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Aus der Frauenklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
mRNA-Expression des CRH-Systems in menschlichen schwangerschaftsspezifischen
Geweben
INAUGURAL-DISSERTATION zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Vorgelegt 2002 von Silke Biller
geboren in Bremervörde
Dekan Prof. Dr. M. Schumacher
1. Gutachter PD Dr. W. Schäfer
2. Gutachter PD Dr. M. Hüll
Jahr der Promotion 2003
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in:
Wetzka B, Sehringer B, Schäfer WR, Biller S, Hör C, Benedek E, Deppert WR,
Zahradnik HP (2002) Human intrauterine tissues show specific patterns of CRH,
CRH receptors, and CRH-binding protein in human gestational tissues at term.
Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. Im Druck
I Inhaltsverzeichnis _________________________________________________________________________________
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung.............................................................................................. 1
1.1 Physiologie von Wehentätigkeit und Geburt ..........................................................1
1.2 Frühgeburt ...................................................................................................................3
1.3 Die Theorie einer Plazentaren Uhr ..........................................................................4
1.4 Corticotropin Releasing-Hormon .............................................................................5
1.4.1 CRH .......................................................................................................................6
1.4.2 Urocortin................................................................................................................7
1.4.3 CRH-Bindeprotein ...............................................................................................8
1.4.4 CRH-Rezeptoren.................................................................................................9
1.5 Die schwangerschaftsspezifischen Gewebe .......................................................10
1.5.1 Myometrium ........................................................................................................10
1.5.2 Dezidua ...............................................................................................................11
1.5.3 Die fetalen Eihäute – Chorion und Amnion ...................................................11
1.5.4 Plazenta ..............................................................................................................11
1.6 RT-PCR......................................................................................................................12
1.6.1 Molekularbiologische Grundlagen ..................................................................12
1.6.2 RNA-Extraktion ..................................................................................................13
1.6.3 Reverse Transkription.......................................................................................13
1.6.4 Polymerasekettenreaktion................................................................................14
1.7 Fragestellungen........................................................................................................17
2 Material und Methoden ..................................................................... 18
2.1 Materialien .................................................................................................................18
2.1.1 Reagenzien.........................................................................................................18
2.1.2 Chemikalien........................................................................................................19
2.2 Gewebebank .............................................................................................................20
2.2.1 Konzept der Gewebebank ................................................................................20
II Inhaltsverzeichnis _________________________________________________________________________________
2.2.2 Gewebegewinnung und Gewebeauswahl .....................................................20
2.2.3 Gewebeaufbereitung.........................................................................................22
2.2.4 Gewebedokumentation.....................................................................................22
2.3 Molekularbiologische Methoden ............................................................................23
2.3.1 RNA-Extraktion ..................................................................................................23
2.3.2 Photometrische Ermittlung der RNA-Konzentration ....................................24
2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................24
2.3.4 Reverse Transkription.......................................................................................25
2.3.5 Polymerasekettenreaktion (PCR) ...................................................................26
2.3.6 Identifikation der PCR-Produkte ......................................................................27 2.3.6.1 Restriktionsendonuklease-Verdau .............................................................................................27 2.3.6.2 Sequenzierung..................................................................................................................................28
3 Ergebnisse.......................................................................................... 30
3.1 Gewebebank .............................................................................................................30
3.2 Methodische Aspekte ..............................................................................................34
3.2.1 RNA-Extraktion ..................................................................................................34
3.2.2 RT mit Oligo (dT) und Random Hexamere....................................................36
3.2.3 Etablierung der PCR-Bedingungen................................................................36
3.2.4 Primer-Auswahl..................................................................................................38
3.2.5 CRH-BP-Doppelbande .....................................................................................39
3.2.6 Uterine und choriale Dezidua ..........................................................................40
3.3 Molekularbiologische Ergebnisse ..........................................................................41
3.3.1 CRH .....................................................................................................................41
3.3.2 Urocortin..............................................................................................................42
3.3.3 CRH-BP...............................................................................................................43
3.3.4 CRH-R1...............................................................................................................46
3.3.5 CRH-R2...............................................................................................................47
4 Diskussion.......................................................................................... 48
4.1 Gewebebank – Gewebesammlung und Patientinnenkollektiv..........................48
III Inhaltsverzeichnis _________________________________________________________________________________
4.2 Methoden...................................................................................................................49
4.2.1 RNA-Extraktion ..................................................................................................49
4.2.2 Polymerasekettenreaktion................................................................................50
4.2.3 CRH- und Urocortin-Primer..............................................................................51
4.2.4 CRH-BP-Doppelbande .....................................................................................52
4.3 Expression des CRH-Systems...............................................................................53
4.3.1 CRH .....................................................................................................................53
4.3.2 Urocortin..............................................................................................................53
4.3.3 CRH-BP...............................................................................................................54
4.3.4 CRH-Rezeptoren...............................................................................................54
5 Zusammenfassung............................................................................ 56
6 Literaturverzeichnis........................................................................... 57
7 Anhang................................................................................................ 65
7.1 Liste der verwendeten Abkürzungen.....................................................................65
7.2 Verzeichnis der Tabellen.........................................................................................68
7.3 Verzeichnis der Abbildungen..................................................................................69
1 Einleitung _________________________________________________________________________________
1 Einleitung
Neuere Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass dem Corticotropin Releasing-
Hormon (CRH)-System eine wichtige Rolle bei der hormonellen Steuerung der Ge-
burt des Menschen zukommt (10, 31, 49).
In dieser Arbeit wurde die messenger Ribonukleinsäure (mRNA)-Expression der
Komponenten des CRH-Systems in schwangerschaftsspezifischen Geweben mittels
Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Dies umfass-
te eine Gewebesammlung und die Etablierung der Methode im Labor.
1.1 Physiologie von Wehentätigkeit und Geburt
Bei der Geburt wird durch die Wehentätigkeit der Fetus kontrolliert aus dem Uterus
herausgeleitet.
Klinisch beginnt die Geburt mit der Eröffnungsperiode. Unter regelmäßigen Wehen
wird die Zervix verkürzt und der Muttermund eröffnet. Bei vollständig eröffnetem Mut-
termund kommt es zur Ruptur der Fruchtblase, damit beginnt die Austreibungsperio-
de. Nach Durchwanderung des Beckens kommt es zum endgültigen Austritt des Kin-
des aus dem mütterlichen Körper. In der anschließenden Nachgeburtsperiode wird
die Plazenta entbunden (46).
Der Funktionszustand des Uterus lässt sich in Schwangerschaft und Geburt in vier
Phasen einteilen: Ruhestellung (Phase 0), Aktivierung (Phase 1), Stimulation (Phase
2) und Involution (Phase 3) (52). In jeder Phasen haben unterschiedliche Signalstoffe
Einfluss auf den Uterus.
• Phase 0
Während der Schwangerschaft befindet sich der Uterus im Ruhezustand. Er wird
überwiegend von Progesteron beeinflusst, we lches für den Erhalt der Schwanger-
schaft ausschlaggebend ist. Progesteron wird während der ersten drei Schwanger-
schaftsmonate vom Corpus luteum gebildet, anschließend von der Plazenta. Pro-
gesteron steigt bis zur Geburt im mütterlichen Serum kontinuierlich an, auch mit We-
henbeginn findet noch kein Abfall des Serumspiegels statt. Weitere Mediatoren der
Phase 0 sind Stickstoffmonoxid (NO) und Prostazyklin (PGI2), beide Stoffe führen zur
Relaxation des Myometriums.
2 Einleitung _________________________________________________________________________________
• Phase 1
Noch vor dem Geburtstermin wird das zervikale Bindegewebe unter Prostaglandin
(PG)-Einfluss erweicht (Zervixreifung) und die Uterusmuskulatur aktiviert, so werden
beide Uterusteile auf die Geburt vorbereitet. Im Fundus uteri kommt es zur verstärk-
ten Ausbildung von Gap junctions interzelluläre Verbindungen, die zu einer synchro-
nen Kommunikation zwischen den Zellen und zur einheitlichen Ausrichtung der Mus-
kelkontraktionen führen. Gap junctions entstehen aus Connexin – ein Protein, das in
den Muskelzellen des Uterus gebildet wird. Die Rezeptorexpression und Synthese
von Oxytocin und Prostaglandinen wird gesteigert.
Die Phase der Aktivierung ist Östrogen-vermittelt. Östrogen wird von der Plazenta
durch Umwandlung aus Dehydroepiandrosteron Sulfat (DHEAS) gebildet. DHEAS
stammt aus der fetalen Nebennierenrinde (NNR). Die Östrogensynthese nimmt im
Schwangerschaftsverlauf zu. Da sie von der fetalen DHEAS-Produktion abhängig ist,
gilt der maternale Östrogen-Serumspiegel als Parameter für den Reifegrad der feta-
len Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse. Östrogen fördert ebenfalls die
Prostaglandinproduktion, die in allen intrauterinen Geweben synthetisiert werden.
• Phase 2
Der aktivierte Uterus wird durch Uterotonine stimuliert. Zur Wehentätigkeit kommt es,
wenn die kontraktionsfördernden die kontraktionshemmenden Faktoren übersteigen.
In dieser Phase findet die Geburt statt. Es kommt zu koordinierten rhythmischen We-
hen, die vom Fundus augehen. Die elektromechanische Kopplung ist optimal, die
Wirkungsmöglichkeit von Oxytocin und den Prostaglandinen PG E2 und PG F2 alpha
ist maximal ausgebildet. Oxytocin ist bei empfänglichem Uterus das stärkste Utero-
tonin. Es wird im Hypothalamus produziert und im Hypophysenhinterlappen (HHL)
gespeichert. Als weitere Syntheseorte gelten die intrauterinen Gewebe und dort be-
sonders die Dezidua.
• Phase 3
In Phase 3 wird die Plazenta geboren und der Uterus zurückgebildet. Es ist die Pha-
se der Involution, sie steht hauptsächlich unter dem Einfluss von Oxytocin.
3 Einleitung _________________________________________________________________________________
Tab. 1: Die Phasen der uterinen Aktivität während Schwangerschaft und Geburt. Aufgelistet sind die wichtigsten beteiligten Mediatoren, ihre Funktion und der Zeitraum ihres Hauptauf-tretens. Phase 0 1 2 3
Funktion Ruhigstellung Aktivierung Stimulation Involution
Zeitraum in der Schwanger-schaft
Schwangerschaft Spätschwanger-schaft
Geburt Nachgeburts
periode
Funktion in der Schwanger-schaft
Erhalt der
Schwangerschaft
Zervixreifung
Deziduale Akti-vierung
Sensitivi erung des Myometriums
Geburt Rückbildung des Uterus
Wichtige Media-toren
Progesteron
Prostazyklin
NO
Zytokine Prostaglandine Östrogene
Oxytocin
PG E2
PG F2alpha
Oxytocin
Die glatte Muskulatur des Uterus unterliegt hauptsächlich einer humoralen Regula-
tion. Die Innervationsfähigkeit nimmt im Verlauf der Schwangerschaft ab (9).
1.2 Frühgeburt
Die Schwangerschaft beim Menschen dauert 281 Tage post menstruationem (p.m.).
Von einer Frühgeburt spricht man, wenn es vor Beendigung der 38. Schwanger-
schaftswoche (SSW) p.m. zur Geburt kommt (46).
Fünf bis zehn Prozent aller Kinder in den Industrieländern kommen als Frühgeborene
zur Welt (46). Diese Quote hat sich in den letzten 30 Jahren nicht verringert (12). Die
Frühgeburtlichkeit bedingt wiederum etwa 80% der perinatalen Komplikationen und
Todesfälle (77).
Die Folgeprobleme für Frühgeborene ergeben sich aus der Unreife der Organsyste-
me (69). Die wichtigsten Symptome und Ursachen einer Frühgeburt sind vorzeitige
Wehentätigkeit (VWT), Chorioamnionitiden, die utero-plazentare Insuffizienz, sowie
die Zervixinsuffizienz (46).
Die Chorioamnionitis kann eine Bedrohung für den maternalen und fetalen Organis-
mus, die utero-plazentare Insuffizienz bei starker Unterversorgung des fetalen Orga-
nismus eine Gefährdung für den Fetus darstellen. In beiden Fällen kann die vorzeiti-
ge Beendigung der Schwangerschaft indiziert sein. Die Zervixinsuffizienz stellt einen
4 Einleitung _________________________________________________________________________________
unzureichenden mechanischen Schutz des unteren Eipols dar, der unterschiedliche
Ursachen haben kann.
Vorzeitige Wehen sind regelmäßige, koordinierte, die Zervix verkürzende und den
Muttermund eröffnende Kontraktionen des Uterus, die vor Abschluss der 37. SSW
auftreten (77). Etwa ein Drittel der vorzeitigen Wehen ist infektionsbedingt (71). An-
dere Ursachen können physische und psychische Überlastung der Schwangeren,
systemische Infektionen oder Fieber sein. Auch individuelle Besonderheiten wie ge-
nitale Fehlbildungen, eine besondere Dehnung des Uterus durch eine Mehr-
lingsschwangerschaft oder ein Polyhydramnion können Ursache sein. Als weitere
Möglichkeit kommt eine Rheobasensenkung mit herabgesetzter nervaler Erregbar-
keit des Uterus in Frage. Als Risikofaktoren gelten viele vorangegangene Schwan-
gerschaften, Nikotinabusus, Schwangerschaften sehr junger und sehr alter Schwan-
gerer, ein niedriger sozialer Status sowie ein niedriges Ausgangsgewicht vor der
Schwangerschaft (46, 52).
Therapiebedürftig sind Uterusaktivitäten, wenn mehr als sechs Kontraktionen in einer
Stunde auftreten oder die Dauer einer Kontraktion mehr als 30 Sekunden beträgt.
Dabei ist die Wirksamkeit auf den Muttermund unerheblich. Andersherum gilt, bei
Eröffnung des Muttermundes oder Verkürzung der Zervixlänge ist eine tokolytische
Therapie einzuleiten, unabhängig vom Nachweis einer Wehentätigkeit (77).
Therapeutisch steht eine Vielzahl an Möglichkeiten zur Verfügung, allerdings konnte
für keine Methode der sichere Beweis für ein Sistieren der Wehen für mehr als 48
Stunden bewiesen werden (52).
1.3 Die Theorie einer Plazentaren Uhr
McLean et. al. (49) haben die These formuliert, dass die Dauer einer Schwanger-
schaft möglicherweise schon zu einem frühen Gestationszeitpunkt determiniert wird.
In dieser Theorie spielt das CRH eine entscheidende Rolle. Sie beobachteten den
CRH-Plasmaspiegel und den CRH-Bindungsprotein (CRH-BP)-Plasmaspiegel im
Verlauf der Gestation. Dabei stellten sie einen langsamen Anstieg am Anfang der
Schwangerschaft und einen steilen Anstieg von CRH kurz vor der Geburt fest. Ent-
sprechend dieser Aufwärtsbewegung fand sich ein zunehmender Abfall von CRH-BP
im Plasma zum Ende der Schwangerschaft, was die exponentielle Aufwärtsbewe-
gung von CRH noch unterstützt .
5 Einleitung _________________________________________________________________________________
Bereits durch die Messungen des CRH-Plasmaspiegels in der Frühschwangerschaft
(16. bis 20. SSW) gelang eine tendenzielle Aussage über die Dauer einer Schwan-
gerschaft. Frauen mit einem hohen CRH-Plamaspiegel hatten ein erhöhtes Risiko
einer Frühgeburt, Frauen mit einem CRH-Plasmaspiegel unterhalb des Durchschnitts
neigten vermehrt zur Übertragung.
Abb. 1: Der mütterliche CRH- und CRH-BP-Plasmaspiegel im Schwangerschaftsverlauf (entnommen aus 49). Aus dem Anstieg von CRH und den Abfall von CRH-BP resultiert ein exponentieller Anstieg von bio-verfügbarem CRH im maternalen Plasma.
Diese Ergebnisse warfen die Frage auf, ob CRH ein Marker für die schwanger-
schaftsdauer oder ein entscheidender Faktor für den Geburtszeitpunkt ist.
Derzeit wird versucht, klinische Tests zu entwickelt, die durch Messung des mütterli-
chen CRH-Plasmaspiegels und anderer Parameter eine Vorhersage über eine dro-
hende Frühgeburt treffen sollen (12).
1.4 Corticotropin Releasing-Hormon
CRH ist ein 41-Aminosäuren Polypeptid, das 1981 als hypothalamisches Neuropep-
tid charakterisiert wurde (79). Seine bekannte Funktion ist die Steuerung der Hypo-
thalamus-Hypophysen-NNR-Achse im Rahmen der Stress-Antwort. CRH wird im Hy-
pothalamus gebildet und reguliert die Ausschüttung des Adrenocorticotropen-
Hormons (ACTH) im Hypophysenvorderlappen (HVL). Transportweg des CRH ist das
hypothalamischen Portalgefäßsystem.
ACTH erreicht über den Körperkreislauf die NNR und bewirkt dort eine Cortisolaus-
schüttung. Cortisol und ACTH wirken im Sinne einer negativen Feed-back-Schleife
6 Einleitung _________________________________________________________________________________
hemmend auf die hypothalamische CRH-Ausschüttung, während Stress einen positi-
ven Impuls darstellt. CRH wurde bald auch außerhalb des Hypothalamus nachge-
wiesen, zunächst weit verbreitet im Hirn dann in der Peripherie.
Weiter, an der Wirkung von CRH beteiligte Komponenten sind das CRH-
Bindungsprotein und die CRH-Rezeptoren 1 (CRH-R1) und 2 (CRH-R2) mit ihren
Subtypen. Ebenfalls zum CRH-System wird Urocortin (UCN) gerechnet, ein CRH-
verwandtes Peptid.
1982 wurde CRH erstmals in der Plazenta nachgewiesen (74) und später auch bei
nicht Schwangeren in den weiblichen Reproduktionsorganen: Myometrium, Endo-
metrium (47) und Ovarien (48). Es wird angenommen, dass CRH am entzündlichen
Prozess der Ovulation und der uterinen Physiologie beteiligt ist.
1.4.1 CRH
Es ist bekannt, dass der maternale Plasmaspiegel des bioverfügbaren CRH beim
Menschen kurz vor der Geburt stark ansteigt (25, 49, 53) und dass das CRH-Gen in
der Plazenta exprimiert wird (32, 67). Hieraus wurde abgeleitet, dass CRH eine wich-
tige Rolle bei der menschlichen Geburt haben könnte. Weitere Befunde zeigen, dass
das plazentare CRH autokrine und parakrine Effekte auf die intrauterinen Gewebe
hat und den maternalen und fetalen Organismus beeinflusst.
Die CRH-Produktion wird bis kurz vor der Geburt von Progesteron supprimiert. Dann
stimuliert plazentares CRH die fetale DHEAS- und Cortisol-Produktion (75) und damit
die plazentare Östrogensynthese; zugleich beeinflusst es die fetale Lungenreife. In
der Spätschwangerschaft kommt es wiederum zur Stimulation des plazentaren CRH
durch fetales Cortisol (34). Diese beiden Mechanismen gekoppelt führen zu einer
weiteren Steigerung aller Komponenten – plazentares CRH, fetales Cortisol und
DHEAS (36).
CRH wurde in den Endothelzellen der Nabelschnur nachgewiesen und wirkt vasodi-
latatorisch auf die fetoplazentare Einheit; dies ermöglicht einen verstärkten Zustrom
von Signalstoffen und energieliefernden Molekülen (19, 39, 80). Plazentares CRH
erhöht die Prostaglandinsynthese in Plazenta, Dezidua, Amnion und Chorion (34),
sowie von Gewebsmakrophagen und Monozyten, aber nicht vom Myometrium (73).
Umgekehrt steigern PG E2 und Interleukin (IL) 1beta die CRH-Synthese. Dies gilt als
parakrine Wirkung von plazentarem CRH unter der Geburt.
7 Einleitung _________________________________________________________________________________
Es wird angenommen, dass CRH über die durch zyklisches Adenosinmonophosphat
(cAMP) vermittelte Wirkung auf glatte Muskulatur in der Schwangerschaft an der Ru-
higstellung des Uterus beteiligt ist (33). Am Ende der Schwangerschaft soll CRH
durch Entkoppelung der Adenylatcyclase (26) zur verstärkten Kontraktilität des Ute-
rus führen. Es gibt Theorien, nach denen CRH einen synergistischen Effekt auf die
kontraktilen Mediatoren Oxytocin (23, 64) und Prostaglandin F2 alpha hat (6). Insge-
samt gibt es jedoch unterschiedliche Aussagen zum CRH-Einfluss auf die Uteruskon-
traktion.
Die Plazenta sezerniert in der Schwangerschaft CRH in den mütterlichen Kreislauf
(25). Es wurde nachgewiesen, dass in der Schwangerschaft plazentares CRH etwa
ab der Mitte des zweiten Trimenons zu steigen beginnt und mit der Wehentätigkeit zu
Spitzenwerten gelangt, die ein Vielfaches des Ausgangswertes darstellen (25, 49,
53). Ebenso wie beim hypothalamischen CRH ist auch für plazentares CRH Stress
ein Sezernierungsreiz (58, 61). Eine CRH-Expression wurde in Myometrium, Plazen-
ta, Amnion, Chorion und Dezidua nachgewiesen (60, 67). CRH greift auf vielfältige
Weise in die Mechanismen der Geburt ein (31).
1.4.2 Urocortin
Urocortin ist ein CRH-verwandtes Peptid. Es wurde erstmals 1995 im Rattenhirn
nachgewiesen. Es besteht aus 40 Aminosäuren (AS) und weist eine 45%ige Homo-
logie zum CRH auf. UCN weist eine hohe Affinität zu den Komponenten des CRH-
Systems auf (20, 80). Dabei liegt die Affinität zu CRH-R2 deutlich höher als die von
CRH selbst. Die second-messenger-Aktivität ist ebenfalls höher als bei CRH. Es wird
angenommen, dass UCN der endogene Ligand von CRH-R2 ist. UCN bindet auch an
CRH-R1 und CRH-BP – hier liegt die Affinität ähnlich hoch wie die vom CRH. UCN
wirkt als CRH-Agonist. Ebenso wie CRH stimuliert es die ACTH-Ausschüttung aus
der Hypophyse. Möglicherweise ist Urocortin ebenfalls am Geburtsprozess beteiligt,
denn es gelang, UCN-mRNA und -Peptid in allen intrauterinen Geweben nachzuwei-
sen (57). Daraus wurde die Hypothese über eine parakrine und autokrine Wirkung
von UCN abgeleitet.
Über die Funktion von UCN ist, verglichen mit CRH, eine 30-fache vasodilatatorische
Wirkung auf die fetoplazentare Einheit bekannt (80). UCN ist in ca. 80% der mütterli-
chen Plasmen ab der 7. SSW nachweisbar, die Konzentration ändert sich im
8 Einleitung _________________________________________________________________________________
Schwangerschaftsverlauf nicht. Bei nicht Schwangeren ist kein UCN im Plasma
nachweisbar (81).
UCN ist unabhängig von Wehenbelastung in Plazenta, Eihaut, Dezidua und der Ge-
fäßmuskulatur des Myometriums nachweisbar. Deshalb wurde die Hypothese aufge-
stellt, dass UCN lokal produziert wird und regulatorisch auf die uteroplazentare
Durchblutung wirkt (15). Einige Forschungsgruppen bezweifeln eine UCN-Beteiligung
an der Schwangerschaft. Der Nachweis einer UCN-Expression in schwangerschafts-
spezifischen Geweben gelang nicht immer und im Serum wurden nicht in allen Un-
tersuchungen messbare UCN-Konzentrationen gefunden (24).
1.4.3 CRH-Bindeprotein
Das CRH-BP ist ein 37 Kilodalton Glykoprotein (74) bestehend aus 322 Aminosäuren
(63). CRH-BP mRNA konnte bisher beim Menschen in Leber und Hirn sowie im Ge-
webe von Plazenta, Amnion, Chorion und Dezidua nachgewiesen werden (59, 63).
Das CRH-BP ist für humanes CRH spezifisch (43, 44). CRH und UCN binden an
CRH-BP und verlieren so ihre Bioaktivität im Blutkreislauf. So wird in der Schwan-
gerschaft die Stimulation des HVL verhindert und es erfolgt keine ACTH-
Ausschüttung (5). Dadurch ist der ACTH-Spiegel trotz erhöhter CRH-Werte in der
Schwangerschaft kaum erhöht (65). Die Bindung von CRH an CRH-BP ist zeit- und
dosisabhängig. Die Affinität von CRH zu Rezeptoren und Bindeprotein ist ähnlich. Da
es im Portalkreislauf von Hypothalamus und Hypophyse zu einer pulsatilen Aus-
schüttung von CRH kommt und die Entfernung sehr gering ist, wird an der Hypophy-
se eine sehr hohe CRH-Konzentration erreicht, die im Rahmen der CRH-gesteuerten
Stressantwort die Funktion auf parakrine Weise aufrechterhält. Zusätzlich ist die Hy-
pophyse durch die ansteigenden Cortisolwerte am Ende der Schwangerschaft durch
die negative Feed-back-Wirkung geschützt (42).
Es kommt am Geburtstermin beim Menschen zu einem Abfall des CRH-BP im müt-
terlichen Blut (7, 43). Dieser Abfall ist mitverantwortlich für den CRH-Anstieg kurz vor
der Geburt. Gleichzeitig wird dem freien CRH eine Clearance-Funktion für CRH-BP
nachgesagt, so dass sich dadurch beide Mechanismen zusätzlich verstärken (49).
Die Leber gilt als der Hauptproduktionsort vom CRH-BP (63). Da es auch an den lo-
kalen Syntheseorten von CRH auftritt, wird dem CRH-BP eine parakrine und autokri-
ne Wirkung zugesprochen. Das CRH-BP kommt auch bei nicht schwangeren Frauen
und bei Männern im Plasma vor (44).
9 Einleitung _________________________________________________________________________________
1.4.4 CRH-Rezeptoren
Die CRH-Rezeptoren gehören zur Familie der Guanylnukleotidregulatorischen (G)
Protein-gekoppelten Rezeptoren, die über Adenylatcyc lase ihren second messenger
cAMP aktivieren und so die Wirkung ihrer Liganden (hier CRH und UCN) herbeifüh-
ren (29). Die Rezeptoren verfügen über sieben Transmembran-Domänen. Bisher
wurden zwei CRH-Rezeptor-Isoformen CRH-R1 und CRH-R2 nachgewiesen (13).
Ihre Aminnosäurensequenzen sind zu 70% identisch.
Für CRH-R1 waren zu Beginn der Arbeit die Subtypen alpha, beta, c und d bekannt,
die als Spleiß-Varianten der 14 Exon-mRNA entstehen (Abb. 2). Die codierende Se-
quenz des CRH-R1 beta liegt auf allen 14 Exons. Der CRH-R1 alpha hat eine Deleti-
on auf Exon sechs, der CRH-R1c hat zwei Deletionen, auf Exon sechs und Exon
drei, der CRH-R1d hat zwei Deletionen, ebenfalls auf Exon sechs und auf Exon 13.
Für CRH-R2 entstehen beim Spleißen die Subtypen alpha, beta und gamma (83). Es
wurde festgestellt, dass die Liganden eine unterschiedliche Affinität zu den Rezepto-
ren besitzen. CRH und UCN haben eine ähnliche Affinität zu CRH-R1, UCN weist
eine wesentlich höhere Affinität zum CRH-R2 auf als CRH. In der späten Schwan-
gerschaft steigt die Affinität von CRH zu den Rezeptoren (33).
Abb. 2: Der menschliche CRH-R1 mit seinen Spleiß-Varianten (modifiziert nach 30). Die gesamte Sequenz stellt den Subtypen CRH-R1 beta dar. Die Sequenzen, die den jeweiligen an-deren Subtypen fehlen, sind gekennzeichnet.
10 Einleitung _________________________________________________________________________________
Es liegen viele Ergebnisse zur Verteilung der Rezeptoren und ihren Subtypen vor:
CRH-R1 wurde im Myometrium des schwangeren Uterus, am Geburtstermin und vor
dem Geburtstermin, mit und ohne Wehentätigkeit (26) nachgewiesen. Die Variante
CRH-R1 alpha wurde im schwangeren und nichtschwangeren Myometrium nachge-
wiesen (27). CRH-R2 ließ sich in einem Drittel der untersuchten schwangeren Uteri
nachweisen, unabhängig von Gestationsalter und Wehentätigkeit. Der Subtyp CRH-
R2 alpha wurde im schwangeren und nichtschwangeren Myometrium nachgewiesen
und damit erstmals außerhalb des Hirns (68). Im nicht-graviden Zustand sind CRH-
R1 und CRH-R2 ebenfalls im Myometrium exprimiert (17, 22). Es wird über eine vari-
able Verteilung der CRH-Rezeptoren im Myometrium diskutiert, dies besonders im
Hinblick auf die unterschiedlichen Funktionen des Uterus während der Wehentätig-
keit. Während der Fundus starke Kontraktionen aufweist, ist das untere Uterinseg-
ment relaxiert. Es wird ebenfalls angenommen, dass sich das CRH-Rezeptor-
Expressionsmuster im Myometrium im Schwangerschaftsverlauf verändert (31).
In Chorion und Dezidua gibt es eine CRH-R1-Expression (30), jedoch nicht im Amni-
on. Die Subtypen CRH-R1 alpha und c wurden in der Plazenta und den Eihäuten
nachgewiesen (38). Eine CRH-R2-Expression konnte weder in Eihäuten noch in der
Dezidua nachgewiesen werden (78).
1.5 Die schwangerschaftsspezifischen Gewebe
1.5.1 Myometrium
Der Uterus ist ein muskelstarkes Organ, das im nicht-gravidem Zustand 6-7cm lang
ist und ca. 40-65g wiegt. Der Uterus besteht aus dem Fundus uteri, der den Corpus
uteri kuppelartig überragt. Vom Corpus uteri gehen die Eileiter ab. Der Übergang zur
Zervix uteri wird durch den Isthmus uteri gebildet. Anatomisch scheint der Isthmus
uteri eher der Zervix uteri anzugehören, er wird jedoch etwa ab dem 3. Trimenon als
das untere Uterinsegment von der Schwangerschaft mit in Anspruch genommen. Im
unteren Uterinsegment wird bei der Sectio caesarea die Uterotomie vorgenommen.
Im Schwangerschaftsverlauf steigt die Masse des Uterus etwa um den Faktor 25.
Dabei kommt es sowohl zu einer Hypertrophie der glatten Muskelzellen als auch zu
einer Hyperplasie. Während der Uterus in der Schwangerschaft stark gedehnt wird,
bleibt die Zervix bis kurz vor der Geburt straff verschlossen.
11 Einleitung _________________________________________________________________________________
1.5.2 Dezidua
Die Dezidua ist das umgewandelte Endometrium in der Schwangerschaft. Das En-
dometrium unterteilt sich in eine am Menstruationszyklus beteiligte Lamina functiona-
lis und eine der Regeneration dienenden Lamina basalis. Mit der Implantation bildet
sich aus der Lamina functionalis die Dezidua, wohingegen die Lamina basalis durch
die Schwangerschaft kaum verändert wird. Die Dezidua wird in drei Abschnitte ge-
teilt: die Dezidua capsularis bedeckt den Keim zum Uteruslumen hin, die Dezidua
basalis liegt zwischen Uterusmuskulatur und Eibasis und die Dezidua parietalis klei-
det die Uterushöhle aus. Etwa im fünften Schwangerschaftsmonat haben sich Dezi-
dua capsularis und Dezidua parietalis angenähert, die Dezidua capsularis bildet sich
zurück, so dass die Dezidua parietalis am Chorion anliegt.
Die Dezidua dient der Blutversorgung der gefäßlosen Eihäute, ist für den Ionen- und
Wassertransport für das Fruchtwasser von Bedeutung und reguliert die Permeabilität
der Einheit. Als Syntheseort für Prolaktin und Relaxin spielt sie im Hormonhaushalt
der Schwangerschaft eine Rolle. Sie ist zentraler Ort der Prostaglandinsynthese.
Immunkompetente Zellen wie Granulozyten, Makrophagen, T- und B-Lymphozyten
sind in der Dezidua nachweisbar.
1.5.3 Die fetalen Eihäute – Chorion und Amnion
Die Eihaut, bestehend aus Amnion und Chorion, enthält das Fruchtwasser, das den
Fetus umgibt. Amnion und Chorion vereinigen sich zur doppelwandigen Fruchthöhle
und sind durch eine Intermediärschicht voneinander getrennt.
Das Amnion ist eine im Stadium der zweiblättrigen Keimscheibe zwischen
Trophoblast und Ektoderm entstehende Zellschicht, die zusammen mit dem Ekto-
derm des Embryos die Amnionhöhle bildet. Die Amnionzellen bilden einen geringen
Teil des Fruchtwassers.
Das Chorion entwickelt sich aus den Trophoblasten und besitzt endokrine Funktio-
nen.
1.5.4 Plazenta
Die Plazenta hat einen Durchmesser von 15 bis 20cm, ist zwei bis vier Zentimeter
dick und wiegt ca. 500g. Die maternale Seite zeigt die Kotyledonen und ist von einer
Deziduaschicht überzogen. Die fetale Seite ist von Amnion überzogen. Dazwischen
12 Einleitung _________________________________________________________________________________
weist die Plazenta drei Schichten auf: direkt an der Uteruswand liegt die Basalplatte,
an die der Zottenbaum und schließlich die Chorionpla tte anschließt.
Mütterlicher und fetaler Kreislauf sind durch Synzytiotrophoblasten getrennt. Die Pla-
zenta dient der Ernährung des Fetus und ist zentraler Ort der hormonalen Regulati-
on. Die Synzytiotrophoblasten und Zytotrophoblasten enthalten die Enzyme, die der
Plazenta die endokrine Funktion ermöglichen.
1.6 RT-PCR
Um zu klären, ob ein Gewebe Syntheseort für ein Protein ist, kann die Genexpressi-
on für das gesuchte Protein auf mRNA-Ebene untersucht werden. Eine hierfür ge-
eignete Methode ist die RT-PCR. Bei der RT wird mRNA zu komplementärer Des-
oxyribonukleinsäure (cDNA) umgeschrieben. In der PCR wird durch Amplifizierung
ausreichender Mengen cDNA eine weitere Charakterisierung (z.B. Gelelektrophore-
se) und Identifizierung (z.B. Restriktionsanalyse und Sequenzierung) ermöglicht.
1.6.1 Molekularbiologische Grundlagen
In Nukleinsäuren sind Mononukleotide über 5´-3´-Phosphodiesterbrücken zu Poly-
nukleotidketten verknüpft. Auf der DNA ist die genetische Information codiert. Durch
Genexpression wird die biologische Information eines Gens umgesetzt und für die
Zelle nutzbar gemacht. Dieser Vorgang lässt sich in mRNA-Synthese (Transkription)
und Proteinbiosynthese (Translation) einteilen.
Die Hauptklassen der RNA lassen sich nach ihrer Funktion einteilen, deren Anteil in
der Eukaryoten-Zelle unterschiedlich hoch ist: etwa 85% ribosomale-RNA (rRNA),
10-15% transfer-RNA (tRNA) und nur 1-5% mRNA (8). r-RNA und t-RNA entstehen
bei der Transkription. Sie sind Endprodukte der Genexpression und erfüllen ihre Auf-
gabe in der Zelle als RNA-Moleküle, sie werden deshalb auch stabile RNA genannt.
mRNA durchläuft beide Stufen der Genexpression: Transkription und Translation. Sie
dient als Vermittler zwischen einem Gen, das im Zellkern liegt, und dem Expressi-
onsprodukt – einem Polypeptid, das im Cytoplasma synthetisiert wird. mRNA-
Moleküle haben in der Regel eine kurze Lebensdauer. Bei Eukaryoten liegt die
Halbwertzeit der mRNA meist bei wenigen Stunden. Die absolute Menge einer be-
stimmten mRNA wird von der Transkriptions- sowie der Abbaugeschwindigkeit des
jeweiligen Gens gesteuert.
13 Einleitung _________________________________________________________________________________
Die Transkription erfolgt im Zellkern. Die DNA wird durch RNA-Polymerase in die
prä-mRNA umgeschrieben. Die prä-mRNA enthält neben Exons (expressed regions),
die die codierenden Sequenzen (CDS) enthalten, auch Introns (intervening regions).
Nach erfolgter Transkription wird an eukaryotischer prä-mRNA an das 5´-Ende eine
schützende „Cap-Struktur“ und an das 3´-Ende ein Poly(A)-Schwanz gehängt. In ei-
nem Reifungsprozess (Spleißen) werden die Introns herausgeschnitten. Anschlie-
ßend wird die reife mRNA in das Zytoplasma transportiert.
Die Translation erfolgt im Zytoplasma. Die mRNA dient an den Ribosomen als Matri-
ze für die Proteinsynthese. Die Sequenz der Aminosäuren ist auf der codierenden
Sequenz (CDS) auf der mRNA durch Basentriplets (Codons) festgelegt. Die spezifi-
sche Aminosäuren tragende tRNA besitzt Anticodons, die es ermöglichen, die Co-
dons zu lesen und die Aminosäuren zu übertragen. Die Proteinsynthese wird durch
ein Stopcodon terminiert.
1.6.2 RNA-Extraktion
Die RNA-Extraktion erfolgt in zwei Schritten. Zunächst wird das Gewebe homogeni-
siert und lysiert, dann wird die RNA isoliert.
Die Methode von Chomczynski und Sacchi (14) erfolgt mit einem wässrigen Puffe r,
der Guanidiniumthioisocyanat, Phenol und Chloroform als Zusätze enthält. Guanidi-
nium-Salze zerstören Zellen, lösen deren Bestandteile und denaturieren ubiquitär
vorkommende endogene RNasen. Durch Phenol, Chloroform und Wasser werden
RNA, DNA und Protein aufgrund unterschiedlicher Polarität in unterschiedliche Pha-
sen getrennt. Die in wässriger Phase gelöste RNA wird durch Isopropanol ausgefällt.
Die Gesamt-RNA-Ausbeute schwankt bei der Extraktion je nach Zelltyp und Gewe-
beart. In der Regel lassen sich 0,5-30mg Gesamt-RNA aus einem Gramm Gewebe
bzw. 5x108 Zellen gewinnen (8).
1.6.3 Reverse Transkription
Die Reverse Transkription beschreibt die Umkehr des genetischen Informationsflus-
ses. Diese Umkehr kommt in der Natur nur bei Retroviren vor. In vitro wird die RT vor
der PCR zur Umschreibung der mRNA in cDNA genutzt . Die direkte Amplifikation der
instabilen mRNA mittels PCR ist nicht praktikabel, daher wird die wesentlich stabilere
cDNA für die weiteren Arbeitsschritte benutzt . Das Umschreiben wird mit Enzymen
aus Retroviren, der Reversen Transkriptase durchgeführt. Die Reverse Transkriptase
14 Einleitung _________________________________________________________________________________
benötigt als Matrize einen Primer, von dem aus die RT gestartet werden kann. Ein
Primer ist ein Oligonukleotid, das zur Zielsequenz komplementär ist und an einer
Nukleinsäure als Startermolekül für die Neusynthese eines komplementären Nuk-
leinsäurestranges dient. Die eukaryotische mRNA kann mit Oligo (dT) aufgrund der
Poly(A)-Sequenz am 3´-Ende spezifisch in cDNA umgeschrieben werden, da Oli-
go(dT) an Adenin anlagert. Zur unspezifischen Umwandlung der Gesamt-RNA kön-
nen Random Hexamere verwendet werden, sie sind ein Gemisch verschiedener He-
xamere und lagern an unterschiedliche RNA-Sequenzen an. Die Synthese erfolgt
immer vom 5´- zum 3 -́Ende der mRNA.
1.6.4 Polymerasekettenreaktion
Die PCR ist eine in vitro-Technik, die eine selektive Vervielfältigung (Amplifizierung)
eines bestimmten DNA-Abschnitts ermöglicht. Voraussetzung ist die Kenntnis der
Sequenzen, die den untersuchten DNA-Abschnitt einschließen. Als Primer müssen
zwei Oligonukleotide synthetisiert werden, die sich an die bekannten Enden des
Zielbereichs anlagern und von dort die Synthese neuer, komplementärer
Polynukleotide starten.
Die PCR besteht aus Teilschritten, die bei unterschiedlichen Temperaturen erfolgen.
Zunächst erfolgt die Trennung der DNA-Stränge (Denaturierung) bei über 90°C, im
zweiten Schritt werden Primer bei 40-70°C an die Zielsequenz angelagert (Annea-
ling). Im dritten Schritt erfolgt die Neusynthese des komplementären DNA-Stranges
(Elongation) bei 72°C. Diese Schrittfolge wird 20-50mal wiederholt.
Zwei Entwicklungen erleichterten die PCR in der Anwendung. Die Amplifizierung wird
von thermostabilen DNA-Polymerasen aus dem Bakterium Thermus aquaticus in
Gegenwart von Desoxynucleosidtriphosphaten (dNTP) ausgeführt. Die DNA-
Polymerase wird durch Hitze nicht denaturiert und muss dem Reaktionsgemisch
nicht bei jedem Temperaturzyk lus erneut zugegeben werden. Für die Steuerung der
Temperaturzyklen wurden programmierbare Heizblocksysteme entwickelt (Thermo-
cycler). Diese können die benötigten Temperatursprünge innerhalb von Sekunden
mit hoher Präzision vollziehen.
Abbildung 3 zeigt schematisch die ersten Runden einer PCR. Im ersten Zyklus wer-
den DNA-Stränge ohne definierte Länge gebildet, da die DNA-Polymerase so lange
DNA synthetisiert, bis sie zufällig stoppt oder durch den Beginn eines neuen Vermeh-
rungszyklus unterbrochen wird. Auch im zweiten Zyklus ist die Länge der PCR-
15 Einleitung _________________________________________________________________________________
Produkte noch nicht festgelegt. Ab dem dritten Zyklus werden Amplikons definierter
Länge direkt gebildet.
Abb. 3: Schema der ersten Runden einer PCR (modifiziert nach 2).
Die Vermehrung verläuft in der PCR exponentiell, da die bereits synthetisierten DNA-
Abschnitte zur Synthese weiterer Kopien dienen. In der Theorie ist ein DNA-Molekül
als Ausgangsmaterial ausreichend. Dies ist in der Praxis nicht gegeben. Die Amplifi-
kation der cDNA in der PCR zeigt einen sigmoiden Verlauf. Das heißt, dass die Aus-
beute nicht in jedem Zyklus 100% ist. Dafür gibt es mehrere Ursachen: Die Effizienz
ist von Matrize zu Matrize unterschiedlich und von der Optimierung der Methode ab-
hängig. Nach etwa 25 bis 30 Zyklen besteht ein molarer Überschuss an Ziel-DNA,
dann ist meist die Enzymmenge der begrenzende Faktor für die Effizienz der Reakti-
on. Zudem konkurrieren bei zunehmender Amplikon-Konzentration die Amplikons mit
den Primern. Hybridisieren die Zielsequenzen untereinander, so kann an diesen kei-
ne Neusynthese stattfinden. Die Enzymaktivität nimmt ebenfalls ab; obwohl das En-
zym als thermostabil bezeichnet wird, denaturiert es mit der Zeit. Meist liegt die Aus-
beute einer PCR bei etwa 70%.
Zur Positivkontrolle für mRNA werden Haushaltsgene verwendet. Dies sind ubiquitär
exprimierte Gene. Häufig verwendete Haushaltsgene sind z.B. Glycerinaldehyd-3-
16 Einleitung _________________________________________________________________________________
phosphat Dehydrogenase (GAPDH), beta-Actin und Cyklophilin A. In dieser Arbeit
wurde Cyklophilin A (Cyph) verwendet. Cyklophilin A ist der zelluläre Rezeptor von
Cyclosporin und besitzt Peptidyltransferase-Aktivität. Es wurde gewählt, da es kaum
Expressionsschwankungen unterlegen ist.
Die weitere Charakterisierung und Identifizierung der Amplikons wird mittels Gele-
lektrophorese, Restriktionsanalyse und Sequenzierung durchgeführt. Bei der Elektro-
phorese werden Nukleinsäuren aufgrund unterschiedlicher Wandergeschwindigkei-
ten im elektrischen Feld aufgetrennt. Agarose-Gel, mit Ethidiumbromid zur Anfärbung
versehen, ist als Trägermaterial für Nukleinsäuren geeignet. Nukleinsäuren wandern
im elektrischen Feld als negativ geladene Teilchen zum positiven Pol. Die Laufge-
schwindigkeit im Gel ist abhängig von der Größe und Ladung der Nukleinsäuren. Die
Nukleotid-Zahl wird durch den mitlaufenden DNA-Marker mit definierten Größen ge-
schätzt.
Bei der Restriktionsanalyse werden PCR-Produkte durch Enzyme an spezfischen
Basenkombinationen gespalten. Daraus folgt für eine Sequenz eine definierte Anzahl
von Fragmenten mit einer definierten Anzahl von Basenpaaren. Diese Fragmente
können in der Elektrophorese aufgetrennt werden. So wird die Anzahl der Fragmente
ermittelt und die Anzahl der Basenpaare geschätzt.
Die herkömmliche PCR ist eine rein qualitative Methode. Da aber oftmals eine quan-
titative Aussage von besonderem Interesse ist, wurden semiquantitative und quanti-
tative Methoden entwickelt. Eine davon ist die Real-time-TaqMan-PCR. Ihr Prinzip
beruht auf einer Markierung der in die PCR eingesetzten DNA zwischen den Prime-
ransatzstellen mit einer Oligonukleotidsonde. Diese Sonde ist mit zwei komplementä-
ren Fluoreszenzfarbstoffen markiert, der Reporter- bzw. Quencher-Fluoreszenz. Die
Sonde wird durch Taq Polymerase und deren 5 -́3´-Exonuklease-Aktivität während
der Neusynthese abgebaut. Durch Abbau der Sonde wird Fluoreszenzlicht meßbar
und steigt proportional zur Anzahl der synthetisierten PCR-Produkte. Die Quantifizie-
rung erfolgt nach der Anzahl der Zyklen. Diese wird bestimmt, wenn ein bestimmter
Fluoreszenzsignal-Schwellenwert überschritten wird. Die quantitative Analyse wird
also während der Amplifikation durchgeführt (real-time). Für eine absolute Quantifi-
zierung muss ein externer Standard erstellt werden.
17 Einleitung _________________________________________________________________________________
1.7 Fragestellungen
In dieser Arbeit wurden schwangerschaftsspezifische Gewebe bei Schnittentbindun-
gen nach unterschiedlichen Schwangerschaftsverläufen und in unterschiedlichen
Gestationsaltern gesammelt. An diesen Geweben sollte die Expression des CRH-
Systems auf der mRNA-Ebene untersucht werden. Im Einzelnen wurden folgende
Aufgaben und Fragestellungen bearbeitet.
I. Aufbau einer Gewebebank mit Myometrium, Plazenta, Dezidua, Chorion und Am-
nion von unterschiedlichen Schwangerschaften.
II. Etablierung der RT-PCR-Methoden zur Untersuchung der Genexpression der
Komponenten des CRH-Systems (CRH, UCN, CRH-BP, CRH-R1 und CRH-R2).
III. Welche Komponenten des CRH-Systems werden auf mRNA-Ebene in welchen
schwangerschaftsspezifischen Geweben exprimiert?
IV. Ist die Expression des CRH-Systems in den schwangerschaftsspezifischen Ge-
weben vom Gestationsalter und von der Wehentätigkeit abhängig?
18 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
2 Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Reagenzien
1st Strand Buffer Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland
Agarose Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland
DNA Ladepuffer (10 x): Glycerin (50%) Merck, Darmstadt, Deutschland Bromphenolblau (0,05%) Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden Xylencyanol (0,05%) Bio Ras, Hercules, USA
EDTA 50mM Serva Electrophoresis GmbH, Cleveland, USA
DNA-Marker (10 Vol%): 1KB+ Ladder Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland 25bp DNA Ladder Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland
dNTP Mix (10mM) Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland
Dithioethritol (DTT) (0,1M) Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland
Hanks´salt solution Biochrom KG, Berlin, Deutschland (ohne Calcium und Magnesium)
Loading Buffer Loading Dye Solution MBI Fermentas
MgCl2 (25mM) Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland
NaCl (5 M) Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz
Oligo (dT) Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland
PBS Dulbecco´s Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland (ohne Calcium, Magnesium und Natriumbicarbonat)
10xPCR Puffer minus Mg: Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland 200mM Tris HCl (pH 8,4) 500mM KCl
Peq Gold RNA Pure peqlab Biotechnologies GmbH, Erlangen, Deutschland
Peq Gold TriFast peqlab Biotechnologies GmbH, Erlangen, Deutschland
QIA quick PCR purification Kit Qiagen, Hilden, Deutschland
Random Hexamere Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland
19 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
Restriktionsendonukleasen: ALU I (aus Arthrobacter luteus) Boehringer, Mannheim, Deutschland HAE III (aus Haemophilus aegyptius) Boehringer, Mannheim, Deutschland
RNA-Ladepuffer hergestellt aus: Foramid (20%) 10xDNA-Ladepuffer-Farbmix (25%)
Aqua ad iniectabila (55%) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland
Superscript Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland
Taq DNA Polymerase Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland
10xTBE Puffer (pH 8,0): Tris 121,14g/mol USB-United States Biochemical, Cleveland,
USA Borsäure 61,83g/mol Merck, Darmstadt, Deutschland EDTA 40ml/l 0,5M (pH 8,0) Serva Electrophoresis GmbH, Cleveland,
USA
2.1.2 Chemikalien
Aqua ad iniectabilia B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland
Chloroform J.T. Baker, Deventer, Holland
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,
Deutschland
Ethanol 100 % J.T. Baker, Deventer, Holland
Ethanol 70% (vergällt) Allchem GmbH, Freiburg, Deutschland
Ethanol 75 % J.T. Baker, Deventer, Holland
Ethidiumbromid 10mg/ml Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe, Deutsch-land
HCl (1M) Merck, Darmstadt, Deutschland
Isopropanol Merck, Darmstadt, Deutschland
KCl Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumacetat Merck, Darmstadt, Deutschland
20 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
2.2 Gewebebank
2.2.1 Konzept der Gewebebank
Folgende schwangerschaftsspezifische Gewebe wurden zwischen Februar 1999 und
Juni 2000 gesammelt: Myometrium (Mu), Dezidua (D), Plazenta (P), Chorion (C) und
Amnion (A). Die Codierung der Proben erfolgte aus der laufenden Patientinnen-
Nummer und der Abkürzung der Gewebeart. Das Gewebe wurde ausschließlich bei
Schnittentbindungen gewonnen. Die Proben stammten sowohl von Schwangerschaf-
ten, die einer Wehenbelastung ausgesetzt waren, als auch von solchen, bei denen
es zu keiner Wehentätigkeit kam. Das Gestationsalter der Schwangerschaften lag
zwischen 24 und 41 Schwangerschaftswochen. Die Schwangerschaften wurden in-
folge unterschiedlicher Indikationen beendet. Ein hoher Anteil der Schwangerschaf-
ten wiesen pathologische Verläufe auf. Zusätzlich wurde Gewebe eines nicht
schwangeren Uterus entnommen. Dieses stammte von einer Hysterektomie, die we-
gen eines Zervixkarzinoms durchgeführt wurde.
Für die beschriebene Gewebesammlung im Rahmen des von der Deutsche For-
schungsgemeinschaft (DFG) geförderten Projekts „Rolle von CRH bei der Auslösung
der Geburt“, liegt ein positives Votum der Ethikkommission der Albert-Ludwigs-
Universität Freiburg vor (Nr. 190 / 98 vom 5.10.1998).
Alle Frauen, bei denen Gewebe entnommen wurde, wurden vor der Gewebeentnah-
me in einem Aufklärungsgespräch und anhand eines vorbereiteten Informationsblatts
über das Projekt und das Vorgehen informiert und gaben schriftlich ihr Einverständ-
nis.
2.2.2 Gewebegewinnung und Gewebeauswahl
Myometrium
Nach Entwicklung des Kindes und der ersten Blutstillung entnahm der Operateur im
Zuge der Wundbegradigung Myometrium mit einem Skalpell vom oberen Rand des
unteren Uterinsegments. Das Myometrium wurde direkt im Operationssaal in das
vorbereitete Transportmedium Hanks´salt solution (Biochrom KG) gegeben.
21 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
Dezidua
Das deziduale Gewebe wurde auf zwei Arten gewonnen. Uterine Dezidua (Du) wisch-
te der Operateur mit sterilen Tupfern aus dem Cavum uteri. Von diesen Tupfern wur-
de im Operationssaal die Du abpräpariert und in das Transportmedium überführt. Um
eine ausreichend große Menge Du auf diese Weise zu gewinnen, mussten meist drei
Tupfer bearbeitet werden, was eine Zeit von ca. 10min beanspruchte. Choriale Dezi-
dua (Dc) wurde stumpf vom Chorion abgeschoben. Auf diese Weise ließen sich rela-
tiv große Mengen Dc gewinnen. Die Qualität der mit beiden Präparationstechniken
gewonnene Dezidua wurde im Rahmen einer weiteren Dissertation (72) systematisch
untersucht.
Plazenta
Die Gewinnung von Plazenta-Proben erfolgte in der Regel aus einer Kotyledone rela-
tiv nah am Nabelschnuransatz, wo die Plazenta meist die größte Dicke aufweist. Es
wurden Plazenta-Bereiche ausgewählt, die ein besonders homogenes Gewebe ohne
Blutgefäße und Septen aufwiesen und deutlich von Eihäuten und Dezidua entfernt
waren. Mit Skalpell oder Schere wurden würfelförmige Gewebestücke mit einer Sei-
tenlänge von ca. 2cm entnommen.
Die Plazenta wurde zunächst routinemäßig mit dem Neugeborenen in den Kreißsaal
gebracht. Hier erfolgte oft die Entnahme des Plazentarestblutes. Dies hatte für die
Gewebeentnahme den Vorteil, dass das Plazentagewebe weniger Blutverunreini-
gung enthielt. Bei Pathologien des Neugeborenen wurde die Plazenta zusätzlich in
der Pädiatrie untersucht. Erst im Anschluss an diese Untersuchungen konnte Plazen-
tagewebe entnommen werden.
Chorion und Amnion
Amnion- und Choriongewebe konnten wie das Plazentagewebe erst nach den Routi-
neuntersuchungen im Kreißsaal gewonnen werden.
Chorion und Amnion ließen sich nach der Freipräparierung eines Haltebereichs leicht
von Hand auseinanderziehen. Wie bei der Plazenta wurde das Gewebe nach Homo-
genität und geringster Verunreinigung ausgewählt.
22 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
2.2.3 Gewebeaufbereitung
Nach Erhalt der Gewebe wurden diese in das Transportmedium Hanks´salt solution
ohne Calcium und Magnesium (BiochromKG) gegeben. Als Transportbehälter wur-
den Mehrzweckbecher 100ml (Greiner Labortechnik, Österreich) oder PP-Röhrchen,
steril, 50ml (cellstar, Greiner Labortechnik, Österreich) verwendet. Um Verunreini-
gungen weitestgehend auszuschließen, erfolgte die Weiterverarbeitung der Gewebe
im Zellkulturlabor an der Sterilbank (Biohit Deutschland GmbH, Köln).
Um das Gewebe von Blut zu befreien, wurde es in PBS Dulbecco´s ohne Calcium,
Magnesium und Natriumbicarbonat (Life Technologies) bei Raumtemperatur durch
langsames Schütteln auf einem Schüttler (MS 2 Minishaker IKA Works, Inc. Wilming-
ton, NC) gewaschen. Die weniger verunreinigten Gewebe wurden als erstes verar-
beitet (erst Amnion, dann Chorion, dann Dezidua). Danach wurde erst Myometrium
und dann Plazenta weiter verarbeitet. Diese Gewebe wurden nicht vollständig von
Blut befreit. Der Waschvorgang wurde aber zugunsten einer schnelleren Weiterver-
arbeitungszeit abgebrochen. Die gereinigten Gewebestücke wurden zu möglichst
drei Aliquots in beschriftete Reaktionsgefäße (2,0 oder 1,5ml, Eppendorf, Hambug,
Deutschland) gefüllt und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die weitere
Lagerung erfolgte bei -70°C. Die Verarbeitungsdauer von Erhalt des Gewebes im
Operationssaal bis zum Schockgefrieren des Feuchtgewebes betrug 30-50min.
2.2.4 Gewebedokumentation
Die Proben wurden nach klinischen und labortechnischen Gesichtspunkten doku-
mentiert. Ein Gewebeinformationsblatt beinhaltete Angaben über Aliquotzahl, Lage-
rungsort und -nummer, sowie Besonderheiten bei der Verarbeitung oder makrosko-
pische Auffälligkeiten der Gewebe sowie Eckdaten der Schwangerschaft. Die spe-
ziellen klinischen Angaben wurden getrennt dokumentiert. Alle Daten wurden ent-
sprechend dem Datenschutzgesetz anonymisiert.
23 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
2.3 Molekularbiologische Methoden
2.3.1 RNA-Extraktion
Die RNA-Extraktion wurde nach der single-step-Methode von Chomczynski & Sacchi
durchgeführt (14). Dazu wurde der peq-GOLD TriFast Kit (Peqlab Biotechnologie)
benutzt.
Das bei -70°C gelagerte Gewebe wurde gewogen und in gefrorenem Zustand dis-
membriert (Mikrodismembrator II, B. Braun, Melsungen AG, Deutschland). Auf 50-
100mg Gewebe wurde 1ml peq-GOLD TriFast gegeben und erneut dismembriert.
Anschließend wurde das Homogenisat aufgetaut.
Zur Phasentrennung wurde das Homogenisat in Reaktionsgefäße (2ml, Eppendorf)
gefüllt. Pro Milliliter peq-GOLD TriFast wurden 0,2ml Chloroform (J.T. Baker) zuge-
geben. Dieses Gemisch wurde geschüttelt und anschließend zur Phasentrennung
bei 4°C und 12.000 x g für 3-10min zentrifugiert (Zentrifuge 5417 R, Eppendorf).
Hierbei entstanden als Unterphase ein DNA- und proteinhaltiges Phenol-Chloroform-
Gemisch, darüberliegend die DNA-haltige Interphase und die RNA-haltige wässrige
Oberphase. Die Oberphase wurde vorsichtig abpipettiert und in ein Reaktionsgefäß
(1,5ml, Eppendorf) zur RNA-Präzipitation überführt.
Pro eingesetztem Anteil peq-GOLD TriFast wurde ein halber Anteil Isopropanol
(Merck) zugegeben. Nach Schütteln wurde die ausgefällte RNA bei 4°C und 12.000 x
g für 60-90min abzentrifugiert.
Das weißliche, geleeartige RNA-Pellet wurde erneut mit 75%igem Ethanol (J.T. Ba-
ker) gewaschen und abschließend etwa 30min luftgetrocknet. Es wurde dabei darauf
geachtet, das Pellet nicht vollständig auszutrocknen, da dies die Löslichkeit der RNA
erheblich herabsetzt.
Zur weiteren Verarbeitung wurde die RNA mit 100µl RNase-freiem Wasser durch
wiederholtes Aufziehen in eine Pipettenspitze in Lösung gebracht. Dieser Vorgang
erforderte je nach Trockenheit des RNA-Pellets 10-20min.
Die Qualität der RNA-Extraktion wurde im Agarose-Gel geprüft. Die quantitative Ana-
lyse erfolgte photometrisch.
Die RNA-Lösung wurde für wenige Tage bei -20°C im gefällten Zustand mit
100%igen Ethanol (J.T. Baker) (2,5-faches Volumen der RNA-Lösung) und NaCl
24 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
(5M, Fluka Chemie GmbH) (0,1-faches Volumen der RNA-Lösung) gelagert. Vor der
weiteren Verarbeitung wurde dieses Ethanol-Präzipitat erneut gewaschen und gelöst.
2.3.2 Photometrische Ermittlung der RNA-Konzentration
Die Ermittlung der Konzentration der gewonnenen RNA wurde photometrisch durch-
geführt.
Dazu wurde die RNA-Absorption bei 260nm (A260) bestimmt und gegen die Absorpti-
on bei 320nm als Nullwert abgeglichen. Anhand des Verhältnisses der Absorption bei
260nm und 280nm wurde die Lösung auf mögliche Proteinverunreinigung geprüft.
Bei der Durchführung wurden die Proben auf Eis gelagert. Es wurde ein Ultrospec
3000 Photometer (Pharmacia Biotech) und eine Suprasil Quarz Küvette (Hellma)
verwendet. Der Null-Abgleich erfolgte mit DEPC-Wasser (Sigma Aldrich Chemie
GmbH). Die eingesetzte RNA wurde in DEPC-Wasser 1:100 verdünnt. Eine A260 von
1 entspricht einer Konzentration von 38µg/µl RNA (70). Berechnet wurden die Men-
gen mit 40µg/µl.
2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese
Bei der Gel-Herstellung wurde Agarose (Life Technologies) in 1 x TBE Puffer (TRIS,
USB-United States Biochemical; Borsäure, Merck; EDTA, Serva Electrophoresis
GmbH) durch Hitzezufuhr gelöst und mit 0,5µg Ethidiumbromid (Carl Roth GmbH &
Co.) pro 50ml 1 x TBE Puffer versehen. Gel zur DNA-Charakterisierung enthielt 2%,
Gel zur RNA-Qualitätskontrolle 1% Agarose. Das Gel wurde in Gel-Kammern (Mini-
sub cell GT, 200/2.0, Bio Rad, Hercules, USA) gegossen, die mit Kämmen versehen
waren, die die Taschen für die Proben bildeten. Es wurde auf die vollständige Lö-
sung der Agarose geachtet und nach dem Gießen wurden die Luftblasen vom Gel
entfernt. Beides behindert die gleichmäßige Bandenwanderung.
Das Beladen des Gels wurde in der Elektrophorese-Kammer durchgeführt. Bei DNA
wurden 5-10µl DNA mit 2µl Ladepuffer (Glycerin, 5%, Merck; EDTA, 5%, Serva E-
lectrophoresis GmbH; Bromphenolblau 0,005%, Phamacia Biotech AB; Xylen Cyanol
0,005%, Bio Ras) gemischt. Das im Ladepuffer enthaltene Glycerin erhöht die spezi-
fische Dichte der Lösung, damit die Proben in die mit TBE gefüllten Gelkammern
hineinsinken. Der Farbstoff stellt einen Marker für die „Lauffront“ dar. Bei RNA wur-
den 2µl RNA-Probe mit 5µl RNA-Ladepuffer vermischt (Formamid 20%, 10xDNA La-
depuffer 25%, Aqua ad iniectiabila 55%).
25 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
Die Elektrophorese erfolgte in Gel-Kammern bei einer Stromstärke von 60-80mA
(EPS 300, Pharmacia Biotech, San Francisco, USA). Die Laufzeit betrug bei RNA-
Beladung etwa 30min, bei DNA-Beladung etwa eine Stunde.
Zur Sichtbarmachung der Ethidiumbromid-gefärbten Banden standen ein Transillu-
minator (302nm, Bachofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen, Deutschland) und ein
Image Documentation and Analysis System (Raytest, Straubenhardt, Deutschland)
zur Verfügung, hier erfo lgte auch die Dokumentation.
Die DNA-Nukleotid-Zahl der Banden wurde durch die DNA-Marker 1KB+Ladder oder
25bp DNA Ladder (beide Life Technologies) geschätzt.
Abb. 4: Verwendete DNA-Marker bei der Agarose-Gel-Elektrophorese.
2.3.4 Reverse Transkription
Die RT-Ansätze zur Denaturierung enthielten 2µg der jeweiligen RNA und wurden
auf ein Gesamtvolumen von 16µl mit DEPC-Wasser (Sigma Aldrich Chemie GmbH)
aufgefüllt. Die Denaturierung erfolgte im Thermocycler (T-Gradient Thermoblock, Bi-
ometra, Göttingen, Deutschland) bei 85°C für 5min. Die denaturierte RNA wurde bis
zur Weiterverarbeitung auf Eis gelagert.
Die cDNA-Synthese wurde mit dem „Super-Script preamplification system for first
strand cDNA Synthesis“ durchgeführt. Das Reaktionsgemisch enthielt ein Gesamtvo-
lumen von 30µl. Zur denaturierten RNA wurde First Strand RT buffer mit Tris-HCl (pH
8,3) 50mmol/l, KCl 75mmol/l, MgCl2 3mmol/l sowie Dithioethritol (DTT) 10mmol/l, Oli-
go (dT)- oder Random Hexamer-Primer 25ng/µl, dNTPs 2,7mmol/l und 10U/µl Su-
perscript II reverse transcriptase (alle Reagentien Life Technologies) gegeben. Die
cDNA-Synthese wurde bei 42°C für 90min durchgeführt, danach wurde die Enzymak-
tivität durch Hitzeinaktivierung bei 80°C über 15min gestoppt.
26 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
cDNA wurde mit DEPC-Wasser in einem Endvolumen von 90µl gelöst und bei -20°C
gelagert.
2.3.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Das Gesamtvolumen des Reaktionsgemischs betrug 50µl. Es enthielt zwischen 1
und 30µl der jeweiligen cDNA (Tab. 8), PCR-Puffer bestehend aus Tris-HCl (pH 8,4)
20mmol/l und KCl 50mmol/l sowie MgCl2 1,5mmol/l, dNTP 800µmol/l, Taq DNA Po-
lymerase 0,025 U/µl (alle Reagentien Life Technologies) und die spezifischen Pri-
merpaare 4µmol/l (synthetisiert bei TIB MOLBIOL, Berlin, Deutschland) (Tab. 2). Das
Reaktionsgemisch wurde mit Aqua ad iniectabilia (B. Braun Melsungen AG) aufge-
füllt.
Tab. 2: Übersicht der verwendeten Primer.
Zielgen / Accession Nr. Richtung Primer Position Amplikonlän-ge
Refe-renz
CRH ah Sense 5´-TGGATCTCACCTTCCACCTC-3´ 481 – 500 308bp 1
NM_000756 Antisense 5´-CATTGTGTTGCTGCTGCAC-3´ 788 – 770
UCN pe Sense 5´-CAGGCGAGCGGCCGCG-´3 2809 – 2824 146bp 57
AF038633 Antisense 5´-CTTGCCCACCGAGTCGAAT-´3 2954 – 2936
CRH-BP se Sense 5´-TAGCAGGAGGAGCATCAG-3´ 481 – 498 400bp 82
X58022 Antisense 5´-GTCACAGCCAACTTTCATCT-3´ 880 – 861
CRH-R1st Sense 5´-GCCCTGCCCTGCCTTTTTCTA-3´ 235 – 255 334bp (á,d) 78
L23332 Antisense 5´-GCTCATGGTTAGCTGGACCA -3´ 568 – 549 421bp (â)
CRH-R2 ro Sense 5´-GCAGCTCGTTGACCATGAAG-3´ 609 – 627 615bp 68
U34587 Antisense 5´-GACACGAAGAAACCCTGGAA-3´ 1223 – 1204
Cyclophilin A Sense 5´-AGGGTGGTGACTTCACACGCCAT-3´ 202 – 224 268bp 4
Y00052 Antisense 5´-GTCTTGCCATTCCGGACCCAAA-3´ 469 – 447
CRH bl Sense 5´-TTTCCGCGTGTTGCTGC-´3 518 – 534 234bp 18
NM_000756 Antisense 5´-TTCCTGTTGCTGTGAGC-´3 751 – 735
CRH-R1ro Sense 5´-ACAAACAATGGCTACCGGGA-´3 275 – 294 592bp (á,c,d) 68
L23332 Antisense 5´-TCATGGGGCCCTGGTAGAT -´3 944 – 925 679bp (â)
CRH-R1bl Sense 5´-GGCAGCTAGTGGTTCGGCC-´3 219 – 238 274bp (á,d) 18
L23332 Antisense 5´-TCGCAGGCACCGGATGCTC-´3 490 – 470 361bp (â)
27 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
Das Primerpaar für CRH-BP wurde im Labor mit Hilfe des Programms Oligo 5.0 ent-
wickelt. Erste Ergebnisse mit dem Primerpaar wurden bereits veröffentlicht (82), die
anderen Sequenzen wurden der Literatur entnommen (Tab. 2). Die Primerpaare
werden nach dem Gen, das sie amplifizieren, benannt und nach den Anfangsbuch-
staben des Erstautors der Referenz.
Die Reaktionen wurden im Thermocycler (T-Gradient Thermoblock) durchgeführt.
Die Positivkontrolle der Reaktion wurde mit Cyclophili n A als Haushaltsgen durchge-
führt.
2.3.6 Identifikation der PCR-Produkte
Die Identität der PCR-Produkte wurde in Stichproben mittels Restriktionsverdau
nachgewiesen. Für jede Komponente des CRH-Systems wurde exemplarisch eine
Sequenzierung durchgeführt.
2.3.6.1 Restriktionsendonuklease-Verdau
Verwendet wurden die Restriktionsendonukleasen HAE III aus Haemophilus aegypti-
us mit der Schnittstelle GG-CC und ALU I aus Arthrobacter luteus (beide Boehringer)
mit der Schnittstelle AG-CT. HAE III und ALU I wurden in Reaktionsgemischen mit
einem Gesamtvolumen von 25µl angesetzt: 10U/µl Restriktionsendonuklease, 1µg
DNA und Puffer A (Boehringer) beim ALU I Verdau bzw. Puffer H (Boehringer) beim
HAE III Verdau. Aufgefüllt wurde mit Aqua ad iniectabilia (B. Braun Melsungen AG).
Nach einstündiger Inkubation im Heizblock (Thermostat 3401, Eppendorf, Deutsch-
land) bei 37°C wurde das Reaktionsgemisch in der Agarose-Gelelektrophorese auf-
getrennt.
28 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
Abb. 5: Restriktionsanalyse eines CRH-R1 Amplikons mit ALU I und HAE III. Das Amplikon wurde aus einer nested PCR gewonnen. Die first-round-PCR wurde mit den Primern CRH-R1ro durchgeführt. In der nested PCR wurde der CRH-R1ro sense-Primer mit dem CRH-R1bl antisense-Primer kombiniert. Die Banden 20bp und 15bp bei HAE III sind nicht abgebildet, da sie im Gel schlecht sichtbar waren.
2.3.6.2 Sequenzierung
Die Identität der PCR-Produkte wurde in Sequenzierungen kontrolliert. Die Big Dye
Terminator Cycle Sequenzierung an einem ABI Prism 377 Sequenzer (PE Biosys-
tems, Weiterstadt, Deutschland) wurde von der Core Facility der Inneren Medizin,
Abteilung I der Universität Freiburg, durchgeführt. Zur Sequenzanalyse wurde das
Programm Basic Blast 2.0 (National Center for Biotechnology Information, Washing-
ton DC, USA – www.ncbi.nlm.nih.gov) verwendet.
Um die Sequenz eines Amplikons im Big Dye Sequence Reaction Protokoll zu ermit-
teln, wurde ein Reaktionsgemisch erstellt. Dieses enthielt das Amplikon (10ng), einen
definierten Primer (3,2pmol), sowie den BigDye-Reaction Mix (4µl). Dieser Ansatz
wurde nach einem Protokoll erneut amplifiziert (Denaturierung 30s bei 96°C, Annea-
ling 15s bei 50°C, Elongation 4min bei 60°C). Das Amplikon dieser PCR wurde ext-
rahiert und zur weiteren Bearbeitung an die Core Facility gegeben.
Die PCR-Produkte wurden für die Sequenzierung entweder durch ein präparatives
Gel oder durch eine PCR-Produktreinigung vorbereitet.
29 Material und Methoden _________________________________________________________________________________
Präparatives Gel und Gelreinigung
Im präparativen Gel wurde die Amplikon-haltige Bande aus dem Agarose-Gel auf
dem Transilluminator (Bachofer Laboratoriumsgeräte) geschnitten. Die Isolation des
Amplikons erfolgte im QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Das Gel wurde mit Puffer
entsprechend der Agarose-Konzentration und des Gel-Gewichts versehen und unter
Hitzezufuhr gelöst. Die Amplikons wurden durch QIAquick spin columns herausgefil-
tert, mit Iso-propanol (Merck) gewaschen und mit Aqua ad iniectabilia (B.Braun Mel-
sungen AG) aus dem Filtersystem gelöst.
PCR-Produktreinigung
Die PCR-Produktreinigung wurde mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)
durchgeführt. Die Reinigung verlief durch ein Filtersystem in einer Zentrifuge (Biofug
pico, Heraeus Instruments, Osterode, Deutschland). Das PCR-Produkt wurde mit
PB-Puffer (Qiagen) im Verhältnis 1:5 verdünnt. Das Reaktionsgemisch wurde in eine
mit einem Filter versehene Säule gegeben und zentrifugiert. Das PCR-Produkt wurde
im Filtersystem gehalten, die Verunreinigungen konnten verworfen werden, danach
wurde das PCR-Produkt mit PE-Puffer (Qiagen) auf die gleiche Art gewaschen und
anschließend mit Aqua ad iniectabilia (B. Braun Melsungen AG) aus der Säule ge-
löst.
30 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
3 Ergebnisse
3.1 Gewebebank
Bei der Gewebesammlung gab es Unterschiede in der Gewebe-Verfügbarkeit. Pla-
zenta und Eihäute wurden zu je drei Aliquots mit einem Feuchtgewicht von ca. 1g
asserviert. Die Myometriummenge war vom Operateur und der intraoperativen Situa-
tion abhängig. Die geringsten Mengen hatten ein Feuchtgewicht von etwa 90mg.
Noch geringere Gewebemengen ergaben sich für die Du. Hier lag das minimale
Feuchtgewicht eines Aliquots bei 23mg. Die Tupfer mit dem Gewebe aus dem Ca-
vum uteri enthielten große Mengen Blutkoagel und Eihautreste, wohingegen Dezidua
nur in kleinen Partikeln vorhanden war. Myometrium und Dezidua wurden bei gerin-
ger Gewebemenge in weniger als drei Aliquots asserviert. Dc konnte in ähnlich gro-
ßen Mengen asserviert werden wie von Eihäute. Diese Gewinnungsmethode wurde
zeitgleich mit dieser Arbeit entwickelt (72).
Das Feuchtgewicht wurde im gefrorenen Zustand ermittelt. Da es sich dabei um eine
Zustandsänderung ohne Mengenveränderung handelt, wurde das ermittelte Gewicht
dem Feuchtgewicht gleichgesetzt. Diese Reihenfolge wurde gewählt, um die Verar-
beitungszeit und die Kontaminationsgefahr gering zu halten.
Die Gewebebank enthielt nach der Sammelperiode von Februar 1999 bis Juni 2000
Gewebe von etwa 100 Schwangerschaften. Aus diesem Pool wurden Proben für die
weiteren Untersuchungen ausgewählt und in Gruppen unterteilt. Laborbedingte Krite-
rien waren dabei, dass die Probenmenge für die weitere Verarbeitung ausreichte, die
Zeit zwischen Entnahme und Gefrieren der Proben nicht außergewöhnlich lang war.
Die klinischen Kriterien für die Gruppenbildung waren Gestationsalter und Wehentä-
tigkeit. Daraus ergaben sich zunächst folgende vier Gruppen:
• Entbindung am Termin ohne Wehen
• Entbindung als Frühgeburt ohne Wehen
• Entbindung am Termin unter Wehen
• Entbindung als Frühgeburt unter Wehen
Im Verlauf der Arbeit wurde zusätzlich vorzeitige Wehentätigkeit berücksichtigt und
folgende Gruppen aufgenommen:
• Entbindung am Termin mit vorzeitigen Wehen
• Entbindung a ls Frühgeburt mit vorzeitigen Wehen
31 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
Tab. 3: Übersicht über die Schwangerschaften, von denen Gewebe untersucht wurde. Die Patientinnen sind durch die Nummern der Gewebebank gekennzeichnet.
Reife SSW Keine Wehen Vorzeitige
Wehen
Wehen unter der
Geburt
Termingerechte Geburten 41 15 25 40 6, 28 29 39 24, 20, 26 23 38 62, 64
Frühgeburten 37 72, 21 71, 17 36 30 35 49 34 46, 13 33 65 32 31 30 78 29 28 18 27 40
Die einzelnen Schwangerschaftsanamnesen zeigten individuelle Besonderheiten.
Diese werden für die Patientinnen mit einer termingerechten Geburt in Tabelle 4, für
die Patientinnen mit Frühgeburten in Tabelle 5 aufgeführt, sowie exemplarisch an
einem Fallbeispiel dargestellt.
Fallbeispiel 78:
Bei einer 20-jährigen Zweitgraviden, Zweitpara kam es in der 30. SSW zur sekundären Sectio caesarea wegen drohender kindlicher Asphyxie mit unstillbarer Wehentätigkeit und V.a. Amnionin-fektsyndrom. In der 12. SSW kam es zu Abortus imminens Blutungen. In der 29. SSW traten erneut vaginale Blutungen mit vorzeitiger Wehentätigkeit auf. Mit der Verdachtsdiagnose eines Amnioninfekt-syndroms wurde tokolytisch und antibiotisch behandelt und eine Lungenreifeinduktion mit Cortison durchgeführt. In der 29+1. SSW kam es zum vorzeitigen Blasensprung. Am folgenden Tag zeig-ten sich im Cardiotokogramm (CTG) variable Dezelerationen und es wurde bei nie ganz unter-drückter Wehentätigkeit die sekundäre Sectio durchgeführt. Das Kind war hypotroph und bedurfte pädiatrischer Betreuung wegen Unreife. In der 18. SSW war eine Amnionzentese mit unauffälli-gem Ergebnis durchgeführt worden. Die erste Schwangerschaft verlief unauffällig und endete mit einer Spontangeburt in der 39. SSW.
32 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
Tab. 4: Klinische Befunde der termingerechten Geburten. G/P gibt die Anzahl der bisherigen Schwangerschaften und Geburten an. Sectio-Datum Pat.- Nr. Alter G/P SWW Sectio-Indikation Schwangerschaftsverlauf und Vorgeschichte
07/99 15 30 3/1 40+1 Beckenendlage (BEL) bei einer Erstpara
Zustand nach (Z.n.) Abortabrasiones 1992 und 1994
08/99 28
27 2/2 39+3 Relatives Missverhältnis Z.n. sekundärer Sectio 1995 wegen relativem Missverhältnis mit anschließender positiver Gut-man-Martius Aufnahme
02/99 6 38 2/2 39+1 Relatives Missverhältnis Unauffällige Amnionzentese in der 15. SSW Einnahme von Paracetamol und Tramadol be-darfsweise ab der 34. SSW wegen Lumboischial-gie Z.n. sekundärer Sectio 1990 wegen relativem Missverhältnis
08/99 26 34 3/3 38+5 Vorausgegangene Ute-rus- Operation (OP)
C-Reaktives Protein (CRP) präpartal 1,1mg/dl, Erkältung Z.n. sekundärer Sectio 1990 wegen relativem Missverhältnis Z.n. primärer Re-Sectio 1995 wegen relativem Missverhältnis, vorzeitiger Blasensprung (VBS)
07/99 20 28 2/2 38+4 Vorausgegangene Ute-rus- OP
Z.n. Myomenukleation 1998 Z.n. Spontanpartus 1994
08/99 24 32 4/2 38+2 Relatives Missverhältnis Z.n. Abortus imminens Blutung in der 10.SSW Nikotinabusus Z.n. sekundärer Sectio 1989 wegen relativem Missverhältnis mit anschließender positiver Gut-man-Martius Aufnahme Z.n. Abortabrasio 1995 Z.n. Abruptio 1997
01/00 64 28 3/2 37+6 BEL bei relativer Erstpara Z.n. VWT 19. und 33. SSW Z.n. Bronchitis 30. SSW, antibiotische Therapie Insulinpflichtiger Gestationsdiabetes seit der 35. SSW Magnesium in der Schwangerschaft Z.n. Spontanpartus Z.n. Abruptio
01/00 62 38 4/1 37+3 BEL bei Erstpara, Uterus bicornis
Z.n. VWT und Isthmocervikale Insuffizienz (ICI) 23. und 28. SSW, Behandlung mit Diazepam und Magnesium oral, Cerclage ab 23. SSW Z.n. vaginalen Blutungen, 18. SSW Z.n. Sterilitätsbehandlung Z.n. drei Frühaborten
08/99 25 26 1/1 40+4 Sekundäre Sectio bei Geburtsstillstand
Geburtseinleitung mit Prostaglandin-Gel, intra-cervikal, wegen beginnender Gestose Digitalis Gabe ab der 30. SSW wegen fetaler Tachyarrhythmie (sub partal Metoprolol)
08/99 29 27 1/1 39+4 Sekundäre Sectio bei Geburtsstillstand
Wehenunterstützung mit Oxytocin Magnesium in der Schwangerschaft
08/99 23 18 2/2 38+4 Sekundäre Sectio bei Geburtsstillstand
Wehenunterstützung mit Oxytocin Nottokolyse vor der Sectio mit Fenoterol (Partu-sisten) Z.n. intrauteriner Fruchttod (IUFT), spontan aus-gestoßen
33 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
Tab. 5: Klinische Befunde der Frühgeburten. Sectio-Datum Pat.-Nr. Alter G/P SWW Sectio-Indikation Schwangerschaftsverlauf und Vorgeschichte
07/99 21 29 1/1 36+6 Maternale Erkrankung Z.n. Radiatio 1999
02/00 72 35 1/1 36+2 Geminigravidität bei Erstpara mit beginnender Diskordanz
Intraoperativ Gabe von PG F2 alpha Pessareinlage in der 20. SSW Z.n. operativer Lagekorrekur des Uterus
11/99 49 23 2/1 34+6 Geminigravidität bei Erstpara mit Nabel-schnur-Komplikationen
Z.n. Abruptio 1998
07/99 18 37 6/3 27+3 Progrediente Pr ä-eklampsie
Gestosebeginn in der 25. SSW Z.n. Lungenreifeinduktion mit Celestan Z.n. Amnionzentese 15. SSW Z.n. Spontanpartus 1990 und 1992 Z.n. Abort 1994 Z.n. Abruptiones 1985 und 1996
07/99 17 25 2/3 36+4 Gemini mit Wachstums Diskordanz
VWT, 29. SSW Z.n. Spontanpartus
02/00 71 33 2/2 36+2 V.a. relatives Missver-hältnis
VWT und vaginale Candidosis, 34. SSW Z.n. Lungenreifeinduktion Z.n. sekundärer Sectio, drohender kindlicher Asphyxie 42. SSW, 1998
09/99 30 27 2/2 35+6 Maternale psychische Belastung
VWT 34. SSW, Magnesium und Diazepam Z.n. Vakuumextraktion 1994
04/99 13 42 4/1 33+5 Notsectio Drohende kindliche Asphyxie bei vaginaler Blutung bei Plazenta praevia marginalis
Z.n. Amnionzentese Z.n. Harnwegsinfekt (HWI) und Kolpitis im zweiten Trimenon Z.n. VWT und vaginaler Blutung (33. SSW), behandelt mit Magnesium, Diazepam, Cefotiam. Z.n. Lungenreifeinduktion Präpartal erhöhte Infektparameter (Leukozyten 22,5 tsd/l, CRP 3,5 mg/ml) Z.n. Abortabrasio, 8. SSW, 1997 Z.n. Abortabrasio, 25. SSW bei VBS, 1988 Z.n. Abortabrasio, 25. SSW bei VBS, 1987 Z.n. Konisation 1986
10/99 46 29 1/1 33+1 Gemini bei Erstpara, I in BEL und maternaler Harnstau
ICI mit Pessareinlage, 25. SSW VWT ab 30. SSW, Magnesium, Fenoterol, Cefoti-am, Metronidazol Präpartal erhöhte Infektparameter (CRP 2,3mg/ml) Z.n. Lungenreifeinduktion Z.n. Uretertransplantation bei vesikouretralen Reflux, 1994
01/00 65 30 1/1 32+6 Maternale psychische Belastung
Z.n. Nierenstau, 22. und 26. SSW Z.n. ICI mit Pessareinlage, 27. SSW Z.n. VWT 27. SSW, Magnesium und Diazepam Z.n. Lungenreifeinduktion Präpartal erhöhte Infektparameter (CRP 1,3mg/ml) Z.n. Beckenringfraktur 1973 Z.n. Pyelonephritis, 1991
10/99 40 30 32 26+2 BEL bei Unreife nach VBS mit drohender kindli-cher Infektionsgefahr
VBS, vaginale Streptokokken Präpartal erhöhte Infektparameter (Leukozyten 14,4tsd/l, CRP 4,8mg/ml), Cefotiam, Metronidazol VWT, Magnesium, Fenoterol, Diazepam Z.n. Lungenreifeinduktion Z.n. Spontanpartus 1990 Z.n. Konisation 1993 Z.n. Abortabrasio mit Uterusverletzung 1992
03/00 78 20 2/2 29+2 Drohende kindliche Asphyxie, bei unstillbaren Wehen und V.a. Amnio-ninfektsyndrom
Abortus Imminens 12. SSW Amnionzentese VBS 29+1. SSW VWT mit drohendem Amnioninfektsyndrom 29. SSW Vaginale Blutung 29. SSW Z.n. Spontanpartus 1998
34 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
3.2 Methodische Aspekte
3.2.1 RNA-Extraktion
Die RNA-Qualität wurde anhand der 28S rRNA (5,0kb) und 18S rRNA (1,9kb) (2) in
der Gelelektrophorese beurteilt (Abb 6a+b). Zur weiteren Untersuchung wurden nur
Proben mit vorhandenen 28S- und 18S-Banden eingesetzt.
Die aus weniger Nukleotiden bestehende mRNA liegt im Gel unterhalb der 18S-
rRNA-Bande, ist aber nicht sichtbar, weil der mRNA-Gehalt sehr gering ist und sie
unterschiedliche Sequenzlängen hat. Befindet sich genomische DNA in der RNA-
Extraktion, treten Banden nahe der Auftragungsstelle auf. Genomische DNA besteht
aus weitaus mehr Nukleotiden (>10kb) als RNA und wandert daher im Gel weniger
weit. Eine Degradierung von RNA durch RNAse zeigt sich im Gel als breiter
„Schmier“ im Bereich kurzer Fragmente.
Abb. 6: Beispiele für die extrahierte RNA von unterschiedlicher Qualität. (a) zeigt eine intakte RNA nach Extraktion. Die 28S- und 18S -Banden sind deutlich und mit gutem Kontrast ausgeprägt. Nahe der Auftragungsstelle ist genomische DNA sichtbar. (b) zeigt eine teilde-gradierte RNA ohne genomische DNA. (c) zeigt eine degradierte RNA, es ist keine 28S- und 18S-Bande mehr sichtbar, die RNA -Fragmente sind als „Schmier“ an der „Gelfront“ sichtbar.
Die RNA-Extraktion wurde an 85 Gewebeproben durchgeführt, 26 Proben zeigten im
Gel eine Verunreinigung mit genomischer DNA. Die meisten Kontaminationen mit
genomischer DNA zeigten sich bei Chorion-Proben (12 von 16). Bei den 23 Plazen-
ta-Proben waren neun mit genomischer DNA kontaminiert. Weniger verunreinigte
Proben gab es bei Myometrium (drei von 22) und Dezidua (zwei von 18). Die sechs
Amnion-Proben zeigten keine DNA-Kontamination. In Tabelle 6 sind die RNA-Proben
mit genomischer DNA vergleichend mit den CRH- und UCN-PCR-Ergebnissen dar-
35 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
gestellt. Aufgrund der verwendeten Primer für diese Komponenten kann genomische
DNA hier zu falsch positiven Ergebnissen führen.
Die CRH-Expression wurde an zehn Proben untersucht, die genomische DNA ent-
hielten. Die neun Plazenta-Proben zeigten eine Expression, die Dezidua-Probe zeig-
te keine.
Die UCN-Expression wurde an 24 Proben untersucht, die genomische DNA enthiel-
ten. Die drei Myometrium-Proben davon zeigten eine Expression. Insgesamt zeigten
13 von 21 Myometrium-Proben eine UCN-Expression. Sechs von acht Plazenta-
Proben mit genomischer DNA und vier von neun Plazenta-Proben ohne genomische
DNA zeigten eine UCN-Expression. Zwei Dezidua-Proben enthielten genomische
DNA und zeigten eine UCN-Expression und neun von 13 Dezidua-Proben ohne ge-
nomische DNA zeigten eine UCN-Expression. Fünf von elf Chorion-Proben mit ge-
nomischer DNA zeigten eine UCN-Expression aber keine der vier untersuchten Pro-
ben ohne genomische DNA.
Tab. 6: RNA-Proben verglichen mit den PCR-Ergebnisse von CRH und UCN. Grau hinterlegt sind Proben, die genomische DNA enthielten. (+) und (-) kennzeichnen in den Spalten CRH und UCN die Ergebnisse der durchgeführten PCR-Versuche. Für die leeren Felder liegen keine Ergebnisse vor.
Pat.-Nr. M P D C A M P D C A M P D C A15 - + - - - + +28 - + - + + + -6 + + - + -
26 - + - + - - -20 - + + - +24 - + - + - + +64 + - + -62 - + +25 + - + + -29 + + + + + +23 + + - + -21 - + -72 + - + +49 + - +18 - + - -17 + - - -71 - + +30 + + + + + +13 + + - -46 + - + +65 - + +78 +40 - + - + + + +
RNA CRH UCN
36 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
3.2.2 RT mit Oligo (dT) und Random Hexamere
Die RT wurde alternativ mit Oligo (dT) bzw. Random Hexameren durchgeführt. Ta-
belle 21 zeigt die PCR-Ergebnisse für die unterschiedlichen CRH-Komponenten. Die
CRH- und CRH-BP-Ergebnisse zeigen unabhängig von den in der RT benutzten
Primern positive und negative Ergebnisse. Beim Nachweis von UCN und dem CRH-
R1 wurden in der PCR ausschließlich negative Ergebnisse erhoben, wenn Oligo (dT)
in der RT eingesetzt wurde.
Tab. 7: Expression der CRH-Komponenten in Abhängigkeit von den RT-Primern. Grau unterlegt sind die Proben, die mit Oligo (dT)-Primern synthetisiert wurden. Einen weißen Hinter-grund haben Proben, die mit Random Hexameren synthetisiert wurden. Für leere Felder liegen keine Ergebnisse vor. Alle Dezidua- und Chorion-Proben wurden mit Random Hexameren als Primer syn-thetisiert und sind deshalb nicht in der Tabelle aufgeführt.
3.2.3 Etablierung der PCR-Bedingungen
In dieser Arbeit wurden die PCR-Bedingungen für die untersuchten Komponenten
des CRH-Systems etabliert. Es wurde die optimale Einsatzmenge der cDNA titriert,
die geeignete Zyklenanzahl für die jeweiligen Primer in der PCR gesucht, sowie die
geeignete Annealing-Temperatur für die jeweiligen Primer in der Gradienten-PCR
CRH UCN CRH-BP CRH-R1
Pat.-Nr. Mu P A Mu P A Mu P A Mu P A
15 - + - - - + - - - -28 - + + + + + +6 + + - + + +26 - + - + - + + - + - -20 - + + - + - +24 - + + - + + +64 + - + + +62 - + + + +25 + - + + -29 + + - + + - -23 + + - + -21 - + + + +72 + - + + +49 + - + + +18 - + - + -17 + - +71 - + +30 + - + + + + -13 + + - + +46 + - + - +65 - + + + + +40 - + + + - + -78 + -
37 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
ermittelt. Die Ergebnisse dieser Vorversuche sind exemplarisch in den Abbildungen
7-9 dargestellt.
Abb. 7: PCR mit unterschiedlichen cDNA-Einsatzmengen.
Abb. 8: CRH-BP Bande im Gel nach unterschiedlicher Anzahl PCR-Zyklen. (a) zeigt die Plazenta-Probe 26 nach 30 Zyklen. (b) zeigt die Plazenta-Probe 26 nach 35 Zyklen.
Abb. 9: Gradienten-PCR mit dem CRH-R1bl.
Tab. 8: Übersicht über angewandten RT-PCR Bedingungen.
Zielgen cDNA Vorinkubation Denaturierung Annealing Extension Long Extension Zyklen Referenz
CRH ah
1 µl
95 °C / 5 min
95 °C / 1 min
56 °C / 1 min
72 °C / 3 min
72 °C / 5 min
40
1
UCN pe 1 µl 94 °C / 3 min 94 °C / 30 s 60 °C / 40 s 72 °C / 90 s 72 °C / 10 min 35 57
CRH-BP se 1 µl 94 °C / 3 min 94 °C / 30 s 63 °C / 40 s 72 °C / 90 s 72 °C / 10 min 35 82
CRH-R1st 30 µl 95 °C / 5 min 94 °C / 30 s 62 °C / 30 s 72 °C / 30 s 72 °C / 8 min 32 78
CRH-R2ro 5 µl 94 °C / 5 min 94 °C / 1 min 62 °C / 1 min 72 °C / 2 min 72 °C / 5 min 30 68
38 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
3.2.4 Primer-Auswahl
Die Primer wurden größtenteils aus der Literatur entnommen und die darauf aufbau-
end geeigneten Bedingungen für das Labor entwickelt.
Zum Nachweis einer CRH-Expression wurde zunächst ein Primerpaar von di Blasio
et. al. (18) verwendet – CRHbl. Die gesuchte 234bp-Bande konnte in keinem der
durchgeführten Versuche sichtbar gemacht werden. Sie wurde durch das Primerpaar
von Ahmed et. al. (1) – CRHah – ersetzt.
Für den Nachweis von CRH-R1 wurden zunächst zwei Primerpaare ausgewählt. Der
CRH-R1ro konnte die Subtypen alpha, c und d in einer Amplikonlänge von 592bp,
den Subtyp beta in einer Amplikonlänge von 679bp amplifiziert. Der CRH-R1bl Primer
amplifiziert die Subtypen alpha und d in einer Länge von 274bp und den Subtyp beta
mit 361bp. Der Subtyp c wird nicht erfasst.
Für diese beiden CRH-R1 Primerpaare ließen sich in der Gradienten-PCR keine ge-
eigneten Temperaturen finden, die sämtliche möglichen Banden darstellten. Einmalig
gelang ein Sichtbarmachen der kürzeren Bande des CRH-R1bl. Bei einer durchge-
führten nested PCR konnte der CRH-R1 Subtyp alpha und/oder d gezeigt werden.
Bei der nested PCR wurden in der first-round-PCR CRH-R1ro-Primer eingesetzt . Die-
se zeigten im Gel keine Banden. Das erhaltene PCR-Produkt wurde 1:500 verdünnt
und anstelle der cDNA in der second-round-PCR eingesetzt. Es wurde das Primer-
paar CRH-R1ro sense und CRH-R1bl antisense eingesetzt. Das erwartete Amplikon
hatte eine Länge von 216bp. Mit dieser Methode gelang der Nachweis des CRH-R1.
Das zuletzt verwendete Primer-Paar CRH-R1st amplifiziert die Subtypen alpha und d
(334bp) und beta (421bp). Der Subtyp c konnte mit diesem Primerpaar nicht nach-
gewiesen werden, da der sense Primer auf Exon drei ansetzt, der beim Subtyp c
nach Spleißen fehlt. Die Subtypen alpha und d konnten durch das Primerpaar nicht
unterschieden werden, da der Subtyp d eine Deletion auf Exon 13 hat. Dieses wurde
vom verwendeten Primerpaar nicht erfasst. Der Subtyp beta enthält als einziger Sub-
typ das Exon sechs. Dadurch wird das CRH-R1 beta Amplikon länger als die Ampli-
kons der Subtypen alpha und d und kann sich als zweite Bande darstellen.
39 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
Exons
Isoformen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Primer sense antisense
CRH-R1alpha
CRH-R1beta
CRH-R1c
CRH-R1d
Abb. 10: Ansatzstellen der verwendeten CRH-R1st-Primer (modifiziert nach 62).
Die ausgewählten Primerpaare von CRHah und UCNpe liegen auf einem Exon. Das
bedeutet, dass die Primer in der PCR nicht zwischen mRNA und genomischer DNA
unterscheiden. Das Vorliegen von genomischer DNA kann anhand der Gele-
lektrophorese der RNA-Extraktion beurteilt werden.
3.2.5 CRH-BP-Doppelbande
Beim Nachweis des CRH-BP in der PCR ließ sich regelmäßig neben der erwarteten
Bande in Höhe von 400bp eine zweite unerwartete Bande bei etwa 300bp nachwei-
sen. Diese Bande stellte sich ebenso eindeutig dar wie die 400bp-Bande.
Da der optische Eindruck darauf schließen ließ, dass es sich bei der zweiten Bande
um ein definiertes Amplikon handeln könnte, wurde der Frage nachgegangen, we l-
chen Ursprung diese zweite Bande hatte.
Abb. 11: Gradienten-PCR der CRH-BP-Doppelbande. Die 300bp-Bande verliert bei zunehmender Temperatur an Helligkeit und Kontrast ohne ganz zu ve r-schwinden. Die 400bp-Bande gewinnt bis zu einer Temperatur von 64,7°C an Deutlichkeit, anschlie-ßend nimmt sie wieder ab.
Es wurde eine Gradienten-PCR durchgeführt (Abb. 11, um zu klären, ob es sich um
ein temperaturabhängiges Phänomen handelte. Hierbei stellte sich die 300bp-Bande
bei niedrigeren Temperaturen deutlicher dar als die 400bp-Bande. Bei höheren Tem-
40 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
peraturen gestaltete sich das Bild umgekehrt: die Bande bei 400bp war deutlicher
exprimiert als die 300bp-Bande. Es gelang aber an keinem Ende der Temperaturska-
la, eine solitäre Darstellung einer der beiden Banden zu erlangen.
Es wurde ein präparatives Gel durchgeführt, um beide Banden zu sequenzieren. Das
Alignment wies bei der 300bp-Bande eine Homologie von etwa 50% zur Sequenz
des CRH-BP auf und zeigte eine hohe Anzahl nicht identifizierter Basen. Die 400bp-
Bande wurde durch die Sequenzierung als CRH-BP identifiziert.
3.2.6 Uterine und choriale Dezidua
Tabelle 9 stellt die PCR-Ergebnisse der Komponenten des CRH-Systems für Dezi-
dua nach der Gewinnungsmethode dar. CRH wurde in keiner der drei Dezidua-
Proben nachgewiesen, UCN wurde in sieben von acht Dc-Proben und in drei von fünf
Du-Proben nachgewiesen. CRH-BP wurden in vier von elf Dc-Proben und in einer von
vier Du-Proben nachgewiesen. CRH-R1 wurden in zwei von fünf Dc-Proben und in
einer von zwei Du-Proben nachgewiesen. Es lag kein Hinweis auf unterschiedliche
PCR-Ergebnisse aufgrund der Dezidua-Gewinnungsmethode vor.
Tab. 9: Expression der Komponenten des CRH-Systems in uteriner und chorialer Dezidua. Grau unterlegt sind die Proben, die aus dem Cavum uteri gewonnen wurden, einen weißen Hinter-grund haben die vom Chorion abgetragenen Dezidua-Proben. Nr.15 wurde eingerahmt, da diese Pro-be in der RNA-Extraktion genomische DNA enthielt.
Pat.-Nr. CRH UCN CRH-BP CRH-R125 + -15 - + - -6 + - -20 + + +64 - -62 -21 + +72 + - -30 + +65 -40 - + +29 + -26 - - -23 + -24 - + + +17 -
41 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
3.3 Molekularbiologische Ergebnisse
3.3.1 CRH
Es wurden 35 Gewebeproben auf ihre CRH-Expression hin untersucht. Die folgende
Abbildung zeigt beispielhaft ein Agarose-Gel der schwangerschaftsspezifischen Ge-
webe.
Abb. 12: Agarose-Gel der CRH-Expression. Dargestellt sind die Proben der Patientin Nr.15 sowie beispielhaft für alle durchgeführten PCR eine Positivkontrolle mit Cyclophilin A (von einem anderen Gel).
20 Plazenta-Proben, neun Myometrium-Proben, vier Dezidua-Proben und zwei Am-
nion-Proben wurden untersucht, Chorion-Proben wurden nicht untersucht. Mit einer
Ausnahme (P18) war bei allen Plazenta-Proben eine CRH-Expression nachweisbar.
P18 stammte von einer Schwangerschaft ohne Wehen aus der 28. SSW. Die Proben
der weiteren Gewebearten zeigten keine CRH-Expression.
42 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
Tab. 10: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH. Die Ergebnisse der Dezidua-Proben wurden alternativ von uteriner (Du) bzw. chorialer Dezidua (Dc) ermittelt. Nur Proben, von denen Ergebnisse vorlagen, erhielten einen Eintrag: (+) für den Nac hweis, (-) für keinen Nachweis einer Expression. Für die leer gelassenen Felder liegen keine Ergebnisse vor.
Geburtsreife Pat.-Nr. SSW Wehen M P Du Dc A
Termingerechte Geburten 15 40+1 keine Wehen - + - - 28 39+3 - + - 6 39+1 + 26 38+5 - + - 20 38+4 - + 24 38+2 - + - 64 37+6 VWT . + 62 37+3 - + 25 40+4 Wehen +
29 39+4 + 23 38+4 +
Frühgeburten 21 36+6 keine Wehen - + 72 36+2 + 18 27+3 - 30 35+6 VWT + 30 35+6 + 13 33+5 + 46 33+1 + 65 32+6 - + 40 26+4 - + -
3.3.2 Urocortin
Die UCN-Expression wurde an 72 Proben untersucht. Abbildung 13 zeigt beispielhaft
ein Agarose-Gel mit Urocortin-Expression in den verschiedenen Geweben.
Abb. 13: Agarose-Gel der UCN-Expression. Die Gewebe stammen von der Patientin Nr. 30.
Die UCN-Expression im Myometrium wurde bei acht von elf Proben von terminge-
rechten Geburten und bei sechs von zehn Proben von Frühgeburten nachgewiesen.
Vier von neun Plazenta-Proben von termingerechten Geburten waren positiv und
43 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
sieben von neun von Frühgeburten. 15 Dezidua-Proben wurde bezüglich der UCN-
Expression untersucht. Acht von zehn termingerechten Dezidua-Proben und vier von
fünf Dezidua-Proben von Frühgeburten zeigten eine Expression. Die UCN-
Expression von Chorion wurde ebenfalls an 15 Proben untersucht, drei von acht
Proben von termingerechten Geburten und drei von sieben Proben von Frühgeburten
zeigten eine Expression. Die UCN-Expression im Amnion-Gewebe wurde an drei
Proben untersucht, zwei zeigten eine Expression. Tabelle 11 stellt die Ergebnisse
dar. Eine Abhängigkeit des Expressionsmusters von Wehen und Gestationsalter
zeigte sich nicht.
Tab. 11: Die RT-PCR-Ergebnisse von UCN.
Geburtsreife Pat.-Nr. SSW Wehen M P Du Dc C A
Termingerechte Geburt 15 40+1 keine Wehen - . + + 28 39+3 + + + - 6 39+1 + - + - 26 38+5 + - - - 20 38+4 + - + 24 38+2 + - + + 64 37+6 VWT - + - 62 37+3 + 25 40+4 Wehen - + + - 29 39+4 + + + + + 23 38+4 + - + -
Frühgeburt 21 36+6 keine Wehen - 72 36+2 - + + 49 34+6 - + 18 27+3 + - - 17 36+4 VWT + - - - 71 36+2 - + + 30 35+6 + + + + + 13 33+5 + - - 46 33+1 - + + 65 32+6 + 40 26+4 + + + + 78 29+2 Wehen +
3.3.3 CRH-BP
Für das CRH-BP liegen von 78 Gewebeproben aus 22 Schwangerschaften Ergeb-
nisse aus der RT-PCR vor. Die folgende Abbildung zeigt beispielhaft Ergebnisse der
Gewebearten im Agarose-Gel.
44 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
Abb. 14: Agarose-Gel der CRH-BP-Expression.
In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse zum CRH-BP zusammengefasst.
Tab. 12: Die RT-PCR Ergebnisse vom CRH-BP.
Reife Pat.-Nr. SSW Wehen M P Du Dc C A
Termingerechte Geburten 15 40+1 keine Wehen - + - - - 28 39+3 + + + - 6 39+1 + + - - 26 38+5 + + - - 20 38+4 + - + - 24 38+2 + + + + 64 37+6 VWT + + - 62 37+3 + + - 25 40+4 Wehen + - - - 29 39+4 + - - - - 23 38+4 + - - -
Frühgeburten 21 36+6 keine Wehen + + + + 72 36+2 + + - 49 34+6 + + 18 27+3 + - - 17 36+4 VWT + - 71 36+2 + - 30 35+6 + + + - 13 33+5 + - + 46 33+1 - + - 65 32+6 + + - 40 26+4 - + + + - 78 29+2 Wehen -
Die CRH-BP-Expression zeigt in dieser Untersuchung keine Abhängigkeit vom
Gestationsalter. Bei Myometrium-Proben wurde CRH-BP-Nachweis bei zehn von elf
Proben von termingerechten Geburten und bei acht von elf Proben von Frühgeburten
nachgewiesen. In Plazenta-Proben zeigte sich CRH-BP in sieben von elf Proben von
termingerechten Geburten und bei acht von neun Proben von Frühgeburten. Diese
Gewebe zeigten unabhängig vom Gestationsalter zumeist eine CRH-BP-Expression.
45 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
In Dezidua-Proben von termingerechten Geburten wurde CRH-BP in drei von zehn
Proben nachgewiesen und in drei von sechs Proben von Frühgeburten. Chorion-
Proben termingerechter Geburten zeigten in einer von acht Proben eine CRH-BP-
Expression und in zwei von sechs Proben von Frühgeburten. Von Amnion wurden je
drei Proben von termingerechten und Frühgeburten untersucht, eine Probe einer
Frühgeburt zeigte eine Expression. Diese drei Gewebearten zeigten unabhängig vom
Gestationsalter in den meisten Proben keine CRH-BP-Expression.
Die CRH-BP-Expression in Abhängigkeit von der Wehentätigkeit für die Gewebear-
ten zeigt Abbildung 16. Ohne Wehen zeigen neun von zehn Myometrium-Proben,
acht von zehn Plazenta-Proben, vier von acht Dezidua-Proben, zwei von sieben
Chorion-Proben und keine der beiden Amnion-Proben eine CRH-BP-Expression.
Proben mit VWT zeigten bei sechs von acht Myometrium-Proben, alle sieben Plazen-
ta-Proben, zwei von sechs Dezidua-Proben, eine von vier Chorion-Proben und eine
von drei Amnion-Proben eine CRH-BP-Expression. Bei Proben mit Wehen unter der
Geburt zeigten drei der vier Myometrium-Proben eine CRH-BP-Expression in Plazen-
ta, Dezidua, Chorion und Amnion zeigte sich keine Expression.
Die Myometrium-Probe der Gruppe mit Wehen unter der Geburt stammt von Patien-
tin Nr. 78, einer Schwangerschaft aus der 30. SSW mit einem Amnioninfektsyndrom.
Die drei anderen Schwangerschaften waren sekundäre Sectiones.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M P D C A M P D C A M P D C A
keine WT VWT WT bei der Geburt
Pro
ben
zah
l
pos
neg
Abb. 15: CRH-BP-Expression in Abhängigkeit von der Wehentätigkeit.
46 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
3.3.4 CRH-R1
Die CRH-R1-Expression wurde mit dem Primerpaar CRH-R1st untersucht. Dieses
Primerpaar erfasst die Subtypen CRH-R1 alpha und d in einer Amplikonlänge von
334bp und den Subtypen CRH-R1 beta in einer Amplikonlänge von 421bp. Es wur-
den ausschließlich die Expression der Subtypen CRH-R1 alpha und/oder d nachge-
wiesen. Die CRH-R1-Expression wurde an 17 Gewebeproben aus acht Schwanger-
schaften untersucht. Sechs Schwangerschaften stammten von termingerechten Ge-
burten ohne Wehen, zwei von Frühgeburten, eine ohne Wehen, die andere mit VWT.
Abb. 16: Agarose-Gel der CRH-R1-Expression. Das gesuchte Amplikon hat eine Länge von 334bp.
Bei den Myometrium-Proben zeigten sieben der acht Proben ein positives Ergebnis.
Die beiden untersuchten Plazenta-Proben waren negativ. Drei von vier Dezidua-
Proben waren positiv, die Chorion-Probe und beide Amnion-Proben waren negativ.
Der Nachweis einer CRH-R1 mRNA-Expression gelang nur in Myometrium- und De-
zidua-Proben. Der vollständig untersuchte Probensatz Nr.15 zeigte in keiner Gewe-
beart eine CRH-R1-Expression.
Tab. 13: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH-R1.
Geburtsreife Pat.-Nr. SSW Wehen M P Du Dc C A
Termingerechte Geburt 15 40+1 - - - - - - 28 39+3 - + + 6 39+1 - + 26 38+5 - + - - 20 38+4 - + + 24 38+2 - + +
Frühgeburt 21 36+6 - + 65 32+6 VWT +
47 Ergebnisse _________________________________________________________________________________
3.3.5 CRH-R2
Der CRH-R2 wurde in Stichproben mit dem Primerpaar CRH-R2ro nachgewiesen.
Das Primerpaar unterscheidet nicht zwischen den Subtypen alpha, beta und gamma.
Die nachstehende Abbildung zeigt ein CRH-R2 Agarose-Gel.
Abb. 17: Agarose-Gel der CRH-R2-Expression.
Es wurden sechs Myometrium-Proben untersucht, alle zeigten eine CRH-R2 Expres-
sion.
Tab. 14: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH-R2.
Geburtsreife Pat.-Nr. SSW Wehen M
Termingerechte Geburten 6 39+1 keine Wehen + 20 38+4 + 62 37+3 VWT +
Frühgeburten 21 36+6 keine Wehen + 65 32+6 VWT + 40 26+4 +
48 Diskussion _________________________________________________________________________________
4 Diskussion
4.1 Gewebebank – Gewebesammlung und Patientinnenkollektiv
In der Universitäts-Frauenklinik Freiburg gab es während der Sammelperiode (16
Monate) ca. 1.600 Geburten, davon waren ca. ein Drittel Schnittentbindungen, aus
etwa jeder fünften wurde Gewebe gewonnen. Gewebe wurde nicht entnommen,
wenn kein schriftliches Einverständnis vorlag. Etwa jede zweite Schwangere lehnte
eine Gewebeentnahme ab. Ebenfalls kein Gewebe wurde von Schwangeren mit in-
fektiösen Erkrankungen gesammelt. Nur wenige Gewebeproben konnten von sekun-
dären Sectiones gesammelt werden. Die Aufklärung der Schwangeren war in dieser
psychisch sehr belastenden Situation schwierig. Zudem konnte in diesen Fällen das
Labor oft nicht rechtzeitig informiert werden, da diese Schnittentbindungen ungeplant
und häufig nachts erfolgten. Ein weiteres Problem bei der Gewebesammlung stellte
die Gewinnung des Myometriums dar: ein Teil der Schwangeren stimmte der Ent-
nahme von Gewebe aus der Nachgeburt zu, schloss aber die Entnahme von Myo-
metrium explizit aus .
Myometrium wurde an der Uterotomie im unteren Uterinsegment entnommen. Dieser
Abschnitt des Uterus ist bei den Geburtswehen relaxiert. Wehenbelastetes Gewebe
aus dem Fundus ist nur bei Hysterektomien oder T-Schnitt-Erweiterungen der Utero-
tomie zu gewinnen, beides sind seltene Komplikationen der Schnittentbindung.
Bei den Dezidua-Entnahmetechniken ließ sich mit Dc mehr Gewebe gewinnen. Da zu
den Ergebnissen von Du keine Unterschiede zu erkennen waren, ist diese Methode
der Dezidua-Gewinnung von Vorteil.
Bei der Interpretation der Untersuchungsbefunde muss berücksichtigt werden, dass
die Proben aus einer Universitätsklinik stammten, was einen überdurchschnittlich
hohen Anteil pathologisch verlaufender Schwangerschaften besonders bei den
Schnittentbindungen erklärt.
In der Gruppe der termingerechten Geburten ohne Wehen wurden einige geplante
Schnittentbindungen erst nach dem errechneten Termin durchgeführt. Dies zeigt die
Variationsbreite beim Einsetzen spontaner Wehen bei physiologisch verlaufenden
Schwangerschaften. Bei 60% aller Spontangeburten setzen die Wehen zehn Tage
vor bis zehn Tage nach dem errechneten Termin ein (46). Möglicherweise ließe sich
durch Heranziehen des präpartalen Zervix-Scores die Geburtsnähe weiter eingren-
49 Diskussion _________________________________________________________________________________
zen. Ob klinische Untersuchungen eine ausreichende Untersucher-unabhängige
Standardisierung zulassen, ist fraglich. Da aber zur Geburt hin viele Veränderungen,
die auch das CRH betreffen, eintreten (36, 49, 75), wäre die Möglichkeit einer weite-
ren Einteilung der Phase 1 für die Untersuchung des Expressionsmusters des CRH-
Systems interessant.
Die Proben von Frühgeburten ohne Wehen beinhalten eine Schwangerschaft mit
einer progredienten Präeklampsie. Für dieses Krankheitsbild wurden bisher Untersu-
chungen bezüglich CRH durchgeführt, die sich mit CRH-Vorstufen oder dem Plas-
maspiegel befassten (1, 53, 54).
Die Proben der sekundären Sectiones waren sehr zeitnah zur Gewebegewinnung
unterschiedlichen Noxen ausgesetzt (Prostaglandin-Gel, Oxytocin, beta-2-
Sympathomime-tika). Ob und in welchem Umfang diese Noxen auf die Expression
des CRH-Systems Einfluss haben, sollte eruiert werden. Wenn es gelingen würde,
eine größere Anzahl Gewebeproben von sekundären Sectiones zu gewinnen, könn-
ten die hier erhobenen Befunde zum CRH-BP weiter geprüft werden.
Die Frühgeburt mit nicht-aufhaltbaren Wehen (Nr. 78) liegt in einem Amnioninfekt-
syndrom begründet. Vorzeitige Wehen treten zu einem Drittel infektionsbedingt über
eine Aktivierung des Zytokinsystems auf (71). Das CRH-System spielt dabei eine
untergeordnete Rolle. Andere Abweichungen von den physiologischen Prozessen
können auf eine Uterotonin-Enzymabbauschwäche (z.B. Prostaglandinhydrogenase
(PGDH)-Enzymschwäche im Chorion) zurückzuführen sein (71, 11). Bei Geminigra-
viditäten kommt es aufgrund einer starken Dehnung des Uterus häufig zu VWT und
Frühgeburten (11). Auch hier ist die Rolle des CRH-Systems eher von geringer Be-
deutung.
Zum üblichen Management einer drohenden Frühgeburt zählt die wiederholte Ce-
lestangabe. Der Einfluss dieser Noxe auf das CRH-System müsste eruiert werden.
4.2 Methoden
4.2.1 RNA-Extraktion
Die RNA-Qualität wurde mit Agarose-Gelen anhand der 28S und der 18S rRNA-
Bande beurteilt. Als kritische Punkte bei der RNA-Extraktion wurden eine Kontamina-
tion mit genomischer DNA und der RNA-Abbau durch RNase identifiziert.
50 Diskussion _________________________________________________________________________________
Innerhalb einzelner Extraktionsversuche war die RNA-Qualität konsistent und es ließ
sich eine individuelle Lernkurve erkennen. Starke Degradierungen traten bei späte-
ren RNA-Extraktionen kaum noch auf.
Empfehlenswert für die RNA-Extraktion ist ein DNase-Verdau. Auf diese Weise wer-
den genomische DNA und eventuell auftretende Amplikonverunreinigungen im Labor
abgebaut. Eine weitere Reinigungs-Methode für RNA ist der RNeasy-Kit (QiaGen).
Zum Schutz vor RNase können Lösungen und Behältnisse, mit denen die extrahierte
RNA in Berührung kommt, mit RNAse-deaktivierenden Mitteln behandelt werden.
Die Bedeutung von genomischer DNA für die Ergebnisse von CRH und UCN wird in
den Abschnitten der entsprechenden Komponenten diskutiert.
4.2.2 Polymerasekettenreaktion
Wesentliche Aspekte bei der Etablierung der RT-PCR sind die Primer-Auswahl, die
cDNA-Menge und die Annealing-Temperatur.
Die Annealing-Temperaturen wurden in der Gradienten-PCR evaluiert, die cDNA-
Einsatzmenge wurde anlehnend an veröffentlichte Arbeiten erhöht (68, 78). Zur Eta-
blierung der Methode sind Positivkontrollen der Gewebe zu empfehlen: Hypothala-
mus- für CRH und Hypophysengewebe für die weiteren Komponenten.
Für die Primerpaare CRHbl und CRH-R1bl konnten keine PCR-Bedingungen ermittelt
werden. Dies kann an Unterschieden in der Laborausstattung und Chemikalienwahl
liegen. Zu Beginn der Arbeit stand ein anderer Thermocycler (Techne Genius) zur
Verfügung. Auch die RNA-Qualität könnte von Bedeutung sein, die ersten Extraktio-
nen zeigten im Agarose-Gel starke RNase Wirkungen, was die photometrische Kon-
zentrationsermittlung beeinflußte. Außerdem wurden die Primerpaare z.T. in anderen
Geweben eingesetzt : CRHbl und CRH-R1bl in Endometrium (18), CRH-R1ro in Myo-
metrium von Schwangeren und nicht Schwangeren (68). Mit dem Primerpaar CRH-
R1ro konnten Ergebnisse erhoben werden (Abb. 9), jedoch nicht zum Subtypen beta
und überwiegend in der aufwendigeren nested-PCR. Die Primer wurden durch ande-
re ersetzt. Das verwendete Primerpaar CRH-R1st ist grundsätzlich in der Lage, die
Subtypen alpha und d sowie den Subtyp beta nachzuweisen (78). Der Subtyp c, der
bereits in Myometrium, Plazenta und Eihäuten nachgewiesen wurde (27, 38), ist mit
diesem Primerpaar nicht nachweisbar. Für den Subtypen beta wurden mit diesem
Primerpaar weder in dieser noch in anderen Arbeiten Ergebnisse erzielt (78).
51 Diskussion _________________________________________________________________________________
Der Erfolg einer PCR könnte auch von den eingesetzten Primern in der RT abhängig
sein. Random Hexamere zeigten sich in dieser Arbeit den Oligo (dT) überlegen. Pro-
ben, die mit Oligo (dT) umgeschrieben wurden, zeigten nie eine UCN- und CRH-R1-
Expression (Tab.18). Dies könnte daran liegen, dass die mRNA in der RT nicht voll-
ständig zu cDNA umgeschrieben wurde. Oligo (dT) startet die Synthese vom Poly-A-
Schwanz der mRNA. Liegt dann das PCR-Primerpaar nahe dem 5´-Terminus, kön-
nen diese bei unvollständiger Transkription nicht anlagern und es erfolgt keine Ampli-
fikation. So traten in der PCR möglicherweise falsch negative Ergebnisse auf. Ran-
dom Hexamere unterscheiden nicht zwischen den RNA-Spezies, sie setzen zufällig
an und starten die cDNA-Synthese an verschiedenen Stellen. Die entstehenden
cDNA-Sequenzen variieren in Länge und je nach transkribiertem Abschnitt.
Die RT-PCR erbringt einen Nachweis über die Expression in einem Gewebehomo-
genisat. Um die mRNA-Expression des CRH-Systems auf zellulärer Ebene nachzu-
weisen, könnte eine in situ-PCR angewendet werden.
4.2.3 CRH- und Urocortin-Primer
Die Primerpaare von CRHah und UCNpe liegen auf einem Exon. Am Beispiel des
UCN wird die Problematik in der PCR dargestellt.
Das UCN-Gen des Menschen liegt auf dem Chromosom 2. Es ist 3081bp lang und
beinhaltet zwei Exons. Ein Exon liegt zwischen Position 2216 und 2318 und ist
103bp lang, das zweite Exon befindet sich zwischen Position 2540 und 3081, es ist
512bp lang. Die codierende Sequenz liegt vollständig auf dem zweiten Exon von Po-
sition 2583 bis Position 2957. Das in dieser Arbeit verwendete Primerpaar lagert mit
dem sense-Primer an die Positionen 2809 bis 2824 an, der antisense-Primer an die
Positionen 2954 bis 2936. Das Primerpaar überspannt kein Intron. Genomische DNA
und cDNA werden in gleicher Länge amplifiziert und können nicht unterschieden
werden.
Das Vorliegen genomischer DNA wurde in den Gelen der RNA-Extraktion geprüft
und diese mit den Ergebnissen der CRH- und UCN-Expression verglichen. Es zeigte
sich keine Korrelation zwischen den CRH- und UCN-Ergebnissen bezüglich der Pro-
ben, die genomische DNA enthielten. Der Gehalt genomischer DNA erscheint durch
die deutlich ausgeprägten Banden sehr hoch. Ethidiumbromid interkaliert in den Nuk-
leinsäuren. Durch dessen höhere Anzahl in genomischer DNA wird der Gehalt leicht
überschätzt. Die Amplifikation genomischer DNA kann mit GAPDH als Haushaltsgen
52 Diskussion _________________________________________________________________________________
direkt geprüft werden (3, 68). GAPDH überspannt ein 114bp Intron. So entsteht bei
Amplifikation von genomischer DNA eine 354bp-Bande, bei cDNA eine 240bp-
Bande. Hierbei stehen aber das kurze und das lange Amplikon in Konkurrenz zuein-
ander. Die Neusynthese kürzerer Amplikons wird schneller durchgeführt, als die län-
gerer Amplikons. Bei geringem Gehalt genomischer DNA nimmt die Amplifikation der
längeren Sequenz weiter ab. Folglich kann auch diese Methode die Amplifikation
genomischer DNA nicht sicher ausschließen. Cyclophilin A ist für den Nachweis ge-
nomischer DNA nicht geeignet. Die Primerpaare liegen auf der DNA mehrere tau-
send Basenpaare auseinander. Ein derart langes Amplikon wird in der RT-PCR nicht
synthetisiert.
Zur sicheren Vermeidung dieses methodischen Problems müssen die Primer auf un-
terschiedlichen Exons positioniert werden.
4.2.4 CRH-BP-Doppelbande
Die positiven Ergebnisse der CRH-BP-Expression zeigten im Agarose-Gel neben der
erwarteten 400bp-Bande häufig eine weitere Bande bei etwa 300bp. In der Sequen-
zierung wurde die 400bp-Bande als CRH-BP identifiziert. Das 300bp-Amplikon wurde
durch Sequenzierung keinem Gen eindeutig zugeordnet, es zeigte eine 50%ige Ho-
mologie zum CRH-BP. Die Gradienten-PCR zeigte die 300bp-Bande temperaturab-
hängig in der Bandenausprägung, aber nicht in der Existenz.
Mögliche Herkunft der 300bp-Bande wäre eine weitere Anlagerungsstelle auf der
mRNA für einen der Primer, so dass eine zweite, kürzere Variante des CRH-BP
Amplikons amplifiziert werden könnte. Die geringe Homologie der Sequenzen spricht
allerdings eher gegen diese These. Möglicherweise handelt es sich um ein Bruch-
stück des CRH-BP Amplikons, aber auch diese Annahme steht im Widerspruch zum
Ergebnis der Sequenzierung. Ein weiterer Erklärungsversuch liegt in der Annahme,
dass das Amplikon eine Sekundärstruktur annimmt und deshalb im Gel als 300bp-
Bande erscheint. Ein Argument für diese These ist, dass in der Sequenzierung ein
hoher Anteil der Basen nicht identifiziert werden konnte. Ob eine Sekundärstruktur
möglich ist, die im Gel als 300bp-Bande erscheint, ließe sich mit entsprechender
Software ermitteln. Das Phänomen einer Nebenbande wurde bereits beschrieben
(78), jedoch ohne Angaben von Ursachen.
53 Diskussion _________________________________________________________________________________
4.3 Expression des CRH-Systems
4.3.1 CRH
Eine CRH-Expression auf mRNA-Ebene wurde in dieser Arbeit in 19 von 20 Plazen-
ta-Proben beobachtet (Tab.12). Lediglich bei Plazenta-Probe Nr.18 aus der 27+3.
SSW wurde keine CRH-Expression nachgewiesen. Grund könnte die frühe Schwan-
gerschaftswoche sein. Der CRH-Plasmaspiegel ist in frühen SSW sehr niedrig (49).
Dies könnte sich bei der Expression in der Plazenta widerspiegeln. Bei dieser
Schwangerschaft waren bis zur Geburt keine Wehen aufgetreten. Plazenta-Probe Nr.
40 aus der 26+4. SSW exprimierte CRH, hier kam es im Schwangerschaftsverlauf zu
vorzeitigen Wehen. Ein falsch positives Ergebnis der Probe Nr.40 ist nicht
auszuschließen, da diese Probe genomische DNA enthielt und das CRHah-
Primerpaar auf einem Exon anlagerte. Ebenfalls wäre in diesen frühen SSW eine
interindividuelle Differenz in der CRH-Expression der Plazenta eine mögliche
Begründung. Myometrium, Dezidua und Amnion wurden in dieser Arbeit stichprobenartig unter-
sucht und zeigten keine CRH-Expression. Dagegen wurde in anderen Studien eine
CRH-Expression in allen schwangerschaftsspezifischen Geweben nachgewiesen. In
weiterführenden Versuchen im hiesigen Labor mit nested-PCR wurde CRH ebenfalls
in allen schwangerschaftsspezifischen Geweben nachgewiesen (82).
4.3.2 Urocortin
Die Urocortin-Expression zeigte ein heterogenes Bild. Nur ein Teil der Proben expri-
mierte UCN, unabhängig von Gewebeart, Gestationsalter und Wehentätigkeit (Tab.
13). Das UCNpe Primerpaar lag auf einem Exon. Deshalb können Proben, die geno-
mische DNA enthielten, falsch positive Ergebnisse gezeigt haben (Tab. 10). Bei Be-
trachtung der Chorion-Proben zeigt sich, dass keine der vier Proben ohne genomi-
sche DNA eine UCN-Expression zeigten. Proben, die genomische DNA enthielten,
zeigten in fünf von elf Proben eine UCN-Expression. Mit denselben Proben wurde
CRH untersucht. Im Vergleich der CRH- und UCN-Ergebnisse zeigen sich keine
Übereinstimmungen bezüglich der Proben. Bei späteren UCN-Untersuchungen mit
einer quantitativen PCR zeigte sich jedoch eine sehr niedrige UCN-Expression in
schwangerschaftsspezifischen Geweben.
Anders als bei CRH gibt es für UCN keine deutlichen Hinweise auf eine wichtige Rol-
le bei Schwangerschaft und Geburt. Weder wurden Veränderungen des maternalen
54 Diskussion _________________________________________________________________________________
UCN-Plasmaspiegels im Schwangerschaftsverlauf gemessen, noch traten Unter-
schiede zum UCN-Plasmaspiegel nicht Schwangerer auf (15). Dennoch zeigt Urocor-
tin eine Expression in den schwangerschaftsspezifischen Geweben (57) und hat eine
starke vasodilatatorische Wirkung auf die fetoplazentare Einheit. Die Rolle von Uro-
cortin und anderen, dem CRH verwandten, Peptiden in der Schwangerschaft bedür-
fen weiterer Klärung. Erst kürzlich wurden UCN II und UCN III nachgewiesen, die
ausschließlich an CRH-R2 binden (41, 60).
4.3.3 CRH-BP
In dieser Arbeit wurde erstmals eine CRH-BP-Expression in allen schwangerschafts-
spezifischen Geweben, auch im Myometrium, nachgewiesen (82). Eine CRH-BP-
Expression wurde zuvor in Plazenta, Dezidua und Eihäuten beschrieben (59).
CRH-BP wurde in 18 von 22 Myometrium-Proben und in 15 von 20 Plazenta-Proben
nachgewiesen. Dezidua, Chorion und Amnion wurde stichprobenartig untersucht
(Tab. 12). Die Ergebnisse deuten auf ein CRH-BP-Expressionsmuster hin, das von
Wehen abhängig sein könnte . Proben von Schwangerschaften ohne Geburtswehen
exprimierten CRH-BP in allen Gewebearten, Proben von sekundären Sectios expri-
mierten CRH-BP ausschließlich im Myometrium. Aufgrund der kleinen Fallzahl erfor-
dern diese Ergebnisse eine weitere Sicherung. Interessant wäre eine quantitative
Untersuchung mittels Taq Man und eine Untersuchung auf Protein-Ebene, beispiels-
weise mit Western Blot. Interessant wäre auch das räumliche Verteilungsmuster im
Myometrium, da das Myometrium unter der Geburt gleichzeitig unterschiedliche
Funktionen hat. Hier wurde ausschließlich Myometrium aus dem unter der Geburt
relaxierten unteren Uterinsegment untersucht.
4.3.4 CRH-Rezeptoren
Die CRH-Rezeptoren weisen unterschiedliche Subtypen auf. Seit Beginn der Arbeit
wurden weitere CRH-R1-Subtypen beschrieben. Die folgende Abbildung demons t-
riert die aktuell bekannten Spleiß-Varianten.
Aus der Abbildung ergibt sich, dass mit dem CRH-R1st-Primerpaar die Subtypen al-
pha, d, f und g nicht-unterscheidbar nachgewiesen werden konnten. Der Subtyp beta
zeigte keine Expression. Er wurde bisher nur mit spezifischen Primerpaaren im My-
ometrium nachgewiesen (22, 27). Vom CRH-R2 sind die Subtypen alpha, beta und
gamma bekannt. Das verwendete Primerpaar differenziert diese nicht (68).
55 Diskussion _________________________________________________________________________________
Abb. 18: Schematische Darstellung der Spleiß-Varianten des menschlichen CRH-R1 (101). Eine mögliche Weiterführung dieser Arbeit bestünde in der Untersuchung zur regio-
nalen Verteilung der CRH-Rezeptoren und ihrer Subtypen in schwangerschaftsspezi-
fischen Geweben, insbesondere auch die regionale Verteilung innerhalb des Uterus.
CRH-R1
Eine CRH-R1-Expression wurde in Myometrium und Dezidua nachgewiesen (Tab.
13). Gewebe von Plazenta und Eihäuten wurde stichprobenartig untersucht und zeig-
te keine Expression. Dies steht im Gegensatz zu anderen Arbeiten (22, 38). Auch im
hiesigen Labor gelang später mit einer nested-PCR der CRH-R1-Nachweis in allen
schwangerschaftsspezifischen Geweben.
Jede Gewebeart von Patientin Nr. 15 wurde untersucht und es konnte nie eine CRH-
R1-Expression nachgewiesen werden. Auch in Myometrium und Dezidua zeigte Nr.
15 als einzige der untersuchten Proben keine CRH-R1-Expression. Es stellt sich die
Frage, ob dies eine individuelle Variante darstellt, oder Ergebnis methodischer Prob-
leme ist. Das Ergebnis wird dadurch gestützt, dass nicht alle Ergebnisse der Nr. 15 in
derselben PCR erhoben wurden. Die RT der Myometrium-, Plazenta- und Amnion-
Probe wurde mit Oligo (dT) durchgeführt, die der Dezidua aber mit Random Hexame-
re. Für Plazenta-, Dezidua- und Chorion-Gewebe liegen für andere Komponenten
des CRH-Systems positive Nachweise vor. Bei Betrachtung des Schwangerschafts-
verlaufs zeigen sich keine Auffälligkeiten. Interessant wäre zu beobachten, ob dieses
Phänomen bei weiteren Einzelfällen auftritt, und in welchem Stadium der uterinen
Aktivität die Rezeptorexpression erhoben wurde, da angenommen wird, dass sich die
Rezeptorexpression im Verlauf der Stadien der uterinen Aktivität ändert (31).
56 Zusammenfassung _________________________________________________________________________________
5 Zusammenfassung
Zahlreiche Veröffentlichungen der letzten Jahre deuten auf eine zentrale Rolle von
CRH bei der hormonellen Steuerung der menschlichen Geburt.
In dieser Arbeit wurde die mRNA-Expression von Corticotropin Releasing-Hormon
(CRH), Urocortin (UCN), CRH-Bindungsprotein (CRH-BP) sowie der CRH-
Rezeptoren 1 und 2 (CRH-R1 bzw. 2) an menschlichen schwangerschaftsspezifi-
schen Geweben, die bei Schnittentbindungen gewonnen wurden, mittels Reverse
Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Dazu wurde eine Ge-
webebank mit Myometrium, Plazenta, Dezidua, Chorion und Amnion von ca. 100 Pa-
tientinnen aufgebaut.
Zunächst wurden die RT-PCR-Methoden für alle o.g. Komponenten des CRH-
Systems etabliert. Untersuchte Einflussgrößen waren dabei die RNA-Qualität, die
Primerauswahl und die Austestung geeigneter PCR-Bedingungen mittels Gradien-
ten-PCR. Bei CRH und UCN wurde als kritischer Punkt die Kontamination der RNA
mit genomischer DNA identifiziert.
Eine CRH-Expression wurde unter den angewandten PCR-Bedingungen ausschließ-
lich in Plazenta gefunden (in 19 von 20 Proben). Dagegen wurde das verwandte
Peptid UCN auch in anderen Geweben nachgewiesen. Im Myometrium wurde erst-
mals die Expression von CRH-BP nachgewiesen, welches darüber hinaus auch in
Plazenta, Dezidua, Chorion und Amnion gefunden wurde. CRH-R1 wurde in Myo-
metrium und Dezidua, nicht aber in Plazenta und Amnion gefunden. Im Myometrium
war ferner eine CRH-R2-Expression nachweisbar.
Die Ergebnisse zum CRH-BP deuten auf ein wehenabhängiges Expressionsmuster
hin. Proben primärer Sectiones exprimierten CRH-BP in allen schwangerschaftsspe-
zifischen Geweben, Proben sekundärer Sectiones ausschließlich in Myometrium.
Die Beobachtung, dass CRH in der Plazenta und seine Rezeptoren in den Zielgewe-
ben Myometrium und Dezidua exprimiert werden, stützt das Modell, dass intrauterin
gebildetes CRH an der hormonellen Steuerung der Geburt beteiligt ist.
Offene Fragen zur Rolle von CRH beim Geburtsprozess bestehen u.a. noch bezüg-
lich quantitativer Daten zur Expression des CRH-Systems auf mRNA-Ebene in Ab-
hängigkeit von Gestationsalter und Wehentätigkeit und der räumlich differentiellen
Expression von CRH-Rezeptoren und ihrer Subtypen im Uterus.
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65 Anhang _________________________________________________________________________________
7 Anhang
7.1 Liste der verwendeten Abkürzungen
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
A260 Absorption bei 260nm
A Amnion
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
AG-CT ALU I Schnittstelle (Adenin, Guanin-Cytosin, Thymin)
ALU I Restriktionsendonuklease aus Arthrobacter luteus
AS Aminosäuren
bp Basenpaare
BEL Beckenendlage
C Chorion
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
CDS codierende Sequenz
Cl Chlor
cm Zentimeter
CRH Corticotropin Releasing-Hormon
CRH-BP Corticotropin Releasing-Hormon-Bindeprotein
CRH-R1 Corticotropin Releasing-Hormon-Rezeptor Subtyp 1
CRH-R2 Corticotropin Releasing-Hormon-Rezeptor Subtyp 2
CRP C-Reaktives Protein
CTG Cardiotokogramm
Cyph Cyclophilin A
D Dezidua
Dc Dezidua, vom Chorion abgeschoben
Du Dezidua aus dem Uterus entnommen
DEPC Diethylpyrocarbonat
DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft
DHEAS Dehydroepiandrosteron Sulfat
66 Anhang _________________________________________________________________________________
dl Deziliter
dNTP Desoxynucleosidtriphosphat
DNA Desoxyribonucleinsäure
DTT Dithioethritol
EDTA Äthylendiamintetraessigsäure (ethylene diamine tetraacetic acid)
Exon expressed regions
g Gramm
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase
GG-CC HAE III Schnittstelle (Guanin-Cytosin)
G/P Gravidität/Parität
G-Protein Guanylnukleotidregulatorisches Protein
h Stunde
HCl Salzsäure
HAE III Restriktionsendonuklease aus Haemophilus aegyptius
HHL Hypophysenhinterlappen
HVL Hypophysenvorderlappen
HWI Harnwegsinfekt
ICI Isthmo-Cervikale-Insuffizienz
IL Interleukin
Introns intervening regions
IUFT intrauteriner Fruchttod
K Kalium
kb Kilobasen
KCl Kaliumchlorid
M Molar
mA Milliampere
Mu Myometrium, entnommen aus dem unteren Uterinsegment
mM Millimolar
Mg Magnesium
mg Milligramm
MgCl Mgnesiumchlorid
min Minute
ml Milliliter
mRNA messenger Ribonukleinsäure
67 Anhang _________________________________________________________________________________
Na Natrium
NaCl Natriumchlorid
nm Nanometer
NNR Nebennierenrinde
NO Stickstoffmonoxid
OP Operation
P Plazenta
Pat. Patientin
PCR Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction)
PG Prostaglandin
PGI2 Prostazyklin
pH -log[H3O+]
p.m. post menstruationem
pmol pico Mol
prä-mRNA Das primäre, nicht weiterverarbeitete Transkript eines proteinco-dierten Gens
RNA Ribonukleinsäure
rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
RT Reverse Transkription
RT-PCR Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion
s Sekunde
SSW Schwangerschaftswoche
Taq Polymerase hitzestabile DNA-Polymerase (Herkunft Thermus Aquaticus)
TRIS Tris (hydroxylmethyl)-aminomethan
tRNA transfer RNA
tsd Tausend
U Units
UCN Urocortin
UV ultraviolett
VBS Vorzeitiger Blasensprung
VWT Vorzeitige Wehentätigkeit
x g x-faches der Erdbeschleunigung
Z.n. Zustand nach
68 Anhang _________________________________________________________________________________
7.2 Verzeichnis der Tabellen
Tab. 1: Die Phasen der uterinen Aktivität während Schwangerschaft und Geburt
Tab. 2: Übersicht der verwendeten Primer
Tab. 3: Übersicht über die Schwangerschaften, von denen Gewebe untersucht wur-de
Tab. 4: Klinische Befunde der termingerechten Geburten
Tab. 5: Klinische Befunde der Frühgeburten
Tab. 6: RNA-Proben verglichen mit den PCR-Ergebnisse von CRH und UCN
Tab. 7: Expression der CRH-Komponenten in Abhängigkeit von den RT-Primern
Tab. 8: Übersicht über angewandte RT-PCR Bedingungen
Tab. 9: Expression der Komponenten des CRH-Systems in uteriner und chorialer Dezidua
Tab. 10: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH
Tab. 11: Die RT-PCR-Ergebnisse von UCN
Tab. 12: Die RT-PCR Ergebnisse vom CRH-BP
Tab. 13: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH-R1
Tab. 14: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH-R2
69 Anhang _________________________________________________________________________________
7.3 Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1: Der mütterliche CRH- und CRH-BP-Plasmaspiegel im Schwangerschafts-verlauf
Abb. 2: Der menschliche CRH-R1 mit seinen Spleiß-Varianten
Abb. 3: Schema der ersten Runden einer PCR
Abb. 4: Verwendete DNA-Marker bei der Agarose-Gel-Elektrophorese
Abb. 5: Restriktionsanalyse eines CRH-R1 Amplikons mit ALU I und HAE III
Abb. 6: Beispiele für die extrahierte RNA von unterschiedlicher Qualität
Abb. 7: PCR mit unterschiedlichen cDNA-Einsatzmengen
Abb. 8: CRH-BP Bande im Gel nach unterschiedlicher Anzahl PCR-Zyklen
Abb. 9: Gradienten-PCR mit dem CRH-R1bl
Abb. 10: Ansatzstellen der verwendeten CRH-R1-Primer
Abb. 11: Gradienten-PCR der CRH-BP-Doppelbande
Abb. 12: Agarose-Gel der CRH-Expression
Abb. 13: Agarose-Gel der UCN-Expression
Abb. 14: Agarose-Gel der CRH-BP-Expression
Abb. 15: CRH-BP-Expression in Abhängigkeit von der Wehentätigkeit
Abb. 16: Agarose-Gel der CRH-R1-Expression
Abb. 17: Agarose-Gel der CRH-R2-Expression
Abb. 18: Schematische Darstellung der Spleiß-Varianten des menschlichen CRH-R1
Danksagung
Bedanken möchte ich mich bei
Herrn PD Dr. Wolfgang Schäfer für die Überlassung des Themas und für seine
Unterstützung und Diskussionsbereitschaft während der gesamten Arbeit und die
vielen Tipps und Anregungen vor allem auch in der Phase des
Zusammenschreibens.
Herrn Bernd Sehringer, der in der Laborphase immer ansprechbar für Fragen und
Probleme war und auch während des Schreibens half viele „Hürden“ zu nehmen und
jederzeit zur Verfügung stand.
Frau Eszter Benedek die besonders bei den ersten Schritten im Labor tatkräftig Hilfe
leistete und beharrlich bei methodischen Problemen zur Seite stand.
Frau Dr. Birgit Wetzka, die vor allem bei Schwierigkeiten bezüglich der
Gewebesammlung immer wieder hilfreiche Hinweise gab.
Dem gesamten Laborteam, die zu einer angenehmen und produktiven
Arbeitsathmosphäre beitrugen und jederzeit „mal eben zwischendurch“ anfallende
Fragen und Probleme zu lösen halfen.
Meiner Mutter, meinem Vater, Uli, Veronique, Simi, Maja, Tina, Wendy und Susanne,
die mich in unterschiedlicher Weise unterstützt haben.
Lebenslauf
Name: Silke Biller
Geburtsdatum: 27.10.1967
Geburtsort: Bremervörde
1974 – 1978 Grundschule Selsingen
1978 – 1980 Orientierungsstufe an der Haupt- und Realschule Selsingen
1980 – 1988 St. Viti Gymnasium Zeven
Juni 1988 Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife
SS 1998 Beginn des Medizinstudiums an der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg
Februar 1999 Beginn der Dissertation im Endokrinologischen Labor der
Universitäts-Frauenklinik, Freiburg
„mRNA-Expression des CRH-Systems in menschlichen
schwangerschaftsspezifischen Geweben“
November 1999 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Juli 2000 – Dezember 2001 ÄiP an der Universitäts-Frauenklinik, Freibug