V. NE~o]~]~: Bestimmung yon APAD und 3-Acetylpyridin 49

in der Lokalisation yon hoher Fermentaktiviti~t und Zellnekrosen nach Gabe yon Nicot in~ureamid-antagorSsten wie 3-Acetylpyridin erkl~rt werden kSnnen. Die Zellsch~digungen kSnnen jedoch nieht auf eiae An- reicherung von 3-Aeetylpyridimadenindinucleotid in abgegrenzten Gebieten zurfickgeffihrt werden, denn 3-Acetylpyridin wird in allen Gehirnteilen prozentual in anniihernd gleicher Menge in das NAD ein- gebaut (N~,uHOFr 1962). MSglicherweise ist die Bildung des 3-Acetyl- pyridin-Analogen des NADP viel wesentlicher ffir die Stoffwechsel- stSrungen, zumal die Gesehwindigkeit der Austausehreaktion mit NADP in vitro erheblieh schneller verliiuft und die Konzentrat ion yon NADP im Gehirn mehr als 20 real geriager ist als die voa NAD.

Literatur CoP~, H., I. tt~LG~ u. tL H E R ~ : (:~ber die Wirkung des Hexachlorcyclohexa~s

auf die DPbT. und TPN-Nucleosidase des Gehirns. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. Path. Phaxmak. 24~, 99 (1962).

GRE~]~LL, R. G., and L. MAY: zit. nach ~q. O. K ~ L ~ . In: Coenzyme metabolism of the brain. The Neurochemistry of 5Iucleotides and Amino Acids 1960, p. 70.

~ v ~ o ~ , V.: Mikromethode zur Bestimmung yon APAD und 3-Acetylpyridin. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. Path. Pharmak. (ira Druck).

V. N]~UHOFI~ (Berlin-Dahlem): Mikromethode zur Bestimmung yon APAD und 3-Acetylpyridin

COrEl~ u. tI~RKEN haben 1962 fiber die pharmakologische Analyse der 3-Acetylpyridiavergiftung berichtet. B ~ E M ~ - ~ , CoP~R u. HERKE~ ist es erstmals gelungen, das abnorme Nucleotid APAD aus Gehirnen yon Ra t t en zu isolieren, die mit 3-AP vergfftet waren. Die isolierteVerbiadung war mit dem yon K ~ L A ~ aus Tumoren gewonnenen Analogen identisch. Zum enzymatischea Nachweis yon APAD werden zumindest 3 ? /ml benStigt. Ffir Lokalisations- und Verteilungsstudien ist eine Methode er- forderlich, die mit niederen Konzentrat ionen eiadeutige Identifizierung und Unterscheiduag yon NAD gestattet . Mit der fluorometrisehen Methode yon L o w e r ist APAD nicht zur Fluorescenz zu briagen. Am geregt dutch Methoden yon HuFF u. a. bzw. Bu~c~ u. a. wurden Ver- suehe mit versehiedenen Ketonen vorgenommen. 1--50/~1 APAD-LSsung werden mit 50 #1 Methyliithylketon und 100/A 0,1 n NaOH gut gesehfit- telt und 7 mia bei 100°C iakubiert . Dana werden 2 ml 5 n HC1 zugesetzt Lmd noehmal bei 100°C 5 min inkubiert. Wird Aceton s tar t Methyl~thyl- keton eingesetzt, ist die Intensi t£t der Fluorescenz nur halb so stark. Die Vohlm~ua si~mtlicher Reaktionspartner kSnaen auch so variiert werden, dai~ mi t einem Gesamtvolumen von 0,1 ml in Mikroeuvetten gemessen werden kann. Das charakteristisehe Anregungsspektrum von

~aunyn- Schraie deberg's Arch. exp. Path. Pharmak., Bd. 245 (Tagungsbericht) 4

50 V. NEUHOFF: Bestimmung yon APAD und 3-Acetylpyridin

A P A D ist dureh zwei etwa gleiekhohe Maxima gekennzeichnet, die bei den anregenden Wellenli~ngen 265 und 365 m/z (unkorr.) auftreten. Die maximale Emission liegt bei 500 m# (unkorr.). Wird NAD gleichartig behandelt, hat das Anregungsspektrum nur ein Maximum bei 365 m/~ und 100faeh schw/~chere Emission. Dadurch ist es mSglieh, zwischen APAD und NAD auch dann noeh zu unterseheiden, wenn in einer Misehung yon beiden nut 1--2°/0 APAD vorhanden ist. In dem Bereich yon 5 - 1 0 -9 bis 2 . 1 0 -12 Mol besteht eine lineare Beziehung zwischen Konzentrat ion und Fluorescenz. Freies 3-Aeetylpyridin kann nach vor- heriger Inkubat ion mit Methyljodid zu gleichartiger Fluorescenz an- geregt werden. Dureh Differenzmessungen aliquoter Mengen mit und ohne Methyljodidzusatz kann zwischen freiem und in das Nucleotid eingebautem 3-AP unterschieden werden. Die Spezifiti~t und hohe Emp- findliehkeit der Methode gestattet APAD-Gehaltsbest immungen in per- ehlorsauren Gewebsextrakten, die aus weniger als 1 mg Gewebe gewon- hen werden kSnnen. In ~bereinst immung mit Befunden yon BRVNN]~- MANN, COPEI~ U. HERKElV wird APAD in Gehirnen yon Rat ten gefunden, die mit 3-AP behandelt waren. 8 Std naeh der Applikation sind im Gesamtgehirn 9,10/o APAD ~- APADP nachweisbar. In Cortex, Medulla und Pons, Stammganglien und KleinJaira finden sich zur gleichen Zeit 11,1, 10,1, 7,7 und 8,69/0, in den Lamina quadrigemina posterior und anterior 3,80/0 und 2,60/0, in Thalamus und Hypothalamus 3,4 und 3,99/0 . Wie erste Versuche einer vollst~ndigen Analyse yon perchlorsauren Hirn- extrakten ergaben, enthi~lt der Ex t rak t neben APAD auch APADP. Es wurden etwa 40--500/0 des gesamten NADP des Gehirns als abnorm strukturiert gefunden. Die Deutung dieser Befunde wird erst nach weiteren Analysen, insbesondere auch des Stoffwechsels der NAD- bzw. NADP-abh~ngigen Enzyme mSglich sein.

Literatur B~v~,~AN~, A., H. CoP~.~ u. H. HEaX~.~: Naturwissenschaften 49, 185 (1962). -- -- -- Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. l~ath. Pharmak. (ira Druck). BUROH, H. B., C. A. STORVICK, t~. L. BICKNELL, H. C. KUNG, L. G. ALEJO, W. A.

EVE~R])T, O. H. LOW,V, C. G. KZNG and O. A. B]~ss]~r: J. biol. Chem. 212, 897 (1955).

COPV.R, H., u. H. ItERK~.~: Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. Path. Pharmak. 248, 291 (1962).

HUFF, J. W.: J. biol. Chem. 167, 151 (1947). --, and W. A. P~LZW~,m: J. biol. Chem. 167, 157 (1947). KirLAN, 1~ T. 0., and M. IV[. CIOTTI: J. Amer. chem. Soc. 76, 1713 (1954).

- - -- J. biol. Chem. 221,823 (1956). L~vrrAs, N., J. ROBINSON, F. ROSE~, J. W. HVFF and W. A. P~RLZW~.IC: J. biol.

Chem. 167, 169 (1947). LOWRY, O. H., I~. 1%. ROBF, RTS and J. I. KieP~im~: J. biol. Chem. 224, 1047

(1957).