Untersuchungen zur Kontrolle der VDJ-Rekombination am IgH ... · Untersuchungen zur Kontrolle der VDJ-Rekombination am IgH-Lokus Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität

Untersuchungen zur Kontrolle der

VDJ-Rekombination am IgH-Lokus

Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Johannes Lutz

aus Wiesbaden

2006

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 21.12.2006

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. H.-M. Jäck

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. T. Winkler

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ......................................................................................3

2 Summary.......................................................................................................5

3 Einleitung......................................................................................................7

3.1 B-Zellentwicklung und V(D)J-Rekombination ......................................................................... 7

3.2 Sekundäre Ig-Gen-Rearrangements..................................................................................... 12

3.3 Allelausschluss...................................................................................................................... 14

3.4 Nonsensense-vermittelter mRNA Abbau in Lymphozyten.................................................... 21

4 Aufgabenstellung.......................................................................................23

5 Ergebnisse..................................................................................................25

5.1 VH-Replacement bei Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiven VDJ-Allelen.......................... 25

5.1.1 Etablierung einer transgenen Maus mit zwei nicht-produktiven VDJ–-Allelen ............ 27 5.1.2 B-Zellentwicklung in Knochenmark und Milz der IgHVDJ–/VDJ–-Mäuse ......................... 27 5.1.3 Sequenzanalyse produktiver µH-Ketten-Gene ........................................................... 30 5.1.4 Zeitpunkt des VH-Replacements ................................................................................. 32 5.1.5 B-Zellentwicklung in der Gegenwart langer CDR-3H-Regionen................................. 35 5.1.6 Konkurrenz zwischen B-Zellen mit einem VH-ersetzten und B-Zellen mit einem regulär

rekombinierten VDJ-Exon in heterozygoten IgHVDJ–/wt-Mäusen .................................. 37

5.2 Kontrolle der VDJ-Rekombination am IgH-Lokus durch eine nicht-produktive µ-mRNA...... 39

5.2.1 Etablierung einer transgenen Maus mit einer stabilisierten Nonsense-µ-mRNA........ 42 5.2.2 Bestimmung der Kopienzahl und des Integrationsortes des Transgens .................... 42 5.2.3 Expressions-Niveau der stabilisierten Ter3-Nonsense-µ-mRNA................................ 47 5.2.4 B-Zellentwicklung in Gegenwart der Ter3-µ-mRNA.................................................... 50 5.2.5 Komplementation der B-Zellentwicklung durch ein produktives VDJ-Exon ................ 54 5.2.6 Abwesenheit von µH-Ketten-Signalen in rekombinations-defizienten Ter3-transgenen

Pro-B-Zellen ................................................................................................................ 56 5.2.7 Expression der endogenen IgH-Keimbahn-Transkripte.............................................. 58 5.2.8 VH-Replacement in Gegenwart der Ter3-µ-mRNA...................................................... 60 5.2.9 VH-Repertoire in Ter3-transgenen Tieren ................................................................... 62 5.2.10 Anteil der B-Zellen mit VDJ+/VDJ–-Konfiguration ........................................................ 63

6 Diskussion..................................................................................................65

6.1 VH-Replacement in Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiven VDJ-Allelen ............................ 65

6.2 Entwicklung von B-Zellen mit langen CDR3-H-Regionen..................................................... 68

6.3 Hemmung der VDJ-Rekombination am IgH-Lokus durch µH-Ketten-Transkripte................ 70

Inhaltsverzeichnis

6.3.1 Effekte von Ter3-µ-Transkripten auf die B-Zellentwicklung und VDJ-Rekombination 71 6.3.2 RNA-vermittelte Mechanismen.................................................................................... 72 6.3.3 Alternative Mechanismen ............................................................................................ 76 6.3.4 Erweitertes Feedback-Modell zur Allelausschluss am IgH-Lokus............................... 77 6.3.5 Zusammenfassung ...................................................................................................... 80

7 Material und Methoden ............................................................................. 81

7.1 Material.................................................................................................................................. 81

7.1.1 Antikörper .................................................................................................................... 81 7.1.2 Oligonukleotide............................................................................................................ 81 7.1.3 Mäusestämme ............................................................................................................. 83

7.2 Molekularbiologische Methoden............................................................................................ 83

7.2.1 Präparation von Plasmid-DNA und Restiktionsverdaus.............................................. 83 7.2.2 Herstellung und Transformation elektrokompetenter Bakterien.................................. 83 7.2.3 DNA für Oozyten-Injektion........................................................................................... 84 7.2.4 DNA für ES-Zell-Transfektion ...................................................................................... 84 7.2.5 Southern-Blot-Analyse................................................................................................. 85 7.2.6 PCR ............................................................................................................................. 86 7.2.7 RT-PCR ....................................................................................................................... 86 7.2.8 Site-directed Mutagenese............................................................................................ 86 7.2.9 DNA-Sequenzierungen................................................................................................ 87 7.2.10 Bestimmung des Transgen-Insertionspunkts per Zirkel-PCR ..................................... 87 7.2.11 Einzelzell-PCR............................................................................................................. 88 7.2.12 Genotypisierung transgener Mäuse ............................................................................ 89 7.2.13 Durchflusszytometrie (FACS) ...................................................................................... 89 7.2.14 Durchflusszyometrische (FACS) und magnetische (MACS) Zellsortierungen............ 90 7.2.15 Nachweis der Ig-Isotypen im Serum ........................................................................... 91

8 Literaturverzeichnis .................................................................................. 93

9 Anhang..................................................................................................... 105

9.1 Veröffentlichungen .............................................................................................................. 105

9.2 Lebenslauf ........................................................................................................................... 107

1. Zusammenfassung

3

1 Zusammenfassung Um den Organismus vor Pathogenen mit sich verändernden, unbekannten Strukturen zu schützen, produziert das erworbene Immunsystem eine gewaltige Anzahl von B-Zellen mit unterschiedlichen B-Zellrezeptoren (BZRs). Die Vielfalt der BZRs wird hierbei durch die VDJ-Rekombination erzeugt, bei der die Gene für die schwere und leichte Immunglobulin-(Ig-) Kette in den sich entwickelnden B-Zellen aus verschiedenen Gensegmenten zusammengestellt werden. Diese Promotionsarbeit beschäftigt sich mit zwei Aspekten der VDJ-Rekombination am Immunglobulin-Schwerketten-(IgH-) Lokus, die in Progenitor-(Pro-) B-Zellen stattfindet. Im ersten Teil werden die Folgen eines nicht-produktiven Rearrangements untersucht. Da die VDJ-Rekombination ein ungenauer Prozess ist, tragen rund Zwei-Drittel der erzeugten Ig-Gene eine Verschiebung im Leseraster, was zu einer großen Anzahl von Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiv rearrangierten IgH-Allelen führt. Solche Zellen werden durch Apoptose eliminiert, da ihnen essentielle, durch die Expression einer schweren µH-Kette auf der Oberfläche ausgelöste Überlebenssignale fehlen. Allerdings wurden sekundäre Rearrangements von stromaufwärts gelegenen VH-Gensegmenten in rearrangierte VDJ-Exons in Mäusen beschrieben, die eine transgene produktive µH-Kette tragen. Falls dieses VH-Replacement unabhängig von µH-Ketten-Signalen verläuft, könnte es auch nicht-produktive VDJ-Exons verändern und so Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiven Allelen retten. Um diese Hypothese zu testen, wurden die JH-Gensegmente einer Maus durch ein nicht-produktives VDJ–-Exon ersetzt. Überraschenderweise war die B-Zellentwicklung in IgHVDJ–/VDJ–-Mäusen nur geringfügig gestört, da durch ein RAG-abhängiges VH-Replacement eine beachtliche Anzahl an IgM-positiven B-Zellen produziert wurde. Eine weitere einmalige Eigenschaft der transgenen Mäuse war die Anwesenheit von IgH-Ketten mit ungewöhnlich langen Complementarity-Determining Regions 3 (CDR3-Hs). Diese IgH-Ketten waren trotzdem funktional und wurden nur geringfügig gegenselektioniert, was gegen strikte Längenbeschränkungen für die CDR3-H-Regionen spricht. Der zweite Teil der Promotionsarbeit beschäftigt sich mit dem Allelausschluss am IgH-Lokus. Obwohl beide IgH-Allele rekombiniert werden können, darf jede B-Zelle nur eine IgH-Kette produzieren, um die Monospezifität des BZRs zu wahren. Daher muss die Rekombination des zweiten IgH-Allels nach einem produktiven Rearrangement auf dem ersten Lokus gestoppt werden. Um zu testen, ob bereits die stabile µ-mRNA als direkte Folge eines produktiven Rearrangements die VDJ-Rekombination auf dem zweiten Lokus dämpfen kann, wurde eine transgene Maus etabliert, die eine stabile Nonsense-µ-mRNA mit einem Stopkodon im Leader-Peptid exprimiert. In diesen Tieren war die B-Zellentwicklung beim Übergang vom Pro-B- zum Prä-B-Zellstadium gestört und der Anteil der µH-Ketten-negativen Pro-B-Zellen erhöht. Da einerseits die Störung im Pro-B-Zellstadium durch ein produktives µH-Ketten-Transgen komplementiert werden konnte und andererseits das VH-Replacement in den transgenen B-Zellen ebenfalls reduziert ist, scheint die transgene µ-mRNA spezifisch die VDJ-Rekombination am IgH-Lokus in Pro-B-Zellen zu reduzieren. Aufgrund dieser Beobachtungen schlagen wir ein erweitertes Feedback-Modell zum Allelausschluss vor, bei dem die µ-mRNA einen kurzfristigen dämpfenden Effekt auf die Rekombination am zweiten Allel ausübt, bis Prä-BZR-Signale von der Oberfläche die Rekombination endgültig terminieren

2. Summary

5

2 Summary The adaptive immune system creates an enormous number of B cells with different B cell receptors

(BCRs) to protect the organism against pathogens with changing and unknown structures. The

diversity of the BCRs is created by VDJ recombination, which assembles the genes for the heavy and

light immunoglobulin (Ig) chains from different gene segments. This thesis focuses on two aspects of

the VDJ recombination at the Ig heavy (IgH) chain locus, which occurs in Progenitor-(Pro-) B cells.

In the first part, the consequences of a nonproductive rearrangement are investigated. Inaccurate VDJ

rearrangements generate a large number of pro-B cells with two nonproductive IgH alleles. Such cells

lack essential survival signals mediated by surface IgM heavy chain (µH chain) expression and are

normally eliminated. However, secondary rearrangements of upstream VH gene segments into

assembled VDJ exons have been described in mice transgenic for productive µH chains, a process

known as VH replacement. If VH replacement was independent of µH chain signals, it could also

modify nonproductive VDJ exons and thus rescue pro-B cells with unsuccessful rearrangements on

both alleles. To test this hypothesis, we homologously replaced the JH cluster of a mouse with a

nonproductive VDJ– exon. Surprisingly, B cell development in IgHVDJ–/VDJ– mice was only slightly

impaired and significant numbers of IgM-positive B cells were produced. DNA sequencing confirmed

that all VDJ sequences from µH chain-positive B lymphoid cells were generated by VH replacement in

a RAG-dependent manner. Another unique feature of our transgenic mice was the presence of IgH

chains with unusually long Complementarity-Determining Regions 3 regions (CDR3-Hs). Such IgH

chains were nevertheless functional and only modestly counter-selected, arguing against strict length

constraints for CDR3-H regions. In conclusion, VH replacement can occur in the absence of a µH chain

signal and provides a potential rescue mechanism for pro-B cells with two nonproductive IgH alleles.

The second part of this thesis deals with the establishment of allelic exclusion at the IgH locus. Even

though both IgH alleles can be rearranged each B cell may only express one IgH chain to maintain

monospecificity. Therefore, rearrangement of the second allele must be stopped once a productive

rearrangement has been performed on the first allele. To test the hypothesis, that already a stable µH

chain (µ-) mRNA as primary result of a productive rearrangement can reduce recombination of the

second IgH allele, a transgenic mouse was generated, which expresses a stable nonsense µ-mRNA

with a stop codon in the leader peptide. In these animals B cell development was impaired at the pro-

B to pre-B cell transition with an increased number of µH chain negative pro-B cells and a reduced VH

replacement. The effect of the transgenic µ-mRNA seems to specifically reduce VDJ recombination at

the IgH locus because this impairment could be complemented by a productive µH chain transgene.

Based on these observations we propose an extended feedback model for allelic exclusion at the IgH

locus, in which the µ-mRNA exerts a short-term reducing effect on the recombination of the second

allele until recombination is terminated by surface pre-BCR signals.

3. Einleitung

7

3 Einleitung

3.1 B-Zellentwicklung und V(D)J-Rekombination

Die B-Zellentwicklung, die anfangs in der fötalen Leber und später im adulten

Knochenmark stattfindet, beginnt mit der Differenzierung pluripotenter

hämatopoetischer Stammzellen (HSZ) in Progenitor-(Pro-) B-Zellen (Abb. 1). Pro-B-

Zellen sind durch die Expression des Transkriptionsfaktors Pax5 auf die B-

Zellentwicklung festgelegt und tragen die Oberflächenmarker c-kit und, wie alle B-

Zellfolgestadien außer der Plasmazelle, CD19. Molekular sind Pro-B-Zellen durch die

somatische DNA-Rekombination am Immunglobulin-Schwerketten-(IgH-) Lokus

gekennzeichnet, bei der durch die Verknüpfung von Variable-(V-), Diversity-(D-) und

Joining-(J-) Gensegmenten ein VDJ-Exon erstellt wird. Das VDJ-Exon kodiert für die

V-Region der schweren Immunglobulin-Kette und bildet zusammen mit der V-Region

der leichten Ig-(IgL-) Kette die Antigenbindungstelle eines membrangebundenen B-

Zellrezeptors beziehungsweise eines sezernierten Antikörpers (zusammengefasst in

Jung et al. 2006). Die VDJ-Rekombination erzeugt eine große Anzahl

unterschiedlicher V-Regionen und ist damit die Grundlage für die immense

Antikörpervielfalt und das Funktionieren des erworbenen Immunsystems.

Am IgH-Lokus findet die VDJ-Rekombination in zwei Schritten statt, für die der Lokus

durch Chromatinmodifikationen schrittweise geöffnet wird (zusammengefasst in

Chowdhury and Sen 2004; Jung et al. 2006). In der frühen Pro-B-Zelle werden

zunächst auf beiden Allelen jeweils ein D- und ein JH-Gensegment durch nicht-

homologe Rekombination verknüpft (Abb. 2a). Anschließend werden in der späten

Pro-B-Zelle die stromaufwärts von den D- und JH-Segmenten liegenden VH-

Segmente geöffnet, der Lokus wird kontrahiert (Fuxa et al. 2004), und ein VH-

Segment wird mit einem DJ-Rearrangement verknüpft.

Molekular wird die Rekombination von den Lymphozyten-spezifischen Enzymen

RAG1 und RAG2 (Recombination-activating Genes 1 und 2) und den ubiquitär

vorkommenden DNA-Doppelstrangbruch-Reparaturenzymen Ku70, Ku80, XRCC4,

DNA-Ligase IV, DNA-abhänigen Proteinkinase (DNA-PK) und Artemis vermittelt

(Abb. 3, zusammengefasst in Bassing et al. 2002). Die RAG-Enzyme erkennen

3. Einleitung

++++++-Igα/Igβ

+++++/---Intrazell. IgM

----++-TdT

-++-++-Rag1/2

++-----Membran-IgM

-+/-++---CD25

----+++c-kit

++++++-CD19

VJVJVJ°°°°Igκ/λ

VDJVDJVDJVDJVDJDJ°IgH

Reife BUnreife B

Kleine Prä-B

Große Prä-B

Späte Pro-B

Frühe Pro-B

HSZ

Konf

igur

atio

nde

r Ig-

Lozi

O

berfl

äche

n-m

arke

rIn

traze

llulä

reM

arke

r

Abb. 1. B-Zellentwicklungsstadien mit der Konfiguration der Ig-Lozi und der Angabe von differenzierungs-spezifischen Oberflächen- und intrazellulären Marker. HSZ: Hämatopoetische Stammzelle, Ig° = Keimbahn-Konfiguration der entsprechenden Lozi

spezifische, die Ig-Gensegmente flankierende Rekombinationssignalsequenzen

(RSS, Abb. 2, Fugmann et al. 2000) und beginnen die V(D)J-Rekombination, indem

sie zwischen den beiden zu verknüpfenden Ig-Segmenten und ihren RSS einen

Doppelstrangbruch einfügen (Abb. 3B, McBlane et al. 1995). Das freie 3’-OH Ende

an beiden Ig-Segmenten wird dann jeweils mit dem eigenen Komplementärstrang zu

einer Haarnadelstruktur verknüpft (Coding Joints), während die beiden RSS-Enden

miteinander verknüpft werden und einen Signal Joint bilden (Abb. 3C). Die

Haarnadelstrukturen der beiden Ig-Segmente werden dann von der Endonuklease

Artemis durch einen Einzelstrangschnitt wieder geöffnet und nach Prozessierung zu

stumpfen Enden durch die exonukleolytische Aktivität von Artemis und durch

Polymerasen untereinander verknüpft (Abb. 3D-G, Rooney et al. 2004). Da die

Haarnadelstrukturen nicht an der gleichen Base geöffnet werden müssen, an der die

ursprüngliche Verknüpfung stattgefunden hat, kann die dazwischenliegende 8

3. Einleitung

9

23bp-RSS 12bp-RSS

Keimbahn

DJ

VDJ

23bp RSS

VH DDVH JHJH Cµ

VH DVH JHJH Cµ

VH DVH JHJH Cµ

12bp RSS 23bp RSS

A) Primäre Rekombination am IgH-Lokus

Keimbahn

VJ

VκVκ JκJκ Cκ

VκVκ JκJκ Cκ

12bp RSS 23bp RSS

B) Primäre Rekombination am Igκ-Lokus

Kryptische RSS

VH DVH JHJH CµVH

VH DVH JHJH CµVH

C) Sekundäre Rekombination am IgH-Lokus (VH-Replacement)

D) Sekundäre Rekombination am Igκ-Lokus

VκVκ JκJκ Cκ

Vκ Jκ Cκ

Abb. 2. Primäre und sekundäre Rekombinationen an den Ig-Lozi. Dargestellt sind die über Rekombinationssignalsequenzen (RSS) mit 23bp- (schwarze Dreiecke) oder 12bp-langen Spacern(graue Dreiecke) vermittelten primären (A, B) und sekundären (D) Rekombinationen, sowie das über die kryptische RSS (weißes Dreieck) vermittelte VH-Replacement (C).

3. Einleitung

D JH

D

JH

D

JH JH OH

DOH

D JH

OH

OH

D JH

D

CGCGCG

CGCGCG

AGCTCG

JHCGATCG

D CGCGCG NNN JHCGATCGNNN

A

B

C

D

E

F

G

Doppelstrangbruch durch Rag

Rekombinationssignalsequenzen (RSS)

Anhängen von N-Nukleotiden durch TdT

Coding Joints Signal Joint

Doppelstrangbruch durch Rag

Einzelstrangbruch durch Artemis

Einzelstrangbruch durch Artemis

Palindromische Nukleotide

AReko

bb. 3. Molekulare Schritte der V(D)J-Rekombination am Beispiel der D-nach-J-mbination am IgH-Lokus. Siehe Text für Erklärung.

10

3. Einleitung

Sequenz gespiegelt werden, was zu palindromischen (P-) Nukleotiden führt (Abb.

3D, E). Die Verknüpfungen werden durch die P-Nukleotide und die an der offenen

Bruchstelle durch die terminale Desoxynulkeotidyltransferase (TdT) zufällig

angefügten nontemplated-(N-) Nukleotide (Abb. 3F) diversifiziert, was als

Verknüpfungsdiversiät zusammen mit der rekombinatorischen Diversität das

Antikörperrepertoire erhöht. Um sicherzustellen, dass jeweils nur V- und D-

beziehungsweise D- und J-Segmente miteinander rekombiniert werden,

unterscheiden sich die RSS der beteiligten Gensegmente. Zwischen den relativ

konservierten Heptamer- und Nonamer-Sequenzen CACAGTG und ACAAAAACC,

die in allen RSS vorkommen, liegt eine Spacer-Sequenz, die bei den RSS von V-

und J-Gensegmenten 23bp und bei den RSS auf beiden Seiten des D-Segments

12bp lang ist (Abb. 2). Da die V(D)J-Rekombinationen fast ausschließlich zwischen

RSS mit unterschiedlich langen Spacern stattfinden (12/23-Regel), wird so eine

direkte Verknüpfung der V- und J-Segmente am IgH-Lokus verhindert (Early et al.

1980).

Nach einem produktiven Rearrangement wird die IgM-Schwere-(µH-) Kette

synthetisiert. Falls es sich um eine paarungsfähige µH-Kette handelt, bildet diese

zusammen mit der aus den Proteinen VpreB und λ5 bestehenden surrogaten

leichten (SL-) Kette und den Signalmolekülen Igα und Igβ den Prä-B-

Zellrezeptorkomplex (zusammengefasst in Bradl et al. 2005; Vettermann et al. 2006).

Dieser wird auf die Oberfläche transportiert, von wo er Signale induziert, die die

Diffrenzierung in frühe Prä-B-Zellen und deren klonale Expansion einleitet sowie die

Rekombination am IgH-Lokus terminiert. Falls bei dem VDJ-Rearrangement jedoch

das Leseraster durch das Einfügen von P- und N-Nukeotiden oder das Entfernen von

Nukleotiden verschoben wurde, das VDJ-Exon also nicht-produktiv ist, wird die

Rekombination auf dem zweiten Allel fortgesetzt. Ist auch das zweite Rearrangement

nicht-produktiv, so fehlen der Pro-B-Zelle essentielle Prä-BZR-vermittelte

Überlebenssignale, und sie geht durch Apoptose zugrunde.

Für Pro-B-Zellen mit einem produktiv rearrangierten VDJ-Exon und einer

paarungsfähigen µH-Kette bedeutet die Expression des Prä-BZRs den Übergang

vom Pro-B- in das in das frühe Precursor-(Prä-) B-Zellstadium, der mit einem Verlust

der c-kit- und der TdT-Expression einhergeht. Auch RAG1 und RAG2 werden

11

3. Einleitung

12

vorübergehend herunterreguliert (Grawunder et al. 1995). Stattdessen exprimieren

die frühen Prä-B-Zellen nun CD25 und durchlaufen eine kurze Proliferationsphase

mit 4-6 Zellteilungen, was zur selektiven Vervielfältigung von Prä-B-Zellen mit einer

funktionellen, mit IgL-Ketten paarungsfähigen IgH-Kette führt. Diese klonale

Expansion funktionaler Prä-B-Zellen trägt entscheidend zur Vergrößerung des Ig-

Repertoirs bei, da jeder daraus resultierende B-Zellvorläufer eine andere L-Kette und

somit einen Ig-Rezeptor mit einer anderen Spezifität produziert (Kawano et al. 2006,

Herrmann et al. unpublizierte Beobachtung). Der klonalen Expansion der frühen Prä-

B-Zellen folgt die Differenzierung in kleine, ruhende Prä-B-Zellen, die dann analog

zum Rearrangement am IgH-Lokus die κ- und λ-Leichtketten-Lozi umlagern (Abb.

2b). Nach erfolgreichem Rearrangement eines IgL-Gens wird eine IgL-Kette

produziert, die dann mit der IgH-Kette den für den Übergang ins unreife B-

Zellstadium notwendigen B-Zellrezeptor (BZR) bildet.

3.2 Sekundäre Ig-Gen-Rearrangements

Nach der Expression eines kompletten BZRs an der Zelloberfläche durchlaufen

unreife B-Zellen eine negative Selektion, bei der ihr BZR auf eine mögliche

Autoreativität überprüft wird. B-Zellen, die während dieser Phase Antigen binden,

werden je nach Signalstärke entweder durch Apoptose eliminiert oder verlieren ihre

Fähigkeit, auf Antigenstimuli zu reagieren, d.h., sie werden anergisch. Unreife B-

Zellen mit einem autoreaktiven BZR haben jedoch noch die Möglichkeit, durch

sekundäre Rearrangements der Ig-Lozi ihren BZR und damit ihre Antigen-Spezifität

zu ändern (Radic et al. 1993; Tiegs et al. 1993, zusammengefasst in Radic and

Zouali 1996; Nussenzweig 1998). Diese durch Antigenkontakt ausgelöste sekundäre

Umlagerung, die in diesem Fall als Rezeptor-Editing bezeichnet wird, findet

hauptsächlich durch Umlagerungen am IgL-Lokus statt, da die Keimbahn-VL- und -JL-

Segmente noch über die für die VJ-Rekombination benötigten RSS verfügen (Abb.

2c). Analog zum primären Rearrangement wird die RSS eines Keimbahn-VL-

Segments, das stromaufwärts vom rearrangierten VJ-Exon liegt, mit der RSS eines

stromabwärts gelegenen Keimbahn-JL-Segments verknüpft. Dieser Mechanismus ist

so effektiv, dass Mäuse, die im IgH- und Igκ-Lokus autoreaktive VDJ-Exons als

Transgene tragen, durch Rezeptorreditierung normale B-Zellzahlen erreichen (Chen

et al. 1997; Pelanda et al. 1997).

3. Einleitung

13

Ein Sonderfall der sekundären Rearrangements ist das VH-Replacement am IgH-

Lokus, bei dem das VH-Segment eines rearrangierten VDJ-Exons durch ein

stromaufwärts gelegenes Keimbahn-VH-Segment ersetzt wird (Abb. 2d, Kleinfield et

al. 1986; Reth et al. 1986; Chen et al. 1995, zusammengefasst in Zhang et al. 2004).

Mechanistisch unterscheidet sich das VH-Replacement von den primären

Rearrangements und dem Rezeptor-Editing am IgL-Lokus durch das Fehlen einer

regulären RSS im VDJ-Exon, mit der die RSS eines stromaufwärts gelegenen VH-

Segments verknüpft werden könnte. Stattdessen wird das VDJ-Exon an einer

kryptischen RSS intern am 3’-Ende des rekombinierten VH-Segments geöffnet. Die

kryptische RSS, die in fast allen VH-Gensegmenten vorhanden ist, besteht nur aus

einem Heptamer mit der Konsensus-Sequenz TACTGTG (Covey et al. 1990). Die

physiologische Funktion des VH-Replacements und die Häufigkeit, mit der es in

reifenden B-lymphoiden Zellen benützt wird, ist noch unklar. Ursprünglich wurden VH-

Replacements in Zelllinien entdeckt, die so ihre VDJ-Exons änderten (Kleinfield et al.

1986; Reth et al. 1986). Später wurden sie auch in transgenen Mausmodellen

beobachtet, bei denen über homologe Rekombination ein produktives VDJ-Exon mit

einer kryptischen RSS in den IgH-Lokus eingefügt worden war (Chen et al. 1995;

Taki et al. 1995; Cascalho et al. 1996). Besonders bei Transgenen, die für

autoreaktive BZRs kodierten, wurde eine hohe Anzahl an B-Zellen gefunden, die ihre

autoreaktive Spezifität durch VH-Replacements verloren hatten, weshalb es auch als

Toleranzmechanismus beschrieben wurde (Chen et al. 1995). Allerdings findet man

VH-Replacement auch in einer transgenen Maus mit einer nicht-autoreaktiven VH-

Kette (Cascalho et al. 1996), was darauf hindeutet, dass VH-Replacement auch in

nicht-autoreaktiven B-Zellvorläufer im Knochenmark stattfinden kann. Bei allen

bisherigen Untersuchungen blieb jedoch unklar, ob die beobachteten VH-

Replacements in vivo durch Antigenkontakt ausgelöst worden waren, oder ob VH-

Replacements auch in Abwesenheit von Ig-Signalen ablaufen können und nur

deshalb in transgenen Mäusen mit ursprünglich autoreaktiven BZRs so prominent

sind, weil die B-Zellen mit unveränderten BZRs durch Selektionsprozesse entfernt

werden.

Falls VH-Replacement in vivo auch in der Abwesenheit von Ig-Signalen stattfindet,

könnte dieses sekundäre Rearrangement auch wichtig sein, um Pro-B-Zellen vor

3. Einleitung

14

Apoptose zu retten, die entweder auf beiden Allelen ein nicht-produktives VDJ-

Rearrangement besitzen oder eine dysfunktionale, mit IgL paarungsunfähige µH-

Kette produzieren (Keyna et al. 1995; Kline et al. 1998). Diesen Zellen, die nicht in

der Lage sind einen Prä-BZR an der Oberfläche zu präsentieren und deshalb durch

Apoptose deletiert werden, könnte das VH-Replacement eine zweite Chance geben,

doch noch eine funktionelle µH-Kette zu rearrangieren und so die Entwicklung

fortzusetzen. Um diese Frage zu untersuchen, sollte im ersten Teil dieser Arbeit eine

transgene Maus etabliert werden, bei der alle Pro-B-Zellen ein nicht-produktives

VDJ-Exon tragen. Falls unsere Hypothese und VH-Replacements auch in

Abwesenheit von Ig-Rezeptorsignalen stattfinden können, sollte man in dieser Maus

reife B-Zellen mit modifizierten VDJ-Exons finden.

3.3 Allelausschluss

Potentiell kann eine B-Zelle am IgH-, Igκ- und Igλ-Lokus jeweils auf beiden Allelen

ein produktives V-Exon erzeugen. Die resultierenden zwei IgH- und vier IgL-Ketten

würden in verschiedenen Kombinationen zu einer Vielfalt an BZRs und Antikörpern

mit unterschiedlichen Antigen-Spezifitäten in einer B-Zelle beziehungsweise

Plasmazelle führen. Damit eine B-Zelle jedoch anhand ihres BZRs für oder gegen

eine Antigen-Spezifität selektioniert werden kann, ist es wichtig, dass jede B-Zelle

nur einen BZR produziert. Die Monospezifität der B-Zelle bildet die Grundlage von

Burnets klonaler Selektionstheorie (Clonal-Selection-Theory, Burnet 1960) und wird

molekular dadurch erreicht, dass jeweils nur ein IgH- und ein Igκ- oder Igλ-Allel

produktiv rearrangiert werden, und die anderen Allele von der Expression

ausgeschlossen werden. Experimentell wurde das Phänomen des Allelausschlusses

an den Ig-Lozi zuerst in Kaninchen mit spezifischen Antiseren gegen allotyp-

spezifische Epitope in der VH-Region und der konstanten Region des schweren µH-

Kettengens (CH) nachgewiesen. Diese Analyse ergab, dass mehr als 99% der B-

Zellen nur eine IgH exprimieren (Pernis et al. 1965; Cebra et al. 1966). Kurz darauf

wurde dieses Phänomen auch am IgH-Lokus der Maus mit Antikörper gegen allotyp-

spezische Epitope in der CH-region beobachtet (Weiler 1965), bei denen ein Bruch

des Allelausschluss’ ebenfalls sehr selten ist. Nur 0.01% der Milz-B-Zellen

exprimieren zwei verschiedene µH-Ketten, und oft handelt es sich bei einer der

beiden Ketten um eine dysfunktionelle Kette, die nicht an die Oberfläche gelangen

3. Einleitung

15

kann, so dass das Phänomen des Allelausschluss für den an der Oberfläche

exprimierten BZR gewahrt bleibt (Barreto and Cumano 2000).

Eine frühe Hypothese zum Allelausschluss schlug eine Steuerung auf Protein-Niveau

vor, bei der die von zwei Allelen produzierte IgH-Menge zur Deletion von Zellen mit

zwei µH-Ketten führen sollte (H-Chain-Toxicity-Theorie von Georges Köhler, Kohler

1980; Wabl and Steinberg 1982; Haas and Wabl 1984). Da diese Situation jedoch in

transgenen Tieren ohne Auswirkungen auf die B-Zellentwicklung blieb (Sonoda et al.

1997), wird heute hauptsächlich davon ausgegangen, dass der Allelausschluss

bereits auf genomischer Ebene etabliert wird.

Da alle Ig- und T-Zellrezeptor (TZR-) Gene durch die gleiche Rekombinations-

Maschinerie gebildet werden, muss das V(D)J-Rearrangement in B- und T-Zellen auf

der DNA-Ebene durch Chromatinstruktur, trans-aktivierende Faktoren und Lokus-

Zugänglichkeit reguliert werden (Zusammengefasst in Krangel 2003; Wilson and

Merkenschlager 2006). Grundlegend ist die Unterscheidung zwischen B- und T-

Zellen (Lineage-Specificity), da BZR-Gensegmente nur in B- und TZR-Gensegmente

nur in T-lymphoiden Vorläufern umgelagert werden dürfen. Aber auch innerhalb einer

Zelldifferenzierungsreihe wird die Zugänglichkeit der jeweils zu rekombinierenden

Lozi durch eine Vielzahl an Mechanismen schrittweise gesteuert, deren Abfolge und

jeweiliger Beitrag an der Rekombination experimentell noch nicht vollständig geklärt

sind.

In der B-Zelldifferenzierungsreihe beginnt die Rekombination am IgH-Lokus und lässt

sich im zeitlichen Ablauf folgendermaßen zusammenfassen (nach Corcoran 2005).

Zunächst werden beide IgH-Allele aus der repressiven nukleären Peripherie in das

Zentrum des Kerns gebracht (Kosak et al. 2002). Dort wird die DNA der JH-Lozi an

CpG-Sequenzen demethyliert und die RSS von Nukleosomen getrennt (Cherry and

Baltimore 1999), um ein Schneiden der DNA durch die RAG-Enzyme zu

ermöglichen. Gleichzeitig wird die Öffnung des Chromatins durch Histon-Azetylierung

und weitere Histon-Modifikationen verbeigeführt. Um die Rekombination eines D- mit

einem J-Gensegment zu erleichtert, werden in frühen Pro-B-Zellen zuerst die Histone

in der Keimbahn-D-J-Cµ-Region hyperazetyliert. Interessanterweise scheinen die

Umlagerungen von D- und J-Gensegmneten nicht reguliert zu sein, da sie auf beiden

3. Einleitung

16

Allelen stattfinden. Mit der Öffnung des Chromatins und der Aktivierung Zelltyp- und

Entwicklungsstadien-spezifischer Enhancer und Promotoren werden von beiden IgH-

Allelen sterile Keimbahntranskripten der konstanten Region produziert, deren

Transkription am DQ52-Promotor (µ°-Transkript) oder am intronischen µ-Enhacer

(Iµ-Transkripte) beginnen (Alt et al. 1982; Lennon and Perry 1985; Alessandrini and

Desiderio 1991; Kottmann et al. 1994). Zusätzlich wird nach dem DJ-Rearrangement

die Transkription von Keimbahn-VH-Gensegmenten induziert, die in der Synthese von

Sense-Transkripte einzelner VH-Gensegmente und Antisense-Transkripte über

größerer VH-Bereiche resultiert (Yancopoulos and Alt 1985; Bolland et al. 2004). Es

ist allerdings nicht geklärt, ob diese VH-Keimbahntranskripte nur eine Folge des

geöffneten Chromatins sind oder auch selber zur Öffnung des VH-Clusters beitragen.

Die Histone der VH-Segmente werden nun ebenfalls hyperazetylierten, und VH-

Segmente werden durch eine Kontraktion beider IgH-Allele (Fuxa et al. 2004) in die

Nähe des bereits rearrangierten DJ-Exons gebracht, um so eine Verknüpfung eines

Keimbahn-VH-Segments mit dem bereits rearrangierten DJ-Segments zu erleichtern.

Sobald ein produktives VDJ-Rearrangement stattgefunden hat und ein Prä-BZR

exprimiert wird, treten gegenläufige Prozesse ein. Der Lokus entspannt sich wieder

(Skok et al. 2001; Roldan et al. 2005) und die Sense- und Antisense-Transkription

am VH-Lokus wird, mit Ausnahme der auch in späterer B-Zellstadien vorhandenen

biallelischen Iµ-Transkription, beendet. Ein IgH-Allel, wahrscheinlich das nicht-

produktiv oder unvollständig arrangierte, assoziiert mit dem Heterochromatin, und die

entstandene große Prä-B-Zelle durchläuft die klonale Expansion (Vettermann et al.

2006).

In der kleinen Prä-B-Zelle werden anschließend die IgL-Kettengene rearrangiert, bei

denen es zusätzlich zum Allelausschluss auch zum Isotypen-Ausschluss kommt, so

dass nur eine produktive Kette vom κ- oder λ-Isotyp produziert wird (Hieter et al.

1981; Korsmeyer et al. 1982). Zunächst wird der Igκ-Lokus rearrangiert, der dazu

ebenfalls ins Kernzentrum gebracht und an den Histonen azetyliert wird. Wie beim

IgH-Lokus kommt es zu einer basalen Transkription von Igκ-Keimbahntranskripten

von beiden Allelen und einer Kontraktion beider Lozi (Singh et al. 2003). Allerdings

werden die Igκ-Allele im Gegensatz zum IgH-Lokus im nächsten Schritt

unterschiedlich prozessiert: Ein Allel wird bevorzugt DNA-demethyliert und scheint

häufiger zu rekombinieren (Mostoslavsky et al. 1998; Goldmit et al. 2002), während

3. Einleitung

Allelausschluss,Differenzierung

Öffnung und Rearrangement des zweiten Allels

V D J Cµ

V D J Cµ

V D J Cµ

V D J Cµ

mRNA

VDJ Cµ

V D J Cµ

Nicht-produktiv (2/3)

Produktiv (1/3)

Prä-BZR

Igα/Igβ

Abb. 4. Allelausschluss am IgH-Lokus durch Prä-BZR-Signale (µH-Ketten-Feedback-Modell nach Alt). Nach einem produktiven Rearrangement auf dem ersten IgH-Allel wird die µH-Kette in das endoplasmatische Retikulum (ER) synthetisiert und zusammen mit der SL-Kette und den Signalmolekülen Igα/Igβ als Prä-BZR an die Oberfläche transportiert. Die von dort initiierten Prä-BZR-Signale bewirken Differenzierung und Allelausschluss des zweiten Allels durch temporäre Terminierung der Rag-Expression und der anschließenden Schließung des zweiten IgH-Allels. Ist das erste Rearrangement jedoch nicht-produktiv, so wird das Rearrangement auf dem zweiten Allel fortgesetzt. Modell nach Alt et al. 1984.

das zweite Allel ins Heterochromatin rekrutiert wird und methyliert bleibt (Goldmit et

al. 2005). Nach einem produktiven Rearrangement wird der vollständige BZR an der

Oberfläche exprimiert und das primäre Rearrangement durch Terminierung der RAG-

Expression beendet (Grawunder et al. 1996).

Vor dem Hintergrund dieser die Rekombination begleitenden Ereignisse stellt sich

die Frage, wie es zum Allelausschluss am IgH-Lokus kommt. Hierfür werden

hauptsächlich zwei Modelle diskutiert. Das regulierte Feedback-Modell (Alt et al.

1980; Alt et al. 1984) geht davon aus, dass die Rekombination auf beiden Ig-Lozi

nacheinander stattfinden kann, die Umlagerung des zweiten Allels aber nach einem

produktiven Rearrangement des ersten Ig-Lokus' durch ein Signal der gebildeten Ig-

unterdrückt wird. Im Falle des IgH-Lokus' würde der Allelausschluss durch das Signal

einer µH-Kette beziehungsweise eines Prä-BZR kontrolliert, um so die Expression

zweier funktioneller IgH-Ketten zu verhindern. Das unregulierte, stochastische Modell

hingegen geht von einem ineffizienten Rearrangement der beiden IgH-Lozi aus, bei

17

3. Einleitung

18

dem es unwahrscheinlich ist, dass eine Zelle zwei produktive IgH-Rearrangements

erzeugt (Coleclough et al. 1981; Coleclough 1983; Liang et al. 2004). In beiden

Modellen wird das weitere Rearrangement des zweiten IgH-Lokus durch die mit der

Differenzierung einhergehenden Chromatin-Änderungen verhindert. Diese sind

besonders am IgH-Lokus zu erwarten, da die Prä-B-Zelle nach der VDJ-

Rekombination eine proliferative Phase mit 4-6 Replikationen durchläuft (Decker et

al. 1991; Karasuyama et al. 1994; Rolink et al. 1994).

Als wichtiger Beleg für das Feedback-Modell gilt die Beobachtung, dass Signal-

kompetente Ig-Transgene die Rekombination der endogenen Ig-Lozi unterdrücken

(Ritchie et al. 1984; Rusconi and Kohler 1985; Weaver et al. 1985; Nussenzweig et

al. 1987), während Signal-inkompetente Ig-Ketten, z.B. eine µH-Kette ohne

Transmembranregion (µMT, Kitamura and Rajewsky 1992), die Umlagerungen

endogener Lozi nicht verhindern. Auch ist der Allelausschluss in B-Zellen gestört, bei

denen die Signalleitung des Prä-BZRs oder BZRs durch Deletion oder Mutation der

Komponenten Igα (Minegishi et al. 1999) oder Igβ (Gong and Nussenzweig 1996)

oder durch eine µH-Kette, die nicht mit Igα/Igβ assoziieren kann (Papavasiliou et al.

1995), unterbrochen wurde. Diese Experimente weisen alle darauf hin, dass Signale

durch einen unreifen Prä-BZR oder reifen BZR wichtig sind, um die Umlagerung des

zweiten Ig-Allels zu verhindern und somit den Allelausschluss zu erreichen.

Allerdings muss hierbei beachtet werden, dass der zeitliche Verlauf der B-

Zellentwicklung und der Turnover der B-lymphoider Vorläufer durch diese Eingriffe

erheblich gestört wird. Produktive Ig-Transgene sorgen für eine Verkürzung des

Rekombinationsstadiums, was dadurch belegt wird, dass IgH-transgen-positive B-

Zellen im Gegensatz zu Wildtyp-B-Zellen z.T. unvollständige DJ-Rearrangements auf

den endogenen IgH-Lozi durchführen (Weaver et al. 1985). Signal-Mutanten

hingegen blockieren die Differenzierung B-lymphoider Vorläufer und verlängern so

das VDJ-rekombinationsaktive Pro-B-Zellstadium, so dass zeitliche Mechanismen

unterlaufen werden. Doch gerade der zeitliche Verlauf spielt eine große Rolle und

stellt für das Feedback-Modell am IgH-Lokus ein Problem dar. Da nach einem

produktiven Rearrangement die µH-Ketten erst neu synthetisiert und als Prä-BZR an

die Oberfläche transportiert werden müssen, können etwaige µH-Ketten-vermittelte

Feedback-Signale erst verzögert initiiert werden. Damit während dieser Zeit das

zweite Allel nicht arrangiert, muss davon ausgegangen werden, dass die Allele

3. Einleitung

19

nacheinander rearrangieren. Für den Igκ-Lokus wurde mit der unterschiedlichen

Replikation der beiden Igκ-Allele ein Mechanismus beschrieben, der für

unterschiedliche Chromatinstrukturen der beiden Allele sorgt und die Grundlage für

die benötigte Asynchronität des Rearrangements sein könnte. Hierbei repliziert eines

der beiden Igκ-Allele früh in der S-Phase, während das zweite Allel erst später

repliziert. Die Auswahl des früh-replizierenden Allels findet in einem frühen B-

Zellentwicklungstadium vor Öffnung des IgL-Lokuses zufällig statt und wird klonal

vererbt (Mostoslavsky et al. 1998). Beim IgL-Rearrangement ist es dann meistens

das früh-replizierende Allel, das zuerst demethyliert (Mostoslavsky et al. 1998),

Histon-azetyliert (Goldmit et al. 2005) und rearrangiert wird, während das zweite Allel

aus dem Zentrum des Kerns ins Heterochomatin rekrutiert wird. Diese

Beobachtungen am Igκ-Lokus scheinen jedoch nicht auf den IgH-Lokus übertragbar

zu sein. So findet am IgH-Lokus eine biallelische DNA-Demethylierung statt, und

beide kontrahierten Allele bleiben nach der DJ- und während der V-nach-DJ-

Umlagerung im Zentrum des Kerns (Skok et al. 2001). Erst nach einem Prä-BZR-

Signal findet man ein Allel in der Prä-B-Zelle wieder mit dem Heterochromatin

assoziiert (Kosak et al. 2002). Dies spricht für eine gleichzeitige Öffnung beider IgH-

Allele während der VDJ-Umlagerung und eine Stilllegung des nicht-komplett oder

nicht-produktiv rearrangierten Allels erst nach einer produktiven VDJ-Umlagerung.

Daher ist es unklar, wie nach einem produktiven Rearrangement des ersten IgH-

Allels die Rekombination auf dem zweiten Allel bis zur Initiierung von Prä-BZR-

Signalen von der Zelloberfläche unterdrückt wird.

Das stochastische Modell umgeht das zeitliche Problem durch die Annahme, dass

die VDJ-Rekombination so ineffizient ist, dass zwei produktive Rearrangements in

einer Zelle nur selten vorkommen können (Coleclough 1983; Schlissel 2003). Da die

DJ-Umlagerung jedoch in allen B-Zellen auf beiden IgH-Allelen stattfindet, kann die

ineffiziente Umlagerung erst bei der Verknüpfung eines Keimbahn-VH-Gensegments

mit einem bereits rearrangierten DJ zum Tragen kommen, was durch die

Beobachtung gestützt wird, dass die RSS von VH-Gensegmenten ein schlechtes

RAG-Substrat darstellen (Liang et al. 2002). Nach einem nicht-produktiven VDJ-

Rearrangement auf dem ersten Allel wird jedoch auf das zweite Allel gewechselt, und

das so effektiv, dass 40-50% der reifen B-Zellen ein produktives und ein nicht-

produktiv rearrangiertes IgH-Allel besitzen (Alt et al. 1984; Mostoslavsky et al. 2004).

3. Einleitung

20

Dies steht im Widerspruch zu der Annahme, dass das die Umlagerungen eines VH-

Gensegments mit einem DJ-Rearrangement einen ineffizienten Schritt darstellt

(Mostoslavsky et al. 2004). Das Verhältnis spiegelt eher eine Situation wider, bei der

1/3 der Zellen nach einem erfolgreichen VDJ-Rearrangement des ersten Allels das

zweite Allel unterdrücken, während die 2/3 der Zellen mit einem nicht-produktiv-

rearrangiertem ersten Allel mit der gleichen Wahrscheinlichkeit zügig das zweite Allel

rearrangieren. In Zahlen ausgedrückt sind 3/9 Zellen VDJ+/DJ und 2/9 VDJ–/VDJ+,

was ungefähr dem in reifen B-Zellen beobachteten Verhältnis von 60-zu-40

entspricht, auch wenn diese Berechnung weitere Faktoren wie z.B. die Leseraster

der D-Segmente außer acht lässt (Rajewsky 1996).

Ein neuer Gedankenansatz, wie der Allelausschluss am IgH-Lokus durch einen

Feedback-Mechanismus kontrolliert werden kann ohne eine Asynchronität in der

Rekombination der IgH-Allele vorauszusetzen, ergab sich aus Vorarbeiten in

unserem Labor mit einer transgenen Maus, die eine mit einer SL- und IgL-Kette

paarungsunfähige und somit Signal-inkompetente (dysfunktionelle) µH-Kette

produziert (Kline et al. 1998). Silke Meister konnte in ihrer Promotionsarbeit zeigen,

dass die dysfunktionale µH-Kette das VDJ-Rearrangement der endogenen IgH-Lozi

auch in Abwesenheit eines Prä-BZR-Signals reduziert jedoch nicht inhibiert (Kline et

al. 1998; Meister 2004). Dies legte den Schluss nahe, dass von einem produktiv

arrangierten IgH-Lokus neben dem µH-Ketten-Protein weitere Signale ausgehen

können, die das VDJ-Rearrangement beeinflussen. Ein idealer Kandidat hierfür ist

das µ-Transkript, das sofort nach einem produktiven VDJ-Rearrangement im Kern

zur Verfügung steht. Es könnte als elegante Erweiterung des Feedback-Modells ein

sofortiges Feedback erlaubten und damit die zeitliche Trennung der Rekombination

und einen Unterschied zwischen den IgH-Allelen überflüssig machen. Die wichtige

Unterscheidung zwischen einem produktiven und nicht-produktiven IgH-

Rearrangement, die im klassischen Feedback-Modell durch An- oder Abwesenheit

der µH-Kette getroffen wird, wird in unserem erweiterten Feedback-Modell durch die

mRNA-Stabilität erzielt, da eine von einem nicht-produktiv rearrangierten IgH-Allel

kodierte mRNA aufgrund von vorzeitigen Stopkodons (Nonsense-Kodons) im

Gegensatz zu einer produktiven mRNA durch den Nonsense-mediated mRNA-Decay

abgebaut wird (Baumann et al. 1985; Jack et al. 1989).

3. Einleitung

21

Um unser erweitertes Feedback-Modell zu überprüfen, sollte daher im zweiten Teil

dieser Arbeit untersucht werden, ob bereits eine stabile µ-mRNA als primäres

Resultat eines produktiven VDJ-Rearrangement die VDJ-Rekombination des zweiten

Allels reduzieren kann und so eine weitere Komponente des

Allelausschlussmechanismuses darstellt.

3.4 Nonsensense-vermittelter mRNA Abbau in Lymphozyten

Fehlerhafte mRNAs mit einem vorzeitiges Stopkodon (Premature Termination-

Codon, PTC) können aus viele Gründen entstehen, z.B. durch fehlerhaftes oder

alternatives Spleißen von Prä-mRNAs oder durch Mutationen, Deletionen oder

Insertionen im Genom (Maquat 2005). Würden diese Nonsense-mRNAs translatiert,

käme es zur Synthese verkürzter Proteine mit eventuell veränderten funktionellen

Domänen. Möglich wären zum Beispiel dominant-aktive oder -negative Rezeptoren.

Um dieser potentiellen Gefahr vorzubeugen, wird die mRNA-Synthese durch den

Nonsense-mediated mRNA-Decay (NMD) überwacht, der mRNAs mit PTCs erkennt

und schnell abbaut (zusammengefasst in Frischmeyer and Dietz 1999; Neu-Yilik et

al. 2004; Maquat 2005). Dieses könnte besonders in Lymphozyten notwendig sein,

da V(D)J-Umlagerungen in der Mehrheit der B- und T-Zellen nicht-produktive V(D)J-

Gene erzeugt, die für Nonsense-Ig-mRNAs kodieren (zusammengefasst in Li and

Wilkinson 1998). Rund 40% der reifen B-Zellen tragen einen nicht-produktiv

rearrangierten IgH-Lokus; hinzukommen die nicht-produktiven Rearrangements der

Leichtketten-Lozi. Interessanterweise ist der NMD in Lymphozyten besonders

effektiv, und Nonsense-µ-mRNA hat eine 50- bis 100-fach geringere Stabilität als

Sense-µ-mRNA (Baumann et al. 1985; Jack et al. 1989; Buhler et al. 2004).

Der NMD ist ein translationsabhängiger Prozess, der bisher in allen eukaryotischen

Organismen gefunden wurde, sich aber in seinem Mechanismus zwischen den

Spezies unterscheidet. In Säugern werden PTCs auf mRNAs nur unter bestimmten

Voraussetzungen entdeckt. Die beiden wichtigsten Voraussetzungen sind, dass die

mRNA gespleißt werden muss, und dass das PTC nicht im letzten Exon liegen darf.

Diese Bedingungen zeigen, dass der NMD in Säugern Exon-Exon-Grenzen als

Kriterium zur Erkennung fehlerhafter mRNAs heranzieht. Wird ein Gen, dessen

gespleißte, PTC-haltige mRNA vom NMD erkannt und abgebaut wird, als intronlose

3. Einleitung

22

cDNA exprimiert, so versagt der NMD, und das Transkript ist bei gleicher Sequenz

stabil (Zhang et al. 1998). Die molekularen Mechanismen der NMD in Säugerzellen

sind noch nicht vollständig geklärt. Ein allgemein akzeptiertes Modell geht davon

aus, dass nach dem Spleißen ein Teil der beteiligten Proteine mit der Exon-Exon-

Verküpfung assoziiert bleiben und einen Exon-Exon-Junction-Komplex (EJC) bilden

(Zusammengefasst in Lejeune and Maquat 2005). Dieser Komplex besteht unter

anderem aus Proteinen, die am NMD (Upf1, Upf2 und Upf3), dem Spleißen von Prä-

mRNAs (RNPS1, UAP56, SRm160 und Pnn/DRS) und dem mRNA-Export (REF/Aly,

Y14 und Magoh) beteiligt sind. Kommt es nun zur Translation der reifen mRNA, so

gleitet das Ribosom die mRNA entlang und streift die Exon-Exon-Junction-Komplexe

ab, bis es zu einem Stopkodon kommt und dort zerfällt. Ein postulierter

Überwachungskomplex setzt jedoch die Fahrt fort und überprüft die restliche mRNA.

Trifft dieser Überwachungskomplex auf einen weiteren Exon-Exon-Junction-

Komplex, so ist klar, dass die Translation bei einem vorzeitigen Stopkodon terminiert

wurde. Die betreffende mRNA wird als fehlerhaft deklariert. Als Konsequenz leitet der

Überwachungskomplex den schnellen Abbau der mRNA in 5’-3’- und 3’-5’-Richtung

ein (zusammengefasst in Frischmeyer and Dietz 1999; Neu-Yilik et al. 2004; Maquat

2005).

Die bisher bekannte Rolle des NMD in Lymphozyten beschränkt sich auf den Abbau

PTC-haltiger mRNAs von nicht-produktiv arrangierten Ig-Genen, um die Expression

verkürzter Ig-Rezeptoren zu verhindern (Baumann et al. 1985; Jack et al. 1989).

Sollte jedoch die Hypothese zutreffen, dass µ-mRNAs die VDJ-Rekombinationrate

des IgH-Lokus' reduzieren können, so wäre der NMD zusätzlich auch an der

Kontrolle der VDJ-Rekombination des IgH-Lokus beteiligt, da er zwischen Sense-

und Nonsense-µ-mRNAs unterscheidet und nur die Ansammlung von Sense-µ-

Transkripten zulässt, die dann die Rate der VDJ-Rekombination am zweiten IgH-

Lokus solange reduzieren, bis ein Prä-BZR-Signal weitere Rekombinationen am

zweiten Lokus endgültig verhindert.

4. Aufgabenstellung

23

4 Aufgabenstellung Bei der VDJ-Rekombination am IgH-Lokus werden Variable-(V-), Diversity-(D-) und Joining-(J-) Gensegmente zu einem VDJ-Exon zusammengesetzt, das die variable Region der schweren Ig-Kette kodiert. Dieser Vorgang ist von zentraler Bedeutung für die B-Zellentwicklung, da er die Grundlage der Antikörpervielfalt und der erworbenen B-Zell-vermittelten Immunität darstellt. Für die sich entwickelnde B-Zelle ist er jedoch ein zweischneidiges Schwert, das die Zelle vor zwei Probleme stellt, die in dieser Arbeit näher untersucht werden sollen. 1.) Die VDJ-Rekombination wird durch Rekombinationssignalsequenzen (RSS) vermittelt, welche die Segmente flankieren und bei der Rekombination entfernt werden. Kommt es bei der Genumlagerung, bei der Nukleotide an den Verknüpfungen hinzugefügt oder entfernt werden, zur einer Verschiebung im Leseraster, so kann das entstandene nicht-produktive VDJ-Exon nicht durch eine weitere VDJ-Rekombination ersetzt werden, da hierfür die RSS fehlen. Stattdessen wird die Rekombination auf dem zweiten Allel fortgesetzt. Da allerdings die meisten VDJ-Rekombinationen nicht-produktiv sind, entsteht eine große Anzahl an Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiven VDJ–-Allelen, die keine µH-Ketten exprimieren können. Diesen Zellen fehlen essentielle Überlebenssignale, so dass sie durch Apoptose zugrunde gehen. In der vorliegenden Arbeit sollte nun untersucht werden, ob Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiven VDJ–-Allelen nicht doch in der Lage sind, das VH-Segment des fehlerhaften VDJ-Exons durch ein stromaufwärts gelegenes VH-Segment zu ersetzten, und durch dieses VH-Replacement ein produktives IgH-Gen zu erzeugen, das eine weitere Entwicklung der Pro-B-Zelle zulässt. Hierfür sollten transgene Mäuse etabliert werden, bei denen der JH-Lokus durch ein nicht-produktives VDJ–-Exon ersetzt wird, um in ihnen dann die B-Zell-Entwicklung zu untersuchten. 2.) Während es nach einem nicht-produktiven Rearrangement auf dem ersten Allel vorteilhaft ist, dass die VDJ-Rekombination auf dem zweiten Allel fortgesetzt wird, muss nach einem produktiven Rearrangement auf dem ersten Allel das Rearrangement auf dem zweiten Lokus unterdrückt werden, damit die B-Zelle nur eine produktive IgH-Kette exprimiert. Obwohl dieser Allelausschluss die Voraussetzung für monospezifische B-Zellen bildet, ist der genaue Mechanismus noch unbekannt. Als zweites Ziel dieser Promotion sollte deshalb die Hypothese überprüft werden, dass eine stabile µ-mRNA, die als erste Konsequenz eines produktiven Rearrangements gebildet wird, einen dämpfenden Einfluss auf die V-nach-DJ-Rekombination haben und zum Allelausschluss beitragen könnte. Daher sollten transgene Mäusen hergestellt werden, die eine stabilisierte, nicht-produktive µ-mRNA exprimieren, um in ihnen dann die B-Zellentwicklung zu untersuchen.

5. Ergebnisse

5 Ergebnisse

5.1 VH-Replacement bei Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiven VDJ-Allelen

Die Genumlagerungen am IgH-Lokus finden im Pro-B-Zellstadium statt. Ist das

gebildete VDJ-Exon produktiv, so wird eine µH-Kette synthetisiert, die mit der

surrogaten leichten (SL-) Kette und den Signalkomponenten Igα und Igβ assoziiert

und einen Prä-B-Zellerezeptor bildet (Vettermann et al. 2006). Durch das Hinzufügen

oder Entfernen von Nukleotiden während der Rekombination haben jedoch die

meisten VDJ-Exons eine Verschiebung im Leseraster, weshalb viele Pro-B-Zellen

nicht-produktive Rearrangements auf beiden Allelen enthalten (Rajewsky 1996).

Zusätzlich kodieren einige der produktiven VDJ-Rearrangements für dysfunktionale

µH-Ketten, die nicht mit der SL-Kette oder konventionellen leichten Ketten paaren

können (Keyna et al. 1995; ten Boekel et al. 1997). In beiden Fällen fehlen den Pro-

B-Zellen essentielle Differenzierungssignale, was zur Apoptose führt. Die meisten

rearrangierten VDJ-Exons stellen jedoch noch ein Substrat für RAG1/2 dar, da die

fast alle VH-Segmente an ihrem 3’-Ende eine nur aus dem konservierten Heptamer

TACTGTG bestehende kryptische RSS enthalten (Chen et al. 1995). Daher kann die

VH-Sequenz des VDJ-Exons durch ein stromaufwärts liegendes VH-Segment ersetzt

werden (Zhang et al. 2003). Dieses VH-Replacement wurde zuerst in murinen und

humanen Pro-B-Zelllinien beschrieben (Kleinfield et al. 1986; Reth et al. 1986; Zhang

et al. 2003) und später auch in transgenen Mäusen gefunden (Chen et al. 1995; Taki

et al. 1995; Cascalho et al. 1996; Zhang et al. 2004), bei denen der JH-Lokus durch

ein produktives VDJ-Exon ersetzt worden war. Während VH-Replacements in µH-

Ketten-negativen Pro-B-Tumorzelllinien nachgewiesen werden konnten, wurden VH-

Replacements in vivo nur in Mäusen mit einer transgenen funktionellen µH-Kette,

d.h. in Anwesenheit eines funktionalen Prä-BZR- und BZR-Signalwegs gefunden.

Daher war es zu Beginn der Arbeit nicht klar, ob VH-Replacements in vivo ein µH-

Ketten-Signal benötigen, oder ob sie auch in Abwesenheit eines Prä-BZR-Signals

vorkommen und so einen Rettungsmechanismus für Pro-B-Zellen mit zwei nicht-

produktiv rearrangierten IgH-Allelen darstellen können.

25

5. Ergebnisse

Wildtyp-IgH-Lokus

Targeting-Vektor

Veränderter IgH-Lokus (nach Deletion der neor-Kassette)

AseI

DQ52 Cµ1

HindIII

AseI

L VDJH4

AseI

4.6kb

7.4kb

neor

BamHI

SpeI

AseI

L VDJH4

DQ52-Sonde

SacI

I

JH4revVHQMfwdVDJ-

loxP-Stellen

DQ52

AseI

DQ52 JH1-4 Cµ1

HindIII

AseI

JH2revJH1fwdJH

1.2kb

C

7.4 (wt)

4.6 (VDJ-)

AseI-Verdau mit DQ52-Sonde

kb

5

3

6

IgH

wt/w

t

IgH

VDJ-

/wt

IgH

VDJ-

/VDJ

-

8

B

kb

5

3

6

8

Abb. 5. Etablierung transgener Mäusen mit einem in den JH-Lokus eingefügten nicht-produktiven VDJ--Allel (VDJ--Mäuse). (A) Schematische Darstellung des IgH-Lokus' und der Strategie, um durch homologe Rekombination das JH-Cluster durch ein nicht-produktives VDJ--Exon zu ersetzen. (B) Homologe Rekombination des Vektors in das Genom von G418-resisten ES-Zellklonenwurde durch Hybridisierung AseI-verdauter DNA mit einer DQ52-Sonde nachgewiesen. (C) Die Deletion der neor-Kassette in den aus dem ES-Zellklon H5 gewonnenen Tieren wurde mit der gleichen Sonde nachgewiesen.

Klon

H5

AseI-Verdau mit DQ52-Sonde

A

26

5. Ergebnisse

5.1.1 Etablierung einer transgenen Maus mit zwei nicht-produktiven VDJ–-Allelen

Um zu untersuchen, ob VH-Replacement in vivo auch in der Abwesenheit von Ig-

Rezeptorsignalen vorkommen kann, wurde einen transgene Maus etabliert, bei der

alle Pro-B-Zellen zwei nicht-produktive VDJ–-Allele tragen. Dazu wurde in der

embryonalen Stammzelllinie IDG3.2 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von

Ralf Kühn, GSF München) der komplette JH-Lokus durch homologe Rekombination

gegen ein rearrangiertes VDJ–-Exon mit einem Stop-Kodon an Aminosäure-Position

+3 des Leader-Peptids ausgetauscht. Das daraus resultierende IgH-Gen wird zwar

transkribiert ist aber nicht-produktiv, da das vorzeitige Stop-Kodon nur die

Translation eines Dipeptids erlaubt. Die Targeting-Strategie ist in Abb. 5 dargestellt.

Nach der Transfektion wurden die ES-Zellen mit dem Antibiotikum G418 selektioniert

und DNA von 147 G418-resistenten Klonen auf homologe Integration des Transgens

geprüft. Dazu wurde die ES-Zell-DNA mit AseI verdaut und mit einer DQ52-Sonde

hybridisiert (Abb. 5B). Nur Klon H5 aus der Mikrotiterplatte Ter3#2-WM zeigte das für

eine homologe Rekombination diagnostische 5.8kb-Fragment und wurde zur

Blastozysteninjektion benutzt. Die chimären Mäuse wurden dann mit Cre-Deleter-

Mäusen (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Michael Wegner, Universität

Erlangen) verpaart, welche die Cre-Rekombinase unter dem ubiquitär aktiven EIIa-

Promotor exprimieren (Lakso et al. 1996). Die Deletion der von LoxP-Sequenzen

flankierten Neomyzin-Resistenz-Kassette (neor) wurde erfolgreich im Southern-Blot

über den Nachweis eines um 1.2kb auf 4.6kb verkürzten Fragments nachgewiesen

(Abb. 5C).

5.1.2 B-Zellentwicklung in Knochenmark und Milz der IgHVDJ–/VDJ–-Mäuse

Falls Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiven VDJ–-Allelen sekundäre

Genumlagerungen am IgH-Lokus durchführen, würden wir eine B-Zellreifung über

das Pro-B-Zellstadium hinaus erwarten. Konsequenz hiervon wären IgM-positive B-

Zellen im Knochenmark und in der Milz von homozygoten Mäusen mit dem VDJ–-

Transgen. Tatsächlich gelang es, B-lymphoide Zellen jenseits des CD19/ckit-

doppelpositiven Pro-B-Zellstadiums im Knochenmark (Abb. 6A) und der Milz (Abb.

27

5. Ergebnisse

A

B

IgHwt/wt IgHVDJ-/wt IgHVDJ-/VDJ-

FI (CD19)

FI (c

-kit) 3.5 4.5 5.4

48.9 38.9 26.9

FI (CD19)

FI (I

gM)

28.8 20.5 15.4

23.5 22.8 16.7

IgHwt/wt IgHVDJ-/VDJ-

37.142.5

FI (I

gM)

FI (CD19)

Abb. 6. Durchflusszytometrische Analyse der B-Zellentwicklung in transgenen VDJ-- und Wildtyp- Mäusen. Knochenmarks- und Milzzellen von sechs Wochen alten Mäusen wurden mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern gegen c-kit und IgM gefärbt. Die Fluoreszenzintensität (FI) der in den Lymphozyten-Bereich fallenden Zellen wurden per FACS bestimmt. Die Zahlen rechts neben den Diagrammen zeigen den Anteil der Zellen in den markierten Bereichen in Prozent. Die Resultate sind für sechs Experimente mit unabhängigen Würfen repräsentativ.

28

5. Ergebnisse

IgHwt/wt, RAG2-/-IgHVDJ-/wt, RAG2-/-

11.5

1.3

18.2

9.3

0.052.6 0.0

FI (I

ntra

zellu

läre

s Ig

M)

SSC

IgHwt/wt

FI (CD19)

FI (c

-kit)

3.5

57.0

Abb. 8. Durchflusszytometrische Analyse rekombinations-defizienter VDJ--Mäuse.Knochenmarkszellen wurden mit Antikörpern gegen c-kit an der Oberfläche und intrazelluläres Igefärbt. Die Fluoreszenzintensität (FI) der in den Lymphozyten-Bereich fallenden Zellen wurde perFACS bestimmt. Die Zahlen rechts neben den Diagrammen zeigen den Anteil der Zellen in den markierten Bereichen in Prozent.

c-kit+CD19+

CD25+

CD19+IgM+

CD19+

gM

IgHVDJ-/wt

Zellz

ahle

n in

Milli

onen

Knochenmark Milz

0

5

10

15

20

25

30

35

IgM+

IgHVDJ-/VDJ-

IgHwt/wt

Abb. 7. Anzahl der B-lymphoiden Zellen in transgenen VDJ-- und Wildtyp- Mäusen. Anzahlder B-lymphoiden Zellen im Knochenmark und in der Milz von sechs Mäusen aus einem Wurf mje zwei Tieren pro Genotyp. Die Standardabweichung ist eingezeichnet.

it

29

5. Ergebnisse

6B) solcher Tiere nachzuweisen. In homozygoten Mäusen ist im Vergleich zu

Wildtyp-Tieren aus dem gleichen Wurf die Zahl der Pro-B-Zellen ungefähr auf das

Doppelte angestiegen, während die Zahl der CD19/CD25-doppelpositiven Prä-B- und

unreifen B-Zellen gleich blieb, und die Zahl der reifen Oberflächen-IgM-positiven

Zellen im Knochenmark leicht reduziert war (Abb. 7). Im Gegensatz zu diesem

leichten Phänotyp im Knochenmark war die Gesamtzellzahl und die Anzahl der

Oberflächen-IgM-positiven Zellen in der Milz deutlich reduziert auf 41%

beziehungsweise 33% der in Wildtyp-Tieren beobachteten Werte (Abb. 7). Bei der

Analyse der Marginalzonen und follikulären B-Zellen in der Milz und der peritonealen

B1-Population wurden keine reproduzierbaren Unterschiede gemessen (Daten nicht

gezeigt).

Um zu zeigen, dass das nicht-produktive VDJ–-Transgen nicht doch für eine

möglicherweise verkürzte µH-Kette kodiert, wurde das Transgen in einen

rekombinations-defizienten Rag2–/–-Hintergrund gekreuzt (Abb. 8). Das vollständige

Fehlen reifer B-Zellen und einer Differenzierung jenseits des Pro-B-Zellstadiums

sowie die Abwesenheit intrazelluläre µH-Ketten zeigen eindeutig, dass die

Produktion von µH-Ketten-positiven Zellen in RAG-exprimierenden homozygoten

IgHVDJ–/VDJ– Mäusen auf einer RAG-vermittelten Modifikation des Transgens beruht,

wahrscheinlich durch VH-Replacement. Gleichzeitig schließen diese Daten RAG-

unabhängige Mechanismen als Quelle produktiver µH-Ketten-Gene aus und belegen,

dass es nicht zu einer Reinitiation der Translation und der Expression einer

verkürzten µH-Kette vom Transgen kommt.

5.1.3 Sequenzanalyse produktiver µH-Ketten-Gene

Um zu überprüfen, ob die produktiven VDJ-Rearrangements in µH-Ketten-positiven

Zellen in homozygoten IgHVDJ–/VDJ–-Mäusen durch VH-Replacement des Transgens

erzeugt wurden, wurden B-Zellen unterschiedlicher Entwicklungsstufen sortiert und

deren Gesamt-RNA mit oligo-dT-Primern und dem SuperScriptIII Kit (Invitrogen) in

cDNA umgeschrieben. Dann wurden VH-Sequenzen mit einem Vorwärtsprimer, der

entweder an Sequenzen in der D-proximalen VH7183-Familie oder der distalen

VHJ558-Familie bindet, und einem Rückwärtsprimer im Cµ1-Exon amplifiziert. Alle

30

5. Ergebnisse

Akryptisches Heptamer Rekombinationssignalsequenzen

TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTACTACAGGTAC AAGTATGGTATACTGTGCAAGACAA7183-1.06

TransgenN/PDN/PVH#

TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTTAGGTAC GCCGACTGAGCCTACTGTGCAAGGGA7183-1.04TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTACTATAGGTACGAGACTACGGTAGAGGGGTACTGTGCAAGAC7183-1.05

GGGA

GAGCTT

GGTTACGAC

CTACGGTAGTAGTATGGCAACTAC TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTTACTATAGGTACTAGACA TACTGTGCAAG7183-1.02

TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTTACTATAGGTACCTACTGTGCAAGA7183-1.03

TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTTACTATAGGTACGAGTACTGTGCAAGJ558-5.13

JH4NDSP2.3VHTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTTACTATAGGTACCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGAVDJ-

TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTGTACAAAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCAGTGTATTTCTGTAJ558-5.14

TransgenN/PVH#

TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTACTATAGGTAC ATGATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCTTGTATTACTGTGCAAGAC7183-3.04TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTTACTCATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGAC7183-4.65

GGGG

CATGCCCC TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTGGTAC ATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCATGTACTACTGTGCAAG7183-1.01

TACTATGCTATGGACTACTGGGGTCCTTACTATAGGTAC ATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGA7183-1.29

GCTATGGACTACTGGGGTATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACG7183-4.19

a

b

Schnittstellekryptisches Heptamer

DSP2.3 JH4VH

DSP2.3 JH4VH DVH D VH DSP2.3 JH4

VH D VH DSP2.3 JH4

Direktes V-nach-VDJ-Replacement

Zweistufiges VD-nach-VDJ-Replacement

B

CDR3-H

a

b

Abb. 9. VH-Replacement auf dem VDJ--Allel. (A) Das inserierte VDJ--Transgen wird 3' von dem kryptischen Heptamer TACTGTG (fett in B) geschnitten und über Rekombinationssignalsequenzen (RSS) entweder (a) direkt mit einem stromaufwärts gelegenen VH-Segment (dunkelgrau) oder (b)in zwei Schritten mit einem D (hellgrau) und einem VH-Segment verknüpft. (B) Vergleich des unveränderten VDJ--Allels mit produktiven VH-Sequenzen aus IgHVDJ-/VDJ--Tieren. VDJ-Rearrangements wurden mittels RT-PCR mit einem für VH7183- oder VHJ558-Familienmitglieder spezifischen Primer amplifiziert. (a) Bei sechs von 114 Sequenzen wurde die transgene VH-Regiondurch ein stromaufwärts gelegenes VH-Segment ersetzt, ein Vorgang, der für das VH-Replacementin Wildtyp-Mäusen prototypisch ist. (b) Allerdings wurde in der Mehrheit der Sequenzen (108 von 114 Sequenzen) die transgene VH-Region durch ein stromaufwärts gelegenes VH- und D-Segment ersetzt. Sechs repräsentative Sequenzen werden gezeigt. In den meisten Rearrangements wurden N- und P-Nukleotide zu den Bruchstellen hinzugefügt und Basen 3' von der Rekombinationsstelleentfernt. Die CDR3-H-Region zwischen dem TGT im VH- und dem TGG im JH-Segment ist durch gestrichelte Linien angezeigt.

31

5. Ergebnisse

114 analysierten Sequenzen hatten das VH-Segment des transgenen VDJ–-Exons

durch ein stromaufwärts liegendes Ig-Segment ersetzt. Für das VH-Replacement

wurden die kryptische RSS TACTGTG im transgenen VDJ–-Exon und die reguläre

RSS des stromaufwärts liegenden Keimbahn-D- oder -VH-Segments benutzt (Abb.

9). Die Verknüpfungen waren zusätzlich durch das Hinzufügen von nontemplated (N-

) und palindromischen (P-) Nukleotiden, sowie durch das Entfernen von Nukleotiden

am 5’-Ende des verbleibenden VDJ–-Exons verändert worden.

Die produktiven VDJ-Sequenzen konnten in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die

kleinere Gruppe (6 von 114 Sequenzen) hatte das VH-Segment des transgenen VDJ-

Exons durch ein Keimbahn-VH-Segment ersetzt und stellt den Prototyp für ein VH-

Replacement in Wildtyp-Mäusen dar (Abb. 9B,a). Die größere Gruppe (108 von 114

Sequenzen) hatte hingegen das VH-Segment durch ein VH- und ein D-Segment

ersetzt (Abb. 9B,b). Letzteres ist möglich, da in dieser Maus die D-Segmente noch

stromaufwärts vom VDJ–-Exon vorliegen und zur Rekombination benutzt werden

können, während sie beim regulären VDJ-Rearrangement deletiert werden.

5.1.4 Zeitpunkt des VH-Replacements

In Wildtyp-B-Zellen kann ein VH-Replacement erst in späten Pro-B-Zellen stattfinden,

nachdem die VH-Gensegmente geöffnet und das primäre VDJ-Exon erzeugt wurde.

In der VDJ–-transgenen Maus hingegen könnte bereits im frühen Pro-B-Zellstadium,

in dem normalerweise die D-nach-J-Umlagerung an beiden IgH-Lozi vollzogen wird,

ein unvollständiges D-nach-VDJ-Replacement stattfindet, dem später ein normales

V-nach-DJ-Rearrangement folgt. Alternativ dazu könnte das VDJ–-Allel auch erst im

späten Pro-B-Zellstadium parallel zu einer V-nach-DJ-Umlagerung am Wildtyp-Lokus

ersetzt werden. Da durch den Wechsel zwischen den Allelen nach einem nicht-

produktiven Rearrangement identische genetische Konfigurationen auf

unterschiedlichen Wegen erzeugt werden können, kann nur die vereinfachte Frage

gestellt werden, ob VH-Replacements in heterozygoten IgHVDJ–/wt B-Zellen bereits vor

der V-nach-DJ-Rekombination des Wildtyp-Lokus stattfinden, oder ob sie erst in

Zellen mit zwei nicht-produktiv rearrangierten Allelen stattfinden, wie man es in

IgHwt/wt B-Zellen erwarten würde.

32

5. Ergebnisse

Abb. 10. Einzelzell-PCR zur Bestimmung der Konfiguration der IgH-Lozi. (A) Nachweis einer Sequenz 5‘ vom ersten D-Lokus (DFL16.1), die nur vorhanden ist, wenn (a) das Wildtyp-Allel noch kein V-nach-DJ Rearrangement vollzogen hat oder (b) das VH-Segment im VDJ--Allel nicht durch ein Keimbahn-VH-Segment ersetzt wurde. Die Primerpaare sind als Pfeile dargestellt. (c) Eine repräsentative PCR von DNA aus sortierten IgMa- bzw. IgMb-positiven Milz-B-Zellen ist gezeigt. Ausgewertet wurden je drei einzelne IgMa+- oder IgMb+-Zellen. Die erste Spur enthält je 10 IgMa- und 10 IgMb-Zellen als Positivkontrolle, die letzte Spur ist eine DNA-Isolierung aus einer Mikrotitervertiefung ohne Zelle und dient als Negativkontrolle. (B) Nachweis des unveränderten VDJ-

-Allels (a) Lage der verwendeten PCR-Primer. (b) IgMa- und IgMb-positive Milz-B-Zellen wurden wie in (Ac) sortiert und das nicht-ersetzte VDJ--Allel per PCR nachgewiesen. (C) Tabellarische Auswertung von je 18 IgMa+- und IgMb+-Zellen. Konfigurationen, die nicht möglich sind, wurden mit einem Strich gekennzeichnet.

-

-

+

+

VDJ--PCR

-

-

+

+

VDJ--PCR Konfiguration der IgH-Lozi

Zellen5' of DFL-PCR

Konfiguration der IgH-Lozi

Zellen5' of DFL-PCR

-0--0-

IgMa: VDDJ-

IgMb: VDJ+

IgMa: DDJIgMb: VDJ+

IgMa: VDJ-

IgMb: VDJ+

IgMa: VDDJ+

IgMb: VDJ-

IgMa: VDDJ+

IgMb: DJ

-

1-10-

2+8+

15+0+

µb+-Zellenµa+-Zellen

A

B

C

a

b Nachweis eines nicht-ersetzten VDJ--Allels

Nachweis eines nicht V-DJ-rearrangierten Wildtyp-Allels

Nachweis eines nicht-ersetzten VDJ--Allels

c

ba

1 1 1 1 1 0120µa+ µb+

µa+µb+

Zellen

VH D JH CµbDFL

16.1

1 1 1 1 1 0120µa+ µb+

µa+µb+

Zellen

5’ of DFL16.1-PCR

VH D VDJ- Cµa

5’ of DFL16.1-PCR

DFL

16.1

VDJ--PCR

VH D VDJ- CµaDFL

16.1

33

5. Ergebnisse

Um diese Frage zu beantworten, wurde mit der Einzelzell-PCR-Technik der Anteil

der Zellen bestimmt, die ein produktives VH-Replacement des Transgens vor einem

V-nach-DJ-Rearrangement am Wildtyp-Lokus durchgeführt haben. Hierzu wurden

IgM-positive B-Zellen aus einer heterozygoten IgHVDJ–/wt Maus benutzt, bei denen die

beiden IgH-Allele durch ihren Allotyp in der Cµ-Region unterschieden werden können

(Abb. 10). In diesen Tieren haben die IgM+-B-Zellen entweder ein VH-Replacement

auf dem transgenen IgMa-Allel durchgeführt oder das Wildtyp-IgMb-Allel rearrangiert.

Für die Analyse wurden Milzzellen mit Antikörpern gegen IgMa und IgMb gefärbt, und

einzelne Zellen mit einem FACS-Sorter in PCR-Platten sortiert. Die Zellen wurden

dann mit Proteinase K verdaut und per Einzelzell-PCR die Anwesenheit einer

Keimbahnsequenz direkt stromaufwärts vom D-Lokus (DFL16.1-Gensegment)

nachgewiesen (Abb. 10A). Diese Sequenz wird bei jedem V-nach-DJ-

Rearrangement entfernt und ist deshalb ein Indikator für ein unrearrangiertes oder

DJ-rearrangiertes Allel. Zusätzlich wurde das nicht-ersetzte VDJ–-Exon amplifiziert

(Abb. 10B). Die Effizienz und Spezifität der Einzelzell-PCR wurde in einem

Vorversuch mit einer Zelllinie überprüft und in jedem Experiment folgendermaßen

kontrolliert: Erstens mussten alle IgMa-positiven Zellen negativ für das VDJ–-Signal

sein, da diese Sequenz durch das VH-Replacement entfernt wird; und zweitens

mussten alle Zellen mit einem VDJ–-Signal auch ein Signal für die Sequenz

stromaufwärts vom DLF16.1-Gensegment haben, da diese Sequenz auch oberhalb

des unveränderten VDJ–-Lokus’ liegt. Diese Bedingungen wurden bei allen PCRs

erfüllt.

Die Einzelzell-PCR-Analyse (Abb. 10C) ergab, dass acht von 18 IgMa-postiven Zellen

auf dem Wildtyp-Lokus noch kein V-nach-DJ-Rearrangement durchgeführt hatten. In

diesen Zellen hatte das VH-Replacement des Transgens also schon vor der V-nach-

DJ-Rekombination des Wildtyp-Allels stattgefunden, möglicherweise im frühen Pro-B-

Zellstadium während der D-nach-J-Rekombination. Bei einem VH-Replacement

während der D-nach-J-Rekombination würden aus Zellen mit einem VDJ–- und einem

Keimbahn-Allel erst Zellen mit einem D-nach-VDJ-ersetzten DDJ-Allel und einem

Wildtyp-DJ-Allel entstehen, die dann auf einem der beiden Allele V-nach-DJ-

rekombinieren können. In Einklang mit dieser Interpretation steht, dass zwei von 18

IgMb-positiven Zellen ein unvollständiges D-nach-VDJ-Replacement auf dem IgMa-

Lokus hatten. Allerdings sind die Daten nur schwer zu interpretieren, da das VDJ–-

34

5. Ergebnisse

Exon einen gravierenden Einfluss auf die B-Zellentwicklung haben könnte. So könnte

es mit seiner Promotor/Enhancer-Aktivität den Lokus öffnen und gegebenenfalls für

eine höhere Rekombinationsfrequenz des veränderten Allels in einem früheren B-

Zellstadium sorgen.

5.1.5 B-Zellentwicklung in der Gegenwart langer CDR-3H-Regionen

Da die meisten VH-Replacements auf dem VDJ–-Allel ein zweites D-Segment

enthalten, sollten sie für µH-Ketten kodieren, die im Vergleich zu µH-Ketten aus

Wildtyp-Mäusen deutlich längeren CDR3-H-Regionen besitzen. Um diese Frage zu

klären, wurden in produktiven VDJ-Sequenzen aus Milz-B-Zellen von heterozygoten

IgHVDJ–/wt-Mäusen die Länge der CDR3-H-Regionen bestimmt. Dazu wurden B-Zellen

im FACS-Sorter anhand der exprimierten µH-Ketten in eine IgMa-positive Population

mit VH-Replacement und in eine IgMb-positive Population mit normal rekombinierten

Wildtyp-VDJ-Rearrangements getrennt. Aus der Gesamt-RNA der Zellen wurden

dann VH-Sequenzen mit RT-PCR amplifiziert, kloniert und sequenziert. Da die

Änderungen in der Länge der CDR3-H-Region bei Sequenzen der VH7183-Familie

während der B-Zellentwicklung bereits ausgiebig untersucht worden sind (Ivanov et

al. 2005), wurde ein Vorwärtsprimer für diese D-proximale VH-Familie benutzt. VDJ-

Sequenzen mit dem VH7183-Familienmitglied VH81x wurden von der Analyse

ausgeschlossen, da IgH-Ketten mit VH81x-Sequenzen oft nicht mit der SL-Kette und

konventionellen leichten Ketten paaren können (Keyna et al. 1995; Kline et al. 1998).

Da alle VDJ-Sequenzen mit VH-Replacement das JH4-Segment des Transgens

enthalten, wurde als Rückwärtsprimer ein JH4-Primer benutzt, so dass alle

verglichenen Sequenzen das gleiche JH-Segment benutzen. Die analysierten

Sequenzen von IgMa-positiven B-Zellen mit einem VH-ersetzten V-Exon enthielten

CDR3-H-Regionen mit einer durchschnittlichen Länge von 18.0 Aminosäuren.

Demgegenüber hatten Sequenzen von IgMb-positiven B-Zellen mit einem normalen

VDJ-Wildtyp-Rearrangement CDR3-H-Regionen mit einer durchschnittlichen Länge

von 12.5 Aminosäuren (Abb. 11), ein Wert, der mit publizierten Befunde für VH7183-

Sequenzen in Wildtyp-Mäusen sehr gut übereinstimmt (Ivanov et al. 2005).

Als nächstes wurde die Frage untersucht, ob während der B-Zellreifung B-lymphoide

Vorläufer mit langen CDR3-H-Regionen einen Differenzierungsnachteil gegenüber

35

5. Ergebnisse

C

DR

3-H

-Län

ge (i

n A

min

osäu

ren)

7183 J5587183

IgHVDJ-/VDJ-IgHVDJ-/wt

VH-Familie

Genotyp

KMCD19+/c-kit+

n=16

KMCD19+/CD25+/sIgM-

n=15

KMCD19+/CD25+/sIgM+

n=10

MilzCD19+

n=17

MilzCD19+

n=15

MilzIgMa+ (ersetzt)

n=25

MilzIgMb+ (wt)

n=12

17.8 18.116.5 16.4

15.5

18.0

12.5

6

10

15

20

24

Abb. 11. Bestimmung der CDR3-H-Länge VH-ersetzter µH-Ketten während der B-Zellentwicklung in VDJ--transgenen Mäusen. Milz- und Knochenmarks-(KM)-B-Zellstadien wurden aus hetero- oder homozygoten VDJ--Mäusen durchflusszytometrisch gemäß ihrer Oberflächenmarker sortiert. Aus den sortierten Zellen wurden VDJ-Sequenzen per RT-PCR mit spezifischen Primern für die VH7183- oder VHJ558-Familie amplifiziert, kloniert und sequenziert. Die Länge der CDR3-H-Regionen wurde gemäß Abb. XXX bestimmt und für jede Sequenz aus der entsprechenden Gruppe in das Diagramm eingetragen. Die Mittelwerte sind als Linien dargestellt. B-Zellen aus der Milz von heterozygoten VDJ--Mäusen wurden in IgMa- und IgMb-positive Populationen sortiert, die entsprechend das ersetzte IgMa- oder das Wildtyp-IgMb-Allel exprimieren. In homozygoten VDJ--Tieren exprimieren alle B-Zellen VH-ersetzte Sequenzen. Die beobachtete Verringerung der CDR3-H-Länge zwischen Oberflächen-µH-Ketten-negativen und -positiven Stadien ist nicht signifikant (p=0.05).

Vorläufern mit normalen VDJ-Umlagerungen haben. Dafür wurden produktive VDJ-

Sequenzen von FACS-sortierten Pro-B- (CD19+ und c-kit+), Prä-B- (CD19+, CD25+

und Oberflächen IgM-negativ) und unreifen B-Zellen (CD19+, CD25+ und

Oberflächen-IgM-positiv) aus dem Knochenmark, sowie von reifen Oberflächen-IgM-

positiven B-Zellen aus der Milz von homozygoten IgHVDJ–/VDJ–-Tieren verglichen.

Diese Analyse bestätigte einen deutlichen Anstieg der CDR3-H-Länge in allen

Stadien (Abb. 11). Pro-B- und Prä-B-Zellen enthielten µH-Ketten mit einer ähnlichen

Länge von 17.8 beziehungsweise 18.1 Aminosäuren. Demgegenüber sank die

CDR3-H-Länge beim Übergang von der Prä-BZR-positiven Prä-B-Zelle zur BZR-

positiven unreifen B-Zelle auf 16.8 Aminosäuren. Bei der weiteren Entwicklung zu

reifen Milz-B-Zellen blieb die CDR3-H-Länge unverändert. Um auszuschließen, dass

das Auftreten langer CDR3-H-Regionen eine Eigenheit der VH7183-Familie ist,

wurden auch Sequenzen mit VH-Segmenten der VHJ558-Familie untersucht. Diese

umfangreichste aller VH-Familien zeigte ebenfalls verlängerte CDR3-H-Regionen mit

einer Durchschnittslänge von 15.5 Aminosäuren in Milz-B-Zellen (Abb. 11). Unsere

Beobachtungen erlauben den Rückschluss, dass B-lymphoide Vorläufer mit CDR3-

36

5. Ergebnisse

A B

IgM

a+al

s %

der

IgM

+

10

0

5

15

KM MilzFI

(IgM

b , W

ildty

p-Al

lel)

FI (IgMa, ersetztes Allel)

2.8 5.0

48.017.7

Knochenmark Milz

Abb. 12. Durchflusszytometrische Bestimmung der Frequenzen von IgM-positiven B-Zellen mit VH-ersetzten und Wildtyp-VDJ-Exons in heterozygoten VDJ--Mäusen. (A) Knochenmarks-und Milz-B-Zellen wurden mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen Oberflächen-IgM gefärbt, die zwischen VH-ersetzten µH-Ketten mit dem Allotyp des VDJ--Allels (IgMa) und Wildtyp-µH-Ketten mit dem Allotyp des Wildtyp-Allels (IgMb) unterscheiden können. (B) Frequenzen der IgMa-positivenZellen in sechs heterozygoten VDJ--Mäuse aus zwei unabhängigen Würfen. Die Mittelwerte sind als Striche eingetragen.

H-Regionen mit einer Länge von mehr als 16 Aminosäuren sich in reife B-Zellen

entwickeln können und nur eine geringfügige Gegenselektion beim Übergang vom

Prä-B- zum unreifen B-Zellstadium, möglicherweise über die Paarung mit IgL-Ketten,

erfahren.

5.1.6 Konkurrenz zwischen B-Zellen mit einem VH-ersetzten und B-Zellen mit einem regulär rekombinierten VDJ-Exon in heterozygoten IgHVDJ–/wt-Mäusen

Um die Differenzierung von B-Zellen mit langen CDR3-H-Regionen und B-Zellen mit

CDR3-H-Regionen mit normaler Länge direkt zu vergleichen, wurden wieder

heterozygote IgHVDJ–/wt-Mäuse untersucht. Wie oben beschrieben, können Zellen, die

ein VH-ersetztes transgenes IgMa-Allel mit einer langen CDR3-H-Region exprimieren,

durch ihren Allotyp in der Cµ-Region von Zellen mit einem Wildtyp-IgMb-Allel mit

normaler CDR3-H-Länge unterschieden werden. Falls B-Zellen mit einem BZR mit

einer langen CDR3-H-Region einen Nachteil haben, sollte die Frequenz der Zellen,

die das transgene IgMa-Allel exprimieren, in der IgM+-Population beim Übergang vom

unreifen zum reifen B-Zellstadium stark abnehmen. Jedoch sank der Anteil der

IgMa+-Zellen an den IgM+-Zellen beim Übergang vom Knochenmark in die Milz nur

um ein Drittel von 14% auf 9.2% (Abb. 12).

Die Beobachtung, dass B-Zellen mit deutlich längeren CDR3-H-Regionen als den im

Wildtyp-Repertoire gemessenen 11.5 Aminosäuren sich auch in Konkurrenz zu

37

5. Ergebnisse

Wildtyp-B-Zellen mit kürzeren CDR3-H-Regionen entwickeln können, legt den

Schluss nahe, dass dieses Ansteigen der CDR3-H-Länge die funktionalen

Eigenschaften der µH-Ketten und die Signalkapazität des Prä-BZRs und des BZRs

nicht stark beeinträchtigt. Gleichzeitig zeigt jedoch der hohe Anteil der IgMb-

exprimierenden Zellen im Knochenmark heterozygoter IgHVDJ–/wt-Mäuse, dass die

VDJ-Rekombination am endogenen Wildtyp-Allel deutlich effizienter als das VH-

Replacement des Transgens ist.

Als weiterer Test auf die Funktionalität der ersetzten Antikörper wurden die Serum-Ig-

Spiegel von sechs Wochen alten homozygoten VDJ–-Mäusen mit denen von Wildtyp-

Geschwistern verglichen (Abb. 13). Hierbei wurden für die Isotypen IgM, IgA, IgG1,

IgG2b und IgG3 in beiden Fällen gleiche Serum-Spiegel gemessen. Nur der IgG2a-

Spiegel lag in transgenen Tieren 3.5-fach höher als in Wildtyp-Tieren. Dieser Befund

muss jedoch mit Vorsicht behandelt werden, da sich die ersetzten Antikörper vom

Sv129-Allel und die Wildtyp-Antikörper vom C57/Bl6-Allel in ihrem Cγ2a-Allotyp

unterscheiden und gegebenenfalls unterschiedlich gut von dem im der ELISA-

Messung eingesetzten Capture-Antikörper gegen IgG2a gebunden werden (Matthias

Wabl, persönliche Mitteilung). Weitere Untersuchungen müssen daher klären, ob die

stärkeren Signale für IgG2a eine Besonderheit der VDJ–-transgenen Tiere sind oder

durch den Unterschied im CH-Allotyp erklärt werden können.

Abb. 13. Serum-Ig-Spiegel in Wildtyp-und transgenen VDJ--Mäusen.Konzentrationen der angegebenen Ig-Klassen wurden im Serum von sechsWochen alten Tieren aus zwei Würfen in Triplikaten mittels ELISA bestimmt. Die Werte aus Wildtyp-Mäusen wurden als 100% angesetzt. Standardabweichungen sind als Balken angeben.

IgM IgA IgG1 IgG2a IgG2b IgG30

50

100

150

200

250

300

350

400

IgHwt/wt

IgHTer3/Ter3Ser

um-I

g-S

pieg

elal

s %

der

Wild

typ-

Spi

egel

38

5. Ergebnisse

5.2 Kontrolle der VDJ-Rekombination am IgH-Lokus durch eine nicht-produktive µ-mRNA

Ein zentraler Aspekt der Rekombination eines Keimbahn-VH-Gensegments mit einem

bereits umgelagerten DJ-Segment (V-nach-DJ-Rekombination) am IgH-Lokus ist der

Allelausschluss, durch den sichergestellt wird, dass nur eines der beiden IgH-Allele

eine produktive µH-Kette kodiert und die B-Zelle monospezifisch ist. Daher muss das

Rearrangement des zweiten Allels sofort nach einer produktiven Rekombination auf

dem ersten Allel unterdrückt werden. Ein Mechanismus hierfür ist die

Herunterregulierung der RAG-Rekombinations-Maschinerie durch Oberflächen-µH-

Ketten-Signale (Grawunder et al. 1995) und die Schließung der IgH-Lozi, bevor die

Rekombinationsenzyme zur Umlagerung der Leichtketten-Lozi erneut re-exprimiert

werden. Die Notwendigkeit einer Signal-kompetenten µH-Kette für die permanente

Schließung des IgH-Lokus’ für weitere V-nach-DJ-Rekombinationen belegen

Experimenten mit Mäusen, in denen die Prä-BZR-Signalleitung durch Mutationen in

der Membranregion der µH-Kette (µMT, Kitamura and Rajewsky 1992) oder durch

die Deletion oder Mutation der Prä-BZR-Signalkomponenten Igα und Igβ verhindert

wird (Papavasiliou et al. 1995; Gong and Nussenzweig 1996; Minegishi et al. 1999).

In diesen transgenen Zellen ist der Allelausschluss unvollständig, und es können

Zellen mit zwei µH-Ketten detektiert werden. Gleichzeitig sind die Zellen jedoch auch

in ihrer Entwicklung im Pro-B-Zellstadium arretiert und haben dadurch eine

verlängerte Zeitspanne, in der sie V-nach-DJ-Rearrangements durchführen können.

Dieser Entwicklungsblock könnte dazu geführt haben, dass schwächere, kurzfristige

Signale übersehen wurden, die in Wildtyp-Mäusen nach einem produktiven

Rearrangement auf einem Allel die V-nach-DJ-Rekombination auf dem zweiten Allel

solange verhindern, bis das µH-Ketten-Signal einsetzt und die Zelle ins Prä-B-

Zellstadium differenziert.

Hinweise für einen Mechanismus, der unabhängig von einem µH-Ketten-Signal die

VDJ-Rekombination und damit die Differenzierung früher Pro-B-Zellen kontrolliert,

ergaben sich aus Experimenten mit einer transgenen Maus, die eine transport-

inkompetente µH-Kette produziert, die weder das Endoplasmatische Retikulum (ER)

39

5. Ergebnisse

verlassen noch Differenzierungssignale auslösen kann (Kline et al. 1998; Mielenz et

al. 2003). In diesen Tieren war trotz der Gegenwart endogener Wildtyp-IgH-Lozi die

B-Zellentwicklung am Übergang vom Pro-B- zum Prä-B-Zellstadium beeinträchtigt,

was zu einer erhöhten Anzahl an Pro-B-Zellen und weniger Zellen in den B-

lymphoiden Folgestadien führte. Negative Effekte durch die Ansammlung

ungefalteter µH-Ketten und die Induktion der Unfolded-Protein-Response (UPR)

konnten ausgeschlossen werden, da die B-Zellentwicklung durch das Einbringen

einer funktionalen µH-Kette wiederhergestellt werden konnte (Meister 2004). Der

beobachtete Phänotyp ist vergleichbar mit einem partiellen Allelausschluss, bei dem

die VDJ-Rekombination in Pro-B-Zellen reduziert wird, es am Ende aber doch zu

einer Rekombination kommt. Da die transgene µH-Kette jedoch nicht signalisieren

kann, muss ein zweites, Transgen-abhängiges Signal beteiligt sein.

Daher sollte im zweiten Teil der Arbeit untersucht werden, ob schon die

Akkumulierung einer µ-mRNA alleine, d.h. in Abwesenheit eines µH-Ketten-Signals,

die Rate der VDJ-Rekombination am IgH-Lokus reduzieren kann. Die Menge an µ-

mRNA wäre ein idealer Indikator für eine produktive VDJ-Rekombination: Ist ein VDJ-

Rearrangement produktiv, so ist die transkribierte µ-mRNA stabil, liegt deshalb in

hohen Mengen vor und wird translatiert. Ist das VDJ-Rearrangement jedoch nicht-

produktiv, so enthält die transkribierte µ-mRNA ein vorzeitiges Translations-

Stopkodon (Nonsense- beziehungsweise Premature-Termination-Codon, PTC)

stromaufwärts von Exon-Exon-Grenzen in der Cµ-Region. Solche PTC-haltigen

Nonsense-mRNAs werden von der Nonsense-Mediated-mRNA-Decay (NMD)-

Maschinerie erkannt und rasch abgebaut, was zu einer 50- bis 100-fachen

Reduzierung in der Menge an Nonsense-µ-mRNA führt (Baumann et al. 1985; Jack

et al. 1989). Falls die µ-mRNA an der Kontrolle der VDJ-Rekombination am IgH-

Lokus beteiligt wäre, könnte sie die Zeitlücke zwischen dem Entstehen eines

produktiven VDJ-Rearrangement und der Induktion eines Prä-BZR-Signals von der

Oberfläche überbrücken.

40

5. Ergebnisse

Ter3-µH-Ketten-TransgenA Endogener IgH-Lokus

B

12.3kb

3.5kb

Sonde1.9kb

L VDJH4

SalI XhoIAseI Ase

I

Cµ

Stop (+3)

iEµ

7.3kb

Sonde1.9kb

DQ52 J H4

AseI

AseI

CµJ H3

J H2

J H1 iEµ

Abb. 14. Nachweis des integrierten Ter3-Transgens. (A) Das Ter3-μH-Ketten-Transgen besteht aus dem einem mutierten 17.2.25-VDJ-Exon und dem µH-Ketten-Lokus. Das VDJ-Exon enthält im Leseraster ein Translations-Stopkodon (Nonsense-Kodon) an Position +3 im Leader. (B) Southern-Blot-Analyse mit AseI-verdauter DNA von Mäusen mit den angezeigten Genotypen. Die DNA wurde nach Verdau und Transfer auf Nitrozellulosemembran mit einer 1.9kb-Sonde hybridisiert, die eine direkt auf das JH4-Gensegment folgende Sequenz enthält. Diese Sequenz liegt bei dem Transgen auf einem internen 3.5kb-AseI-Fragment und beim endogenen Lokus auf einem 7.3kb-AseI-Fragment. (C) Die Bandenintensitäten wurden quantifiziert und die Kopienzahl aus dem Verhältnis der Bandenintensitäten des Transgens und der endogenen Lozi bestimmt.

kb

5

3

6

8

Wildtyp 7307Ter3 7307Ter3/Ter3 7204Ter3 7204Ter3/Ter3

Endogene IgH-Lozi

Transgen

9,54,711,69,5Transgen-Kopien pro Lokus

1290269-1342022-Homozygotes Transgen

-742069-1177343Hemizygotes Transgen

135178319151115713248314Endogene IgH-Lozi

7204Ter3/Ter37204Ter37307Ter3/Ter37307Ter3

C

41

5. Ergebnisse

5.2.1 Etablierung einer transgenen Maus mit einer stabilisierten Nonsense-µ-mRNA

Um die Hypothese zu überprüfen, dass eine stabile µ-mRNA unabhängig von der

Anwesenheit einer µH-Kette weitere Umlagerungen am IgH-Lokus beeinflussen

kann, wurde eine transgene Maus etabliert, die eine stabilisierte Nonsense-µ-mRNA

exprimiert. Ausgehend vom Expressionsvektor pµPGT wurde dazu der transgene

Expressionsvektor pµTer3 konstruiert, in dem das dritte Kodon (+3) im Leader-Peptid

in ein Stopkodon umgewandelt wurde, da ein Stopkodon an dieser Position die

Stabilität der Nonsense-µ-mRNA in Plasmazellen nur um 50% reduziert (Buzina and

Shulman 1999; Buhler et al. 2004). Um eine Re-Initiation der Translation und die

Synthese einer verkürzten µH-Kette zu verhindern, wurden zusätzlich im pµTer3-

Vektor alle im Leseraster vorhandenen ATG-Kodons des VDJ-Exons in Ala-Kodons

umgewandelt. Anschließend wurde das 12.3kb SalI/XhoI-Fragment (Ter3-Transgen,

Abb. 14A), das den VH-Promotor und das mutierte VDJ-Exon des Hybridomas

17.2.25 sowie die genomische Cµ-Region aus Sv129-Mäusen enthält, aus dem

Vektor pµTer3 herausgeschnitten, gelelektrophoretisch isoliert und in den Pronukleus

von C57/Bl6-Oozyten injiziert. Durch Verpaaren der Founder-Mäuse 7204, 7302 und

7307 mit C57/Bl6-Tieren wurden drei unabhängige Ter3-transgene Linien etabliert,

die den gleichen Knochenmarks-Phänotyp zeigten. Von den weitergeführten Linien

7204 und 7307 wurde für die meisten Untersuchungen die 7307-Linie benutzt.

5.2.2 Bestimmung der Kopienzahl und des Integrationsortes des Transgens

Zuerst wurde die Anzahl der integrierten Transgenkopien durch Southern-Blot-

Analyse bestimmt. Dazu wurde DNA aus Schwanzbiopsien aufgereinigt, mit AseI

verdaut, gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Membran transferiert und mit

einer 1.9kb langen NaeI/SpeI-Sonde aus dem Vektor pµGPT hybridisiert (Abb. 14A).

Mit dieser Sonde konnte nach dem Verdau mit AseI ein transgenes 3.5kb-Fragment

und ein endogenes 7.3kb-Fragment nachgewiesen werden. Die Anzahl der

integrierten Transgenkopien wurde dann aus dem Verhältnis der Bandenintensitäten

42

5. Ergebnisse

5'-Ende des Transgens

IgMTer113 revMseI MseI (419)

IgMTer386 fwd

IgMTer344 rev

Bruchpunkt

FlankierendeSequenz

MseI

IgMTer113rev

IgMTer344 rev

IgMTer386fwd

FlankierendeSequenz


A B

Abb. 15. Bestimmung des Ter3-Transgen-Integrationsorts durch Zirkel-PCR.(A) Schema eines Insertionspunktes mit den Positionen der für die Zirkel-PCR verwendeten Primer. (B) Konfiguration eines nach MseI-Verdau von Schwanz-DNA und anschließender Ligierungentstandenen DNA-Zirkels mit Bruchpunktsequenz, der neben dem 5'-Ende des Transgens auch die flankierende endogene Sequenz bis zur nächsten MseI-Schnittstelle enthält. Die flankierende Sequenz wurde in einer semi-nested PCR mit den als Pfeilen eingezeichneten Primern amplifiziert, kloniert und sequenziert.

für das transgene 3.5kb-Fragment und für das endogene 7.3kb-Fragment

abgeschätzt (Abb. 14B, C) und ergab für die 7204-Linie 5-10 Transgenkopien und für

die 7307-Linie ca. 10 Transgenkopien.

Um den Einfluss des Integrationsortes auf die VDJ-Rekombination beziehungsweise

auf ein für die B-Zellentwicklung wichtiges Gen auszuschließen, wurden die

Integrationsorte der Transgene in beiden transgenen Mauslinien bestimmt. Dazu

wurde die aufgereinigte Schwanz-DNA mit dem 4bp-erkennenden Enzym MseI

verdaut, und die Fragmente nach Verdünnung zu Zirkeln ligiert (Abb. 15). Da MseI

an einer unbekannten Stelle im Genom stromaufwärts vom inserierten Transgen und

an Position 419 des Transgens schneidet, enthielten einige der entstandenen Zirkel

das 5’-Ende des Transgens und die flankierende genomische Sequenz bis zur

nächsten MseI-Schnittstelle. Diese Bruchpunktsregion wurde mit Primern in der

Transgen-Sequenz (IgMTer386 fwd und IgMTer344 rev oder IgMTer113 rev) in einer

semi-nested PCR amplifiziert, kloniert und sequenziert (Abb. 16). Die genomische

Position der Integrationsorte wurde mit dem Maus-BLAT-Programm der Genome-

Bioinformatics-Group an der UC Santa Cruz (http://genome.ucsc.edu) bestimmt und

basiert auf der "essentially complete" Zusammenstellung des Mus musculus-Genoms

von NCBI und dem Mouse-Genome-Sequencing-Consortium vom Februar 2006

(mm8, Build 36). Die beiden Integrationsorte werden im folgenden als 7204- und

7307-Lokus bezeichnet, und Hemizygotie (Ter3) oder Homozygotie (Ter3/Ter3) der

Transgene entsprechend angezeigt.

43

5. Ergebnisse

A

B


IgMTer 113 rev 3' of 7204 rev5' of 7204 fwd

Sequenzierter Bruchpunkt

MseI (41) MseI (148) MseI (225)

IgMTer 113 rev 3' of Ter7307 rev35' of Ter7307 fwd2

MseI (62) MseI (351)


Sequenzierter Bruchpunkt

C

D

Abb. 16. Bruchpunktsequenzen der inserierten Ter3-Transgene. Der Bruchpunkt in der transgenen Linie 7204 als Schema (A) und Sequenz (B) und in der Linie 7307 als Schema (C) und Sequenz (D). Die zur Genotypisierung verwendeten Primer sind als Pfeile eingezeichnet.

44

5. Ergebnisse

A B Abb.

17.

Anal

yse

der d

as T

rans

gen

7307

flan

kier

ende

n ge

nom

isch

enSe

quen

zen

auf f

unkt

ione

lle G

ene.

(A) I

nteg

ratio

nsor

tdes

Tra

nsge

ns 7

307

auf C

hrom

osom

5 a

n Po

sitio

n 10

.473

.198

. (B

) Pos

ition

en v

on G

enen

, mR

NAs

und

miR

NA

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ein

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38kb

stro

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f-un

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Inte

grat

ions

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Ber

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BLA

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grat

ions

ort d

es T

rans

gens

730

7

(http

://ge

nom

e.uc

sc.e

du).

45

5. Ergebnisse

A B Ab

b. 1

8. A

naly

se d

er d

as T

rans

gen

7204

flan

kier

ende

n ge

nom

isch

enSe

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zen

auf f

unkt

ione

lle G

ene.

(A) I

nteg

ratio

nsor

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Tra

nsge

ns 7

204

auf C

hrom

osom

5 a

n Po

sitio

n 10

9.97

5.63

3. (B

)Pos

ition

en v

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NA

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d m

iRN

Asin

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erei

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38kb

stro

mau

f-un

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ts z

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größ

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Ber

eich

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geno

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).

Inte

grat

ions

ort d

es T

rans

gens

720

4

46

5. Ergebnisse

In der Linie 7307 ist das Ter3-Transgen auf Chromosom 5 an Position 10.473.198

integriert, wo zu beiden Seiten in einem Bereich von 238kb keine Gene oder miRNAs

in Santa-Cruz-Browser angezeigt wurden (Abb. 17). Die Region ist zwar homolog

zum Gen Anapc5 (Anaphase-promoting-complex-subunit 5) im Krallenfrosch

(Xenopus), Zebrafisch (Danio) und Huhn (Gallus), doch liegt der Anapc5-Lokus in

der Maus an einem anderen Ort.

In der Linie 7204 ist das Ter3-Transgen ebenfalls auf Chromosom 5 integriert (Abb.

18). In der Nähe des Integrationsortes an Position 109.975.633 befinden sich zwei

Gene. In direkter Nachbarschaft liegt das uncharakterisierte Gen BC065392 (Similar

to Kruppel-Related-Zinc-Finger-Protein F80-L). Das zweite Gen, Tpte2 (CRLM2,

Tslpr), liegt 175kb stromaufwärts vom Integrationsort und kodiert die Common-γ-

Like-Chain (Fujio et al. 2000), die ähnlich zur Common-γ-Chain des Interleukin-7-

Rezeptors ist. Die Common-γ-Like-Chain bildet als Heterodimer mit der Interleukin-7-

Rezeptor-α-Kette den Thymic-Stromal-Lymphopoietin-Receptor (TSLP-R). Dieser

Rezeptor erkennt das Thymic-Stromal-Lymphopoietin, das ursprünglich aus einer

murinen Thymusstroma-Zelllinie isoliert wurde und die Entwicklung unreifer B-Zellen

in vitro unterstützt (Friend et al. 1994; Levin et al. 1999). Trotz des Abstands von

175kb lässt sich ein Einfluss des Transgens auf die Expression des Tpte2-Lokus’

nicht komplett ausschließen. Allerdings sollte eine verringerte TSLP-R-Expression

keine größeren Auswirkungen auf die B-Zellentwicklung haben, da Mäuse mit einer

Deletion des TSLP-R-Lokus’ eine normale B-Zellentwicklung mit unverändertem Pro-

B-Zellstadium durchlaufen (Carpino et al. 2004). In nächster Nachbarschaft des

7204-Transgens befindet sich zusätzlich eine Region, die homolog zu dem Gen

Golga7 (Golgi-Autoantigen, Golgin Subfamily A, 7) in Ratte, Mensch und anderen

Spezies ist. In der Maus liegt der Golga7-Lokus jedoch an einer anderen Position.

5.2.3 Expressions-Niveau der stabilisierten Ter3-Nonsense-µ-mRNA

Um zu überprüfen, ob die durch das Stopkodon an Position +3 stabilisierte Ter3-

Nonsense-µ-mRNA als Modell für eine endogene Sense-µ-mRNA dienen kann und

in ähnlichen Mengen wie Sense-µ-mRNA vorliegt, wurde zunächst in der transgene

Mauslinie 7307 das Expressionsniveau der Ter3-µ-mRNA mit dem einer endogenen,

47

5. Ergebnisse

Produktives 17.2.25 Allel(in QM-Transgen / pµGPT)

Nicht-produktives 17.2.25 Allel(in Ter3-Transgen / pµTer3)

A

C D

Abb. 19. Vergleich des Expressionsniveaus von Ter3- und QM-µ-mRNA.(A, B) Darstellung der Konfiguration des nicht-produktiven und des produktiven 17.2.25-Allels in den entsprechenden Transgenen und Expressionsvektoren. Die Position der nur im nicht-produktiven Allel vorhandenen FspI-Schnittstelle ist gekennzeichnet. Die Positionen der PCR-Primer sind als Pfeile angedeutet. (B) RT-PCR-Analyse von 17.2.25-mRNAs in transfizierten Ag8-Zellen und B-lymphoiden Zellen aus IgHQM/wt, 7307Ter3-Mäusen. RNA aus transfizierten Ag8-Zellen und c-kit+-Pro-B-Zellen und 17.2.25-Idiotyp+-Milzzellen (Milz) aus zwei IgHQM/wt, 7307Ter3-Mäusen wurde isoliert. µ-mRNAs wurden dann von der cDNA mit den in (A) als Pfeile eingezeichneten Primern amplifiziert, aufgereinigt und unverdaut (-) oder nach FspI-Verdau (+) gelelektrophoretisch aufgetrennt. (C) Der Anteil der unverdauten produktiven µ-mRNA an der gesamten µ-mRNA wurde aus dem Verhältnis der Bandenintensitäten der 567bp-Bande aus verdauten und unverdauten Proben errechnet und in Triplikaten bestimmt.

Sense-mRNA

567bp

Cµ1 rev5' UTR17.2.25 fwd

Nonsense-mRNA

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

Tier 1 Tier 2 Tier 1 Tier 2Pro-B-Zellen Id+-Milz-B-Zellen

FspI

379bp188bp

Cµ1 rev5' UTR17.2.25 fwd

VDJH4 Cµ2Cµ1L

Stop +3

VDJH4 Cµ2Cµ1L

B

[Sen

se-µ

-mR

NA

] / [G

esam

t-µ-m

RN

A]FspI

Milz-B-ZellenIgHQM/wt, 7307Ter3 Tiere

+-+-+-+-+-+-Tier 2Tier 1Tier 2Tier 1pµTer3pµ

Pro-B-ZellenTransfizierteAg8-Zellen

567bp

379bp

188bp

121110987654321

produktiven Sense-µ-mRNA verglichen. Hierzu wurden transgene 7307-Ter3-Tiere

mit Quasi-monoklonalen (QM-) Mäusen gekreuzt (Cascalho et al. 1996), die ein in

den JH-Lokus inseriertes produktives 17.2.25-VDJ-Exon tragen. So konnte die vom

Ter3-Transgen exprimierte Nonsense-17.2.25-mRNA mit der vom IgHQM-Lokus

kodierten Sense-17.2.25-mRNA verglichen werden (Abb. 18A). Für die Analyse

wurde RNA aus sortierten c-kit/CD19-positiven Knochenmarkszellen und CD19-

48

5. Ergebnisse

/17.2.25-Idiotyp-positiven Milz-B-Zellen von IgHQM/wt, 7307Ter3-Tieren gewonnen und

mit Oligo-dT-Primern in cDNA umgeschrieben. Sense- und Nonsense-Transkripte

wurden dann im gleichen PCR-Ansatz mit Primern amplifiziert, die an die 5’-UTR des

17.2.25-Exons und an die Cµ1-Region binden. Die PCR-Produkte wurden

gelelektrophoretisch aufgereinigt, und die Hälfte der Probe wurde mit dem

Restriktionsenzym FspI verdaut. Da FspI nur in den Nonsense-Amplifikaten

schneidet (Abb. 19A), konnte so der relative Anteil der Nonsense-µ-mRNA an der

Gesamt-µ-mRNA aus dem Verhältnis zwischen den Bandintensitäten der

unverdauten Proben und den Intensitäten der Sense-Amplifikate (567bp in Abb. 19C)

in verdauten Proben errechnet werden (Abb. 19D). Die Validität des diagnostischen

FspI-Verdaus wurde mit cDNA aus Ag8-Hybridomalinien überprüft, die entweder mit

dem Sense-pµGPT- oder dem Nonsense-pµTer3-Plasmid stabil transfiziert worden

waren (Abb. 19C, Spuren 1-4).

Die Analyse ergab etwa dreimal mehr Ter3-Nonsense- als Sense-Transkripte in c-kit-

positiven Pro-B-Zellen und etwa gleiche Mengen beider Transkripte in 17.2.25-

Idiotyp-positiven Milz-B-Zellen. Allerdings ist die scheinbar höhere Expression der

Ter3-Nonsense-µ-mRNA in Pro-B-Zellen wahrscheinlich eine Überschätzung, da ein

signifikanter Anteil an Pro-B-Zellen in IgHQM-Mäusen das QM-Allel durch VH-

Replacement verliert und die Sense-17.2.25-mRNA somit nicht mehr exprimiert

(siehe unten). Bei der Analyse der RNA aus sortierten 17.2.25-Idiotyp-positiven

Milzzellen, die alle das Sense-Transkript exprimieren, sollte dieses Problem nicht

auftreten, weshalb die 17.2.25-Idiotyp-positiven Milzzellen besser zur Abschätzung

der relativen Sense- und Nonsense-µ-mRNA-Mengen geeignet sind. Aus diesen

Ergebnissen kann geschlossen werden, dass in B-lymphoiden Zellen der Ter3-

transgenen 7307-Linie die Menge der Ter3-Nonsense-µ-mRNA in etwa vergleichbar

mit der Menge an endogener Sense-µ-mRNA ist. Die Ter3-transgenen Mäuse sollten

deshalb ein ideales Modellsystem sein, um den Einfluss einer µ-mRNA auf die VDJ-

Rekombination am IgH-Lokus in Abwesenheit einer µH-Kette zu untersuchen.

49

5. Ergebnisse

5.2.4 B-Zellentwicklung in Gegenwart der Ter3-µ-mRNA

Falls die transgene Ter3-µ-mRNA tatsächlich die VDJ-Umlagerung am endogenen

IgH-Lokus negativ beeinflusst, sollte sich in Ter3-transgenen Tieren die Anzahl der

Pro-B-Zellen erhöhen und die Anzahl der Zellen in den darauf folgenden B-

Zellstadien erniedrigen. Zur Überprüfung dieser Vorhersage wurden in den beiden

Ter3-Linien 7307 und 7204 B-lymphoide Differenzierungsstadien im Knochenmark

durchflusszytometrisch analysiert (Abb. 20A, B und 21A, B). Hierbei zeigten Ter3-

transgene Tiere in beiden Linien im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen aus dem gleichen

Wurf im Knochenmark eine vergrößerte Pro-B-Zellpopulation und eine Reduktion in

den Folgestadien. In homozygoten Ter3-Mäusen war die Frequenz (Abb. 20, 21) und

die absolute Zellzahl (Tab. 1) der Pro-B-Zellpopulation verdoppelt, während in

heterozygoten Ter3-Mäuse einen intermediären Phänotyp beobachtet wurde.

Gleichzeitig waren die CD25-positiven Prä-B- und IgM-positiven unreifen B-Zellen im

Knochenmark in Frequenz und absoluter Zellzahl in beiden transgenen Ter3-Linien

erniedrigt. In der Milz waren hingegen die IgM-positiven Populationen nicht verändert

(Abb. 22). Ähnliche Ergebnisse wurden auch in der dritten Ter3-transgenen Linie

7302 beobachtet (Daten nicht gezeigt).

Um zu untersuchen, ob die Pro-B-Zellen vor oder nach dem VDJ-Rearrangement in

ihrer Differenzierung beeinträchtigt sind, wurden CD19-/c-kit-postive Pro-B-Zellen

fixiert und für intrazelluläre µH-Ketten angefärbt (Abb. 20C, D, 21C, D). In beiden

transgenen Ter3-Linien war der Anteil der µH-Ketten-positiven Zellen in der Pro-B-

Zellpopulation in homozygoten transgenen Tieren im Vergleich zu Wildtyp-

Geschwistern auf die Hälfte reduziert. Diese Erhöhung des Anteils an µH-Ketten-

negativen Pro-B-Zellen in transgenen Ter3-Mäusen deutet auf eine Störung der VDJ-

Rekombination hin.

Um einen unspezifischen negativen Einfluss des Transgens auf RAG-vermittelte

Rekombinationen auszuschließen, wurde die T-Zellentwicklung und die Umlagerung

der T-Zellrezeptor-(TZR-) Gene im Thymus von Ter3-transgenen und Wildtyp-

Mäusen analysiert (Abb. 23). Diese Analyse ergab keinen signifikanten Unterschied

zwischen Ter3-transgenen und nicht-transgenen Geschwistern in der Frequenz an

doppelt-negativen (DN) Zellen, die den TZR-β-Lokus umlagern und dann den Prä-

50

5. Ergebnisse

FI (c

-kit)

FI (CD19)

FI (C

D25

)FI

(IgM

)7307Ter3A Wildtyp 7307Ter3/Ter3

SSC

FSC

FI (c

-kit)

FI (CD19)

6.6 8.5 16.8

19.7 22.0 12.9

48.0 42.1 29.0

7307Ter3C Wildtyp 7307Ter3/Ter3

FI (c

-kit)

FI (Intrazelluläres IgM)

28.2 16.4 14.2

3.7 7.6 14.3

B

D

Abb. 20. Durchflusszytometrische Analyse der B-Zellentwicklung in der Ter3-transgenen Linie 7307. (A, C) Knochenmarkszellen von sechs Wochen alten Mäusen wurden mit den angegebenen Antikörpern gefärbt und die Fluoreszenzintensität (FI) der in den Lymphozyten-Bereich fallenden Zellen per FACS bestimmt. Die Zahlen rechts neben den Diagrammen zeigen den Anteil der Zellen in den markierten Bereichen in Prozent. (B, D) Die Ergebnisse des gesamten Wurfs wurden jeweils als Grafik dargestellt und sind für sieben Experimente mit unabhängigen Würfen repräsentativ. Die Mittelwerte sind als Striche dargestellt und über den Spalten angegeben.

P = 0.018 * P = 0.008 ** P = 0.017 *

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

051015202530354045505560

c-kit+ CD25+ IgM+

7.1 8.5 15.7 51.8 42.0 24.0 21.9 22.0 11.7

7307

Ter3

/Ter

3

7307

Ter3

Wild

typ

7307

Ter3

/Ter

3

7307

Ter3

Wild

typ

7307

Ter3

/Ter

3

7307

Ter3

Wild

typ

Pop

ulat

ion

als

Proz

ent d

er L

ymph

ozyt

en

P = 0.0003 *** P = <0.0001 ***

0

5

10

15

20

25

30

35 3.4 7.7 12.9

7307

Ter3

/Ter

3

7307

Ter3

Wild

typ

C-k

it+-P

opul

atio

nal

s %

der

Lym

phoz

yten

Intra

zell.

IgM

+ -Ze

llen

als

% d

er c

-kit+

-Pop

ulat

ion

7307

Ter3

/Ter

3

7307

Ter3

Wild

typ

P = <0.0001 *** P = <0.008 **

30.1 17.0 13.635

30

25

20

15

10

5

0

51

5. Ergebnisse

FI

(c-k

it)

FI (CD19)

FI (C

D25

)FI

(IgM

)

A 7204Ter3Wildtyp 7204Ter3/Ter3

SSC

FSC

23.2 30.8 21.9

24.0 23.9 20.6

3.3 4.3 7.0

FI (Intrazelluläres IgM)

FI (c

-kit)

C

B

FI (CD19)

FI (c

-kit)

Abb.7204.AntikZellenden mGrafiMittel

D7204Ter3Wildtyp 7204Ter3/Ter3

21. Durchflusszytometrische Analyse der B-Zellentwicklung in der Ter3-transgenen Linie (A, C) Knochenmarkszellen von sechs Wochen alten Mäusen wurden mit den angegebenen

örpern gefärbt und die Fluoreszenzintensität (FI) der in den Lymphozyten-Bereich fallenden per FACS bestimmt. Die Zahlen rechts neben den Diagrammen zeigen den Anteil der Zellen in arkierten Bereichen in Prozent. (B, D) Die Ergebnisse des gesamten Wurfs wurden jeweils als

k dargestellt und sind für sechs Experimente mit unabhängigen Würfen repräsentativ. Die werte sind als Striche dargestellt und über den Spalten angegeben.

0123456789

10

0

5

10

15

20

25

30

35

c-kit+ CD25+ IgM+

3.3 5.0 6.829.0

25.520.6

23.929.3

21.7

Pop

ulat

ion

als

Pro

zent

der

Lym

phoz

yten

7204

Ter3

/Ter

3

7204

Ter3

Wild

typ

7204

Ter3

/Ter

3

7204

Ter3

Wild

typ

7204

Ter3

/Ter

3

7204

Ter3

Wild

typ

0

5

10

15

20

25

30

3520.1 15.3 12.8

Intra

zell.

IgM

+ -Ze

llen

als

% d

er c

-kit+

-Pop

ulat

ion

7204

Ter3

/Ter

3

7204

Ter3

Wild

typ

1.9 2.8 4.1

20.0 16.3 12.3

P = 0.0075 **

P = 0.089

P = 0.0375 *

P = 0.118

52

5. Ergebnisse

7307Ter3A Wildtyp 7307Ter3/Ter3S

SC

FSC

FI (IgM)

FI (I

gD)

10.4 10.9 11.6

B

Abb. 22. Durchflusszytometrische Analyse der B-Zellpopulationen in der Milz von Ter3-transgenen Mäusen. Milzzellen von Tieren aus der 7307-Linie (A) und der 7204-Linie (B) wurmit den angegebenen Antikörpern gefärbt und die Fluoreszenzintensität (FI) der in den LymphozBereich fallenden Zellen per FACS bestimmt. Folgende Populationen sind markiert (im Uhrzeigersinn): Die rezirkulierenden naiven B-Zellen (IgMschwach, IgDhoch), die transitional-Type-IIZellen (IgMhoch, IgDhoch) und die IgMhoch, IgDschwach-Population mit den Marginalzonen-, unreifen transitional-Type-I-, B1- und Gedächtnis-B-Zellen. Die Zahlen rechts neben den Diagrammen zeiden Anteil der Zellen in den markierten Bereichen in Prozent.

den yten-

-B-

gen

FI (IgM)

FI (I

gD)

15.7 14.5

SSC

FSC

7204Ter3Wildtyp

5.7 4.8

8.6 8.0

4.2 5.3 5.0

8.4 9.3 5.8

7307Ter3/Ter37307Ter3Wildtyp

Abb. 23. Durchflusszytometrische Analyse der T-Zellentwicklung in der Ter3-transgenen Linie 7307. Thymuszellen von sechs Wochen alten Mäusen wurden mit den angegebenen Antikörpern gefärbt und die Fluoreszenzintensität (FI) der in den Lymphozyten-Bereich fallendenZellen per FACS bestimmt. Die Zahlen rechts neben den Diagrammen zeigen den Anteil der Zein den markierten Bereichen in Prozent. Die doppelt-negative (DN) Population wurde zusätzlich anhand der Marker CD25 und CD44 in die Stadien DN I bis IV unterteilt. In der DN II-Population(Pro-T-Zellstadium) findet die VDJ-Rekombination am TZR-β-Lokus statt.

llen

CD44

CD

25

66.7 4.8

22.9 5.6

67.2 1.1

25.8 5.9

65.6 1.2

28.4 4.8

DN III DN II

DN IV DN I

CD8

CD

4

10.1

1.4 2.5

10.1

1.5 2.4

10.3

1.8 2.5

CD4+

DN CD8+

DP

53

5. Ergebnisse

TZR exprimieren, an doppelt-positiven (DP) Zellen, die den TZR-α-Lokus umlagern

und dann den TZR exprimieren, und an den darauf folgenden CD4- und CD8-einzel-

positiven Zellen. Um die T-Zellstadien, in denen die dem IgH-Lokus entsprechende

Rekombination am TZR-β-Lokus stattfindet, genauer zu untersuchen, wurden die

DN-Stadien durch das Anfärben spezifischer Oberflächenmarker weiter aufgetrennt.

Auch hierbei war keine Änderung in der Frequenz von Zellen am Übergang vom Pro-

T-Zellstadium (DN II), in dem die TZR-β-Rekombination stattfindet, zum Prä-TZR-

positiven Prä-T-Zellstadium (DN III) nachweisbar. Diese Daten zeigen, dass das

Ter3-Transgen nur die Entwicklung von Pro-B-Zellen beeinträchtigt. Ob damit auch

ein Einfluss der Ter3-µ-mRNA auf die T-Zellentwicklung ausgeschlossen werden

kann, ist noch nicht klar. Zwar werden in µH-Ketten-transgenen Mäusen vom Ig-

Promoter/Enhancer getriebene Transgene auch in T-Zellen exprimiert (Grosschedl et

al. 1984), allerdings wurde das Expressionsniveau des Ter3-Transgens in T-Zellen

noch nicht untersucht.

5.2.5 Komplementation der B-Zellentwicklung durch ein produktives VDJ-Exon

Falls die erhöhte Anzahl an µH-Ketten-negativen Pro-B-Zellen in Ter3-transgenen

Mäusen auf einer Störung der VDJ-Rekombination am IgH-Lokus beruht, sollte die

B-Zellentwicklung durch eine transgene funktionelle QM-µH-Kette (siehe oben)

wieder in den in Wildtyp-Mäusen beobachten Phänotyp revertiert werden. Daher

wurde die B-Zellentwicklung in heterozygoten QM-Mäusen mit und ohne 7307-Ter3-

Transgen verglichen. Durchflusszytometrische Analysen mit Knochenmark aus

entsprechenden transgenen Mäusen ergaben vergleichbare Frequenzen an c-kit-

positiven Pro-B-Zellen in IgHQM/wt, 7307Ter3- und IgHQM/wt-Mäusen (Abb. 24). Dies

zeigt, dass die in Ter3-transgenen Mäusen beobachtete Beeinträchtigung der

Differenzierung von Pro-B-Zellen (Abb. 20, 21) durch eine funktionelle µH-Kette

vollständig aufgehoben werden kann (Abb 24). Der geringe Anstieg der c-kit-

positiven Pro-B-Zellpopulation in Ter3-transgenen QM-Mäusen lässt sich

wahrscheinlich durch Pro-B-Zellen erklären, die ihr produktives QM-Allel durch VH-

Replacement verloren haben und in Gegenwart der Ter3-Transkripte den endogenen

IgH-Lokus schlechter rearrangieren können.

54

5. Ergebnisse

A BFI

(c-k

it)FI

(CD

25)

IgHQM/wt IgHQM/wt, 7307Ter3

SSC

FSC

FI (I

gM)

FI (CD19)

FI (CD19)

FI (CD19)

4.0 3.7

18.9 20.6

23.5 18.7

Abb. 24. Komplementation der Ter3-transgenen Linie 7307 durch ein produktives QM-VDJ-Exon. (A) Knochenmarkszellen von 10 Wochen alten Mäusen wurden mit den angegebenen Antikörpern gefärbt und die Fluoreszenzintensität (FI) der in den Lymphozyten-Bereich fallenden Zellen per FACS bestimmt. Die Zahlen rechts neben den Diagrammen zeigen den Anteil der Zellen in den markierten Bereichen in Prozent. (B) Die Ergebnisse des gesamten Wurfs wurden jeweils als Grafik dargestellt und sind für 10 Experimente mit unabhängigen Würfen repräsentativ. Die Mittelwerte sind als Striche dargestellt und über den Spalten angegeben.

3.5 4.0 24.7 21.6 23.6 21.6

8

CD25+ckit+ IgM+

7 30

6 255

204

153

102

51

0 0

35

Pop

ulat

ion

als

Proz

ent d

er L

ymph

ozyt

en

IgH

QM

/wt

IgH

QM

/wt ,

7307

Ter3

IgH

QM

/wt

IgH

QM

/wt ,

7307

Ter3

IgH

QM

/wt

IgH

QM

/wt ,

7307

Ter3

55

5. Ergebnisse

Da QM-Mäuse wie Wildtyp-Mäuse im Prä-B-Zellstadium eine endogene leichte Kette

rearrangieren müssen, um in das IgM-positive Stadium zu differenzieren, ließ sich in

ihnen auch der Einfluss der Ter3-µ-Transkripte auf die VJ-Rekombination an den

Leichtketten-Lozi untersuchen. Hierbei stellte sich heraus, dass die CD25-positiven

Prä-B- und die IgM-positiven B-Zellpopulationen in IgHQM/wt, 7307Ter3-Mäusen durch

das Ter3-Transgen nicht verändert wurden und mit IgHQM/wt-Mäusen vergleichbar

waren (Abb. 24).

Die erfolgreiche Reversion der in Ter3-transgenen Mäusen beobachteten

Beeinträchtigung der B-Zellentwicklung durch eine produktive µH-Kette und die

unveränderten Prä-B-Zellpopulationen deuten also darauf hin, dass die in Ter3-

transgenen Mäusen beobachte Störung im Pro-B-Zellstadium durch eine

Beeinträchtigung der VDJ-Rekombination am IgH-Lokus ausgelöst wird, während die

Rekombination der Leichtketten-Lozi nicht behindert wird.

5.2.6 Abwesenheit von µH-Ketten-Signalen in rekombinations-defizienten Ter3-transgenen Pro-B-Zellen

Um auszuschließen, dass von dem Ter3-Transgen durch Reinitiierung der

Translation an einem Leseraster-ATG der Cµ-Region verkürzte µH-Ketten exprimiert

werden, die dann Differenzierungssignale auslösen könnten, wurde das Ter3-

Transgen in einen rekombinations-defizienten Mausstamm gekreuzt, der durch die

homozygote Deletion des Rag2-Lokus’ keine endogenen µH-Ketten umlagern und

exprimieren kann. In diesen Rag2-defizienten Ter3-transgenen Mäusen wurden

keine Zellen mit intrazellulären µH-Ketten nachgewiesen (Abb. 25A). Das Transgen

wurde zusätzlich in einen ebenfalls rekombinations-defizienten Mausstamm mit einer

Deletion des JH-Lokus’ gekreuzt. Da die B-Zellentwicklung in beiden rekombinations-

defizienten Hintergründen auf dem c-kit-positiven Pro-B-Zellstadium arretiert war

(Abb. 25B, C), können vom Transgen ausgehende Differenzierungssignale

ausgeschlossen werden. Interessanterweise ist jedoch in beiden Hintergründen die

Pro-B-Zellpopulation in Anwesenheit des Transgens vergrößert (Abb. 25B-D).

56

5. Ergebnisse

D

B

C

FI (CD19)

JH-/- JH-/-, 7307Ter3

FI (c

-kit) 11.1 17.8

Rag2-/- Rag2-/-, 7307Ter3/Ter3

FI (c

-kit)

FI (CD19)

8.9 13.1

Abb. 25. Durchflusszytometrische Analyse rekombinations-defizienter Pro-B-Zellen in der Ter3-transgenen Linie 7307. (A, B, D) Knochenmarkszellen aus Rag2-/-- und JH-/--Mäusen wurden mit den angegebenen Antikörpern gefärbt und die Fluoreszenzintensität (FI) der in den Lymphozyten-Bereich fallenden Zellen per FACS bestimmt. Die Zahlen rechts neben den Diagrammen zeigen den Anteil der Zellen in den markierten Bereichen in Prozent. (C) Die Ergebnisse der Würfe aus (A) und (B) wurden als Grafik dargestellt. Die Mittelwerte sind als Striche dargestellt und über den Spalten angegeben.

A

RAG2-/- RAG2-/-

7307Ter3/Ter3JH-/- JH-/-

7307Ter3

02468

1012141618

C-k

it+-P

opul

atio

nal

s %

der

Lym

phoz

yten

8.4 12.5 11.9 16.6

Rag2-/-, 7307Ter3 Rag2-/-WildtypS

SC

FSC

FI (I

ntra

zell.

IgM

)

SSC

0.00.537.9

FI (CD19)

FI (c

-kit) 3.3 20.3 11.7

46.8 3.3 6.2

57

5. Ergebnisse

5.2.7 Expression der endogenen IgH-Keimbahn-Transkripte

Falls die transgenen Ter3-µ-Transkripte die VDJ-Rekombination durch einen

Mechanismus reduzieren, bei dem die Zugänglichkeit der endogenen IgH-Allele

verringert wird, dann sollte auch die Transkription der IgH-Lozi reduziert sein. Um

dies zu untersuchen, wurden die Expressionsniveaus des sterilen Keimbahn-µ°-

Transkripts gemessen, das während der VDJ-Rekombination in Pro-B-Zellen von

einem Promotor vor dem DQ52-Segment exprimiert und ausschließlich vom

Keimbahn-IgH-Lokus kodiert wird (Abb. 26A,a). Hierzu wurde RNA aus FACS-

sortierten CD19-positiven Zellen aus rekombinations-defizienten Rag2–/–-Mäusen mit

und ohne Ter3-Transgen isoliert und in cDNA umgeschrieben. In semiquantiativen

RT-PCRs mit in 1:3-Schritten verdünnten cDNA-Mengen wurden dann die

Expressionsniveaus der µ°-Keimbahntranskripte abgeschätzt (Abb. 26B).

Interessanterweise ist das µ°-Expressionsniveau in transgenen Tieren leicht

reduziert, was auf eine geringere Zugänglichkeit des IgH-Lokus’ in Ter3-Pro-B-Zellen

hinweist.

Die in den transgenen Tieren exprimierte Ter3-µ-mRNA besteht hauptsächlich aus

der Sequenz der Cµ-Region. Doch auch in unrearrangierten Pro-B-Zellen werden

bereits Cµ-haltige Transkripte exprimiert, nämlich das µ°-Transkript und das Iµ-

Transkript, das am intronischen µ-Enhancer (iEµ) initiiert (Abb. 26A). Beide

Transkripte enthalten die Cµ-Region und unterscheiden sich nur in ihren 5’-

Bereichen von der Ter3-µ-mRNA. Falls die Ter3-µ-mRNA ihren Effekt durch die Cµ-

Sequenz ausübt, müssten sich die Expressionsniveaus der Ter3-µ-mRNA und der

Keimbahntranskripte deutlich unterscheiden. Daher wurde die Gesamtmenge der

Cµ-haltigen Transkripte in Pro-B-Zellen aus Rag-defizienten Mäusen mit und ohne

Ter3-Transgen mit einem Cµ-spezifischen PCR (Primer Cµ1 fwd und Cµ1/2 rev in

Abb. 26A) vergleichen, die in den Rag-2-defizienten Mäusen ohne Ter3-Transgen die

Keimbahntranskripte (Abb. 26A,a) und in den Ter3-transgenen Mäusen zusätzlich

die transgene µ-mRNA amplifiziert (Abb. 26A,b). Überraschenderweise war die

Gesamtmenge Cµ-haltiger Transkripte in transgenen Tieren nur auf das dreifache

erhöht (Abb. 26B).

58

5. Ergebnisse

Abb. 26. Expression Cµ-haltiger Transkripte in Pro-B-Zellen aus Ter3-transgenen und Wildtyp-Mäusen. (A) Konfiguration des (a) Keimbahn-IgH-Lokus mit den exprimierten Keimbahntranskripte µ° und Iµ und (b) des Transgens mit den exprimierten µ-mRNA und Iµ-Transkripten. Die Positionen der für die RT-PCR verwendeten Primerpaare sind gekennzeichnet. (B) RT-PCR-Analyse mit RNA aus sortierten CD19+-Pro-B-Zellen von Rag2-/-- und Rag2-/, 7307Ter3-Mäusen. Die Analyse wurde mit cDNA in 1:3-Verdünnungsschritten (angedeutet durch graue Dreiecke) durchgeführt. Die µ°-und Iµ-Primer amplifizieren nur die jeweiligen Keimbahntranskripte. Die Cµ-Primer hingegen amplifizieren bei Wildtyp-Mäusen beide Keimbahntranskripte und bei transgenen Tieren zusätzlich die µ-mRNA. RT-PCR mit HPRT-spezifischen Primern kontrolliert die Integrität und Menge der für die Analyse verwendete cDNA.

B

Cµ

Iµ

HPRT

A

µ°

#1 #2 #1 #2

Rag2-/-, 7307Ter3Rag2-/-

1 1:3 1:9 1:27

H2O

1:81 1 1:3 1:9 1:27 1:81 1 1:3 1:9 1:27 1:81 1 1:3 1:9 1:27 1:81Verdünnung:

a b

µ°

Iµ

Keimbahn-IgH-Lokus

JH1-4DQ52 iEµ I Cµ1 Cµ2

Cµ1/2 revCµ1 fwd

Cµ1/2 revCµ1 fwdIµ fwd

µ° fwd

µ-mRNA

Ter3-Transgen

VDJH4L iEµ I Cµ1 Cµ2

Cµ1/2 revCµ1 fwd

Cµ1/2 revCµ1 fwdIµ fwdIµ

59

5. Ergebnisse

Sterile Transkripte vom Igκ-Lokus (κ°), die ein Hinweis für das Öffnen des IgL-Lokus

sind und vor der VJ-Rekombination in Prä-B-Zellen initiiert werden, waren in Zellen

aus beiden Genotypen nicht messbar (Daten nicht gezeigt).

5.2.8 VH-Replacement in Gegenwart der Ter3-µ-mRNA

Falls Ter3-µ-Transkripte die V-nach-DJ-Umlagerung am IgH-Lokus hemmen, sollte man erwarten, dass sie auch das VH-Replacement an einem bereits rearrangierten VDJ-Exon beeinträchtigen. Um diese Vorhersage zu überprüfen und so den hemmenden Einfluss des Ter3-Transgens auf das Rearrangement in einer unabhängigen Analyse zu bestätigen, wurde das VH-Replacement in heterozygoten QM-Mäusen (IgHQM/wt) mit und ohne Ter3-Transgen verglichen (Abb. 27). In QM-Mäusen können mittels idio- und allotypischer Marker drei „Arten“ von B-Zellen unterschieden werden (Abb. 27A): (1) Zellen mit einem unveränderten QM-Transgen exprimieren die transgene µH-Kette vom IgMa-Allotyp mit dem VH17.2.25-Idiotyp. (2) Wurde das QM-17.2.25-VDJ mit seiner kryptischen RSS jedoch durch ein VH-Replacement verändert, so exprimieren die Zellen bei einem produktiven Replacement eine µH-Kette vom IgMa-Allotyp ohne VH17.2.25-Idiotyp. (3) Schließlich rearrangieren die Pro-B-Zellen bei einem nicht-produktiven Replacement am QM-Allel das Wildtyp-C57/BL6-Allel und produzieren eine µH-Kette vom IgMb-Allotyp. Anhand der idio- und allotypischen Marker konnte nun in transgenen IgHQM/wt-Mäusen mit und ohne Ter3-Allel der Anteil der B-Zellen mit einen ersetzten QM-Allel durchflusszytometrisch bestimmt werden. Diese Analyse bestätigte unsere Vorhersage, da der Anteil der Zellen mit einem ersetzten VH-Exon (d.h. idiotyp-negativ) in der IgMa-positiven Population im Knochenmark von IgHQM/wt-Mäusen mit Ter3-Transgen im Vergleich zu IgHQM/wt-Mäusen ohne Ter3-Allel auf die Hälfte reduziert war (Abb. 27Ba, Ca). Das gleiche Bild ergabt sich in QM-Mäusen für den Anteil der Zellen in der Gesamt-IgM-positiven B-Zellpopulation, die das endogene Wildtyp-Allel vom IgMb-Allotyp rearrangiert haben (Abb. 27Bb, Cb). Auch hier war die IgMb-positive Population in Anwesenheit des Ter3-Allels auf die Hälfte reduziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass in Anwesenheit von Ter3-Transkripten nicht nur die klassische VDJ-Rekombination an den endogenen Wildtyp-IgH-Lozi sondern auch das nicht-klassische VH-Replacement behindert ist.

60

5. Ergebnisse

B C

Abb. 27. Durchflusszytometrische Analyse des VH-Replacements in QM-Mäusen mit und ohne Ter3-Transgen. (A) Durch VH-Replacement des 17.2.25-VDJ-Exons (QM-Transgen) und Rearrangement des Wildtyp-IgH-Allel können sich in IgHQM/wt-Mäusen B-Zellen entwickeln die (a)eine QM-µH-Kette mit dem 17.2.25-Idiotyp und dem IgMa-Allotyp, (b) eine produktiv VH-ersetzte µH-Kette mit dem IgMa-Allotyp oder (c) eine µH-Kette vom Wildtyp-Allel mit dem IgMb-Allotypexprimieren. (B) Durchflusszytometrische Analyse. Um die Anteile der drei B-Zell-Typen zu bestimmen wurden Knochenmarkszellen mit einem Idiotyp-spezifischen Antikörper gegen die 17.2.25-µH-Kette und Allotyp-spezifischen Antikörpern gegen IgMa und IgMb gefärbt. Dargestellt sind Zellen, in den Lymphozyten-Bereich fallen und entweder für (a) für CD19 und IgMa oder (b) für CD19 positiv sind. Die Zahlen rechts neben den Diagrammen zeigen den Anteil der Zellen in den markierten Bereichen in Prozent. (C) Die Ergebnisse des gesamten Wurfs wurden jeweils als Grafik dargestellt und sind für sechs Experimente mit unabhängigen Würfen repräsentativ. Die Mittelwerte sind als Striche dargestellt und über den Spalten angegeben.

a

b

a b

FI (I

gMb )

(µH

-Ket

ten

vom

Wild

typ-

Alle

l)

FI (IgMa)(Unveränderte und ersetzte µH-Ketten vom QM-Allel)


27.2

15.1

30.4

9.2

0

5

10

15

20

25

30

35

FI (1

7.2.

25-Id

ioty

p)(U

nver

ände

rte µ

H-K

ette

n vo

m Q

M-A

llel)

FI (IgMa)(Unveränderte und ersetzte µH-Ketten vom QM-Allel)

12.4

87.1

25.8

73.5


A

V D 17.2.25VDJ Cµa

V D J Cµb

V D 17.2.25VDJ Cµa

V D J Cµb

Cµa

V D J Cµb

VDJ-

V D 17.2.25VDJ Cµa

V D J Cµb

17.2.25+, IgMa+

VDJ+ Cµa

V D J Cµb

IgMa+

VDJ- Cµa

VDJ+ Cµb

IgMb+

Unverän

dert

Produk

tives

Replac

emen

t

Rearra

ngem

ent

des W

t-Alle

ls

VH-ReplacementNicht-produktives

Replacement

a b c

Hämatopoetische Stammzelle

Ant

eil d

er Ig

Mb+

-an

alle

n Ig

M+ -

Zelle

nin

%

0

5

10

15

20

25

30

35

IgH

QM

/wt

IgH

QM

/wt ,

7307

Ter3

34.5 21.1

P = <0.0001 ***An

teil

der 1

7.2.

25-Id

- -an

den

IgM

a+-Z

elle

nin

%

IgH

QM

/wt

IgH

QM

/wt ,

7307

Ter3

25.0 13.7

P = <0.0013 **

61

5. Ergebnisse

Homozygot #1

Homozygot #2

Wildtyp #1

Homozygot #1

Homozygot #2

Wildtyp #1

Wildtyp #2

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

2.6

2.8

7204

7307

Abstand zwischen dem verwendeten VH- und dem DFL16.1 D-Segment in Mb

DFL

16.1

VH-Segmente D-Seg. JH-Seg. Cµ

Abb. 28. Chromosomale Position der verwendeten VH-Gensegmente in produktiven VDJ-Sequenzen aus homozygoten Ter3-transgenen Tieren. RNA aus IgM+-Milzzellen von 7204Ter3/Ter3- und 7307Ter3/Ter3-Mäusen, sowie den jeweiligen Wildtyp-Geschwistern, wurde revers transkribiert, und produktive µH-Sequenzen mit einem degenerierten VH- und einem das Ter3-Transgen nicht erkennenden JH3-Primer amplifiziert, kloniert und sequenziert. Für jede produktive VDJ-Sequenz wurde der Abstand zwischen dem verwendeten VH-Segment und dem ersten D-Segment (DFL16.1) bestimmt und als Punkt aufgetragen. Der Mittelwert ist für jede Gruppe als Linie eingezeichnet

IgH-Lokus

5.2.9 VH-Repertoire in Ter3-transgenen Tieren

Um die Auswirkungen der Ter3-µ-Transkripte auf die Öffnung und Zugänglichkeit der

VH-Lozi und deren Verwendung bei der VDJ-Rekombination zu untersuchen, wurden

produktive VDJ-Rearrangements auf den endogenen Wildtyp-Allelen in homozygoten

7204- und 7307-Ter3-Mäusen analysiert. Dazu wurde RNA aus Milz-B-Zellen isoliert,

revers transkribiert und VDJ-Sequenzen mit einem universellen VH-Primer und einem

JH3-Primer, der nicht an Transgensequenzen bindet, amplifiziert, kloniert und

sequenziert. Die chromosomale Position der VH-Gensegmente wurde mit Mouse-

BLAT-Search bestimmt, und der Abstand in Mb zum ersten D-Segment (DFL16.1) in

Abb. 28 dargestellt. Die Verteilung der benutzen VH-Segmente zeigt keinen

Unterschied zwischen homozygoten Ter3- und nicht-transgenen Wildtyp-Mäusen.

Die Beobachtung, dass auch in transgenen Tieren distale VH-Segmente benutzt

62

5. Ergebnisse

werden, die bis zu 2.7Mb stromaufwärts vom DFL16.1-Segment liegen, legt den

Abb. 29. Einzelzell-PCR zur Bestimmung der Konfiguration der IgH-Lozi.(A) Konfiguration des Maus-IgH-Lokus'. Die Positionen der PCR-Primer zum Nachweis einer Sequenz 5' vom ersten D-Gensegment (DFL16.1) sind eingezeichnet. Diese Sequenz ist nur in der Keimbahnkonfiguration und in DJ-rearrangierten Allelen vorhanden. (B) Ergebnis einer repräsentative Einzelzell-PCR-Analyse. Einzelne B-Zellen wurden in eine Mikrotiterplatte sortiert und die PCR wie in den Methoden beschrieben durchgeführt. Ausgewertet wurden die Sequenzen von je vier IgM-positiven Milz-B-Zellen aus je zwei homozygoten 7307-transgenen und zwei Wildtyp-Tieren. Wasserkontrollen sind in den beiden letzten Spuren mitgeführt. (C) Tabellarische Auswertung von Sequenzen aus je acht einzelnen B-Zellen.

Konfiguration der IgH-LoziZellenTierKonfiguration der IgH-LoziZellenTier

VDJ+/VDJ-3VDJ+/VDJ-4

VDJ+/VDJ-

VDJ+/DJ

VDJ+/DJ

VDJ+/VDJ-

VDJ+/DJ

VDJ+/DJ

53

3#65#2

5#54#1

7307Ter3/Ter3-ZellenWildtyp-Zellen

A

C

Nachweis eines nicht V-DJ rearrangierten Allels

BWt 7307Ter3/Ter3 H2OWt

#1 #2 #5 #6 #1 #2 #5 #67307Ter3/Ter3

Tier

VH D JH Cµ

5’ of DFL16.1-PCR

DFL

16.1

Schluss nahe, dass die Zugänglichkeit der VH-Gensegmente durch die Ter3-µ-mRNA

entweder gar nicht kontrolliert wird, oder sich die Reduktion gleichmäßig auf alle VH-

Gensegmente auswirkt.

5.2.10 Anteil der B-Zellen mit VDJ+/VDJ–-Konfiguration

Da Pro-B-Zellen nur eine begrenzte Zeit zur Verfügung steht, um die Induktion der

Apoptose durch ein produktives VDJ-Rearrangement und die Expression eines Prä-

BZR-Rezeptors zu verhindern, könnte die reduzierte Rekombinationsfrequenz am

IgH-Lokus in Ter3-transgenen Tieren dazu führen, dass ein Großteil der Ter3-

transgenen Zellen nur ein V-nach-DJ-Rearrangement durchführen kann. Zellen mit

einem nicht-produktiven VDJ-Rearrangement (VDJ–) auf dem ersten Lokus könnten

so die Rekombination nur noch bedingt auf dem zweiten Allel fortsetzen, was zu

63

5. Ergebnisse

einer erhöhten Frequenz von Zellen in der Peripherie führen sollte, die ein

produktives VDJ+-Allel und ein unvollständig rearrangiertes DJ-Allel tragen. Um diese

Hypothese zu testen wurde die Konfiguration der IgH-Lozi in einzelnen IgM+-Milz-B-

Zellen aus homozygoten 7307Ter3/Ter3- und Wildtyp-Mäusen per Einzelzell-PCR

miteinander verglichen (Abb. 29). Hierzu wurde mit Einzelzell-PCR ein DNA-

Fragment amplifiziert, das stromaufwärts vom DFL16.1-Gensegment liegt und bei

jedem V-nach-DJ-Rearrangement entfernt wird (Abb. 29A). IgM-positive Zellen, bei

denen dieses Fragment nicht nachgewiesen werden kann, besitzen also neben

ihrem VDJ+-Allel noch ein nicht-produktives VDJ–-Allel, während in Zellen, in denen

diese Sequenz noch detektierbar ist, am zweite Allel nur ein DJ-Rearrangement

vorliegt. Die Einzelzell-PCR-Analyse ergab, dass acht von 16 IgM-positiven B-Zellen

aus 7307-Ter3-Mäusen und sieben von 16 IgM-positiven Zellen aus Wildtyp-Mäusen

ein nicht-produktiv rearrangiertes IgH-Allel besaßen (Abb. 29C). Die resultierenden

Verhältnisse von Zellen mit VDJ+/DJ-Konfiguration zu Zellen mit VDJ+/VDJ–-

Konfiguration von 50-zu-50 für transgene beziehungsweise 56-zu-44 für Wildtyp-

Tiere entsprechen dem in der Literatur dokumentiertem Wert von ungefähr 60-zu-40

(Alt et al. 1984). Dies zeigt, dass die transgenen Pro-B-Zellen nach einem nicht-

produktiven Rearrangement die Rekombination auf dem zweiten Allel fortsetzen

können.

64

6. Diskussion

6 Diskussion

6.1 VH-Replacement in Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiven VDJ-Allelen

Angesichts des fehlerbehafteten VDJ-Rekombinationsmechanismus' könnte das VH-

Replacement ein wichtiger Mechanismus sein, der nicht nur B-Zellen mit einem

autoreaktiven BZR rettet, sondern auch Pro-B-Zellen mit entweder nicht-produktiven

VDJ-Rearrangements oder produktiven Rearrangements, die für Transport-

inkompetente dysfunktionale µH-Ketten kodieren (Zusammengefasst in Zhang et al.

2004). Dieser Mechanismus würde allerdings voraussetzten, dass VH-Replacement

in Pro-B-Zellen in der Abwesenheit von Prä-BZR-Signalen stattfinden kann.

Fortwährendes VH-Replacement wurde in verschiedenen murinen und humanen Pro-

B- und Prä-B-Zelllinien entdeckt (Kleinfield et al. 1986; Reth et al. 1986; Zhang et al.

2003), was bedeutet, dass in transformierten B-Zelllinen VH-Replacement in der

Abwesenheit eines µH-Ketten-Signals stattfinden kann. Weitere Indizien für ein µH-

Ketten unabhängiges VH-Replacement kommen von Mäusen, die transgen für

funktionale µH-Ketten sind. In diesen Mäusen wurden VH-Replacements per PCR

bereits in großen Pro-B-Zellen (Hardy Fraction C) detektiert, die normalerweise keine

µH-Ketten exprimieren (Taki et al. 1995). Außerdem enthalten VH-Replacements oft

N-Nukleotide, die von der nur in Pro-B-Zellen exprimierten Terminalen

Deoxynucleotidyltransferase (TdT) eingefügt werden. Allerdings beginnen Vorläufer-

B-Zellen in diesen transgenen Mauslinien bereits mit einem produktiv rearrangierten

VDJ-Exon, so dass die Expression der transgenen µH-Kette früher beginnen könnte

als die Expression normaler µH-Ketten und sich mit der Expression von Pro-B-

Zellmarkern überschneiden könnte.

Um eindeutig zu untersuchen, ob VH-Replacements von nicht-produktiven VDJ–-

Exons in der Abwesenheit von µH-Ketten-Signalen stattfinden, wurde eine Knock-In-

Maus etabliert, bei der die JH-Gensegmente durch ein nicht-produktives VDJ-Exon

ersetzt wurden. Diese Maus gleicht der Quasi-Monoklonalen (QM-) Maus (Cascalho

et al. 1996), in der VH-Replacement ausgiebig untersucht worden ist (Cascalho et al.

65

6. Diskussion

1996; Cascalho et al. 1997; Bertrand et al. 1998; Cascalho et al. 1999; Madan et al.

2000; Golub et al. 2001), allerdings mit dem Unterschied, dass das VDJ-Exon ein

Translations-Stopkodon (Nonsense-Kodon) im Leseraster der µH-Kette an Position

+3 enthält. Die Analyse homozygoter IgHVDJ–/VDJ–-Mäuse zeigte eindeutig, dass Pro-

B-Zellen mit zwei nicht-produktiven VDJ–-Allelen in vivo VH-Replacement benutzen

können, um produktive VDJ-Exons zu erstellen und so in reife IgM-positiven B-Zellen

zu differenzieren. Zusätzlich konnten VH-Replacements nur in RAG-exprimierenden

homozygoten IgHVDJ–/VDJ–-Mäusen detektiert werden, was sich mit früheren Daten

deckt (Cascalho et al. 1999) und die Notwendigkeit von RAG beim VH-Replacement

unterstreicht. Andere DNA-Rekombinationsmechanismen, wie die durch die

Activation-induced-Cytidine-Deaminase (AID) vermittelte Genkonversion von Ig-

Exons in einigen Vögeln und Säugern (Knight and Barrington 1998; Arakawa et al.

2002), können daher für murine Pro-B-Zellen ausgeschlossen werden.

Die Sequenzanalyse von 114 produktiven VDJ-Exons zeigte, dass alle VH-

Replacements die kryptische RSS im VH-Segment des VDJ–-Exons benutzt hatten.

Ähnlich zu den VH-Replacements in anderen transgenen Mauslinien (Chen et al.

1995; Taki et al. 1995; Cascalho et al. 1996) konnten die VH-Replacements in zwei

Gruppen unterteilt werden. In sechs Sequenzen wurde die VH-Region im transgenen

VDJ-Exon durch ein stromaufwärts gelegenes VH-Gensegment ersetzt, ein Vorgang,

der prototypisch für ein VH-Replacement in Wildtyp-Mäusen ist. In den restlichen 108

Sequenzen wurden jedoch durch das VH-Replacement sowohl ein VH- als auch ein

D-Gensegment eingefügt. Dies ist möglich, da in IgHVDJ–/VDJ-Knock-in-Mäusen die D-

Gensegmente noch stromaufwärts vom transgenen VDJ–-Exon liegen. Ein Grund für

die bevorzugte Rekombination der kryptischen RSS mit stromaufwärts positionierten

D-Gensegmenten, die in Wildtyp-Mäusen bei der primären VDJ-Rekombination

entfernt werden, könnten der Unterschied in den Abständen (Spacer) zwischen dem

Nonamer und dem Heptamer in den 3’-RSS der D- und der VH-Segmente sein, die

12bp beziehungsweise 23bp lang sind. Generell findet VDJ-Rekombination

bevorzugt zwischen einer RSS mit einem 12bp- und einer RSS mit einem 23bp-

Spacer statt (Tonegawa 1983). Allerdings ist bei der kryptischen RSS im V-

Gensegment des transgenen VDJ-Exon unklar, ob das Heptamer mit einem

Nonamer assoziiert ist. Chen et al. (Chen et al. 1995) haben ein potentielles

66

6. Diskussion

Nonamer-Motiv 12bp stromaufwärts des Heptamers beschrieben. Aber in diesem

Falle würde die 12/23-Regel eine bessere Kompatibilität des putativen 12bp-Spacers

mit dem 23bp-Spacers der VH-RSS als mit dem 12bp-Spacer des bevorzugt

benutzten D-RSS vorhersagen. Daher ist es wahrscheinlicher, dass VH-

Replacements mit einem zusätzlichen D-Segment hauptsächlich ihre Ursache im

kürzeren Abstand zwischen dem transgenen VDJ-Exon und den D-Gensegmenten

und der geordneten Öffnung des Chromatins am IgH Lokus haben (Alt et al. 1984;

Chowdhury and Sen 2004). Aufgrund von letzterem können die D-Gensegmente

bereits im frühen Pro-B-Zellstadium rekombiniert werden, wo normalerweise die D-

nach-J-Rekombination stattfindet; die VH-Gensegmente werden hingegen erst in dem

darauf folgenden späten Pro-B-Zellstadium zugänglich, in dem die V-nach-DJ-

Rekombination stattfindet. VH-Replacements des bereits rearrangierten transgenen

VDJ–-Exons, die D-Gensegmente benutzen, könnten daher bereits im frühen Prä-B-

Zellstadium erfolgt sein. Jedoch zeigen die analysierten Sequenzen mit direkten V-

nach-VDJ-Replacements in unserer Maus, dass VH-Replacements auch nach

Öffnung des VH-Clusters in der späten Pro-B-Zelle erfolgen, und so möglicherweise

Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiven IgH-Allelen in Wildtyp-Mäusen retten können.

Diese Beobachtung wurde mit einem ähnlichen Knock-In-Mausmodell in einer

kürzlich erschienenen Studie bestätigt (Koralov et al. 2006).

Die Idee, dass VH-Replacement in der B-Zellentwicklung ein häufiger Vorgang sein

könnte, kommt von einer Computeranalyse humaner Ig-Sequenzen. Hierbei wurden

in 5-13% der Sequenzen Hinweise für ein VH-Replacement gefunden, das zu

verschiedenen Zeitpunkten der B-Zellentwicklung stattgefunden haben könnte

(Zhang et al. 2003). Diese Ergebnisse widersprechen jedoch sowohl einer Studie, die

nur eine geringe Rekombinationsfrequenz in Substraten mit kryptischen RSS

gefunden hat (Nadel et al. 1998), als auch der Beobachtung, dass in TdT-defizienten

Mäusen, in denen VH-Replacement eindeutig nachgewiesen werden kann, VH-

Replacements nur selten gefunden wurden (Watson et al. 2006). Daher können der

Umfang des VH-Replacements in Pro-B-Zellen von nicht-transgenen Tieren und sein

quantitativer Beitrag zum Schicksal von Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiven VDJ–

-Exons erst in weiteren Studien geklärt werden.

67

6. Diskussion

6.2 Entwicklung von B-Zellen mit langen CDR3-H-Regionen

Interessanterweise haben µH-Ketten, die in IgHVDJ–/VDJ–-transgenen Tieren durch VH-

Replacement erzeugt werden, im Durchschnitt erheblich längere CDR3-H-Regionen

als µH-Ketten von Wildtyp-B-Zellen. Dies bietet die Möglichkeit, den Einfluss von

langen CDR3-H-Regionen auf die B-Zellentwicklung und die Funktionalität des Prä-

BZRs und BZRs zu untersuchen.

Die CDR3-H-Region ist hauptsächlich für die Antigenspezifität des Antikörpers

verantwortlich, und beinhaltet das D-Segment und die benachbarten Enden des VH-

und des JH-Segments. In Wildtyp-Mäusen erzeugt die VDJ-Rekombination CDR3-H-

Regionen unterschiedlicher Länge, die mit dem Beginn der TdT-Aktivität in adulten

B-Zellen länger werden (Bangs et al. 1991). Trotzdem folgt die Längenverteilung der

CDR3-H-Regionen im peripheren Repertoire einer engen Gaußschen Verteilung

(Zemlin et al. 2003). Diese enge Verteilung mit einem Mittelwert von 11.5

Aminosäuren in Wildtyp-Mäusen (Zemlin et al. 2003) könnte zwei verschiedene

Ursachen haben. Einerseits könnte sie einfach intrinsische Eigenschaften des VDJ-

Rekombinationsmechanismuses in Mäusen reflektieren, wie die Länge der D- und

JH-Segmente oder die TdT-Aktivität. Andererseits könnte sie auch das Ergebnis einer

Selektion für B-lymphoide Zellen mit µH-Ketten mit bevorzugten strukturellen und

funktionalen Eigenschaften sein. Letzteres wird durch das Ansteigen der

durchschnittlichen Länge der CDR3-H während der B-Zellentwicklung in adulten

Wildtyp-Mäusen unterstützt (Ivanov et al. 2005; Schroeder 2006). Frühere Studien

haben gezeigt, dass die Struktur der CDR3-H-Region die Bindung der µH-Kette mit

der surrogaten leichten (SL-) und einer konventionellen leichten Kette, und damit den

Zusammenbau eines signalkompetenten Prä-BZRs und BZRs, beeinflussen kann

(Keyna et al. 1995; Kline et al. 1998; Kawano et al. 2005). Außerdem kann die

Struktur der CDR3-H-Region auch die Menge eines Prä-BZRs und BZRs an der

Zelloberfläche, und damit die Signalstärke, durch ihre Affinität zu dem im

endoplasmatischen Retikulum (ER) vorkommenden Chaperon BiP regulieren

(Herrmann, Vettermann, Jäck, unpubliziert). Schließlich kann die CDR3-H-Region

auch zu autoreaktiven Spezifitäten beitragen.

68

6. Diskussion

In VDJ–-transgenen Tieren enthalten die meisten VH-Replacements auf dem VDJ–-

Allel ein zweites D-Segment und erzeugen VDDJ-Exons mit einer CDR3-H-Länge

von bis zu 22 Aminosäuren. Gleichzeitig entstehen aber auch CDR3-H-Regionen von

Wildtyp-Länge durch direkte V-nach-VDJ-Replacements oder die Entfernung von

Basen stromabwärts der geöffneten kryptischen RSS. Falls die in reifen B-Zellen von

Wildtyp-Mäusen beobachtete Durchschnittslänge für CDR3-H-Regionen von 11.5

Aminosäuren (Zemlin et al. 2003) das Resultat einer Selektion für strukturelle

Eigenschaften der µH-Kette sind, sollte sich die CDR3-H-Längenverteilung in

homozygoten IgHVDJ–/VDJ–-Mäusen während der Entwicklung B-lymphoider Zellen von

frühen zu späten Entwicklungsstadien von längeren zu kürzeren CDR3-H-Regionen

verschieben. Ist die durchschnittliche Länge von CDR3-H-Regionen jedoch durch

den VDJ-Prozess und seine Eigenschaften bestimmt und sind µH-Ketten mit

längeren CDR3-H-Regionen bezüglich ihrer Assoziation mit SL- und IgL-Ketten

genauso funktional wie µH-Ketten mit kürzeren CDR3-H-Regionen, so sollten sich

die CDR3-H-Längenverteilungen in Pro-B- und reifen B-Zellen ähneln.

Um diese Vorhersagen zu überprüfen, wurden VDJ-Exons mit VH7183-

Gensegmenten untersucht, da die Änderungen in der CDR3-H-Länge in dieser VH-

Familie ausgiebig untersucht worden sind (Ivanov et al. 2005). In Wildtyp-Mäusen

liegt die Durchschnittslänge der CDR3-H-Regionen in Pro-B-Zellen bei 11.4

Aminosäuren und in reifen B-Zellen bei 12.5 Aminosäuren (Ivanov et al. 2005), Werte

die auch in dieser Studie für Milzzellen mit Wildtyp-Sequenzen aus heterozygoten

IgHVDJ–/wt-Mäuse bestätigt wurden. Im Gegensatz dazu lag die durchschnittliche

CDR3-H-Länge in homozygoten VDJ–-Tieren bei 17.8 Aminosäuren in unselektierten

Pro-B-Zellen und bei 16.5 Aminosäuren in reifen Milz-B-Zellen. Bezeichnenderweise

lag die durchschnittliche CDR3-H-Länge von VH-ersetzten VDJ–-Exons in Milz-B-

Zellen, die sich in heterozygoten (also in Konkurrenz von B-Zellen mit kürzeren

CDR3-H-Regionen) VDJ–-Mäusen entwickelten, ebenfalls bei etwa 17 Aminosäuren,

was darauf hinweist, dass B-Zellen mit längeren CDR3-H-Sequenzen keinen

Wachstumsnachteil gegenüber B-Zellen mit kürzeren CDR3H-Regionen haben.

Gleichzeitig sank in heterozygoten Mäusen während des Übergangs vom

Knochenmark in die Milz die Frequenz der B-Zellen mit einem VH-ersetzten BZR nur

um ein Drittel. B-Zellen mit längeren CDR3-H-Regionen waren auch funktional im

69

6. Diskussion

Hinblick auf ihre Möglichkeit, in Antikörper-produzierende Plasmazellen zu

differenzieren, da die IgM-, IgA- und IgG1-Titer im Serum vom IgHVDJ–/VDJ–-Mäusen

sich nicht von denen in Wildtyp-Tieren aus dem gleichen Wurf unterschieden. Auch

die Toleranz wurde nicht beeinflusst, da in sechs Monate alten homozygoten IgHVDJ–

/VDJ–-Weibchen keine Antikörper gegen doppelsträngige DNA im ELISA

nachgewiesen werden konnten (Daten nicht gezeigt), obwohl lange CDR3-H-

Regionen oft mit antinukleären Spezifitäten und Autoreaktivität assoziiert sind (Bangs

et al. 1991; Eilat and Fischel 1991; Klonowski et al. 1999). Diese Ergebnisse zeigen,

dass die in Wildtyp-Mäusen beobachtete geringe Frequenz von B-Zellen, die eine

µH-Kette mit einer CDR3-H-Länge von mehr als 16 Aminosäuren exprimieren, eher

auf den VDJ-Rekombinationsmechanismus zurückzuführen ist, als auf eine starke

Selektion gegen B-Zellen mit längeren CDR3-H-Regionen.

Zusammengefasst konnte in diesem Abschnitt der Promotionsarbeit gezeigt werden,

dass VH-Replacement in Pro-B-Zellen in der Abwesenheit eines Ig-Rezeptor-Signals

stattfinden kann. Dies deutet stark darauf hin, dass VH-Replacement ein potentieller

Rettungsmechanismus sein könnte, um Pro-B-Zellen mit zwei nicht-produktiv

rearrangierten Allelen durch Editieren eines der nicht-funktionellen VDJ-Exons vor

Apoptose zu retten. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die enge CDR-3-H-

Längenverteilung in Wildtyp-Mäusen nicht ausschließlich das Ergebnis negativer

Selektion gegen längere CDR3-H-Regionen ist, sondern eher auf mechanistische

Eigenschaften der VDJ-Rekombination zurückzuführen ist.

6.3 Hemmung der VDJ-Rekombination am IgH-Lokus durch µH-Ketten-Transkripte

In späten Pro-B-Zellen können auf beiden IgH-Lozi V-nach-DJ-Rekombinationen

stattfinden. Um jedoch die Expression zweier IgH-Ketten in einer Zelle zu vermeiden,

muss nach einer produktiven VDJ-Rekombination auf dem ersten Allel die V-nach-

DJ-Rekombination des zweiten Allels verhindert werden. In dieser Arbeit wurde

untersucht, ob bereits die Expression eines produktiven µH-Ketten-Transkriptes (µ-

Transkriptes) vor der Initiierung eines Prä-BZR-Signals von der Oberfläche einen

70

6. Diskussion

dämpfenden Einfluss auf die V-nach-DJ-Rekombination am zweiten Allel haben

kann.

6.3.1 Effekte von Ter3-µ-Transkripten auf die B-Zellentwicklung und VDJ-Rekombination

Normalerweise korreliert die Stabilität einer µ-mRNA direkt mit ihrer Produktivität, da

nicht-produktive Nonsense-mRNAs schnell durch den Nonsense-Mediated mRNA-

Decay (NMD) abgebaut werden (Jack et al. 1989). Ein produktives und ein nicht-

produktives VDJ-Rearrangement am IgH-Lokus unterscheiden sich daher nicht nur in

der An- oder Abwesenheit eines µH-Ketten-Proteins, sondern auch in der An- oder

der fast kompletten Abwesenheit eines µ-Transkriptes. Um den Effekt einer

produktiven µ-mRNA auf die VDJ-Rekombination in Abwesenheit der kodierten µH-

Kette zu studieren, wurde eine transgene Maus etabliert, die eine Nonsense-µ-

mRNA exprimiert, deren Stabilität der einer Sense-µ-mRNA ähnelt. Während

physiologische Nonsense-µ-mRNAs ein vorzeitiges Stopkodon (Premature

Termination Codon, PTC) in oder nach der CDR3-H-Region haben und durch den

NMD 50-100-fach herunterreguliert werden (Jack et al. 1989; Buhler et al. 2004),

wurde im Ter3-Transgen das Stopkodon an Position +3 im Leader-Peptid platziert.

Dies führte in den Ter3-transgenen Mäusen zu einer Akkumulation der transgenen

Nonsense-Ter3-µ-mRNA, die mit dem Niveau einer produktiven Sense-µ-mRNA

vergleichbar ist.

Die Ter3-transgenen Mäuse zeigten eine gestörte B-Zellentwicklung mit einer

vergrößerten Pro-B-Zellpopulation und einer Minderung der Zellzahlen in den B-

lymphoiden Folgestadien. Diese Störung wurde in drei unabhängigen Linien

beobachtet und war in homozygoten Tieren am stärksten ausgeprägt. Mehrere

Beobachtungen deuten darauf hin, dass dem Phänotyp einen Defekt in der VDJ-

Rekombination am IgH-Lokus zugrunde liegt. So war im Vergleich zu Wildtyp-

Mäusen in den transgenen Tieren hauptsächlich die intrazellulär µH-Ketten-negative

Fraktion der Pro-B-Zellpopulation erhöht, in der die VDJ-Rekombination stattfindet.

Auch konnte die gestörte B-Zellentwicklung in Ter3-transgenen Mäusen durch das

produktiv rearrangierte µH-Gen der QM-Maus komplementiert werden, was andere,

71

6. Diskussion

rekombinations-unabhängige Effekte der Ter3-µ-Transkripte ausschließt. Der

stärkste Hinweis auf eine gestörte VDJ-Rekombination ist jedoch die reduzierte Rate

des VH-Replacements des QM-Transgens in Ter3-transgenen Tieren.

Übereinstimmend mit einer spezifischen Reduktion der Rekombination am IgH-Lokus

ist auch die Beobachtung, dass die V-nach-J-Rekombination der Leichtketten-Lozi im

Prä-B-Zellstadium nicht beeinträchtigt ist. Dies wird in IgHQM/wt-Mäusen deutlich, die

wegen der Anwesenheit des transgenen, produktiven QM-VDJ-Exons zwar kein IgH-

Kettengen im Pro-B-, aber ein IgL-Kettengen im Prä-B-Zellstadium rearrangieren

müssen. Trotzdem ist der Anteil der CD25-positiven Prä-B- und unreifen B-Zellen

und der Ausstoß an IgM-positiven B-Zellen in An- und Abwesenheit des Ter3-

Transgens unverändert.

6.3.2 RNA-vermittelte Mechanismen

Der molekulare Mechanismus, mit dem die transgenen Ter3-µ-Transkripte in Pro-B-

Zellen die VDJ-Rekombination am IgH-Lokus reduzieren, ist allerdings noch unklar.

Mehrere Möglichkeiten sind denkbar. So könnten die µ-Transkripte die VDJ-

Rekombination entweder durch eine Repression der an der VDJ-Rekombination

beteiligten Enzyme oder durch Chromatinmodifikationen an den IgH-Lozi reduzieren.

Im Folgenden werden mögliche Mechanismen diskutiert, wie die Akkumulierung von

µ-Transkripten ohne Ig-Rezeptorsignale die VDJ-Rekombination am IgH-Lokus

reduzieren könnten.

Die erste Möglichkeit ist ein posttranskriptionelles Gene-Silencing (PTGS), bei dem

die Rekombinations-Enzyme durch den Abbau oder die translationelle Inhibition ihrer

mRNA in ihrem Expressionsniveaus beeinflusst werden. Dieser Mechanismus wird

von microRNAs (miRNAs) benutzt, um Gene in ihrer Expression zu regulieren, und

basiert auf kurzen, polyadenylierten pri-miRNAs mit einem 5'-Cap, die sekundäre

Haarnadel-Strukturen ausbilden (Ambros et al. 2003). Die Haarnadel-Motive werden

im Kern von der RNase III Drosha abgeschnitten und als pre-miRNAs von 60-70

Nukleotiden ins Zytoplasma exportiert. Dort wird die Haarnadel-Schlaufe von der

RNase III Dicer entfernt, so dass 21-23 Nukleotid lange Duplexe entstehen.

Anschließend werden die beiden Stränge getrennt und die reife miRNA in den

72

6. Diskussion

miRNA-haltigen Ribonukleoprotein (miRNP) Komplex geladen, der an die Ziel-

mRNAs entweder ohne Basen-Fehlpaarungen bindet und sie schneidet, oder mit

Basen-Fehlpaarungen bindet und ihre Translation hemmt. Falls nun das stabile µ-

Transkript pri-miRNA-ähnliche sekundäre Haarnadel-Strukturen ausbilden würde, so

könnte es neben seiner Funktion als mRNA ebenfalls von der miRNA-Maschinerie

prozessiert werden. Dies könnte zur Bildung kurzer µ-miRNAs führen, die dann z.B.

Rekombinations-Enzyme posttranskriptionell unterdrücken könnten. Dieser

Mechanismus hat jedoch zwei gravierende Nachteile. Einerseits ist die Stadien-

Spezifität nicht gewährleistet, da die gleiche µ-mRNA auch bei der Rekombination

der Leichtketten-Lozi vorliegt, und zweitens wird die mRNA hierbei verbraucht und

kann nicht zur Proteinbiosynthese verwendet werden.

Eine Lokus-, Differenzierungs- und Linien-spezifische Regulation der VDJ-

Rekombination könnte durch die Bildung doppelsträngiger RNAs (dsRNA) erreicht

werden, bei der stabile µ-Transkripte mit Antisense-Transkripten von VH-

Gensegmenten hybridisieren. Diese Möglichkeit ist besonders attraktiv, da die

Expression der Antisense-Transkripte die VH-Exons und intergenische Bereiche des

VH-Clusters abdeckt und zeitlich genau auf die V-nach-DJ-Rekombination beschränkt

ist. Die aus µ-mRNA und VH-Antisense-Transkripten gebildeten dsRNAs könnten von

der RNA-Interferenz-(RNAi)-Maschinerie erkannt und in siRNA-ähnliche Strukturen

verarbeitet werden (Hamilton and Baulcombe 1999; Tuschl et al. 1999; Hammond et

al. 2000; Zamore et al. 2000). Hierbei schneidet Dicer die dsRNA im Zytosol in

Duplexe von small-interfering RNAs (siRNAs) mit ungefähr 21 Nukleotiden, die dann

in den RNA-induced Silencing-complex (RISC) geladen werden und den Abbau von

mRNAs mit homologen Sequenzen einleiten (Bernstein et al. 2001; Hammond 2005).

Zusätzlich zu diesem posttranskriptionellen Gene-Silencing können siRNAs aber

auch direkte Chromatinmodifikationen am Lokus bewirken, die zu

Heterochromatinbildung und transkriptionellem Gene-Silencing (TGS) führen

(zusammengefasst in Bernstein and Allis 2005). So können siRNAs in Säugerzellen

an Promotoren binden und durch Rekrutierung von entsprechenden Enzymen durch

DNA-Methylierung und H3K9-Methylierung von Histonen den Lokus deaktivieren

(Kawasaki and Taira 2004; Weinberg et al. 2006). In der Spalthefe

(Schizosaccharomyces pombe) sind siRNAs Teil des RNA-induced inititation of

73

6. Diskussion

Transcriprional Gene Silencing (RITS)-Komplexes, der zur Heterochromatin-Bildung

notwendig ist (Verdel and Moazed 2005) und vermutlich Histon-Methyltransferasen

enthält. Die siRNAs übernehmen hierbei die Rekrutierung von Chromatin-

modifizierenden Enzymen an das betreffende Zielgen. Da die VH-Antisense-

Transkription wahrscheinlich von schwächeren Promotoren getrieben wird als die

Transkription der rearrangierten µ-mRNA, könnte die µ-mRNA im Überschuss

vorliegen, so dass nicht alle Sense-Transkripte mit Antisense-Transkripten

hybridisieren. Die µ-mRNA könnte dann in zwei Formen unterschiedliche Funktionen

erfüllen. Die hybridisierten µ-mRNAs könnten als dsRNAs regulative Aufgaben in der

Modifikation des nicht komplett rearrangierten IgH-Allels übernehmen, während die

freien µ-mRNAs zur Proteinsynthese herangezogen würden. Da Dicer jedoch nur im

Zytosol vorliegt, in das die nicht-polyadenylierten sterilen VH-Transkripte alleine nicht

exportiert werden, müssten sich die dsRNAs bereits im Kern bilden und gemeinsam

exportiert werden.

µ-Transkripte könnten aber auch ohne Prozessierung als lange einzel- oder, in

Verbindung mit Antisense-Transkripten, doppelsträngige RNAs den IgH-Lokus

modifizieren. Ein Beispiel hierfür ist die Inaktivierung des zweiten X-Chromosoms in

weiblichen Säugern-Zellen durch lange, nichtkodierende Sense-Xist- und Antisense-

Tsix-RNAs, die zu kovalenten Histonmodifikationen führen (Avner and Heard 2001).

Ein vierter Mechanismus, bei dem µ-Transkripte abhängig von ihrer Menge die VDJ-

Rekombination beeinflussen könnten, beruht auf den potentiellen RNA-

Bindungsdomänen des RAG1-Enzyms (Spanopoulou et al. 1995). Dadurch könnten

RAG1 mit einem µ-mRNA/Antisense-VH-RNA-Hybrid interagieren und so in seiner

Aktivität reduziert werden. Auch hierbei würde die Stadien-Spezifität durch die auf

das Pro-B-Zellstadium beschränkte Expression der VH-Antisense-RNA erreicht

werden und so das IgL-Rearrangement trotz der Anwesenheit großer Mengen an µ-

mRNA nicht beeinflussen. Als mögliches Bindemotiv auf der RNA könnten die

kryptischen RSS dienen, die in fast allen VH-Gensegmenten vorkommen.

Bei allen oben diskutierten Mechanismen zum transkriptionellen und post-

transkriptionellen Gene-Silencing stellt sich allerdings die Frage nach den

74

6. Diskussion

Zielsequenzen auf dem IgH-Lokus beziehungsweise in den mRNAs, die für Faktoren

der Rekombinations-Maschinerie kodieren. Die Untersuchung des VH-Repertoires in

Ter3-transgenen Tieren hat keine Unterschiede in der Verwendung von distalen und

proximalen VH-Regionen bei der VDJ-Rekombination gezeigt und damit keinen

Hinweis auf eine reduzierte Zugänglichkeit der distalen Region des IgH-Lokus’

ergeben, wie sie z.B. bei IL-7Rα-defizienten Mäusen auftritt (Corcoran et al. 1998;

Chowdhury and Sen 2003). Daher ist nicht anzunehmen, dass die einzelnen VH-

Gensegmente durch die µ-mRNA modifiziert werden. Allerdings wäre es für einen

regulativen Mechanismus auch effektiver, anstelle des langen VH-Clusters die Region

zwischen den VH- und D-Segmenten zu modifizieren, die kürzer und vor allem nur

auf dem noch nicht vollständig rearrangierten DJ-Allel vorhanden ist, dessen

Rearrangement unterdrückt werden soll. Unsere Daten schließen auch einen

Einfluss der µ-mRNA auf die Lokus-Kontraktion und -Dekontraktion aus, da hierbei in

transgenen Tieren ebenfalls weniger VDJ-Exons mit distalen VH-Regionen erwarten

würden.

Verbunden mit der Frage nach der Zielsequenz ist die Frage nach der Effektor-

Sequenz in den µ-Transkripten. Hierbei muss beachtet werden, dass die

rearrangierten µ-mRNAs nicht die einzigen Sense-Transkripte sind, die während der

V-nach-DJ-Rekombination vom IgH-Lokus exprimiert werden. Zusätzlich zu sterilen,

gespleißten Transkripten der VH-Gensegmenten (Yancopoulos and Alt 1985; Duber

et al. 2003) werden auch vom intronische µ-Enhancer das sterile Iµ und von den

rearrangierten DJ-Segmenten DJCµ-Transkripte erzeugt, die beide gespleißte Cµ-

Regionen enthalten. Von diesen Transkripten unterscheidet sich die rearrangierte µ-

mRNA dadurch, dass sie sowohl eine VH- als auch eine Cµ-Region besitzt. Weitere

Untersuchungen müssen zeigen, ob die rearrangierte µ-mRNA ihren Effekt durch

Sequenzmerkmale ausübt, oder ob dieser einfach durch die höheren

Transkriptmengen ausgelöst wird. Letzteres ist zumindest für die Cµ-Region

unwahrscheinlich, da die semiquantitative PCR gezeigt hat, dass durch die

Expression der µ-mRNA nur eine 3-9fach höhere Mengen an Cµ-haltigen

Transkripten erzeugt wird. Man kann allerdings auch nicht ausschließen, dass die

sterilen Transkripte ähnlich wie unstabile Nonsense-Transkripte in speziellen

75

6. Diskussion

Bereichen in der Zelle, den so genannten P-Bodies, konzentriert sind und so für eine

Regulation des IgH-Lokus' nicht zur Verfügung stehen (Teixeira et al. 2005).

Die grundlegende Frage, ob die µ-mRNA spezifisch die Rekombination am IgH-

Lokus oder unspezifisch die Aktivität der gesamten Rekombinations-Maschinerie

reduziert, wird hoffentlich durch Experimente geklärt, die momentan durchgeführt

werden und bei denen die Rekombinationsaktivität in transgenen Pro-B-Zellen mit

transfizierten extrachromosomalen Substraten gemessen werden soll. Parallel zu

diesem funktionellen Ansatz sollen die Expressionsniveaus der RAG-mRNAs in den

transgenen Pro-B-Zellen mit und ohne Ter3-µ-mRNA gemessen werden, um

mögliche PTGS-Mechanismen zu erkennen. Im Rahmen dieser Studien, die durch

Probleme in der Zucht aufgehalten wurden, sollen außerdem die RNA-Mengen der

Keimbahn-Sense- und der Antisense-Transkripte im VH-Cluster und der Sense-

Transkripte in der Cµ-Region mit quantitativer PCR genauer bestimmt werden. Erste

Ergebnisse zeigen eine leicht reduzierte Expression des µ°-Keimbahntranskripts in

Ter3-transgenen Pro-B-Zellen, was auf eine reduzierte Zugänglichkeit des IgH-

Lokus' hindeuten könnte.

6.3.3 Alternative Mechanismen

Die Ansammlung von Pro-B-Zellen in Ter3-transgenen Tieren ließe sich auch durch

einen durch die Expression des Transgens ausgelösten Mangel an

Transkriptionsfaktoren erklären, der zu einer verringerten Expression der endogenen

µH-Kette und daher zu verringerten Prä-BZR-Rezeptorsignalen führt. Gegen diese

Hypothese spricht jedoch, dass die Expression von endogenen µH-Ketten und von

CD19, das ein Zielgen des die B-Zellentwicklung dominierenden

Transkriptionsfaktors Pax5 ist, in B-Zellen durch die Anwesenheit des Ter3-Transgen

nicht reduziert wird (Daten nicht gezeigt) und Transkriptionsfaktoren normalerweise

im starke Überschuss vorliegen (Mark Schlissel, persönliche Mitteilung). Auch könnte

ein Mangel an Transkriptionsfaktoren nicht durch ein produktives µH-Ketten-

Transgen komplementiert werden und widerspricht der Beobachtung, dass die µ°-

Expression in Ter3-transgenen Pro-B-Zellen nur leicht reduziert ist. Am wichtigsten

76

6. Diskussion

ist jedoch die Beobachtung, dass sich µH-Ketten-negative Pro-B-Zellen ansammeln,

die Störung also vor der Expression der µH-Kette und des Prä-BZRs liegt.

Es lässt sich auch nicht ausschließen, dass der Effekt auf die Differenzierung von

Pro-B-Zellen nicht von der transkribierten Ter3-µ-mRNA, sondern von dem in das

Genom integrierten Transgensequenz ausgelöst wird. Möglich wäre hier, dass durch

die Intergation Gene beeinträchtigt wurden, die für die B-Zellentwicklung notwendig

sind. Dies ist jedoch unwahrscheinlich, da der Phänotyp in drei Ter3-Linien mit

unterschiedlichen Integrationsorten auftrat, und zumindest bei der hauptsächlich

untersuchten 7307-Linie keine Gene in der Nähe des Transgens lagen. Eine weitere

Möglichkeit wäre die Bindung von RAG an die kryptische RSS im Transgen, so dass

weniger freies RAG für die VDJ-Rekombination zur Verfügung steht. In Anbetracht

der Tatsache, dass in C56/BL6 Mäusen pro Allel 110 funktionale VH-Segmente

während des V-nach-DJ-Rearrangements zur Verfügung stehen (Johnston et al.

2006), die je eine Konsensus-RSS und in 95% der Fälle auch eine kryptischen RSS

enthalten (Chen et al. 1995), scheint es unwahrscheinlich, dass die 10 Transgen-

Kopien in heterozygoten, beziehungsweise die 20 Transgen-Kopien in homozygoten

Ter3-Tieren mit je einer kryptischen RSS die verfügbare RAG-Menge in einem

Ausmaß reduzieren, das den Phänotyp erklären würde. Außerdem ist die Bindung

von RAG an kryptische RSS fünfmal weniger effizient als die an konventionelle RSS

(Zhang et al. 2003).

6.3.4 Erweitertes Feedback-Modell zur Allelausschluss am IgH-Lokus

Zusammengenommen lässt sich die Ansammlung µH-Ketten-negativer Pro-B-Zellen

und die reduzierte Rate des VH-Replacement in Ter3-tansgenen Mäusen am besten

durch einen dämpfenden Effekt der Ter3-µ-mRNA auf die VDJ-Rekombination der

endogenen IgH-Allele erklären. Wir schlagen daher für den Allelausschluss am IgH-

Lokus ein erweitertes Feedback-Modell vor (Abb. 30), das im Gegensatz zum

klassischen Feedback-Modell (Alt et al. 1980; Alt et al. 1984, Abb. 4) nicht nur das

µH-Ketten-Protein sondern auch die µ-mRNA berücksichtigt. Dieses Modell

unterscheidet zwischen einer kurzfristigen, unvollständigen Dämpfung der

Rekombination, die direkt nach einem produktiven Rearrangement auftritt und durch

77

6. Diskussion

Stabile mRNA dämpft Rekombination am zweiten Lokus

Oberflächen-µH-Signalbeendet Rekombination am

zweiten Lokus

Nicht-produktive mRNA wirdvom NMD abgebaut

V DJ CµV DJ Cµ

mRNA

VDJ CµV DJ Cµ

mRNA

VDJ CµV DJ Cµ

VDJ CµV DJ Cµ

mRNANMD

Allelausschluss,Differenzierung

Öffnung und Rearrangement deszweiten Allels

Abb. 30. Das erweiterte Feedback-Modell zum Allelausschluss am IgH-Lokus. Im Gegensatz zum klassischen Feedback-Modell (Abb. 4) berücksichtigt das erweiterte Feedback-Modell zum Allelausschluss nicht nur das µH-Ketten-Protein und die von ihm initiierten Prä-BZR-Signale, sondern auch die µ-mRNA und die von ihr ausgehenden Effekte. Direkt nach dem produktiven Rearrangement wird ein stabiles Sense-µ-Transkript synthetisiert, das die Rekombination auf dem zweiten Lokus solange dämpft bis die neu-synthetisierte µH-Ketten mit SL-Kette und Igα/Igβ als Prä-BZR an die Oberfläche gelangt und von dort Signale zur Modifizierung des zweiten IgH-Allels und zur Differenzierung initiiert. Bei einem nicht-produktiven VDJ-Rearrangement hingegen entsteht eine Nonsense-mRNA, die vom Nonsense-Mediated-mRNA-Decay (NMD) abgebaut wird und die Öffnung und das Rearrangement des zweiten Allels nicht unterdrückt.

die Menge an produktiver mRNA kontrolliert wird, und einer langfristigen,

vollständigen Beendigung der Rekombination, die durch Oberflächen-Prä-BZR-

Signale vermittelt wird. Wichtiger Bestandteil des erweiterten Feedback-Modells ist

der Nonsense-mediated mRNA-Decay (NMD), da er zwischen den produktiven

Sense- und den nicht-produktiven Nonsense-µ-mRNAs unterscheiden und durch

raschen Abbau der Nonsense-mRNAs gewährleisten muss, dass sich nur Sense-µ-

mRNAs ansammeln und die Rekombination dämpfen können.

Der große Vorteil des erweiterten Feedback-Modells besteht darin, dass durch die

sofortige Verfügbarkeit der µ-mRNA nach einem produktiven Rearrangement schnell

Signale unabhängig von der Produktion einer IgH-Kette erzeugt werden können, um

die Rekombination am zweiten Lokus solange zu verhindern, bis Prä-BZR-Signale

78

6. Diskussion

initiiert werden können. Dies schließt die Zeitlücke, die zwischen Rearrangement und

Oberflächensignal klafft und in der kein Rearrangement des zweiten Lokus

stattfinden darf. Versuche in Zelllinien haben gezeigt, dass zwischen der VDJ-

Rekombination und der Oberflächenexpression eines BZRs mindestens zwei

Stunden vergehen (Zhang et al. 1998). Im klassischen Feedback-Modell wird

deshalb ein asynchrones Rearrangement der IgH-Lozi postuliert, bei dem zwischen

den Rekombinationen genügend Zeit liegen muss, um ein mögliches Proteinsignal

abzuwarten. Eine Asynchronität der Allele, wie sie beim Igκ-Lokus durch

monoallelische Demethylierung und unterschiedliche nukleäre Positionierung der

Allele erreicht wird (Goldmit et al. 2005), ist im erweiterten Feedback-Modell für den

IgH-Lokus nicht mehr unbedingt notwendig. Das passt zu der Beobachtung, dass im

Gegensatz zu Igκ-Lokus bisher keine klaren Belege für Asynchronität am IgH-Lokus

gefunden wurden (Corcoran 2005).

Die über die µ-RNA-Menge vermittelte Dämpfung der VDJ-Rekombination ist ein

schwacher Effekt, der in unserem Mausmodell zwar zu einer Ansammlung von Pro-

B-Zellen führt, ihre Differenzierung jedoch nicht verhindert. Dies liegt allerdings auch

daran, dass unser Mausmodell nur den ersten Teil des erweiterten Feedback-

Modells abbildet, da die transgene Ter3-mRNA eben nicht für eine µH-Kette kodiert,

die in der Wildtyp-Situation nach der für Synthese und Transport der µH-Kette

benötigten Zeit ein starkes Oberflächensignal gibt. Die endogenen Lozi werden in

Abwesenheit dieses Prä-BZR-Signals nicht vollkommen geschlossen, so dass es

dann doch noch zu einer Rekombination kommt. Dies ist auch der Grund, wieso der

Effekt der µ-mRNA nicht in den Maus-Modellen beobachtet wurde, in denen kein

Prä-BZR-Signal erzeugt (Kitamura and Rajewsky 1992) oder weitergeleitet

(Papavasiliou et al. 1995; Gong and Nussenzweig 1996; Minegishi et al. 1999)

werden kann und die als Belege des klassischen Feedback-Modells gelten. In diesen

Tieren können die Pro-B-Zellen nach einem produktiven Rearrangement nicht

weiterdifferenzieren, sondern bleiben unphysiologisch lange im rekombinations-

aktiven Pro-B-Zellstadium. In dieser Situation kann der temporäre, dämpfende Effekt

der µ-mRNA die Rekombination nicht verhindern, und es kommt zum Bruch des

Allelausschluss'. Das erweiterte Feedback-Modell steht somit im Einklang mit den

bisherigen Beobachtungen.

79

6. Diskussion

Ohne Zweifel sind weitere Versuche sind notwendig, um die mechanistische

Grundlage des beobachteten Effekts zu klären und weitere Belege für das erweiterte

Feedback-Modell zu finden. Es wäre außerdem sehr interessant, die VDJ-

Rekombination in NMD-defizienten Mäusen zu studieren, in denen es nach einem

nicht-produktiven Rearrangement zur Expression stabiler Nonsense-µ-mRNAs

kommen sollte. Als Folge wäre in der Peripherie ein geringerer Anteil an B-Zellen zu

erwarten, die nach einem nicht-produktiven Rearrangement das zweite Allel

rearrangiert haben, da die stabilisierten Nonsense-µ-mRNAs ein Rearrangement am

zweiten Lokus dämpfen sollten. Während dieser Arbeit wurde versucht, hierzu zwei

NMD-defiziente Mausmodelle zu etablieren, bei denen jedoch die Aktivität des NMDs

nicht beeinträchtigt war.

6.3.5 Zusammenfassung

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass bereits eine stabile

µ-mRNA einen dämpfenden Einfluss auf die Pro-B-Zelldifferenzierung und die VDJ-

Rekombination am IgH-Lokus hat und so am Allelausschluss beteiligt sein kann. Wir

schlagen daher für den Allelausschluss am IgH-Lokus ein erweitertes Feedback-

Modell vor (Abb. 30), bei dem die stabile µ-mRNA als primäres Produkt einer

produktiven VDJ-Rekombination durch bisher unbekannte Mechanismen die

Rekombination am zweiten Allel kurzfristig dämpft, bis die Rekombination durch Prä-

BZR-Signale beendet wird.

80

7. Material und Methoden

7 Material und Methoden

7.1 Material

7.1.1 Antikörper

Folgende Antikörper wurden für die FACS-Analyse benutzt:

Spezifität Spezies Bezugsquelle Verdünn.

Maus-CD19-PerCP (1D3) Ratte BD, Heidelberg 1:200

Maus-CD25-PE (PC61) Ratte BD, Heidelberg 1:50

Maus-c-kit-PE (ack45) Ratte BD, Heidelberg 1:50

Maus-IgM (µH)-FITC Ziege BD, Heidelberg 1:200

Maus-IgM (µH) Ziege Southern Biotech., USA 1:200

Maus-IgM (µH)-Cy5 Ziege Southern Biotech., USA 1:200

Maus-Igλ-PE Ziege Southern Biotech., USA 1:200

Maus-Igκ-PE Ziege Southern Biotech., USA 1:200

Maus-IgMa-FITC (DS-1) Maus BD, Heidelberg 1:200

Maus-IgMb-PE (AF6-78) Maus BD, Heidelberg 1:200

7.1.2 Oligonukleotide

Alle Oligonukleotide wurden von Invitrogen synthetisiert und in einer Konzentration

von 100µM in H2O bei -70°C gelagert.

Name ER# Sequenz

IgMTer139 fwd 1650 GCACTGATCAAGGATAATCAAGGGAG

IgMTer113 rev 1649 CTGTCAAAGCTACTTGATGAGGATGC

IgMTer386 fwd 1652 CAGGGTATGGTCCTCATTTACAAAGC

IgMTer344 rev 1651 CACAGAATAAGGTTATTTTATGGTCTCAC

5' of JH1 fwd 997 GAACAGAGGCAGAACAGAGACTGTG

JH2 rev 998 ACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTG

JH-/- Neo fwd 999 CTGAAGAGCTTGGCGGCGAAT

81


JH -/- rev 1000 GACTCCACCAACACCATCACACAGA

5’ of 7204 fwd 1646 CAAGACAACTCTCGACTACATGTGAG

3’ of 7204 rev 1645 CTGTCCTGAAACTCACCTTGTAGACC

5' of Ter7307 fwd2 1359 AACATCAAGTTTCCAAGTAGTGGTGG

3' of Ter7307 rev3 1360 GCTTCTACTAGATTCAGTGTATCTGG

RAG2-for 14892 GACGTTCATACATGCCTTCTACCC

RAG2-rev 14893 TGTCAAATTCATCGTCACCATCAA

Neo-rev 14894 GGCCACACGCGTCACCTTA

QM-VDJ-for 972 TGCTAGATACTATAGGTACCCTTACTATGC

JH4-rev 973 ATCGGATACTGTATAAATGCTGTCAC

Cre fwd 1077 CCTGGAAAAATGCTTCTGTCCG

Cre rev 1078 CAGGGTGGTATAAGCAATCCC

5’UTR of 17.2.25 fwd 1376 CTACAGACACTGAATCTCAAGGTCC

VH7183 fwd 1101 TGCGAGGTCGACCTGGTGGAGTCTGGG

J558 leader1 1012 ATG GGA TGG AGC TGG ATC TT

J558 leader3 1014 ATG GAA TGG AGC TGG GTC TT

mCµ1 rev 1377 GAAGGAAATGGTGCTGGGCAGG

JH4exon rev 1589 ACGGTGACTGAGGTTCCTTGACC

Cµ1 fwd 1633 AGTCAGTCCTTCCCAAATGTCTTCC

Cµ1/2 rev 1634 GGGGTTCATCTCTGCGACAGCTGG

Ter3KI fwd 1st 1325 GCCTGAGCTATGAGGAAGTAGAGAGGC

Ter3KI fwd 2nd 1326 GTGCAGAGAAGAACGAGTTACTGTGG

Ter3KI rev 1st 1327 GACGCTGGGCCCGACGTCGCATGCTCC

Ter3KI rev 2nd 1328 CGTCGCATGCTCCTCTAGACTCGAGG

5’ DFL16.1 fwd 1007 GAGTGCCATCAGACACCACAG

5’ DFL16.1 rev 1008 GTGTGGAAAGCTGTGTATCCCC

DFL16.1 2nd fwd 1643 CAGGAGAGATGAGTGTACCTAGTGC

DFL16.1 2nd rev 1644 GGTAGTGGAGATTCACAGCTTCCC

HPRT-for 415 GCTGGTGAAAAGGACCTC

HPRT-rev 416 CACAGGACTAGAAGACCTGC

82


7.1.3 Mäusestämme

Folgende Mäusestämme wurden in individuell belüfteten Käfigen im Tierstall des

Nikolaus-Fiebiger-Zentrums gemäß der Institutsrichtlinien gehalten:

• Rag2–/– (Shinkai et al. 1992)

• JH–/– (Chen et al. 1993)

• Quasi-monoklonale (QM) (Cascalho et al. 1996)

• EIIa-cre (Lakso et al. 1996)

• C57/BL6 (Charles River)

7.2 Molekularbiologische Methoden

Die meisten molekularbiologischen Methoden wurden gemäß der Protokolle von

Maniatis (Sambrook 1989), beziehungsweise gemäß der Herstellerprotokolle

durchgeführt. Daher erfolgt hier nur ein kurzer Überblick.

7.2.1 Präparation von Plasmid-DNA und Restiktionsverdaus

Plasmid-DNA wurde je nach benötigter Menge mit den Mini-, Midi-, oder Maxi-Kits

der Firma QIAgen (Hilden) aufgereinigt.

Restriktionsverdaus und PCR-Produkte wurden auf 0.8-1.5% Agarosegelen mit TAE

Puffer (50x TAE: 2 M Tris, 50 mM EDTA, 143 ml Eisessig für 2,5 L Puffer, um einen

pH-Wert von ca. 8,5 zu erhalten) aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt, und die

Fragmente mit QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen) bei kleinen Fragmenten oder

QIAexII (Qiagen) bei Fragmenten über 8kb aus dem Gel extrahiert.

7.2.2 Herstellung und Transformation elektrokompetenter Bakterien

Für die Klonierungen wurden GeneHog-Bakterien (Invitrogen) benutzt, die selbst

elektrokompetent gemacht wurden.

Dafür wurde 1l LB-Medium mit 1/100 Volumen einer GeneHog-Übernachtkultur

angeimpft, und die Kultur bis zu einer OD600 von 0.5-0.6 inkubiert. Die Kultur wurde

dann 30min auf Eis gekühlt, die Bakterien 15min bei 3000 Upm auf 4°C in einem

JA14-Rotor abzentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig entfernt, und das Pellet

83


dreimal mit kleiner werdenden Volumina (1l, 500ml, 20ml) eiskalter 10%

Glyzerinlösung gewaschen. Anschließend wurde das Pellet in 2ml eiskalter 10%

Glyzerinlösung aufgenommen und in 50µl-Aliquots bei -70°C eingelagert.

Zur Transformation wurden 50µl kompetente Bakterien mit 1-2µl DNA-Lösung

vermischt und auf Eis in eine Elektroporationsküvette (Spaltbreite 1mm) überführt.

Die Elektroporation wurde in einem GenePulser (BioRad Laboratories, München) mit

den Einstellungen 25µF, 1.66kV und 200Ω durchgeführt. Die Bakterien wurden nach

der Transformation in 1ml reinem LB-Medium aufgenommen und 45min bei 37°C

inkubiert. Anschließend wurde die Kultur auf LB-Agar-Platten mit den

entsprechenden Selektionsmitteln ausplattiert und über Nacht bei 37°C bebrütet.

7.2.3 DNA für Oozyten-Injektion

Der Transgenvektor pµTer3 wurde mit einem QIAgen Maxi-Kit aufgereinigt, mit SalI

und XhoI verdaut und auf einem Agarosegel aufgetrennt. Das 12.3kb SalI-XhoI-

Fragment wurde anschließend mit QiagenExII Glasmilch (Qiagen) extrahiert, über

Schleicher&Schüll EluTips (Whatman, Dassel) aufgereinigt und durch Zugabe von

1/10 Volumen 3 M NaAcetat pH 4.8 und 2.5 Volumenteilen 100% Ethanol gefällt. Der

Ansatz wurde dann 20min bei 4°C und 13000 rpm in einer Heraeus Biofuge Fresco

abzentrifugiert, und die präzipitierte DNA zweimal mit 70% Ethanol gewaschen. Von

der gefällten DNA wurden 2.8µg in der Transgene-Facility der University of Alabama

in Birmingham in den Pronukleus von C57Bl/6 Oozyten injiziert.

7.2.4 DNA für ES-Zell-Transfektion

Der Knock-In-Vektor pBS-DQNTe3 wurde mit dem Qiagen-Maxi-Kit-Endofree

aufgereinigt, mit SacII und SpeI verdaut und auf einem Agarosegel aufgetrennt. Das

7.4kb SacII-SpeI-Fragment, das keine bakteriellen Sequenzen enthielt, wurde

anschließend mit QiagenExII Glasmilch (Qiagen) extrahiert, über Schleicher&Schüll

EluTips aufgereinigt und mit Ethanol gefällt. In TE gelöst wurden 15µg DNA an

Werner Müller (GBF - Gesellschaft für Biotechnologische Forschung / Helmholtz-

Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig) geschickt und dort in die von Ralf

Kühn (GSF - Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, München) aus

84


(C57BL/6J x 129S6/SvEvTac) F1-Mäusen etablierte embryonale Stammzelllinie

IDG3.2 (unpubliziert) transfiziert.

7.2.5 Southern-Blot-Analyse

Für die Southern-Blot-Analyse wurden Schwanz-Biopsien mit 10µl Proteinase K

(20mg/ml, PeqLab, Erlangen) in 500µl Lysepuffer (50mM Tris-HCl pH 8.3, 5mM

EDTA, 100mM NaCl, 0.5% SDS) unter starkem Schütteln bei 56°C über Nacht

verdaut, die DNA mit Phenol/Chloroform extrahiert und in Isopropanol gefällt. Dann

wurden 5µg DNA in einem 30µl Ansatz mit den entsprechenden Restriktionsenzymen

für 3h verdaut und auf einem Agarosegel bei 20V über Nacht aufgetrennt. Das Gel

wurde anschließend beschnitten und 2x 20min in Denaturierungspuffer (0.5M NaOH,

1.5M NaCl) denaturiert.

Die positiv geladene Nylon-Membran (GeneScreenPlus, Perkin Elmer, Rodgau-

Jügesheim) wurde im Denaturierungspuffer getränkt und auf drei Whatman-Papiere

gelegt, die wiederum auf einem Stapel von Papiertüchern lagen. Auf die Membran

wurde dann das Gel gelegt, dessen DNA per Kapillartransfer auf die Membran

übertragen wurde. Nach dem Transfer wurde die Membran kurz in H2O

abgewaschen und in Neutralisierungspuffer (0.5M Tris-HCl, pH 7.2, 1M NaCl)

neutralisiert.

Hybridisierungslösung Formamid 50%(10ml)

SSC 5x (5ml von 20x)

Denhardts 5x (2ml von 50x)

SDS 1.5% (1.5ml von 20%)

Lachssperma-DNA 5min auf 95°C, dann auf Eis;100µl/ml Endkonzentration

H2O ad 20ml

Die Membran wurde bei 42°C in einem rotierenden Ofen mit der

Hybridisierungslösung vorinkubiert. Währenddessen wurden 25ng Sonden-DNA mit

dem RadPrime Labeling Kit (Invitrogen) und 5µl α-32P dCTP [10mCi/ml, Amersham

Bioscience, GE Healthcare Europe, München] radioaktiv markiert. Die Sonde wurde

85


zur Hybridisierungslösung hinzugegeben und für mindestens 16h hybridisiert.

Anschließend wurde die Membran in drei verschiedenen Waschlösungen

gewaschen:

Waschlösung 1: 2x SSC, 0.5% SDS für 5min bei RT

Waschlösung 2: 2x SSC, 0.1% SDS für 15min bei RT

Waschlösung 3: 0.1x SSC, 0.1% SDS für 30min bei 65°C

Die Membran wurde dann in einer Plastiktüte für zwei Tage auf eine

Phosphoimagerplatte gelegt, die Phosphoimagerplatte anschließend eingelesen

(FLA-3000, Fujifilm, Düsseldorf) und das Bild mit BASReader 3.14 Software (Raytest,

Straubenhardt) ausgewertet.

7.2.6 PCR

PCR-Reaktionen wurden auf einer GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer) oder

einer Primus advanced 96 (Peqlab) durchgeführt. Das zur Amplifikation verwendete

Standard-PCR-Protokoll war: 95°C, 3 min; 35 Zyklen (95°C, 30 s / 60°C, 30 s / 72°C,

1 min); 72 °C, 5 min. Die Bindetemperatur und die Elongationszeit wurden je nach

Primer und PCR-Produkt angepasst. Ein PCR-Ansatz enthielt bei 20 µl

Gesamtvolumen je 5 pmol Primer (1 µl der 1:20 Verdünnung einer 100 µM

Stammlösung), 0.25 mM dNTPs, 0.2 U Taq-Polymerase (Genaxxon Bioscience,

Biberach) und 2 µl des 10x Reaktionspuffer mit MgCl2.

7.2.7 RT-PCR

RNA wurde mit dem RNeasy Kit (Qiagen) isoliert und dem Superscript II Kit

(Invitrogen) in cDNA umgeschrieben.

7.2.8 Site-directed Mutagenese

Die benötigten Mutationen wurden mit dem QuikChange-Site-Directed Mutagenesis

Kit (Stratagene, Cedar Creek, TX) in den Vektor pµGPT eingefügt. Dieses Kit benutzt

86


die PfuTurbo DNA-Polymerase, um den kompletten Vektor mit zwei Primern zu

amplifizieren, die gegenläufig an der gleichen Stelle binden und die gewünschte

Mutation in der Mitte tragen. Nach der Amplifikation wurden die methylierten,

unmutierten Vektoren mit DpnI verdaut. Die unmethylierten, mutierten PCR-

Amplifikate blieben hierbei unverdaut und wurden in GeneHog-Bakterien

transformiert.

7.2.9 DNA-Sequenzierungen

Zur Sequenzierung wurde das BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Version 1.1

(Applied Biosystems, Foster City, CA) benutzt. Abweichend vom Hersteller-Protokoll

wurde folgendes Protokoll angewandt.

6µl 200-300ng Plasmid-DNA in H2O (HPLC-Grade)

2µl BigDye Kit Ver. 1.1 Sequenzier-Mix (2.5x)

1µl 5x BigDye Sequenzierpuffer

1µl Primer (5pmol/µl)

PCR Programm: 94°C 3min, 25 Zyklen (96°C 20sec, 52°C 15sec, 60°C 4min)

Die Sequenzier-Reaktion wurde anschließend in Eppendorff-Gefäße überführt und

durch die Zugabe von 90µl H2O (HPLC-Grade), 1/10 Volumen 3M NaAc pH 5.8 und

2.5 Volumen 100% Ethanol in einer Zentrifuge 20min bei 13000rpm auf 4°C gefällt.

Der Überstand wurde verworfen und das Pellet zweimal mit 200µl 70% Ethanol

gewaschen und getrocknet. Anschließend wurde das Pellet in 15µl HighDye-

Formamid (Applied Biosystems) gelöst und auf einem ABI3130 Kapillarsequenzierer

(Applied Biosystems) aufgetrennt. Die Chromatogramme wurden mit der Software

SeqMan (DNASTAR, GATC Biotech, Konstanz) analysiert.

7.2.10 Bestimmung des Transgen-Insertionspunkts per Zirkel-PCR

Zur Bestimmung des Transgen-Insertionspunkts wurde DNA wurde aus Schwanz-

Biopsien wie für eine Southern Blot Analyse aufgereinigt. 5µg DNA wurden in einem

50µl-Ansatz für 10h mit MseI verdaut, und das Enzym anschließend 30min bei 65°C

87


hitzeinaktiviert. Vom Verdau wurden 5µl mit H2O und Ligationspuffer auf 500µl

verdünnt, 5µl T4 DNA-Ligase hinzugefügt und über Nacht bei 14°C inkubiert, um

DNA-Zirkel zu erhalten. Die Ligase wurde danach 15min bei 65°C inaktiviert.

Die Amplifikation der Bruchpunkte geschah in zwei PCR-Schritten. Zunächst wurden

1.5µl des Ligationsansatzes in einer 20µl PCR-Reaktion mit den Primern IgMTer113

rev und IgMTer139 fwd oder IgMTer344 rev und IgMTer386 fwd eingesetzt. Von der

ersten PCR-Reaktion wurde dann 1µl für die zweite PCR-Reaktion mit den Primern

IgMTer113 rev und IgMTer386 fwd benutzt. Das PCR-Programm war für beide

Amplifikationen gleich: 5min 94°C, 20 Zyklen (30sec 94°C, 30sec 65°C, 3min 72°C),

3min 72°C. Das zweite PCR-Produkt wurde auf einem Gel aufgetrennt, die Banden

extrahiert, mit dem TA Cloning Kit (Invitrogen) kloniert und mit dem Primer T7

sequenziert. Dabei wurden sowohl die Bruchpunkte, als auch der endogene Lokus

identifiziert.

7.2.11 Einzelzell-PCR

Für die Einzelzell-PCR wurden einzelne B-Zellen am FACS-Sorter (Coulter, Krefeld)

in PCR-Platten (PeqLab) sortiert, in die in jede Vertiefung 40µl H2O vorgelegt waren.

Die Platten wurden sofort auf Trockeneis eingefroren und bei -20°C gelagert. Zur

PCR wurden die Platten aufgetaut, 10µl Lysepuffer (6µ PCR Puffer mit 15mM Mg2+

und 4µl Proteinase K [0.1mg/ml]) zu jeder Vertiefung hinzugegeben und 1h bei 56°C

inkubiert. Anschließend wurde die Proteinase 15min bei 95°C inaktiviert, die Platten

auf Eis gekühlt und abzentrifugiert. Nun wurde in jede Vertiefung 10µl PCR-Mix (2µl

NTPs, 2µl von jedem Primer, 0.25µl Taq, H2O ad 10µl) gefüllt und die PCR mit

folgenden Bedingungen gestartet: 5min 94°C, 30 Zyklen (30sec 94°C, 30sec 65°C,

40sec 72°C), 3min 72°C.

In der ersten PCR wurden das äußere Primerpaar für die Sequenz 5’ von DFL16.1

(5’DFL16.1 fwd, 5’DFL16.1 rev) und das Transgen (Ter3KI fwd 1st, Ter3KI rev 1st)

gemeinsam eingesetzt. Je 1µl des PCR-Produkts der ersten Runde wurde dann mit

den gleichen Bedingungen ein zweites Mal in getrennten Ansätzen amplifiziert mit

den inneren Primerpaaren DFL16.1 2nd fwd und DFL16.1 2nd rev oder Ter3KI fwd

2nd und Ter3KI rev 2nd.

88


Zur Analyse der Konfiguration der IgH-Allele in den Splenozyten von heterozygoten

IgHVDJ–/wt-Mäusen wurden die Zellen mit Antikörpern gegen IgMa und IgMb angefärbt

und nach folgendem Schema sortiert:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 Je 10 µa+ und µb+ Zellen

B 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Eine µa+ Zelle

C 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Eine µa+ Zelle

D 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Eine µa+ Zelle

E 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Eine µb+ Zelle

F 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Eine µb+ Zelle

G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Eine µb+ Zelle

H 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Keine Zelle

Bei der Analyse der Nonsense-transgenen Mäuse wurde hingegen in alle

Vertiefungen der Platten je eine IgM-positive Milzzelle aus 7307Ter3/Ter3- oder Wildtyp-

Tieren sortiert.

7.2.12 Genotypisierung transgener Mäuse

Zur Genotypisierung transgener Mäuse wurden Schwanzbiopsien entnommen und in

jeweils 300µl PBND (PCR-Buffer with nonionic-detergent)-Puffer (50mM KCl, 10mM

Tris-HCl pH 8.3, 2.5mM MgCl2, 0.1mg/mgl Gelatine, 0.45%v/v NP-40, 0.45% v/v

Tween 20) mit 2µl Proteinase K (20mg/ml, PeqLab) unter starkem Schütteln bei 56°C

über Nacht verdaut. Die Proteinase wurde anschließend 15min bei 95°C inaktiviert,

die Proben auf Eis gekühlt und die unverdauten Bestandteile abzentrifugiert. Für die

PCR wurde 1µl des Verdaus eingesetzt.

7.2.13 Durchflusszytometrie (FACS)

Primärzellen wurden je nach Gewebe unterschiedlich präpariert. Zur Isolation von

Knochenmarkszellen wurden Femur und Tibia präpariert, an den Enden

aufgeschnitten und mit FACS-PBS (PBS, 5% FCS, 0.01% Azid) gespült. Durch

89


erneutes Aufziehen in die Spritze wurde aus dem Knochenmark eine

Einzelzellsuspension erzeugt. Milzen wurden in RPMI (Invitrogen) aufgenommen und

mit einem Sieb (Cell Strainer, BD, Heidelberg, Maschenweite 70µm) homogenisiert,

und peritonealen B-Zellen durch Ausspülen der Peritoneums mit PBS gewonnen.

Die Einzelzellsuspensionen wurden dann 5min bei 1500 rpm auf 4°C in einer

Heraeus Megafuge abzentrifugiert, und in 0.15M NH4Cl, 20mM HEPES

aufgenommen, um die Erythrozyten zu lysieren. Nach einer 5minütigen Inkubation

bei RT wurde die Lyse durch Zugabe von PBS gestoppt, die Zellen abzentrifugiert

und das Pellet erneut in FACS-PBS aufgenommen.

Zur Oberflächenfärbung wurden die Zellen in Micronix-Röhrchen (Lelystad, NL)

abzentrifugiert, in 50µl FACS-PBS mit den entsprechenden Antikörpern

aufgenommen, und 45min auf Eis inkubiert. Abschließend wurden die Zellen zweimal

mit PBS gewaschen und auf einem FACS Calibur (BD) analysiert und mit CellQuest-

Software ausgewertet.

Für intrazelluäre Färbungen wurden die Zellen, ggf. nach vorheriger

Oberflächenfärbung, in Micronix-Röhrchen abzentifugiert, in 50µl Fixierlösung

(Solution A, Fix und Perm Kit (An der Grub Biosciences)) aufgenommen und 15min

bei RT fixiert. Die Zellen wurden danach zweimal mit PBS gewaschen, in 50µl

Permeabilisierungslösung (Solution B) mit den entsprechenden Antikörpern

aufgenommen und erneut 15min bei RT inkubiert. Abschließend wurden die Zellen

zweimal mit PBS gewaschen und analysiert.

7.2.14 Durchflusszyometrische (FACS) und magnetische (MACS) Zellsortierungen

Um definierte Zellpopulationen aus der Gesamtpopulation aufzureinigen, wurden die

gewünschten Zellen anhand ihrer Oberflächenmarker entweder mit

floureszenzgekoppelten Antikörpern im FACS-Sorter (Coulter) oder mit an

magnetische Kügelchen gekoppelten Antikörpern im AutoMACS (Miltenyi, Bergisch

Gladbach) sortiert. Die Vorbereitung der Zellen für den FACS-Sorter entspricht dem

FACS-Protokoll. Für die MACS-Sortierung wurden 1x107 Zellen nach

Erythrozytenlyse durch einen Nylonfilter (Pre-Separation Filter, Miltenyi) gefiltert, in

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10µl CD19 Magnetic Beads (Milteny) und 90µl MACS-PBS (PBS, 2% FCS, 0.01%

Azid) aufgenommen, 20min auf Eis inkubiert, und zweimal in MACS-PBS

gewaschen. Die Zellen wurden dann im AutoMACS separiert.

7.2.15 Nachweis der Ig-Isotypen im Serum

Serum von sechs Wochen alten Tieren wurde durch einen ELISA mit dem

Clonotyping Sytem/HRP (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) nach dem

Herstellerprotokoll nachgewiesen. Die Platten wurden mit Ziege-Anti-Maus-Ig-

Antikörpern beschichtet, mit dem Serum inkubiert und mit HRP-gekoppelten Isotyp-

spezifischen Antikörpern und dem entsprechenden HRP-Substrat entwickelt.

91


92

8. Literaturverzeichnis

8 Literaturverzeichnis

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104

9. Anhang

9 Anhang

9.1 Veröffentlichungen

Paul E, Lutz J, Erikson J, Carroll MC

Germinal center checkpoints in B cell tolerance in 3H9 transgenic mice.

Int Immunol. 2004 Feb;16(2):377-84.

Lutz J, Muller W, Jack HM

VH Replacement Rescues Progenitor B Cells with Two Nonproductive VDJ Alleles

J. Immunol., Nov 2006; 177: 7007 - 7014.

Vettermann C, Lutz J, Selg M, Bosl M and Jack HM

Genomic suppression of murine B29/Ig-b promoter-driven transgenes

Eur J Immunol. 2006 Dec, in press

105

9. Anhang

106

9. Anhang

9.2 Lebenslauf

Persönliche Daten Name: Johannes Lutz

Geboren: 14.5.1975 in Wiesbaden

Familienstand: Ledig

Schulbildung Sept. 1981 bis Juli 1985 Grundschule, Wiesbaden.

Sept. 1985 bis Juli 1991 Leibniz-Gymnasium Wiesbaden.

Sept. 1991 bis Juli 1994 Carl-von-Ossietzky Oberstufen-Gymnasium Wiesbaden,

abgeschlossen mit Abitur.

Zivildienst Nov. 1994 bis Sept. 1995 Zivildienstleistender im Rettungsdienst, Wiesbaden.

Studium Okt. 1995 bis März 2001 Biologiestudium auf Diplom an der Universität Konstanz.

Okt. 1998 bis Jan. 1999 Auslandssemester an der University of Wales,

Aberystwyth, UK.

März 2000 bis Feb. 2001 Diplomarbeit am Center for Biomedical Research

(CBR), Harvard Medical School, Boston, USA. Thema

der Diplomarbeit: "Autoimmunity in Complement

Deficient Mice".

März 2001 Abschluss als Diplom-Biologe.

April 2001 bis April 2002 Fortführung des Diplom-Projektes als wissenschaftlicher

Angestellter am CBR.

Mai 2002 bis Dez. 2006 Promotion in der Abteilung für Molekulare Immunologie,

Medizinische Klinik III, Nikolaus-Fiebiger-Zentrum,

Universität Erlangen-Nürnberg. Thema der Promotion:

"Untersuchungen zur Kontrolle der VDJ-Rekombination

am IgH-Lokus".

107

9. Anhang

108

9. Anhang

9.3 Danksagung

Besonders danken möchte ich Herrn Prof. Dr. Hans-Martin Jäck für die Überlassung

des attraktiven Themas, die großzügige Unterstützung, die exzellenten

Arbeitsbedingungen und die große Freiheit bei der experimentellen Planung und

Umsetzung meines Projektes.

Herrn Prof. Dr. Thomas Winkler danke ich für die vielen wissenschaftlichen

Anregungen und die Übernahme des Zweitgutachtens.

Christian Vettermann danke ich für unzählige wissenschaftliche (und nicht-

wissenschaftliche) Diskussionen und kritische Anregungen, und Jürgen Wittmann

besonders für die Einführung in das RNA-Feld, den NMD und das Klonieren.

Edith Roth und Christine Albert danke ich für die Unterstützung bei der Durchführung

einiger Experimente, Prof. Dr. Werner Müller, Anke Samuels, Maria Ebel und Dr.

Martin Hafner für die ES-Zellkultur und die Herstellung Keimbahn-kompetenter

chimärer Mäuse und Dr. Chander Raman für die Hilfe bei der Herstellung der

transgenen Mäuse.

Bei allen Mitarbeitern der Molekularen Immunologie möchte ich mich für

immerwährende Hilfs- und Diskussionsbereitschaft und die schöne Zeit bedanken.

Ein besonderer Dank gilt meiner Freundin Christina, die alle Höhen und Tiefen

meines Forscher-Daseins mitbekam, sowie meinen Eltern und meiner Familie, die

meinen Weg nicht nur immer unterstützt haben, sondern mir diesen auch erst

ermöglicht haben.

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Untersuchungen zur Kontrolle der VDJ-Rekombination am IgH ... · Untersuchungen zur Kontrolle der VDJ-Rekombination am IgH-Lokus Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität