MOLEKULARE GRUNDLAGEN DER VERERBUNG Bio Teil III.pdf · Begrenzende Membran fehlt Vorhanden Genübertragung und Genaustausch (= Rekombination) bei Bakterien Bei höheren Lebewesen

Seite 58 © Florian Zeller 07/08

MOLEKULARE GRUNDLAGEN DER VERERBUNG

1. Bakterien und Viren als genetische Forschungsobjekte

Bakterium:

Plasmide (kleine Zusatzchromosömchen)

ringförmige DNA, das s. g. „Bakteriumchromosom“

Versuch von Griffith 1928

Pneumokokken: Erreger der Lungenentzündung

S-Stamm: smooth, Kapsel aus Schleim vorhanden, virulent

R-Stamm: rough, Kapsel aus Schleim nicht vorhanden, nicht virulent

Versuch von Avery 1944 (in vitro)

S-Stamm R-Stamm

Pathogen nicht pathogen

Abkochen zum

Abtöten der Bakterien

R-Stamm: keine schützende Schleimhülle,

daher nicht virulent keine Erkrankung

R-Stamm: lebendig

Aber ungefährlich !!

Pneumokokken – Transformationsexperiment


Die DNA des S-Stamms muss in den lebenden R-Stamm übergegangen sein, dort eingebaut & realisiert wor-

den sein.

= Übertragung von Erbanlagen durch reine blanke DNA

Bei solchen Experimenten arbeitet man oft mit s.g. Mangelmutanten; das sind Mutanten, die die Fähigkeit

zur Herstellung oder Verwertung eines bestimmten Stoffes verloren haben. Sie sind auxotroph in Bezug auf

diesen Stoff.

Gewinnung von Mangelmutanten

Transformation


Schema der Stempeltechnik

zur Suche nach Mangelmutanten

ohne Lysin

lys-

ohne Leucin

leu-

ohne Valin

val-

Transformation bei Bacillus subtilis

Die Zellen einer Wildtyp-Kultur werden künstliche lysiert.

Mit Phenol werden die Proteine denaturiert.

Das Lysat wird mit Chloroform geschüttelt.

Zentrifugation

Die DNA wird aus der wässrigen Phase gewonnen !!!

Bakterien-

lysat

wässrige Phase

mit DNA

Chloroform-Phase

mit Protein

Bacillus subtilis

auxotropher Stamm im

Vollmedium

Keine Kolonien auf einer

Minimalmedium-

Agarplatte

Bacillus subtilis

auxotropher Stamm im

Vollmedium + DNS aus

Wildtypzellen

Koloniebildung

auf einer Minimalmedium-

Agarplatte


Ablauf der Transformation

Voraussetzung für die Aufnahme reiner DNA einer Spenderzelle ist ein bestimmter Stoffwechselzustand der

Empfängerzelle, d.h. sie ist kompetent (empfangsbereit). In diesem Zustand werden Rezeptoren auf der

Zellwand gebildet oder aktiviert. Die Spender-DNA muss doppelsträngig vorliegen und eine bestimmte Mo-

lekülgröße aufweisen, damit die Aufnahme durch Endozytose (winzige fingerförmige Einstülpungen der

Zellmembran schnüren kleine mit der aufzunehmenden Substanz gefüllte Bläschen ab, die ins Zellinnere

wandern) in die Empfängerzelle möglich ist.

1. Endozytose

Ein Einzelstrang der Spender-DNA wird mit dem homologen Einzelstrangabschnitt der Empfänger-DNA

verbunden. Bei der anschließenden Integration verdrängt dieser Einzelstrang der Spender-DNA den entspre-

chenden Abschnitt der Empfänger-DNA, der dann ausgeschnitten und abgebaut wird.

2. Integration

Bei der folgenden Replikation wird der eingebaute Spender-DNA-Einzelstrang verdoppelt und bildet eine

durchgehende Doppelhelix, während der nun ungepaarte Empfänger-DNA-Einzelstrang abgebaut wird.

3. Replikation

Vorteile von Bakterien für genetische Untersuchungen:

- Einfach strukturiert, 1 ringförmiges Chromosom (DNA) + Plasmide

Mutation erscheint meist sofort im Phänotyp

- Geringer Aufwand für Kultivierung

- Rasche Vermehrung

- Viele nachkommen statistisch haltbare Ergebnisse

- Keine ethisch-moralischen Bedenken


Vergleich von VIREN und ZELLEN

VIREN ZELLEN

Nucleinsäuren DNA oder RNA DNA RNA

Fähigkeit zur Mutation vorhanden vorhanden

Stoffwechsel ---- vorhanden

Vermehrung lässt sich vermehren,

nur in Wirtszellen möglich

vermehrt sich selbst

mitotisch oder meiotisch;

Spaltung bei Bakterien

Begrenzende Membran fehlt Vorhanden

Genübertragung und Genaustausch (= Rekombination) bei Bakterien

Bei höheren Lebewesen erfolgt die Rekombination durch Meiose und Befruchtung. Bei Bakterien gibt es

hierfür andere Vorgänge, man nennt sie parasexuell.

1. GENAUSTAUSCH = REKOMBINATION

Versuch: 1946 mit 2 Doppelmutanten von E. coli:

1. A-B

- , d.h. Synthese von Aminosäuren A und B nicht möglich

2. C-D

- , d.h. Synthese von Aminosäuren C und D nicht möglich

Minimalmedium ohne A,B,C,D

Rekombination hat stattgefunden !!!

„Geheilte“ Mangelmutanten (Rekombinanten) erkennt man im Experiment daran, dass sie

Auf Minimalagar wieder Kolonien bilden können!!

Problem:

Wie gelangen die Gene von einer Bakterienzelle in die andere, d.h. wie erfolgt der Gentransfer, die Gen-

übertragung?

2. GENTRANSFER = GENÜBERTRAGUNG

a) Konjugation

Bakterien, die auf einem Plasmid den sog. F+-Faktor (= Fertilitätsfaktor) haben, sind in der Lage,

dünne Röhren auszubilden und damit Kontakt zu F--Zellen aufzunehmen. Es kann zur Ausbildung

von Plasmabrücken kommen, über diese können Gene transferiert werden!


Transferiert werden können Kopien

eines ganzen Plasmids (z.B. mit

F+-Faktor) oder Kopien von Stücken

der Spender-DNS !!!

Der dauerhafte Einbau von Spender-Genen in die Empfänger-DNS erfolgt über Crossing over Pro-

zesse und kann z.B. so erfolgen:

Empfängerbakterium: a-b

-c

- (Genotyp)

Dreifachmutante!!

Einbaumöglichkeiten (Rekombinationsmöglichkeiten)

Rekombinante:

A+B

+c

-

Aufgabe:

1. Kann auch der „Wildtyp“ wieder entstehen?

Ja, wenn alle 3 eingebaut werden A+B

+C

+ ; aber zwar Rekombinante

2. Gibt es weitere Rekombinanten? Nennen Sie alle möglichen neuen Genotypen!!

A+b

-c

- ; a

-B

+c

- , a

-b

-C

+ , A

+b

-C

+ , a

-B

+C

+

Konjugation = Übertragung von genetischem Material mit Ausbildung einer Plasmabrücke

b) Transduktion

Transduktion = Übertragung von genetischem Material durch Vieren

Vieren werden als „Gentaxis“ oder „Genfähren“ benutzt!

Sie nehmen z.B. bakterielle Gene wie Passagiere auf und laden sie irgendwo wieder ab, dies kann

auf zwei unterschiedliche Weise geschehen!

1. Allgemeine Transduktion

Lytischer Vermehrungszyklus


Gen a (defekt)

Gen a (defekt) ausgebaut

Mangelmutante ist genetisch geheilt!

2. Spezielle Transduktion (Modell für gezielte Gentransplantation)

T4 – Bakteriophage

HIV-Virus

Wenn in einem phagenbefallenen Wildtyp-

bakterium die vermehrte Phagen-DNS in die

Kopfhüllen verpackt wird, kann versehentlich

ein Stück Bakterien-DNS in den Kopf gelan-

gen. Injiziert ein solcher Phage die DNS in

eine Mangelmutante, kann er zufällig das

Gen A mitbringen, das bei der Mangelmutan-

te zu a mutiert ist. Durch einen Paarungs- und

Rekombinationsvorgang (crossing over) kann

das defekte Gen a gegen das intakte Gen A

ausgetauscht werden.

Gefesselter Prophage nimmt bei seinem Austritt

aus dem Bakterienchromosom benachbarte Gene

mit und wird vermehrt. In alle Phagenköpfe, die

im Bakterium hergestellt werden, gelangt eine

Kopie desselben bakteriellen Gens!

Befallen diese transduzierten Phagen einen be-

züglich dieses Gens mutierten Bakterienstamm,

erfolgt mit hoher Erfolgsrate dessen Heilung durch

Austausch des defekten Gens.


Bakterien und Viren als Forschungsobjekte

2. Vorkommen, Struktur und Replikation von Nucleinsäuren

Vorkommen: DNA: chromosomal Bestandteil der Chromosomen

extrachromosomal Platiden und Mitochondiren

RNA: in und außerhalb des Zellkerns

Cytoplasma

Ribosomen

Mitochondrien und Plastiden

Struktur: Wenn man DNA durch Kochen mit Säure hydrolisiert, so kann man im Hydrolysat stets folgende Be-

standteile nachweisen:

1. BESTANDTEILE:

Phosphorsäure P

Zucker (Desoxyribose, Ribose) Z

Organische Basen B

Purinbasen Pyrimidinbasen

Adenin A - - - - - - - T Thymin (U = Uracil bei RNA)

Guanin G - - - - - - - C Cytosin

Basenpaarung


2. MONOMERE (= Bausteine) der Nucleinsäuren

Nucleotid:

3. POLYNUCLEOTID = Nucleinsäuren

einsträngig

doppelsträngig 2 Stränge,

paralleler und antiparalleler Polynucleotidstrang mit komplementärer Basenpaarung

aus 1 – 3

4. WATSON-CRICK-STRUKTURMODELL DER DNA

Strickleiterprinzip:

Basenpaare = Sprossen der Leiter

Zucker-Phosphatketten = Holme der Leiter

Komplementarität der Stränge ! (= Basen ergänzen sich gegenseitig)

Raumstruktur: Die beiden Stränge sind um eine gemeinsame (gedachte) Achse gewunden und bil-

den so eine sog. Doppelhelix (Doppelschraube).

Nach je 10 Basenpaaren ist eine vollständige Schraubenwindung durchlaufen.

5‘-Ende (bezogen auf

das Zucker-

molekül)

3‘-Ende

Der Faden hat

einen Rich-

tungssinn (Pola-

rität) !!

Reihenfolge der Basen

im Molekül

= Basensequenz

Komplementäre Polynucleotidstränge!

zwischen den Basen:

Wasserstoffbrücken!


Tertiärstruktur der DNA

Doppelhelix

Raumstruktur der DNA = WATSON-CRICK-Modell

Kurzschreibweisen

Nukleinsäuren (Nicht für die Prüfungen besonders relevant)

1. Bestandteile

a) Phosphorsäure

b) Zucker: Desoxyribose Ribose

c) Organ Basen


2. Monomere der Nukleinsäuren

a) Bildung eines Nucleosids:

Thymin 𝜶-Thymidin

(Nukleosid)

N-glykosidische Bindung

b) Bildung eines Nucleotids:

Esterbindung

𝛼-Thymidin-5‘-monophosphat = 𝜶TMP

3. Polynukleotide = Nukleinsäuren

Primärstruktur der Desoxiribonukleinsäure (DNS =

DNA)

einsträngig: Richtungssinn des Fadens (Polarität)

Sekundärstruktur der DANN: doppelsträngig

Anordnung der beiden Polynukleotidfäden

„antiparallel“

5‘ Ende 3‘ Ende

Guanin Cytosin

Adenin Thymin

Cytosin Guanin

3‘ Ende 5‘ Ende


4. Wasserstoffbrückenbindung, Basenpaarung „Komplementäre“ Polynukleotidstränge

Identische Verdoppelung der DNS

Denkmöglichkeiten:

Wenn von Zellteilung zu Zellteilung keine genetische Information verlorengeht, muss vor jeder Teilung eine identische

Verdoppelung der Erbsubstanz erfolgen. Das Strukturmodell der DNS von Watson und Crick bietet hierfür durch das

Prinzip der komplementären Basenpaarung eine verblüffend einfache Modellvorstellung an.

Der Doppelstrang öffnet sich wie ein Reißverschluss. An die frei werden-

den Basen lagern sich in jedem Strang einzelne Nucleotide mit den jeweils

komplementären Basen an, die miteinander verknüpft werden.

Die angedockten Nucleotide werden über Phosphor-Esterbindungen mi-

teinander verknüpft. Dadurch entstehen zwei neue Doppelstränge von

DNS mit genau derselben Aufeinanderfolge von Basenpaaren.

Nach dieser Modellvorstellung besteht jeder Doppelstrang zur Hälfte aus

altem, zur anderen Hälfte aus neuem Material.

Den experimentellen Nachweis für die semikonservative Replikation der

DNA lieferten MESELSON und STAHL 1958. Einfachste Schema der identischen Ver-

Doppelung der DNS


Markierungsexperiment von Meselson und Stahl 1958

15

N = schwerer Stickstoff

Eichungsschritt

1 halbschwere Bande Ausschluss des Konserva-

tiven Mechanismus

1 halbschwere und 1 leichte

Bande Ausschluss des Dispersi-

ven Mechanismus

SEMIKONSERVATIVER MECHANISMUS !!!

Diese sogenannte semikonservative Art der DNS-Verdoppelung oder DNS-

Replikation konnte durch Isotopen-Markierungsversuche bestätigt werden.

Escherichia coli-Bakterien werden während mehrerer Replikations- und Tei-

lungszyklen in einem Nährmedium gehalten, das in seinen Stickstoffverbin-

dungen das „schwere“ Isotop 15

N enthält. Dabei wird 15

N über die Purin-

und Pyrimidinbasen schließlich in beide Stränge der DNS eingebaut.

In einer sogenannten analytischen Ultrazentrifuge ist es möglich, 15

N-haltige,

„schwere“ DNS von 14

N-haltiger, „leichter“ DNS, sowie „halbschwerer“ 15

N/14

N-haltiger DNS als Banden optisch zu unterscheiden.

Bakterien mit 15

N-haltiger DNS werden in 14

N-haltiges Medium überführt und

dort für die Zeit eines Replikationszyklus belassen. Isoliert man dann die DNS

aus diesen Bakterien und untersucht sie in der Ultrazentrifuge, so erweist sie

sich als „halbschwer“. Untersucht man die Bakterien-DNS nach zwei Replika-

tionen in normalem Medium, so findet man leichte und halbschwere DNS im Verhältnis 1:1, in Übereinstimmung mit

der Modellvorstellung der semikonservativen Art der Replikation.

1. Replikationszyklus

auf Nährboden mit 14N

2. Replikationszyklus

auf Nährboden

mit 14N

Kontrollversuch

Nach 3 Replika-

tionszyklen auf

Nährboden mit 14N



Ablauf der DNS-Verdoppelung

DNS-Doppelhelix wird enzymatisch entdrillt und geöffnet.

Komplementäre Nucleotide lagern sich an

(liegen als energiereiche Nucleosidtriphosphate vor: PPP-Z-B, Abspaltung von PP liefert Energie nur Nucleotid-

verknüpfung)

DNS-Polymerase kann Nucleotide nur in 3‘ 5‘-Richtung des Mutterstranges verknüpfen, deshalb erfolgt die

Ergänzung zum Doppelstrang an beiden Ästen der Replikationsgabel unterschiedlich:

an einem Strang kontinuierlich von der Gabelungsstelle weg,

am anderen Ast diskontinuierlich (nach und nach) in kleinen Stücken (Okazaki-Fragmente), die dann von DNS-

Ligase verbunden werden.

DNS-Reparatur-Polymerase korrigiert fehlerhafte Basenpaarungen.

DNS-Polymerase kann DNS-Synthese nur fortsetzen, nicht beginnen; ein Primer (ein kurzes RNS-Stück), von

Primase aufgebaut, startete den Vorgang.

DNS-Polymerase braucht am Leitstrang nur 1 Primer, für die Synthese jedes Okazaki-Fragmentes einen eigenen

Primer.

(Okazaki-Fragmente bei Eukaryonten: 100 – 200 Nucleotide, bei Prokaryonten: 1000 – 2000 Nucleotide).

Die Replikation der Bakterien-DNS erfolgt von einem Startpunkt aus. Zur Anlagerung der Nucleotide ist Entspira-

lisierung notwendig. Die Bakterienzelle besitzt 3 × 105 Windungen.

Verdoppelung ca. alle 40 Minuten 3 × 105 : 40 = 7500 Umdrehungen pro Minute = mittelschwere Zentri-

fuge!

Problem weitgehend ungeklärt, müsste eigentlich für die Zelle verheerende Folgen haben. Heute weiß man, dass

DNS-Topoisomerasen DNS entwinden können, ohne die Doppelhelix dabei zu drehen: die „Holme“ der verdrillen

„Leiter“ werden an vielen Stellen durchtrennt, entflochten und anschließend wieder repariert.

Die Verdoppelung der DNS erfolgt bei Eukaryonten an mehreren Startpunkten gleichzeitig.

Startstelle = Replikationsursprung (spezi-

fische Nucleotidsequenz), wird von be-

stimmtem Enzym erkannt und leitet Repli-

kation ein.


ATP – Adenosintriphosphat Adenin + Desoxyribose + P P P

GTP – Guanosintriphosphat

CTP – Cytidintriphosphat

TTP – Thymidintriphosphat

Vergleich DNA und RNA

DNA RNA

Aufbau

Zucker: Desoxiribose

Phosphat

Basen: A , T , C , G

Zucker: Ribose

Phosphat

Basen: A , U , C , G

Form

Doppelstrang

Helix (spiralig gewunden)

Einzelstrang

nicht gewunden

Arten

Kern – DNA

Mitochondriale DNA

Plastiden – DNA

messenger-RNA: langgestreckt

ribosomale RNA: Kleeblattstruktur

transfer-RNA: Kleeblattstruktur

Vorkommen

Kern

Mitochondrien

Plastiden (Chloro-, Chromo-, Leuko-

plasten)

Kern

Plasma

Mitochondrien

Plastiden

Ribosomen


Eiweißverbindungen (Proteine und Peptide)

Bedeutung: Baustoffe und Wirkstoffe

1. Strukturproteine: Substanzen, die den Körper aufbauen (Faserprotein Kollagen, Muskelproteine Aktin

und Myosin).

2. Enzyme: Biokatalysatoren, ermöglichen chemische Reaktionen im Körper

3. Membranproteine: Diese Proteine sorgen für den selektiven Stofftransport durch die Biomembran, sie die-

nen der Erkennung von zellen und sind als Rezeptormoleküle in Membranen von Ner-

venzellen an der Informationsübermittlung beteiligt.

4. Transportproteine: Hämoglobin transportiert Sauerstoff.

5. Immunproteine: Antikörper binden Krankheitserreger.

6. Regulatorproteine: Hormone sind an der Regulation von Stoffwechselreaktionen beteiligt.

Im menschlichen Körper kommen ca. 50.000 verschiedene Proteine vor. (+ Immunsystem Millionen)

Aufbau: Die Bausteine der Proteine und Peptide sind die Aminosäuren:

H

Aminogruppe H2N C COOH Säuregruppe (= Carboxylgruppe)

R

In Proteinen können 20 verschiedene (= proteinogene) Aminosäuren vorkommen, die sich in den Resten R unterschei-

den.

Es gibt unpolare lipophile Reste und polare hydrophile Reste.

H H

H2N C COOH H2N C COOH

CH3 H2C – OH

Alanin (unpolar) Serin (polar)

DIPEPTID

Aminosäure 1 Aminosäure 2

Von 1 bis 99 Aminosäuren spricht man von Peptide,

ab 100 Aminosäuren spricht man von Proteinen (Primärstruktur).


Verknüpfung von Aminosäuren durch Peptidbdindungen

Prinzip:

Aminosäure 1 Aminosäure 2 DIPEPTID

Dipeptid Aminosäure 3 TRIPEPTID


Allgemeine Schreibweise: H2N – AS1 – AS2 – AS3 – COOH

Aminoende Carboxylende

R1 , R2 , R3 = Aminosäurereste

Bauprinzip der Proteine

Primärstruktur (Verknüpfungsprinzip der Aminosäuren)

Der räumliche Bau und das chemische Verhalten der Proteine hängt ab von:

- Der Art der Aminosäure

- Der Anzahl der Aminosäuren

- Vor allem von der Reihenfolge der Aminosäuren

Die Aufeinanderfolge der Aminosäuren in einem Protein wird als dessen Aminosäuresequenz bzw. Primärstruk-

tur bezeichnet.

z.B. Val – His – Leu – Ser – Ala – Glu – Lys – …

Bei einem Polypeptid mit 100 Aminosäuren gibt es 20100

Möglichkeiten !!!!

Ursache für die Mannigfaltigkeit der Proteine !!!

(Im menschlichen Körper nur 5 Mio. verschiedene Proteine)

Sekundärstruktur (Raumstruktur der Peptidketten)

Verursacht durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen C O und N H

- Schrauben- oder Helixstruktur: innermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen

- Faltblattstruktur: zwischenmolekulare Wasserstoffbrückenbindungen

Ob Helix- oder Faltblattstruktur, hängt von der Primärstruktur, also von der Aminosäuresequenz des Proteins ab!

Tertiärstruktur (spezielle Raumgestalt globulärer Proteinmoleküle)

Verursacht durch spezielle kovalente Bindungen oder Kohäsionskräfte innerhalb des Makromoleküls:

Kovalente Bindung: Disulfidbrücke

Kohäsionsbindung: Ionenbindung

Wasserstoffbrückenbindung

Van der Waals-Kräfte


Myoglobin Häm

Quartärstruktur

Ist ein Eiweißmolekül aus mehreren einzelnen Polypeptidketten, die durch Wechselwirkung (nicht durch Peptid-

bindungen) zusammengehalten werden, aufgebaut, so besitzt es eine Quartiärstruktur.

Bsp.: Hämoglobin

Viele Enzyme scheinen nach diesem Prinzip aus verschiedenen Untereinheiten bestimmter Tertiärstruktur zu

Molekülverbänden mit Quartärstruktur zusammengesetzt zu sein, wobei stets die charakteristische Quartärs-

truktur erst die typische Wirkung ermöglicht.

Hämoglobin


Molekulare Wirkungsweise der Gene

Was tun Gene nun eigentlich genau?

Gene machen Enzyme ( Merkmale)

Beadle-Tatum Versuch

Experimentelle Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Gen und Merkmal beim roten Schimmelpilz Neurospora,

durch UV-Strahlen erzeugt.

Eine Mutante kann eine Vorstufe des Tryptophans nicht mehr bilden. Neurospora-Myzel ist haploid, man kann von

Phänotyp direkt auf den Genotyp schließen.

a Gefäß mit Minimal-Nährmedium.

Nicht mutierte Sporen keimen, das auswachsende Myzal wird durch Gift abgetötet.

Mutierte Sporen keimen nicht, bleiben somit vom Gift unbeeinflusst und kommen ins Vollnährmedium.

Neurospora gedeiht auf einem

„Minimal-Nährmedium“

(Zucker und Nährsalz)

UV-Strahlen,

können Mutationen in

den Sporen bewirken

Entwicklung einer Kolonie nur auf

Vollnährmedium (Bestandteile des Mini-

malnährmediums + Vitamine + alle Amino-

säuren)

Watte

Kein Wachstum auf

Minimalnährmedium + Vitamine

(Beweis dafür, dass durch die Mutation die

Fähigkeit zur Bildung von Aminosäuren

gestört ist)

Kolonie auf Minimalmedium + Aminosäuren

Kein Wachstum auf Minimalmedium + Aminosäure Lysin

Kolonie auf Minimalmedium + Aminosäure Tryptophan

Kolonie auf Minimalmedium + Indol (Vor-

stufe des Tryptophans


z.B. Tryptophan als Endprodukt

Wenn Gen 3 ausfällt, kann das Enzym 3 nicht produziert

werden, was wiederum nicht zu dem Produkt Idol führt.

Somit kann die Kette nicht weiter fortgesetzt werden und es

kommt nicht zu dem Endprodukt Tryptophan.


Genetischer Code und dessen Verwirklichung (= Proteinbiosynthese)

Überlegungen zum Dreiercode auf der DNS

1. Zucker-Phosphat-Homen der DNS

Z P Z = Aminosäure 1

P Z P = Aminosäure 2

Die Information für die Aminosäuren kann nicht durch die Zucker-Phosphat-Holmen verschlüsselt sein,

da nur 2 der 20 Aminosäuren codiert werden können.

2. Eine Base bedeutet eine Aminosäure

Code reicht nur für 4 Aminosäuren aus

3. Ein Basendoublett bedeutet eine Aminosäure

AA AC AG AT

CA CC CG CT

GA GC GG GT für zusammen 16 Aminosäuren

TA TC TG TT

4. Ein Basentriplett bedeutet eine Aminosäure

AAA AAG AAC AAT GCA GCG GCC GCT

AGA AGG AGC AGT CGA CGG CGC CGT

ACA ACG ACC ACT CCA CCG CCC CCT

ATA ATG ATC ATT CTA CTG CTC CTT

GAA GAG GAC GAT TAA TAG TAC TAT

GGA GGG GGC GGT TGA TGG TGC TGT

GTA GTG GTC GTT TCA TCG TCC TCT

CAA CAG CAC CAT TTA TTG TTC TTT

Codewort auf der DNA = Codogen 64 Möglichkeiten

Basentriplett der DNA = Codogen

z.B. AAA AAC AAG TAG

lückenloset, kommafreier Code

Basentripplet der RNA = Codons

z.B. UUU UUG UUC AUC

Code-Sonne (Code-Lexikon,

genetisches Wörterbuch)

Start

STP = Terminator-Codon

= Abbruch-Codon

Start = Starter-Codon, die am Anfang der

Translation stehen.

Aminosäuren:

Arg Arginin Leu Leucin

Asn Asparagin Lys Lysin

Asp Asparaginsäure Met Methionin

Ala Alanin Phe Phenylalanin

Cys Cystein Pro Prolin

Gln Glutamin Ser Serin

Glu Glutaminsäure Thr Rhreorin

Gly Glycin Trp Tryptophan

His Histidin Tyr Tyrosin

Ile Isoleucin Val Valin


Der genetische Code ist UNIVERSELL !!!

d.h. ein bestimmtes Codon bedeutet bei allen bisher untersuchten Organismen die selbe Aminosäure.

64 Codons: 61 für die Bezeichnung der unterschiedlichen Aminosäuren (20) degeneriertes Codesystem

UAG UAA UGA = Abbruch Codons (= Stopp Codons)

Wenn diese Tripletts in der m-RNA (mesenger-RNA) vorkommen, erfolgt KEINE Synthese mehr bzw. eine be-

gonnene Polypeptidkette wird abgebrochen.

AUG GUG = Start Condons

Sie signalisieren den Beginn einer Polypeptidsynthese, aber nur wenn sie auf ein oder eine kleine Serie von

Stopp-Codons folgen. Ansonsten, d.h. innerhalb eines Gens, bedeuten diese Triplets normale Aminosäuren.

Entzifferung des genetischen Codes

Nirenberg, Matthei 1961

künstlich synthetisierte m-RNS

m-RNS: U-U-U-U-U-U-RNS

Zellfreies System

von E.coli

(Ribosomen, energie-

Reiche Phosphate,

Enzyme)

(Ausflockung) Filter

Trichter

Nirenberg 1965 : Synthese von m-RNS-Trinucleotiden bekannter Basenfolge

Entzifferung fast aller Codeworte

Khorana 1965: Synthese von DNS-Oligonucleotiden definierter Zusammensetzung

Endgültige Klärung des genetischen Codes

Proteinsynthese

Transkription = die Phase des Umschreibens einer bestimmten Basensequenz von der DNS in die mesenger-RNS

Protein

Translation = ist die Phase des Übersetzens der Basensequenz der m-RNS in die Aminosäuresequenz eines bestimmten

Proteins mit Hilfe der Kleeblattförmigen t-RNS (transfere-RNS)

20 Ansätze des zellfreien Systems

von E.coli mit je einer anderen

14C markierten Aminosäure

Der Ansatz mit der Aminosäure Phenylalanin zeigte gegenüber

den anderen Ansätzen eine 1000-fach gesteigerte Aktivität.

Folgerung: ein Polypeptid aus Phe* ist entstanden

Codewort UUU bedeutet Phenylalanin

Phe

Phe

Phe

Information

Gen = DNA-Abschnitt m-RNA

Speicher der genet. Information Transportform der

Information

Bausteine

Aminosäure Baustein der Proteine Aminosäure-tRNA

sorgt zusamen mit

t-RNA transportiert und aktiviert die AS der mRNA für die Reihenfolge


Modellvorstellung vom Transkriptionsvorgang

Der Enzymkomplex der Transkriptase erkennt

Startstellen auf der DNS an einer bestimmten Ba-

sensequenz und setzt sich darauf fest. Anhand der

Basensequenz erkennt er, welcher der beiden

Stränge in welcher Richtung abgeschrieben werden

soll. Er öffnet den Doppelstrang und ermöglicht

Basenpaarung zwischen dem sog. codogenen

Strang und den Basen der viererlei Nucleotide, die

er zu m-RNS verknüpft.

Während der Transkription wandert der hohlzylin-

derförmige Enzymkomplex an der DNS entlang, bzw. diese durch ihn hindurch, wobei ein m-RNS-Strang aus ihm

herauswächst. Er enthält die Basensequenz des sog. Code-Stranges. Bestimmte Stellen erkennt der Komplex schließ-

lich als Zielstellen, wo er sich und die m-RNS ablöst.

Ein Transkriptionsabschnitt auf der DNS und damit auch eine m-RNS enthält die Information von wenigstens einem

Gen, meist von mehreren.

Über einen Transkriptionsabschnitt wandern (bei E.

coli) gleichzeitig mehrere Transkriptase-Moleküle.

Die wachsenden m-RNS-Stränge werden sofort von

Ribosomen besetzt. Auf m-RNS aufgefädelte Ribo-

somen nett man Poly-Ribosomen.

Translation – ein Protein wird „montiert“

„Vorbereitung“: Die t-RNS wirkt als Vermittler zwischen m-RNS und Aminosäuren!

Für jede Aminosäure gibt es eine spezifische t-RNS, die sie zu den Ribosomen transportiert. Die Aktivierung der Ami-

nosäure und deren Anbindung an „ihre“ t-RNS erfolgen unter Energieverbrauch durch sog. Synthetasen (Enzyme).

t-RNS-Molekül: Kleeblattstruktur

Anticodon: komplementär zu 1 bestimmten Basentriplett der m-RNA, also zu einem codon!

Die Zuordnung der passenden Aminosäure erfolgt über die Synthetasen welche die spezifische

Raumstruktur der t-RNS Moleküle abgreifen und jeweils die richtige Aminosäure auswählen und

anheften.

Aminosäureanheftestelle: immer gleich; kann daher nur anheften, aber nicht auswählen!

(immer CCA)

Synthese des Proteins

Zunächst lagern sich die beiden Untereinheiten des Ribosoms an der Starsequenz der m-RNS zu einem funktionsfähi-

gen Ribosom zusammen.

Im Ribosom paart an jedes Codon (3 Nucleotide = Triplett) der m-RNS eine t-RNS (beladen mit ihrer spezifischen

Aminosäure) mit „passendem“ Anticodon (zum Codon komplementäres Triplett).

Das Ribosom besitz zwei t-RNS-Bindestellen. Dadurch wird der Kontakt zwischen den an den beiden t-RNS hängenden

Aminosäuren hergestellt – die Peptidbindung kann geknüpft werden.

Die „vordere“, nun freie t-RNS löst sich aus dem Ribosom und macht Platz für die nächste Ankopplung einer „neuen“

beladenen t-RNS an die um ein Triplett weitergerückte m-RNS.


Durch die Wiederholung dieses Vorgangs wird die angefangene Aminosäure-Kette um eine Aminosäure nach der ande-

ren verlängert, und zwar exakt so, wie es die Codons der m-RNS vorschreiben.

Kommt das Ribosom an ein Stop-codon der m-RNS, so endet der Translationsprozess. Das gebildete Protein wird frei

und nimmt seine funktionsfähige Raumstruktur ein.


Analogen aus der menschlichen Sprache

4 Buchstaben des genetischen Codes A,C,G,T bzw. U entsprechen 4 anderen Buchstaben des Alphabets E, I, N, S.

Eine kurze Sequenz von Tripletts wird in die menschliche Sprache übertragen. Die Wortfolge ISS NIE EIN EIS soll

als Modell für ein Protein aus 4 Aminosäuren dienen.

Dieser Satz soll nun verändert werden:

a) Austausch eine Buchstaben (= Base) in einem Wort (=Triplett)

ISS NIE EIN SIS

Sie kann, muss aber nicht

entstellt sein.

b) Einschub eines Buchstaben (= zusätzliche Base oder Nucleotid)

INS SNI EEI NEI S

Leseraster ist verschoben;

kein Sinn mehr!

c) Ausfall eines Buchstaben

ISS …IEE INE IS

Leseraster ebenfalls ver-

schoben; kein sinn!

d) Ausfall eines ganzen Wortes (= Triplett)

… NIE EIN EIS

ISS NIE … EIS

Takt bleibt erhalten;

Sinn entstelt

Sinn bleibt

Zellverhältnisse

Codogener DNA-Strang:

m-RNA-Original:

codierte Aminosäure:

GAC

CUG

Leu

CCT

GGA

Gly

ATG

UAC

Tyr

CGT

GCA

Ala

CAC

GUG

Val

AAG

UUC

Phe

TCG

AGC

Ser

a) Basenaustausch (m-RNA):

[A gegen G in der DNA]

CUG

Leu

GGA

Gly

CAC

His

GCA

Ala

GUG

Val

UUC

Phe

AGC

Ser

liefert Fehlsinn: ein Enzym mit einer falschen Aminosäure und dadurch mehr oder weniger

Verminderte Aktivität.

b) Baseneinschub (m-RNA):

[zusätzlich G in der DNA]

CUG

Leu

GGA

Gly

CUA

Leu

CGC

Arg

AGU

Ser

GUU

Val

CAG C

Gln

liefert Unsinn: ein Protein mit völlig veränderter Aminosäuresequenz und Tertiärstruktur.

Ursprüngliche Enzymfunktion verloren.

c) Basenverlust (m-RNA)

[Wegfall von A in der DNA]

CUG

Leu

GGA

Gly

ACG

Thr

CAG

Gln

UGU

Cys

UCA

Ser

GC.

ähnlich wie bei b.

d) Verlust eines Tripletts

[Wegfall von ATG in der DNA]

CUG

Leu

GGA

Gly

GCA

Ala

GUG

Val

UUC

Phe

AGC

Ser

liefert mehr oder weniger Sinn: ein Protein, dem 1 Aminosäure fehlt und das, je nach der Bedeutung

dieser Aminosäure für die Tertiärstruktur, eine mehr oder weniger ge-

störte Enzymaktivität.

Durch energiereiche Strahlung mögliche Veränderungen der DNS:

1. Doppelstrangbruch

2. Zweistrangbruch

3. Basenveränderung

(=Punktmutation)


Allgemeine Fehlerquellen:

- Gelegentlich bei normaler Replikation

- Mutagene (Strahlung, Chemikalien)

Reparaturenzyme beseitigen Schäden:

- Bei der Replikation meist sofort

- Durch Mutagene in kurzer Zeit, sofern nur einer der beiden DNA-Stränge betroffen ist

Reparaturmechanismus:

Das beschädigte Strangstück wird durch ein Enzym herausgeschnitten und abgebaut. Das fehlende Stück wird

neu gebildet, wobei der Komplementäre unbeschädigte Strang als Martritze dient.

Anmerkung: Wenn beide Stränge der DNA geschädigt wurden bleibende Veränderung !!!

Mutationsmechanismen (nur zur Anschauung! / erklären können!)

1. Mutagen salpetrige Säure HNO2 bzw. chemische Veränderung einzelner Basen

HNO2 setzt aus der Aminogruppe der Basen (z.B. Cytosin) Stickstoff frei.

Beispiel: Aus Cytosin entsteht Uracil

Folgen einer solchen Basenveränderung

Mutierte Form !!!

Ohne Mutation keine Evolution !!!

- Veränderungen im Erbgut einer angepassten Art sind meist negativ

- Wenn sie in seltenen Falle positiv sind, bringen sie einen Selektions-

vorteil, die Veränderungen im Erbgut führen auf lange Sicht zur Ent-

stehung neuer Arten; z. B. fliegender Fisch, Schneearten

Cytosin Uracil

HNO2 hat letztlich den Austausch des Basenpaares

gegen das Basenpaar T=A bewirkt.

Es wurde ein REPLIKATIONSFEHLER ausgelöst.


2. Einbau von Basenanaloga

z.B. 5-Bromuracil (BU), eine dem Thymin analoge Base

Es kann nur während der DNS-Replikation anstelle von Thymin eingebaut werden und dann unter Umständen ei-

nen weiteren Basenaustausch bewirken.

Keine Folgen, wenn weiterhin Adenin als Paarungspartner verwendet wird:

Folgen, wenn Ketoform des BU in die Enolform übergeht! Diese paart mit Guanin !!!

Wurde einmal Guanin eingebaut, dann wird es stets Cytosin als Paarungspartner suchen und die Mutation ist fi-

xiert!

Aber:

EINE IN DIE DNS EINGEBAUTE BU-BASE WIRKT WIE EIN ZUFALLSGENERATOR, DER ÜBER GE-

NERATIONEN IMMER WIEDER BASENAUSTAUSCHE UND DAMIT GENMUTATIONEN BEWIRKT !!!

3. Rastermutationen: EINBAU oder VERLUST von NUCLEOTIDEN

Acridinmoleküle sind so groß wie Nucleotide. Sie können sich in die DNS einschieben und ebenso wieder ausge-

baut werden.

Möglichkeit 1: Acridineinschub in ruhende DNS,

d.h. Einbau vor der Replikation

Die Enolform kann wieder in die Ketoform übergehen, dann stellt sich in den nächsten Generation

wieder die ursprüngliche Basensequenz ein !


Einbau vor der

Replikation

X‘ = beliebiges zusätzliches Nucleotid

Ausbau vor nächster

Replikation

Ausgangsform Einbau !

Möglichkeit 2: Acridineinbau während der Replikation, d.h. anstelle eines Nucleotids

Einbau während der Replikation

Ausstoß vor der nächsten Replikation

Ausgangsform Verlust !!

DNS-Molekül mit zusätzlichem Basenpaar !!

Folgen bei Manifestation im fertigen Protein:

Rastermutation, Verschiebung des Leseras-

ters auf DNS & RNS

Aminosäuresequenz wird verändert !!

Raumstruktur (Tertiär- & Quartiär-

struktur) es Proteins verändert !!

DNS-Molekül, dem 1 Basenpaar fehlt !!

Folgen bei Manifestation im fertigen Protein:

Rastermutation, Verschiebung des Leserasters auf

DNS & RNS

Aminosäuresequenz wird verändert !!

Raumstruktur (Tertiär- & Quartiär-

struktur) es Proteins verändert !!


Wirkungsmechanismen von Mutagenen

Mutagene können auf vielerlei Art und Weise wirken. Dies hängt beispielsweise von der Struktur und der Reaktion

eines chemischen Mutagens mit den Basen der DNA ab. Einige Beispiele für die Wirkungsweise von Mutagenen sollen

hier dargestellt werden.

1. Chemische Änderung normaler Basen

z.B. durch salpetrige Säure HNO2: sie bewirkt den Umbau von Cytosin in Uracil:

während sich Cytosin mit Guanin paart, verbindet sich Uracil bei der Replikation mit Adenin. Nach zwei Replika-

tionen wurde wurde letztlich das Basenpaar C-G durch das Basenpaar T-A ausgetauscht.

[vgl. Daumer „Genetik“, Abb. 85.1]

2. Einbau von instabilen „Basenanaloga“ anstatt der natürlichen Basen

(Basenanaloga sind basenähnliche Stoffe, die wie normale Basen, z.B. bei der Replikation, in die DNA eingebaut

werden. Durch spontane Umlagerung können sie ihre Molekülstruktur und damit ihre Paarungseigenschaften än-

dern)

z.B. von 5-Bromuracil (BU): die Normalform ist Thymin analog, die Sonderform paart sich aber wie Cytosin mit

Guanin. Damit kommt es nach zwei Replikationen zum austausch A-T gegen G-C.

3. Veränderung der Nukleotidzahl durch zeitweiligen Einschub nukleotidähnlicher Moleküle

z.B. von Acridin (oder Teerstoffe des Zigarettenrauchs):

Es sind Moleküle mit Ringsystemen, die sich zwischen benachbarte Basenpaare der DNA schieben und eine Base

zuviel vortäuschen. Bei einer Replikation wird an diese vermeintliche Base eine beliebige andere angelagert. Je

nach dem Ort des zeitweiligen Einschubs bzw. Einbaus kommt es zum Einschub (Insertion) oder zum Verlust (De-

letion) von einem Nukleotid.

[vgl. Daumer „Genetik“, Abb. 86.1]

4. Vernetzung zweier benachbarter oder gegenüberliegender Basen der DNA

z.B. durch kurzwellige UV-Strahlung:

Am häufigsten ist die Vernetzung zweier benachbarter Thymin-Moleküle in demselben Einzelstrang, wodurch ihre

komplementäre Basenpaarung unmöglich gemacht wird. Als Folge wird die DNA nicht mehr richtig transkribiert

und repliziert.

Die hier beschriebenen Mutagene werden gewöhnlich in Laboratorien benutzt. Eine große Zahl anderer Chemikalien ist

auch Mutagen. Da wir ständig mit Stoffen in Berührung kommen, die potentielle Mutagene sein können, ist die Erfor-

schung mutagener Einflüsse und ihrer Wirkungen wichtig, um die nötigen Schutzmaßnahmen für Bevölkerung und

Umwelt treffen zu können. Dazu werden in zunehmendem Umfang Medikamente, Kosmetika, Nahrungsmittelzusätze,

Konservierungs- und Düngemittel, Insektizide, usw. durch geeignete Verfahren einem Mutagenitätstest unterzogen.

Regulation der Genaktivität

Wären alle Strukturgene (ca. 1 Million) einer Zelle gleichzeitig aktiv, so gäbe das ein fürchterliches Chaos in der Zelle.

Das ist nicht der Fall. Offenbar unterliegt die Genaktivität einer Kontrolle, die dazu führt, dass jeweils nur das produ-

ziert wird, was gerade nötig ist!

Regulation der Enzymaktivität

Das für die Regulation verantwortliche Enzym ist ein besonderes. Normale Enzyme haben 1 aktives Zentrum, also

einen Bindungsort für das Substrat.

Allosterisches Enzym ist ein regulierbares Enzym mit zwei verschiedenen, hochgradig spezifischen Bindungsorten


Zeichenerklärung:

= ungleichsinniger Zusammenhang (je weniger, desto mehr / je mehr, desto weniger)

= gleichsinniger Zusammenhang (je mehr, desto mehr / je weniger, desto weniger)

Bei hohem Vorkommen des Endprodukt D erfolgt durch das Andocken die allosterische Konformationsänderung und

blockiert die Andockung des Stoffes A und dessen Umsetzung.

Bei mangel am Endprodukt D erfolgt Abkopplung vom Enzym und die Umsetzung kann von statten gehen.

Nun gibt es auch Stoffe, welche die Aktivität eines Enzyms beeinflussen, man nennt sie Effektoren:

Hat der Effektor hemmende Wirkung, wirkt er als Inhabitor,

hat der Effektor fördernde Wirkung, wirkt er als Aktivator.

Allosterische Enzyme können also fördernde und hemmende Einflüsse empfangen und darauf reagieren:

Feinregulierung des Stoffwechsels

Rolle beim An- und Abschalten von Genen, d.h. Regulation bei der Proteinbiosynthese

+

durch das Endprodukt gehemmter Zustand

des Enzyms

Endprodukt Aktiver Zustand des Enzyms

Bindung für das

Endprodukt

= allosterisches Zentrum

Bindungsort für das

Ausgangssubstrat

= aktives Zentrum

(findet Umsetzung statt)

allosterische

Konformationsänderung

(= Raumstrukturänderung)

des Enzyms E1

Bindungsort blockiert

Ausgangssubstrat Ausgangssubstrat


Regulation der Genaktivität bei Bakterien

Jacob-Monod-Modell

1. Aufbauender Stoffwechsel

Abschalten er Enzymproduktion durch ein Endprodukt

Die Produktion der gesamten Enzymserie, die an einer Synthesekette beteiligt ist, wird abgestellt.

Begriffe:

Strukturgene S: Gene für die Synthesekette sind auf dem Chromosom unmittelbar benachbart.

Operator O: Ein Gen, das die Tätigkeit (Operation) einer nachfolgenden Gruppe von Strukturgenen kontrolliert,

nennt man Operator. (DNS-Abschnitt unmittelbar vor dem 1. Strukturgen der Synthesekette)

Die Steuereinheit Operatorgen + Gruppe der Strukturgene = Operon

Promoter P: Im vorderen Abschnitt des Operatorgens liegt der Startplatz für die Transkriptase

Abschalten des tätigen Operons:

Vermutung: das Endprodukt verändert irgendwie den Zustand des Operatorgens, so dass die Transkriptase die nachfol-

genden Gene nicht mehr ablesen kann. Hierzu ist ein Vermittler notwendig, das Regulatorgen.

Regulatorgen R:

Der Repressor ist aber zunächst inaktiv!!

Das Endprodukt kann aber als Effektor an den allosterischen Repressor binden

Konformation des Enzyms ändert sich

Repressor wird aktiv, d.h. er kann jetzt an das Operatorgen binden

- reguliert die Tätigkeit des Operons

- ist ein DNA-Abschnitt, der nicht in unmittelbarer Nähe des Operons liegt

- sein Genprodukt ist ein allosterisches Enzym!!! Es kann in einem bestimmten Konformationszustand an das Operatorgen bin-

den und die Transkription unterbinden (= Repressor)


Was geschieht, wenn nun die Endproduktkonzentration durch Verbrauch sinkt?

Repressor und Corepressor trennen sich, die Blockierung des Operons wird aufgehoben, Transkription kann er-

neut durchgeführt werden (bis eben wieder genug EP vorhanden ist…)

2. Abbauender Stoffwechsel

Anschalten der Enzymproduktion durch ein abzubauendes Substrat

Kommt E.coli z.B. plötzlich in Kontakt mit Lactose, so stellt es daraufhin die nötigen Enzyme für den Abbau des Subs-

trates Lactose her. Die Lactose löst also die Bildung der zu ihrem Abbau nötigen Enzyme selbst aus!

Auslösevorgang = Induktion der Enzymsynthese

Substrat, das die Induktion bewirkt = Induktor

Lactose – Operon: enthält 3 Strukturgene

Wenn keine Lactose im Medium: Operon liegt „ausgeknipst“ vor.

Lac-Repressor (Produkt des Regulatorgens) ist aktiv, er bindet an den Operator und blockiert so die Transkription. Da

der Repressor ein allosterisches Protein ist, hat er eine zweite Bindungsstelle für das Substrat Lactose.

Wenn Lactose in die Zelle gelangt: Operon wird „eingeschaltet“

Substrat bindet an Repressor, dieser ändert dadurch seine Konformation, löst sich vom Operator ab und ist inaktiv.

Folge: Transkriptese kann ablesen, Transkription, Translation, Enzyme zum Abbau der Induktion der Genaktivität.

Die Lactose verschwindet durch den Abbau, das Lac-Operon wird wieder geschlossen, da der Repressor nach Austritt

der lactose wieder den aktiven Konformationszustand annimmt und an den Operator bindet.

(alle Abbildungen von Seite 89 bis 91 skizzieren können !!!)

Documents

MOLEKULARE GRUNDLAGEN DER VERERBUNG Bio Teil III.pdf · Begrenzende Membran fehlt Vorhanden Genübertragung und Genaustausch (= Rekombination) bei Bakterien Bei höheren Lebewesen