin

4 .64 mgPhenylalanin

8.w-

15

S

2 .43 mgPhenylalanin

s.

Abb .43 : Gleichspannungs-Polarogramme von Phenylalanin-Aufschlußlösungen verschiedener Einwaagen

(0 .25 -, -0 .85 V)

In einem weiteren Experiment wurden der Mischung von Phe-nylalanin und Glucose vor dem Aufschluß die der Leberentsprechenden Mengen an Histidin (5 .3 mg), Tryptophan(1 .2 mg) und Methionin (2 .5 mg) zugesetzt, da nur dieseStoffe zusätzliche organische Rückstände liefern . Hierzeigte sich nun, daß das polarographische Maximum auf diebei Biomaterial-Aufschlüssen übliche geringe Intensitätreduziert ist und - analog dazu - das mittlere Störsignalim inversen Square-Wave-Voltammogramm verschwindet . In ge-trennten Versuchen konnte durch Kombination von Phenyl-alanin mit jeder der betreffenden Aminosäuren bewiesen wer-den, daß lediglich der aus Tryptophan gebildete organischeRückstand für die Eliminierung des Mäximums verantwortlichist . Um die aus Phenylalanin-Rückständen resultierendenSignale für einen Vergleich mit denen aufgeschlossenerbiologischer Proben zu simulieren, muß also zum Aufschlußvon Phenylalanin unter Glucose-Zusatz auch Tryptophan zu-gemischt werden . Dabei ist jedoch zu beachten, daß Trypto-phan einen geringen Beitrag zum intensiveren "Signal 2" desPhenylalanin-Rückstandes liefert .

Zur Überprüfung wurden 0 .45 - 10 .2 mg Phenylalanin unterZusatz von 1 .0 ± 0 .1 mg Tryptophan und Glucose - insgesamtjeweils 90 mg C - aufgeschlossen . Die anschließende Unter-suchung erfolgte durch inverse Square-Wave-Voltammetrie(Bedingungen : vgl . S .105) . Die Intensität des bei positi-verem Potential auftretenden "Störsignals 2" wurde nachAbzug des Tryptophan-Anteils (gemäß Abb .39) gegen dieEinwaage an Phenylalanin aufgetragen (Abb .44) . Man erhälteine lineare Beziehung (Korrelation r = 0 .9990) . Errechnetman aus Tab .15 und Abb .39 für verschiedene Probenmateria-lien die dem Tryptophan-Rückstand zuzuschreibenden Signal-anteile und korrigiert diese am "Signal 2" der Proben, soerhält man aus Abb .44 folgende Werte für den Phenylalanin-Gehalt pro Einwaage (entspr . 90 mg C) :

Algen : 1 .9 mg

Milchpulver : 4 .3 mgLeber : 6 .8 mg

Schweineblut : 10 .2 mgDie Werte stimmen gut mit denen aus Tab .15 überein .

Icz

xma

12 0

Abb .44 : Phenylalanin ; Aufschluß unter Zusatz von Glucoseund Tryptophan, Abhängigkeit der Peakhöhe des"Störsignals 2" von der Einwaage (SWASV)

Zu erwähnen ist noch, daß das "Störsignal 2" bei Aufschlußvon 0 .447 mg Phenylalanin bei -0 .07 V erscheint, mit zu-nehmender Einwaage an Phenylalanin jedoch in den negative-ren Potentialbereich verschoben wird . Mit 10 .17 mg Phenyla-lanin findet man es bei -0 .102 V . Diese Verschiebung wirdauch bei Aufschlußlösungen biologischer Materialien beob-achtet, wobei die Potentiale mit denen von Modell-Lösungenvergleichbarer Phenylalanin-Einwaagen übereinstimmen . Ver-dünnt man die Lösung nach Aufschluß von 10 .17 mg Phenyl-alanin, so wird diese Potentialverschiebung bei konstanterAcidität der Meßlösung ebenfalls beobachtet . Sie ist alsokonzentrationsabhängig und kann nicht auf verschiedeneOxidationsprodukte zurückgeführt werden .

Schließlich war zu belegen, daß Glucose zum Ersatz der imAufschluß biologischer Materialien vollständig minerali-sierbaren Probenbestandteile auch bei den voltammetrischenUntersuchungen problemlos als "Hilfsmatrix" verwendet wer-

den kann . Dazu wurde Einwaagen von 4 - 10 mg PhenylalaninAlgenpulver als Matrix zugewogen . Die Intensität des alleinaus dem Algen-Anteil resultierenden "Störsignals 2" ist be-kannt (Abb .28) und wurde vom Bruttosignal subtrahiert . Dieso korrigierten Signalhöhen der Reaktionsprodukte desPhenylalanins stehen in guter Übereinstimmung mit den durchZusatz von Glucose erhaltenen Werten (Abb .44) . Daraus kannabgeleitet werden,a .) daß Glucose als "Matrixersatz", der keine voltamme-

trischen Störsignale liefert, geeignet ist undb .) daß sich in Algen gebundenes und freies Phenylalanin

beim Aufschluß gleich verhalten .

Dies ist zugleich ein weiterer Hinweis dafür, daß Peptidebeim Aufschluß zunächst hydrolytisch gespalten werden unddie Aminosäuren nachfolgend unabhängig voneinander weiter-reagieren . Hier zunächst nicht diskutiert wird die Beobach-tung, nach der die Reaktionsprodukte von Phenylalanin undTryptophan, abhängig von der Einwaage, zu einer Erhöhungdes Wasserstoffstromes führen, wogegen die unzersetztenAminosäuren diesen Effekt nicht zeigen . Histidin verhältsich umgekehrt : Während die unzersetzte Aminosäure einekonzentrationsabhängige Erhöhung des Wasserstoffstromesverursacht, findet man dies bei den Reaktionsproduktennicht mehr, wenn in den bei Biomaterial-Aufschlüssen auf-tretenden Konzentrationen gemessen wird . Siehe hierzuKap . 4 .9 .1 .

Zusammengefaßt haben die voltammetrischen Untersuchungenfolgende Ergebnisse erbracht : Die Störsignale bei dervoltammetrischen Elementanalyse von Lösungen biologischerMaterialien nach Druckaufschluß bei 180°C mit nachfolgendemAbrauchen bei 130°C sind hauptsächlich auf Reaktionspro-dukte des Phenylalanins, zu geringeren Anteilen auf solchedes Tryptophans und des Histidins zurückzuführen . Alleanderen in biologischen Materialien vorhandenen Stoffeliefern keine nennenswerten Beiträge zu den beobachteten

12 2

Störsignalen, da sie entweder vollständig abgebaut werdenoder in so geringen Konzentrationen vorliegen, daß dieStörsignale ihrer Reaktionsprodukte nicht gefunden werden .Andere Stoffe, wie Methionin und Linolsäure, liefern offen-sichtlich Produkte, die im untersuchten Potentialbereichvoltammetrisch inaktiv sind .

4 .9 Identifizierun der Aufschlu -Rückstände

4 .9 .1 Identifizierung der Rückstände aus Aufschlüssendefinierter Substanzen

Um aus den Aufschluß-Rückständen ausreichende Substanzmen-gen zur weiteren Untersuchung isolieren zu können, wurdenPhenylalanin, Histidin, Methionin, Tryptophan und Linol-säure zunächst ohne Zusatz von Glucose unter den Standard-Bedingungen aufgeschlossen : Temperatur : 180°C ; Aufschluß-zeit : 3 h ; Säure : 3 ml 69 %ige HN03 ; Gefäßvolumen : 35 ml ;Abrauchen bei 130°C bis zur Trockene . Dabei wurde voraus-gesetzt, daß die Art der im Aufschlußprozeß gebildetenVerbindungen vom Glucose-Zusatz unabhängig ist und daß beiPhenylalanin, Tryptophan und Histidin lediglich die Mengeder Rückstände vom Glucose-Zusatz und somit von der N02-Konzentration abhängt . Bei Methionin und Linolsäure hat derZusatz von Glucose, wie gezeigt wurde, keinen Einfluß aufden RKG-Wert, da bereits beim alleinigen Aufschluß dieserStoffe genügend N02 entsteht, um die problematischenProbenbestandteile optimal zu oxidieren . Zur Identifizie-rung der enthaltenen Verbindungen wurden die Aufschluß-Rückstände nach dem Abrauchen den abgekühlten PTFE-Tiegelnentnommen . Die Rückstände haben folgende Eigenschaften :

12 3

1 . Rückstand aus Phenylalanin :- Erhöht man die Abrauchtemperatur im PTFE-Gefäß auf

180°C und hält diese 1 h bei, so kann der RKG-Wertbezüglich Phenylalanin auf 0 .8 % verringert werden ;98 % des im Rückstand gebundenen Kohlenstoffs sindalso bei 180°C flüchtig .

- Das "Störsignal 2" der inversen Square-Wave-Voltamme-trie (SWASV) ist unsymmetrisch . Dies deutet auf einStoffgemisch mit überlagerten Signalen bei unter-schiedlichen Potentialen hin .

- Der Rückstand ist hellgelb, fest und löslich inAceton, jedoch unlöslich in Wasser und Chloroform .

2 . Rückstand aus Histidin :- Der Rückstand ist bei 180°C nicht flüchtig .- Er liefert nur sehr geringe Störsignale bei der SWASV,

die, bezieht man auf den hohen RKG-Wert, vermutlichauf Nebenprodukte von geringer Konzentration zurückzuführen sind . Das Hauptprodukt ist also voltamme-trisch inaktiv .

- Der Rückstand ist farblos, fest und löslich in Wasser,jedoch unlöslich in Aceton und Chloroform . Die Sub-stanz ist also polar .

3 . Rückstand aus Tryptophan :- Etwa 50 % des Rückstandes (als C) sind bei 180°Cflüchtig ; er besteht also aus einem Stoffgemisch .

- Der Rückstand liefert bei der SWASV mindestens 2 über-lagerte Signale, was ebenfalls auf ein Stoffgemischhinweist .

- Der Rückstand ist intensiv gelb, fest, aber vonklebriger Konsistenz . Er ist löslich in Aceton, jedochunlöslich in Wasser und Chloroform .

124

4 . Rückstand aus Linolsäure :- Der Rückstand (als C berechnet) ist bei 180°C zu 98 %

flüchtig .- Er ist im untersuchten Potentialbereich voltammetrischinaktiv .

- Er ist farblos, fest und löslich in Wasser und Aceton,jedoch unlöslich in Chloroform

5 . Rückstand aus Methionin :- Der Rückstand ist bei 180°C flüchtig ( :~e99 ~) .- Er ist im untersuchten Potentialbereich voltammetrischinaktiv .

- Er ist farblos und flüssig .- Er reagiert, in Wasser gelöst, stark sauer .- Der Rückstand besitzt auch bei 130°C schon einen hohen

Dampfdruck, so daß die Kohlenstoffbestimmung nach Ab-rauchen bei 130°C sehr unreproduzierbare Ergebnisseliefert (RKG 9 % ; s= = 0 .2) . Die coulometrische Koh-lenstoffbestimmung nach W-Photolyse in der nicht ab-gerauchten Aufschlußlösung führt zu einem gut repro-duzierbaren RKG-Wert von 19 .8 ± 0 .2 % . Da Methioninfünf verschieden gebundene Kohlenstoffatome besitzt,ist zu vermuten, daß nur eine Bindungsform davon beimAufschluß quantitativ erhalten bleibt . Der unter die-ser Annahme zu erwartende RKG-Wert beträgt 20 % undstimmt sehr gut mit dem beobachteten Wert von 19 .8überein .

- Der Rückstand ist löslich in Wasser, mäßig löslich inAceton, jedoch unlöslich in Chloroform .

Die Elementaranalyse der Rückstände ergab die in Tab .17zusammengestellten Werte .

12 5

Tab .17 : Elementaranalyse von Aufschlußrückständen ausdefinierten organischen Substanzen

An dieser Stelle kann bereits auf den aus der AminosäureMethionin gebildeten Rückstand geschlossen werden : Da dieGruppierung -CH2-CH2-CH(NH2)-COOH bei Glutamin, Lysin undArginin im Aufschluß abgebaut wird, kann dies auch fürMethionin vorausgesetzt werden . Als Oxidationsproduktbleibt Methansulfonsäure (CH3SO3H) zurück, wobei die end-ständige Methylgruppe nicht angegriffen, der Schwefel je-doch zur Sulfonsäure oxidiert wird . Die für diese Verbin-dung erwarteten Gehalte liegen bei 12 .5 % C und 33 .4 % S .Ein Vergleich mit den Daten aus Tab .17 zeigt, daß Methioninpraktisch ausschließlich zu Methansulfonsäure umgesetztwird .

Zur Aufnahme des 1H-NMR-Spektrums wurde der Rückstand inD20 gelöst . Man beobachtet erwartungsgemäß nur ein einzigesSingulett bei 2 .7 ppm, das Signal der Methylprotonen . DasVergleichsspektrum handelsüblicher Methansulfonsäure(Fluka, Buchs, Art .Nr .64280) liefert ein identischesSignal . Der Nachweis des sauren Protons ist wegen des Aus-tausches in D20 nicht möglich ; die saure Reaktion in Wassergibt jedoch einen deutlichen Hinweis . Die Bildung vonMethansulfonsäure aus Methionin wurde auch von MARTINIE undSCHILT (26) beim offenen Aufschluß mit Salpeter- undPerchlorsäure beobachtet .

Rückstand aus : C (%) H (%) N (%) S (%)

Phenylalanin 47 .8 2 .8 9 .1 -Histidin 27 .4 2 .9 24 .5 -Tryptophan 40 .0 2 .2 12 .3 -Methionin 12 .1 - 0 .002 31 .4Linolsaure 44 .7 4 .8 0 .2 -

12 6

Zur Identifizierung der Rückstände aus Histidin, Tryptophanund Linolsäure wurden Infrarotspektren (KBr-Pressling,Gerät : IR-Spektralphotometer 283 B, Bodenseewerk Perkin-Elmer, Überlingen) sowie die 1H- und 13C-NMR-Spektren(Gerät : Impuls-Kernresonanzspektrometer Bruker AM-400,Bruker, Karlsruhe) gemessen . Alle Spektren : siehe Anhang .Zur Aufnahme von NMR-Spektren wurden die Rückstände ausTryptophan und Linolsäure in Deuteroaceton gelöst . Da deraus Histidin gebildete Rückstand nur in Wasser löslich ist,wurden die sauren Protonen (vgl . IR-Spektrum) zunächstdurch Abrauchen eines Aufschlußrückstandes mit 0 .5 ml65 Eiger DN03 (Merck, Darmstadt, Art .Nr .446) und 2 .0 ml D20gegen Deuterium ausgetauscht, um die im Protonen-NMR-Spektrum störenden Signale zu vermeiden . Zur Aufnahme derSpektren wurde die D20-Lösung verwendet . In Tab .18 sind dieinterpretierbaren Signale des IR-Spektrums (Abb .53) sowiedie der iH-NMR-und der entkoppelten 1 3C-NMR-Spektren aufge-f ührt .

Die IR-Spektren zeigen, daß alle drei Rückstände Carboxyl-gruppen enthalten (OH-Valenzschwingung um 3000 cm- - ; CO-Valenzschwingung einer Carbonsäure bei 1710 - 1730 cm- -L)(138) . Weitere Informationen sind den IR-Spektren nicht zuentnehmen ; lediglich beim Histidin-Rückstand kann (sieheweiter unten) die Bande bei 1380 cm- 1 noch zugeordnet wer-den . Das 1 H-Spektrum des Histidin-Rückstandes (deuteriert)zeigt nur 2 Singuletts im aromatischen Bereich im Verhält-nis der Integrale von 1 :1 (Abb .54) . Das 13 C-Spektrum weistdie Signale von vier unterschiedlichen C-Atomen auf, davondrei im aromatischen Bereich und ein Carboxyl-C bei160 .1 ppm im Verhältnis der Integrale von 1 :1 :1 :1 (Abb .55) .

12 7

(a) = Lösungsmittel-Signal : CD3000D2H(s) = Singulett

Chemische Verschiebung bei NMR : ppm vs . Tetramethylsilan

Tab.18 : IR- und NMR-Signale von Aufschlußrückständen ;Spektren im Anhang (Abb .53-62)

Die Integrale der '- 3C-Signale wurden, wie auch bei allennoch folgenden Messungen, nach Aufnahme der Spektren mitHilfe der "Inverse-Gated"-Technik ermittelt, bei der derProtonen-Entkoppler nur während der Aufzeichnungszeit(Aquisitionszeit) eingeschaltet ist . Nach jeder Aufnahme-zeit wurde eine Pausenzeit von 10 T1 eingehalten, um denÜbergängen ein vollständiges Relaxieren in die ungestörteBoltzmann-Verteilung zu ermöglichen . Dabei ist T . die"longitudinale Relaxationszeit", also die Zeit, die nachEinbringen der Probe in den Magneten vergeht, bis ein be-trachteter Übergang sich bis auf den e'ten Teil dem durch

Rückstand aus : IR-Banden (cm-1 ) 1H-Signale 13C-Signale

Histidin 2300 - 3600 8 .7 (s) 123 .31710 7 .95 (s) 125 .01380 135 .3

160 .1

Tryptophan 2300 - 3700 7 .8 - 9 .5 110 - 1501730 12 .45 (s) 160 - 170

Linolsaure 2300 - 3600 1 .25 12 .221710 1 .47 21 .96

2 .10 172 .3629 .8 (a)

2 .04 (a) 207 .6 (a)

12 8

die Boltzmann-Verteilung gegebenen Grenzwert der Magneti-sierung angenähert hat . Auf diese Weise wird die Energie-übertragung der durch die Entkopplerfrequenz angeregtenProtonen (Kern-Overhauser-Effekt) auf die Kohlenstoffkerneausgeschaltet, die zu einer Verzerrung der Signal-Intensi-tätsverhältnisse führt .

Die Kohlenstoffatome des Histidin-Rückstandes mit Signalenbei 123 .3 und 135 .3 ppm sind jeweils an ein Proton gebun-den, was im nicht entkoppelten 13C-Spektrum durch Dublettsbelegt wird (Abb . 56) .

Die beiden anderen C-Atome erscheinen als Singulett undhaben demnach quarternären Charakter . Folglich liegt eincarboxyl-substituierter Aromat mit drei unterschiedlichenRing-Kohlenstoffatomen vor . Beim Aufschluß des Histidinsentsteht also durch Oxidation der Seitenkette Imidazol-4-carbonsäure gemäß :

HOOC-CHINHZ I-CHZ-ONH

N

Die Spektren lassen sich folgendermaßen interpretieren :In der deuterierten Substanz sind die sauren Protonen 3 und4 gegen D ausgetauscht ; sie erscheinen folglich nicht imNMR-Spektrum . Die aromatisch gebundenen Protonen 1 und 2sind für die zwei beobachteten Singuletts verantwortlich .Im 13C-Spektrum treten neben dem Signal des Carboxyl-C nochdie Signale der Atome a und c bei 123 .3 und 135 .3 ppm (C-H-Kopplung) sowie das Signal des quarternären C-Atoms b bei125 .0 ppm auf . Das IR-Spektrum der entsprechenden nichtdeuterierten Verbindung zeigt die Schwingungen derCarboxylgruppe .

12 9

Imidazol-4-carbonsäure hat einen berechneten C-Gehalt von42 .8 % und einen N-Gehalt von 25 % . Während der zu 24 .5 % Ngemessene Stickstoffgehalt gut damit übereinstimmt, liegtder Kohlenstoffgehalt mit 27 .4 % deutlich niedriger als er-wartet . Da nach Aussage der NMR-Spektren eine Nitro-Gruppeam Ring ausgeschlossen werden kann, liegt die Verbindungvermutlich (nach Protonierung des freien Elektronenpaaresam Stickstoff) als Nitrat vor . Die Zusammensetzung dieserSubstanz berechnet sich zu C : 27 .4 % ; N : 24 .0 % ; H : 2 .9 % .Diese gut mit den Werten aus Tab .17 übereinstimmenden Datenund die Tatsache, daß die Substanz ausschließlich in Wassergut löslich ist, belegen den Salzcharakter des Rückstandes .Auch die Beobachtung, daß der Rückstand bei 180°C nichtflüchtig ist, kann als Hinweis auf den Salzcharakter aufge-faßt werden . Außerdem kann die im IR-Spektrum beobachteteintensive Bande bei 1380 cm-1 der Nitrat-Gruppe zugeordnetwerden ; sie wird auch von Kaliumnitrat geliefert (138) .

Im Gegensatz zu Histidin liefert Imidazol-4-carbonsäurekeinen katalytischen Wasserstoffstrom bei der Voltammetrie(Kap .4 .8 .4) . Zur Erklärung kann der Mechanismus der durchStickstoffbasen katalysierten Wasserstoffabscheidung (Seite24) herangezogen werden . Bei Histidin wird die Elektronen-dichte im aromatischen Ring durch den positivinduktivenEffekt des Alkylsubstituenten erhöht, wodurch die Protonie-rung der Stickstoffbase erleichtert und die katalytischeFunktion der Verbindung bei der Wasserstoff-Reduktionbewirkt wird .

Bei Imidazol-4-carbonsäure hingegen wird die Elektronen-dichte im Ring durch den negativ induktiven Effekt der Car-boxylgruppe verringert, wodurch die Protonierung der Stick-stoffbase und damit eine Katalyse der Wasserstoffabschei-dung verhindert wird . Dies gilt, wie Vergleichsuntersu-chungen ergaben, analog auch für die Imidazol-4,5-dicarbon-säure (Aldrich, Steinheim, Art .Nr .24611-5) und für das un-substituierte Imidazol (Sigma, Deisenhofen, Art .Nr . 10250) .

130

Ein erhöhter Wasserstoffstrom konnte jedoch erwartungsgemäßbei Methylimidazol (Fluka, Buchs, Art .Nr .67580) beobachtetwerden, da hier wieder der durch die Methylgruppe verur-sachte +I-Effekt wirksam ist .

Dem IR-Spektrum nach handelt es sich auch beim Rückstandaus Tryptophan um eine Carbonsäure ; das entkoppelte 13C-NMR-Spektrum (Abb .57) zeigt jedoch, daß mindestens 10verschieden gebundene Carboxylgruppen vorliegen, angezeigtdurch die Signale im Bereich von 162 - 168 ppm (138) . ImProtonen-Spektrum (Abb .58) wird daher ein breites, durchÜberlagerung geprägtes COOH-Signal bei 10 .8 ppm gefunden .Alle anderen in den NMR-Spektren beobachteten Signale tre-ten im aromatischen Bereich auf, was auf ein Gemisch ausaromatischen Carbonsäuren hinweist . Möglicherweise sindjedoch auch aromatische Verbindungen ohne Carboxylgruppevorhanden . Aufgrund der Fülle der auftretenden Signalekonnte den NMR-Spektren keine weitere Information entnommenwerden . Der Rückstand wurde daher nach Silylierung7 ) gas-chromatographisch untersucht (vgl . Untersuchungen beimRückstand aus Phenylalanin, Seite 136) . Das Gaschromato-gramm zeigt etwa 28 verschiedene Signale, von denen 10deutlich hervortreten . Der Aufschlußrückstand aus Trypto-phan ist demnach so komplex zusammengesetzt, daß auf einedetaillierte Aufklärung im Rahmen dieser Arbeit verzichtetwurde . Das ist vertretbar, da die beim Druckaufschluß bio-logischer Materialien aus Tryptophan gebildeten Stoffe be-züglich der Kohlenstoffbilanz und der in der Voltammetrieverursachten Störungen, mit Ausnahme der Erhöhung des Was-serstoffstromes, ohnehin von nur untergeordneter Bedeutungsind .

Die als Maximum-Dämpfer auf das durch den Phenylalanin-Rückstand verursachte Signal wirkende Substanz konnte nichtidentifiziert werden .

')Umsatz mit Trimethylsilylchlorid

Analog zu Histidin wird der aromatische Ring auch beimTryptophan nicht vollständig zerstört, wobei jedoch offenbleibt, ob im Rückstand vorwiegend Benzol- oder Indolderi-vate vorliegen, da eine Aussage über eine Ringöffnung desstickstoffhaltigen Ringes nicht gemacht werden kann .

Auch beim Rückstand aus Linolsäure handelt es sich nachAussage des IR-Spektrums (Abb .53) um eine Carbonsäure . DieNMR-Spektren (Abb .59-62) zeigen, daß die Substanz keineMethylgruppen besitzt und nicht aromatisch ist . Sie verfügtlediglich über drei verschieden gebundene C-Atome imVerhältnis 1 :2 :2 (Integral 13 C-Spektrum) sowie über vierunterschiedliche H-Atome im Verhältnis 1 :1 :2 :2 (Integral1H-Spektrum) . Sie enthält keinen Stickstoff (Tab .17), istalso eine CHO-Verbindung . Die NMR-Spektren zeigen ferner,daß eine C-C-Doppelbindung nicht vorhanden ist . Insgesamtleitet sich daraus eine ringförmige Carbonsäure mit gesät-tigtem Ring oder eine gesättigte Dicarbonsäure ab . DieGruppe -CHz-0- im Molekül ist ausgeschlossen, da das ent-sprechende Protonen-Signal bei etwa 3 .6 ppm, im Epoxid-Ringbei 2 .6 ppm (138), fehlt . Auch eine weitere Carbonylfunk-tion scheidet aus, da im L 3C-Spektrum nur das Signal derCarboxylgruppe beobachtet wird . Aus dem Verhältnis derCarboxyl-C-Atome zu den anderen C-Atomen der Verbindung(2 :3 ; vgl . Abb .62) und aus dem Verhältnis der Carboxyl-Protonen zu den übrigen Protonen (1 :2 ; vgl Abb .59) wirdklar, daß die Substanz außerhalb der Carboxylgruppen 3 C-Atome und 4 H-Atome bzw . 6 C-Atome und 8 H-Atome etc . auf-weisen muß . Da eine Doppelbindung nicht vorliegt, läßt sichdemnach auf eine ringförmige Struktur schließen .

Das Verhältnis von Carboxyl-C-Atomen zu Ring-C-Atomen von2 :3 zeigt, daß die Verbindung entweder eine Dreiring-Dicar-bonsäure, eine Sechsring-Tetracarbonsäure oder ein weiteresVielfaches davon ist . Die im nicht entkoppelten 13 C-Spek-trum beobachtete H-C-Kopplungskonstante beträgt 167 bzw .168 Hz und ist typisch für Dreiringe (Abb .61) . Aufgrund des

13 2

gespannten Ringes haben die C-H-Bindungen weitgehend sp 2 -Charakter (139) . Daraus resultiert eine gegenüber einem6- oder 12-Ring (sp3 , H-C-Kopplung etwa 125 Hz (139,140)erhöhte H-C-Kopplungskonstante von etwa 160 Hz (139,140) .In Cyclopropan beträgt sie 161 Hz (139,140) .

Aus alledem folgt, daß es sich bei dem Rückstand aus Linol-säure um Cyclopropandicarbonsäure handelt . Die Tatsache,daß vier unterschiedliche Protonen-Signale erhalten werden,zeigt, daß es sich um cis-1,2-Cyclopropandicarbonsäurehandelt, da die entsprechende trans-Verbindung nur drei,

die 1,1-Dicarbonsäure nur zwei verschiedene Signale liefernwürde .

Die in den NMR-Spektren beobachteten Signale können demnachfolgendermaßen zugeordnet werden .

'-H-Signale (Abb .59 und 60) :Die Protonen H1 und H2 sind nicht äquivalent ; sie führenjeweils zu einem Triplett bei 1 .26 und 1 .47 ppm durch Kopp-lung mit H3 . Da H1 und H2 auch untereinander koppeln, sinddie Tripletts jeweils dublettiert . Die beiden Protonen H3sind äquivalent ; sie koppeln mit den nicht äquivalentenProtonen H1und H2 zu einem dublettierten Dublett, das bei2 .10 ppm erscheint . Das bei 2 .04 ppm auftretende 5-fachaufgespaltene Signal wird durch nicht deuterierte Reste desLösungsmittels (CD3000D2H) verursacht . Die Signalgruppe bei

13 3

1 .35 ppm deutet darauf hin, daß die Substanz noch eine Ver-unreinigung enthält .

13C-Signale (Abb .61 und 62) :Die Ring-Kohlenstoffatome sind zuständig für die Signalebei 12,22 und 21 .96 ppm . Der Carboxyl-Kohlenstoff erscheintbei 172 .36 ppm . Die H-C-Kopplung (C° koppelt mit den 2 Pro-tonen zu einem Triplett, C" mit H3 zu einem Dublett) wurdebereits diskutiert . Die Integrationsverhältnisse stimmenmit der oben angegebenen Struktur überein .

Über das 13C-Spektrum des zugehörigen Dimethylesters kannmit Literaturdaten verglichen werden :RUPPRECHT und BREMSER (141) geben folgende Verschiebung an :

C° : 11 .78 ppm

C- :

170 .36 ppmCl=, : 21 .49 ppm

Methyl-C : 52 .03 ppm.

Von ROL und CLAGUE (142) werden folgende Werte mitgeteilt :

Ca : 11 .10 ppm

C° :

169 .80 ppmCID : 20 .70 ppm

Methyl-C : 51 .40 ppm

Der Aufschlußrückstand aus Linolsäure wurde mit Diazomethangemäß (143) zum Dimethylester umgesetzt . Die anschließendfür die chemische Verschiebung ermittelten Werte sind(Abb . 63) :

Ca : 11 .68 ppm

C° :

170 .29 ppm.Cb : 21 .27 ppm.

Methyl-C : 52 .04 ppmCDC13 (Lbsungsmittel) : 77 .00 ppm

Die Übereinstimmung ist eine weitere Stütze für die ange-gebene Struktur . Die durch Elementaranalyse ermittelte Zu-sammensetzung (44 .7 % C ; 4 .8 % H) stimmt mit den erwartetenWerten genügend gut (46 .2 % C ; 4 .65 % H) überein . Im Mas-senspektrometer wird ein Molekülpeak von geringer Intensi-

13 4

tät bei der Masse 130 beobachtet ; die Molmassenbestimmungmit Hilfe der Dampfdruck-Osmometrie ergab eine Molmasssevon 132 ± 4 g "mol -1 . Auch diese Zahlen belegen, daß nur einDreiring vorliegen kann .

cis-1,2-Cyclopropandicarbonsäure ist im Handel nichterhältlich . Ein von W . Kirmse (Lehrstuhl für OrganischeChemie II der Ruhr-Universität Bochum) gemäß (144,145) dar-gestelltes Präparat liefert in Deuteroaceton ein 1H-NMR-Spektrum, das mit dem des Rückstandes aus Linolsäure (Abb .

60) übereinstimmt, wenn man von Signalen der Verunreini-

gungen absieht (Abb .64) .

Durch homonukleare zweidimensionale NMR-Spektroskopie(hier : "COSY" = Correlated Spectroscopy) konnte zusätzlichgezeigt werden, daß alle ringständigen Protonen der ausLinolsäure gewonnenen cis-1,2-Cyclopropandicarbonsäure mit-einander koppeln, wie für dieses Molekül zu erwarten ist(Abb .65) . Die beiden Achsen in Abb .65 enthalten die che-mische Verschiebung der Protonen . Nach Einwirken einer vonJENEER (146) vorgeschlagenen Impulsfolge und Registrierender FID (Free Induction Decay) erhält man nach zweidimen-sionaler Fourriertransformation für nicht koppelnde Proto-

nen lediglich ein Signal auf der Diagonalen, für koppelndeKerne jedoch zusätzlich Nebendiagonalensignale, die in Form

von Höhenlinien aufgezeichent werden und eine Energieüber-tragung zwischen den Protonen anzeigen . Ihre Intensitätspiegelt den Energietransfer zwischen zwei Kernen wiederund ist ein Maß für die Kopplung . Die zugehörigen Kopp-

lungskonstanten können nach wie vor aus dem eindimensio-nalen Spektrum der Achsen abgelesen werden .

Um eine Aussage über das den zusätzlichen Signalen im 1 H-NMR-Spektrum zugrundeliegende Nebenprodukt zu gewinnen,wurde der Aufschlußrückstand mit Trimethylsilylchloridverestert und gaschromatographisch getrennt (Bedingungensiehe Rückstandsanalyse bei Phenylalanin, Seite 136) . Man

135

erhält zwei Signale im Verhältnis 1 :20, was den Intensi-tätsverhältnissen im Protonen-NMR-Spektrum entspricht . DasNebenprodukt wurde als trans-1,2-Cyclopropandicarbonsäureidentifiziert . Zur Absicherung wurde 1,2-Cyclopropandi-carbonsäure-diethylester (Aldrich, Steinheim, Art .Nr .15,729-5 ; nach GC und 1H-NMR ~e 99 % trans-Isomeres) durchDruckaufschluß mit Salpetersäure unter den Standard-Be-dingungen hydrolysiert, wobei der gebildete Alkohol voll-ständig abgebaut wird und die freie Dicarbonsäure hinter-bleibt . Das 1H-NMR-Spektrum des Rückstandes enthält nebenden zwei sauren Protonen erwartungsgemäß nur zwei Signalebei 1 .35 und 2 .04 ppm (Abb .66) . Das Signal bei 1 .35 ppmentspricht dabei demjenigen im Protonen-NMR^Spektrum desLinolsäure-Rückstandes . Eine Aussage über das Signal bei2 .04 ppm ist nicht möglich, da es vom Aceton-Signal(CD3000D2H) überlagert wird . Durch Vergleich der Gaschroma-togramme der silylierten trans-Dicarbonsäure und des sily-lierten Rückstandes aus Linolsäure konnte die Verunreini-gung jedoch als trans-1,2-Cyclopropandicarbonsäure identi-fiziert werden .

Der nach Druckaufschluß von Linolsäure und Abrauchen bei130°C hinterbleibende Rückstand besteht also zu etwa 95 %aus cis- und zu etwa 5 % aus trans-1,2-Cyclopropandicarbon-säure .

Aus diesen Versuchen kann geschlossen werden, daß auchtrans-Cyclopropandicarbonsäure unter den Bedingungen desDruckaufschlusses nicht zersetzt wird . Dies ist auch dannnicht der Fall, wenn dem trans-Diethylester beim Druckauf-schluß Glucose (vgl . Kap .4 .8 .2) zugesetzt wird .

Auch beim Aufschluß von Phenylalanin entsteht eine Carbon-säure, wie aus dem IR-Spektrum (Abb .53 und Tab .19) hervor-geht .

13 6

IR-Bande (cm-1)

Schwingung (138)

2200 - 3600

O-H-Valenz, Carbonsäure1700

C=0-Valenz, Carbonsäure

15401Schwingungen der Nitrogruppe

1350)1600

C=C-Valenz, Benzolring

Tab .19 : Banden im IR-Spektrum des Rückstandes ausPhenylalanin

Das IR-Spektrum weist auf eine nitrierte Benzoesäure hin .Dieses Produkt würde der Imidazol-4-carbonsäure beimHistidin-Aufschluß entsprechen mit dem Unterschied, daß

jetzt ein nitrierter aromatischer Ring vorliegt . Die Vermu-tung liegt nahe, daß es sich um ein Gemisch aus verschie-denen Isomeren handelt, da bei Nitrierungen oft entspre-chende Gemische entstehen . Zur näheren Untersuchung wurdeder Rückstand silyliert und gaschromatographisch unter denfolgenden Bedingungen getrennt :

Meßgerät :

Gaschromatograph HRGC 5160(Carlo Erba Strumentazione, Mailand)

Säule :

23 m DB5 ; Durchmesser 0 .32 mmFüllung :

Methylsilicongummi mit 5 % PhenylsiliconTrägergas : HeliumDetektor :

Flammenionisationsdetektor 300°CTemperatur : Injektor 300°C

Ofen : zunächst 2 min bei 80°C,dann mit 10° " min- auf 140°C,

30 min bei 140°C .

13 7

Das GaschromatQgramm (Abb .67) enthält 7 Signale . Durch Ver-gleich mit den reinen Isomeren (Fluka, Buchs) konnten dieSignale in der Reihenfolge ansteigender Retentionszeitenfolgendermaßen zugeordnet werden :

1 .

2-Nitrobenzoesäure (tn = 13 .9 min)2 .

4-Nitrobenzoesäure (tn = 16 .0 min)3 .

3-Nitrobenzoesäure (tn = 16 .3 min)4 .

2,4-Dinitrobenzoesäure (tn = 33 .7 min)5,6,7 . Vermutlich weitere Dinitrobenzoesäuren

(tn et 34 min)

Bei der Bewertung des Gaschromatogramms (siehe Anhang) istzu beachten, daß die Signale 4 - 7 mit fünffach höhererVerstärkung als die Signale 1 - 3 registriert sind . Diequantitative Auswertung führt zu folgenden Gehalten imAufschlußrückstand des Phenylalanins :

2,4-Dinitrobenzoesäure : etwa 5Übrige Verbindungen :

etwa 5

Da die Konzentrationen der den Signalen 5 - 7 zugrundelie-genden Stoffe im Vergleich zu den vier Hauptbestandteilennur gering sind, wurde nicht näher darauf eingegangen . Esist aber zu vermuten, daß es sich um weitere nitrierte Ben-zoesäuren handelt . Eine Überschlagsrechnung erhärtet dieseAnnahme : Geht man von 10 % Dinitrobenzoesäuren und 90Nitrobenzoesäuren aus, so sollte das Gemisch 49 .2 % C und8 .9 % N enthalten . Gefunden wurden 47 .8 % C und 9 .1 % N .

NMR-spektroskopische Messungen wurden nicht durchgeführt ;eine weitere Absicherung der Substanzidentität gelang je-doch anhand von Signalen der inversen Square-Wave-Voltam-metrie (Kap .4 .9 .3) . Wichtig für die Interpretation ist der

2-Nitrobenzoesäure : 153-Nitrobenzoesäure : 234-Nitrobenzoesäure : 51

13 8

Einfluß beigemischter Glucose auf die Zusammensetzung derDruckaufschluß-Rückstände . Zur Untersuchung wurden die Ein-

waagen an Phenylalanin, Tryptophan und Histidin auf 1/10

verringert und jeweils soviel Glucose als "Matrixersatz"

zugegeben, daß die Gesamt-Masse an Kohlenstoff pro Ansatz

90 mg C betrug . Auf entsprechende Versuche konnte bei

Linolsäure und Methionin verzichtet werden, da deren RKG-

Werte unabhängig vom Glucose-Zusatz sind (vgl . Kap .4 .8 .2) .

Die 1H-NMR-Spektren der Rückstände aus Histidin und Trypto-

phan (Abb .68 und 69) stimmen mit denen der Rückstände ausAufschlüssen ohne Glucose-Zusatz überein . Der Rückstand aus

dem Aufschluß des Phenylalanins unter Zusatz von Glucose

besteht nach Aussage des Gaschromatogramms zu 15 % aus

2-Nitrobenzoesäure, zu 19 % aus 3-Nitrobenzoesäure, zu 56 %

aus 4-Nitrobenzoesäure und zu etwa 10 % aus anderen Verbin-

dungen . Der Zusatz von Glucose beeinflußt also nur die

Menge, nicht aber die Art der zurückbleibenden Verbin-

dungen . Dies gilt auch für den Aufschluß von Benzoesäure :

Deren Rückstand besteht, unabhängig vom Glucose-Zusatz, zu

25 % aus 2-Nitro-, zu 70 % aus 3-Nitro- und zu 5 % aus4-Nitrobenzoesäure . Der Restgehalt an nicht umgesetzterBenzoesäure liegt unterhalb von 0 .1 % . Dieses Ergebnis wird

in Kap .5 als Hinweis auf den Reaktionsmechanismus disku-

tiert .

139

4 .9 .2 Verqleich der NMR-Spektren von Rückständen nachAufschluß biologischer Materialien mit denen vonAufschlußrückständen aus definierten Substanzen

4 .9 .2 .1 Linolsäure und natürliche Fette

Der Befund, daß beim Aufschluß natürlicher Fette mit Sal-petersäure lediglich 1,2-Cyclopropandicarbonsäure zurück-bleibt, wird anhand der 1H-NMR-Spektren von Rückständenfolgender Stoffe erhärtet : Margarine, Olivenöl, Sojaöl,Distelöl, Maiskeimöl, Sonnenblumenöl . Die Spektren weisengleichermaßen ein cis/trans-Verhältnis von näherungsweise20 :1 aus (Abb .70-75), was an Sonnenblumenöl zusätzlich mitHilfe der Gaschromatographie überprüft wurde . Das Fehlenweiterer Signale zeigt an, daß alle Fettbestandteile außerden mehrfach ungesättigten Fettsäuren im Aufschluß voll-ständig abgetrennt werden, was auch mit den Kohlenstoff-bilanzen übereinstimmt .

Linolensäure bildet beim Aufschluß mit Salpetersäure nachAussage der 2-H-NMR-Spektroskopie und der Gaschromatographieebenfalls 1,2-Cyclopropandicarbonsäure, jedoch liegen hieretwa 10 % als trans-Isomeres vor (Abb .76) . Aus Linolensäureentsteht also im wesentlichen das gleiche Stoffgemisch wiebeim Aufschluß der Linolsäure .

4 .9 .2 .2 Weitere biologische_Materialien

Um zu zeigen, daß die beim Abbau von Aminosäuren gebildetenStoffe auch beim Aufschluß relevanter biologischer Materia-lien entstehen, wurden 200 mg Leber mit 2 .0 ml 69 EigerSalpetersäure unter den Standard-Bedingungen aufgeschlos-sen . Im Anschluß daran wurde bei 130°C zur Trockene abge-raucht . Nach Zusatz von 0 .5 ml 65 Eiger DN03 und 2 .0 ml D20wurde erneut abgeraucht . Der Rückstand wurde mit 0 .5 ml

14 0

65 %iger DN03 und D20 zu 10 .0 ml gelöst . Das Protonen-NMR-Spektrum dieser Lösung ist in Abb.45 dargestellt ; es zeigtdie Signale folgender Substanzen :

( PPm )

Abb .45 : Leber ; 1H-NMR-Spektrum des Druckaufschluß-Rückstandes

Singulett bei 2 .7 ppm : MethansulfonsäureSingulett bei 5 .0 ppm : HOD in stark saurer Lösung

Der Bereich der aromatisch gebundenen Protonen ist inAbb .46 gesondert dargestellt und enthält die Signalefolgender Stoffe :

4hWY IM

8.4

( ppm )

7.8

Abb .46 : Leber ; LH-NMR-Spektrum eines Druckaufschluß-Rückstandes ; Bereich der aromatisch gebundenenProtonen

Signale bei 7 .95 und 8 .70 ppm : Imidazol-4-carbonsäure(vgl . Abb .54)

Signale bei 8 .17 und 8 .03 ppm : 4-Nitrobenzoesäure(vgl . Abb .77)

Signalgruppe bei 7 .6 ppm : 2-Nitro- und 3-Nitrobenzoesäure(vgl . Abb .75 und 76)

Signale bei 8 .21, 8 .30 und 8 .64 ppm: 3-Nitrobenzoesäure(vgl . Abb .75)

Signale bei 7 .89 ppm : 2-Nitrobenzoesäure (vgl . Abb .76)

7.6 7.4

14 2

Bezüglich der Signalintensitäten sind folgende Punkte zubeachten :

1 . 2- und 3-Nitrobenzoesäure kommen in erheblich niedri-geren Konzentrationen vor als 4-Nitrobenzoesäure .

2 . 2- und 3-Nitrobenzoesäure besitzen jeweils vier unter-

schiedliche H-Atome am Ring, so daß die Intensität der

Signale geringer ist als bei 4-Nitrobenzoesäure, die nur

zwei Arten von Protonen enthält .3 . Die Konzentrationen aller Stoffe in der Aufschlußlösung

sind sehr gering, so daß für das vorliegende Spektrum

eine relativ lange Meßzeit (4 h) erforderlich war .

4 . Signale von 2,4-Dinitrobenzoesäure sowie der aus Tryp-tophan gebildeten Stoffe werden aufgrund ihrer niedrigenKonzentrationen nicht beobachtet .

4 .9 .3 Vergleich der voltammetrischen Signale des Aufschluß-

rückstandes von Phenylalanin mit den Signalen identi-

fizierter Reaktionsprodukte

In Kap .4 .8 .4 wurde gezeigt, daß die bei der inversen

Square-Wave-Voltammetrie durch Oxidationsprodukte von

Phenylalanin verursachten Signale mit denen aufgeschlosse-

ner biologischer Materialien übereinstimmen, sofern vor demAufschluß Tryptophan zugesetzt wird . Im folgenden werden

die nach Aufschluß von Phenylalanin resultierenden Signale

(ohne Tryptophan zuzusetzen) mit denen der im Rückstand

identifizierten Nitrobenzoesäuren verglichen . Zur Berech-

nung der zu erwartenden Menge an Reaktionsprodukten wurde

ein Aufschluß von 200 mg einer biologischen Substanz mit

einem Phenylalanin-Gehalt von 1 % (entsprechend 2 mg

Phenylalanin je Aufschluß) angenommen . Bei einem RKG-Wert

von 44 % würden im Experiment 0 .58 mg Kohlenstoff im Auf-

schlußrückstand zurückbleiben . Zur voltammetrischen Unter-

suchung wurden die folgenden Verbindungen mit Einwaagenentsprechend der ermittelten Kohlenstoffmasse von 0 .58 mg C

14 3

in 0 .5 ml 69 Eiger Salpetersäure und Wasser zu 10 .0 ml ge-löst ; 1 .0 ml der Lösungen wurden mit 5 .0 ml Wasser versetztund die inversen Square-Wave-Voltammogramme registriert . InEinzelversuchen wurden eingesetzt :

1 . 2-Nitrobenzoesäure2 . 3-Nitrobenzoesäure3 . 4-Nitrobenzoesäure4 . 2,4-Dinitrobenzoesäure5 . Mischung aus 16 % 2-Nitrobenzoesäure, 25 % 3-Nitroben-

zoesäure, 54 % 4-Nitrobenzoesäure und 5 % 2,4-Dinitro-benzoesäure (vgl . Kap .4 .9 .1) .

Man erhält die in Abb .47 und 48 dargestellten Signale .

Das durch den Aufschlußrückstand von Phenylalanin verur-sachte Maximum (vgl . Abb .41) findet man auch in den Voltam-mogrammen des Gemisches und der drei einfach nitriertenBenzoesäuren, nicht hingegen bei 2,4-Dinitrobenzoesäure .Verdünnt man die Lösungen, so kann das Maximum, wie auchbei Phenylalanin-Aufschlußlösungen, beseitigt werden . Inweiterer Analogie zum Phenylalanin-Rückstand liefern auchdie eingesetzten Verbindungen vergleichbare Voltammogrammemit je 2 Signalen . Die Potentiale des intensiveren"Signals 2" sind im folgenden zusammengestellt :

2-Nitrobenzoesäure :

-l15 mV3-Nitrobenzoesäure :

-l12 mV4-Nitrobenzoesäure :

-60 mV2,4-Dinitrobenzoesäure : -40 mVGemisch :

-70 mV

2 .

0.5

4-Nitrobenzoesäure

14 4

2-Nitrobenzoesäure1 .

l .s

O . S

e. OL

2 .%-

e. s

3-Nitrobenzoesäure

2,4-Dinitrobenzoesäure

Abb .47 : Nitrobenzoesäuren; SWASV-Signale (-0 .75

a- 0 .25 V)

0.5

0.0

Abb .48 : SWASV-Signale der Mischung (-0 .75: 0 .25 V)

Die Peakhöhen des "Signals 2" erreichen 700 - 1000 nA .Lediglich das Signal der 2,4-Dinitrobenzoesäure (2 Nitro-gruppen1) ist mit 1200 nA intensiver . Schließt man 2 mgPhenylalanin mit Glucosezusatz auf, so liefert der Rück-stand ein Signal bei -75 mV mit einer Intensität von etwa900 nA, was gut mit dem der entsprechenden Mischung vonBenzoesäuren (-70 mV, etwa 700 nA) übereinstimmt .

Die Ergebnisse erklären auch die unsymmetrische Form des"Störsignals 2" bei Aufschlußlösungen aus Phenylalanin undbiologischen Materialien : Da die Signale von 2-Nitro- und3-Nitrobenzoesäure bei negativerem Potential auftreten alsdas der 4-Nitrobenzoesäure, so resultiert in Mischungen einverbreitertes Kombinationssignal mit einem Spitzenpotentialzwischen denen der Einzelverbindungen . Für den "Störpeak 1"kann eine ähnliche Aussage aufgrund seiner flachen Form,die eine genaue Bestimmung des Spitzenpotentials verhin-dert, nicht getroffen werden .

146

Schließlich wurde untersucht, welche der vier Säuren einenBeitrag zur Erhöhung des Wasserstoffstromes liefert, wie erbei Aufschlußlösungen von Phenylalanin und bei solchen bio-logischer Materialien beobachtet wird . Es zeigte sich, daßlediglich 2-Nitro- und 2,4-Dinitrobenzoesäure zu diesem

Prozeß beitragen, 3- und 4-Nitrobenzoesäure jedoch nicht .

Eine Erklärung für das unterschiedliche Verhalten istschwierig, da sowohl die Nitro- als auch die Carboxylgruppe

in dieser Hinsicht aktiv sein können : Ersetzt man in

2-Nitrobenzoesäure z .B . zum einen die Carboxylgruppe durch

eine Nitrogruppe (1,2-Dinitrobenzol, Fluka, Buchs, Art .Nr .41970), zum anderen die Nitrogruppe durch eine weitereCarboxylgruppe (Phthalsäure, Fluka, Buchs, Art .Nr .80010),so stellt man fest, daß beide Verbindungen in den der Lö-sung von 2-Nitrobenzoesäure entsprechenden molaren Konzen-trationen einen erhöhten Wasserstoffstrom verursachen . DieVerhältnisse im aromatischen Ring sollten bei den verschie-

denen Verbindungen nicht grundlegend unterschiedlich sein,da Carboxyl- und Nitrogruppe beide einen vergleichbarennegativ induktiven Effekt ausüben .

Die Erhöhung des Wasserstoffstromes in Aufschlußlösungenbiologischer Materialien kann folglich ausschließlich auf2-Nitrobenzoesäure, 2,4-Dinitrobenzoesäure und auf Zerset-zungsprodukte des Tryptophans (vgl . Kap .4 .8 .4) zurückge-führt werden .

4 .10 Zum elektrochemischen Verhalten nitrierterBenzoesäuren

Die in vorausgehenden Abschnitten der Arbeit beschriebenen

voltammetrischen Störsignale, verursacht durch nitrierteBenzoesäuren, sind an dieser Stelle am Beispiel der Leber-Aufschlußlösung noch einmal aufgeführt (Abb .49) :

148) .

4.0F-

9.0-

147

2

Abb .49 : Leber ; Durch Nitrobenzoesäuren verursachte SWASV-

Störsignale (-0 .75

-, 0 .25 V)

Das voltammetrische Verhalten von Nitrobenzoesäuren ist inder Literatur beschrieben . Danach werden aromatische Nitro-verbindungen gemäß

4e- 2e -Ar-NO2 -> Ar-NH-OH --> Ar-NH2

über Hydroxylamine zweistufig zu Aminen reduziert (118,147,

Die Reduktion des Hydroxylamins zum Amin wird nach (118,147) nur in saurer Lösung (pH <4) beobachtet . Auch bei den

Untersuchungen dieser Arbeit wurden saure Lösungen (pH 0)verwendet . Die Reduktion zum Amin findet bei negativerenPotentialen statt als die zum Hydroxylamin (118) . Somit istletztere die Grundlage für "Signal 2" (4-Elektronen-Pro-zeß), während "Signal l" durch die Reduktion des Hydroxyl-

amins zum Amin verursacht wird (2-Elektronen-Prozeß) . Dies

kann auch an den Halbwertsbreiten der Signale abgelesenwerden, die mit zunehmender Zahl an umgesetzten Elektronenpro Formelumsatz abnimmt . Die Tatsache, daß die Reduktionzum Hydroxylamin bei 4-Nitrobenzoesäure bei einem um 50 mVpositiveren Potential abläuft als bei 3-Nitrobenzoesäure,ist auf den Substituenteneinfluß der unterschiedlichentfernten Carboxylgruppe zurückzuführen und wird auch vonZUMAN (149) beschrieben . Er gibt eine Verschiebung um etwa60 mV an, führt jedoch 2-Nitrobenzoesäure bei seinen Unter-suchungen nicht mit auf . Gemäß (118) ist die Reduktion vonNitrobenzol über Phenylhydroxylamin zu Anilin irreversibel .Dies kann auch für Nitrobenzoesäuren bestätigt werden :4-Aminobenzoesäure wird unter gleichen Bedingungen im beob-achteten Potentialbereich nicht oxidiert .

4 .11 Schwefel-, Phos hor- und Stickstoffbilanz beimDruckaufschluß biolo ischer Materialien

4 .11 .1 Schwefelbilanz

148

Schwefel kommt in biologischen Materialien hauptsächtlichals Bestandteil der Aminosäuren Methionin, Cystein undCystin vor . Der in Methionin gebundene Schwefel-Anteil wirdbeim Druckaufschluß mit Salpetersäure vollständig in Me-thansulfonsäure überführt (vgl . Kap .4 .9) . Um die Bindungs-form des in Cystin und Cystein gebundenen Schwefels nachdem Aufschluß zu ermitteln, wurden diese Aminosäuren (Ein-waage entsprechend 90 mg C) mit 3 ml 69 Eiger HN03 unterDruck bei 180°C über 3 h im 35-ml-Tiegel aufgeschlossen .Die ionenchromatographische Analyse der resultierenden Auf-schlußlösung ergab, daß der in Cystein und Cystin gebundeneSchwefel zu mehr als 95 % in Sulfat überführt wird .

14 9

Dies kann auch für Rinderleber bestätigt werden, derenSchwefel-Gehalt 0 .83 % und deren Methionin-Gehalt 1 .41- bezogen auf die Trockenmasse - beträgt (Tab .l und 14) .Aus dem Schwefel-Gehalt des Methionins (21 .5 %) folgt, daß36 % des in Leber gebundenen Schwefels in Form vonMethionin, 64 % in Form von Cystein und Cystin vorliegen .Dabei wird davon ausgegangen, daß lediglich die drei ge-nannten Aminosäuren zum Gesamt-Schwefel-Gehalt beitragen .Es ist also zu erwarten, daß 64 % des in Leber enthaltenenSchwefels nach dem Aufschluß als Sulfat vorhanden sind . Dieionenchromatographische Analyse einer Leber-Aufschlußlösungführt zu einem Anteil von 60 % .

4 .11 .2 Phosphorbilanz

Phosphor tritt in biologischen Materialien im wesentlichenin Phosphorsäureestern auf . Polyphosphorsäuren werden durchSalpetersäure bei 180°C in Monophosphorsäure überführt,Phosphorsäureester, wie z .B . Glucose- und Adenosinphos-phate, werden hydrolytisch gespalten (vgl . Rap .4 .8 .2) . Wieionenchromatographisch gezeigt werden konnte, hinterbleibtbeispielsweise nach dem Druckaufschluß von 20 mgNa4P20, " 10 H20 (Merck, Darmstadt, Art .Nr .6591) mit 3 ml69 Eiger Salpetersäure (180°C, 3 h, 35-ml-Tiegel) aus-schließlich Phosphat als Phosphorverbindung . Unter gleichenAufschlußbedingungen wird auch der in Leber gebundene Phos-phor-Anteil quantitativ in Phosphat überführt . Dies konntedurch Ionenchromatographie gezeigt werden, nachdem die Auf-schlußlösung mit konzentrierter Salzsäure mehrfach bis fastzur Trockene abgeraucht war, um überschüssige HN03 weit-gehend zu entfernen . Für die Richtigkeit dieser Bilanz mußjedoch vorausgesetzt werden, daß nach dem Druckaufschlußeventuell vorliegende phosphororganische Verbindungen nichtdurch das beim Abrauchen mit HCl entstehende Nitrosyl-chlorid NOC1 zu Phosphat umgesetzt werden .

4 .11 .3 Stickstoffbilanz

15 0

Der Stickstoffgehalt biologischer Materialien wird inerster Linie durch Aminosäuren bestimmt . Diese enthalteneine a-ständige Aminogruppe . Zusätzlich kann Stickstoff inAmidgruppen (Asparagin, Glutamin), in weiteren Aminogruppender Seitenkette (Lysin, Arginin) sowie als Teil aroma-tischer Ringsysteme gebunden sein (Tryptophan, Histidin) .

Harnstoff wird im Verlauf des Druckaufschlusses vollständigmineralisiert (vgl . Kap .4 .8 .2) . Nach Abrauchen der Auf-schlußlösung bei 130°C hinterbleibt Ammoniumnitrat, dessenAmmoniumionen zu einem erhöhten Wasserstoffstrom bei derinversen Voltammetrie führen (vgl . Kap .4 .8 .4) . Zusätzlichwird eine Depression des Zink-Signals beobachtet .

Um zu klären, ob Ammonium auch beim Aufschluß von Aminosäu-ren entsteht, wurden folgende Aminosäuren (Einwaage entspr .90 mg C) mit 3 ml 69 Eiger HN03 bei 180°C über 3 h im35-ml-Tiegel unter Druck aufgeschlossen : Glutamin, Aspara-gin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Lysin, Arginin, Leucin .In den nicht zusätzlich abgerauchten Aufschlußlösungen wur-de der Ammoniumgehalt nach KJELDAHL bestimmt . Die Analysenergaben, daß mehr als 99 .9 % des eingesetzten Stickstoffsnicht zu Ammonium umgesetzt werden . Der Aufschluß der Ami-nosäuren Leucin, Asparaginsäure und Glutaminsäure zeigtedabei, daß die a-ständige Aminogruppe nicht zu Ammoniumreagiert . Dieses ist unter den oxidierenden Aufschlußbe-dingungen auch nicht zu erwarten . Analoges gilt auch füralternativ gebundene Aminogruppen, wie der Aufschluß vonLysin und Arginin belegt . Aus den Säureamid-Gruppen vonGlutamin und Asparagin ist jedoch primär eine hydrolytischeAmmoniak-Abspaltung zu erwarten . Wenn das so ist, kanngefolgert werden, daß Ammoniak während des Druckaufschlus-ses oxidiert wird . Das Normalpotential für die ReaktionNH+a ;=e~ 1/2 N2 + 4 H+ + 3 e - beträgt 0 .27 V, jenes für die

Salpetersäure-Reduktion gemäßNO3- + 4 H+ + 3 e-2 H2O + NO 0 .96 V (150) .Eine Oxidation von NH3 zu N2 ist thermodynamisch alsomöglich . Um die Reaktion experimentell zu belegen, wurden0 .30 ml 25 %ige wäßrige NH3-Lösung (Merck, Darmstadt,Art.Nr .5428) mit 3 ml 69 Eiger HN03 versetzt und im Druck-aufschlußsystem erhitzt . In den aus mehreren Versuchenresultierenden Lösungen wurden stark variierende Ammonium-gehalte nachgewiesen (entsprechende'-- 0 .5 bis etwa 90 % deseingesetzten NH3) ; eine praktisch vollständige Zersetzungdes Ammoniums gelang nur bei etwa einem Zehntel der Auf-schlüsse . Ein ähnlich unreproduzierbares Verhalten wurdeauch beim Aufschluß von Harnstoff beobachtet . Es wird ver-mutet, daß die Reaktion zwar möglich ist, jedoch zu ver-schiedenen Zeiten nach Aufschlußbeginn "anspringt" . Je nachLage dieses Zeitpunktes erhält man einen mehr oder wenigervollständigen Umsatz . Die Ursache für dieses Verhaltenkonnte nicht ermittelt werden . Interessant ist jedoch, daßauch diese Reaktion durch Glucose-Zusatz gestartet werdenkann (vgl . Kap .4 .8 .3) : Setzt man zu 0 .30 ml 25 Eiger NH3-Lösung und 3 ml 69 Eiger Salpetersäure 200 mg Glucose zu,so werden bei allen Aufschlüssen mehr als 99 .9 % des einge-setzten NH3 vermutlich zu N2 umgesetzt . Dies gilt auch füranalog durchgeführte Harnstoff-Aufschlüsse . Demnach kannauch beim Abbau des Ammoniums ein Einfluß der NO2-Konzen-tration in der flüssigen Phase angenommen werden, wie erbei organischen Verbindungen beobachtet wird (vgl .Kap .4 .6 .4 und 4 .8 .3) .

Aus den letztgenannten Experimenten geht hervor, daß nachDruckaufschluß biologischer Materialien kein Ammonium hin-terbleibt, was am Beispiel von Rinderleber durch die Ammo-niumbestimmung nach KJELDAHL gezeigt werden konnte : NachDruckaufschluß von 200 mg Leber (Bedingungen sieheKap .4 .6 .1) sind weniger als 0 .1 % des in Leber gebundenenStickstoffs in Form von Ammonium im Rückstand enthalten .

5. Diskussion

152

Der Druckaufschluß biologischer Probenmaterialien in umman-telten Gefäßen aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der ausSicherheitsgründen mit konzentrierter Salpetersäure ohneden Zusatz weiterer Oxidationsmittel erfolgen sollte, kannaufgrund der thermischen Eigenschaften des PTFE nur beiTemperaturen bis maximal 200°C - abhängig von der Güte undVerarbeitung des Kunststoffes - durchgeführt werden . ImVerlauf der Aufschlußreaktion werden zwar die meisten orga-nischen Verbindungen bzw . die Hauptanteile der in biolo-gischen Materialien gebundenen Komponenten mineralisiert,es gelingt aber nicht, die in solchen Proben enthaltenenStoffe Phenylalanin, Tryptophan, Histidin, Methionin undLinolsäure so weit umzuwandeln, daß sie als bei 130°Cflüchtige Verbindungen abgetrennt werden können .

Ein praktisch vollständiger Abbau der oben genannten Stoffeist erst bei einer Aufschlußtemperatur von 300°C möglich,wie sie mit dem Hochdruckverascher nach KNAPP erreichtwerden kann . Auch durch Nachbehandlung von Druckaufschluß-rückständen mit Perchlorsäure gelingt eine weitgehendeMineralisierung . In beiden Fällen erhält man Lösungen, indenen die Konzentration organischer Stoffe so gering ist,daß eine störungsfreie inversvoltammetrische Bestimmung vonSpuren Zn, Cd, Pb und Cu gelingt . Lediglich die nach Druck-aufschluß mit Salpetersäure gelöst zurückbleibenden Stick-oxide müssen vor der Analyse durch Abrauchen entfernt wer-den, da sie andernfalls zu hohen Untergrundströmen führen,die besonders die Bestimmung von Zn und Cd erschweren oderverhindern können . Die durch zusätzliches Abrauchen in ei-nem kleinen Quarztiegel eingebrachte Kontamination ist beientsprechender Sorgfalt meist belanglos : Für das Gesamtver-fahren (Aufschluß mit dem Hochdruckverascher in Quarzge-fäßen, Abrauchen im Quarztiegel, Auffüllen auf 10 .0 ml imMeßkolben, inversvoltammetrische Bestimmung) wurden die alsBlindwerte eingebrachten Schwermetallmengen für Pb und Cd

15 3

zu - 0 .2 ng ermittelt . Damit ist auch von der Blindwertbe-lastung her eine Bestimmung dieser Elemente in biologischenMaterialien im unteren ng " g-1-Bereich möglich .

Die weite Verbreitung und einfache Handhabung des gut re-produzierbaren Druckaufschlusses im PTFE-Gefäß rechtfertigtes, die mechanistischen Abläufe beim Umsatz biologischerMaterialien mit Salpetersäure unter diesen Bedingungen zuverfolgen und die zurückbleibenden organischen Stoffe nachArt und Menge zu untersuchen . Die bereits in einer früherenArbeit (22) als optimal ermittelten Arbeitsparameter fürden Druckaufschluß im PTFE-Gefäß wurden an zwei weiterenMaterialien (Rinderleber und Braunalgen, jeweils gefrierge-trocknet und pulverisiert) bestätigt . Für den Aufschluß in35-ml-Gefäßen sind folgende Bedingungen zu empfehlen :Temperatur : 170-180°C ; Aufschlußzeit : 3 h ; Oxidations-mittel : 2 ml 69 %ige Salpetersäure ; Einwaage : Probenma-terial entsprechend 100 mg C . Voraussetzung für die Para-metereinstellung ist, daß das System einem Innendruck vonetwa 20 bar standhält . Als Zielgröße der Optimierung wurdeder Restkohlenstoffgehalt des Aufschlußrückstandes (RKG,Definition siehe S .49) gewählt, der nach Abrauchen über-schüssiger Säure bei 130°C (Kp . HNOs/Hz0 : 122°C) sowie dergelösten Stickoxide und vorhandener flüchtiger organischerVerbindungen durch Verbrennung und coulometrische COZ-Titration bestimmt wurde . Dieses Verfahren erwies sich alsausreichend nachweisstark und ermöglicht eine relativrasche Analyse (siehe auch (22)) . Zur Kohlenstoffbestimmungist es erforderlich, überschüssige Säure zu entfernen, umStörungen der auf pH-Änderung basierenden coulometrischenCOZ-Bestimmung zu vermeiden . Die Methode liefert keineInformation über eventuell nach dem Aufschluß vorliegendeleicht flüchtige organische Verbindungen . Da jedoch bekanntist, daß Druckaufschlußlösungen zur voltammetrischen Be-stimmung von Zn, Cd und Pb im allgemeinen abgeraucht werdenmüssen, um störende Stickoxide zu entfernen, spielen leichtflüchtige organische Verbindungen zur Beurteilung von Ana-

15 4

lysenstörungen hier keine Rolle . Es konnte gezeigt werden,daß nach Druckaufschluß biologischer Proben bei 180°C etwadie Hälfte des organisch gebundenen Kohlenstoffs in Formvon Verbindungen vorliegt, die bei 130°C flüchtig sind .Auch die nach Aufschluß mit Salpetersäure bei 300°C bzw .nach Behandlung mit Perchlorsäure noch vorhandenen orga-nischen Stoffe setzen sich aus leichtflüchtigen und schwer-flüchtigen Substanzen zusammen . Sofern bei der Perchlor-säure-Nachbehandlung unter Rückfluß gearbeitet wird, ver-bleiben geringe Mengen flüchtiger organischer Stoffe in derAufschlußlösung . Die dadurch bedingten Analysenstörungenbei der inversen Voltammetrie sind jedoch bedeutungslos .Untersucht wurden in dieser Arbeit daher nur die schwer-flüchtigen organischen Verbindungen, die nach Druckauf-schluß bei 180°C mit nachfolgendem Abrauchen bei 130°C zu-rückbleiben . Es konnte gezeigt werden, daß folgende Umset-zungen zu definierten Verbindungen im Aufschlußrückstandablaufen .

Phenylalanin-->15 % 2-Nitrobenzoesäure23 % 3-Nitrobenzoesäure51 % 4-Nitrobenzoessäure5 % 2,4-Dinitrobenzoesäure und etwa5 % weitere Stoffe, vermutlich ebenfalls

nitrierte Benzoesäuren

Histidin -. Imidazol-4-carbonsäure als HN03-Addukt

Methionin~Methansulfonsaure

Linolsaure~ 95 % cis-1,2-Cyclopropandicarbonsäure5 % trans-1,2-Cyclopropandicarbonsäure

Tryptophan-> Gemisch aus mindestens 10 aromatischenVerbindungen, überwiegend Carbonsäuren

155

Von diesen Stoffen besitzt lediglich Methansulfonsäure bei130°C einen so hohen Dampfdruck, daß sie unter den gewähl-ten Abrauchbedingungen etwa zur Hälfte zusammen mit derverdampfenden Salpetersäure verflüchtigt wird . Die Kohlen-stoffbestimmung nach Abrauchen bei 130°C ist daher fürMethansulfonsäure nur schlecht reproduzierbar . Gut reprodu-zierbare voltammetrische Störsignale sowie Kohlenstoffge-halte in Aufschlußlösungen biologischer Materialien erhältman jedoch für die bei 130°C praktisch quantitativ im Rück-stand verbleibenden Nitrobenzoesäuren . Dies wird deutlich,wenn man das durch Nitrobenzoesäure verursachte "Störsig-nal 2" bei abgerauchten und nicht abgerauchten Aufschluß-lösungen von Leber (Abb .21 und 23) vergleicht : Die Signaleunterscheiden sich nur unerheblich in ihrer Höhe .

Für die gute Reproduzierbarkeit der Kohlenstoffbestimmungnach Abrauchen bei 130°C ist neben der geringen Flüchtig-keit der Nitrobenzoesäuren auch das Verdampfungsverhaltender aus Histidin gebildeten Imidazol-4-carbonsäure verantwortlich . Diese in Form eines ammoniumanalogen salpeter-sauren Salzes vorliegende Verbindung enthält zusammen mitden Nitrobenzoesäuren die Hauptmenge des im Rückstandverbleibenden organischen Kohlenstoffs und kann selbst bei180°C nicht verflüchtigt werden, so daß sie quantitativ imAufschlußrückstand verbleibt . Die aus Tryptophan gebildetenStoffe spielen, wie auch Methansulfonsäure, aufgrund ihrergeringen Konzentrationen in dieser Hinsicht keine wesent-liche Rolle ; jedoch zeigt die gute Reproduzierbarkeit derKohlenstoffbestimmung aus Tryptophan-Aufschlußlösungen nachAbrauchen bei 130°C, daß die zurückbleibenden Verbindungenauch hier nicht nennenswert flüchtig sind . Analoges giltfür die Cyclopropandicarbonsäuren, welche die Kohlenstoff-bilanz bei Fettaufschlüssen bestimmen .

Für die Vollständigkeit von Aufschlüssen definierter orga-nischer Verbindungen ist wesentlich, daß im Aufschlußsystemeine genügend hohe NOZ-Konzentration entsteht, da Stick-

15 6

stoffdioxid an den Abbaureaktionen maßgebend beteiligt ist .Bei Biomaterialien wird eine ausreichende NO2-Konzentrationbereits durch den Umsatz der im Überschuß vorliegendenleicht abbaubaren organischen Stoffe und die damit verbun-dene Reduktion der Salpetersäure gewährleistet . Bei manchenReinsubstanzen können vergleichbare Bedingungen, etwa durchZusatz einer bestimmten Menge an vollständig abbaubarerGlucose, geschaffen werden . Für die Vollständigkeit desAufschlusses spielt es keine Rolle, ob Substanzen in Formvon Makromolekülen bzw . hydrolysierbaren Verbindungen ein-gesetzt werden oder ob die Einzelkomponenten solcher Stoffeaufgeschlossen werden . Da unter stark sauren Bedingungenprimär eine Hydrolyse von Ester-, Peptid-, Amid- undglykosidischen Bindungen abläuft, liegen vermutlich nochvor den eigentlichen oxidativen Abbauprozessen kleinereMolekülbausteine vor, die dann unabhängig voneinander rea-gieren . Der Einfluß von NO2 beim Aufschlußprozeß ist sobedeutend, daß die durch Reaktion allein mit Salpetersäureerreichbaren Aufschlußraten durch weiteren Zusatz von NO2deutlich erhöht werden können . Dies gelingt nicht mit ande-ren Gasen (CO2, C2F4C12), ist also nicht auf eine Druck-erhöhung zurückzuführen . Die Wirkung von NO2 wird auch beimoffenen Aufschluß mit Salpetersäure z .B . in einem Kolbenmit aufgesetzten Steigrohr (22,23) deutlich : Während nichtgerührte, ruhig siedende Lösungen relativ lange durchgelöstes NO2 braun gefärbt sind und dementsprechend zuniedrigen Restkohlenstoffgehalten führen, findet man beigerührten Lösungen, aus denen die gelösten Stickoxidefrühzeitig ausgetrieben werden, teilweise erheblich höhereRKG-Werte . Wesentliche Voraussetzungen für die Ergebnisseder zugrundeliegenden Untersuchungen ist ein über alleAufschlußschritte (Aufheizen, Aufschluß, Abkühlen) völligdichtes Aufschlußsystem . Bei dem in dieser Arbeit gewähltenGerät ist dies auch langfristig gewährleistet . Bei Auf-schlüssen in undichten Tiegeln muß man als Folge desNO2-Verlustes mit einer Verschlechterung des Kohlenstoffum-satzes rechnen . NO2 kann also keineswegs als Endprodukt der

15 7

Redoxreaktion, sondern muß als Zwischenprodukt mit weitererFunktion als Oxidationsmittel angesehen werden .

Unter Beachtung dieser Randbedingungen gelingt es, die beimAufschluß biologischer Materialien resultierenden Restkoh-lenstoffgehalte allein aus den Aminosäure- und Linolsäure-Gehalten dieser Materialien sowie den RKG-Werten dieserVerbindungen zu berechnen . Unter Bezugnahme auf die Rest-kohlenstoffgehalte der in Biomaterialien enthaltenen Ein-zelverbindungen lassen sich einige mechanistische Effektebeim Druckaufschluß diskutieren .

Auf den Einfluß von gelöstem NOZ in der flüssigen Phase undauf die Möglichkeit, NOz durch Zusatz von Glucose zu er-zeugen, wurde bereits hingewiesen . Dieser Effekt wird beimAufschluß von Betain besonders deutlich : Während diese Ver-bindung mit HN03 allein praktisch nicht zersetzt wird, kanndie Reaktion durch Zusatz von wenig Glucose eingeleitetwerden, wobei Betain fast vollständig umgesetzt wird .

Auch die Vermutung, daß Ester-, Peptid-, Amid- und glykosi-dische Bindungen primär hydrolysiert werden, wobei dieHydrolyseprodukte unabhängig voneinander weiterreagieren,konnte experimentell erhärtet werden .

Bei systematischen Untersuchungen zum Abbauverhalten einergroßen Zahl unterschiedlicher Substanzen wurde festge-stellt, daß Verbindungen aus bestimmten Stoffgruppen prak-tisch vollständig im Salpetersäureaufschluß unter Druckzersetzt werden . Dies gilt für Kohlenhydrate und für gesät-tigte Fettsäuren, ebenfalls für die Alkane Eicosan undCyclododecan, für Eicosanol als langkettigen Alkohol undfür die Dicarbonsäuren Malon- und Tetradecandisäure . Aucheine Doppelbindung (Ölsäure) ändert an diesem Verhaltennichts . Der Aufschluß des Cyclododecans zeigt, daß die Ab-baureaktion an einer Methylengruppe der gesättigten Ketteeinsetzt . Dies wird auch durch den vollständigen Abbau von

15 8

Polyethylen untermauert . Endständige Methylgruppen sinddazu offensichtlich nicht notwendig, wie diese Versuche unddie Aufschlüsse von Dicarbonsäuren zeigen . Bei Methioninwird die endständige Methylgruppe nicht oxidiert, worausjedoch nicht geschlossen werden kann, daß enständigeMethylgruppen prinzipiell nicht angegriffen werden . BeimMethionin ist möglicherweise ein stabilisierender Effektvom benachbarten Schwefel her vorhanden . Methylamine ge-hören z .B . zu den methylhaltigen Verbindungen, die voll-ständig abgebaut werden . Analoges gilt auch für die dreiN-methylierten Aminosäuren . Bei diesen Verbindungen und beiden Methylaminen stellt sich jedoch die Frage, ob derAngriff oxidierender Agentien am Stickstoff oder am Methyl-kohlenstoff oder, bei den Aminosäuren, an der Seitenketteeinsetzt .

Mehrfach ungesättigte Fettsäuren können mit HN03 bei 180°Cnicht quantitativ mineralisiert werden :Die cis-cis-substituierten Doppelbindungen der GruppeR1-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-R2 werden fast ausschließlich zucis-1,2-Cyclopropandicarbonsäure umgesetzt . Dieses Produktsowie die ebenfalls nachweisbare trans-Verbindung zeigen,daß der Dreiring so stabil ist, daß er von Salpetersäurebei 180°C nicht angegriffen wird . Die Ausbeute an Cyclo-propandicarbonsäure beträgt 36 % der Theorie, woraus folgt,daß zusätzlich Nebenreaktionen ablaufen . Da aus natürlichenFetten mit HN03 unter Druck ausschließlich diese Verbindung(95 % cis- und 5 % trans-Isomeres) in hoher Reinheit erhal-ten wird, kann die Reaktion auch präparativ angewendet wer-den . Alle anderen in natürlichen Fetten enthaltenen Stoffewerden beim Druckaufschluß abgebaut . Für eine präparativeAnwendung wäre es jedoch notwendig, ein Druckaufschluß-system mit höherer Kapazität zu entwickeln . Möglicherweisekann die Ausbeute auch durch Optimierung der Aufschlußpara-meter (z .B . eine Temperaturerniedrigung) gesteigert werden .Eine dritte Doppelbindung, wie bei Linolensäure vorhanden,hat keinen Einfluß auf die Reaktion und auf das Endprodukt .

15 9

Lediglich das cis/trans-Verhältnis ist mit 9 :1 leicht zu-gunsten des trans-Isomeren verändert . Das in natürlichenFetten gebundene Glycerin wird erwartungsgemäß vollständigzersetzt (vgl . Kohlenhydrate) .

Aminosäuren als untersuchte dritte große Stoffgruppe werdenbis auf wenige Ausnahmen quantitativ zersetzt ; grundsätz-lich wird ein vollständiger Abbau der Gruppierung-CH(NH2)-000H beobachtet . Das weitere Verhalten einer Ami-nosäure hängt von ihrem charakteristischen Rest ab . Währendaliphatische Reste bis auf die CH3-S-Gruppe des Methioninsvollständig zerlegt werden, gelingt dies bei unsubstituier-ten aromatischen Ringen nicht . So wird bei Histidin ledig-lich die Seitenkette abgebaut ; die zum Ring benachbarteMethylengruppe wird - etwa vergleichbar der Oxidation vonToluol mit Permanganat oder Salpetersäure (143) zu Benzoe-säure - zur Carboxylgruppe oxidiert . Die entstehende aroma-tische Carbonsäure ist bei 180°C gegen Salpetersäure stabilund wird aufgrund der Protonierung der zwei Ring-Stick-stoffatome in Salpetesäure nicht nitriert . Der Angriff desnitrierenden N02+-Ions (Autoprotonierung von HN03 gemäß :2 HN03 . NO2+ + N03- + H20) an ein Kation ist unter diesenBedingungen nicht möglich . Da die Ausbeute an Imidazol-4-carbonsäure nur 38 % der Theorie beträgt, müssen weiterebeim Aufschluß ablaufende Reaktionen dafür verantwortlichsein, daß 62 % des Aromaten zu anderen Endprodukten reagie-ren .

Bei Phenylalanin hingegen wird der Abbau der Seitenkettezur Carboxylgruppe von der Nitrierung des Phenylrestes be-gleitet . Solange die -CH2-R-Gruppe am Ring vorhanden ist,wird die Nitrierung aufgrund des aktivierenden und dirigie-renden Einflusses dieser Gruppe in ortho- und para-Stellungerfolgen . Dabei ist unklar, warum die weniger wahrschein-liche Para-Verbindung im Überschuß entsteht . Möglicherweisewird die Nitrierung der ortho-Position durch den Amino-säurerest zunächst sterisch erschwert . Die Tatsache, daß

16 0

3-Nitrobenzoesäure entsteht, deutet darauf hin, daß dieNitrierung teilweise erst im Anschluß an die Oxidation derSeitenkette abläuft . Die dann vorliegende Carboxylgruppedirigiert in meta-Position . Dies wird auch beim Aufschlußvon Benzoesäure deutlich, durch den zu 70 % meta-Nitroben-zoesäure geliefert wird . Für Hippursäure, die zunächst zuBenzoesäure und Glycin hydrolysiert wird, gilt Analoges .Bei Phenylalanin beträgt die Ausbeute an unzersetztenAromaten 57 % der Theorie . Auch hier werden bei weiterenAbbaureaktionen flüchtige Stoffe gebildet .

Interessant ist der Einfluß von Substituenten, die eineNitrierung erleichtern : So werden Tyrosin und Dihydroxy-phenylalanin sowie die drei isomeren Hydroxybenzoesäurenvollständig zersetzt . Dabei reagieren die substituiertenPhenylalanine auf Zusatz vonheftig . Weniger deutlich istaktivierenden Aminogruppe inwird auch hier ein erheblichHippursäure beobachtet, wennVerbindungen hinterbleiben .

Salpetersäure spontan undder Effekt der ebenfalls4-Aminohippursäure . Jedochniedrigerer RKG-Wert als beiauch unzersetzte organische

Die Reaktion des Tryptophans ist kompliziert . Sowohl Gas-chromatographie als auch Kernresonanzspektroskopie zeigendie Komplexizität des Rückstandes an, der aus etwa 10 domi-nierenden, insgesamt jedoch aus vermutlich mehr als 30Stoffen zusammengesetzt ist . Da es sich ausschließlich umAromaten handelt (NMR), stellt sich die Frage, ob der Hete-roring unter Bildung von Benzolderivaten geöffnet wird oderin Form substituierter Indole erhalten bleibt . Da Trypto-phan in der Kohlenstoffbilanz nur eine untergeordnete Rollespielt, wäre eine weitere Identifizierung der im Rückstandenthaltenen Verbindungen nur im Hinblick auf deren nachge-wiesene Eigenschaft als Maximum-Dämpfer bei der Voltamme-trie von Interesse . Wegen des hohen Aufwands bei der Tren-nung und Analytik dieser Stoffe wurde auf eine Bearbeitungjedoch verzichtet . Bereits bei der Zugabe von 69 Eiger

Salpetersäure zu Tryptophan erfolgt eine heftige Reaktion,die im Verlauf weniger Sekunden abklingt . Sie hinterläßteine schwarze Suspension, die darauf hinweist, daß vermut-lich schon vor dem eigentlichen Aufschluß ein komplexesStoffgemisch entsteht, das dann weiter umgesetzt wird .

Auch die aromatische Nicotinsäure wird erwartungsgemäß nurunvollständig abgebaut . Die resultierenden Produkte sindhier jedoch nicht näher untersucht worden, da Nicotinsäurein biologischen Materialien nur in vernachlässigbar ge-ringen Konzentrationen vorhanden ist . Die schwachen Signaleder inversen Square-Wave-Voltammetrie lassen jedoch vermu-ten, daß keine nitrierten Stoffe entstanden sind . Dies istauch deshalb anzunehmen, weil Nicotinsäure wie Imidazol-4-carbonsäure in saurer Lösung als ammoniumanaloges Kationvorliegt, an dem ein Angriff des nitrierenden NO2+-Ionsverhindert wird . Die Beobachtung, daß das Reaktionsproduktzu einer Erhöhung des Wasserstoffstroms bei der Voltamme-trie führt, deutet darauf hin, daß nach wie vor eine orga-nische Stickstoffbase im Aufschlußrückstand enthalten ist .Da Imidazol-4-carbonsäure, die eine der Nicotinsäure ähn-liche Struktur besitzt, unter den Bedingungen des Druckauf-schlusses stabil ist, ist zu vermuten, daß auch Nicotin-säure unter den gleichen Bedingungen nicht angegriffenwird . Unklar bleibt dann jedoch, warum nach dem Aufschlußnur noch 65 % des ursprünglichen Kohlenstoffs vorhandensind . Es entsteht also entweder ein anderes Endprodukt oderdie Umsetzung der Nicotinsäure ist nach 3 h noch nichtabgeschlossen, woraus weiter gefolgert werden müßte, daßNicotinsäure prinzipiell abbaubar ist . Ein der letzterenÜberlegung zugrundeliegender kinetischer Effekt tritt je-doch bei den Stoffen, welche die Kohlenstoffbilanz be-stimmen, nicht auf, was daran zu erkennen ist, daß durchVerlängerung der Aufschlußzeit eine Verringerung des RKG-Wertes nicht erreicht werden kann . Dies wurde auch in (22)schon gezeigt : Nach Druckaufschluß von Schweineblut undSonnenblumenöl wurden die Aufschlußrückstände erneut mit

16 2

überschüssiger Salpetersäure über 3 h im Druckgefäß behan-delt . Eine Verringerung der RKG-Werte wurde nicht beobach-tet . Es liegen also nach dem Aufschluß im Rückstand Verbin-dungen vor, die gegen HN03 bei 180°C beständig sind . DasVerhalten der Nicotinsäure müßte also in weiteren Experi-menten untersucht werden . An dieser Stelle soll nur nochmit dem Aufschluß von Dihydronicotinamid-adenin-dinucleotid(NADH) verglichen werden, das eine Art nicht-aromatischer,reduzierter Form der Nicotinsäure - gebunden an Zucker -enthält . Während Nicotinsäure, auch in Form von Nicotin-amid-adenin-dinucleotid (NAD) und Nicotinamid-adenin-dinuc-leotid-phosphat (NADP), einen RKG-Wert von 65 % liefert,beobachtet man beim Aufschluß von NADH nur 5 .8 % RKG . Bezo-gen auf die Gruppierung -N(CsH4)-CONHZ entspricht dieseinem RKG-Wert von 20 % . Der nichtaromatische Charakter desNADH begünstigt zwar zunächst einen Abbau des Ringes, derdann vermutlich durch Oxidation teilweise aromatisiertwird, so daß schließlich ein stabiler Rückstand hinter-bleibt . Dafür spricht, daß eine Aromatisierung beim Auf-schluß des 1,4-Cyclohexadiens mit HN03 beobachtet wird : DerRückstand besteht zu etwa 80 % aus 1,3-Dinitrobenzol . Auchdas aromatische Riboflavin wird nicht vollständig abgebaut .

Zusammenfassend kann man feststellen, daß alle hier unter-suchten aromatischen Stoffe, die keine aktivierende OH-Gruppen am Ring besitzen, unter den Bedingungen des Druck-aufschlusses nicht vollständig abgebaut werden können . Da-bei bleiben die aromatischen Ringe bei Tryptophan, Phenyla-lanin und Histidin erhalten .

Die CH3S-Gruppe des Methionins wird vollständig zu Methan-sulfonsäure oxidiert . Die S-H-Gruppe in Cystein und dieS-S-Gruppe in Cystin wird dagegen quantitativ zu Sulfat um-gesetzt . Da die S-S-Gruppe des Cystins auch in Liponsäurevorhanden ist, sollte auch diese vollständig mineralisier-bare Verbindung unter Bildung von Sulfat oxidiert werden .Die drei schwefelhaltigen Aminosäuren und Liponsäure rea-

16 3

gieren heftig auf Zusatz von Salpetersäure und werden alsobereits vor dem Aufschluß zersetzt . Da bei dieser Anfangs-reaktion jedoch nur geringe Stickoxidmengen entstehen, nachdem Aufschluß dagegen erheblich mehr an NOZ vorliegt, kannnach Zugabe der Salpetersäure wohl noch keine vollständigeUmsetzung abgelaufen sein . Vermutlich erfolgt nur ein pri-märer Angriff, der eine teilweise Zersetzung der Verbin-dungen zur Folge hat .

Zusammenfassend wurden folgende Primärreaktionen bei derZugabe von Salpetersäure zu biologischem Material festge-stellt :1 . Hydrolyse von Ester-, Peptid-, Amid- und

glykosidischen Bindungen,2 . spontane Zersetzung von Tryptophan, Tyrosin

und schwefelhaltigen Aminosäuren .Andere in biologischen Materialien in merklichen Konzen-trationen enthaltenen Stoffe zeigen keine spontanen Reak-tionen .

Milch-, Zitronen-, Ascorbin- und Weinsäure, die als OH-sub-stituierte aliphatische Carbonsäuren Strukturelemente vonFettsäuren und Zuckern besitzen, werden vollständig zer-setzt . Dies gilt ebenso für Brenztraubensäure und belegt,daß auch C-C-Ketten mit angefügten Carbonylgruppen abgebautwerden können . Die Tatsache, daß Oxalsäure quantitativmineralisiert wird, zeigt, daß prinzipiell auch Carboxyl-gruppen umgesetzt werden können, was bei aromatischenCarbonsäuren nicht immer gelingt .

Nucleinsäuren werden praktisch quantitativ abgebaut ; diesgilt auch für ihre isolierten Bausteine sowie für Adenosin-triphosphat und Adenosinmonophosphat . Die StickstoffbasenCytosin und Uracil benötigen jedoch eine genügend hoheStartkonzentration an N02, um vollständig reagieren zukönnen, was beim Aufschluß biologischer Materialien gegebenist . Die beim Aufschluß dieser Stoffgruppe häufig beobach-

16 4

teten RKG-Werte unterhalb von 1 % sind vermutlich auf Ver-unreinigungen der Ausgangsstoffe oder auf unbedeutendeNebenreaktionen zurückzuführen .

Die untersuchten phosphorhaltigen, nichtaromatischen Stoffemit Ausnahme des NADH, das vermutlich während des Auf-schlusses ' aromatisiert wird, erleiden einen vollständigenAbbau der organischen Matrix, wobei auch aus PolyphosphatenP04 3- gebildet wird, wie Untersuchungen an Rinderleber er-gaben (vgl . Kap .4 .11) .

Das einzige in biologischen Materialien in relevanten Kon-zentrationen auftretende Steroid, Cholesterin (Eidotter,Gehirn : bis zu 3 % (137)), wird zu 98 % abgebaut . Eine ver-gleichbar aufgebaute Substanz, Androsteron, wird zu 97zersetzt, bezogen jeweils auf den Kohlenstoffgehalt . Auchdiese cyclischen Systeme, die im Falle des Cholesterinseine C-C-Doppelbindung enthalten, werden praktisch voll-kommen aufgeschlossen, da sie ähnliche Strukturelementeenthalten wie bereits diskutierte kettenförmige Verbin-dungen .

Porphyrinsysteme wurden am Beispiel der Stoffe Haemin undHaematoporphyrin untersucht . Diese werden nahezu quantita-tiv abgebaut . Der prinzipiell ähnliche Aufbau von Chloro-phyll läßt erwarten, daß auch Chlorophyll a und b voll-ständig zerlegt werden . Dabei sollte der unterschiedlicheAufbau der Seitenketten keine Rolle spielen, da die darinenthaltenen Strukturelemente - wie bei anderen Stoffgruppendiskutiert wurde - mineralisiert werden können . Die Über-tragung dieser Ergebnisse auf Chlorophyll ist möglicher-weise aber deshalb unsicher, weil Chlorophyll a und Chloro-phyll b über einen nur partiell ungesättigten Ring verfü-gen . Erfahrungsgemäß sollte jedoch auch dieses Struktur-element leicht abbaubar sein . Reines Chlorophyll selbstkonnte aus Kostengründen nicht untersucht werden .

16 5

Bei Phosphatiden stellt sich, setzt man eine Primärhydro-lyse voraus, nur die Frage nach der Reaktionsfähigkeit derBasen, da die Fettsäurereste und Glycerin vollständig ab-gebaut werden können, sofern keine mehrfach ungesättigtenFettsäuren vorhanden sind . Neben den bereits diskutiertenMonosacchariden (z .B . Inosit) und der Aminosäure Serin wer-den auch Cholin und Ethanolamin praktisch quantitativ zer-setzt . Auch das Dipalmitoyllecithin mit Cholin als Basewird daher vollkommen abgebaut . Lecithin, das neben einemPalmitoyl- noch einen Ölsäure-Rest aufweist, wird zwarnicht vollständig zersetzt (RKG 2 .7 %), da das Probenma-terial jedoch ein aus Eiern isoliertes Naturprodukt ist,dürfte der Rückstand auf Proteine zurückzuführen sein . Dieswird auch aus dem Voltammogramm ersichtlich, das dem Auf-schlußrückstand aus Phenylalanin (Nitrobenzoesäuren) ent-sprechende Signale enthält .

Die Polyamine 1,6-Diaminohexan und 1,2-Bis-(3-aminopropyla-mino)-ethan reagieren, wie auch Ethanolamin, äußerst heftigauf Zusatz von Salpetersäure . Im nachfolgenden Aufschlußwerden sie praktisch vollkommen zersetzt . Die in Alkyl-Ketten eingebaute Aminogruppe und die endständige Amino-gruppe verhindern den Abbau dieser Ketten nicht (vgl . auchMethylamin und Arginin) . Die heftige Reaktion bei Vorhan-densein endständiger Aminogruppen läßt vermuten, daß derAbbau gegenüber reinen C-H-Verbindungen erleichtert wird .Die drei Methylamine zeigen die heftige Reaktion bei Sal-petersäure-Zusatz nicht . Harnstoff wird vollständig zer-setzt, wobei durch Hydrolyse Ammonium und C02 gebildetwird . Die Tatsache, daß auch Ethylendiamintetraessigsäure(EDTA) abgebaut wird, ist zwar für die Beurteilung desAufschlußverhaltens biologischer Materialien von geringemInteresse, dieses Verhalten kann aber in anderen Bereichender analytischen Chemie wichtig sein, da EDTA oft als Kom-plexierungsmittel eingesetzt wird . Beim Aufschluß von Blut,dem EDTA-Salze oft zur Stabilisierung zugesetzt werden,

16 6

braucht es ebenfalls bezüglich der Kohlenstoffbilanz nichtberücksichtigt zu werden .

Die Untersuchungen zur Kohlenstoffbilanz legen es nahe,anzunehmen, daß Esterbindungen unter den Bedingungen desDruckaufschlusses durch Salpetersäure hydrolytisch gespal-ten werden . Aus dieser Sicht ist die oft als Gefahr hervor-gehobene Bildung explosiver Salpetersäureester (etwa mitGlycerin oder Cellulose) nur wenig wahrscheinlich, was auchdadurch erhärtet wird, daß beim Aufschluß dieser Stoffe inkeinem Fall explosive Reaktionen beobachtet wurden . Nichtausgeschlossen werden kann jedoch, daß die hohe Konzentra-tion an Salpetersäure bei manchen Probenmaterialien dieBildung von Salpetersäureestern begünstigt, so daß geringeMengen dieser Verbindungen entstehen . Die in dieser Arbeituntersuchten Stoffe lassen sich jedoch unter den mitgeteil-ten Bedingungen gefahrlos aufschließen .

Die durch Zersetzungsprodukte biologischer Materialien her-vorgerufenen Signale bei der inversen Voltammetrie von Ele-mentspuren sind bereits in Kap .4 .8 .4 diskutiert worden . DieFrage der Zuordnung von Störsignalen nach Aufschluß biologischer Proben führte zu dem Ergebnis, daß die Signalinten-sität zu über 95 % auf das aus Phenylalanin gebildete Ni-trobenzoesäure-Gemisch zurückzuführen ist (vgl . Kap .4 .9 .3) .Die in diesem Gemisch enthaltenen Stoffe 2-Nitro- und2,4-Dinitrobenzoesäure tragen neben dem Rückstand aus Tryp-tophan außerdem zur Erhöhung des Wasserstoffstromes bei .Die im Druckaufschluß aus Phenylalanin gebildeten Nitroben-zoesäuren werden über das Hydroxylamin zweistufig zum Aminreduziert . Die Höhe der im Voltammogramm beobachteten zweiStörsignale ist unabhängig von der Anreicherungszeit, dadie Substanzen elektrolytisch nicht an der Quecksilberelek-trode angereichert werden können . Der Reduktionsmechanismusist in Kap .4 .10 beschrieben . Die aus Tryptophan- undHistidin-Rückständen resultierenden Störsignale sind gegen-über denen der Nitrobenzoesäuren vernachlässigbar gering .

Während das Signal nach Histidin-Aufschlüssen nicht vonImidazol-4-carbonsäure, sondern von einem in sehr geringenAnteilen entstehenden Nebenprodukt verursacht wird, konntedie für das Signal nach Tryptophan-Aufschluß verantwort-liche Substanz nicht ermittelt werden, weil die Zusammen-setzung des komplexen Aufschlußrückstandes nicht bekanntist . Das beim Aufschluß von Histidin gebildete Nebenproduktverursacht ein sehr intensitätsschwaches Störsignal, so daßauf eine Identifizierung dieser Substanz verzichtet wurde .Untersuchungen dieser Art wären auch schwierig, da dieImidazol-4-carbonsäure in großem Überschuß im Rückstandvorliegt . Nicht auszuschließen ist ferner, daß das Signalauf Verunreinigungen des Histidins zurückzuführen ist .

Der eliminierende Einfluß des Tryptophan-Rückstandes aufdas Maximum bei Nitrobenzoesäure-Signalen wurde bereits inKap .4 .8 .4 diskutiert . Nach Aufschluß biologischer Materia-lien tritt dieses Maximum dementsprechend bei Anwesenheitvon Zersetzungsprodukten des Tryptophans nicht auf . Dieswird auch von OEHME und LUND (29) bestätigt, die bei der

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 " 0 .2

E CVl vs . Ag/AgCI

16 7

Abb .50 : Signale nach Druckaufschluß von Blut (nach (29))

168

inversen Differential-Pulse-Voltammetrie von Blut-Druckauf-schlußlösungen (Aufschluß mit Salpetersäure) die zwei inAbb .50 dargestellten maximumfreien Störsignale beobachte-ten . Das intensive Signal bei -0 .1 V stimmt mit dem in dervorliegenden Arbeit beschriebenen "Störpeak 2" (vgl . z .B .Abb .49) in den Voltammogrammen der SWASV und analog auchder DPASV überein . Der "Störpeak 1" (vgl . Abb .49) ist beiOEHME und LUND durch einen hohen Grundstrom verzerrt . Die-ser rührt vermutlich daher, daß Stickoxide nach dem Auf-schluß nicht durch Abrauchen entfernt wurden (vgl . Abb .26) .Die Autoren machen darüber keine näheren Angaben . Das Sig-nal des Kupfers erscheint in Abb .50, wie auch bei Rinder-leber (Abb .49), als Schulter . Ein Vergleich der gestörtenVoltammogramme dieser Arbeit mit dem in Abb .2 dargestelltenVoltammogramm einer Untersuchung von BAUMGARDT (27) istnicht ohne weiteres möglich, da es in acetatgepufferter

e.

0. gf!'

B

Abb .51 : Leber ; Square-Wave-Voltammogramm einer nicht abge-rauchten Druckaufschlußlösung nach Zusatz vonNatriumacetat (-0 .75

> 0 .25 V)

16 9

Lösung aufgenommen wurde . Um vergleichen zu können, wurdeeine Leber-Druckaufschlußlösung (nicht abgeraucht ; Voltam-mogramm ohne Acetat-Zusatz : Abb .23) in der voltammetrischenMeßzelle mit Natriumacetat auf pH 5-6 eingestellt . Die Ana-lyse dieser Lösung unter den Abb .23 zugrundeliegendenBedingungen (siehe dort) liefert das in Abb .51 dargestellteSquare-Wave-Voltammogramm . Signal B wird durch Nitrobenzoe-säuren verursacht . Es ist in seiner Höhe unabhängig von derAnreicherungszeit, schmaler als in stark saurer Lösung undzu positiveren Potentialen hin verschoben . Seine Intensitätgegenüber der des Signals aus saurer Lösung ist etwa um denFaktor 5 erhöht . Cu erscheint bei 0 .02 V, Pb bei -0 .40 Vund Cd bei -0 .55 V . Dies kann durch Verlängerung der Anrei-cherungszeit oder durch Eichzusatz der Metallionen gezeigtwerden . BAUMGARDT (27) erhält gemäß Abb .2 folgende Poten-tiale : Cd : -0 .5 V; Pb : -0 .43 V ; Cu : 0 .02 V . Ein exakterVergleich der Potentiale ist zwar nicht möglich, da ver-schiedene Geräte und Verfahren (DPASV bzw . SWASV) verwendetwurden, dennoch ist die relative Lage der Signale zuein-ander etwa identisch . Demnach stimmt der bei BAUMGARDT inAbb .2 mit "?" bezeichnete Peak mit Signal A in Abb .51 über-ein ; der intensive Peak B ist in dem von BAUMGARDT gemes-senen Voltammogramm nur als Stromanstieg am rechtenBildrand zu erkennen .

Das in Abb .51 gezeigte Störsignal B wird auch von KINARD(5) in der DPASV an acetatgepufferten Druckaufschlußlö-sungen von Rattenblut beobachtet . Er interpretiert diesesSignal jedoch nicht, da es, wie in Abb .2, nur als Schulteram rechten Rand des Voltammogramms erscheint und so diebeginnende Auflösung des Quecksilbers der Mikroelektrodevortäuscht . OEHME und LUND (29) kommen unter Bezugnahme aufKINARD (5) zu dem Schluß, daß die von ihnen beobachtetenStörungen durch "elektroaktive nitrierte Substanzen" imGegensatz zu den Ergebnissen von KINARD stehen . Dies istjedoch nicht der Fall, da die Voltammogramme aufgrund un-

terschiedlicher Aciditäten und Leitelektrolyte nicht direktmiteinander verglichen werden können .

Das in Abb .51 enthaltene Signal B kann auf den ersten BlickKupfer vortäuschen, durch Eichzusatz läßt sich jedoch nach-weisen, daß Cu bei deutlich negativerem Potential oxidiertwird . Ein weiteres Beispiel dafür, daß das Signal derNitrobenzoesäuren mitunter nur schwer von dem des Kupferszu unterscheiden ist, gibt Abb .52 anhand der Analyse einerAlgen-Druckaufschlußlösung (vgl . Abb .15) . Bei einer

17 0

300 ul

Abb .52 : Einfluß von Cl - auf SWASV-Signale einer Algen-Aufschlußlösung (Zugabe als 30 %ige Salzsäure) ;Startvolumen : 6 .0 ml

Endvolumen : 7 .0 ml

elektrolytischen Anreicherungszeit von 3 min wurden stei-gende Mengen an 30 Eiger Salzsäure zugesetzt . Die in Abb .52aufgeführten Voltammogramme zeigen, daß das Kupfer-Signalzunächst auf dem "Störsignal 2" erscheint . In der zunächstnoch chloridfreien Lösung wird Cu unmittelbar zu Cut-(2-Elektronenübergang, schmales Signal) oxidiert . Bereitsnach Zusatz von 50 gl HC1 findet vorwiegend der ÜbergangCu --3 Cu+

> (CuClz) - statt . Das Kupfer-Signal erscheintfolglich bei negativerem Potential und ist vom Störsignalnicht mehr zu unterscheiden . Gleichzeitig wird die Halb-wertsbreite des nun 1-Elektronen-Übergangs gegenüber demdes 2-Elektronenübergangs verdoppelt . Eine unkritischeKupferbestimmung an dieser Stelle würde zwangsläufig zueinem stark erhöhten, falschen Meßergebnis führen . Beiweiterer Zugabe von Salzsäure werden sowohl die Cu- alsauch die Hg-Oxidation stärker in den negativen Potentialbe-reich hinein verschoben, da die Bildung von (CuC12) - undHg2C12 mit zunehmender Chloridionenkonzentration gefördertwird . Während das mit 500 gl Salzsäure wieder deutlichsichtbare Störsignal schließlich von dem Strom der Queck-silberoxidation überlagert wird, wird das Cu-Signal zuneh-mend vom Störsignal getrennt . Nach Zugabe von 1000 g1 Salz-säure ist die Trennung so vollständig, daß eine Analyse beiBeachtung der gekrümmten Basislinie annähernd zum richtigenKupfer-Gehalt führt . Diese von der Chlorid-Konzentrationbeeinflußte Potentiallage kann an Leber-Aufschlußlösungen(Abb .20) analog vorgeführt werden .

Das in Abb .51 dargestellte "Störsignal A" ist aus dem Sig-nal der Nitrobenzoesäuren (vgl . Abb .49) und dem weitererStoffe (vgl . Abb .23) zusammengesetzt . Dabei entsteht diefür den letztgenannten Signalanteil verantwortliche Sub-stanz aus Proteinen : Das Signal erscheint jeweils bei derAnalyse nicht-abgerauchter Aufschlußlösungen aus Algen,Milchpulver, Leber und Schweineblut, nicht jedoch beiLösungen aus Fett- und Kohlenhydrataufschlüssen . Um festzu-stellen, welche der Aminosäuren für das Signal verantwort-

17 2

lich ist, wurde einer der Rinderleber entsprechendenMischung von 6,4 mg Phenylalanin und 1,2 mg Tryptophan inEinzelaufschlüssen je eine weitere Aminosäure zugesetzt,wobei mit Glucose stets zu 90 mg Gesamtkohlenstoff ergänztwurde . Mit Hilfe der square-wave-voltammetrischen Analyseder nicht abgerauchten Aufschlußlösungen wurde ein zusätz-liches Störsignal nur nach Zugabe von Leucin, Valin undIsoleucin gemessen . Nach Aufschluß der Mischung aus Phenyl-alanin, Tryptophan und Glucose wird ein zusätzliches Signalnicht beobachtet . Die nähere Untersuchung zeigte, daß essich bei der Störung nicht um ein Maximum, sondern um einechtes polarographisches Signal handelt, welches durchleichtflüchtige Verbindungen verursacht wird, die aus Leu-cin, Valin und Isoleucin entstehen . Die Signale werden auchnach Aufschluß der genannten Aminosäuren in Einzelversuchenbeobachtet, sind also unabhängig von denen der Nitrobenzoe-säuren . Da Valin, Leucin und Isoleucin bei der Reaktion mitHN03 genügend NOZ liefern, kann auf den Zusatz von Glucoseverzichtet werden . Auffallend ist, daß das Störsignal nurvon diesen drei Aminosäuren verursacht wird, die tertiäreKohlenstoffatome besitzen und daß ein analoges Signal auchnach Aufschluß von 2,3-Dimethylbutan geliefert wird . Ledig-lich das Signal des Isoleucin-Rückstandes erscheint um20 mV negativer als das der anderen Verbindungen . Die zu-grundeliegenden Stoffe wurden nicht näher identifiziert .Sie sind zur Beurteilung von Analysenstörungen auch weit-gehend bedeutungslos, da sie beim Abrauchen zusammen mitStickoxiden und überschüssiger Salpetersäure entferntwerden . Vermutlich handelt es sich jedoch um aliphatischeNitroverbindungen . Wie bei den Nitrobenzoesäuren erhält manauch hier Signale, deren Intensität unabhängig von der An-reicherungszeit ist . Die Reduktionssignale von Nitromethanund 3-Nitropropionsäure in entsprechend saurer Lösung lie-gen bei einem um 0 .3 V negativeren Potential, sind aber inihrer Form identisch mit dem diskutierten Störsignal . DerAufschlug von 2,3-Dimethylbutan weist darauf hin, daß dieIsopropyl-Gruppe wohl für die Bildung der störenden Verbin-

17 3

dungen verantwortlich ist . Die Isobutyl-Gruppe C2Hs(CH3)CH-des Isoleucins führt vermutlich zu einem davon unterschied-lichen Produkt, wie die erwähnte Potentialverschiebungandeutet .

Aus der Flüchtigkeit der Nitrobenzoesäuren bei 180°C (vgl .Kap .4 .9 .1) kann eine Verbesserung der Analyse von Schwerme-tallen in Druckaufschlußlösungen abgeleitet werden : Rauchtman im PTFE-Gefäß bei 180°C bis zur Trockene ab, so werdenNitrobenzoesäuren bis zu 98 % (bezogen auf den C-Gehalt),der Rückstand aus Tryptophan bis zu etwa 50 % entfernt . Dadie Ionen Zn2+, Cd 2+, Pb2 + und Cut-*- auch bei 180°C ausRückständen biologischer Materialien nicht zu verflüchtigensind, wie an Algen- und Leberproben nachgewiesen wurde,können die beobachteten Störsignale auf diese Weise dra-stisch verringert und richtige Kupferbestimmungen ermög-licht werden . Völlig störungsfreie Voltammogramme sind sojedoch nicht zu erhalten, da jeweils geringe Anteile derZersetzungsprodukte bei 180°C zurückbleiben und weiterhinzu Störsignalen führen .

Abschließend sollen einige aus den Ergebnissen dieserArbeit resultierende Fragestellungen erörtert werden . Trotzder zahlreichen Einzelergebnisse bleiben die Informationenüber die Reaktionsmechanismen des Druckaufschlusses bei180°C nur bruchstückhaft . Kaum behandelt wurde z .B . dieBildung und Identifizierung der bei 130°C flüchtigen Abbau-produkte von Biomaterialien . Die Arbeit liefert auch keineHinweise auf den Mechanismus des in der Spurenanalyse eben-falls gebräuchlichen Abbaus organischer Stoffe bei 300°Cmit Salpetersäure und bei 180°C mit Perchlorsäure . Inter-essant ist z .B ., daß die bei 180°C gegen konzentrierteSalpetersäure resistenten Stoffe bei 300°C bereits in etwa3 Eiger HN03 praktisch vollständig abgebaut werden können .Dies wurde an Algen- und Leberproben gezeigt, bei denenLösungen aus Druckaufschlüssen bei 180°C in einer Quarzam-pulle bei 300°C über 1 h nachbehandelt wurden .

17 4

Ebenfalls überraschend ist der Befund, daß Phenylalanin undTryptophan beim offenen Aufschluß mit Salpeter- und Per-chlorsäure unter den von MARTINIE und SCHILT (26) mitge-teilten Bedingungen vollständig abgebaut werden, währenddies bei Glycin und Alanin nicht gelingt (RKG 20 bzw .67 %) . Beim Druckaufschluß mit Salpetersäure bei 180°C wirdein praktisch umgekehrtes Verhalten beobachtet . Die vonMARTINIE und SCHILT mitgeteilten RKG-Werte konnten dabeidurch Vergleichsuntersuchungen bestätigt werden; jedochwerden auch Alanin und Glycin vollständig abgebaut, wennder Aufschluß allein mit Perchlorsäure bei 203°C - nach demAbrauchen der Salpetersäure aus der Aufschlußmischung -verlängert wird (vgl . (26)) . Die Ergebnisse von MARTINIEund SCHILT sind also nicht aussagekräftig, da die Arbeits-parameter nicht optimiert wurden, so daß eine endgültigeAussage über die Leistungsfähigkeit der Perchlorsäure alsAufschlußreagenz nicht möglich ist .

Schließlich wurde in der vorliegenden Arbeit der Einflußorganischer Aufschlußprodukte lediglich auf die Schwerme-tallbestimmung mit Hilfe voltammetrischer Verfahren unter-sucht . Spektrochemische Analysenverfahren, die ebenfallsvielfältig durch organische Zersetzungsprodukte gestörtwerden können, wurden nicht behandelt . Da die nach einemDruckaufschluß biologischer Proben mit Salpetersäure resul-tierenden organischen Rückstände nun jedoch bekannt sind,kann in Fortführung dieser Arbeit gezielt ihr Einfluß aufdie Elementbestimmung mit atomabsorptionspektrometrischenVerfahren, insbesondere mit der Hydrid-, Hg-Dampf- undGraphitrohr-AAS untersucht werden . In Zusammenhang mit derHydrid- und Hg-Dampf-AAS wäre sicher auch die Untersuchungdes Verhaltens der beim Aufschluß gebildeten leicht flüch-tigen Verbindungen interessant, wenn Druckaufschlußlösungenunmittelbar zur Analyse eingesetzt werden .

6. Zusammenfassung

17 5

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit beziehen sich imwesentlichen auf folgende Untersuchungen :

1 . Bilanzierung der Aufschlußreaktion

Als Maß für die Leistungsfähigkeit des Druckaufschlussesmit Salpetersäure zur Mineralisierung biologischer Materia-lien wurde der von der Probe abgetrennte Kohlenstoffanteilgewählt . Er ergibt sich aus dem coulometrisch bestimmtenRestkohlenstoffgehalt in der Aufschlußlösung . Unter opti-mierten Standardbedingungen (35-ml-PTFE-Tiegel, Einwaageentsprechend 100 mg C, 2 ml 69 %ige HNO3, Einengen derAufschlußlösung bei 130°C) hinterbleiben organische Rück-stände, deren Restkohlenstoffgehalt bei eiweißhaltigenMaterialien mit dem Stickstoffgehalt, bei Fetten mit demGehalt an Linolsäure bis auf etwa 6 % ansteigt . Kohlenhy-drate werden praktisch quantitativ abgebaut (Restkohlen-stoffgehalte-- 0 .08 %) .

An Hand von Modellsubstanzen wurde gezeigt, daß biologischeMaterialien beim Druckaufschluß in folgender Reaktionskettezersetzt werden :- saure Hydrolyse von Ester-, Peptid-, Amid- undGlykosidbindungen ;

- oxidativer Abbau der Bruchstücke .

Für die Aufschlußreaktion ist NO2 in ausreichender Konzen-tration in der flüssigen Phase erforderlich . Beim Aufschlußbiologischer Materialien unter den oben angegebenenBedingungen ist dies im allgemeinen gewährleistet, da siegenügend leicht abbaubare Verbindungen enthalten, die HN03zu NO2 reduzieren .

17 6

An Proben von Rinderleber und Braunalgen wurde nachge-wiesen, daß etwa die Hälfte des nach dem Aufschluß nochvorhandenen organischen Kohlenstoffs in Verbindungen gebun-den ist, die bei 130°C flüchtig sind . Diese Verbindungenentstehen - zumindest anteilig - aus den Aminosäuren Valin,Leucin und Isoleucin .

Insgesamt wurden etwa 120 Verbindungen aufgeschlossen undder jeweils verbleibende Rückstand untersucht . Von den inbiologischen Materialien in wesentlichen Konzentrationenvorhandenen Stoffen liefern lediglich einige Aminosäuren(Phenylalanin, Histidin, Methionin, Tryptophan) sowie diedoppelt ungesättigte Fettsäure Linolsäure Rückstände or-ganischer Produkte, die bei Temperaturen bis zu 130°C nichtzu verflüchtigen sind . Diese Stoffe verbleiben im Auf-schlußrückstand also auch dann, wenn die salpetersaurenProbenlösungen zur inversvoltammetrischen Elementbestimmungbei dieser Temperatur eingedampft werden .

Untersuchungen zum Druckaufschluß stickstoff-, phosphor-und schwefelhaltiger Verbindungen mit Salpetersäure bei180°C ergaben, daß der in Aminosäuren gebundene Stickstoffnicht zu Ammonium, sondern vermutlich zu NZ umgesetzt wird .Der in Cystin und Cystein gebundene Schwefel wird zu Sul-fat, der Schwefelanteil des Methionins zu Methansulfonsäureoxidiert . In biologischen Materialien enthaltener Phosphorwird in Phosphat überführt .

2 . Identifizierung der Reaktionsprodukte

Im einzelnen wurden folgende Verbindungen in den Rückstän-den der zum Aufschluß eingesetzten Stoffe nachgewiesen .

17 7

Eingesetzt

Im Rückstand nachgewiesen

Phenylalanin

Gemisch aus 15 % 2=Nitrobenzoesäure23 % 3-Nitrobenzoesäure51 % 4-Nitrobenzoesäure5 % 2,4-Dinitrobenzoesäure5 % weitere Verbindungen,

vermutlich isomereDinitrobenzoesäuren

Histidin

Imidazol-4-carbonsäure alsSalpetersäureaddukt

Methionin Methansulfonsäure

Tryptophan

Gemisch aus mehr als 10 aromatischenVerbindungen, überwiegend Carbonsäure

Linolsäure

Gemisch aus95 % cis-1,2-Cyclopropandicarbonsäure5 % trans-1,2-Cyclopropandicarbonsäure

Entsprechend dem Vorkommen der Modellverbindungen konntenderen Reaktionsprodukte auch in den Aufschlußrückständenbiologischer Materialien nachgewiesen werden : Nitrobenzoe-säuren, Imidazol-4-carbonsäure und Methansulfonsäure findetman im Rückstand des HN03 -Druckaufschlusses von Rinderle-ber ; natürliche Fette mit mehrfach ungesättigten Fettsäurenliefern als Rückstand ausschließlich cis- und trans-1,2-Cyclopropandicarbonsäure im Verhältnis 20 :1 . Folgeprodukte

des Tryptophans konnten, entsprechend der geringen Gehalte

dieser Aminosäure in biologischen Materialien, signifikantnicht nachgewiesen werden .

17 8

Für die Nachweise und quantitativen Bestimmungen wurdenfolgende Analysenmethoden eingesetzt : Elementaranalyse,Gaschromatographie, IR-Spektrometrie, 1 H-Kernresonanzspek-trometrie, 13C-Kernresonanzspektrometrie, inverse Voltamme-trie .

3 . Einfluß der Reaktionsprodukte auf die inversvoltamme-trische Elementbestimmung

Während Methansulfonsäure, Imidazol-4-carbonsäure und dieCyclopropandicarbonsäuren im Potentialbereich von -1 .2 Voltbis +0 .3 Volt gegen gesätt . Ag/AgC1 voltammetrisch inaktivsind, werden die Nitrobenzoesäuren bei pH 0 zweistufig überdie Hydroxylamine zu Aminen reduziert . Die zugehörigenSignale findet man bei der inversen Square-Wave-Voltamme-trie bei -0 .1 Volt (Reduktion zum Hydroxylamin) und beietwa -0 .55 Volt (Reduktion zum Amin) gegen gesätt . Ag/AgCl .Dabei handelt es sich um Ströme, die analog auch bei derdifferentiellen Pulspolarographie und der differentiellenPuls-Inversvoltammetrie gefunden werden . Auch in denGleichstrompolarogrammen beobachtet man zwei entsprechendeStufen . Da die verschiedenen Nitrobenzoesäuren bei etwasunterschiedlichen Potentialen reduziert werden, findet mannach dem Aufschluß biologischer Materialien bei der inver-sen Voltammetrie stets verbreiterte Kombinationssignale .Das Signal bei -0 .55 Volt wird ausschließlich, das bei -0 .1Volt zu etwa 95 % durch nitrierte Benzoesäuren verursacht .Einen geringen Beitrag liefern auch die Zersetzungsproduktedes Tryptophans ; das Signal erscheint bei 0 Volt und be-steht aus mindestens zwei Einzelteilen . Die in saurenAufschlußlösungen biologischer Materialien beobachteteErhöhung des Wasserstoffstromes bei pH 0 ist allein auf2,4-Dinitrobenzoesäure, 2-Nitrobenzoesäure und auf Zerset-zungsprodukte des Tryptophans zurückzuführen .

17 9

Bei der Elementspurenanalyse nicht abgerauchter, saurerAufschlußlösungen durch inverse Square-Wave-Voltammetrieliefern die aus Valin, Leucin und Isoleucin resultierendenProdukte ein Störsignal bei etwa -0 .35 Volt vs . gesätt .Ag/AgCl . Es wird vermutet, daß nitrierte aliphatische Ver-bindungen das Signal verursachen . Da die in einem weitenPotentialbereich ebenfalls störenden gelösten Stickoxidevor der inversvoltammetrischen Spurenbestimmung in Druck-aufschlußlösungen durch Abrauchen entfernt werden müssen,werden auch flüchtige organische Substanzen abgetrennt unddamit für die Spurenbestimmung bedeutungslos .

Durch die im Aufschlußrückstand nachgewiesenen organischenVerbindungen wird die Bestimmung der Schwermetalle Zn, Cd,Pb und Cu in sauren Aufschlußlösungen erschwert oder sogarverhindert : Neben einer Depression der Signale wird dasSignal/Untergrund-Verhältnis bei der Zn-Bestimmung durchden erhöhten Wasserstoffstrom verschlechtert . Die Signaleder drei übrigen Metalle interferieren mit denen der Nitro-benzoesäuren, so daß unter ungünstigen Bedingungen eineTrennung der Einzelsignale nicht mehr möglich ist .

4 . Möglichkeiten zum rückstandsfreien Aufschlußbiologischer Probenmaterialien

Nach Aussage der Temperaturabhängigkeit des Restkohlen-stoffgehaltes im Bereich zwischen 100 und 300°C sind min-destens 300°C und Quarzgefäße erforderlich, um die in bio-logischen Materialien enthaltenen organischen Stoffe soweit abzubauen, daß nach Abrauchen bei 130°C praktischkohlenstofffreie Lösungen erhalten werden . Auch die Gehaltean leichter flüchtigen organischen Spezies sind in diesenLösungen nur noch gering . Zn, Cd, Pb und Cu sind in deneingedampften Aufschlußlösungen störungsfrei inversvoltam-metrisch zu bestimmen .

Eine Nachbehandlung von Rückständen biologischer Materia-lien mit Perchorsäure nach Druckaufschluß mit HN03 bei180°C liefert Spurenkonzentrate, die - verglichen mit denenaus dem Druckaufschluß bei 180°C - erheblich niedrigereRestkohlenstoffgehalte aufweisen . Ein vollständiger Abbauorganischer Stoffe gelingt zwar auch hierbei nicht, dieinversvoltammetrische Bestimmung der angegebenen Elementeführt jedoch zu richtigen Ergebnissen, da die verbleibendenStöreffekte bedeutungslos sind .

7. Literaturverzeichnis

18 0

1 . J .P . Franke, Dissertation, Groningen (Niederlande) 1978

2 . J .P . Franke, R .A . de Zeeuw, Pharmaceutisch Weekblad,Scientific Edition 3 (1981) 1042

3 . A .M . Bond, J .B . Reust, Anal .Chim.Acta 162 (1984) 389

4 . J .P . Franke, R .A . de Zeeuw, Arch .Toxicol . 37 (1976) 47

5 . J .T . Kinard, Anal .Letters 10 (1977) 1147

6 . M . Stoeppler, K . Brandt, Fresenius Z .Anal .Chem . 300(1980) 372

7 . H .D . Narres, C . Mohl, M . Stoeppler,Int .J .Environm .Anal .Chem . 1 8 (1984) 267

8 . H .D . Narres, C . Mohl, M . Stoeppler,Z .Lebensm .Unters .Forsch . 18 1 (1985) 111

9 . C . Mohl, P . Ostapczuk, M . Stoeppler, in : B . Welz,Fortschritte in der atomspektrometrischen Spuren-analytik, Band I, S . 317, Verlag Chemie, Weinheim 1984

10 . F .J . Langmyhr, G . Wibetoe, Prog .Analyt .Atom .Spectrosc .8 (1985) 193

11 . G . Knapp, Fresenius Z .Anal .Chem . 317 (1984) 213

12 . K . Bachmann, CRC Crit .Rev .Anal .Chem . 1 2 (1981) 1

13 . E . Kahane, Fresenius Z .Anal .Chem . 111 (1937) 14

14 . Analytical Methods Committee, Analyst 84 (1959) 214

15 . T .T . Gorsuch, Analyst 84 (1959) 135

16 . T .T . Gorsuch, The Destruction of Organic Matter,Pergamon Press, Oxford 1970

17 . R . Kühn, K . Birett, Merkblätter gefährliche Arbeits-stoffe, Vlg . Moderne Industrie, München 1974

18 . R .L . Anderson, S . Davis, C1in .Chim .Acta 121 (1982) 111

19 . Sichere Chemiearbeit 35 (1983) 85

20 . J . Angerer, M . Fleischer, G . Machata, W . Pilz,K .H . Schaller, H . Seiler, M . Stoeppler, H . Zorn, Auf-schlußverfahren zur Bestimmung von Metallen in biolo-gischem Material, in : Analytische Methoden, Analysen inbiologischem Material, Verlag Chemie, Weinheim 1981

21 . P . Tschöpel, L . Kotz, W . Schulz, M . Veber, G . Tölg,Fresenius Z .Anal .Chem . 302 (1980) 1

22 . M . Würfels, Diplomarbeit, Bochum 1984

23 . M . Würfels, E . Jackwerth, Fresenius Z .Anal .Chem . 322(1985) 354

18 2

24 . M . Stoeppler, K .P . Müller, F . Backhaus, FreseniusZ .Anal .Chem . 297 (1979) 107

25 . K .P . Müller, Ingenieurarbeit, Jülich 1976

26 . G .D . Martinie, A.A . Schilt, Anal .Chem . 48 (1976) 70

27 . B . Baumgardt, Diplomarbeit, Bochum 1982

28 . L . Kotz, G . Henze, G . Kaiser, S . Pahlke, M . Veber,G . T61g, Talanta 26 (1979) 681

29 . M . Oehme, W . Lund, Fresenius Z .Anal .Chem . 298 (1979)260

30 . J . Hertz, R . Pani, Fresenius Z .Anal .Chem . 328 (1987)487

31 . S . Gomiscek, V . Hudnik, M . Veber, in : S .S . Brown,Chlinical Chemistry and Chemical Toxicology of Metals,Elsevier, Amsterdam 1977

32 . I . Sinko, S . Gomiscek, Mikrochim .Acta 1972 163

33 . M . Stoeppler, F . Backhaus, Fresenius Z .Anal .Chem . 291(1978) 116

34 . M . Stoeppler, F . Backhaus, R . Dahl, M . Dumont,H . Hagedorn-Gbtz, K . Hilpert, P . Klahre, H . Rützel,P . Valenta, H .W . Nürnberg, Proceedings, InternationalSymposium on Recent Advances in the Assessments of theHealth Effects of Environmental Pollution, Paris 1974,Vol . 4, S . 2231, Luxemburg : Commission of the EuropeanCommunities 1974

35 . G . Knapp, Intern .J .Environ .Anal .Chem . 2 2 (1985) 71

183

36 . P .O . Bethge, Anal .Chim .Acta 10 (1954) 317

37 . H . Seiler, Laborpraxis 6 (1979) 23

38 . K . May, M . Stoeppler, Fresenius Z .Anal .Chem . 293 (1978)127

39 . Analytical Methods Committee, Analyst 85 (1960) 643

40 . S . Bajo, U . Suter, B . Aeschlimann, Anal .Chim .Acta 149(1983) 321

41 . U . Harms, Fresenius Z .Anal .Chem . 322 (1985) 53

42 . G . Knapp, Fresenius Z .Anal .Chem . 274 (1975) 271

43 . W .G . Dorner, GIT Fachz .f .d .Laboratorium 26 (1982) 750

44 . B . Sansoni, V . Iyengar, Spezielle Berichte derKernforschungsanlage Jülich 13 (1978)

45 . G .F . Smyth, Anal .Chim .Acta 8 (1953) 397

46 . G . Knapp, Methoden zum Aufschluß organischer Materia-lien für die Elementspurenanalyse, in : B . Welz, Atom-spektrometrische Spurenanalytik, S . 151, Verlag Chemie,Weinheim 1982

47 . B . Lonnerdal, M . Clegg, C .L . Keen, L . Hurley, TraceElem .Anal .Med .Bio1 ., Proc .Int .Workshop, S . 619, Hrsg . :P . Braetter, P . Schramel, Vlg . de Gruyter, Berlin 1980

48 . R . Bock, Aufschlußmethoden in der anorganischen undorganischen Chemie, Verlag Chemie, Weinheim 1972

49 . G . Knapp, B . Sadjadi, H . Spitzy, Fresenius Z .Anal .Chem .274 (1975) 275

184

50 . B . Zak, H .H . Willard, G .B . Myers, A .J . Boyle,Anal .Chem . 24 (1952) 1345

51 . G . Kaiser, D . Götz, G . Tölg, G . Knapp, B . Maichin, H .Spitzy, Fresenius Z .Anal .Chem . 291 (1978) 278

52 . J . Piwonka, G . Kaiser, G . Tölg, Fresenius Z .Anal .Chem .321 (1985) 225

53 . F . Schlieckmann, F . Umland, Fresenius Z .Anal .Chem . 318(1984) 495

54 . B . Sansoni, W . Kracke, Fresenius Z .Anal .Chem . 243(1968) 209

55 . G .L . Carius, Ann-Chem . 116 (1860) 1

56 . G .L . Carius, Ber .Dtsch .Chem .Ges . 3 (1870) 697

57 . J . Dolezal, J . Lenz, Z . Sulcek, Anal .Chim .Acta 47(1969) 517

58 . J .W . Mitchell, Anal .Chem . 45 (1973) 492 A

59 . B . Bernas, Anal .Chem . 40 (1968) 1682

60 . 0 . Buresch, H .G . v .Schnering, Fresenius Z .Anal .Chem .319 (1984) 418

61 . H . Matusiewicz, Chemia Analityczna 28 (1983) 439

62 . H .U . Kasper, Fresenius Z .Anal .Chem . 320 (1985) 55

63 . F .J . Langmyhr, P .E . Paus, Anal .Chim .Acta 49 (1970) 358

64 . P .E . Paus, Atom .Absorpt .Newsl . 10 (1971) 44

185

65 . S .L . Gaffin, Clin .Toxicology 15 (1979) 293

66 . P . Broske, Laborpraxis 3 (1985) 152

67 . Druckaufschlupapparatur PRAWOL, Bedienungsanleitung,Fleischhacker, Schwerte

68 . L . Kotz, G . Kaiser, P . Tschbpel, G .'Tölg, FreseniusZ .Anal .Chem . 260 (1972) 207

69 . I . May, J .J . Rowe, Anal .Chim .Acta 33 (1965) 648

70 . K . Lounamaa, Fresenius Z .Anal .Chem . 146 (1954) 422

71 . W . Wahler, Neues Jahrb .Mineral .Abhandl . 101 (1964) 109

72 . F .J . Langmyhr, S .Sveen, Anal .Chim .Acta 32 (1965) 1

73 . H .M . Kingston, L .B . Jassie, Anal .Chem . 58 (1986) 2535

74 . 0 . Buresch, W . Hönle, U . Haid, H .G . v .Schnering,Fresenius Z .Anal .Chem . 328 (1987) 82

75 . C .S .E . Papp, L .B . Fischer, Analyst 112 (1987) 337

76 . P . Aysola, P . Anderson, C .H .Langford, Anal-Chem . 59(1987) 1582

77 . L .B . Fischer, Anal .Chem . 58 (1986) 261

78 . F . Backhaus, M . Cremer, H .J . Groteklaes, A . Hertling,0 . Schneider, M . Stoeppler, Unveröffentlichter Bericht

79 . P . Schramel, A . Wolf, R . Seif, B .J . Klose, FreseniusZ .Anal .Chem . 302 (1980) 62

186

80 . E . Jackwerth, S . Gomiscek, Pure Appl . Chem . 56 (1984)479

81 . A . Boorn, J .E . Fulford, W . Wegscheider, Mikrochim .Acta1985 II 171

82 . P . Schramel, G . Lill, R . Seif, Fresenius Z .Anal .Chem .326 (1987) 135

83 . R . Röhl, H .J . Hoffmann, W . Besler, FreseniusZ .Anal .Chem . 317 (1984) 872

84 . U . Völlkopf, R . Lehmann, Z . Grobenski, B . Welz,Angewandte Atom-Spektroskopie 26 (1980)

85 . A .M . Hartstein, R .W . Freedmann, D .W . Platter,Anal .Chem . 45 (1973) 611

86 . G . Kaiser, E . Grallath, P . Tschöpel, G . Tölg, FreseniusZ .Anal .Chem . 259 (1972) 257

87 . T . Liese, Fresenius Z .Anal .Chem . 321 (1985) 37

88 . H .P . BrUckner, G . Drews, K . Kritsotakis,H .J . Tobschall, Fresenius Z .Anal .Chem . 322 (1985) 778

89 . L .J . Tyler, Chemical and Engineering News 32 (1973) 20

90 . J .W . Jones, R .J . Gajan, K .W . Boyer, J .A . Fiorino,J .Assoc .Off .Anal .Chem . (JAOAC) 60 (1977) 827

91 . R .C . Munter, R .A . Grande, P .C . Ahn, ICP InformationNewsl . 5 (1979) 368

92 . S .B . Adeloju, A .M . Bond, M .L . Noble, Anal .Chim .Acta161 (1984) 303

18 7

93 . W . Thornburg, J.Assoc .Off .Anal .Chem . (JAOAC) 65 (1982)992

94 . A .D . Hill, K .Y . Patterson, C . Veillon, E .R . Morris,Anal .Chem . 58 (1986) 2341

95 . S .R . Koirtyohann, C .A . Hopkins, Analyst 101 (1976) 870

96 . G . Schönhard, H.D . Schenke, Landwirtsch .Forsch . 29(1976) 248

97 . G . Knapp, S .E . Raptis, G . Kaiser, G . Tölg, P . Schra-mel, B . Schreiber, Fresenius Z .Anal .Chem . 308 (1981)790

98 . W . Schöniger, Mikrochim .Acta 1955 123

99 . E . Scheubeck, A . Nielsen, G . Iwantscheff, FreseniusZ .Anal .Chem . 294 (1979) 398

100 . E . Scheubeck, J . Gehring, M . Pickel, FreseniusZ .Anal .Chem . 297 (1979) 113

101 . C . Weichan, Chemie-Technik 1 (1981) 53

102 . R . Plesch, Fresenius Z .Anal .Chem . 298 (1979) 400

106 . F . Ehrenberger, K . Hommel, S . Gorbach, FreseniusZ .Anal .Chem . 210 (1965) 349

107 . C .E . Gleit, W .D . Holland, Anal .Chem . 34 (1962) 1454

103 . H . Narasaki, Anal .Chem . 57 (1985) 2482

104 . R . Wickbold, Angew .Chem . 64 (1952) 133

105 . R . Wickbold, Angew .Chem . 69 (1957) 530

18 8

108 . G . Kaiser, P . Tsch6pel, G . T61g, FreseniusZ .Anal .Chem . 253 (1971) 177

109 . G . T61g, Fresenius Z .Anal .Chem . 283 (1977) 253

110 . G . Kortüm, Elektrochemie, 5 . Auflage, Verlag Chemie,Weinheim 1972

111 . F . Ehrenberger, S . Gorbach, Organische Elementar- undSpurenanalyse, Verlag Chemie, Weinheim 1973

112 . M . Geißler, Polarographische Analyse, Verlag Chemie,Weinheim 1981

113 . H . Schmidt, M . v .Stackelberg, Neuartigepolarographische Methoden, Verlag Chemie, Weinheim1962

114 . H .W . Nürnberg, Advances in Polarography, Hrsg . I .S .Longmyhr, Vol . 2, Pergamon Press, Oxford, London,New York, Paris 1960

115 . T . Ugapo, W .F . Pickering, Talanta 32 (1985) 131

116 . Z . Lukaszewski, M.K . Pawlak, J .Electroanal .Chem . 103(1979) 225

117 . G .E . Batley, T .M . Florence, Electroanalytical Che-mistry and Interfacial Electrochemistry 55 (1974) 23

118 . P . Zuman, C .L . Perrin, Organic Polarography, Inter-science Publishers J . Wiley & Sons, New York, London,Sidney, Toronto 1969

119 . M . Stoeppler, Berichte der Kernforschungsanlage JülichNr .1675, 1980

18 9

120 . Landoldt-Börnstein, Zahlenwerte und Funktionen ausPhysik, Chemie, Astronomie, Geophysik, Technik,Springer-Verlag, Berlin, Göttingen, Heidelberg 1960

121 . GIT Merk- und Arbeitsblätter, GIT 7 (1963) Heft 4,Verlag E . Giebeler, Darmstadt

122 . GIT Merk- und Arbeitsblätter, GIT 7 (1963) Heft 1,Verlag E . Giebeler, Darmstadt

123 . P . Wölfel, Dissertation, Karlsruhe 1974

124 . Coulomat 702, Betriebsanleitung, Ströhlein, Kaarst

125 . G . Kainz, J . Mayer, Mikrochim-Acta 1963/64 628

126 . G . Kainz, J . Mayer, Mikrochim-Acta 1962 241

127 . G . Kainz, J . Mayer, Mikrochim-Acta 1963 542

128 . H . Kaiser, Fresenius Z .Anal .Chem . 209 (1965) 1

129 . M . Würfels, E . Jackwerth, M . Stoeppler, FreseniusZ .Anal .Chem . 329 (1987) 459

130 . P . Schramel, S . Hasse, G . Knapp, FreseniusZ .Anal .Chem . 326 (1987) 142

131 . Gmelins Handbuch der anorgansichen Chemie, Stickstoff,Lieferung 1-4, Verlag Chemie, Berlin 1934

132 . F .A . Cotton, G . Wilkinson, Anorganische Chemie, VerlagChemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel 1982

133 . P . Karlson, Kurzes Lehrbuch der Biochemie, 12 . Auf-lage, G . Thieme Verlag, Stuttgart, New York 1984

19 0

134 . A .L . Lehninger, Biochemie, Verlag Chemie, Weinheim,New York 1977

135 . S .P . Colowick, N .O . Kaplan, Methods in Enzymology,Vol . III, Academic Press, Inc ., Publishers, New York1957

136 . A . Streitwieser, C .H . Heethcock, Organische Chemie,Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida,Basel 1980

137 . H .D . Cremer, Die große GU Nährwerttabelle, Neuausgabe1984/85, 3 . Auflage 1985, Verlag Gräfe & Unzer,München

138 . D .H . Williams, I . Fleming, Spektroskopische Methodenzur Strukturaufklärung, 4 . Auflage, G . Thieme Verlag,Stuttgart 1979

139 . E . Breitmayer, G . Bauer, 13C-NMR-Spektroskopie, G .Thieme Verlag, Stuttgart 1977

140 . E . Pretsch, T . Clerk, J . Seibl, W . Simon, Tabellen zurStrukturaufklärung organischer Verbindungen mit spek-troskopischen Methoden, 2 . Auflage, Springer Verlag,Berlin, Heidelberg, New York 1981

141 . R . Rupprecht, W . Bremser, X3 C-NMR Spektral-Datenbank,Inka Online Service, Eggenstein-Leopoldshafen 1981

142 . N .C . Rol, A .D . Claque, Org .Magn .Resonance 16 (1981)187

143 . Organikum, 15 . Auflage, VEB Deutscher Verlag derWissenschaften, Berlin 1976

144 . W . Kirmse, M . Kapps, R .B . Hager, Chem .Ber . 99 (1966)2855

145 . L .L . McCoy, J .Am .Chem .Soc . 8 0 (1958) 6568

146 . J . Jeneer, Ampäre International Summer Scool, BaskoPolje, Jugoslawien 1971

147 . G . Henze, R . Neeb, Elektrochemische Analytik, SpringerVerlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokio 1986

148 . M .R . Smyth, W .F . Smyth, Analyst 103 (1978) 529

149 . P . Zuman, Substituent Effects in Organic Polarography,Plenum Press, New York 1967

150 . A .F . Holleman, E . Wiberg, Lehrbuch der anorganischenChemie, Verlag W . de Gruyter, Berlin, New York 1976

151 . G . Denbsky, Fresenius Z .Anal .Chem . 267 (1973) 350

B. Anhang

LM = Signal des Lösungsmittels

Die chemische Verschiebung ist in den NMR-Spektren in ppmbezogen auf Tetramethylsilan angegeben .

da

100

0

100

Histidin

Linolsaure

19 2

Abb .53 : IR-Spektren von Druckaufschlußrückständen

verschiedener Ausgangsstoffe

r

Y

f

04000 3000 2000 1600 1200 800 400

Wellenzahl (cm-1 )

-s2 F-, oi

0ö

cN

N

CM

NM

GC

vv>

c

O:

xN

v

N

U

t1

AUN44

194

VSim

1das3int

If)N

O-M

O

9.1. 1410. 14

x

b

XU

AUN44

XNaizUch

195

-7W

(D-N

F- M

-M

O

-o

~21

Ici.-141

.,Ax

xU

02

10

UC1

U

4)04a0

. .x+-)

a)

U

vUM

196

0

0N

o- M

~oO

Oco

IOrn

O+et Q

Q

0.

a04-304

E-+

N

cd

100

xU

c4

UN44

+-)xav

z

UM

AA

197

ieas3INI

a0

asaH

b

xü

Sa

UrnW

XU)04

A

198

-

Mtld-~

mom/NI

L.

P °

~

im~

~r-

-

+q

P wu

w M

o~44

9

~G%

un.

199

N

üN4-I

N

s~

UNN

0N

U04

zN x

0A

NN

200

0bC

Oa0xIUIx

0

aU) (n::1 z

0A

u~ S-1"a cdü

cd "rl4-)NXU Oa

Oa 04

OiU

U >1cn U44 IN

N IU N

U

0 GSa ".-I

üUa om +i

IU

z IIU :~M "rla

201

0.aa

b

xU

.-IUN44

N

A

202

-oN

o

0

0N

U)4)

N(0 (Db ±-I

N

äOIaw '-+O O

U " r-1>4 a

MILOAA

ta

pQ)41U)U)

ONH

IU)

-4 0,>1 (a4-) 4J

-o O

"d t~

U) b~0 S~-o

U) O

OAcd O

0 U- N C1a b

f~ O

U1 U)

0 N- CO

1 10U)

" rl cdU +~

~occ

N+P d

O0 04 4-o U) UN I to

W

zIU0

-N M UN .-i '0

203

N

M

et

0N

N

NN

N

cdNANN

U"rlO

saN

NN:cd

f~OA

U

s~

a0a

Q oU

UNw

AA

Kd

Cs

Q 0o

D® .

a

ow a

®®:

(1)

:(d

1-1O

.aa

v

xU

el

U

4-4

O"rl+Jtd

O

O

1xvx

205

a

a

Uto

N 44

bxU

A

a)

41

a)Ul

cd'0

N

OA

UE " rlc " 10n

wO a)sa p°°.

ö :aa)

-4 U)

U +JI a)N w

U

't7

a)

9: 4-3

+3o InN

rg (1)

$4 tN+J a)xa)04 4

I a~A

z

x a)N bN

HH"

HH"H"HHH"H"HH""M""REE

H"HH""HH"HHH1H"""H"H""HH"HO"HH"M"HH"H"H"""""""""""H"""H"""M""

HH"""H"""W"""m

"""i"ön MEN= ""H""~"H""""""""H"""fM"""M"""f """"""""""""H""""""""HHHH"H"H"""H"HH"HHH"H"~""H""

"HHH"HHH""~//~~""""~MOM"""""""~""H"H"m"H""""""

ii "~- II_ .i" ,.... .~r~..r

-NORN

Retentionszeit

Zuordnung : Kap .4 .9 .1 ; S .137

h

!w

~~ """""I= """"""""""""""""" ff11 """"""""" "fl" """"""""H" IMH """"""""""" tfa""" HH"HH"" t/"""HHH"H

n

v

#-H:

n

Abb .67 : Gaschromatogramm silylierter CarbonsdurenDruckaufschlußrückstand des Phenylalanins

aus dem

-00

U

_ et'd.-I1-1

1~b+)

x

N

vI-^

4a

14

sa+1xa)a

iz1x

A

1.0

208

OA

tr],

0 A0ö U

N44

cdAswO

aöLO -P

04

H

0~o

AU

44

209

T

2,2

2,0

1,8

1,6

1,4

1,2( ppm )

Abb .70 : Margarine ; 1 H-NMR-Spektrum des Aufschluprückstandes

LM

( ppm )

2,2

2,0

1,8

1,6

1,4

1.2

Abb . 7 1 : Olivenöl ; 1H-NMR-Spektrum des Aufschluprückstandes

LM

2,2

210

1,8

1,6( ppm

LM

2,2

210

1,8

1,6( PPm 1

210

Abb .72 : Sojaöl ; 1H-NMR-Spektrum des Aufschlußrückstandes

Abb . 7 3 : Distelöl ; 1H-NMR-Spektrum des Aufschlußrückstandes

v vU_,?

LM

LM

( ppm )

2,2

2,0

1,8

1,6

1,4

1,2

Abb .74 : Maiskeimöl ; 1H-NMR-Spektrum des Aufschlußrückstandes

2,2

2,0

1,8

1,6

1,4 1,2

( ppm )

Abb .75 : Sonnenblumenöl ; 1H-NMR-Spektrum des Aufschlußrückstandes

0N

NN

OM

NM

OV

V

ON

xU

N

0N

NN

O

Abb .77 : 1H-NMR-Spektrum von 3-Nitrobenzoesäure in DN03/D20 ;4-Nitrobenzoesäure als Verunreinigung(Signale bei 8 .06 und 8 .19 ppm)

j

8,8 8,6 8,4 8,2 8,0 7.8 7.6 7,4( PPm )

w

7,9

7,8

7.7

7.6

7,5

( PPm )

Abb .78 : 1H-NMR-Spektrum von 2-Nitrobenzoesäure in DN0 3 /D2 0 ;