LA TRILOGIE DE LA MORT - Freeatctoxicologie.free.fr/archi/apoptose_Chmielewski.pdfLa mort par apoptose est potentielle, la capacité à s'auto-détruire est programmée génétiquement

Valérie Chmielewski CNAM-2008/2009

LA TRILOGIE DE LA MORT

Mlle Valérie CHMIELEWSKIATC CNAM

23 Septembre 2008

Mlle CHMIELEWSKI Valérie Conservatoire National des Arts et Métiers (CNAM)Chaire de Biologie Accès 35-4-19 2, rue Conté 75003 PARIS Tél : 33-(0)1-40-27-23-82 Fax : 33-(0)1-40-27-23-80 Mél :[email protected]

Note aux lecteurs : pour des raisons éthiques, je demande aux personnes qui souhaitent utiliser ce document (que je vous donne en WORD !)même en partie, de m’en faire la demande par e-mail.

1

mailto:[email protected]


Liste des abréviations

AIF : facteur induisant l’apoptoseApaf-1 : Apoptosis protease-activiting factor-1 ATG : AuTophagy-related Genes ATP : adénosine triphosphateBar : Bifunctional apoptosis regulator Bax : Bcl-2- associated protein X Bcl-2 : b-cell lymphoma-2 BH : Bcl-2 homology Ca2+ : calciumCARD : Caspase Activation and Recuitment Domain Dad1 : Defender against apoptotic death 1 Dapi : 4’-6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride DD : Death Domain DED : Death Effector Domain DMSO : Dimethyl sulfoxide dNTP : nucléotidesDO600 : densité optique à 600nmDTT : 1,4-Dithiothréitol EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Endo G : endonucléase GFadd : Fas-associated death domain H2O2 : peroxyde d’hydrogèneIAP : inhibiteur de protéines apoptotiquesIP3R : récepteur d’inositol-3-phosphateME : microscopie électroniquepb : paire de basePBS : phosphate buffered saline PCR : polymerase chain reaction PMSF : phenylmethyl sulfonide fluoride PTP : permeability transition pore PVDF : polyvinylidene difluoride RE : réticulum endoplasmiqueROS : reactive oxygen species RyR : récepteur ryanodineSDS : sodium dodecyl sulfate SERCA : Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase sGFP : synthetic green fluorescent protein SRG1 : Senescence Related Gene 1 TEGT : Testis Enhanced Gene Transcript TM : domaine transmembranaireTNF : Tumor necrosis factor TNF-R1 : Tumor necrosis factor receptor TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand TUNEL : terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling U : unité d’activité enzymatiqueU.V. : ultravioletVDAC : voltage-dependent anion channel

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Table des matières

Introduction......................................................................................... 51. Définition de la mort cellulaire : nécrose, apoptose et autophagie..... 72- Les cellules impliquées dans l’apoptose homéostatique.....................93. L’apoptose...................................................................................... 124. La régulation de l’apoptose ............................................................ 13

4-1 La voie extrinsèque ...................................................................................................................................... 144-2 La voie intrinsèque .......................................................................................................................................164-3 Une activité en amont de la mitochondrie.................................................................................................... 19

5. L’autophagie................................................................................... 226. Mécanisme commun entre l’autophagie, l’apoptose et la nécrose.... 247- Les régulateurs de la mort cellulaire programmée........................... 25

7.1La famille Bcl-2............................................................................................................................................. 257-2 Les caspases.................................................................................................................................................. 29

8- Apoptose et pathologies ................................................................. 318-1 HIV : Chronique d’une mort programmée ...................................................................................................328-2 Apoptose et cancer .......................................................................................................................................348-3 Apoptose et ischémie.................................................................................................................................... 39

9- Mise en évidence de l’apoptose / nécrose. ..................................... 409-1 Caractères morphologiques de l'apoptose.....................................................................................................409-2 Modification de la membrane plasmique......................................................................................................429-3 Fragmentation de l’ADN ............................................................................................................................. 439-4 Modifications des mitochondries : .............................................................................................................46

Bibliographie...................................................................................... 48

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Table des illustrations

Liste des abréviations........................................................................... 2 F igure 1 : Apoptose/nécrose/autophagie............................................ 7Figure 2 : Les étapes de la nécrose versus apoptose. ............................ 8Figure 3 : apoptose. intra-thymique ..................................................... 9Figure 4 : Apoptose régulatrice de la RI infectieuse ............................10Figure 5 : Apoptose de segmentation embryonnaire............................ 11Figure 6 : chronologie de l’apoptose................................................... 12Figure 7 : Les voies extrinsèques et intrinsèques de l’apoptose. ......... 13Figure 8 : récepteur FAS et TNFR1...................................................... 15Figure 9 : Voies extrinsèques : 2 sentiers............................................ 15Figure 10 : La famille Bcl –2............................................................... 17Figure 11 : la mitochondrie altérée..................................................... 18Figure 12 : antiport NHE-1.................................................................. 19Figure 13 : Schéma représentant les principaux composants impliqués dans la régulation de l’apoptose au niveau du réticulum endoplasmique........................................................................................................... 21Figure 14 : Schéma de l’autophagie (macroautophagie)....................... 23Figure 15 : Schéma de la trilogie de la mort........................................ 24Figure 16 : TNF : apoptose ou autophagie ?........................................ 25Figure 17 : Structure des protéines Bcl-2 et Bax ................................ 27Figure 18 : les C Asp ases................................................................... 29 Figure 19: Voie des caspases............................................................. 31Figure 20 : impact du VIH sur une cellule cible ............................ 33Figure 21 : régulation et p53.............................................................. 35Figure 22 : Cisplatine et ADN.............................................................. 37Figure 23 : Stratégie pour augmenter ou induire les signaux impliquants

les récepteurs de mort....................................................................... 38Figure 24 :Anticancer :la facilitation de la voie mitochondriale...........39Figure 25 : ME de cellule en apoptose et corps apoptotique................ 40Figure 26 : marquage Annexin V /IP................................................... 42Figure 27 : technique TUNEL ............................................................ 43Figure 28 : Fragmentation inter-nucléosomale de l’ADN..................... 44 Figure 29 :Photo d’un gel agarose ................. 44figure 30: QUANTIFICATION DES CELLULES EN APOPTOSE PAR CMF après ELUTION................................................................................... 45Figure 31 : perméabilisation des mitochondries ................................ 47Figure 32 : Utilisation du JC-1 ........................................................... 47

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IntroductionLa mort cellulaire se décline selon trois modes distincts à savoir l’apoptose, la nécrose et l‘autophagie. En l’absence d’une régulation, on définit la mort

cellulaire comme nécrotique alors qu’en présence d’une régulation, on la qualifie de mort cellulaire programmée. Il existe deux voies majeures de mort cellulaire programmée (PCD) : apoptose ou PCD de type I et mort autophagique ou PCD de

type II. Ces PCD sont gérées par des cascades d’activation différentes pouvant se

recouper à plusieurs niveaux.

En introduction, la mort cellulaire n’est pas l’oméga de la vie. Contrairement aux

apparences, la vie et la mort ne sont pas radicalement antagonistes. Le corps

humain, par exemple, est une colonie de cellules hétérogènes, dont beaucoup

meurent (s'auto-détruisent) pour permettre le renouvellement organique. Dans tous

les cas, la mort laisse place à une naissance assurant ainsi l’homéostasie des êtres

supérieurs. En résumé : tout se passe comme si le tout ne pouvait exister dans sa

globalité qu’à travers le suicide de la partie.

La mort cellulaire a longtemps été considérée comme l'incapacité de résister aux

agressions de l'environnement et du temps. Or, si ce phénomène appelé nécrose existe et résulte d’une agression directe par une substance quelconque (par

exemple, un acide), il existe un autre phénomène appelé apoptose qui se définit

comme la capacité d'une cellule de s'auto-détruire en quelques heures et ainsi de se

sacrifier pour la survie du tout. Cette aptitude à l'autodestruction est donc tout à

fait vitale au plein sens du terme. La vie c’est l’empêchement de s’autodétruire, ce qui n’est pas une mission impossible. L’apoptose a essentiellement deux

fonctions : structurer la vie, tel le sculpteur puis la défendre non dans un état

statique mais dans une dynamique de renouvellement qui s’adapte au plus près des

changements corporels (accidents) tant qu’ils sont jugés compatibles avec la survie

à l’échelle cellulaire ou jugés compatibles avec la survie de l’individu qui reste le

seul capable d’en décider.

La mort à l’échelle cellulaire est créatrice à l’échelle de l’individu. De plus,

une cellule toute seule, qui ne perçoit plus de signaux émanant des autres cellules,

finit par se suicider. Elle ne peut vivre seule. S’agissant de l’être humain

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considéré dans sa dimension humaine, « je » n’existe pas sans « tu ». Croire le

contraire est au mieux une absence de pensée et au pire d’une vanité insolente.

Mais quelle que soit la raison d’envisager un « je » sans un « tu » qui entre en

résonance à l’unisson au dernier instant, elle fait naître une inquiétude : la

négation de la survie de l’humanité.

« Les missions du soin relèvent d’une double exigence : préserver l’humanité d’une relation et ne pas renoncer à reconnaître l’autre en ce qu’il demeure jusqu’au terme de son existence. Le soupçon que suscite, notamment dans nos institutions hospitalières, la confusion de prises de positions ambiguës, d’apparence aléatoires — avantageusement relayées au sein de la cité —,s’avère dès lors inconciliable avec la reconnaissance des besoins de confiance, d’estime, d’appartenance à laquelle aspire la personne dans ces circonstances extrêmes. D’autant plus lorsque l’envahit le sentiment parfois oppressant d’un temps qui lui est compté, d’une vulnérabilité qui s’accentue et menace son intégrité ». (Emmanuel Hirsch, à lire absolument ! Apprendre à mourir, Paris, Grasset, 2008 Sortie le 7 octobre - 126 p.)

La mort par apoptose est potentielle, la capacité à s'auto-détruire est programmée

génétiquement ; mais, comme on l'a vu, le destin individuel de chaque cellule n'est

pas prédéterminé. La formule du suicide cellulaire est la suivante : la cellule meurt,

non parce qu'un signal extérieur la tue directement, mais parce qu'elle se tue en

fonction des signaux ou de l'absence de signaux auxquels elle est confrontée lors de

ses rencontres. Au Japon, on emploie des aides pour accompagner ceux qui vont se

faire " hara-kiri " dans leurs derniers moments. Mais, au cas où le suicidaire serait

tenté de renoncer, l'aide est chargé de l'exécuter. Or, une colonie de cellules

fonctionne " à la japonaise ". Une cellule en train de se tuer implose et se détache de

ses voisines, elle se détruit en se rétrécissant, elle part ensuite en morceaux qui

sont phagocytés par les autres cellules avoisinantes. Mais passer un point de non

retour, elle ne saurait revenir en arrière, car même si elle s'arrêtait dans son

processus d'autodestruction, elle serait ingérée quand même.

Exemples de suicides : L'autodestruction rapide et constante des cellules de la

peau est un exemple: notre peau, contrairement aux apparences, n'est jamais la

même, elle se renouvelle indéfiniment. En ce qui concerne des territoires cellulaires

persistant, comme l'ensemble des neurones, la différence est de degré, mais pas de

nature : en cas de fracture de la moelle épinière, les neurones coupés de tout signal

se tuent également. On retrouve ici une des règles fondamentales de la colonie

cellulaire : une cellule qui ne perçoit plus aucun signal de la communauté

s'autodétruit très rapidement.

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1. Définition de la mort cellulaire : nécrose, apoptose et autophagie

Dans la littérature, plusieurs formes de mort cellulaire programmée ont été

décrites dans la classification de Schweichel et Merker en fonction des

caractéristiques morphologiques des cellules. Cette classification (Fig. 1)

distingue l’existence de deux formes principales de mort cellulaire programmée soit

l’apoptose (type I :où les débris sont éliminés par les lysosomes des cellules

phagocytaires) soit l’autophagie (type II: où l’ élimination procède par l’action des

lysosomes propres à la cellule).

F igure 1 : Apoptose/nécrose/autophagie

Ce phénomène peut être contrôlé ou non par les constituants propres de la cellule.

Outre la régulation par des protéines, la mort cellulaire programmée se distingue de

la nécrose par l’intensité des signaux qui l’induisent et par les caractéristiques

cellulaires. La nécrose induite par des perturbations environnementales violentes

se manifeste souvent par le gonflement généralisé des organites intracellulaires et par la rupture des membranes (Fig. 2). D’un autre côté, la mort cellulaire

programmée fait suite à des situations de stress et de développement moins sévères

et peut se reconnaître par des caractéristiques cellulaires particulières qui seront

précisées dans la suite. Par opposition à la nécrose, la mort cellulaire programmée

nécessite un contrôle cellulaire qui s’établit par l’intermédiaire de nombreuses

molécules. Cette mort fait suite à une variété de stimuli environnementaux,

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physiologiques ou pathologiques afin d’éliminer les cellules inutiles, en excès, infectées ou endommagées.

En fait, ce processus est si important qu’un dérèglement entraîne chez l’homme des

maladies importantes (Vaux & Korsmeyer, 1999).

Figure 2 : Les étapes de la nécrose versus apoptose.

Ce schéma montre les caractéristiques observées lors de la nécrose et l’apoptose. L’apoptose correspond à un "suicide" cellulaire par mort cellulaire

programmée alors qu’une atteinte massive et accidentelle de cellules se traduit par

une nécrose tissulaire. La nécrose se caractérise par le gonflement de la cellule

jusqu’à son éclatement alors que l’apoptose se définit par une condensation de la

cellule, une fragmentation du noyau et la formation de corps apoptotiques.

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2- Les cellules impliquées dans l’apoptose homéostatique

La mort cellulaire programmée est un processus physiologique normal qui joue un

rôle déterminant dans le développement embryonnaire ainsi que dans le

fonctionnement du système immunitaire :

Dans le système immunitaire, l'apoptose intervient, d'une part dans l'élimination des lymphocytes B et T inadaptés ou dangereux (auto-agressifs).

La moelle osseuse produit 4 à 5 fois plus de lymphocytes B que ceux nécessaire à

l’organisme. Les cellules qui ne sont pas sélectionnées au contact de celles qui les

éduquent, ne rejoignent pas la circulation périphérique et meurent par apoptose.

Figure 3 : apoptose. intra-thymique

Le thymus est un organe de maturation des lymphocytes T. Lors de leur

développement les lymphocytes T subissent une sélection positive et négative

drastique et plus de 90 % se trouvent engagés dans un processus de mort

cellulaire. (Fig. 3)

D'autre part lors d’une infection les cellules cibles sont détruites par les cellules de l'immunité à activité cytotoxiques.

9

Prothymocyte DNThy-1,c-kit,CD44,

Thymocyte mature SPThy-1,

Thymocyte immaturePréthymocyte DPThy-,RAG1/2,TdT

SélectionPositive des DP ssi leur TcR se lie aux CMH I et/ou II.Les autres sont condamnés à être apoptosé.

SélectionNégative des DP qui sont apoptosés ssi leur TcR reconnaît avec une haute affinité un auto-Ag dans un contexte du CMH du soi.

Réarrangement du TcR-βou apoptose dans les 3 à 4 jours

Réarrangement du TcR-α ou apoptose

Th ou Tc

Maturation extra thymique des DN ayant un TcR -γδ

Cours d’immunologie V.Chmielewski ©


De plus, au cours d’une infection, les ganglions s’hypertrophient. En fonction du

signal transmis par l'agent pathogène, les cellules se multiplient très vite, il s'en

crée des centaines de milliards. Mais, au bout de quinze jours environ, elles

s'autodétruisent pour ne pas envahir l'organisme ; seules subsistent des cellules

mémoires qui iront renforcer le système immunitaire lors d’une attaque réitérée.

(Fig. 4)

Figure 4 : Apoptose régulatrice de la RI infectieuse

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Plasmo

Baiser de la mort=granzymes: lyse

CPATh

CMH-II TcR

CD4

CTL

S馗r騁ion d 但c sp馗ifiques neutralisant

Tc

IL-2

TcR CMH-I

CD8Th

BBcR

Tc m

Th m

+

+

+Pool de lymphocytes m駑oires

Cellule infect馥

Ag

ActivationExpansion

ｫ Processing ｻ de l 但g

Bm

Cours d段mmunologie V.Chmielewski


Cellules embryonnaires : au cours du développement embryonnaire de la souris,

la mort programmée de certaines cellules survient afin d’assurer l’individualisation

de segments corporels comme par exemple la formation des doigts. Au cours de l’

embryogénèse un organisme se forme en multipliant ses cellules, mais aussi en

détruisant une foule d'entre elles et ceci en l'absence de toute maladie. Dans

l'embryogenèse, la vie et la mort jouent un rôle complémentaire. La formation des

doigts illustre parfaitement cette complémentarité. La main n'est au départ qu'une

sorte de moufle, dont les doigts se différencient par le suicide des cellules

composant les tissus qui les réunissent. (Fig. 5).

Figure 5 : Apoptose de segmentation embryonnaire

De même dans le cadre de l’organisation du SNC, la synaptogenèse procède à l’élimination de plus de 50 % des neurones pendant l’embryogenèse. Le

système nerveux humain comporte quelque cent milliards de neurones ! Tous les

neurones sont génétiquement programmés pour former un axone qui permet la

connexion avec d'autres cellules; ils sont également programmés pour voyager à

l'intérieur de l'organisme. Or, les neurones finissent par se détruire, sauf s'ils

rencontrent un autre neurone ou toute autre cellule avec laquelle une connexion

est possible (ces cellules-partenaires envoient des signaux permettant la

connexion). Le neurone se suicide ainsi dans deux cas : a) s'il ne rencontre rien

avec quoi établir une connexion (synapse) ; b) s'il rentre en contact avec une cellule

non-partenaire. Les neurones qui ont mal voyagé meurent de cette façon. En définitive, un corps est constitué de réseaux de survivants qui se connectent avec d'autres réseaux de survivants. Le voyage des neurones est déterminé

génétiquement, mais la complexité naît en quelque sorte du hasard des rencontres.

(Voir la partie pathologie et ischémie.)

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3. L’apoptose

Figure 6 : chronologie de l’apoptose

Dès 1972, l’équipe de Kerr a montré que, chez plusieurs types cellulaires, la mort

est précédée par une condensation du noyau et du cytoplasme, une fragmentation

du contenu cellulaire en corps apoptotiques (structure membranaire contenant des

débris cytoplasmiques et nucléaires) et l’élimination de ces dernières composantes

par phagocytose ( Fig. 6) (Kerr et al., 1972). De plus, ce type de mort cellulaire

n’induit aucune réponse inflammatoire et n’affecte en rien les cellules voisines.

Comme les caractéristiques observées par Kerr contrastaient avec celles des cellules

nécrotiques (Fig. 1), ce groupe de chercheurs a proposé le terme apoptose, qui, en

grec, décrit la chute des feuilles en automne, pour identifier ce type de mort

cellulaire programmée (Kerr et al., 1972). Aujourd’hui, on reconnaît qu’une cellule

en apoptose se caractérise principalement par le rétrécissement de la cellule, la condensation de la chromatine, la fragmentation du noyau, la dégradation de l’ADN nucléaire avec des fragments correspondant à des multiples de 180-200pb

et la formation de vésicules contenant les débris cellulaires. De plus, les

cellules en apoptose possèdent des organelles bien préservées alors que leur

cytosquelette est dégradé. (Martin et al., 1994).

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4. La régulation de l’apoptose

Chez ces organismes, on reconnaît principalement deux voies qui conduisent à

l’autodestruction cellulaire : la voie extrinsèque et la voie intrinsèque.

Ces deux voies ont en commun de conduire à l’activation des caspases, ce qui

constitue le point de non-retour pour la cellule. Si les caspases sont activées, la

mort est inévitable.

Ces deux voies sont complexes et font intervenir un réseau d’interactions protéiques

incluant des récepteurs, des protéines régulatrices et des caspases. (Fig. 7 ).

Figure 7 : Les voies extrinsèques et intrinsèques de l’apoptose.

Ce schéma représente les deux voies menant à l’apoptose. La voie extrinsèque est induite par les récepteurs TNFR situés dans la membrane plasmique. Ce récepteur induit la cascade des caspases ce qui conduit la cellule à l’apoptose. La voie intrinsèque est dirigée par les membres de la famille Bcl-2 tels que Bax, qui induit le relargage du cytochrome c et la cascade des caspases ce qui conduit aussi la cellule à l’apoptose. Tirée de ((Reed, 2000). Le terme « caspase » fait référence à une famille de protéases, extrêmement conservées au cours de l’évolution, possédant une cystéine dans leur site actif et clivant leurs substrats après un résidu acide aspartique, d’où le terme caspase, Cystein-ASPartate proteASE. On compte jusqu’à maintenantplus de quatorze membres de cette famille qui ont été identifiés et séparés en deux groupes :les caspases initiatrices (2, 8, 9, 10) et les caspases effectrices (3, 6, 7) (Curtin et al, 2003).

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Les caspases initiatrices activent les effectrices, et les effectrices ont comme rôle de

cliver des protéines bien précises, résultant soit en leur activation ou leur

inactivation. Les caspases sont toujours présentes dans la cellule animale. Elles

existent à l’état basal sous la forme de proenzymes inactives (elles sont alors

appelées procaspases) qui seront ensuite activées. Le

mécanisme d’activation diffère pour les deux groupes de caspases. L’activation des caspases initiatrices se fait par deux mécanismes : la proximité induite et

l’association avec une sous unité régulatrice. Pour la proximité induite, l’activation

requiert un recrutement massif de procaspases dans un micro-environnement de la

cellule, un récepteur de mort par exemple, et c’est cette proximité qui permet à la

faible activité protéolytique intrinsèque des procaspases de s’autocliver entre elles,

et ainsi de s’activer. Pour le mécanisme d’activation par liaison : l’association avec

une ou des sous unités régulatrices active la procaspase (Hentgartner, 2000). Une

fois activée par un clivage protéolytique, la caspase initiatrice activera les caspases

effectrices qui cliveront leurs substrats et mèneront ainsi la cellule à sa mort.

L’activation et l’activité des caspases sont soumises à une inhibition directe par les

protéines de la famille des IAP. Celles-ci sont capables d’inhiber les caspases soit en

se liant à leur domaine catalytique ou encore en empêchant leur dimérisation (Shi,

2004).

4-1 La voie extrinsèque La voie extrinsèque implique un récepteur du signal au niveau de la membrane plasmique. Plusieurs récepteurs connus appartiennent à la famille des récepteurs TNF (Tumor Necrosis Factor) tels que Fas, TNF-R1 (Tumor Necrosis Factor Receptor)

ou TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand).(Fig. 8) Quand un ligand se lie sur

la portion N-terminal extracellulaire du récepteur. Ceci mène à la trimérisation du

récepteur et à son activation qui conduit à un recrutement de protéines via la

portion c-terminal cytoplasmique du récepteur, parmi celles-ci des procaspases

initiatrices. La transmission du message s’effectue par l’intermédiaire de la protéine

adaptatrice FADD (Fas-associated death domain). Cette protéine possède deux

domaines d’interaction, l’un nommé DD (Death Domain) pour le récepteur et l’autre

domaine nommé DED (Death Effector Domain) qui interagit avec la caspase-8.

L’activation subséquente des caspases-3, 6 et 7 par un clivage protéolytique de la

caspase-8 induit l’autodestruction cellulaire en clivant les composantes essentielles

au maintien de la vie cellulaire (Borner, 2003; Ouellet, 2004; Reed, 2000)

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Figure 8 : récepteur FAS et TNFR1

À partir de ce moment, la mort cellulaire induite par les récepteurs de mort peut

emprunter deux sentiers qui varient selon le type cellulaire. (Debatin et al, 2004).

Dans les cellules de type I, la caspase initiatrice active immédiatement une

caspase effectrice. Par contre dans les cellules de type II, la caspase initiatrice

clive Bid, une protéine à domaine BH3 (voir plus bas) ce qui mènera au largage de

facteurs pro-apoptotiques de la mitochondrie, à l’activation d’autres caspases et à

l’induction de l’apoptose. (Opferman et Korsmeyer, 2003).[Fig.9]

Figure 9 : Voies extrinsèques : 2 sentiers

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Sentier cellules II

Sentier cellules I

TNF-R


4-2 La voie intrinsèque La voie intrinsèque a pour éléments déclencheurs des agressions intracellulaires,

comme l’augmentation des ROS, des dommages à l’ADN, le stress du réticulum

endoplasmique, l’activation d’oncogènes, etc. (Opferman et Korsmeyer, 2003). Via

divers sentiers de signalisation intracellulaire, ces insultes convergent en un point

dans la cellule :la mitochondrie. Bien que la mitochondrie soit essentielle à la vie

cellulaire, elle joue un rôle central dans l’apoptose. Lorsque des signaux de mort y

parviennent, la perméabilisation de la membrane mitochondriale et le relargage de

plusieurs protéines dans le cytosol, dont le cytochrome c, Smac/Diablo, EndoG,

Omi/HtrA2 et AIF (Fig. 2).le point de non retour est atteint.

Bien que chacune ait son rôle à jouer dans l’apoptose, seul le cytochrome c,

Omi/HtrA2 et les protéines Smac/DIABLO ont un effet sur l’activation des caspases

(Saelens et al, 2004).

La voie intrinsèque implique une réception du signal qui fait intervenir les membres

de la famille Bcl-2, (Fig. 10) famille de protéines régulatrices connue pour leurs

activités pro-apoptotiques telles que Bax et Bak ou anti-apoptotiques telles que Bcl-

2 et Bcl-XL. Dans ce cas, la transmission du message s’effectue par la protéine Bax

qui est principalement localisée dans le cytosol. Suite à un stress apoptotique,

l’extrémité C-terminale de la protéine Bax change de conformation afin de

s’accrocher à la membrane externe des mitochondries (Borner, 2003). La membrane

mitochondriale se perfore et devient perméable aux protéines. Les membres anti-

apoptotiques de la famille Bcl-2 agiraient en prévenant la perforation de la

membrane mitochondriale soit en bloquant la formation de pores, soit en stabilisant

la couche lipidique de la membrane externe (Borner, 2003).

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Figure 10 : La famille Bcl –2

L’action de Bax, quant à elle, se situe aussi au niveau de la membrane

mitochondriale et varie selon le type de cellules et le stimulus apoptotique. Quatre

hypothèses ont été émises pour expliquer l’action de Bax :

a) Bax pourrait induire le relargage du cytochrome c en formant des pores dans la membrane,

b) Bax pourrait induire la perméabilisation mitochondriale par une interaction avec le pore de transition de perméabilité connu sous l’abréviation PTP pour «Permeability Transition Pore» et permettre le relargage des protéines mitochondriales dans le cytosol,

c) Bax pourrait participer à la formation de canaux chimériques avec VDAC «Voltage-Dependent Anion Channel» dans la membrane externe,

d) Bax pourrait aussi induire la formation de pores lipidiques (Polster & Fiskum, 2004; Sharpe et al., 2004).

Peu importe le mode d’action de la protéine Bax, il y a une perméabilisation de

la membrane mitochondriale. La perméabilisation de cette membrane entraîne le

relargage du cytochrome c (voir Figure 2), du facteur induisant l’apoptose (AIF)

et de l’endonucléase G (EndoG) (Borner, 2003; Polster & Fiskum, 2004). Le relargage du cytochrome c de la mitochondrie dans le cytosol est l’étape irréversible du processus. [fig. 11]

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Pro apoptique

Anti apoptique


Figure 11 : la mitochondrie altérée

Le cytochrome c peut intervenir sur la production de ROS. Les ROS sont des

produits réactifs de l’oxygène tels que l’oxygène singulet (1O2), le radical

superoxyde (O2 •-), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (OH•).

Les ROS peuvent endommager les composantes cellulaires comme les protéines,

les lipides et l’ADN (Brookes et al., 2004). Le cytochrome c peut se lier au

récepteur IP3R du réticulum endoplasmique (RE) ce qui conduit à

l’accroissement du calcium relâché par le RE (Brookes et al., 2004). Le

cytochrome c peut aussi intervenir sur la cascade des caspases en se liant avec

la protéine Apaf-1 (Apoptosis Protease-Activiting Factor-1) pour former

l’apoptosome en présence d’ATP. L’apoptosome se lie à la procaspase-9 par son

domaine CARD afin d’activer la caspase-9. L’activation de cette caspase

initiatrice mène à l’activation des caspases effectrices telles que les caspases-3,

6 et 7. L’activité de toutes ces caspases, des endonucléases ENDO G et des ROS

conduit à l’autodestruction cellulaire (Fig 12) (Borner, 2003).

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Figure 12 : antiport NHE-1

A lire : fiche de publication de l’article.

4-3 Une activité en amont de la mitochondrie

Le paragraphe précédent montre entre autres l’importance du cytochrome c et de

la mitochondrie lors de l’apoptose. On remarque que l’effet du cytochrome c peut

être multiple puisqu’il agit sur diverses cibles dont le calcium. Le calcium (Ca2+) est

un messager intracellulaire important dans de nombreux sentiers métaboliques.

Plusieurs études ont démontré que le Ca2+ est un important déclencheur de

l’apoptose. En effet, une surcharge de calcium cellulaire ou une perturbation de la

compartimentation du calcium intracellulaire provoque un stress au niveau du RE

ce qui déclenche une mort par apoptose (Orrenius et al., 2003).

En tant que réservoir de Ca2+, le réticulum endoplasmique serait aussi un

organite impliqué dans l’apoptose. De plus, le fait que certaines protéines

régulatrices comme celles de la famille du Bcl-2 soient également localisées au

niveau du RE renforce l’hypothèse de son implication dans le processus. Le

réticulum endoplasmique est un organite hautement dynamique impliqué dans la

19

FADD Na+ donc: Le flux Na+/H+par l’antiport NHE-1 augmente le pHi de 7.1 à 7.6

d’où la désamidation des aa Asn52 et Asn 66 en iso-Asn du Bcl-xl Caspase 8 initiatrice

Bim, Puma,Bad: protéines BH3 seules

Bcl-xl + BH3 mais ∆ Bcl-xl + BH3

Bcl-2

Cytochrome c + Apaf-1 Apoptosome

activation Caspase 9 Clivage protéolylique

H+

D’après PLoS Biology, 2007; 5,(1) e1.

Chanel Bax,Bak

++

AIF + endoG ROS

Clivage de l’ADN


synthèse et le repliement des protéines et dans la signalisation et l’entreposage du

calcium. Comme le calcium est la clé régulatrice de la fonction mitochondriale, la

fonction du RE lors de l’apoptose serait intimement liée avec celle de la

mitochondrie d’autant plus que cet organite tamponne généralement la

concentration de calcium intracellulaire. La proximité entre les deux organites

faciliterait les échanges du calcium. Son relargage du RE s’établit par des

récepteurs d’inositol-3-phosphate (IP3R) et des récepteurs ryanodine (RyR) ou par

des fuites à travers des pores aqueux. Ce relargage de Ca2+ peut être contré par la

pompe SERCA (Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase) qui a pour fonction de

maintenir le niveau de Ca2+ constant à l’intérieur du RE (Berridge, 2002). La

quantité de calcium relarguée par le RE influence la réponse de la mitochondrie.

Ainsi, lorsque la concentration de calcium est faible, la mitochondrie le recycle pour

éventuellement le lui retourner (Fig. 13). Une légère augmentation de calcium à l’intérieur de la mitochondrie provoque une augmentation de la production d’ATP et assure le maintien des activités normales de la mitochondrie au niveau de la réduction de l’oxygène. À l’opposé, lorsque la concentration de calcium est élevée, les activités de la mitochondrie s’orientent vers l’apoptose. Des travaux ont rapporté que l’ouverture des PTP, le relargage du

cytochrome c, la production de ROS, l’induction de la cascade des caspases et la

sensibilisation des récepteurs RyR font suite à un excès de calcium (Fig. 13)

(Brookes et al., 2004). Chacune de ces composantes peut avoir un effet sur les

autres ce qui peut amplifier le signal apoptotique et accélérer le processus.

20


Figure 13 : Schéma représentant les principaux composants impliqués dans la régulation de l’apoptose au niveau du réticulum endoplasmique.

On peut voir la proximité des deux organites ce qui permet à la mitochondrie

d’absorber rapidement le calcium relargué du RE. Un relargage trop important de

calcium du RE provoque une saturation de la mitochondrie, l’ouverture des PTP, la

formation de l’apotosome et la mort par apoptose. Tirée de (Bolduc, 2005).

Plusieurs des membres de la famille de Bcl-2 se retrouvent au niveau du RE tels

que Bcl-2 et Bax et peuvent donc être impliqués dans le contrôle du calcium. En

effet, Pinton et ses collaborateurs ont démontré que la surexpression de Bcl-2 augmente les fuites de calcium et diminue ainsi la concentration de calcium à

l’intérieur du RE (Pinton et al., 2000). Les fibroblastes Bax-/--Bak-/- montrent

d’ailleurs une diminution de la concentration de calcium à l’intérieur du RE

(Scorrano et al., 2003). La surexpression de Bax et celle de Bak, quant à elles,

provoquent le déplacement du calcium du RE vers la mitochondrie lors de

l’apoptose (Nutt et al., 2002). Le mode d’action des protéines Bax et Bcl-2 n’est pas

encore élucidé, mais il semble que ces protéines agiraient entre autres au niveau

des flux calciques (Distelhorst & Shore, 2004). Selon les données actuelles, il

semblerait que Bax aurait pour fonction de séquestrer le Ca2+ à l’intérieur du RE jusqu’à la présence d’un stress apoptotique. À la suite d’un signal de stress,

la protéine Bax laisserait le Ca2+ s’échapper massivement du RE ce qui aurait pour

effet de saturer rapidement la mitochondrie. Cette saturation provoquerait une

21


perméabilisation de la membrane mitochondriale et conduirait à l’autodestruction

cellulaire. La protéine Bcl-2 affecterait le calcium du RE en augmentant les fuites

passives des ions à travers la membrane du RE. Cet effet de Bcl-2 permettrait de

contrer l’effet de Bax et inhiberait l’apoptose (Pinton et al., 2000).

5. L’autophagie

Le terme «autophagie» provient du grec autos pour soi-même et phagein pour

manger donc se manger soi-même. Chez les animaux, les végétaux et la levure,

l’autophagie a principalement été décrite lors d’une carence en nutriments pour les

récupérer à des fins de survie. Cette autodigestion se fait par l’entremise des

lysosomes ou des vacuoles propres à la cellule. Ces organites contiennent un grand

nombre d’enzymes qui dégradent la plupart des macromolécules biologiques. Les

caractéristiques morphologiques de l’autophagie sont principalement liées à la

formation de vésicules autophagiques qui dégradent des organelles comme

l’appareil de Golgi, les ribosomes, le réticulum endoplasmique et finalement le

noyau. Cependant, puisque les microfilaments sont préservés, on suppose que le

cytosquelette est requis pour l’autophagocytose (Bursch et al., 2000). Ces

caractéristiques sont totalement contraires à celles observées lors de l’apoptose

puisque, lors de ce processus, les organites sont préservés et le cytosquelette est

dégradé. L’autophagie est une forme de mort cellulaire programmée plus ancestrale que l’apoptose et très conservée puisqu’elle est présente chez les végétaux, les animaux et la levure.

Dans la littérature, trois formes d’autophagie ont été décrites : l’autophagie influencée par les chaperones, la microautophagie et la macroautophagie. L’autophagie influencée par les chaperones est une seconde réponse à une

famine et contrairement aux deux autres processus, elle implique la translocation

directe des protéines cibles à travers la membrane du lysosome. Aucun équivalent

de ce processus n’a été retrouvé chez la levure. La microautophagie est le

processus le moins bien connu. Il a lieu lorsque le cytoplasme est séquestré par

invagination de la membrane lysosomale/vacuolaire. La forme la plus répandue, la macroautophagie implique la formation de vésicules cytosoliques à double

membrane, les autophagosomes, qui séquestrent des portions du cytoplasme. La

fusion complète de l’autophagosome avec le lysosome ou la vacuole libère la

vésicule interne (corps autophagique) à l’intérieur du lumen du compartiment de

22


dégradation. La rupture subséquente de la membrane de la vésicule permet la

dégradation de son chargement et éventuellement le recyclage des acides aminés et

des autres composants générés (Fig. 14) (Klionsky, 2005).

Figure 14 : Schéma de l’autophagie (macroautophagie).

Ce schéma décrit La macroautophagie : c’est une voie majeure du catabolisme

lysosomal conservée chez les eucaryotes Sur le plan cellulaire, l’autophagie se

décompose en trois étapes :

1. formation d’une vacuole initiale (autophagosome) qui séquestre le matériel

cytoplasmique (macromolécules et organelles) généralement de manière non

sélective,

2. maturation de l’autophagosome en une vacuole dégradative,

3. fusion avec le lysosome.

Suite à un stress, la formation de l’autophagosome, est suivie de l’amarrage et de la

fusion à la vacuole ou au lysosome puis d’une dégradation et d’un recyclage du

chargement du corps autophagique. Figure adaptée de (Klionsky & Emr, 2000).

23


6. Mécanisme commun entre l’autophagie, l’apoptose et la nécroseLes mitochondries semblent jouer un rôle clef dans le processus apoptotique ( Gross et al., 2007) en utilisant les pores formés par les membres de la famille Bcl-2.

Figure 15 : Schéma de la trilogie de la mort.

Il est intéressant de noter que malgré les différences marquées entre les formes de

mort cellulaire, il semble qu’elles impliquent un mécanisme commun, soit

l’induction transitoire de la perméabilisation de la membrane mitochondriale, mais

à des degrés différents. Lorsque seulement quelques mitochondries deviennent

perméables, l’activation de l’autophagie conduit à la destruction lysosomale des

mitochondries affectées et à la réparation de la cellule. Lorsque plusieurs

mitochondries sont impliquées, la perméabilisation mitochondriale commence à

promouvoir l’apoptose, peut-être lorsque le mécanisme de l’autophagie devient

inadéquat pour contenir le cytochrome c et les autres facteurs pro-apoptotiques

relâchés de la mitochondrie. Finalement, lorsque la perméabilisation mitochondriale

implique toutes les mitochondries de la cellule, la quantité d’ATP devient

profondément réduite et la mort cellulaire nécrotique s’ensuit rapidement. Cette

manière graduelle de fonctionner permet à la cellule d’abord de promouvoir la

réparation, ensuite la réabsorption cellulaire et finalement la détérioration massive

et non sélective des tissus (Rodriguez-Enriquez et al., 2004).(Fig. 15)

24


Figure 16 : TNF : apoptose ou autophagie ?

7- Les régulateurs de la mort cellulaire programmée

Dans les années 80, Horvitz et ses collaborateurs identifient les premiers gènes

spécifiques à la mort cellulaire programmée, soit les gènes ced-3, ced-4 et ced-9,

chez le nématode Caenorhabditis elegans (Ellis & Horvitz, 1986). Ils découvrirent

que la protéine ced-9 est un inhibiteur de l’apoptose, la protéine ced-4 est une

molécule adaptatrice pro-apoptotique et la protéine ced-3 est une cystéine protéase

responsable de la dégradation de plusieurs protéines pendant la mort cellulaire

programmée.

7.1 La famille Bcl-2

Chez les mammifères, le processus de la mort cellulaire programmée a été attribué,

entre autres, à un ensemble de protéines impliquées dans la réception et dans la

transmission du message de mort cellulaire. Parmi ces protéines régulatrices, les membres de la famille Bcl-2 jouent un rôle important soit en activant ou en

25


supprimant la mort cellulaire programmée. On note alors les pro-apoptotiques et

les anti-apoptotiques en fonction de leur effet respectif d’activateurs et de

répresseurs. Le gène Bcl-2 (b-cell lymphoma) a été le premier régulateur de

l’apoptose à être identifié chez l’humain. Il a été découvert à la jonction de la

translocation chromosomique t(14;18) retrouvée chez des cellules B cancéreuses

(Cleary et al., 1986). La surexpression de bcl-2 résultante de cette translocation

empêche les cellules de mourir normalement ce qui explique la prolifération

excessive des cellules et la formation d’une tumeur (Vaux & Korsmeyer, 1999).

Quelques années plus tard, la protéine Bax (Bcl-2-associated protein X) a été isolée

grâce à sa capacité de former un hétérodimère avec la protéine Bcl-2 (Oltvai et al.,

1993). Lorsque surexprimée, la protéine Bax accélère l’apoptose et inhibe l’effet

protecteur conféré par la surexpression de Bcl-2.

Depuis ce temps, au moins trente protéines de cette famille ont été caractérisées

chez les animaux grâce à leur homologie structurale. En effet, tous les membres de

cette famille possèdent un à quatre domaines conservés BH (Bcl-2 homology) compris dans des hélices α. Les membres de la famille Bcl-2 se divisent en trois

groupes : les anti-apoptotiques (qui favorisent la survie des cellules)

multidomaines comme Bcl-2 et Bcl-XL, les pro-apoptotiques (qui induisent la mort

des cellules) multidomaines, comme Bax et Bak, et les pro-apoptotiques qui ne

possèdent que le domaine BH-3, comme Bad et Bid. La plupart des membres de

cette famille peuvent former des homo- ou hétérodimères entre eux par le domaine BH-3. L’équilibre entre les protéines anti-apoptotiques et pro-apoptotiques

via leurs interactions mutuelles permet donc de déterminer le sort de la cellule

(Bortner & Cidlowski, 2002).

La plupart des membres anti-apoptotiques possèdent les domaines BH1, BH2, BH3

et BH4 alors que les pro-apoptotiques ne possèdent que les domaines BH1, BH2 et

BH3. Le domaine BH4 ne peut à lui seul expliquer la fonction anti-apoptotique,

mais certaines des protéines anti-apoptotiques, telles que Bcl-2 et Bcl- XL, peuvent

se faire cliver leur domaine BH4 ce qui a pour effet des transformer en pro-

apoptotiques. BH-3 est le domaine le plus important, il peut, à lui seul, induire ou

inhiber l’apoptose en interagissant avec d’autres protéines. Cette liaison se fait soit

entre protéines pro-apoptotiques, soit avec le sillon hydrophobique formé par les

domaines BH1-3 des protéines anti-apoptotiques (Borner, 2003). Le domaine BH3

des pro-apoptotiques est différent de celui des anti-apoptotiques.

26


Figure 17 : Structure des protéines Bcl-2 et Bax

La protéine Bcl-2 possède les quatre domaines BH et un domaine

transmembranaire (TM). On peut voir la localisation des neuf hélices de Bcl-2, dont

les hélices α5 et α6 qui forment un pore dans la membrane. La protéine Bax

possède uniquement les domaines BH1-BH3 et le TM. Les hélices α5 et α6 de Bax

peuvent aussi former un pore. Tirée de (Ouellet, 2004).

En général, les membres de la famille Bcl-2 sont composés de deux hélices

hydrophobes (α-5 et α-6) et d’environ sept hélices amphipatiques. La plupart des

membres de la famille possèdent aussi un domaine transmembranaire (TM) au

niveau de l’extrémité C-terminale permettant une localisation aux membranes de la

mitochondrie et du réticulum endoplasmique où se situe leur action (Fig. 17).

L’équipe de Muchmore a observé une ressemblance entre la structure

tridimensionnelle de Bcl-XL et celle des toxines bactériennes comme la toxine de la

diphtérie et de la colicine (Muchmore et al., 1996). Par la suite, des recherches ont

démontré qu’en effet, certains membres de la famille Bcl-2, comme Bax, Bcl-XL et

Bcl-2, sont capables de former des canaux ioniques à l’intérieur d’une membrane

lipidique in vitro (Antonsson et al., 1997; Minn et al., 1997; Schendel et al., 1997).

Ces pores se forment à partir des hélices α-5 et α-6. Ces deux hélices

hydrophobes sont essentielles pour la fonction cytoprotectrice de Bcl-2. Cependant,

même si ces hélices sont nécessaires, elles sont insuffisantes pour l’activité anti-

apoptotique de Bcl-2. Tandis que, chez la protéine Bax, une délétion ou une

substitution des hélices α-5 et α-6 réduit, mais ne supprime pas l’induction de

l’apoptose dans les cellules humaines (Matsuyama et al., 1998). Il est intéressant de

noter que la régulation exercée par les membres de la famille Bcl-2 peut se faire via

des interactions protéine-protéine pour lesquelles les domaines BH sont impliqués

et/ou via la structure de la protéine par la formation de pores.

La capacité des membres de la famille Bcl-2 à former des pores dans la membrane

revêt un intérêt fonctionnel puisque l’action des protéines Bax et Bcl-2 peut se

27


situer au niveau de la régulation du passage des ions ou des macromolécules au

travers d’une membrane ce qui peut conduire à la survie ou à la mort cellulaire.

Suivant cette ligne de pensée, les travaux de Antonsson ont montré que les

caractéristiques des canaux pro- et anti-apoptotiques, telles que la conductance et

la sélectivité des ions, semblent différer. Ils ont même démontré que les pores

formés par la protéine Bax laissent échapper des molécules à des pH neutres et

acides alors que la protéine Bcl-2 peut agir comme antagonisme seulement à un pH

physiologique (Antonsson et al., 1997). Ainsi, les stress importants qui conduisent à

une acidification du cytoplasme solliciteraient davantage l’activité du canal formé

par Bax ce qui conduirait à la mort de la cellule afin de protéger l’ensemble de

l’organisme ou de la population contre cet effet toxique. Un pH physiologique

permet aussi à la protéine Bax d’induire la mort cellulaire programmée, mais son

action peut être neutralisée par celle de la protéine Bcl-2.

Chez la souris, la délétion des membres de la famille Bcl-2, tels que Bcl-2, Bcl-XL et

Bax, a démontré que ces protéines sont importantes et qu’elles jouent un rôle non

redondant dans le développement et le maintien de l’homéostasie cellulaire (Vaux &

Korsmeyer, 1999). Wei et son équipe ont démontré que les souris présentant une

double suppression quant aux protéines Bax/Bak sont résistantes à l’apoptose

induite par de nombreux signaux tels qu’une exposition à des radiations

ultraviolettes ou une carence en facteur de croissance ce qui confirme que Bax est

primordiale dans le processus de l’apoptose (Wei et al., 2001). Cependant, Shimizu

et ses collaborateurs ont démontré que, suite à un stress induisant la mort, ces

cellules subissent plutôt une mort non-apoptotique. Cette mort peut être réprimée

par les inhibiteurs de l’autophagie qui dépendent des protéines de l’autophagie

telles que Beclin 1. Beclin 1 est une protéine animale capable de se lier avec Bcl-2

et Bcl-XL. Ces résultats indiquent que la famille Bcl-2 n’est pas seulement impliquée

dans la régulation de l’apoptose, mais aussi dans le contrôle de l’autophagie

(Shimizu et al., 2004), mais le rôle exact des membres de la famille Bcl-2 au niveau de l’autophagie demeure une énigme.

La protéine Bax

La protéine Bax, dont la taille est de 21kDa, induit l’apoptose suite à un stress

apoptotique en se déplaçant du cytosol vers la membrane externe de la

mitochondrie. La structure de Bax est très semblable à celle des protéines anti-

apoptotiques. Comme Bcl-2 et Bcl-XL, les domaines BH1-BH3 de Bax forment une

pochette hydrophobique à l’intérieur de laquelle un peptide BH3 d’une autre

protéine peut venir se lier. L’extrémité N-terminale de Bax est non structurée, mais

28


il est possible d’y déceler la présence d’un domaine BH4 dégénéré semblable à celui

des anti-apoptotiques. La principale différence entre Bcl-XL et Bax est retrouvée

dans le domaine BH3. Chez Bax, le domaine BH3 est moins entassé contre le cœur

hydrophobique ce qui permet à ce domaine de pivoter autour de cet axe pour

exposer ses résidus loin du cœur hydrophobique. Les résidus ainsi exposés sont

rendus disponibles pour se lier avec le sillon hydrophobique des anti-apoptotiques

(Borner, 2003). Cette flexibilité du domaine BH3 est cruciale pour les protéines pro-

apoptotiques puisque l’insertion du domaine BH3 de Bax à la place du domaine

BH3 de Bcl-2 convertit cette protéine anti-apoptotique en pro-apoptotique malgré la

présence du domaine BH4 (Hunter & Parslow, 1996).

7-2 Les caspases

L’activité principale des membres de la famille Bcl-2 est de contrôler l’activation ou

l’inhibition de la cascade des caspases. Les caspases sont une famille de cystéine protéases spécifiques à la mort cellulaire programmée clivant après un résidu d’acide aspartique. Chez l’homme et la souris, environ 14 caspases ont été

identifiées. Les caspases se divisent en deux groupes : les initiatrices qui

comprennent les caspases-2, -8, -9, -10 et -12 et les effectrices qui englobent les

caspases-3, -6 et -7. Les caspases initiatrices sont caractérisées par un long pro-

domaine en N-terminal qui est peu conservé. Ce site d’interaction protéine-protéine

est nommé DED (Death Effector Domain) pour les caspases-8 et -10 et CARD

(Caspase Activation and Recruitment Domain) pour les caspases-2 -9 et -12

(Degterev et al., 2003). Ce site d’action spécifique aux caspases initiatrices leur

permet d’être activé par d’autres molécules et d’activer à leur tour les caspases

effectrices.

Figure 18 : les C Asp ases

29


Les caspases sont présentes sous la forme d’une proenzyme (30-50kDa) inactive

dans toutes les cellules animales. Chaque pro-caspase est constituée d’un pro-

domaine en N-terminal, d’une grosse (20kDa) et une petite sous-unité (10kDa). Le

clivage et l’hétéro-dimérisation de deux grosses et de deux petites sous-unités

provoquent l’activation de la caspase. De plus, toutes les caspases possèdent la

séquence QACXG qui est un site actif conservé (Orrenius, 2004). Les caspases

initiatrices s’activent par elles-mêmes lors de la réception d’un signal apoptotique

ou à l’aide d’une liaison avec une autre molécule telle que l’apoptosome. Par la

suite, les caspases initiatrices activent les caspases effectrices qui à leur tour

activent d’autres caspases initiatrices ou clivent plusieurs protéines structurales

nécessaires au maintien de la structure de la cellule.

Près de 100 substrats des caspases ont été identifiés. Ces cibles se séparent en six

catégories : les protéines directement impliquées dans la régulation de l’apoptose

telles que Bcl-2 ou Bid, les protéines régulant la traduction du signal apoptotique

telles que les kinases, les protéines structurales du cytosol et du noyau telles que

les actines, les protéines requises pour les réparations cellulaires, les protéines

régulatrices du cycle cellulaire et les protéines impliquées dans certaines

pathologies humaines. Leur potentiel pro-apoptotique nécessite un contrôle strict

afin de maintenir les cellules saines en vie. Pour ce faire, il existe des inhibiteurs de

caspases tels que p35, CrmA et l’inhibiteur de protéines apoptotiques (IAP). p35 est

une protéine qui prévient l’activité des caspases en se liant aux enzymes cibles de la

protéase. En présence des caspases actives, une coupure intramoléculaire s’effectue

à des sites spécifiques par la p35 qui demeure liée à celles-ci. CrmA est l’unique

membre de la famille serpine qui peut inhiber l’action des cystéine protéases

(caspases) et des sérine protéases. L’inhibiteur de protéines apoptotiques (IAP) est

un régulateur physiologique de la mort cellulaire très important puisque très

conservé. (Bortner & Cidlowski, 2002; Degterev et al., 2003). Mais Smac/DIABLO

(Smac pour la protéine humaine, et DIABLO pour la protéine murine) et Omi/HtrA2

sont également des protéines qui résident en temps normal dans la mitochondrie.

Lorsque survient un stress apoptotique dans la cellule, ces protéines sont larguées

dans le cytosol. Contrairement au cytochrome c dont le rôle est d’activer la

procaspase-9, Smac/DIABLO a comme tâche d’inhiber les IAP dans la cellule. Les

IAP sont des protéines inhibitrices des caspases. Smac/DIABLO participe donc

indirectement à l’activation des procaspases, en empêchant leurs inhibiteurs de

30


faire leur action et en envoyant même certaines IAP vers le protéasome pour la

dégradation. [ Fig.: 19]

Figure 19: Voie des caspases

8- Apoptose et pathologies

Les maladies auto-immunes correspondent, du reste, à un déficit de suicide :

certains facteurs empêchent l'autodestruction des cellules défensives qui prolifèrent

alors et se retournent contre l'organisme.

Différemment, mais selon le même schéma, l'EPO pris par certains sportifs ne

fabrique pas des globules rouges; il contient simplement des produits qui les

empêchent de se tuer naturellement.

Le contrôle de la production d'exécuteurs qui vont permettre à la cellule de s'auto-

détruire, le contrôle de la production de protecteurs qui vont empêcher le suicide, et

le contrôle de la production d'outils permettant aux cellules survivantes de manger

les mortes ; chez l'homme, chacune des trois tâches est contrôlée par 15 gènes, ce

qui laisse du choix. Certaines maladies sont dues à la disparition anormale et

31


excessive de cellules. Par exemple, la maladie d'Alzheimer, ou celle de Parkinson. On pensait jadis que la disparition était due à l'agression des cellules

nerveuses par diverses substances. En réalité, il semble bien s'agir d'un excès de

suicide. C'est l'anomalie de l'environnement qui entraîne le suicide, certes, mais les

cellules ne sont pas détruites directement par un facteur extérieur. Dans le cas

d'accidents vasculaires cérébraux humains, le manque d'oxygène n'empêche pas

la cellule de survivre comme on le croyait, mais il exige le suicide.

8-1 HIV : Chronique d’une mort programmée Le virus de l’immunodéficience humaine VIH a pour cible principale les

lymphocytes T CD4+ (acteurs essentiels à la réponse immunitaire cellulaire et

humorale T dépendante). Leur nombre dans le sang décroît progressivement au

cours du développement de la maladie jusqu’à atteindre une concentration critique

<200/mm3 ne permettant plus à l’organisme infecté de lutter contre les infections

opportunistes.

Pourtant, au cours de la primo-infection la réponse immunitaire est initiée

classiquement : réponse CTL médiée par les CD4 accompagnée d’une réponse

humorale avec production d’anticorps neutralisants. Rappelons à ce sujet que la

réponse CTL est une réponse apoptotique médiée par des granules contenant des

granzymes.

Les granzymes sont des enzymes protéolytiques à sérine contenues dans des

granules lytiques des T cytotoxiques et des NK . Elles coupent leur substrat au

niveau de résidus aspartate. Il en résulterait l’activation de la p34cdc2 protéine

kinase qui régule l’activité d’une cycline du cycle cellulaire.

Pourquoi cette réponse ne permet pas d’éliminer le virus et encore moins d’en

contrôler sa réplication ? ! That is the question !

C’est là que commence le drame Shakespearien….

Acte1

Chronique d’une mort programmée : apoptose des lymphocytes T CD4+.

A partir du moment de l’infection par le VIH, les lymphocytes CD4 diminuent

inexorablement deux théories s’affrontent : soit les LyT CD4+ se renouvellent

rapidement lorsqu’ils sont stimulés par la réplication virale. Par jour, on estime le

nombre Ly T CD4 produits et détruits à 2x109. et leur durée de demi-vie serait de

32


1.6 j, soit le turn-over n’est pas augmenté pendant l’infection mais le

renouvellement serait défectueux.

Acte2

L’effet cytopathogène du VIH ne se limite pas aux cellules infectées. La proportion

de cellules infectées (0.1 à 1 %) par le VIH est très inférieure à celle des lymphocytes

en apoptose (10 à 50 %) parmi lesquels on compte des T CD4 mais aussi des T CD8

et des B… Cette observation est vraie in vivo dans les ganglions où de plus les CFD

sont-elles aussi touchées.

A cela s’ajoute des phénomène d’autophagie décrits :

Le contact avec CXCR4 des protéines d’enveloppe du VIH-1, exprimées à la surface

de cellules infectées, induit l’apoptose des cellules T CD4 non infectées. (Fig.20)

L'autophagie est induite dans les lymphocytes T CD4 non infectés après contact

avec les protéines d’enveloppe exprimées à la surface de cellules, et celle-ci est

nécessaire à l’induction de l’apoptose. Le blocage de la cascade apoptotique par un

inhibiteur général des caspases n’inhibe pas l’autophagie. De plus, la mort

cellulaire induite par les protéines d’enveloppe du VIH-1 n’est pas totalement

inhibée, indiquant que les lymphocytes T CD4 peuvent mourir par autophagie

lorsque la voie des caspases est bloquée. Cette découverte ajoute un niveau de

complexité aux mécanismes activés dans le lymphocyte T CD4 non infecté par les

protéines d’enveloppe du virus et conduisant à sa destruction. L’étude des voies de

signalisation conduisant à l’autophagie et articulant le passage entre autophagie et

apoptose permettra, à terme, de proposer de nouveaux outils thérapeutiques

agissant directement sur ces voies de mort.

Figure 20 : impact du VIH sur une cellule cible

33


8-2 Apoptose et cancer

Le cancer est la situation de la cellule qui refuse de s'auto-détruire. Le cancer ne

vient pas de ce que la cellule se multiplie trop (heureusement qu'il existe une

multiplication des cellules, nécessaire à la survie et à la réparation de l'organisme),

mais de ce qu'elle devient incapable de s'auto-détruire en présence des signaux

habituels. De fait, une anomalie génétique quelconque les empêche de se tuer.

Hanahan et Weinberg ont suggéré en 2001 que 6 altérations dans la physiologie

cellulaire étaient requises pour soutenir une croissance maligne :

-autosuffisance en signaux de croissance,

-insensibilité aux signaux anti-croissance,

-inhibition de l’apoptose,

-potentiel réplicatif illimité,

-angiogénèse soutenue et

-invasion tissulaire et métastase.

Or, la chimiothérapie, la radiothérapie ne tuent pas ces cellules , elles les forcent

à se tuer elles-mêmes. Il serait d'ailleurs intelligent d'entraîner par des

médicaments le suicide, non pas des cellules tumorales, mais celui des cellules

normales exploitées par les tumeurs : les cellules des vaisseaux sanguins qui

nourrissent la tumeur. Car chaque cellule cancéreuse, dans une même tumeur, est

un cas d'espèce, ce qui présente au total une multitude innombrable d'anomalies

génétiques, difficiles à combattre de front. Il est donc plus sensé de combatte des

cellules nourricières, normales, et à peu près identiques.

Les suppresseurs de tumeurs sont des gènes qui, lorsqu’ils s’expriment

normalement dans la cellule, contribuent à l’élimination des tumeurs puisqu’ils

agissent sur la répression du cycle cellulaire et sont impliqués dans l’induction de

l’apoptose. Lorsqu’ils sont mutés, ils se comportent comme des allèles récessifs, ce

qui implique que les deux allèles doivent être mutés pour que la cellule soit en

danger, et c’est la perte de fonctionnalité de ce gène qui est dommageable pour la

cellule. Deux exemples de suppresseurs de tumeurs sont le gène du rétinoblastome

(Rb) et la p53.

Le gène p53 (oncosuppresseur) code pour une nucléophosphoprotéine activateur

transcriptionnel des gènes jouant un rôle important dans la prolifération cellulaire,

34


notamment comme inhibiteur du cycle cellulaire en phase Gl et comme inducteur

de la différenciation cellulaire.

La protéine p53 a le surnom de gardien de l'intégrité du génome. En effet en

présence d'altérations de l'ADN, cette protéine provoque l'arrêt du cycle cellulaire en

phase Gl en régulant la transcription d'un autre gène, CIP 1/WAF1, qui code lui-

même pour la protéine p2l. Cette p2l constitue un inhibiteur de la kinase cdk2 (qui

permet normalement l'initiation de la réplication de l'ADN). P53, en provoquant

l'arrêt du cycle en phase G1,permet aux cellules de réparer les dommages de l'ADN

avant qu'elles ne s'engagent vers la réplication. Si les lésions sont trop importantes

et les réparations insuffisantes, la p53 favorise l'élimination de la cellule en

orientant le métabolisme cellulaire vers l'apoptose par inhibition, sans doute, de

bcl-2 (par le biais de la transcription du gène bax). L'expression anormale de p53

empêche la cellule de se suicider. Les mutations de la p53, responsables de la non-

fonctionnalité de la protéine et de son accumulation, constituent l'anomalie génique

la plus courante des tumeurs de l'homme. Ces mutations permettent aux cellules

tumorales de franchir le point Gl, sans avoir corrigé les lésions de l'ADN. (Fig. 21)

Figure 21 : régulation et p53

Par opposition aux suppresseurs de tumeurs, les oncogènes sont des gènes qui, à

l’état normal, influent positivement sur la croissance et la division cellulaire; ils

sont alors appelés proto-oncogènes. C’est lorsqu’ils sont mutés qu’ils prennent la

nomination d’oncogène. Contrairement aux suppresseurs de tumeurs, la trop

grande présence ou activité de leurs produits sont dangereuses pour la cellule. La

35


mutation d’un seul allèle est suffisante pour amener le danger. Plusieurs

oncogènes ont été étudiés, notamment E2F, Ras, c-myc.

Le proto-oncogène c-myc est donc nécessaire au bon fonctionnement de

l’organisme. Malheureusement, l’oncogène c-myc peut y être délétère en étant

impliqué dans la cancérogénèse. Une activité soutenue de cet oncogène peut être

détectée dans environ 70% des cancers humains. La dérégulation de c-myc peut

être la conséquence de plusieurs mécanismes : translocation chromosomique,

amplification, traduction accrue de la protéine, plus grande stabilité de la protéine,

mais le plus souvent, c’est la surexpression de c-Myc

suite à des altérations dans les voies de signalisation qui contrôlent son expression

à la base de cette activation incontrôlée (Nilsson et Cleveland, 2003). Généralement,

c’est l’hyper-prolifération et la non différenciation des cellules qui sont associées

au potentiel néoplasique de c-Myc.

c-myc possède une dualité intrigante : il capable d’induire la prolifération

cellulaire,et il sensibilise énormément les cellules à l’apoptose induite par une

grande variété de stimuli (Nilsson et Cleveland, 2003).

Parmi ceux-ci on retrouve l’hypoxie, la déprivation en facteurs de croissance, le

choc thermique, les infections virales, l’interféron, le TNF-α, le récepteur Fas, les

dommages à l’ADN et divers agents chimiothérapeutiques. (Henriksson et al, 2001).

La sensibilisation à l’apoptose induite par c-Myc est un mécanisme de protection

présent pour éliminer les cellules contenant de trop grandes quantités de cette

protéine et donc potentiellement dangereuses pour l’organisme. Cette apoptose

requiert l’interaction de c-Myc avec Max et

leur liaison à l’ADN. Les fonctions de transactivation et de transrépression de gènes

cibles sont également impliquées. La sensibilisation à l’apoptose induite par c-Myc

est donc médiée via l’activité transcriptionnelle de la protéine, en induisant ou

réprimant 647 gènes cibles.

Le cisplatine (cis-diaminedichloroplatinum II) est un des médicaments les plus

utilisés dans la lutte contre le cancer. Il est utilisé en clinique depuis 1978 pour

traiter une variété de cancers dont celui des ovaires, des testicules et naso-

pharyngés. Une concentration sérique efficace de l’ordre de 35µM est objectivée lors

d’un traitement avec cette drogue (Dimanche-Boitrel et al, 2005).

Le cisplatine tue les cellules en causant des lésions dans l’ADN. Lorsqu’il entre dans

la cellule, ses deux atomes de chlore subissent une attaque nucléophile et sont

remplacés par des molécules d’eau. La molécule devient ainsi chargée positivement

et réactive. Elle réagit avec l’ADN pour créer des liens intra brins et inter brins. Cela

36


induit des distorsions dans l’hélice d’ADN et ces défauts amènent le blocage de la

réplication de l’ADN et/ou de la transcription. De plus, la reconnaissance de ces

défauts enclenche plusieurs voies de signalisation cellulaire dont celle de l’apoptose.

C’est par l’induction de l’apoptose dans les cellules cancéreuses que le cisplatine

exerce son effet thérapeutique L’apoptose induite par le cisplatine dans les cellules

possédant une dérégulation de c-Myc emprunte la voie intrinsèque et requière

l’activation de Bax (Desbiens et al, 2003). Cette apoptose dépend en partie de

l’activation de la MAP kinase p38, (Deschesnes et al, 2001) mais aussi du relargage

du cytochrome c au niveau de la mitochondrie.

Figure 22 : Cisplatine et ADN

Résumé traitements anti-cancéreux et apoptose :(Meng et al, 2006)

Les substances en cours d’évaluation afin d’induire une mort cellulaire apoptotique

doivent préférentiellement cibler les cellules cancéreuses par rapport aux cellules

normales. On note d’une part celles qui augmentent ou induisent les signaux de

mort par le récepteur Fas,TNFR1,DR3, TRAIL R1 et R2 (DR4 et DR5),DR6 qui

possèdent les DD (death domain) et d’autre part celles qui facilitent l’activation de la

voie mitochondriale (intrinsèque).S’agissant des récepteurs (fig 23), l’Ac agoniste de

DR4 montre un intérêt dans le sens où son absence de toxicité (phase I) et ses 8 %

de réponse obtenus sur 40 patients (phases II) avec des LNH en rémission ou

37


réfractaire sont un espoir car 50% des lignées des cellules humaines sont

résistantes à l’induction de TRAIL.

On note aussi que des inhibiteurs de la cyclooxygénase 2 ont une action

chimiopreventive et thérapeutique contre le cancer colorectal, en sensibilisant les

cellules à Fas-L et TRAIL.Dans des cellules de lignées leucémiques myéloïdes on

observe une augmentation de l’apoptose en induisant la déphosphorylation de

FADD.

La rapamycine peut dans des cellules de glioblastomes moduler l’action de c-FLIP

en le diminuant ,or c-FLIP est un inhibiteur de la voie TRAIL.

Figure 23 : Stratégie pour augmenter ou induire les signaux impliquants les récepteurs de mort

Concernant les activateurs de la voie mitochondriale, (fig 24) la stratégie antisens

consiste à cibler les 6 premiers codons de Bcl-2 afin de les inactiver. Une étude de

phase III s’est montrée décevante comparée à d’autres thérapies utilisée

seules.(seulement 1.2 mois en plus de survie , non significatif sur le plan statistique

mais qui peut dire ce qu’il en est sur le plan humain de ce dernier mois ?…)Une

38

c-FLIP

Apoptose

DED/ Procaspase8/10 8/10

+

TRAIL, TNF, FasL

TRAIL R1/R2 (DR4/DR5) ou Fas, TNFa R1, DR3 ou DR6 contient DD

DED / FADD

Bid tBidPro casp3 casp 3

1-Ligation à ces Rcpt *AMG951 RecHu TRAIL*HGS ETR1 Ac agoniste de DR4*HGS ETR2 Ac agoniste de DR5

Caspase8/10 8/10 8/10

2-Up régulation de DR4, DR5

*MG132*Inhibiteur cox2*Inhibiteur de protéasome bortezimib

3-déphosphorylation du FADD*MEK Inhibiteur Cl-1040*PD098059

P

4-Augmenter le recrutemnt de procasp 8 par le FADD*MG132

5-Down régulation de c-FLIP*inhibiteur mTOR rapamycine*Inhibiteur de protéasome bortezimib


alternative est d’utiliser les protéines ayant un domaine BH3 seul pour mimer BH3

et se fixer sur le récepteur BH3 des membres de Bcl-2 antiapoptotiques afin de les

inactiver. Enfin, la protéine inhibitrice de l’apoptose liant le chromosome X peut

être neutraliser par un antagoniste qui inhibe Bcl-2.

Figure 24 :Anticancer :la facilitation de la voie mitochondriale

8-3 Apoptose et ischémie

Une ischémie de 6 h des cultures neuronales suivie d’une reperfusion pendant 48h,

provoque une apoptose des cellules qui peut être prévenue par une surexpression

du gène codant pour Bcl-2. (Petit rappel pour faire surexprimer le gène, les cellules

sont transfectées avec des lipidosomes 3µl et un plasmide 2µg contenant l’ADN

d’intérêt.) (Hong et al, 2008). Concernant l’apoptose, l’interaction entre le stress du

RE et la voie mitochondriale apoptotique est mis en évidence. Cependant la

surexpression de Bcl-2 pourrait supprimer l’apoptose neuronale conséquente à une

39

Bcl-2, Bcl-X

l,

Mcl-1

Neutralisation Bcl-2 par Bax/Bak

Apoptose

Neutralisation Bcl-2 par prot.BH3

XIAPX chrom linked inhb of apop

-Cyt. c + APAF-1 + dATP: apoptosome

Bax / Bak cytoplasmique

+

TRAIL ou TNF ou FasL

TRAIL R1/R2

Pro casp 9 casp 9Pro casp 8 casp 8Pro casp2,3 casp 2,3

1-Stratégie antisens par les ARNm.

2- Membres de la Famille Bcl-2: Antiapoptotique:agonistes ABT-737

3- XIAP antagonistes et relargage Neutralisation de Bcl-2


ischémie reperfusion en protégeant l’intégrité des mitochondries ce qui renforcerait

le rôle central joué par les mitochondries.

9- Mise en évidence de l’apoptose / nécrose.

Le programme apoptotique est caractérisé par certaines modifications

morphologiques : changement au niveau de la membrane plasmique, condensation

nucléaire et cytoplasmique, clivage contrôlé de l’ADN, atteinte mitochondriale.

9-1 Caractères morphologiques de l'apoptose

Les modifications morphologiques

Les modifications morphologiques sont nombreuses et se situent aussi bien

au niveau de la membrane, qu’au niveau du cytoplasme et du noyau, mais

sont seulement visibles totalement en microscopie électronique. (fig 25)

Figure 25 : ME de cellule en apoptose et corps apoptotique

L'apoptose concerne généralement quelques cellules isolées (à la différence de la

nécrose qui est massive et porte sur l’ensemble des cellules voisines).

Les modifications morphologiques nucléaires et cytoplasmiques au cours de

l'apoptose sont les suivantes :

* Au commencement les cellules s'isolent et perdent leurs jonctions cellulaires

(destruction des desmosomes), on assiste alors au lissage de la surface de la cellule.

* Ensuite la cellule se rétracte et on observe une diminution du volume cellulaire

ainsi qu’ un regroupement des organites cellulaires qui restent intacts en apparence

(contrairement à la nécrose). Les organites cellulaires, comme les mitochondries

peuvent migrer à un pôle du cytoplasme.

40


* La membrane cellulaire bien que conservant son intégrité et restant imperméable

aux colorants vitaux, prend un aspect irrégulier avec une surface convolutée.

* Enfin on assiste à une condensation de la chromatine en mottes qui s'accolent

ensuite le long de l'enveloppe nucléaire formant un croissant homogène marginal

dense. Le nucléole se désintègre. Puis le noyau prend un aspect très dense

homogène (aspect pycnotique) et se fragmente parfois. L'enveloppe nucléaire

disparaît et le cytoplasme se divise alors en fragments contenant des morceaux du

noyau et des organites cellulaires apparemment intacts, ces fragments formant

ainsi les corps apoptotiques de taille optimale pour être phagocytés par les cellules

environnantes. Cette élimination se fait très rapidement et n'est donc pas facilement

observée.

Comme ce processus naturel d'apoptose n'est généralement pas massif, touchant

quelques cellules progressivement, on utilise pour l'étudier, des agents inducteurs

d'apoptose (comme les glucocorticoïdes sur les thymocytes voir Travaux Pratiques

Immuno) provoquant une apoptose plus importante. La dégradation des corps

apoptotiques survient après phagocytose par des macrophages. Les granulocytes

neutrophiles n'interviennent pas. L'apoptose n'induit pas de réaction inflammatoire.

En effet, la dégradation des corps apoptotiques se fait dans le cytoplasme des

macrophages. A la différence de la nécrose, leur contenu cellulaire n'est pas déversé

dans le milieu. Il n'y a donc pas d'activation des protéases qui déclenchent la

nécrose.

COMPARAISON DE L’APOPTOSE AVEC LA NECROSE :

APOPTOSE NÉCROSE

Cellules souvent isolées Nombreuses Cellules

Cellules rétractées au Cellules gonflées contour irrégulier Conservation de son Perte de son intégrité intégrité membranaire membranaire ⇒ lyse cellulaire

Lysosomes intacts Libération d'enzymes lysosomales Absence d'inflammation Inflammation

41


9-2 Modification de la membrane plasmique

Plusieurs modifications de surface interviennent dans la phagocytose finale des

cellules apoptotiques par les macrophages :

• translocation des phosphatidylsérines en surface de la membrane plasmique

(Fig. 26)

Un procédé souvent utilisé en cytométrie en flux, utilise simultanément l'annexine

V fluorescente et l'iodure de propidium. Les cellules au début de l'apoptose fixent,

en présence de Ca++, l'annexine V au niveau des phosphatidyl-sérine transloquées

en surface. En revanche, leur noyau n'est pas marqué par l'iodure de propidium,

car à ce moment la membrane plasmique est imperméable au colorant. Ceci permet

de discriminer les cellules en apoptose des cellules nécrosées.

Figure 26 : marquage Annexin V /IP

42


9-3 Fragmentation de l’ADN Une autre technique de révélation du processus d'apoptose repose sur la

démonstration de la fragmentation de l'ADN.

La méthode TUNEL [fig. 27] est une application de la biologie moléculaire

permettant de repérer in situ les coupures de l'ADN. L'utilisation de la

déoxynucléotidyltransférase (Tdt, pour Terminal déoxynucléotidyl-transférase),

permet d'ajouter des désoxyribonucléotides aux extrémités 3' OH terminales de

l'ADN. Un système de révélation est associé à ces nucléotides (par exemple,

déoxyuridine biotinylée mise en évidence par un complexe avidine-peroxydase)

permettant de localiser les fragments d'ADN. Cette technique est nommée méthode

TUNEL ( pour Tdt-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling). Elle est applicable à

des coupes, à des étalements, à la cytométrie en flux.

Figure 27 : technique TUNEL

Une méthode qualitative permet de visualiser l’état de fragmentation de l’ADNAprès une lyse cellulaire, une extraction et une purification de l'ADN passé dans le surnageant, la migration électrophorètique de l’ADN dans un gel d'agarose fait apparaître l'aspect en "échelle" correspondant aux fragments multiples de 180 paires de bases. Une révélation par le SYBR gold donne le résultat suivant : [fig.26 ; 27]

43

3’OH 3’OH

+ TdT+ x-dUTP5’

Nombre de

Intensité de fluorescence

M1= % cellules avec ADN clivé

+ TdT+ x-dUTP

Sur coupe :MO Sur cellules en suspension: CMF


Figure 28 : Fragmentation inter-nucléosomale de l’ADN. Figure 29 :Photo d'un gel d' agarose

La fragmentation internucléosomale ou non de l'ADN est due à l'activation d'endonucléases non lysosomales puisque ces organites restent intacts pendant l'apoptose.Parfois l'apoptose ne s'accompagne pas de fragmentation internucléosomale de

l'ADN nucléaire. D'autres critères sont alors à prendre en compte tels que la

dégradation de l'ADN libérant des fragments de 50 à 300 kilobases visibles en ECP ou les modifications fonctionnelles des mitochondries.( ECP : électrophorèse en

champs pulsé sur gel d’agarose LMP pendant 18h de migration par technique

CHEF)

44

V.Chmielewski © TP2001

A1 A2 PM

100

200

300

400500

600700

pb


Une variante mesure par cytométrie en flux la quantité d'ADN des noyaux marqué

par l'iodure de propidium après perméabilisation des cellules. L'image obtenue, lors

de l'apoptose, est celle d'une hypoploïdie M1 due à la perte des fragments d'ADN

passés dans le cytoplasme au cours des lavages puis dans le surnageant. M1=Pic

sub-G1= cellules en apoptose [Fig. 28,30].

figure 30: QUANTIFICATION DES CELLULES EN APOPTOSE PAR CMF après ELUTION

45

Quantité d’ADN ≤ 2N Quantité d’ADN = 2N

LAVAGES = ELUTION DES FRAGMENTS

MARQUAGE DE L’ADN = Iodure de propidium ou SYTO13.

Clivage par une endonucléase activée qui coupe au hasard l’ADN entre les nucléosomes.

Cellule normale

PERMEABILISATION

Cellule en APOPTOSE

Pic sub-

G0/G

1

S G2

Intensité de fluorescence Syto13 ou IP

Nombre de cellules

Histogramme CMF/ V.Chmielewski © TP2001


Un procédé différent fait appel à des Ac monoclonaux spécifiques des ssDNA (ADN

dénaturé). Un noyau normal ne contient pratiquement pas de fragments dénaturés

d'ADN, or l'ADN des noyaux apoptotiques, même sans fragmentation nucléosomale,

est le siège d'une instabilité thermique en présence de MgCl2 à pH neutre. Ainsi,

seuls les noyaux des cellules en apoptose sont marqués par des Ac monoclonaux

spécifiques des ssDNA si les coupes ou les cellules sont chauffées au préalable

6min à 100°C en présence de 4,5mM de MgCl2.

9-4 Modifications des mitochondries :

L'augmentation de la concentration de Ca++ apparaît dès les premiers événements

qui accompagnent l'apoptose. Elle est rapide et prolongée. Les ions calciques sont

en partie extracellulaires puisqu'en milieu dépourvu de Ca++ les cellules ne

présentent plus d'apoptose.

Les mitochondries, bien qu'ayant un aspect pratiquement normal dans un premier

temps, perdent leurs capacités fonctionnelles notamment le pouvoir de synthèse de

l'ATP, car elles sont très précocement le siège d'une chute du potentiel

transmembranaire (∆Ψm ) par ouverture des pores de transition de la perméabilité

(Mitochondrial Permeability Transition pores (MTP) ou mégacanaux) de la

membrane interne de la mitochondrie. Il en résulte une augmentation de la

perméabilité aux molécules de PM inférieur ou égal à 1500 Da, alors que dans les

conditions normales la membrane interne de la mitochondrie est pratiquement

imperméable aux petites protéines ce qui crée un gradient électrochimique. Cette

propriété est utiliséeen utilisant des cations fluorescents (Rh123,DioOC6, JC-1)

capables de s’incorporer dans les mitochondries proportionnellement à leur ∆Ψm.

(Galluzzi et al, 2007) Les MTP jouent notamment un rôle déterminant dans

l'induction de l'apoptose par les radicaux libres de l'oxygène (RLO). Ainsi, sous

l'effet d’un stress oxydatif, les mitochondries subissent une transition de

perméabilité avec libération de Ca++, et sont le siège d'un gonflement important et

d'un découplage de la respiration mitochondriale. Les MTP sont au niveau de la

membrane interne des mitochondries des canaux sensibles à la ciclosporine qui, en

se liant aux cyclophilines (famille de protéines ubiquitaires qui en sont la cible

intracellulaire), ont la capacité de fermer les MTP.

46


Figure 31 : perméabilisation des mitochondries

Figure 32 : Utilisation du JC-1 Ce fluorophore émet en vert lorsqu’il est monomérique et en rouge lorsqu’il est agrégé d’où la discrimination en CMF en fonction de la concentration intra mitochondriale proportionnelle au ΔΨm

47

Fluo verte

Fluo rouge

Cellules apoptotiques

Cellules normales Contrôle valynom.


Bibliographie

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Livres : et même si la mort est devenue un tabou dans notre société prétendue évoluée ne soyez pas effrayé à l’idée de lire ces livres qui enrichirons votre culture et votre réflexion : Jean Claude Ameisen, La sculpture du vivant, Seuil, 1999, (Une vision philosophique de l’apoptose) 482 pages.

Jean Claude Ameisen, Danièle Hervieu-Leger et Emmanuel Hirsch, Qu’est ce que mourir ?, Le pommier, 2003 .

Emmanuel Hirsch, Apprendre à mourir, Grasset, 2008, Sortie le 7 octobre 2008 dans toutes les bonnes librairies, 126 p.

Le Pr Emmanuel Hirsch est Directeur de l'Espace éthique Assistance publique-Hôpitaux de Paris, et du Département de recherche en éthique, Université Paris-Sud 11 Réseau de recherche en éthique médicale, INSERM

Espace éthique/AP-HP CHU Saint Louis - 75475 Paris Cedex 10 Tél. 01 44 84 17 57/33 1 44 84 17 57 www.espace-ethique.org

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http://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.0050001

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LA TRILOGIE DE LA MORT - Freeatctoxicologie.free.fr/archi/apoptose_Chmielewski.pdfLa mort par apoptose est potentielle, la capacité à s'auto-détruire est programmée génétiquement