Molekulargewichtsbestimmung des kallikrein-inaktivators mittels der ultrazentrifuge

Die Makromolekulare Chemie 98 (1966) 204-234 (Nr. 2222)

Aus dem Kolloidchemischen Laboratorium der Ingenieur-Abteilung Angewandte Physik der Farbenfabriken Bayer AG., Werk Leverkusen

Molekulargewichtsbestimmung des Xallikrein-Inaktivators mittels der Ultrazentrifuge

Von W. SCHOLTAN und SIE YING LIE

(Eingegangen am 22. .November 1965)

ZUSAMMENFASSUNG: Das Molekulargewicht des Kallikrein-Inaktivators (KI) wurde mittels der Ultrazentri-

fugenmethode nach ARCHIBALD nnd TRAUTMANN bestimmt. Das Molekulargewicht der hoch gereinigten Praparate ist vom PH der Losung und von der Konzentration unabhangig und betragt 6500 =k 200.

Aus Sedimentations-, Diffusions- und Viskositatsmessungen ergibt sich, daB das Mole- kiil des K I eine merklich von der Kugelform abweichende Gestalt besitzt.

Der K I bildet nicht nur mit Enzymen, sondern auch mit niedermolekularen Stoffen Assoziate; solche Stoffe sind z. B. : Purine, Pyrimidine, ADP, ATP und in geringem Mal3e mehrwertige Anionen (z. B. Citronensaure, Pyro- und Metaphosphorsaure). Die zweiwer- tigen Kationen des Calciums, Magnesiums und Zinks bewirken dagegen keine Dimeri- sierung.

Die Wechselwirkung des K I mit den niedermolekularen Stoffen ist eine Gleichgewichts- reaktion und folgt dem Massenwirkungsgesetz.

Gleichungen fiir die Abhangigkeit des mittleren Molekulargewichts und des Assozia- tionsgrades von der EiweiBkonzentration und der Konzentration des Komplexbildners werden aufges-ellt. Die Gleichgewichtskonstante der Assoziationsreaktion wird fiir Adenin und Thymin ermittelt.

Aus TRAUTMANN-Diagrammen wurde beim isoelektrischen Punkt des K I (PH 10,5) die Molekulargewichtsverteilung ermittelt. Die friiher untersuchten Praparate enthalten in 1-proz. waBriger Losung vor allem Molekiile vom Molekulargewicht 6500, in geringer Menge ferner Assoziate vom Molekulargewicht 13 000.

Durch Dialyse und Gelfiltration ist eine Fraktionierung und partielle Trennung der Komponenten moglich.

In den bereits friiher untersuchten Praparaten wurde ein Stoff mit einem adenosin- ahnlichen UV-Spektrum gefunden, der in sehr kleiner Konzentration eine Assoziation des K I bewirkt. Das Molekulargewicht dieser unreinen Praparate ist daher sowohl vom PH der Losung als auch von der Konzentration abhangig. In saurer und alkalischer Losung besitzen diese Praparate ein Mindest-Molekulargewicht ; in neutraler Losung erreicht das Molekulargewicht einen maximalen Wert.

Beim Verdiinnen einer neutralen Losung dieser Praparate verringert sich das Moleku- largewicht bei Konzentrationen unter 0,2 oh und niihert sich dem Wert 6500. In alkalischer

Molekulargewicht des Kallikrein-Inaktivators

Losung bei p~ 12,5 nimmt das Molekulargewicht mit der Zeit zu und erreicht nach einigen Tagen einen konstanten maximalen Wert von 13 000. Die durch pE-Anderungen verursachten Molekulargewichtsanderungen sind im pH-Bereich von 1 , l bis 10,5 vollstandig reversibel, iiber PH 12 dagegen teilweise irreversibel.

SUMMARY:

The inolecular weight of kallikrein inactivator (KI) is determined in the ultracentrifuge, by the ARCHIBALD and TRAUTMANN methods. The molecular weight of highly purified K I is found to be 6500 f 200 and is independent on the PH values of the solutions as well as on the K I concentration.

It follows from the sedimentation, diffusion and viscosity measurements that the molecules of K I have non-spherical forms.

The K I molecules associate not only with enzyms, but also with low molecular substances such as purines, pyrimidines, ADP, ATP. High valent anions (e.g. citric acid, pyro- and metaphosphoric acids) have little effect on such association. The bivalent cations, calcium, magnesium, and zinc, do not cause the dimerisation.

The interaction between K I and the low molecular substances follows the law of mass action.

Equations for the dependence of molecular weight and of the rate of association on the concentrations of protein and the complex formed are derived. The equilibrium constants of K I molecules associated in the presence of adenin and thymin are experimentally determined.

The molecular weight distribution curye of K I is obtained from TRAUTMANN diagram a t its isoelectrical point ( p ~ 10.5). The 1 yo solution of K I used in the earlier experimental work contains mostly the molecular weight of 6500 and less of 13000.

Fractionation and partial separation of these components are possible by means of dialysis and gelfiltration.

A trace of foreign substance having a similar UV-spectrum as adenosin is found in the substance used in our earlier experimental work. Although present in K I only in traces, it causes association. The molecular weight of this K I depends therefore on the PH of the solution as well as on the K I concentrations. In acidic and alkaline solution it is found to have a minimum molecular weight; while in neutral solution a maximum value is obtained.

By diluting a neutral solution of this substance, the molecular weight decreases a t K I concentration smaller than 0.2 Yo and approaches 6500. The molecular weight in solution of PH 12.5 increases with time and reaches a constant value of 13000 after standing for several days. The change in K I molecular weight caused by differing p~ values of the solutions are fully reversible for solutions having p~ values between 1.1 and 10.5. For PH greater than 12, the molecular weights are partly irreversible.

A.. Einleitung

Uber die Molekulargewichtsbestimmung des Kallikrein-Inaktivators (KI) inittels der Ultrazentrifuge ist von KRAUT, KORBEL, SCHOLTAN und SCHUI,TZ4) bereits in einer fruheren Arbait berichtet worden. Dabei wurde gefunden, dal3 der Kallikrein-Inaktivator in physiologischer NaC1-Losung

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W. SCHOLTAN und S. Y. LIE

PH

ein Molekulargewicht von 11 700 besitzt (bestimmt nach der Methode von ARCHIBALD). Bei einer Wiederholung der Messungen mit den damals verwendeten Praparaten zeigte es sich jedoch, daB das Molekulargewicht vom PH und von der Zusammensetzung des Losungsmittels und der Be- gleitstoffe abhiingig ist. Dagegen fanden wir neuerdings bei hochgerei - n i g t e n Praparaten unabhangig vom PH des Losungsmittels ein einheit- liches Molekulargewicht von 6500. Dieser Wert stimmt auch mit dem Min- dest-Molekulargewicht von 6511 uberein, das sich aus der von ANIJERER und HORNLE l) kurzlich ermittelten Aminosauresequenz des Kallikrein-In- aktivators ergibt.

Die von diesen Autoren gefundene Primarstruktur des K I aus Rinder- lunge stimmt auch mit der Aminosaurefrequenz des basischen Trypsin- Inhibitors aus Rinderpankreas iiberein, die von KASSELL u. Mitarb. s, publiziert worden ist.

Unsere Untersuchungen ergaben ferner, da13 der Kallikrein-Inaktiva- tor eine Substanz ist, die nicht nur mit bestimmten Enzymen, sondern auch mit anderen Stoffen in Wechselwirkung tritt und dabei Assoziate bild et.

B. Die verwendeten Praparate Zur Untersuchung wurden verschiedene aus. Rinderlunge hergestellte Praparate ver-

wendet, die urn von Herrn Professor KRAUT und Herrn Dr. BHARGANA (Max-Planck- Institut fiir Ernlihrungsphysiologie, Dortmund), Herrn Dr. SCHULTZ und Herrn Dr. ARENS (Biochemisches Labor der Farbenfabriken Bayer, Werk Elberfeld) ZUT Verfiigung gestellt worden waren.

Das PrHparat A1 wurde in Dortmund nach dem von KRAUT et d. beschriebenen Ver- fahren elektrophoretisch gereinigt. Die Priparate B 1 und B 2 wurden nach dem Verfahren

Tab. 1. pH-Wert und Zusammensetzung der Pufferlosungen

Zusammensetzung der Pufferlosungen

0,l n HCl 0,l n Essigsiiure 0,l m Glycin + HCl nach SORENSEN 0,l m Phosphatpuffer nach SORENSEN 0,l m Glycin + NaOH nach SORENSEN 0.05 n NaOH + 0,l m KC1

I Phosphathaltige Losungen mit 1 % KI

0,l m KH,PO,’+ H,PO, 0,l m KH,PO, + H,PO, 0,l m Phosphatpuffer nach SORENSEN 0,l m Phosphatpuffer nach SORENSEN 0,l m Na,HPO, + NaOH 0,l m Na,HPO, + NaOH

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von F. SCHULTZ hergestellt, die Prapiparate C1, C2 und C3 aus solchen Praparaten durch Gelfiltration mit Sephadex. Die verwendeten Praparate hatten einen Reinheitsgrad von 0,14 bis 0,20 y/KIE (KIE = Kallikrein-Inaktivator-Einheiten).

Zur Untersuchung wurden die PrPparate ohne weitere Vorbehandlung unmittelbar in verschiedenen Pufferlosungen gelost (s. Tab. 1).

C . Versuchsmethoden

1. Diffusionsmessungen Diffusionsmessungen wurden in der Unterschichtungszelle der Spincb-Ultrazentrifuge

bei Tourenzahlen von 12590 und 42040 Upm und einer Temperatur von 20,O"C durchge- fiibrt. Aus den PHILPOT-SvENssoN-AUfnahmen wurden die Diffusionskoeffizienten DA nach der FlHchenmethode berechnet und auf Standardbasis (Wasser) umgerechnet. Der EinfluB des Zentrifugalfeldes auf den Diffusionsvorgang ist infolge der geringen Sedimen- tationsgeschwindigkeit der Substanz bei beiden Tourenzahlen relativ gering (0,7 yo) und kann vernachlPssigt werden.

2 . Partielles spesijsches Volumen Das partielle spezifische Volumen des KI wurde nach der Pyknometermethode aus der

Konzentrationsabhgngigkeit der Dichte der KI-Losung in Puffer PH 7.4 bei 20,O "C bestimmt. Fiir das untersuchte Konzentrationsgebiet von 1 bis 5 yo wurde fiir das partielle spezifische Volumen V ein Wert von 0,726 & 0,005 cm3/g gefunden.

3. Sedimentationsmessungen Die Sedimentationsmessungen wurden in der Spinco-Ultrazentrifuge Modell E bei einer

Temperatur von 20,O "C durchgefiihrt. Aus den PHILPOT-SVENsSON-Anfnahmen wurden die Sedimentationskoeffizienten sm, und die Molekulargewichte berechnet. Zur Molekular- gewichtsberechnung wurden drei verschiedene Methoden angewandt : a) Vedahren nach SVEDBERG unter Benutzung der Sedimentations- und Diffusions-

b) Verfahren nach ARCHIBALD. c) Verfahren nach TRAUTMANN.

Gleichung lautet:

konstanten.

Die von ARCHIBALD fiir das Gewichtsmittel des Molekulargewichts xw abgeleitete

In dieser Formel haben zw, R, T, o und V ihre iibliche Bedeutung. Mit (dc/dx)m und cm wird der Konzentrationsgradient bzw. die Konzentration am Meniskus xm bezeichnet. cm wurde nach der folgenden Formel berechnet:

cm = c , , - ~ ~ x z dx dc dx

Xm Xm


Die Anfangskonzentration co wurde in willkiirlichen Einheiten als Flache (cmz) in der Uberschichtungszelle bestimmt. co betrug fiir eine I-proz. KI-Losung bei den angewandten Versuchsbedingungen 44,3 cm2.

zur Konstruktion des TRAUTMANN-Diagramms wird die GroBe ~ (dc/dx)m (Konzentra- WZX:,

tionsgradient am Meniskus (dc/dx)m geteilt durch das Quadrat der Winkelgeschwindig- keit w und den Abstand des Meniskus vom Rotationszentrum x k ) gegen die Verminde- rung der EiweiBkonzentration am Meniskus (Acm = co-cm) anfgetragen. (dc/dx)m und Acm wurden aus der zehnfach vergroaerten PHILPOT-SVENSSON-Aufnahme in willkiirlichen Einheiten (cm bzw. cm2) bestimmt. Sie werden im folgenden als 2, (cm) bzw. A C ~ F (cmz) bezeichnet. Ferner ist x h = 21,6 xm.

Das Molekulargewicht der Substanz errechnet sich nach TRAUTMANN aus den Koordi- natenabschnitten des Diagramms, und zwar ergibt es sich als Quotient aus Ordinaten- abschnitt und Abszissenabschnitt, multipliziert mit dem Faktor RT/(1-V p) und einer Apparatekonstante K. K betrug bei unserer Versuchsanordnung 467.

Die Genauigkeit der Molekulargewichtsbestimmung nach ARCHIBALD und TRAUTMANN wird vor allem von der Genauigkeit bestimmt, mit der V, Zm und C ~ F bestimmt werden konnen. Die iibrigen GroSen der G1. (1) sind dagegen so genau bestimmbar, da13 sie bei der Berechnung der Fehlerbreite als Konstanten betrachtet werden. Fiir den maximalen relativen Fehler der Molekulargewichtsbestitnmung erhalt man fiir wai0rige Losungen aus GI. (1) den Ausdruck:

FLU den mittleren relativen Fehler ergibt sich auf Grund des GAussschen Fehlerfort- pflanzungsgesetzes :

~ __ -

(4) AHw (mittel) @W

Tab. 2. Maximaler und mittlerer relativer Fehler von Pw fiir den Kallikrein-Inaktivator (KI) (Praparat C1) bei PH 10,5 und Hw = 6500 nach den Gln. (3) und (4)

1 g/100 ml K I I Konz d. KI-Losung I 0,4 g/100 ml K I

3,66 i 0,l

3 9 3 & 0,3

0,726 j, 0,005

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Bei dem in der Tab. 2 aufgefiihrten Beispiel, das auch fiir die iibrigen Molekulargewichts- berechnungen charakteristisch ist, wurde der maximale und mittlere relative Fehler von Nw fiir den KI (Praparat C 1 ; PH 10,5) fiir zwei Konzentrationen ermittelt. Bei unseren Versuchen betrug der maximale Fehler von V f 0,005 d / g , von Zm 3~ 0,l cm und von CmF rt 0,3 cm2.

D. Versuchsergebnisse

1. Abhangigkeit der SedimentationskoefJkienten und der Molekulargewichte des Kallikrein- Inaktivators von der Konzentration und vom PH- Wert der Liisung

Die Konzentrationsabhangigkeit der Sedimentationskoeffizienten ist fiir Lijsungen der Praparate A1 und C1 fiir verschiedene pH-Werte in Abb. 1 dargestellt. Die Versuchsergebnisse sind in Tab. 3 aufgefuhrt.

Abb. 1. Abhangigkeit der reziproken Sedimentationskoeffizienten szo, von der Konzen- tration des Kallikrein-Inaktivators und vom pH-Wert der Losung fiir die PrLparate A1

und C 1

Die Sedimentationskoeffizienten szOIw sind bei PH 1, l stark von der EiweiBkonzentration der Losung abhangig, beim isoelektrischen Punkt des K I bei PH 10,5 (vgl. ANDERER und HORNLE~)) dagegen von der Kon- zentration unabhangig. Zwischen dem reziproken Wert der Sedimenta- tionskoeffizienten und der KI-Konzentration besteht bei p~ 1,l eine lineare Beziehung. Durch Extrapolation auf die Konzentration c = 0 erhdt man die Sedimentationskonstante, und zwar ergibt sich fur das Praparat C1 ein Wert von 0,87 (Svedberg). Einen sehr ahnlichen Wert, namlich 0,91 (Svedberg), erhdt man fur alle Konzentrationen des Pra- parates C1 bei PH 10,5.

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Konzentration (g/100 ml)

l,oo 0,78 0,56 n,37 0

Das Praparat A1 zeigt demgegeniiber bei beiden pH-Werten deutlich groBere Sedimentationskoeffizienten. Dies deutet darauf hin, daB auch das Molekulargewicht dieses Stoffes etwas gro13er ist als das von C1.

Die Diffusionskoeffizienten des Praparates C 1 sind in der Tab. 3 auf- gefiihrt. Sie sind bei PH 10,5 ebenso wie die Sedimentationskoeffizienten von der KI-Konzentration und der Versuchszeit (vgl. Abb. 2) unabhangig.

~ ~ . 1 0 7 f/f08) Sao. w

(SYEDBERG) (cmz/sec) MS,D Mkch

0,91 12,9 6350 6490 0,91 12,3 6650 6510 0,91 12,4 6600 6500 0,91 12,3 6650 0,91 12,5 6550 6500 1,387

0750 D

Zcif /h Mhufen

Abb. 2. Bestimmung des Sedimentations- und des Diffusionskoeffizienten vom Kallikrein- Inaktivator (Praparat C1) aus der zeitlichen Abhangigkeit der GroOen log x bzw. (A/H)2. Proteinkonzentration 1 g/100 ml; Losungsmittel: 0 , l rn Glycinpuffer; p~ 10,5; Temp.: 20 "C

sz0 = 0,88 SVEDBERG D, = 12,6.10-7 cm2/sec szOlw = 0,91 SVEDBERG Dzo, = 12,9 cma/sec

Aus den Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten kann man das Molekulargewicht nach der SVEDBERGschen Formel berechnen (M,,D). Unabhangig davon wurden die Molekulargewichte nach dem Verfahren von ARCHIBALD @Arch) ermittelt. Ein Vergleich der in Tab. 3 zusammen- gestellten Werte zeigt, da13 die nach den beiden unabhangigen Methoden

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1 I I I I I

bestimmten Molekulargewichte gut miteinander ubereinstimmen. Nach beiden Restimmungsmethoden ergibt sich fur das Molekulargewicht des Kallikrein-Inaktivators ein Wert von 6500 + 200.

Die zeitliche Abhangigkeit der nach ARCHIBALD bestimmten Molekular- gewichte fur Losungen der Praparate A 1 und C1 fur verschiedene PH- Werte ist in Abb. 3 dargestellt.

Es ist ersichtlich, daS die apparenten Molekulargewichte bei allen p ~ - Werten mit Ausnahme des isoelektrischen Punktes @H 10,5) in geringem MaBe won der Versuchszeit abhangen. Als Molekulargewicht wurden daher stets die auf die Zeit t = 0 extrapolierten Werte angegeben.

Die Abb. 3 zeigt, daS das apparente Molekulargewicht mit der Zeit meist abnimmt. Nur in einer 0,4-proz. Losung des Praparates A1 steigt bei PH 12,5 das Molekulargewicht laufend an. Bereits dieses Verhalten ist ein gewisser Hinweis dafur, daB auch das wahre Molekulargewicht des Praparates bei PH 12,5 nicht konstant ist, sondern mit der Zeit zunimmt.

Die Konzentrationsabhangigkeit des Molekulargewichtes vom K I ist fur verschiedene Molekulargewichte in den Abbn. 4 a und 4 b dargestellt.

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Abb. 4 a. Abhangigkeit der nach ARCHIBALD bestimmten reziprokep apparenten Moleku- largewichte (ga)app fiir den Kallikrein-Inaktivator von der Konzentration und vom p ~ - Wert fiir das F’riparat A1 und fiir ein aus Parotis hergestelltes Praparat K (nach KRAUT, KORBEL, SCHOLTAN und sCHULTZ4) ( p ~ 7, Zeichen 0). Die Molekulargewichte dieses Pra-

parates wurden mit dem partiellen spezifischen Volumen von 0,726 neu berechnet)

7

Abb. 4 b. Abhangigkeit der nach ARCHIBALD bestimmten reziproken apparenten Mole- kulargewichte (xw)app fiir den Kallikrein-Inaktivator (Praparat C 1 und C2) von der Kon-

zentration und vom pH-Wert der Losung

Die Abbn. 4 a und 4 b zeigen, daB die apparenten Molekulargewichte der Praparate A und C ebenso wie ihre Sedimentationskoeffizienten bei allen pH-Werten von der Konzentration der Losung abhangen ; beim isoelektrischen Punkt bei PH 10,5 dagegen von der Konzentration unabhangig

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sind. Die bei endlicher Konzentration bei PH 10,5 erhaltenen Molekular- gewichte sind daher unmittelbar mit den wahren Molekulargewichten der Praparate identisch, ohne daB eine Extrapolation auf die Koneentration Null vorgenommen werden muB.

Rei einigen EiweiBkorpern (Insulin) findet mit zunehmender Verdiin- nung der Losung eine Dissoziation des Molekuls in kleinere Spaltstiicke statt. Ein ahnliches Verhalten scheint nach der in Abb. 4 dargestellten Konzentrationsabhangigkeit der Molekulargewichte beim K I nicht vor- zuliegen. Untersucht man jedoch das Sedimentationsverhalten von sehr verdiiiinten Losungen des Praparates A in einer Ultrazentrifugenzelle von 30 mm Schichtdicke und berechnet daraus das Molekulargewicht nach ARCHIBALD, so erhalt man die in Abb. 5 dargestellten apparenten Mole- kulargewichte. In der Abb. 5 sind ferner die wahren Molekulargewichte des in der Losung vorhandenen Eiweiflkorpers eingezeichnet. Diese Werte lassen sich bis zu einer Konzentration von 0,2 % aus der Konzentrations- abhangigkeit der apparenten Molekulargewichte nach Abb. 4 berechnen.

02 44 Q6 48 lo X I - Konzenf/o;'/on /h g/LV m/

40

Abb. 5. Abhangigkeit der apparenten Molekulargewichte (%,),,, (x) fiir den Kallikrein- Inaktivator von der Konzentration in 0, l m Phosphatpuffer, PH 7,4 fiir' das Praparat A1 . o = wahre Molekulargewichte %,, berechnet unter Beriicksichtigung der Konzentrations -

abhan5igkeit

Die Abb. 5 zeigt, dal3 beim Abnehmen der KI-Konzentration im Kon- zentrationsbereich von 1 % bis 0,2 % die apparenten Molekulargewichte in bekannter Weise ein wenig zunehmen. Wird die Losung jedoch weiter verdiinnt, so nehmen die Molekulargewichte laufend ab. Bei einer Kon-

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w. SCHOLTAR und s. Y. LIE

zentration von 0,05 % liegen dann nur noch KI-Molekule vom Molekular- gewicht 6500 vor. Offenbar findet im Xonzentrationsbereich unter 0,2 eine Dissoziation der Molekule in kleinere Untereinheiten vom Moleku- largewicht '6500 statt.

Einen bemerkenswerten Unterschied zeigen die mit Sephadex gereinigten Praparate C 1 und C2 von den ubrigen in der pH-Abhangigkeit ihres Molekulargewichtes. Aus der Abb. 4 b ist ersichtlich, daB ihr Molekular- gewicht vom PH der Losung weitgehend unabhangig ist ; es wurde immer ein Molekulargewicht von 6500 f 200 gefunden. Dieser Wert stimmt mit dem aus der Aminosauresequenz von ANDERER und HORNLI l) bestimmten Molekulargewicht von 6511 sehr gut uberein. Aus dieser Unabhangig- keit des Molekulargewichtes vom pH-Wert muB gefolgert werden, daB der Kallikrein-Inaktivator in reiner Form nicht zur Assoziation neigt, sondern auch in Losungen von verschiedenem pH-Wert als Einzelmolekul bestandig ist.

Im Gegensatz dazu sind die Molekulargewichte der nicht uber Sephadex gereinigten Praparate vom pH-Wert der Losung abhangig, wie in Abb. 6 gezeigt ist. Man erkennt, daB das Praparat A1 in neutraler Losung ein maximales Molekulargewicht besitzt. I m sauren und alkalischen Gebiet ist mit zunehmender Konzentration der H+- bzw. OH--1onen eine fort- schreitende Verminderung des Molekulargewichtes verbunden.

0 2 4 6 8 10 72 p,, -Ned

Abb. 6 . Abhangigkeit des wahren (w,) und des apparenten Molekulargewichtes (&fw)app von der Konzentration des Kallikrein-Inaktivators und vom pH-Wert der Losung fur das

PrPparat A1

Besondere Verhaltnisse liegen bei p~ 12,5 vor (vgl. Abb. 7). In Losun- gen des Praparates B 2, die unmittelbar vor dem Ultrazentrifugenversuch angesetzt wurden, betragt das Molekulargewicht dieses Praparates M, = 6810. Die Abhangigkeit der reziproken Molekulargewichte von der -

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Konzentration wird im Gegensatz zu allen anderen pH-Werten durch eine Gerade mit negativer Steigung wiedergegeben. Der zweite Virialquotient ist bei p~ 12,5 also negativ. Negative Virialkoeffizienten sind z.B. auch bei osmotischen Messungen von Insulinlosungen von GUTFREUND~) beobachtet worden; das konnte in diesem Falle durch ein Assoziations-Dis- soziations-Gleichgewicht erklart werden : die bei kleiner EiweiBkonzen- tration vorliegenden Insulin-Molekiile lagern sich bei Konzentrations- steigerung zu Assoziaten zusammen. Auch unsere bei p~ 12,5 erhaltenen Versuchsergebnisse weisen auf das Vorliegen einer solchen Assoziations- reaktion hin. Die Ultrazentrifugenaufnahmen nach ARCHIBALD lassen erkennen, daB das apparente Molekulargewicht in 0,d-proz. KI-Losung mit der Zeit laufend ansteigt (vgl. Abb. 3) ; dagegen nimmt das apparente Molekulargewicht in 1-proz. Losungen bei p~ 12,5 wie bei allen anderen pH-Werten mit der Zeit ab. Die Zunahme des apparenten Molekularge- wichtes bei kleiner Eiweifikonzentration wird unseres Erachtens nicht durch thermodynamische Faktoren, sondern tatsachlich durch die Zu- nahme des Molekulargewichtes des K I verursacht.

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v ?4 2 ‘$2

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‘ 08 L

K l - Konzenffufkm /n g/100 ml Abb. 7. Abhangigkeit des reziproken apparenten Molekulargewichtes (~,),,, von der Konzentration des Kallikrein-Inaktivators und vom Alter der Losung bei JJH 12,5 fiir das

Praparat B2

Einen Beweis dafur, daB das Molekulargewicht von KI-Losungen bei p~ 12,5 tatsachlich zeitlich veranderlich ist, liefert die Molekulargewichts- bestirnmung von Losungen, die mehrere Stunden bzw. Tage gestanden habert (vgl. Abb. 7 und Tab. 4). Das Praparat B 2 hat unmittelbar nach dem Ansetzen ein Molekulargewicht von 6810, das nach 2 Tagen auf 10520’und nach 7 Tagen bis auf 12690 ansteigt. Bei noch langerem Ste- hen der Losung findet nur noch eine unwesentliche Zunahme des Mole- kulargewichtes statt. I n einer 17 Tage alten Losung wurde z. B. ein Mole- kulargewicht von 13000 gefunden. Es hat den Anschein, als ob damit ein

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Kv bei p~ 12,s Zeit in Tagen

oberer Grenzwert fiir das Molekulargewicht des veranderten Produktes erreicht ist. Aus der Konzentrationsabhangigkeit der reziproken Mole- kulargewichte errechnen sich fur diese Losungen wieder positive Werte fur den zweiten Virialkoeffizienten.

PW nach dem Neutralisieren

Tab. 4. Zeitliche Abhangigkeit des Molekulargewichtes aw des Praparates B 2, gelost im Puffer PH 12,5

10 890 10 520 12610 12690 12 670 I 17 13000

2. Reversibilitat der Molekulargewichtsanderungen

Zur Priifung der Frage, ob die durch pH-Anderung verursachten Ver- anderungen des Molekulargewichtes reversibel sind, wurden Losungen des KI-Praparates A1 bestimmte Zeiten bei verschiedenen pH-Werten aufbewahrt, dann neutralisiert und das Molekulargewicht nach ARCHI- BALD bestimmt. Wie aus der Abb. 6 ersichtlich ist, besitzt das Praparat A 1 bei PH 7,4 ein Molekulargewicht von 9310, das sich in alkalischer Lo- sung @H 10,5) bis auf 7590 verringert. LaBt man diese alkalische Losung 72 Stunden stehen und neutralisiert sie dann, so erhalt man ein Moleku- largewicht von 9490. Dieses Molekulargewicht ist mit dem Ausgangswert der ursprunglichen Losung praktisch identisch.

In entsprechender Weise verringert sich das Molekulargewicht des Pra- parates A1 in saurer Losung von 9310 bis auf 7640. Neutralisiert man eine Losung vom PH 1 , l nach 4 Stunden, so findet man fiir das Moleku- largewicht des Praparates den im Vergleich zur Ausgangslosung nur wenig kleineren Wert von 8900. Auch diese Molekulargewichtsanderung ist also weitgehend rucklaufig.

Um zu entscheiden, bis zu welchem pH-Wert die beobachtete Moleku- largewichtsverminderung gilt, wurde das Praparat B 2 in einer Puffer- losung vom PH 12,5 gelost. Neutralisiert man die Losung nach 4 Stunden, so erhalt man fur das Molekulargewicht des KI einen Wert von 10890. In einer Losung, die 48 Stunden nach demednsetzen neutralisiert worden ist, steigt das Molekulargewicht des K I bereits auf 12610 an und erreicht nach 7 Tagen nach analoger Behandlung einen Wert von 12670 (vgl.

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Tab. 4). Der in alkalischer Losung bei PH 12,5 gefundene Anstieg des Molekulargewichtes bedingt also nach dem Neutralisieren der Losu2g auch einen zusatzlichen Anstieg des Molekulargewichtes in neutraler Losung. Das fur die neutrale Losung dieses Praparates charakteristische Molekular- gewicht von etwa 10 000 wird dadurch wesentlich uberschritten. Daraus mu13 man folgern, daB der bei PH 12,5 beobachtete Anstieg des Molekular- gewichtes weitgehend irreversibel ist und somit als Denaturierungs- erscheinung aufzufassen ist.

Ein gewisser Teil der Molekiile ist allerdings auch in stark alkalischer Losung noch befahigt, in kleinere Molekule zu dissoziieren. Erniedrigt man denpa-wert einer 17 Tage alten LosungvonpH 12,5 durch Saurezugabe auf 10,5, so vermindert sich das Molekulargewicht von 13 000 auf etwa 10 000.

Die Veranderlichkeit des Molekulargewichtes mit dem p H - Wert der Losung und mit der EiweiBkonzentration bei den Praparaten A und B kann unseres Erachtens als Folge eines Assoziations-Dissoziations-Gleich- gewichtes befriedigend erklart werden. Das unter verschiedenen Ver- suchsbedingungen beobachtete Ansteigen des Molekulargewichtes laBt sich zwanglos deuten, wenn man annimmt, daB sich mehrere KI-Mole- kiile vom Molekulargewicht 6500 zu einem Komplex vereinigen. Da die Praparate C im Gegensatz zu den Praparaten A und B bei verschiedenen pE-Werten jedoch stets das gleiche Molekulargewicht aufweisen, so muB man schlieoen, daB die KI-Molekiile allein (in reiner Form) offenbar keine Assoziationstendenz haben ; man muB vielmehr annehmen, dal3 die As- soziation durch niedermolekulare Begleitstoffe ausgelost wird, die als Veruiireinigung noch in den Praparaten vorhanden sind. Da das Moleku- largewicht bei allen Versuchen nicht groBer als 13 000 gefunden wurde, so werden durch den als Bindeglied wirkenden Stoff offenbar nicht mehr als 2 Molekiile zu einem Komplex verbunden. Weitere Aufschliisse iiber die Art des Assoziationsvorganges ergeben sich aus den in den folgenden Abschnitten beschriebenen Versuchen.

3. Molekulargewichtsverteilung aus TRAUTMANN-Diagrammen

Die bei verschiedenen pH-Werten und fur verschiedene Praparate erhaltenen TRAUTMANN-Diagramme sind in der Abb. 8 wiedergegeben.

Bemerkenswert ist, daf3 die TRAUTMANN-Diagramme der Praparate geradlinig verlaufen, wahrend die TRAUTMANN-Diagramme der Praparate A und B mehr oder weniger gekriimmt sind. Der geradlinige Verlauf des TRArrTMANN-Diagrammes ist (fur Losungen mit PH 10,s) ein Hinweis darauf, daB die Molekiile dieses Praparates einheitlich sind. Aus der Krum-

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w. SCHOLTAN und s. Y. LIE

Abb. 8. TRAUTMANN-Diagram von 1-proz. Losungen des Kallikrein-Inaktivators fiir die Priiparate A l , C 2 und C 3

mung der TRAuTMANN-Diagramme der Praparate A und B mufi dagegen geschlossen werden, da13 die Losungen mehrere Molekiilarten von unter- schiedlichem Molekulargewicht enthalten. Dieser SchluB ist allerdings nur dann zwingend, wenn die Molekulargewichte und die Molekular- gewichtsverteilungen unabhangig von der Konzentration sind und der zweite Virialkoeffizient Null ist. Dies ist bei PH 10,s der Fall. I n diesem Fall erhalt man aus dem Kurvenzug des TRAUTMANN-Diagramms nicht nur das Gewichtsmittel und das Z-Mittel der Komponenten, sondern auch das Molekulargewicht der in der Losung vorhandenen niedermolekularen Komponenten. Aus dem TRAUTMANN-Diagramm der Abb. 8 ergibt sich z.B., daB die 1-proz. Losung des Praparates A 1 eine niedermolekulare Komponente vom Molekulargewicht 6490 enthalt. Fur die Mittelwerte des Molekulargewichtes aller Komponenten erhalt man M, = 7590 und zz = 8370 bzw. 9460. -

218


Das Molekulargewicht der in dem Praparat A 1 gefundenen niedermolekularen Komponenten stimmt mit dem Molekulargewicht der Praparate C gut iiberein. Aus dem Molekulargewicht der niedermolekularen Kompo- nenten und den Mittelwerten des Molekulargewichtes mw und Ez lafit sich unter gewissen Annahmen die Konzentration der niedermolekularen Komponenten berechnen.

Fur das Gewichtsmittel und das Z-Mittel einer aus zwei Komponenten bestehenden Mischung, die in den Konzentrationen c1 und c2 vorliegen, gelten die Gleichungen:

Bei Kenntnis von MI, Mw und %& konnen daher die Konzentrationen c1 und c2 berechnet werden. Aus den Gln. (5) und (6) ergibt sich fur die relative Konzentration cz/c :

Nach G1. (7) erhalt man dann mit M, = 6500; Ew = 7590 und Rz = 8370 fur die relative Konzentration der hochmolekularen Komponenten den Wert 100 *c2/c = 16,9 %. Entsprechend betragt die relative Konzentration der niedermolekularen Komponenten c1 = 83,l %. Mit diesen Werten erhalt man das Molekulargewicht der hohermolekularen Komponente nach G1. (l;); es ergibt sich M, = 13000.

Die nach dieser Methode durchgeftihrte Molekulargewichtsberechnung ist allerdings stark van der Lage der eingezeichneten Tangente abhangig. Durch die eingezeichneten Wertepaare lieBe sich auch eine Tangente legen, aus deren Steigung sich ein Z-Mittel van 9460 ergeben wiirde. In diesem Falle wiirde c1 = 92,15%, c, = 7,85% und M, = 20494 betragen.

Die Fehlerbreite der Bestimmungsmethode gestattet es also nicht, die Existenz van Assoziaten mit einem Molekulargewicht van 13000 in der Losung mit zwingender Not- wendigkeit zu beweisen. Die gefundenen Versuchsergebnisse lassen sich aber gut mit der Existenz solcher Assoziate vereinbaren.

Den Gin. (5) bis (7) liegt die Annahme zugrunde, daB in der Losung zwei verschiedene Molekiilarten vorhanden sind, die nicht miteinander im Gleichgewicht stehen und sich nicht ineinander umwandeln.

Van diesen Annahmen ist bei den Praparaten A und B des Kallikrein-Inaktivators wahrscheinlich nur die erste erfiillt. Die Existenz der Molekiilart vom Molekulargewicht 6500 kann auf Grund unserer Versuche als gesichert betrachtet werden. Diese Molekiilart steht jedoch bei hoherer KI-Konzentration im Gleichgewicht mit hohermolekularen As-

219


soziaten. Erst bei einer Konzentration, die kleiner als 0,2 yo ist, zerfden die in der Losung der Praparate A oder B vorhandenen Assoziate in Molekiile vom Molekulargewicht 6500. Da beim Ultrazentrifugenversuch die EiweiBkonzentration am Fliissigkeitsmeniekus laufend abnimmt, so verandert sich auch die relative und die absolute Konzentration der an der Fliissigkeitsoberflache vorhandeuen Molekiilarten im Lade des Versuches fortwihrend.

Die in Abb. 5 dargestellte Konzentrationsabhangigkeit der Molekulargewichte zeigt aber andererseits, daB die Verminderung des wahren Molekulargewichtes bei Verringerung der EiweiBkonzentration von 1 bis 0,2% anscheinend nicht sehr grof3 sein kann, da das apparente Molekulargewicht in diesem Konzentrationsbereich ansteigt.

Die aus den ersten Punkten des TRAuTmNN-Diagramms zu Beginn des Versuches berechneten Mittelwerte gw und gz geben daher in guter Nkiherung die Mittelwerte fiir die zu Beginn des Versuches in der Losung vorhandenen Molekiilarten an.

Die aus diesen Mittelwerten berechneten Konzentrationen der beiden Molekiilarten gelten dann ebenfalls fiir den anfanglich in derAusgangslosung vorliegenden Gleichgewichts- zustand.

4 . Abhangigkeit. der Molekulargewichte von der Zusammensetzung des Losungsmittels

Um festzustellen, welchen EinfluB die Zusammensetzung des Losungs- mittels auf das Molekulargewicht der KI-Praparate ausubt, wurden einer 1-proz. KI-Losung (gelost in 0,l rn Phosphatpuffer von PH 7,4) verschie- dcne organische Losungsmittel und Salze in unterschiedicher Konzen- tration zugesetzt. Als Zusatzstoffe wurden solche Verbindungen gewahlt, die bei anderen EiweiBstoffen eine Dissoziation des Molekuls in kleinere Untereinheiten bewirken. Die unter diesen Versuchsbedingungen gefundenen Molekulargewichte sind in der Tab. 5 zusammengestellt.

Tab. 5. Abhangigkeit der Molekulargewichte (P,),,, des Praparates B2 (1 g/100ml) in 0,l m Phosphatpuffer vom p~ 7,4 von der Art und Konzentration von Zusatzstoffen -

Zusatzstoff

- Mercaptathanol Alkyldimethylbenz ylammoniumchlorid Harnstoff hithanol KCN Na2S0, NaCl NaCl

Konzentration

1 g/100 ml

6 m 30 m1/100 ml

1 g/100 ml 1 g/100 ml 5 g/100 ml

10 g/100 ml

1 g/lOO ml

8710 8870 8870 8790 8800 8950 8230 7910 7360

WW oach Abb. 9

9700

9700

8820 8210

220


Aus der Tabelle ist ersichtlich, daB durch den Zusatz der verschiedenen organischen Stoffe das Molekulargewicht des Praparates kaum verandert wird. Da durch Mercaptathanol und KCN das Molekulargewicht nicht erniedrigt wird, so mu13 geschlossen werden, daB der Zusammenhalt des Assoziates nicht durch reversibel aufspaltbare Schwefelbriicken zustande kommt. Auch hydrophobe Bindungen, die durch die Einwirkung von Harnstoff verandert wiirden, konnen keine wesentliche Rolle spielen. Dagegen wird das Molekulargewicht des Praparates durch den Zusatz von Salzen verringert, und zwar ist die Molekulargewichtsverringerung um so groBer, je starker die Ionenstarke in der Losung ist (vgl. Abb. 9).

1 I I

K/ - Konzentruhon in g//OUm/ 42 44 46 48 (0

Abb. 9. Abhingigkeit des reziproken apparenten Molekulargewichtes (aw)app des Kalli- krein-Inaktivators fiir das Prlparat B2 in 0, l rn Phosphatpuffer vompH 7,4 von der Kon-

zentration in Gegenwart von NaCl oder Harnstoff

Die Abhangigkeit des Molekulargewichts von der Ionenstarke und vom pH-Wert der Losung ist ein Hinweis dafiir, darj die Assoziation der KI- Molekiile durch eine Wechselwirkung zwischen den polaren Gruppen der Reaktionspartner verursacht wird. F'iir den Zusammenhalt der Molekiile im Assoziat miissen also elektrostatische Bindungen oder Wasserstoff- briickenbindungen verantwortlich sein.

5 . Eiaktionierung durch Dialyse und durch Gel- Filtration

Weitere Aufschliisse iiber die in der Losung der Praparate A und B vorliegenden Molekiilarten erhdt man durch Dialyseversuche und durch Gel-Filtration.

Fiir den Dialyseversuch wurden 2 ml einer 5-proz. Losung des Praparates A 1 in Gly- cinpuffer,pH 10,5, in dem von uns konstruierten Dialysegerat') gegen 2 ml Glycinpuffer dialysiert. Fiir die Dialyse wurde eine Cellophanmembran 600 benutzt. Die Pufferlosung

22 1


des Dialysegerkes wurde nach gewissen Zeitabschnitten erneuert. AnschlieBend wurden die in den beiden Kammern des Dialysegerates befindlichen Losungen in der Ultrazentri- fuge nach dem Verfahren von TRAUTMANN untersucht (vgl. Abb. 10).

Abb. 10. TRAUTMANN-Diagramme des Kallikrein-Inaktivators fiir das Praparat 0,l m Glycinpuffer vom p~ 10,5, fraktioniert durch Dialyse

B2 in

Das TRAUTMANN-Diagramm des nach 8-stiindiger Dialyse erhaltenen Dialysates zeigt, daB der zuerst hindurchdiffundierende EiweiBkorper einheitlich ist, ein Molekulargewicht von 6510 hat und damit offenbar mit dem EiweiBkorper der Praparate C identisch ist. Anscheinend vermogen die in den Praparaten A oder B enthaltenen niedermolekularen Begleit- stoffe, die eine Assoziation der KI-Molekiile bedingen, nicht in die Puffer- kammer des Gerates zu diffundieren, sondern werden von der Membran adsorbiert. (Da die Konzentration des KI in der Pufferkammer 0,64 % betrug, so ist ein allein durch Verdiinnung bewirkter Zerfall des Assozia- tes wenig wahrscheinlich.)

Der beim zweiten Austausch nach 24-stiindiger Dialyse erhaltene EiweiBkorper hat immer noch ein sehr kleines Molekulargewicht von 6940. Die Kriimmung des TRAUTMANN-Diagramms (in Abb. 10 nicht eingezeichnet) 1aBt erkennen, daB dieser EiweiBkorper allerdings nicht mehr vollig einheitlich ist, sondern bereits hohermolekulare Anteile enthalt. Nach einer Versuchsdauer von 154 Stunden - wahrend dieser Zeit wurde die AuBenfliissigkeit 6mal ausgetauscht - verbleiben in der KI-Kammer des Dialysegerates EiweiBmolekiile mit einem mittleren Molekulargewicht von 11 250. Dieser Wert des Molekulargewichtes kommt unseres Erach- tens dadurch zustande, daIj in dieser Losung nur noch ein geringer Anteil von KI-Molekiilen mit einem Molekulargewicht von 6500 vorhanden ist, daB der groBte Teil der Molekiile dagegen in Form eines dimeren As-

222


soziates vorliegt. Da die KI-Konzentration in dieser Losung 0,75 % betragt, so ist auch nicht zu erwarten, da13 die Assoziate in Molekule vom Molekulargewicht 6500 zerfallen. Ein solcher Zerfall wurde erst bei Kon- zentrationen unter 0,2 % auftreten.

Die Versuche zeigen, da8 es moglich ist, die Praparate A und B durch Dialyse in Fraktionen unterschiedlichen Molekulargewichts zu zerlegen. Eine entsprechende Auftrennung sollte daher auch durch Gelfiltration moglich sein.

Fiir die Gelfiltration wurde Sephadex G 75 verwandt, das in 0, l m Phosphatpuffer vom p~ 7,4 zum Quellen suspendiert worden war und anschlieaend in eine Glassaule von 100 cm Lange und 1,s cm Durchmesser eingefiillt wurde. Zur Fraktionierung wurden 250 mg des Praparates B 2, gelost in 2 ml Phosphatpuffer, auf die obere Schicht der Sephadexsade gegebeii und dann mit 0,l m Phosphatpuffer eluiert. Die Stromungsgeschwindigkeit der Pufferlosung betrug 7 d / h . Das Eluat wurde mittels eines automatischen Fraktions- sammlers in Fraktionen von je 6 ml zerlegt. Die EiweiDkonzentration der Fraktionen wurde durch Messung der UV-Absorption bei 275 rnp bestimmt. Die erhaltenen Versuchs- ergebnisse sind in Abb. 11 dargestellt. Es ist ersichtlich, daB die bei der Gelfiltration des K I

Abb. 11. Fraktionierungskurve fiir den Kallikrein-Inaktivator (Praparat B 2), erhalten durch Gelfiltration mit Sephadex G 75

erhaltene Fraktionierungskurve unsymmetrisch ist und eine Schulter bei der 26. Fraktion aufweist. Die Form der Kurve ist ein Hinweis dafiir, daB das Praparat B 2 nicht einheitlich ist, sondern aus mehreren Komponenten besteht. Von den Fraktionen 22 und 26 wurde daher das Sedimentationsverhalten in der Ultrazentrifuge untersucht, und die TRAUTMANN- Diagramme wurden berechnet.

223


46 I I I I I I

3 10 15 20 25 Eweflkonzen~ruhon dcmF in wilkhichen finheiten (cm

Abb. 12. TRAuTMANN-Diagram der Fraktionen 22 und 26 am der Gelfiltration des Kallikrein-Inaktivators (Priiparat B2) iiber Sephadex G 75 (s. Abb. 11)

Aus den in Abb. 12 dargestellten TRAUTMANN-Diagrammen erhalt man fur die apparenten Molekulargewichte der beiden Fraktionen die Werte 6550 und 10 780. Unter Berucksichtigung der Konzentrationsabhangig- keit ergeben sich daraus die Gewichtsmittel %fw = 7360 bzw. gw = 13 150. Aus der Krummung der TRAUTMANN-Diagramme ist ferner zu schlieBen, daB die gewonnenen Fraktionen nicht ganz einheitlich sind, sondern noch Molekule anderer GroBe enthalten.

Eine partielle Auftrennung des KI wurde in entsprechender Weise auch bei anderen pH-Werten beobachtet, z.B. in 0, l m Essigsaure. Dabei erhdt man zwar keine reineren Fraktionen; durch Gefriertrocknung lassen sich jedoch salzfreie KI-Fraktionen gewinnen.

Unsere Versuche zeigen, daB in Losungen des Praparates B 2 Molekiile vom Molekulargewicht 6500 und Assoziate vom Molekulargewicht 13 000 nebeneinander vorliegen. Durch Dialyse und Gelfiltration findet eine partielle Trennung der Komponenten statt. Ferner wurde gefunden, daB das Molekulargewicht der KI-Molekule vom Molekulargewicht 6500 selbst bei einer Beobachtungszeit von mehreren Wochen vollstandig unveran- dert bleibt. Die KI-Molekiile zeigen also in reiner Form keinerlei Tendenz, Assoziate zu bilden. Auch daraus mu13 geschlossen werden, daB die beobachtete Assoziation des KI keine Eigenschaft ist, die dem Molekiil als solchem zukommt und durch die Struktur des Molekiils bedingt ist, sondern vielmehr durch gewisse Zusatzstoffe bewirkt wird.

6. Form des Kallikrein- Inaktivators

Aus der Sedimentations- und Diffusionskonstante einer Substanz kann nicht nur das Molekulargewicht des Stoffes berechnet werden; mit Hilfe

224


903

des Reibungsverhaltnisses f/fo konnen vielmehr auch Aussagen uber die Form des Molekiiles gemacht werden. Bei fehlender Hydratation wiirde sich aus f/fo = 1,387 (s. Tab. 3 und Tab. 6) fur das Achsenverhaltnis ein Wert von 1 : 7,2 ergeben. Nimmt man an, daB 1 g EiweiB in der Losung 0,2 g Wasser zu binden vermag, so laBt sich aus dem Reibungsverhaltnis und der Hydratation (S = 0,2 g H,O/g EiweiB) das Achsenverhdtnis nach einem von ONCLEY~) berechneten Diagramm ermitteln. Man findet dann ein Verhdtnis von 1 : 5.

Zusataliche Aufschlusse uber die Form der KI-Molekiile erhdt man aus Viskositatsmessungen.

In Abb. 13 ist die Konzentrationsabhangigkeit der reduzierten spezifischen Viskositat fur eine KI-Losung vom pH-Wert 10,5 dargestellt; es besteht zwischen der reduzierten spezifischen Viskositat und der Konzen- tration eine lineare Beaiehung. Durch Extrapolation auf die Konzentra- tion Null erhalt man fur die Viskositatszahl des KI den Wert [q] = 3,26

d - - - - - L I

I 1 I I

ml/g. Das Viskositatsinkrement ergibt sich dann als Quotient von [I] und dem partiellen spezifischen Volumen zu v = 3,26/0,726 = 4,48 d / g . Die- sem Viskositatsinkrement entspricht auf Grund der von MEHL und Mit- arb. angegebenen Beziehung5) bei fehlender Solvatation ein Achsenver- hdtnis von 1 :3,8. Berucksichtigt man jedoch die Hydratation des Stoffes und nimmt man dafur wieder einen Wert von 0,2 g H,O/g Protein an, so ergibt sich nach MEHL fiir das Achsenverhaltnis des KI-Molekiils ein etwas kleinerer Wert, und zwar 1:2,8 (vgl. Tab. 6).

225


Konzentration ( d l )

Tab. 6. Reibungsverhdtnis f/fo, Viskositiitsinkrement v und Achsenverhdtnis des Kallikrein-Inaktivators

Achsenverhiiltnis unsolvatisiert I solvatisiert

~ . 1 0 - 7 (Ww)a,, (l/mo1)2

f/fo = 1,387 ................ v = 4,48 (ml/g) .............

0,022 0,024 0,026 0,026 0,050 0,047 0,047 0,047

0,052 0,082 0,127

0,055

Ein Vergleich der aus dem Sedimentationsverhalten und dem Viskosi- tatsverhalten berechneten Achsenverhaltnisse zeigt zwar gewisse Abwei- chungen; es kann aber trotzdem mit Sicherheit geschlossen werden, daB die Gestalt des Kallikrein-Inaktivators ahnlich wie die des Albumins merklich, wenn auch nicht sonderlich stark von der Kugelform abweicht.

6910 9070 9550 1,45a) 8900

9840 9320 9210 8360 9150 8950 8940 8130

10830 10,6")

7. Assoziationsreaktionen des Kallikrein- Inaktivators

Um festzustellen, welche Verbindungen eine Assoziation des Kallikrein- Inaktivators verursachen, wurde zunachst die Wirkung einer Reihe von im Organismus vorkommenden Purinen und Pyrimidinen auf das Mole- kulargewicht untersucht. Das molare Konzentrationsverhdtnis betrug bei diesen Versuchen 4 Mol KI auf 1 Mol Zusatzstoff; das Ergebnis ist in Tab. 7 wiedergegeben. Diese Tabelle zeigt, daI3 alle untersuchten Purine

Tab. 7. E i d d verschiedener Purine und Pyrimidine auf das Molekulargewicht (Mw)app

des Kallikrein-Inaktivators (KI) (Praparat C 3 ) bei 20°C (0,s g/100 ml KI in 0,l rn Phosphatpuffer, PH 7,4)

- Zusatzstoff

- ................. Uracil. ............. Thymin ............ Cytosin ............ Adenin :. ........... Guanin ............. Uridin ............. Thymidin .......... Cytidin ............ Guanosin ........... Adenosin ........... Adenosindiphosphat . Adenosintriphosphat .

1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92

a) Berechnet aus Abb. 14, K = Gleichgewichtskonstante der Reaktion (8).

226


und Pyrimidine als Komplexbildner auftreten konnen und das Molekular- gewicht mehr oder weniger erhohen. Eine besonders starke Wirkung hat das Adenin; die Bindung dieser Substanz an das K I erfolgt offenbar mit besonders grol3er Affinitat. Die desoxyribosehaltigen Verbindungen werden im Vergleich zu den entsprechenden zuckerfreien Verbindungen im allgenieinen weniger stark gebunden. Besonders auffallend ist der Affini- tatsruckgang beim Vergleich der durch Adenin und durch Adenosin be- wirkten Dimerisierung. Durch hydroxylhaltige Verbindungen wird die Wechselwirkung der Komponenten offenbar vermindert. Eine weitere Verminderung der Affinitat tritt ein, wenn das Adenosinmolekiil zusatzlich niit zwei bzw. drei Molekiilen Phosphorsaure verbunden ist.

Die durch Purine und Pyrimidine bewirkte Molekulargewichtserhohung des KI beruht unseres Erachtens auf einer Wechselwirkung der Kompo- nenten, die dem Massenwirkungsgesetz gehorcht und durch folgende Gleicligewichtsreaktion ausgedriickt werden kann:

In dieser Gleichung hezeichnet P den Kallikrein-Inaktivator und L den Komplexbildner. Bezeichnet man ferner die molare Konzentration der Stoffe mit [PI und [L], so ergibt sich fur die Gleichgewichtskonstante K dieser Reaktion:

Die molare Konzentration [L] des freien Komplexbildners ergibt sich a= der Differenz zwischen der molaren Konzentration CL des gesamten Kom- plexbildners abziiglich der molaren Konzentration des gebundenen Kom- plexbildners. Letztere ist gleich der molaren Konzentration [P,L] des KI-Komplexes. Es gilt also:

[Ll = cL-[P,Ll (10)

Wird die Konzentration der EiweiBstoffe nicht in mol/l, sondern in g/1 angegeben, so gilt:

Konzentration des monomeren KI : c1 [dll = [PI.M,

Konzentration des gesamten KI: c k / l l = c1+ CZ

Konzentration des dimeren Komplexes :

Molekulargewieht des monomeren KI: Molekulargewicht des dimeren Komplexes: M, = 13000 -L ML

c, [g/Z] = [P,L] .M,

M, = 6500 13000 2 2M,

227


Fur die Gleichgewichtskonstante der Reaktion ergibt sich dann :

Durc rmformung der G1. (11) erhalt man die fur die Berechnung der Gleichgewichtskonstante K wichtige Beziehung:

Durch Umformung der G1. (12) erhalt man die folgende Gleichung 3. Grades :

Setzt man in dieser Gleichung fur c, CL und K bestimmte Werte ein,so kann man die Konzentration c, des monomeren KI berechnen. Dividiert man c, durch die Gesamt-Konzentration c, so erhalt man den Quotienten CJC, durch den der Dissoziationsgrad tc des KI-Komplexes charakterisiert werden kann. Der Assoziationsgrad p des Kallikrein-Inaktivators ergibt sich aus der Beziehung:

p = I-a (15)

Die Konzentration des monomeren KI (nicht assoziiertes KI) kann ferner aus dem experimentell bestimmten Gewichtsmittel des Molekulargewich- tes berechnet werden. Fur das Gewichtsmittel eines aus zwei Komponen- ten (M, = 6500; M, = 13000 + Komplexbildner g 13000) bestehenden Stoffes gilt:

6500. c1 + 13000. c2

c1 + CP H, =

Berucksichtigt man, daB c, + c, = c bzw. c, = c-c, ist, so erhalt man fur die Konzentration des monomeren K I in guter Naherung:

(17) 13 OOO-%,

6500 c1 = ' C

228


#- I G X'

Um festzustellen, ob die Wirkung zwischen dem KI und den Purinen und Pyrimidinen dem Massenwirkungsgesetz gehorcht und durch die Gln. (11) bis (17) beschrieben werden kann, wurde das Molekulargewicht des K I (Praparat C3) in 0, l m Phosphatpufferlosung bestimmt, die 5 g/Z KI und steigende Mengen des Zusatzstoffes (Thymin bzw. Adenin) enthielt.

Aus den nach ARCHIBALD bestimmten apparenten Molekulargewichten (mw)app wurde unter Beriicksichtigung der Konzentrationsabhangigkeit die Konzentration des monomeren KI nach G1. (17) ermittelt. Zur Dar- stellung der Versuchsergebnisse und zur Berechnung der Gleichgewichts- konstanten wurde nach G1. (13) der Quotient c2/c: gegen den Ausdruck CL- (c2/13 000) aufgetragen. Bei dieser Darstellungsart erhalt man gerade Linien, die aber nicht dusch den Nullpunkt des Koordinatensystems ge- hen, sondern die Abszisse im negativen Bereich schneiden. Die Ursache dafiir liegt wohl darin, da13 das monomere K I nicht vollig rein ist und noch Spuren eines als Bindeglied auftretenden Begleitstoffes enthalt. Nimnit man an, da13 in der 0,S-proz. KI-Losung zusatzlich noch 2 mg/100 ml des Komplexbildners enthalten sind, so lassen sich die Versuchsergeb- nisse durch die in Abb. 14 dargestellten Geraden wiedergeben. Aus der Steigiing der Geraden ergeben sich die Gleichgewichtskonstanten Krhymin = 1,45.107 und K*denin = 1.06-108 (Z/mol)2.

229


Abb. 15. Abhiingigkeit des Assoziationsgrades p bzw. des mittleren Molekulargewichtes P, des Kallikrein-Inaktivators (KI) von der molaren Konzentration des Komplexbildners fiir verschiedene Gleichgewichtskonstanten K. Die ausgezogenen Kurven wurden theore- tisch nach dem Massenwirkungsgesetz berechnet. +, 0 = experimentell erhaltene Werte fiir eine KI-Konzentration (0,5 g/100 ml in 0,l rn Phosphatpuffer vom PH 7,4) unter Zusatz

von Thymin (0) und Adenin (+)

I n Abb. 15 sind die experimentell bestimmten mittleren Molekular- gewichte Mw in Abhangigkeit von der Konzentration des Komplexbild- ners (Adenin und Thymin) aufgetragen; sie zeigt, daB bei gleicher Molari- tiit der Zusatzstoffe Adenin eine starkere Erhohung des Molekulargewichts bewirkt als Thymin. In Abb. 15 ist ferner fur einige Gleichgewichtskon- stanten K die Abhangigkeit des Assoziationsgrades p von der Konzen- tration des Komplexbildners berechnet. Die Abbildung zeigt, daB der experimentell erhaltene Assoziationsgrad gut mit den nach dem Massen- wirkungsgesetz berechneten Werten iibereinstimmt. Die Wechselwirkung von KI mit Adenin und Thymin gehorcht also dem Massenwirkungsgesetz und laBt sich durch die Gl. (11) beschreiben.

I n Abb. 16 ist die nach,Gl. (14) berechnete Abhangigkeit des Assozia- tionsgrades von der KI-Konzentration dargestellt. Der Berechnung der meisten Kurven liegt die Annahme zugrunde, daB das Gewichtsverhalt- nis y von KI und Komplexbildner bei allen KI-Konzentrationen konstant ist und daB auf zwei Mol KI ein Mol des Komplexbildners kommen.

Konzentration c des gesamten K I in g/Z 13000 1

; meist - = Konzentration CL des Komplexbildners in mol/l

230

Molekulareewicht. rlw Kallikrein-Inaktivators

' b i0 i5 20 i 5 i 0 C,~?bbin~0//~fdr~-J3000

Abb. 16. Abhingigkeit des Assoziationsgrades p und des mittleren Molekulargewichtes P, des Kallikrein-Inaktivators (KI) von der Gesamt-Konzentration c des KI fiir bestimmte Konzentrationsverhdtnisse y von KI und Komplexbildner und fiir bestimmte Werte der Gleichgewichtskonstanten K; berechnet nach dem Massenwirkungsgesetz G1. (11) mit

Aus der Abb. 16 ist ersichtlich, daB der Assoziationsgrad und das mittlere Molekulargewicht des K I mehr oder weniger von der KI-Konzentra- tion abhangen. Nur bei kleinen Konzentrationen liegt der KI vorwiegend als nichtassoziierte Verbindung vor. Eine Erhohung der KI-Konzentra- tion bewirkt je nach der Natur und der Affinitat des Komplexbildners eine mehr oder weniger starke Molekulargewichtserhohung.

Eine durch Purin- und Pyrimidinderivate bewirkte Dimerisierung von EiweiBstoffen ist bisher nicht beobachtet worden. Unseres Erachtens sind ahnliche Erscheinungen jedoch auch bei anderen EiweiBstoffen zu erwarten. Die Art der Reaktion erscheint zunachst uberraschend, wenn man in ublicher Weise annimmt, daB elektrostatische Krafte zwischen entgegengesetzt geladenen Ionen zu einer Assoziation fuhren. Da die Purine und Pyrimidine bei p~ 7,4 vorwiegend in nichtionogener Form vorliegen, so ist es im vorliegenden Falle nicht moglich, die Assoziation als Wechsel- wirkung zwischen entgegengesetzt geladenen Ionen zu deuten. Es ist jedoch zu berucksichtigen, daB bei der Wechselwirkung der EiweiBstoffe keineswegs ionogene Bindungen immer die Hauptrolle spielen, sondern daB haufig andere Bindungskrafte wichtig sind.

231


Die Purine und Pyrimidine vermogen z. B. Wasserstoffbruckenbindungen zu bilden. A d diese Weise bewirken sie als Komponenten in der Desoxyribonucleinsaure den Zusammen- halt zwischen den aus zwei Ketten bestehenden Molekiilen. Dabei bildet sich z.B. eine Wasserstoffbriickenbindung zwischen dem Wasserstoff der Aminogruppe des Adenins und der Carboxylgruppe des Thymins aus; ferner zwischen dem Stickstoff des Adenins und dem Wasserstoff der Iminogruppe des Thymins. In ahnlicher Weise konnten sich Wasserstoff- briickenbindungen bei der Wechselwirkung von Purinen und Pyrimidinen mit dem KI- Inaktivator ausbilden. Beim KI-Molekiil kommen als Wasserstoff-Donatoren und Wasser- stoff-Acceptoren auI3er der Peptidgruppe die Carboxylgruppe und die Hydroxyigruppe in Frage. Die pH-Abhangigkeit des Assoziationsgrades des K I ist ein Hinweis dafiir, daI3 an der Wasserstoffbruckenbindung vor allem die Carboxylgruppe und die OH-Gruppe der Tyrosins beteiligt sind.

und Pyrimidine ausgeloste Dimerisierung des K I wirft die Frage auf, ob auch andere Stoffe eine ahnliche Wirkung ausiiben. Es ist naheliegend anzunehmen, da13 zur Dimerisierung zwei- und mehrwertige Ionen befahigt sein konnten. Wenn sich namlich ein mehr-

Die durch die Purine

Tab. 8. Molekulargewicht ((xw)app, Rw) des Kallikrein-Inaktivators (KI) unter dem E i d u S mehrwertiger Kationen und Anionen

~

Puffer

0,8 yo NaCl

0,8 ?& NaCl

0,8% NaCl

Tris-Puffer, PH 7,4 Tris-Puffer, PH 7,4 0,l rn Essigsaure

0,8 yo NaCl

0.1 m Phosphat, p~ 7.4 0.1 m Phosphat, PH 7.4

0,l m Phosphat, PH 7,4 0,l m Phosphat, PH 7,4 0,l m Phosphat, PH 7.4

Zusatz

keiner

0,l m Mg-Acetat

0,Ol m Zn-Acetat

keiner 1 % CaCl, + 1 yo MgCl,

0,Ol rn Bthylendiamintetra- essigsiure, Dinatriumsalz I

PH - 2 8

0,Ol rn Na-Citrat

keiner 1 % Athylendiamintetra-

1 % Na-Pyrophosphat 1 yo NaPO, 0.1 yo NaPO,

essigsaure

5360 5550 5750 5960 4560 4840 5150 6050 6050 6180 6660 5810 5450 5710 5890 6150 7800 7920 8080 6200

6480 7090

17500 7880

Kv - 6500

6400

6390

6500

8450

6780

232


wertiges Ion mit zwei KI-Molekulen verbindet, so wurde dadurch eine Dimerisierung des KI-Molekuls erfolgen. Der Zusammenhalt des Kom- plexes wurde in diesem Fall durch elektrostatische Krafte bewirkt, die zwischen den Ionen des Zusatzstoffes und den entgegengesetzt geladenen ionogenen Gruppen des K I wirksam sind. Den EinfluB, den verschiedene mehrwertige Anionen und Kationen auf das Molekulargewicht des mono- mere11 K I ausiiben, geht aus der folgenden Tab. 8 hervor. Aus ihr ist ersichtlich, daB der Kallikrein-Inaktivator in Gegenwart der positiven zwei- wertigen Ionen von Magnesium, Calcium und Zink in neutraler Losung absolut bestandig ist und nicht dimerisiert wird.

Von den untersuchten Anionen verandert die Bthylendiamintetraessig- saure das Molekulargewicht des KI in essigsaurer Losung nicht, in neutraler, p hosphatgepufferter Losung nur geringfiigig. Eine erhebliche Erho- hung des Molekulargewichts wird dagegen durch Citrationen verursacht.

Bemerkenswert ist vor allem der EinfluB, den Phosphationen auf das Molekulargewicht des Kallikrein-Inaktivators besitzen. Wahrend durch Monophosphationen das Molekulargewicht des K I nicht verandert wird, bewirken Pyrophosphationen bereits eine starke Molekulargewichts- erhohung. Eine noch starkere Assoziation der KI-Molekiile wird schliel3- lich durch die Metaphosphationen ausgelost. Die Assoziation fuhrt in diesem Falle iiber die dimeren Molekiile hinaus zu Trimeren und wahrscheinlich zu noch groBeren Aggregaten.

Im Gegensatz zu den Purinen und Pyrimidinen ist jedoch von den untersuchten mehrwertigen Anionen (mit Ausnahme des Metaphosphates) eine wesentlich groBere Konzentration notig, um eine merkliche Dimeri- sierun g zu bewirken. Die Gleichgewichtskonstante fur die Wechselwirkung von K I mit mehrwertigen Ionen ist also wesentlich kleiner als die fur Purine und Pyrimidine.

Die Frage, durch welche in den Praparaten A und B enthaltenen Be- gleitstoffe das Molekulargewicht erhoht wird, kann zunachst nicht ein- deutig beantwortet werden. Gewisse Hinweise sprechen dafiir, daB es sich dabei um Spuren von Stoffen handelt, die Purine bzw. Pyrimidine enthalten. Wie unsere Versuche zeigen, geniigen von diesen Stoffen bereits sehr geringe Mengen, urn das Molekulargewicht des KI durch Bildung von Assoziaten stark zu erhohen. Fur diese Annahme spricht aber vor allem eine Beobachtung, die wir bei der Fraktionierung des KI mittels Sephadex machten. Die zum SchluB der Fraktionierung erhaltenen Losungen ent- hielton einen Stoff (bzw. ein Stoffgemisch), der ein adenosinahnliches UV-Spektrum besaB und in sehr kleiner Konzentration eine Assoziation des KI bewirkte (Abb. 17).

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Abb. 17. Gelchromatographie des Kallikrein-Inaktivators (Priiparat A 1) an Sephadex. UV-Spektren der Fraktion 38 und von Adenosin in n/10 Essigsiiure

Nimmt man an, daD im Priiparat A1 a d zwei Molekiile K I ein Molekiil ekes Begleit- stoffes enthalten ist und daB die Reaktion zwischen dem Protein P und dem Begleitstoff L der G1. (11) gehorcht, dann kann man die Gleichgewichtskonstante dieser Reaktion ermitteln. I n Abb. 16 sind die bei Verdiinnung einer KI-Losung erhaltenen wahren Moleku- largewichte (vgl. Abb. 5) eingetragen; sie zeigt, daB sich unter den angegebenen Voraus- setzungen aus den experimentell ermittelten Molekulargewichten fiir die Gleichgewichts- konstante der Reaktion ein Wert von 3,s .lo7 (I/mol)a ergibt. Da die Assoziate eine relativ kleine Assoziationskonstante besitzen, so ist das Priiparat A 1 bei den unter physiologischen Bedingungen vorkommenden Konzentrationen vollkommen disoziiert.

Fur die Anregung und kritische Stellungnahme zu dieser Arbeit sind wir Herrn Dr. AUHAGEN, Biochem. Labor der FARBENFABRIKEN BAYER AG, Werk Elberfeld, zu groI3em Dank verpflichtet.

Fur die sorgfaltige Durchfuhrung der Versuche danken wir unserem Mitarbeiter Herrn LANGFELD.

') F. A. ANDERER und S. HORNLE, Z. Naturforsch. 20b (1965) 457. *) H. GUTFREUND, Biochem. J. 42 (1948) 544; 50 (1952) 564. 3) B. KASSELL, M. RADICEVIC, ST. BERLOW, R. J. PEANNASKY und M. LASKOWSKY, J. biol.

4) H. KRAUT, W. KORBEL, W. SCHOLTAN und F. SCHULTZ, Hoppe-Seyler's Z. physiol.

5) J. W. MEHL, J. L, ONCLEY und R. SIMHA, Science [New York] 92 (1940) 132. 6 ) J. L. ONCLEY, Ann. N. Y. Acad. Sci. 41 (1911) 121.

Chem. 238 (1963) 3274.

Chem. 321 (1960) 90.

W. SCHOLTAN, Makromolekulare Chem. 54 (1962) 24.

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Molekulargewichtsbestimmung des kallikrein-inaktivators mittels der ultrazentrifuge