Regulation des Zellcylus - uni-potsdam.de 2016.pdf · Modell: Saccharomyces sereviciae Identifizierung von Zellzyklusregulatoren: CDKs 25°C 35°C 35°C nicht CDC-Mutanten Mutagenisierte

Regulation des Zellcylus

Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs)

Dr. F. Neuschäfer-Rube

Cyclin-abhängige Kinasen: Motoren und Schalter des Zellzyclus

Dr. F. Neuschäfer-Rube

M

S

Der Zellzyklus

S = DNA-Synthese

(Replikation)

Der Zellzyklus

M

M = Mitose

Verteilung der Chromosomen

S = DNA-Synthese

Der Zellzyklus

Der Zellzyklus: Teilschritte der Mitose

Prophase Metaphase Anaphase Telophase

M = Mitose

S = DNA-Synthese

G1

Der Zellzyklus

G2

S = DNA-Synthese

G2 = Kontrolle der

DNA-Synthese

Der Zellzyklus

M = Mitose

G1

M = Mitose

S = DNA-Synthese

G1 = Zellwachstum

Der Zellzyklus

G2 = Kontrolle der

DNA-Synthese

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

z.B. ausdifferenzierte

Zellen

G1 = Zellwachstum

G2 = Kontrolle der

DNA-Synthese

Der Zellzyklus

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum

G2 = Kontrolle der

DNA-Synthese

Kontrollpunkte des Zellzyklus

Wie wird der korrekte

Abblauf des Zellzyklus

kontrolliert?

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum

G2 = Kontrolle der

DNA-Synthese


Wie wird der korrekte

Abblauf des Zellzyklus

kontrolliert?

Kontrollpunkte

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum

G2 = Kontrolle der

DNA-Synthese


Restriktionspunkt

intrinsisch: Zellgröße erreicht?

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum

G2 = Kontrolle der

DNA-Synthese


Restriktionspunkt


extern: Wachstumsfaktoren?

M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum

G2 = Kontrolle der

DNA-Synthese


G2-Kontrolle

Replikation vollständig?

DNA intakt?

Restriktionspunkt



M = Mitose

S = DNA-Synthese

Go = Ruhezustand

G1 = Zellwachstum

G2 = Kontrolle der

DNA-Synthese


G2-Kontrolle

Replikation vollständig?

DNA intakt?

Metaphasen-Kontrolle

korrekte

Chromosomenanlagerung?

Restriktionspunkt

intern: Zellgröße erreicht?


M = Mitose

S

Go

G1G2


Durch welche biochemischen

Faktoren wird der Übergang

der Zellzyklusphasen

reguliert?

S-Phase

S-Phase

G1

G2

G1G2

Zellfusionsexperimente mit synchronisierten HeLa-Zellen

+

+

+

S-Phase

S-Phase

G1

G2

G1G2


+

+

+

S-Phase

S-Phase

G1

G2

G1G2


+

+

+

Zellfusionsexperimente zeigen 3 Phänomene:

1. Nur Zellen in der G1-Phase sind kompetent, um in die S-Phase ( DNA-Replikation) überzugehen

2. Nur Zellen in der S-Phase besitzen einen Aktivator,der die DNA-Replikation in kompetenten Zellen der G1-Phase

stimulieren kann.

3. Kerne von Zellen der G2-Phase können keine DNA-Replikation durchführen, solange die Mitose nicht abgeschlossen ist.

Auslösen der DNA-Synthese in der frühen S-Phase durch löslichen Faktor

G1/S-Phase: S-Phase-promoting- factor (SPF)G2/M-Phase: Mitosis-promoting-factor (MPF)




stimulieren kann.







stimulieren kann.







stimulieren kann.







stimulieren kann.




Leland H Hartwell

Identifizierung von Zellzyklusregulatoren: CDKs

25°C

35°C

Identifizierung Temperatur-sensitiver CDC (Cell-Division-Cycle) Mutanten

Modell: Saccharomyces sereviciae

Mutagenisierte Zellen





25°C

35°C

35°C

nicht CDC-Mutanten


Knospung

Eintritt in den

Zellzyklus




25°C

35°C

35°C

CDC-START-Mutante

nicht CDC-Mutante


kein Eintritt in den

Zellzyklus

35°C 35°C

Identifizierung des CDC-START Gens

Wt CDC-START-Gen


CDC-START-Mutante

Wt Gen X

35°C 35°C

Identifizierung des CDC-START-Gens

Wt CDC START Gen


CDC-START-Mutante

Wt Gen X

Cyclin-abhängige Kinase (CDK)

Analyse

Entdeckung Cyclin-abhängiger Kinasen (CDKs):

Medizin Nobelpreis 2001

Leland H Hartwell Tim HuntPaul Nurse

CDKs der Hefe Cycline des Seeigels

Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs): Heterodimere Proteine

C.L. Card et al.,

EMBO Journal 2000

katalytische Untereinheit: CDK regulatorische Untereinheit: Cyclin


C.L. Card et.al.,

EMBO Journal 2000

katalytische Untereinheit: CDK

- Serin/Threonin-Kinasen

- Hefe: eine CDK

- Säugetiere: CDK1 - CDK7

- hohe Identitität

- konservierte Cyclin-Bindungsstelle

regulatorische Untereinheit: Cyclin

C.L. Card et.al.,

EMBO Journal 2000

katalytische Untereinheit: CDK

- Serin/Threonin-Kinasen

- Hefe: eine CDK

- Säugetiere: CDK1 - CDK7

- hohe Identität

- konservierte Cyclin-Bindungsstelle

-

regulatorische Untereinheit: Cyclin

- Cyclin A-H

- heterogene Proteinfamilie

- zyklische Konzentrationsänderungen

im Zellzyklus

- Kernlokalisation


M

S

G1

G2

CDK/Cyclin-Komplexe im Wirbeltier-Zellzyklus

Restriktionspunkt

Go

CDK2/CyclinD

CDK4/CyclinD

CDK6/CyclinD

CDK2/CyclinE

G1/S-Phasen

Übergang

M

S

G1

G2


Restriktionspunkt

Go

CDK2/CyclinE

CDK2/CyclinA

G1/S-Phasen

Übergang

CDK2/CyclinD

CDK4/CyclinD

CDK6/CyclinD

M

S

G1

G2


Restriktionspunkt

Go

CDK2/CyclinE

CDK1/CyclinB

G1/S-Phasen

Übergang

G2/M-Phasen

ÜbergangCDK2/CyclinD

CDK4/CyclinD

CDK6/CyclinD

CDK2/CyclinA

CDKs: Motoren des Zellzyklus

Welche "Motorwirkung" haben CDKs im

Zellzyklus ?

Durch die Phosphorylierung welcher Substrate

werden Zellzyklusphasen eingeleitet ?

CDK Substrate: Initiation der S-Phase

Bedeutung von CDKs

bei der Initiation der S-Phase


NH2- -COOHA B

Retinoblastom-Protein (Rb)

- Schlüsselsubstrat der S-Phase -

nucleäres Protein, 110 kDa


NH2- -COOHA B




Bindung des

Transkriptionsfaktors E2F


NH2- -COOHA B




Bindung des


Rb wirkt als Tumorsupressorgen


NH2- -COOHA B

E2F: zentraler Transkriptionsfaktor bei der Induktion

von S-Phase Genen




Bindung des



NH2- -COOHA B

Bindung des


P P P P P P P P PP




E2F: zentraler Transkriptionsfaktor bei der Induktion

von S-Phase Genen

Rb wirkt als Tumorsupressorgen


Rb

E2F

Rb

Repression

E2F-kontrollierter Gene


Rb

E2F

Induktion


P P P

CDK 2

Cyclin E

Rb

E2F

Rb

Repression


E2F: Initiator der S-Phase

E2F


DNA-Pol I

dNTP-Synth.

CDK 2

Cyclin E

Rb

P P P


E2F


Cyclin E

E2F

DNA-Pol I

dNTP-Synth.

CDK 2

Cyclin E

Rb

P P P

positiv autoregulatorischer

Verstärkungsmechanismus!


E2F


Cyclin E

E2F

DNA-Pol I

dNTP-Synth.

CDK 2

Cyclin E

Rb

P P P


Verstärkungsmechanismus!

"Lawinenhafter"

Übergang über den

Restriktionspunkt

S-Phase

CDK Substrate: Mitose

Bedeutung von CDKs

bei der Mitose


Ein Teilschritt der Mitose ist die Auflösung der Kernmembran

InterphaseMitose


Chromatin Kernlamina

innere Kernmembran



Desintegration

der Kernlamina

Auflösen der

Kernmembran

Mitose



CDK 1

Cyclin B

Desintegration

der Kernlamina

Auflösen der

Kernmembran

Mitose

ATP



CDK 1

Cyclin B

Lamintetramer

Desintegration

der Kernlamina

Auflösen der

Kernmembran

Mitose

Laminnetzwerk

ATP



CDK 1

Cyclin B

Lamintetramer

-P P--P P-

phosphorylierte

Lamindimere

Desintegration

der Kernlamina

Auflösen der

Kernmembran

Laminnetzwerk

Mitose

ATPATP

M

S

G1

G2


Restriktionspunkt

Go

CDK2/CyclinE

CDK1/CyclinB

G1/S-Phasen

Übergang

G2/M-Phasen

Übergang

CDK2/CyclinD

CDK4/CyclinD

CDK6/CyclinD

CDK2/CyclinA

Lamin-P

Rb-P E2F

CDKs: Schalter des Zellzyklus

Wie wird die Aktivität der CDKs im Zellzyklus

an- und ausgeschaltet?

Regulation der CDK-Aktivität

CDKinaktiv

Regulation der CDK-Aktivität: Cyclinkonzentration

inaktivCDK

CyclinCyclin

CDKinaktiv


inaktivCDK

CyclinCyclin

CDKinaktiv

P

nur CDK-Cyclin Komplexe

sind Substrate

Threonin-Kinase (CAK)

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

PATP

Veränderungen der CDK Struktur durch Cyclin-Bindung

Veränderungen der CDK Struktur durch Cyclin-Bindung

+ CAK


inaktivCDK

CyclinCyclin

CDKinaktiv

P

Cyclinkonzentration

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

ATP


Wie wird die Konzentration der Cycline im Zellzyklus

reguliert?


Cyclin


reguliert?


Neusynthese

durch transkriptionelle

Induktion

Cyclin

Regulation der Cyclinkonzentration: transkriptionelle Induktion

P

Beispiel: Induktion durch Wachstumsfaktorsignalketten


P

Beispiel: Induktion durch WachstumsfaktorsignalkettenW

F-RWF


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P


Proteinkinasen


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P

immediate early

genes


Proteinkinasen


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P

immediate early

genes

c-jun/c-fos (TF)


Proteinkinasen


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P

immediate early

genes

c-jun/c-fos (TF)

delayed genes

c-jun

c-fos


Proteinkinasen


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P

immediate early

genes

c-jun/c-fos (TF)

delayed genes

Cyclin D

Cyclin E

CDK2

CDK4

c-jun

c-fos


Proteinkinasen


P

WF

-RWF

TF-OH TF-O-P

immediate early

genes

c-jun/c-fos (TF)

delayed genes

Restriktionspunkt

(G1 S-Phase)

c-jun

c-fos


Cyclin D

Cyclin E

CDK2

CDK4

Proteinkinasen


reguliert?


Neusynthese

durch trankriptionelle

Induktion

Cyclin

Restriktionspunkt

(G1 S-Phase)

Abbau

durch Proteolyse

Regulation der Cyclinkonzentration: proteolytischer Abbau

CD

K1

-Ak

tiv

ität

Zellzyclus-Phase

G1 S G2 M G1 S G2 M

Beispiel: Regulation der CDK1-Aktivität durch Abbau von Cyclin B

Metaphase


CD

K1

-Ak

tiv

ität

Zellzyclus-Phase

G1 S G2 M G1 S G2 M

CDK1-Konzentration


Metaphase



Abbau von

CyclinB

CD

K1

-Ak

tiv

ität

Cy

clin

B-K

on

ze

ntra

tion

Zellzyclus-Phase

G1 S G2 M G1 S G2 M

CDK-1 Konzentration

Metaphase


NH2 COOH

Cyclin A,B

Destruction-Box


NH2 COOH

Cyclin A,B

Destruction-Box

NH2 COOH

Ubiquitin


NH2 COOH

Cyclin A,B

Destruction-Box

NH2 COOH

Ubiquitin Anaphase-promoting-complex

(APC, Ubiquitin-Ligase-Komplex)


NH2 COOH

Cyclin A,B

Destruction-Box

NH2 COOH

Ubiquitin

Markierung für

proteolytischen Abbau

Anaphase-promoting-complex



NH2 COOH

ProteasomAbbau

NH2 COOH

Cyclin A,B

Destruction-Box

NH2 COOH

Ubiquitin

Markierung für

proteolytischen Abbau

Anaphase-promoting-complex



Wie wird der proteolytische Abbau von Cyclin B reguliert?


CDK1

Cyclin B

G1-Phase

APC

inaktiv


Cyclin B

Synthese

Cyclin B

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1

APC

inaktiv


CDK1

Cyclin B

Cyclin B

Synthese

P

Metaphase

Cyclin B

APCAPC

P

inaktiv aktiv

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1


CDK1

Cyclin B

Cyclin B

Synthese

P

Metaphase

Cyclin B

APCAPC

P

inaktiv aktiv

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1

ATP


CDK1

Cyclin B

CDK1

Cyclin B

Cyclin B

Synthese

P

Polyubiquitinylierung

Metaphase

Cyclin B

APCAPC

P

inaktiv aktiv

Proteasom

Abbau

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1

ATP


CDK1

Cyclin B

CDK1

Cyclin B

Cyclin B

Synthese

P


Metaphase

Anaphase

Cyclin B

APCAPC

P

inaktiv aktiv

Proteasom

Abbau

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1

ATP


CDK1

Cyclin B

CDK1

Cyclin B

Cyclin B

Synthese

P


Metaphase

Anaphase

Cyclin B

APCAPC

P

inaktiv aktiv

Proteasom

Abbau

S, G2-Phase

G1-PhaseCDK1

negativ autoregulatorischer

Mechanismus

ATP


Neusynthese

durch transkriptionelle

Induktion

Cyclin

Restriktionspunkt

G1 S-Phase

Abbau

durch Proteolyse

Metaphase Anaphase

Abschluss der Mitose

Wachstumsfaktoren Autoregulation

Regulation der CDK-Aktivität: Phosphorylierung

inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

CDK

Cyclin

CDK

T14

Y15

P

P

inaktiv

inaktivP

T160 P

Threonin/Tyrosin-

Kinase

Cyclinkonzentration ATP

ATP


inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

CDK

Cyclin

CDK

T14

Y15

P

P

inaktiv

inaktiv

Threonin/Tyrosin

Phosphatase

P

T160 P

Regulation der CDK-Aktivität: Dephosphorylierung

Cyclinkonzentration

Threonin/Tyrosin-

Kinase

P

Pi

ATP

ATP


Regulation der CDK-Aktivität: Dephosphorylierung

Wie wird die Aktivierung der CDK durch

Dephosphorylierung reguliert?

CDK1

CyclinB

T14

Y15

P

P

inaktiv

P

T160 P

Regulation der CDK-Aktivität: Dephosphorylierung von CDK1

G2-Phase

Threonin/Tyrosin

Phosphataseinaktiv

G2-Phase


P P

Threonin/Tyrosin

Phosphataseaktiv

Threonin/Tyrosin

Phosphataseinaktiv

CDK1

CyclinB

T14

Y15

P

P

inaktiv

P

T160 P

CDK1

CyclinB

aktiv

T160 P

G2-Phase

Mitose

G2-Phase

Mitose

Pi


Aktivierung

P P

Threonin/Tyrosin

Phosphataseaktiv

Threonin/Tyrosin

Phosphataseinaktiv

CDK1

CyclinB

T14

Y15

P

P

inaktiv

T160 P

CDK1

CyclinB

aktiv

T160 P

P

G2-Phase

Mitose

G2-Phase

Mitose

Pi

ATP


Aktivierung

P P

Threonin/Tyrosin

Phosphataseaktiv

Threonin/Tyrosin

Phosphataseinaktiv

CDK1

CyclinB

T14

Y15

P

P

inaktiv

T160 P

CDK1

CyclinB

aktiv

T160 P

G2-Phase

Mitose

G2-Phase

Mitose


Verstärkungsmechanismus

Pi

ATP

Regulation der CDK-Aktivität: Inhibitoren

inaktiv

inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

T160 PCDK

CKI

CDKinaktiv

CKI

P

Cyclinkonzentration

Phosphorylierung

DephosphorylierungCDK-Inhibitoren

CDK

Cyclin

T14

Y15

P

P

inaktiv

T160 P

ATP

Pi

ATP


Beispiel: CKI p21

isosterische Hemmung durch Bindung im aktiven Zentrum

CDK 2

Cyclin E

CKI p21

G1 S-Phase


Wie wird die Konzentration von CKI p21 reguliert?

Regulation der CDK-Aktivität: Induktion des Inhibitors p21

p53 Transkriptionsfaktor, Tumorsupressor-Gen


p53

p53

CKI p21

Transkriptionsfaktor, Tumorsupressorgen


p53

p53

CKI p21

CDK 2

Cyclin E


CKI p21


p53

p53

CKI p21

T1/2

= 3

0 m

in

p53

Abbau


CDK 2

Cyclin E

CKI p21


p53

p53

CKI p21

T1/2

= 3

0 m

in

p53

Abbau

DNA

Schäden

T1/2

= 1

50 m

in


CDK 2

Cyclin E

CKI p21


p53

p53

CKI p21

T1/2

= 3

0 m

in

p53

Abbau

DNA

Schäden

T1/2

= 1

50 m

in


CDK 2

Cyclin E

CKI p21

G1-Phasen Arrest


p53

p53

CKI p21

T1/2

= 3

0 m

in

p53

Abbau

DNA

Schäden

T1/2

= 1

50 m

in


CDK 2

Cyclin E

CKI p21

Zeit für DNA-Reparatur

vor der Replikation G1-Phasen Arrest

p53

Mdm2p53

Mdm2

Abbau

Ubiquitin-Ligase

Regulation der CDK-Aktivität: Regulation von p53

p53

Mdm2p53

Mdm2p53

P

Abbau


p53

Mdm2p53

Mdm2p53

P MAPK

Abbau

Wachstumsfaktor-hyperstimulation


p53

Mdm2p53

Mdm2p53

P

DNA-Schaden

DNA-PK

ATMMAPK

Abbau


Proteinkinase


p53

Mdm2p53

Mdm2p53

P

DNA-Schaden

DNA-PK

ATM ATR

Mdm2

P

MAPK

Abbau


Proteinkinase


p53

Mdm2p53

Mdm2 p19/Arfp53

P

DNA-Schaden

DNA-PK

ATM ATR

Mdm2

P

MAPK

Abbau



p53

Mdm2p53

Mdm2 p19/Arf

Mdm2 p19/Arf

p53

P

DNA-Schaden

DNA-PK

ATM ATR

Mdm2

P

MAPK

Abbau



p53

Mdm2p53

Mdm2 p19/Arf

Mdm2 p19/Arf

p53

P

DNA-Schaden

DNA-PK

ATM ATR

Mdm2

P

MAPK

Abbau


Induktion von:p21GADD45

14-3-3-Zellzyklus-Arrest


Regulation der CDK-Aktivität: Übersicht

inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

CDKinaktiv

P

CyclinkonzentrationP

G1 S M G1ATP


inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

CDKinaktiv

P

Cyclinkonzentration

Phosphorylierung

Dephosphorylierung

G2 M

G1 S M G1

G2 M

ATP

CDK

Cyclin

T14

Y15

P

P

inaktiv

T160 P

ATP

Pi


inaktiv

inaktivCDK

CyclinCyclin

aktiv

T160 PCDK

Cyclin

T160 PCDK

CKI

CDKinaktiv

CKI

P

Cyclinkonzentration

Phosphorylierung

DephosphorylierungCDK-Inhibitoren

G1 S

G2 M

G1 S M G1

G2 M

ATP

CDK

Cyclin

T14

Y15

P

P

inaktiv

T160 P

ATP

Pi

M

S

G1G2

Cyclin-abhängige Kinasen: Motoren und Schalter des Zellzyclus

R

Dephosphorylierung Cyclinabbau

Cyclinsynthese

Inhibitoren

pRb/E2F

Lamin-P

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