Mechanismus der V(D)J Rekombination

Signale auf DNA Ebene: RSS

Rekombinasekomplex

Spaltung und Verknüpfung der Segmente

V(D)J Rekombination

Deletion undInversion

Erkennungssequenzen auf DNA EbeneRSS: „recognition signal sequences“

1-turn Signal: Heptamer-12-Nonamer

2-turn Signal: Heptamer-23-Nonamer

Rekombination nur zwischen 1-turn Signalund einem 2-turn Signal möglich

weiss: 1-turnschwarz: 2-turn

Anordnung der RSS für einen Lokus identisch,bei verschiedenen Loci unterschiedlich

Verknüpfung der Signalenden: präziseVerknüpfung der kodierenden Segmente: „unpräzise“

Einzelschritte der V(D)J Rekombination:

Zusammenführungder Signale

Spaltung und Bildung der Haarnadelschleife

Öffnen der Haarnadelschleifeund Endbearbeitung

Reparatur undLigation

Synapsis:

kombiniertes Schneiden,Zusammenführen der Enden

in Komplex, der alle 4 Enden bindet

V(D)J Rekombinase:RAG1 und RAG2 (recombination activation genes)

einzige lymphoid-spezifische Faktoren für Rekombinationandere Faktoren in allen Zellen vorhanden

k.o. Mäuse: keine reifen T und B Zellen, keine anderen Defekte

RAG1 + RAG2 binden RSS und spalten DNA zwischenHeptamer und kodierendem Segment

2 Stufen:Nick am 5´-Ende des HeptamersHairpin Bildung

Mg2+HMG1 und 2 erhöhen Effizienz der Spaltung am 2-turn RSSund bevorzugte 1-turn + 2-turn Paarung

Spätere Stadien der Rekombination:Spalten des Hairpin und Verknüpfung der Enden

DNA Doppelstrangbruch-Reparaturenzyme:

DNA-PKArtemisKu ProteineDNA Ligase IVXRCC4Histon H2AXMre11/Rad50/Nbs1 Komplex

Öffnen des Hairpin:

DNA-PK phosphoryliert und aktiviert Artemis,Endonuklease, welche Hairpin spaltet

„Junctional Diversity“

„Coding joints“

Nukleotide gehen verloren, kommen neu dazu (ohne Template)

P-Nukleotide: „hairpin“

N-Nukleotide: TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) bis zu 15 N

Exonuklease

Artemis: bei Defekt humane SCID FormDNA-PK bindet und aktiviert Artemis durch Phosphorylierung,Artemis bekommt dadurch Endonuklease-Aktivität für Hairpin und5´- und 3´-überhängende Einzelstrang-DNA

DNA-PKbesteht aus Katalyt. DNA-PKs Untereinheit und Ku Protein-Heterodimer (Ku70 und Ku80)Ku bindet DNA, überbrückt Enden

DNA Ligase IV / XRCC4 Komplexauch wichtig, da defekte Zellen bestrahlungssensitiv sind, und keine signal- oder coding joints machen können

weiters vermutlich beteiligt:Histon H2AX

Mre11/Rad50/Nbs1 Komplex: DNA repair in Hefefördert Verknüpfung von DNA an Mikrohomologien ?

Nonhomologous DNA end-joining proteins

Regulation der Zugänglichkeit eines Lokus

Hypothesen:Germ line TranskriptionDNA DemethylierungHiston Acetylierung

Rekombination und transkriptionelle Aktivität

Non T cells

Early thymocytes

E deleted

Stadien der B Zellreifung

Stadien der T Zellreifung

M