Pflanzenphysiologie

Praktikum Sommersemester 2019

Leitung: Dr. Jeannette Pfalz, Ute Holtzegel, Björn Grübler

1

Praktikum Pflanzenphysiologie

Sommersemester 2019 Zum Pflanzenphysiologischen Praktikum im Sommersemester 2019 werden Ihnen 7 Praktikums-komplexe in vier Praktikumstagen vorgelegt. Anhand der verschiedenen Komplexe soll Ihnen eine Wiederholung des in der Vorlesung gebotenen Stoffes ermöglicht werden. Die Literaturangaben sollen Ihnen eine Vorbereitung auf die durchzuführenden Versuche ermöglichen. Eine Praktikums-anleitung, wie die Ihnen vorliegende, kann nicht die erforderlichen theoretischen Grundlagen lie-fern. Das Anliegen und die Versuchsdurchführung müssen Ihnen vor Beginn des Praktikums be-kannt sein, da wir sonst Ihre Teilnahme nicht akzeptieren können. Einige Komplexe werden durch ein Gespräch mit einem zuständigen Tutor abgeschlossen. Während des Praktikums stehen Ihnen Betreuer zur Verfügung, deren Aufgabe auch darin besteht, Ihre Vorbereitung zu kontrollieren. Wir laden Sie ausdrücklich zu einem schöpferischen Umgang mit dem Praktikum ein: wenn Sie bestimmte Versuche im Rahmen der vorhandenen Möglichkeiten variieren wollen, so freuen wir uns darüber. Sprechen Sie das aber bitte mit uns ab. Das erste Praktikum beinhaltet die Komplexe 1 (Ernährung), 2 (Wachstum und Differenzierung) und 3 (Auxinwirkungen), das zweite Praktikum die Komplexe 4 (Phytohormone) und 5 (Pflanzen-inhaltsstoffe), das dritte Praktikum den Komplex 6 (Enzyme) und das vierte Praktikum den Komplex 7 (Photosynthese und Respiration. Die Langzeitversuche werten Sie bitte in eigener Regie im Ver-lauf des Praktikums aus. Die Tutorien beziehen sich auf folgende Themen: Ernährung, Wachstum, Differenzierung (1. Prak-tikumstag), Phytohormone (2. Praktikumstag), Pflanzliche Enzyme und Enzymologie (3. Prakti-kumstag) und Photosynthese (4. Praktikumstag). Zu Beginn des Praktikums bitten wir einige Stu-denten, das Prinzip einiger Versuche zu erklären. Dies dient der Kontrolle der individuellen Vorbe-reitung. Jeder der drei Praktikumsdurchläufe umfasst 45 Unterrichtsstunden. In jeder zweiten Woche fin-det jeweils 18 Uhr s. t. ein Institutscolloquium statt. Dort werden Probleme der Forschung darge-stellt, die sich auf die Arbeiten unseres Institutes beziehen. Wir laden Sie zur Teilnahme herzlich ein. Die Arbeit im Praktikum wird in Arbeitsgruppen aus jeweils 3 Studenten durchgeführt. Jede Gruppe erstellt ein Praktikumsprotokoll. Die Praktikumsprotokolle sind die Grundlage für die Bestätigung der erfolgreichen Teilnahme am Praktikum. Teile des Praktikums werden betreut von Dr. Jeannette Pfalz (Pflanzenphysiologie Jena). Viel Erfolg und Spaß Dr. Jeannette Pfalz; Email: jeannette.pfalz@uni-jena.de

2

INHALTSVERZEICHNIS

Seite

A. Allgemeines ....................................................................................................................... 3 Protokolle ..................................................................................................................................... 3 Literatur ........................................................................................................................................ 3 B. Versuche ................................................................................................................................. 5 Komplex 1 – Ernährung von Pflanzen ....................................................................................... 5

1.1 Biomonitoring .......................................................................................................................... 5

Komplex 2: Wachstum und Differenzierung ............................................................................. 8 2.1 Die Wirkung eines Herbizids - SAN 9789 (Norflurazon) .......................................................... 8

2.2 Ein klassisches Experiment zur Phytochromwirkung .............................................................. 9

Komplex 3: Multiple Auxinwirkungen ..................................................................................... 11 3.1 Untersuchungen an Coleussprossen - Krümmung der Sprossachse, Verhinderung des

Blattabfalls und Bildung von Adventivwurzeln .................................................................... 11

3.2 Induktion des Streckungswachstums von Maiskoleoptilsegmenten durch Auxin ................... 12

3.3 Selektive Herbizidwirkung ..................................................................................................... 13

Komplex 4: Wirkungen weiterer Phytohormone .................................................................... 14 4.1 Zwergmutanten der Erbse und ihre Normalisierung durch Gibberellinsäure ...................... 14

4.2 Einfluss von Abscisinsäure auf die Samenkeimung .............................................................. 15

Komplex 5: Pflanzliche Inhaltsstoffe ....................................................................................... 16 5.1 Quantitative Bestimmung von Gesamtproteinen ................................................................... 16

5.2 Ein Vorversuch zur pflanzlichen Molekularbiologie: Isolierung von DNA ............................... 18

5.3 Fett-Kohlenhydratumwandlung bei der Keimung fetthaltiger Samen ..................................... 20

5.4 Isolierung und Nachweis der Alkaloide des Schöllkrauts ....................................................... 22

Komplex 6: Pflanzliche Enzyme .............................................................................................. 24 6.1 Operationale Kriterien der Enzymaktivitätsbestimmung - Fallstudie Fumarathydratase ........ 24

6.2 Die kinetische Charakterisierung eines Enzyms - Fallstudie Peroxidase ........................... 26

6.3 Nachweis von Phosphatasen im Kartoffelpresssaft ........................................................... 28

6.4 Dissimilation von Speicherstärke durch Amylasen ............................................................. 30

Komplex 7: Photosynthese und Respiration ............................................................................... 32

7.1 Vergleich der Pigmente aus Chloroplasten und Chromoplasten ........................................ 32

7.2 Fluoreszenz von Chlorophyll in vitro und in vivo ................................................................ 34

7.3 CO2-Aufnahme bei C3- und C4-Pflanzen ........................................................................... 35

7.4 Demonstration und Messung des photosynthetischen Elektronentransports an isolierten

Chloroplasten .................................................................................................................... 37

Liste der im Pflanzenphysiologischen Praktikum verwendeten Pflanzen ............................ 39

3

A. Allgemeines

Protokolle

Schreiben Sie zu jedem Experiment ein Einzelprotokoll pro Gruppe.

Form und Inhalt:

Protokoll mit einem Computer schreiben.

Auf der ersten Seite unbedingt Kurstagzeitraum und Ihre Gruppennummer angeben.

Protokolle bitte mit Heftstreifen zusammen heften (keine Schnellhefter notwendig).

Jedes Protokoll sollte wie folgt gegliedert sein:

Einleitung: 5-6 Sätze als Grundlagenwissen zum Thema

Aufgabenstellung: 1-2 Sätze

Durchführung: nur falls abweichend vom Skript

Ergebnisse: Darstellung und Auswertung der Ergebnisse

o Originalmesswerte

o Vollständige Berechnungen

o Grafiken mit Beschriftung

o Abbildungen (Fotos)

Diskussion: Diskutieren Sie Ihre Ergebnisse (nicht ihre Erwartungen).

Abgabe:

Die Protokolle sind 2 Wochen nach dem letzten Kurstag bei den Betreuern abzugeben.

4

Literatur BUCHANAN/ GRUISSEM/ JONES. Biochemistry and Molecular Biology of Plants. Rockville, Ma-ryland, USA. 2000. KUTSCHERA, U.: Prinzipien der Pflanzenphysiologie. Spektrum Akademischer Verlag. 2002. KUTSCHERA, U.: Grundpraktikum zur Pflanzenphysiologie. Quelle & Meyer, Wiesbaden 1999. METZNER, H.: Pflanzenphysiologische Experimente. Fischer, Jena. 1982. WEILER, E, NOVER, L., NULTSCH, W: Allgemeine und molekulare Botanik. Thieme, Stuttgart. 2008. 1SCHOPFER, P.: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Einführung in die Methoden. Band I. Springer-Verlag, Berlin 1986. 2SCHOPFER, P.: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Einführung in die Anwendung. Band II. Sprin-ger-Verlag, Berlin 1989. 3SCHOPFER, P und BRENNICKE, A: Pflanzenphysiologie. 7. Auflage, Spektrum, 2010. STRASBURGER. Lehrbuch der Botanik. A. Bresinsky, C. Körner, J.W. Kadereit, G. Neuhaus, U. Son-newald. Spektrum Akademischer Verlag, 2008. TAIZ, L. und E. ZEIGER: Plant Physiology. Palgrave Macmillian, USA. 5th edition. 2010. (Besonders empfohlen für das Gesamtgebiet: 1-3)

1. Kurstag

5

B. Versuche

Komplex 1 – Ernährung von Pflanzen

1.1 Biomonitoring Literatur: Schopfer/ Brennicke; Kutschera Dieser Versuch hat über die mineralische Ernährung hinausgehende Bedeutung. Als Versuchs-pflanzen werden Kresse und Mais eingesetzt. Vorbereitung: Was für Mineralien brauchen Pflanzen? Welche Rolle spielen einzelne Elemente? Erklären Sie den Begriff „Biomonitoring“.

Materialien & Geräte: - Glaspipetten - Standzylinder 500 ml, 100 ml - Beschriftungsband - Glasstäbe - Samen - Vermiculit - Töpfe und Pflanzschalen

Chemikalien & Lösungen: - Stammlösungen und Ersatzlösungen (vgl.

Tabelle Pipettierschema im Text)

Durchführung: Jede Gruppe benötigt zwei Medien: Normal- und Mangelmedium. Es hat sich als günstig erwiesen,

wenn Sie als Gruppen kooperieren, indem Sie gleich die doppelte Menge an Vollmedien herstellen

(d.h. 1 Liter). Die Mangelmedien sind in jeder Gruppe individuell herzustellen (d.h. 500 ml).

Bitte legen Sie ca. 900 (für Vollmedium) bzw. 450 ml (für Mangelmedium) Reinstwasser in einen

Plastikzylinder vor und pipettieren Sie in der angegebenen Reihenfolge die Komponenten (siehe

Tabelle). Nach Zugabe aller Komponenten auf 1 L bzw. 500 ml und mit einem Glasstab umrühren.

Beschriften Sie die Pflanzgefäße (Gruppennummer und Normal-bzw. Mangelmedium) und befül-

len Sie diese mit Vermiculit. Anschließend werden die Gefäße entsprechend gegossen bis das Ver-

miculit sich vollsaugt. Pro Gefäß sind ca. 3 (Mais) bzw. 10 (Kresse) Samen auszulegen und mit

feuchtem Vermiculit zu bedecken, so dass keine Samen frei liegen. Stellen Sie die Anzuchten in das

Gewächshaus und beobachten Sie die Entwicklung Ihrer Pflanzen.

1. Kurstag

6

Tabelle: Pipettierschema für die Medienvarianten (Angaben ml/ 500 ml):

Stammlösungen Vollme-dium

Mangelvarianten

-N -P -S -K -Mg -Fe -Ca

KH2PO4 (1,0 M) 1 1 - 1,0 - 1,0 1,0 1,0

Ca(NO3)2 (3,5 M) 1 - 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 -

KNO3 (2,5 M) 1 - 1,0 1,0 - 1,0 1,0 1,0

MgSO4 (1,0 M) 1 1 1,0 - 1,0 - 1,0 1,0

H3BO3 (45,2 mM); MnCl2 (9,09 mM); Na2MoO4 (171,1 μM); ZnSO4 (695,5 µM); CuSO4 (400 µM)

1 1 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Fe (III) EDTA (5 mM) 1 1 1,0 1,0 1,0 1,0 - 1,0

Ersatzlösungen

KCl (2,5 M) - x x

CaCl2 (3,5 M) - x

MgCl2 (1 M) - x

NaH2PO4 (1 M) - x

NaNO3 (2,5 M) - x x

Na2SO4 (1 M) - x

Na2EDTA (17 mM) - x

Die in den Mangelvarianten fehlenden Gegenionen müssen durch die Ersatzlösungen in Form von Cl- oder Na+ äquimolar ersetzt werden. Bitte machen Sie sich zur Berechnung kundig und berech-nen Sie die mit Fragezeichen markierten Stellen für Ihre Ansätze v o r Beginn des Praktikums.

Tabelle: Eine Vorgabe zur Aufteilung auf die Gruppen: Gruppe Vollmedium -N -P -S -K -Mg -Fe -Ca

1 x x

2 x x

3 x x

4 x x

5 x x

6 x x

7 x x

Zur Auswertung am letzten Praktikumstag: Bitte beobachten Sie die Entwicklung Ihrer Pflanzen in jeder Praktikumswoche. Fotografieren Sie die Pflanzen. Zum Abschluss sind die Frischgewichte zu messen. Ebenfalls soll eine Bonitierung stattfinden, wobei besonders der Chlorophyllgehalt (wie grün sind die Pflanzen?) und der Ant-

1. Kurstag

7

hocyangehalt (wie rot sind die Pflanzen?) zu berücksichtigen sind. Beschreiben Sie in der schriftli-chen Auswertung die Bonitierungsergebnisse. Fügen Sie zusätzlich Abbildungen ein. Ähnlich umfassende Begutachtungen finden in der Pflanzenzüchtung statt und werden gewöhnlich als Bonitierung (lat. bonitas = gute Beschaffenheit, Güte), damit meint man eine visuelle Begut-achtung, bezeichnet.

1. Kurstag

8

Komplex 2: Wachstum und Differenzierung

2.1 Die Wirkung eines Herbizids - SAN 9789 (Norflurazon) Literatur: Schopfer II; Kutschera; Schopfer/Brennicke (dort weitere Hinweise) Vorbereitung: Wie wirkt Norflurazon? Welche Funktion haben Carotinoide?

Materialien & Geräte: - Kresse oder Radieschen - Vermiculit - Pflanzschalen - Beschriftungsband

Chemikalien & Lösungen: - Wasser mit und ohne Norflurazon (10 µM;

Molekulargewicht 269,1 g mol-1)

Durchführung:

- Arbeiten Sie in Gruppen (bitte absprechen): d.h. eine Gruppe zieht die H2O-Kontrolle an, die andere Gruppe die Pflanzschalen mit Norflurazon.

- Anzuchtschalen beschriften (mit Gruppennummer): Schwachlicht + H2O Schwachlicht + Norflurazon Starklicht + H2O Starklicht + Norflurazon

- Anzuchtschalen mit Vermiculit befüllen und entsprechend gießen bis es sich vollsaugt.

- 10 – 15 Samen pro Schale auslegen und mit feuchtem Vermiculit bedecken, so dass keine Samen frei liegen.

- Schwachlichtschalen abdecken (z.B. Haushaltspapier) und zusammen mit den Starklicht-schalen auf das Fensterbrett stellen.

- Der Versuch ist nach zwei Woche abzubrechen und auszuwerten.

Auswertung: Die Beschaffenheit der Blätter (grün bzw. ausgebleicht) und ihre Größe ist nach einer Woche zu bestimmen.

Arbeitszeit: 20 Minuten plus Auszählen nach einer Woche

1. Kurstag

9

2.2 Ein klassisches Experiment zur Phytochromwirkung Literatur: Kutschera; Schopfer/Brennicke Vorbereitung: Was sind Phytochrome? Funktion? Signaltransduktion? Erklären Sie Skotomorpho-genese und De-Etiolierung – Vergleiche verschiedener Entwicklungsstrategien.

Materialien & Geräte: - Lactuca-Achänen, Sorte „Grand Rapid“ - Rundfilter, Messgläser - Petrischalen - Teichfolie zum Verdunkeln - Dia-Projektoren mit Filtern für Rotlicht (R)

und dunkelrotes Licht (FR), schwaches Grün-licht

- Kisten zum Abdunkeln, Klebeband zum Be-schriften

- Kresse angezogen in Licht, Dunkelheit und Dunkelrotlicht

Chemikalien & Lösungen: keine

Durchführung: Teil 1: Keimung In 6 Petrischalen mit 3 Lagen autoklaviertem Filterpapier wird so viel Leitungswasser gegeben, dass darauf ausgelegte Achänen gerade noch nicht wegschwimmen (etwa 5 ml). In jede Schale werden 30 Achänen gleichmäßig verteilt ausgelegt. Die Achänen werden nach der Quellung sehr rasch lichtempfindlich. Schalen nun sofort nach der Aussaat in Teichfolie einpacken und für 1h - 2 h ins Dunkle stellen (Holzkiste verwenden)! Die Schalen werden danach mit folgenden 6 Programmen bestrahlt:

Ansatz 1: 2 min R + Dunkel Ansatz 2: 10 min FR + Dunkel Ansatz 3: 2 min R + 10 min FR + Dunkel Ansatz 4: 10 min FR + 2 min R + Dunkel Ansatz 5: Weißlicht (Tageslicht) Ansatz 6: Dunkel

Bitte kombinieren Sie bei der Bestrahlung alle Varianten einer Bestrahlungsart so, dass insgesamt möglichst wenig Bestrahlungszeit benötigt wird. Die Auszählung erfolgt nach einer Woche. Als gekeimt gilt eine Achäne, wenn die Radicula die Achänenwand durchbrochen hat. Auswertung: Die Keimprozente jeder Variante sind zu bestimmen und die Ergebnisse in Beziehung zum Phy-tochromsystem zu bringen (in Tabellenform).

1. Kurstag

10

Teil 2: Licht-abhängige Entwicklung - Phytochrome Durchführung: Vergleichen Sie morphologische Unterschiede bei Pflanzen aus unterschiedlichen Lichtbedingun-gen. Auswertung: Skizieren Sie ihre Beobachtung. Literatur: Schopfer I, Schopfer II, Kutschera

1. Kurstag

11

Komplex 3: Multiple Auxinwirkungen

3.1 Untersuchungen an Coleussprossen - Krümmung der Sprossachse, Verhinde-rung des Blattabfalls und Bildung von Adventivwurzeln

Literatur: Schopfer II; Schopfer/ Brennicke. Für das Thema Phytohormone ist zurzeit das entsprechende Kapitel in Taiz/Zeiger (5. Auflage 2010) unübertroffen. Vorbereitung: Wie wirkt Auxin? Bildung und Transport in der Pflanze?

Materialien & Geräte: - 3 Coleus-Pflanzen pro Gruppe - Schere - Spatel oder Streichhölzer - Beschriftungsband

Chemikalien & Lösungen: Auxin- und Wasserpaste: Die Pasten werden im Mör-ser durch inniges Vermischen gleicher Teile von (was-serfreiem) Wollfett und Wasser bzw. wässriger Auxin-lösung hergestellt. Lösungen bzw. Suspensionen 0,5 % IAA werden unter Vermittlung von wenigen Trop-fen Ethanol bereitet.

Durchführung: Teil 1: Induktion von Adventivwurzeln Um junge und ältere Internodien einer Pflanze von Coleus wird Auxinpaste gestrichen, als Kon-trolle dient Wasserpaste. Nach 3 Wochen wird der Versuch ausgewertet. Wenn Interesse besteht, so kann auch eine mikroskopische Analyse der Adventivwurzelbildung (Sprossquerschnitt) erfol-gen. Teil 2: Auxin-induzierte Streckungsbewegung der Sprossachse An jüngeren Sprossachsenabschnitten (z.B. Internodien) gut gegossener Coleus-Pflanzen wird Au-xinpaste einseitig aufgetragen. Kontrolle der sehr feucht, hell und warm zu haltenden Pflanzen (Kulturenraum) nach einer Woche. Teil 3: Verhinderung der Abszission von Blättern durch Auxin An einer Coleus-Pflanze werden die Blätter wie folgt behandelt: a) Abtrennen der Blattspreite (Positivkontrolle) b) Abschneiden von 4/5 der Blattspreite (Negativkontrolle) c) Abschneiden der Blattspreite, Auftragen von Auxinpaste auf die Schnittfläche des Blattstieles (experimentelle Probe). Kontrolle erfolgt nach einer Woche. Auswertung: (Bitte aber nicht ins Protokoll) 1. Welche Beziehung könnte zwischen Auxinwirkung und Phototropismus bestehen? 2. Diskutieren Sie die Wechselwirkung von Auxin und Ethylen beim Blattabfall !

1. Kurstag

12

3.2 Induktion des Streckungswachstums von Maiskoleoptilsegmenten durch Auxin Literatur: Kutschera Vorbereitung: Funktion von Auxin? Was versteht man unter der Säure-Wachstumshypothese?

Materialien & Geräte: - 8 Schalen etiolierte Maiskeimlinge 5 d bei

28°C auf feuchtem Filterpapier im Dunkeln angezogen (Die Keimlinge sollten zusätzlich 12 h vor Verwendung für 10 min mit Weiß-licht bestrahlt werden, da dann die Koleop-tile besser ausgebildet werden)

- etwa 1 mm stumpfer Metallstift zur Entfer-nung des Primärblattes aus den Segmenten

- Koleoptil-Schneidegerät (2 parallel im Ab-stand von 10 mm befestigte Rasierklingen)

- Inkubationsapparatur mit elektrischer Pumpe.

- Becherglas mit Wasser, Messpapier

Chemikalien & Lösungen: - IAA-Stammlösung (1 mM) ist schon fertig.

(Herstellung: 0,1 M Indolylessigsäure in 0,5 ml Ethanol vorlösen und auf 100 ml mit Aqua demin. auffüllen (kühl und dunkel etwa 1 Woche haltbar).)

- Daraus Verdünnungen (= IAA-Testlösungen) 0,1 mM, 0,01 mM und 0,001 mM IAA her-stellen.

- Phosphatpuffer (5 mM) mit pH 3,0, 5,0 und 7,0; je 250 ml.

Durchführung: Aus geraden, etwa 25 mm langen Koleoptilen werden 30 Segmente von 10 mm Länge etwa 3 mm unter der Spitze herausgeschnitten und das darin befindliche Primärblatt vorsichtig herausgesto-ßen. Segmente in einem Becherglas mit Wasser sammeln. Je 10 Segmente fugenfrei auf die Nadel einer Messapparatur aufreihen und in demin. Wasser bei Raumtemperatur und kräftiger Belüftung aufbewahren. Nach 30 min (gerechnet ab Schneiden der Segmente) werden die Ansätze in 2 vor-bereitete Reagenzröhrchen mit den IAA-Testlösungen umgesetzt. Die Längenmessung erfolgt zum Zeitpunkt t = 0 und dann über 3 h in 30 min-Abständen. Die Nadel mit den Segmenten muss kurz herausgenommen und an ein Lineal angelegt werden (es ist darauf zu achten, dass zwischen den Segmenten während der Messung keine Fugen auftreten und die Segmente nicht überlappen). Jede Gruppe sollte 2 Varianten untersuchen:

1. Wasserkontrolle (Leitungswasser) 2. verdünntes Auxin 0,1 mM oder 0,01 mM 3. Keine Auxinlösung verwenden, sondern Puffer mit den pH-Werten 3,0, 5,0 oder 7,0.

Auswertung: Es ist der Wachstumsanstieg in Abhängigkeit von der IAA-Konzentration zu ermitteln (grafische Darstellung). Dazu muss darauf geachtet werden, dass die Messpunkte einen linearen Anstieg über die Zeit nehmen.

Arbeitszeit: 50 Minuten plus Messung aller 30 Minuten über 3 Stunden

1. Kurstag

13

3.3 Selektive Herbizidwirkung Literatur: Kutschera; R. Wejnar et al. (1994). Der Einfluss des selektiven Herbizids 2,4-Dichlorphen-oxyessigsäure auf Wachstum und Pigmentbildung bei mixo-, auto- und heterotroph kultivierten Lemna gibba-Pflanzen. Angew. Bot. 68, 168-171. Vorbereitung: Wie wirkt das Herbizid 2,4-D auf Pflanzen? Wie wird es aufgenommen?

Materialien & Geräte: 1. Je Gruppe 3 - 5 mit Komposterde gefüllte Blu-

mentöpfe; Karyopsen von Getreide (Avena, Triticum) und Samen von Sinapis oder Kresse gemischt gesät (nicht zu dicht) und etwa 14 Tage im Gewächshaus vorkultiviert

2. Erlenmeyerkolben (100 ml), Impföse, Messzy-linder (für 50 ml)

3. Sprühflaschen 4. große Plastikschale für jede Variante

Chemikalien & Lösungen: 1. 0,05 %ige 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Lö-

sung (wässrig) und 0,05 %ige IAA-Lösung zum Besprühen

Wichtiger Hinweis: Die verwendeten Getreidearten und Lemnaceen gehören zu den Liliopsida, Senf und Kresse zu den Rosopsida. Durchführung: Besprühen je eines Blumentopfes mit (i) dem Herbizid 2,4-D bzw. (ii) dem natürlichen Auxin IAA. (iii) Kontrolle: Besprühen mit Wasser. Vorsicht beim Besprühen mit Herbizidlösung, damit andere Pflanzen (und Menschen) nicht konta-miniert werden. Das Herbizid wird im Abzug versprüht. Variationsmöglichkeit: 0,005 % oder 0,0005 % IAA. Zusatzversuch: Mit 10 ml 0,05 % 2,4-D-Lösung gießen. Wie verhält es sich hierbei mit der Selekti-vität des Herbizides?

Arbeitszeit: 30 Minuten plus Auswertung nach einer Woche

2. Kurstag

14

Komplex 4: Wirkungen weiterer Phytohormone

4.1 Zwergmutanten der Erbse und ihre Normalisierung durch Gibberellinsäure Literatur: Kutschera/ Taiz/ Zeiger Vorbereitung: Funktion? Bildungsort? Transport?

Materialien & Geräte: Keimlinge von Pisum sativum „Zwerg-Markerb-sen“ z.B. Sorte „Bördi“, 2 Wochen im Gewächs-haus vorkultiviert; Pro Gruppe 4 Töpfe mit je-weils mindestens 10 Pflanzen Plastikpipetten, Sprühflaschen

Chemikalien & Lösungen: - Gibberellinsäure-Lösung (2 mM).

- Für Teil 1: Vor Gebrauch die Stammlö-sung auf 0,2 mM verdünnen,

Die Lösungen sind im Kühlschrank aufzubewah-ren.

Durchführung: Die vorkultivierten Kulturen werden (i) mit ca. 10 ml Lösung besprüht, (ii) mit ca. 10 ml GA3 gegos-sen bzw. (iii) nicht behandelt. Alle Töpfe sind hinreichend zu wässern. Die Auswertung erfolgt an folgenden Praktikumstagen (Länge der Sprosse bis zur Knospe, Anzahl der Internodien). Auswertung nach einer und zwei Wochen: Von möglichst 10 Pflanzen werden die Mittelwerte (Sprosslänge und Internodienzahl, nur An-fangswerte und Endwerte vergleichen, d.h. Woche 0 und Woche 2) und die Standardabweichung berechnet. Stellen Sie ihre Ergebnisse grafisch dar (in Form eines Balkendiagramms).

Arbeitszeit: 30 Minuten plus Auswertung nach ein und zwei Wochen.

2. Kurstag

15

4.2 Einfluss von Abscisinsäure auf die Samenkeimung

Vorbereitung: Funktion? Bildungsort? Transport?

Materialien & Geräte: - Samen von Sinapis alba (Senf) - Petrischalen - Filterpapier (autoclaviert) - 100 ml-Bechergläser - Parafilm zum verschließen - 4 x 10 ml Standzylinder oder grad. Gläser

Chemikalien & Lösungen: - Stammlösung 10-4 M ABA. - Lösungen von ABA: 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M,

10-7 M, jeweils 100 ml, plus Kontrolle (ohne ABA).

Die Verdünnungen werden im Praktikum mit Leitungswasser hergestellt.

Durchführung: Die Petrischalen werden mit 3 Lagen Filterpapier belegt und jeweils 5 ml ABA-Lösung bzw. Wasser (Kontrolle) werden eingefüllt. Danach werden 30 Samen ausgelegt. Die Petrischalen werden mit Parafilm verschlossen und im Praktikumsraum oder im Gewächshaus aufgestellt. Auswertung: 1. Die Keimprozente sind nach 7 Tagen zu bestimmen und gegen die Konzentration von ABA gra-

phisch aufzutragen.

Arbeitszeit: 15 Minuten plus Auswertung nach einer Woche.

2. Kurstag

16

Komplex 5: Pflanzliche Inhaltsstoffe

5.1 Quantitative Bestimmung von Gesamtproteinen Vorbereitung: Welche Methoden zur Proteinbestimmung gibt es? Welche Reservestoffe werden in Samen gespeichert? Wo im Samen erfolgt die Speicherung der Nährstoffe? Müssen bei der Isolierung Detergentien eingesetzt werden, so versagt die übliche Bradford-Me-thode. Dies gilt z.B. für die Isolierung von Membranproteinen und damit auch, wenn eine Gesamt-proteinbestimmung erforderlich ist.

Materialien & Geräte: - Verschiedenes Saatgut, gemahlen - Eisbad - Tisch-Zentrifuge - Spektrophotometer - Koch-Wasserbad - Eppendorfpipetten mit Spitzen - Zentrifugenröhrchen - Vortexer - Kolbenpipetten (= automatische Pipetten) - Reagenzgläser, Pipetten

Chemikalien & Lösungen: - Aceton - TRIS 50 mM, 20 g l-1 Na-Dodecylsulfat (SDS) - mit

HCl auf pH = 8,3 einstellen; direkt vor der Ver-wendung im Praktikum (nicht vorher, auch we-gen der Messelektrode) 10 ml l-1 Mercapto-ethanol zugeben

- TCA-Lösung (250 g l-1 Triochloressigsäure; Vor-sicht, starke Säure! Hautkontakt vermeiden!)

- Biuret-Reagenz - NaOH-Lösung (100 ml) - BSA-Stammlösung: 10 mg ml-1

Durchführung: Jede Gruppe sollte mindestens 4 Samensorten (Erbsen, Soja, Mais, Gerste, o.a.) auswählen. Von jeder Sorte sind 2 parallele Proben zu untersuchen. 1. Erstellen einer Eichkurve: Zunächst wird aus der Standardproteinlösung (10 mg/mL BSA) eine

Verdünnungsreihe hergestellt um eine Eichkurve zu erhalten: 0,2/ 0,4/ 0,6/ 0,8 und 1 ml wer-den mit Wasser auf 1 ml aufgefüllt. Allen Ansätzen 4 ml Biuret-Reagenz zufügen, gut mischen und vor der Messung etwa 15 min warten. Die Referenzlösung enthält 1 ml Wasser + 4 ml Reagenz. Die klaren Lösungen werden gegen die Referenzlösungen photometrisch vermessen (1 cm Küvetten, 546 nm).

2. Extraktion: Die Proben werden zu genau 100 mg abgewogen. Mit 7 ml Extraktionspuffer ver-setzt, werden die Proben unter gelegentlichem Schütteln 10 min bei 100oC in Zentrifugenröhr-chen extrahiert. Nach dem Abkühlen der Proben Eis, jeweils 2 ml in ein Eppi überführen und 5 min bei 13000 rpm zentrifugieren.

3. Fällung: Vom klaren Überstand werden jeweils 1 ml abgenommen, in ein frisches Eppi über-

führt und durch Zugabe von 1 ml TCA-Lösung die darin enthaltenen Proteine im Eisbad gefällt. Nach 15 min den Niederschlag abzentrifugieren (10 min bei 10000 rpm), mit 2 x 2 ml eiskaltem Aceton waschen (durch vortexen aufwirbeln) und nochmals zentrifugieren (5 min bei 10000 rpm). Aceton mit einer Pipette absaugen. Rest durch kurzes Erwärmen im Inkubationsschrank

2. Kurstag

17

entfernen (es darf kein Lösungsmittel mehr vorhanden sein). Das Pellet wird in 1 ml 0,1 M NaOH gelöst.

4. Colorimetrischer Test: Zur Proteinbestimmung werden jeweils 0,5 ml der vollständig rückge-

lösten Proben in je ein Reagenzglas überführt und mit 2 ml Biuret-Reagenz versetzt. Weiter wie bei der Erstellung der Eichkurve verfahren.

Auswertung: 1. Erstellen Sie eine Eichgerade (gemessenen Extinktionswerte für entsprechende Konzentratio-

nen von BSA in mg/ml). 2. Errechnen Sie die Proteikonzentrationen in den Proben anhand der Eichgeraden. Ergebnisangabe: Proteingehalt pro Frischgewicht (in mg pro 100 mg, achten Sie auf alle Verdün-nungsschritte und auf die Angaben der Eichkurve!)

Arbeitszeit: 90 Minuten plus 30 Minuten Eichkurve für die erste Gruppe

2. Kurstag

18

5.2 Ein Vorversuch zur pflanzlichen Molekularbiologie: Isolierung von DNA Vorbereitung: Welche Eigenschaften der DNA werden bei der Isolation genutzt? Welche Isolati-onsmethoden gibt es?

Materialien & Geräte: - Blattmaterial, z.B. Erbse - Reaktionsgefäße (2,0 ml, von Sarstedt) - Eppiständer - Pipetten - Eisbad - Schere - Tisch-Zentrifuge - UV-Spektrophotometer und UV-Küvetten

(lila Markierung) - Nitrilhandschuhe (blau) - Vortex

Chemikalien & Lösungen: - Lyse-Puffer - Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) - 75% Ethanol - Isopropanol

alle Phenol/Chloroform-haltigen Sa-

chen kommen in ein separates Abfall-gefäß

Durchführung:

1) Jeweils ca. 0,3 g Blattmaterial von zwei verschiedenen Pflanzenarten abwiegen (Gewicht

aber genau notieren) und im Mörser auf Eis lagern.

2) Blattmaterial mechanisch im Mörser in 1 ml Lyse-Puffer zerkleinern, auf zwei 2,0-ml-Reak-

tionsgefäße verteilen und anschließend für 5 min bei RT inkubieren.

3) 500 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (steht im Kühlschrank) zugeben (im Abzug ar-

beiten!).

4) Proben kurz vortexen (jede Probe 5 sec).

5) 5 min bei 12500 rpm bei RT zentrifugieren.

6) Oberphase (ca. 450 µl) abnehmen, in neues 2 ml Eppi überführen (Abzug!).

Hinweis: Die Interphase besteht aus Protein und darf nicht weiterverwendet werden.

7) 450 µl Chloroform/Iosamylalkohol zugeben (Abzug!).

8) Proben kurz vortexen (jede Probe 5 sec).

9) 5 min bei 12 500 rpm zentrifugieren.

10) Oberphase abnehmen (ca. 400 µl), in neues 2 ml Eppi überführen (Abzug!).

11) Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion (400 µl) noch mal wiederholen.

12) 1 Probenvolumen Isopropanol zugeben (vorgekühlt – aus dem Kühlschrank) und gut mi-

schen (Nicht vortexen!).

13) Proben 5 min auf Eis inkubieren, wenn möglich länger.

2. Kurstag

19

14) 15 min bei 12500 rpm bei 4°C zentrifugieren.

15) Flüssigkeit vorsichtig mit einer Pipette abnehmen bzw. abschütten.

16) Pellet in 750 µl 75% EtOH (vorgekühlt – aus dem Kühlschrank) waschen - Pellet muss

schwimmen!

17) 5 min bei 12500 rpm bei 4°C zentrifugieren.

18) Flüssigkeit vorsichtig mit einer Pipette abnehmen bzw. abschütten (nach einem erneuten,

kurzen Zentrifugationsschritt kann die restliche Flüssigkeit abpipettiert werden) [Vorsicht:

Pellet nicht verlieren].

19) Pellet für 10-20 min bei RT trocknen lassen.

20) Pellet in 25 µl bis 50 µl dH2O lösen (hängt von der Pelletgröße ab).

21) 25 μl dieser Lösung in eine Küvette mit 975 µl Wasser pipettieren, mischen und im Spekt-

rophotometer messen.

Mit dem Programm DNA (Life sciences) wird die Konzentration und die Reinheit der DNA-Lösung

gemessen. Es werden die Extinktionen bei 260 nm (Hauptextinktion von Nukleinsäuren), 280 nm

(Hauptabsorption von Proteinen) und 230 nm (Gerbsäuren und Kohlenhydrate) gemessen. Zur Er-

mittlung der DNA-Reinheit werden die Quotienten E260/E280 und E260/E230 berechnet bzw. ab-

gelesen (siehe dazu die oben genannten Hauptextinktionen). Wenn nur Absorptionswerte ange-

zeigt werden: Extinktion 1 entspricht 50 µg dsDNA ml-1.

Auswertung:

1. Welche DNA-Menge (total und pro Frischgewicht) haben Sie isoliert?

2. Was können Sie über die Reinheit Ihrer Präparation sagen?

Arbeitszeit: 100 Minuten

2. Kurstag

20

5.3 Fett-Kohlenhydratumwandlung bei der Keimung fetthaltiger Samen Literatur: Schopfer II; Schopfer/Brennicke. Vorbereitung: Warum muss Speicherfett der Samen in Kohlenhydrate umgewandelt werden? Wie erfolgt die Umwandlung von Fett in Saccharose? In welchen Zellkompartimenten finden die Pro-zesse statt?

Materialien & Geräte: - 50 trockene Rapssamen sowie 50 Keimpflanzen

(5-6 d nach Aussaat) - Präzisionswaage - Mörser - Quarzsand - Zentrifugenröhrchen (Hermle, verschließbar) - Zentrifuge mit swing-out-Rotor - skalierte Glasröhrchen - Eppendorfgefäße (1,5 ml) - Pipetten + Spitzen - Wasserbad (100°C) - Spektrophotometer (578 nm) - Küvetten (1 cm) - Handschuhe

Chemikalien & Lösungen: - Anthron-Reagenz (max. 12 h alt; Vorsicht:

konzentrierte Schwefelsäure!) - Saccharose-Stammlösung (100mg/100ml

H2O)

Durchführung:

1. Zur Erstellung der Eichkurve wird die Saccharose-Stammlösung so verdünnt, dass folgende Mengen in 1ml Reinstwasser enthalten sind: 0, 25, 50, 100, 150, 200 µg. Zu jedem Ansatz der Proben für die Eichkurve (sowie zur Verdünnungsreihe der Messproben) kommt 1 ml Anthron-Reagenz. Alle Proben werden dann 15 min im kochenden Wasserbad erhitzt und nach Abkühlung im Eisbad kräftig geschüttelt. Bei 578 nm wird vermessen. Bei Extinktionen über 0,9 muss entweder der Küvetteninhalt 1:10 verdünnt werden (oder die Messungen mit der kleineren Konzentration erfüllen bereits das Kriterium).

2. Extraktion: Die ausgekeimten 50 Samen werden in Wurzeln und Sprosse geteilt, in Wäge-schälchen gewogen und anschließend in einem Mörser homogenisiert. Die 50 trockenen Samen werden ebenfalls gewogen und homogenisiert. Zur Homogenisation werden ca. 10 ml Reinstwasser und sehr wenig Sand mit den Proben in den Mörser gegeben. Vom Homo-genat werden 2 ml in Eppendorfröhrchen 5 min im kochenden Wasserbad erhitzt und an-schließend 10 min bei 5000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird sofort nach der Zentri-fugation in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Daraus werden zur Mehrfachbestimmung der Konzentration je dreimal 50 µl für eine Verdünnungsreihe in Eppendorfgefäße pipet-tiert und mit Reinstwasser auf 200 µl ergänzt (Leerwert 200 µl Reinstwasser). Dazu werden 1 ml Anthronreagenz (Eichkurve) pipettiert und die Lösung gut gemischt. Danach kommt das Gemisch 15 min ins kochende Wasserbad, und wird danach im Eisbad abgekühlt und die Extinktion gemessen.

2. Kurstag

21

Auswertung: Anhand der erstellten Eichkurve (nur eine Gruppe) ist die Saccharose-Konzentration in µg/ml zu berechnen. Geben Sie die Mittelwerte an. Vergleichen Sie die Werte pro mg Frischgewicht.

Arbeitszeit: 2 Stunden

2. Kurstag

22

5.4 Isolierung und Nachweis der Alkaloide des Schöllkrauts Literatur: Schopfer I und II; Schopfer/ Brennicke Vorbereitung: Was sind Alkaloide? Welche Funktion haben sie in Pflanzen?

Materialien & Geräte: - Frischer Spross von Chelidonium majus - TLC-Fertigfolien aus Kieselgel (in vier Teile

aufteilen) - TLC-Tank, Pipetten, Kapillarröhrchen zum

Auftragen - UV-Lampe, Schutzbrillen

Chemikalien & Lösungen: - Berberin (feste Vergleichssubstanz), stark

verdünnt einsetzen - Extraktionsmedium: 14 ml Methanol + 1 ml

Essigsäure (Eisessig) - Laufmittel: 85 ml Chloroform + 15 ml Me-

thanol + 1 ml demin. Wasser + 2 ml Essig-säure (Eisessig)

Durchführung: Ein Tropfen des bei frischen Pflanzen an der Schnittfläche austretenden Milchsaftes wird mit 100 μl Extraktionsmedium in einem 2 ml Reaktionsgefäß (Eppi) suspendiert. Es hat sich für praktisch erwiesen, dazu der Stängel direkt in das Eppi einzutaucht. Auf der Kieselgelfolie wird etwa 2 cm vom unteren Rand entfernt eine Bleistiftlinie gezogen. Nebeneinander werden mit einer Glaska-pillare drei Tropfen dieses Gemisches auf die Linie aufgetragen, so dass eine Bande entsteht (•••). Zwischendurch trocknen lassen, damit die Bande nicht „auseinanderläuft“. Eine weitere Bande wird mit der doppelten Menge erstellt (auf jeden Punkt ein zweites Mal tupfen). Nach dem Trocknen der Flecken wird die Platte in den mit dem Laufmittel gefüllten Tank (Füllhöhe höchstens 0,5 cm) gestellt (im Abzug!). Kurz bevor die Laufmittelfront den oberen Rand der Platte erreicht hat, wird der Lauf abgebrochen (Laufzeit ca. 30 min). Sofort Laufmittelfront mit einem Bleistift markieren und die Rf-Werte ermitteln. Die Banden werden mit Bleistift markiert und die Farbe daneben notiert. Unter einer UV-B-Lampe (Dunkelkammer) werden die fluoreszierenden Banden ebenfalls mit der Farbe beschriftet. Zum Vergleich kann man z.B. Hylomecon japonicum, wie Schöllkraut ein Mohngewächs, benutzen. Achtung: Bitte Schutzbrille & Handschuhe unter UV-Licht tragen! Vergleichswerte: (s. Schopfer II) Die angegebenen Rf-Werte können nur eine grobe Orientierung sein, die Reihenfolge jedoch bleibt erhalten. - Sanguinarin (Farbe rot-orange; Fluoreszenz orange) Rf = 0,9 - Chelerythrin (Farbe goldgelb-zitronengelb; Fluoreszenz goldgelb) Rf = 0,8 - Berberin (Farbe zitronengelb; Fluoreszenz grün) Rf = 0,3 - Coptisin (Farbe gelb-gelbbraun; Fluoreszenz zitronengelb) Rf = 0,2 Es müssen auch die Fluoreszenzfarben zur Charakterisierung herangezogen werden. Anmerkungen 1. Ein Vergleich mit Rf-Werten aus der Literatur ist erfahrungsgemäß nur bedingt möglich. Das

stellt jedoch kein Problem dar, weil der Vergleich von Absorptions- und Fluoreszenzfarbe eine

2. Kurstag

23

eindeutige Zuordnung ermöglicht. 2. Als Vergleichssubstanz ist Berberin vorhanden. Um sie als Hilfe bei der Zuordnung einsetzen zu

können, werden steigende Volumina auf die TLC-Folie mit aufgetragen. 3. Bitte nicht mehr als 5 Platten in ein Gefäß stellen, weil sich die Gruppen sonst gegenseitig durch

zu häufiges Öffnen behindern.

Arbeitszeit: 15 Minuten plus 15-30 Minuten Laufzeit der TLC

3. Kurstag

24

Komplex 6: Pflanzliche Enzyme

6.1 Operationale Kriterien der Enzymaktivitätsbestimmung - Fallstudie Fuma-rathydratase

Literatur: Schopfer II, Schopfer/Brennicke - Vorbereitung: An welcher Reaktion sind Fumarathydratase bzw. Malathydrolase beteiligt? Er-

klären Sie die Verwendung von Triton, Polyclar AT (PVP) und Dithioerythrit bei der Isolation von Enzymen. Wie berechnet man die Enzymaktivität?

Materialien & Geräte: - Keimlinge von Sinapis alba, 3 oder 4 d bei 25°C auf

feuchtem Filterpapier angezogen, je Gruppe 2 Pet-rischalen mit mindestens 25 Keimlingen

- Eisbad - Mörser - Quarzsand - Eppendorf-Zentrifuge mit Festwinkelrotor für 15000 U

min-1 - Reaktionsgefäße (1,5 ml) - Peleusball und Glaspipetten - Spektrophotometer (240 nm), - 3 Quarzküvetten (1 cm, 3 ml), Stoppuhr oder Handy

Chemikalien & Lösungen:

- Extraktionspuffer - L-Malatlösung (50 mM) - Triton X-100 - Polyclar AT (PVP) - Dithioerythrit 1 mM

Durchführung: Achtung! Vor Versuchsbeginn bitte die „weiterführenden Experimente“ zur Kenntnis nehmen und in Absprache mit dem Versuchsbetreuer die eine oder andere Variante zusammen mit der Kon-trolle einplanen. Alle Lösungen während der Präparation kalt halten (Eisbad). 1. Etwa 0,5 g Kotyledonen ernten. Genaues Gewicht notieren.

2. Homogenisieren im Mörser mit wenig Quarzsand und 1,5 ml Extraktionspuffer (ebenfalls eis-

kalt) im Eisbad.

3. Wenn keine Partikel mehr erkennbar sind, weitere 1,5 ml Extraktionspuffer zugeben, gut durch-mischen. Davon werden 2 ml in ein Reaktionsgefäß („Eppi“) gegeben

4. Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min (gekühlte Tischzentrifuge) 5. Reaktionsgefäße vorsichtig aus dem Rotor nehmen und etwa 1 ml des klaren Überstandes unter

der Fettschicht langsam abpipettieren. Überstand auf Eis aufbewahren.

6. Pro Ansatz werden in eine Küvette (für kleinere Küvetten entsprechend herunterskalieren)

3. Kurstag

25

1,45ml Malatlösung pipettiert und auf Raumtemperatur temperiert.

7. Jetzt wird der Leerwert gemessen, bei 240 nm. Die Bildung von Doppelbindungen in Fumarat kann als Zunahme der Absorption photometrisch bei 240 detektiert werden.

8. Geben Sie 50 µl Enzymextrakt ( = Start der Reaktion) dazu und messen Sie bei 240 nm (gegen

Malatlösung) in Abständen von 1 - 3 min über etwa 30 min.

Weiterführende Experimente: 1. Ist das Enzym im Rohextrakt in der Kontrolle im Vergleich zum Ansatz mit Dithioerythrit maximal

aktiv? Welchen Effekt hat der Zusatz von Dithioerythrit (1 mM) auf die Enzymaktivität? Zum Test dem Homogenisationspuffer Dithioerythrit zusetzen (1 ml Stammlösung herstellen auf Eis), ansonsten wie im Grundexperiment.

2. Gibt es Anhaltspunkte für Hemmstoffe im Extrakt? Welchen Effekt hat eine Behandlung des Extraktes mit PVP? PVP (5 mg in 10ml Extraktionspuffer) wird dem Puffer vor der Homogenisa-tion zugesetzt. Achtung! PVP quillt im Puffer, dadurch nimmt das Extraktvolumen stark ab. Das Extraktvolumen muss bei der Berechnung der Enzymaktivität berücksichtigt werden.

3. Wird das Enzym durch die Extraktion optimal in Lösung gebracht? Welchen Effekt hat der Zusatz

von 0,05 ml Triton X-100 zu 10 ml Extraktionspuffer? Auswertung: Die Enzymaktivität von zwei unterschiedlich behandelten Proben (z.B. Kontrolle und Zusatz von Dithioerythrit) ist zu berechnen (siehe dazu Schopfer II) und zu vergleichen. Der Extinktionskoef-fizient von Fumarat beträgt bei 240 nm 2,6 x 103 L mol-1 cm-1.

Arbeitszeit: 2 Stunden

3. Kurstag

26

6.2 Die kinetische Charakterisierung eines Enzyms - Fallstudie Peroxidase Literatur: Schopfer II. Besonders bei diesem Versuch sollten Sie den entsprechenden Abschnitt vor Versuchbeginn gelesen haben. - Vorbereitung: Was sind Peroxidasen. Welche Peroxidasen gibt es? Funktion? Wie berechnet man

die Enzymaktivität bzw. Reaktionsgeschwindigkeit?

Materialien & Geräte - Meerrettichwurzel (im Kühlschrank aufbe-

wahren für alle Kurse) - Messer, Mörser, Schneidbrettchen - Eisbad, Eppis 1,5 ml - Spektrophotometer (436 nm, 25°C) - Küvetten (1 cm) - Uhr - Glaspipetten, Peleusbälle - Tischzentrifuge - Schutzhandschuhe, Schutzbrille - Reagenzgläser (kurz) - Nitrilhandschuhe (blau) - Bechergläser 100 ml - Messzylinder 100 ml

Chemikalien & Lösungen - Phosphatpuffer (50 mM, pH = 7,0) - Wasserstoffperoxid, 1 mM und 4 mM frisch

verdünnen (die Perhydrol-Ausgangslösung enthält 30 Gew.-% = 9,8 M)

- Guajakol (Lösung: 20 mM = 220 μl in 100 ml Reinstwasser, frisch ansetzen)

Guajacol [https://de.wikipedia.org/wiki/Guajak] ist ein in Guajak-Bäumen vorkommender sekun-därer Pflanzenstoff, der sich strukturell vom Anisol und vom Phenol ableitet. Guajacol ist einer der Aromastoffe von Whisky und Kaffee. Man macht auch Vanillin daraus.

Sicherheitshinweis: Wasserstoffperoxid wirkt stark oxidierend, auch auf menschlicher Haut! Bitte Schutzhandschuhe und Schutzbrille beim Verdünnen tragen. Unverdünntes Guajacol sollte im Ab-zug gehandhabt werden. Es reizt Haut und Augen.

Durchführung: Herstellung des Enzymextraktes: 0,250 g fein zerschnittene Stückchen Meerrettich mit 1 ml Puffer und einer Prise Sand in einem Mörser auf Eis homogenisieren. Wenn keine Partikel mehr erkennbar sind, Suspension in Zentri-fugenröhrchen (im Eisbad) gießen. Mörser mit 3 ml Puffer ausspülen, ebenfalls in das Röhrchen geben. 2 x 1,5 ml der Suspension in ein Reaktionsgefäß („Eppi“) zum Zentrifugieren füllen. Danach

3. Kurstag

27

Zentrifugation: Tischzentrifuge 10 min, 13.000 rpm (= U min-1). Vom Überstand 1 ml abnehmen und mit 3 ml Puffer verdünnen (1+3-Verdünnung). Dies ist der Enzymextrakt. Hinweis: Die enzymatische Reaktion verläuft über verschiedene Teilreaktionen. Testansatz unter Verwendung von Teilreaktion 1: 0,4 ml Puffer + 1 ml Guajakol-Lösung + 0,05 ml Enzymextrakt in Küvette mischen (dann auf Raum-temperatur einstellen lassen). Leerwert messen. 0,05 ml H2O2-Lösung (1 mM) zugeben, mischen und Stoppuhr starten. Messung alle 10 s über 2 min. Testansatz unter Verwendung von Teilreaktion 2: Ebenfalls in eine Küvette pipettiert werden 1,4 ml Puffer, 0,025 ml Guajakol-Lösung, 0,05 ml Enzy-mextrakt. Die Reaktion wird mit 0,05 ml H2O2-Lösung (4 mM) gestartet und wie oben verfahren. Hinweis Die beiden vorverdünnten Wasserstoffperoxid-Lösungen (1 mM, 4 mM) sollten beim Einsatz nicht älter als 10 min sein. Wenn die Küvette durch Bildung eines Farbstoffes von innen beschlägt, dann bitte zwischen 2 Messreihen mit Aceton reinigen und mit Reinstwasser nachspülen. Auswertung: Bestimmen Sie die Anfangsgeschwindigkeiten der beiden Enzymreaktionen und vergleichen Sie die Geschwindigkeiten miteinander (siehe Schopfer II). Diskutieren Sie im Protokoll warum Test-ansatz 1 eine höhere Anfangsgeschwindigkeit haben sollte als Testansatz 2 (vergleiche Verdünnun-gen und Geschwindigkeitskonstanten der Teilreaktionen - ).

Arbeitszeit: ca. 30 min

3. Kurstag

28

6.3 Nachweis von Phosphatasen im Kartoffelpresssaft Nachweis von Phosphatasen im Kartoffelpresssaft Vorbereitung: Was sind Phosphatasen? An welche Reaktionen sind Phosphatasen beteiligt? Wie berechnet man die Enzymaktivität?

Materialien: - 2 Kartoffelknollen mittlerer Größe Geräte: - Pipetten - Reagenzgläser - Reagenzglasständer - Mixer - Zentrifuge - Halbmikroküvetten - Spektrometer

Chemikalien: - 1M NaOH-Lösung - 10mM Natriumacetat pH 5.3 - 0,1 mM p-Nitrophenylphosphat - 0,1 mM p-Nitrophenol

Durchführung: Aufstellen der Eichkurven: Phosphatasen hydrolysieren in vitro das synthetische p-Nitrophenylphosphat. Dabei entsteht (Hydrolyse des Phosphorsäureesters) unter basischen Bedingungen das gelbe p-Nitrophenolat, das bei 405 nm im UV-VIS-Spektrometer detektiert werden kann. Zur Aufstellung einer Eichkurve wird eine Verdünnungsreihe mit p-Nitrophenol (das ist das Produkt der enzymatischen Reaktion) hergestellt. Dazu wird die Lösung verdünnt (0,1 mM bis 0,01 mM mit 10 Messwerten). Von den Verdünnungen wird 1 ml entnommen, mit 1 ml Natronlauge versetzt und im Spektrometer bei 405 nm (Halbmikroküvetten, 1 cm Schichtdicke, Wasser in der Vergleichs-küvette) vermessen. Herstellung des Kartoffelpreßsaftes: 1. Kartoffeln waschen, klein schneiden und in den Mixer geben. 2. Soviel Natriumacetat-Puffer (10mM pH 4.8) zufügen bis die Stücke bedeckt sind. 3. Die Kartoffelstücke im Mixer homogenisieren. 4. Homogenat durch 4 Lagen Mull filtrieren. 5. 10 ml Filtrat bei 10.000 rpm 10 min zentrifugiert. 6. Überstand (Enzymlösung) abpipettieren und zur Enzymbestimmung folgende Varianten anset-zen:

a) 0.5 ml Enzymlösung + 4.5 ml Puffer + 5 ml Substratlösung b) 0.5 ml Enzymlösung + 0.5 ml Puffer + 9 ml Substratlösung

3. Kurstag

29

7. Beide Ansätze gut mischen. 8. Im Abstand von 10 min im Verlauf von einer Stunde je 0,5 ml entnehmen. Vor dem Abnehmen noch einmal schütteln. 9. Probe mit 0.5 ml Natronlauge versetzt, mischen und im Spektrometer (siehe Vorgehen bei der Erstellung der Eichkurve) vermessen. Auswertung: 3. Erstellen Sie eine Eichgerade (gemessenen Extinktionswerte für entsprechende Konzentratio-

nen von p-Nitrophenol in mM). 4. Errechnen Sie die Konzentration an p-Nitrophenol in den Proben anhand der Eichgeraden. 5. Tragen Sie den Konzentrationsverlauf (gebildetes Produkt der Enzymreaktion) über die Zeit

auf. 6. Berechnen Sie anhand der Eichgeraden die jeweiligen Enzymaktivitäten in mol gebildetes Pro-

dukt pro Sekunde und g Frischgewicht. Was können Sie für Schlüsse aus den Kinetiken ziehen?

Arbeitszeit: 75 Minuten plus 30 min für die Erstellung der Eichkurve durch die erste Gruppe.

3. Kurstag

30

6.4 Dissimilation von Speicherstärke durch Amylasen Literatur: Schopfer/ Brennicke; Schopfer II; Metzner (für Teil 2) Vorbereitung: Welche Amylasen gibt es, welche Funktionen haben sie? Wie ist Stärke aufgebaut? Wie berechnet man die Enzymaktivität? Erklären Sie die Nachweisreaktion von Stärke.

Materialien - Teil 1: Gerstenkeimlinge (Karyopsen, 4 d

in einem Blumentopf mit Vermiculit ausgekeimt)

- Teil 2: Am Vortag ca. 30 Gerstenkaryop-sen eingequollen

- Wasserbad - Eisbad - Zentrifugenröhrchen - Spektrophotometer und Küvetten

Fertige Lösungen Teil 1: - Extraktionspuffer: 100 mM Natriumcitrat-puf-

fer mit 5 mM Ca-Citrat oder Ca-Acetat (pH = 6,0) - Nachweisreagenz: 1 g Dinitrosalicylsäure wird

mit etwas demin. Wasser vorgelöst, dazu 40 ml 1 M NaOH plus 30 ml demin. Wasser plus 30 g K-Na-Tartrat. Rühren (ca. 1 h bei Raumtempe-ratur), auffüllen auf 100 ml

- Natriumfluorid-Lösung: 31,5 mg NaF/ 100 ml - Stärkelösung: 0,5 g/ 50 ml (Stärke löslich nach

Zulkowsky) Teil 2: - Stärkeagar (1 % Agar mit 0,2 % löslicher Stärke

in Petrischalen) - Lugolsche Lösung (2 g KI in 5 ml Reinstwas-ser

lösen, dann 1 g Iod zugeben, nach dem Auflösen auffüllen auf 300 ml). Vor Gebrauch 1:10 ver-dünnen

Durchführung: Teil 1 - Gewinnung des Extraktes: Etwa 10 gekeimte Gerstenkaryopsen werden in Karyopse, Spross und Wurzel geteilt. Von den Sprossen werden 0,5 g Frischsubstanz mit 5 ml Extraktionspuffer auf Eis homogenisiert und an-schließend ca. 5 min bei 5000 rpm und 4 °C zentrifugiert (Bremsstärke niedrig stellen, weil sonst das Pellet wieder suspendiert wird). Ebenso wird mit dem Rest (Wurzeln und Karyopsen) verfah-ren. Diese Enzymextrakte (Überstände der Zentrifugation) werden zur Aktivitätsbestimmung ver-wendet. Enzymreaktion: bei 25°C im Wasserbad: - 1 ml Extr.-Puffer - 0,5 ml NaF- Lösung - 1 ml Stärkelösung.

Start mit 0,5 ml Enzymextrakt (in der Kontrolle Wasser)

3. Kurstag

31

Nachweisreaktion: Zum Zeitpunkt t = 0 min, 15 min, 30 min und nach 60 min werden jeweils 0,5 ml aus dem Reakti-onsgefäß entnommen und in ein anderes Reagenzglas mit 0,5 ml Nachweisreagenz gegeben. Die-ses Gemisch wird 5 min bei 100°C behandelt, danach schnell abgekühlt und mit 5 ml H2O versetzt. Der Leerwert muss ebenfalls 5 min bei 100oC erhitzt und danach schnell abgekühlt und mit Wasser verdünnt werden. Die Messung erfolgt im Spektralphotometer bei 540 nm in 1 cm-Küvetten (Leerwert: 5,5 ml H2O + 0,5 ml DNSS-Reagenz). Eine Eichkurve wird zur Verfügung gestellt. Damit kann die gemessene Extinktion einer Maltose-konzentration zugeordnet werden und damit die Enzymaktivität berechnet werden. Angabe als mmol Maltose min-1 g-1 Frischgewicht. Teil 2: Eine Petrischale mit Stärkeagar wird mit vorgequollenen und trockenen Gerstekaryopsen be-schickt; die Karyopsen werden längs durchgeschnitten und mit der Schnittfläche auf den Agar ge-legt (etwa 4 Hälften pro Schale; Zimmertemperatur). Nach zwei Tagen entfernt man die Karyopsen und übergießt die Platten mit der verdünnten Lugolschen Lösung. Was zeigen die rotbraunen Rän-der bzw. die farblosen Felder auf der Agarplatte an? Die Bereiche mit nicht abgebauter Stärke färben sich blauschwarz. Auswertung

1. Tragen Sie die vorgegebenen Extinktionswerte für die Maltose-Konzentration (in mg/ml) in einem Diagramm auf. Ermitteln Sie mittels linearer Regression aus den gemessenen Ex-tinktionswerten die Konzentration in den Proben.

2. In welchen Pflanzenorganen befindet sich welche Enzymaktivität?

Arbeitszeit: 2 Stunden.

4. Kurstag

32

Komplex 7: Photosynthese und Respiration

7.1 Vergleich der Pigmente aus Chloroplasten Literatur: Kutschera; Schopfer/ Brennicke Vorbereitung: Welche Pigmente gibt es in Pflanzen? Wie funktioniert Dünnschichtchromatogra-phie? Was beeinflusst das Laufverhalten?

Materialien & Geräte: - etwa 14 Tage vorkultivierte Mais-Pflanzen

oder Efeublätter ohne Stiele - Mörser, Sand, Eisbad - Chromatographiekammern - Silikagel-Dünnschichtfolien (vierteilen) - Skalpell, Glaskapillaren - Zentrifugenröhrchen 1,5 ml - Spektrometer, Küvetten - UV-Lampe - Ventilator

Chemikalien & Lösungen: - Laufmittel Benzin (100 - 140oC) : Aceton : Chlo-

roform = 50 : 50 : 40 - gepuffertes Aceton: 800 ml Aceton + 195 ml

Wasser + 5 ml Ammoniak (25 % w/v). - Leerwert: Aceton.

Durchführung: Es wird auf Eis gearbeitet.

1. Teil: - Ca. 150 mg Blattmaterial (genaues Gewicht protokolieren) im Mörser mit etwas Sand undAce-

ton-Puffer (2,0 + 0,5 ml) homogenisieren. - Extrakte zentrifugieren bei 5000 rpm und 4oC für 10 min. - Überstand abnehmen und im Dunkeln lagern. - Absorption bei 663 nm, 647 nm and 470 nm messen. Der Messbereich sollte zwischen 0,2 und

0,9 liegen. Bitte ein Teil der Proben (Rest wird für Teil 2 benötigt) so verdünnen, dass die Ab-sorptionswerte dazwischen liegen.

- Pigmentgehalt nach folgender Formel berechnen: Chla (mg/ml) = [12.7 x A663 – 2.69 x A645] × [V x E/1000]

Chlb (mg/ml) = [22.9 x A645 – 4.86 x A663] × [V x E/1000]

Chla+b (mg/ml) = [8.02 × A663 + 20.20 x A645] × [V x E/1000]

V = Verdünnungsfaktor: Volumen Aceton-Puffer/Volumen des Extraktes (ml)

E = Extraktionsvolumen (ml)

4. Kurstag

33

2. Teil: - Auftrennung der Pigmente durch Dünnschichtchromatographie. Dafür muss ein Teil der un-verdünnten Proben aufgetragen werden.

Auswertung

1. Der Pigmentgehalt im Extrakt ist quantitativ zu bestimmen! 2. Dünnschichtchromatographie: Welche Pigmente konnten Sie ermitteln? Banden markie-

ren, beschriften, danach UV-Fluoreszenz ansehen. 3. Berechnen Sie den Rf-Wert jeder Bande. 4. Die Chromatogramme abfotografieren und die Bilder dem Protokoll beifügen.

Arbeitszeit: 60 Minuten

4. Kurstag

34

7.2 Fluoreszenz von Chlorophyll in vitro und in vivo

Dieser Versuch ist ein Demonstrationsversuch und wird mit dem Versuchsbetreuer durchgeführt. Aufgrund seiner kurzen Dauer ist er von allen Gruppen durchführbar. Literatur: Kutschera; Schopfer/Brennicke Vorbereitung: Wie kann Chlorophyllfluoreszenz erklärt werden? Chlorophylle können durch Licht angeregt werden. Welche Anregungszustände gibt es? Wie gelangt angeregtes Chlorophyll wieder in den Grundzustand?

Materialien & Geräte - Chlorophyllextrakt aus grünen Blättern (z.B. Mais

oder Efeu) (siehe Versuch 7.1) - Bohnenblatt von Versuch 7.3. - Paprikaextrakt von Versuch 7.1 - UVA-Lampe und UV-Schutzbrille - Glasschälchen, Plastikpipette

Chemikalien & Lösungen - Aceton

Durchführung: Teil 1: Ein Blatt (siehe Tabelle) wird mit UVA-Licht auf dunklem Hintergrund bestrahlt. Bei Zugabe eines Tropfens Aceton wird die Fluoreszenz verstärkt (warum?). Einwirkzeit bei Wasserpflanzen 10 min, bei Laubblättern 30 min vor Kontrolle der Fluoreszenz.

Teil 1 Wasser Aceton

Mais ? ?

Bohne ? ?

Teil 2: Der Chlorophyllextrakt von grünen Blättern und von grüner Paprikafrucht wird mit UVA-Licht in einer Küvette bestrahlt. In einem Winkel von 90° wird die Fluoreszenz beobachtet.

Arbeitszeit: 20 Minuten

4. Kurstag

35

7.3 CO2-Aufnahme bei C3- und C4-Pflanzen Literatur: Schopfer II, Schopfer/Brennicke Vorbereitung: Erklären Sie den Unterschied im CO2-Kompensationspunkt bei C3- und C4-Pflanzen. Welcher Zusammenhang besteht zum Lichtkompensationspunkt? Vergleichen Sie C3-und C4-Pflanzen in struktureller Hinsicht! Vergleichen Sie die Energiebilanz beider Stoffwechseltypen! Wie ist die CO2-Bilanz im Dunkeln? Warum erfolgt ein Farbumschlag der Indikatorlösung?

Materialien & Geräte: - Aussaat drei Wochen vor Versuch, Empfeh-

lung: Zea mays und Phaseolus vulgaris. - Gut verschließbare Einweckgläser mit Gum-

miringen und Klammern, kleine Becherglä-ser. Standzylinder (2 pro Gruppe)

- Mehrere Leuchtstoffröhren, auf ein Gestell gelegt zur Erzeugung von Starklicht. Beleuch-tung: Röhren von drei Seiten

- Plastikpipetten für Indikator - Messzylinder

Chemikalien & Lösungen: - 0,1 mM NaHCO3 (einwiegen) in 0,1 M KCl (wird

aus 1 M KCl durch Verdünnen hergestellt). Wird von der ersten Gruppe für alle frisch bereitet; 2 L ansetzen.

- Cresolrot-Indikatorlösung (100 mg in 2 ml Etha-nol vorlösen und auf 100 ml mit Wasser).

- Der Indikator Cresolrot schlägt im Bereich von pH 7,2 bis 8,8 von gelb nach rot um.

Durchführung: Fünf bis 15 Pflanzen (sodass die gleiche Biomasse eingesetzt wird) sind je nach Größe pro Gefäß zu verwenden. Ein großes Einweckglass wird mit Reinstwasser ausgespült. Ca. 50 ml der NaHCO3-Lösung (mit ei-nigen Tropfen Indikatorlösung versetzt bis die Farbe sichtbar wird) werden in das Einweckglas hin-eingeben. In ein kleines Becherglas werden Bohnenpflanzen oder Maispflanzen (nutzen sie die gleiche Frischmasse, ca. 6 g) ohne Wurzeln (vorher abschneiden) hineingestellt, dann wird es zu 2/3 mit Leitungswasser gefüllt. Das Becherglas wird auf den Boden des Einweckglases gestellt (mit 2 Pinzetten anfassen), so dass es in der Indikatorlösung steht. Die Weck-Gläser werden mit Gum-miringen und Klammern luftdicht verschlossen. Das Ganze wird entweder in starkes Licht übertra-gen oder in Dunkelheit aufbewahrt (Schrank). Daraus ergeben sich vier Varianten:

(i) Mais-Pflanze, Dunkelheit (ii) Mais-Pflanze, Licht (iii) Bohnenpflanze, Dunkelheit (iv) Bohnenpflanze, Licht

4. Kurstag

36

Auswertung: Beobachten Sie die Farbe über 3 Stunden. Verfärbung aller 30 min registrieren und fotografieren. Erklären Sie den Farbumschlag anhand der Formel: NaHCO3 ↔ Na+ + HCO3

- ↔ Na+ + H+ + CO32- ↔ NaOH + CO2 ↑

Arbeitszeit: 20 Minuten plus Auswertung nach 3 Stunden

4. Kurstag

37

7.4 Demonstration und Messung des photosynthetischen Elektronentransports an isolierten Chloroplasten

Literatur: Kutschera; Schopfer/ Brennicke Vorbereitung: Erklären Sie die Hillreaktion. Was geschieht mit dem reduzierten Nachweißreagenz im Dunkeln?

Materialien & Geräte: - Frische Petersilie oder Spinat - Bender, Mull, Nylon - Pipetten - 15 ml Falcons und Glasröhrchen - Zentrifuge - Spektrometer - Eisbox

Chemikalien & Lösungen: Alle Geräte und Lösungen müssen im Kühlschrank vor-

gekühlt werden.

- DCPIP: 0,1 g DCPIP/100 ml H2O: am Vorabend

herstellen - Saccharosepuffer - Phosphatpuffer (PM)

Durchführung:

1. Bereitstellung des Materials für 2 Gruppen: - Achtung: Alle Schritte müssen rasch und auf Eis durchgeführt werden. - Stiele von Spinatblättern entfernen. - 5-10 g Blätter abwiegen und mit 50 ml Saccharosepuffer homogenisieren (im Blender 3 x 3s). - Homogenat durch 4 Lagen Mull filtrieren und auswringen. - Homogenat durch 2 Lagen Nylon filtrieren. - 2 x 10 ml des Filtrats in ein Falconröhrchen geben, Röhrchen austarieren und 4 min bei 4000

rpm zentrifugieren. - Überstände verwerfen. - Chloroplastenpellets in 2-4 ml Phosphatmedium resuspendieren. - Chloroplasten 5 min auf Eis stehen lassen (Thylakoide werden freigesetzt) und im Dunkeln auf-

bewahren. - Extinktion bestimmen (578 nm, 1 cm- Glasküvette, Vergleichsküvette: PM). - Ein Teil (10 ml Endvolumen) der Thylakoide auf OD ~ 1.0 mit PM verdünnen. Versuchsdurchführung: - Folgende Ansätze in Reagenzgläser pipettieren (Angaben in ml):

Probe Null Licht Dunkel

Thylakoide - 7 7

PM 7,6 0,6 0,6

DCPIP 0,4 0,4 0,4

4. Kurstag

38

- Reagenzgläser mit Parafilm verschließen, gut mischen. - 1ml von jedem Ansatz sofort bei 578 nm im Spektrometer vermessen (Anfangsextinktion nach

Zugabe von DCPIP sollte zwischen E = 0,7 und 0,9 liegen (Referenz: PM). - Die Küvette sollte randgefüllt (damit keine Luftblasen vorhanden sind) sein. - Reagenzgläser werden ins Dunkel (schwarze Box), Sonnenlicht (Fensterbank) und unter die

Lichtquelle aus dem Versuch 7.3 gestellt. - Weitere Messungen erfolgen nach 10, 20 und 30 min. - Achtung! Zügig arbeiten wenn die Reagenzgläser aus ihrer jeweiligen Lichtbedingung genom-

men werden. Auswertung: Die Differenz zwischen Anfangs- und Endextinktion bzw. der Anstieg (Abfall) der Extinktions-Zeit-kurve sind ein Maß für die HILL-Aktivität. Stellen Sie diese grafisch dar.

Arbeitszeit: 90min

Anhang

39

C. Liste der im Pflanzenphysiologischen Praktikum verwendeten

Pflanzen

Wissenschaftlicher Name Deutsches Synonym

Armoracia rusticana Echter Meerettich

Avena sativa

Bellis perennis

Saat-Hafer

Gänseblümchen

Brassica napus Raps

Chelidonium majus Großes Schöllkraut

Hordeum vulgare

Lactuca sativa

Gerste

Grüner Salat

Lepidium sativum Garten-Kresse

Petroselinum crispum Petersilie

Phaseolus vulgaris Garten-Bohne, Grüne Bohne

Pisum sativum Garten-Erbse

Secale sereale Roggen

Sinapis alba

Solanum lycopersicum

Solanum tuberosum

Solenostemon scutellaroides

Weißer Senf

Tomate

Kartoffel

Buntnessel (alt: Coleus bumeii)

Spinacia oleracea Echter Spinat

Zea mays Mais