Evaluation eines Radioimmunoassays zur Bestimmung der freien Metanephrine im Plasma im

Vergleich zu bisher angewandten biochemischen Verfahren in der Diagnostik des

Phäochromozytoms

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Dr. med.

an der medizinischen Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von:

Ulrich Miehe

06.06.1981, Magdeburg

angefertigt in:

Universität Leipzig, Klinik für Endokrinologie und Nephrologie

Betreuer: Prof. Dr. Christian Koch

Prof. Dr. Jürgen Kratzsch

Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 13.12.2010

2

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Christian Koch sowie Herrn Prof. Dr. Jürgen

Kratzsch, die mich bei der Konzeption und Durchführung der Arbeit sowie der Erstellung der

Dissertationsschrift betreut und mir in fachlichen Fragen stets zur Seite gestanden haben.

Bedanken möchte ich mich darüber hinaus bei meinen Eltern sowie bei Dir, Anett. Ohne Eure

ausdauernde und vielseitige Unterstützung wäre die Umsetzung meiner Promotion kaum

möglich gewesen.

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Bibliographische Beschreibung

Miehe, Ulrich

Evaluation eines Radioimmunoassays zur Bestimmung der freien Metanephrine im Plasma im

Vergleich zu bisher angewandten biochemischen Verfahren in der Diagnostik des

Phäochromozytoms

Universität Leipzig, Dissertation

55 S., 178 Lit., 23 Abb.

Referat:

In den vergangen Jahren ist durch eine verbesserte Bildgebung die Anzahl der zufällig

entdeckten adrenalen Raumforderungen beständig angewachsen. Eine wichtige

Differenzialdiagnose sowohl bei adrenalen Inzidentalomen als auch bei der refraktären

Hypertonie stellt das Phäochromozytom dar. Aus diesem Hintergrund heraus leitet sich der

Wunsch nach Methoden zur sensitiven und spezifischen Bestimmung biochemischer

Parameter in der Diagnostik des Phäochromozytoms ab. Derzeit werden hierzu die freien

Plasmametanephrine durch High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) als Mittel der

Wahl angesehen. In der vorliegenden Arbeit wurden bei 113 Patienten mit klinischem

Verdacht auf bzw. zum Ausschluss eines Phäochromozytoms die freien Plasmametanephrine

mit Hilfe eines Radioimmunoassays (RIA) untersucht. Ziel war zum einen die Evaluierung

der freien Metanephrine im Plasma mittels RIA als auch der Vergleich dieser mit anderen

biochemischen Parametern und diagnostischen Verfahren hinsichtlich Sensitivität und

Spezifität.

Der hier verwendete RIA ist relativ zeitnah durchzuführen, kostengünstig und dadurch breit

verfügbar. Er zeigt eine hohe diagnostische Sensitivität und Spezifität bei der Bestimmung der

freien Metanephrine im Plasma und bietet sich somit für den Einsatz in der Routinediagnostik

des Phäochromozytoms an, wodurch verbesserte Aussagen zum Ausschluss bzw. zur

Bestätigung der Anwesenheit des Tumors möglich werden.

4

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 6

1.1 EPIDEMIOLOGIE 6 1.2 GENETISCHER HINTERGRUND 6 1.3 MALIGNITÄT DES PHÄOCHROMOZYTOMS 11 1.4 GESCHICHTLICHER ABRISS 11 1.5 PHYSIOLOGIE DES KATECHOLAMINMETABOLISMUS 12 1.6 KATECHOLAMINMETABOLISMUS BEIM PHÄOCHROMOZYTOM 14 1.7 LABORDIAGNOSTIK DES PHÄOCHROMOZYTOMS 15

2 Zielstellung 19

3 Patientencharakteristika und Methoden 20

3.1 PATIENTENCHARAKTERISTIKA 20 3.2 METHODEN 22 3.2.1 RADIOIMMUNOASSAY FÜR PLASMAMETANEPHRINE 22 3.2.2 ERMITTLUNG EINES GRENZWERTES FÜR PLASMAMETANEPHRINE MITTELS

RADIOIMMUNOASSAY (RIA) DER FIRMA LDN GMBH & CO. KG 24 3.2.3 RADIOIMMUNOASSAY FÜR SERUM-CHROMOGRANIN A 26 3.2.4 HPLC FÜR PLASMA-, URINMETANEPHRINE UND URINKATECHOLAMINE 27 3.3 DIAGNOSTISCHER ABLAUF 27 3.4 STATISTISCHE VERFAHREN 28

4 Ergebnisse 29

4.1 BESTIMMUNG DER PLASMAMETANEPHRINE MIT RADIOIMMUNOASSAY (RIA) 29 4.2 VERGLEICH DER PLASMAMETANEPHRINE BEI PATIENTEN MIT PHÄOCHROMOZYTOM PRÄ-

UND POSTOPERATIV MIT RIA 31 4.3 VERGLEICH DER RIA-PLASMAMETANEPHRINBESTIMMUNG MIT HPLC 33 4.4 BESTIMMUNG DER URINKATECHOLAMINE MIT HPLC 36 4.5 BESTIMMUNG DER URINMETANEPHRINE MIT HPLC 37 4.6 BESTIMMUNG DES SERUM-CHROMOGRANIN A MITTELS RIA 39 4.7 MEHRFACHBESTIMMUNG DER METANEPHRINE IM PLASMA MIT RIA 40 4.8 PLASMAMETANEPHRINE IN ABHÄNGIGKEIT VOM ALTER 41 4.9 VERGLEICH DER ANALYSIERTEN PARAMETER 42

5 Diskussion 44

5.1 ÜBERBLICK 44 5.2 PLASMAMETANEPHRINE 46 5.2.1 KATECHOLAMINE UND METANEPHRINE IM 24-H-SAMMELURIN 50 5.2.2 CHROMOGRANIN A IM SERUM 51 5.2.3 PRÄKLINISCHE EINFLUSSFAKTOREN 52 5.3 EINSCHRÄNKUNGEN DIESER STUDIE 53 5.4 ÖKONOMISCHE GESICHTSPUNKTE 53

6 Zusammenfassung 56

5

Abkürzungsverzeichnis 58

Abbildungsverzeichnis 59

Literaturverzeichnis 61

6

1 Einleitung

1.1 Epidemiologie

Das Phäochromozytom ist mit einer jährlichen Inzidenz von 2 bis 8 Fällen pro 1 Million

Einwohner ein extrem seltener Tumor (Beard et al. 1983, Hartley et al 1985, Stentstrom et al.

1986, Andersen et al. 1988, Fernandez et al.1994). Es handelt sich hierbei entsprechend der

WHO-Klassifikation endokriner Tumoren aus dem Jahr 2004 um einen Tumor, der von den

Katecholamin produzierenden chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks ausgeht. Nach de

Lellis (2004) wird das Phäochromozytom auch als intraadrenales Paragangliom bezeichnet. In

der Fetalzeit sind die chromaffinen Zellen in vielen Körperregionen vorhanden. Sie

degenerieren aber im Verlauf der Entwicklung, so dass lediglich die sympathischen und

parasympathischen Ganglien sowie das Nebennierenmark als Sitz der chromaffinen Zellen

erhalten bleiben. Aus der Embryologie erklärt sich die variable Lokalisation des Tumors. Er

entspringt in circa 85% der Fälle aus den chromaffinen Zellen des adrenalen Gewebes (Reisch

et al. 2006). Das Phäochromozytom tritt jedoch auch in bis zu 15% der Fälle als so genanntes

extraadrenales Paragangliom auf, wenn es seinen Ursprung im extraadrenalen Gewebe hat

(Hernandez et al. 2000, Baguet et al.2004). Insgesamt entstehen 95% aller

Phäochromozytome im Abdomen. Die häufigsten extraadrenalen Lokalisationen sind

paraaortal, in der Gallenblase sowie im Kopf- und Halsbereich (Bravo et al. 2003, Elsayes et

al. 2005).

1.2 Genetischer Hintergrund

Entgegen der früheren Annahme, dass ca. 10% der Phäochromozytome genetischen

Ursprungs sind, wird heutzutage durch verschiedene in den letzten Jahren veröffentlichte

Studien von etwa 20% bis 30% genetisch bedingten Phäochromozytomen ausgegangen

(Neumann HP et al. 2002, Amar et al. 2005). Wie Abbildung 1 zeigt sind verschiedene

hereditäre Erkrankungen bekannt, die mit der Entstehung von Phäochromozytomen assoziiert

sind. Die von-Hippel-Lindau Erkrankung (VHL) ist eine autosomal-dominant vererbte

Krankheit, die durch einen Gendefekt auf dem Locus p25-26 des Chromosoms 3 verursacht

wird (Latif et al. 1993, Neumann et al. 2002). Sie tritt mit einer Häufigkeit von 1 zu 30.000

bis 1 zu 40.000 auf (Maher et al. 1991, Neumann et al. 1991). Das VHL-Gen ist ein typisches

7

Abbildung 1 Differentialdiagnose der hereditären Phäochromozytome und Paragangliome; in Anlehnung an:

Kim WY and Kaelin WG 2004. Abkürzungen: VHL; von-Hippel-Lindau Erkrankung, MEN 2, multiple

endokrine Neoplasie 2, SDHB-D; Succinatdehydrogenase-Subunit B-D, MTC, medullary thyroid carcinoma

Tumorsuppressorgen, dessen normale Funktion die Regulation des Zellwachstums ist. Es

kodiert für zwei Proteine mit ähnlicher Wirkungsweise. Verschiedene Forscher haben gezeigt,

dass diese Genprodukte nicht nur den Zellzyklus beeinflussen, sondern auch eine Rolle bei

der mRNA-Stabilität und der Expression Hypoxie induzierbarer Gene spielen (Gnarra et al.

1996, Siemeister et al. 1996, Krieg et al. 2000).

vererbtes Syndrom Gen Locus andere Manifestationen

VHL VHL 3p25 ZNS-Hämangioblastome

Retinale Hämangioblastome

Inselzelltumoren

Tumoren des endolymphatischen Sackes

Nieren- und Pankreaszysten

MEN 2A RET 10q11 MTC, Hyperparathyreoidismus

MEN 2B RET 10q11 MTC, marfanoider Habitus, Ganglioneuromatose

SDHB SDHB 1p36 keine

SDHC SDHC 1q21 keine

SDHD SDHD 11q23 keine

NF 1 NF 1 17q11 Café-au-lait Flecken

Neurofibrome

Irishamartome

Optikusgliome

Leukämie

Zusammen mit anderen Kofaktoren bilden sie einen Komplex, der Proteine ubiquitiliert und

damit dem Proteasom zum Abbau bereitstellt (Iwai et al. 1999, Lisztwan et al. 1999). Es

konnte nachgewiesen werden, dass dieser Komplex auch für die Ubiquitilierung Hypoxie

induzierbarer Faktoren (HIF) verantwortlich ist (Kamura et al. 2000, Tanimoto et al. 2000).

HIF sind Proteine, die unter hypoxischen Bedingungen die Transkription verschiedener

angiogenetischer Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel platelet-derived growth factor

(PDGF) oder vascular endothelial growth factor (VEGF) erhöhen (Wiesener et al. 2001). Bei

Normoxämie werden die HIF durch die Mitwirkung der VHL-Proteine abgebaut. Mutationen

8

im VHL-Gen resultieren jedoch in einem Verlust der Fähigkeit, Proteine zu ubiquitilieren und

damit in einer Hochregulation der HIF (Flamme et al. 1998). Hierdurch entstehen vermehrt

angiogenetisch wirksame Wachstumsfaktoren. Diese Erkenntnisse liefern eine Erklärung für

die Assoziation der VHL mit hochvaskularisierten Tumoren.

Trotz des autosomal-dominanten Erbgangs kommt es erst dann zu unkontrolliertem

Zellwachstum und Tumorentstehung, wenn beide Genkopien des VHL-Gens durch Mutation

oder Verlust von genetischer Information inaktiviert sind. Jedoch verfügen an VHL erkrankte

Patienten zunächst über ein gesundes, vom nicht erkrankten Elternteil geerbtes Allel und ein

mutiertes, vom betroffenen Elternteil geerbtes Allel. Nach der „two-hit“-Hypothese von

Knudson und Strong existiert die Mutation zwar in allen Körperzellen, es entarten jedoch nur

diejenigen Zellen, bei denen das gesunde Allel einer zweiten somatischen Mutation unterliegt

(Knudson et al. 1972, Knudson et al. 1986).

Die VHL kann durch die Abwesenheit (Typ 1) oder Anwesenheit (Typ 2) von

Phäochromozytomen weiter unterteilt werden (Lonser et al. 2003). Ferner wird bei der VHL

Typ 2 an Hand des jeweiligen Risikos für die Entwicklung eines Nierenzellkarzinoms eine

zusätzliche Unterscheidung in Typ 2 A (niedriges Risiko) und Typ 2 B (hohes Risiko)

vorgenommen. Darüber hinaus ist die VHL durch das Auftreten von Hämangioblastomen des

zentralen Nervensystems, Tumoren des endolymphatischen Sackes und der Inselzellen sowie

Pankreaszysten charakterisiert (Eras et al. 2004, Gläsker et al. 2005). Werden in einer an VHL

erkrankten Familie nur Phäochromozytome beobachtet, so wird dies als VHL Typ 2 C

klassifiziert. Insgesamt betrachtet treten Phäochromozytome bei 19 bis 39% der Patienten auf,

dann allerdings oft als Erstmanifestation dieser Krankheit (Neumann et al. 1993, Walther et

al. 1999).

Darüber hinaus stellt die Gruppe der multiplen endokrinen Neoplasien (MEN) eine weitere

hereditäre Erkrankungsform dar, die mit der Entstehung von Phäochromozytomen assoziiert

ist. Sie werden in MEN 1 und MEN 2 unterteilt.

Die MEN 1 ist eine autosomal-dominante Erkrankung, deren Prävalenz auf 1 zu 30.000 bis 1

zu 60.000 geschätzt wird (Katai et al. 1997, Balogh et al. 2007). Chandrasekhareppa et al.

(1997) entdeckten, dass dieses familiäre Tumorsyndrom durch einen Defekt des

Tumorsuppressorgens Menin auf Chromosom 11q13 verursacht wird. Ähnlich dem VHL-Gen

führt erst eine zweite somatische Mutation zum Verlust der Funktion des normalen

Meninallels und somit zum Tumorwachstum. Endokrine Organe, die typischerweise

Neoplasien aufweisen sind Nebenschilddrüsen, Pankreas, Duodenum und Hypophyse

(Schussheim et al. 2001, Tonelli et al. 2005, Lakhani et al. 2007). Der Einfluss des Meningens

9

auf die Entstehung von Nebennierentumoren, Karzinoide und Lipome scheint dagegen eher

gering zu sein, so dass sie bei der MEN 1 eher selten auftreten (Gortz et al. 1999, Heppner et

al. 1999).

Die ebenfalls autosomal-dominant vererbte MEN 2 tritt mit einer Häufigkeit von 1 zu 30.000

auf und wird in die MEN 2 A und MEN 2 B unterteilt (Marini et al. 2006). Das Auftreten von

medullären Schilddrüsenkarzinomen ist ein obligater Bestandteil der MEN 2 A. Ein weiteres

Charakteristikum der Erkrankung ist die Entstehung eines primären Hyperparathyreoidismus

in 15% bis 30% der Fälle (Nguyen et al. 2001, Jimenez et al. 2004, Gujral et al. 2006).

Darüber hinaus werden bei 50% bis 60% der Patienten uni- oder bilaterale

Phäochromozytome diagnostiziert (Gimm et al. 2001, Koch et al. 2001, Peczkowska et al.

2005). Insgesamt stellt die MEN 2 A mit einem Anteil von 70% bis 80% aller MEN die am

häufigsten vorkommende Entität dar (Eng et al. 1996).

Die MEN 2 B ist ebenfalls durch das Auftreten von Phäochromozytomen (50% bis 60% der

Fälle) charakterisiert. Jedoch ist bei den betroffenen Patienten die Kombination einer

Ganglioneuromatose mit medullärem Schilddrüsenkarzinom und marfanoidem Habitus

weitaus häufiger (Lee et al. 2000).

Eine weitere Erscheinungsform der MEN ist das familiäre medulläre Schilddrüsenkarzinom

(FMTC). Bei dieser seltenen Erkrankung sind viele Mitglieder innerhalb einer Familie von

einem medullären Schilddrüsenkarzinom betroffen (Machens et al. 2001). Im Gegensatz zur

MEN 1 und MEN 2 beobachtet man bei jenen Patienten jedoch keine weiteren krankhaften

Vorgänge.

Verschiedene Forschergruppen konnten nachweisen, dass die Ursache der MEN 2 in einer

Mutation des auf Chromosom 10q11.2 liegenden REarranged during Transfection (RET-)

Protooncogens liegt (Mulligan et al. 1993, Huang et al. 2000, Koch et al. 2002, Zhou et al.

2009). Es kodiert für einen membrangebundenen Rezeptor mit Tyrosinkinaseaktivität, der von

den Zellen der ehemaligen Neuralleiste (C-Zellen der Schilddrüse, Nebennierenzellen und

andere) exprimiert wird (Arighi et al. 2005). Verschiedene Liganden können an den Rezeptor

binden und eine komplexe Signalkaskade auslösen, die Einfluss auf die Proliferation,

Migration, Differenzierung und das Überleben der Zellen hat (Koch et al. 2005). Mutationen

auf dem oben genannten Chromosomenabschnitt führen zu einer Aktivitätszunahme des

Rezeptors und damit zur Tumorentstehung (Marx et al. 2005).

Eine weitere hereditäre Erkrankung, die mit der Entstehung von Phäochromozytomen

einhergeht, ist die autosomal-dominant vererbte Neurofibromatose 1 (NF 1). Die Prävalenz

dieser Krankheit liegt bei 1 zu 3.000 bis 1 zu 5.000 (Lammert et al. 2005, Poyhonen et al.

10

2005). Im Jahr 1990 gelang es erstmals, das NF1-Gen auf Chromosom 17q11.2 zu isolieren

(Cawthon et al. 1990, Viskochil et al. 1990, Wallace et al. 1990). Mutationen in diesem

Chromosomenbereich verursachen den Funktionsverlust von Neurofibromin, dem Produkt des

NF1-Gens (John et al. 2000, Serra et al. 2001). Neurofibromin ist ein GTPase aktivierendes

Protein, welches die Zellproliferation durch Beschleunigung der Inaktivierung von

Protooncogenen (z.B. p21ras) hemmt (Buchberg et al. 1990, Xu et al. 1990). Eine durch

Mutationen hervorgerufene Funktionsbeeinträchtigung von Neurofibromin führt zu

beschleunigtem Zellwachstum und Tumorentstehung (Basu et al. 1992, Bollag et al. 1996).

Die extrem vielgestaltige Krankheit ist durch das Auftreten von café-au-lait Flecken,

Neurofibromen, axillären und inguinalen Pigmentveränderungen sowie Lischknötchen

charakterisiert (Yohay 2006, Ferner et al. 2007). Darüber hinaus werden in 1-5% der Fälle

Phäochromozytome beobachtet (Bausch et al. 2006, Erem et al. 2007, Erlic et al. 2009).

In den letzten Jahren ist mit dem so genannten Paragangliomsyndrom (PGL) eine weitere

genetische Ursache für das Auftreten von Phäochromozytomen und familiären

Paragangliomen (extraadrenale Phäochromozytome) entdeckt worden. Durch Genanalysen

identifizierten Forscher 4 verschiedene Loci, die mit der Entstehung dieser Tumoren

assoziiert sind (Astuti et al. 2001, Heutink et al. 1992, Mariman et al. 1995, Niemann et al.

1999). Dementsprechend werden die PGL heute in PGL 1 bis PGL 4 unterteilt.

Im Jahr 2000 wiesen Baysal et al. erstmals nach, dass PGL 1 mit dem Gen der

Succinatdehydrogenase-Subunit D (SDHD) korrespondiert. Weitere Studien folgten, welche

die Übereinstimmung von PGL 3 mit dem SDHC-Gen und PGL 4 mit dem SDHB-Gen

zeigten (Astuti et al. 2001, Baysal et al. 2004). Das verursachende Gen von PGL 2 wurde

bisher noch nicht identifiziert. Insgesamt wurde jedoch nachgewiesen, dass dem gehäuften

Auftreten der genannten Tumoren bei einigen Familien Mutationen des Gens der

Succinatdehydrogenase (SDH) zu Grunde liegen. Die aus den Untereinheiten A bis D

bestehende SDH gehört zum mitochondrialen Komplex 2 der Atmungskette, auch bekannt als

Succinat-Ubichinon-Oxidoreduktase. Als ein wichtiger Bestandteil der Atmungskette stellt sie

die Verbindung zum Zitronensäurezyklus her. In bisher durchgeführten Studien zeigte sich,

dass Mutationen von SDHB, SDHC und SDHD zu einer Beeinträchtigung der Aktivität der

SDH führen (Gimenez-Roqueplo et al. 2001, Gimenez-Roqueplo et al. 2002). Ähnlich wie bei

der VHL-Erkrankung werden hierdurch hypoxiesensible Proteine aktiviert (u. a. HIF, VEGF),

die die Entstehung von stark vaskularisierten Paragangliomen und Phäochromozytomen

fördern (Pollard et al. 2005, Selak et al. 2005). Somit stellen die SDHB, SDHC und SDHD

typische Tumorsuppressorgene dar. Im Gegensatz dazu sind Mutationen der SDHA nicht mit

11

Paragangliomen und Phäochromozytomen assoziiert. Vielmehr werden Veränderungen dieses

Gens beim Leigh-Syndrom - einem kindlichen Enzephalomyopathiesyndrom - beobachtet

(Bourgeron et al. 1995, Birch-Machin et al. 2000).

1.3 Malignität des Phäochromozytoms

Die Prävalenz von malignen Phäochromozytomen wird im Allgemeinen mit circa 10%

angegeben, jedoch ist sie stark davon abhängig, ob eine genetische Grunderkrankung vorliegt

(Mannelli et al. 1999). In mehreren Studien wurde ein signifikant erhöhtes Risiko für das

Auftreten von malignen Phäochromozytomen bei SDHB-Mutationen nachgewiesen (Benn et

al. 2006, Timmers et al. 2007, Solis et al. 2009). Auf der anderen Seite sind die im Rahmen

von MEN 2, VHL, NF 1 und SDHD-Mutationen auftretenden Phäochromozytome zu über

90% benigne (Opocher et al. 2005, Van Houtum et al. 2005, Scholz et al. 2007).

Verschiedene biochemische, morphologische und molekulare Marker wurden untersucht, um

eine Differenzierung zwischen benignem und malignem Verhalten des Tumors vornehmen zu

können (Boltze et al. 2003, Guillemot et al. 2006, Willenberg et al. 2006). Bisher konnte

jedoch durch keinen dieser Parameter ein sicherer Ausschluss von Malignität erfolgen. Die

Bestimmung der Dignität des Phäochromozytoms ist damit weiterhin nur durch den Nachweis

lokaler Invasion oder entfernter Metastasen möglich, die sich bevorzugt in Lymphknoten,

Knochen, Leber und Lunge befinden (Huang et al. 2008). Zurzeit besteht keine Möglichkeit,

ein malignes Phäochromozytom effektiv zu heilen.

1.4 Geschichtlicher Abriss

Im Jahr 1886 beschrieb der deutsche Arzt Felix Fränkel erstmals einen bilateral auftretenden

Nebennierentumor bei einer mit 18 Jahren verstorbenen Frau, die über Palpitationen,

Übelkeit, Kopfschmerzen, Erbrechen und Verwirrtheit geklagt hatte (Fränkel 1886). Erst

kürzlich wurde von Neumann et al. (2007) nachgewiesen, dass diese Frau an einer MEN II

erkrankt war und somit Fränkel der Erstbeschreiber des Phäochromozytoms ist. Bereits 1908

wurde der Begriff Paragangliom als Ausdruck eines extraadrenal in den Ganglien

auftretenden Tumors geprägt (Alezais und Peyron 1908). Der Terminus Phäochromozytom

wurde 1912 von Ludwig Pick eingeführt, nachdem er das charakteristische Färbeverhalten

chromaffiner Zellen entdeckt hatte (Pick 1912). Im Jahr 1926 führten Cesar Roux in der

Schweiz und Charles H. Mayo in den USA die ersten erfolgreichen Operationen an

12

Phäochromozytompatienten durch (Saegesser 1984, Mayo 1924). Sie versuchten den Tumor

durch spezifische klinische Zeichen und explorative Laparotomien zu entdecken. In den

1940er Jahren und Anfang der 1950er Jahre wandten Wissenschaftler erstmals diagnostische

Tests an, die auf Histaminstimulation oder Phentolaminsuppression beruhten (Emlet et al.

1951, Roth und Kvale 1945). Diese Tests zeigten sich dahingehend als nachteilig, als dass sie

zum einen für den Patienten gefährlich waren und zum anderen sowohl falsch-positive als

auch falsch-negative Resultate ergaben. Eine wesentliche Verbesserung in der Diagnostik des

Phäochromozytoms kam im Laufe der 1950er und 1960er Jahre mit der Entwicklung neuer

biochemischer Tests auf. Pisano et al. (1960, 1962) gelang es, Vanillinmandelsäure (VMS)

und Metanephrine im Urin mit Hilfe spektrophotometrischer Messungen nachzuweisen.

Zusätzlich konnten von Euler et al. (1961) erstmals Urinkatecholamine fluorimetrisch

bestimmen. Durch verfeinerte Methoden der Katecholaminmessung und die

computergestützte Bildgebung, die in den 1970er und 1980er Jahren aufkam, gelang es, die

Diagnostik des Phäochromozytoms weiter zu verbessern. Heutzutage werden beim Verdacht

auf das Vorliegen eines Phäochromozytoms die Katecholamine und ihre Metabolite aus dem

Blut oder Urin bestimmt. Dazu wird meistens die HPLC, ein gaschromatographisches

Verfahren oder die Massenspektrometrie verwendet.

1.5 Physiologie des Katecholaminmetabolismus

In den Zellen des Nebennierenmarkes und in adrenergen, postganglionären

Nervenendigungen werden die Katecholamine synthetisiert. Aus Tyrosin entsteht durch

Hydroxylierung und Decarboxylierung Dopamin, welches dann aktiv in die chromaffinen

Granula des Nebennierenmarkes bzw. der postganglionären Neurone aufgenommen und

weiter zu Noradrenalin hydroxyliert wird. Durch Methylierung des Noradrenalins entsteht

Adrenalin. Die Katecholaminsekretion erfolgt exozytotisch, indem die Sekretgranula mit der

Zellmembran verschmelzen und ihren Inhalt nach außen abgeben. Adrenalin wird

hauptsächlich von den Zellen des Nebennierenmarkes in den Blutkreislauf abgegeben und

fungiert als Hormon in den Zielzellen. Dahingegen nimmt Noradrenalin vorwiegend die

Funktion eines Neurotransmitters ein, der von den Axonenden sympathischer

postganglionärer Neurone freigesetzt wird und direkt an den innervierten Zellen wirkt. Jedoch

kann es auch aus dem Nebennierenmark freigesetzt werden und dann hormonelle Funktionen

ausüben.

13

Wie in Abbildung 2 dargestellt, ist der Abbau der Katecholamine sehr komplex und findet in

verschiedenen Geweben des Körpers statt. Ein Weg des Katabolismus, den vor allem

Noradrenalin und in geringem Maß auch Adrenalin durchläuft, wird durch das Enzym

Monoaminooxidase (MAO) und eine Reduktase eingeleitet. Als erstes Zwischenprodukt

entsteht 3,4-Dihydroxyphenylglycol (DHPG). Dieser Abbauschritt findet häufig noch

innerhalb der Zelle statt, in dem die Katecholamine produziert wurden: zum Beispiel in den

sympathischen Nervenendigungen aber auch in den chromaffinen Zellen des

Nebennierenmarks. DHPG wird durch das Enzym Catechol-O-Methyltransferase (COMT)

weiter zu 3-Methoxy-4-Hydroxyphenylglycol (MHPG) verarbeitet, das seinerseits zu VMS

abgebaut wird. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass VMS vornehmlich in der Leber

produziert wird (Eisenhofer et al. 1996). Jedoch liegt der Anteil der direkt aus Noradrenalin

und Adrenalin gebildeten VMS nur bei 11%. Dagegen entstehen 87% der aus der Leber

stammenden VMS durch die hepatische Aufnahme und Umwandlung von MHPG und DHPG.

Damit ist nachgewiesen, dass der Katecholaminabbau nicht an einem Ort, sondern in

verschiedenen Organen des Körpers erfolgt.

Eine weitere Möglichkeit des Katecholaminabbaus besteht in der O-Methylierung durch

COMT. Vor allem im Blut zirkulierendes Adrenalin wird über diesen Weg abgebaut, da

Noradrenalin hauptsächlich bereits intraneuronal verstoffwechselt wird. Durch die O-

Abbildung 2 Abbauwege der Katecholamine. In Anlehnung an: Eisenhofer et al. 2003, Abkürzungen: COMT,

Catechol-O-Methyltransferase; MAO, Monoaminooxidase; AR, Aldose Reduktase; ADH,

Alkoholdehydrogenase; DHPGA, 3,4-Dihydroxyphenylglycolaldehyd; MN, Metanephrin; NMN,

Normetanephrin; DHPG, 3,4-Dihydroxyphenylgylcol; MHPG, 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol; VMS,

Vanillinmandelsäure

Adrenalin

MHPG

MN

MHPG

DHPG

DHPGA

VMS

VMS

NMN

VMS

MHPG

Noradrenalin

COMT COMT

COMT

MAO

MAO

ADH

AR

ADH

ADH

MAO

14

Methylierung entsteht aus Adrenalin Metanephrin (MN) und aus Noradrenalin

Normetanephrin (NMN). Das Enzym COMT ist in hohem Maß in der Leber und der Niere

exprimiert, jedoch wird nur ein geringer Teil der zirkulierenden Metanephrine tatsächlich von

ihnen produziert. Über 80% des im Blut vorhandenen NMN und über 90% des MN sind

bereits in den Herkunftsorganen o-methyliert worden. So kommen 91% des zirkulierenden

Plasma-MN und 23% des Plasma-NMN aus der Nebenniere selbst, hingegen nur 6% des

zirkulierenden Noradrenalins beziehungsweise 19% des Adrenalins (Eisenhofer et al. 1995).

Dadurch stellt die Nebenniere die größte natürliche Quelle der Metanephrine im menschlichen

Körper dar. Dies erklärt auch die immense Bedeutung der Metanephrine in der Diagnostik des

Phäochromozytoms. Die entstandenen Zwischenprodukte MN und NMN können entweder

direkt über die Niere ausgeschieden werden oder weiter zu VMS prozessiert werden. VMS ist

somit das Endprodukt beider Katecholaminabbauwege.

Zusätzlich besteht für den Körper mit Hilfe des vor allem im Dünndarm lokalisierten Enzyms

Sulfotransferase 1A3 die Möglichkeit, MHPG, MN, NMN und VMS zu sulfatieren und dann

über die Niere auszuscheiden (Rubin et al. 1996). Dieser Schritt reduziert jedoch die

Geschwindigkeit der Elimination und verlängert die Plasmahalbwertzeiten der einzelnen

Substanzen, so dass ihre Plasmakonzentrationen erheblich ansteigen (Goldstein et al. 2003).

Folglich liegt das Niveau der sulfatierten Metabolite 20fach bis 40fach über dem der freien

Metabolite.

1.6 Katecholaminmetabolismus beim Phäochromozytom

Das Phäochromozytom ist in der Lage, die in gesteigerter Menge produzierten Katecholamine

Noradrenalin und Adrenalin durch die Expression von COMT abzubauen und in MN bzw.

NMN umzuwandeln. Dadurch steigt zum einen die Konzentration von freien Metanephrinen

im Tumor selbst auf das 13.000fache bis 23.000fache des Plasmawertes an (Eisenhofer et al.

1998). Zum anderen wurde auch nachgewiesen, dass bei Phäochromozytompatienten über

94% der erhöhten Plasmametanephrine aus dem Phäochromozytom selbst stammen. Ursache

hierfür ist ein passiver Ausstrom von Katecholaminen aus intrazellulären Speichervesikeln

des Zytoplasmas mit folgendem aktivem Rücktransport oder Abbau zu freien Metanephrinen

und konsekutiver Abgabe in den Blutkreislauf. Dieser Prozess läuft kontinuierlich und

unabhängig von der Katecholaminsekretion des Tumors statt. In der Folge sind Erhöhungen

der freien Metanephrine im Plasma beständiger als die der Katecholamine bei Patienten mit

Phäochromozytom (Eisenhofer et al. 2000). Dadurch ist es möglich, ein Phäochromozytom

15

bei Patienten zu diagnostizieren, die nur einen geringen oder gar keinen Anstieg der Urin-

oder Plasmakatecholaminwerte haben.

Das Phäochromozytom kann neben der COMT auch MAO besitzen und folglich DHPG oder

MHPG sezernieren. Da diese beiden Metabolite jedoch schon beim physiologischen Abbau

der Katecholamine in hohen Mengen anfallen, stellen sie keine sensitiven Marker dar und

sind zur Diagnostik des Phäochromozytoms nicht geeignet. Darüber hinaus erklärt dies auch

den diagnostisch sehr eingeschränkten Nutzen von VMS, da dieses hautsächlich aus

zirkulierendem DHPG und MHPG entsteht.

1.7 Labordiagnostik des Phäochromozytoms

Durch das genaue Wissen sowohl um den physiologischen Katecholaminmetabolismus als

auch den Katecholaminabbau beim Phäochromozytom in Kombination mit verfeinerten

Nachweisverfahren, steht heutzutage ein breites Spektrum an biochemischer Diagnostik zur

Verfügung:

a) Katecholamine im 24-h-Urin:

Die Bestimmung der Urinkatecholamine kann bei der Differenzierung zwischen einem

Tumor oder einer angestiegenen Katecholaminfreisetzung bedingt durch nervale

Prozesse (z. B. Sport, Stress) hilfreich sein. Allerdings ist es durch eine Vielzahl an

physiologischen, pharmakologischen und pathologischen (z.B. Herzinsuffizienz,

Schock, Sepsis) Prozessen, die den Katecholaminspiegel beeinflussen, oftmals

schwierig, den definitiven Ursprung eines Katecholaminanstieges zu ermitteln (Bravo

2004). Darüber hinaus sezernieren Phäochromozytome Katecholamine periodisch, so

dass ein Bestimmen der Werte in einer stummen Phase erfolgen kann und ein falsch-

negatives Ergebnis nicht auszuschießen ist.

b) Bestimmung der totalen Urinmetanephrine im 24-h-Sammelurin:

Bei den totalen Urinmetanephrinen handelt es sich um die Summe aus freien und

Sulfat konjugierten Metanephrinen. Sie sind verhältnismäßig einfach zu bestimmen,

da ihre Konzentration bedingt durch eine langsame Elimination circa 20fach bis

30fach höher ist als die der freien Metanephrine. Der guten Spezifität der

Urinmetanephrine steht eine relativ geringe Sensitivität gegenüber. Ursache hierfür ist

16

die Tatsache, dass die Urinmetanephrine vor ihrer Bestimmung einen

Dekonjugationsschritt durchlaufen, bei dem aus Sulfat gebundenen Metanephrinen

freie Metanephrine gewonnen werden. Die Sulfat gebundenen Metanephrine werden

jedoch in vielen anderen Geweben, vor allem im Gastrointestinaltrakt gebildet

(Eisenhofer 2003c). Dadurch stellen die totalen Urinmetanephrine ein Gemisch von

Katecholaminmetaboliten dar, die aus unterschiedlichen Regionen des Körpers

stammen. Ein geringer Anstieg der durch ein Phäochromozytom gebildeten

Metanephrine ist hierdurch schwerer zu entdecken.

c) Einsatz von VMS im 24-h-Sammelurin:

Die Urin-VMS wird hauptsächlich aus DHPG und MHPG in der Leber gebildet. Diese

Metabolite entstammen vor allem dem Katecholaminabbau aus Nervenendigungen

sympathischer Neurone. Durch die physiologisch hohe Produktion von DHPG und

MHPG erklärt sich die relativ geringe Sensitivität der Urin-VMS (Widimsky 2006).

Ein Vorteil der Untersuchung mit VMS liegt jedoch in der hohen Spezifität des

Markers (Lenders et al. 2002a).

d) Serum-Chromogranin A:

Chromogranin A ist ein säurelösliches Protein, das ebenso wie andere Chromogranine

eine wichtige Funktion bei der Formation sekretorischer Granula übernimmt

(Taupenot et al. 2003). Es scheint vor allem in neuroendokrinen Zellen, unter anderem

auch in denen des Nebennierenmarks und sympathischer Nervenendigungen, bei der

Freisetzung von Hormonen und Katecholaminen von Bedeutung zu sein (Gorr et al.

1989, Bargsten et al. 1992, Watkinson et al. 1992). Durch die vielseitigen Funktionen

und das häufige Vorkommen des Chromogranin A in verschiedenen Geweben, ist es

ein relativ unspezifischer Marker für viele neuroendokrine Tumore (Nobels et al.

1997). Die Spezifität wird bei der Diagnostik des Phäochromozytoms zwischen 74%

und 99% angegeben. Ebenso liegt die Sensitivität des Chromogranin A bei 76% bis

95% (Canale et al. 1994, d´Herbomez et al. 2001, Cotesta et al. 2005, Giovanella et al.

2006). Ein Vorteil der Bestimmung des Chromogranin A liegt in der Tatsache, dass

der Plasmawert mit der Tumormasse des Phäochromozytoms korreliert und somit als

Verlaufsparameter genutzt werden kann (Grossrubatscher et al. 2006, Bilek et al.

17

2008). Ebenso beeinflussen zur Therapie des Phäochromozytoms genutzte

Medikamente wie Clonidin, Phentolamin oder Metoprolol den Wert des

Chromogranin A kaum. Deswegen wird von einigen Autoren empfohlen,

Chromogranin A als additiven Test vor allem bei der endokrinologischen

Differenzierung adrenaler Inzidentalome zu verwenden (Miehle et al. 2005).

Andererseits steigen die Plasmawerte des Chromogranin A bei Patienten mit

Niereninsuffizienz an, da es hauptsächlich renal eliminiert wird (Bernini et al. 2004).

e) Plasmakatecholamine:

Die Bestimmung der Plasmakatecholamine wird heutzutage nur noch selten

durchgeführt, da die Plasmakonzentration der Katecholamine vielen externen

Einflüssen (z.B. Position des Patienten bei der Blutentnahme, Stress) unterliegt.

Darüber hinaus wird die Bestimmung durch eine geringe Plasmahalbwertszeit

erschwert. Des Weiteren sezernieren manche Phäochromozytome nur geringe

Katecholaminmengen oder geben diese nur periodisch ab, so dass sie biochemisch

unauffällig bleiben. Dadurch wird die Sensitivität zwischen 70% und 84% angegeben.

Die Spezifität liegt bei 69% bis 81% (Lenders et al. 2002, Unger et al. 2006).

f) Freie Plasmametanephrine:

Obwohl die Metanephrine schon seit vielen Jahren als Abbauprodukte im

Katecholaminstoffwechsel bekannt sind, ist es erst Mitte der 1990er Jahre gelungen, einen

verlässlichen Test zu entwickeln, der die freien Plasmametanephrine (das ist das

unkonjugierte Nor-, Metanephrin) nachweist. Seitdem wurde in verschiedenen Studien die

hohe Sensitivität und Spezifität der Plasmametanephrine mit Werten zwischen 96% und 100%

bzw. 79% und 89% belegt (Lenders et al. 2002, Hickman et al. 2009). Ein Grund hiefür liegt

in dem speziellen Katecholaminmetabolismus des Phäochromozytoms (siehe oben). Wie

Abbildung 3 illustriert, existiert die Möglichkeit, die Metanephrine als totale Metanephrine

(Summe von NMN und MN) zu messen. Darüber hinaus werden auch die fraktionierten

Metanephrine (getrennte Bestimmung von MN und NMN) analysiert. Des Weiteren können

Plasmametanephrine in der freien oder in der sulfatierten Form gemessen werden. Die

sulfatkonjugierten Metanephrine liegen im Plasma in 20-30fach höherer Konzentration vor,

18

weil sie langsam und ausschließlich renal eliminiert werden. Dadurch steigt ihre

Konzentration im Plasma bei renaler Funktionsbeeinträchtigung sehr schnell an.

Die gebräuchlichste Methode zur Diagnose eines Phäochromozytoms ist derzeit die

Bestimmung der Katecholamine und ihrer Abbauprodukte- den Metanephrinen und VMS- im

24-Stunden-Urin. In den meisten Fällen ist mit Hilfe dieser Methoden eine korrekte Diagnose

möglich. So liegt die Sensitivität für Urinkatecholamine zwischen 74% und 90%, für totale

Urinmetanephrine zwischen 65% und 77%, für VMS im Urin zwischen 47% und 64%. Die

Spezifität wird für Urinkatecholamine zwischen 88% und 99%, für totale Urinmetanephrine

zwischen 93% und 99% und für Vanillinmandelsäure im Urin zwischen 95% und 100%

angegeben (Eisenhofer et al. 1999, Raber et al. 2000, Lenders et al. 2002a, Kudva et al. 2003).

Abbildung 3 Möglichkeiten der Katecholamin- und Metanephrinbestimmung. In Anlehnung an

Eisenhofer et al. 2004. Abkürzungen: COMT, Catechol-O-Methyltransferase; SULT1A3,

Sulfotransferase Isoenzym Typ 1A3

COMT

Adrenalin

sulfatkonju-

gierte Meta-

nephrine

totale Meta-

nephrine

freie Meta-

nephrine

freie Katechol-

amine

SULT1A3

Normetanephrin

Metanephrin

Metanephrin-

sulfat

Normetanephrin-

sulfat

Noradrenalin

19

2 Zielstellung

Die biochemische Diagnostik des Phäochromozytoms stützte sich bis Anfang der 1980er

Jahre auf die Messung verschiedener Parameter im menschlichen Urin. Es wurden vor allem

fluorimetrische, colorimetrische oder gaschromatographische Methoden verwandt. Mit der

Einführung der HPLC wurde es möglich, diese Metabolite auch im Blut zu bestimmen. Das

Ziel dieser Studie war es, die sensitive und zugleich spezifische Messung von freien

Metanephrinen im Blut mit einem RIA (Firma Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG,

Nordhorn, Deutschland) nachzuweisen und dieses Verfahren gleichzeitig mit bisherigen

Methoden zu vergleichen.

Die Fragestellungen an diese Studie lassen sich stichpunktartig wie folgt zusammenfassen:

1. Ist die Anwendung des RIA zur Bestimmung der freien Metanephrine im Plasma

sensitiv und spezifisch, um in der Routinediagnostik des Phäochromozytoms

eingesetzt werden zu können?

2. Welche Vor- und Nachteile hat der RIA im Vergleich zu bisher angewandten

Methoden?

3. Ist eine Beeinflussung der Plasmakonzentration der freien Metanephrine mittels RIA

durch Grunderkrankungen der Patienten wie arterielle Hypertonie, Niereninsuffizienz

oder Diabetes mellitus möglich?

4. Eignet sich der RIA zum postoperativen Follow-up bei Patienten mit

Phäochromozytom?

5. Gibt es eine Korrelation der Plasmametanephrinwerte mit dem Lebensalter bei

Patienten mit klinisch nicht nachgewiesenem Phäochromozytom?

20

3 Patientencharakteristika und Methoden

3.1 Patientencharakteristika

Zwischen den Jahren 2000 bis 2006 untersuchten wir 163 Patienten, die sich in ambulanter

oder stationärer Behandlung befanden, mit Hilfe eines Radioimmunoassays auf das

Vorhandensein eines Phäochromozytoms. Das mediane Alter lag bei 60 Jahren (Bereich 16-

88 Jahre). In Abbildung 4 sind die Charakteristika der untersuchten Patienten zu sehen.

Abbildung 4 Charakteristika von 163 untersuchten Patienten. Abkürzungen: MEN II, Multiple Endokrine

Neoplasie II; NF1, Neurofibromatose I; SSRI, selektive Serotonin-reuptakeinhibitoren

Patientencharakteristika Anzahl Prozent

Patientenzahl 163

Geschlecht m 59

w 104

Alter 16-29 13

30-59 65

60-88 85

Charakteristika

Hypertonie

keine Hypertonie 36/163 22,09%

Hypertonie Stadium I 41/163 25,15%

Hypertonie Stadium II 46/163 28,22%

Hypertonie Stadium III 40/163 24,54%

vegetative Symptome

keine Symptome 95/163 58,28%

Schwitzen 18/163 11,04%

Angina pectoris 17/163 10,43%

Kopfschmerzen 14/163 8,59%

Palpitationen 14/163 8,59%

Schwindel 13/163 7,98%

Übelkeit 7/163 4,29%

Sehstörungen 8/163 4,91%

Flush 8/163 4,91%

Synkope 5/163 3,07%

akutes Lungenödem 2/163 1,23%

Nebennieren-Raumforderung 30

Hochrisikogruppe

MEN II 10

NF 1 2

Medikation

keine Antihypertensiva 27/163 16,56%

1-fach-Kombination 18/163 11,04%

2-fach-Kombination 33/163 20,25%

3-fach-Kombination 28/163 17,18%

4-fach-Kombination 33/163 20,25%

5-fach-Kombination 21/163 12,88%

6-fach-Kombination 3/163 1,84%

Trizyklische Antidepressiva 3/163 1,84%

SSRI 3/163 1,84%

Benzodiazepine 2/163 1,23%

Neuroleptika 2/163 1,23%

21

Die initialen Plasma- und Urinmessungen wurden bei 12 Patienten im Rahmen eines

Screenings auf ein Phäochromozytom durchgeführt, da bei ihnen eine familiäre Anamnese

von MEN II beziehungsweise NF 1 bekannt war oder sie bereits an einem Phäochromozytom

oder Paragangliom operiert worden waren. Darüber hinaus erfolgte die biochemische Analyse

auf Grund eines Hypertonus (refraktär, paroxysmal, neu aufgetreten, Blutdruckspitzen) oder

vegetativen Symptomen. Am häufigsten traten hierbei Schweißausbrüche, Angina pectoris,

Kopfschmerzen und Palpitationen auf. Zusätzlich waren Schwindel, Synkopen, Übelkeit,

Sehstörungen, Flush und ein akutes Lungenödem zu beobachten. Die klassische Trias

bestehend aus Palpitationen, Kopfschmerz und Schwitzen gaben lediglich 4 Patienten an. Die

meisten der Patienten mit Bluthochdruck in unserer Untersuchung erhielten eine

antihypertensive Therapie mit 1 bis 3 Medikamenten (48,47%). Allerdings war bei 34,97%

der Patienten eine 4- bis 6-fach-Kombination nötig, um eine optimale Einstellung des

Hypertonus zu erzielen.

a) Patienten mit Phäochromozytom

Insgesamt wurde in diesen Jahren bei 8 Patienten ein Phäochromozytom diagnostiziert. Die

initiale laborchemische und bildgebende Diagnostik erfolgte bei 7 der 8 Patienten im

Universitätsklinikum Leipzig. Auf Grund der niedrigen Fallzahl wurde eine

Phäochromozytompatientin aus dem Spital Bern Tiefenau/Schweiz mit in die Analyse

eingeschlossen. Mit Ausnahme der Auswertung der Plasmametanephrine mit Hilfe des RIA

wurde die gesamte Diagnostik und Therapie dieser Patientin in der Schweiz durchgeführt.

Von den 8 diagnostizierten Phäochromozytomen waren 7 benigne und 1 maligne. Bei 2

Patienten traten die Tumoren im Rahmen eines familiären Syndroms auf (MEN 2 A,

Neurofibromatose Typ I). Die Patientin mit bekannter Neurofibromatose Typ I und Zustand

nach Adrenalektomie bei Phäochromozytom erlitt ein Rezidiv des Tumors mit Metastasen im

Skelettsystem und in der Lunge im Sinne eines malignen Phäochromozytoms (Koch et al.

2006). Bei der Patientin mit MEN 2 A wurde ebenfalls ein Rezidiv nach vorheriger

beidseitiger Adrenalektomie vor 10 Jahren auf Grund eines Phäochromozytoms

diagnostiziert. Die Primärtumoren waren bei allen 8 Patienten adrenal lokalisiert. Alle

Katecholamin produzierenden Tumoren wurden histologisch untersucht und bestätigt.

22

3.2 Methoden

3.2.1 Radioimmunoassay für Plasmametanephrine

Die RIA KITS wurden von Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG (Nordhorn,

Deutschland) hergestellt.

Blutproben der Patienten

Es wurden Blutproben von den Patienten in Lithium-Heparin-Röhrchen entnommen. Die

Blutentnahme erfolgte ohne die Verwendung einer Venenverweilkanüle. Auf das Einhalten

einer nächtlichen Diät oder das Absetzen von Medikamenten wurde verzichtet. Das Plasma

konnte durch Zentrifugation (3,000 x g) separiert und bei -20°C bis zur Verwertung

aufbewahrt werden.

Radioimmunoassay für freie Metanephrine und Normetanephrine

Die Proteinmatrix der Plasmaproben wurde durch spezielle Präzipitationsreagenzien entfernt

und die Metanephrine aus dem Überstand entnommen. Da diese keine suffizienten

immunogenen Strukturen aufweisen, die es erlauben Antikörper dagegen herzustellen, wurden

sie zu ihren N-acetyl-derivaten acetyliert.

Der Assay folgt den grundlegenden Prinzipien eines Radioimmunoassays, basierend auf der

Konkurrenz von radioaktiven und nichtradioaktiven Antigenen um eine fixe Anzahl von

Antikörperbindungsstellen. Die Menge an 125-I-markiertem Antigen, gebunden an die

Antikörper, ist umgekehrt proportional zur Analysekonzentration der Plasmaprobe. Wenn das

System im Äquilibrium ist, wird die antigengebundene Radioaktivität separiert, indem man

einen zweiten Antikörper und Polyethylenglykol (PEG) benutzt. Die Messung des nach der

Zentrifugation gewonnenen Präzipitates erfolgt im Gammazähler. Eine Quantifikation

unbekannter Proben wird erreicht, indem man deren Aktivität mit einer Referenzkurve

vergleicht, die durch Messen von Standards mit bekannten Konzentrationen erhalten wurde.

Die in diesem Test verwendeten Antiseren erkennen nur die biologisch relevanten L-Formen

der Metanephrine.

23

Testablauf

a) Vorbereitung der Reagenzien

Die Standards und Kontrollen wurden mit jeweils 1,25 ml destilliertem Wasser verdünnt. 80

µl konzentrierter Acetylierungsreagenz wurden mit 3 ml destilliertem Wasser verdünnt.

b) Präzipitation von Standards, Plasmaproben und Kontrollen

500 µl von Standards, Plasmaproben und Kontrollen wurden in die Präzipitationsröhrchen

gefüllt. Hinzugefügt wurden 50 µl Präzipitator 1 und 50 µl Präzipitator 2. Nach vorsichtigem

Mixen (Vortex) erfolgten eine 60-minütige Inkubation und anschließend die Zentrifugation

bei 3000 x g. Vom Überstand wurde 100 µl für die Bestimmung der MN und 25 µl für die

Bestimmung der NMN entnommen.

c) Radioimmunoassay

100 µl destilliertes Wasser wurden zur Bestimmung der nichtspezifischen Bindungen (NSB)

in jedes Röhrchen pipettiert. Danach wurden 100 µl der Überstände von Standards,

Plasmaproben und Kontrollen in die entsprechenden Röhrchen gefügt. Anschließend erfolgte

die Zugabe von 25 µl Acetylierungspuffer in alle Röhrchen. Danach wurden 25 µl verdünnte

Acetylierungsreagenz in jedes Röhrchen pipettiert. Hierauf wurde sorgfältig gemixt und für

15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nun wurden 50 µl des 125-I-MN- bzw. 125-I-

NMN-Tracers in alle Röhrchen pipettiert. Hieran schloss sich die Zugabe von 50 µl des MN-

bzw. NMN-Antiserums, das Mixen und einminütige Zentrifugieren bei 500 x g. Dies diente

dem Entfernen aller sich an der Innenseite der Röhrchen befindlichen Tropfen. Nach einer

nächtlichen Inkubationszeit von 15 bis 20 Stunden bei 2 bis 8°C folgten das vorsichtige

Mixen des Präzipitationsreagenz und das Pipettieren von jeweils 1ml in alle präzipierten

Reagenzien. Daraufhin wurde erneut mit dem Schüttler gemixt und 15 Minuten bei 2 bis 8°C

inkubiert. Anschließend erfolgte die Zentrifugation mit 3000 x g über 15 Minuten. Der

Überstand wurde vorsichtig abgegossen oder aspiriert. Die Flüssigkeitsreste wurden

ausgeschlagen, wozu man die Röhrchen 2 Minuten auf dem Kopf stehen ließ. Den Abschluss

des RIA bildete das Zählen der Röhrchen mit dem Gammazähler.

24

Kalkulation der Resultate

Die Kalkulation der Resultate erfolgte mit dem Computerprogramm LBIS 501 von Berthold.

Der Counts-per-minute (CPM)-Mittelwert der nichtspezifischen Bindung wurde vom CPM-

Mittelwert der Nullreferenz (= Standard A), Standard B bis F, Kontrolle 1 und 2 sowie den

Patientenproben subtrahiert. Anschließend wurde eine Standardkurve konstruiert, indem der

prozentuale CPM-Wert jeder Standardprobe im Verhältnis zum CPM-Wert der Nullreferenz

(y-Achse, linear) gegen die entsprechende Konzentration (x-Achse, logarithmisch)

aufgetragen wurde [(B-NSB)/(B0-NSB) in %]. Aus diesen Standardkurven konnte daraufhin

die Metanephrin- und Normetanephrinkonzentration der Kontrollen und Patientenproben

abgelesen werden. Für die Messung wurde der Gamma-Counter LB 2111 der Firma Berthold

verwendet.

Reproduzierbarkeit

Die Reproduzierbarkeit des RIA wurde durch Bestimmung des Inter- und Intraassay-

Variationskoeffizienten ermittelt. Durch wiederholte Messungen zweier Proben mit

unterschiedlichen Konzentrationen von Metanephrin und Normetanephrin konnten

Variationskoeffizienten von 15% bis 4,2% für Metanephrin bzw. 16,9% bis 3,6% für

Normetanephrin ermittelt werden.

Qualitätskontrolle

In jedem Assay inbegriffen waren 2 Kontrollproben, die von LDN GmbH & Co. KG

(Nordhorn, Deutschland) gestellt wurden.

3.2.2 Ermittlung eines Grenzwertes für Plasmametanephrine mittels Radioimmunoassay (RIA) der Firma LDN GmbH & Co. KG

Auf Grund dessen, dass uns in der Anfangsphase unserer Arbeit keine validierten

Referenzwerte für den RIA zur Verfügung standen, orientierten wir uns an den von Unger et

al. (2004) in einer klinischen Studie ermittelten Grenzwerten für Normetanephrin und

Metanephrin. In dieser Studie wurden 119 Patienten untersucht, von denen 17 ein histologisch

nachgewiesenes Phäochromozytom aufwiesen. Es wurden Grenzwerte von 123 pg/ml für

NMN und 96 pg/ml für MN verwendet. Die Sensitivität und Spezifität gaben Unger et al. mit

25

58,8% und 97,1% für Plasma-MN bzw. 94,1% und 97,1% für Plasma-NMN an. Für die

Validierung eigener Grenzwerte, untersuchten wir von 163 Patienten die ersten 50, bei denen

ein Phäochromozytom durch bildgebende Verfahren nahezu ausgeschlossen wurde (wenn

man von solchen Patienten absieht, die Paragangliome/extraadrenale Phäochromozytome

haben, welche (noch) keine erhöhte Katecholaminsekretion zeigen). Zur bildgebenden

Diagnostik wurden CT, MRT, Sonographie und Metajodobenzylguanidin-Szintigraphie

(MIBG) -Szintigraphie verwandt. Die klinischen Charakteristika der Patienten sind in

Abbildung 5 illustriert.

Die NMN-Werte lagen bei allen 50 Patienten unter dem von Unger et al. verwendeten

Grenzwert (s. Abb. 6). Der Median der Plasma-NMN-Werte wurde mit 40,70 pg/ml

gemessen, der Wert des 3. Quartils ergab 64,10 pg/ml. Die MN-Werte waren bei 49 der 50

Patienten unterhalb des Grenzwertes von Unger et al. Der Median der MN wurde mit 23,9

pg/ml gemessen, der Wert des 3. Quartils ergab 34,60 pg/ml. Bei einem Patienten wurde mit

Patientencharakteristika

Anzahl

Geschlecht m 19

w 31

Alter 16-29 7

30-59 21

60-99 22

Blutdruck Normotonie 6

Hypertonie Stadium I 13

Hypertonie Stadium II 18

Hypertonie Stadium III 13

Medikation keine Antihypertensiva 9

1-fach-Kombination 5

2-fach-Kombination 6

3-fach-Kombination 10

4-fach-Kombination 11

5-fach-Kombination 8

6-fach-Kombination 1

Nierenfunktion unauffällig 44

Niereninsuffizienz St. I 3

Niereninsuffizienz St. II 1

Niereninsuffizienz St. III 2

Niereninsuffizienz St. IV 0

Abbildung 5 Charakteristika der Patienten zur Validierung der Grenzwerte

26

140pg/ml ein erhöhtes Metanephrin im Plasma gemessen. Dieser Patient war an einem

Lungenkarzinom erkrankt und wies eine Nebennierenvergrößerung auf. Nach CT-gestützter

Punktion und histologischer Begutachtung war diese Veränderung gut mit einer Metastase des

Lungenkarzinoms vereinbar. Insgesamt wurde bei Anwendung der von Unger et al.

verwendeten Grenzwerte ein falsch-positives Ergebnis bestimmt.

Wir übernahmen daher die bestätigten Grenzwerte und wandten diese in den folgenden

Untersuchungen an.

3.2.3 Radioimmunoassay für Serum-Chromogranin A

Zur Messung von Chromogranin A im Serum wurde ein Sandwich-Immunoassay mit 125-I-

Markierung und zwei monoklonalen Antikörpern verwendet (CGA-RIA-CT; Cis Bio

International, Gif-sur-Yvette, Frankreich). Im Rahmen der Kalibrierung wurde humanes

rekombinantes Chromogranin A genutzt. Der vom Hersteller empfohlene Referenzbereich

liegt bei < 100 µg/l.

Abbildung 6 Plasmametanephrine bei 50 Patienten mit klinischem Verdacht jedoch ohne Nachweis eines

Phäochromozytoms zur Validierung der Grenzwerte von NMN und MN

Normetanephrin

Pla

sm

ako

nze

ntr

atio

n (

pg

/ml)

0

20

40

60

80

100

120

140

Metanephrin

Pla

sm

ako

nzn

etr

atio

n (

pg

/ml)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Grenzwert

Grenzwert

27

3.2.4 HPLC für Plasma-, Urinmetanephrine und Urinkatecholamine

Wir ließen zusätzlich zu dem RIA bei einigen Patienten eine Vergleichsuntersuchung der

Plasmametanephrine mittels HPLC als Goldstandard der Plasmametanephrinmessung zur

weiteren Validierung unserer Ergebnisse durchführen. Die HPLC stellt ein Trennverfahren

dar, bei dem Probengemische untersucht werden, indem man sie in ihre einzelnen

Bestandteile auftrennt. Basis der Auftrennung der Proben ist die unterschiedliche Verteilung

der Probenbestandteile in zwei Phasen (flüssige und stationäre Phase). Das zu analysierende

Gemisch wird mittels der flüssigen Phase unter hohem Druck über die stationäre Phase

transportiert, wobei die Auftrennung durch unterschiedlich starke Wechselwirkungen mit der

stationären Phase erreicht wird. Die Analyse der einzelnen Bestandteile erfolgt nach dem

Austritt aus der stationären Phase mittels eines geeigneten Detektors. Die Bestimmung der

Plasmametanephrine wurde freundlicherweise von Prof. Lenders/Nijmwegen durchgeführt

und erfolgte nach dem bereits von ihm beschriebenen Verfahren (Lenders et al. 1993). Die

Grenzwerte betrugen 600 pmol/l für NMN und 300 pmol/l für MN.

Die Bestimmung der Urinmetanephrine und –metanephrine erfolgte ebenfalls mittels HPLC

der Firma Biorad. Die Testkits wurden von Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH

(München) hergestellt.

3.3 Diagnostischer Ablauf

Nach der Validierung eines eigenen Grenzwertes für Plasmanormetanephrin und –

metanephrin mittels RIA bei 50 konsekutiven Patienten mit durch bildgebende Verfahren

nahezu ausgeschlossenem Phäochromozytom, bestimmten wir bei 113 weiteren Patienten die

Metanephrine im Plasma. Ein falsch-positives Ergebnis eines Plasmametanephrintests von

Patienten ohne Phäochromozytom wurde definiert durch Werte von Metanephrin oder

Normetanephrin, die dem Grenzwert entsprachen oder über ihm lagen. Ein falsch-negatives

Testergebnis eines Plasmametanephrintests von Patienten mit Phäochromozytom wurde

definiert durch Werte von Metanephrin und Normetanephrin, die unter dem entsprechenden

Grenzwert lagen.

Wir führten eine weiterführende bildgebende Diagnostik bei denjenigen Patienten durch, bei

denen erhöhte Plasmametanephrinwerte festgestellt wurden (s. Abb. 7). Bei

altersentsprechenden Metanephrinen im Plasma wurden keine zusätzlichen Untersuchungen

eingeleitet.

28

Zur Validierung und Sicherung der Ergebnisse, die durch die Bestimmung der Metanephrine

im Plasma erzielt wurden, untersuchten wir die Patienten zusätzlich auf erhöhte Werte von

Chromogranin A im Serum bzw. von Katecholaminen und Metanephrinen im 24-h-

Sammelurin. Des Weiteren untersuchten wir die Stabilität der Plasmametanephrine, indem

wir zum einen Mehrfachbestimmungen dieser Parameter durchführten und zum anderen der

Frage nachgingen, inwieweit eine Altersabhängigkeit der Werte vorliegt

Abbildung 7 Diagnostisches Prozedere bei 163 Patienten mit Verdacht auf bzw. zum Ausschluss eines

Phäochromozytoms

3.4 Statistische Verfahren

Bei der Auswertung der Daten wurde eine deskriptive Statistik angewandt. Als Kenngrößen

dienten Lagemaße (Median, Quantile) und Streuungsmaße (Variationsbreite/Spannweite).

Eine Ausnahme ist die Untersuchung der Metanephrine in Abhängigkeit vom Lebensalter der

untersuchten Personen, da hier eine Regressionsanalyse nach Spearman durchgeführt wurde.

163 Patienten

50 Patienten zur Validierung eines Referenzwertes

113 Patienten zum Ausschluss eines Phäochromozytoms

erhöhtes MN / NMN unauffälliges MN / NMN

CT / MRT

negativ

positiv

Szintigraphie keine weitere Diagnostik

positiv negativ

OP / Histologie

29

4 Ergebnisse

4.1 Bestimmung der Plasmametanephrine mit Radioimmunoassay (RIA)

Unter Verwendung der in Abschnitt 3.2.2 bestätigten Referenzwerte untersuchten wir 113

Patienten durch Bestimmung der Plasmametanephrine auf das Vorhandensein eines

Phäochromozytoms. Wie in Abbildung 8 illustriert ist, wurden bei 14 Patienten erhöhte Werte

für Normetanephrin und/oder Metanephrin im Plasma detektiert. Die daraufhin initiierte

Bildgebung mittels CT, MRT und MIBG-Szintigraphie bestätigte den Verdacht eines

Phäochromozytoms bei 8 der 14 Patienten. Diese Diagnose konnte ebenso histologisch

gesichert werden. In der bildgebenden Diagnostik der anderen 6 Patienten zeigten sich 4

unauffällige CT-Untersuchungen sowie 2 Befunde, die mit einem Nebenniereninzidentalom

(bei unauffälliger MIBG-Szintigraphie) bzw. einer Metastase eines Lungenkarzinoms

vereinbar waren. Somit konnte bei 8 der 113 untersuchten Patienten ein Phäochromozytom

sowohl laborchemisch mittels Bestimmung der Plasmametanephrine als auch histologisch

nachgewiesen werden. Bei 105 Patienten wurde dieser Tumor nicht festgestellt.

Abbildung 8 Charakteristika von 14 Patienten mit Erhöhung der Plasmametanephrine. Abk.: Pat, Patient, A,

Adrenalin, NA, Noradrenalin, Chr. A, Chromogranin A, CT, Computertomographie, MRT, Magnetresonanz-

tomograpie, Szinti, MIBG-Szintigraphie, RF, Raumforderung, Mx, Metastase. Grenzwerte: RIA-NMN <123

pg/ml, MN <96 pg/ml, A < 109 nmol/d, NA <620 nmol/d, Urin-NMN <2424 nmol/l, MN < 1729 nmol/l, Chr. A

<100 µg/l

Die Ergebnisse der Plasmametanephrinbestimmungen der 113 Patienten sind in Abbildung 9

dargestellt: der Median für NMN liegt bei 49,5 pg/ml, der Median für MN wurde mit 32

Pat NMN MN A NA NMN MN Chr. A CT / MRT Szinti Phäo

1 1889 2450 3806 3147 27931 29655 - RF pos. +

2 462 149 100 539 2869 178567 - Mx pos. +

3 51 168 77 287 6312 2237 185 RF pos. +

4 845 1821 1827 903 55724 15200 3880 RF pos. +

5 143 68 45 1793 510 10210 - RF pos. +

6 106 109 25 175 2707 1724 517 RF pos. +

7 1311 63 0 6995 945 45743 - RF pos. +

8 1357 420 483 2163 8893 24932 1150 RF pos. +

9 56 176 23 110 1109 533 58 unauff. - -

10 66 123 44 281 1391 372 83 Mx Mx -

11 20 98 74 225 958 622 - unauff. - -

12 165 130 0 65 2293 546 - unauff. - -

13 75 282 10 130 1452 242 188 RF unauff. -

14 91 258 - - - - - unauff. - -

RIAKatecholamine

im 24-h-UrinMN im 24-h-Urin Bildgebung

30

pg/ml ermittelt. Der Wert des 3. Quartils von NMN ergab 68,4 pg/ml während der Wert des 3.

Quartils von MN bei 46,2 pg/ml lag.

Insgesamt wurden 12 MN- und 7 NMN- Werte festgestellt, die den zugehörigen oberen

Referenzwert überschritten. Dabei entfielen jeweils 6 der 7 NMN-Werte und 6 der 12 MN-

Werte auf Patienten mit einem Phäochromozytom. Die NMN-Werte dieser Patienten

überschritten den zugehörigen oberen Referenzwert um das 1,2fache bis 15,3fache (s.

Abbildung 10). Die MN-Bestimmungen der Phäochromozytompatienten lagen um das

1,1fache bis 25,5fache oberhalb des Referenzbereiches. Insgesamt wurden sowohl bei der

Messung des Plasma-NMN als auch bei der Messung des Plasma-MN 2 falsch-negative

Werte bestimmt. Die Sensitivität für NMN und MN lag jeweils bei 75,0%. Jedoch waren bei

den falsch-negativen NMN-Messungen die MN im Plasma deutlich erhöht und umgekehrt, so

dass bei der zusammengefassten Betrachtung der Plasmametanephrine keine falsch-negativen

Ergebnisse zu verzeichnen waren und die Sensitivität folglich bei 100% lag.

Bei 6 der insgesamt 105 Patienten ohne nachgewiesenes Phäochromozytom wurde ein falsch-

positives Testergebnis festgestellt, wobei 5 Patienten isoliert erhöhte MN-Werte aufwiesen.

Von diesen 5 Patienten waren 3 stationär wegen rezidivierender hypertensiver Entgleisungen

bei bestehender arterieller Hypertonie und 5-6facher antihypertensiver Therapie. Zusätzlich

litt 1 Patient an einer chronischen Niereninsuffizienz mit einer glomerulären Filtrationsrate

Grenzwert

NMN

Pla

sma

no

rme

tane

ph

rin

(p

g/m

l)

0

500

1000

1500

2000

MN

Pla

smam

eta

nephrin (

pg/m

l)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Grenzwert

Abbildung 9 Plasmakonzentration von Metanephrin und Normetanephrin mit RIA bei 113 Patienten mit

klinischem Verdacht auf Phäochromozytom

31

(GFR) von 11 ml/min. Bei 2 der 5 Patienten war eine Nebennierenraumforderung mit

gleichzeitiger arterieller Hypertonie bekannt, die mit 2 bzw. 3 Antihypertensiva therapiert

wurde. Ein Patient hatte sowohl ein erhöhtes Plasma-MN als auch einen NMN-Wert, der über

dem Referenzwert lag. Dieser Patient war neben einer malignen Hypertonie mit

Blutdruckwerten über 200 systolisch trotz antihypertensiver Therapie an einer

Niereninsuffizienz Stadium V erkrankt, die eine Dialysepflichtigkeit notwendig machte.

Somit ergab sich für NMN eine Spezifität von 99,0% und für MN eine Spezifität von 94,3%.

In der Gesamtbetrachtung betrug die Spezifität für Plasmametanephrine mit RIA 94,3%.

4.2 Vergleich der Plasmametanephrine bei Patienten mit Phäochromozytom prä- und postoperativ mit RIA

Präoperative und postoperative Plasmametanephrinmessungen wurden bei jeweils 7 von 8

Patienten mit einem Phäochromozytom durchgeführt (s. Abbildung 11 und 12). Bei einer

Patientin mit malignem Phäochromozytom bei NF 1 und Zustand nach Adrenalektomie waren

nur Werte vor und nach Initiierung der Chemotherapie zu erheben (Koch et al. 2006).

Abbildung 10 Plasmakonzentration der Metanephrine bei 8 Patienten mit Phäochromozytom mit RIA

Normetanephrin

Pla

sm

akon

zen

tration (

pg/m

l)

0

500

1000

1500

2000

Metanephrin

Pla

sm

akon

zen

tration (

pg/m

l)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

GrenzwertGrenzwert

32

a) Normetanephrin

Wie in Abschnitt 4.1 dargestellt, ermittelten wir bei 5 der 7 Phäochromozytompatienten

erhöhte NMN-Werte vor der Adrenalektomie. Bei 3 der 5 Patienten kam es zu einem

postoperativen Abfall des NMN unter den oberen Referenzwert. Bei einem Patienten

verringerte sich der Plasmawert des NMN nur gering und blieb weiterhin deutlich über dem

Grenzwert. Zusätzlich stiegen bei diesem Patienten die präoperativ normalen MN auf einen

postoperativ erhöhten Wert an und in der MIBG-Szintigraphie zeigte sich eine pulmonale

Mehranreicherung. Im daraufhin durchgeführten CT des Thorax ließ sich eine Verdichtung im

linken Unterfeld der Lunge darstellen, die jedoch keine radiologischen Malignitätskriterien

aufwies. In Anbetracht des im weiteren Follow-up unauffälligen klinischen Verlaufes war

diese Veränderung am ehesten als Verschwielung anzusehen.

Eine Patientin wies postoperativ ein zwar gesunkenes jedoch weiterhin geringgradig erhöhtes

NMN auf. Zwei Patienten, bei denen präoperativ ein falsch-negativer NMN-Wert bestimmt

worden war, hatten auch nach der Adrenalektomie normale Plasmawerte. Klinisch war jedoch

bei beiden Personen eine eindeutige Besserung insbesondere bezüglich des hypertensiven

Blutdruckes zu verzeichnen, so dass die antihypertensive Therapie auf 1 bzw. 2 niedrig

dosierte Medikamente reduziert werden konnte. Bei der Patientin mit malignem

Bild 11 Plasmanormetanephrin bei 7 Phäochromozytompatienten prä- und postoperativ mit RIA

Grenzwert

NMN prä-op NMN post-op

Pla

sm

an

orm

eta

ne

ph

rin

(p

g/m

l)

0

500

1000

1500

2000

33

Phäochromozytom waren nach Beendigung der Chemotherapie die vormals bereits erhöhten

NMN-Werte nochmals angestiegen.

b) Metanephrin

Wir ermittelten bei 5 von 7 Phäochromozytompatienten ein präoperativ erhöhtes MN. Wie in

Abbildung 10 zu sehen ist, fielen die MN postoperativ bei allen jenen Patienten auf einen

Wert unterhalb des oberen Grenzwertes. Dahingegen zeigte sich bei dem oben beschriebenen

Patienten nach präoperativ unauffälligem MN ein postoperativ erhöhtes MN. Bei einer

Patientin mit präoperativ normalem MN konnten keine postoperativen Werte erhoben werden.

Die MN-Werte der Patientin mit malignem Phäochromozytom zeigten zwar einen leichten

Rückgang nach Beendigung der Chemotherapie, waren jedoch weiterhin erhöht.

4.3 Vergleich der RIA-Plasmametanephrinbestimmung mit HPLC

Wir versuchten, bei 22 von 113 Patienten die mit dem RIA ermittelten Plasmawerte für NMN

und MN mit einer Bestimmung durch die HPLC zu vergleichen (s. Abbildung 13). Unter den

22 Patienten befanden sich 3, bei denen ein Phäochromozytom bereits durch Analyse der

präoperativen Plasmametanephrine mittel RIA sowie bildgebende Diagnostik bestätigt wurde.

MN prä-op MN post-op

Pla

sm

am

eta

nephrin (

pg/m

l)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Grenzwert

Bild 12 Plasmametanephrin bei 7 Phäochromozytompatienten prä- und postoperativ mit RIA

34

Die Messung konnte bei 5 Phäochromozytompatienten nicht durchgeführt werden, da zu

wenig Probenmaterial vorhanden war.

Abbildung 13 Vergleich der Plasmakonzentration der Metanephrine mit HPLC und RIA bei 22 von 113

Patienten mit klinischem Verdacht auf Phäochromozytom

Plasmanormetanephrin

HPLC

Pla

sm

ano

rmeta

nep

hrin (

pm

ol/l)

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

RIA

Pla

sm

ano

rmeta

nep

hrin (

pg

/ml)

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

HPLC

Pla

sm

am

eta

ne

ph

rin

(p

mo

l/l)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Plasmametanephrin

RIA

Pla

sm

am

eta

ne

ph

rin

(p

g/m

l)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

Grenzwert

Grenzwert

Grenzwert

Grenzwert

35

a) HPLC

Die Untersuchungen wurden freundlicherweise von Prof. Lenders/Nijmwegen durchgeführt.

Durch die Bestimmung der Plasmametanephrine mittels HPLC wurden insgesamt 5 erhöhte

NMN- und 3 erhöhte MN-Werte ermittelt.

In der Gruppe der Patienten ohne nachgewiesenes Phäochromozytom hatten alle Patienten

einen MN-Wert, der unter dem Referenzwert von 300 pmol/l blieb. Bei 2 der 19 Patienten

wurde ein erhöhtes Plasma-NMN festgestellt. Die Charakteristika der Patienten sind in

Tabelle 14 dargestellt. Insgesamt lag der Median in der Gruppe für Patienten ohne

Phäochromozytom für Plasma-NMN bei 346 pmol/l, der Median für Plasma-MN betrug 150

pmol/l. Der Wert des 3. Quartils von NMN ergab 444 pmol/l. Für das 3. Quartil von MN

wurde ein Ergebnis von 179,5 pmol/l ermittelt.

Abbildung 14 Charakteristika von 2 Patienten mit NMN-Erhöhung mittels HPLC. Abkürzungen: NN-RF,

Nebennierenraumforderung; KHK, koronare Herzkrankheit; COPD, Chronic Obstructive Pulmonary Disease

Bei den 3 Phäochromozytompatienten zeigte sich ein erhöhtes NMN und MN. Der Wert des

MN übertraf den zugehörigen Grenzwert um das 3,6-fache bis 92-fache. Ebenso zeigte sich

ein Anstieg des Plasma-NMN um das 2,5fache bis 40fache über dem oberen Grenzwert.

Somit zeigten sich sowohl beim MN als auch beim NMN keine falsch-negativen Ergebnisse.

Die Sensitivität lag somit bei 100%. Eine postoperative Auswertung der Plasmametanephrine

mit HPLC wurde bei 1 Patientin durchgeführt. Hier konnte ein Abfall des präoperativ

erhöhten NMN und MN in den Normbereich beobachtet werden.

Patient 1 676 NN-RF (3x3 cm) negativ Captopril

Nierenzysten bds. Hydrochlorothiazid

KHK ASS

COPD Theophyllin

Diabetes mellitus Typ II Clenubterol

Pravastatin

Metformin

Tolterodin

Patient 2 752 NN-RF (6x6 cm) nicht durch- Estramustin

metastasierendes geführt Clodronsäure

Prostatakarzinom Ramipril

arterielle Hypertonie Torasemid

MIBG-

Szintigraphie

NMN

(< 600 pmol/l)Erkrankungen Medikamente

36

b) RIA

Wir analysierten bei 22 Patienten die Plasmametanephrine mit einem RIA. Es zeigten sich

insgesamt 3 erhöhte NMN- und 2 erhöhte MN-Werte.

In der Gruppe der Patienten ohne Phäochromozytom lagen sowohl beim Plasma-NMN als

auch beim Plasma-MN alle gemessenen Werte innerhalb des Referenzbereiches. Der Median

von NMN lag bei 31,9 pg/ml, der Median für MN bei 25,5 pg/ml. Der Wert des 3. Quartils

ergab 42,9 pg/ml für NMN und 34,5 pg/ml für MN.

Bei den Phäochromozytompatienten wurde bei einem Patienten ein falsch-negativer NMN-

Wert gemessen. Die übrigen NMN- und MN-Werte überschritten den jeweiligen

Referenzwert um das 6,8fache bis 12,3fache bzw. 1,1fache bis 18,9fache und waren somit

positiv.

Im direkten Vergleich der beiden Methoden konnten somit folgende Werte ermittelt werden:

NMN-Messungen mit der HPLC hatten auf Grund von 2 falsch-positiven NMN-Werten eine

Spezifität von 89,47%, MN-Messungen eine Spezifität von 100%. Die Sensitivität lag für

beide Werte jeweils bei 100%. Dadurch, dass in dieser Patientengruppe keine falsch-positiven

Ergebnisse durch den RIA ermittelt wurden, ergab sich eine Spezifität für MN und NMN von

jeweils 100%. Die Sensitivität lag insgesamt bei 100%, in der Einzeldarstellung der

Ergebnisse jedoch bei 66% für NMN und 100% für MN.

4.4 Bestimmung der Urinkatecholamine mit HPLC

Wir analysierten bei 79 der 113 Patienten, die auf das Vorhandensein eines

Phäochromozytoms durch Analyse der Plasmametanephrine mittels RIA untersucht wurden,

zur weiteren Validierung unserer Diagnostik die Urinkatecholamine im 24-h-Sammelurin. Bei

8 der 79 Patienten war ein Phäochromozytom bereits bestätigt worden. Wie in Abbildung 15

zu sehen ist, wurden insgesamt 5 erhöhte Adrenalin- und 6 erhöhte Noradrenalinspiegel

bestimmt. Davon entfielen 3 Adrenalin- bzw. 5 Noradrenalinwerte auf Patienten mit

nachgewiesenem Phäochromozytom. Die Werte überschritten den oberen Referenzbereich um

das 4- bis 34-fache (Adrenalin) bzw. 1,5- bis 11fache (Noradrenalin). Insgesamt waren bei 3

Phäochromozytompatienten sowohl Adrenalin-, als auch Noradrenalinwerte innerhalb des

Normbereiches.

37

Abbildung 15 Urinkatecholamine mittels HPLC bei 79 von 113 Patienten mit klinischem Verdacht auf

Phäochromozytom

Die Gesamtsensitivität der Urinkatecholamine lag bei 62,5%, die Sensitivität der einzelnen

Katecholamine bei 37,5% für Adrenalin und 62,5% für Noradrenalin. Wir ermittelten 2

falsch-positive Adrenalinwerte sowie 1 falsch-positiven Noradrenalinwert. Die Spezifität für

Adrenalin und Noradrenalin lag somit bei 98,1% bzw. 99,0%, die Gesamtspezifität bei 95,8%.

4.5 Bestimmung der Urinmetanephrine mit HPLC

Eine Analyse der Metanephrine im 24-h-Sammelurin wurde bei 76 der 113 Patienten, die auf

das Vorhandensein eines Phäochromozytoms durch Analyse der Plasmametanephrine mittels

RIA untersucht wurden, durchgeführt (s. Abbildung 16). Unter den 76 Patienten befanden

sich 8, bei denen ein Phäochromozytom bereits gesichert worden war. Die Untersuchung der

Metanephrine im 24-h-Sammelurin diente der weiteren Sicherung und Validierung der

Ergebnisse, die durch die Plasmametanephrinbestimmungen erzielt wurden.

Insgesamt wurden 6 positive MN- und 13 positive NMN-Messungen durchgeführt. Davon

entfielen jeweils 6 MN- und NMN- Bestimmungen auf Phäochromozytompatienten. Die MN-

Werte überstiegen den oberen Grenzwert um das 1,5-fache bis 32-fache. Bei 2 Patienten mit

Phäochromozytom lag das MN im Sammelurin im Normbereich. Die NMN-Werte lagen um

Adrenalin

Urinkonzentr

ation (

nm

ol/d)

0

1000

2000

3000

4000

Noradrenalin

Urinkonzentr

ation (

nm

ol/d)

0

2000

4000

6000

8000

GrenzwertGrenzwert

38

das 4,2-fache bis 19-fache höher als der zugehörige obere Grenzwert. 2 Patienten hatten einen

NMN-Wert, der im Normbereich blieb.

Die Sensitivität betrug für MN und NMN jeweils 75,0%. Jedoch waren bei den falsch-

negativen NMN-Messungen die MN im Urin deutlich erhöht und umgekehrt, so dass bei der

zusammengefassten Betrachtung der Metanephrine im 24-h-Sammelurin keine falsch-

negativen Ergebnisse zu verzeichnen waren und die Sensitivität folglich bei 100% lag.

7 der 68 Patienten ohne nachgewiesenes Phäochromozytom hatten einen NMN-Wert, der den

Grenzwert um das bis zu 2fache überschritt. Der Median für NMN wurde mit 1422 nmol/l

bestimmt, der Wert des 3. Quartils von NMN ergab 1905 nmol/l. Alle MN-Werte lagen im

Normbereich, der Median lag bei 478 nmol/l, der Wert des 3. Quartils bei 666 nmol/l. Es

wurden somit 7 falsch-positive Ergebnisse ermittelt. Die Spezifität für MN und NMN lag bei

100% bzw. 89,7%, die Gesamtspezifität bei 89,7%

Abbildung 16 Urinmetanephrine mittels HPLC bei 76 von 113 Patienten mit klinischem Verdacht auf

Phäochromozytom

NMN

Uri

nkonzentr

ation (

µm

ol/l)

0

20000

40000

60000

180000

200000

MN

Uri

nkonzentr

ation (

µm

ol/l)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Grenzwert

Grenzwert

39

4.6 Bestimmung des Serum-Chromogranin A mittels RIA

Wir konnten bei 67 der 113 auf das Vorhandensein eines Phäochromozytoms untersuchten

Patienten das Chromogranin A im Serum als zusätzlichen diagnostischen Marker bestimmen

(s. Abbildung 17).

Unter den 67 Patienten befanden sich 4, bei denen ein Phäochromozytom bereits gesichert

war. Bei 4 Phäochromozytompatienten konnte keine Analyse des Chromogranin A auf Grund

mangelnden Probenmaterials durchgeführt werden.

Der Wert des 1. Quartils ergab 41 µg/l, der Median für Chromogranin A wurde mit 64 µg/l

bestimmt, der Wert des 3. Quartils lag bei 180 µg/l. Insgesamt wurden 26 positive Ergebnisse

gemessen. Bei allen Patienten mit nachgewiesenem Phäochromozytom war der Spiegel des

Chromogranin A erhöht und lag um das 1,8-fache bis 388-fache über dem oberen

Referenzwert. Die Sensitivität der Messung von Chromogranin A im Serum lag bei 100%.

Bei 22 Patienten wurde ein falsch-positives Ergebnis gemessen, wodurch eine Spezifität von

65,1% ermittelt wurde.

Abbildung 17 Chromogranin A im Serum bei 67 von 113 Patienten mit klinischem Verdacht auf

Phäochromozytom

Grenzwert

Chromogranin A

Ch

rom

ogra

nin

A (

µg/l)

0

1000

2000

3000

4000

5000

40

4.7 Mehrfachbestimmung der Metanephrine im Plasma mit RIA

Bei 19 Patienten ohne Phäochromozytom wurden im weiteren ambulanten Verlauf wiederholt

Messungen von MN und NMN im Plasma durchgeführt (s. Abbildung 18 und 19).

Diese Untersuchungen fanden in unterschiedlichen zeitlichen Abständen sowohl im Rahmen

von Verlaufskontrollen bei bisher endokrinologisch unauffälligen

Nebennierenraumforderungen als auch bei schwer einstellbarem Hypertonus statt. Darüber

hinaus war es unsere Absicht, zu erkennen, inwieweit die bisher ermittelten

Plasmametanephrinwerte bei Patienten ohne nachgewiesenes Phäochromozytom im Verlauf

stabil blieben. Es stellte sich heraus, dass bei den NMN-Bestimmungen kein Wert gemessen

wurde, der den oberen Referenzwert überschritt. Der Median war 55,9 pg/ml bei der ersten

Messung und 46,2 pg/ml bei der zweiten Messung.

Im Gegensatz dazu waren bei 2 Patienten die MN-Werte initial falsch-positiv. Sie

überschritten den oberen Referenzwert um das 1,02-fache bis 1,83-fache. Beide Patienten

erhielten zu diesem Zeitpunkt eine antihypertensive Therapie mit 5 Medikamenten

(einschließlich Clonidin bzw. Moxonidin). In einer im Verlauf erneut durchgeführten

Messung ließen sich keine falsch-positiven Werte bestimmen, die Medikamente Moxonidin

und Clonidin waren bei den initial falsch-positiv gemessenen Patienten zu diesem Zeitpunkt

abgesetzt. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass der Nebennierentumor ein bislang

Abbildung 18 2fache Bestimmung des Normetanephrin im Plasma bei 19 Patienten ohne Phäochromozytom mit

RIA. 1: initiale Normetanephrinbestimmung, 2: Verlaufskontrolle

Normetanephrin

Pla

sm

konzentr

ation (

pg/m

l)

0

20

40

60

80

100

120

140

Grenzwert

21

41

endokrinologisch/biochemisch unauffälliges Phäochromozytom ist bzw. intermittierend

Katecholamine sezerniert.

4.8 Plasmametanephrine in Abhängigkeit vom Alter

Wir untersuchten den Spiegel der Plasmametanephrine in Abhängigkeit vom Lebensalter. In

diese Bestimmung flossen die Daten von 105 Patienten ohne nachweisbares

Phäochromozytom ein.

Abbildung 20 Plasmanormetanephrinwerte in Abhängigkeit vom Alter der Patienten

r=0,2

Alter der Patienten (Jahre)

0 20 40 60 80 100

Pla

sman

orm

etan

ephr

in in

pg/

ml

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Abbildung 19 2fache Bestimmung des Metanephrin im Plasma bei 19 Patienten ohne Phäochromozytom mit

RIA. 1: initiale Metanephrinbestimmung; 2: Verlaufskontrolle

Metanephrin

Pla

smako

nze

ntr

atio

n (

pg/m

l)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Grenzwert

1 2

42

Eine Regressionsanalyse nach Spearman wurde durchgeführt. Wie in Abbildung 20 und 21

illustriert ist, besteht kein Zusammenhang zwischen dem Alter der Patienten und der Höhe

sowohl des NMN-Spiegels als auch des MN-Spiegels im Plasma (p>0,05).

4.9 Vergleich der analysierten Parameter

Im Rahmen der Untersuchung hinsichtlich eines Phäochromozytoms wurden bei 113

Patienten die freien Plasmametanephrine mittels RIA evaluiert und mit der HPLC verglichen.

Darüber hinaus wurde auch eine Analyse weiterer diagnostischer Parameter durchgeführt und

hinsichtlich Sensitivität und Spezifität den freien Plasmametanephrinen gegenübergestellt. So

lag die Sensitivität und Spezifität der Plasmametanephrine mittels RIA bei 100% bzw. 94,3

%, mittels HPLC bei 100% bzw. 89,5%. Eine ähnlich hohe diagnostische Sensitivität und

Spezifität (100% bzw. 89,7%) konnte bei der Analyse der Urinmetanephrine ermittelt werden.

Dahingegen konnte bei der Untersuchung des Chromogranin A im Serum zwar eine

Sensitivität von 100% nachgewiesen werden, allerdings erwies sich dieser Parameter mit 65%

als wenig spezifisch. Die Sensitivität der Urinkatecholamine im Urin lag bei 62,5% bei einer

Spezifität von 95,5%. Eine Übersicht der ermittelten Werte ist in Abbildung 22 dargestellt.

Anzahl Patienten Sensitivität (%) Spezifität (%)

RIA

Metanephrine im Plasma 113/113

NMN 75,0 99,0

MN 75,0 94,3

NMN+MN 100,0 94,3

Chromogranin A im Serum 67/113 100,0 65,1

HPLC

Metanephrine 22/113

NMN 100,0 89,5

MN 100,0 100,0

Urinkatecholamine 79/113

Adrenalin 37,5 98,1

Noradrenalin 62,5 99,0

A+NA 62,5 95,8

Urinmetanephrine 76/113

Abbildung 21 Plasmametanephrinwerte in Abhängigkeit vom Alter der Patienten

43

Abbildung 22 Sensitivität und Spezifität der ermittelten Laborparameter; Abkürzungen: NMN, Normetanephrin;

MN, Metanephrin, A, Adrenalin; NA, Noradrenalin

RIA

Metanephrine im Plasma 113/113

NMN 75,0 99,0

MN 75,0 94,3

NMN+MN 100,0 94,3

Chromogranin A im Serum 67/113 100,0 65,1

HPLC

Metanephrine 22/113

NMN 100,0 89,5

MN 100,0 100,0

Urinkatecholamine 79/113

Adrenalin 37,5 98,1

Noradrenalin 62,5 99,0

A+NA 62,5 95,8

Urinmetanephrine 76/113

NMN 75,0 89,7

MN 75,0 100,0

NMN+MN 100,0 89,7

Sensitivität

(in %)

Spezifität

(in %)

Anzahl

Patienten

44

5 Diskussion

5.1 Überblick

In den vergangenen Jahren hat sich die Bestimmung der freien Metanephrine im Plasma

mittels HPLC als Mittel der Wahl in der Diagnostik des Phäochromozytoms etabliert

(Eisenhofer 2003c).

Im Rahmen einer Untersuchung verschiedener biochemischer Parameter hinsichtlich der

jeweiligen Sensitivität und Spezifität in der Phäochromozytomdiagnostik konnten Lenders et

al. (1995) erstmals zeigen, dass die freien Plasmametanephrine als diagnostisches Mittel

eingesetzt werden können. In sich hierauf anschließenden Studien wurde dieses Ergebnis

nicht nur bestätigt, sondern es zeigte sich die diagnostische Überlegenheit der freien

Plasmametanephrine gegenüber anderen Parametern (Eisenhofer et al. 1999, Goldstein et al.

2004, Unger et al. 2006, Hickman et al. 2009).

Als Gründe der verbesserten Sensitivität und Spezifität der freien Plasmametanephrine

wurden aufgeführt:

Die Expression von Catechol-O-Methyltransferase (COMT) innerhalb des Tumors. So

erfolgt bereits intratumoral eine kontinuierliche Umwandlung von aus durchlässigen

Speichervesikeln stammendem Adrenalin und Noradrenalin zu MN und NMN. In

einer Studie (Eisenhofer et al. 1995) wurde nachgewiesen, dass dadurch die

Konzentration an freien Metanephrinen innerhalb des Phäochromozytoms auf das

13.000fache bis 23.000fache ansteigen kann.

Im Gegensatz zu den oftmals nur periodisch sezernierten Katecholaminen ist bei den

Phäochromozytompatienten durch den o.g. Mechanismus eine beständige Erhöhung

der freien Metanephrine im Plasma zu verzeichnen.

91% des zirkulierenden Plasma-MN und 23% des Plasma-NMN stammen aus der

Nebenniere selbst. Sie stellt damit die größte natürliche Quelle der Metanephrine im

menschlichen Körper dar.

Mit der HPLC steht ein Labortest zur Verfügung, der eine sensitive und zugleich spezifische

Bestimmung der Metanephrine ermöglicht. Auf Grund dessen, dass dieses Verfahren durch

eine komplizierte Analytik sehr kosten- und arbeitsintensiv ist, steht es derzeit nur wenigen

Zentren zur kommerziellen Verfügung (Sawka et al. 2004a). Dies ist insbesondere

dahingehend ein Nachteil, als durch die stetig verbesserte Bildgebung die Zahl der entdeckten

45

adrenalen Inzidentalome beständig ansteigt und dadurch die Phäochromozytomdiagnostik

auch in kleineren Kliniken an Bedeutung gewinnt (Aron 2001, Thompson und Young. 2003).

Darüber hinaus sind verschiedene Substanzen beschrieben worden- insbesondere

Medikamente wie trizyklische Antidepressiva, Phenoxybenzamin und Sympathomimetika-

die mit der HPLC interferieren und falsch-positive Ergebnisse verursachen können

(Eisenhofer et al. 2003b, Wassell et al. 1999).

Neben der HPLC existieren weitere Verfahren, die in der Diagnostik des Phäochromozytoms

eingesetzt werden und über charakteristische Vor- und Nachteile verfügen.

Die Gaschromatographische Massenspektrometrie (GC-MS) ist sehr zeitaufwändig und durch

die notwendige große Laborausstattung nur in wenigen klinischen Zentren vorhanden.

Darüber hinaus ist es mit dieser Methode zwar möglich, konjugierte Metanephrine im Urin zu

bestimmen, jedoch ist es bisher nicht gelungen, freie Metanephrine im Plasma nachzuweisen

(Crockett et al. 2002).

Im Gegensatz zur GC-MS und HPLC ist ein immunologischer Assay einfach durchzuführen

und bietet dadurch eine breite Anwendbarkeit. Allerdings konnten bis zum heutigen Zeitpunkt

auch mit diesem Verfahren nur die konjugierten Metanephrine im Urin und nicht die freien

Metanephrine im Plasma analysiert werden (Wolthers et al. 1997).

Eine weitere Methode ist die Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung

(LC-MS), mit der die Analyse freier Metanephrine im Plasma möglich ist. Ein Nachteil dieses

Verfahren ist jedoch die Anfälligkeit gegenüber interferierenden Substanzen. So beobachtete

Lagerstedt (2004) eine Beeinflussung der Messergebnisse von Metanephrinen im Plasma

durch Adrenalin.

Es lässt sich konstatieren, dass keines der vorgestellten Verfahren die Anforderungen in der

Diagnostik des Phäochromozytoms vollständig erfüllt. Eine gute Sensitivität und Spezifität

einiger Methoden wird nur durch hohe Kosten oder einen immensen Zeitaufwand erreicht.

Auf der anderen Seite ist es bei schnell und einfach durchzuführenden Methoden bisher nicht

möglich gewesen, freie Metanephrine im Plasma nachzuweisen. Zusätzlich bereiten

interferierende Substanzen immer wieder Probleme in der exakten Bestimmung der

jeweiligen Parameter.

Aus diesen Gesichtspunkten heraus leitet sich die Anwendung eines RIA ab, der auf Grund

seiner Einfachheit und breiten Verfügbarkeit zur Bestimmung von freien Metanephrinen im

Plasma bei der Diagnostik des Phäochromozytoms denkbar ist. Zusätzlich ist die Verwendung

eines RIA an die Erwartung einer der HPLC mindestens gleichwertigen Sensitivität und

Spezifität geknüpft. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Untersuchung die

46

Bestimmung der Metanephrine im Plasma mittels RIA im Vergleich zu bisher angewandten

Verfahren, insbesondere der HPLC, in der Diagnostik des Phäochromozytoms durchgeführt.

Es wurden 163 Patienten eingeschlossen, von denen lediglich 4 Patienten die klassische

klinische Symptomtrias bestehend aus Palpitationen, Kopfschmerz und Schwitzen angaben.

Dies kontrastiert mit anderen Studien. So fanden Plouin et al. (1981) bei Vorhandensein

dieser Trias und Bluthochdruck bei 2585 Bluthochdruckpatienten solche mit einem

Phäochromozytom mit einer Sensitivität von 91% und Spezifität von 94%.

Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Kapitel 4 dargestellt. Es zeigt sich, dass der hier

getestete RIA freie Metanephrine im Plasma sensitiv und spezifisch nachweist und somit eine

gute Alternative zur HPLC ist.

5.2 Plasmametanephrine

Wir untersuchten in dieser Studie 163 Patienten auf das Vorhandensein eines

Phäochromozytoms durch Bestimmung der Plasmametanephrine mit Hilfe eines RIA. In der

Anfangsphase unserer Arbeit standen uns keine validierten Referenzwerte für Metanephrin

und Normetanephrin mittels RIA zur Verfügung. Wir ermittelten daher bei den ersten 50 der

163 Patienten, bei denen ein Phäochromozytom durch bildgebende Verfahren nahezu

ausgeschlossen wurde eigene Grenzwerte (s. 3.2.2). Hierbei orientierten wir uns an den von

Unger et al. (2004) in einer klinischen Studie ermittelten Grenzwerten für Normetanephrin

und Metanephrin. Nachdem wir die Grenzwerte bei den ersten 50 Patienten bestätigen

konnten, wandten wir sie bei der Untersuchung der übrigen 113 Patienten an. Die so

ermittelte Sensitivität und Spezifität der Plasmametanephrine lag bei 100% bzw. 94,3%. Es

zeigte sich, dass die von Unger et al. (2004) ermittelten Grenzwerte auch bei unseren Proben

valide waren und in der Diagnostik des Phäochromozytoms eingesetzt werden können.

Bei 8 der 113 Patienten konnte ein Phäochromozytom histologisch nachgewiesen werden. In

den analysierten Plasmametanephrinen zeigte sich entweder ein erhöhter MN- oder NMN-

Wert. Es wurden sowohl bei den NMN als auch den MN jeweils 2 Werte im Normbereich

ermittelt. Das führte zu einer Sensitivität von 75% bei der Verwendung beider Parameter.

Jedoch waren bei den normwertigen NMN-Bestimmungen die MN deutlich erhöht und

umgekehrt, so dass insgesamt kein falsch-negatives Ergebnis ermittelt wurde und die

Sensitivität der Plasmametanephrine somit bei 100% lag. Diese Ergebnisse stehen im

Einklang mit anderen Studien, in denen eine ähnliche hohe Sensitivität der

Plasmametanephrine ermittelt wurde (Raber et al. 2000, Giovanella et al. 2006, Unger et al.

47

2006, Hickman et al. 2009).

Ferner führten wir eine Analyse der prä- und postoperativen Werte für NMN und MN bei 7

von 8 Phäochromozytompatienten durch. Auf Grund der niedrigen Fallzahl konnten keine

statistisch zu belegenden Aussagen getroffen werden. Es ließen sich jedoch folgende

Vermutungen äußern, die durch weitere Untersuchungen bestätigt werden müssen:

bei den meisten Patienten ist eine rasche Normalisierung bzw. starker Abfall von präoperativ

erhöhten NMN- oder MN-Werten zu verzeichnen. Dies geht gleichzeitig einher mit einem

deutlichen Rückgang bzw. einer kompletten Regredienz der jeweiligen klinischen

Beschwerdesymptomatik der Patienten. Darüber hinaus scheinen nach der Entfernung eines

malignen Phäochromozytoms die Plasmametanephrine auch im weiteren Verlauf erhöht zu

bleiben. In unserer Untersuchung gab die Patientin mit malignem Phäochromozytom auch

nach Adrenalektomie weiterhin Beschwerden (Palpitationen, Kopfschmerzen) an. Sollten bei

initial benignen Phäochromozytomen postoperativ weiterhin erhöhte Spiegel für NMN oder

MN bestehen, sind engmaschige Kontrollen der Werte zu empfehlen, so dass ein eventueller

maligner Verlauf diagnostiziert werden kann. Insgesamt scheint die Bestimmung der

Plasmametanephrine mittels RIA zum postoperativen Follow-up geeignet zu sein.

Bei 6 der 105 Patienten ohne Phäochromozytom wurden falsch-positive Werte mit dem RIA

ermittelt, so dass wir eine Spezifität von 99,0% für NMN und 94,3% für MN ermittelten Dies

sind deutlich höhere Werte als in vorausgegangenen Studien, in denen die Spezifität für

Plasmametanephrine mit 79% bis 89% angegeben wird (Lenders et al. 2002b, Sawka et al.

2003, Unger et al. 2006). Eine mögliche Ursache ist die Verwendung von niedrigeren

Grenzwerten, welche eine höhere Sensitivität ermöglichen, allerdings auf Kosten einer

geringeren Spezifität.

In den letzten Jahren ist immer wieder das diagnostische Dilemma bei Patienten mit

terminaler Niereninsuffizienz oder Dialysepflichtigkeit und erhöhten Plasmakatecholaminen

beschrieben worden (Stumvoll et al. 1995, Box et al. 1997, Saeki et al. 2003). Morioka et al.

(2002) versuchten, dieses Problem durch die Festlegung von separaten Normalwerten zu

lösen. Durch den Einsatz der Metanephrine im Plasma wurde hier ein bedeutender Fortschritt

in der Verbesserung der Phäochromozytomdiagnostik erreicht, da sie unabhängig von der

renalen Funktion und hauptsächlich durch aktive extraneurale Wiederaufnahme aus dem Blut

entfernt werden. So fanden Marini et al. (1994) keinen Unterschied in der Konzentration von

fraktionierten freien Metanephrinen im Plasma zwischen 10 Patienten mit Phäochromozytom

und normaler Nierenfunktion und 11 Patienten ohne Phäochromozytom, die auf Grund einer

terminalen Niereninsuffizienz dialysepflichtig waren. Trotzdem sind auch hier weiterhin

48

Berichte über falsch-positive Metanephrinmessungen bei Patienten mit Niereninsuffizienz

veröffentlicht worden (Eisenhofer et al. 2005b). In unserer Untersuchung waren 6 Patienten

an einer terminalen Niereninsuffizienz erkrankt. Bei keinem von ihnen zeigten sich falsch-

positive Werte für NMN oder MN, so dass unserer Ansicht nach die Plasmametanephrine gut

bei dieser Patientenklientel eingesetzt werden können.

Im Rahmen einer Kontrolluntersuchung wurde bei 19 der 105 Patienten eine zweite Messung

der Plasmametanephrine durchgeführt. Es zeigten sich keine falsch-positiven Ergebnisse. Die

bei der ersten Untersuchung festgestellten MN-Erhöhungen bei 2 Patienten waren regredient.

Beide Patienten waren bei der ersten Untersuchung unter antihypertensiver Therapie mit

Moxonidin bzw. Clonidin. Nach Absetzen der Medikation fielen die Werte der

Plasmametanephrine in den Normbereich. Eine Interferenz der Medikamente mit dem RIA

scheint deswegen möglich zu sein. Dies steht im Gegensatz zu bisherigen Studien, in denen

vor allem trizyklische Antidepressiva, Sympathomimetika und Phenoxybenzamin als

mögliche pharmakologische Ursachen für falsch-positive Messungen der Plasmametanephrine

genannt wurden (Eisenhofer et al. 2003b, Harding et al. 2005). Insgesamt zeigen die

ermittelten Ergebnisse jedoch, dass die Werte der Plasmametanephrine mittels RIA im

Verlauf stabil bleiben und damit nur geringen Schwankungen unterliegen.

Sawka et al. (2005) untersuchten 158 Patienten (inklusive 23 Patienten mit histologisch

nachgewiesenem Phäochromozytom) auf das Vorhandensein eines Phäochromozytoms mit

Hilfe der freien Metanephrine im Plasma. Sie wiesen eine direkte Korrelation der Höhe der

Plasmametanephrinspiegel mit dem Alter der Patienten nach und konnten durch

altersspezifische Referenzwerte eine signifikante Verbesserung der Spezifität beider

Parameter erzielen. In unserer Untersuchung konnte kein Zusammenhang zwischen dem

Lebensalter und der Höhe des Plasmaspiegels der freien Metanephrine gefunden werden

(p>0,05).

Wir versuchten darüber hinaus, die Bestimmung der Plasmametanephrine durch den RIA mit

einer HPLC hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zu vergleichen. Die Spezifität lag mit der

HPLC bei 100% für MN bzw. 89,5% für NMN verglichen mit 94,3% für MN und 99,0% für

NMN beim RIA. Es wurde eine Sensitivität sowohl für NMN als auch für MN von 100% mit

der HPLC ermittelt. Die Sensitivität für MN und NMN mit Hilfe des RIA lag jeweils bei

75,0%. Jedoch waren bei den normwertigen NMN-Bestimmungen die MN deutlich erhöht

und umgekehrt, so dass insgesamt kein falsch-negatives Ergebnis ermittelt wurde und die

Sensitivität ebenfalls bei 100% lag. Vergleicht man die Ergebnisse des RIA mit denen der

HPLC, wird jeweils eine Sensitivität von 100% erreicht bei ebenso vergleichbarer Spezifität.

49

Daher erscheint die Anwendung des RIA zur Bestimmung der Plasmametanephrine auch aus

diesem Gesichtspunkt heraus möglich.

Es lassen sich insgesamt folgende Schlussfolgerungen ziehen:

Die Bestimmung der Plasmametanephrine mit Hilfe des RIA zeigte eine hohe

diagnostische Sensitivität. In unserer Untersuchung war ein Anstieg der Metanephrine

um das 1,1fache bis 25,5fache und der Normetanephrine um das 1,2fache bis

15,3fache über den Grenzwert zu verzeichnen.

Darüber hinaus konnte eine hohe diagnostische Spezifität in der Determination der

Plasmametanephrine mittels RIA erzielt werden. In Anbetracht dieser Ergebnisse ist

ein Einsatz des RIA zur Messung der Metanephrine im Plasma in der Diagnostik des

Phäochromozytoms empfehlenswert.

Die Evaluation der Plasmametanephrine scheint beim postoperativen Follow-up

geeignet zu sein. Bei benignen klinischen Verläufen ist ein rascher postoperativer

Abfall der Werte zu verzeichnen, welcher auch mit einer abnehmenden

Beschwerdesymptomatik der Patienten einhergeht. Nach Durchführung einer

Adrenalektomie eines malignen Phäochromozytoms ist die Tendenz nachweisbar, dass

die Plasmametanephrine auch im weiteren Verlauf erhöht bleiben.

Der Ausschluss eines Phäochromozytoms bei multimorbiden Patienten, insbesondere

bei Patienten mit Niereninsuffizienz ist - im Gegensatz zu Chromogranin A im Serum-

durch die Bestimmung der Plasmametanephrine gut möglich.

Die HPLC ist ein sensitives und zugleich spezifisches Verfahren bei der Bestimmung

der freien Plasmametanephrine. Ein Nachteil der Methode liegt darin, dass sie nur an

wenigen Standorten verfügbar ist. Dies ist insbesondere dadurch bedingt, dass das

Verfahren kostenintensiv, zeitaufwändig und auf Grund von präanalytischen

Extraktionsschritten in der Methodik sehr schwierig ist. Des Weiteren sind einige

Nahrungsmittel und Medikamente beschrieben worden, die mit der HPLC

interferieren (Westphal 2005). Deswegen werden dem Patienten vor der Bestimmung

eine 12-stündige Nahrungskarenz sowie das Absetzen bestimmter Medikamente

empfohlen. Durch die Ergebnisse unserer Untersuchung konnten wir die

vorbeschriebene hohe Spezifität der HPLC bestätigen.

50

Der RIA ist im Vergleich zur HPLC wesentlich kostengünstiger und dadurch auch

besser verfügbar. Hinzu kommt, dass er pro Probe weniger zeitintensiv ist und viele

Proben gleichzeitig analysiert werden können. Ein Nachteil ist der Umgang mit

radioaktiven Substanzen, der nur dadurch vermieden werden kann, dass anstelle des

RIA ein Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) verwandt wird. Eine

Beeinflussung des RIA durch Medikamente ist bisher nicht beschrieben worden. In

der durchgeführten Untersuchung scheint jedoch eine Interferenz durch bestimmte

Antihypertensiva möglich (z.B. Moxonidin, Clonidin). Insgesamt zeichnet sich der

hier getestete RIA durch eine hohe Sensitivität und Spezifität aus.

5.2.1 Katecholamine und Metanephrine im 24-h-Sammelurin

In der Gruppe der Phäochromozytome wurden 3 falsch-negative Werte bei der Bestimmung

der 24-h-Urinkatecholamine gemessen. Die Sensitivität lag bei 62,5%. Bei 71 Patienten ohne

nachgewiesenes Phäochromozytom traten 3 falsch-positive Ergebnisse auf. Somit ergab sich

eine Spezifität von 95,8%.

Es gab keine falsch-negativen Ergebnisse in der Analyse der 24-h-Urinmetanephrine bei den

Patienten mit Phäochromozytom. Jedoch waren 7 falsch-positive Ergebnisse in der

Kontrollgruppe zu verzeichnen. Eine mögliche Ursache könnte bei 2 Patienten eine

symptomatische Hypoglykämie sowie bei einem weiteren Patienten eine intrazerebrale

Blutung bei Hypertension und Therapie mit oralen Antikoagulanzien bei Vorhofflimmern

gewesen sein. Wie bereits in anderen Studien beschrieben, wird durch bestimmte klinische

Situationen (unter anderem Operationen, Hypoglykämie, intrazerebrale Blutungen, Manie) die

sympatho-adrenale Achse aktiviert (Gerlo und Sevens 1994). Dies fördert die Freisetzung der

Katecholamine und ihrer Metabolite, was zu deren falsch-positiver Messung führen kann.

Eine stationäre Behandlung wurde bei 4 Patienten wegen rezidivierender hypertensiver

Entgleisungen notwendig. Die Therapie erfolgte mit einer 2fachen bis 6fachen

antihypertensiven Kombinationsmedikation. Die Sensitivität und Spezifität der 24-h-

Urinmetanephrine lag bei 100% bzw. 89,7%. Insgesamt können folgende Aussagen getroffen

werden:

Betrachtet man die Urinkatecholamine, so sind sie in der Diagnostik des Phäochromozytoms,

insbesondere im Vergleich zur Messung von Plasma- und Urinmetanephrinen nur

eingeschränkt empfehlenswert. So zeigt sich eine hohe Spezifität von Adrenalin und

Noradrenalin bei jedoch geringer Sensitivität. Eine Erklärung für diese Tatsache liegt in der

51

Eigenschaft von Phäochromozytomen, Katecholamine nur periodisch abzugeben. Dadurch

können endokrinologisch aktive Phasen des Tumors verpasst werden, woraus falsch-negative

Messungen resultieren. Daher wird der diagnostischer Einsatz der Urinkatecholamine von

verschiedenen Autoren nur als Ergänzung zu den oben genannten Parametern empfohlen

(Lipsic et al. 2004, Karagiannis et al. 2007).

Wie diese Untersuchung ebenfalls zeigt, ist der Einsatz von Urinmetanephrinen in der

Diagnostik des Phäochromozytoms sinnvoll. Es zeigte sich eine Sensitivität von 100% bei

einer Spezifität von 89,7%. Damit kontrastieren die Ergebnisse mit denen anderer Studien, in

denen vor allem eine niedrigere Sensitivität ermittelt wurde (Lenders el al. 2002b, Unger et al.

2006). Dies wurde mit der fehlenden Organspezifität der Urinmetanephrine begründet,

wodurch die zusätzlich von einem Phäochromozytom gebildeten Metanephrine theoretisch

schlechter zu detektieren sind. In dieser Untersuchung lässt sich dies jedoch nicht nachweisen.

5.2.2 Chromogranin A im Serum

Eine Erhöhung des Chromogranin A im Serum konnte bei allen Phäochromozytompatienten,

bei denen diese Untersuchung durchgeführt wurde, nachgewiesen werden. Somit wurden

keine falsch-negativen Werte bestimmt. Bei 63 Patienten ohne nachgewiesenes

Phäochromozytom wurde das Chromogranin A ebenfalls analysiert. Hier traten 22 falsch-

positive Messungen auf. Die Spezifität lag somit insgesamt bei 65,1%. Die hohe Anzahl

falsch-positiver Messergebnisse in dieser Studie könnte unter anderem aus der Tatsache

resultieren, dass 6 der 22 Patienten mit falschpositivem Chromogranin A eine eingeschränkte

Nierenfunktion (bei diabetischer Nephropathie) aufwiesen sowie 9 Patienten mit einem

Protonenpumpenhemmer behandelt wurden. Es ist bekannt, dass diese Medikamentengruppe

ebenfalls zu einer Erhöhung des Chromogranin A beitragen kann (Blausque et al. 2003,

Wiedmann et al. 2009). Darüber hinaus beschreiben einige Studien einen Zusammenhang

zwischen der Entstehung eines Diabetes mellitus Typ 2 und dem pituitary adenylate cyclase-

activating polypeptide (PACAP) (Filipsson et al. 2001, Vaudry et al. 2002). PACAP hat

neben den Effekten auf das Pankreas auch einen stimulierenden Einfluss auf die Biosynthese

von Katecholaminen und die Sekretion von Chromogranin A, so dass eine Verbindung von

Diabetes mellitus Typ 2 und erhöhten Serumwerten von Chromogranin A bestehen könnte. In

dieser Studie scheint sich dies zu bestätigen, da 14 der 22 Patienten mit falschpositivem

Chromogranin A einen Diabetes mellitus Typ 2 hatten.

52

Anhand der hier vorliegenden Daten können jedoch folgende Feststellungen getroffen

werden:

Chromogranin A hat als Phäochromozytommarker eine hohe Sensitivität, jedoch eine

niedrige Spezifität. Die Ursache hierfür liegt darin, dass Chromogranin A

hauptsächlich renal eliminiert wird. Dadurch steigen die Serumwerte bei

beeinträchtigter Nierenfunktion schnell an. Darüber hinaus ist eine Beeinträchtigung

der Chromograninwerte durch Protonenpumpeninhibitoren und Diabetes mellitus Typ

2 möglich. Insgesamt stützen die Ergebnisse dieser Studie die Empfehlung einiger

Autoren, das Serumchromogranin A als ergänzenden Marker in der

endokrinologischen Diagnostik adrenaler Inzidentalome zu verwenden (Miehle et al.

2005, Algeciras-Schimnich et al. 2007).

5.2.3 Präklinische Einflussfaktoren

Die Bestimmung biochemischer Marker im 24-h-Sammelurin zur Diagnostik des

Phäochromozytoms hat Vor- und Nachteile. So stellt der erforderliche lange Sammelzeitraum

oftmals eine Belastung für den Patienten dar. Darüber hinaus gestaltet sich die Urinsammlung

gerade bei Kindern schwierig oder ist bei ambulanten Patienten nahezu unmöglich

durchzuführen. Auf der anderen Seite gleicht eine 24-h-Sammlung Zeiten des

Phäochromozytoms, in denen der Tumor endokrinologisch inaktiv ist, aus. Ein Problem

stellen jedoch Patienten mit Niereninsuffizienz dar. Bei ihnen ist auf Grund der

beeinträchtigten Nierenfunktion die Interpretation von Urinbestimmungen eingeschränkt. Es

wird jedoch in einigen Studien darüber diskutiert, dieses Problem zum Beispiel durch die

Bestimmung des Metanephrin-Kreatinin-Verhältnisses zu lösen (Heron et al. 1996).

Die Analyse der biochemischen Parameter zur Phäochromozytomdiagnostik im Blut weist

einige Vorteile gegenüber dem 24-h-Sammelurin auf. So entfällt die für den Patienten

aufwändige Urinsammlung und es muss nur einmal venös punktiert werden. Dies

gewährleistet eine gute Anwendbarkeit bei fast allen Patienten, insbesondere bei Kindern. Des

Weiteren wird so auch eine ambulante Diagnostik ermöglicht. Allerdings wird von einigen

Wissenschaftlern empfohlen, vor der Blutentnahme eine nächtliche Diät einzuhalten und die

Blutentnahme nach einer 20-minütigen Ruhezeit beim liegenden Patienten aus einer

Venenverweilkanüle durchzuführen, da dies falsch-positive Messergebnisse durch einen

53

erhöhten Sympathikotonus vermeiden würde (Lenders et al. 2007). In unserer Untersuchung

verzichteten wir auf das Einhalten spezifischer Maßnahmen (z.B. die Anlage einer

Venenverweilkanüle oder das Einhalten einer nächtlichen Diät) im Vorfeld der Blutentnahme.

Wie in der Diagnostik des 24-h-Sammelurins auch, findet eine Beeinträchtigung der

Aussagekraft verschiedener Serummarker bei Niereninsuffizienz statt. Dies betrifft

insbesondere die sulfatierten Metanephrine, die Vanillinmandelsäure und das Chromogranin

A. In einigen Studien wurde auch eine leichte Erhöhung der freien Plasmametanephrine

nachgewiesen (Eisenhofer et al. 2005b). Insgesamt jedoch werden die freien Metanephrine

hinsichtlich ihrer diagnostischen Aussagefähigkeit durch eine Niereninsuffizienz kaum

beeinflusst und stellen hier das Mittel der Wahl dar.

5.3 Einschränkungen dieser Studie

Hauptschwäche dieser Studie ist die geringe Anzahl an Phäochromozytompatienten. Es ist

daher nötig, die bisher ermittelten Daten durch weitere Untersuchungen und eine größere

Anzahl an Patienten mit Phäochromozytom zu bestätigen. Ferner gelang es nicht, bei allen

Patienten ohne nachgewiesenes Phäochromozytom Messungen der Urinkatecholamine,

Urinmetanephrine, Plasmametanephrine mit HPLC und Chromogranin A durchzuführen.

Die Stärke dieser Studie liegt in dem Einschluss aller zur Abklärung einer sekundären

Hypertonie untersuchten Patienten. Hierdurch wurden die freien Metanephrine im Plasma bei

Patienten mit einem breiten Spektrum verschiedener Krankheiten und der

Differentialdiagnose Phäochromozytom analysiert.

5.4 Ökonomische Gesichtspunkte

In einer in den USA durchgeführten Studie wurden verschiedene Screeningalgorithmen zur

Phäochromozytomdiagnostik aufgestellt und hinsichtlich ihrer Kosten-Nutzen-Relation

überprüft (Sawka et al. 2004b). Bei einer angenommenen Prävalenz des Phäochromozytoms

von 0,5% pro 100.000 Personen mit Bluthochdruck wurden je nach Algorithmus zwischen

457 und 489 Phäochromozytompatienten identifiziert. Demgegenüber standen Kosten

zwischen 28,6 und 56,6 Millionen Dollar. Als ursächlich für den hohen finanziellen Aufwand

werden zum einen die bei 80% bis 90% liegende Spezifität verschiedener biochemischer

Tests und zum anderen die niedrige Prävalenz der Erkrankung verantwortlich gemacht. So

errechneten Sawka et al. (2003) eine Post-Test-Wahrscheinlichkeit eines Phäochromozytoms

54

bei einem Patienten mit positiven Plasmametanephrinen und Hypertonie von 3%, bei einem

Patienten mit einem adrenalen Inzidentalom und erhöhten Plasmametanephrinen von 25%.

Auch in Deutschland steht man dem Dilemma gegenüber, ein lebensgefährliches

Krankheitsbild wie das Phäochromozytom einerseits nicht verpassen zu wollen und können,

andererseits jedoch die hohen Kosten und Folgekosten des Screenings einer sekundären

Hypertonie vermeiden zu wollen. Ein mögliches Lösungskonzept muss an vielen Punkten

angreifen. So ist zum einen ein Routinescreening auf ein Phäochromozytom bei Patienten mit

Hypertonie nicht notwendig. Viel wichtiger ist, dass der erfahrene Arzt die oftmals typische

Symptomatik des Phäochromozytompatienten erkennt und die Wahrscheinlichkeit auf das

Vorhandensein eines endokrinologischen Tumors analysiert (Goldstein et al. 1999, Mannelli

et al. 1999, Young WF 2007). Darüber hinaus können biochemische Tests, die besser (vor

allem in der Spezifität), günstiger und damit breiter verfügbar sind, die Diagnostik wesentlich

erleichtern. Der in dieser Studie getestete RIA (bzw. auch HPLC in Speziallaboratorien)

scheint dies zu ermöglichen.

In Abbildung 23 ist ein möglicher diagnostischer Ablauf zur Phäochromozytomdiagnostik

dargestellt. Er betont den Stellenwert der Metanephrine im Plasma, indem diese auf Grund

ihrer hohen diagnostischen Sensitivität und Spezifität als Initialdiagnostik des

Phäochromozytoms vorgeschlagen werden. Sollte keine Erhöhung der Metanephrine im

Plasma detektiert werden, so ist keine weitere Diagnostik hinsichtlich eines

Phäochromozytoms notwendig. Bei einer Erhöhung der Metanephrine um das mindestens 4-

fache gilt die Diagnose Phäochromozytom als gesichert und es sollte eine bildgebende

Diagnostik eingeleitet werden. Bei nur leichter Erhöhung der Plasmametanephrinwerte stellt

der 1981 von Bravo et al. vorgestellte Clonidinsuppressionstest weiterhin ein Mittel dar,

falsch-positive von richtig-positiven Testergebnissen zu unterscheiden (Bravo et al. 1981). In

Abhängigkeit des jeweiligen Befundes schließt sich auch hierauf eine anatomische und

funktionelle Bildgebung zur Lokalisation und Differenzierung des Tumors an. Ein nicht zu

unterschätzender Aspekt ist allerdings die Existenz von so genannten klinisch (Normotension

etc.) und biochemisch ‚silent’ Phäochromozytomen, die in den letzten Jahren insbesondere

durch die verbesserten bildgebenden Maßnahmen in den Fokus der Wissenschaft gelangt sind

(Kopetschke et al. 2009). Hier sind weitere Forschungen notwendig, um eine verbesserte

biochemische Diagnostik und Therapieeinleitung zu gewährleisten.

55

refraktäre Hypertonie, Risikogruppe

freie Plasmametanephrine (RIA)

sehr hoch (>4fach) grenzwertig, 2-3fache Erhöhung

negativ

Clonidin-Test

Phäo

ausgeschlossen

biochemische Bestätigung

CT / MRT des Abdomen

keine Raumforderung

Raumforderung CT / MRT Hals

keine Raumforderung

MIBG-Szinti / PET / Octreotidscan negativ

Phäo ausgeschlossen

Phäo bestätigt

operative Behandlung

Abbildung 23 Diagnostisches Vorgehen bei Verdacht auf Phäochromozytom. Abkürzungen: CT, Computerto-

mographie, MRT, Magnetresonanztomographie; PET, Positronenemissionstomographie, in Anlehnung an:

Karagiannis et al. 2007.

56

6 Zusammenfassung

Der hier verwendete RIA zeigt eine hohe diagnostische Sensitivität und Spezifität bei der

Bestimmung der freien Metanephrine im Plasma.

Der Einsatz des RIA bei Patienten mit dem Verdacht auf ein Phäochromozytom erscheint

nach Datenlage dieser Studie eine sinnvolle diagnostische Option, die gegenüber anderen

Methoden (u. a. HPLC, GC-MS) einige Vorteile aufweist:

Der RIA ist relativ zeitnah durchzuführen, kostengünstig und dadurch breit verfügbar.

Die exakte Analyse der freien Plasmametanephrine ist auch bei Patienten mit

Komorbiditäten (z.B. Niereninsuffizienz) möglich.

Eine genaue Bestimmung der freien Plasmametanephrine im Blut ist durch die schnell

und einfach zu realisierende Probenasservierung auch im ambulanten Bereich

möglich.

Es konnte keine Korrelation zwischen dem Lebensalter der Patienten und der Höhe der

Plasmametanephrinwerte festgestellt werden. Dahingehend ist eine altersspezifische

Anpassung der Grenzwerte der freien Plasmametanephrine nicht notwendig.

Die freien Plasmametanephrine mittels RIA scheinen für das postoperative Follow-up

geeignet zu sein. Ein rascher postoperativer Abfall des Normetanephrin und Metanephrin

einhergehend mit einer deutlichen klinischen Verbesserung der Symptomatik ist bei den

meisten benignen Verläufen zu beobachten. Bei einem malignen Phäochromozytom scheinen

die freien Plasmametanephrine auch im weiteren Verlauf erhöht zu bleiben. Die Daten dieser

Studie sind jedoch auf Grund einer zu geringen Patientenanzahl nur eingeschränkt

aussagekräftig. Weitere Untersuchungen müssen deshalb zur Beantwortung dieser

Fragestellung erfolgen.

Auf Grund der Ergebnisse dieser Studie ist eine Beeinflussung der Plasmametanephrinwerte

durch Erkrankungen wie arterielle Hypertonie, Niereninsuffizienz oder Diabetes mellitus

unwahrscheinlich bzw. nur in geringem Maße vorhanden. Jedoch scheint eine Interferenz des

RIA mit antihypertensiven Medikamenten wie Clonidin oder Moxonidin möglich. Hier sind

weitere Untersuchungen nötig, um diesen Verdacht zu bestätigen oder auszuschließen.

57

In dieser Arbeit zeigte sich weiterhin, dass auch ohne das Befolgen spezifischer

Verhaltensregeln vor der Blutentnahme (z.B. nächtliche Nahrungskarenz, Entnahme des

Blutes aus einer Venenverweilkanüle) keine vermehrten falsch-positiven Messergebnisse

auftreten.

Der getestete RIA bietet sich somit für den Einsatz in der Routinediagnostik des

Phäochromozytoms an, wodurch verbesserte Aussagen zum Ausschluss bzw. zur Bestätigung

der Anwesenheit des Tumors möglich werden.

58

Abkürzungsverzeichnis

Aldosereduktase AR

Alkoholdehydrogenase ADH

Catechol-O-Methyltransferase COMT

Chromogranin A CgA

Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA

Flüssigchromatographische Massenspektrometrie LC-MS

Gaschromatographische Massenspektrometrie GC-MS

High Pressure Liquid Chromatography HPLC

Metanephrin MN

Monoaminooxidase MAO

Multiple Endokrine Neoplasie MEN

Metajodobenzylguanidin-Szintigraphie MIBG-Szintigraphie

Neurofibromatose 1 NF 1

Normetanephrin NMN

Paragangliomsyndrom 1-4 PGL 1-4

Polyethylenglykol PEG

Radioimmunoassay RIA

Rearranged during Transfection RET

Succinat-Dehydrogenase-Subunit A-D SDHA-D

Vanillinmandelsäure VMS

Von Hippel-Lindau-Syndrom VHL

3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol MHPG

3,4-Dihydroxyphenylglycolaldehyd DHPGA

3,4-Dihydroxyphenylglycol DGPG

59

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 Differentialdiagnose der hereditären Phäochromozytome und

Paragangliome

Abbildung 2 Abbauwege der Katecholamine

Abbildung 3 Möglichkeiten der Katecholamin- und Metanephrinbestimmung

Abbildung 4 Charakteristika von 163 untersuchten Patienten

Abbildung 5 Charakteristika der Patienten zur Validierung der Grenzwerte

Abbildung 6 Plasmametanephrine bei 50 Patienten mit klinischem Verdacht

jedoch ohne Nachweis eines Phäochromozytoms zur Validierung

der Grenzwerte

Abbildung 7 Diagnostisches Prozedere bei 163 Patienten mit Verdacht auf

bzw. zum Ausschluss eines Phäochromozytoms

Abbildung 8 Charakteristika von 14 Patienten mit Erhöhung der

Plasmametanephrine

Abbildung 9 Plasmakonzentration von Metanephrin und Normetanephrin mit

RIA bei 113 Patienten mit klinischem Verdacht auf

Phäochromozytom

Abbildung 10 Plasmakonzentration der Metanephrine bei 8 Patienten mit

Phäochromozytom mit RIA

Abbildung 11 Plasmanormetanephrin bei 7 Phäochromozytompatienten prä- und

postoperativ mit RIA

Abbildung 12 Plasmametanephrin bei 7 Phäochromozytompatienten prä- und

postoperativ mit RIA

60

Abbildung 13 Vergleich der Plasmakonzentration der Metanephrine mit HPLC

und RIA bei 22 von 113 Patienten mit klinischem Verdacht auf

Phäochromozytom

Abbildung 14 Charakteristika von 2 Patienten mit NMN-Erhöhung mittels

HPLC

Abbildung 15 Urinkatecholamine mittels HPLC bei 79 von 113 Patienten mit

klinischem Verdacht auf Phäochromozytom

Abbildung 16 Urinmetanephrine mittels HPLC bei 76 von 113 Patienten mit

klinischem Verdacht auf Phäochromozytom

Abbildung 17 Chromogranin A im Serum bei 67 von 113 Patienten mit

klinischem Verdacht auf Phäochromozytom

Abbildung 18 2fache Bestimmung des Normetanephrin im Plasma bei 19

Patienten ohne Phäochromozytom mit RIA

Abbildung 19 2fache Bestimmung des Metanephrin im Plasma bei 19 Patienten

ohne Phäochromozytom mit RIA

Abbildung 20 Plasmanormetanephrinwerte in Abhängigkeit vom Alter der

Patienten

Abbildung 21 Plasmametanephrinwerte in Abhängigkeit vom Alter der

Patienten

Abbildung 22 Sensitivität und Spezifität der ermittelten Laborparameter

Abbildung 23 Diagnostisches Vorgehen bei Verdacht auf Phäochromozytom

61

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82

Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe

oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass

Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten

haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass

die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer

anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens

vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene

Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird,

wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt

an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.

15.03.2010............................... ....................................

Datum Unterschrift

83

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Ulrich Miehe

Anschrift: Brockhausstr. 20

04229 Leipzig

Geburtsdatum: 06.06.1981

Geburtsort: Magdeburg

Nationalität: deutsch

Familienstand: ledig, keine Kinder

Schullaufbahn

08/1988-07/2000 Grundschule Magdeburg

Gymnasium Magdeburg

Gymnasium: Oschersleben

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife, Note 1,2

Grundwehrdienst

09/2000-07/2001 Panzergrenadierlehrbataillon 92 in

Munster/Niedersachsen

Studium

10/2001 Studium der Humanmedizin, Universität Leipzig

08/2003 Ärztliche Vorprüfung, Note 2,6

08/2006 Beginn des Praktischen Jahres

Famulaturen

02/2004 Kardiologie, Klinikum St. Georg/Leipzig

02/2005 Gastroenterologie, University of Sydney/Australia

02/2006 Notfallambulanz, Universitätsklinikum Leipzig

03/2006 Neurologie, Universitätsklinikum Leipzig

Praktisches Jahr

08/2006-12/2006 Chirurgie am Spital Bern Tiefenau/Schweiz

12/2006-04/2007 Innere Medizin: 8 Wochen Universitätsklinikum

Leipzig (Rheumatologie), 8 Wochen Herzzentrum

Leipzig (Kardiologie)

04/2007-08/2007 Pädiatrie: Universitätsklinikum Leipzig

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Berufliche Erfahrungen Seit 02/2008 Assistenzarzt in Weiterbildung, Universitätsklinikum

Leipzig, Abteilung für Pädiatrie

Promotion

Evaluation eines Radioimmunoassays zur Bestimmung der freien Metanephrine im Plasma

im Vergleich zu bisher angewandten biochemischen Verfahren in der Diagnostik des

Phäochromozytoms. Beginn: 06/2004

Betreuer:

Prof. Dr. med. C. A. Koch, Division of Endocrinology, University of Mississippi Medical

Center, Jackson, Mississippi/USA

Prof. Dr. rer. nat. J. Kratzsch, Institut für Laboratoriumsmedizin, Klinische Chemie und

Molekulare Diagnostik, Universitätsklinkum Leipzig

Zusatzqualifikationen

Sprachen: Sehr gute Kenntnisse in Englisch und Latein

Grundkenntnisse in Französisch

EDV-Kenntnisse: Microsoft Office, SPSS

Fortbildungskurse 15th

Budapest Nephrology School 26.8-31.8.2008

Hochschullehrertraining Leipzig 3.10.-06.10.2009

Vorträge: Schuster, V., Falkenberg, C., Miehe, U. 8. Interdisziplinäres

Leipziger Allergiegespräch, 27.5.2009

Prenzel, F., Miehe, U., Hammerschmidt, S. „Kinderzentrum-

Kinderpneumologie“, Leipzig, 30.09.2009

Interessen: Leichtathletik und Handball (jeweils 7 Jahre Vereinsspieler)

Leipzig, 15.03.2010