Offizielles Organ: AGRBM, BRZ, DVR, DGA, DGGEF, DGRM, DIR, EFA, OEGRM, SRBM/DGE

Krause & Pachernegg GmbH, Verlag für Medizin und Wirtschaft, A-3003 Gablitz

Journal für

Reproduktionsmedizin und Endokrinologie– Journal of Reproductive Medicine and Endocrinology –

Andrologie • Embryologie & Biologie • Endokrinologie • Ethik & Recht • Genetik Gynäkologie • Kontrazeption • Psychosomatik • Reproduktionsmedizin • Urologie

Indexed in EMBASE/Excerpta Medica/Scopus

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Moderne Verfahren in der spermatologischen Diagnostik

Petrunkina AM, Töpfer-Petersen E, Waberski D

J. Reproduktionsmed. Endokrinol 2008; 5 (5), 262-271

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Die in unseren Webseiten publizierten Informationen richten sich ausschließlich an geprüfte und autorisierte medizinische Berufsgruppen und entbinden nicht von der ärztlichen Sorg-faltspflicht sowie von einer ausführlichen Patientenaufklärung über therapeutische Optionen und deren Wirkungen bzw. Nebenwirkungen. Die entsprechenden Angaben werden von den Autoren mit der größten Sorgfalt recherchiert und zusammengestellt. Die angegebenen Do-sierungen sind im Einzelfall anhand der Fachinformationen zu überprüfen. Weder die Autoren, noch die tragenden Gesellschaften noch der Verlag übernehmen irgendwelche Haftungsan-sprüche.

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(AGRBM),• der Sektion Reproduktionsbiologie und -medizin der Deutschen

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Moderne Verfahren in der

spermatologischen Diagnostik

Petrunkina AM, Töpfer-Petersen E

Waberski D

J. Reproduktionsmed. Endokrinol

2008; 5 (5), 262-271

262 J. REPRODUKTIONSMED. ENDOKRINOL. 5/2008

Moderne Verfahren in derspermatologischen Diagnostik

A. M. Petrunkina1, E. Töpfer-Petersen2, D. Waberski3

Standardspermatologische Parameter sind unzureichend zur Einschätzung der männlichen Fertilität. Computergestützte undzytometrische Verfahren gewinnen in der spermatologischen Diagnostik zunehmend an Bedeutung. Sie basieren auf Erkennt-nissen aus der Spermienphysiologie über fertilitätsrelevante Eigenschaften auf dem Weg zur Befruchtung. Unter befruchtungsför-dernden In-vivo-Bedingungen kommt einer Reihe funktioneller Spermiencharakteristika entscheidende Bedeutung zu: der Mo-tilität, insbesondere Hyperaktivierung, der Bindungs- und Interaktionsfähigkeit der Spermatozoen mit dem weiblichen Genital-trakt, ihrer Überlebens- und Kapazitationsfähigkeit sowie der Erkennung und Penetration der Eizelle. Eine wesentliche Bedeu-tung wird dabei der funktionellen Heterogenität der Spermien eines Ejakulates zugesprochen. Sie erlaubt die Adaptations-fähigkeit an individuelle Befruchtungssituationen und die Selektion der potenziell befruchtungsfähigen Population im weibli-chen Genitaltrakt. Einzelzell-orientierte Verfahren, wie die computergestützte Motilitätsanalyse, die Durchflusszytometrie unddie Fluoreszenzbildgebung ermöglichen in Zusammenhang mit multiparametrischen Analysen die Identifizierung diverserSpermiensubpopulationen mit unterschiedlichen für die Befruchtung relevanten funktionellen Eigenschaften. Die Charakterisierungder Heterogenität und Dynamik von Spermienpopulationen folgt den Merkmalen einer auf Einzellphänotypanalyse basieren-den molekularen Zellsystemforschung (Zytomik). In diesem Review werden moderne, an dem Verständnis der Befruchtungs-kaskade orientierte spermatologische Verfahren, die die funktionellen Eigenschaften in den repräsentativen Populationen durchEinzelzell-basierte Methoden charakterisieren (Durchflusszytometrie, computergestützte Spermienanalyse, Fluoreszenzimaging,volumetrische Analyse, Spermien-Eileiter-Bindungsassays, Kapazitationstests und Zonabindungs- bzw. -penetrationstests) spezies-übergreifend für die andrologische Diagnostik und zur Bearbeitung experimenteller Fragestellungen dargestellt.

Schlüsselwörter: Spermatologie, männliche Fruchtbarkeit, Kapazitation, Akrosomreaktion,computergestützte Spermienanalyse, Durchflusszytometrie, Volumenregulation

Modern Methods in Spermatology. Routine spermatological parameters are insufficient to assess male fertility. Computer-assistedand cytometric methods are of growing importance in advanced semen assessment. Modern diagnostics are based on increasingknowledge on sperm physiology and relevant functional sperm properties on the route of fertilization. There is a combination ofsperm functional parameters which is crucial for fertilization under fertilizing conditions in vivo: motility, especiallyhyperactivation, the ability to bind to and to interact with the female genital tract and the ability to survive, to capacitate and topenetrate the ooctye. The functional heterogeneity of sperm in a given ejaculate is of utmost importance. This heterogeneityrepresents a strategy for the adaptation to individual conditions of fertilization and the selection of the potentially fertilizingsperm population in the female tract. Single cell orientated methods, such as computer-assisted motility analysis, flow cytometryand fluorescence imaging enable in combination with the multiparametric analysis the identification of sperm subpopulationswith different functional properties, relevant for fertilization. The characterization of sperm populations heterogeneity and dy-namics instrumentalises tools of a molecular cell system research (cytomics) based on single cell phenotype analyse. Thepresent review describes modern spermatological methods based on our current knowledge of fertilization and characterizingthe functional properties of representative cell populations by means of single cell oriented technologies for their use in bothandrological examination and research across species: flow cytometry, computer-assisted sperm analysis, fluorescence imaging,volumetric analysis, sperm-oviduct binding assays, capacitation tests and zona binding or penetration tests. J ReproduktionsmedEndokrinol 2008; 5 (5): 262–71.

Key words: capacitation, acrosome reaction, spermatology, male fertility,computer-assisted sperm analysis, flow cytometry, volume regulation

Eingegangen: 25.02.2008; akzeptiert nach Revision: 04.07.2008Aus der 1Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken/Klinik für Pferde und dem 1Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge, GB,dem 2Institut für Reproduktionsbiologie und der 3Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken/Klinik für kleine Klauentiere, TierärztlicheHochschule Hannover.Korrespondenzadresse: PD Dr. Anna Petrunkina, Cambridge Institute for Medical Research, University of Cambridge, Welcome Trust/MRC Building,Hills Road, Addenbrooke’s Hospital, CB20XY, Cambridge, GB; E-Mail: anna.petrunkina@gmx.de

Die routinemäßig erfassten quan-titativen und qualitativen sperma-

tologischen Parameter (Ejakulatvolu-men, Spermienkonzentration, Moti-lität und Morphologie) erlauben nureine bedingte Aussage über die Be-fruchtungskompetenz eines Ejakula-tes. Die Anwendung spezieller, fort-geschrittener diagnostischer Verfah-ren ist für die Fertilitätsdiagnostikinsbesondere dann wichtig, wennbei nachweislich subfertilen TierenNormospermie nach standardsper-matologischen Kriterien vorliegt.

Nach der Ejakulation durchlaufenSäugetierspermatozoen auf dem Wegdurch das weibliche Genitale eineSequenz funktioneller Prozesse zur

Erlangung der Befruchtungsfähigkeit.Diese Vorgänge werden in ihrer Ge-samtheit als „Kapazitation“ bezeich-net [1, 2]. Auf dem Weg zum Ort derBefruchtung kommt es zur drastischenVerminderung der Spermienzahl; wäh-rend bei der Ejakulation einige Milli-arden Spermatozoen in den weibli-chen Genitaltrakt deponiert werden,passieren nur einige Tausend dieuterotubale Verbindung und etablie-ren sich in dem bei Haussäugetierenals Spermienreservoir fungierendenunteren Eileiteristhmus. Am Endedieser Sequenz sind es nur wenigeSpermatozoen, die mit der Eizelleinteragieren, und nur ein einziges Sper-matozoon vollendet den Befruch-tungsvorgang [3]. Dieser Spermien-

gradient ist durch verschiedene ana-tomische Barrieren und funktionelleSelektionsmechanismen zu erklären.Dabei kommt einer Reihe von Sper-mieneigenschaften entscheidende Be-deutung zu, u. a. der Spermienmo-tilität, der Bindungs- und Interak-tionsfähigkeit von Spermatozoen mitdem weiblichen Genitaltrakt, ihrerÜberlebens- und Kapazitationsfähig-keit sowie der Erkennung und Pene-tration der Eizelle. Die funktionelleHeterogenität der Spermatozoen ei-nes Ejakulates erlaubt die Selektionder potenziell befruchtungsfähigenPopulation im weiblichen Genital-trakt. Die Selektionskriterien könnenz. B. in Abhängigkeit des weiblichenhormonellen Status oder des Inter-

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valls zwischen Insemination und Ovu-lation variieren und damit Spermienaus unterschiedlichen Subpopulatio-nen bevorzugen. Die moderne sper-matologische Diagnostik morpholo-gischer und funktioneller Parametersollte daher die Untersuchung der Sper-mienheterogenität beinhalten. Im Fol-genden werden Beispiele einer moder-nen, an dem Verständnis der Befruch-tungskaskade orientierten, spermato-logischen Diagnostik gegeben.

Einzelzellbasierte Verfahrenund zytomische Konzepte

Eine entscheidende Rolle in der mo-dernen Zellbiologie und klinischenMedizin wird der molekularen Zell-systemforschung (Zytomik) zugeschrie-ben, die eine dreistufige Einzelzell-phänotypanalyse ermöglicht: die Zell-verhaltensanalyse innerhalb des Zell-zyklus, die molekulare Analyse ein-zelner Zellen im System (Zytom) undggf. die gewebeassoziierte Analyse[4, 5]. In diesem Kapitel werden spe-zielle spermatologische Verfahrendargestellt, die die funktionellen Re-gulationsprozesse und einige mole-kulare Abläufe in spezifischen Popu-lationen (z. B. Populationen osmo-tisch aktiver und membranintakterZellen) auf Einzelzellbasis charakte-risieren. Eine der wichtigen Eigen-schaften vieler moderner einzelzell-basierter Verfahren ist darin begrün-det, dass die Charakteristiken einzel-ner Zellen im Gesamtkontext der re-präsentativen Zellpopulationen oder– auf einer höheren Ebene – im Kon-text der Zellsysteme (Zytome) erfasstwerden, wie z. B. in der Durchfluss-zytometrie, der elektronischen Volu-menanalyse oder in anderen compu-tergestützten Verfahren bzw. Bildge-bungsmethoden. Da von einer Ver-gleichbarkeit der repräsentativen Zell-populationen auszugehen ist, könnendiese Methoden in bestimmtem Maßin der Diagnostik eingesetzt werden.Bei der Untersuchung von Zellen imKontext komplexer heterogener bio-logischer Zellsysteme (Zytome: wiez. B. Blut, Knochenmark, Hodenge-webebiopsien, Gesamtejakulat o. a.)postuliert die Zytomik, dass nicht nureine Information über den gegenwär-tigen Zustand der Organismen, son-dern auch eine prädiktive Aussageüber die weitere Entwicklung erhält-lich ist [4, 5]. In der humanen undveterinärmedizinischen Andrologiebefindet sich allerdings die Entwick-

lung der molekularen Zellsystem-forschung noch in der Anfangsphase.

Spermatozoen eines Ejakulates stel-len ein dynamisches System mitüberaus heterogenen funktionellenEigenschaften dar [6]. So enthältein Ejakulat verschiedene Spermien-populationen mit unterschiedlicherBefruchtungsfähigkeit. Die Hetero-genität eines Ejakulates, insbeson-dere die Anpassungsfähigkeit derZellen an ihre Umgebung, ist ein be-stimmender Faktor für seine funktio-nelle Leistung. Die Untersuchungvon Parametern des Gesamtejakula-tes (klassische Parameter, Enzym-aktivität, Ionen-, Lipid- und Protein-gehalt im Seminalplasma u. Ä.) be-rücksichtigt diese Heterogenitätnicht. Bei am Gesamtejakulat durch-geführten Untersuchungen kannnicht unterschieden werden, ob sichdie gemessenen Veränderungen aufdie Prozesse in allen Zellen oder inspezifischen Subpopulationen bezie-hen. Vor allem die Fähigkeit derSpermatozoen zur Interaktion mitden Sekreten der akzessorischen Ge-schlechtsdrüsen und mit dem weibli-chen Genitale ist erwartungsgemäßfür die diversen Spermatozoenpopu-lationen je nach ihrem funktionellenStatus unterschiedlich. Deshalb er-scheint die Analyse spezifischer Po-pulationen sinnvoll. Einzelzellorien-tierte Verfahren, wie die Durchfluss-zytometrie, computergestützte Sper-mienanalyse (CASA) und Fluores-zenzimaging, ermöglichen dieseAnalyse unter Vermeidung von Inter-pretationsversuchen anhand vonDurchschnittswerten.

Computergestützte Spermienanalyse(CASA)Die computergestützte Motilitätsmes-sung ist ein wichtiges Instrument dermodernen andrologischen Labordia-gnostik. Neben der Ermittlung desprozentualen Anteils an progressivbeweglichen, orts- und unbewegli-chen Zellen kann eine weitere Klas-sifizierung in lineare, kreisbeweg-liche und hyperaktivierte Zellen vor-genommen werden. Darüber hinauswerden die Einzelbahngeschwindig-keiten der linearen, mittleren undkurvilinearen Bewegung erfasst undSpermatozoen nach diesen Kriterienklassifiziert. Mehrere kinetische Pa-rameter können gleichzeitig in multi-parametrischen Analysen berück-sichtigt werden; auf diese Weise las-sen sich Subpopulationen von Sper-

mien mit unterschiedlichen funktio-nellen Eigenschaften darstellen. Über30 verschiedene kinetische Parame-ter stehen zu Verfügung. Darüber hi-naus sind die Spermienkonzentra-tion und ansatzweise auch die Sper-mienmorphologie unter standardi-sierten und objektiven Bedingungenerfassbar. Das Potenzial dieser Tech-nologie zeigt sich besonders im ex-perimentellen Bereich: Unter defi-nierten Bedingungen lassen sich ki-netische Reaktionen der Spermienauf unterschiedliche Behandlungs-verfahren z. B. bei Konservierungs-tests oder nach motilitätsstimulieren-den Einflüssen messen [7, 8]. Diecomputergestützte Motilitätsanalyseermöglicht eine bessere Vorhersageder Fertilität im Vergleich zur her-kömmlichen subjektiven Schätzung.In einer Feldstudie wurde beimSchwein nachgewiesen, dass sichdie Variation in den Wurfgrößen biszu 24 % durch die Variation in denMotilitätsparametern erklären lässt[9].

DurchflusszytometrieBei diesem Untersuchungsverfahrenwerden die Spermatozoen, ähnlichwie für fluoreszenzmikroskopischeVerfahren, mit spezifischen Fluoro-chromen markiert. Nach einer hy-drodynamischen Fokussierung derProbe und Anregung durch Laserlichtwird die von den Zellen ausgehendeFluoreszenz detektiert. Die Flussrate(Anzahl der gemessenen Partikel proSekunde) ist bei modernen Gerätenvariabel, sodass innerhalb wenigerSekunden Daten von mehr als10.000 Zellen erfasst und analysiertwerden können. Je nach der opti-schen Konfiguration des Gerätes undLichtquelleneigenschaften (Anzahlund Spezifikationen der Laser) kön-nen in modernen Durchfluss-zytometern Streulichtparameter undFluoreszenz von bis zu 18 Kompo-nenten, die das Licht verschiedenerWellenlängen λ emittieren, erfasstwerden. Diese Spannbreite ermög-licht eine gleichzeitige multipara-metrische Analyse verschiedenerZelleigenschaften. Streulichtparame-ter charakterisieren die Größe undKomplexität der Zellen, während Fluo-reszenzsignale weitere Auskunft überden funktionellen Zustand jeder ein-zelnen Zelle geben. Der Vorteil die-ser Technik liegt darin begründet,dass jede Zelle einzeln charakteri-siert wird; anstatt von Durchschnitts-werten werden diese Einzeldaten ge-

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speichert und weiter für eine Zell-population verarbeitet.

Die durchflusszytometrische Metho-dik gehört zu den effizientestensemi-quantitativen Verfahren undzeichnet sich durch ein hohes Maßan Reproduzierbarkeit, Standardisier-barkeit und Objektivität aus. Für diedurchflusszytometrischen Untersu-chungen stehen in der Routinedia-gnostik mittlerweile mehrere etab-lierte Verfahren zur Verfügung, die,in Abhängigkeit von den ausgewähl-ten Fluoreszenzmarkern und ihrenLokalisierungsstellen, Aussagen überdie Integrität und andere physiologi-sche, biochemische und funktionelleEigenschaften jedes einzelnen Sper-matozoons erlauben.

Zu den weitestgehend akzeptiertenVerfahren in der modernen spermato-logischen Diagnostik gehören derSpermienchromatinstruktur-Assay(SCSA), die Erhebung des Membran-integritätsstatus und des akrosoma-len Zustandes zur primären Beurtei-lung der Spermienqualität und eineFülle funktioneller Kapazitationstestswie der Merocyaninbindungsassay,Kalziuminflux, Tyrosinphosphorylie-rung und die Auslösung der Akrosom-reaktion. Diese Assays betreffen diefunktionelle Kompetenz eines Sper-matozoons in Bezug auf die unter-schiedlichen Stadien des Befruch-tungsprozesses.

Spermienchromatinstruktur-Assay(SCSA)Während der letzten Schritte der Sper-matogenese kommt es zur Konden-sation des Nukleus und zur Bildungder charakteristischen Form des Sper-mienkopfes. Während der Spermio-genese findet dann der Austausch derDNA-Histone gegen Protamine statt.Die Fähigkeit der reifen Zellen, ihreDNA zu reparieren und Apoptosis ein-zuleiten, ist stark reduziert [10]. Des-halb können DNA-Defekte, die vorder Bildung der stabilen Chromatin-bündelung stattgefunden haben, aufdie Oozyte übertragen werden. Einstabiles Chromatin ist daher eine ent-scheidende Voraussetzung für die er-folgreiche Befruchtung und ungestörtefrühembryonale Entwicklung.

Die Untersuchung der Chromatin-struktur mittels SCSA [11] stellt einwichtiges Diagnostikum zur Beurtei-lung der Fertilität dar. Bei diesem Ver-fahren wird die Stabilität der Sper-

mien-DNA nach saurer Denaturie-rung in situ mittels Durchflusszy-tometrie erfasst. Der SCSA macht sichdie metachromatischen Eigenschaf-ten des DNA-Farbstoffes AcridinOrange zunutze. Acridine Orangefluoresziert bei Bindung in doppel-strängigen Nukleinsäuren grün. Ineinsträngiger, denaturierter DNAbindet der Farbstoff an geladene Phos-phatgruppen und fluoresziert rot. DerProzentsatz roter Spermien relativzur Gesamtpopulation wird als De-fragmentationsindex (DFI) erfasst.Der SCSA hat eine breite Anwen-dung in der Diagnostik der humanenReproduktion gefunden und wurdeauch im Nutztierbereich etabliert[12, 13]. In einigen Studien wurdegezeigt, dass ein hoher Anteil anchromatin-instabilen Spermatozoenmit männlicher Sub- und Infertilitätzusammenhängt [14, 15]. NeuereUntersuchungen zeigen, dass chro-matininstabile Eberspermien eineverminderte Fähigkeit zur Eileiter-bindung besitzen und daher unterIn-vivo-Bedingungen nur geringeChancen haben, Eizellen zu errei-chen und zu befruchten [16].

MembranintegritätDie Befruchtungskompetenz einerZelle ist wesentlich von der morpho-logischen und funktionellen Integri-tät der Plasmamembran und dendarunter liegenden akrosomalen Mem-branen (äußere und innere akroso-male Membran) abhängig. Die Mem-branen reagieren sehr empfindlichauf Milieuveränderungen und Kon-servierungseinflüsse. So wurde bei-spielsweise festgestellt, dass die Sper-mienviabilität (Beurteilung des Mem-branintegritätsstatus anhand der DNA-Farbstoffe) in einem engeren Zusam-menhang mit der Fertilität (Wurfgrö-ße) von Ebern steht als die konventio-nelle Motilität [17]. Daher kommtder Diagnostik der Membranintegri-tät ein besonderer Stellenwert zu. ImVergleich zur konventionellen licht-mikroskopischen Diagnostik bietetdie Durchflusszytometrie die Vorteileder simultanen Darstellung der Inte-grität von Plasma- und Akrosom-membranen und eine höhere Sensi-tivität zur frühzeitigen Entdeckung vonMembranschäden.

Die morphologische Integrität derPlasmamembran kann durch direkteFluoreszenzmarkierung der Zellkom-ponenten evaluiert werden. Zu die-sem Zweck werden entweder perme-

able oder impermeable Fluorochro-me verwendet. Meistens kommenmembranimpermeable Farbstoffe zumEinsatz; dabei werden nur „tote“ Sper-mien mit defekter und daher für denFarbstoff durchlässiger Plasmamem-bran markiert. Die am öftesten ver-wendeten Farbstoffe dieser Gruppesind Propidium und Ethidium, diezwischen den Basen in doppelsträn-giger DNA interkalieren. Sie könnenin Kombination mit anderen Farbstof-fen für die gleichzeitige Messung vonAntikörper-Bindung und DNA-Ge-halt verwendet werden. Die Integri-tät der akrosomalen Membranenwird über die Bindungsfähigkeit vonLektinen (kohlenhydratbindende Pro-teine) an bestimmte Kompartimentedes Akrosoms bestimmt. Die Lektinesind zur Detektion der Bindung andas fluoreszierende FITC (Fluores-ceinisothiocyanat) gekoppelt. DieLektine Peanut Agglutinin, PisumSativum Agglutinin und PhaseolusVulgaris Agglutinin (PNA, PSA, PHA)binden je nach Tierart an die äußereoder innere akrosomale Membranoder den Inhalt der akrosomalen Ma-trix und zeigen auf diese Weise Schä-den an der akrosomalen Membranan. In der erweiterten Labordiagnos-tik hat insbesondere die kombinierteErfassung des Zustandes von Plasma-und Akrosommembranen unter Ein-satz des DNA-Farbstoffes Propidium-iodid und FITC-konjugierten Lekti-nen Eingang gefunden. Dabei lassensich je nach Färbezustand und Kom-bination 4 Spermienpopulationenunterscheiden (Abb. 1). Nur unge-färbte Spermien mit intakter Plasma-membran und akrosomaler Memb-ran sind intakt; die grüne, rote oderDoppelfärbung bedeutet, dass dieIntegrität zumindest einer der Zell-membranen beeinträchtigt ist.

Volumetrische Analyse

Anpassung an die UmgebungNach der Ejakulation durchlaufenSäugetierspermatozoen auf dem Wegdurch das weibliche Genitale eineSequenz funktioneller Prozesse zurErlangung der Befruchtungsfähigkeit.Zwei funktionelle Voraussetzungensind dafür entscheidend, ob die Sa-menzellen nach der Ejakulation undDeponierung in den weiblichen Geni-taltrakt (vor und nach der Bindungam Eileiterepithel) prinzipiell zu wei-teren Schritten befähigt sind. Dabeihandelt es sich um die Fähigkeit derSpermatozoen zur Regulation des

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Zellvolumens und zum zeitgerech-ten Durchlaufen der Kapazitations-sequenz.

Die funktionelle Integrität der Plasma-membran versetzt die Zelle in dieLage, auf die Veränderungen des ex-ternen Milieus zu reagieren und sichohne Funktionseinschränkungen an-zupassen. Das trifft insbesondere fürdie Samenzelle zu, da sie im Verlaufder Reifungsprozesse im männlichenund weiblichen Genitaltrakt vielekomplexe funktionelle Veränderun-gen erfahren muss und damit beson-ders sensibel auf äußere Bedingun-gen reagiert. Obligatorisch für dieAnpassung an die Umgebung ist dieFähigkeit zur Volumenregulation, diein vielen Zellsystemen entwickelt ist[18]. Spermatozoen werden schon beider Ejakulation und nach Deponie-rung in den weiblichen Genitaltraktmit hypotonen Bedingungen kon-frontiert, da Seminalplasma und ute-rine Flüssigkeit eine niedrigereOsmolalität aufweisen als die epidi-dymale Flüssigkeit. Der osmotischeGradient variiert speziesspezifischund kann bis zu 100 mOsmol/kg be-tragen [19]. In Spermatozoenpopu-lationen, die nicht imstande sind, ihrZellvolumen langfristig zu regulie-ren, kommt es zu gravierenden funk-tionellen Einschränkungen wie Ver-

lust der Motilität, Unfähigkeit derZervixpenetration und Verminderungder Spermien-Eileiter-Bindung [20–22]. Auch für die Kryokonservierungspielt die Fähigkeit zur Volumenregu-lation eine große Rolle. Während desEinfrierens werden Spermien dehyd-riert; während des Auftauvorgangesfindet die Re-Äquilibrierung von Was-ser statt und die Zellen schwellen inFolge eines hypoosmotischen Schocks,was zu schwerwiegenden Schädenführen kann. Funktionierende Mecha-nismen der Volumenregulation imFrischsamen deuten daher darauf hin,dass die Spermatozoen den mit derKryokonservierung assoziierten Stressbesser vertragen können [23].

Regulation des isotonen VolumensDie Größe des Zellvolumens unterisotonen Bedingungen ist ein poten-ziell wichtiger diagnostischer Para-meter. Die Fähigkeit der Samenzel-len, ihr Zellvolumen unter isotonenBedingungen zu regulieren, ist sehrindividuell ausgeprägt [24–26]. Indi-viduelle zellvolumetrische Unter-schiede (Abb. 2) stehen im Zusam-menhang mit der unterschiedlichenBefruchtungsleistung der Vatertiere[27]. Die Grundlage dafür ist diehohe individuelle Variation in derFunktionalität der Ionentransportme-chanismen im intra- und extrazellu-

lären Ionengehalt und die damit ein-hergehende Variation des elektro-chemischen Gradienten durch dieZellmembran. Diese Variabilität hatDifferenzen in der isotonen Volu-menregulation zur Folge. So konntegezeigt werden, dass erhöhte Natri-umionen-Konzentrationen im Semi-nalplasma und erhöhte isotone Zell-volumina mit niedrigen Befruch-tungsraten einhergehen [27].

Die Fähigkeit der Samenzelle, ihrVolumen unter isotonen Bedingun-gen zu regulieren und aufrechtzuer-halten, ist somit eine entscheidendeVoraussetzung für die funktionelleIntegrität der Zellmembran und fürdie funktionelle Kompetenz (Befruch-tungsfähigkeit) eines Spermatozo-ons. Die Messung des isotonen Volu-mens kann entweder unter Einsatzeines Partikelzählers (elektronischeVolumenmessung) oder eines Durch-flusszytometers (Streulichtcharakteris-tika) erfolgen [28, 29].

Hypoosmotischer SchwelltestIm Normalfall bleibt das Zellvolu-men unter physiologischen, isotonenBedingungen konstant; nach einemhypotonen Stress kommt es dagegenphysiologischerweise bei membran-intakten Spermatozoen zu einer pri-mären Anschwellung [30].

Abbildung 1: Fluoreszenzoptische und durchflusszytometrische Darstellung von 4 Spermiensubpopulationen: Integrität von Spermienplasma- (PM)und Akrosommembran (AM) nach Doppelfärbung mit Propidiumjodid (PI) und FITC-PNA.Q1: PI-positive und FITC-PNA-negative Zellen: PM defekt, AM intakt; Q2: PI-positive und FITC-PNA-positive Zellen: PM und AM defekt; Q3: PI-negative und FITC-PNA-negative Zellen: PM und AM intakt; Q4: PI-negative und FITC-PNA-positive Zellen: PM intakt, AM defekt.

266 J. REPRODUKTIONSMED. ENDOKRINOL. 5/2008

Diese Eigenschaft wurde zur Ent-wicklung praktischer osmotischer Re-sistenz- und hypoosmotischer Schwell-tests (ORT und HOST) für verschie-dene Tierarten verwendet [30–32].Nach einer Inkubation im hypotonenPuffer wird mikroskopisch der Pro-zentsatz plasmamembranintakter Sper-mien anhand von Schwellung undcharakteristischem Aufrollen desSchwanzes oder Schleifenbildungbestimmt [30]. Allerdings liegen so-wohl in der Human- als auch in derNutztierreproduktion widersprüchli-che Ergebnisse über die Befruch-tungsrelevanz dieses mikroskopischenTests vor [33–35]. Wegen der ausge-prägten Subjektivität der Aussage,der geringen Anzahl ausgezählterSpermien und dem Unvermögen,den Grad der Schwellung zu charak-terisieren, bleibt der Wert dieses Pa-rameters fraglich.

Modifizierter hypoosmotischerSchwelltestDurch Einsatz des Partikelzählers istes möglich, eine exakte Verteilungdes Zellvolumens von Spermatozo-enpopulation zu erfassen. Aufgrundder technischen Entwicklung (hoch-frequente Pulsflächenanalyse undWiderstandsmessprinzip) können dieMessungen sehr präzise durchge-führt werden [23].

Spermatozoen vieler Spezies funk-tionieren als sogenannte perfekteOsmometer, d. h. dass ihr Zellvolu-men sich umgekehrt proportionalder Osmolalität verändert [36–38].Der Grad der Volumenveränderun-gen V wird durch die Boyle-Van’t-Hoff’sche-Gleichung beschrieben und

entspricht der sogenannten Reaktiondes perfekten Osmometers [39]:

V = (π0/πe)(V0–Vb)+Vb

wo π0 und πe die isotone und an-isotone (extrazelluläre) Osmolari-tät darstellen, V0 dem isotonen Zell-volumen entspricht und Vb das os-motisch inaktive Zellvolumen be-schreibt.

Die relative Verschiebung des Zell-volumens beim Übergang von isoto-nen zu hypotonen Bedingungen

Vr = Vhypo/Viso

wird als Gradmesser für die relativeSchwellung von Spermatozoen defi-niert. Ist dieser Quotient größer als 1(progressive Schwellung), sind diemeisten Zellen in der Zellpopulationintakt. Ist dieser Quotient geringerals 1, bedeutet dies, dass die Schwel-lung nicht stattfindet und die Zelleneine defekte Plasmamembran haben.Die Spermatozoen eines Ejakulates,die dabei starke Abweichungen zei-gen oder in der Verteilung des Zell-volumina mehrere Subpopulationenaufweisen, gelten als „membran-destabilisiert“ [28, 38].

Die primäre Schwellung, die durcheine hypotone Belastung verursachtist, geht bei weiterer Inkubation un-ter hypotonen Bedingungen durchdie Aktivierung von Ionenkanälenund den Efflux von intrazellulären Io-nen (z. B. Kalium- und Chloridionen)zurück [22, 40]. Dieser Prozess wirdals „Regulatory Volume Decrease“(RVD) bezeichnet. Die Aktivierungder Kanäle erfolgt durch noch nichtkomplett charakterisierte Signalüber-

tragungswege, die beispielsweiseVeränderungen in der Proteinphos-phorylierung und dem Zytoskelettbetreffen [28, 41].

Volumenregulatorische Tests wurdenin der Spermatologie für verschiede-ne Spezies etabliert. Für Schweinund Rind bestehen Hinweise, dassdiese Verfahren relevant für eine Fer-tilitätsprognose sind. So wurde es fürEbersperma gezeigt, dass die besse-ren Regulatoren auch höhere Ab-ferkelraten haben [42]. Es ist einhoher Variationsgrad bezüglich derZellvolumenregulation nach hypoto-nem Stress zwischen Individuen undEjakulaten zu erwarten. Diese Varia-bilität manifestiert sich zum einenin unterschiedlichen Zellvoluminazum anderen treten mehrere Sub-populationen innerhalb eines Ejaku-lates in Erscheinung.

Spermien-Eileiter-BindungsassaysNach dem Eintritt der Spermien indas weibliche Genital und Passageder uterotubalen Verbindung etab-liert sich bei Haussäugetieren prä-ovulatorisch im unteren Eileiteristh-mus die potenziell befruchtungsfähigeSpermienpopulation. Sie wird hierdurch Bindung an die meist zilien-tragenden Epithelzellen zurückge-halten und unter Erhalt ihrer Via-bilität und Funktionalität gelagert[43].

Aus heutiger Sicht erfüllt das oviduk-tale Spermienreservoir mehrere Funk-tionen:• Selektion einer intakten befruch-

tungskompetenten Spermienpopu-lation

A B

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Volumenverteilungen bei Bullenspermien unter isotonen und hypotonen Bedingungen im modifizier-ten hypoosmotischen SchwelltestA: Eingipflige Zellvolumenverteilungen unter iso- und hypotonen Bedingungen. B: Zweigipflige Zellvolumenverteilung eines subfertilen Bullen.Der zweite Gipfel (Pfeil) repräsentiert eine Spermienpopulation mit veränderter Volumenregulationsfähigkeit. Die Zellen mit instabiler Volumen-regulation zeigen eine progressive Verschiebung (Schwellung) unter isotonen Bedingungen.

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• Erhalt der Lebensfähigkeit der ge-lagerten Spermatozoen

• Regulation der Spermienfunktio-nen wie Kapazitation und Hyperak-tivierung

• Begrenzung der Spermienzahl amOrt der Befruchtung

Nur befruchtungskompetente, mor-phologisch normale, vitale Spermienbinden an das Eileiterepithel [44–46]. Für die spermatologische Diag-nostik ist die selektive Funktion vonentscheidender Bedeutung. Um denEinfluss des Eileiters auf die Sper-mienvitalität und -funktion zu unter-suchen, wurden bei einer Reihe vonSpezies wie Kaninchen, Rind, Pferd,Schwein und Mensch In-vitro-Assaysmit oviduktalen Epithelzellkulturen(OEC) oder mit sogenannten Ovi-dukt-Explanten entwickelt. Explantesind Zellhaufen, die durch „Strip-pen“ der Eileiter (Rind [47]) gewon-nen oder wie beim Schwein in win-zigen mm-großen Stückchen [45,48] herausgeschnitten werden. Vor-teil dieses Verfahrens ist die Untersu-chung kurz nach der Gewinnung derEileiter ohne Kultivierungsschritte aneinem intakten Zellverband unter in-vivo-nahen Bedingungen. In quanti-tativen Studien kann im „OviduktExplant Assay“ (OEA) die Bindungs-fähigkeit von Spermatozoen an dasEileiterepithel als Maß für die Sper-mienqualität ermittelt werden (Abb. 3).Dazu werden frisch gewonnene Ovi-duktexplante mit einer definiertenAnzahl gewaschener Spermatozoenkurzzeitig koinkubiert und gefilmt.

Die Fläche der Explantfragmentewird gemessen und die Anzahl dergebundenen Spermien gezählt. Dersogenannte Bindungssindex (BI: Sper-mienzahl/0,01 mm2 wird als arith-metisches Mittel der Bindungsindizeszweier (oder mehrerer) Explante ausunterschiedlichen Regionen des Ei-leiters definiert:

BI = (BIE1 + BIE2)/2

BIE1,2 = (NR1 + NR2 + NR3)/(SR1 + SR2 + SR3)

wobei NR1, NR2, NR3 die Anzahl derSpermien, die an den Fragmenten R1,R2, R3 gebunden sind, und SR1, SR2,SR3 die Fläche dieser Fragmente dar-stellen.

Obwohl systematische Studien überdas Verhältnis zwischen den Ergeb-nissen des OEAs und der Fruchtbar-keit fehlen, gibt es Hinweise für dieNützlichkeit dieses Verfahrens in derspermatologischen Diagnostik. Un-tersuchungen an geringen Proban-denzahlen bei Schwein und Rind zei-gen individuenabhängig eine hohe Va-riation der Bindungsindizes, die nach-weislich mit Fertilitätsunterschiedenverbunden war [21, 49]. Die Sensitivi-tät des Assays zeigt sich auch darin,dass flüssigkonservierte Eberspermiennach 72 Stunden Lagerung eine redu-zierte Eileiterbindungskapazität auf-wiesen, ohne dass der lagerungsbe-dingte Qualitätsverlust standardsper-matologisch diagnostizierbar war [50].Die Resultate des OEA stehen zudemin einem wichtigen funktionellen Zu-

sammenhang mit der Volumenregula-tion: die höhere Bindungsfähigkeit derSpermatozoen ist mit der besseren Re-gulation des Zellvolumens assoziiert[21].

KapazitationstestsDie post-ejakulatorische Wechsel-wirkung mit der Umgebung hat wei-tere Auswirkungen auf die membran-vermittelten Prozesse in Spermato-zoen. Die Vorgänge der Kapazitation,die die Spermatozoen auf die Be-fruchtung vorbereiten, umfassen vorallem Veränderungen der molekula-ren Struktur, der Funktion und der Mor-phologie der Membran. Diese Verän-derungen spiegeln sich in der Dyna-mik der Regulation der Transportvor-gänge und intrazellulären Ionenkon-zentrationen wider und resultieren inder Aktivierung spezifischer Signal-übertragungssysteme, die zur Hyper-aktivierung (Veränderung des Bewe-gungsmusters) und am Ende zur Akro-somreaktion (Exozytose des Akrosoms)führen [51]. Während der Ejakulationbinden als „Dekapazitationsfaktoren“bezeichnete sekretorische Proteineder akzessorischen Geschlechtsdrü-sen an die Spermienoberfläche undbilden eine Schutzschicht [52]. Diefunktionelle Destabilisierung wirdzum einem durch die Bikarbonat-ge-steuerte Veränderung der Lipidstrukturder Membran und durch einen „lipidcarrier“-vermittelten Efflux von Cho-lesterin aus der Membran, zum an-deren durch die Entfernung der se-kretorischen Proteine (Dekapazitati-onsfaktoren) eingeleitet. Erst dann istdie Membran für die endogenen Pro-zesse (z. B. Veränderungen in denintrazellulären Ionenkonzentratio-nen und Umverteilungen der Rezep-toren und Proteine) vorbereitet.

Tests zur Erfassung molekularer Ver-änderungenEines der frühzeitigen Ereignisse derKapazitation ist die Veränderung derLipidarchitektur der Membran. DerGrad der Asymmetrie kann mit demMerocyanin-Assay unter Anwendungder Durchflusszytometrie nachge-wiesen werden. Schon nach wenigenMinuten (10–25 min) ist in der kapazi-tationsbehandelten (Bikarbonat/CO2)Spermienpopulationen ein höheresMaß an Merocyanin-Bindung nach-weisbar. Die Ausprägung ist höchstindividuell bei unterschiedlichen Va-tertieren. Dieser Test wird erfolgreichbei Schwein, Hengst und Bulle an-gewandt.

Abbildung 3: „Ovidukt Explant Assay“: an ein Eileiterexplant gebundene Eberspermien. Vergrö-ßerung × 250.

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Die Erhöhung des internen Ca2+-Spiegels und Tyrosinphosphorylie-rung von Spermienproteinen sind en-dogene Veränderungen, die im Ver-lauf der Kapazitation auftreten; siesind für die nachfolgende Akrosom-reaktion essenziell. Diese Verände-rungen können anhand der Immun-fluoreszenz unter Anwendung derMikroskopie oder Durchflusszytome-trie im Rahmen fortgeschrittener dia-gnostischer Verfahren erfasst werden.

Mit Darstellung des intrazellulärenCa2+-Spiegels von Spermatozoen durchCa2+-Imaging unter Einsatz von Kal-zium-Fluorochromen (z. B. Fluo-3-AM) wurde am Beispiel von Pferd undSchwein nachgewiesen, dass durchdie Interaktion der Spermatozoenmit dem Eileiterepithel der intrazel-luläre Ca2+-Gehalt auf einem kon-stant niedrigeren Niveau gehaltenwird [53–55], während sich der pro-zentuale Anteil der ungebundenenSpermatozoen mit hohem Ca2+-Levelim Verlauf einer 3-stündigen Koinku-bation unter kapazitationsfördern-den Bedingungen verdoppelte (22 %).

Durch Aktivierung der Adenylatzy-klase und der damit zusammenhän-genden Erhöhung des cAMP-Spie-gels erfolgt die Aktivierung von PKA(Proteinkinase A) und die Tyrosin-phosphorylierung von Proteinen [56,57]. Diese Phosphorylierung setzt in-nerhalb der ersten Stunden des Kapa-zitationsvorganges ein [58, 59]. Dassdie Phosphorylierungsreaktionen eineBegleiterscheinung der Kapazitationsind, wurde in unterschiedlich kom-binierten In-vitro-Systemen nachge-wiesen. Die spezifische Phosphory-lierung der Spermienproteine, derenMolekulargewichte sich tierartspezi-fisch unterscheiden, wurde sowohl imGeißelkompartiment als auch im Sper-mienkopfkompartiment der Spermato-zoen einiger Spezies, z. B. Schweinund Hund, lokalisiert [60]. Diese Ver-änderungen könnten somit sowohlauf eine mögliche Beteiligung derTyrosinphosphorylierung in Vorberei-tung auf die Akrosomreaktion als auchauf die Hyperaktivierung hindeuten.Individuelle Unterschiede in der Tyro-sinphosphorylierung können sowohlin der Elektrophorese als auch in derImmunofluoreszenz nachgewiesenwerden und sind als fortgeschritteneDiagnostika anwendbar (z. B. beimHund [61]). Die Ausprägung der ka-pazitationsbedingten Tyrosinphospho-rylierung ist außerdem von der Be-

handlung der Spermien abhängig, waseine Perspektive zum Einsatz vondiesem Parameter für die Beurtei-lung der Verdünnereffizienz zunutzemacht [62].

Auslösung der AkrosomreaktionNur kapazitierte Spermien sind in derLage, die Akrosomreaktion zu durch-laufen, die Zona pellucida zu pene-trieren und mit der Eizelle zu fusio-nieren [2]. Daher ist die Erfassungdes Membranstatus durch gleichzei-tige Beurteilung der Integrität vonPlasmamembran und Akrosom unterEinsatz Propidiumjodid/FITC-konju-gierter Lektine nach einer Kapazita-tionsbehandlung und Induktion derAkrosomreaktion ein Gradmesser derKapazitationsfähigkeit der Spermienund ein wichtiges Diagnostikum[63]. Auch bei der Beurteilung derVerdünnereffizienz für die Kryokon-servierung erweist sich die Erfassungder induzierten Akrosomreaktion inKombination mit der volumetrischenAnalyse sensitiver als standardsper-matologische Parameter bei Hunde-spermien [64].

Die Induktion der Akrosomreaktionkann durch Anwendung speziellerStimuli erfolgen: intakte Zona pellu-dida, solubilisierte Zona pellucida-Proteine, Progesteron, Kalziumiono-phor etc. Der Grad der Reaktivitätauf die verschiedenen Stimuli ist vondem Reifungsstatus der Spermien,dem Individuum, den Inkubations-bedingungen und anderen Einfluss-faktoren wie Konzentration der Sti-muli oder Reifungsstatus der Zonaeabhängig. Deshalb sollten solche Testsunter standardisierten Bedingungen

durchgeführt und als Gesamtprozessbetrachtet werden [22].

Dynamische Charakterisierung der ka-pazitationsbedingten DestabilisierungKapazitation kann auch als ein Pro-zess der kontrollierten positiven Mem-brandestabilisierung verstanden wer-den [65]. Die Heterogenität der Zell-populationen (stark ausgeprägte Va-riation funktioneller Eigenschafteninnerhalb eines Ejakulates) sowie Dif-ferenzen zwischen den Ejakulaten ei-nes Spenders und zwischen denEjakulaten verschiedener Individuenäußern sich in unterschiedlichenGeschwindigkeiten dieser Kapazita-tionsabläufe. Je schneller die Sperma-tozoen die einzelnen Stadien diesesProzesses durchlaufen, desto schnellerwird die untere und obere Grenzedes sogenannten „Kapazitationsfens-ters“ erreicht (Abb. 4). Der Eintritt indas „Kapazitationsfenster“ wird imAllgemeinen mit der Fähigkeit derSpermatozoen assoziiert, auf die be-fruchtungsfördernden Bedingungenzu reagieren, indem sie hyperaktivierteBewegungsmuster zeigen und an derZona pellucida der Eizelle die Akro-somreaktion vollziehen [65].

Außerhalb dieses Fensters ist nichtmehr von „positiver Destabilisierung“,sondern von „Zelldegeneration“ zusprechen. Die Bestimmung einzelnerspermatologischer Parameter als Po-pulationsdurchschnitt zu einem defi-nierten Zeitpunkt reflektiert wederden Grad der Heterogenität der Ge-samtpopulation noch den Grad derfunktionellen Modulation der Samen-zellen in ausreichender Weise. Da-gegen ermöglicht die dynamische

Abbildung 4: Modell zur Kinetik der Kapazitationsveränderungen bei Vatertieren mit unterschied-licher Fertilität.

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Charakterisierung funktioneller Ver-änderungen (1) die Determinierungder Sequenz einzelner Kapazita-tionsabläufe (Prozesskette) und (2)den Vergleich zwischen funktionellunterschiedlichen Zellpopulationen[55, 61].

Deswegen wird in der weiterführen-den Diagnostik großen Wert auf Ver-fahren zur Erfassung der Prozesski-netiken gelegt. Anwendungsbeispie-le gibt es aus der Spermakonservie-rungsforschung. So konnten bei flüs-sigkonservierten Eberspermien lage-rungstemperaturabhängige Quali-tätsunterschiede nur anhand derKinetiken des Kalziuminfluxes und in-duzierten Akrosomreaktion erfasstwerden; standardspermatologischeParameter erwiesen sich nicht sensitivgenug [66]. Darüber hinaus wurdegezeigt, dass sowohl eine zu schnelleals auch eine zu langsame Kinetik derkapazitationsbedingten Destabilisie-rung mit Subfertilität assoziiert ist[63]. Das begründet die weitere Eta-blierung solcher spezieller Verfahrenin der spermatologischen Praxis.

Zonabindung/PenetrationZona pellucida-Bindung und Oozy-ten-Penetration-Tests wurden für un-terschiedliche Spezies etabliert. In die-sem Verfahren werden die an die Zonapellucida gebundenen bzw. penetrier-ten Spermatozoen ausgezählt. Aller-dings sind solche Assays einigen Ein-schränkungen unterlegen. Es wurdegezeigt, dass auch unkapazitierteSpermien an der Zona pellucida bin-den können und somit die Bindungnicht als Kriterium der Befruchtungs-kompetenz angesehen werden kann[67]. Andererseits gilt die Fähigkeitvon Spermatozoen, die Zona pellu-cida zu penetrieren, als Zeichen derfunktionellen Kompetenz, da dieseBarriere nur von kapazitierten Sper-mien während des Befruchtungsvor-ganges überwunden werden kann[68]. Die Assays gelten als aufwen-dig und wenig standardisierbar, so-dass sie in der Laborroutine nicht etab-liert sind. Nachteilig ist auch, dassunter In-vivo-Bedingungen essenzi-elle Spermieneigenschaften, wie de-ren Überlebensfähigkeit im weibli-chen Genital, mit diesen Testverfah-ren nicht erfassbar sind [69]. Für ex-perimentelle Zwecke, die der unmit-telbaren Überprüfung der Befruch-tungs- und frühembryonalen Entwik-klungsfähigkeit dienen, sind IVF-Testsfür verschiedene Spezies etabliert.

Perspektiven in dermodernen Spermatologie

Die Anwendung computergestützterund insbesondere zytometrischer Ver-fahren in der Reproduktionsbiologieund in der spermatologischen Diag-nostik gewinnt zunehmend an Be-deutung. Allerdings steht die Zyto-mik als neues Gebiet der funktionel-len und molekularen Analyse nocham Anfang ihrer Entwicklung. Obwohldas enorme Potenzial der multipara-metrischen Erfassung von Systemeigen-schaften und nachfolgender Moleku-laranalyse nicht zu bestreiten ist, be-darf es umfassender Vorarbeit in konven-tionellen Monosystemen isolierter Zel-len, um die zu Verfügung stehendentechnischen und analytischen Mittel indas Spektrum gängiger Verfahren zuintegrieren und Aspekte der Dynamikund Heterogenität in die Analyse derZellpopulationen innerhalb komplexerbiologischer Systeme einzuschließen.

Um die spermatologischen Parame-ter gemäß ihrer Signifikanz im Repro-duktionsgeschehen einordnen zu kön-nen, müssen die Erfassungs- und Ana-lyse-Methoden sensitiv und reprodu-zierbar sein. Dabei ist es wichtig,nicht nur eine repräsentative Popula-

tion quantitativ auszuwerten, sondernmöglichst die gesamte biologische He-terogenität innerhalb eines Zellsys-tems zu berücksichtigen. Die multi-parametrische zytometrische Erfas-sung und Bestimmung dynamischerRegulationsprozesse in Spermatozoen-populationen in ihrem zeitlichen Ver-lauf bietet in diesem Zusammenhangeine einzigartige Möglichkeit, dieCharakterisierung und das Verständ-nis reproduktionsbiologischer Vorgän-ge zu erweitern. Das humane Zytom-projekt schreibt neben modernen Me-thoden der Proteomik und Genomikder zusammenfassenden molekula-ren funktionellen Zellsystemforschungeine zentrale Rolle in der Diagnostikund Prädiktivmedizin zu [4, 5]. Die Ein-beziehung der modernen Methodender Zytomik bei der Charakterisierungder Heterogenität und Dynamik tieri-scher Zellen und Zellsysteme würdeeine logische Fortsetzung des huma-nen Zytomprojektes zur funktionel-len Zytomanalyse darstellen. Die In-halte vorliegender Arbeit illustrierendie Anwendung multimolekularerAnalyseverfahren in Verbindung mitnachfolgender quantitativer undanalytischer Auswertung auf demGebiet der Reproduktionsbiologievon Säugetierspezies.

Relevanz für die Praxis

In der Praxis ermöglichen die modernen Methoden neue Perspektiven derFertilitätsprognose und des Therapieentscheids. Die Differenzierung biolo-gisch unterschiedlicher Spermiensubpopulationen ist insbesondere unterIn-vivo-Fertilisationsbedingungen von hoher Bedeutung. Hiervon profitiertin erster Linie die veterinärmedizinische Andrologie, wo die Erzielungmöglichst vieler Graviditäten mit konserviertem Sperma nach Inseminationdie Grundlage einer effizienten Tierproduktion ist. Die frühzeitige Erken-nung subfertiler Vatertiere steht dabei im Vordergrund. In der Humanmedi-zin bieten die neuen Verfahren wertvolle Entscheidungshilfen für den Ein-satz assistierter Reproduktionstechniken. Die stetige Suche nach besserenSpermakonservierungstechniken und die Bestrebung, mit möglichst gerin-gen Spermienzahlen oder mit besonders aufbereitetem Sperma (z. B. ge-sextem Sperma) zum Befruchtungserfolg zu gelangen, erfordern eine diffe-renzierte spermatologische Diagnostik. Hier findet sich ein großes An-wendungspotenzial der modernen Spermatologie.

Literatur:1. Austin CR. The capacitation of mammaliansperm. Nature 1952; 17: 326.2. Yanagimachi R. Mammalian fertilization.In: Knobil E, Neill JD (ed). The physiology ofreproduction. New York, Raven Press, 1994;189–317.3. Hunter RHF. The Fallopian Tubes: TheirRole in Fertility and Infertility. In: The Fallo-pian Tubes. Springer-Verlag, Berlin, Heidel-berg, New York, 1988; 58–74.

4. Valet G, Tarnok A. Cytomics in predictivemedicine. Cytometry B Clin Cytometry 2003;B53; 1–3.

5. Valet G, Leary JF, Tarnok A. Cytomics – newtechnologies: towards a human cytomeproject. Cytometry A 2004; A59: 167–71.

6. Holt WV, Van Look KJ. Concepts in spermheterogeneity, sperm selection and spermcompetition as biological foundations for labo-ratory tests of semen quality. Reproduction2004; 127: 527–35.

270 J. REPRODUKTIONSMED. ENDOKRINOL. 5/2008

7. Davis RO, Siemers RJ. Derivation and reli-ability of kinematic measures of sperm mo-tion. Reprod Fertil Dev 1995; 7: 857–69.

8. Satake N, Elliot RMA, Watson PF, Holt WV.Sperm selection and competition in pigs maybe mediated by the differential motility acti-vation and suppression of sperm subpopula-tions within the oviduct. J Exp Biol 2006; 209:1560–72.

9. Holt C, Holt WV, Moore HD, Reed HC,Curnock RM. Objectively measured boar spermmotility parameters correlate with the out-comes of on-farm inseminations: results oftwo fertility trials. J Androl 1997; 18: 312–23.

10. Aitken RJ, de Iuliis GN. Value of DNA in-tegrity assays for fertility evaluation. SocReprod Fertil Suppl 2007; 65: 81–92.

11. Evenson DP, Darzynkiewicz Z, MelamedMR. Relation of mammalian sperm chromatinheterogeneity to fertility. Science 1980; 210:1131–3.

12. Evenson DP, Larson KL, Jost LK. Spermchromatin structure assay: its clinical use fordetecting sperm DNA fragmentation in maleinfertility and comparison with other tech-niques. J Androl 2002; 23: 25–43.

13. Evenson DP, Wixon R. Clinical aspects ofsperm DNA fragmentation detection andmale fertility. Theriogenology 2006; 65: 979–91.

14. Spano M, Bonde JP, Hjøllund HI, KolstadHA, Cordelli E, Leter G. Sperm chromatindamage impairs human fertility. Fertil Steril2000; 73: 43–50.

15. Evenson DP, Jost LK, Marshall D, ZinamanMJ, Clegg E, Purvis K, de Angelis P, ClaussenOP. Utility of the sperm chromatin structureassay as a diagnostic and prognostic tool inthe human fertility clinic. Hum Reprod 1999;14: 1039–49.

16. Ardón F, Helms D, Sahin E, Bollwein H,Töpfer-Petersen E, Waberski D. Chromatin-unstable boar spermatozoa have little chanceof reaching oocytes in vivo. Reproduction2008; 135: 461–70.

17. Christensen P, Knudsen DB, WachmannH, Madsen MT. Quality control in boar semenproduction by use of the FACSCount AF sys-tem. Theriogenology 2004; 62: 1218–28.

18. Al Habori M. Cell volume and ion trans-port regulation. Int J Biochem 1994; 26: 319–34.

19. Cooper TG, Yeung CH. Acquisition of vol-ume regulatory response of sperm upon matu-ration in the epididymis and the role of thecytoplasmic droplet. Micros Res Tech 2003;61: 28–38.

20. Yeung CH, Cooper TG. Effects of the ion-channel blocker quinine on human spermvolume, kinematics and mucus penetration,and the involvement of potassium channels.Mol Hum Reprod 2001; 7: 819–28.

21. Khalil AAY, Petrunkina AM, Sahin E,Waberski D, Töpfer-Petersen E. Enhancedbinding of sperm with superior volume regu-lation to oviductal epithelium. J Androl 2006;27: 754–65.

22. Petrunkina AM, Waberski D, Günzel-ApelAR, Töpfer-Petersen E. Determinants of spermquality and fertility in domestic species.Reproduction 2007; 134: 3–17.

23. Petrunkina AM, Gröpper B, Günzel-ApelAR, Töpfer-Petersen E. Functional significanceof the cell volume for detecting cell mem-brane changes and predicting freezability indog semen. Reproduction 2004; 128: 829–42.

24. Engel S, Petzoldt R. The spermatozoal vol-ume as indicative of the plasma membraneintegrity (modification of the hypoosmoticswelling test). I. Methods. Andrologia 1994;26: 309–13.

25. Petzoldt R, Engel S. The spermatozoal vol-ume as indicative of the plasma membraneintegrity (modification of the hypoosmoticswelling test). II. Diagnostic approach.Andrologia 1994; 26: 315–21.

26. Petrunkina AM, Harrison RAP, Petzoldt R,Weitze KF, Töpfer-Petersen E. Cyclicalchanges in sperm volume during in-vitro in-cubation under capacitating conditions: anovel boar semen characteristics. J ReprodFertil 2000; 118: 283–93.

27. Petrunkina AM, Petzoldt R, Stahlberg R,Pfeilsticker J, Beyerbach M, Bader H, Töpfer-Petersen E. Sperm-cell volumetric measure-ments as parameters in bull semen functionevaluation: correlation with nonreturn rate.Andrologia 2001; 33: 360–7.

28. Petrunkina AM, Jebe E, Töpfer-Petersen E.Regulatory and necrotic volume increase inboar spermatozoa. J Cell Phys 2005; 204:508–21.

29. Yeung CH, Barfield JP, Cooper TG. Chlo-ride channels in physiological volume regula-tion of human spermatozoa. Biol Reprod2005; 73: 1057–63.

30. Jeyendran RS, Van der Ven HH, Perez-Pelaez M, Crabo BG, Zaneveld LJ. Develop-ment of an assay to assess the functional in-tegrity of the human sperm membrane and itsrelationship to other semen characteristics.J Reprod Fertil 1984; 70: 219–28.

31. Pérez-Llano B, Lorenzo JL, Yenes P, TrejoA, García-Casado P. A short hypoosmoticswelling test for the prediction of boar spermfertility. Theriogenology 2001; 56: 387–98.

32. Caiza de la Cueva FI, Pujol MR, Rigau T,Bonet S, Miró J, Briz M, Rodriguez-Gill JE. Re-sistance to osmotic stress of horse spermato-zoa: the role of ionic pumps and their rela-tionship to cryopreservation success. Therio-genology 1997; 48: 947–68.

33. Januskauskas Rodriguez-Martinez H. As-sessment of sperm viability by measurementof ATP, membrane integrity and motility in fro-zen/thawed bull semen. Acta Vet Scand 1995;36: 571–4.

34. Casper RF, Meriano JS, Jarn KA, Cowan L,Lucato ML. The hypo-osmotic swelling test forselection of viable sperm for intracytoplasmicsperm injection in men with completeasthenozoospermia. Fertil Steril 1996; 65:972–86.

35. Van der Ven HH, Jeyendran RS, Al-HasaniS, Perez-Pelaez M, Dietrich K, Zaneveld LJD.Correlation between human sperm swellingin hypoosmotic medium (hypoosmotic swell-ing test) and in vitro fertilization. J Androl1986; 7: 190–6.

36. Gilmore JA, McGann LE, Liu J, Gao DY,Peter AT, Kleinhans FW, Critser JK. Effect ofcryoprotectant solutes on water permeabilityof human spermatozoa. Biol Reprod 1995;53: 985–95.

37. Gilmore JA, Liu J, Peter AT, Critser JK. De-termination of plasma membrane characteris-tics of boar spermatozoa and their relevanceto cryopreservation. Biol Reprod 1998; 58:28–36.

38. Petrunkina AM, Töpfer-Petersen E. Hetero-geneous osmotic behaviour in boar spermpopulations and its relevance for detection ofchanges in plasma membranes. Reprod FertilDev 2000; 12: 297–305.

39. Drevius LO, Erickson H. Osmotic swellingof mammalian spermatozoa. Exp Cell Res1966; 136–56.

40. Kulkarni SB, Sauna ZE, Somlata V,Sitaramam V. Volume regulation of spermato-zoa by quinine-sensitive channels. MolReprod Dev 1997; 46: 535–50.

41. Petrunkina AM, Hebel M, Waberski D,Weitze KF, Töpfer-Petersen E. Requirement ofintact cytoskleton for volume regulation inboar spermatozoa. Reproduction 2004; 127:105–16.

42. Petrunkina AM, Harrison RAP, Ekhlasi-Hundrieser M, Töpfer-Petersen E. The role ofvolume-sensitive osmolyte and anion chan-nels in volume regulation by mammalianspermatozoa. Mol Human Reprod 2004; 10:815–23.

43. Hunter RHF. Sperm transport and reser-voirs in the pig oviduct in relation to the timeof ovulation. J Reprod Fert 1981; 63: 109–17.

44. Thomas PG, Ball BA, Miller PG, BrinskoSP, Southwood L. A subpopulation of morpho-logically normal, motile spermatozoa attachto equine oviductal epithelial cell mono-layers. Biol Reprod 1994; 51: 303–9.

45. Petrunkina AM, Gehlhaar R, Drommer W,Waberski D, Töpfer-Petersen E. Selective spermbinding to porcine oviductal epithelium invitro. Reproduction 2001; 121: 889–96.

46. Gualtieri R, Talevi R. Selection of highlyfertilization-competent bovine spermatozoathrough adhesion to the fallopian tube epithe-lium in vitro. Reproduction 2003; 125: 251–8.

47. Lefebvre R, Chenoweth PJ, Drost M,LeClear CT, MacCubbin M, Dutton JT, SuarezSS. Characterization of the oviductal spermreservoir in cattle. Biol Reprod 1995; 53:1066–74.

48. Suarez SS, Redfern K, Raynor P, Martin F,Philipps DM. Attachment of boar sperm mu-cosal explants of oviduct in vitro: possiblerole in formation of a sperm reservoir. BiolReprod 2001; 44: 998–1004.

49. De Pauw IMC, Van Soom A, Laevens H,Verberckmoes S, de Kruif A. Sperm binding toepithelial oviduct explants in bulls with differ-ent nonreturn rates investigated with a new invitro model. Biol Reprod 2002; 67: 1073–9.

50. Waberski D, Magnus F, Ardón F,Petrunkina AM, Weitze KF, Töpfer-Petersen E.Binding of boar spermatozoa to oviductal epi-thelium in vitro in relation to sperm morphol-ogy and storage time. Reproduction 2006;131: 311–8.

51. Suarez SS. Hyperactivated motility insperm. J Androl 1996; 17: 331–5.

52. Töpfer-Petersen E. Molecules on thesperm’s route to fertilization. J Exp Zool 1999;285: 259–66.

53. Dobrinski I, Suarez SS, Ball BA. Intracellu-lar calcium concentration in equine sperma-tozoa attached to oviductal epithelial cells invitro. Biol Reprod 1996; 54: 783–8.

54. Dobrinski I, Smith TT, Suarez SS, Ball BA.Membrane contact with oviductal epitheliummodulates the intracellular calcium concen-tration of equine spermatozoa in vitro. BiolReprod 1997; 56: 861–9.

55. Petrunkina AM, Friedrich J, Drommer W,Bicker G, Waberski D, Töpfer-Petersen E. Ki-netic characterization of the changes in pro-tein tyrosine phosphorylation of membranes,cytosolic Ca 2+-concentration, and viability inboar sperm populations selected by bindingto oviductal epithelial cells. Reproduction2001; 122: 469–80.

271J. REPRODUKTIONSMED. ENDOKRINOL. 5/2008

56. Harrison RAP, Miller NGA. cAMP-de-pendent protein kinase control of plasmamembrane lipid architecture in boar sperm.Mol Reprod Dev 2000; 55: 220–8.

57. Holt WV, Harrison RAP. Bicarbonatestimulation of boar sperm motility via a pro-tein kinase A-dependent pathway: between-cell and between-ejaculate differences arenot due to deficiencies in protein kinase A ac-tivation. J Androl 2002; 23: 557–65.

58. Visconti PE, Bailey JL, Moore GD, Pan D,Olds-Clarke P, Kopf GS. Capacitation ofmouse spermatozoa: I. Correlation betweenthe capacitation state and protein tyrosinephosphorylation. Development 1995; 121:1129–37.

59. Visconti PE, Moore GD, Bailey JL, LeclercP, Connors SA, Pan D, Olds-Clarke P, Kopf GS.Capacitation of mouse spermatozoa: II. Pro-tein tyrosin phosphorylation and capacitationare regulated by a cAMP-dependent pathway.Development 1995; 121: 1139–50.

60. Urner F, Sakkas D. Protein phosphoryla-tion in mammalian spermatozoa. Reproduc-tion 2003; 125: 17–26.61. Petrunkina AM, Simon K, Günzel-ApelAR, Töpfer-Petersen E. Specific order in theappearance of protein tyrosine phosphoryla-tion patterns is functionally coordinated withdog sperm hyperactivation and capacitation.J Androl 2003; 24: 423–33.62. Dubé C, Beaulieu M, Reyes-Moreno C,Guillemette C, Bailey JL. Boar sperm storagecapacity of BTS and Androhep Plus: viability,motility, capacitation, and tyrosine phosphor-ylation. Theriogenology 2004; 62: 874–86.63. Petrunkina AM, Volker G, Brandt H,Töpfer-Petersen E, Waberski D. Functionalsignificance of sperm responsiveness to ca-pacitating conditions. Theriogenology 2005;64: 1766–82.64. Petrunkina AM, Gröpper B, Töpfer-Petersen, Günzel-Apel AR. E Volume regula-tory function and sperm membrane dynamicsas parameters for evaluating cryoprotective

efficiency of a freezing extender. Theriogeno-logy 2005; 63: 1390–406.

65. Harrison RAP. Capacitation mechanisms,and the role of capacitation as seen ineutherian mammals. Reprod Fertil Dev 1996;8: 581–94.

66. Petrunkina AM, Volker G, Beyerbach M,Töpfer-Petersen E, Waberski D. Detection ofcooling-induced membrane changes in boarsperm response to capacitating conditions.Theriogenology 2005; 63: 2278–99.

67. Lynham JA, Harrison RAP. Use of storedpig eggs to assess boar sperm fertilizing func-tions in vitro. Biol Reprod 1998; 58: 539–50.

68. Gadea J, Matas C. Sperm factors related toin vitro penetration of porcine oocytes.Theriogenology 2000; 54: 1343–57.

69. Waberski D, Magnus F, MendoncaFerreira F, Petrunkina AM, Weitze KF, Töpfer-Petersen E. Importance of sperm-binding as-says for fertility prognosis of porcine sperma-tozoa. Theriogenology 2005; 63: 470–84.

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51st Annual Conference of Physiology and Pathology of Reproduction and 43rd Mutual Conference of Veterinary and Human Reproductive Medicine, 21st–23rd February, 2018, Hannover – Abstracts

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