S. ArltA. KontushT. Müller-ThomsenU. Beisiegel

Lipoproteinoxidationals gemeinsamer Pathomechanismusder koronaren Herzerkrankungund der Alzheimer Krankheit

Z Gerontol Geriat 34:461–465 (2001)© Steinkopff Verlag 2001

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G052

Eingegangen: 26. Oktober 2001Akzeptiert: 29. Oktober 2001

Dr. med. S. Arlt ()) · A. KontushU. BeisiegelInstitut für Medizinische Biochemieund MolekularbiologieAbt. Molekulare ZellbiologieUniversitätsklinikum Hamburg-EppendorfMartinistr. 5220246 Hamburg, GermanyTel.: +49-40 /42803-3917Fax: +49-40 /42803-4592E-Mail: arlt@uke.uni-hamburg.de

T. Müller-ThomsenKlinik für Psychiatrie und PsychotherapieUniversitätsklinikum Hamburg-EppendorfMartinistr. 5220246 Hamburg, Germany

Lipoproteinoxidation as a commonpathomechanism in coronary heartdisease and Alzheimer’s disease

n Zusammenfassung OxidativeProzesse sind sowohl an der Alte-rung als auch verschiedenen de-generativen Erkrankungen betei-ligt. In den letzten Jahren ist ins-besondere die Rolle der Oxidationvon Lipoproteinen geringerDichte bei der Entstehung der Ar-therosklerose und der koronarenHerzkrankheit deutlich geworden.Dazu wurde die Lipoproteinoxida-tion im Plasma untersucht. Wirhaben uns für die Rolle der Lipo-

proteinoxidation bei der Alzhei-mer Demenz interessiert und ha-ben die Methoden zur Bestim-mung der Oxidierbarkeit von Li-poproteinen weiterentwickelt, umMessungen im Liquor cerebrospi-nalis von Alzheimerpatientendurchzuführen. Ausserdem sinddie wichtigsten lipophilen undhydrophilen Antioxidantien, �-To-copherol (Vitamin E) und Ascor-bat (Vitamin C), und der Gehaltan mehrfach-ungesättigten Fett-säuren bestimmt worden. Bei Alz-heimerpatienten findet sich ge-genüber Kontrollen eine erhöhteLipoproteinoxidation sowohl imLiquor als auch im Plasma. DieKonzentrationen der antioxidanti-ven Vitamine sind dagegen er-niedrigt, was auf erhöhten oxida-tiven Stress bei dieser Erkran-kung hinweist. In einer Pilotstu-die konnte die in vitro Lipopro-teinoxidation im Liquor von Alz-heimerpatienten durch die Gabevon Vitamin E und C verzögertwerden. Zusammenfassend zeigendie Ergebnisse, dass eine erhöhteLipoproteinoxidation auch bei derAlzheimer Krankheit eine wichti-ge Rolle spielen könnte, und siebilden eine mögliche Grundlagezur Behandlung dieser Erkran-kung mit Antioxidantien. Die kli-nische Wirksamkeit eines solchenAnsatzes muss durch entspre-chende Langzeitstudien geprüftwerden.

n SchlüsselwörterAlzheimer Krankheit – Antioxi-dantien – Lipoproteine – Liquorcerebrospinalis – Oxidation

n Summary Oxidative processesare involved in aging as well asthe pathogenesis of different de-generative diseases. In the lastfew years the role of low densitylipoprotein oxidation in the devel-opment of artherosclerosis andcoronary heart disease has be-come evident. Lipoprotein oxida-tion in plasma is used as a mar-ker for disease progression. Wewere interested in the role of lipo-protein oxidation in Alzheimer’sdisease. For this purpose we de-veloped methods to determinethe in vitro oxidizability of cere-brospinal fluid and plasma lipo-proteins of Alzheimer patients. Inaddition we measured the lipo-philic and hydrophillic antioxi-dants, �-tocopherol (vitamin E)and ascorbate (vitamin C). Cere-brospinal fluid and plasma lipo-protein oxidation was found to beincreased in Alzheimer’s patientscompared to controls and a cor-responding decrease of antioxi-dant vitamins was found. In apilot study, in vitro lipoproteinoxidation in cerebrospinal fluid ofAlzheimer patients could be de-layed by vitamin E and C supple-mentation. In conclusion thesedata show that increased lipopro-

THEMENSCHWERPUNKT

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tein oxidation could play an im-portant role in Alzheimer’s dis-ease and possibly provide a ratio-nale for the treatment of this dis-

ease with antioxidant drugs. Theclinical effect of this therapeuticalapproach remains to be proved inlong-term studies.

n Key wordsAlzheimer’s disease –antioxidants – lipoproteins –cerebrospinal fluid – oxidation

Einleitung

Oxidativer Stress spielt eine Rolle bei Alterungspro-zessen und bei der Pathogenese von degenerativenErkrankungen, wie der Artherosklerose oder derAlzheimer Krankheit (1). Der menschliche Körperist in der Sauerstoffatmosphäre der Erde ständig ak-tivierten Sauerstoffspezies (ROS) bzw. freien Radika-len, die chemisch äußerst reaktiv sind, ausgesetzt.ROS entstehen auch im Körper selbst, z.B. in der At-mungskette der Mitochondrien. Sie sind in der Lage,Biomoleküle wie DNA, Proteine oder Lipide zu oxi-dieren und so zu verändern, dass sie ihre normaleFunktion verlieren oder sogar pathogen wirkenkönnen. Um dem entgegenzuwirken besitzt derKörper zahlreiche antioxidative Mechanismen u.a.durch antioxidative Enzyme (z.B. Superoxid-Dis-mutase) oder durch mit der Nahrung aufgenommeneAntioxidantien, wie Vitamin C (Ascorbat) oder Vita-min E (�-Tocopherol). Überwiegt der Angriff freierRadikale über die antioxidative Abwehr des Körpers,spricht man von oxidativem Stress (1).

Hauptsubstrate der Lipidperoxidation durch freieRadikale, sind mehrfach-ungesättigte Fettsäuren(MUFS), wie Arachidon- oder Linolsäure, als Bestand-teile von Zellmembranen und Lipoproteinpartikeln.Die Oxidation wird initiiert durch eine Wasserstoff-abstraktion von einem eine Doppelbindung tragendesKohlenstoffatom, beispielsweise durch ein Hydroxyl-radikal, da die Bindungsenergie zwischen Wasserstoff-atom und Kohlenstoffatom dort relativ niedrig ist.Hierdurch wird eine Kettenreaktion gestartet, die zurOxidation von weiteren Fettsäuren und zur Bildungvon toxischen Abbauprodukten wie 4-Hydroxynone-nal (4-HNE) führt, ausgelöst (Abb. 1) (2). Diese Ket-tenreaktion kann durch lipophile Antioxidantien, diesich auf Lipoproteinpartikeln befinden, gestoppt wer-den. Besonders hervorzuheben ist die Rolle von Vita-min E (�-Tocopherol). Vitamin E wirkt entweder an-tioxidativ, indem es freie Radikale, wie das Hydroxyl-radikal abfängt, bevor es MUFS angreifen kann, oderdie Kettenreaktion der Lipidperoxidation unterbricht.Das dabei entstehende relativ reaktionsträge �-Toco-pherylradikal kann durch Vitamin C wieder zu �-To-copherol regeneriert werden. Findet die Lipidperoxi-dation von Fettsäuren auf Lipoproteinen statt, sprichtman von Lipoproteinoxidation. Dies schließt auch dieoxidative Modifikation von Apolipoproteinen und de-ren Derivatisierung mit Oxidationsprodukten wie4-HNA mit ein (2, 3).

Artherosklerose und ihre Folgeerkrankungen wiekoronare Herzkrankheit (KHK) oder Schlaganfallsind in den Industrieländern die häufigste Todes-ursache. Als Risikofaktoren gelten u. a. Rauchen, Dia-betes mellitus und Hyperlipidämien. Die Oxidationvon Lipoproteinen, insbesondere Lipoproteinen ge-ringer Dichte (engl.: Low-density-lipoproteins; LDL)wird als wichtiger Schritt bei der Entstehung der Ar-therosklerose diskutiert. Erhöhte LDL-Spiegel imPlasma führen zur Akkumulation von LDL in derArterienwand. Dort können freie Radikale, die vonaktivierten Makrophagen stammen, Lipoproteineoxidativ modifizieren. Oxidierte LDL-Partikel sindbevorzugte Liganden von spezifischen Scavenger-Re-zeptoren, die die ungeregelte Aufnahme von Choles-terin in Makrophagen vermitteln. Cholesterin akku-muliert in Makrophagen, die danach zu Schaumzel-len werden, die wichtige Bestandteile artheroskleroti-scher Ablagerungen sind. Es wurde gezeigt, dass beiPatienten mit KHK die in vitro Oxidation von Plas-malipoproteinen erhöht ist (4, 5).

Auch bei der Alzheimer Krankheit scheint oxida-tiver Stress eine wichtige Rolle zu spielen, über diegenauen Mechanismen ist allerdings viel weniger be-kannt, als bei der Artherosklerose. In post mortem

Abb. 1 Schematische Darstellung der Peroxidation von mehrfach-ungesättig-ten Fettsäuren. RH, Fettsäure; R•, Fettsäureradikal; OH•, Hydroxylradikal

Untersuchungen wurde im Hirngewebe von Alzhei-merpatienten im Vergleich zu Kontrollen mehr oxi-dativ modifizierte DNA, Proteine und Lipide gefun-den (6). Auch scheint das beta-Amyloid Peptid, einHauptbestandteil der Alzheimerplaques, eine Rollebei oxidativen Vorgängen zu spielen (7). Da im Li-quor cerebrospinalis, ähnlich wie im Plasma, Lipideauf Lipoproteinpartikeln transportiert werden (8),und die Oxidation von Lipoproteinen eine heraus-ragende Rolle bei der Enstehung der Artherosklerosespielt, haben wir die Rolle der Lipoproteinoxidationin Liquor und Plasma bei der Alzheimer Krankheituntersucht.

Methoden

n Patienten und Probenmaterial

Die Patienten wurden in der Gedächtnissprechstundeder Psychiatrischen Klinik des UniversitätsklinikumHamburg-Eppendorf untersucht und die Diagnoseder Alzheimer Krankheit nach internationalen Studi-enkriterien (DSM-IV, NINCDS-ADRDA) gestellt.Plasma und Liquorproben wurden im Rahmen vondiagnostischen Punktionen mit Einwilligung der Pa-tienten nach eingehender Aufklärung gewonnen. Umunspezifische Oxidation zu vermeiden, wurde Liquorcerebrospinalis und EDTA-Plasma nach Punktion in-nerhalb von 25 min unter Stickstoff bei –80 �C einge-froren und erst direkt vor den Messungen aufgetaut.

n Lipoproteinoxidation

Die Bestimmung der Oxidierbarkeit von Liquor- undPlasmalipoproteinen erfolgte in Anlehnung an eineMethode, die für die Oxidation von isolierten LDL-Partikeln entwickelt wurde (9–11). Zwischenprodukteder Oxidation von mehrfach-ungesättigten Fettsäu-ren, sogenannte konjugierte Diene (Abb. 1), besitzenein Absorptionsmaximum bei 234 nm. Liquor bzw.Plasmaproben werden mit Phosphatpuffer (PBS)verdünnt und bei 37 �C entweder ohne Zusatz vonProoxidantien (Autooxidation) oder unter Zusatz desProoxidans 2,2�-Azobis-(2-Amidinopropane) (AAPH)inkubiert und die Absorption bei 234 nm kontinuier-lich registriert. Hieraus ergeben sich charakteristi-sche Oxidationsverläufe für Plasma (11) und Liquor(Abb. 2). Im dreiphasigen Verlauf der Liquoroxida-tion lassen sich Verzögerungs-, Propagations- undPlateauphase unterscheiden. In der Verzögerungs-phase findet noch keine Oxidation von Lipoprotei-nen statt, da diese noch durch Antioxidantiengeschützt sind, die während dieser Phase verbraucht

werden (10). Als Mass für die Oxidierbarkeit wirdsowohl die Dauer der Verzögerungsphase, als auchihre Steigung berechnet, die die Produktionsrate vonkonjugierten Dienen widerspiegelt.

n Antioxidantien

�-Tocopherol, das wichtigste lipohile Antioxidans,und Ascorbat, das wichtigste hydrophile Antioxidanswurden in Liquor und Plasma bestimmt. �-Tocophe-rol wurde mittels High Performance Liquid Chroma-tography (HPLC), Ascorbat spektrophotometrischgemessen, wie an anderer Stelle beschrieben (10, 12,13).

n Fettsäuren

Um den Anteil der mehrfach-ungesättigten Fettsäu-ren als Hauptsubstrat der Lipoproteinoxidation zubestimmen, wurde die Fettsäurezusammensetzungmittels Gaschromatographie mit Flammenindukti-onsdetektion bestimmt und der Anteil der mehrfach-ungesättigten Fettsäuren errechnet wie beschrieben(10).

n Supplementierung mit Antioxidantien

Um den Einfluss der Einnahme von Antioxidantienauf die Lipoproteinoxidation im Liquor cerebrospi-nalis zu bestimmen, wurde in einer Studie mit zehnAlzheimerpatienten über einen Monat 400 mg Vita-min E und 1000 mg Vitamin C täglich gegeben. Oxi-

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Abb. 2 Typischer Verlauf der Lipoproteinoxidation in Liquor cerebrospinalis.Liquor wurde 10fach mit PBS verdünnt und bei 37 �C in Abwesenheit vonexogenen Oxidantien (Autooxidation) inkubiert. Die Absorption bei 234 mwurde in fünfminütigen Intervallen gemessen und ergibt einen typischendreiphasigen Verlauf (nach (10))

dationsparameter wurden in Liquor und Plasma vorund nach Substitution bestimmt.

Ergebnisse

Wir haben Liquor- und Plasmaproben von 29 Alz-heimerpatienten und 29 nicht dementen Kontrollenbezüglich ihres Lipidgehaltes, den Spiegeln von lipo-philen und hydrophilen Antioxidantien und derLipoproteinoxidierbarkeit in vitro untersucht (14).Die Oxidierbarkeit von Lipoproteinen im Liquor warbei Alzheimerpatienten im Vergleich zu nicht de-menten Kontrollen signifikant erhöht. Die Dauer derVerzögerungsphase der Liquoroxidation war bei Alz-heimerpatienten signifikant kürzer, wogegen die Oxi-dationsrate in dieser Phase signifikant erhöht war(Abb. 3). Mehrfach-ungesättigte Fettsäuren, dasHauptsubstrat der Lipidperoxidation, und der Spiegeldes hydrophilen Antioxidans Ascorbat waren imLiquor cerebrospinalis von Alzheimerpatienten deut-lich erniedrigt (Tabelle 1). Wir fanden einen nichtsignifikanten Trend zu niedrigeren �-Tocopherol-Spiegeln im Liquor cerebrospinalis von Alzheimerpa-tienten. Für die Oxidationsparameter im Plasma fan-den wir ebenfalls eine beschleunigte Lipoproteinoxi-dation bei Alzheimerpatienten (14).

Die Supplementierung von Viatmin E und C beizehn Alzheimerpatienten über einen Monat führtezu einer erhöhten Resistenz der Liquorlipoproteinegegenüber in vitro Oxidation, insbesondere zu einerReduzierung der Oxidationsrate in der Verzö-gerungsphase (Abb. 4) und der Propagationsphase(Daten nicht dargestellt). Die Dauer der Verzö-gerungsphase wies eine nicht signifikante Erhöhungauf (Abb. 4) (17).

Diskussion

Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse weisendarauf hin, dass Lipoproteinoxidation nicht nur inder Pathogenese der Artherosklerose, sondern auchin der Pathogenese der Alzheimer Krankheit ein Rol-le spielen könnte. Während die Rolle von oxidiertenLipoproteinen bei der Entstehung der Artherosklero-se schon weitgehend aufgeklärt ist, gibt es über dieRolle der Lipoproteinoxidation bei der AlzheimerKrankheit nur wenige Arbeiten. Es ist gezeigt wor-den, dass die Liquorlipoproteinoxidation bei Alz-heimerpatienten erhöht ist (14, 15) und oxidierte Li-quorlipoproteine neurotoxisch wirken können (15,16). Diese Daten bilden die Grundlage für Therapie-versuche der Alzheimer Krankheit mit Antioxidan-tien, die die Lipoproteinoxidation beeinflussen. Diein vitro Messung der Lipoproteinoxidation im Liquoroder Plasma kann hierbei zur Therapiekontrollenützlich sein. Wir konnten zeigen, dass eine gleich-zeitige Supplementierung der Antioxidantien Vita-min E und C über einen Monat zu einer Verzö-

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Abb. 3 Oxidationsrate und Dauer der Verzögerungsphase der Liquoroxidati-on (Autooxidation) von Alzheimerpatienten und Kontrollen (Mittelwerte±Standardabweichung). Liquor wurde 10fach mit PBS verdünnt und bei37 �C inkubiert. Die Signifikanz der Differenz zwischen den Gruppen ist alsp-Wert dargestellt

Tab. 1 Mehrfach-ungesättigte Fettsäuren (MUFS) und Antioxidantien imLiquor cerebrospinalis von Alzheimerpatienten und Kontrollen

Alzheimerpatienten(n=29)

Kontrollen(n=29)

MUFS % a 11,0±4,9 *** 15,0±2,7Ascorbat (�M) 166,7±40,9 ** 193,4±27,7�-Tocopherol (nM) 45,5±34,6 56,7±28,4

a Prozent von Gesamtfettsäuren; *** p<0,001; ** p<0,01

Abb. 4 Oxidationsrate und Dauer der Verzögerungsphase der AAPH-indu-zierten Liquoroxidation von Alzheimerpatienten (n=10) vor und nach Einnah-me von Vitamin C 1000 mg/die und Vitamin E 400 mg/die über einen Monat.(Mittelwerte±Standardabweichung). Liquor wurde 10fach mit PBS verdünntund bei 37 �C unter Zusatz von 100 �M AAPH inkubiert. Die Signifikanz derDifferenz zwischen den Gruppen ist als p-Wert dargestellt. n.s., nicht signifi-kant

Kontrollen Alzheimerpat. Kontrollen Alzheimerpat.

gerung der Lipoproteinoxidation im Liquor führt,wobei besonders die Oxidationsrate in der Verzö-gerungs und Propagationsphase reduziert wird (17).Die klinische Wirkung dieser und anderer Antioxi-dantien muss über einen längeren Zeitraum geprüftwerden, wobei ein günstiger Effekt auf den Krank-heitsverlauf für die Gabe von Vitamin E allein be-reits gezeigt werden konnte (18).

Zusammenfassend scheint die Oxidation von Li-poproteinen nicht nur bei der Artherosklerose, son-dern auch bei der Alzheimer Krankheit eine wichtigeRolle zu spielen, deren genauer Pathomechanismusnoch aufgeklärt werden muss.

n Danksagung Diese Daten wurden im Rahmen der Forscher-gruppe „Molekulare Pathomechanismen der Alzheimer Erkran-kung“ erhoben, die von der Deutschen Forschungsgemeinschaftunterstützt wird (FOR 267/2–1).

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Literatur

1. Gutteridge JMC, Halliwell B (1994),Antioxidants in Nutrition, Health andDisease, Oxford University Press, Ox-ford New York Tokio

2. Stocker R (1994) Lipoprotein oxida-tion: mechanistic aspects, methodolo-gical approaches and clinical rele-vance. Curr Opin Lipidol 5:422–433

3. Steinberg D, Parthasarathy S, CarewTE, Khoo JC, Witztum JL (1989) Be-yond cholesterol. Modifications oflow-density lipoprotein that increaseits atherogenicity. N Engl J Med 320:915–924

4. Kontush A, Beisiegel U (1999) Mea-surement of oxidizability of bloodplasma. Methods Enzymol 49:29 935–29949

5. Steinberg D (1997) Low density lipo-protein oxidation and its pathobiolo-gical significance. J Biol Chem 272:20963–20 966

6. Markesbery WR (1997) Oxidativestress hypothesis in Alzheimer’s dis-ease. Free Radic Biol Med 23:134–147

7. Mark RJ, Blanc EM, Mattson MP(1996) Amyloid beta-peptide and oxi-dative cellular injury in Alzheimer’sdisease. Mol Neurobiol 12:211–224

8. Koch S, Donarski N, Goetze K,Kreckel M, Stuerenburg HJ, BuhmannC, Beisiegel U (2001) Characteriza-tion of four lipoprotein classes in hu-man cerebrospinal fluid. J Lipid Res1143–1151

9. Esterbauer H, Striegl G, Puhl H,Rotheneder M (1989) Continuousmonitoring of in vitro oxidation ofhuman low density lipoprotein. FreeRadic Res Commun 6:67–75

10. Arlt S, Finckh B, Beisiegel U, KontushA (2000) Time-course of oxidation oflipids in human cerebrospinal fluidin vitro. Free Radic Res 32:103–114

11. Kontush A, Spranger T, Reich A, Dja-hansouzi S, Karten B, Braesen JH,Finckh B, Kohlschutter A, Beisiegel U(1997) Whole plasma oxidation assayas a measure of lipoprotein oxidiz-ability. Biofactors 6:99–109

12. Finckh B, Kontush A, Commentz J,Hubner C, Burdelski M, KohlschutterA (1999) High-performance liquidchromatography-coulometric electro-chemical detection of ubiquinol 10,ubiquinone 10, carotenoids, and toco-pherols in neonatal plasma. MethodsEnzymol 299:341–348

13. Spranger T, Finckh B, Fingerhut R,Kohlschutter A, Beisiegel U, KontushA (1998) How different constituentsof human plasma and low density li-poprotein determine plasma oxidiz-ability by copper. Chem Phys Lipids91:39–52

14. Schippling S, Kontush A, Arlt S, Buh-mann C, Sturenburg HJ, Mann U,Muller-Thomsen T, Beisiegel U (2000)Increased lipoprotein oxidation inAlzheimer’s disease. Free Radic BiolMed 28:351–360

15. Bassett CN, Neely MD, Sidell KR,Markesbery WR, Swift LL, MontineTJ (1999) Cerebrospinal fluid lipopro-teins are more vulnerable to oxida-tion in Alzheimer’s disease and areneurotoxic when oxidized ex vivo. Li-pids 34:1273–1280

16. Neely, Swift LL, Montine T (2000)Human, but not bovine, oxidized ce-rebral spinal fluid lipoproteins dis-rupt neuronal microtubules. Lipids35:1249–1257

17. Kontush A, Mann U, Arlt S, Ujeyl A,Luhrs C, Müller-Thomsen T, BeisiegelU (2001) Influence of vitamin E andC supplementation on lipoproteinoxidation in patients with Alzhei-mer’s disease. Free Radic Biol Med31:345–354

18. Sano M, Ernesto C, Thomas RG,Klauber MR, Schafer K, GrundmanM, Woodbury P, Growdon J, CotmanCW, Pfeiffer E, Schneider LS, Thal LJ(1997) A controlled trial of selegiline,alpha-tocopherol, or both as treat-ment for Alzheimer’s disease. TheAlzheimer’s Disease CooperativeStudy. N Engl J Med 336:1216–1222