274 J. ScHoRMffLLER u.H.-J . STAN:

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Prof. Dr. F. E. BEArish, Department of Chemistry, University of Toronto, Toronto 5 (Canada)

Kontinuierliche Messung yon 14C-markierten Aminos~iuregemischen mit Hilfe eines Scintillatorsehlauehes nach der Trennung an Ionenaustauschers~iulen ~ J. S(~HORM~LLER und H.-J. STAI~ ~

Aus dem Ins~itut ffir Lebensmittelchemie und Lebensmitteltechnologie der Technischen Universit~t Berlin

Eingegangen am 20. Januar 1965

Summary. A method is described for the continuous measurement of 14C-labelled amino-acids during automatic separation by ion-exchanger columns. Immediately after emerging from the column the single fractions are passed through a measuring device consisting of a plastic scintillator between two photomultipliers in a coin- cidence circuit. Subsequently the eluate is reacted with ninhydrin. The limit of detection is 2 �9 10 -s #C. The procedure is simple and the measuring device is com- mercially available.

Bei Stoffwechseluntersuchungen, insbesondere beim S tud ium biosynthe-

t ischer Leis tungen vieler Organismen, werden in grol~em Umfang laC-

markier te AminosKuren oder andere an der Aminosi~urensynthese be-

tefligte Metabol i te eingesetzt, deren Markierung sich in Pro te inf rak t ionen

wiederfindet. U m derart ige Synthesen zu verfolgen, bieten sich verschie-

dene Wege an. E inen yon ihnen haben wir in frfiheren Arbei ten be-

nutztl ,5-% Dor t waren aus dem Hydro]ysa t derar t markier te r Prote ine

einzelne Aminos~uren isoliert, abgebaut und auf die spezifische laC-Mar-

kierung geprfift worden. Ffir laufende Arbe i ten erschien es notwendig, eine andere Methode auszuarbeiten, mi t deren Itflfe es mSglieh ist, in

~ y d r o l y s a t e n 14C-markierter Prote ine die Aminosgurenzusammense tzung

* Die Untersuchungen wurden durch den Minister ffir Atomkernenergie gefSrdert. Hierfiir danken wir aueh an dieser Stelle verbindlich. ** Am Ausbau der Methode waren zeitweilig die Herren Dr. Int. W. H~PT~E~ und Dr. Ing. S. VI~R~:OT~E~ beteiligt.

Kontinuierliehe Messung yon ltC-Aminosiiuregemischen 275

und die Verteflung der Aktivit~t auf einzelne Aminos/iuren in einem Analysengang zu ermitteln.

1. Die quantitative AuRrennung eines Aminos~iurengemisches Die quantitative Auftrennung eines Aminos~urengemisches erfolgt vor- zugsweise an Ionenaustauschers~ulen durch Elution mit Puffern ver- schiedenen ptI-Wertes, im besonderen Fall dutch Anlegung eines pH- Gradienten. Die einzelnen Aminos/~uren werden dureh die Farbreaktion mit Ninhydrin nachgewiesen. Die Ausarbeitung des ehromatographischen Trennverfahrens und die Anwendung der Ninhydrinanfi~rbung f/Jr quanti- tative Bestimmungen ist das Verdienst der Arbeitsgruppe um MOOSE u. STEIr 4,1a. Das Verfahren gestattet die quantitative Analyse yon 1--2 mg Proteinhydrolysat, wobei die aus der S/iule austretenden Eluate in einem Fraktionssammler aufgenommen werden. Die einzelnen Fraktionen werden mit Ninhydrin angefgrbt. Diese halbautomatische ~ethode ist zeitraubend , hat aber den Vorzug, da6 aliquote Teile jeder Fraktion fiir andere Bestimmungen, beispielsweise zur Ermittlung der l~adioaktivitgt, verwendet werden kSnnen. Eine yon t t A ~ m ~ entwiekelte Apparatur (Abb. 1) gestattet eine automatisehe Aminosgurenanalyse an 2 Sgulen. An einem stark sauren Kationenaustauseher (Amberlite CG 120/[H/AS, Korngr6l~e 35--45 #) werden alle neutralen und sauren Aminosguren getrennt. Das I-Iydrolysat wh'd in einem Puffer vom p i t 2,2 auf der Sgule fixiert und anfangs mit Puffer vom p i t 3,1, dann dureh Gradienten- elution ansteigend auf p t I 5,1 eluiert.

Die Tremmng der basisehen AminosR.uren erfolgt getrennt an dem schwaeh sauren Kationenaustauseher (Amberlite II~C 50/A8, KorngrSBe 80--100 #) dureh Elution mit Puffer vom pH 7,0. Der Puffer wird mit Itilfe einer Pumpe dureh die Sgule ge- drtiekt, wodureh eine konstante DurehfluBgesohwindigkeit gewghrleistet wird. Am Ausgang der Sgule wird das Eluat mit Ninhydrinreagens gemischt, im siedenden Wasserbad zur Farbentwieklung erhitzt und anschliel]end dureh die Megkiivette eines Photometers gefiihrt. Die gegistrierung der Extinktion erfolgt in Abst~nden von 20 see alternierend bei den Wellenl~ngen 578 und 436 nm. Mit dieser Apparatur kann in etwa I6 Std eine vollst/indige Aminos~turentrennung durehgefiihrt werden. Naeh der Anfgrbung ist jedoeh das Eluat nieht weiter ver- wendbar.

2. Die gleichzeitige Messung der Radioaktivit~t Die Benutzung eines seintillatorhaltigen Kunststoffsehlauehes gestattet eine ~essung der I{adioaktivit/it ohne Eingriff in die kontinuierliche Aminos/~urenanalyse. Die Messung der Aktivit/~t weieher/~-Strahlerin w/~13 - tiger LSsung in Plastikscintillatorzellen ftihrten Scm~A~ u. LOMBAEtCT 11,12 mit ~4C und ssS durch. KnUBEL u. WILLENmZINK a bestimmten die Aktivi- tat yon 14C-marlderter Benzoess mit dem Scintillatorschlaueh NE 102. S CH~A~ U. LO~]~AnRT 10 benutzten zur kontinuierliehen Messung yon w/iBrigen L6sungen weicher/~-Strah]er eine mit Anthracen gefiillte

18"

276 J. SC~O~iiLLEa U. H.-J. STA~:

Zelle. Sie kombinierten diese auch mit dem Aminosauren-Analysator yon SPACK~A~, MOOaE U. ST]~r~ 18. Wir verwendeten ffir unsere Arbeit den Scintfllatorsehlaueh I~E 102 (Nuclear Enterprises). Dieser befindet sieh spiralig gelagert zwischen 2 rauseharmen Photomultipliersonden in einer Blefl~ammer. Die beiden Photomultip]ier shad in Koinzidenz geschaltet. Die Eluate werden unmittelbar vom S~ulenende dureh die MeBkammer geffihrt und anschliel~end mit Ninhydrin angef~rbt. Die aus der Koinzi- denzstufe austretenden Impulse werden zu einem Zahlger~t geleitet, das mit einem Vorwahlimpulsgeber und einem Zeitdrucker verbunden ist. Bei Erreichung eines vorgegebenen Zi~hlbetrages wird vom Impulsgeber ein Signal zum Zeitdrueker gesehickt, der daraufhin die abgelaufene Zeit abdi'uckt und ohne Zeitverlust erneut zu zahlen beginnt. Abb. 1 bringt das Diagramm der Anordnung. Die Zeit, die zwischen 2 Signalen vergeht, ist ein ~ a ~ fiir die Aktiviti~t. Sie ist der Aktivi ta t umgekehrt proportional. Eine kfirzere Zeitspanne, als sie ffir den Nullwert erforderlich ist, zeigt Radioaktivi ts an. Zur

I ~/nz/denzs/Se~

Abb. 1. Aufbau d.er Apparatur zur gleiehzeitigen Bestimmung der Aminos~nre- und Aktivit~ts- verteilung

Auswertung zahlt man lediglieh die Zahl der Abdrucke zwisehen 2 Null- werten und multipliziert sie mit der vorgegebenen Impulszahl. Davon wird der ~qullwert abgezogen, den man aus Nullrate dureh Multiplikation mit der Zeitdauer des Aktivit~tsgipfels erh~lt. Die Dauer des Gipfels kann man grob aus der Extinktionskurve der Aminos~ureanfarbung entnehmen oder man addiert alle Zeiten, die den Gipfel bilden. Der Anschlul~ eines Ratemeterschreibers hat den Vorteil, dal3 die ge- sehriebene Aktivit~tskurve sofort einen ~lberbliek fiber die Aktivit~ts- verteilung bietet und die Zuordnung der Aktivit~ten zu den einzelnen Aminosi~uren erleichtert. Voraussetzung ffir quantitative Aussagen fiber die Aktivit~t der einzelnen Fraktionen ist die gleiehe Verweilzeit al]er Teilchen im Me~raum, d. h., die konstante DurehfluBgesehwindigkeit des Eluats in der Mel~zelle.

Kontinuierliche Messung yon ltC-Aminos~uregemischen 277

Diese is t nur gew~hrle is te t dureh die Benu tzung einer Pumpe , die ein kons tan tes Volumen an Elut ionsflf iss igkei t je Zei te inhei t durch die S~ule flieBen li~l~t, unabh~ngig yore S t rSmungswiders tand , den die Si~ule ent- gegensetzt . E ine E lu t ion un te r k o n s t a n t e m ~ul~eren D r u e k s icher t die kons t an t e Durehf lu l tgeschwindigkei t nieht .

3. Die E ichung der lYIellanordnung

Zur Eichung der r a d i o a k t i v e n ~e l~anordnung benu tz t en wir LSsungen von 14C-markierter Glutamins~iure beka~n te r Aktivit~it . Wi r f ixier ten sie au f einer k le inen Si~ule und e lu ier ten mi t der gleichen Durchflul~geschwin- d igke i t wie bei der Aminos / iurenanalyse . Die E ichkurve is t f iber e inen grol~en Ak t iv i t a t sbe re i ch l inear (1:200). Die Nachweisgrenze liegt, doppel- t en Nulleffekt angenommen, bei 2 �9 10 -s tiC. Aus den Ergebnissen yon 6 Para l l e lmessungen bei 5 �9 10 -3 #C geht hervor , dal~ qua n t i t a t i ve Aus- sagen gu t mSglich sind. Der mi t t l e re Feh l e r de r Einze lmessung be t r~g t 5,6o/o, der mi t t l e re Feh le r des Ergebnisses be t r a g t 2,3~ . Die gleiche B e t r a c h t u n g bei 2 �9 10 -2 ftC ergibt ftir 8 P roben einen mi t t l e r en Feh le r der Einze lmessung yon 3,7 ~ und ffir das Ergebnis (1Kittelwert) von 1,6 ~ (Tab. 1). D a die Bes t immung der einzelnen Aminos/ iuren mi t e inem mi t t -

Tabelle 1. _~ehlerbetrachtung z u r E i c h u n g m i t ~aC-marlcierter G l u t a m i n s S u r e

A k t i v i t ~ i t P r o b e I m p u l s z a h l 1 ~ i t t e l w e r t x x 2

0,005 #C

0,02 ~C

1 2 3

I 4

i 5

6

320 340 290 315 305 300

312

8 -t- 28 -- 22 ~- 3 - - 7

- - 1 2

64 784 484

9 49

144

1870 1534

7 8 9

i0 11 12 13 14

1260

1250 1295 1255 1160 1265 1260 1285 1315

- - 10 ~- 35 - - 5

--100 § 5

0 + 25 § 55

10085

100 1225

25 10000

25 0

625 3025

15025

m Der mittlere Fehler der Einzelmessung errechnet sich aus ~ - . 100 (~ mi$

1 / Z x 2 m ~ ~ V ~ i - _ 1 . I)en mittleren Fehler ffir das Ergebnis (Mittelwert) erh~ilt man mit

ff E x ~ m = ~ n ( n - - l ) "

278 J. SC~OR~i)nL~ u. H.-J. STA~:

leren Fehler der Einzelmessung bis zu 50/0 behaf te t ist, ha l ten wir die Genauigkei t der Akt iv i t s fiir ausreichend. E in Vergleich der MeBwerte von pla t t ier ten Proben, die mi t einem Methan- durchfluBzi~hler mi t Endfens ter gemessen wurden, mi t den im Scintillator- schlauch gemessenen, f~llt zuguns ten der letzteren aus (Tab.2).

Tabelle 2. Vergleieh der Meflmethoden

Aktivit~t Impulszahl gel Aktivit~tt Abweichung (io -~ ~C) (lo -~ ~C) o/o

5 20 50

100

5 20 50

100

1. Scintillatorschlaueh 309 4,84 -- 3,2

1261 19,75 -- 1,3 3120 48,90 -- 2,2 6387 100,00 --

2. Plattierte Proben im Methandurchflu[3zShler mit End/enster 463 5,18 + 3,6

1915 21,45 ~- 7,25 4250 47,60 -- 4,8 8930 100,00 --

T~belle 3. Analyse eines uni/orm l~C-markierten Algen2roteins Aufgabe: etw~ 5 ug

% Amino- Impulse Aktiviti~ der gefundenen Ak~.lC-Atom 3iol. 0[o s~iuren (10 -3 ~C) Aktivit~t (10 -~ ~C)

Asp Thre Ser Glu Pro Gly Ala Cys Val Ileu Leu Tyr 1)he Lys Arg

3140 1820 1250 4270 2030 1480 3090 290

2410 2000 4850 1360 3260 2570 1940

50,3 29,0 20,2 68,2 32,5 23,6 49,5 4,7

38,5 31,9 78,0 21,7 52,2 41,0 31,0

572,3

8,79 5,07 3,53

11,92 5,68 4,12 8,65 0,82 6,73 5,57

13,63 3,79 9,12 7,16 5,42

100,00

12,6 7,25 6,73

13,64 6,5

11,8 16,5

1,57 7,7 5,32

13,0 2,41 5,8 6,83 5,16

122,81

10,26 5,90 5,48

11,10 5,29 9,61

13,44 1,28 6,27 4,33

10,59 1,96 4,72 5,56 4,20

99,99

4. Untersuehung eines 14C-markierten Algenproteins

Wir prfiften unsere ~ e t h o d e durch Analyse eines rad ioakt iven 14C-mar- kierten Algenproteins (Abb. 2). Die T rennung der nichtbasischen Amino- s~uren bereitete keine Schwierigkeiten, bei der T rennung der b~sischen

Xontinuierliche Messung yon ~aC-Aminos~uregemisehen 279

Aminos/~uren kam es dureh die vorherlaufenden Frakt ionen saurer und neutraler Aminos~uren im Puffer pI~ 7,0 zu einer Kon tamina t ion des Seintillatorsehlauehes. Diese kann umgangen werden, wenn das bei pI-I 2,2 fixierte Pro te inhydro lysa t zuerst mi t Puffer pI-[ 5,1 ausgewasehen

ARt Pro YI~ zlOOr-- [ipm] 3z5~c~.7

OI I I 300 .~50 Ak~ r- 200 Dnml

i- 500

~;o/#n ~/oo ~

:o? A "~176

.450

Set /ks Asp Arg Z vs

10o so I ..._._s5o t [mini 1oo [

/50

Leul [ lieu

I i 1 500 450 ~00 350 200

Abb.2. Aktivitgtsdiagramm eines Algenproteinhydroigsates

wird. Dadurch lassen sieh die sauren und neutralen Aminos~uren in einem gemeinsamen grogen Vorgipfel auswaschen; ansehliegend eluiert man die basisehen Aminos/mren mit Puffer p H 7,0. Da in unserem Algenprotein prakt isch der gesamte Kohlenstoff als 1~C vorlag, verffigten wit fiber eine sehr hohe spezifisehe Aktivi tgt . Wit gaben deshalb etwa 5 #g unseres Algenproteins zusammen mit einem Tr~gergemiseh, das 1 # ~ o l yon jeder Aminoss enthielt, auf die Ss und errechneten aus der Aktivit~ts- verteilung die Zusammensetzung des Proteins (Tab. 3).

Folgende Versuchsbedingungen wurden eingehalten:

a) Zusammensetzung der PuMer 1. !att 2,2:105 g Citronensgure-Monohydrat + 42 g NaOH + 80 mI 32~ Salz- sgure -t- 5 1 Wasser. 2. pit 3,1 �9 210 g Citronensiiure-3~onohydrat + 83 g NaOtt -f- 135 ml 32~ Sa]z- s~ure + 10 1 Wasser. 3. pI-I 5 ,1:105 g Citronensi~ure-Monohydrat + 20ml Eisessig + 47 g NaOI{ + 136 g Natriumacetat. 3 It20 + 10 1 Wasser. 4. pI-I 7,0:210 g Citronensgure-Monohydr~t + 120 g NaOH + 5 1 Wasser. Die Puffer vom pH 3,1 und 5,1 werden mit 5 ml Thiodiglykol uad 5 ml BRIJ 35/ 1 1 Puffer versetzt. AUe PufferlSsungen werden dureh Aufkoehen luftfrei gemaeht und unter ParaffinS1 im Kiihlkeller bei etwa + 3~ aufbewahrt.

280 SCHOR~O~Ln~ u. ST~ : Kontinuierl. Messung yon ~aC-Aminos~uregemischen

b) Ninhydrin-Reagens 20 g Ninhydrin und 0,4 g SnCI~ �9 2 H20 werden in einer Mischung aus 750 ml friseh destilliertem Methylglykol und 250 ml 4 m Acetatpuffer pH 5,5 (1360 g Natrium- aeetat �9 3 H20 -~ 250ml Eisessig, auf 2,51 mit Wasser aufgef'fillt), aus der vorher' durch Einleiten yon Stickstoff der Suuerstoff vertrieben wurde, gel6st. Das Reagens wird kiihl unter ParaffinS1 aufbewahrt.

c) Radioa]ctivit~itsmessung Die Messung der Radioaktivit~t wurde mit Ger~ten der Fa. Frieseke & Hoepfner, Erlangen-Bruck, durehgefiihrt. Der Scintillatorschlauch ~E 102 (Fa. Nuclear Enter- prises) hatte einen Innendurchmesser yon ~ 0,7 ram, einen Aul]endurchmesser yon ~ 1,5 mm. Das aktive Mel3volumen des spiralig aufgewundenen Sehlauches wurde mit 0,3 • 0,1 ml angegeben. Der Sehlauch befindet sich, wie oben erw~hnt, zwischen 2 rauscharmen Photomultip]iersonden FH421 R, die in Koinzidenz gesehaltet sind.

dJ Versuchsbedingungen /i~r die Scintillationsmessung U = 1,0kV; Eingangsempfindlichkeit 0,6mV; Durehflu]geschwindigkeit des Eluates N 32 ml/Std. Die MeBzeit (min) wurde fiir jeweils 100, 200 oder 400 Impulse durch einen Zeit- drucker ausgedruckt. Die plattierten Proben wurden in einem Methandurchflul~zi~hler mit Endfenster (0,8 mg/cm 2) auf Aluminiumsch~lchen yon 30 mm Durchmesser gemessen. Die Spannung betrug 2,6 kV, die Eingangsempfindlichkeit 10 mV. Das uniform 14C-markier~e Protein stammte yon auf 14C-Hydrogenearbonat als einziger Kohlenstoffquel]e gewaehsenen Ze]len yon Chlorella vulgaris (Radio- chemical Centre, Amersham).

e) Experimentdler Hinweis zur Dekontamination des ScintillatorscMauches NE 102

Nach unseren Erfahrungen kontaminiert der Scintillatorschlauch h~upts~chlich bei Beriihrung mit radioaktiv markierten Anionen. Bei frfiheren Arbeiten an unserem Institut mit a2p-markiertem Phosphat kam es zu damals irreversibler Kon~aminie- rung, auch beim Einsatz von 14C-markiertem Natriumformiat kontaminierte der Schlauch. Starke Kontaminierungen, die beim Auswaschen der sauren und neutra- len Aminos~uren mit Puffer pH 7,0 auftraten, wurden volls~i~ndig mit Salzs~ure verschiedener Konzentration (bis zu 5 ~ riiekgi~ngig gemacht. Der Scintillator- schlauch war dann wieder einw~ndfrei arbeitsf~hig.

Zusammenfassung Es wh'd eine ~V~ethode beschrieben, die es gestat tet , w~hrend einer auto- mat ischen Aminos~urc t rennung an Ionenaustauschersi~ulen die Radio- akt iv i t~t der einzelnen l~C-markierten Aminos~uren zu messen. Die auf- ge t renn ten F rak t ionen werden unmi t t e lba r am S~ulenausgang durch eine ~eBanordnung geschickt, bes tehend aus einem Scintil latorschlauch, der sich zwischen zwei in Koinzidenz geschalteten Photomul t ip l ie rn befindet. Ansehliel]end wird mi t N inhydr in ~ngef~rbt. Die Nachweisgrenze betr~gt 2 �9 10 -3/~C. Die Methode ist einfach zu handhaben , die ~Viel3ger~te, ein- schlieBlich der ~el~zelle, s ind im Hande l erh~ltlich.

I. SARUDI (VON STETINA)-" Gravimetrische Bestimmung der Oxals~ure 28t

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Prof. Dr.-Ing. J. SC~O~tiLL~, Institut fiir Lebensmittelchemie und Lebensmitteltechnologie, Technische Universitgt Berlin, 1 Berlin 12, tIardenbergstr. 34

Kurze Mitteilungen

Zur gewichtsanalytischen Bestimmung der 0xaMiure als Thoriumoxalat I. SARUDI (VON STETINA)

Aus dem Chemischen Untersuchungsamt der Stadt Szeged (Ungarn)

Eingegangen am 24. ])ezember 1964

I n einer frfiheren Arbei t 1 wurde ein gewiohtsanalytisehes Verfahren zur Bes t immung der Oxalsgure vorgesohl~gen, wobei das Oxala$ aus salzsaurer L6sung als Thor iumoxala t gef~llt u n d der Niedersehlag zu ThO 2 vergli iht wird. Das Thor iumoxala t eignet sieh als unmi t t e lba re W/igungsform ffir die Oxalsgure. So ist die Bes~immung der Oxals/~ure in salzsauren Pflanzen- ausz/igen mSglich.

F/Jr die unmi t t e lba re Wggung der Oxalsgure als Thoriumsalz ist nu r der in der t I i tze gef/illte, kristall inisehe Niedersehlag geeignet, der sich durch Troeknen vom Fremdwasser leicht befreien l~13t. Ungeeignet ist dagegen der in der K/ilte gef~llte Niedersohlag, der infolge seiner amorphen Beschaffenheit das Fremdwasser festh/~lt u n d es selbst beim s tunden- langen Trocknen n ieh t restlos abgibt .