Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik

Teil 14Untersuchung von

DNA-Polymorphismen

Prof. Dr. Ralf LichtinghagenMedizinische Hochschule Hannover

Klinische ChemieTel.: 0511-5323940

Gliederung

•Methodische Grundlagen der DNA/RNA-Analyse

•Anwendungen der molekularen Diagnostik:

Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken

Pharmakogenetik

Grundlagen zur DNA

•Struktur

•Wichtige EnzymeDNA-PolymerasenRestriktionsenzyme

•DNA-Isolierung

•DNA-Auftrennung

Desoxyribonukleinsäure: Grundlagen

Doppelhelix

Basenpaarungen über Wasserstoff-brückenbindungen

A T

G CSchmelzpunkt des A/T-Paares ist niedriger.

Berechnung des Schmelzpunktes kleiner DNA-Fragmente :2°C (A/T) vs. 4°C (G/C)

DNA-Polymerasenbenötigen:•DNA-Matrize mit Startpunkt (5’ 3’)•Nukleotide (dNTP)•Salze: Mg2+

•opt. pH-Bereich•opt. Temperaturbereich

O NRO

OR

123

4

5

5‘

5‘

3‘

3‘

(5‘-) AGCGATTGAA AGGTAGGCCC TGAACGTGAC GTAGGGAAAA AGTTA (-3‘)

Restriktionsenzyme

...G A A T T C...

... C T T A A G...

5’ 3’

3’ 5’

Bsp.:Restriktionsendo-Nuklease Eco RI

Sequenzspezifische(Hexamer)Spaltung von DNA

DNA-Isolierung

Methoden:

Proteinase K-VerdauungPhenol/CHCl3-ExtraktionEthanol-Fällung

Proteinase K-VerdauungAdsorption an GlaspartikelSäulenreinigung

Elektrophoretische Trennung von DNA

23 kb

9,4 kb

6,6 kb

4,4 kb

•Agarosegel-Elektrophorese

•InterkalierenderFluoreszenz-farbstoffEthidiumbromid

•Detektion unter UV-Licht (312 nm)

⊕

Untersuchung von DNA

•Southern-Blot•Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-PCRAllel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung

Sreeningmethoden für Punktmutationen„Single-Strand Conformation Polymorphism PCR“

•DNA-Sequenzierung

Southern Blotting

Transfer der DNA auf eine Membran

Southern Blotting: Anwendungen

Mst II..CCTNAGG..

β-Globingen..CCTGAGG..

Mutation..CCTGTGG..

PolymerasePolymerase Chain Chain ReactionReaction (PCR)(PCR)

Prinzip der PCR

1111

cyclecycle 11 cyclecycle 22

94°C1 min 72°C

1 min

55°C1 min

94°C1 min 72°C

1 min

55°C1 min

denaturationdenaturation annealingannealing elongationelongation

11

22

11

22

11

22

11

2211

2222

11

22

22

DNA-Template, Primer (sense, antisense)Nukleotide, Puffer, Mg2+, thermostabile DNA-Polymerase

Prinzip der PCR5’-...AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGC...-3’3’-...TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG...-5’

ds DNA

Denaturierung94°C

Neusynthese72°C

5’-...AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGC...-3’

5’- AGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’ Annealing3’-...TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG...-5’ ca. 60°C

5’-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’ (Oligonukleotid 1)

5’-...AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGC...-3’3’-...TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG...-5’

5’- AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGC...-3’3’-...TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG...-5’

Prinzip der PCRPrimäre Produkte

Sekundäre Produkte

Hauptprodukte(Kurze Fragmente)

Bedeutung der Effizienz

N = N0 x En

Effizienz der Reaktion wichtig (oft 70-80%): 80% Effizienz bedeutet 4% der theoretischen Ausbeute

Protein-Polymorphismus in einer Population

Ursache: Akkumulation verschiedener Mutationen (Genpolymorphismen) im Genpool einer Population

Die Phänotyp-Verteilung in einer Population hängt von der Art der zugrunde liegenden Mutation ab

SNP: „single nucleotide polymorphisms“

Mutationstypen

Ermittlung eines Genotypsdurch die Analyse einer

bekannten Mutation

•RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)-PCR(Häufigkeit des Einsatzes etwa 25%)

•Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung(Häufigkeit des Einsatzes etwa 50%)

Genchip-Analyse zur gleichzeitigen Erfassungvieler unterschiedlicher Mutationenkommerziell bedingt erhältlich (z.B. CYP450-Array

mit 33 versch. Mutationen)

Ermittlung eines Genotypsdurch die Analyse einer

bekannten Mutation

•RFLP-PCR

•Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung

Ausstattung für RFLP-PCR

RFLP-PCRGenotypisierung über Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen

Ermittlung der Punktmutation (C/T) bei Nukleotid 677 im MTHFR-Gen(Methylentetrahydrofolsäurereduktase)

100200300

MN N N N N HO HE NHE

bp

•Amplifikation des DNA Bereiches•DNA-Fragment von 198 bp•Verdauung der DNA mit Hinf I

•Wildtyp: 198 bp•Homozyg. Mutation: 175 bp•Heterozyg. Mutation: 175+198 bp

Allelspezifische Hybridisierung

Real-Time-PCRBsp.: Glaskapillar-Thermocycler

Real-Time-PCRFluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)

zwischen Hybridisierungssonden

•Methode geeignet zur Quantifizierung von PCR-ProduktenMessung eines zunehmenden Fluoreszenzsignals während der laufenden PCR. Beginn des Signalanstiegs ist das Maß für die Ausgangskonzentration des betreffenden DNA-Bereiches.

•Methode geeignet zur MutationsanalyseNach der abgeschlossenen PCR wird das Schmelzverhalten der FRET-Sonden geprüft. Mutation und Wildtyp haben aufgrund von Basen-Fehlpaarungen verschiedene Schmelzpunkte.

Bindung der Fluoreszenz-markierten Sonden

Genotypisierung mittels Schmelzkurvenanalyse

Schmelzkurve45 –75 °C

Ableitung-d[Fluoreszenz]/dT

WTHE

HO

WT

HE

HO

Im Beispiel:FRET-Sonden haben eine 100%ige Übereinstimmung mit der Wildtyp-Sequenz

Genotypisierung mittels Sequenzierungder betroffenen Genregion

Nukleotid 677 imMTHFR-Gen

Einbau von Didesoxynukleotiden (ddNTP) in 4 getrennten Reaktionen,Statistisch verteilte Strangabbrüche, Fragmente elektroph. getrennt,Einbau eines 32P- dNTP (dATP) Autoradiographie

Enzymatische Reaktion (DNA-Polymerase):

Automatisierte DNA-Sequenzierung

Diodenlaserzur Detektion

eines Fluoreszenz-Labels

einer automatisiertenDNA-Sequenzierung

mit Online-Übertragung der Sequenzdaten

Increasing role of genotype at other loci

Incr

easi

ngro

leof

env

ironm

ent

and

stoc

hast

icfa

ctor

s

•Tay Sachs•Duchenne dystrophy

•Huntington disease•Cystic fibrosis

•Sickle-cell anemia

•G6PD deficiency•Hemochromatosis

•Acute intermittent porphyria

• α1-Antitrypsin ZZ

•Phenylketonuria

•Apo E-2/E-2 hyperlipoproteinämie

•Type I diabetes mellitus

Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken

• Alpha-1-Antitrypsin

• Angiotensin converting enzyme (ACE)

• Apolipoprotein B100

• Apolipoprotein E

• Faktor II-Leiden (Prothrombin)

• Faktor V-Leiden

• HFE (HLA-H)

• HLA (Klasse I und Klasse II, zur Typisierung)

• MTHFR

• Mukoviszidose

• UDP-Glucuronosyltransferase (Gilbert-Meulengracht)

Häufig untersuchte Gene (Beispiele)

Angiotensin-converting enzyme (ACE)

Insertions (I) / Deletions (D) –Polymorphismus im ACE-Gen

0 20 40 60 80 100 U/l

Häu

figke

it

0

2

4

6

8

10

12

DD

ID

II

Klinische Bedeutung:Labordiagnostik der Sarkoidose:S-ACE als Surrogatmarker erhöht(Polymorphismus beeinflusst Serumkonz.)

Gendefekt: Risikofaktor kardiovaskulärer Erkrankungen??

Referenzintervalle (Genotyp-abhängig)

ACE Genotyp DD (ca. 25%) 24-89 U/lACE Genotyp DI (ca. 50%) 13-66 U/lACE Genotyp II (ca. 25%) 7-33 U/l

α1-Antitrypsinmangelα1-Antitrypsin: Akute-Phase-Protein aus Hepatozyten,

Aktivitätshemmung von Serinproteasen(PMN-Elastase)>40 AlleleWildtyp (PiM), Mangelallele: 7% PrävalenzWichtige klinisch relevante Mangelallele:PiZ, PiS, PiNullRisiko korreliert mit vermind. Antitryp.-Konz.high risk: PiZZ, PiZNull, PiNullNullincreased risk : PiSZ

Erkrankungen der Leber (Kindesalter): Sekretionsstörung in Hepatozyten bei PiZZ

Lungenemphysem (Erwachsenenalter):Folge einer nicht inhibierten PMN-Elastase-Aktivität

Hereditäre Hämochromatose (HH)Prävalenz in Mitteleuropa: 1:400, häufigste autos. rez. Erbkrankheit

Manifestationsalter: 40-60 Jahre, Hepatomegalie, Leberzirrhose, D. mellitus, dunkle Hautpigmentierung

Mutationen im HFE-Gen (Typ 1-Hämochromatose)Cys 282Tyr (C282Y) homozygot bei ca. 85-95% der HH-Patienten, Compound-Heterozygotie mit His63Asp (H63D) bei 3-8% der HH-Patienten (Prävalenz dieses H63D-Polymorphismus: 13%)

Typ 2-Hämochromatose (Hepcidin, Hämojuvelin): seltene juvenile Form, vor 30. Lebensjahr manifest, geht mitschwerer Kardiomyopathie und Hypogonadismus einher.

Typ 3: (Transferrinrezeptor 2)Typ 4: (basolateraler Eisencarrier Ferroportin 1)

Diagnoseweg bei V.a. hereditäre Hämochromatose

Klinische Hinweise und Transferrinsättigung >60% und S-Ferritin >250-300 ng/l

Gen-Test: Cys282Tyr-Mutation, gegebenenfalls His63Glu

_ +

Gentest negativ, aber klin. Verdacht,bzw. zur Bestimmung des Ausmaßes

des Leberschadens

Hämochromatose gesichert

Leberbiopsie mit quantitativer Messungdes Lebereisengehaltes

Aderlasstherapie+

FettstoffwechselLipoproteinstoffwechsel maßgeblich durch Zelloberflächenrezeptoren mitbestimmt

LDL-Rezeptor bindet neben ApoB100 auch Apo E Funktion: Regulation der Cholesterinkonzentration

Cholesterinlieferung für zell. Bedarf, Hormonsynthese

Familiäre Hypercholesterinämie:LDL-Rez.defekte: >100 bislang bekannte Mutationen

(DNA-Sequenzierung)

ApoB100: häufigste Mutation: G10699A (Arg3500Gln)Frequenz: 1 auf 700 Kaukasierbei Heterozygotie erhöhtes S-LDL-Cholesterin,gestörte Bindung an LDL-Rezeptor,Risiko kardiovaskulärer Erkrankungen

FettstoffwechselHyperlipoproteinämie Typ III:

ApoE: ApoE2-Homozygotie ist Voraussetzung zur Ausprägung dieser Fettstoffwechselstörung

Aber: Nur ein kleiner Teil der Homozygoten erkrankt!!!Ansonsten korreliert das Allel E2 mit niedrigeren Cholesterinspiegeln.

ApoE-Allele: E2, E3 und E4 durch Mutat. C112R und R158CIsoformen: E2/2 (1%), E3/3(55%), E4/4, E2/3, E2/4, E3/4 (26%)

Rezeptorbindung E2 bindet nicht , Aktivierung des hepat. LDL-RezeptorsE4-Partikel bewirken das Gegenteil, E4 ist somit potentiell artherogen, E2 protektiv

Assoziation mit M. Alzheimer für E4

ThrombophiliediagnostikStudien gerade bei jungen Thrombophilie-patienten ergaben eine Korrelation von verschiedenen genetischen Polymorphismen vor allem in zwei Genen von Faktoren des Gerinnungssystems : Faktor V (G1691A) Prothrombin (Faktor II, G20210A)

Außerdem konnte eine Korrelation mit einem Polymorphismus (thermolabiles Enzym) der Methylentetrahydrofolsäurereduktase(MTHFR; C611T) gezeigt werden.

ThrombophiliediagnostikFaktor V: G1691A (Arg506Gln), autosom. dominant

(nach Entdeckungsort Faktor V/Leiden genannt)Effekt : verlangsamte Spaltung durch aktiviertes Protein C (APC-Resistenz)Prävalenz: 1:20 für heterozygoten Defekt

Weitverbreitester Risikofaktor für venöse ThrombosenHeterozygotie: ca. fünf- bis zehnfache Erhöhung des Thromboserisikos gegenüber der Normalbevölkerung

Homozygotie: Risiko ca. 100fach erhöht

Weitere Risikofaktoren (z.B. Kombinationsdefekte, Nikotinkonsum, Einnahme oraler Kontrazeptiva) können das Thromboserisiko zusätzlich erheblich erhöhen.

(zusätzlich Ausschluss von Prothrombin-Genmutation, Antithrombin III-, Protein C-, Protein S-Mangel).

PharmakogenetikBeschäftigt sich mit den hereditären Grundlagen der Unterschiede in einer Population bezüglich dem Response auf ein Arzneimittel.

DNA-Sequenzen variieren leicht von Individuum zu Individuum

zahlreiche Polymorphismen

Genetische und damit häufig auch Unterschiede in Proteinzusammen-setzungen verursachen daher bei gleicher Medikation verschiedene systemische Konzentrationsniveaus.

Insgesamt abhängig vonAufnahme, Absorption, Metabolismus (Phase I und Phase II Biotransformations-reaktionen), Clearance und Exkretion

PharmakogenetikEnzym Häufigkeit Medikamente ProblemeCytochrom P450CYP2D6 3-10% viele (Antidepressiva Meist verstärkte CYP2C19 2-5% Neuroleptika, Beta-Blocker.....) WirkungCYP1A2 12%

N-AcetyltransferaseNAT2 50% Isoniazid, Sulfapyridin Überempfindlich-

Dapson, Koffein, Hydralazin keitsreaktionenThiopurinmethyltransf.TPMT 0,3% Azathioprin, Mercaptopurin Leukopenie

Dihydropyrimidin-Dehydr. 5% (Het.) 5-Fluoruracil verstärkte Wirkung(DPD, DPYD)

Glukose-6-Phos.-Dehydr. 1% Sulfonamide, Primaquin Hämolyse

Serum-Cholinesterase 0,04% Succinylcholin Apnoe

Ca-Transport im ER 0,005% Inhalationsanästhetika Maligne Hyperthermie

Siehe MHH-Homepage/MHH-Internes/ CYP P450 Tabelle sowie Einrichtungen/Klinische Chemie/ Analysenspektrum/Pharmakogenetik/

Sinn dieser Analysen abh. von klin. Bedeutung + Durchführbarkeit.

Bsp: Die Cytochrom P450-Genfamilie (CYP) umfasst eine Vielzahl von Isoenzymen, die für die Verstoffwechslung diverser Substanzen verantwortlich sind.CYP 2D6: Von diesem Isoenzym (Debrisoquin-Hydroxylase) sind eine Reihe von Allelen bekannt, die zu einem Verlust der Enzymaktivität führen [CYP2D6*1 (Wildtyp)] („extensive (rapid) Metabolizer“).

CYP2D6*3, *4, *5, *6 („poor (slow) Metabolizer (PM)“) sind in 98% aller Fälle an einem Verlust der CYP2D6-Aktivität beteiligt. Zwei Mangelallelemüssen allerdings nachgewiesen werden.

CYP2D6*2 („intermediate Metabolizer“) in Verbindung mit einem Poor-Metabolizer-Allel. Genduplikationen führen zu „Ultrafast Metabolizer“.

Betroffene Pharmaka: Antidepressiva (z.B. Amitriptylin), Neuroleptika (z.B. Haloperidol), Antiarrhythmika (z.B. Propafenon)

Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6

Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6

UM: ultrafast metabolizerEM: extensive metabolizerIM: intermediate metabolizerPM: poor metabolizer

Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6

3025N =polymorphismnon-polymorphism

inpa

tient

trea

tmen

t day

s

200

150

100

50

0

45

40

5

CYP-abhängige Schwierigkeiten bei der medikamentösen Therapie psychiatrischer Patienten spiegeln sich sogar in der stationären Behandlungsdauer wider.

Höhere BehandlungskostenEM PM/IM

Weitere Einsatzmöglichkeitenmolekularbiologischer Diagnostik

DNA-Polymorphismen in Assoziation zu Krankheiten/KrankheitsrisikenPharmakogenetik

HLA-Typisierung

Molekularbiologischer Nachweis von Krankheitserregern Mikrobiologie: z.B. Chlamydia trachomatisVirologie: z.B. HBV, HCV, HIV

DNA-Polymorphismen in Assoziation mit einem erhöhten Tumorrisikoz.B. BRCA1 und BRCA2 (Brustkrebsrisiko)

Nachweis von Tumorzellen über tumorspezifische Genprodukte bzw. -variationenz.B. Cytokeratin-RNA, PSA-RNA….

somatische Mutationen in tumorassoziierten Genen (z.B. p53)DNA-Methylierungsmuster (Epigenetik)

Nachweis von chromosomalen Aberrationen zum Nachweis und zur Differenzierung von Leukämien und Lymphomen (z.B. Philadelphia-Chromosom

BCR-ABL (t(9;22))

Patient, 51 J, rauchgraue Pigmentierung der Haut und Schleimhäute, Verdacht auf Lebererkrankung

Befundbeispiel

Transferrinsättigung: 82%

Hereditäre Hämochromatose, sek. D. mellitus (Bronzediabetes), Zirrhose