Molekulargenetische und physiologische …...Frauke Julia Bink Osnabrück, Juli 2010 Diese Arbeit wurde teilfinanziert durch den Forschungsring Deutschen Weinbaus (FDW) Diese Arbeit

Molekulargenetische und physiologische

Untersuchungen an der Weinhefe

Kloeckera apiculata

(Hanseniaspora uvarum)

Dissertation

Zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor rerum naturalium

(Dr. rer. nat.)

vorgelegt von

Frauke Julia Bink

Osnabrück, Juli 2010

Diese Arbeit wurde teilfinanziert durch den

Forschungsring Deutschen Weinbaus (FDW)

Diese Arbeit widme ich, in Liebe

meinen Eltern

Frauke Bink,

Dr. med Helmut Bink

und

meinem Verlobten

Dr.-Ing. Thomas Rohdenburg

INHALT

III

Inhalt

Inhalt ......................................................................................................................................... III

1 Einleitung ............................................................................................................................ 1

1.1 Die Weinhefe Kloeckera apiculata ............................................................................... 1

1.2 Die Glykolyse ............................................................................................................... 4

1.2.1 Die Populationsdynamik im Most ......................................................................... 7

1.2.2 Die sensorischen Eigenschaften des Weines ......................................................... 8

1.3 Genomanalysen bei Hefen .......................................................................................... 10

1.4 Ziele der Arbeit ........................................................................................................... 14

2 Material und Methoden ..................................................................................................... 15

2.1 Materialien .................................................................................................................. 15

2.1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien ............................................................. 15

2.1.2 Enzyme ................................................................................................................ 15

2.1.3 Kits und Reagenzien ............................................................................................ 15

2.1.4 Antikörper und Fluoreszenzfarbstoffe ................................................................. 15

2.2 Stämme und Medien ................................................................................................... 16

2.2.1 Escherichia coli Stamm ....................................................................................... 16

2.2.2 Medien zur Anzucht der E. coli- Stämme ............................................................ 16

2.2.3 Verwendete Hefestämme ..................................................................................... 16

2.2.4 Medien zur Anzucht von Hefestämmen .............................................................. 17

2.2.5 Plasmide .............................................................................................................. 18

2.2.6 Oligonukleotide ................................................................................................... 19

2.3 Methoden .................................................................................................................... 21

2.3.1 Herstellung kompetenter E. coli- Zellen (Rubidium-Chlorid-Methode) .............. 21

2.3.2 Transformation von E. coli .................................................................................. 22

2.3.3 „Mini-Plasmid-Isolierung“ aus E. coli ................................................................. 22

2.3.4 Herstellung kompetenter Hefezellen („Freeze Methode“) ................................... 22

2.3.5 Transformation in Hefe ....................................................................................... 23

2.3.6 Elektroporation .................................................................................................... 23

2.3.7 Sphäroblasten Trafo ( nach (Beggs 1978)) .......................................................... 24

2.3.8 Lithium Acetat Transformation ........................................................................... 24

2.3.9 Plasmidisolierung aus Hefe ................................................................................. 25

2.3.10 Glycerin-Dauerkultur von Hefe ........................................................................... 25

2.3.11 Polymerasekettenreaktion (PCR) ......................................................................... 26

2.3.12 Restriktionsanalyse .............................................................................................. 27

2.3.13 Ligation ............................................................................................................... 27

2.3.14 Agarosegel-Elektrophorese ................................................................................. 27

INHALT

IV

2.3.15 Extraktion von DNA aus Agarosegelen ............................................................... 28

2.3.16 Reinigung von PCR-Fragmenten ......................................................................... 28

2.3.17 DNA-Sequenzierung ........................................................................................... 28

2.3.18 Ethylmethansulfonat (EMS) Behandlung ............................................................ 28

2.3.19 Messung von mitotischer Stabilität von Plasmiden ............................................. 28

2.3.20 Chromosomale DNA Isolierung aus K. apiculata ............................................... 29

2.3.21 Annotation des Kloeckera apiculata Genoms ..................................................... 29

2.3.22 BLAST („Basic Alignment Search Tool“) .......................................................... 30

2.3.23 Durchflusszytometrie [Fluorescence activated cell sorter (FACS)] ..................... 30

2.3.24 Blöckchen für die Pulsfeld Gelelektrophorese..................................................... 31

2.3.25 Pulsfeld-Gelelektrophorese ................................................................................. 32

2.3.26 Southern-Blot ...................................................................................................... 32

2.3.27 DIG DNA Markierung ........................................................................................ 33

2.3.28 Reinigung der DIG- Markierten Sonden.............................................................. 34

2.3.29 Hybridisierung ..................................................................................................... 34

2.3.30 Herstellung von Proteinextrakten nach der Roedel-Methode .............................. 35

2.3.31 Western-blot-Analyse zum spezifischen Nachweis von Proteinen ...................... 36

2.3.32 Grad Oechsle ....................................................................................................... 38

2.3.33 Phosphat-Puffer ................................................................................................... 38

2.3.34 Herstellung von Rohextrakten ............................................................................. 39

2.3.35 Proteinbestimmung .............................................................................................. 39

2.3.36 Aufnahme von Wachstumskurven ....................................................................... 39

2.3.37 Bestimmung der Enzymaktivitäten der Glykolyseenzyme .................................. 40

2.3.38 Fluoreszenzmikroskopie und Bildbearbeitung..................................................... 42

3 Ergebnisse ......................................................................................................................... 44

3.1 Morphologische Untersuchungen zur Weinhefe Kloeckera apiculata ........................ 44

3.1.1 Untersuchungen zum Wachstum von DSM2768 ................................................. 44

3.1.1 Untersuchung gärungsrelevanter Stresssituationen.............................................. 49

3.2 Genetische Charakterisierung, Genomsequenzierung und Annotation der

proteinkodierenden Gene des K. apiculata Stammes DSM2768 ........................................... 54

3.2.1 Untersuchungen des K. apiculata-Stamms DSM2768 mit Hilfe der Pulsfeld-Gelelektrophorese ............................................................................................................. 54

3.2.2 Southern Hybridisierung ..................................................................................... 55

3.2.3 Untersuchungen zum DNA-Gehalt des K. apiculata-Stammes DSM2768 .......... 57

3.2.4 Sequenzierung und Annotation des K. apiculata-Genoms .................................. 60

3.3 Molekulargenetische Untersuchungen zur Weinhefe Kloeckera apiculata ................ 62

3.2.5 Ansätze zur Herstellung von K. apiculata/E.coli "Shuttle-Vektoren" ................. 64

3.2.6 Transformation von K. apiculata ......................................................................... 70

INHALT

V

3.2.7 Versuche zur gezielten homologen Rekombination im K. apiculata -Genom ..... 71

3.3 Untersuchungen zu ausgewählten Enzymen des Kohlenhydratstoffwechsels in der Weinhefe Kloeckera apiculata .............................................................................................. 75

3.3.1 Spezifische Enzymaktivität ................................................................................. 75

3.3.2 Western Blot Analyse der KaPfk in S. cerevisiae ................................................ 77

3.3.3 Aldehyd-Dehydrogenase Untersuchungen .......................................................... 79

4 Diskussion ......................................................................................................................... 80

4.1 Morphologische Untersuchungen zur Weinhefe K. apiculata .................................... 80

4.1.1 Eigenschaften von K. apiculata Stamm DSM2768 beim Wachstum................... 80

4.1.2 K. apiculata unter Einfluss von gärungsrelevanten Stresssituationen.................. 82

4.2 Molekulargenetische Untersuchungen zur Weinhefe K. apiculata ............................. 84

4.2.1 Einsatz von Resistenzmarkern in der Hefe K. apiculata ...................................... 84

4.2.2 Versuche zur Isolierung von ura3-Mutanten ....................................................... 85

4.2.3 Untersuchung zur Ploidität von K. apiculata ....................................................... 86

4.2.4 Centromerische und ARS Elemente aus K. apiculata ......................................... 86

4.2.5 Transformation von K. apiculata ......................................................................... 88

4.3 Physiologische Untersuchungen zur Weinhefe K. apiculata ...................................... 89

4.3.1 Untersuchungen zur Glykolyse in K. apiculata ................................................... 89

4.3.2 Untersuchungen zur Aldehyd-Dehydrogenase .................................................... 91

4.4 Genetische Charakterisierung der Weinhefe K. apiculata .......................................... 92

4.4.1 Untersuchungen zur Zahl der Chromosomen ...................................................... 92

4.4.2 Weitere Eigenschaften des K. apiculata-Genoms ................................................ 93

4.4.3 Vergleich des K. apiculata Genoms mit anderen Hefegenomen ......................... 94

5 Zusammenfassung ............................................................................................................. 96

6 Ausblick ............................................................................................................................ 98

7 Literaturverzeichnis:.......................................................................................................... 99

8 Anhang ............................................................................................................................ 109

8.1 Abkürzungsverzeichnis............................................................................................. 109

8.2 Daten zur Sequenzierung und Annotation von K. apiculata ..................................... 111

8.3 Tabellen Vergleich S. cerevisiae, K. apiculata, K. lactis und A. gossypii ................. 112

8.4 Lebenslauf ................................................................................................................ 121

8.5 Tagungs- und Buchbeiträge ...................................................................................... 122

8.6 Anlage ...................................................................................................................... 123

9 Danksagung ..................................................................................................................... 124

EINLEITUNG

SEITE 1

1 Einleitung

Hefen werden schon seit Jahrtausenden zur Herstellung von alkoholischen Getränken, wie Bier

und Wein, aber auch für die Herstellung von Brot eingesetzt. Allerdings zeigten erst die

Arbeiten von Louis Pasteur (1822- 1895), dass die zugrundeliegenden Gärprozesse durch die

anwesenden Hefen vollzogen werden. In heutiger Zeit werden Hefen vielfältiger verwendet.

Neben dem traditionellen Einsatz zur Herstellung von Alkohol und Backwaren werden sie nicht

nur zur Produktion verschiedener Therapeutika (z.B. Insulin und Interferon) eingesetzt, sondern

haben sich in der Grundlagenforschung zu einem der wichtigsten eukaryontischen

Modellorganismen entwickelt. Die Weinindustrie stellt heute einen wichtigen Wirtschaftsfaktor

dar, wobei die Weinqualität wesentlich durch die natürliche Hefeflora auf der Weintraube

bestimmt wird. Diese natürlich auf der Oberfläche von Früchten lebenden Hefearten gelangen

in den Most und sind entscheidend an der Produktion von Aromastoffen und Sekundär-

metaboliten beteiligt, die die sensorischen Eigenschaften des Endproduktes prägen.

1.1 Die Weinhefe Kloeckera apiculata

Das natürliche Habitat der Weinhefe Kloeckera apiculata sind Früchte. Erstmals erwähnt

wurde diese sogenannte „Apiculatus- Hefe“ in Arbeiten aus den 1950er Jahren (Shehata 1960,

van Uden 1953). Sie bildet ovale, zitronenförmige Zellen, die sich durch bipolares Sprossen

vermehren. Die sexuelle Form dieser Hefe, die auf Malzagar zwei Ascosporen ausbilden soll,

wird als Hanseniaspora uvarum bezeichnet. Obwohl H. uvarum damit die wissenschaftlich

korrekte Bezeichnung ist, werden beide Namen noch als Synonym verwendet (Barnett 2000),

und K. apiculata ist bei den Winzern eher gebräuchlich.

Taxonomisch wird Kloeckera apiculata der Familie der Saccharomycodaceae untergeordnet,

während Saccharomyces cerevisiae der Familie der Saccharomycetaceae zugeordnet wird.

Erstere Familie bildet bipolare Knospen aus, während letztere Familie durch mehrseitige

Knospenausbildung während des vegetativen Wachstums charakterisiert ist. Beide Hefearten

gehören zur Ordnung Saccharomycetales und der Klasse Hemiascomyceteales an. Die

Hemiascomyceten bilden eine von drei Untergruppen des Stammes der Ascomyceten und

werden als die „wahren“ Hefen bezeichnet, die einen hauptsächlich unizellulären Lebenszyklus

aufweisen. Einige der Hefen weisen einen dimorphen Lebenszyklus auf und vermehren sich

sowohl vegetativ, als auch sexuell. Die Wahl des einen oder anderen Lebenszyklus wird

entscheidend durch äußere Einflüsse bestimmt. Während der sexuellen Fortpflanzung bilden

alle Mitglieder dieses Stammes als Produkt der Meiose Asci aus, in denen die haploiden Sporen

EINLEITUNG

SEITE 2

zunächst eingeschlossen bleiben. Allgemein sind Hefen eine Gruppe von Pilzen deren

Klassifizierung nach verschiedenen Kriterien vorgenommen wird. So wurden die Hefen bisher

nach ihrer mikroskopischen Erscheinung, ihrer sexuellen Vermehrung, ihren physiologischen

Merkmalen und ihren biochemischen Merkmalen eingeteilt und benannt. Moderne Methoden

der Klassifizierung legen Sequenzunterschiede in der genomische DNA (bestimmte Regionen

wie die „internal transcribed spacers“(ITS) der ribosomale DNA (rDNA), oder auch teilweise

oder vollständig sequenzierte Genome) zugrunde (Abbildung 1).

Abbildung 1: Phylogenetische Einteilung der Hefen nach Kurtzman 2003. Hervorgehoben: Kloeckera

apiculata bzw. Hanseniaspora uvarum. Basierend auf Untersuchungen eines komprimierten Datensatzes aus

Sequenzen der 18S, 5,8S/ 26S rDNA und ihren transkribierten Zwischenbereichen (ITS), den Gensequenzen

für den Translationsfaktor EF-1α, der kleinen Untereinheit der mitochondrialen rDNA und einer

Komponente der Atmungskette, COXII.

Nicht alle mit den klassischen Systemen beschriebenen Hefen sind bisher mit den moderneren

Methoden nach ihrer evolutionären Verwandtschaft zugeordnet. So wurden Studien gemacht, in

EINLEITUNG

SEITE 3

denen das Gen für die mitochondriale Cytochrom-C-Oxidase-II (COX2) genutzt wurde um

verschiedene Kluyveromyces Spezies zu klassifizieren (Belloch et al. 2000). Für die

Klassifizierung verschiedener Candida Spezies wurden auch die Sequenzunterschiede im

Aktin-Gen verwendet (Daniel et al. 2001). In weiteren Klassifizierungsstudien konnten die

Gensequenzen für den Elongationsfaktor 1-α und die RNA Polymerase II entschlüsselt werden

um Hefen zu klassifizieren, die dem „Saccharomyces-Komplex“ angehören (Kurtzman &

Robnett 2003). Solche molekularen Methoden konnten bisher jedoch nur zur Klassifizierung

von Spezies innerhalb einer Gruppe eingesetzt werden, da sie aufwendig und kostenintensiv

sind. Viele der damit durchgeführten gruppenübergreifenden Klassifizierungen der Hefen legen

daher die rDNA-Sequenz zugrunde. Die Unterschiede zwischen der rDNA der ersten und

zweiten Domäne der großen Untereinheit (26S) sind zum einen so gering, dass ein gleiches

Primerpaar für ihre Amplifikation aus allen Hefearten verwendet werden kann, und zum

anderen so unterschiedlich, dass sie eine evolutionäre Zuordnung der Arten erlauben (Fell et al.

2000, Kurtzman 1998, Peterson & P. 1990). Bei dieser Methode wird ein ca. 600 Nukleotide

langes PCR-Produkt gebildet. Bei einem Unterschied von bis zu drei Nukleotiden in der

amplifizierten Sequenz kann von einer engen Verwandtschaft der Organsimen zueinander und

somit von der Zugehörigkeit zu einer Spezies gesprochen werden, Unterschiede von mehr als

sechs Nukleotiden lassen dagegen auf unterschiedliche Hefearten schließen (Kurtzman & Fell

1998).

Einige der Ascomyceten sind genetisch mittlerweile sehr gut charakterisiert und gelten als

Modellorganismen für die Grundlagenforschung. Ihre Genome sind vollständig sequenziert.

Hier kann eine Klassifizierung anhand von Vergleichen zur Syntenie, also der gleichen

Anordnung ganzer Gengruppen vorgenommen werden. Im Gegensatz dazu war die Genetik der

Weinhefe Kloeckera apiculata zu Beginn dieser Arbeit kaum untersucht. Allerdings lag bereits

die mitochondriale Genomsequenz vor. Im Gegensatz zu den meisten Organismen, erscheint

das mitochondriale Genom von K. apiculata linear und extrem kompakt. In einem Bereich von

11.094 bp sind dabei alle essentiellen, mitochondrialen Gene kodiert (Pramateftaki et al. 2006).

Kloeckera apiculata hat damit das bisher kleinste beschriebene mitochondriale Genom von

Hefen.

Aufgrund ihrer praktischen Bedeutung in der Weingärung ist die Physiologie der Weinhefe

Kloeckera apiculata dagegen sehr viel besser untersucht als ihr Genom. Da die traditionelle

Herstellung von Wein über Jahrtausende durch eine sogenannte „wilde“ Weingärung erfolgte,

mussten die natürlich auf Trauben vorkommenden Hefen für die Umwandlung von Zucker in

Ethanol verantwortlich sein. Erst in den letzten Jahrzehnten wurden zunehmend Starterkulturen

EINLEITUNG

SEITE 4

der Hefe Saccharomyces cerevisiae zugesetzt, um den Gärverlauf zu kontrollieren. Die „wilde“

Weinhefe Kloeckera apiculata, lässt sich dagegen schon auf intakten Trauben nachweisen, wo

sie mit 51-89% an der Gesamtpopulation der Hefearten vorherrscht (Gafner 2007). Durch ihre

anfängliche Präsenz auf den Trauben, und damit auch im Most, ist anzunehmen, dass sie

entscheidend zur Bildung von Weininhaltsstoffen beiträgt. Sie stellt damit einen für die

Weinindustrie sehr wichtigen Organismus dar, der den Gärungsverlauf entscheidend mit

beeinflusst.

1.2 Die Glykolyse

Die im Most enthaltenen Hefen setzen während der Weingärung den enthaltenen Zucker

(Glucose und Fructose zu etwa gleichen Teilen mit einer Gesamtkonzentration von rund 20%)

in Ethanol und Kohlendioxid um (Rodicio & Heinisch 2009). Dies geschieht über den zentralen

Stoffwechselweg, der Glykolyse (Abbildung 2). Dabei wird der Zucker zunächst über mehrere

Reaktionsschritte in Pyruvat und danach durch die Pyruvatdecarboxylase und

Alkoholdehydrogenase zum Ethanol umgewandelt. Über die Verstoffwechselung des Zuckers

zu Pyruvat bildet die Hefezelle Energie in Form von ATP und Reduktionsäquivalente in Form

von NAD+. Der Glykolysefluss wird durch die Kapazität der Glucosetransporter begrenzt, die

die Aufnahme von Zuckern in die Zelle gewährleisten (Bailey 1984, Lagunas 1993). Die

intrazelluläre Konzentration der Glykolyseenzyme, die zur Produktion von Ethanol führen,

begrenzen dagegen die Ethanol-Bildungsrate nicht. So führt eine Überproduktion der

Schlüsselenzyme (Phosphofructokinase und Pyruvatkinase) der Glykolyse nicht zu einer

gesteigerten Bildung von Ethanol (Schaaff et al. 1989).

EINLEITUNG

SEITE 5

Abbildung 2: Reaktionen der Glykolyse. Darstellung der Produkte und der beteiligten Enzyme. Verändert

nach (Dequin 2001, Rodicio & Heinisch 2009)

Nach der Zuckeraufnahme in die Zelle stellt der durch die Phosphofructokinase (Pfk)

katalysierte Umsatz von Fructose-6-phosphat zu Fructose-1,6-bisphosphat (unter ATP-

Verbrauch) den wichtigsten Kontrollpunkt der Glykolyse dar. Diese Reaktion ist der erste

irreversible Schritt, der spezifisch für die Glykolyse ist (Kopperschläger 1997). Das aktive

Enzym der Hefe S. cerevisiae ist ein Heterooktamer, das aus 4α- und 4β- Untereinheiten

zusammengesetzt ist. Die Untereinheiten werden in S. cerevisiae durch die Gene PFK1 und

PFK2 kodiert (Heinisch 1986). In zellfreien Extrakten kann nur eine Aktivität der

Phosphofructokinase gemessen werden, wenn beide Untereinheiten vorhanden sind, während in

vivo vermutlich auch Homooligomere einzelner Untereinheiten zur Katalyse befähigt sind

(Arvanitidis & Heinisch 1994). Die Phosphofructokinase steuert den Fluss der Glykolyse

(Heinisch 1993a), da ihre Aktivität von zahlreichen kleineren Molekülen stark reguliert wird.

So wurden in verschiedenen Organismen bisher 24 kleine Effektoren der Pfk- Aktivität

beschrieben (Kopperschläger 1997). Das Enzym ist damit ein Paradigma für allosterische

Regulation. So wird die Phosphofructokinase stark von ATP gehemmt, jedoch von AMP und

EINLEITUNG

SEITE 6

Fructose-2,6-bisphosphat aktiviert (Heinisch 1993b). Durch die stimulierende Wirkung von

Ammonium auf die Phosphofructokinase, wird möglicherweise die Verfügbarkeit von

Stickstoff mit dem Kohlenstoffmetabolismus in der Weinfermentation verknüpft. Genetische

Untersuchungen zur Phosphofructokinase der Milchhefe Kluyveromyces lactis, die

phylogenetisch nah verwandt ist mit der Weinhefe Kluyveromyces marxianus, ergaben

interessante Aspekte. So ist die Phosphofructokinase ebenfalls ein Heterooktamer, wie in

S. cerevisiae. Im Gegensatz zu letzterer kann eine pfk1pfk2 Doppelmutante von K. lactis

allerdings auf Medium mit Glucose als einzige Kohlenstoffquelle wachsen. Dies wird in

K. lactis durch eine Umgehungsreaktion („bypass“) ermöglicht, die den Pentose-Phosphat-Weg

nutzt, um die Glykolyse zu umgehen (Jacoby et al. 1993). Es ist deshalb anzunehmen, dass ein

Teil des angebotenen Zuckers von Weinhefen auch über den Pentose-Phosphat-Weg

verstoffwechselt wird, was die Bildung weiterer, sensorisch relevanter Metabolite zur Folge

hat.

Im weiteren Verlauf der Glykolyse, wird die erste Reaktion, die Energie in Form von ATP für

die Zelle bereitstellt, durch die Phosphoglyceratkinase katalysiert. Von dieser wird die

Phosphatgruppe des 1,3-Bisphophoglycerates auf ADP übertragen. In S. cerevisiae wird die

Phosphoglyceratkinase durch das Gen PGK1 kodiert und bildet ein Homodimer. PGK1 ist

eines der am stärksten exprimierten Hefegene, weshalb sein Promoter auch häufig für die

Expression heterologer Gene (z.B. zur Bildung von Interferon) verwendet wird. Die

Phosphogyceratkinase macht bis zu 5% des löslichen Zellproteins aus (Chambers et al. 1989).

Der zweite ATP-bildende Schritt in der Glykolyse wird durch die Pyruvatkinase (kodiert durch

PYK1) katalysiert, die den letzten Schritt der Glykolyse einleitet. Die Pyruvatkinase katalysiert

die irreversible Reaktion von Phosphoenolpyruvat zu Pyruvat, und wirkt dabei als

homotetrameres Enzym. Sie stellt einen weiteren wichtigen Kontrollpunkt der Glykolyse dar

und unterliegt ebenfalls einer allosterischen Regulation (Boles 1997). So ist das Endprodukt der

Phosphofructokinase-Reaktion, Fructose-1,6-bisphosphat, einer der Aktivatoren der

Pyruvatkinase (Morris et al. 1984). Dieser Metabolit kann von allen Zwischenprodukten der

Glykolyse in auf Glucose wachsenden Hefezellen in den höchsten Konzentrationen

nachgewiesen werden (Heinisch 1997). Auch ADP, PEP und Ammonium-Ionen aktivieren die

Pyruvatkinase, während Citrat und ATP die Aktivität des Enzyms hemmen (Haeckel et al.

1968). Das Pyruvat wird bei hohen extrazellulären Zuckerkonzentrationen hauptsächlich in die

alkoholische Gärung eingeschleust, kann aber auch durch die Pyruvatdehydrogenase zu Acetyl-

CoA decarboxyliert und in den Tricarbonsäurezyklus eingeschleust werden.

EINLEITUNG

SEITE 7

1.2.1 DIE POPULATIONSDYNAMIK IM MOST

Die Weinproduktion ist ein komplexes Zusammenspiel von ökologischen und biochemischen

Prozessen, die durch den ständigen Wechsel von Mikroorganismen beeinflusst wird (Pretorius

2000). Die sensorische Qualität eines Weines beruht im Wesentlichen auf der Qualität des

eingesetzten Mostes und der Zusammensetzung der Hefepopulationen, die während der Gärung

auftreten. Ein Großteil der beteiligten Hefen gelangt dabei durch die Trauben in den Most. In

diesem Zusammenhang wurden etwa 15 Hefearten beschrieben, die häufig in der

Weinproduktion auftreten, wie Brettanomyces (sexuelle Form Dekkera), Candida,

Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora (asexuelle Form: Kloeckera), Kluyveromyces,

Metschnikowia, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycodes, Schizosaccharomyces

und Zygosaccharomyces (Pretorius et al. 1999). Mit einem Gesamtanteil von 51-89% macht die

Hefe Kloeckera apiculata oder Hanseniaspora uvarum den größten Teil der Hefepopulation

auf Trauben aus (Fleet 1998, Fleet 1993a, Gafner 2007). Dagegen findet man S. cerevisiae nur

mit einem Anteil von 0,3-3% auf gesunden und intakten Trauben (Martini 1993). Neben der, in

den ersten Tagen der Weingärung dominierenden Hefe Kloeckera apiculata, beeinflussen auch

andere Nicht-Saccharomyceten, die Qualität des Endproduktes. Dies kann zum einen direkt

durch die eventuelle Produktion von Aromata (und damit auch Aromafehlern) und zum anderen

indirekt durch ihren Einfluss auf das Wachstum und den Metabolismus der eigentlichen

Gärhefe Saccharomyces cerevisiae geschehen (Mills et al. 2002). Während der Weingärungen

ist die Mikroorganismen-Population einer Reihe von Stressfaktoren ausgesetzt. So wirken

Veränderungen in der Temperatur, dem pH-Wert, der Nährstoffe im Most und die

Fermentationstechniken (S02 Einfluss, Zugabe von Reinzuchthefen, Kaltmazeration, etc.) auf

Wachstum und Metabolismus der beteiligten Hefen ein (Pretorius 2000, Rodicio & Heinisch

2009). Die Zusammensetzung der Nährstoffe in einem Most begünstigt Hefen, bei denen der

Gärungsstoffwechsel dominiert, wie S. cerevisiae (Martini 1993). Bei einer Spontangärung,

d.h. ohne Zusatz von Starterkulturen, wird der Most in den ersten Tagen durch die Hefen

Kloeckera apiculata (Hanseniaspora uvarum) und durch Candida-Arten dominiert, die nur

wenig Ethanol bilden (Fleet 1993b). Im Laufe der Gärung, wenn der Alkoholgehalt auf Werte

um 3-4% steigt, dominieren dann zunächst Hefen, der Gattungen Metschnikowia und Pichia

(Fleet 2003, Povhe Jemec et al. 2001). Während sich dann später die alkoholtoleranteren

S. cerevisiae Stämme durchsetzen (Beltran et al. 2006, Fleet 1998). Es wird vermutet, dass der

ansteigende Alkoholgehalt im Most entscheidend das Absterben von K. apiculata mitbestimmt,

wobei in jüngerer Zeit auch andere sekundären Metabolite mit toxischen Eigenschaften als

Ursache genannt werden (Fleet 2003, Pérez-Nevado et al. 2006, Schütz & Gafner 1993).

EINLEITUNG

SEITE 8

Tatsächlich konnte die anfänglich postulierte Sensitivität von Kloeckera apiculata gegenüber

hohen Alkoholgehalten im Most experimentell nicht bestätigt werden (Fleet 1993a). Auch das

Wachstum der Nicht-Saccharomyces Hefe wird durch die Anwesenheit von S. cerevisiae

offenbar nicht gehemmt (Egli et al. 1998, Romano et al. 1997, Schütz & Gafner 1993). So

konnte bei anfänglichen Zelldichten zwischen 104-10

6 cfu/ml eine Vermehrung auf zu 10

8-10

9

cfu/ml am Ende der Mostgärung beobachtet werden (Fleet 1993b). Bei der Vergärung von

Weißweinen konnte die Weinhefe Kloeckera apiculata sogar bis zum neunten Tag der

Fermentation in ähnlich hohen Zellzahlen nachgewiesen werden, wie S. cerevisiae (Heard &

Fleet 1985).

1.2.2 DIE SENSORISCHEN EIGENSCHAFTEN DES WEINES

Das endgültige Weinaroma ergibt sich aus einer komplexen Kombination von verschiedenen,

für den Wein typischen, Komponenten (Saerens et al. 2008). Diese werden zum Teil durch

sekundäre Metabolite von Hefen eingebracht, die in fünf Gruppen unterteilt werden können:

schwefelhaltige Moleküle, organische Säuren, höhere Alkohole, Carbonyl-Komponenten und

flüchtige Ester (Abbildung 3) (Verstrepen et al. 2003). Verschiedene gärungsaktive Hefearten

und darunter auch verschiedene Stämme, tragen in unterschiedlichem Maße zur Bildung von

Stoffen wie biogenen Aminen, Estern und höheren Alkoholen bei, die entscheidend für die

Sensorik des Weines sind (Caruso et al. 2002, Charoenchai et al. 1997, Romano et al. 2003,

Soden et al. 2000).

Einige Stämme der Weinhefe K. apiculata bilden vermehrt Ester und bilden damit einen sehr

fruchtigen und aromatischen Wein (Moreira et al. 2008). Besonders flüchtige Ester, die

wesentlich zum fruchtigen Aroma beitragen, sind hierbei von großem industriellem Interesse

(Saerens et al. 2008). Die Art der gebildeten Aromata hängt wesentlich von der

Gärungstemperatur ab. So werden bei niedrigeren Temperaturen mehr fruchtige Aromen

produziert (Beltran et al. 2006), die auf eine gesteigerte Synthese, sowie eine reduzierte

Hydrolyse der gebildeten Ester zurückzuführen ist (Mallouchos et al. 2003). Daher wird bei

einigen Rotweinen die Methode der Kaltmazeration des Mostes verwendet, die der eigentlichen

Weingärung vorausgeht und sich besonders positiv auf das Weinaroma und die Weinfarbe

auswirkt (Gómez-Mígueza et al. 2007). Dabei werden die Moste für einige Tage (sehr variabel)

bei niedrigen Temperaturen inkubiert, bevor die Gärung gestartet wird. In dieser Phase

dominieren besonders Nicht-Saccharomyces-Hefen, wie K. apiculata (Hierro et al. 2007, Zott

et al. 2008). Der Anteil von S. cerevisiae erhöht sich in dieser Zeit nicht (Hierro et al. 2006).

EINLEITUNG

SEITE 9

Abbildung 3: Produktion der Aromakomponenten in Hefen. Verändert nach: (Dequin 2001, Henschke

1993, Rodicio & Heinisch 2009)

Tatsächlich wird die Mehrheit der Aromakomponenten aber erst während der Fermentation

gebildet wobei von K. apiculata und anderen Nicht-Saccharomyces-Hefen auch noch Enzyme,

wie z.B. β-Glucosidasen und Proteasen, freigesetzt werden. Deren Sekretion in das Medium

beeinflusst das Weinaroma zusätzlich, da die Enzyme andere Weininhaltsstoffe umsetzen (Zott

et al. 2008), wobei schon kleinere Veränderungen in deren Konzentrationen die Qualität des

Weines entscheidend verändern. Spontan vergorene Weine, also solche, denen keine

Reinzuchthefen zugesetzt wurden, können qualitativ besser sein, als Weine, deren Gärverlauf

durch die Zugabe von S. cerevisiae- Starterkulturen kontrolliert wurden (Henick-Kling et al.

1998, Jakob 1997). Teilweise kann die bessere Weinqualität sicherlich auch auf die von

K. apiculata, im Vergleich zu S. cerevisiae gebildeten höheren Gehalte an Glycerin im Wein

zurückgeführt werden (zwischen 1,2-3 g/l) (Romano et al. 1997, Romano et al. 1993). Die

Sensorik des Weines wird durch die vom Glycerin eingebrachte Süße weiter positiv beeinflusst

(Dequin 2001). Auch von S. cerevisiae können im Verlauf der Weingärung größere Mengen an

Glycerin gebildet werden, wenn der Most einen hohen Zuckergehalt (>20%) aufweist, da

Glycerin unter solchen Bedingungen als Antwort auf den osmotischen Stress produziert wird

(Tamás et al. 2003). Ein weiterer positiver Aspekt ist die geringere Konzentration an Ethanol in

EINLEITUNG

SEITE 10

Weinen, in denen mehr Glycerin produziert wurde (Remize et al. 1999). Allerdings konnte bei

verschiedenen Hefestämmen eine Korrelation zwischen der erhöhten Bildung von Glycerin

während der Gärung und einer erhöhten Acetatbildung zu einem späteren Zeitpunkt beobachtet

werden (Remize et al. 1999). Die Konzentration an Acetat beträgt in normalen Weinen

ungefähr 0,5g/l, wobei der für die Weinqualität abträgliche Schwellenwert bei etwa 0,8 g/l liegt

(Dequin 2001). Eine erhöhte Acetatbildung konnte auch bei einigen K. apiculata-Stämmen

beobachtet werden, was gelegentlich auch Gärstockungen verursachen könnte (Romano et al.

1997, Romano et al. 1993). So produzieren manche Stämme im Laufe der Fermentation bis zu

2,0 g/l Acetat, das eine sogenannte Fehlgärung bedingt und den Wein ungenießbar macht

(Gafner 2007, Romano et al. 2003). Welche Stoffwechselwege und welche Umwelt-

bedingungen dazu führen dass Hefen Acetat bilden, ist noch nicht vollständig geklärt (Dequin

2001). In S. cerevisiae kodieren die Gene ALD2, ALD3 und ALD6 für die cytosolische

Acetaldehyd-Dehydrogenasen, die Acetaldehyd zu Acetat umwandeln. Die Gene ALD4 und

ALD5 kodieren für mitochondriale Isoformen, die bei Wachstum auf Ethanol als einziger

Kohlenstoffquelle, aktiv sind. Die Expression der cytosolischen Isoformen ALD2 und ALD3

unterliegen der Glucose-Repression, d.h. sie werden nur auf alternativen Kohlenstoffquellen

gebildet. Für die Acetat-Produktion während der Weingärung wird hauptsächlich Ald6

verantwortlich gemacht (Saint-Prix et al. 2004). Eine Deletion der Gene ALD4 und ALD6 aus

S. cerevisiae führte zu einer Halbierung der gebildeten Acetate Mengen (Remize et al. 2000).

In einer Mischkultur aus K. apiculata und S. cerevisiae überleben die Apiculatus-Hefen länger

und bilden weniger Acetat und Ethylacetat als wenn sie in Reinkultur dem Most zugesetzt

werden (Mendoza et al. 2007).

1.3 Genomanalysen bei Hefen

S. cerevisiae stellt den führenden Organismus in der Weinindustrie dar und dient darüber

hinaus als Produktionsorganismus in der Biotechnologie und als der am besten untersuchteste

eukaryontische Modellorganismus in der Grundlagenforschung. Dies ist nicht zuletzt darauf

zurückzuführen, dass die Genome der Hemiascomyceten mit einer Größe von 12-20 Mb, im

Vergleich zu Genomen höheren Eukaryonten, relativ klein und leicht zu entschlüsseln sind.

Dies erlaubt Rückschlüsse auf das Vorhandensein von Stoffwechselwegen, deren genetische

Analyse sowie die Untersuchung regulatorischer Netzwerke. Wie bei anderen Organismen mit

kleinen Genomen ist der Anteil an Protein kodierenden Sequenzen bei Hefen relativ hoch. So

findet man in verschiedenen Hefen zwischen 5000 und 7000 Protein-kodierende Gene, die

ungefähr 70% des Hefegenoms ausmachen. Des Weiteren sind nur zwei Typen von

EINLEITUNG

SEITE 11

Transposons in Hefe beschrieben. Die zur Klasse I gehörenden Retrotransposons und die zur

Klasse II gehörenden DNA-Transposons. Jedoch konnten die Klasse II-Transposons nur in

Hefen gefunden werden, die sich nach der frühen evolutiven Abtrennung von der Hefe

Y. lipolytica entwickelt haben. Darüber hinaus sind in Protein-kodierenden Genen bei

Hemiascomyceten nur zwischen 1%-13% Intronsequenzen zu finden (Bon et al. 2003), die im

Vergleich zu höheren Eukaryonten auch meist sehr kurz sind. So variiert die Intronlänge nur

zwischen 100-300 Nukleotiden. Bemerkenswerterweise sind die Introns in Hefen häufig am

5Ènde der entsprechenden Gene lokalisiert und in orthologen Genen verwandter Spezies,

sowohl bezüglich ihrer Position als auch ihrer Existenz stark konserviert. Orthologe Gene

werden auf einen gemeinsamen Vorfahren zurückgeführt und können so Aufschluss über die

Verwandtschaftsverhältnisse zwischen einzelnen Hefen geben. Im Gegensatz dazu sind

paraloge Gene aus einer Genduplikation innerhalb einer Art entstanden. Diese als homologe

Sequenzen innerhalb eines Genoms identifizierten Gene sind oft ebenfalls in Gengruppen mit

hoher Sequenzübereinstimmung angeordnet. Durch die zu Grunde liegende Genduplikationen

können die Produkte paraloger Gene neue Funktionen entwickeln, da die ursprüngliche

Funktion durch eines der Allele weiter erhalten bleibt, während sich das andere durch Mutation

verändern kann. Ein Vergleich der Anordnung paraloger Gene, liefert einen Hinweis auf die

evolutionäre Distanz zwischen verschiedenen Hefearten. In den meisten Hefen ist die

Verteilung der paralogen Gene sehr verschieden. Vergleicht man die von paralogen Genen

abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Hefen S. cerevisiae, C. glabrata, K. lactis, D. hansenii

und Y. lipolytica so findet man eine Gaußsche Verteilung ihrer relativen Ähnlichkeiten (Dujon

et al. 2004). Da die meisten hier untersuchten paralogen Genpaare eine Identität von 35%

aufweisen ist zu vermuten, dass alle Duplikationen in diesen Organismen in einem sehr

begrenzten Zeitraum aufgetreten sein müssen.

Neue Gene können darüber hinaus auch durch die Bildung von so genannten Mosaikgenen

entstehen. Diese setzen sich aus der Kombination einzelner Bereiche bestehender Gene neu

zusammen. Weitere theoretische Möglichkeiten ein neues Gen zu bilden, sind die de novo

Entstehung eines Gens aus zuvor nicht-kodierenden Bereichen oder die Aufnahme eines neuen

Gens durch horizontalen Gentransfer aus anderen Organismen (Wolfe & Li 2003). Tatsächlich

ist aber die Genduplikation aus bestehenden Sequenzen das bisher am häufigsten

dokumentierte Phänomen. Solche Ereignisse, Mutationen und Rekombinationen sorgen für die

ständige Modifikation bestehender Genome, die zur Entwicklung und Anpassung der

Organismen führen. Die Genome der an der Weingärung beteiligten Hefearten, weisen eine

entsprechend große genetische Diversität auf (Lopandic et al. 2007). Molekulare

EINLEITUNG

SEITE 12

Genomanalysen haben ergeben, dass die genomische Instabilität auf verschiedene Faktoren

zurückgeführt werden kann, wie z.B. spontane Mutationen, Ty-vermittelte chromosomale

Translokationen (Rachidi et al. 1999), mitotisches Crossing-over (Aguilera et al. 2000) oder

Genkonversionen (Puig et al. 2000). Die genetischen Veränderungen und das

Transkriptionsprofil sind dabei spezifisch für verschiedene Weinhefestämme (Dunn et al. 2005,

Hauser et al. 2001, Rossignol et al. 2003). Sie können von den Mediums- und

Wachstumsbedingungen beeinflusst werden, die sich jeweils auf die stammspezifische

Genomflexibilität auswirken. Weiterhin äußert sich die vorkommende Instabilität der

Hefegenome dadurch, dass es zu häufigen chromosomalen Umwandlungen mit entsprechenden

Längenpolymorphismen kommen kann (Dunham et al. 2002, Miklos et al. 1997, Rachidi et al.

1999). Darüber hinaus wurden bei vielen der im Wein enthaltenen S. cerevisiae-Stämme für

Chromosomen Trisomien oder Tetraasomien beobachtet (Bakalinsky & Snow 1990, Guijo et

al. 1997). Sie sind entsprechend häufig aneuploid oder polyploid oder bilden Hybride innerhalb

ihrer Spezies (Bradbury et al. 2006, González et al. 2007, Lopandic et al. 2007).

Durch die Untersuchung ihrer kompakten Genome haben die Hefen wesentlich zum

Verständnis von molekularen Funktionen und der Evolution von Eukaryonten beigetragen

(Consortium et al. 2009). Oft wird dabei das Genom der Hefe S. cerevisiae, das erste

vollständig sequenzierte Eukaryontengenom (Goffeau et al. 1996), als Modell in genomischen

Studien eingesetzt (Hofmann et al. 2003, Ooi et al. 2006). Genome anderer Hefen, die der

Saccharomyces-Gruppe angehören, wie z.B. Zygosaccharomyces bailii, Candida albicans oder

auch Kluyveromyces lactis sind vollständig sequenziert, genauso wie das Genom des filamentös

wachsenden Pilzes Ashbya gossypii. Auf Grund der damit vorliegenden sehr hohen

Datenmenge können detailliertere phylogenetische Stammbäume erstellt werden und es ist

möglich Stoffwechselwege zu analysieren, sowie deren Regulation zu untersuchen.

Zur Charakterisierung ganzer Hefegenome werden im Allgemeinen drei Ansätze verfolgt: Zum

einen wird die primäre Sequenz der Hefen durchsucht und mit bereits annotierten Genomen

anderer Hefen verglichen, um potentielle Orthologe zu identifizieren. Diese Methode erlaubt

auch eine Aussage zu den Verwandtschaftsverhältnissen mit bereits bekannten Hefen. Eine

weitere Methode um Verwandtschaftsverhältnisse von Hefen zu analysieren, ist der Vergleich

der Syntenie. Die gleiche Anordnung der gefundenen Gene in verschiedenen annotierten

Hefegenomen liefert ebenfalls einen Hinweis auf einen eventuellen gemeinsamen Vorfahren

beider Hefen. Schließlich können die Primärsequenzen der aus den Genen abgeleiteten Proteine

verglichen werden. Hierbei sollten die Domänenstrukturen orthologer Gene entsprechend

konservierte Bereiche aufweisen (Krantz 2006). Neben dem Vergleich der Domänenstrukturen,

EINLEITUNG

SEITE 13

ist der Vergleich der Proteingröße ein entscheidender Faktor, der bei verwandten Hefen

konserviert sein sollte. So findet man häufiger N- oder C-terminale Verlängerungen oder auch

interne Sequenzinsertionen in bestimmten Proteinen, je weiter zwei Arten voneinander entfernt

sind (Scannell et al. 2007). Der Vergleich von metabolischen Stoffwechselwegen aus

Eukaryonten ist eine weitere Methode, um Genome zu vergleichen und zu analysieren. Diese

funktionelle Proteinanalyse von einer komplexen Maschinerie von Proteinen ermöglicht zum

einen die Identifizierung von funktionellen Domänen aber auch von eventuell neuen Partnern.

Weiter könnten über den Vergleich komplexer Stoffwechselwege potentielle Bereiche für

posttranslationale Modifikationen evaluiert werden.

Die größte Veränderung in der Evolution der Hefen ist die gesamte Duplikation des Genoms,

wie sie im Saccharomyces Komplex stattgefunden hat (Wolfe 2006). Die Genome dieser Hefen

verdoppelten ihre Chromosomen (Scannell et al. 2007). Der Genomduplikation folgte ein

extremer Genverlust (ca. 11%) (Byrne & Wolfe 2005, Dujon 2006). Die Größe der

S. cerevisiae Genoms wird mit rund 5.844 für Proteine kodierende Genen angegeben, wobei

1.102 Gene 551 duplizierte orthologe Paare bilden (Wolfe 2001).

EINLEITUNG

SEITE 14

1.4 Ziele der Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit ist, die Physiologie und die Genetik der bisher wenig untersuchte

Weinhefe K. apiculata (H. uvarum) näher zu untersuchen. Die Weinhefe K. apiculata ist durch

ihre Dominanz zu Beginn der Gärung und ihren durchaus positiven aromaprägenden

Eigenschaften, eine interessante Hefe für die Weinindustrie. Dennoch wurde die Hefe bisher

hauptsächlich in physiologischen Untersuchungen charakterisiert. Eine genetische

Charakterisierung der Hefe wurde bis heute nicht weiter vorgenommen. Um jedoch einen

genauen Wissensstand über die Stoffwechselwege dieser Hefe zu haben und um negative

Aspekte, die während der Fermentation auftreten, wie die Acetat Produktion durch die

Weinhefe Kloeckera apiculata minimieren oder gar ausschalten zu können, muss zunächst eine

genetische Analyse dieser Hefe durchgeführt werden. Die meisten Untersuchungen an

K. apiculata wurden mit Wildisolaten durchgeführt und sind daher schwer reproduzierbar. Um

Stammspezifische Unterschiede auszuschließen, wird in dieser Arbeit ein Stamm der deutschen

Stammsammlung (DSMZ) verwendet. Dieser wird zunächst auf Wachstumsparameter, sowie

auf gärungsrelevante Aspekte, wie Stresssituationen die in der Weingärung auf die Hefen

einwirken, näher untersucht. Um den Typstamm von K. apiculata weiter zu charakterisieren

wird er auch mikroskopischen Untersuchungen unterzogen.

Die Glykolyse ist der entscheidende Stoffwechselweg der bei Weinhefen die Umwandlung von

Zucker zu Ethanol beschreibt. In dem K. apiculata Stamm wird die Effizienz der Glykolyse

durch die Messung der spezifischen Enzymaktivität einiger Glykolyseenzyme bestimmt.

Vertieft werden diese Erkenntnisse mit näheren Untersuchungen zu der Phosphofructokinase,

welche das erste Enzym darstellt, das spezifisch ist für die Glykolyse.

Neben der physiologischen Charakterisierung des Typstammes, werden auch genetische

Charakterisierungen vorgenommen. Dazu werden Untersuchungen zur Ploidität der Weinhefe

durch die FACS Analyse und die Separation der Chromosomen durch die Pulsfeld-

Gelelektrophorese in Betracht gezogen. Gene, die aus K. apiculata isoliert werden, können über

Southern Hybridisierungen bestimmten Chromosomen zugeordnet werden. Um die Weinhefe

K. apiculata besser in ihren Stoffwechselwegen untersuchen zu können, muss sie genetisch

manipulierbar sein. Eine Etablierung eines Transformationssystems für die Weinhefe wäre

daher eine Möglichkeit um solche Untersuchungen der Stoffwechselwege zu ermöglichen.

Die Sequenzierung und Annotation des Genoms von K. apiculata wird ein weiterer

entscheidender Aspekt der Charakterisierung der Weinhefe sein.

MATERIAL UND METHODEN

SEITE 15

2 Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN

Alle Chemikalien wurden von den folgenden Firmen bezogen: Applichem (Darmstadt,

Deutschland), BD (Franklin Lakes, USA), Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Deutschland),

Invitrogen (Carlsbad,CA,USA), Roche (Basel, Schweiz), Roth (Karlsruhe, Deutschland), Serva

(Heidelberg, Deutschland) und Sigma Aldrich (St. Louis, USA).

Das verwendete Material wurde bezogen von: Amersham-Pharmacia (Uppsala, Schweden),

Eppendorf (Hamburg, Deutschland), Greiner BioOne (Frickenhausen, Deutschland), Omnilab

(Bremen, Deutschland) und Roth (Karlsruhe, Deutschland).

2.1.2 ENZYME

In dieser Arbeit verwendete Restriktionsenzyme wurden von den Firmen New England Biolabs

(Ipswich, USA) oder von Fermentas GmbH (St. Leon-Rot, Deutschland). Für PCR Produkte

wurden entweder DreamTaq TM DNA Polymerase oder „High Fidelity PCR Enzyme Mix“ von

Fermentas verwendet. Zur Konstruktion von Plasmiden wurden „calf intestine alkaline

phosphatase“ (CIAP) und T4-Ligase der Firma New England Biolabs eingesetzt. Des Weiteren

wurde Zymolyase-100T (Seikagaku Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan) verwendet.

2.1.3 KITS UND REAGENZIEN

Folgende aufgelistete Kits und Reagenzien kamen während der Arbeit zum Einsatz und wurden

nach Herstellerangaben verwendet.

„High Pure Plasmid Isolation Kit“ (Roche, Mannheim), „High Pure PCR Product Purification

Kit“ (Roche, Mannheim).

2.1.4 ANTIKÖRPER UND FLUORESZENZFARBSTOFFE

Tabelle 1: Verwendete Antikörper

Epitop Anwendung Referenz

primärer Antikörper polyklonaler Anti-PFK Heinisch 1986

Sekundärer Antikörper IRDye 700DX Conjugated Donkey Anti- Rabbit IgG Rockland


SEITE 16

Tabelle 2: Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe.

Fluoreszenzfarbstoffe Firma

DAPI Carl Roth

Fluorecent Brightener 28 Sigma-Aldrich

Sytox Green Molecular Probes

2.2 Stämme und Medien

2.2.1 ESCHERICHIA COLI STAMM

Escherichia coli K12-Stamm

DH5αF´: F´(Φ80dlacZΔM15)Δ(LacZYA-argF)U169recA1 endA1 hsdR17 rK- mK+

supE44 thi-1 gyrA relA1 (GibcoBRL, Gaithersburg MD, USA)

2.2.2 MEDIEN ZUR ANZUCHT DER E. COLI- STÄMME

Vollmedium (LB0): 0,5% Hefeextrakt, 1% Trypton, 0,5% NaCl.

Für die Selektion auf eine plasmidkodierte Antibiotikaresistenz wurden dem Medium nach dem

Autoklavieren 50mg/l Ampicillin oder 25 mg/ml Kanamycin zugesetzt. Für die Verwendung

von festen Nährböden wurde 1,5% Agar zugefügt. Zusätzlich wurde für ein blau/weiß Färbung

zum sichtbar machen von inserierten Fragmenten in ein lacZ Gen, 100µl einer 2%igen X-Gal

Lösung vor dem eigentlichen ausplattiert, auf die Agarplatten ausplattiert.

2.2.3 VERWENDETE HEFESTÄMME

Tabelle 3: Verwendete Hefestämme mit angegebenen Genotypen. (Ka: Kloeckera apiculata, Sc:

Saccharomyces cerevisiae, Kl: Kluyveromyces lactis, Km: Kluyveromyces marxianus)

Name Hefe Genotyp Bemerkung

DSM2768 K.a. Wildtyp Deutsche

Sammlung von

Mikroorganismen

und Zellkulturen

GmbH

DSM70788 K.a. Wildtyp

DSM5420 Km Wildtyp

HHD1 Sc Prototroph Schehl et al. 2004


SEITE 17

Name Hefe Genotyp Bemerkung

HD56-5A Sc MATalpha ura3-52 his3-11,15 leu2-3,112 Arvanitidis und

Heinisch

DHD5 Sc isogene Diploide zu HD56-5A Kirchrath et al.

AST30 Sc MATalpha; pfk1::HIS3; pfk2::URA3; ura3-52 his3-

11,15 leu2-3,112; trp1::loxP A. Strauß

K18 Sc MATa ura3-52; leu2-3,112; his3Δ1; trp1-289; MAL2-

8c; SUC2; GAL

(Schehl et al.,

2004)

KKB2 Sc MATα; ura3-52; leu2-3,112; his3Δ1; trp1-289;

MAL2-8c; SUC2; GAL; Δade2::kanMX K. Backhaus

Y01671 Sc BY4741; MAT a; his3D1; leu2D0; met15D0;

ura3D0; YOR374w::kanMX4 Euroscarf

(european

Saccharomyces

cerevisiae archive

for functional

analysis)

Y02767 Sc BY4741; MAT a; his3D1; leu2D0; met15D0;

ura3D0; YPL061w::kanMX4

BY4732 Sc Matα; his3Δ200; met15Δ0; trp1Δ63; ura3Δ0

HOD90-

2D Sc

MATalpha ura3-52 his3-11,15 leu2-3,112,

ald4ΔkanMX, ald6ΔkanMX diese Arbeit

HOD90-

7C Sc

MATalpha ura3-52 his3-11,15 leu2-3,112,

ald4ΔkanMX, ald6ΔkanMX diese Arbeit

Os223 Kl MATalpha ura3 leu2 ade2::loxP lac4::kanMX J.J. Heinisch

CBS2359 Kl prototroph Centraalbureau

voor

Schimmelcultures,

Delft KHO80 Kl Congen zu CBS2359

2.2.4 MEDIEN ZUR ANZUCHT VON HEFESTÄMMEN

Die Anzucht der Zellen erfolgte aerob bei 30°C auf den in Tabelle 4 beschriebenen Medien.

Die Platten wurden mit 1,5% Agar angesetzt. Zur Selektion wurde das Antibiotikum

Geneticinsulfat (G418) in einer Endkonzentration von 0,2 μg/ml für S. cerevisiae und 0,18

µg/ml für K. apiculata zugegeben. Die Hefen wurden erst über Nacht zur Regeneration auf

YEPD Medium inkubiert, bevor sie auf das selektive Geneticin-Medium ausplattiert wurden.


SEITE 18

Tabelle 4: Zusammensetzung der verwendeten Medien zur Anzucht von Hefestämmen. Die Zugabe der

verschiedenen Kohlenstoffquellen und der Antibiotika erfolgte nach Bedarf. YNB: Yeast nitrogen Base w/o

amino acids 0,67%.

Name Zusammensetzung Kohlenstoff-

quelle

Antibiotikum

Zugabe Bemerkung

Vollmedium

(YEP)

Bacto-Pepton 2%,

Hefeextrakt 1%

Glucose 2%,

Glycerin 2%,

Ethanol 3%

Geneticin/G418

(Konz.:

S. cerevisiae

200 mg/l,

K. apiculata

180 mg/l) bei

<50°C

zugegeben

Ethanol wurde

dem

autoklavierten

Medium nach

Abkühlung

zugegeben

Synthetisches

Medium mit

Zusätzen (SC)

YNB 0,67%, Aminosäure

nach Bedürfnis, pH 6,3

Glucose 2%,

Glycerin 2%

Ethanol 3%

Synthetisches

Minimalmedium

(SM)

YNB 0,67%, pH6,0

Glucose 2%,

Glycerin 2%,

Ethanol 2%

Sporulations-

medium

S. cerevisiae

(KAc)

Kalium-Acetat 1%, Agar

2%, pH5,5

5´-FOA- Platten

0.67% YNB, 0.06% AS

Pulver, Uracil (Endkonz

100ng/ml)

Glucose 2%

pH 6,2-6,3;

Glucose und 5-

FOA (Endkonz

1mg/ml) nach

dem abkühlen

hinzugegeben

2.2.5 PLASMIDE

Tabelle 5: Im Zuge dieser Arbeit sind folgende Plasmide verwendet und konstruiert worden.

Name Ausgangsplasmid Insert Quelle

pUC21 (Vieira & Messing

1991)

YEp351 (Hill et al. 1986)

YEp352 (Hill et al. 1986)

pCXJ22 (Chen 1996)

pUG6

(Güldener et al.

1996)

pFB3 pUG6 KaURA3dis kanMX diese Arbeit

pFB12 YEp352 KaLEU2 diese Arbeit

pFB25 pUC21 KaCEN10 diese Arbeit





SEITE 19

Name Ausgangsplasmid Insert Quelle


pFB30 pCXJ22 KaCEN10 diese Arbeit





pFB35 YEp352 KaPFK1 diese Arbeit

pFB36 YEp351 KaPFK2 diese Arbeit

pFB40 pUC21 KaGPM1 diese Arbeit

pFB42 YEp352 KaGPM1 diese Arbeit

pFB43 pFB42 KaGPM1pKanMX (in vivo

Rekombination) diese Arbeit

pFB44 pFB42 KaGPM1pClonNAT (in vivo

Rekombination) diese Arbeit

pFB45 pFB25 KaGPM1pKanMX/KaCEN10 diese Arbeit





pFB50 YEp351 KaURA3 diese Arbeit

pFB56 pFB50 KaURA3 (Deletion) diese Arbeit

pFB57 pUC21 KaGPM1pKanMX diese Arbeit

pFB59 YEp352 KaPFK1 KaPFK2 diese Arbeit

pFB60 pFB57 KaURA3 (DIS) diese Arbeit

pAKL3 YEp352 KaLEU2 A.K. Langenberg

pAKL4 YEp352 KaADE2 A.K. Langenberg

pAKL5 YEp352 KaALD4 A.K. Langenberg

pAKL6 YEp352 KaALD6 A.K. Langenberg

2.2.6 OLIGONUKLEOTIDE

Die in Tabelle 6 aufgelisteten Oligonukleotide wurden von der Firma Metabion (Martinsried,

Deutschland) bezogen.

Tabelle 6 Verwendete Oligonukleotide

Name Sequenz (5`---> 3`)

99.98 Reverse CAGGAAACAGCTATGACCATG

3.44 KanMX-3óut GTATTGATGTTGGACGAGTCGG

3.45 KanMX-5óut GGAATTTAATCGCGGCCTCG

7.269 KaURA3forw CCTTTCGGAGTTTAATAACCATATTCC


SEITE 20


7.270 KaURA3rev GATTCCATTTTTTGTGTGTGTGTG

7.370 HuURAdel5 CGAAGCTAGAAGCGAAGCACACAGCGCACCAGTTGTGA

AGCTT CGTACGCTGCAGGTCGAC

7.371 HuURAdel3 GGATGGATACTCTTTTCAAATAAGCATTCCATCCA

GCTTCTTTGTATCCCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG

8.317 KaTRP1nHind ccgcaaGCTTCTGCTTTACCAGACTCCGCC

8.318 KaTRP1vBam gcgcggATCCATTCTTATAGCACGACCGTG

09.26 HuHIS3vor Eco GCGCGCACTGAACTAAGAAACACCACCTAACAGATCCG

09.27 HuHIS3nach Hin GGCGAAGGAGTAATCATCTATGTCTGTATTTTGCC

09.80 KaDelK Ura for GAACCAAGGATTAAGACCCACCG

09.81 KaDelK Ura rev GAGGTGAAGTCTTCAACACAGTCGGAG

9.154 KaCEN10vBam GTTGCTAAAGTCTCAATTCAGAG

9.155 KaCEN10nPst GCTGGAGACACTGTTTTAGTAACGG

9.156 KaCEN39vXba GAGTTTGATAGTGCTGAAGCAAG

9.157 KaCEN39nBam GTAGTGGTCATCAACAAAGGG

9.158 KaCEN331vPst gcgcctgCAGAAGGTTGATTGAATGATG

9.159 KaCEN331nBam gcgcggaTCCAAAGCGACAAATTGAGTAG

9.160 KaCEN403vXba GTTAAATTTGATAATGTGACAG

9.161 KaCEN403nBam gcgcggaTCCAAAGAAGATACTTTAGGTG

9.162 KaCEN417vBam GATCTTGGTACAGTTGTAGG

9.163 KaCEN417nPst GTGGCATATAAGGTTATTGG

9.183 KaLEU2forBam

HI gcgcggatccCTTGCTAGGTAAAGATGAAGCTG

9.184 KaLEU2revnach

SalI gcgcgtcgacTAGAGTCCGCTCTCAAAGGGTG

9.185 KaADE2forKpnI gcgcggtaccGGGCCTTACTGGTGAATGCAGC

9.186 KaADE2revnach

EcoRI gcgcgaattcGTTCTAAAACCCTGACTCCAC

9.187 KaALD4forBam

HI gcgcggatccGTCCGATACCATAGATCACGTGTG

9.188 KaALD4revnach

SalI gcgcgtcgacCGGAGAATGGTGATATTACTC

9.189 KaALD6forSacI gcgcgagctcGAGAGTCATTCCGTCAGACTAC

9.190 KaALD6revnach

KpnI gcgcggtaccCCCCTCGGTTTAAGAACGGC

9.193 KaGPM1forPst1 gcgcctgcagGGATGTCATGGTTGTTGCTCAC

9.194 KaGPM1revnach

BamHI gcgcggatccGCCTAAACTCCGAATGCCGTG

9.195 KaPFK1for

Kpn1 gcgcggtaccGAAGGATAATCTATCGGCTT

9.196 KaPFK1revSac1 gcgcgagctcCTCCGAAATCCCTCCTCAGC

9.197 KaPFK2forPst1 gcgcctgcagGTCTCGTTATCCTTGCACCC

9.198 KaPFK2revnach

Sal1 gcgcgtcgacCGCCATAATGCATACTATGAG


SEITE 21


9.218 ARSDelADEfor CCGCATCAGGCGATGAATGGAAATTACGTACTTTCAAC

GCAAGAGCAAGACGGACGTATGATTGTTGAGGCAGC

9.219 ARSDelADE rev GGGTGTTTATATTTAGGTAGGGCATAAGGATTTACTGTC

GGCATGAACCGCGCCAAGCAGTCTGACAGCC

9.220 KaGPM1KanM

Xfor

CCACAAATTTGATAAGAGAAATAAGGCATTATGGGTAA

GGAAAAGACTCACGTTTCG

9.221 KaGPM1KanM

Xrev

AATCAATGTTTGATCATGTCTCTGATGGATTAGAAAAAC

TCATCGAGCATC

9.225 KaGPM1cloNA

Tfor

gcgcctgcagCCACAAATTTGATAAGAGAAATAAGGCATTAT

GGGTACCACTCTTGACGACACGGC

9.226 KaGPM1cloNA

Trev

gcgcggatccAATCAATGTTTGATCATGTCTCTGATGCGCTTA

GGGGCAGGGCATGCTCATGTAG

9.237 KaURA3delGP

MKANfor

AAGAGATGAAGGCTTTGATTGGTTGATCATGACTCCTGG

TGTTGGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGC

9.238 KaURA3delGP

MKANrev

TCAGTAACAGGGTCTCTGCCTTTACCATACAAACCTCTA

CCTACGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGG

10.41 CEN40for GATAATCAGCAGCTCTCACA

10.42 CEN40rev CCAACGTAATACAGTGTGTTC

10.43 CEN296for GGCGGTGACCGCAGAGACAG

10.44 CEN296rev CCAAATGCCAGCATATCATC

10.45 CEN379for CTGTGCTGGACCACGTCAAAG

10.46 CEN379rev CTGGTCTTTGAGCAATGTAAGC

2.3 Methoden

2.3.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI- ZELLEN (RUBIDIUM-CHLORID-METHODE)

20 ml LB-Medium wurden aus einer Übernachtkultur mit einer Verdünnung von 1:100

angeimpft. Die Zellen wurden bis zu einer OD600~0,4- 0,6 angezogen und anschließend 10-15

min auf Eis gelagert. Anschließend wurden sie für 5 min bei 5000 rpm und 4°C in einer

„Centrikon T-124“-Zentrifuge (Kontron Instruments) mit dem Rotor A8.24 sedimentiert. Der

Überstand wurde abgenommen und das Sediment in 10 ml eiskalten Puffer RF1 resuspendiert

(Tabelle 7).

Tabelle 7: Zusammensetzung für die Herstellung von kompetenten E. coli Zellen.

Bezeichnung Zusammensetzung

RF1 100 mM RbCl2, 50 mM MnCl2, 30 mM KAc, 10 mM CaCl2, 15%

Glycerin, pH 5,8

RF2 10 mM MOPS, 10 mM RbCl2, 75 mM CaCl2, 15% Glycerin pH 6,8


SEITE 22

Nach Inkubation für 20 Minuten auf Eis wurden die Ansätze bei 2000 rpm und 4°C für 12-15

min abzentrifugiert. Daraufhin wurde der Überstand erneut verworfen und das Zellsediment in

2 ml Puffer RF2 suspendiert. Nach 15-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen in 150

µl-Fraktionen portioniert und bei –80°C eingefroren.

2.3.2 TRANSFORMATION VON E. COLI

Für die Transformation nach der RbCl-Methode von (Hannahan 1983) durchgeführt, dazu

wurden 150 µl der kompetenten Zellen verwendet. Diese wurden mit 100-200 ng Plasmid-

DNA bzw. 5-10 µl Ligationsansatz vermischt. Um eine Anlagerung der Plasmid-DNA an die

kompetenten Zellen zu gewährleisten, wurden die Ansätze für 30 min auf Eis inkubiert. Zur

Aufnahme der DNA wurden die Zellen einem Hitzeschock bei 42°C für 90 sec ausgesetzt und

anschließend für etwa 5 min auf Eis gelagert. Nach der Zugabe von 1 ml LB-Medium wurden

die Ansätze zur phänotypischen Expression bei 37°C für 1 h inkubiert. Im Anschluss daran

wurden die Zellen 5 min bei 4000-8000 rpm abzentrifugiert, in 100 µl LB-Medium

resuspendiert und auf selektive Medien plattiert.

2.3.3 „MINI-PLASMID-ISOLIERUNG“ AUS E. COLI

Die Plasmidisolierung erfolgte aus einer 3-5 ml Übernachtkultur mit Hilfe des „QIAprep Spin

Miniprep-Kits“ der Firma Qiagen (QIAprep Spin Miniprep Kit, QIAGEN GmbH, Hilden) nach

Angaben des Herstellers. Die DNA wurde mit 50 µl Wasser (bidest, steril) eluiert.

2.3.4 HERSTELLUNG KOMPETENTER HEFEZELLEN („FREEZE METHODE“)

Für diese Methode [(Klebe et al. 1983) modifiziert nach (Dohmen et al. 1991)] werden 50 ml

YEPD- Medium aus einer Übernachtkultur mit einer Verdünnung von 1:100 angeimpft. Die

Zellen wurden bis zu einer OD600~0,6-0,8 angezogen und anschließend für 5 min bei 2500 rpm

in einer "Centrikon T-124"- Zentrifuge (Kontron Instruments) mit dem Rotor A8.24

sedimentiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Sediment in 5ml Lösung A

resuspendiert (Tabelle 8).

Tabelle 8: Zusammensetzung der Lösung zu der Herstellung von kompetenten Hefezellen.


Lösung A 1M Sorbit, 10mM Bicin pH 8,35, 3% Ethylenglycol

Lösung B 40% PEG 1500, 200mM Bicin pH 8,35

Lösung C 150mM NaCl, 10mM Bicin (pH8,35)


SEITE 23

Diese Ansätze wurden erneut bei 2500 rpm für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand

verworfen. Das Sediment wird mit 4 ml Lösung A resuspendiert und in bereits vorgekühlte

Eppendorfcups zu 200 µl aliquotiert und bei -80°C eingefroren.

2.3.5 TRANSFORMATION IN HEFE

Für die Transformation wurden 200 µl der kompetenten Zellen verwendet. Diese wurden noch

in gefrorenem Zustand mit 10 µl, bei einfachen Transformationen, und je 7 µl bei

Doppeltransformationen der Plasmid-DNA und 5 µl Heringssperma- DNA (10ng/ml) versetzt.

Zur Aufnahme der DNA wurden die Zellen einem Hitzeschock bei 37°C für 45 sec ausgesetzt

und anschließend mit 1ml Lösung B versetzt und für eine Stunde bei 30°C inkubiert. Optional

konnten die Zellen nach der Regeneration noch mit Lösung C gewaschen werden. Im

Anschluss daran wurden die Zellen bei 6000 rpm 3 min abzentrifugiert und in 100 µl des

entsprechenden Selektivmediums resuspendiert und auf selektive Medien ausplattiert.

2.3.6 ELEKTROPORATION

Eine bis zum Anfang der stationären Phasen (OD600 1,3-1,7) gewachsene Hefekultur (200 ml)

wird bei 3.000 rpm bei 4°C für 5 Minuten abzentrifugiert. Das Pellet wird in 25 ml Lösung 1

(Tabelle 9) aufgenommen und für eine Stunde bei 18-20°C inkubiert.

Tabelle 9: Zusammensetzung der für die Elektroporation verwendeten Lösung.


Lösung 1 0,1M Lithiumacetat, 10mM DTT, 10mM Tris-HCl pH7,5, 1mM EDTA

Nach einem Zentrifugationsschritt, bei 4000 rpm, 5 min, bei 4°C werden die Zellen in 40 ml

Eis kaltem sterilem H2O aufgenommen. Es erfolgt ein weiterer Zentrifugationschritt bei 2.500

rpm bei 4°C für 5 Minuten abzentrifugiert. Das Pellet wird erneut in 20 ml sterilem, kaltem

H2O resuspendiert und abermals bei 2.500 rpm bei 4°C für 5 Minuten abzentrifugiert. Das

Pellet wird in 5 ml 1 M Sorbitol (eis gekühlt) resuspendiert und bei 2.000 rpm bei 4°C für 5

Minuten abzentrifugiert. Die abzentrifugierten Zellen werden in 150 µl 1 M Sorbitol

aufgenommen und zu 40 µl Portionen in sterile Elektroporations Küvetten gegeben. Zu der

Zellsuspension werden < 5µl DNA gegeben und fünf Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen

werden mit einem Puls versetzt (V=1,5 kV, 25 µT, 200 Ohm, 4-5 Sekunden) und danach

SOFORT mit 1 ml YEPD+1 M Sorbitol versetzt. Die Zellen werden 2 Sunden bei 30°C (bei

K. apiculata 25°C) regeneriert, danach abzentrifugiert bei 3.000 rpm für 3 Minuten und in 1 ml


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Wasser (bidest, steril) aufgenommen. Ausplattiert werden die Zellen auf entsprechendem

Selektivmedium.

2.3.7 SPHÄROBLASTEN TRAFO ( NACH (BEGGS 1978))

Eine über Nacht gewachsene Kultur wird morgens umgeimpft und bei einer Zelldichte von

2*107 Zellen, 5 Minuten bei 4000 rpm abzentrifugiert. Das Pellet wird in 10 ml H2O gelöst und

erneut bei 4000 rpm für 5 Minuten abzentrifugiert. Anschließend wird das Pellet in 1ml der

Lösung I aufgenommen und zusätzlich mit 9 ml der DTT-Lösung versetzt (Tabelle 10).

Tabelle 10: Zusammensetzung der Lösungen für die Sphäroblasten Transformation.


Lösung I 1,2 M Sorbit, 25 mM EDTA pH 8,0

DTT Lösung 1,2 M Sorbit, 25 mM EDTA pH8,0, 1,5ml 1M DTT

Lösung II 1,2 M Sorbit, 0,1 M Na-Citrat, 10 mM EDTA pH 5,8

Lösung III 1,2 M Sorbit, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl pH 7,5

PEG Lösung 20% PEG4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris/HCl pH 7,5

Regenerationslösung 2 ml 1,2 M Sorbit, 10 mM CaCl2, 2 ml YEPD

Nach 15 Minuten Inkubation bei 30-32°C wird bei 4000 rpm für 5 Minuten abzentrifugiert. Das

Pellet wird in 1,2 M Sorbit aufgenommen und es erfolgt ein weiterer Zentrifugationsschritt bei

4000 rpm für 5 Minuten. Das Pellet wird zunächst in 10 ml der Lösung II aufgenommen, bevor

die Zugabe von Zymolyase (Endkonzentration:1 mg/ml) mit anschließender einstündigen

Inkubation bei 30°C erfolgte. Die Zellen wurden auf Protoplasten hin untersucht und

anschließend bei 2000 rpm für 10 Minuten abzentrifugiert. Die Zellen wurden viermal mit 10

ml, 1,2 M Sorbit gewaschen und erneut abzentrifugiert. Das Resuspendieren erfolgte vorsichtig

mit einer Pipette. Nach den Waschschritten wurden die Zellen in 0,15 ml Lösung III

aufgenommen und zu 0,1 ml Portionen, die ca. 10-20 µg DNA enthielten alliquotiert. Nach 15

minütiger Inkubation bei 18-22°C wurde 1ml der PEG- Lösung hinzugefügt. Es erfolgte eine

erneute Inkubation bei 18-22°C für 15 Minuten. Das Pellet wurde, nach einer erneuten

Zentrifugation (2000 rpm, 10 min) in der Regenerationslösung aufgenommen. Nach einer 40

minütigen Regeneration bei 18-22°C wurden die Zellen erneut abzentrifugiert, in 1,2 M Sorbit

verdünnt (10-2

, 10-4

, 10-6

), im Weichagar gelöst und auf Selektionsplatten gegossen.

2.3.8 LITHIUM ACETAT TRANSFORMATION

Eine über Nacht gewachsene Kultur wird morgens auf eine OD600~0,2 neu angeimpft. Die

Zellen werden bei einer OD600 ~0,6-0,8 geerntet und 10 ml der Kultur werden abzentrifugiert


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für 5 min bei 2500 rpm. Die Zellen werden in 1ml H2O resuspendiert und in einem Eppendorf

Cup überführt. Nachdem die Zellen erneut bei 2.500 rpm für 5 min abzentrifugiert wurden,

werden sie in 1 ml TE/LiAc (1:1:8 TE, LiAc, H2O) resuspendiert und erneut zentrifugiert. Das

Pellet wird in 200 µl TE/LiAc resuspendiert und in 4 Portionen à 50 µl Hefekultur geteilt. Zu

jeder 50 µl Hefekultur wird 1µg DNA und 50 µg Heringssperma-DNA gegeben. Nach der

Zugabe von 300 µl 50% PEG 4000 Lösung (8:1:1 TE, LiAc, PEG) werden die Eppendorf Cups

bei 30°C (bei K. apiculata bei 25°C) für 30 Minuten, schüttelnd inkubiert. Nach einer

Inkubation bei 42°C (bei K. apiculata bei 32°C) für 15 Minuten werden die Zellen

abzentrifugiert und resuspendiert. Wenn eine Regeneration der Zellen nach der Transformation

erforderlich war (G418, ClonNAT) wurden die Zellen in YEPD resuspendiert und über Nacht

bei 30°C (bei K. apiculata 4-5 Stunden bei 25°C) inkubiert, bevor sie auf Selektivmedium

ausgestrichen wurden. Bei Zellen die keine Regeneration brauchten wurde das Pellet in 200 µl

Wasser (bidest, steril) aufgenommen und direkt auf Selektivmedien ausplattiert.

2.3.9 PLASMIDISOLIERUNG AUS HEFE

Für die Plasmidisolierung aus Hefe wurde eine 10 ml Übernachtkultur für 3 min bei 5000 rpm

abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen im verbliebenen Medium

resuspendiert. Anschließend wurde dem Ansatz 400 µl Puffer P1 des „QIAprep Miniprep Kits“

von QIAGEN und 0,5 ml Glasperlen (Durchmesser 0,45-0,5 mm) hinzugegeben. Der

Zellaufschluss erfolgte für 10 min bei 4°C auf dem „IKA-Vibrax-VXR“. Nachfolgend wurden

250 µl vom Überstand abgenommen und in ein Eppendorf-Gefäß überführt. Die weitere

Plasmidisolierung erfolgte mit dem „QIAprep Spin Miniprep-Kit“ der Firma Qiagen (Hilden)

nach Angaben des Herstellers für die Plasmidisolierung aus E. coli ab dem zweiten Schritt des

Protokolls. Der optionale Schritt wurde zur besseren Reinigung durchgeführt und die DNA mit

50 µl Wasser (bidest, steril) eluiert.

2.3.10 GLYCERIN-DAUERKULTUR VON HEFE

Zur Aufbewahrung von Hefestämmen wurden Glycerin-Dauerkulturen angelegt. Die Zellen

wurden über Nacht in 5 ml Selektionsmedium angezogen. Es wurden 250 µl der Kulturen

abgenommen und mit jeweils 500 µl 30 % Glycerin versetzt. Die Ansätze wurden für 60 min

bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bei –80°C eingefroren und gelagert.


SEITE 26

2.3.11 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR)

Die Polymerase-Kettenreaktion (Saiki et al. 1988) ermöglicht die in vitro-Amplifikation von

Nukleotidsequenzen. Vom Prinzip her ähnelt diese Methode der natürlichen Replikation.

Ausgehend von synthetischen Primer-Oligonukleotiden, die an die Matrizen-DNA

hybridisieren, kommt es von deren freiem 3´-OH-Ende zur Synthese eines neuen DNA-

Stranges durch eine hitzestabile Polymerase. Durch den Einsatz eines gegenläufigen

Oligonukleotid-Primers kann gezielt die Sequenz zwischen beiden Primern amplifiziert

werden. Entscheidend dabei ist die Wiederholung eines dreistufigen Temperaturprofils, die zur

exponentiellen Amplifikation führt. Ein Standard PCR- Temperaturprofil ist in Tabelle 11

dargestellt

Tabelle 11: Standard-Ansatz für PCR-Reaktionen

PCR-Temperaturprofil

Temperatur Dauer PCR-Schritt

94° C 2 min

Initiale

Doppelstrang-

Denaturierung

72° C 10 min Polymerase-Zugabe

Zyklus-Beginn (insgesamt 30 - 40 Wiederholungen)

94° C 30 s Denaturierung der

DNA-Hybride

50-58° C 30 s Annealing

72° C 30 s Elongation

Zyklus-Ende

72° C 10 min Vervollständigen der

Elongation

15° C Beenden der Elongation

Bei dem Einsatz von genomischer DNA wurde diese unverdünnt eingesetzt. Die PCR wurde in

einem Thermocycler der Firma Biometra, Göttingen durchgeführt. Das verwendete PCR-

Programm wurde jeweils dem zu amplifizierenden Fragment angepasst. Generell wurde ein

sogenannter Hot-Start durchgeführt, was bedeutet, dass die Taq-Polymerase erst nach der initialen

Denaturierung und Erreichen von 72° C zugegeben wurde. Dies sollte die Bildung unspezifischer

Hybridisierungen verhindern.

Bei den verwendeten Primer wurde darauf geachtet, dass diese eine Schmelztemperatur TM von

55 – 80° C und einen G/C-Gehalt zwischen 40 – 60 % aufwiesen. Des Weiteren wurde

beachtet, dass die jeweiligen Primerpaare eine möglichst geringe Komplementarität zueinander

aufwiesen, um die Bildung von Primer-Konkatemeren zu vermindern.


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2.3.12 RESTRIKTIONSANALYSE

Zur Restriktion wurden Enzyme der Firma New England Biolabs und Fermentas verwendet.

Die Restriktionsansätze wurden nach Angaben der Hersteller mit den mitgelieferten Puffern

durchgeführt. Anschließend wurden die DNA-Fragmente über eine Gelelektrophorese getrennt

und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

2.3.13 LIGATION

DNA-Ligasen katalysieren die Verknüpfung des Phosphodiester-Rückgrats von DNA-Strängen

unter Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der 5´-Phosphatgruppe der einen Desoxyribose

und der 3´-Hydroxygruppe des folgenden Zuckerrestes. Dies ermöglicht es, unter anderem DNA-

Stränge, die mit den gleichen Restriktionsenzymen behandelt wurden und dadurch kompatibel

zueinander sind, miteinander zu verknüpfen. Hierzu wurden T4-Ligasen der Firmen Fermentas und

New England Biolabs verwendet. Alle durchgeführten Ligationen fanden nach Angaben der

Hersteller bei 16° C ÜN statt.

2.3.14 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte mittels der Agarosegel-Elektrophorese.

Verwendet wurden Gele mit einer Agarosekonzentration von 1% (w/v) in einfachem TAE-

Laufpuffer (Tabelle 12).

Tabelle 12: Zusammensetzung der Puffer, die für das Agarosegel verwendet wurden.


Gelladepuffer 0,25 % Bromphenolblau, 0,25 % Xylencyanol FF, 50 %

Glycerin, 0,5 % 10 x TAE

TAE-Laufpuffer

(50x) 2 M Tris-HCl; 1M Essigsäure; 50 mM EDTA; pH 8,3

Die aufzutrennende DNA wurde mit Gelladepuffer auf das Agarosegel aufgetragen. Zur

Größenbestimmung der DNA-Fragmente wurde der „2-log DNA Ladder“ als DNA-Standard

aufgetragen. Nach der Inkubation der Gele für mindestens 10 min in einer

Ethidiumbromidlösung (Stammlösung 10 mg/ml, davon 20 µl/200 ml Wasser), wurde die DNA

auf einem UV-Transilluminator bei 254 nm sichtbar gemacht.


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2.3.15 EXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN

DNA-Fragmente wurden mittels des „QIAquick Gel Extraction Kit“ von Qiagen (Hilden) nach

Angaben des Herstellers aus Agarosegelen extrahiert. Die DNA wurde mit 50 µl Wasser

(bidest, steril).

2.3.16 REINIGUNG VON PCR-FRAGMENTEN

Die Reinigung doppelsträngiger DNA-Fragmente einer PCR sowie DNA aus anderen

enzymatischen Reaktionen wurde mit dem „Purification-Kit“ der Firma Roche (Mannheim)

durchgeführt. Die gereinigte DNA wurde in 50 µl Wasser (bidest) aufgenommen.

2.3.17 DNA-SEQUENZIERUNG

Die Sequenzierungen wurden vom SRD (Frankfurt) durchgeführt. Als „Primer“ wurden

verschiedene Oligonukleotide (Metabion vgl.) eingesetzt, welche komplementär zu den

bestimmten Abschnitten der Plasmidsequenz waren.

2.3.18 ETHYLMETHANSULFONAT (EMS) BEHANDLUNG

Eine auf OD600=2 eingestellten ÜNK werden 4ml abzentrifugiert und in ebenfalls 4 ml H2O

gewaschen. Die Zellen werden in 4 ml H2O resuspendiert und je 1ml in Eppendorf Cups

überführt und erneut abzentrifugiert. Die Zellen werden in 500 µl eines 100mM, pH7

Kaliumphosphat Puffer (2.3.33) resuspendiert und mit EMS (Endkonzentration 2%) versetzt

und für 1 h bei 30°C auf dem Thermoblock inkubiert. Die mit EMS behandelten Zellen werden

auf 5-FOA (Tabelle 4) Platten ausplattiert. Kontrollen (ohne EMS Zugabe) werden in

Verdünnungen ebenfalls ausplattiert.

2.3.19 MESSUNG VON MITOTISCHER STABILITÄT VON PLASMIDEN

Potentielle centromerische Sequenzen aus K. apiculata wurden in den Vektor pCXJ22 kloniert.

Die im Vektor enthaltene S. cerevisiae CEN/ARS Sequenz wird durch eine in vivo

Rekombination im K. lactis Stamm OS224 durch ein S. cerevisiae ADE2 Gen ersetzt. Eine

erfolgreiche Integration des ADE2 Gen bedingt eine weiß Färbung der Transformanten auf

Adenin haltigem Medium. Von jedem potentiellen K. apiculata Centromer, werden drei weiße

Kolonien in 3 ml YEPD Medium angezogen. Täglich werden die über Nacht gewachsenen

Kulturen in frischem Medium umgeimpft. Nach einem und nach drei Tagen erfolgt eine

Bestimmung der OD600 und ein anschließendes ausplattieren von Verdünnungsreihen auf SC-


SEITE 29

ura + Adenin. Die Agarplatten werden bei 30°C für zwei Tage inkubiert und die Anzahl der

weißen und roten Kolonien bestimmt.

2.3.20 CHROMOSOMALE DNA ISOLIERUNG AUS K. APICULATA

Eine über Nacht gewachsene Kultur wurde frisch angezogen und für erneut 2-3 Stunden

wachsen lassen. Die Zellen wurden bei einer OD600 von 0,9-1,2 geerntet. Die Zellen wurden bei

3.000 rpm für 3 Minuten abzentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 0,5 M EDTA pH 7,5

gewaschen, bevor es in 300 µl Puffer P1 resuspendiert wurde (Tabelle 13).

Tabelle 13: Verwendeter Puffer für die Isolierung der chromosomalen DNA aus K. apiculata


P1 Puffer 50 mM Tris/HCl, pH8; 10 mM EDTA; 100 µg/ml RnaseA

Zu der Zellsuspension wurden 250 µl Glasperlen (im Durchschnitt µm) gegeben. Der

Zellaufschluss erfolgte bei 4° C für 15 Minuten auf dem Vibrax. Nach einem kurzen

Zentrifugationsschritt wurde der Überstand in ein neues Eppendorf Cup gegeben und zur

Inaktivierung der DNAsen für 20 Minuten bei 65° C inkubiert. Nach einer kurzen

Abkühlungsphase wurde 70 µl einer 5 M KAc Lösung hinzugegeben und auf Eis für 20

Minuten inkubiert. Die ausgefallenen Proteine werden bei einem Zentrifugationsschritt (13.000

rpm, 10 Minuten) pelletiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit 300µl eiskaltem

Ethanol versetzt. Die DNA wurde nach einem erneuten Zentrifugationsschritt (13.000 rpm, 10

min) pelletiert. Die DNA wurde in einer Speedvac getrocknet und bis zur Verwendung

eingefroren. Bei Bedarf wurde ein Alliquot mit 50-200 µl Wasser (bidest, steril) resuspendiert.

Die Menge des Volumens wurde an der Menge der gefällten DNA angepasst.

2.3.21 ANNOTATION DES KLOECKERA APICULATA GENOMS

Die Sequenzierung der genomische DNA von Kloeckera apiculata erfolgte durch die Firma

Microsynth AG (Balgach, Schweiz). Hierzu wurde DNA isoliert, wie in 2.3.20 beschrieben, die

mindestens eine Konzentration von 300 ng/µl, in einem Volumen von mindestens 10-15 µg

hatte. Zudem musste der gemessene Quotient von A260 zu A280 größer 1,8 sein. Die erhaltene

DNA Sequenz wurde mit dem Programm: STADEN (Staden package version 1.7.1.1.b) auf

überlappende Contigs hin untersucht (Staden et al. 2000). Es wurden alle Contigs ausgewählt,

die mindestens eine Größe von 500 bp hatten. Im Weiteren wurde mit dem Programm

EMBOSS (EMBOSS for Windows 2.10.0-0.8) offene Leseraster gesucht und diese als

Proteinsequenz angegeben (Senger et al. 2000).


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2.3.22 BLAST („BASIC ALIGNMENT SEARCH TOOL“)

Um Genome von Hefen zu analysieren werden sogenannte BLAST durchgeführt. Hierbei

handelt es sich um einen Vergleich von DNA- oder Protein-Sequenzen mit einer Datenbank

(Altschul et al. 1990, McGinnis & Madden 2004, Sansom 2000). Die erhaltenen Treffer sind

eine Reihe von lokalen Alignments, die eine Gegenüberstellung der gesuchten Sequenz mit

ähnlichen Sequenzen aus der Datenbank ergibt (Ladunga 2002). Es wurden BLAST (mit blast

2.2.19) gegen A. gossypii, K. lactis und S. cerevisiae gemacht. Als Datenbasis diente YGOB

(Yeast Gene Order Browser [www.genome.org]). Verschiedene BLAST Methoden sind in

Tabelle 14 dargestellt.

Tabelle 14: Verschiedene Methoden BLAST zu verwenden.

Methode Beschreibung

blastp Vergleicht eine Aminosäuresequenz gegen eine Proteinsequenzdatenbank

blastn Vergleicht eine Nukleotidsequenz gegen eine Nukleotidsequenzdatenbank

blastx

Vergleicht eine Nukleotidsequenz (in allen Leserastern) gegen eine

Proteindatenbank. Dies ermöglicht eine mögliche Translation der bekannten

Nukleotidsequenz zu finden

tblastx Vergleicht die six-frame Translation einer Nukleotidsequenz gegen die six-

frame- Translationen einer Nukleotidsequenzdatenbank.

Neben den Treffern, wird auch für jeden eine Signifikanz angegeben. Die Homologie der

bearbeiteten Suchsequenz wird anhand von Score und E-Werten definiert. Wobei es sich bei

dem Score Wert um eine quantitative Bewertung anhand der Ähnlichkeiten der Treffer handelt.

Je höher dieser Wert ist, desto höher ist auch die Identität der Sequenzen. Der E- Wert gibt

dagegen die erwartete Anzahl der Hits an, wobei deren Score mindestens so groß sein muss,

wie der beobachtete. Je kleiner der E- Wert ist, desto besser ist der Treffer.

2.3.23 DURCHFLUSSZYTOMETRIE [FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTER (FACS)]

Es werden 107

Zellen einer exponentiell wachsenden Kultur bei 2000 rpm für fünf Minuten

abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Nachdem das Pellet mit kaltem 70 % EtOH

versetzt wurde und durch vortexen gelöst wurde, werden die Cups für 15 bis 30 Minuten bei

4°C inkubiert. Von der gekühlten Lösung werden 300 µl weiterverwendet (ca. 2-3x 106 Zellen)

und mit 3 ml einer 50 mM Na Citrat Lösung gemischt. Die Zellen werden bei 2000 rpm für 5

Minuten abzentrifugiert und der Überstand anschließend verworfen. Das Pellet wird in 500 µl

Na Citrat Lösung, die 0,1 mg/ml RNase A enthält resuspendiert und bei 37°C für mindestens


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zwei Stunden inkubiert. Die Färbung erfolgt mit der Zugabe von 1 ml einer 50 mM Na Citrat

Lösung, die 2 µm Sytox Green enthält (Endkonzentration: 1 µM). Anschließend werden die

Zellen für 45 Sekunden mit Ultraschall versetzt um die Zellen zu vereinzeln und

Aggregatbildungen zu verhindern. Danach werden diese Proben eingesetzt und gemessen.

2.3.24 BLÖCKCHEN FÜR DIE PULSFELD GELELEKTROPHORESE

Um Chromosomen intakt zu separieren müssen zuerst die Zellen intakt in Agarose eingebettet

werden. Um ein scheren der Chromosomen zu verhindern dürfen die Chromosomen erst

freigelegt werden, wenn sie stabil in einem Agaroseblöckchen eingebettet sind.

Eine über Nacht gewachsene Hefe Kultur (200 ml) wird bei 6.000 rpm abzentrifugiert. Das

Pellet wird in 15 ml einer 50 mM EDTA (pH 7,5) Lösung resuspendiert und die

Zellkonzentration bestimmt. Die Zellen werden zweimal mit 50 mM EDTA (pH 7,5)

gewaschen und anschließend so in derselben Lösung resuspendiert, so dass die Zellen eine

OD600 von 10-12 aufwiesen. Von der Lösung wurden 2 ml kurz auf 42° C vorgewärmt und mit

2 ml einer 2 % „low melting agarose“ versetzt, gemischt und auf Eis zu 100 µl Blöckchen

gegossen. Nachdem diese fest geworden waren, wurden sie über Nacht bei 42° C in 10 ml

Lösung 1 inkubiert (Tabelle 15).

Tabelle 15: Für die Herstellung der Blöckchen verwendete Lösungen


Lösung 1 Proteinase K (0,17 mg/ml), 1% N-Lauroylsarkosine, 0,5 M EDTA pH7,5

Lösung 2 Pronase E (0,03 g/ 15 ml), 1% N-Lauroylsarkosine, 0,5 M EDTA pH7,5

Lösung 3 Trypsin (0,008 g/15 ml), 1% N-Lauroylsarkosine, 0,5 M Tris/HCl pH7,5

Die Lösung wurde am nächsten Morgen entfernt, die Blöckchen wurden mit H2O (sterilem

bidest) gewaschen und erneut über Nacht bei 42°C in Lösung 2 inkubiert. Die Lösung wurde

erneut entfernt, die Blöckchen erneut gewaschen und es folgte ein weiterer Inkubationsschritt

mit Lösung 3 bei 42°C. Zusätzlich wurde die weitere Behandlung der Blöckchen mit Trypsin

getestet. Diese sollte eine saubere Freilegung der Chromosomen von allen Proteinen

gewährleisten. Hierzu wurden die Blöckchen in Lösung 3 bei 42°C inkubiert. Aufbewahrt

wurden die Blöckchen für maximal 3 Wochen in einer 0,5 M EDTA (pH8) Lösung bei 4°C.


SEITE 32

2.3.25 PULSFELD-GELELEKTROPHORESE

Größere DNA Fragmente können in einem normalen Agarosegel nicht mehr aufgetrennt

werden. Um größere Fragmente, bzw. intakte Chromosomen aufzutrennen muss das

angebrachte elektrische Feld in unterschiedlichen Intervallen angebracht werden. Damit werden

die Chromosomen dazu gebracht ihre Richtung durch das Agarosegel häufiger zu ändern.

Kleinere Chromosomen können solchen Richtungswechsel schneller folgen, als größere, so

dass durch Intervalllänge, Richtungswechseln und unterschiedlichen Gelkonzentrationen eine

Trennung der Chromosomen erreicht werden kann.

Ein 0,5%- 0,8% Agarose Gel (Ultra Pure Agarose) wurde mit den Blöckchen beladen, wobei

ein S. cerevisiae Standard mit aufgetragen wurde (Erster Standard: Bio Rad; Zweiter Standard:

Bio Zym). Das Agarose Gel wurde in die PFGE Kammer gespannt, die mit auf 4° C gekühlten,

0,5 % TBE (45 mM Tris-borate pH7,5: 1 mM EDTA pH8,0) Puffer gefüllt wurde. Der Lauf

erfolgte bei 200 Volt, über unterschiedlich langen Zeitintervallen und unterschiedlichen

Pulsbedingungen.

2.3.26 SOUTHERN-BLOT

Der Southern Blot wurde nach der Methode von (Southern 1975) durchgeführt. Dazu wurde

das Gel nach dem Pulsefeld-Gelelektrophorese-Lauf in Ethidiumbromid inkubiert um die

Chromosomen sichtbar zu machen. Außerdem wurde das Gel für 5 Minuten mit UV-Licht

bestrahlt um Brüche in die DNA einzufügen und somit den anschließenden Transfer auf eine

Membran zu erleichtern. Verwendete Lösungen für den Southern-Blot sind in ihrer

Zusammensetzung in Tabelle 16 zusammengefasst.

Tabelle 16: Zusammensetzung der Lösungen für einen Southern-Blot.


Depurinationslösung 0,25 M HCl

Denaturierungslösung 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH

Neutralisierungslösung 1 M Tris-HCl (pH 7,4), 1,5 M NaCl

20 x SSC 3 M NaCl, 300 mM Na-Citrat mit HCl auf pH7

Zur Erhöhung der Transfereffizienz wird daher vor dem Blotten eine partielle Hydrolyse der DNA

durchgeführt (Meinkoth & Wahl 1984). Aus diesem Grund wurde das Gel zweimal zehn Minuten

in 0,25 M HCl inkubiert, was zur Depurinierung der DNA führt. Nach kurzem Waschen des Gels in

H2O wurde dieses 2x 15 min in einer Denaturierungslösung inkubiert, was zu Strangbrüchen an den

depurinierten Positionen führt. Nach einem weiteren kurzen Waschschritt mit H2O wurde das


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Gel für 30 min in einer Neutralisierungslösung inkubiert. Für den Southern Blot wird der

folgende Aufbau (siehe Abbildungen) verwendet. Ein Tisch, wird mit einem dünnen Whatman

Papier bedeckt, so dass die Enden des Whatman Papieres beidseitig in die Becken ragen. In

diese Becken wird 20 x SSC gefüllt. Auf das dünne Whatman Papier wird ein dickeres

Whatman papier gelegt, darauf das Pulsfeld Gel, auf das Gel wird eine Hybond-N Membran

(Amersham) gelegt, gefolgt von 5-6 dicken Whatman Papieren. Auf diese Papiere werden noch

Papierhandtücher gelegt (7-10 cm). Abschließend wird eine Glasplatte oben aufgelegt und mit

zwei Flaschen beladen um einen gleichmäßigen Druck aus zu üben. Durch den entstehenden

vertikalen Flüssigkeitsstrom in Richtung Nylonmembran, wurden die DNA-Fragmente auf die

Membran transferiert. Dies geschah stets ÜN bei RT (Meinkoth & Wahl 1984). Nach einer Nacht

wird der Turm wieder abgebaut, das Gel wird zum nachfärben in ein Ethidiumbromid-Bad

gelegt, die Membran wird links oben die Ecke abgeschnitten und die Taschen dünn mit Bleistift

nachgezeichnet und bei 80°C für zwei Stunden gebacken.

2.3.27 DIG DNA MARKIERUNG

2.3.27.1 „Random primed“ DNA Markierung mit Digoxigenin-dUTP (Roche)

Die zu markierende DNA (10 ng-3 µg) wurde mit autoklaviertem Wasser auf ein

Gesamtvolumen von 15 µl in ein Reaktionsgefäß gebracht werden. Die DNA wird für 10

Minuten auf 90°C erhitzt um die DNA zu denaturieren und schnell danach in einem Eisbad

abgekühlt. Auf Eis werden die in Tabelle 17 aufgeführten Reagenzien zu der denaturierten

DNA pipettiert, gemischt und kurz abzentrifugiert.

Tabelle 17: Reagenzien für „Random-primed“ DNA Markierung mit DIG-dUTP

Reagenzien Volumen

Hexanucleotide Mix (10xkonz) 2 µl

DIG DNA labeling Mix (10xkonz) 2 µl

Klenow Enzym 1 µl

Um eine gute Markierung zu gewährleisten, werden die Proben mit den Reagenzien über Nacht

inkubiert. Die Reaktion wird mit 2 µl 0,2 M EDTA pH 8,0 gestoppt. Anschließend werden die

Proben gereinigt, wie in 2.3.28 beschrieben.

2.3.27.2 PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche)

Um bei Southern-Blots spezifische Basensequenzen nachzuweisen, wurden DIG-markierte

DNA-Sonden nach der Methode von (Lion & Haas 1990) synthetisiert. Dazu wurde eine PCR


SEITE 34

durchgeführt bei der neben „normalen“ dNTPs auch DIG-markierte dNTPs zum Einsatz kamen

(Tabelle 18).

Tabelle 18: Zusammensetzung des für das Markieren verwendeter DIG-dNTP-Mixes.


DIG-dNTP-

Mix

4 mM dNTPs (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0,65 mM

dTTP, 0,35 mM DIG-11-dUTP, pH 7,5)

Sowohl markierte, als auch die unmarkierten Nukleotide werden während der PCR-Reaktion

statistisch von der Taq-Polymerase in die Amplifikate eingebaut. Die Reaktion wurde dabei mit

einem Standard-PCR-Temperaturprofil durchgeführt.

Zur Kontrolle wurden die PCR-Produkte in einem 2%-igem (w/v) LMP-Agarosegel

elektrophoretisch getrennt. Aufgrund der DIG-Markierung kommt es zur Retardierung der

DNA-Sonden und damit zu verzögerten Laufeigenschaften im Gel.

Zur Isolierung wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht die

entsprechende Bande herausgeschnitten. Der Agaroseblock wurde entweder direkt in die

Hybridisierungslösung eingesetzt oder bei – 20° C gelagert.

2.3.28 REINIGUNG DER DIG- MARKIERTEN SONDEN

Die Reaktionen werden mit der Zugabe von 4 µl einer 0,2 M EDTA pH8,0 gestoppt. Nach der

Zugabe von 5 µl 4 M LiCl und 150µl EtOH (absolut, kalt) wurde das Gemisch für mindestens 2

Stunden bei -80° C inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (13.000 rpm, 10 min) wurde

das Pellet mit kaltem 70% Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde in der

Speedvac getrocknet und danach in 50 µl sterilem Wasser resuspendiert. Die Lagerung erfolgte

bei -20° C.

2.3.29 HYBRIDISIERUNG

Die Membran wurde in entsprechende Streifen geschnitten und in Inkubationsröhrchen (Schott)

gelegt. Die Membran wurde mit Hybridisierungspuffer überschichten und 2 Stunden bei 68° C

prähybridisieren (Tabelle 19).

Tabelle 19: Zusammensetzung der Puffer die zur Hybridisierung verwendet wurden.


20 x SSC-Puffer 3 M NaCl, 300 mM Na-Citrat, mit HCl auf pH 7,0

Hybridisierungslösung 5 x SSC, 0,1% (w/v) NLS, 0,02 % (w/v) SDS, 2 % (w/v)

Blocksolution, angesetzt mit DEPC-H2O


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high salt-Puffer 2 x SSC, 0,1 % (w/v) SDS

low salt-Puffer 0,1 x SSC, 0,1 % (w/v) SDS

Die Sonde in Hybridisierungspuffer lösen und 10 Minuten bei 90° C erhitzen. Die

Prähybrisierungslösung abgießen und die Sonde auf die Membran geben. Über Nacht bei 68° C

Hybridisieren. Die Sonde wird nach dem Verwenden aufgefangen und bei –20°C aufbewahrt.

Die Membran wird nach der Hybridisierung für 10 Minuten bei Raumtemperatur in einem

„High-Salt-Puffer“ gewaschen. Danach wird die Membran für zweimal 15 Minuten bei 68° C

in einem „Low-Salt-Puffer“ gewaschen. Weiter wird sie eine Minute im Puffer 1 (Tabelle 20)

in einer Wanne gewaschen, danach 30 Minuten in einem 1:10 verdünnten Puffer 2 (10x

Blocking-Reagenz) bevor sie dann in einer Folie eingeschweißt für 30-60 Minuten im Puffer 2

(Verdünnung wie oben), der Anti-Digoxigenin-AP-Konjugat-Fab-Fragmente (Roche) enthält,

inkubiert wird.

Tabelle 20: Zusammensetzung der Puffer, die zur Hybridisierung verwendet wurden.


Maleinsäurepuffer

(Puffer1) 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5

Waschpuffer Maleinsäurepuffer mit 0,3% (v/v) Tween 20

Blockpuffer (Puffer2) Maleinsäurepuffer mit 1% (w/v) Blocksolution

Reaktionspuffer

(Puffer3)

100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2 x 6 H20, pH

9,5

Substratlösung 0,1 % (v/v) CSPD in Reaktionslösung

Die Membran wird zweimal 15 Minuten bei Raumtemperatur mit dem Waschpuffer gewaschen

und zwei Minuten mit Puffer 3 inkubiert, bevor sie mit Puffer 3 und CSPD (Roche) für fünf

Minuten in einer Folie im Dunkeln inkubiert wird. Die Membran wird nur kurz in Puffer 3

gewaschen und dann ohne Flüssigkeit in eine neue Folie eingeschweißt und für 10 Minuten bei

37° C inkubiert. Die Membran wird in eine neue Folie gelegt und der Film aufgelegt. Je nach

Stärke des Signals werden 30 min bis zu 3 Stunden exponiert.

2.3.30 HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN NACH DER ROEDEL-METHODE

Für diese Methode (Jendretzki et al. 2009) werden 5 ml Flüssigmedium aus einer

Übernachtkultur auf eine OD600 von 0,2 angeimpft. Die Anzucht erfolgte bis zu einer OD600 von

1,0. Es wurde 1 ml einer solchen Kultur in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß überführt und für 3 min


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bei 4000 rpm in einer „Biofuge pico“-Zentrifuge (Heraeus) zentrifugiert. Das Pellet wurde in

500 μl Roedel- Mix resuspendiert (Tabelle 21).

Tabelle 21: Zusammensetzung vom Roedel-Mix


Roedel Mix 0,25 N NaOH, 100 mM PMSF, 100 mM Na-

Orthovanadat, 140 mM β- Mercaptoethanol

Es folgte ein Inkubationsschritt von 10 min auf Eis. Durch Zugabe von 100 μl 78%iger TCA-

Lösung (Endkonzentration: 37%) wurden die Proteine gefällt. Ein weiteres Mal wurden die

Proben für 10 min auf Eis inkubiert und anschließend für 10 min bei 4° C und 13.000 rpm in

einer.“Mikro 22R“- Zentrifuge (Hettich, Tuttlingen) zentrifugiert. Das Pellet wurde mit -20° C-

kaltem Aceton (100%) gewaschen und daraufhin für 10 min bei 4° C und 13.000 rpm

zentrifugiert. Der Überstand wurde mit der Pipette abgenommen und das Pellet für 1 min bei

55° C auf einem. Thermomixer comfort“ (Eppendorf) getrocknet. Im Anschluss daran wurden

zu dem Pellet 32 μl 1x Proben-Puffer hinzugegeben und für 3 min bei 95° C gekocht (Tabelle

22).

Tabelle 22: Zusammensetzung des verwendeten Lauf- und Probenpuffers.


Probenpuffer 60 mM Tris/HCl pH 8, 10 % Glycerin, 2 % SDS, 0,005 %

Bromphenolblau

Laufpuffer (1x) 25mM Tris, 192 mM Glycin, 0,5 % SDS, 0,9 mM EDTA

Zu den Proben wurden vor dem Auftragen auf das Gel 8 μl 5x Proben-Puffer gegeben. Um die

Bildung von Proteinaggregaten zu verhindern, wurden zu dem 1x Proben-Puffer 10 % DTT (1

M) zugegeben. Die Durchführung mit dem 1x Lauf-Puffer 10 % DTT erfolgte wie oben

beschrieben.

2.3.31 WESTERN-BLOT-ANALYSE ZUM SPEZIFISCHEN NACHWEIS VON PROTEINEN

Die gängige Methode um Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufzutrennen ist die von

(Sharpio et al. 1967) etablierten Elektrophorese mit Natrium Dodecylsulfat (Natrium engl.:

Sodium). Die Anwesenheit der anionischen Detergenz SDS in der Probe führt dazu, dass die

individuelle Ladung der Proteine maskiert wird. Des Weiteren werden strukturgebende H+-

Brückenbindungen, die zwischen oder innerhalb der Aminosäureketten vorhanden sind,

gespalten. Durch die Einstellung reduzierender Bedingungen, z.B. durch Anwesenheit von

DTT oder β-Mercaptoethanol, werden bestehende intra- und intermolekulare Disulfidbrücken


SEITE 37

gespalten, das Protein entfaltet sich, was zum Verlust der Quartär-, Tertiär- und

Sekundärstruktur führt und das SDS bindet an die Aminosäuren. Es kommt zur Bildung von

anionischen Micellen, welche eine konstante Ladung besitzen, die proportional zur Masse ist

und es ermöglicht, dass Proteine im Spannungsfeld nach ihrer Masse aufgetrennt werden. In

der Praxis ist es so, dass die Proben mittels Polyacrylamidgelen getrennt werden. Durch die Co-

Polymerisation von Acrylamid und N,N‟-Methylenbisacrylamid als Cross-linking-Reagenz

kommt es zur Porenbildung. Die Porengröße kann reproduzierbar kontrolliert werden durch

Einstellung der Totalacrylamidkonzentration T und der Menge an quervernetzendem

Bisacrylamid C (Hjerten 1962). Bei der Polymerisationsreaktion dienen APS und TEMED als

Katalysatoren. APS bildet im Wasser SO4-Radikale, die mit Acrylamid reagieren. Das

entstandene Acrylamidradikal kann mit weiteren Acrylamidmolekülen, Monomeren, sowie

Polymeren reagieren. TEMED wiederum erleichtert die Radikalbildung des APS und stellt

dabei selbst ein stabileres Radikal dar. Die in der Roedel-Methode vorbereiteten Proben werden

nach dem Denaturierungsschritt durch Hitze auf ein SDS-Gel aufgetragen. Das Sammelgel des

SDS-Gels wies eine Acrylamid-Konzentration von 1,8 % auf und das Trenngel von 10%.

(Tabelle 24) Die Auftrennung der Proteine erfolgte bei 130 V fur 1,5-2,5 h. Als

Größenstandard wurde ein „Page Ruler Prestained Protein Ladder“ (Fermentas) verwendet.

Tabelle 23: Pipettierschema für die Herstellung eines SDS Gels.

Pipettierschema

Substanz Trenngel Sammelgel

40% Acrylamid 1530 μl 197 μl

1% Bisacrylamid 290 μl 187,5 μl

2 M Tris-HCl pH 8,7 585 μl

250 mM Tris-HCl pH 6,8 750 μl

20% SDS 19,5 μl 15 μl

H2O 1075 μl 350 μl

Bei der Methode des Western- bzw. Protein-Blottings kommt es nach einer elektrophoretischen

Trennung eines Proteingemisches im SDS-Gel zu einem Semi-Dry-Verfahren, in dem die

Proteine auf eine Membran transferiert und immobilisiert werden. Das Blotten erfolgt dabei

senkrecht zur elektrophoretischen Trennrichtung, damit das Trennmuster der Proteine erhalten

bleibt. Vor der Durchführung des Transfers wurden sechs auf Gelgröße zugeschnittene

Whatman-Papiere, sowie die Nitrozellulosemembran für 5 min in Transferpuffer inkubiert. Der

Blot wurde so aufgebaut, dass sich zwischen der Anode und Katode drei inkubierte Whatman-

Papiere, die „Protran“-Nitrozellulose Transfer Membran, das SDS-Gel und wieder drei

Whatman-Papiere befanden. In einer .semi-dry“-Kammer (BioRad, München) wurden die


SEITE 38

zuvor im SDS-Gel aufgetrennten Proteine auf eine mit Blotpuffer benetzte „Nitrocellulose

Transfer Membrane“ für 50 min bei 20 V übertragen. Das hierzu notwendige „Gel Blotting

Papier“ sowie das Gel wurden vor dem Blotvorgang ebenfalls mit Blotpuffer benetzt (Tabelle

24).

Tabelle 24: Zusammensetzung von Blot-Puffer und TBS-Tween.


Blotpuffer 25 mM Tris/HCl, 150 mM Glycin, 20 % Methanol, 0,1 % SDS

TBS-Tween 20 mM Tris/HCl pH7,6, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20

Nach diesem Übertragungsvorgang der Proteine auf die Nitrozellulose-Membran wurde letztere

zunächst mit TBS-Tween gewaschen und daraufhin für 1,5 h bei Raumtemperatur mit 5%iger

Milchpulver- Lösung (in TBS-Tween) geblockt. Die Membran wurde anschließend für 2 h

unter ständigem Schütteln bei Raumtemperatur mit dem primären Antikörper inkubiert. Als

primärer Antikörper diente ein polyklonales Antikörpergemisch aus Kaninchen gegen die

Phosphofructokinase aus S. cerevisiae. Dieses wurde in 10 ml 1%iger Milchpulverlösung

1:5000 verdünnt. Im Anschluss folgten Waschschritte (8x 5 min) mit TBS-Tween, um

überschüssige, nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Der sekundäre Anti-Kaninchen-

Antikörper (IRDye 700DX Conjugated Donkey Anti- Rabbit IgG) wurde in 10 ml 1%iger

Milchpulverlösung 1:10000 verdünnt. In dieser Lösung wurde die Membran für weitere 1,5 h

bei Raumtemperatur inkubiert. Abschließend wurde die Membran 6 Mal für 5 min mit TBS-

Tween gewaschen und die immungefärbten Proteinbanden wurden mit Hilfe des „Odyssey“-

Fluoreszenzscanners visualisiert.

2.3.32 GRAD OECHSLE

Oechsle ist eine Maßeinheit für das Mostgewicht. Das Mostgewicht ist ein Grad für die im

Most gelösten Stoffe, vornehmlich Zucker. Mit der Bestimmung des Mostgewichtes kann

ebenfalls angegeben werden, wie viel Alkohol maximal gebildet werden kann. So ergibt ein

Most mit 80° Oechsle bei einer vollständigen Vergärung einen Wein der in einem Liter 84 g

reinen Ethanol enthält, was 10,6% Vol entspricht. Gemessen wurden die °Oechsle mit einem

Refraktometer.

2.3.33 PHOSPHAT-PUFFER

Kaliumphosphat-Puffer wurde als 1 M Stammlösung angesetzt. Dazu wurden 1 M Lösungen

von K2HPO4 und KH2PO4 hergestellt und durch Mischen der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Zur


SEITE 39

Herstellung von 50mM Phosphat-Puffer wurde entsprechend mit Wasser verdünnt. Zur

Herstellung von Testlösungen für die Enzymmessungen wurden die jeweiligen Zusätze aus

Stammlösungen beigegeben.

2.3.34 HERSTELLUNG VON ROHEXTRAKTEN

Zur Herstellung von Rohextrakten zur Messung der spezifischen Enzymaktivitäten der

Glykolyseenzyme wurden aus Kulturen zum gewünschten Zeitpunkt je nach Zelldichte 5-10 ml

entnommen. Die Zellen wurden gesammelt, zweimal mit sterilem Wasser gewaschen und mit

Kalium-Phosphat-Puffer bei 4° C (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0) gewaschen. Dem

Zellsediment wurden 500µl Glasperlen (Ø 0,25-0,5 mm) und 500 µl kalter Phosphat-Puffer

zugegeben. Der Zellaufschluss geschah bei 4° C für 7 min (IKA Vibrax-VXR). Anschließend

wurde nochmals 500µl Phosphat-Puffer (50 mM) zugegeben und der Überstand in Eppendorf-

Gefäße überführt und die Zelltrümmer bei 4° C und 13000 rpm für 10 min durch Zentrifugation

(MIKRO 22R Firma Hettich Zentrifugen) entfernt. Der Überstand (="Rohextrakt") wurde in

ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und während der Enzymmessungen auf Eis gelagert.

2.3.35 PROTEINBESTIMMUNG

Der Proteingehalt der Rohextrakte wurde mit der Micro-Biuret-Methode bestimmt. Von jeder

Probe erfolgte eine Doppelbestimmung, der Leerwert wurde mit einer Dreifachbestimmung

festgelegt. Je 50 µl der Rohextrakte bzw. 50 µl Kaliumphosphatpuffer (Leerwert) wurden mit

950 µl Wasser auf ein Volumen von 1 ml aufgefüllt. Zu jedem Ansatz wurde 0,5 ml

Biuretlösung (10 N NaOH; 1% CuSO4) zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 10-30 min

bei Zimmertemperatur erfolgte die Messung der Extinktion bei 290 nm (DU 800

Spectrophotometer der Firma Beckman Coulter) in Quarzküvetten. Zuvor wurde eine

Standardkurve mit Rinderserumalbumin (BSA) hergestellt.

EichgeradederFaktorinProbe

1000]/[zentrationProteinkon 290

l

ODmlmg

2.3.36 AUFNAHME VON WACHSTUMSKURVEN

Die zu untersuchenden Stämme wurden auf OD600= 0,5 angeimpft und bei 30°C und 120-

150rpm auf einem Infors-Schüttler inkubiert. Als Kulturgefäße kamen sterile

Erlenmeyerkolben mit Alukappe mit 5-10 fachem Volumen der Kulturmenge zum Einsatz. Die

Entnahme von Kultursuspension erfolgte mit sterilen Glaspipetten. Die Zellmasse wurde


SEITE 40

indirekt über die Messung der OD600 (DU800 Spectrophotometer, Beckman Coulter, Fullerton,

USA) durch Herstellen geeigneter Verdünnungen (1/1 bis 1/20) mit H2O ermittelt.

2.3.36.1 Wachstumsrate µ

Die Wachstumsrate µ ist ein Maß für die Geschwindigkeit des Zellwachstums und wurde

ermittelt aus der Gleichung:

3026,2)(

loglog

)(log

loglog

)(

lnln

01

01

01

01

01

01

tt

xx

tte

xx

tt

xxµ . Dabei ist t0 der Zeitpunkt 0, t1 der

beliebig spätere Zeitpunkt 1, x0 die Zellmasse zum Zeitpunkt 0 und x1 die Zellmasse zum

Zeitpunkt 1. Die Einheit der Wachstumsrate ist in h-1

gemessen. Alle in dieser Arbeit

ermittelten Wachstumsraten wurden in der exponentiellen Wachstumsphase ermittelt und

stellen daher die maximale Wachstumsrate µmax dar.

2.3.36.2 Generationszeit g

Die Generationszeit g (Verdopplungszeit) ist die für eine Zellteilung benötigte Zeit. Sie hängt

direkt mit der Wachstumsrate µ zusammen durch: g =

2ln. Die Generationszeit wurde in

Stunden angegeben.

2.3.37 BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITÄTEN DER GLYKOLYSEENZYME

Die Enzymaktivitäten wurden photometrisch bestimmt (DU800 Spectrophotometer, Beckman

Coulter, Fullerton, USA). Die zu untersuchende Reaktion wurde an einen durch NAD- oder

NADP-abhängige Dehydrogenasen katalysierten Schritt gekoppelt. Der Verbrauch oder die

Bildung von Reduktionsäquivalenten wurde durch die Messung der Extinktionsänderung bei

340nm verfolgt, die dem Substratverbrauch proportional ist. Aus der Extinktionsänderung

wurde der Substratumsatz errechnet. Alle Substanzen und Hilfsenzyme wurden in optimalen

Konzentrationen eingesetzt und wurden von Sigma (Honk-Town, USA) und Roche (Basel)

bezogen. Die Rohextrakte wurden auf Eis gelagert und kurz vor der Messung in den fertigen

Testmix pipettiert und im Photometer während eines 3minütigen Blindlaufs der zur Korrektur

des eigentlichen Substratlaufes diente, auf 30°C erwärmt. Die Reaktion wurde durch Zugabe

des Substrates gestartet. Die Testmixe wurden stets frisch angesetzt durch die Zugabe der

angegebenen Komponenten in den entsprechenden Konzentrationen. Die Ermittlung der

Aktivitäten wurde immer als Doppelbestimmung durchgeführt.


SEITE 41

2.3.37.1 Phosphofructo-Kinase

Der Test wurde nach (Rodicio et al. 2000) durchgeführt. Der Testmix bestand aus ATP (1

mM), ADP (0,3 mM), AMP (0,1 mM), Fru-2,6-P2 (5 µM), MgCl2 (10 mM), NADH (0,2 mM)

DTT (1mM) und den Hilfsenzymen Fructose-1,6-diphosphataldolase (1 U/ml), Glycerin-3-

phosphat-Dehydrogenase (0,5 U/ml) und Triosephosphat-Isomerase (0,5 U/ml) in Phosphat-

Puffer (50 mM). Die Reaktion wurde durch Zugabe von Fructose-6-phosphat

(Endkonzentration im Gemisch 5 mM) gestartet.

2.3.37.2 Phosphoglycerat-Kinase

Der Test wurde nach (Maitra & Lobo 1971) durchgeführt. Der Testmix bestand aus ATP (10

mM), MgCl2 (10 mM), KCl (100 mM), NADH (0,2 mM), Cystein (5 mM) und dem

Hilfsenzym Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (1 U/ml) in Phosphat-Puffer (50

mM). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3-Phosphoglycerat (Endkonzentration im

Gemisch 10 mM) gestartet.

2.3.37.3 Pyruvat-Kinase

Der Test wurde modifiziert nach (Maitra & Lobo 1971) durchgeführt. Der Testmix bestand aus

ADP (0,6 mM), MgCl2 (10 mM), KCl (100 mM), NADH (0,2 mM), Fru-1,6-P2 (1 mM) und

dem Hilfsenzym Laktat-Dehydrogenase (1 U/ml) in Phosphat-Puffer (50 mM). Die Reaktion

wurde durch Zugabe von Phosphoenol-Pyruvat (PEP) (Endkonzentration im Gemisch 10 mM)

gestartet.

2.3.37.4 Bestimmung der Spezifischen Enzymaktivitäten der Glykolyseenzyme

Die spezifischen Enzymaktivitäten wurden aus den Enzymaktivitäten und dem Proteingehalt

der Rohextrakte berechnet. Die Spezifische Aktivität eines Enzyms ist durch die

Enzymeinheiten/mg Protein definiert. Eine Enzymeinheit entspricht der Umsetzung von 1µmol

Substrat/min (=1U). Nach dem Lambert-Beer‟schen Gesetz ( E = cd ) lässt sich der

Substratumsatz aus der Messung der Extinktionsänderung berechnen. Zur Angabe der

spezifischen Aktivität sind die durchgeführten Verdünnungsschritte zu beachten und der

Proteingehalt in mg/ml anzugeben.

Es gilt: Pr

(U/mg)Aktivität eSpezifischVcd

FVE K

ΔE = gemessene Extinktionsänderung (1/min)

ε = molarer Extinktionskoeffizient für NADH bei 340 nm (6,22cm2/µmol)


SEITE 42

d = Schichtdicke (Küvette) (1cm)

c = Proteinkonzentration der Enzymlösung (mg/ml)

VK = Volumen der Küvettenfüllung (ml)

VPr = Volumen der eingesetzten Probe (ml)

F = Verdünnungsfaktor

Bei der Berechnung der spezifischen Enzymaktivität der Phosphofructokinase wurde die

Rechnung noch mal den Faktor 0,5 genommen, dar pro umgesetztem Fructose-1,6-bisphosphat

zwei Moleküle NADH gebildet werden.

2.3.38 FLUORESZENZMIKROSKOPIE UND BILDBEARBEITUNG

Zur mikroskopischen Analyse wurde ein Axioplan2 Mikroskop mit Plan-Apochromat

100x/1,45 NA Oil DIC und Plan-Apochromat 63x/1,4 NA Oil DIC Objektiven (Carl Zeiss Ag,

Feldbach, Schweiz) und entsprechenden Filtern verwendet (Chroma, Rockingham, USA). Als

Lichtquelle für Fluoreszenzaufnahmen diente eine 100 Watt HBO Lampe (OSRAM GmbH,

Augsburg, Deutschland). Der Kameraverschluss wurde durch einen „MAC200 shutter“

(LUDL, Hawthorne, NY, USA) bedient, der wiederum mit einer gekühlten „chargedcoupled

device“ Kamera (CoolSNAP HQ, Photometrics, Tucson, AZ, USA) synchronisiert war. Das

Mikroskop wurde mit der MetaMorph Software (v.6x Molecular Devices Corp.,

Downingtown, PA, USA) bedient. „Out-of-focus“- Schattierungsreferenzen wurden zur

Aufnahme von DIC-Bildern verwendet. Die Bilder wurden zur Dekonvolution mit Huygens

Essential 32 bit (Scientific Volume Imaging, Hilversum, Niederlande) bearbeitet. Die Größe

und Auflösung der Bilder wurde mit COREL Photoshop 12 bearbeitet.

Für die Fluoreszenzmikroskopie wurde das „Axioplan 2 imaging“- System der Firma Zeiss

verwendet. Die Zellen wurden entweder auf einem Objektträger mit Deckglas oder auf einem

Objektträger mit einer mit „Time lapse“-Medium befüllten Ausbuchtung gegeben und

mikroskopiert. Die Bilder wurden mit der „cool-SNAP HQ“-Kamera von Photometrics

aufgenommen und anschließend mit dem Programm „Metamorph“ bearbeitet.

2.3.38.1 Chitinfärbung

Calcofluor White ist ein fluoreszierender Farbstoff der spezifisch in Hefe an Zellwandchitin

bindet (Molano et al. 1980). Es konnte gezeigt werden, dass Calcofluor White an die im

Aufbau befindliche β-verknüpfte Polysacharide wie Chitin und Cellulose durch

Wasserstoffbrückenbindungen und Dipolinteraktionen bindet. Für die spezifische Anfärbung


SEITE 43

des Chitins in Hefezellen wurden 300 µl einer Übernachtkultur mit 20 µl „Fluoreszenz

Brightener“ (2 mg/ml) bei 30° C inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit 100 mM Kalium-

Phosphat-Puffer wurden die Zellen je nach Pelletgröße in 400-600 µl 100 mM Kalium-

Phosphat-Puffer resuspendiert. 2 µl der Zellen wurde fluoreszenzmikroskopisch mit dem

DAPI-Filter betrachtet.

2.3.38.2 Zellkernfärbung

Für die Markierung der Zellkerne mittels des blauen Fluoreszenzfarbstoffes 4,6-Diamidino-2-

phenylindol (DAPI) wurde 1 µl einer 1 mg/ml DAPI Lösung zu 200 µl Zellen gegeben. Die

Inkubation erfolgte für 10-20 Minuten im Dunkeln auf Eis. Anschließend wurden die Zellen

mit 0,25 M Kaliumphosphat Puffer gewaschen. Zur Beobachtung unter dem Fluoreszenz-

mikroskop wurde ein Tropfen von 3-5 µl gefärbter Zellen auf einen Objektträger gegeben und

mit einem Deckgläschen verschlossen, welches mit Fixogum Rubber Cement (Marabu) auf

dem Objektträger fixiert wurde.

2.3.38.3 „Time lapse“-Analysen

Um das Wachstum von Hefezellen zu dokumentieren wurden 2 µl aus einer logarithmisch

wachsenden Kulturen verwendet. Die Zellen wurden auf einen Objektträger mit „Time lapse“-

Medium befüllter Ausbuchtung auf getropft, ein Deckglas aufgelegt und mit „Fixo Gum“

luftdicht verschlossen. Zur Beobachtung eines gesamten Zellzyklus ein beheizbarer

Objektträgertisch verwendet. Dieser hat es ermöglicht, dass die Zellen bei eingestellter

Temperatur (25-30° C) beobachtet werden konnten. Zu definierten Zeitpunkten wurden

Aufnahmen der Zellen erstellt, wodurch sich das Wachstum einer Zelle über einen längeren

Zeitraum verfolgen ließ.

ERGEBNISSE

SEITE 44

3 Ergebnisse

3.1 Morphologische Untersuchungen zur Weinhefe Kloeckera apiculata

Die Weinhefe Kloeckera apiculata ist nicht nur die dominierende Hefe auf Trauben, sie ist

auch in den ersten Tagen der Weingärung die vorherrschende Hefe. Sie wird nach ca. fünf bis

sieben Tagen schließlich von S. cerevisiae verdrängt. Stammspezifische Unterschiede von

Kloeckera apiculata beeinflussen das Fermentationsgeschehen erheblich. So kann diese Hefe

positiv durch die Bildung von Estern die Weinqualität beeinflussen, sie kann aber auch

aufgrund von erhöhter Acetatproduktion zu Fehlgärungen und Gärstockungen führen. Um

stammspezifische Unregelmäßigkeiten auszuschließen, wurde ein Stamm aus der deutschen

Stammsammlung (DSMZ) (DSM2768) verwendet. Dieser sollte zunächst auf seine

Anpassungsfähigkeit an Stressfaktoren untersucht werden, die während der Weingärung auf die

Hefen einwirken.

3.1.1 UNTERSUCHUNGEN ZUM WACHSTUM VON DSM2768

Beide zunächst untersuchten Kloeckera apiculata Stämme aus der Deutschen Stammsammlung

(DSM2768 und DSM70788) wuchsen in Flüssigmedium nicht als Einzelzellen, sondern ließen

eine starke Aggregatbildung erkennen, die optische Dichtemessungen zur Bestimmung der

Zellzahlen verhinderten. Um dieses Problem zu beheben wurde als Erstes auf das Wachstum

von Kloeckera apiculata als Einzelzellen selektioniert, wie in Abbildung 4 dargestellt.

ERGEBNISSE

SEITE 45

Abbildung 4: A) Schema zur Selektion auf Einzelzellen. Zellen aus einer über Nacht gewachsenen Kultur

werden für fünf Stunden stehen gelassen. Aus dem Überstand wird eine neue Über- Nacht- Kultur

angeimpft. B) Mikroskopbilder vom Wachstum der Zellen des DSM2768 Stammes vor (links) und nach

(rechts) der Selektion auf Einzelzellwachstum.

Dazu wurden die Kulturen über 15 Wochen immer wieder in frisches Medium überimpft. Die

gewachsenen Kulturen sedimentierten über einen Zeitraum von fünf Stunden und die noch im

Überstand vorhandenen Zellen wurden in ein neues Medium umgeimpft. Dies führte letztlich

zu Kulturen von Kloeckera apiculata, die als Einzelzellen wuchsen. Nachdem diese

Voraussetzung geschaffen war, wurden die Lebend- und Gesamtzellzahl des K. apiculata-

Stammes DSM2768 bestimmt. Die Gesamtzellzahlbestimmung wurde in einer Thomakammer

ermittelt, während die Lebendzellzahl durch das Ausplattieren von Verdünnungen erfolgte.

Diese Untersuchungen ergaben, dass durchschnittlich 74,2 % (± 0,5%) der auf YEPD

ausplattierten K. apiculata Zellen lebensfähig waren. Außerdem ergab sich eine Zellzahl von

1,15x108 Zellen/ml bei einer OD600 von 1,0. Im Gegensatz dazu bildet die Hefe S. cerevisiae

bei einer OD600 von 1,0 eine Zellzahl von 1x107 Zellen/ml. Mikroskopische Untersuchungen

animpfenaus Überstand

ÜNK ÜNK ÜNK



ÜNK = Übernacht-Kultur von 30 C mit Schütteln

5h 5h 5h

S = Sedimentation der Zellaggregate ohne Schütteln

S S S

A

B

ERGEBNISSE

SEITE 46

zeigten darüber hinaus, dass die Zellen von K. apiculata deutlich kleiner sind, als diejenigen

von S. cerevisiae (Abbildung 5).

Abbildung 5: Größenvergleich von K. apiculata und S. cerevisiae nach Wachstum der Zellen in YEPD bei

30°C.

Die Größe der Kloeckera apiculata Zellen wurde mit Hilfe des Programms Metamorph

berechnet. Dabei wiesen die zitronenförmigen K. apiculata Zellen eine durchschnittliche Größe

von 2,4 x 5,0 µm auf, während die meist ovalen S. cerevisiae Zellen eine Größe von 7,0 x 5,0

µm hatten. Um das Wachstum von K. apiculata genauer zu dokumentieren wurden Aufnahmen

unter dem Mikroskop gemacht, die die Zellen bei einer konstanten Temperatur über mehrere

Stunden hinweg dokumentieren. Das Sprossungsmuster der K. apiculata Zellen ist bipolar,

wobei die neuen Knospen wechselseitig an den Polen der zitronenförmigen Zellen entstehen

(Abbildung 6).

ERGEBNISSE

SEITE 47

Abbildung 6: Zeitraffer-Aufnahmen wachsender K. apiculata-Zellen. Dargestellt ist das Wachstum von

K. apiculata mit Aufnahmen, die im 5-minütigem Abstand über einen Zeitraum von insgesamt 80 Minuten

gemacht wurden. Das Zellwachstum wurde bei einer Temperatur von 30°C dokumentiert.

Um erste Aufschlüsse über die Zellwandzusammensetzung von Kloeckera apiculata zu erhalten,

wurden die Zellen mit „Calcofluor white“ angefärbt. In S. cerevisiae kann damit spezifisch das

Chitin in der Zellwand angefärbt werden, das sich hauptsächlich im Knospenhals und in den

nach der Zellteilung verbleibenden Narben anhäuft (Abbildung 7).

Abbildung 7: Calcofluor white-Färbung von K. apiculata im direkten Vergleich zu S. cerevisiae.

Das Chitin in K. apiculata ist eher verstärkt in den lateralen Zellwänden angehäuft und bleibt

am Knospenhals ausgespart. Für eine genauere Aussage über die Verteilung des Chitins in

K. apiculata sind noch weitergehende Untersuchungen nötig. In einer weiteren Analyse konnte

20 Minuten

40 Minuten

60 Minuten

80 Minuten

5µm

K. apiculata

S. cerevisiaeCCWDIC

5µm

ERGEBNISSE

SEITE 48

mit DAPI (4`,6-Diamidin-2`-phenylindol- dihydrochlorid) die DNA der Zellkerne von

Kloeckera apiculata spezifisch angefärbt werden (Abbildung 8).

Abbildung 8: DAPI-Färbung des Zellkerns in K. apiculata. Pfeile in DIC und DAPI markieren die Lage des

Knospenhalses und weisen auf die Lage des Zellkerns hin.

Die Verteilung der Zellkerne auf Mutter- und Tochterzelle in der Weinhefe Kloeckera

apiculata könnte demnach ähnlich derjenigen von S. cerevisiae verlaufen. Der Zellkern

wandert dort im Verlauf der Cytokinese in Richtung der entstehenden, neuen Knospe. Bei

deren Bildung ist er somit am Knospenhals lokalisiert, bevor die Kerne nach ihrer Teilung

wieder in Richtung der jeweiligen Zellmitte wandern.

Die Temperatur hat einen entscheidenden Einfluss auf das Wachstum von Hefen, wobei

verschiedene Hefearten divergente optimale Wachstumstemperaturen aufweisen. Bei der

Weinbereitung wird außerdem in einigen Fällen vor der eigentlichen Gärung eine

Kaltmazeration durchgeführt. Somit sind Hefen, die bei niedrigeren Temperaturen noch

wachsen können im Vorteil. Daher wurde zunächst das Wachstum von K. apiculata im

Vergleich zu S. cerevisiae bei verschiedenen Temperaturen untersucht (Abbildung 9).

DIC DAPI

5µm

ERGEBNISSE

SEITE 49

Abbildung 9: Wachstumsrate der Hefen S. cerevisiae (HD56-5A) und K. apiculata (DSM2768) in

Abhängigkeit von der Temperatur. Aufgetragen ist die Wachstumsrate µ, die je aus drei unabhängigen

Wachstumskurven bestimmt wurde.

Die Weinhefe Kloeckera apiculata zeigte besonders bei niedrigen Temperaturen ein deutlich

besseres Wachstumsverhalten, als die Hefe Saccharomyces cerevisiae. Bei 25°C betrug die

durchschnittliche Generationszeit der Weinhefe K. apiculata ca. 68,5 (± 3,5) Minuten, während

der von uns verwendete Laborstamm von S. cerevisiae eine Generationszeit von 85 (± 5,5)

Minuten aufwies.

3.1.1 UNTERSUCHUNG GÄRUNGSRELEVANTER STRESSSITUATIONEN

Auch gegenüber einem kurzen Hitzeschock (2h/45°C) erwies sich K. apiculata als sensitiver im

Vergleich zu S. cerevisiae und anderen Hefearten (Abbildung 10).

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

15 20 25 30 32 34 37

Wa

ch

stu

msr

ate

[µ

]

Temperatur [in C]

DSM2768

HD56-5A

ERGEBNISSE

SEITE 50

Abbildung 10: Wachstum verschiedener Hefen nachdem sie für zwei Stunden einem Hitzeschock bei 45°C

ausgesetzt wurden. Verwendete Stämme: K. apiculata: DSM2768, S. cerevisiae: HD56-5A, K. marxianus,

DSM5420 und K. lactis: CBS2359.

Die Weinhefe Kloeckera apiculata zeigt als einzige untersuchte Hefe eine deutliche Sensitivität

gegenüber einer kurzzeitig erhöhten Wachstumstemperatur, während bei anderen untersuchten

Hefen, wie S. cerevisiae, K. marxianus und K. lactis keine nennenswerte Wachstumshemmung

beobachtet wurde.

Aufgrund der Vielzahl von Hefearten, die sich vor allem in den ersten Tagen der Gärung noch

im Most befinden, gelangen verschiedene sekundäre Metabolite ins Medium. Somit sind die

Hefen ständig wechselnden Nährstoffangeboten und auch Stresssituationen ausgeliefert, auf die

sie reagieren müssen. Deshalb wurde im Folgenden die Stresstoleranz von K. apiculata genauer

untersucht. Der noch hohe Gehalt an Zucker im Most wird während der Fermentation

zunehmend durch steigende Konzentrationen von Ethanol ersetzt. Daher wurde die postulierte

Alkoholsensitivität von Kloeckera apiculata, die eine Wachstumshemmung bewirken soll,

näher untersucht. Um das Wachstum des K. apiculata Stammes unter möglichst Most-

ähnlichen Bedingungen zu verfolgen, wurden diese Versuche in Medien durchgeführt, die

einen ähnlich hohen Zuckergehalt aufwiesen. In einem typischen Erntejahr haben die Moste

einen durchschnittlichen Wert von 70-90° Oechsle, was etwa 1,07-1,09 kg/l

Zuckerkonzentration entspricht. Deshalb wurden hier synthetisches Medium und Traubensaft

mit Glucose und Fructose (im Verhältnis 1:1) auf 90° Oechsle angereichert und die

Wachstumsfähigkeit der Hefen bei unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen bestimmt

(Abbildung 11).

Kontrolle bei 30°C

S. cerevisiae

K. apiculata

K. marxianus

K. lactis

10-1 10-2 10-3OD600=0,110-1 10-2 10-3OD600=0,1

2h, 45°C Inkubation 30°C

ERGEBNISSE

SEITE 51

Abbildung 11:Wachstum von Kloeckera apiculata (DSM2768 [rot] und DSM70788 [grün]) im Vergleich zu

S. cerevisiae (HHD1 [blau]) unter Most-ähnlichen Bedingungen. A) SC Medium mit Glucose (Glc) und

Fructose (Frc) wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen an Ethanol versetzt. B) Wachstum über 5

Tage in SC Medium (wie A) mit 1 % Ethanol. C) Traubensaft mit Glc und Frc angereichert mit

verschiedenen Ethanol Konzentrationen. D) Wachstum über 5 Tage in Traubensaft (wie C) mit Zusatz von

1 % Ethanol. Bei konstant niedrigen Ethanolkonzentrationen zeigte K. apiculata unter mostähnlichen

Bedingungen über mehrere Tage ein konstantes Wachstum. A,C) Die Zellen wurden mit einer OD600 von

0,5 angeimpft und 24 h bei 30°C mit den angegebenen Ethanolkonzentrationen inkubiert. Die erreichte

OD600 ist auf der Ordinate angegeben. B,D) Zellen wurden mit einer OD600 von 0,15 angeimpft und für 5

Tage bei 30°C unter schütteln inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die OD600 gemessen.

Die beiden K. apiculata-Stämme zeigen unter diesen Bedingungen eine erhöhte Sensitivität

gegenüber Ethanol im Vergleich zu dem diploiden S. cerevisiae-Kontrollstamm. In dem mit

Zucker angereichertem Traubensaft wachsen die K. apiculata-Stämme in Gegenwart von 1%

Ethanol deutlich besser, als im vergleichbaren synthetischen Medium. Tatsächlich wuchs

K. apiculata hier ähnlich gut, wie S. cerevisiae. In Wachstumsanalysen mit niedrigeren

Zuckergehalten (2% Glucose) zeigte K. apiculata ebenfalls eine eingeschränkte Toleranz

gegenüber Ethanol, mit deutlich schlechterem Wachstum bei steigenden Alkoholgehalten als

S. cerevisiae. Wie in Abbildung 12 dargestellt, wächst K. apiculata auch auf Medium mit

Ethanol als einziger Kohlenstoffquelle deutlich schlechter als S. cerevisiae.

A

B

C

D

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 3 5 7

OD

60

0

Ethanol [in%]

HHD1 DSM2768 DSM70788

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0 3 5 7

OD

60

0

Ethanol [in%]


0.1

1

10

0 1 2 5OD

600

Tage


0 1 2 50.1

1

10

100

0 1 2 5

OD

60

0

Tage


0 1 2 5

ERGEBNISSE

SEITE 52

Abbildung 12: Wachstum verschiedener Hefestämme mit Ethanol als Kohlenstoffquelle. Übernacht-

Kulturen der Hefen K. apiculata (DSM2768) und S. cerevisiae (HHD1), wurden auf eine OD600=0,1

eingestellt und das Wachstum bei verschiedenen Ethanolkonzentrationen getestet. Ebenfalls getestet wurde

das Wachstum der Stämme, wenn nur Ethanol als Kohlenstoffquelle angeboten wurde. Die Inkubation

erfolgte über 3 Tage bei 30°C.

Auf einem Medium mit 2% Glucose und unterschiedlichen Konzentrationen von Ethanol

wuchs K. apiculata dagegen deutlich schlechter als S. cerevisiae, obwohl hier höhere

Ethanolkonzentrationen toleriert wurden, als in Abwesenheit von Glucose.

Ethanolkonzentrationen zwischen 4,5-6,0% führten anders als bei S. cerevisiae zu einer

deutlichen Wachstumshemmung bei K. apiculata.

YEPD YEP

DSM2768

HHD1

YEP 1,5% EthanolYEPD 1,5% Ethanol

DSM2768

HHD1

DSM2768

HHD1

YEPD 3% Ethanol YEP 3% Ethanol

YEP 4,5% EthanolYEPD 4,5% Ethanol

DSM2768

HHD1

OD600

=0,1

10 -1 10 -2 10 -3 OD600

=0,1

10 -1 10 -2 10 -3

ERGEBNISSE

SEITE 53

Auch niedrige Zuckerkonzentrationen, wie sie am Ende der Weingärung auftreten, bedingen

einen Nährstoffstress für Hefen. Hierzu wurden die Hefen für acht Stunden in Medium ohne

Kohlenstoffquelle inkubiert und ihre Fähigkeit zu überleben ermittelt (Abbildung 13).

Abbildung 13: Wachstum verschiedener Hefen unter Glucose-Stress. Dazu wurden die Hefen über acht

Stunden in Medium ohne Glucose inkubiert ihr Wachstum wurde danach auf SC Medium mit 2% Glucose

beobachtet. Die Inkubation erfolgte bei 30°C über 2 Tage.

Der verwendete K. apiculata-Stamm zeigt unter diesen Bedingungen eine deutlich schlechtere

Lebensfähigkeit, als der mit 2% Glucose angezogene Kontrollstamm. Die anderen untersuchten

Hefestämme werden durch die Glucose-Limitierung nicht signifikant beeinflusst.

In der weiter fortschreitenden Gärung und der damit verbundenen Produktion von Biomasse

können Hefen durch von oxidativen Stress am Wachstum gehindert werden. Um die

Sensitivität der Hefen gegenüber oxidativem Stress zu untersuchen wurde Wasserstoffperoxid

(H2O2) in einem Agardiffusionstest verwendet (Abbildung 14).

K. apiculata ohne Stress

S. cerevisiae

K. marxianus

K. lactis

K. apiculata

OD600= 0,1 10 –1 10 –2 10 –3

ERGEBNISSE

SEITE 54

Abbildung 14: Wirkung von Wasserstoffperoxid (H2O2) auf das Wachstum von verschiedenen Hefen. Um

die Sensitivität gegenüber einer 30% H2O2-Lösung zu testen wurden 200µl einer Flüssigkultur (OD600=1)

auf YEPD ausplattiert. Aufgebrachte, sterile Filterplättchen wurden mit 10µl einer 33% H2O2-Lösung

betropft. Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 30°C.

Die Weinhefe K. apiculata zeigte hier eine deutlich höhere Resistenz gegenüber oxidativem

Stress als etwa S. cerevisiae oder K. lactis. Dies gilt auch für ein Wildtyp-Isolat von

K. apiculata (Stamm 98J). Auffällig war auch, dass K. apiculata einen zweiten Hemmhof

ausbildet, der darauf schließen lässt, dass sich die Zellen an den oxidativen Stress anpassen

können. Diese zweite Hemmhofbildung konnte ausschließlich bei den Kloeckera apiculata

Stämmen beobachtet werden.

3.2 Genetische Charakterisierung, Genomsequenzierung und Annotation der

proteinkodierenden Gene des K. apiculata Stammes DSM2768

Aufgrund ihrer praktischen Bedeutung in der Weingärung wurde zur Physiologie der Weinhefe

Kloeckera apiculata deutlich mehr veröffentlicht, als zu ihrer genetischen Ausstattung. Diese

Lücke sollte durch die im folgenden Abschnitt beschriebenen Experimente geschlossen

werden.

3.2.1 UNTERSUCHUNGEN DES K. APICULATA-STAMMS DSM2768 MIT HILFE DER PULSFELD-

GELELEKTROPHORESE

In früheren Arbeiten wurden für verschiedene Stämme von K. apiculata Stämme

unterschiedliche Chromosomenzahlen gefunden (Esteve-Zarzoso et al. 2001, Versavaud et al.

1995). Daher sollte zunächst die Chromosomenanzahl des hier verwendeten Typstamms

DSM2768 mit Hilfe der Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) bestimmt werden, in der die

Chromosomen nach ihrer Größe in einem ständig die Richtung wechselnden elektrischen Feld

DSM2768 98J.

S. cerevisiae K. marxianus K. lactis Kloeckera apiculata

2,3 (1,6) cm 2,1 (1,4) cm3,2 cm 2 cm 3,2 cm

CBS2359DSM5420HHD1

ERGEBNISSE

SEITE 55

wandern (Abbildung 15). Als Größenstandard dienten die Chromosomen des S. cerevisiae

Stammes (HHD1).

Abbildung 15: Trennung der Chromosomen im PFGE von S. cerevisiae (HHD1) und K. apiculata

(DSM2768). A) Als Größenstandard dienten die Chromosomen des diploiden S. cerevisiae-Stammes HHD1.

B) Ermittelte Größen der K. apiculata Chromosomen. Die Nummern der Chromosomen von S. cerevisiae

sind in schwarz, diejenigen von K. apiculata sind rot beschriftet. C): Tabelle mit der Angabe der

K. apiculata Chromosomen und ihrer anhand des S. cerevisiae-Standards ermittelten ungefähren Größe.

Aus diesen Untersuchungen kann geschlossen werden, dass der K. apiculata-Stamm DSM2768

einen Satz von sieben Chromosomen enthält. Die Ermittlung der Chromosomengrößen im

Vergleich zum S. cerevisiae-Standard ergab eine Gesamtgenomgröße von etwa 9,35 Mb.

3.2.2 SOUTHERN HYBRIDISIERUNG

Bei der Genomsequenzierung (3.2.4) konnten verschiedene Gene und mögliche

Centromersequenzen identifiziert werden, die im Folgenden als Sonden für Southern-

Hybridisierungen mit den in der PFGE aufgetrennten Chromosomen verwendet wurden. Damit

befinden sich die in Abbildung 16 (A-F) dargestellten Sequenzen auf den in Abbildung 16

(Tabelle G) angegebenen Chromosomen. Unter der Voraussetzung, dass bei der Assemblierung

X (0,75)

XIV (0,785)

XI (0,68)

I (0,15)

VI (2,19)

II (0,68)

XII (2,2)

IV (1,6) V (1,59)

VII (2,7)

III (1,0)IV (1,04)

III (0,375)

IX (0,45)

I (0,225)

VI (0,295)

V, VIII

(0,61; 0,555)

XV, VII

(1,09)

XVI, XIII

(0,95;0,92)

Chromosomen K. apiculata

abgeschätzeChromosomengröße

[in Mb]

I 0.15

II 0.68

III 1.0

IV 1.04

V 1.59

VI 2.19

VII 2.7

Summe 9.35

K. apiculata

Chromosomen

S. cerevisiae

Chromosomen

A B

C

XII

IV

XV, VII,

XIIXVIXIII

II

X

XI

V

2,2

1,6

1,09

0,9450,915

0,8150,7850,75

0,68

0,61

VI

IX

0,555

0,45

III

I

0,375

0,2950,225

Chromo

somen #

Größe in

[Mb]

S. cerevisiae

Chromosomen

VIII

XIV

1,078

ERGEBNISSE

SEITE 56

der Contigs keine Fehler aufgetreten sind, können damit auch diese den entsprechenden

Chromosomen zugeordnet werden.

Nach der Auftrennung der Chromosomen von K. apiculata in der PFGE (3.2.1) sollten im

weiteren Verlauf die isolierten Gene, Chromosomen zugeordnet werden. Die Southern

Hybridisierung ermöglicht eine solche Zuordnung der bereits isolierten Gene zu bestimmten

Chromosomen. So konnten mit selbst hergestellten DIG markierten Sonden, gegen Gene aus

K. apiculata, bestimmten Chromosomen spezifisch zugeordnet werden.

Abbildung 16: Mit DIG markierten Sonden nachgewiesene Lokalisation von K. apiculata Genen. A)

Nachweis der Lokalisation von einem möglichen K. apiculata CEN10 auf Chromosom III oder IV. B)

Nachweis der Lokalisation von einem möglichen Centromer CEN403 von K. apiculata auf Chromosom VI.

C) Nachweis der Lokalisation von dem K. apiculata Gen HIS3 auf Chromosom VI. D) Nachweis der

Lokalisation von dem K. apiculata Gen KaPFK1 auf Chromosom III oder IV. E) Nachweis der Lokalisation

von dem K. apiculata Gen KaPFK2 auf Chromosom VII. F) Nachweis der Lokalisation von dem

IV

III

KaCEN10

PFGE Southern

Hybridisierung

VI

KaCEN403

PFGE Southern

Hybridisierung

IV

III

KaPFK1

PFGE Southern

Hybridisierung

KaPFK2

VII

PFGE Southern

Hybridisierung

A B C

A

D E F KaGPM1

VI

PFGE Southern

Hybridisierung

VII

KaHIS3

PFGE Southern

Hybridisierung

G

Chromosom Gene Contig Nummer

VI

GPM1 31 CEN403 403

III oder IV PFK1 5

CEN10 10

ERGEBNISSE

SEITE 57

K. apiculata Gen: GPM1 auf Chromosom VI. G) Tabelle mit der Zuordnung der Gene zu dem

entsprechenden Chromosom und Contig aus der Genomsequenz (Anhang, 8.2).

Die Southern Hybridisierung ermöglicht eine Zuordnung der bereits isolierten Gene zu

bestimmten Genen. So konnten mit selbst hergestellten DIG markierten Gene KaPFK1 und

KaPFK2 bestimmten Chromosomen spezifisch zugeordnet werden. Nach der Southern

Hybridisierung würde sich das KaPFK1 Gen auf Chromosom drei oder vier befinden, während

das KaPFK2 Gen auf dem Chromosom sieben lokalisiert wäre. Das Gen PFK1 konnte auf dem

Contig5 lokalisiert werden, während das PFK2 Gen auf dem Contig24 lokalisiert ist. Des

Weiteren konnten das Gen HIS3 dem Chromosom sieben und das Gen GPM1 dem Chromosom

sechs zugeordnet werden. Das Gen HIS3 ist laut Annotation auf dem Contig72 lokalisiert und

das Gen GPM1 auf dem Contig31. Neben den einzelnen Genen gelang auch die Hybridisierung

von zwei mit DIG markierten potentiellen Centromeren aus K. apiculata. So konnte das CEN10

dem Chromosom drei oder vier und das CEN403 dem Chromosom sechs zugeordnet werden.

3.2.3 UNTERSUCHUNGEN ZUM DNA-GEHALT DES K. APICULATA-STAMMES DSM2768

Bei S. cerevisiae-Stämmen, die in der Weingärung eingesetzt werden, kann neben diploiden

Stämmen häufig eine Tetra- oder auch eine Aneuploidie beobachtet werden (M. Grossmann,

pers. Mitteilung). Mit einer DNA-Fluoreszenzfärbung und einer anschließenden Untersuchung

in einem FACS-Gerät („Fluorescence Activated Cell Sorting“), sollte daher versucht werden

Aussagen über den DNA-Gehalt und die Ploidität von K. apiculata zu erhalten. Dazu wurde

K. apiculata parallel zu anderen Hefen einer FACS-Analyse unterzogen, in der die DNA

spezifisch mit einem Farbstoff angefärbt und die Emission der Fluoreszenz an Einzelzellen

gemessen wurde. Zunächst wurden die beiden Typstämme von K. apiculata DSM2768 und

DSM70788 untersucht (Abbildung 17).

Beide K. apiculata Stämme zeigten eine unterschiedliche Verteilung der Maxima in ihrer

Häufigkeitsverteilung jedoch lagen sie bei einer gleichen Signalintensität und damit bei einer

korrelierenden Menge an DNA. Um eine Aussage zur Ploidität der K. apiculata-Stämme zu

erhalten, sollte das Profil mit demjenigen von Stämmen mit bekannter Ploidie verglichen

werden.

ERGEBNISSE

SEITE 58

Abbildung 17: A) FACS-Analyse der beiden Typstämme von K. apiculata: DSM2768 und DSM70788. B)

FACS Analyse von K. apiculata (DSM2768), einem haploiden (CBS2359) und einem diploiden K. lactis

Stamm (KHO80). C) FACS Analyse von K. apiculata (DSM2768) und dem diploiden, prototrophen

S. cerevisiae Stamm (HHD1). Aufgetragen sind die Anzahl der Zellen, die mit einer bestimmten

Signalstärke die Fluoreszenz emittieren. Der K. apiculata Stamm DSM2768 ist in allen Abbildung grün

dargestellt und korreliert aufgrund seiner Maxima der Signalstärken mit dem diploiden S. cerevisiae-

Stamm HHD1.

Zunächst wurde K. apiculata mit K. lactis-Stämmen verglichen, da bei diesen, im Gegensatz zu

S. cerevisiae, das Genom im Laufe der Evolution nicht dupliziert wurde (Abbildung 17).

Der Vergleich des K. apiculata Stammes mit einem haploiden und einem diploiden K. lactis

Stamm zeigt, dass das Profil von K. apiculata weder mit dem DNA-Gehalt des haploiden

K. lactis-Stammes übereinstimmt, noch mit dem des diploiden Stammes von K. lactis. Zur

C

100

101

102

103

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

FITC-A

An

za

hl

DSM2768

DSM70788

100

101

102

103

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

FITC-A

An

zahl

HHD1DSM2768

100

101

102

103

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

FITC-AA

nzahl

DSM2768

KHO80 CBS2359

A B

ERGEBNISSE

SEITE 59

weiteren Untersuchung der Ploidität von K. apiculata wurden deshalb auch S. cerevisiae

herangezogen (Abbildung 17 ).

Das DNA-Profil des K. apiculata-Stammes stimmt hier mit dem des diploiden S. cerevisiae-

Stammes überein. Um dieses Ergebnis zu untermauern, wurden nochmals ein haploider und ein

diploider S. cerevisiae-Stamm im Vergleich zu K. apiculata untersucht (Abbildung 18).

Abbildung 18: FACS-Analyse von K. apiculata (DSM2768) im Vergleich zu einem haploiden (HD56-5A) und

einem diploiden (DHD5) Stamm von S. cerevisiae.

Das erste Maximum entpricht in diesen FACS-Analysen einer geringeren Signalstärke von

haploiden Hefezellen (HD56-5A) mit einfachem Chromosomensatz, das zweite Maximum

dagegen entsteht aufgrund einer höheren Signalstärke und entspricht Hefen mit einem

doppelten DNA-Gehalt. Diese Hefen befinden sich in der G2-Phase bzw. M-Phase des

Zellzyklus und haben ihren Chromosomensatz bereits verdoppelt. Das dritte Maximum sollte

schließlich nur bei diploiden Hefen auftreten, deren DNA-Gehalt in der G2/M-Phase einem

vierfachen Chromosomensatz entspricht. Noch höhere Maxima der Häufigkeitsverteilung

deuten auf Zellen hin, die aneinander hängen und Aggregate bilden. Die Maxima der

Häufigkeitsverteilung im K. apiculata-Stamm zeigen eine höhere Signalintensität im Vergleich

zu dem haploiden S. cerevisiae-Stamm und liegen etwas niedriger als die des diploiden

S. cerevisiae-Stammes. In Verbindung mit der aus den PFGE-Daten ermittelten geringeren

Genomgröße von K. apiculata im Vergleich zu S. cerevisiae legen diese Ergebnisse nahe, dass

der Stamm DSM2768 von K. apiculata diploid ist.

1n 2n 4n

K. apiculata

S. cerevisiae, haploid

S. cerevisiae, diploid

ERGEBNISSE

SEITE 60

3.2.4 SEQUENZIERUNG UND ANNOTATION DES K. APICULATA-GENOMS

In der modernen Molekulargenetik kann aus Genomsequenzen und ihrem Abgleich mit

bestehenden Datenbanken sehr viel über die mögliche Funktion der kodierten Proteine

abgeleitet werden. Eine Sequenzhomologie der abgeleiteten Aminosäuresequenz eines

bestimmten Gens zu bereits charakterisierten Proteinen lässt dabei in erster Näherung auf

ähnliche Funktionen schließen. Damit können z.B. für einen Stoffwechselweg wichtige Gene

identifiziert, mit Hilfe der PCR-Technik amplifiziert und auf ihre Fähigkeit zur heterologen

Komplementation in entsprechenden S. cerevisiae-Mutanten untersucht werden. Eine wichtige

Voraussetzung für die Sequenzierung eines Hefegenoms ist die Bereitstellung ausreichender

Mengen an genomischer DNA. Hierzu wurde in der vorliegenden Arbeit eine Methode

entwickelt um genomische DNA des Typstammes DSM2768 zu isolieren, die zur

Sequenzierung geeignet ist. Diese wurde durch die Firma Microsynth (Balgach, Schweiz) im

Shotgun-Verfahren nach der Pyrosequenziermethode (4.5.4.) sequenziert. Eine erste Übersicht

der für den Typstamm DSM2768 erhaltenen Daten ist in Tabelle 25 zusammengefasst.

Tabelle 25: Übersicht der von der Firma Microsynth (Balgach, Schweiz) erhaltenen Sequenzierungsdaten

für den K. apiculata Typstamm DSM2768.

Beschreibung Datengröße

Anzahl der Einzelsequenzen 734 790

Durchschnittliche Länge der Einzelsequenzen 391 Basen

Gesamtzahl der sequenzierten Basen 287 Mb

Gesamtzahl der erhaltenen Contigs 441

Anzahl der Contigs mit einer Länge > 500 Basen 181

Durchschnittliche Länge der Contigs 48 kb

N50 Contig Größe 120 kb

Größtest Contig 626 kb

Mit der Sequenzierung der genomischen DNA konnten ca. 93% des K. apiculata-Genoms

abgedeckt werden, da die Summe der erhaltenen Contigs eine Länge von ca. 8,7 Mb abdeckt

und aus der PFGE-Analyse eine Genomgröße von etwa 9,35 Mb abgeleitet wurde. Im

Vergleich zu anderen Hefen hat K. apiculata damit ein relativ kleines Genom.

Bezüglich der Kodierung von Proteinen werden von verschiedenen Organismen

unterschiedliche Codons für bestimmte Aminosäuren bevorzugt verwendet, was i.d.R. der

intrazellulären Konzentration der entsprechenden tRNAs entspricht (Clarke 1970, Jiang et al.

2008). Darüber hinaus korreliert der Codongebrauch innerhalb eines Organismus häufig mit der

Expressionsstärke, d.h. mRNAs mit häufig gebrauchten Codons werden besser translatiert,

ERGEBNISSE

SEITE 61

während solche mit einer Anhäufung seltener Codons schlechter translatiert werden (Freire-

Picos et al. 1994). Der Codongebrauch von K. apiculata, wie er aus den voraussichtlich

proteinkodierenden Sequenzen ermittelt wurde, ist in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 26: Codongebrauch von K. apiculata.

Codon AS Häufigkeit

[in %] pro 1000bp

Codon AS

Häufigkeit

[in %] pro 1000bp

GCA A 25 (30) 10,9 (16,3)

AAT N 59 (60) 45,1 (36,2)

GCC A 20,3 (22) 8,8 (12,2)

CCA P 49,9 (41) 16,9 (17,6)

GCG A 3 (11) 1,3 (6,3)

CCC P 5,2 (16) 1,8 (6,9)

GCT A 52 (37) 22,4 (20,1)

CCG P 6 (12) 2,0 (5,4)

TGC C 24 (38) 2,9 (5,0)

CCT P 39 (31) 13,2 (13,4)

TGT C 76 (62) 9,5 (8,1)

CAA Q 85 (68) 30,5 (26,7)

GAC D 27 (35) 16,0 (20,1)

CAG Q 15 (32) 5,4 (12,3)

GAT D 74 (65) 44,6 (37,7)

AGA R 84 (47) 25,6 (21)

GAA E 82 (70) 54,8 (45,4)

AGG R 7 (21) 2,2 (9,6)

GAG E 18 (30) 12,0 (19,5)

CGA R 3 (7) 0,8 (3,2)

TTC F 34 (41) 17,1 (18,3)

CGC R 1 (6) 0,3 (2,7)

TTT F 66 (59) 33,6 (26,8)

CGG R 1 (4) 0,3 (1,9)

GGA G 26 (23) 11,2 (11,2)

CGT R 5 (14) 1,4 (6,3)

GGC G 9 (20) 3,9 (9,8)

AGC S 10 (11) 8,5 (10,1)

GGG G 9 (12) 3,6 (6,2)

AGT S 18 (16) 15,6 (14,6)

GGT G 56 (45) 23,8 (22,5)

TCA S 24 (21) 20,9 (19)

CAC H 34 (36) 6,2 (7,7)

TCC S 12 (16) 10,1 (14.2)

CAT H 66 (64) 11,9 (13,8)

TCG S 4 (10) 3,4 (8,8)

ATA I 32 (28) 24,1 (18,4)

TCT S 32 (26) 27,4 (23,5)

ATC I 21 (26) 16,2 (16,9)

ACA T 34 (31) 18,8 (17,9)

ATT I 47 (46) 35,8 (30,1)

ACC T 21 (21) 11,3 (12,5)

AAA K 63 (58) 55,9 (42,4)

ACG T 5 (14) 2,5 (8,2)

AAG K 37 (42) 33 (30,4)

ACT T 41 (34) 22,3 (20,0)

CTA L 10 (14) 10,0 (13,5)

GTA V 22 (22) 12,0 (12,2)

CTC L 2 (6) 2,0 (5,7)

GTC V 15 (20) 8,0 (11,3)

CTG L 6 (11) 5,7 (10,7)

GTG V 11 (20) 5,9 (10,9)

CTT L 11 (13) 10,8 (12,6)

GTT V 52 (39) 28,2 (21,6)

TTA L 38 (28) 37,4 (26,2)

TGG W 100 (100) 8,4 (10,5)

TTG L 34 (28) 33,7 (26,8)

TAC Y 46 (43) 17,7 (14,5)

ATG M 100 (100) 22,3 (20,8)

TAT Y 54 (57) 20,7 (19,0)

AAC N 41 (40) 31,8 (24,5)

Angegeben ist die Kodierung der Aminosäure (AS) durch die Basentripletts (Codon), die Häufigkeit der

Codons, angegeben in [%], bezogen auf die proteinkodierenden Gene von K. apiculata und die

Häufigkeit des Auftretens des Codons bezogen auf 1000 bp in diesen Sequenzen. Die Werte in

Klammern geben zum Vergleich die entsprechenden Werte von S. cerevisiae an.

ERGEBNISSE

SEITE 62

Generell ist hier zu vermerken, dass der Codongebrauch von K. apiculata sehr ähnlich dem von

S. cerevisiae ist. So wird beispielsweise das GCT-Codon von beiden Hefen bevorzugt für die

Codierung von Alanin verwendet, während GCG kaum benutzt wird. Bezüglich des G/C-

Gehalts liegt das Genom von K. apiculata mit etwa 36% in einem Bereich, der auch für andere

Hefen ermittelt wurde (z.B. S. cerevisiae mit 38%). Anders ausgedrückt liegt hier ein eher A/T-

reiches Genom vor.

Für eine detailliertere Annotation des K. apiculata-Genoms wurden BLAST-Analysen mit den

nicht duplizierten Genomen von K. lactis und A. gossypii, sowie dem in der Evolution

duplizierten S. cerevisiae-Genom durchgeführt. Damit konnten etwa 4.300 offene Leseraster

jeweils mit mindestens einem Homologen in einem der bereits annotierten Hefegenome

zugeordnet werden (8.2). Eine Zusammenfassung der bis hierher gewonnenen Genomdaten ist

in Tabelle 3 wiedergegeben.

Tabelle 27: Vergleich der Genome von S. cerevisiae, K. lactis, A. gossypii und K. apiculata.

Charakteristika S. cerevisiae K. lactis A. gossypii K. apiculata

Genom vollständig

sequenziert

vollständig

sequenziert

vollständig

sequenziert

zu 93%

sequenziert

Genomgröße 12,1 Mb 10,7 Mb 8,7 Mb 9,35 Mb

Zahl

proteinkodierender

Gene

5 844 5 076 4 718 etwa

4 601*

G/C Gehalt [in%] 38,3 38,8 52,0 37,0

Chromosomenzahl 16 6 7 7

Ploidie haploid/diploid haploid haploid diploid

Genomduplikation ja nein nein nein

Homologe

Rekombination

sehr ausgeprägt vorhanden vorhanden noch unbekannt

Die Angaben zur Genomzusammensetzung wurden folgenden Quellen entnommen: S. cerevisiae =SGD

(http://www.yeastgenome.org/); K. lactis =Génolevures Datenbank (http://www.genolevures.org/);

A. gossypii = AGD (http://www.agd.vital-it.ch/index.html); K. apiculata = diese Arbeit. (*) zu

erwartende Zahl von proteinkodierender Gene bezogen auf das gesamte K. apiculata Genom.

3.3 Molekulargenetische Untersuchungen zur Weinhefe Kloeckera apiculata

Zu Beginn dieser Arbeit war eine Genomsequenzierung, wie sie im letzten Kapitel beschrieben

wurde, aus finanziellen Gründen noch nicht durchführbar. Aus diesem Grund sollten zunächst

einige Markergene über klassische molekulargenetische Methoden mit Hilfe einer Genbank

und der Komplementation entsprechender S. cerevisiae-Mutanten isoliert werden. Dazu wurde

ERGEBNISSE

SEITE 63

zunächst die hier entwickelte Methode zur genomischen DNA-Präparation (2.3.20) eingesetzt.

Die genomische DNA wurde im Weiteren mit verschiedenen Restriktionsenzymen

(BamHI/HindIII und EcoRI/PstI) behandelt, um klonierbare Fragmente zu erhalten. Die

Fragmente wurden in zwei S. cerevisiae/E. coli-"Shuttle-Vektoren" (YEp351 bzw. YEp352)

kloniert. Es konnten somit Genbanken mit jeweils etwa 5000 unabhängigen E. coli-Klonen

hergestellt werden. Die Genbanken wurden in Hefestämme mit Defekten in verschiedenen

Biosynthesegenen (ura3, his3, leu2, trp1, leu1) eingebracht und auf entsprechenden

Selektionsmedien plattiert. So konnten letztlich Plasmide mit Fragmenten aus dem Kloeckera-

Genom isoliert werden, die das URA3- bzw. das HIS3-Gen mit ihren flankierenden Bereichen

enthielten.

Nach der Sequenzierung des K. apiculata-Genoms wurden weitere Gene direkt mit Hilfe der

PCR-Technik amplifiziert und in die Hefevektoren kloniert. Der Vergleich der

Aminosäuresequenz der aus K. apiculata isolierten Gene, zu der Aminosäuresequenz von

S. cerevisiae ergab die in Tabelle 28 zusammengefassten Sequenzübereinstimmungen für die

entsprechenden Gene.

Tabelle 28: Aus K. apiculata isolierte Gene und die Identität der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zu

denen der S. cerevisiae-Homologen.

Isolierte

Gene

Identität der Aminosäuresequenz

zu S. cerevisiae [in%]

Identität der Nukleotidsequenz

zu S. cerevisiae [in%]

KaADE2 64 42

KaALD4 50 38

KaALD6 53 31

KaHIS3 51 53

KaLEU2 74 71

KaPFK1 72 72

KaPFK2 60 62

KaTRP1 21 36

KaURA3 74 67

Die Gene wurden mit PCR und folgenden Oligonukleotiden amplifiziert: KaADE2 09.185/09.186;

KaALD4 09.187/09.188; KaALD6 09.09.189/09.190; KaHIS3 09.26/09.27; KaLEU2 09.183/09.184;

KaPFK1 09.195/09.196; KaPFK2 09.197/09.198; KaTRP1 08.317/08.318; KaURA3 07.269/07.270.

Die aus K. apiculata isolierten Gene wurden entweder in die Vektoren YEp351 oder YEp352

kloniert und zur Komplementation der entsprechenden S. cerevisiae-Deletionsmutanten

eingesetzt. In allen Fällen konnte für die aus K. apiculata isolierten Gene eine

Komplementation beobachtet werden (s. z.B. Abbildung 19 ).

ERGEBNISSE

SEITE 64

Abbildung 19: Charakterisierung der mit Hilfe der PCR-Technik isolierten Gene KaADE2 und KaLEU2. A)

PCR Fragmente der aus K. apiculata amplifizierten ADE2 und LEU2 Gene. B) Restriktion der Plasmide mit

den in der Tabelle angegebenen Enzymen. C) Heterologe Komplementation durch KaADE2 (C; pAKL4)

und KaLEU2 (D; pAKL3) in S. cerevisiae- Der Leervektor (YEp352 ohne Insertion von K. apiculata-DNA;

jeweils linkes Bild), sowie diejenigen mit den in Tabelle 4 angegebenen Oligonukleotiden erhaltenen PCR-

Produkten (jeweils rechtes Bild) wurden in die angegebenen S. cerevisiae-Stämme eingebracht und auf

Medium ohne Adenin (KKB2 = ade2::kanMX; Transformationseffizienz: 104 Transformanten/µg/DNA) C)

bzw. ohne Leucin (HD56-5A = leu2-3,112; Transformationseffizienz: 105 Transformanten/µg/DNA D)

ausplattiert. Die Aufnahmen zeigen das Wachstum nach 3 Tagen Inkubation bei 30°C.

Neben den in Abbildung 19 exemplarisch dargestellten Genen, komplementierten auch noch

Plasmide mit KaHIS3, KaURA3 und KaTRP1 die entsprechenden S. cerevisiae-Mutanten.

3.2.5 ANSÄTZE ZUR HERSTELLUNG VON K. APICULATA/E.COLI "SHUTTLE-VEKTOREN"

Zur Herstellung von "Shuttle-Vektoren", die sich sowohl in E. coli als auch in K. apiculata

vermehren lassen, mussten zunächst Elemente gefunden werden, die eine Selektion und eine

Weitergabe der Plasmide während der Zellteilung beider Organismen erlauben. Hierzu wurden

zunächst mögliche Centromersequenzen in der Genomsequenz von K. apiculata identifiziert.

Als Basis hierfür diente eine Konsensus-Sequenz von S. cerevisiae-Centromeren (Abbildung

20).

5 kb

3 kb

YEp352/

KaADE2

YEp352/

KaLEU2KaADE2KaLEU2

2 kb

3 kb

1,5 kb

A B

Kontrolle:

KKB2 & YEp352 KKB2 & KaADE2

C

Kontrolle:

HD56-5A & YEp352 HD56-5A & KaLEU2

D

Konstrukte

Verwendete

Enzyme

Erwartete

Fragmentgrößen

YEp352/

KaADE2 EcoRI / KpnI 2763, 5173

YEp352/

KaLEU2 BamHI/ EcoRV 2879, 4239

ERGEBNISSE

SEITE 65

Abbildung 20: Konsensus-Sequenz der Centromere von S. cerevisiae im Vergleich zu derjenigen von

Drosophila melanogaster (aus:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=mcb&part=A2288&rendertype=figure&id=A2288).

Entsprechend wurde in den erhaltenen Genomsequenzen nach folgender Sequenzabfolge

gesucht: [AG]TCAC[AG]TGN(60,120)TGN(0,15)CCGAAA. Damit konnten fünf mögliche

Centromere in verschiedenen Contigs (CEN10, CEN39, CEN331, CEN403, CEN417) der

K. apiculata-Sequenz identifiziert und mit Hilfe der PCR-Technik amplifiziert werden. Die

Oligonukleotidpaare wurden dabei so gewählt, dass sie zusätzlich 2 kb 5' und 3' der

entsprechenden Sequenzen mit amplifizierten, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass

auch ein K. apiculata spezifische ARS ("autonomously replicating sequence") enthalten ist. Zu

einem späteren Zeitpunkt wurde die Suche nach Cemtromersequenzen wiederholt, die auf

einem Vergleich verschiedener Centromersequenzen des Saccharomyceten-Klans basiert

(Abbildung 21).

Abbildung 21: Konsensus Sequenz der Centromerregion von Hefe des S. cerevisiae-Klans. (Aus Consortium

2000)

Entsprechend wurde in den erhaltenen Genomsequenzen nach folgender Sequenzabfolge

gesucht: CACGTGN(50,200)TTCCGAA. Hier ergab die Suche acht potentielle Centromer-

Sequenzen im K. apiculata-Genom, die in zwei Fällen (Centromersequenzen CEN10, CEN39)

mit denen der ersten Suche übereinstimmtem. Hierbei wurden auch Centromere gefunden die

auf einem Contig lagen (CEN11, CEN330, CEN392). Von den acht identifizierten Centromer-

Sequenzen wurden drei ausgewählt und mit entsprechenden Oligonukleotiden einschließlich

ihrer flankierenden Regionen wie oben beschrieben amplifiziert (CEN40 [10.41/10.42], CEN

ERGEBNISSE

SEITE 66

296 [10.43/10.44], CEN379 [10.45/10.46]). Die PCR-Produkte wurden über den pGEM-T-

mittels A/T Klonierung eingebracht (Robles & Doers 1994) und daraus mit den

Restriktionsendonukleasen SacII und SpeI in den Vektor pBluescript umkloniert. Diese

Konstrukte konnten allerdings im Verlauf dieser Arbeit nicht mehr näher untersucht werden.

Die Centromere aus der ersten Suche wurden zunächst in ein Derivat des Vektors pCXJ22

umkloniert (mit K. lactis-Replikationsursprung und dem ScADE2-Gen), in K. lactis eingebracht

und auf ihre mitotische Stabilität untersucht (Abbildung 22).

Abbildung 22: Konstruktion und mitotische Stabilität von Plasmiden mit möglichen K. apiculata-

Centromersequenzen in dem K. lactis-Stamm OS224 (ade2::loxP). A) Allgemeine Strategie zur Klonierung

möglicher KaCEN-Sequenzen in einen K. lactis Vektor. B) Restriktion der aus S. cerevisiae isolierten und in

E. coli amplifizierten Konstrukte sowie das PCR Produkt zur Deletion der S.c.CEN Sequenz gegen das

ScADE2-Gen. C) Darstellung der über in vivo Rekombination in K. lactis erzeugten Deletion des

ScCEN/ARS.

ScARS/CEN

NruI

ScADE2

pFB32

3kb

4kb

6kb

pFB30

3kb4kb

2kb

1kb

6kb

pFB33

3kb4kb

6kb

pFB34

3kb4kb

2kb

1kb

6kb

pFB31

3kb4kb

2kb

1kb

6kb

PCR Produkt

3kb

1,5kb2kb

1kb

1,6kb

A:

B:

C:

pCXJ225512 bps

NruIBamHIXbaI

PstI

Klori

URA3

ScARS/CENlacZ'

AmpCentromer

Restriktionsschnitt-stellen

KaCEN10 BamHI/PstI

KaCEN39 BamHI/XbaI

KaCEN331 BamHI/PstI

KaCEN403 BamHI/XbaI

KaCEN417 BamHI/PstI

NruI

Klori

URA3

ScARS/CEN

KaCEN

Amp

BamHI

PstI

oder

XbaI

Plasmid Centromer Kontrollrestriktion erwartete Fragmente

pFB30 KaCEN10 HindIII 1134, 2198, 6389

pFB31 KaCEN39 EcoRI 1503, 7611

pFB32 KaCEN331 HindIII 1665, 7449

pFB33 KaCEN403 PvuI 3722, 5615


Klori

URA3

Scars/cen::ScADE2

Amp

KaCEN

ERGEBNISSE

SEITE 67

Dazu wurde die im Vektor enthaltene CEN/ARS-Region aus S. cerevisiae über eine in vivo-

Rekombination durch das ScADE2 Gen ersetzt, das mit Hilfe von PCR und den Primern

09.218/09.219 aus dem Plasmid pKBO2 amplifiziert wurde. Die Plasmide mit den

entsprechenden K. apiculata Centromer Sequenzen wurden mit dem Enzym NruI linearisiert

und zusammen mit dem PCR Produkt, des ScADE2 Gens transformiert. Als Rezipient für die in

vivo-Rekombination wurde der K. lactis-Stammm OS224 verwendet und auf Medium ohne

Uracil und Adenin selektiert. Die positive Integration des PCR Produktes in die Plasmide war

erfolgreich, wenn die Kolonien weiß gefärbt waren. Die weiß gefärbten Kolonien wurden in

YEPD angeimpft und bei 30° C inkubiert. Ein Verlust des Plasmids führt wieder zu roten

Kolonien. Nach einem und nach drei Tagen wurde auf Medium ohne Uracil und mit einer

niedrigen Adeninkonzentration plattiert, um den Plasmidverlust anhand der Verhältnisses von

roten zu weißen Kolonien zu bestimmen (Abbildung 23).

Abbildung 23: Mitotische Stabilität in K. lactis. Die Transformanten wurden nicht-selektiv in YEPD

angezogen und wie in M&M (vgl. 2.3.19) beschrieben plattiert. Angegeben ist der Prozentsatz roter

Kolonien nach 1 bzw. nach 3 Tagen nicht-selektiven Wachstums, als Maß des Plasmidverlusts.

Mit Ausnahme von KaCEN403 vermitteln alle eingebrachten K. apiculata-Sequenzen eine

erhöhte mitotische Stabilität im Vergleich zum Kontrollvektor ohne eine solche Insertion.

Zumindest in der Milchhefe K. lactis scheinen sie also eine Centromerfunktion auszuüben. Zur

Herstellung von E. coli/K. apiculata Vektoren wurden daher die vier identifizierten

Centromerregionen aus K. apiculata in den reinen E. coli-Vektor pUC21 eingebaut, der

keinerlei hefespezifische DNA trägt (Abbildung 24).

15.5

89.3 78.7 87.3

12.8

83.7

84.5

10.7 21.3 12.7

87.2

16.3

1. Tag bezogen auf 100 Kolonien

weiße Kolonien rote Kolonien

6.8

60.438.6 32.3

1.018.6

93.2

39.661.4 67.7

99.081.4

3. Tag bezogen auf 100 Kolonien

weiße Kolonien rote Kolonien

ERGEBNISSE

SEITE 68

Abbildung 24: Amplifikation möglicher Centromer Sequenzen aus K. apiculata. A) PCR Produkt der aus

dem K. apiculata Genom amplifizierten möglichen CEN Sequenzen. B) Schema der Klonierung der

möglichen KaCEN Sequenzen in den pUC21. C) Dargestellt sind die Agarosebilder von den Restriktionen

zur Kontrolle. Sowie in der Tabelle die angegebenen erwarteten Fragmentgrößen und die verwendeten

Enzyme.

Wenn es sich tatsächlich um Centromere von K. apiculata handelt, dann sollten die

entsprechenden Plasmide in dieser Hefe stabil an die Tochterzelle weitergegeben werden. Für

die Selektion in K. apiculata mussten vorher allerdings noch Resistenzkassetten in den Vektor

eingebracht werden, die voraussichtlich in dieser Hefe auch exprimiert werden. Hierzu wurde

zunächst eine kanMX-Kassette verwendet, die unter der Kontrolle des TEF2-Promotors aus

Ashbya gossypii steht und in verschiedenen Hefen verwendet werden kann. Mit entsprechenden

Plasmiden konnten keine stabilen K. apiculata-Transformanten erhalten werden. Deshalb

wurde die kanMX-Kassette, mit den Primern 09.220/09.221, unter die Kontrolle eines

K. apiculata-eigenen Promotors (derjenigen des KaGPM1-Gens, das für ein Glykolyseenzym

mit erwarteter starker Expression kodiert) zu stellen (Abbildung 25). Ein entsprechendes

Konstrukt mit dem KaGPM1-Promotor wurde auch für die ClonNAT-Resistenzkassette erstellt

(verwendete Primer: 09.225/09.226). Für die KaGPM1-Klonierung wurden die Primer

(09.193/09.194) so gewählt, dass sie im Promotorbereich etwa 1000 bp vor dem ATG und ca.

200 bp nach dem Translations-Stopp-Codon des Gens mit amplifizierten. Das PCR Produkt

wurde zunächst in den Vektor YEp352 kloniert (pFB42). Nach einer in vivo-Rekombination in

S. cerevisiae und Selektion auf G418-haltigem Medium wurde das KaGPM1p-kanMX-

Konstrukt pFB44 erhalten. Die Selektion der in vivo Rekombination erfolgte auf SC-ura G418

EcoRISmaIXmaI

PstI

BamHIPvuI

XbaI

lacZ''

K.a. Centromer

'lacZ

amp

B

25 26 28 2927

3kb

1kb

5kb Plasmid Centromer Kontrollrestriktion erwartete Fragmente

pFB25 KaCEN10 EcoRI 1486. 5917

pFB26 KaCEN39 EcoRI 1518. 5263

pFB27 KaCEN331 PvuI 1401. 5967



Ka

CEN10

Ka

CEN39

Ka

CEN331

Ka

CEN403

Ka

CEN417

3kb

2kb

5kb

A

C

pFB

EcoRI

PvuI

ERGEBNISSE

SEITE 69

Medium. Durch Umklonierung mit StuI und SacI in die pUC21/KaCEN-Vektoren wurden die

Plasmide pFB45-49 erhalten.

Abbildung 25: Konstruktion von E. coli/K. apiculata „Shuttle-Vektoren". A) Dargestellt ist das Schema zur

in vivo-Rekombination. Die Integration der KaGPM1pKanMX-Kassette in den Vektor pFB42. In der

rechten Abbildungen sind die verwendeten PCR-Fragmente abgebildet. Hierzu wurden 5µl des PCR-

Produktes aufgetragen, von dem 20µl für die in vivo Rekombination verwendet wurden. B) Restriktion zur

Kontrolle der durch in vivo Rekombination in S. cerevisiae entstandenen Plasmide pFB43 und pFB44 mit

integrierten KaGPM1pKanMX Kassette. C) Klonierung der KaGPM1pKanMX Kassette in den Vektor

pUC21 mit den KaCEN Vektoren. Rechts: Restriktion der Plasmide mit den in der Tabelle angegebenen,

erwarteten Fragmentgrößen.

Um eine noch stärkere Genexpression zu gewährleisten, wurde auch das TEF2-Gen aus

K. apiculata kloniert und die proteinkodierende Sequenz analog zum oben beschriebenen

Vorgehen durch das KanMX-Gen ersetzt.

KanMX KaGPM1t

KaGPM1

KaGPM1pPCR:

KaGPM1pClonNAT

1kb

0,5kb

PCR:

KaGPM1pKanMX

1kb

0,5kb

A B

3kb

4kb A: pFB43:GPM1pKanMX

B: pFB44:GPM1pClonNAT

A

Plasmid

Restriktions-

enzym

erwartete Frag-

mentgrößen

pFB43 BglI 3212, 3613

pFB44 PvuI 3225, 3391

B

C p

F

B

45

p

F

B

46

p

F

B

48

3 kb

6 kb

1,5 kb

2 kb

p

F

B

47

p

F

B

49

3 kb

6 kb

1,5 kb

2 kb

BamHI

PvuI

SalI

EcoRIEcoRI

BamHI

KaGPM1t

KanMX

Ka Centromer

ampKaGPM1p

PvuIPvuI

Plasmid Centromer Restriktionsenzym

erwartete

Fragmentgrößen

pFB45 KaCEN10 BamHI 4261, 5455




pFB49 KaCEN417 PvuI 1301. 2247. 3726

ERGEBNISSE

SEITE 70

3.2.6 TRANSFORMATION VON K. APICULATA

Um Plasmide in K. apiculata Zellen einzubringen wurden verschiedenen

Transformationsmethoden getestet. Die Sphäroblasten Transformation (vgl. 2.3.7) und die

Lithiumacetat Transformation (vgl. 2.3.8) brachten keine Ergebnisse. Mit der Freeze- (vgl.

2.3.4 und 2.3.5) und der Elektroporations-Methode (vgl. 2.3.6) konnten Kolonien auf selektiven

Platten erhalten werden. Die Verwendung der ClonNAT-Resistenzkassette war nicht

erfolgreich, da auch auf den Kontrollplatten Wachstum zu beobachten war. Unter Verwendung

der KanMX- Resistenzkassette konnten erst nach einer Inkubation von 4-5 Tagen einzelne

Kolonien auf YEPD G418 beobachtet werden. Die erhaltenen Kolonien wurden erneut auf ein

Selektivmedium ausgestrichen und mussten 48 Stunden inkubiert werden, bevor erneutes

Wachstum beobachtet werden konnte. Wie in Abbildung 26 zeigten die isolierten Plasmide ein

abweichendes Restriktionsmuster vom Ausgangsplasmid.

Abbildung 26:Überprüfung der aus K. apiculata isolierten Plasmide. A) Restriktion einiger der aus

K. apiculata isolierten Plasmide mit der Angabe der erwarteten Fragmente der eingesetzten Plasmide. B)

Restriktion zur Kontrolle von vier Kolonien, die aus einer Hefeplasmidisolierung aus K. apiculata

stammten.

A

B

Konstrukte

Verwendete

Enzyme

Erwartete Fragment-

größen [in kb]

pFB45 BamHI 3157, 5889

pFB46 BamHI 1685, 6739

pFB47 BamHI 3157, 5854

pFB48 BamHI 1685, 6962

pFB49 BamHI 3157, 4117

ERGEBNISSE

SEITE 71

Um die in den Plasmiden enthaltene KanMX-Kassette nachweisen zu können, wurde eine PCR

mit Primern durchgeführt, die innerhalb dieser Kassette binden und herauslesend ein Produkt

ergeben sollten (Abbildung 27).

Abbildung 27: Strategie zur Kontrolle der Transformanten aus K. apiculata. A) Schema der Überprüfung

der KanMX-Resistenzkassette mit PCR unter Verwendung der angegebenen Primer. B) PCR zur

Überprüfung der KanMX-Resistenzkassette mit der positiven Kontrolle des Plasmides (pFB43).

Die PCR ergab eine Vielzahl von amplifizierten Fragmenten mit unterschiedlichsten Größen.

Eine re-Transformation von aus K. apiculata Zellen isolierten Plasmiden ergab teilweise einen

Erfolg. Die Transformation der Kloeckera apiculata Plasmide in S. cerevisiae war erfolgreich.

3.2.7 VERSUCHE ZUR GEZIELTEN HOMOLOGEN REKOMBINATION IM K. APICULATA -GENOM

Zusätzlich wurde versucht eine Auxotrophie des K. apiculata Stammes herzustellen. Dazu

wurde versucht eine Deletion und Disruption des KaURA3-Gens zu erhalten. Die Deletion

sollte durch eine Integration der KanMX-Kassette in das KaURA3-Gen erfolgen. Dazu wurden

in einem ersten Ansatz 30mere des KaURA3-Gens mit der KanMX-Kassette aus dem Vektor

pUG6 amplifiziert (Oligonukleotide: 07.370/07.371). Die K. apiculata Zellen wurden mit dem

PCR Produkt transformiert und anschließend auf 5-Fluoroacetat (5-FOA) ausplattiert. Die

positive Selektion mit 5-FOA ermöglicht eine Selektion auf Stämme, die keine

Uracilbiosynthese mehr haben. Das 5-Fluoroacetat wird durch die von URA3 kodierte OMP-

Decarboxylase zu einem toxischen Metaboliten umgesetzt. Diese Art der positiven Selektion

A

B

ERGEBNISSE

SEITE 72

wurde bereits bei verschiedensten Hefen erfolgreich eingesetzt. Es sollten nur solche Hefen

wachsen können, die ein integriertes PCR Produkt im KaURA3-Gen aufwiesen. Bei zahlreichen

Transformationen und Selektionen auf 5-FOA konnte jedoch ein gutes Wachstum von

K. apiculata beobachtet werden. Die gewachsenen Hefen wurden von der Platte abgenommen

und auf neue 5-FOA, SC-ura, YEPD G418 und zur positiv Kontrolle auf SC-leu ausgestrichen.

Es konnte beobachtet werden, dass die Hefen auf SC-leu wuchsen, weiterhin konnte ein

Wachstum auf SC-ura und 5-FOA festgestellt werden. Ein Wachstum auf YEPD G418 blieb

aus. Mikroskopische Kontrollen ergaben, dass es sich weiterhin um K. apiculata Zellen

handelte. Da in dem ersten Versuch eine KanMX-Kassette verwendet wurde, die unter dem

TEF2 Promotor von A. gossypii stand, sollte in einem zweiten Ansatz das K. apiculata URA3-

Gens durch die KaGPM1pKanMX-Kassette deletiert werden (Abbildung 28).

Abbildung 28: Schematische Darstellung zur Deletion des K. apiculata URA3-Gens. A) PCR-Produkte mit

amplifizierten KaGPM1pKanMX-Fragmenten aus pFB43 (Primer 09.237/09.238). B) Schema zur

Integration des PCR-Produktes in das Plasmid pFB50. Die in vivo Rekombination erfolgte in dem

S. cerevisiae Stamm HD56-5A. C) Darstellung der Integration der KaGPM1pKanMX-Kassette in das

KaURA3-Gen. D) Kontrolle des Plasmids pFB56 mit Restriktion zur Kontrolle.

Die KaGPM1pKanMX-Kassette wurde aus dem Plasmid pFB43 mit den Primern 09.237 und

09.238 amplifiziert und zusammen mit dem Plasmid pFB50 (YEp352/ KaURA3) in den

S. cerevisiae Stamm HD56-5A transformiert. Die Plasmide wurden aus den erhaltenen

2kb

1,5kb

PCR

KaGPM1pKanMX

1,7kb

KanMX KaURA3

KaURA3

KaURA3

EcoRV

EcoRV

KaURA3'

URA3 del

GPM1pKanMX

KaURA3'

LEU2

2µm

amp5kb

3kb

pFB56 Restriktion

Konstrukte

Verwendete

Enzyme

Erwartete

Fragmentgrößen [in kb]

pFB56 EcoRV 3455, 5123

A B

C D

ERGEBNISSE

SEITE 73

Transformanten isoliert. Das erhaltene Plasmid wurde mit pFB56 benannt und linearisiert als

Ka ura3ΔKaGPM1pKanMX in K. apiculata Zellen transformiert. Die Zellen wurden auf Sc-

ura, YEPD G418 und 5´FOA Platten selektive ausplattiert und bei 30°C inkubiert. Auch hier

konnte ein Wachstum auf 5-FOA und SC-ura beobachtet werden. Auch die Behandlung der

Kloeckera apiculata Zellen mit dem Mutagen Ethylmethansulfonat (EMS) mit anschließender

Inkubation auf 5-FOA Platten, um eventuell eine Mutanten zu erhalten, die eine Punktmutation

im URA3-Gen trägt, schlugen fehl. Auch hier konnten die K. apiculata Zellen sowohl auf 5-

FOA als auch auf SC-ura wachsen. Neben dem Versuch das K. apiculata Gen zu deletieren,

wurde parallel versucht eine Disruption des genomische KaURA3 vorzunehmen (Abbildung

29).

Abbildung 29: Schematische Darstellung der Disruption des K. apiculata URA3-Gens. Dargestellt ist das

Plasmid pFB3, mit der KanMX-Kassette unter dem A. gossypii TEF2-Promotor. Zur Transformation wurde

das Plasmid über die EcoRV Schnittstelle im KaURA3-Gen linearisiert.

Zur Disruption des K.a.URA3-Gens wurde das Plasmid pFB3 mit EcoRV linearisiert. Die

Schnittstelle des Enzym EcoRV liegt im KaURA3-Gen, so dass eine Homologie zum KaURA3-

Gen von 400 bzw. 600 bp. besteht. Eine Transformation dieses Konstrukts in K. apiculata mit

anschließender Selektion auf 5-FOA und YEPD G418 ergab ein Wachstum auf 5-FOA, jedoch

nicht auf G418.

Genomisches KaURA3

Kaura3-3´ (600bp)pFB3KanMXKaura3-5´ (400bp)

EcoRV

loxPTEFp

kanMX

TEFterm'KaURA3

amp

pFB3

ERGEBNISSE

SEITE 74

Nach einem Abstempeln der 5-FOA Platten auf G418, konnte nach fünf Tagen ein Wachstum

beobachtet werden. Für die gewachsenen Kolonien von K. apiculata konnte in jedem Fall ein

Wachstum auf selektiven Platten, wie YEPD G418, SC-ura, 5-FOA und SC-leu beobachtet

werden. Ein weiterer Ansatz war die Disruption des KaURA3 Gens mit der KaGPM1pKanMX-

Kassette (Abbildung 30).

Abbildung 30: Dargestellt ist das Plasmid pFB57, welches die KaGPM1pKanMX-Kassette enthält. Zur

Transformation wurde das Plasmid linearisiert über die EcoRV-Schnittstelle im KaURA3-Gen.

Eine Transformation mit diesem Konstrukt ergab ein ähnliches Ergebnis, wie mit dem

Disruptionsversuch mit dem Plasmid pFB3.

Um eine eventuelle Integration zu überprüfen wurden die Kolonien zusätzlich mit einer PCR

überprüft. Dazu wurden Primer verwendet (09.80/09.81), die außerhalb der KanMX-Kassette in

dem Bereich binden, in die eine Integration der KanMX-Kassette erfolgen sollte. Die

Integration der KanMX-Kassette würde ein PCR Produkt von 2 kb geben, während die

Amplifikation des Wildtyp KaURA3-Gens eine PCR Größe von knapp 1,3 kb ergibt

(Abbildung 31).

Kaura3-5´ (600bp)Kaura3-5` (400bp) pFB57KaGPM1pKanMX

Genomisches KaURA3

kanMX

KaURA3

ampKaGPM1p

KaGPM1t

pFB57

ERGEBNISSE

SEITE 75

Abbildung 31: Agarosebild zur Überprüfung der versuchten Deletion bzw. Disruption des K. apiculata

URA3-Gens. Dazu wurde genomische DNA aus den gewachsenen Kolonien isoliert und für die PCR mit

Oligonukleotiden 09.80/09.81 eingesetzt.

Die anschließende PCR zur Überprüfung der KanMX-Kassette ergab nur eine Amplifikation

des Wildtyp URA3-Gens aus K. apiculata, jedoch keine Amplifizierung eines URA3-Gens mit

integrierter KanMX-Kassette.

Nachdem es nicht gelungen war eine Auxotrophie in K. apiculata einzuführen, musste die

Plasmidselektion auf einer Resistenzkassette erfolgen.

3.3 Untersuchungen zu ausgewählten Enzymen des Kohlenhydratstoffwechsels in der

Weinhefe Kloeckera apiculata

Die zentralen Schritte der alkoholischen Gärung durch Hefen sind die Aufnahme von Zuckern

in die Zelle, die Reaktionen der Glykolyse mit der im Anschluss stattfindenden

Decarboxylierung des Pyruvats und schließlich die Umsetzung des Pyruvats in Ethanol und

Kohlendioxid. Die Menge Ethanol, die von den Hefezellen produziert wird, wird entscheidend

reguliert durch die Aufnahme der Zucker in die Zelle. Verantwortlich für die Umsetzung der

aufgenommenen Zucker zu Ethanol sind danach die Enzyme der Glykolyse und die sich

anschließenden Reaktionen der Pyruvatdecarboxylase und der Alkohol-Dehydrogenase.

3.3.1 SPEZIFISCHE ENZYMAKTIVITÄT

Um einen ersten Hinweis auf die Aktivität der in der Glykolyse von K. apiculata aktiven

Enzyme zu bekommen wurden einige spezifische Enzymtests durchgeführt. Die Messung der

spezifischen Enzymaktivität von Glykolyseenzymen wurde in Rohextrakten von Kloeckera

apiculata und S. cerevisiae durchgeführt. Dazu wurden drei Enzyme der Glykolyse gewählt,

die an der Regulation des Flusses der Glykolyse maßgeblich beteiligt sind. Die Pyruvatkinase,

die den letzten Schritt der Glykolse katalysiert, wird in ihrer Aktivität stark reguliert. Während

„KaURA3 Disruption“ „KaURA3 Deletion“

WT Banden:

1295 bp

ERGEBNISSE

SEITE 76

der irreversiblen Reaktion wird ATP für den Energiehaushalt der Zelle bereit gestellt. Die

spezifischen Enzymaktivitäten zeigten, dass die K. apiculata-Pyruvatkinase eine etwa halb so

hohe Aktivität, wie des S. cerevisiae-Enzyms aufweist (Tabelle 29).

Tabelle 29: Spezifische Enzymaktivitäten gemessen in Rohextrakten der Wildtyp-Stämme K. apiculata

(DSM2768) und S. cerevisiae (HHD1). N=3

Enzym Spez Aktivität in [U/mg]

K. apiculata S. cerevisiae

Phosphofructokinase (Pfk) 1.1 +/-0.2 0.8 +/- 0.2

Phosphoglyceratkinase (Pgk) 2.5 +/- 1.1 2.3 +/- 0.8

Pyruvatkinase (Pyk) 4.8 +/- 1.2 7.6 +/- 1.4

Ein weiteres wichtiges Enzym, der Glykolyse, ist die Pohosphoglyceratkinase. Dieses Enzym

katalysiert den ersten energiegewinnenden Schritt dieses Weges. Die gemessenen spezifischen

Enzymaktivitäten der untersuchten Glykolyseenzyme in S. cerevisiae und K. apiculata liegen

in einem sehr ähnlichen Bereich. Die Phosphofructokinase, die den ersten irreversiblen Schritt

spezifisch für die Glykolyse katalysiert, steuert den Fluss der Glykolyse und ist damit ein

zentrales Enzym. Die spezifische Aktivität der Phosphofructokinase in K. apiculata war

gegenüber der von S. cerevisiae sogar leicht erhöht. Die Ähnlichkeiten zwischen den für die

Phosphofructokinase kodierenden Genen zwischen S. cerevisiae und K. apiculata ergaben, dass

das PFK1-Gen von K .apiculata eine 72%ige und das PFK2-Gen eine 62% Identität zu den

entsprechenden S. cerevisiae-Genen aufweist.

Auf Ebene der Aminosäuren konnte die Pfk1-Untereinheit von K. apiculata eine 72% und die

Pfk2-Untereinheit eine 60%ige Ähnlichkeit zu den entsprechenden Enzymen von S. cerevisiae

aufweisen. Um die Funktionalität dieser Gene zu überprüfen, wurde das KaPFK1-Gen (Primer:

09.195/09.196) und KaPFK2-Gen (Primer: 09.197/09.198) mit PCR amplifiziert und einzeln in

die 2µm-Vektoren YEp352 bzw. YEp351 kloniert. Es konnte gezeigt werden, dass die

K. apiculata-Gene PFK1 und PFK2 in einem heterologen Stammhintergrund, eines

S. cerevisiae pfk1 pfk2-Stammes, Wachstum auf Glucosemedium vermitteln konnten.

Zusätzlich zu den Messungen der spezifischen Enzymaktivität in Wildtyp-Rohextrakten, wurde

auch die spezifische Aktivität der K. apiculata Enzyme in einem heterologen S. cerevisiae

Stammhintergrund gemessen. Hierzu wurden die bereits für die Komplementation verwendeten

Vektoren verwendet und in einen S. cerevisiae pfk1 pfk2-Deletionsstamm exprimiert

(Abbildung 32).

ERGEBNISSE

SEITE 77

Abbildung 32: Spezifische Enzymaktivität der K. apiculata Phosphofructokinase Untereinheiten kodiert

durch die Gene PFK1 und PFK2. Expression der Gene einzeln und zusammen, heterologe, in dem

S. cerevisiae pfk1 pfk2 Deletions Stamm (AST30). Die Plasmide pFB35 und pFB36 wurden einzeln und

zusammen in den S. cerevisiae Stamm AST30 (pfk1::HIS3 pfk2::URA3) eingebracht und auf Medium ohne

Uracil und/oder Leucin angezogen. Als Kontrolle dienten die Ausgangsvektoren YEp351 und YEp352. N=3

Die einzelnen Produktionen der Phosphofructokinase-Untereinheit aus K. apiculata in einem

S. cerevisiae pfk1 pfk2-Deletions-Stamm zeigt eine geringe Enzymaktivität von 200mU/mg

Protein. Die Produktion beider Untereinheiten der K. apiculata Phosphofructokinase zeigen

eine deutlich höhere spezifische Enzymaktivität von 1U/mg Protein. Die Überproduktion der

beiden Phosphofructokinase-Untereinheiten von K. apiculata haben jedoch eine geringere

spezifische Enzymaktivität im Vergleich zur Überproduktion der beiden Untereinheiten der

S. cerevisiae Phosphofructokinase.

3.3.2 WESTERN BLOT ANALYSE DER KAPFK IN S. CEREVISIAE

Neben den Messungen zur spezifischen Enzymaktivität wurde auch die Proteinexpression der

K. apiculata-Phosphofructokinase in einer Western-Blot Analyse untersucht. Hierzu wurden

die Phosphofructokinase-Gene von K. apiculata erneut heterolog in einem S. cerevisiae

Phosphofructokinase-Deletions-Stammhintergrund exprimiert. Da dieser Stamm selber keine

funktionelle Phosphofructokinase mehr bildet, können die Expressionen der K. apiculata-Gene

nicht durch eventuelle Wechselwirkungen mit der S. cerevisiae Phosphofructokinase

beeinflusst werden. Die Überproduktion der Untereinheiten der K. apiculata Pfk1 und Pfk2 in

U/m

g P

rote

in

0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.8

ERGEBNISSE

SEITE 78

einem S. cerevisiae - Stamm - Hintergrund konnten in einer Western - Analyse mit einem

Antiserum gegen ScPfk, nachgewiesen werden. Die erwartete Größe der Untereinheiten wurde

abgeleitet von der Genomsequenz von K. apiculata und ist in Tabelle 30 zusammengefasst.

Tabelle 30: Aus der Genomsequenz abgeleitete und im Western-Blot ermittelte Molekularmassen für die

Untereinheiten der Phosphofructokinase von S. cerevisiae und K. apiculata.

Stamm abgeleitete

Molekularmassen [in kDa]

apparente

Molekularmassen [in kDa]

K. apiculata α-UE: 86,3

β-UE: 85,9

α-UE: 105

β-UE: 85

S. cerevisiae α-UE: 108,5

β-UE: 100

α-UE: 108

β-UE: 105

Abbildung 33: Western-Analyse der K. apiculata-Phosphofructokinase. Nachweis der Pfk im K. apiculata

Typstamm (DSM2768), im S. cerevisiae Stamm K18 und in der pfk1 pfk2- Doppelmutante von S. cerevisiae,

Stamm AST30, sowie der heterologen Expression der einzelnen (KaPFK1 bzw. KaPFK2) und der beiden

(KaPFK1 und KaPFK2) Gene, die für die Phosphofructokinase-Untereinheiten aus K. apiculata kodieren, in

der pfk1 pfk2- Doppelmutanten von S. cerevisiae (Stamm AST30).

Die erwartete Molekülgröße der Phosphofructokinase war im Fall der K. apiculata α-

Untereinheit, kodiert durch das Gen KaPFK1 größer als berechnet. Dieses Phänomen kann

auch bei S. cerevisiae beobachtet werden, wo die Pfk2-Bande höher läuft als sie von der

Genomsequenz berechnet und abgeleitet worden war (Abbildung 33). Die unterschiedlichen

Mengen der Phosphofructokinase-Untereinheiten in der Western-Blot-Analyse kommen

dadurch zu Stande, dass das polyklonale Antiserum spezifisch gegen die S. cerevisiae

Phosphofructokinase ist. Auch wenn die Identitäten der K. apiculata- und S. cerevisiae-

Phosphofructokinase-Untereinheiten recht hoch sind (um die 70%), bindet dieser Antikörper

jedoch immer besser an die S. cerevisiae Pfk. Diese Tatsache macht eine Quantifizierung der

Expression der K. apiculata-Phosphofructokinase mit der Western-Analyse nicht möglich.

ERGEBNISSE

SEITE 79

3.3.3 ALDEHYD-DEHYDROGENASE UNTERSUCHUNGEN

Die Acetatbildung in S. cerevisiae wird entscheidend durch das Enzym Aldehyd-

Dehydrogenase bedingt. Eine genauere Untersuchung der Aldehyd-Dehydrogenase in

K. apiculata sollte Aufschluss über die Produktionsrate und Aktivität des Enzyms bringen.

Hierzu wurden zwei Gene ALD4 und ALD6, die cytosolisch und mitochondriell für die

Aldehyd-Dehydrogenase in S. cerevisiae kodieren, untersucht. Diesbezüglich wurden aus der

Deletion-Stammsammlung von Euroscarf (Frankfurt) Stämme der Scald4 und Scald6

herangezogen. Da die Einzelmutanten der Aldehyd-Dehydrogenase noch ein Wachstum auf

ethanolhaltigem Medium zeigten, wurden ald4 ald6-Doppeldeletionsstämme in S. cerevisiae

hergestellt. Diese zeigten kein Wachstum mehr auf Medium mit Ethanol. In diesen

Doppeldeletionsstämmen wurde die Aktivität der K. apiculata Aldehyd-Dehydrogenase

untersucht. Die einzelnen Gene ALD4 bzw. ALD6 aus K. apiculata, eingbracht in den ald4 ald6

Doppeldeletionsstamm von S. cerevisiae, ermöglichten wieder ein Wachstum auf

ethanolhaltigem Medium. Die K. apiculata Aldehyd-Dehydrogenase Gene ALD4 und ALD6

komplementieren, heterolog den Phänotypen der S. cerevisiae Mutanten Stammes.

DISKUSSION

SEITE 80

4 Diskussion

In der vorliegenden Arbeit sollte die auf Weintrauben und anderen Früchten dominierende Hefe

K. apiculata bezüglich ihrer Genetik charakterisiert werden. Im Gegensatz zu den bisher

vorliegenden Daten zur Physiologie dieser Hefe im Wein, für die meist Isolate von

Weintrauben eingesetzt wurden, sollte hierfür ein Typstamm verwendet werden. Aufgrund von

Standard Problemen, die nicht für Laboruntersuchungen geeignet sind, mussten zunächst mit

diesem Typstamm morphologische Untersuchungen und die Selektion laborgängiger Varianten

untersucht werden, bevor der Stamm genetisch untersucht werden konnte.

4.1 Morphologische Untersuchungen zur Weinhefe K. apiculata

4.1.1 EIGENSCHAFTEN VON K. APICULATA STAMM DSM2768 BEIM WACHSTUM

Für verschiedene Stämme von H. uvarum, der sexuellen Form von K. apiculata wurden in

früheren Untersuchungen drei verschiedene Formen von Sporen beschrieben. So konnte für

einige Hanseniaspora-Stämme eine hutähnliche Struktur der Ascosporen beobachtet werden

(van Rij 1977). Andererseits wurden auch Ascosporen beschrieben, die wie zwei gleich große

Kugeln geformt waren (Meyer et al. 1978) oder ebenfalls rund, Sporen mit einigen

Auswüchsen (Smith 1984). In späteren Arbeiten wurde jedoch nur noch die Ausbildung von je

zwei Ascosporen mit einer hutähnlichen Struktur beschrieben, wenn die Zellen auf Malzagar

angezogen worden waren (Barnett 2000). Mit den hier verwendeten Typstämmen DSM2768

und DSM70788 konnte auf verschiedenen Sporulationsmedien (Kaliumacetat-Agar, Sherman-

Medium, Malz -Agar) keine Sporenbildung ausgelöst werden. Dies könnte auf das natürliche

Substrat zurückzuführen sein, aus dem diese K. apiculata Stämme isoliert wurden, nämlich aus

Fruchtsaft (Shehata 1960). Auch bei vielen Weinhefestämmen von S. cerevisiae wurde eine

verringerte sexuelle Reproduktion und eine geringe Fähigkeit zur Sporulation festgestellt

(Bakalinsky & Snow 1990, Barre et al. 1993, Guijo et al. 1997, Pérez-Ortín et al. 2002).

Bereits hier kann die jetzt vorliegende Genomsequenz von K. apiculata Aufschluss über die

möglichen Ursachen, im Vergleich zur gut untersuchten sexuellen Fortpflanzung bei

S. cerevisiae, geben. Haploide S. cerevisiae Stämme haben zwei mögliche Paarungstypen, a

und α. Diese sekretieren spezifische Peptid-Pheromone, um die Paarung zweier Zellen mit

entgegengesetztem Paarungstyp einzuleiten (Fraser & Heitman 2003). Transkriptionsfaktoren,

die diese zwei alternativen Allele regulieren, sind im MAT Lokus auf dem Chromosom III in

S. cerevisiae kodiert. Die diploiden S. cerevisiae Zellen können nach der Meiose erneut

DISKUSSION

SEITE 81

sporulieren und zwei a- und zwei α Zellen hervorbringen. Die homothallische Hefe

S. cerevisiae kann zudem ihren Paarungstyp wechseln, was durch die HO-Endonuklease

eingeleitet wird. Es wird vermutet, dass die HO Endonuklease durch horizontalen Gentransfer

in die Hefe gelangte und später in einigen Abstammungslinien verloren ging (Butler et al.

2004, Fabre et al. 2005). Auch in der bisher vorliegenden Genomsequenz von K. apiculata

findet sich weder ein HO-Homologes, noch eine Region, die dem MAT-Locus entsprechen

könnte (Butler et al. 2004). Homologe der bei S. cerevisiae an diesem Locus kodierten Gene

zeigten in K. apiculata nur eine sehr geringe Syntenie und liegen teilweise zudem nicht

vollständig vor. Damit sind die entsprechenden Sequenzen wahrscheinlich nicht an der

sexuellen Fortpflanzung von K. apiculata beteiligt. Allerdings ist hierbei zu bedenken, dass

bisher nur 93% der K. apiculata-Genomsequenz vorliegen, sodass die Existenz eines dem

MAT-Locus homologen Bereiches nicht auszuschließen ist. Darüber hinaus zeigt sich in einem

Vergleich mit dem S. cerevisiae-Genom, dass von 197 Genen, deren Produkte entweder an der

Paarung oder an der Sporulation beteiligt sind, 31 Gene (d.h. 84%) auch Homologe im

K. apiculata-Genom aufweisen (s. Tabelle 34 im Anhang). Zusammen mit den hier vorgelegten

Daten, die auf ein diploides Genom bei dem verwendeten Typstamm von K. apiculata

hindeuten, ist daher zu vermuten, dass die hier getesten Medien für eine Sporulation noch einer

Optimierung bedürfen.

Ein weiteres Problem zu Beginn dieser Arbeit stellte die Neigung des Typstamms DSM2768

dar, Zellaggregate zu bilden. Damit war er zunächst für die üblichen mikrobiologischen

Techniken (wie z.B. die Bestimmung der Zellzahl über OD-Messungen oder der

Lebendzellzahl durch Plattierungen aus Verdünnungsreihen) nicht zugänglich. Im ersten Teil

dieser Arbeit wurden daher zunächst Varianten selektiert, die sich durch Knospung als

Einzelzellen vermehren. Eine Zellaggregation wurde auch für andere K. apiculata-Isolate

bereits beschrieben. So neigt ein Stamm auf Medium mit 20 -50 g/l Glucose zur Flokkulation

(Sosa et al. 2008). Ein solches "Zusammenkleben" von Zellen beruht auf der Bildung

spezifischer Adhesine an der Zelloberfläche der Hefen (Guo et al. 2000, Sheppard et al. 2004,

Verstrepen et al. 2004). Diese vermitteln die asexuelle, Calcium-abhängige, reversible

Adhesion von Zellen (Verstrepen & Klis 2006), die durch die Bindung der Adhesine an

Zellwand-Polysaccharide anderer Zellen zustande kommt (Stratford 1992a, Stratford 1992b).

Die Calciumionen aktivieren hierbei die Adhesine (Miki et al. 1982, Stratford & Carter 1993).

Auch einige Isolate anderer Hefen, wie zum Beispiel Kluyveromyces bulgaricus (al Mahmood

et al. 1991), Kluyveromyces lactis (el Behhari et al. 1998), und S. cerevisiae (Javadekar et al.

2000, Straver et al. 1994) zeigen eine solche Flokkulation, die bei sinkenden

DISKUSSION

SEITE 82

Zuckerkonzentrationen aufgehoben werden kann. Das Zuckersignal wird hauptsächlich über

den RAS/cAMP-Weg vermittelt, der durch Glucose oder Saccharose im Medium aktiviert wird.

Er aktiviert letztlich die Proteinkinase A, die Schlüsselproteine phosphoryliert, die für die

Kontrolle der Flokkulation verantwortlich sind (Gagiano et al. 2002). Homologe sowohl der

RAS-Gene von S. cerevisiae, als auch solche der Gene für die Adenylatzyklase (CYR1), sowie

der Untereinheiten der Proteinkinase A (BCY1, TPK2 und TPK3) finden sich auch im Genom

von K. apiculata.

Da es sich bei dem K. apiculata Stamm DSM2768 um einen eventuell für die Weinindustrie

einsetzenden Stamm handelt, waren zuckerarme Anzuchten als Alternative keine Möglichkeit.

Zudem wird in der Weinindustrie versucht bereits verwendete Weinhefestämme kontrolliert

nach der Gärung zum flokkulieren zu veranlassen (Barre et al. 1993, Govender et al. 2010), um

die spätere Weinfiltration zu erleichtern. In S. cerevisiae kodieren die Gene FLO1, FLO5,

FLO9, FLO10 und FLO11 für an der Flokkulation beteiligte Proteine (Teunissen & Steensma

1995). FLO1, FLO5, FLO9 und FLO10 kodieren dabei für Adhesine, die an andere Zellen

binden und das FLO11-Genprodukt ist für die Adhesion an Substrate verantwortlich (Guo et al.

2000). In der Genomsequenz von K. apiculata finden sich nur Homologe von FLO5 und FLO8,

nicht aber solche der anderen FLO-Gene (Anhang: Tabelle 35). Ob die beiden identifizierten

Gene tatsächlich an der Flokkulation des Typstammes von K. apiculata beteiligt sind, kann erst

abschließend untersucht werden, wenn die Techniken für eine molekulargenetische

Manipulation dieser Hefe bereit stehen.

4.1.2 K. APICULATA UNTER EINFLUSS VON GÄRUNGSRELEVANTEN STRESSSITUATIONEN

Bei der Weingärung üben neben den wechselnden Nährstoffbedingungen auch die

Gärtemperatur und andere Bedingungen im Most, wie beispielsweise die Schwefelung oder die

Kaltmazeration Stress auf die enthaltenen Hefepopulationen aus (Henschke 1993, Pretorius et

al. 1999). Je resistenter also eine Hefeart gegenüber solchen Stressbedingungen ist, umso

länger wird sie den Gärungsverlauf beeinflussen. Besonders bei niedrigen Temperaturen wuchs

der K. apiculata-Stamm DSM2768 deutlich besser als S. cerevisiae. Dies stimmt mit der

Beobachtung überein, dass K. apiculata-Hefen bei Kaltmazerationen, die eine Temperatur von

15°C nicht überschreiten, die dominierende Hefeart darstellen (Zott et al. 2008).

Im Verlauf der Gärung wird zunehmend Ethanol im Most gebildet und die zu Beginn sehr

hohen Zuckerkonzentrationen sinken (Henschke 1993). Unter mostähnlichen Bedingungen

erwies sich der hier verwendete K. apiculata Typstamm als deutlich sensitiver gegenüber

steigenden Ethanolkonzentrationen im Vergleich zu S. cerevisiae. Dies scheint die Vermutung

DISKUSSION

SEITE 83

zu bestätigen, dass sich S. cerevisiae im Verlauf der natürlichen Weingärung als dominierende

Hefe durchsetzt, weil sie deutlich Alkohol-resistenter ist (Fleet 2003, Pretorius 2000).

Allerdings konnte in anderen Untersuchungen für K. apiculata-Reinzuchtstämme noch ein

Wachstum bei einer Ethanolkonzentration von bis zu 5% beobachtet werden (Albergaria et al.

2003). Darüber hinaus wurde zwar in gemischten Gärungen mit S. cerevisiae und K. apiculata

eine geringere Biomasse von K. apiculata als in Reinzuchtkulturen erreicht, jedoch überlebten

diese Hefen länger in der gemischten Gärung als in Reinzuchtkulturen (Mendoza et al. 2007).

Diese Befunde deuten an, dass die wachsende Dominanz von S. cerevisiae im Verlauf der

Weingärung komplexere Ursachen hat und nicht allein auf die unterschiedliche Ethanoltoleranz

Ethanoltoleranz zurückgeführt werden kann.

Tatsächlich sind auch die zellbiologischen Ursachen der Ethanoltoxizität noch nicht vollständig

geklärt. Bezüglich der Weinhefen wird vermutet, dass Ethanol die Struktur der

Zytoplasmamembran verändert und deren Permeabilität erhöht (Boulton et al. 1996, Santos et

al. 2008). Vor allem der durch diese erhöhte Permeabilität verursachte Verlust des

Protonengradienten über die Membran scheint für eine Steigerung des ATP-Verbrauchs

verantwortlich zu sein, der der Zelle Energie entzieht. Darüber hinaus werden die für die

Plasmamembran-ATPase kodierenden Gene (PMA1 und PMA2) in einem Medium mit

erhöhten Ethanolkonzentrationen schlechter exprimiert (Henschke 1993, Monteiro et al. 1994).

Zusammenfassend genommen führt dies zur Entkopplung energieabhängiger Transporter.

Verschiedene Faktoren verstärken noch synergistisch die Ethanolwirkung: hohe

Gärungstemperaturen, Nährstofflimitierung (besonders Reduktion von Sauerstoff, Lipiden und

Magnesium Ionen), metabolische Produkte (andere Alkohole, Ester, organische Säuren) und

auch Fettsäuren (Edwards 1990). Die Hefe K. apiculata ist dafür bekannt, neben Estern auch

höhere Alkohole zu produzieren, die ebenfalls Stress auf S. cerevisiae ausüben (Albergaria et

al. 2003). Allerdings sind die in der Weingärung eingesetzten Stämme stresstoleranter als

andere Hefen (Boulton et al. 1996). Diese Anpassung beinhaltet neben der erhöhten Toleranz

gegenüber Alkohol, auch die Anpassung der Membranfluidität, sowie die Synthese von

detoxifizierenden Enzymen. Insgesamt hängt also die Ethanoltoleranz während der Weingärung

von sehr vielen Faktoren ab und es wird vermutet, dass daran mehr als 250 Genprodukte

beteiligt sind (Boulton et al. 1996, Walker 1998).

Darüber hinaus sind Hefen während der Gärung noch osmotischem Stress, aufgrund des hohen

Zuckergehaltes, und oxidativem Stress, aufgrund vermehrter Biomasse-Bildung, ausgesetzt

(Pretorius 2000). Die hier vorgelegten ersten Untersuchungen deuten an, dass der K. apiculata

Stamm DSM2768 osmoresistenter als S. cerevisiae ist. Zudem scheint eine erhöhte Resistenz

DISKUSSION

SEITE 84

und ein Anpassungsmechanismus an oxidativen Stress vorzuliegen. Beim oxidativem Stress

entstehen reaktive Sauerstoffspezies ("reactive oxygen species", ROS) in den Mitochondrien

als Nebenprodukt der Zellatmung. Zu den Folgen des oxidativen Stresses gehören

Proteinoxidation, Lipidperoxidation und die Schädigung der DNA (Burhans & Weinberger

2007, Doudican et al. 2005). Bei der Untersuchung von 14 verschiedenen in der Weingärung

eingesetzten S. cerevisiae-Stämmen, konnte eine stammspezifische Resistenz der Hefen

gegenüber oxidativem Stress beobachtet werden (Carrasco et al. 2001). Der oxidative Stress

wirkt besonders bei der Anzucht zur Herstellung von Trockenhefen, die unter Zucker-

limitierenden Bedingungen erfolgt, unter denen die Atmungskette ihre höchste Aktivität

erreicht. Um eine gegenüber oxidativem Stress tolerante S. cerevisiae-Weinhefe zu erhalten,

wurde das TRX2-Gen überexprimiert, das für Thioredoxin kodiert und damit eine Abwehr der

Zelle gegenüber oxidativem Stress darstellt (Pérez-Torrado et al. 2009). Neben einem aktiven,

antioxidativen Schutzsystem, welches Radikale und Antioxidantien beseitigt, existiert ein

weiteres, das durch Reparaturmechanismen an der DNA und den geregelten Abbau von

Proteinen die Schäden des oxidativen Stresses minimiert (Doudican et al. 2005).

4.2 Molekulargenetische Untersuchungen zur Weinhefe K. apiculata

Die Weinhefe K. apiculata bringt neben den positiv auf das Weinaroma wirkenden Estern

während der Gärung auch Acetat in den Wein mit ein. Die Produktion beider Stoffgruppen

hängt sehr wesentlich vom verwendeten K. apiculata-Stamm und von den äußeren Einflüssen

ab. Wie die zu diesen Produkten führenden Stoffwechselwege in K. apiculata reguliert werden,

ist noch nicht näher untersucht. Um solche Untersuchungen möglichst effektiv zu gestalten,

wäre die Möglichkeit zur genetischen Manipulation der Hefe sehr hilfreich, weshalb im

Weiteren versucht wurde, ein Transformationssystem für K. apiculata aufzubauen.

4.2.1 EINSATZ VON RESISTENZMARKERN IN DER HEFE K. APICULATA

Das Einbringen von Plasmiden in Hefezellen bedingt zum einen den Einsatz eines

Selektionsmarkers, der in dieser Hefe exprimiert wird, und zum anderen, dass ein

Replikationsursprung für den Zielorganismus in der Plasmidsequenz enthalten ist. Liegt

letzterer nicht vor, so muss die eingebrachte DNA in das Genom integrieren, um stabil vererbt

zu werden.

Zur Selektion wurde zunächst eine Resistenzkassette gegen das Antibiotikum G418 (Geneticin)

verwendet, das auch in eukaryontischen Zellen die Translation hemmt. Das entsprechende

Resistenzgen stammt aus E. coli und konnte, versehen mit in Hefe wirkenden Promotor- und

DISKUSSION

SEITE 85

Terminatorsequenzen, in 12 Nicht-Saccharomyces-Hefen erfolgreich zur Selektion eingesetzt

werden (Wang et al. 2001). Darunter waren Hefen wie Kluyveromyces marxianus und Pichia

pastoris (Das et al. 1984, Scorer et al. 1994). Außer in den Hefen P. angusta und Schiz. pombe

erfolgte dies mit Hilfe des AgTEF2-Promotors, während bei diesen beiden Hefen die KanMX-

Kassette unter die Kontrolle des ScADH1-Promotors gestellt war (Janowicz et al. 1991, Lang-

Hinrichs et al. 1990, Merckelbach et al. 1993). Auch in Kloeckera apiculata wurde daher

zunächst versucht, die übliche KanMX-Kassette (AgTEF2-Promotor) zu verwenden. Zusätzlich

wurde die Resistenzkassette auch unter die Kontrolle des K. apiculata GPM1-Promotors

gestellt. Das GPM1-Gen wird als ein Glykolysegen in S. cerevisiae gut exprimiert, weshalb

auch eine starke Expression des KaGPM1Gens bzw. der neu konstruierten KaGPM1KanMX-

Kassette in K. apiculata zu erwarten war (Rodicio et al. 1993). Tatsächlich wurde diese

Kassette in S. cerevisiae exprimiert, da hier resistente Transformanten erhalten werden konnten

(103 Transformanten/µg/DNA). Für die Expression der KanMX-Kassette unter der Kontrolle

des noch stärkeren K. apiculata-eigenen TEF2-Promotors konnten in dieser Arbeit zwar noch

die Konstrukte erhalten, jedoch nicht mehr in K. apiculata getestet werden. Dies gilt auch für

andere Resistenzkassetten, wie die gegen Hygromycin und Phleomycin, die bereits erfolgreich

in anderen Nicht-Saccharomyces-Hefen verwendet wurden (Gaillardin & Ribet 1987, Glumoff

et al. 1989, Otero & Gaillardin 1996).

4.2.2 VERSUCHE ZUR ISOLIERUNG VON URA3-MUTANTEN

Verschiedene Auxotrophien haben sich in anderen Hefen als schnelle und kostensparende

Methode zur Plasmidselektion erwiesen (Rose & Broach 1991), weshalb auch im K. apiculata

Stamm DSM2768 versucht werden sollte, solche zu erhalten. Erste Versuche der Selektion von

ura3-Mutanten in K. apiculata auf 1mg/ml-FOA-haltigem Medium schlugen fehl, da es sich

vermutlich um einen diploiden Stamm handelt und die Wahrscheinlichkeit, beide Wildtyp-

Allele gleichzeitig zu mutieren verschwindend gering ist. Im Gegensatz dazu konnte in der

Hefe Candida glabrata mit Hilfe einer 5-FOA-Selektion eine ura3-Mutante erzeugt werden

(Kitada et al. 1995). K. apiculata scheint darüber hinaus gegenüber 5FOA resistenter zu sein,

als alle anderen verwendeten Hefen. Daher sollte zunächst ein Allel mit Hilfe einer Deletion

bzw. einer Disruption des K. apiculata URA3-Gens ausgeschaltet werden. Dies scheiterte

daran, dass für keine der oben beschriebenen Resistenzkassetten eine erfolgreiche homologe

Rekombination mit dem K. apiculata-Genom am beabsichtigten Zielort nachgewiesen werden

konnte.

DISKUSSION

SEITE 86

4.2.3 UNTERSUCHUNG ZUR PLOIDITÄT VON K. APICULATA

Mit einer Analyse am FACS können Aussagen über den DNA Gehalt von Zellen gegeben

werden, die wiederum auf die Ploidie der Hefe Rückschlüsse zulassen, sofern eine

Vergleichsprobe mit bekannter Ploidie vorliegt (Niemistö et al. 2007). In der Weingärung

aktive Hefen, die in der Weingärung aktiv sind, sind häufig entweder diploid, aneuploid oder

sogar polyploid (Bakalinsky & Snow 1990, Snow 1983). Der Vergleich der beiden Typstämme

von K. apiculata: DSM2768 und DSM70788 ergab zwar eine unterschiedliche

Häufigkeitsverteilung der Maxima jedoch lagen diese bei einer ähnlichen Signalstärke. Die

Unterschiede der Maxima sind wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass einer der Stämme

entweder in einer anderen Wachstumsphase war oder verstärkt zur Zellaggregation neigt. Als

Vergleichsproben für die FACS-Analyse wurden zunächst ein haploider und ein diploider

K. lactis-Stamm aus einer congenen Serie herangezogen. Die Maxima der

Häufigkeitsverteilung des K. apiculata-Stammes waren in ihrer Signalstärke deutlich höher, als

die des haploiden K. lactis Stammes CBS2359. Dies lässt darauf schließen, dass K. apiculata

ein diploides Genom tragen könnte. Die Untersuchung des diploiden K. lactis-Stamms KHO80

erwies sich als schwierig, da in dieser Hefe die diploide Phase nicht stabil ist, wenn den Hefen

Nährstoffe ausgehen. Entsprechend zeigte der diploide K. lactis-Stamm in seiner

Häufigkeitsverteilung ein dem haploiden Stamm CBS2359 sehr ähnliches Bild. In weiteren

FACS Analysen wurden daher als Vergleich für K. apiculata haploide und diploide Stämme

von S. cerevisiae herangezogen. Hier zeigte sich eine weitgehende Übereinstimmung von

DSM2768 mit diploiden S. cerevisiae-Stämmen. Die Maxima der Häufigkeitsverteilungen von

K. apiculata liegen allerdings bei einer etwas niedrigeren Intensität als die des diploiden

S. cerevisiae-Stammes, was auf einen niedrigeren DNA-Gehalt deutet. Im Vergleich zu einem

haploiden S. cerevisiae-Stamm liegen jedoch die Maxima der Häufigkeitsverteilung bei

K. apiculata bei einer deutlich höheren Intensität, so dass von einem deutlich höheren DNA-

Gehalt bei K. apiculata auszugehen ist. Zusammen mit den Schwierigkeiten der Selektion von

ura3-Mutanten (s.o.) ist also davon auszugehen, dass es sich bei dem K. apiculata-Stamm

DSM2768 um eine diploide Hefe handelt.

4.2.4 CENTROMERISCHE UND ARS ELEMENTE AUS K. APICULATA

Neben den Selektionsmarkern muss für ein funktionierendes Transformationssystem auch ein

Replikationsursprung in die Vektoren eingebracht werden. In S. cerevisiae und einigen anderen

Hefen konnten hefeeigene, natürliche Plasmide mit einer solchen Sequenz isoliert werden, wie

z.B. aus K. lactis, K. waltii, ZygoSaccharomyces bailii (Araki & Oshima 1989, Chen et al.

DISKUSSION

SEITE 87

1992, de Louvencourt et al. 1983). Bisher liegen keinerlei Hinweise vor, dass auch K. apiculata

ein natürliches Plasmid enthält. Das natürliche Plasmid aus S. cerevisiae ist zwar in manchen

Hefen auch heterolog funktionell, in anderen, wie C. albicans und C. glabrata, kann es

allerdings nicht extrachromosomal repliziert werden (Kurtz et al. 1986, Mehra et al. 1992).

Dies gilt ebenso für die hier untersuchten 2µm-Sequenzen aus S. cerevisiae, die anscheinend

keine Replikation in K. apiculata erlauben. Auf der Suche nach Replikationsursprüngen aus

K. apiculata sollten deshalb mögliche Centromere mit ihren flankierenden Bereichen

identifiziert werden, in denen sich bei S. cerevisiae und Yarrowia lipolytica in der Regel auch

ARS-Elemente finden (Fournier et al. 1993, Vernis et al. 2001, Yamashita et al. 1997). Ein

CEN-Plasmid wird in S. cerevisiae relativ stabil an die Tochterzelle weiter gegeben und liegt in

ein bis drei Kopien pro Zelle vor (Dani & Zakian 1983). Da Centromersequenzen sehr

verschieden aufgebaut sind, wurde zum einen eine Consensus-Sequenz der Centromere aus

S. cerevisiae zugrunde gelegt, um in K. apiculata nach entsprechenden Sequenzen zu suchen.

Zum anderen wurde eine Consensus-Sequenz verwendet, die Sequenzvergleichen des gesamten

Saccharomyces-Klans enthielt (Consortium et al. 2009). Um in die Hefe Y. lipolytica, selbst

replizierende Plasmide einzubringen, bedarf es neben einem Replikationsursprung (einem ARS-

Element) auch eines Centromers (Vernis et al. 1997). Die Größe der ARS-Elemente variiert

stark in verschiedenen Hefen, mit 1,2-5,0 kb in K. lactis (Das 1982) und nur 0.5 kb für ein aus

C. glabrata isoliertes ARS-Element (Mehra et al. 1992). Tatsächlich werden in den meisten der

Nicht-Saccharomyces-Hefen ARS-Elemente zur Konstruktion von Vektoren verwendet (Wang

et al. 2001). ARS-Sequenzen wirken seltener als Replikationsursprünge in heterologen

Systemen als diejenigen aus natürlichen Plasmiden. So können ARS-Elemente aus S. cerevisiae

nicht in K. lactis eingesetzt werden (Das 1982). Auch in der vorliegenden Arbeit vermittelten

die Vektoren mit ARS-Elementen von S. cerevisiae, K. lactis und A. gossypii in K. apiculata

keine autonome Replikation. Die DNA-Fragmente mit möglichen Centromersequenzen aus

K. apiculata waren jedoch zur Replikation in S. cerevisiae befähigt und erhöhten die mitotische

Stabilität von Vektoren in K. lactis (mit Ausnahme von CEN403). In der Größenordnung

stimmt die dabei festgestellte Verlustrate in etwa mit dem für C. glabrata ermittelten Wert

überein, wo nach zehn Generationen auf nicht-selektivem Medium noch 93% der Clone ein

entsprechendes Plasmid trugen (Kitada et al. 1996). Die Vermittlung einer Centromerfunktion

in K. lactis und der Replikation in S. cerevisiae durch die K. apiculata-Sequenzen ist nicht

weiter überraschend, da ja die entsprechenden Consensus-Sequenzen als Suchfunktion

eingesetzt wurden. Ob es sich tatsächlich um Centromere von K. apiculata handelt, kann erst

DISKUSSION

SEITE 88

geklärt werden, wenn für diese Hefe ein Selektionsmarker und eine verlässliche

Transformationsmethode zur Verfügung stehen.

4.2.5 TRANSFORMATION VON K. APICULATA

In dieser Arbeit wurden verschiedene Transformationsmethoden und -bedingungen getestet, um

die oben beschriebenen kanMX-Kassetten in K. apiculata einzubringen. Bisher wurde damit

kein K. apiculata/E. coli-"Shuttle-Vector" erhalten, der in beiden Organismen stabil repliziert.

Ob es sich bei den auf G418-Medium erhaltenen Kolonien überhaupt um Transformanten

handelt, war nicht zweifelsfrei nachzuweisen. Während PCR-Reaktionen mit spezifischen

Oligonukleotiden für die Resistenzkassette zwar eine geringe Menge des erwarteten Produktes

erbrachten, konnten nach Plasmidisolierung und anschließender E. coli-Transformation die

ursprünglich eingesetzten Plasmide nicht nachgewiesen werden. Es ist deshalb davon

auszugehen, dass die Resistenzkassette eine illegitime Rekombination in das K. apiculata-

Genom integriert wurde. Eine Analyse des/der Integrationsorte(s) war leider im zeitlichen

Rahmen dieser Arbeit nicht mehr möglich.

Auch bei anderen Nicht-Saccharomyces Hefen ist nicht jede Transformationsmethode

erfolgreich. So konnte, bei 21 verschiedenen Hefen mit Hilfe von Sphäroblasten

Transformation, bei 26 Hefen über die Herstellung von kompetenten Zellen und bei 17 Hefen

durch Elektroporation, externe DNA eingebracht werden (Wang et al. 2001). Die höchste

Effizienz wurde dabei für die Elektroporation beschrieben (Sánchez et al. 1993). Auch für

K. apiculata wurden hier die meisten Klone erhalten, wobei die Transformationsfrequenz von

Versuch zu Versuch stark schwankte. Eine Erklärung für die Schwierigkeiten bei der

Transformation von K. apiculata könnte der Aufbau der Zellwand bieten. In einer

Untersuchung an verschiedenen Hefen, die auch zwei K. apiculata-Stämme beinhaltete, konnte

gezeigt werden, dass die Zellwand von K. apiculata sich in wenigen Komponenten von der

S. cerevisiae Zellwand unterschied (Nguyen et al. 1998). So konnte für die dort untersuchten

K. apiculata Stämme ein geringerer Chitingehalt (mit 0,18-0,47%), als bei einer S. cerevisiae

Zellwand (3,36%) gemessen werden. Bei einer Färbung mit Calcofluor white erschien die

Fluoreszenz in mikroskopischen Aufnahmen bei dem K. apiculata Typstamm DSM2768

vergleichbar mit der bei S. cerevisiae. Allerdings ist dies nur ein indirekter Hinweis und genaue

Chitinbestimmungen konnten im Verlauf der vorliegenden Arbeit nicht mehr vorgenommen

werden.

Einen weiteren Hinweis auf die möglicherweise deutlich unterschiedliche Zusammensetzung

der Zellwand von K. apiculata gibt auch die Genomanalyse. Im Vergleich konnten bei

DISKUSSION

SEITE 89

K. apiculata nur 26% der Gene gefunden werden, die in S. cerevisiae für Zellwandproteine

kodieren. (Anhang: Tabelle 35).

4.3 Physiologische Untersuchungen zur Weinhefe K. apiculata

4.3.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR GLYKOLYSE IN K. APICULATA

Bezüglich der für Glykolyseenzyme kodierenden Gene konnten in der Genomsequenz von

K. apiculata die für jeden einzelnen Schritt kodierenden Homologen identifiziert werden

(Anhang: Tabelle 31). Allerdings scheint hier die Redundanz der Isoenzyme geringer zu sein.

So finden sich z.B. keine Homologen von TDH1 und TDH2. Bei anderen Hefen, wie etwa bei

K. lactis, kann die Glykolyse teilweise durch die Reaktionen des Pentosephosphat-Weges

umgangen werden (Jacoby et al. 1993). Die darin gebildeten Metabolite dienen unter anderem

auch als Substrate für die Synthese von Aromastoffen, wie z.B. Erythrose-4-Phosphat.

Homologe der in S. cerevisiae für Enzyme des Pentosephosphat-Weges kodierenden Gene

finden sich ebenfalls für alle Schritte in K. apiculata (Anhang: Tabelle 31).

Die Glykolyse mit dem weiteren Umsatz des Pyruvats in Ethanol ist der entscheidende

Stoffwechselweg der Gärung. Die Menge des produzierten Ethanols wird jedoch nicht erhöht,

wenn die als "Flaschenhals" bezeichneten Glykolyse-Enzyme (Pfk und Pyk) überproduziert

werden (Schaaff et al. 1989). In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung führten

Modellierungen des Glykolyseflusses zur Hypothese, dass die Zuckeraufnahme über die

Zytoplasmamembran der bestimmende Schritt ist (Boulton et al. 1996). Aus diesem Grund ist

es von großem Interesse, dass das K. apiculata-Genom von den 18 HXT-Genen, die in

S. cerevisiae für mögliche Hexosetransporter kodieren, bisher nur acht Homologe aufweist.

Jedoch konnte bei der Annotation gezeigt werden, dass das HXT1 Gen, welches in S. cerevisiae

für einen schwachen Glucosetransporter, der besonders zu Beginn der Fermentation exprimiert

wird (Rodicio & Heinisch 2009), kodiert und in Kloeckera apiculata in sieben facher Kopie

vorliegt. Von diesen Kopien liegen zudem vier in räumlicher Nähe (auf dem Contig22). Die

Phosphofructokinase, die den ersten für die Glykolyse spezifischen, irreversiblen Schritt

katalysiert nachdem die Glucose in die Zelle aufgenommen wurde, ist allosterisch durch eine

große Zahl von Metaboliten reguliert und könnte somit ebenfalls zur Regulation des

Glykolyseflusses und die Bildung der Endprodukte beitragen (Arvanitidis & Heinisch 1994).

Tatsächlich kann K. apiculata während der Weingärung genauso viel Ethanol produzieren, wie

S. cerevisiae (Sigler 2007). Die Messung der spezifischen Enzymaktivität von drei wichtigen

Glykolyse-Enzymen in Rohextrakten von K. apiculata und S. cerevisiae bestätigt diese

DISKUSSION

SEITE 90

Kapazität. So ist zwar die spezifische Aktivität der Pyruvatkinase in K. apiculata zwar nur halb

so hoch, wie die von S. cerevisiae, die spezifischen Aktivitäten der Phosphoglyceratkinase und

der Phosphofructokinase liegen aber im selben Bereich. Zusammen mit der Beobachtung, dass

die Aktivitäten der Glykolyseenzyme (zumindest die der Phosphofructokinase) in S. cerevisiae

deutlich über der benötigten Kapazität liegen (Arvanitdis und Heinisch, 1993), gibt dies einen

ersten Hinweis darauf, dass der Glykolysefluss in K. apiculata ähnlich effizient ist. Tatsächlich

scheinen auch die kodierenden Gene für die wichtigsten Regulatoren des Kohlenhydrat-

Stoffwechsels von S. cerevisiae in K. apiculata vorhanden zu sein (z.B. CAT8, SIP4, GCR1,

GCR2, HXK2, und PFK27; Anhang: Tabelle 36). Dies deutet darauf hin, dass auch die

zugrunde liegenden molekularen Regulationsmechanismen hier konserviert sind.

Sogar die molekularen Eigenschaften des Schlüsselenzyms Phosphofructokinase ähneln sich

bei S. cerevisiae und K. lactis. In beiden Hefen findet man zwei kodierende Gene für die

Untereinheiten des Enzyms, wobei die Sequenzidentitäten über die gesamte Gen- bzw.

Proteinlänge zwischen 60-70% liegen. Auch in K. apiculata liegen die beiden Gene PFK1 und

PFK2, wie bei S. cerevisiae, auf zwei verschiedenen Chromosomen. Das KaPFK1-Gen liegt

entweder auf Chromosom III oder IV, während das KaPFK2-Gen auf Chromosom VII

lokalisiert ist (in S. cerevisiae liegen die Homologen auf Chromosom VII bzw. auf Chromosom

XIII). Wie für die Homologen der Bäckerhefe führt nur die gleichzeitige Expression beider

KaPFK-Gene in einer pfk1 pfk2-Doppeldeletion von S. cerevisiae zu einer nennenswerten

Enzymaktivität in Rohextrakten, während jedes einzelne eingebrachte Gen bereits ein

Glucosewachstum vermitteln kann. Dies lässt vermuten, dass auch das Enzym von K. apiculata

in vivo als ein funktionelles Heterooktamer vorliegt, wie es für S. cerevisiae und K. lactis

beschrieben wurde (Bär et al. 1997, Kopperschläger 1994, Kopperschläger 1997). Die Tatsache

dass die einzelnen KaPFK-Gene bereits eine geringe Enzymaktivität vermitteln können,

unterstützt die Vermutung, dass bereits die Untereinheiten für sich (wahrscheinlich als

Homooligomere) katalytisch aktiv sind (Arvanitidis & Heinisch 1994).

In S. cerevisiae sind die beiden PFK-Gene wahrscheinlich das Produkt einer doppelten

Genduplikation. Die Homologie im K. apiculata-Genom, wie auch die im K. lactis Genom

(Heinisch 1993a), deutet damit an, dass die entsprechenden Duplikationsereignisse in der

Evolution vor der Abspaltung dieser Hefearten aufgetreten sein müssen. Tatsächlich muss die

erste Genduplikation, die zu Untereinheiten mit einem doppelten Molekulargewicht führte,

bereits vor der Entstehung der Eukaryonten aufgetreten sein (Heinisch et al., 1989).

Ein weiterer Hinweis auf die hohe Ähnlichkeit der Pfk-Untereinheiten zwischen beiden Hefen

liefern auch die Ergebnisse der Western-Analyse. So konnten mit einem Antiserum gegen

DISKUSSION

SEITE 91

S. cerevisiae-Pfk auch die KaPfk-Untereinheiten sowohl in Rohextrakten aus K. apiculata als

auch, nach heterologer Expression der Gene, in S. cerevisiae nachgewiesen werden. Hinweise

auf eine dritte, regulatorische Untereinheit, wie sie für Pichia pastoris beschrieben wurde

(Tanneberger et al. 2007), konnten hier nicht gefunden werden. Ein Signal für ein Protein bei

102 kDa ist, wie sich in dem Kontrollstamm zeigt, der nur die pfk1 pfk2-Doppeldeletion trägt,

eher auf eine unspezifische Reaktion zurückzuführen.

4.3.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR ALDEHYD-DEHYDROGENASE

Obwohl K. apiculata für die Bildung wichtiger Aromakomponenten im Wein bekannt ist, wirkt

sich die gleichzeitige Bildung hoher Acetatmengen eher negativ auf den Wein aus. Außer durch

den Metabolismus verschiedener Hefen, mit einem vergleichsweise geringen Beitrag von

S. cerevisiae (Sigler 2007), entsteht Acetat vor allem auch im Stoffwechsel von Bakterien, z.B.

in der gemischten Milchsäuregärung und kann den Wein ungenießbar machen (Pigeau & Inglis

2007). Daher wäre die Konstruktion eines K. apiculata-Stammes mit verminderter

Acetatproduktion für die Produktion hochwertiger Weine durchaus wünschenswert. In

S. cerevisiae wird Acetat bei anaerobem Wachstum auf Glukose hauptsächlich durch die

cytosolische Acetaldehyd-Dehydrogenase gebildet (Boubekeur et al. 2001), die vom ALD6-

Gen kodiert wird. Eine mitochondriale Isoform des Enzyms ist durch ALD4 kodiert und spielt

beim Wachstum auf Ethanol eine Rolle (Rodicio & Heinisch 2009). Gene von anderen

Isoformen in S. cerevisiae werden bei den zur Weinproduktion eingesetzten Stämmen offenbar

deutlich schwächer exprimiert (Pigeau & Inglis 2005). Die beobachteten Phänotypen von

Deletionsmutanten weichen in der Literatur etwas voneinander ab. So wurde für einen Stamm

mit einer ald4-Deletion einerseits ein eingeschränktes Wachstum auf Ethanol (s.o.) im

Vergleich zum Wildtyp beschrieben (Wang et al. 1997), während eine andere Gruppe kein

Wachstum mehr feststellen konnte (Tessier et al. 1998). In anderen Untersuchungen konnten

weder die ald4- noch die ald6- Deletion auf Medium mit Ethanol als einziger

Kohlenstoffquelle wachsen (Boubekeur et al. 2001). In den hier durchgeführten Kreuzungen

der Deletionen aus der Euroscarf-Stammsammlung wuchsen beide Einzelmutanten (ald4 und

ald6) vergleichbar, dem Wildtyp, auf Ethanol. Erst eine ald4 ald6-Doppeldeletion war nicht

mehr in der Lage, Ethanol als Kohlenstoffquelle zu verwerten. Die heterologe Expression der

K. apiculata ALD4- und ALD6-Gene komplementierte das Ethanolwachstum, was auf eine

ähnliche Funktion beider Homologe in K. apiculata im Vergleich zu S. cerevisiae schließen

lässt. Tatsächlich zeigen Sequenzvergleiche der Gene aus beiden Hefen, dass eine Identität von

mehr als 50% vorliegt. Zudem konnten für die Acetat Produktion verantwortlichen Gene

DISKUSSION

SEITE 92

(ALD2, ALD3, ALD4, ALD5 und ALD6) in S. cerevisiae ebenfalls entsprechende Homologe in

der K. apiculata Sequenz gefunden werden. Eine direkte Messung der Enzymaktivitäten in

beiden Hefen und bei der heterologen Expression in S. cerevisiae steht noch aus.

4.4 Genetische Charakterisierung der Weinhefe K. apiculata

Schließlich lassen sich aus der Genomsequenz und den hier durchgeführten Untersuchungen

zum Genomaufbau von K. apiculata noch weitere interessante Eigenschaften ableiten.

4.4.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR ZAHL DER CHROMOSOMEN

Die in der Literatur angegebenen Chromosomenzahlen von K. apiculata unterscheiden sich bei

verschiedenen Isolaten (Versavaud & Hallet 1995). So konnten bei gelelektrophoretischer

Auftrennung, von Hanseniaspora Stämmen, zwischen sechs und neun Chromosomen

nachgewiesen werden (Esteve-Zarzoso et al. 2001, Versavaud & Hallet 1995). Für den hier

verwendeten Typstamm DSM2768 konnten nach einer Pulsfeldgelelektrophorese in dieser

Arbeit sieben Chromosomen sichtbar gemacht werden. Damit hat K. apiculata eine gleiche

Anzahl an Chromosomen, wie A. gossypii, D. hansenii und Z. rouxii. Eine frühere Arbeit,

basierend auf PFGE Arbeiten postulierte für H. uvarum einen Stamm mit neun Chromosomen,

wobei aufgrund einiger "Doppelbanden" die angegebene Zahl fraglich ist (Esteve-Zarzoso et al.

2001). Zudem war der DNA-Gehalt bei diesen H. uvarum etwa doppelt so hoch wie bei

anderen Stämmen aus der Gattung Hanseniaspora, weshalb für diese Art eine

Genomduplikation postuliert wurde (Esteve-Zarzoso et al. 2001). Dies konnte durch die

vorliegende Genomanalyse des K. apiculata-Stamms DSM2768 allerdings nicht bestätigt

werden, da deutlich höhere Ähnlichkeiten mit den nicht duplizierten Genomen von A. gossypii

und K. lactis gefunden wurden, als mit dem duplizierten Genom von S. cerevisiae.

Die berechnete Genomgröße von 9,35 Mb für K. apiculata liegt etwas niedriger als die anderer

Hefen ohne Genomduplikation wie z.B. C. albicans mit 14,9 Mb, K. waltii mit 10,6 Mb und

S. kluyveri mit 11 Mb. Dies widerspricht ebenfalls der Hypothese eines duplizierten Genoms.

Der aus der Sequenz ermittelte G/C-Gehalt des K. apiculata-Genoms entspricht mit 36,6% dem

für einen H. uvarum Stamm aus biochemischen Analysen ermittelten Wert (Meyer et al. 1978)

und liegt damit nahe an der Basenzusammensetzung wie sie auch für andere Hefearten ermittelt

wurde (Phatthanaphong et al. 2006).

DISKUSSION

SEITE 93

4.4.2 WEITERE EIGENSCHAFTEN DES K. APICULATA-GENOMS

Der Codon Gebrauch in der Weinhefe K. apiculata korreliert in gewisser Weise mit dem von

Ascomyceten. Ähnlich ist der Gebrauch der Codons bei K. apiculata im Vergleich mit der Hefe

S. cerevisiae. So kodieren die Codons AAA (Lysin), TTT (Phenylalanin) und GAA (Glutamat)

auch in K. apiculata für diese Aminosäuren (Phatthanaphong et al. 2006). Abweichend sind die

Codons TAG und TGA die in K. apiculata für Stoppcodons kodieren, während sie in anderen

Ascomyceten häufig für Tryptophan bzw. Leucin kodieren. Des Weiteren kodiert in einigen

Hefen, wie z.B. in D. hansenii und C. albicans das Codon CTG für Serin, während es in

K. apiculata und S. cerevisiae für Leucin kodiert. Die Hefen, die in der Verwendung dieses

Codons Serin kodieren, werden zusammengefasst als CTG-Gruppe bezeichnet (Dujon 2010).

Hefen, die in speziellen Habitaten leben, haben ihr Genom dahingehend angepasst. So haben

einige Hefen im Laufe ihrer Evolution durch den Verlust bzw. den Gewinn von Genen damit

auch ihre Genomgröße verändert. Einige Hefen sind nicht in der Lage Galactose als

Kohlenstoffquelle zu verwerten. Die Hefe S. cerevisiae kann hingegen Galactose

verstoffwechseln, sie in Glucose-6-phosphat umgewandeln und so der Glykolyse zugängig

gemacht. Beteiligt sind an diesem Stoffwechselweg verschiedene Gene (GAL3, GAL4, GAL1,

GAL80, GAL7, GAL10, GAL2), die teilweise regulatorische Aufgabe übernehmen. Vom bisher

sequenzierten Genom von K. apiculata konnte lediglich das Gen GAL4 als Homologe zu

S. cerevisiae identifiziert werden. Auch in dem filamentös wachsenden Pilz A. gossypii konnte

nur das GAL4 Gen identifiziert werden. Interessanterweise wurden in drei unabhängigen

Stammlinien (von C. glabrata, K. waltii und A. gossypii ) eine Inaktivierung oder gar ein

Verlust dieser für den Galactose- Stoffwechselweg beteiligter Gene beobachtet (Hittinger et al.

2004), was auf eine Verzichtbarkeit der GAL Gene in verschiedenen ökologischen Nischen

schließen lässt (Scannell et al. 2007, Dujon 2006).

Eine Vergrößerung von Hefegenomen kann durch einen horizontalen Gentransfer erfolgen,

wobei die zusätzlichen Gene den Hefen einen Vorteil ermöglichen (Bolotin-Fukuhara et al.

2006). So haben manche Hefen, wie auch S. cerevisiae, die HO-Endonuklease, die sie zum

Paarungstypwechsel befähigen, durch horizontalen Gentransfer erhalten. Die Abwesenheit

eines Homologs zur HO-Endonuklease aus S. cerevisiae (kodiert durch YDL227C) lässt

vermuten, dass die Weinhefe K. apiculata keine HO-Endonuklease durch horizontalen

Gentransfer, erhalten hat. Die Hefe S. cerevisiae hat zudem ein weiteres, zusätzliches Gen

durch horizontalen Gentransfer erworben. Das Enzym Dihydroorotat Dehydrogenase

(DHODase), welches in S. cerevisiae durch das URA1 Gen kodiert wird, wurde durch

horizontalen Gentransfer aus Lactococcus lactis erworben. In der K. apiculata Sequenz konnte

DISKUSSION

SEITE 94

ein Homolog zu der DHODase (URA1) aus S. cerevisiae nicht identifiziert werden. Viele Hefen

besitzen eine mitochondriale DHODase, während S. cerevisiae durch den horizontalen

Gentransfer eine cytoplasmatische DHODase erworben hat, die sie unabhängig von Sauerstoff

macht (Gojkovic et al. 2004, Hall et al. 2005). Die Hefe S. kluyveri, die sich etwa vor 100

Millionen Jahren von der Hefe S. cerevisiae separiert hat besitzt ebenfalls beides, eine

cytoplasmatische und eine mitochondriale DHODase.

Eine Veränderung im Genom kann durch die Duplikation von bereits vorhandenen Genen

stattfinden. Eine solche Duplikation eines Gens ist im Laufe der Evolution bei dem Enzym

Alkoholdehydrogenase aufgetreten, welches die Reaktion von Acetaldehyd zu Ethanol

katalysiert. Das ursprüngliche Enzym (Adh(A)) katalysierte die Reaktion in Richtung der

Produktion von Ethanol (Thomson et al. 2005). Das Enzym Adh2 jedoch katalysiert die

Reaktion von Ethanol zu Acetaldehyd, während Adh1 weiterhin die gleiche Reaktion wie

Adh(A) katalysiert. Der Unterschied der beiden Alkoholdehydrogenaseenzyme, die durch

Genduplikation entstanden sind, zeigt sich zwischen Adh1 und Adh2 nur bei 24 (von 348)

Aminosäuren. Eine solche Genduplikation scheint in K. apiculata ebenfalls nicht stattgefunden

zu haben. So konnte in der Sequenz von K. apiculata nur ein Homolog zu dem ScADH1,

jedoch nicht zu dem ScADH2 Gen identifiziert werden.

Eine weitere Besonderheit von K. apiculata ist das mitochondriale Genom, welches linear ist

und liegt stark komprimiert vorliegt (Pramateftaki et al. 2006). Während der Annotation

konnten einige Differenzen zu dem sequenzierten, mitochondrialen Genom beobachtet werden.

Diese Unterschiede können bedingt sein durch die lineare Form, weswegen es nur schlecht und

nicht komplett sequenziert wurde. Die Abweichungen im mitochondrialen Genom wurden

während dieser Arbeit nicht näher untersucht.

4.4.3 VERGLEICH DES K. APICULATA GENOMS MIT ANDEREN HEFEGENOMEN

Der Vergleich des K. apiculata Genoms mit anderen Hefen fasst die gewonnen Erkenntnisse

über die Weinhefe zusammen.

Wie bis vor einigen Jahren in der Molekulargenetik üblich, basieren die bisherigen

Stammbäume mit einer Einordnung von K. apiculata innerhalb der Hefen, auf dem Vergleich

von 26SrDNA-Sequenzen (Kurtzman 1998). Daraus ließ sich für K. apiculata eine Stellung

sehr nahe zum Zeitpunkt ableiten, an dem die Genomduplikation für die S. cerevisiae-Arten

vermutet wird. Neuere phylogenetische Stammbäume, die verschiedene Klassifizierungs-

systeme vereinen (sowohl beruhend auf der Sequenz von bereits komplett sequenzierten, als

auch auf Genomen, die nur teilweise sequenziert vorliegen) platzieren K. apiculata allerdings

DISKUSSION

SEITE 95

deutlich auf der Seite von Hefen, mit nicht dupliziertem Genom. Dies wird auch durch die hier

vorgelegten Untersuchungen bestätigt. Eine Einordung von K. apiculata aufgrund der

vorliegenden Daten im Vergleich zu einigen Hefearten mit sequenziertem Genom ist in

Abbildung 34 gezeigt.

Abbildung 34: Dargestellt ist die Anordnung der Genome von Hemiascomyceten mit der Angabe ihrer

Größe und ihrer Chromosomenzahl. Rote Pfeile zeigen Innovationen der Genome, während Verluste in

grün dargestellt sind. Die blauen Pfeile zeigen die Präsenz von Transposons in den Genomen. Die Präsenz

von Transposons in K. apiculata konnte noch nicht geklärt werden. (Modifiziert nach (Dujon 2006))

Die Einordnung von K. apiculata in einen Stamm beruht auf den erhaltenen Informationen über

diese Hefe. Das Vorhandensein von Transposon in der Weinhefe K. apiculata konnte nicht

geklärt werden. Es konnte jedoch beobachtet werden, dass es keine Homologen zu den

Bereichen gibt, die in S. cerevisiae Transposons enthalten.

Vermutlich würden durch die Sequenzierung der fehlenden 7% des K. apiculata Genoms,

Lücken, die bei der Annotation verdeutlicht wurden, aufgefüllt werden. Zudem könnten

repetetive Sequenzen, die besonders an den Enden der Chromosomen auftauchen und die

schwer zu sequenzieren sind, einen Teil der fehlenden 7% K. apiculata Genom ausmachen.

Post-Duplikation GenverlustS. cerevisiae

C.glabrataPost-Duplikation Genverlust

K. waltiiVerlust von HO

Verlust der GAL Gene

K. lactis

Genom Duplikation

Ty4

Ty1/2

HO Endonuklease

A. gossypiiVerlust von aktiven Klasse I

Retrotransposons

D. hansenii

C. albicans

Y. lipolytica

Ty3

Ty5

Kurze Centromere

Chromosomen

Anzahl

Genom

Größe

16 12,1

13 12,3

8 10,7

6 10,6

7 9,2

7 12,2

8 14,9

6 20,5

Großer Verlust

von Introns

Verlust von aktivem Ty5,

Erweiterung der Zucker-Nutzung

Verlust der GAL Gene, Verlust von Sex, Verlust

von allen aktiven Typ I Retrotransposons

Verlust der

GAL Gene

K. apiculata 7 9,35

ZUSAMMENFASSUNG

SEITE 96

5 Zusammenfassung

Wein wird seit Jahrtausenden durch alkoholische Gärung hergestellt hauptsächlich durch

Verwendung der Hefe S. cerevisiae, die als Starterkultur dem Most zugesetzt wird. Jedoch ist

S. cerevisiae keine Hefe die natürlicherweise auf Trauben vorkommt. Vielmehr ist es die

Weinhefe Kloeckera apiculata (Sexuelle Form: Hanseniaspora uvarum), die zu 60-90%

natürlicherweise auf Trauben wächst und auch in den ersten Tagen der Fermentation dominant

ist. Erst das Auftreten sekundärer Metabolite, wie Ethanol führt dazu, dass Kloeckera apiculata

in der Gärung von S. cerevisiae überlagert wird.

Stammspezifische Unterschiede bedingen, dass Kloeckera apiculata einerseits einen sehr guten

Einfluss auf die Gärung hat, als Folge der Produktion von Estern und höheren Alkoholen.

Andererseits ist diese Hefe dafür bekannt neben den Produkten der alkoholischen Gärung

Ethanol, CO2 und Glycerin, auch hohe Konzentrationen an Acetat zu produzieren. Um einen

Stamm zu entwickeln, der die positiven Eigenschaften dieser Weinhefe einbringt, jedoch keine

Acetatproduktion aufweist, muss zunächst die Weinhefe Kloeckera apiculata genetisch

charakterisiert werden. Nur mit einer genetischen Analyse können die Stoffwechselwege in

ihrer Regulation und ihrer Komplexität ausreichend gut analysiert werden, um einen

entsprechenden Stamm zu erhalten.

Um stammspezifische Unterschiede, die bei K. apiculata auftreten, zu vermeiden, wurde mit

dem Typstamm DSM2768 gearbeitet. Neben der physiologischen Charakterisierung des

Typstammes lag der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der genetischen Charakterisierung der

Weinhefe Kloeckera apiculata. Dazu wurden, neben der Isolierung von chromosomaler DNA,

durch anschließenden heterologen Komplementationstest, Gene aus K. apiculata isoliert.

Weitere Analysen zur Ploidität der Hefe mit der Durchflusszytometrie ergaben, dass es sich bei

dem Typstamm um eine diploide Hefe handelt. Mit der Pulsefeld-Gelelektrophorese konnten

sieben Chromosomen des K. apiculata Stamm DSM2768 separiert werden. In weiteren

Analysen konnten die isolierten Gene aus Kloeckera apiculata mittels Southern-

Hybridisierung einzelnen Chromosomen zugeordnet werden.

Um den Hauptstoffwechselweg, die Glykolyse, in K. apiculata untersuchen zu können, wurden

drei wichtige Enzyme der Glykolyse, die Phosphofructokinase, die Phosphoglyceratkinase und

die Pyruvatkinase in spezifischen Enzymtests untersucht und ihre Aktivität gemessen. Da die

Phosphofructokinase das erste spezifische Enzym für die Glykolyse ist, wurde dieses Enzym in

K. apiculata näher untersucht. Hierzu wurden die Gene, die für die Untereinheiten der

Phosphofructokinase kodieren, PFK1 und PFK2 in einem heterologen Stammhintergrund

exprimiert. Auch wurde die Aktivität der Untereinheiten in spezifischen Enzymtests

ZUSAMMENFASSUNG

SEITE 97

nachgewiesen. Die Expression der K. apiculata Phosphofructokinase-Untereinheiten konnten

zudem in einem Western Blot nachgewiesen und die Gene PFK1 und PFK2 in einer Southern

Hybridisierung bestimmten Chromosomen zugeordnet werden.

Um die Weinhefe genetisch weiter und besser untersuchen zu können, war es erstrebenswert,

über eine funktionelle Genetik für diese Hefe zu verfügen. Dafür wurden E. coli/K. apiculata

„Shuttle“-Vektoren hergestellt, die Resistenzkassetten unter der Expression eines K. apiculata

eigenen Promotors enthielten. Erste Transformationsergebnisse konnten gewonnen werden,

jedoch sind diese noch nicht zuverlässig genug. Zusätzlich konnte im Verlauf dieser Arbeit das

Genom des K. apiculata Stammes DSM2768 sequenziert werden. Die anschließende

Annotation des Genoms mit BLAST-Analysen mit bereits annotierten Genomen von

S. cerevisiae, K. lactis und A. gossypii ergaben sowohl Hinweise auf Sequenzen, die für

Proteine kodieren, als auch für die Verwendung des degenerierten Basencodes in K. apiculata.

Eine erste Einordnung der Hefe K. apiculata in Bezug auf andere Hemiascomyceten konnte

basierend auf den gewonnen Erkenntnissen über die Weinhefe ebenfalls vorgenommen werden.

AUSBLICK

SEITE 98

6 Ausblick

In dieser Arbeit konnten wertvolle Erkenntnisse über die Weinhefe K. apiculata gewonnen

werden. Der Typstamm DSM2768 wurde in seinem Wachstumsverhalten und im Bezug auf

weinrelevante Stresssituationen genauer untersucht. Durch mikroskopische Analysen konnte er

charakterisiert werden.

Bei genetischen Untersuchungen an der Weinhefe K. apiculata konnte die Ploidität mit der

FACS Analyse und die Chromosomenanzahl mit der Pulsfeld-Gelelektrophorese bestimmt

werden. Zudem gelang in ersten Southern Hybridisierungen die aus K. apiculata isolierten

Gene bestimmten Chromosomen zuzuordnen.

Es gelang in dieser Arbeit nur teilweise, eine genetisch manipulierbare K. apiculata Hefe zu

entwickeln. Die ersten E. coli/K. apiculata „Shuttle“-Vektoren mit den aus K. apiculata

isolierten potentiellen Centromersequenzen liegen vor, bedürfen aber noch weiterer

Untersuchungen. Die Verwendung anderer Resistenzkassetten oder anderer Promotoren zur

Kontrolle dieser Vektoren könnte die Hefe transformierbar machen. Die Sequenzierung von ca.

93% des K. apiculata Genoms lieferte große Menge an Daten, die annotiert vorliegen. Sie

ermöglichen eine schnelle und einfache Isolation von K. apiculata Genen und deren

anschließende Untersuchung.

Durch die vorliegende Arbeit sind die ersten wichtigen Schritte gemacht worden, die es

zukünftig ermöglichen, mit dem K. apiculata Stamm weiterzuarbeiten. Das Fernziel eines

K. apiculata Stammes, der bedenkenlos als Reinzuchthefe oder auch als Mischkultur mit

S. cerevisiae dem Most zugeführt werden kann, ist noch nicht erreicht. Durch entsprechende

Analysen der Stoffwechselwege in K. apiculata könnten dann die negativen Eigenschaften der

Acetatproduktion für die Weinherstellung ausgeschaltet werden, wo hingegen die Produktion

von Estern und höheren Alkoholen durch K. apiculata aromavollere Weine erwarten liesse.

LITERATURVERZEICHNIS:

SEITE 99

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ANHANG

SEITE 109

8 Anhang

8.1 Abkürzungsverzeichnis

Enzyme und Proteine

DNAse Desoxyribonuclease

RNAse Ribonuklease

Reagenzien

AA Acrylamid

Amp Ampicillin

APS Amoniumpersulfat

BAA Bis-Acrylamid

CCW Calcofluor White

CSPD Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2‟-(5‟-Chloro) Tricyclo [3.3.1.13,7

]

Dextran}-4-yl) Phenylphosphat

DAPI 4,6-Diamidino-2-phenylindol

DIG Digoxigenin

dNTP Desoxynukleotid-5‟-triphosphat

DTT Dithriothreitol

EMS Ethylmethansulfonat

EDTA Ethyldiamintetraessigsäure

5-FOA 5-Fluoroacetat

G418 Geneticin

LMP Agarose Low-melting-point Agarose

LiCl Lithium Chlorid

MOPS N-Morpholinopropansulfonsäure

NLS N-Laurylsarkosin

PEG Polyethylenglykol

PEP Phosphoenol-Pyruvat

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

SDS Natriumdodecylsulfat

TBE Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan / Borsäure / Ethylendiamintetraessigsäure

TBS Tris Buffered Saline

TEMED N,N,N‟,N‟,-Tetramethylethylendiamin

TAE Tris-Hydroxymethylaminomethan / Acetat / Ethylendiamintetraacetat

ANHANG

SEITE 110

TE Tris- / EDTA

Tris Tris-Hydroxymethylaminomethan

Tween 20 Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat

X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranosid

Allgemeine Abkürzungen

Ade Adenin

ADP Adenosindiphophat

AMP Adenosinmonophosphat

ARS autonomously replicating sequences

AS Aminosäure

ATP Adenosintriphophat

BLAST Basic Alignment Search Tool

Bp Basenpaare

CEN Centromer

FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

kb Kilobasenpaare

Mb Megabasenpaare

BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)

CFU Colonies forming units

Da Dalton (g/mol)

DNA Dexoxyribonukleinsäure

h Stunde

His Histidin

ITS internal transcribed spacers

kDa Kilodalton

LEU Leucin

M molar

n Ploiditätsgrad der Chromosomensätze

NAD+ Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid

OD Optische Dichte

PCR Polymerasekettenreaktion

PFGE Pulsfeld-Gelelektrophorese

r-DNA ribosomale DNA

RNA Ribonukleinsäure

RT Raumtemperatur

ANHANG

SEITE 111

SDS Sodiumdodecylsulfat

upm Umdrehungen pro Minute

U Unit

ÜN über Nacht

ÜNK über Nacht Kultur

URA Uracil

λ Wellenlänge in nm

8.2 Daten zur Sequenzierung und Annotation von K. apiculata

Der Arbeit sind die Daten der Sequenzierung und Annotation auf einer CD beigefügt.

Die Datei „ConsensusVO.fas“ enthält die Daten der Sequenzierung des K. apiculata Genoms.

Die Datei „Contig500.txt“ fasst alle Contigs mit einer Länge von mehr als 500 Bp zusammen.

Die Datei „AghitsV2.xls“ enthält die zusammengefassten Informationen der BLAST Analyse.

ANHANG

SEITE 112

8.3 Tabellen Vergleich S. cerevisiae, K. apiculata, K. lactis und A. gossypii

Die Tabellen wurden mit den in 8.2 („AghitsV2.xls“) zusammengefassten Annotationsdaten

erstellt. Die Tabellen wurden bezogen aus folgender Quelle: http://mips.helmholtz-

muenchen.de/genre/proj/yeast/. Nicht gefundene Homologe in K. apiculata wurden mit „-“

bezeichnet.

Tabelle 31: Gene aus S. cerevisiae, deren Enzyme in den Stoffwechselwegen der Glykolyse bzw.

Gluconeogenese involviert sind. Im Vergleich die in K. apiculata, K. lactis und A. gossypii gefundenen

Homologen. In K. apiculata sind 60% der Gene ebenfalls gefunden werden.

Homologe Gene zu S. cerevisiae gefunden in

S. cerevisiae Gene K. apiculata K. lactis A. gossypii

YAL038w CDC19 YAL038W 0F23397g ADR368W

YBR058c UBP14 YBR058C 0F18700g AGR023C

YBR066c NRG2 - 0F18524g AGR031W

YBR105c VID24 - 0B09592g ADL330W

YBR196c PGI1 YBR196C 0E23595g AEL249C

YBR218c PYC2 - 0C05764g AAR162C

YBR221c PDB1 YBR221C 0F09603g AAR167C

YCL039w GID7 - 0C01177g AFR715C

YCL040w GLK1 YCL040W 0C01155g AFR716C

YCR012w PGK1 YCR012W 0A11011g AEL038C

YCR105w ADH7 - - -

YDL021w GPM2 - 0C04081g AER228C

YDR050c TPI1 YDR050C 0F18832g AGL201C

YDR255c RMD5 YDR255C 0D11704g AGL254W

YDR511w ACN9 YDR511W 0C01430g AFR704W

YEL012w UBC8 YEL012W 0A11198g AEL045W

YER129w SAK1 YER129W 0D09328g ACL053C

YER178w PDA1 YER178W 0F12001g AGR103W

YFR053c HXK1 - 0D11352g AFR279C

YGL062w PYC1 YGL062W 0C05764g AAR162C

YGL227w VID30 - 0A01221g AFR242C

YGL253w HXK2 YGL253W 0D11352g AFR279C

YGR192c TDH3 YGR192C 0A11858g -

YGR193c PDX1 YGR193C 0E09768g AGR323C

YGR240c PFK1 YGR240C 0A05544g AEL208W

YGR254w ENO1 - 0A09185g AER294C

YHR174w ENO2 YHR174W 0A09185g AER294C

YIL017c VID28 - 0D15961g AGR238C

YIL097w FYV10 - 0E08503g ADL222W

YIL107c PFK26 - 0F03773g ADL237C

YJL052w TDH1 - - -

http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/yeast/

http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/yeast/

ANHANG

SEITE 113



YJL089w SIP4 YJL089W 0F14322g AFR096W

YJL155c FBP26 YJL155C 0B07513g AEL106W

YJR009c TDH2 - 0A11858g -

YKL060c FBA1 YKL060C 0E07546g ABR068C

YKL127w PGM1 YKL127W 0B12694g ABL029W

YKL152c GPM1 YKL152C 0E11891g ACR056W

YKR043c

YKR043C 0E15004g ADR323C

YKR097w PCK1 YKR097W 0A00484g AFR292W

YLR345w

YLR345W 0B05709g ACL185C

YLR377c FBP1 - 0E01210g AFR593C

YMR105c PGM2 - 0B12694g ABL029W

YMR135c GID8 - 0F17138g ADR248C

YMR205c PFK2 YMR205C 0F06248g AFL185W

YMR280c CAT8 YMR280C 0D01452g ABL121C

YMR318c ADH6 -

YMR323w ERR3 -

YNL071w LAT1 YNL071W 0F04741g AER364W

YNL134c

YNL134C 0F24464g AFR066C

YNL199c GCR2 YNL199C 0F20790g ABL160C

YNL241c ZWF1 YNL241C 0D19855g ABL206C

YOL056w GPM3 YOL056W 0C04081g AER228C

YOL126c MDH2 - 0E07502g ADL164C

YOL136c PFK27 YOL136C 0E07095g ADL183C

YOL151w GRE2 -

YOR283w YOR283W 0C06908g AFR554W

YOR344c TYE7 - 0F23353g ADR370W

YOR347c PYK2 - 0F23397g ADR368W

YOR393w ERR1 -

YPL075w GCR1 YPL075W 0E23507g AEL245W

YPL281c ERR2 -

YAL038W PYK1 YAL038W 0F23397g ADR368W

YLR044C PDC1 YLR044C 0E16357g ACL134C

YOL086C ADH1 YOL086C 0F21010g AER032W

ANHANG

SEITE 114

Tabelle 32: Gene aus S. cerevisiae, deren Enzyme in dem Pentosephosphatweg involviert sind. Im Vergleich

die in K. apiculata, K. lactis und A. gossypii gefundenen Homologen. In K. apiculata konnten 65% der Gene

ebenfalls gefunden werden.



YBL068w PRS4 - 0E20471g AGR371C

YBR117c TKL2 - 0E23595g AEL249C


YCR036w RBK1 YCR036W 0C03498g AFR626W

YCR073w-a SOL2 - 0C08415g AER268W

YER099c PRS2 YER099C 0E20471g AGR371C

YGR043c - 0A02607g ACL196W

YGR248w SOL4 - 0A05390g AEL215C

YGR256w GND2 - 0A09339g AFR129W

YHL011c PRS3 YHL011C 0F25718g AGL080C

YHR163w SOL3 YHR163W 0A05390g AEL215C

YHR183w GND1 YHR183W 0A09339g AFR129W

YJL121c RPE1 YJL121C 0E15136g AFL208C

YKL060c FBA1 YKL060C 0E07546g ABR068C


YKL181w PRS1 YKL181W 0B02783g AER083C

YLR354c TAL1 YLR354C 0A02607g ACL196W



YNR034w SOL1 YNR034W 0C08415g AER268W

YOL061w PRS5 YOL061W 0C03916g ADR314C

YOR095c RKI1 - 0C13541g ACL077C

YPR074c TKL1 YPR074C 0B09152g ADL366W

YPR118w - 0D15455g AAR098W

ANHANG

SEITE 115

Tabelle 33: Gene aus S. cerevisiae, deren Enzyme in dem TCA- Zyklus involviert sind. Im Vergleich die in

K. apiculata, K. lactis und A. gossypii gefundenen Homologen. In K. apiculata konnten 66% der Gene

ebenfalls gefunden werden.



YAL062w GDH3 -

YCR005c CIT2 - 0F12760g AAR004C

YDL066w IDP1 YDL066W 0B03355g AER061C

YDL215c GDH2 YDL215C 0D08481g AGL040C

YDR148c KGD2 YDR148C 0D16522g AGL200W

YDR178w SDH4 - 0D18117g AGL137W

YEL047c YEL047C 0F16753g AFR367W

YFL018c LPD1 YFL018C 0D11154g AFR512W

YGR244c LSC2 YGR244C 0A05478g AEL211W

YHR188c GPI16 YHR188C 0A09515g ADR333C

YIL125w KGD1 YIL125W 0F04477g AER374C

YJL045w - 0D04444g ACR052W

YJL200c ACO2 YJL200C 0C03432g AFR629W

YJR051w OSM1 - 0F16753g AFR367W

YKL039w PTM1 - 0F25498g ABR044C

YKL085w MDH1 YKL085W 0F25960g ADR152C

YKL141w SDH3 - 0D04444g ACR052W

YKL148c SDH1 YKL148C 0D04444g ACR052W

YLL041c SDH2 YLL041C 0E00616g ACL065C

YLR164w YLR164W 0F12342g AAL022W

YLR174w IDP2 - 0F12342g AAL022W

YLR304c ACO1 YLR304C 0C17314g ADL032W

YMR118c YMR118C 0E12155g AFR207C

YNL009w IDP3 - 0F12342g AAL022W

YNL037c IDH1 YNL037C 0F04103g ADL223W

YNR001c CIT1 YNR001C 0F12760g AAR004C

YOR136w IDH2 YOR136W 0E03058g AFR137C

YOR142w LSC1 YOR142W 0E03168g AFR134C

YOR375c GDH1 - - -

YPL262w FUM1 YPL262W 0D00902g ACR013C

YPR001w CIT3 YPR001W 0E14278g AGR002W

ANHANG

SEITE 116

Tabelle 34: Der an der Sporulation beteiligten Gene, aus S. cerevisiae. Im Vergleich die in K. apiculata,

K. lactis und A. gossypii gefundenen Homologen.

Homologe Gene zu S. cerevisiae gefunden

in


in



YAL009w SPO7 YAL009W 0F08063g AEL334W

YIL154c IMP2` YIL154C 0A00440g AFR294W

YAL013w DEP1 YAL013W 0F07821g AEL344W

YIR008c PRI1 YIR008C 0B11682g AAR018W

YAL024c LTE1 YAL024C 0A04059g ACR292W

YIR026c YVH1 YIR026C 0E18073g ACL102W

YAL029c MYO4 - 0A03905g ADR354W

YJL005w CYR1 YJL005W 0F15708g AAL162C

YAL041w CDC24 YAL041W 0C12969g ADR388C

YJL054w TIM54 YJL054W 0F01441g AEL177C

YAR007c RFA1 YAR007C 0A08844g AFL008W

YJL073w JEM1 YJL073W 0D06402g ADR124C

YBL015w ACH1 YBL015W 0E10549g AFR020W

YJL092w SRS2 YJL092W 0F14234g AFR093W

YBL052c SAS3 YBL052C 0E20009g ACR236W

YJL095w BCK1 YJL095W 0F14190g AFR092W

YBL058w SHP1 YBL058W 0E20141g ABR211C

YJL157c FAR1 YJL157C 0B07469g AEL104W

YBL061c SKT5 YBL061C 0E20361g ACR227W

YJL174w KRE9 YJL174W 0A06468g AEL134W

YBL066c SEF1 YBL066C 0E20405g AGR369W

YJL204c RCY1 YJL204C 0C03300g AFR644C

YBL078c ATG8 YBL078C 0E20669g AER396W

YJR042w NUP85 YJR042W 0E22561g AEL073C

YBR040w FIG1 YBR040W 0B06864g ACL175W

YKL045w PRI2 YKL045W 0F04818g ABR056C

YBR045c GIP1 - 0A10571g ABL089W

YKL130c SHE2 YKL130C 0B12518g AEL307C

YBR057c MUM2 YBR057C 0F18722g ABL103W

YKL165c MCD4 YKL165C 0B07249g AEL113C

YBR073w RDH54 YBR073W 0F11814g AGL212W

YKL184w SPE1 - 0B02673g AER087C

YBR081c SPT7 YBR081C 0E12617g AER172C

YKR031c SPO14 YKR031C 0F21274g AFR071W

YBR126c TPS1 YBR126C 0B08822g ADL378W

YKR082w NUP133 - 0A07909g ADR216W

YBR130c SHE3 YBR130C 0D09042g AAR042W

YLL001w DNM1 YLL001W 0F12892g AAL174C

YBR158w AMN1 YBR158W 0B09856g ADR061C

YLL021w SPA2 YLL021W 0C17380g ADL022C

YBR171w SEC66 YBR171W 0E24574g AGR210C

YLL039c UBI4 - 0E00682g ACL062C

YBR173c UMP1 YBR173C 0E24530g AGR208W

YLL040c VPS13 YLL040C 0E00638g ACL064C

YBR200w BEM1 YBR200W 0E23441g AEL241W

YLR025w SNF7 YLR025W 0F17820g AFR209W

YCL055w KAR4 YCL055W 0C00693g AFR736C

YLR055c SPT8 YLR055C 0F08811g AFR153W

YCR009c RVS161 YCR009C 0E11935g AER193W

YLR127c APC2 YLR127C 0D16324g AGL193W

YCR028c-

a RIM1 YCR028C-A 0A06149g AEL145W

YLR148w PEP3 YLR148W 0D17182g AGL156W

YCR034w FEN1 YCR034W 0C03542g AFR624W

YLR195c NMT1 YLR195C 0E19635g AAR077C

YCR044c PER1 YCR044C 0C02101g AFR678C

YLR229c CDC42 YLR229C 0A04213g AGL093W

YCR086w CSM1 YCR086W 0F10241g AGL235C

YLR234w TOP3 YLR234W 0F20724g AGL101C

YCR088w ABP1 YCR088W 0F10175g AGL237C

YLR263w RED1 - 0F20405g AGR260W

YCR089w FIG2 YCR089W 0D06446g -

YLR292c SEC72 - 0C05104g AGR293C

YDL006w PTC1 YDL006W 0F14729g AEL010W

YLR310c CDC25 YLR310C 0D09306g ADL038W

YDL040c NAT1 YDL040C 0F08459g ADR310W

YLR313c SPH1 - 0C17380g ADL022C

YDL106c PHO2 YDL106C 0D10043g AFL202C

YLR332w MID2 - 0A03179g AEL302W

YDL116w NUP84 YDL116W 0E09053g ADL289C

YLR362w STE11 YLR362W 0B13112g ABL011C

YDL154w MSH5 - 0C16423g -

YLR371w ROM2 YLR371W 0B07799g AFR585W

YDL192w ARF1 YDL192W 0F05225g ADR094W

YLR418c CDC73 YLR418C 0D03036g AER095W

YDR002w YRB1 YDR002W 0E17281g AER002W

YLR433c CNA1 YLR433C 0B05489g AER118C

YDR085c AFR1 - 0C11891g AGR154C

YLR452c SST2 YLR452C 0D10549g ABR176C

YDR103w STE5 YDR103W 0F12023g AGR104W

YML057w CMP2 - 0B05489g AER118C

ANHANG

SEITE 117


in


in



YDR108w GSG1 YDR108W 0F18953g AGR096C

YML115c VAN1 YML115C 0D01529g ABL124W

YDR123c INO2 YDR123C 0F19558g AGR059C

YML124c TUB3 -

YDR150w NUM1 YDR150W 0D16566g AGR043W

YMR065w KAR5 - 0F26180g ADR143W

YDR173c ARG82 YDR173C 0F20680g AGL099C

YMR096w SNZ1 - - ABR122C

YDR207c UME6 YDR207C 0F20680g AGL099C

YMR139w RIM11 YMR139W 0F17006g ADR253W

YDR218c SPR28 YDR218C 0F13112g AGR175C

YMR154c RIM13 - 0F07183g ADR274C

YDR224c HTB1 YDR224C 0F13310g AGR183C

YMR167w MLH1 YMR167W 0D09955g AFL199C

YDR225w HTA1 - 0F13332g AGR184W

YMR231w PEP5 YMR231W 0B13090g ABL012C

YDR264c AKR1 YDR264C 0E16764g AER388C

YMR263w SAP30 YMR263W 0E11187g AER278W

YDR285w ZIP1 - 0C10879g -

YNL001w DOM34 YNL001W 0A08646g AAL001W

YDR388w RVS167 YDR388W 0E02992g AFR140C

YNL027w CRZ1 YNL027W 0E08679g ADL198W

YDR392w SPT3 YDR392W 0E03212g AFR388W

YNL053w MSG5 - 0F03597g ADL245W

YDR410c STE14 YDR410C 0A02167g AAR122C

YNL079c TPM1 - 0E18007g AER424C

YDR523c SPS1 YDR523C 0C00979g AFR724C

YNL084c END3 YNL084C 0C11429g AER416C

YER068w MOT2 YER068W 0C08041g ADL064W

YNL098c RAS2 - 0C13387g ADL262W

YER095w RAD51 YER095W 0E20339g ACR226W

YNL153c GIM3 YNL153C 0D11132g AFR039C

YER133w GLC7 YER133W 0F12496g AFR166C

YNL192w CHS1 YNL192W 0F20966g ABL153W

YER149c PEA2 YER149C 0E10054g AGR135C

YNL223w ATG4 YNL223W 0D19536g ABL191W

YER172c BRR2 YER172C 0C17798g AGR113W

YNL225c CNM67 - 0D19580g ABL193C

YER179w DMC1 YER179W 0F11957g AGR101C

YNL238w KEX2 YNL238W 0D19811g ABL203W

YFL003c MSH4 - 0F11022g -

YNL250w RAD50 YNL250W 0C02915g AFR637W

YFL026w STE2 YFL026W 0F25102g AFR522C

YNL271c BNI1 YNL271C 0C02321g AFR669W

YFL033c RIM15 YFL033C 0F09020g ACR218W

YNL291c MID1 - 0E13211g AEL197C

YFL037w TUB2 YFL037W 0D05269g ACR225C

YNL325c FIG4 YNL325C 0E02112g ADL195C

YFL038c YPT1 YFL038C 0D05313g ABR220W

YNL330c RPD3 YNL330C 0E01980g AGR395W

YFL059w SNZ3 - - -

YNR007c ATG3 YNR007C 0F06402g AFL178W

YGL071w AFT1 YGL071W 0D03256g AFL087C

YNR019w ARE2 YNR019W 0C09152g AAR065C

YGL090w LIF1 - - -

YNR052c POP2 YNR052C 0C18821g ABR119C

YGL100w SEH1 YGL100W 0F06754g AFL038C

YOL004w SIN3 YOL004W 0C06182g ACL004W

YGL173c KEM1 YGL173C 0F22385g ADL046C

YOL051w GAL11 YOL051W 0F07579g ACR285C

YGL178w MPT5 YGL178W 0E13629g ADL056W

YOL081w IRA2 YOL081W 0E17963g AER025C

YGL180w ATG1 YGL180W 0C17160g ACL054W

YOL091w SPO21 - 0C03784g AFR604C

YGL213c SKI8 YGL213C 0A01650g AER439W

YOL104c NDJ1 - 0C12287g AFR345W

YGL225w VRG4 YGL225W 0A01364g AFR236C

YOL139c CDC33 YOL139C 0E21087g ADL188C


YOL145c CTR9 YOL145C 0E01914g AGR398W

YGR023w MTL1 - 0A03179g AEL302W

YOL148c SPT20 YOL148C 0E01848g AGR401W

YGR044c RME1 - 0A02629g -

YOR005c DNL4 - 0D01089g ACR008W

YGR059w SPR3 YGR059W 0B08129g AFR571W

YOR035c SHE4 - 0E16742g AER389C

YGR078c PAC10 YGR078C 0C04510g AER210C

YOR036w PEP12 YOR036W 0E21857g ACR092C

YGR109c CLB6 - 0D15565g AAR100C

YOR075w UFE1 YOR075W 0A07821g ADR220W

YGR253c PUP2 YGR253C 0A05093g AER296W

YOR212w STE4 YOR212W 0D06787g ACR097W

YHL007c STE20 YHL007C 0B13607g ABR014W

YOR254c SEC63 YOR254C 0C09823g AAL103W

YHR004c NEM1 YHR004C 0E18700g AGL070W

YOR298w MUM3 YOR298W 0F25058g AFR524W

ANHANG

SEITE 118


in


in



YHR005c GPA1 YHR005C 0F25916g ADR153C


YHR013c ARD1 YHR013C 0E03289g AFR409W

YOR351c MEK1 YOR351C 0F23507g ADR379C

YHR014w SPO13 - 0E03256g AFR407C

YOR361c PRT1 YOR361C 0A03531g ADR399C

YHR086w NAM8 - 0F14861g ADR307W

YPL002c SNF8 YPL002C 0E14366g AGL002C

YHR119w SET1 YHR119W 0F24134g ABR136W

YPL031c PHO85 YPL031C 0D11990g AGL242C

YHR139c SPS100 - - -

YPL045w VPS16 YPL045W 0D11748g AGL252W

YHR157w REC104 - - -

YPL082c MOT1 YPL082C 0E23804g AEL256C

YHR158c KEL1 YHR158C 0E15598g ADL149W

YPL129w TAF14 YPL129W 0D06809g ACR098C

YHR184w SSP1 - 0A09361g AFR130W

YPR054w SMK1 YPR054W 0B11946g ADL315C

YIL033c BCY1 YIL033C 0E04070g ADL099C

YPR103w PRE2 YPR103W 0F08228g AEL326C

YIL048w NEO1 YIL048W 0C08393g ADL079C

YPR113w PIS1 YPR113W 0D15037g AAR037W

YIL072w HOP1 - 0C07623g ACL029W

YPR120c CLB5 YPR120C 0D15565g AAR100C

YIL073c SPO22 - 0C09328g -

YPR122w AXL1 YPR122W 0D15631g AGR251C

YIL084c SDS3 YIL084C 0E08657g ADL200C

YPR165w RHO1 - 0B10626g ABR183W

YIL128w MET18 YIL128W 0F04565g AER377C

YPR173c VPS4 YPR173C 0B10846g AEL265W

YIL129c TAO3 YIL129C 0F04587g AER378W

YPR198w SGE1 -

Tabelle 35: Gene, die in S. cerevisiae für Zellwandproteine kodieren. Im Vergleich die in K. apiculata,

K. lactis und A. gossypii gefundenen Homologen.



YAL063c FLO9 - - -

YAR050w FLO1 - - -

YBR067c TIP1 - - -

YBR093c PHO5 - - -

YCR089w FIG2 YCR089W 0D06446g -

YDR077w SED1 - 0E01023g AGR138W

YDR261c EXG2 - - AEL220C

YDR534c FIT1 - - -

YEL040w UTR2 - 0F16907g -

YER011w TIR1 - - ADR019C

YGL028c SCW11 - 0E10703g -

YGL032c AGA2 - - -

YGR189c CRH1 YGR189C 0F22671g AGR318C

YGR279c SCW4 YGR279C 0C14047g AGL354C

YGR282c BGL2 YGR282C 0F03036g AGL343C

YHR139c SPS100 - - -

YHR143w DSE2 - 0D08008g AFR026C

YIR019c MUC1 YIR019C - AEL023C

YJL159w HSP150 - 0B07392g AEL110W

YJL171c YJL171C 0A06556g AEL130C

YKL096w CWP1 YKL096W 0B06347g ABR025C

ANHANG

SEITE 119



YKL096w-a CWP2 - - ABR026C

YKL163w PIR3 YKL163W 0B07392g AEL110W

YKL164c PIR1 - 0B07370g AEL111C

YKR102w FLO10 - - -

YLL024c SSA2 YLL024C 0D04224g AFR114W

YLR054c OSW2 YLR054C 0F25212g AFR517C

YLR155c ASP3-1 - - -

YLR157c ASP3-2 - - -

YLR158c ASP3-3 - - -

YLR160c ASP3-4 - - -

YLR286c CTS1 - 0C04730g -

YLR390w-a CCW14 YLR390W-A 0E04939g AER058W

YMR305c SCW10 - 0C14047g AGL354C

YNL066w SUN4 YNL066W 0C02651g AFR654W

YNL260c YNL260C 0C02651g AFR654W

YNL300w - 0A07315g -

YNL322c KRE1 - 0E21131g ADL190C

YNR067c DSE4 YNR067C 0F11704g AGL208C

YOR010c TIR2 - - -

YOR190w SPR1 - 0C05324g AAR146W

YOR255w OSW1 - 0C09779g AAL105C

YPL130w SPO19 - - -

YPL163c SVS1 - 0C10054g AAL092C

Tabelle 36: Gene, die in S. cerevisiae regulatorische Funktionen bezüglich der Glykolyse und

Gluconeogenese haben. Im Vergleich die in K. apiculata, K. lactis und A. gossypii gefundenen Homologen.



YBR058c UBP14 YBR058C 0F18700g AGR023C

YBR066c NRG2 - 0F18524g AGR031W

YBR105c VID24 - 0B09592g ADL330W

YCL039w GID7 - 0C01177g AFR715C

YDR255c RMD5 YDR255C 0D11704g AGL254W

YEL012w UBC8 YEL012W 0A11198g AEL045W

YFR053c HXK1 - 0D11352g AFR279C

YGL227w VID30 - 0A01221g AFR242C


YIL017c VID28 - 0D15961g AGR238C

YIL097w FYV10 - 0F03773g ADL237C

YIL107c PFK26 - 0F03773g ADL237C

YJL089w SIP4 YJL089W 0F14322g AFR096W

YJL155c FBP26 YJL155C 0B07513g AEL106W

YMR135c GID8 - 0F17138g ADR248C

YNL199c GCR2 YNL199C 0F20790g ABL160C

ANHANG

SEITE 120



YOL136c PFK27 YOL136C 0E07095g ADL183C


YPL075w GCR1 YPL075W 0E23507g AEL245W

YMR280C CAT8 YMR280C 0D01452g ABL121C

Tabelle 37: Gene von S. cerevisiae für Enzyme des Pentose-Phosphat-Wegs und damit verbundene

enzymatische Schritte kodieren. Im Vergleich die in K. apiculata, K. lactis und A. gossypii gefundenen

Homologen.



YBL068w PRS4 - 0E20471g AGR371C

YBR117c TKL2 - 0E23595g AEL249C


YCR036w RBK1 YCR036W 0C03498g AFR626W

YER099c PRS2 YER099C 0E20471g AGR371C

YGR043c - 0A02607g ACL196W

YGR256w GND2 - 0A09339g AFR129W

YHL011c PRS3 YHL011C 0F25718g AGL080C

YHR183w GND1 YHR183W 0A09339g AFR129W

YJL121c RPE1 YJL121C 0E15136g AFL208C


YKL181w PRS1 YKL181W 0B02783g AER083C

YLR354c TAL1 YLR354C 0A02607g ACL196W



YOL061w PRS5 YOL061W 0C03916g ADR314C

YOR095c RKI1 - 0C13541g ACL077C

YPR074c TKL1 YPR074C 0B09152g ADL366W

YPR118w - 0D15455g AAR098W

ANHANG

SEITE 121

8.4 Lebenslauf

Dipl. biol. Frauke Julia Bink

Gmünder Str.37, 49076 Osnabrück

Telefon: 0170/ 73 11 538

E-Mail: [email protected]

Persönliche Daten

Geburtsdatum: 20.08.1980

Geburtsort: Wuppertal

Familienstand: verlobt

Staatsangehörigkeit: deutsch

Eltern: Dr. med Helmut Bink, Intern.Gemeinschaftspraxis Dialyse am

Hellweg, Dortmund

Frauke Bink, ehem. Leiterin der Fort-und Weiterbildung für den Operationsdienst, Klinikum Dortmund

Schullaufbahn

1987-1991 Lichtendorfer Grundschule, Dortmund-Lichtendorf

1991-2000 Gymnasium an der Schweizer Allee, Dortmund-Aplerbeck

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

Studium

2000-2006 Studium an der Universität Osnabrück

Diplomarbeit angefertigt in der Abteilung Genetik

Thema: Regulationsphänomene bei der Überexpression von

Glykolyseenzymen in der Hefe S. cerevisiae

Abschluss: Diplom Biologin

2007-2010 Promotion an der Universität Osnabrück

Stipendium des Forschungsrings Deutschen Weinbaus (FDW)

Thema: Molekulargenetische und physiologische

Untersuchungen an der Weinhefe Kloeckera apiculata (Hanseniaspora uvarum)

ANHANG

SEITE 122

8.5 Tagungs- und Buchbeiträge

15th

International Enology Symposium, Trier 2007: Establishing a molecular Genetics

for the wine yeast Kloeckera apiculata (Hanseniaspora uvarum)

50. Intervitis/Interfructa Kongress, Stuttgart 2010: Etablierung einer Molekulargenetik

in der Weinhefe Kloeckera apiculata (Hanseniaspora uvarum)

Beitrag zum Deutschen Wein Jahrbuch 2011: Genetische Untersuchungen an der Weinhefe Kloeckera apiculata (Hanseniaspora uvarum)

ANHANG

SEITE 123

8.6 Anlage

Erklärung über die Eigenständigkeit der erbrachten wissenschaftlichen Leistung

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne

Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen

direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quelle

gekennzeichnet.

Bei der Auswahl und Auswertung folgenden Materials haben mir die nachstehend aufgeführten

Personen in der jeweils beschriebenen Weise unentgeltlich geholfen.

1. Bei der automatisierten, bioinformatischen Aufbereitung der Sequenzdaten wurde ich

unterstützt von Dr. Hans-Peter Schmitz.

2. Im Rahmen von Abschlußarbeiten wurde ein Teil der Laborarbeiten gemeinsam

mit Studenten durchgeführt. Dabei sind die angegebenen Plasmide in Kooperation mit

Anne-Kathrin Langenberg entstanden. Die Abbildung 9 in Zusammenarbeit mit Tim

König.

Weitere Personen waren an der inhaltlichen materiellen Erstellung der vorliegenden Arbeit

nicht beteiligt. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungs-

bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder andere Personen) in Anspruch genommen.

Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten,

die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer

anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

.......................................................... ..............................................................

(Ort. Datum) (Unterschrift)

DANKSAGUNG

SEITE 124

9 Danksagung

Viele haben zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen, denen ich an dieser Stelle DANKE sagen

möchte:

Herrn Prof Dr. J. J. Heinisch möchte ich für dieses Projekt danken und seine Betreuung über

die drei Jahre.

Dr. Hans-Peter Schmitz möchte ich für seine hilfreichen Tipps bei technischen und fachlichen

Fragen danken.

Bei den Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Genetik möchte ich mich ebenfalls bedanken.

Besonders bei dem Labor 329 und dem Ashbya-Team mit allen seinen Mitgliedern über die

Jahre.

Ich möchte mich in diesem Zuge auch bei meiner besten Freundin Katrin W. und meiner

Patentante Susanne B. bedanken! Danke, dass ihr immer für mich da seid!

Mein größter Dank gebührt meiner Familie. Und besonders möchte ich meinen über alles

geliebten Eltern danke, für eure Unterstützung und eure Liebe mit der ihr mir sehr viel Kraft

gebt. Danke für ALLES und danke für Geli und Rovi!!!

Zu guter Letzt möchte ich mich bei Dir, Thomas bedanken. Du bist der beste Begleiter bei

dieser Doktorarbeit gewesen. Ich danke dir für deine Hilfe, deine Geduld und deine offenen

Ohren bei allen Fluffy- und Klöcki-Problemen und für deine Liebe.

Documents

Molekulargenetische und physiologische …...Frauke Julia Bink Osnabrück, Juli 2010 Diese Arbeit wurde teilfinanziert durch den Forschungsring Deutschen Weinbaus (FDW) Diese Arbeit