Photochemistry ondPhotobioZogy. 1966 Vol. 5 , pp. 261-264. Pergamon Press Ltd. Printed in Great Britain

MISCHKLONE U.V.-INDUZIERTER MUTANTEN BEIM PHAGEN KAPPA

R. W. KAPLAN Institut fiir Microbiologie, Universitat, Frankfurt/Main

(Eingegaren am 12 November 1965)

Abstract-Clear-plaque mutations of phage K of Serratia are induced by extracellular u.v.- irradiation in a 2-hit process. The 2-hit-nature cannot be due to induction of one hit in each of the two DNA-strands since replating the contents of 97 wildtype plaques of u.v.-survivors (u.v.-dose 4.5 min) revealed only 1 case of heterozygosity; at least 20 cases would have been expected if phage with 1-hit-mutations formed phages looking like wildtype. On the other hand, oniy 1 case of heterozygosity was observed among replatings of 94 c-mutants induced by the u.v.-dose 4.5 min (survival lo-*); most of the plaques contained pure c-type. The pure c-mutant clones are very probably due to ‘recessive’ lethal lesions in the nonpremutated DNA-strand. This is indicated by the dose dependence of the frequency of heterozygotes; a t a dose of 3 min U.V. (survival 1.2 x lo-*) 9 heterozygotes were observed among 95 mutants tested. From these numbers the rate of induction by U.V. of the ‘recessive lesions’ can be calculated. The data at the higher dose are in satisfactory agreement with the calculated rate. Also other types of plaque mutations (e, I , b) showed heterozygosity. Two cases of abnormal hetero- zygosity were observed ; one contained 2 stable mutant types (c and b), another one wildtype, c - t m and !-type.

DER komplementare Bau der beiden Nukleotid-Strange der DNS bewirkt, dass bereits ein Strang die volle genetische Information tragt. Wenn eine Mutation nur einen der beiden Strange andert, den anderen aber normal belasst, entsteht bei weiterer semikon- servativer Replikation beider Strange ein Mischklon aus Mutanten und Normalen. Solche ‘molekulare Heterozygotie’ wurde verschiedentlich bei Auslosung von Mutationen durch Chemikalien gefunden, z.B. durch Nitrit bei den Phagen T2 und T4@9 2, und bej E. ~ o Z i , ( ~ ) durch Hydroxylamin bei T4(4) und bei Hefe(5) oder durch BU beim Phagen T4@) u. bei E. c0Zi.(~1 8, Jedoch wurden in solchen Experimenten z.T. auch reine Mutantenklone beobachtet. Sofern die reinen Klone mit der Mutagendosis haufiger werden u. bei hohen Dosen vorherrschen, konnen sie durch die Annahme von ‘rezessiven’ Letaltreffern im unmutierten DNS-Strang erklart werden, welche die Replikation des pramutierten Stranges zulassen und nur die des getroffenen ~erhindern.(~) In anderen Fallen zeigte sich jedoch keine Dosisabhangigkeit,(2) was bisher noch unverstanden ist. Vorwiegend oder ausschliess- lich Hone nur aus Mutanten wurden u.a. bei lac--Mutationen nach BU-Einba~,(~) T5r-Mutationen unter LichtfAcridin-Wirkung(lO) bei E. coli sowie fur pyr--Mutationen durch Nitrit bei Neurospora(ll) gefunden, selbst bei niederen Mutagendosen. Anscheinend wird hier nur ein Strang repliziert (2.B. der andere fur die mRNS-Bildung verwendet) oder die Pramutation umfasst beide Strange. Rontgenstrahlen induzierten bei Paramae- cium(12) u. bei E. c01i(13) ebenfalls schon bei niederen Dosen vorwiegend reine Mutantenk- lone. Auch durch U.V. wurden bei E. coli neben gemischten viele reine Mutantenklone

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erzeugt(14) u. bei Serratia war der Anteil u.v.-induzierter reiner Farbmutantenkolonien aus einkernigen Ruhezellen deutlich hoher als aus mehrkernigen Wuchsphasezellen. (lb)

Bei Hefe zeigte U.V. jedoch Mischklone, deren Anteil mit der Dosis abnahm.(6) Der Phage K ergibt nach extrazellularer u.v.-Bestrahlung bis zu wenige Prozente Muta-

tionen, vorwiegend vom Klarplaque-(c)-Typ, auf dem unbestrahlten Indikatorstamm HY von Serratia marcescens. Die konkave u.v.-Dosiskurve deutet auf einen 2-Treffer- prozess fur die Mutationen hin, wahrend die Inaktivierung semilogarithmisch linear verlauft. (16) Eine Moglichkeit, die 2-Treffernatur der Mutationen zu erklaren, bestunde in der Annahme, dass nur die in beiden DNS-Strangen durch das U.V. pramutierten Phagen- partikel erkennbare Mutantenplaques ergeben, wahrend die nur in einem Strang pramu- tierten Partikel (Heterozygote) infolge uberdeckung der Mutanten durch den Normaltyp unmutiert erscheinende Plaques bilden, die sich erst in Nachkultur als gemischt aus Mutan- ten u. Wildtyp enveisen wiirden.

sind 1,5 bis 2 Prozent c-Mutan- tenplaques zu finden. Dies entsprache der Wahrscheinlichkeit (1-e -pD)2 z ( P D ) ~ fur mindestens eine Pramutation in jedem der beiden DNS-Strange, wenn in einem Strang im Mittel pD Mutationstreffer durch die Dosis D erzeugt wurden. Demnach waren in dem Versuch pD= .\/(1,5-10-2)=0,12 Mutationstreffer pro Strang geschehen. Die dann erwartete Haufigkeit von Phagen, die in nur einem (beliebigen) der 2 Strange pramutiert sind ergabe sich zu 1-e-2‘o~12=0,214. Also sollten mindestens 21 Prozent der Plaques aus Heterozygoten entstanden sein ; entsprechend der obigen Annahme wurden sie wie Wild- typplaques aussehen.

Zur Priifung dieser Annahme wurden 97 beliebige Wildtypplaques, welche aus 4,5 min u.v.-bestrahlten (- 2700 erg/mmz) Phagen entstanden waren, angestochen, einzeln resus- pendiert und in je 2 Platten nachkultiviert. Von diesen 97 Nachkulturen mit je mindestens etwa lo00 Plaques war nur eine gemischt aus Wildtyp und N 10 Prozent Mutanten. Diese Mutanten waren vom 1-Typ, der gegenuber dem ganz klaren c-Mutantentyp durch noch leichte Triibung der Plaques den starker truben des Wildtyps ahnelt. Die Wahrscheinlich- keit, nur einen oder keinen Mischplaque zu finden, wenn aufgrund der Hypothese im Mittel m=20 zu erwarten waren, ist P= (l+m)e-m= 21e-20= 4.10-*. Die Hypothese ist also signifikant unwahrscheinlich. In Versuchen, in denen durch c-Mutanten und Wildtyp mischinfizierte Zellen zusammen mit Indikatorbakterien geplattet wurden, erschie- nen viele sektorierte oder schlieriggemischte Plaques rnit gemischten Nachkulturen, wahrend sowohl die reinen Wildtyp wie auch reine Mutantenplaques meist reine Nachkulturen ergaben. Mischklone eneugen also nur selten rein erscheinende Plaques. Die 2-Treffer- natur der u.v.-induzierten c-Mutationen kann somit nicht darauf beruhen, dass Phagen- partikel mit nur einem Treffer (in einem DNS-Strang) zwar ‘heterozygot’ sind, aber un- mutiert erscheinende Plaques erzeugen.

Um zu priifen, ob das U.V. im K-Phagen uberhaupt molekularheterozygote Mutationen auslost, wurden Nachkulturen von 94 c-Plaques (darunter 12 von 1-Typen) gemacht, die nach Bestrahlung des freien Phagen mit der Dosis 4,5 min entstanden waren. Dabei wurden nur solche Plaques gewahlt, die minestens 2,5 mm vom Rand des Nachbarplaques entferent lagen. Vorversuche hatten ergeben, dass Phagenpartikel im Weichagar bis maximal - 1,5 mm weit wahrend der Versuchszeit diffundieren konnen. Unter den 94 c-Nachkulturen enthielten fast alle reinen c-Typ. Nur eine zeigte - 30 Prozent c-Mutanten und 70 Prozent Wildtyp, die beide in weiteren Nachkulturen stabil blieben. Zwei andere der 94 Erstnachkulturen enthielten neben dem c-Typ nur etwa 1 Prozent bzw. 0,03 Prozent

Bei einer u.v.-Dosis von 4,5 min (Uberleben - 1

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Wildtyp, der in weiteren Nachkulturen wieder auftrat, also wohl auf haufiger spontaner Ruckmutation beruht. Somit wurde nur eine oEenbar heterozygote u.v.-induzierte c-Mutation unter den 94 gepriiften gefunden

Das starke Vorwiegen reiner Mutantenklone konnte auf rezessiven Letaltreffern im nichtpramutierten DNS-Strang beruhen. Sollte dies zutreffen, so miisste bei einer geringeren u.v. - Dosis der Antcill der Phagen mit rezessivem Letaltreffer geringer sein und damit die Haufigkeit von Mischklonen unter den mutierten Plaques hoher. Ein Versuch bei der u.v.-Dosis 3 min (Uberleben 1,2 x 10-3 hatte das erwartete Ergebnis: Unter 95 Nachkulturen genugend isoliert liegender c-Plaques waren 9 gemischt mit im Mittel 15 Prozent Wildtyp (Extremwerte 40 und 2 Prozent) neben dem c-Typ. Der unter 50 Prozent liegende Anteil des Wildtyps konnte auf etwas schnellerer Vermehrung der c-Typhen in der Zelle oder im Plaque beruhen. Weitere Nachkulturen erwiesen die in allen Mischplaques vorhandenen Wild- und c-Typen als stabil, sodass mutative Heterozy- gotie angenommen werden darf. Der Unterschied der Hauligkeiten von Heterozygoten bei beiden u.v.-Dosen (1/94 gegen 9/95) ist signifikant (x=8,4/3,4=2,47, P=0,012; Mutung- bereich nach Tafel 4(17)). Wegen dieser sehr wahrscheinlichen Dosisabhangigkeit diirften die reinen Mutantenklone wenigstens zum erheblichen Teil auf dem Ausschalten des einen DNS-Stranges durch rezessive Letallasionen beruhen und hochstens teilweise auf 2-strangigen Pramutationen.

Aus den erhaltenen Werten kann die Haufigkeit der Induktion solcher Letallasionen berechnet werden. Nimmt man fur die Entstehung solcher Lasionen einen 1-Treffer- prozess an, so ist das Verhdtnis reiner zu gemischten Mutantenklonen r/g = e+tD-l bei der u.v.-Dosis D und der Treffwahrscheinlichkeit fur rezessive Lasionen t.@) Fiir D=3 min und r/g=S6/9 ergibt sich t=0,79 rezessive Letaltreffer / min U.V. Aus dem Oberleben der Plaquebildungspotenz u =1,2 - bei dieser Dosis ist die Wahrscheinlichkeit fiir inakti- vierende Treffer (‘dominante’ Letallasionen) k=2,3(log u)/D= 1,5/min u.v., also etwa doppelt so gross.

Aufgrund des bei D=3 min gewonnenen Wertes t kann man das fur die hohere Dosis 4,5 min zu erwartende Verhdtnis r /g berechnen und erhalt 33/1 und also 2,9 Prozent Heterozygote. Dies passt innerhalb des Fehlerbereiches gut zu dem gefundenen Wert 93/1 entsprechend 1,OS Prozent (oberer Matungsbereich fur P=0,05 ist + 5,2 Prozent). Dieser Befund stutzt die Annahme, dass der Anteil reiner Mutantenklone meist oder nur durch rezessive Letallasionen im nichtpramutierten DNS-Strang verursacht wird. Aus dieser Annahme und der konkaven Kurve der c-Mutationen folgt, dass die ‘Heterozygoten’, zumindest meist, durch 2 u.v.-Treffer enstehen.

Neben vorwiegend c-Mutationen erzeugt U.V. im K-Phagen einen kleinen Anteil anderer Plaquemutationen.(17) Auch bei solchen seltenen Typen wurde nach 3 min U.V. z.T. Heterozygotie gefunden : Von den 4 Nachkulturen des e-Typs (enger Farbhof) erwiesen sich 3 rein und eine heterozygot. Unter diesen 4 e-Mutanten konnten sich spontane befinden, da dieser Typ in der unbestrahlten Phagenpopulation mit 0,4 Prozent auftritt. Die eine Nachkultur des sehr seltenen t-Tpys (truberes Plaqueloch als der Wildtyp) zeigte Heterozygotie. Von den 3 nachkultivierten b-Mutationen (blasser Farbhof), die sicherlich u.v.-induziert, da spontan sehr selten sind, war eine rein und zwei gemischt. Die eine aus b und eb gemischte erwies sich als instabil, also nicht heterozygot, und zwar mutiert dieser b-Typ spontan haufig nach eb. Die andere gemischte enthielt -30 Prozent c und 70 Prozent b; beide Typen sind vollig stabil.

Im letzten Fall scheint eine Heterozygote mit je einer anderen Mutation in jedem Strang

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vorzuliegen. Auch von anderen Autoren wurden gelegentlich 2-Mutanten-Mischklone beschrieben, z.B. nach Rontgenbestrahlung bei Drosophila(lB) und bei Hefe nach Hydro- xylaminbehandlung. (5) Ein zweiter Fall eines Mehrmutantenklons wurde unter den 95 c-Nachkulturen (neben den 9 normalen Heterozygoten) aus dem 3-min-u.v.-Versuch gefunden; diese Nachkultur enthielt N 10 Prozent Wildtyp, 10 Prozent c- und 80 Prozent I-Mutanten. Da alle 3 Typen stabil sind, liegt wohl eine besondere Heterozygotie vor, die sich von dem anderen 2-Mutantenklon durch den zusatzlich vorkommenden Wildtyp unterscheidet. Da ein Zusammentreffen von 2 unabhangigen u.v.-Mutationen sehr selten zu erwarten ist (- durften diese Ausnahmefalle wohl auf korrelierte Ereignisse zuriickgehen. Sie sind wahrscheinlich Ergebnisse noch unbekannter, seltener Arten von 'Fehlern' bei der Replikation strahlengeschadigter DNS.

Anerkennung-Die Deutsche Forschungsgemekhaft unterstiitzte die Arbeit durch eine Ekihiife. Frau H. Stoye sei fiir die gewissenhafte technische D u r c h f i i g der Versuche gedankt.

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