mRNA Expression elektrolytregulierender Proteine an der Maus · Prostaglandinbildung und deren Enzym Cyclooxygenase von Bedeutung. I.1. Bartter-Syndrom I.1.1. Einführung Die erste

Aus dem Medizinischen Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin

Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. H.W. Seyberth

Jetzt: Prof. Dr. R.F. Maier

des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg

AG Molekulare und Experimentelle Pharmakologie

Leiter: Prof. Dr. R.M. Nüsing

mRNA Expression elektrolytregulierender

Proteine an der Maus

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin

dem Fachbereich Medizin der

Philipps-Universität Marburg

vorgelegt

von

Christoph Michael Ludewig

aus Idstein

(geboren in Wiesbaden)

Marburg, 2007

Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am: 23.10.2007 Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs Dekan: Prof. Dr. Maisch Referent: Prof. Dr. Nüsing 1. Korreferent: Prof. Dr. Gudermann

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

I. Einleitung...................................................................................... 3

I.1. Bartter-Syndrom ............................................................................................. 3

I.1.1. Einführung................................................................................................ 3

I.1.2. Einteilung des Bartter-Syndroms ........................................................... 4

I.1.2.1. Beschreibung der Symptomatik....................................................... 4

I.1.2.2. Pathogenese........................................................................................ 7

I.1.2.2.1. Funktion und Eigenschaften der Ionen-Kanäle und -

Transporter................................................................................10

I.1.3. Therapie und Prognose.......................................................................... 15

I.2. Arachidonsäurestoffwechsel: Bedeutung der Cyclooxygenase und von

Prostaglandin-E2......................................................................................... 17

II. Material und Methoden ............................................................20

II.1. Material ........................................................................................................ 20

II.1.1. (Bio-) Chemikalien................................................................................ 20

II.1.2. Enzyme und Nucleinsäuren ................................................................. 20

II.1.3. Tiere, Tierfutter und Medikamente.................................................... 21

II.1.4. Instrumente und Apparaturen ............................................................ 21

II.1.5. Sonstige Materialien ............................................................................. 22

II.1.6. Software ................................................................................................. 22

II.2. Methoden ...................................................................................................... 23

II.2.1. Versuchsbedingungen und Präparation der Nieren.......................... 23

II.2.2. Isolierung und Quantifizierung von RNA .......................................... 24

II.2.3. DNAse-Verdau und Reverse Transkiption ........................................ 26

II.2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelelektrophorese ............. 28

III. Ergebnisse...................................................................................33

III.1. Verdünnungen ............................................................................................ 33

III.2. C57Bl6-Mäuse im Vergleich zu COX-2-/- und EP4-/- Mäusen: Expression

von Nierenproteinen ohne und mit Furosemidgabe................................ 37

Inhaltsverzeichnis IV. Diskussion...................................................................................55

IV.1. Behandlung der Mäuse mit Furosemid: Modell für das antenatale

Bartter-Syndrom zur Untersuchung der Veränderungen von Protein-

expressionen in der Niere........................................................................... 55

IV.2. C57Bl6-Mäuse ohne und mit Furosemidbehandlung im Vergleich zu

COX-2-/- und EP4-/- Mäusen ...................................................................... 55

V. Zusammenfassung und Abstract..............................................71

V.1. Zusammenfassung........................................................................................ 71

V.2. Abstract......................................................................................................... 74

VI. Literatur

VII. Anhang

Verzeichnis der Abkürzungen


A Ampere

AMP Adenosin-Monophosphat

ATP Adenosin-Triphosphat

BS Bartter-Syndrom

BSND BS with sensoneurinal Deafness (mit sensorineuronaler Taubheit)

°C Grad Celsius

cAMP cyclic-AMP (cyclisches-AMP)

CaSR calcium-sensible receptor (Calcium-sensibler Rezeptor)

CCD cortical collecting duct (kortikales Sammelrohr)

cDNA copy-DNA (kopierte-DNA)

Cl- Chlorid

ClC-K chloride-channel K (nierenspezifischer Chloridkanal K)

CNT connecting tubule (Verbindungstubulus)

COX Cyclooxygenase

DCT distal convolut (distales Konvolut)

DEPC Diethylpyrocarbonat

DNA Desoxyribonucleinsäure

dNTP Desoxyribonucleosidtriphosphat

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ENaC epithelialel Na-channel (epithelialer Natriumkanal)

EP E-Prostanoid

G Erdbeschleunigung

GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase

HCl Salzsäure

HPS Hyperprostaglandin-E2-Syndrom

HS Henle Schleife

JG juxtaglomerulär

K+ Kalium

KCC Kaliumchlorid Kotransporter

M Mol (Einheit)

MCD medullary collecting duct (medulläres Sammelrohr)


Mg2+ Magnesium

mRNA messenger-RNA (Boten-RNA)

MQ-H2O deionisiertes Wasser (Milli-Q mittels Reinstwasser)

Na+ Natrium

NaCl Natriumchlorid

NCCT thiazide-sensitive NaCl Cotransporter

(Thiazid-senitiver NaCl Kotransporter)

Nedd-4 neuronal precusor cell expressed developmentally down-regulated 4

(aus neuronalen Vorläuferzellen exprimiertes entwicklungs-

geschichtlich herrunterreguliertes Protein 4)

NKCC Na-K-2Cl Cotransporter (Natrium-Kalium-2Chlorid Kotransporter)

NSAR nichtsteroidales Antirheumatikum

OMCD outer medullary collecting duct (äußeres medulläres Sammelrohr)

PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

PGE2 Prostaglandin-E2

PGH2 Prostaglandin-H2

R2 lineare Regression

RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System

RNA Ribonucleinsäure

ROMK renal outer medullary K (renaler Kalium Kanal des äußeren Marks K)

RT reverse Transkription

SGK Serum-Glucocorticoid regulierte Kinase

SLT salt losing tubolopathie (Salzverlusttubulopathie)

TAE Tris-Eisessig-EDTA

TAL thick ascending loop of Henle

(dicker aufsteigender Ast der Henle Schleife)

tAL thin ascending loop of Henle

(dünner aufsteigender Ast der Henle Schleife)

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

U Unit (Einheit)

UE Untereinheit

UV ultra-violett

V Volt

Einleitung 3

I. Einleitung Die Einleitung befasst sich mit dem Bartter-Syndrom und den verschiedenen

Formen, dieser angeborenen Nierenerkrankung. Im Mittelpunkt stehen hierbei die

Elektrolytveränderungen und somit die jeweilige Expression der dafür verant-

wortlichen Ionen-Kanäle der Niere. Im Zusammenhang damit ist auch die

Prostaglandinbildung und deren Enzym Cyclooxygenase von Bedeutung.

I.1. Bartter-Syndrom

I.1.1. Einführung Die erste Beschreibung des Hyperprostaglandin-E2-Syndroms stammt aus dem Jahr

1957, als die amerikanischen Pädiater Rosenbaum und Hughes einen 2 Monate alten

Säugling beobachteten, der unter ausgeprägter Gedeihstörung, Dehydratation,

sporadisch auftretender Diarrhoe, therapieresistenter hypokalämischer Alkalose,

renalem Konzentraionsdefizit und Hyperkaliurie litt und mit 7 ½ Monaten in

extremer Dystrophie verstarb (Rosenbaum, Hughes, 1957).

5 Jahre später wurden durch Bartter et al. zwei ähnliche Fälle veröffentlicht, bei

denen zusätzlich eine hohe Aldosteron- und Reninaktivität nachgewiesen wurde, was

Bartter zu der Vermutung veranlasste, es könne sich um eine Angiotensin-II-

Resistenz mit kompensatorischer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-

Systems handeln, da zusätzlich der juxtaglomeruläre Apparat und die Macula densa

der Niere hypertrophiert waren (Bartter et al. 1962). Seitdem wurde bei Krankheits-

bildern mit hypokalämischer Alkalose und Hyperaldosteronismus kombiniert mit

Normotension vom Bartter-Syndrom gesprochen. Weitere Fälle führten zu einer

Differenzierung dieses Krankheitsbildes.

So hatten von Gitelman et al. im Jahr 1966 beschriebene Patienten eine erhöhte

Krampfbereitschaft mit Hypomagnesiämie und Hypokalzurie (Gitelman et al. 1966).

1971 publizierten Fanconi et al. 2 umfassende Fälle, die zu dem bestehenden

Symptomenkomplex noch Hyperkalziurie mit Nephrokalzinose und Osteopenie

aufwiesen. Auffällig war bei diesen Kindern außerdem ein in der Schwangerschaft

aufgetretenes Polyhydramnion (Fanconi et al. 1971).

Seyberth et al. beschrieben dieses Krankheitsbild mit Polyurie und einem

lebensbedrohlichen Salzverlust, assoziiert mit vermehrter Prostaglandinbildung

(Seyberth et al. 1985).

Einleitung 4

In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, auf der Ebene von Kanalproteinen in der

Niere, die weiter unten beschriebenen pathogenetischen Modelle zu spezifizieren

bzw. genauere Aussagen über deren Regulation zu machen. Daher wurde zunächst

nach einem geeigneten Tiermodell gesucht. Takahashi et al. stellten 2000 ein Modell

vor, mit dem es möglich ist, das antenatale Bartter-Syndrom bei Mäusen zu

simulieren. Sie verglichen zu diesem Zweck Mäuse, bei denen durch homologe

Rekombination das Gen des NKCC2-Kotransporters (Slc12a1) inaktiviert wurde, mit

Mäusen, die das Schleifendiuretikum Furosemid erhielten, das den NKCC2-

Kotransporter inaktiviert. Da die Neugeborenen NKCC2-/- Mäuse bereits vor der

Entwöhnung verstarben, wurde der Versuch unternommen, sie mithilfe des COX-

Hemmers Indomethacin am Leben zu erhalten. Da dies erfolgreich war, konnten nun

die erwachsenen NKCC2-/- Mäuse mit den mit Furosemid behandelten, Wildtyp

Mäusen verglichen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Nierenparameter

beider Tiergruppen ähnlich waren, so dass das durch den Slc12a1-Gendefekt

hervorgerufene antenatale Bartter-Syndrom durch die Behandlung von Mäusen mit

Furosemid simuliert werden kann (Takahashi et al. 2000).

I.1.2. Einteilung des Bartter-Syndroms

I.1.2.1. Beschreibung der Symptomatik Da es sich beim Bartter-Syndrom nur um einen Überbegriff für die hereditären

Salzverlust-Tubulopathien handelt, waren bald weitere Unterteilungen nötig. Die

Nomenklatur erfolgte nach klinischen Symptomen, biochemischen Merkmalen sowie

der vermuteten Pathogenese.

Klinisch ist die Unterteilung in das antenatale und das klassische Bartter-Syndrom,

sowie das Gitelman-Syndrom sinnvoll (reviewed in Naesens et al. 2004).

Das antenatale Bartter-Syndrom (Bartter-Syndrom Typ I, II, IV, nach Hebert et al.

2003; auch Hyperprostaglandin-E2-Syndrom, nach Seyberth et al. 1985) ist durch ein

Polyhydramnion, Polyurie, sowie Polydypsie gekennzeichnet, wodurch es zu

lebensbedrohlichen Dehydratationen kommen kann. Obwohl die Nierenfunktion

oftmals gut erhalten ist, kommt es häufig zu Hyperkalziurie und Nephrokalzinose

(reviewed in Naesens et al. 2004).

Das klassische Bartter-Syndrom (Bartter-Syndrom Typ III) beginnt in den ersten

zwei Lebensjahren, oftmals erfolgt die Diagnose allerdings wesentlich später. Die

Patienten haben ebenfalls Polyurie und Polydypsie und tendieren daher zur

Einleitung 5

Dehydratation. Ohne Behandlung sind Entwicklungsstörungen häufig. Biochemisch

handelt es sich um eine hypokalämisch, hypochlorämische metabolische Alkalose,

nahezu ohne Nephrokalzinose, da die Ausscheidung von Calcium im Urin nur

unwesentlich erhöht ist (reviewed in Naesens et al. 2004). Hingegen ist die

Hypokaliämie hier besonders stark ausgeprägt.

Beim antenatalen und klassischen Bartter-Syndrom sind zudem eine verminderte

Ausschüttung von Vasopressoren, Hyperplasie des juxtaglomerulären Apparates,

Thrombozytenaggregationsstörung und eine erhöhte Prostaglandin-E2 (PGE2)

Ausscheidung im Urin beobachtet worden (reviewed in Naesens et al. 2004).

Interessanterweise findet sich allerdings keine Erhöhung von PGE2 im Blut, wohl

aber in anderen Geweben (Seyberth et al. 1994). Weiterhin ist bei diesen Patienten

das Natrium intrazellulär erhöht, was durch eine erhöhte Membranpermeabilität

erklärbar ist (reviewed in Naesens et al. 2004).

Das Gitelman-Syndrom ist die mildeste Form des Bartter-Syndroms und wird daher

oft erst im Erwachsenenalter durch eine milde Hypokaliämie und Alkalose entdeckt.

Allerdings sind auch Fälle von Muskelschwäche, über regelmäßige Muskelkrämpfe

bis hin zur Tetanie aufgetreten. Weitere Symptome sind nächtlicher Harndrang,

Polydipsie, Polyurie, Durst, Hypotonie, Schwindel, Salzmangel, nächtliches Ein-

nässen. Ausserdem sind Gelenkschmerzen durch Chondrokalzinose bekannt. Bio-

chemisch handelt es sich ebenfalls um eine hypokalämisch metabolische Alkalose,

aber nicht verbunden mit einer Hyperkalziurie wie bei den anderen beiden Formen,

sondern kombiniert mit einer Hypokalziurie (reviewed in Naesens et al. 2004).

Zusätzlich kommt es zu einer hypermagnesiurischen Hypomagnesiämie, wodurch

sich auch die Muskelbeschwerden erklären lassen.

Eine vierte Form mit sensorischer Taubheit ist ebenfalls beschrieben (Landau et al.

1995).

In diesem Zusammenhang ist auch der autosomal-rezessiv vererbte Pseudohypo-

aldosteronismus Typ 1 zu nennen, bei dem es sich ebenfalls um eine Salzverlust-

tubulopathie handelt. Diesem liegt der Defekt des epithelialen Natriumkanals

(ENaC) zugrunde und die Symptome ähneln der Wirkung von Amilorid. Es kommt

also biochemisch zu Hyponatriämie, Hyperkaliämie und hyperchlorämischer meta-

bolischer Azidose.

Eine weitere Krankheit, bei der es sich ebenfalls um einen Defekt des ENaC-Kanals

handelt, ist das Liddle Syndrom. 1963 von Liddle et al. das erste mal als autosomal

Einleitung 6

dominantes Syndrom beschrieben, ist es durch früh einsetzenden schweren Hyper-

tonus, Hypokaliämie, sowie metabolische Alkalose und supprimierte Plasma Renin

Aktivität und Aldosteron Level gekennzeichnet (Liddle et al. 1963; Warnock, 1998).

Neben dieser klinisch orientierten Einteilung ist es wichtig, die Pathogenese zu

verstehen, die in Tabelle 1 dargestellt ist.

Tabelle 1 Klassifikation der hereditären Salzverlusttubulopathien mit hypokalämischer Alkalose (modifiziert nach Naesens et al. 2004)

Klassifikation Gen/ Chromosom

Transport-defekt

Lokalisation Funktion

Bartter-Syndrom Typ I

(Furosemid-SLT)

antenatales BS

SLC12A1

15q15-21

NKCC2 TAL Na+-Cl- -

Wiederaufnahme

TAL

K+ Versorgung

(NKKC2)

Bartter-Syndrom Typ II

(Furosemid-SLT)

antenatales BS

KCNJ1

11q24-25

ROMK

CCD renale Ausscheidung

von K+

TAL Cl- - Wiederaufnahme

distaler

Tubulus

Cl- - Wiederaufnahme

Bartter-Syndrom Typ III

(Furosemid-Thiazid-SLT)

klassisches BS

CLCNKB

1p36

ClC-Kb

CCD Cl- - Wiederaufnahme

tAL β-UE (ClC-Ka)

TAL β-UE (ClC-Kb)

BSND

1p31

Barttin

vaskuläre Stria β-UE (ClC-Ka/Kb)

Bartter-Syndrom Typ IV

(Furosemid-SLT)

antenatales BS

Cl- - Wiederaufnahme

CLCNKA

CLCNKB

1p36

ClC-Ka

ClC-Kb

tAL

TAL → CCD Cl- - Wiederaufnahme

Bartter-Syndrom Typ V

(Furosemid-SLT)

antenatales BS

CASR

3q13.3-q21

CaSR TAL Hemmung NKCC2,

ROMK und Na+-K+-

ATPase

Gitelman-Syndrom

(Thiazid-SLT)

SLC12A3

16q13

NCCT distaler

Tubulus

Na+-Cl- -

Wiederaufnahme

SLT = Salzverlusttubulopathie; NKCC2 = Na+-K+-2Cl--Kotransporter; ROMK = K+-Kanal; ClC = Cl--Kanal; CaSR = Ca2+-sensibler Rezeptor; NCCT = Na+-Cl--Kotransporter; TAL = Dicker aufsteigender Ast der Henle Schleife; tAL = Dünner aufsteigender Ast der Henle Schleife; CCD = Kortikales Sammelrohr; HS = Henle Schleife; UE = Untereinheit

Einleitung 7

I.1.2.2. Pathogenese

Um die Pathogenese zu verstehen, ist es erforderlich, sich das Zusammenspiel der

verschiedenen Ionenkanäle in der Niere anzusehen (s. Abb. 1 und 2).

Abb. 1a: Ionenkanäle der Niere Abb. 1b: Ionenkanäle der Niere (distaler Tubulus) (distaler Tubulus /Sammelrohr)

Zelle Interstitium Lumen

3 Na+

2 K+

Na+-K+-ATPase

K+

Cl -

KCC 1, 3, 4

Cl - ClC-K BS Typ III

Barttin BS Typ IV

K+ 2 Cl -

Na+

NKCC 2 BS Typ I

K+

ROMK-2 BS Typ II

Ionenkanal

Ionenkanal

Interstitium Interstitium

passiver Transport aktiver Transport

aktiver Transport

3 Na+

2 K+

NCCT GitelmanSyndrom

Na+

Cl -

Zelle ZelleLumen Lumen

ROMK

K+

Na+

3 Na+

2 K+

Na+-K+-ATPase

Na+-K+-ATPase

ENaC α, β, γ

NEDD-4

Cl -

Chlorid-Kanal

passiver Transport

aktiver Transport

Abb. 2: Nephron (schematisch) Abb. 1c: Ionenkanäle der Niere (TAL)

Wie in Tabelle 1, sowie den Abbildungen 1c und 2 ersichtlich, ist der Gendefekt

beim Bartter-Syndrom Typ I - IV vor allem im dicken aufsteigenden Ast der Henle-

Schleife lokalisiert.

Einleitung 8

Da der Wirkstoff Furosemid ebenfalls in diesem Bereich ansetzt (Blockade des Na+-

K+-2Cl--Kotransporters (NKCC2)), werden diese Syndrome auch als Furosemid-

ähnliche-Salzverlusttubulopathien bezeichnet. Bilanzierend lässt sich sagen, dass die

in Abbildung 1c angeführten Kanäle für den Transport von Natriumchlorid aus dem

Tubuluslumen ins Interstitium zuständig sind, der für die Harnkonzentrierung

essentiell ist. Treibende Kraft ist hierbei die Na+-K+-ATPase, die unter Energie-

aufwand Natrium aus der Zelle ins Interstitium transportiert. Somit entsteht ein

Gradient, über den der Na+-K+-2Cl--Kotransporter Natrium zusammen mit Chlorid

und Kalium aus dem Tubulus in die Zelle transportiert. Der Defekt des Gens

SLC12A1 führt dazu, dass NKCC2 seine Funktion verliert (Bartter-Syndrom Typ I).

Wichtig ist außerdem, dass dieser Gradient auch aufrechterhalten wird, dazu muss

das Kalium wieder aus der Zelle gelangen, was über den luminalen K+-Kanal ROMK

(renal outer-medullary K+) möglich ist. Kalium muss deshalb zurück ins Lumen, weil

es dort eine wesentlich niedrigere Konzentration als Natrium und Chlorid hat und

deshalb der begrenzende Faktor für den Na+-K+-2Cl--Kotransporter ist. Dieses

System bricht zusammen, wenn, wie beim Bartter-Syndrom Typ II, die Funktion von

ROMK ausfällt (Defekt des Gens KCNJ1). Weiterhin wird Chlorid basolateral aus

der Zelle ins Interstitium transportiert, was entweder über einen Kalium-Chlorid

Kotransporter (KCC1-4) oder über einen Chlorid-Kanal (ClC-Kb), (Defekt des Gens

CLCNKB beim Bartter Syndrom Typ III, typisches Bartter-Syndrom) abläuft. Barttin

hingegen stimuliert den ClC-Ka und ClC-Kb Kanal, daraus erklären sich die

Symptome des Bartter Syndroms Typ IV (Mutation des Barttin Gens BSND), das

zusätzlich mit Taubheit verbunden ist (reviewed in Naesens et al. 2004). Ebenfalls

mit Taubheit verbunden ist ein von Schlingmann et al. beschriebener Fall, bei dem

ein Kind eine ähnliche Symptomatik zeigte, wie beim Bartter Syndrom Typ IV.

Hierbei handelt es sich allerdings um einen kombinierten Defekt der Gene CLCNKA

und CLCNKB und dementsprechend einen Ausfall der Kanäle ClC-Ka und ClC-Kb,

ohne dass das Barttin-Gen BSND betroffen ist (Schlingmann et al. 2004). Chlorid

führt durch seinen Gradienten über der Zellmembran dazu, dass Magnesium und

Calcium passiv interzellulär vom Lumen ins Interstitium folgen. Außerdem ist

Chlorid wichtig, um die Elektronenbilanz neutral zu halten, das heißt, wird es durch

die Blockade von ClC-K nicht ins Interstitium transportiert, ist auch weniger

Natrium-Resorption möglich.

Einleitung 9

Beim Bartter-Syndrom Typ V (in der Abb. nicht gezeigt) handelt es sich um einen

Defekt des extrazellulären Calcium-Ionen sensitiven Rezeptor (CaSR). Dieser ist G-

Protein gekoppelt und reagiert auf erhöhte extrazelluläre Konzentrationen von

Calcium, indem er NKCC2, ROMK und die Na+-K+-ATPase hemmt. Der Kanal

befindet sich auf der basolateralen Seite des dicken aufsteigenden Astes der Henle-

Schleife (reviewed in Hebert, 2003).

Die verminderte Resorption von Natrium-Chlorid beim Bartter- sowie auch beim

Gitelman-Syndrom (s.u.) erklärt auch die spätere Hypokaliämie, denn wenn Natrium

in der Henle-Schleife und dem distalen Tubulus nicht ausreichend resorbiert wird,

muss der Natrium-Verlust im Sammelrohr durch einen Natrium-Kalium Austausch

ausgeglichen werden. Dies ist aber nicht im vollen Umfang möglich, da hier

normalerweise nur noch die Feinregulation stattfindet.

Als weiteres Krankheitsbild ist das Gitelman-Syndrom bekannt. Hierbei ist der

NCCT-Transporter (Na+-Cl--Kotransporter) defekt (s. Abb. 1a), was zu Symptomen

führt, die einer Behandlung mit Thiazid-Diuretika (daher auch Thiazid-ähnliche

Salzverlusttubulopathie) ähneln, die ebenfalls an diesem Transporter ansetzen. Da

der Mechanismus über NCCT nur für 7 % der Natrium-Ausscheidung über die Niere

verantwortlich ist (Naesens et al. 2004), erklärt sich die relative milde Ausprägung

der Bartter-Symptomatik. NCCT ist im distalen Tubulus des Nephrons lokalisiert

und fördert die Resorption von Natrium und Chlorid vom Lumen des Tubulus ins

Interstitium.

Die biochemischen Parameter des autosomal-rezessiv vererbten Pseudohypoaldo-

steronismus Typ 1 erklären sich durch den Defekt des epithelialen Natriumkanals

(ENaC) im Sammelrohr (s. Abb. 1b). Hier ist die Resorption von Natrium aus dem

Lumen ins Interstitium nicht mehr möglich, und somit findet die Kaliumsekretion,

die dem elektrochemischen Ausgleich dient, auch nicht mehr statt. Daraus folgt, dass

im Gegensatz zum Bartter-Syndrom beim Pseudohypoaldosteronismus Typ 1 eine

Hyperkaliämie vorliegt.

Genau umgekehrt verhält es sich beim Liddle Syndrom, bei dem der ENaC Kanal

zwar ebenfalls mutiert, jedoch in diesem Fall vermehrt vorhanden ist (s. Abb. 1b). Es

wird somit gesteigert Natrium rückresorbiert, und es kommt im Gegenzug zur ver-

mehrten Kaliumsekretion. Durch die vermehrte Natriumwiederaufnahme wird auch

Wasser aus dem Tubulus reabsorbiert und es kommt zum Hypertonus.

Einleitung 10

I.1.2.2.1. Funktion und Eigenschaften der Ionen-Kanäle und -Transporter

Na+-K+-ATPase:

Die Funktion der Na+-K+-ATPase in der Niere besteht darin, Natrium im Austausch

mit Kalium aus der Zelle ins Interstitium zu transportieren. Dies ist im Bezug auf die

Niere vor allem für die Natrium-Reabsorption essentiell.

Die Na+-K+-ATPase besteht aus verschiedenen Untereinheiten, bekannt sind die

α,β,γ-Untereinheit (UE). Die minimale funktionale Einheit besteht aus einer α (1-4)

und einer β (1-3) Einheit (reviewed in Blanco, Mercer 1998), wobei α die

funktionale Einheit und β für die Struktur essentiell ist (Hasler et al. 1998). Die

kleine γ UE ist in manchen Nierenabschnitten vorhanden und moduliert die Kinetik

der Pumpe (Crambert, Geering 2003). α1 scheint die hauptsächliche oder einzige

Untereinheit zu sein, die entlang des Nephrons exprimiert wird (Lucking et al. 1996).

Aldosteron wirkt in der Niere am Aldosteron-sensitiven distalen Nephron, dem

Verbindungs-Tubulus und dem Sammelrohr. Summa et al. wiesen nach, dass die

Wirkung von Aldosteron auf die im Sammelrohr befindliche Na+-K+-ATPase, also

vermehrte Expression, mit der α1-UE verknüpft ist. (Summa et al. 2003).

ClC-K:

Es gibt 2 ClC-K Chlorid Transporter, die in der Niere vorkommen, ClC-K1 (bei der

Maus; entspricht dem menschlichen Ka) und ClC-K2 (bei der Maus; entspricht dem

menschlichen Kb, Lokalisation auf Chromosom 1p36, Gen CLCNKB (Saito-Ohara

et al. 1996)). Obwohl sich beide strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sie sich

in ihrer Lokalisation innerhalb der Niere.

ClC-K1 wird im dünnen aufsteigenden Ast der Henle-Schleife exprimiert, findet sich

aber auch in anderen Regionen des distalen Nephrons (Waldegger et al. 2002).

ClC-K2 befindet sich vor allem im distalen Nephron (dicker aufsteigender Ast der

Henle-Schleife) an der basolateralen Membran (Yoshikawa et al. 1999) und spielt

dort bei der Chlorid Resorption eine wichtige Rolle. Beim Defekt des ClC-K2

kommt es zum klassischen Bartter-Syndrom. Dieses ist weniger schwer ausgeprägt,

als die antenatalen Formen. So führt das Bartter-Syndrom Typ IV (Defekt des

BSND-Gens) zu einem wesentlich schwereren Krankheitsbild. Bei diesem Typ ist

das Protein Barttin, ein Stimulator für ClC-K1 und K2, betroffen. Daraus lässt sich

schließen, dass ClC-K1 einen zusätzlichen Effekt, im Vergleich zum reinen ClC-K2

Einleitung 11

Ausfall beim klassischen Bartter-Syndrom, für die Ausprägung der Krankheit hat.

(Waldegger et al. 2002). Das gleiche gilt für den von Schlingmann et al. beschrie-

benen Fall, bei dem die Gene von ClC-Ka und ClC-Kb unabhängig voneinander

mutiert waren (Schlingmann et al. 2004).

ClC-K1 ist für die hohe Chlorid-Permeabilität im dünnen aufsteigenden Ast der

Henle-Schleife verantwortlich und ist somit notwendig für die Urinkonzentrierung,

ClC-K1-/- Mäuse weisen einen Defekt in der Fähigkeit auf den Urin zu konzentrieren

(Uchida, 2000). Wolf et al. zeigten an Ratten, dass Furosemid die ClC-K1 mRNA

Expression in der inneren Medulla der Niere um die Hälfte vermindert. Parallel dazu

veränderte sich das Barttin. Dies weist auf den Versuch hin, über diesen Mecha-

nismus die Wasser- und Salz-Homöostase zu erhalten (Wolf et al. 2003).

ROMK:

Die ROMK-Kanäle (renal outer-medullary K+) gehören zur Familie der ATP-

regulierten-einwärtsgerichteten-niedrigspannungs K+-Kanäle, die vor allem für die

Kalium Sekretion von Bedeutung sind (Giebisch, 1995). Beim Menschen sind fünf

Formen des ROMK-Proteins bekannt, die durch Splicing des gleichen Gens

entstehen (Shuck et al. 1994). Diese Kanäle sind vor allem im dicken aufsteigenden

Ast der Henle Schleife und im kortikalen Sammelrohr lokalisiert. In der Henle

Schleife wird das Kalium auf der apikalen Seite durch ROMK aus der Zelle trans-

portiert, um den elektrochemischen Gradienten für den Na+-K+-2Cl--Kotransporter

aufrechtzuerhalten, zusätzlich fördert das entstehende lumenpositive Membranpoten-

tial die Reabsorption von Magnesium und Calcium auf dem parazellulären Weg. Im

Sammelrohr ist ROMK an der Kaliumsekretion aus der Zelle ins Lumen beteiligt

(Frindt et al. 1989). Das entsprechende Gen ist KCNJ1 und liegt auf Chromosom

11q24-25 (Simon et al. 1996; Károlyi et al. 1997). Es ist beim Bartter-Syndrom Typ

II geschädigt.

NKCC2:

Der bumetanide-sensitive Na+-K+-2Cl--Kotransporter (NKCC) gehört in die Familie

der Kation-Cl--Kotransporter. In der NKCC Gruppe gibt es zwei Isoformen: NKCC1,

ein weit verbreiteter Karrier, der auf der basolateralen Seite von polarisierten Zell-

Typen exprimiert wird (Haas, Forbush III, 2000; Lytle et al. 1995; Mount et al. 1998)

Einleitung 12

und NKCC2, ein nierenspezifischer Karrier, der an der luminalen Membran des

dicken aufsteigenden Astes der Henle Schleife sowie in der Macula Densa vorkommt

(Mount et al. 1999; Nielsen et al. 1998; Obermuller et al. 1996). Das entsprechende

Gen ist das SLC12A1 auf Chromosom 15q15-21 (reviewed in Naesens et al. 2004)

und ist beim Bartter Syndrom Typ I geschädigt. Der Ionentransport von NKCC

beträgt, abgesehen vom Tintenfisch-Axon, immer 1 Natrium, 1 Kalium und 2

Chlorid. Im Zusammenspiel mit dem ROMK-Kanal, der das Kalium „recycled“,

sowie der Na+-K+-ATPase, die den Gradienten für Natrium aufrechterhält und dem

Chlorid-Kanal (ClC-K), über den Cl- die Zelle verlassen kann (Abb. 1c), ist NKCC2

für die Nettoresorption von Natriumchlorid aus dem Tubuluslumen der Niere nach

basolateral verantwortlich. Somit ist er ein wichtiger Baustein für die Konzen-

trierungsfähigkeit der Niere. PGE2 kann über den EP3-Rezeptor und ein inhibitor-

isches G-Protein die Adenylatcyclase hemmen, was zu einer erniedrigten Konzen-

tration von cAMP führt und somit die NKCC2 Expression hemmt (reviewed in

Shankar, Brater 2003). Schleifendiuretika, wie Furosemid, blockieren den NKCC2

Karrier und verhindern somit eine effektive Konzentrierung des Harns.

NCCT:

Der Thiazide-sensitive Natriumchlorid-Kotransporter (NCCT) ist vom Gen

SLC12A3 auf Chromosom 16q13 kodiert, das beim Gitelman-Syndrom geschädigt

ist (Simon et al. 1996; Lemmink et al. 1998). Es sind verschiedene Mutationen dieses

Gens bekannt (Lemmink et al. 1998). Dieser Kanal wird im distalen gewundenen Tu-

bulus exprimiert (Plotkin et al. 1996) und ist dort an der Natriumchlorid-Resorption

beteiligt (Abb. 1a). Durch eine basolaterale Na+-K+-ATPase wird die intrazelluläre

Natriumkonzentration niedrig gehalten und bildet somit einen Gradienten für Na-

trium vom Lumen in die Zelle, durch den der Na+-Cl--Kotransporter (NCCT) ange-

trieben wird. Das Chlorid kann durch einen basolateralen Chloridtransporter wieder

aus der Zelle entweichen, so dass eine Netto Natrium-chlorid-Resorption besteht.

Beim NCCT handelt es sich somit um einen elektroneutralen Ionentransporter.

KCC:

Die Kaliumchlorid-Kotransporter (KCC) gehören zur Familie der anorganischen,

elektroneutralen Kationen-chlorid Kotransporter, zu der auch der Na+-K+-2Cl--Ko-

transporter (NKCC) und der NaCl-Kotransporter (NCC) gehören (Holtzman et al.

Einleitung 13

1998). Es sind vier verschiedene KCC-Kanäle (KCC1-4) bekannt. KCC1 kommt in

vielen Geweben, auch in der Niere, vor (Gillen et al. 1996; Kumar et al. 1996),

KCC2 ist neuronal exprimiert (Payne 1997; Payne et al. 1996). Das entsprechende

Gen liegt auf Chromosom 16q22.1 (Gillen et al. 1996; Frengen et al, 1995). KCC3

liegt auf Chromosom 5p15.3 und ist ebenfalls weit verbreitet, vor allem aber in Herz

und Niere. KCC4 hingegen, der in Muskel, Gehirn, Lunge, Herz und Niere

exprimiert wird, liegt auf Chromosom 15q14 (Mount et al. 1999). KCCs werden

nicht vom Mebranpotential beeinflusst, jedoch aktiviert, wenn die Zelle in einem

hypotonen Zustand ist und fungieren somit als Volumenregulatoren, da sie durch

Ionenausschleusung aus der Zelle auch das Volumen vermindern (Cossins, Gibson,

1997; Lauf et al. 1992). Außerdem sprechen sie auf die Diuretika Bumetanide und

Furosemid an, allerdings mit einer niedrigeren Affinität als NKCC (Gillen et al.

1996; Payne, 1997). Die Expression der Kanäle KCC1, 3, 4 erfolgt entlang des

gesamten Nephrons, einschließlich des Glomerulus (Liapis et al. 1998). Im dicken

aufsteigenden Ast der Henle Schleife ist der Kaliumchlorid-Kotransport auf der

basolateralen Seite lokalisiert und ist somit an der Natriumchloridresorption dieses

Teils des Nephrons beteiligt (Greger, Schlatter, 1983).

ENaC, Nedd-4, SGK:

Der Amilorid-sensitive ephiteliale Natrium-Kanal (ENaC) reguliert viele physiolo-

gische Funktionen im distalen Kolon, dem Lungenepithel, den Gangzellen der exo-

krinen Drüsen und auch im distalen Nephron (reviewed in Garty, Palmer, 1997).

Dort wird er in der zweiten Hälfte des distalen Konvoluts (DCT2), im

Verbindungstubulus (CNT), im kortikalen Sammelrohr (CCD) und im medullären

Sammelrohr (MCD) exprimiert, wobei es im distalen Konvolut eine Überschneidung

mit dem thiazid-sensitiven Natriumchlorid-Kotransporter (NCC) gibt (Duc et al.

1994; Schmitt et al. 1999; Loffing et al. 2000). Diese relativ breite Überschneidung

gilt aber nur für die Maus und die Ratte, beim Menschen ist ENaC nur in einem

kleineren Stück im distalen Konvolut angesiedelt, die Überschneidung ist also

geringer, beim Hasen kommt ENaC im DCT überhaupt nicht vor (Biner et al. 2002).

ENaC nimmt an der Feinregulation der Natriumreabsorption teil, die u.a. durch die

Hormone Vasopressin, das Mineralkortikoid Aldosteron, sowie Insulin und

Proteasen vermittelt wird (Kemendy et al. 1992; Kleyman et al. 1994; Marunaka et

al. 1992; Vallet et al. 1997). Außerdem wird die ENaC Aktivität von intrazellulären

Einleitung 14

Ionen, wie etwa Natrium, Calcium oder Wasserstoff gesteuert (Awayda, 1999;

Chalfant et al. 1999; Palmer, Frindt, 1987; Loffing et al. 2000). Es gibt drei

homologe Untereinheiten: α-, β- und γ–ENaC, die zusammen den Kanal bilden, fehlt

die α-Untereinheit, gibt es keinen Ionenfluss, fehlen β- oder γ– Untereinheit, ist der

Fluss erniedrigt (Canessa et al. 1994). Die α-Untereinheit liegt beim Menschen auf

Chromosom 12p13.3. Die β- und γ-Untereinheiten sind beide auf Chromosom

16p12-p13 lokalisiert (reviewed in Gormley et al. 2003). Letztere kommen in

Vesikeln vor und werden dann in die apikale Zellmembran eingebaut. Die α-

Untereinheit kommt nicht in Vesikeln vor, was für eine unabhängige Regulation der

α-Untereinheit gegenüber den β- und γ-Untereinheiten spricht (Hager et al. 2001).

Beim Typ I Pseudohypoaldosteronismus, einer Krankheit, die durch Volumen-

verringerung und Hypotonie charakterisiert ist, wurde eine Mutation einer ENaC

Untereinheit nachgewiesen (Chang et al. 1996), ebenso beim Liddle-Syndrom, das

durch Volumenvergrößerung und Hypertonie gekennzeichnet ist (Hansson et al.

1995; Shimkets et al. 1994).

Ein erst vor kurzer Zeit entdeckter Regulationsmechanismus läuft über die Proteine

Nedd4 und SGK 1 ab.

Nedd4 (neuronal precusor cell expressed developmentally down-regulated 4) ist ein

Protein, das im embryonalen Mäusegehirn in hoher Konzentration vorliegt, während

der Entwicklung jedoch herrunterreguliert wird. Exprimiert wird es, zusammen mit

ENaC, in den Hauptzellen von kortikalem (CCD) und äußerem medullären

Sammelrohr (OMCD) des distalen Nephrons, aber auch in den Atemwegen und in

distalen Lungenepithelien (Staub et al. 1997).

Es gibt zwei Nedd4-Formen in der Maus, mNedd4-1 und mNedd4-2 (Kamynina et

al. 2001), die humane Homologe haben hNedd4-1 (Chromosom 15q21.1) und

hNedd4-2 (Chromosom 18q21), beide haben eine Hect-Domäne, die als ubiquitin-

protein Ligase fungiert und vier WW-Domänen, die für die Verbindung mit dem PY-

Muster von ENaC verantwortlich sind (reviewed in Gormley et al. 2003). Durch

diese Verbindung kommt die Hect-Domäne in die Nähe des ENaC-Kanals und dieser

kann dadurch mit Ubiquitin markiert (‚ubiquitiniert’), endozytiert und lyso-

somal/proteosomal abgebaut werden (Malik et al. 2001). Nedd4-2 scheint allerdings

funktionell wichtiger in der ENaC Regulierung in vivo zu sein (Kamynina et al.

2001). Beim Liddle Syndrom kommt es zu einer Deletion des PY-Musters, an dem

Einleitung 15

die WW Domäne des Nedd4 ansetzt. Es wird vermutet, dass der fehlende Abbau von

ENaC über Nedd4 der Grund für die erhöhte ENaC Dichte ist (Staub et al. 1996).

Ein weiteres Protein, das in die Regulation des epithelialen Natriumkanals eingreift,

ist die SGK (Serum- und Glucocorticoid-regulierte Kinase). Es sind drei Formen

bekannt, SGK 1 liegt auf Chromosom 6q23, SGK 2 und SGK 3 auf Chromosom 20

und 18 (reviewed in Gormley et al.), wobei nur SGK 1 in der ENaC-Regulation eine

Rolle zu spielen scheint, da sowohl mRNA als auch Protein innerhalb der ersten 30

min. nach Aldosteronbehandlung, durch vermehrte Genexpression, induziert werden

(Chen et al. 1999; Naray-Fejes-Toth, Fejes-Toth, 2000). Es wird vermutet, dass SGK

nicht nur direkt auf ENaC wirkt, sondern auch indirekt über ein PY-Muster mit

hNedd4-2 interagiert, indem es dieses phosphoryliert und damit inaktiviert und somit

den Abbau des ENaC Kanals reduziert (Snyder et al. 2002).

I.1.3. Therapie und Prognose

Da eine Heilung dieser Krankheiten nicht möglich ist, kann es bei der Therapie

bisher nur darum gehen, die Symptomatik so gut wie möglich zu beherrschen.

Wichtig bei allen Formen des Bartter-Syndroms ist vor allem eine ausreichende Salz-

und Flüssigkeitszufuhr, die gegebenenfalls auch parenteral erfolgen muss.

Da vor allem beim antenatalen Bartter-Syndrom das Hyperprosaglandin-E2 massiv

erhöht ist, ist die Therapie mit einem Cyclooxygenase(COX)-Hemmer angezeigt.

Dieser kann die pathologisch erhöhte Diurese um bis zu 50 % erniedrigen (Seyberth

et al. 1985; Köckerling et al. 1996; Nüsing et al. 2001; Reinalter et al. 2002).

Besonders gut eignet sich hier Indomethacin, das weniger gastrointestinale

Nebenwirkungen hat als die anderen nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAR) und

das den Hyperprostaglandin-E2-Spiegel besser senkt als diese (Seyberth et al. 1994).

Nebenwirkungen dieser Therapie sind vorübergehender Haarausfall, aber vor allem

das Maskieren von Infektionskrankheiten durch das ausbleibende Fieber (Seyberth et

al. 1994). Zusätzlich muss der Kaliumspiegel im Plasma kontrolliert werden und bei

Hypokaliämie entsprechend Kalium substituiert werden. Beim Gitelman-Syndrom ist

es außerdem angebracht, die Hypomagnesiämie durch eine Therapie mit Magne-

siumpräparaten wenigstens teilweise zu beheben (Köckerling et al. 1998).

Die Prognose des antenatalen Bartter-Syndrom hängt entscheidend vom Grad der

Frühgeburtlichkeit, sowie der Optimierung des perinatalen Managements ab

Einleitung 16

(Köckerling et al. 1998). Einige beschriebene Fälle von psychomotorischer Retard-

ierung sind wahrscheinlich auf postpartale Entgleisungen des Wasser- und Salzhaus-

haltes sowie auf allgemeine Probleme der Frühgeburtlichkeit zurückzuführen

(Schwartz et al. 1996; Seidel et al. 1995; Seyberth et al. 1998). Bei früher und

konsequenter Behandlung ist die Prognose allerdings recht gut. Dies gilt auch für die

milderen Formen, also das klassische Bartter- und das Gitelman-Syndrom.

Umgekehrt ist die Therapie beim Pseudohypoaldosteronismus Typ 1. Neben einer

adäquaten Natrium- und Flüssigkeitssubstitution, muss die Kaliumzufuhr reduziert

werden, bei bedrohlichen Hyperkaliämien muss gegebenenfalls auf die Gabe von

Ionenaustauschern zurückgegriffen werden (Köckerling et al. 1998). Allerdings ist

auch hier der Einsatz von COX-Hemmern gerechtfertigt, da Prostaglandin-E2

sekundär erhöht ist (Bommen et al. 1982; Rampini et al. 1978). Die Prognose hängt

maßgeblich von der Prävention neonataler Dehydratationszustände und Elektrolyt-

entgleisungen und auch vom Ausmaß der Beteiligung anderer Organsysteme ab

(Köckerling et al. 1998).

Einleitung 17

I.2. Arachidonsäurestoffwechsel: Bedeutung der Cyclooxygenase und von

Prostaglandin-E2

Um zu verstehen, welche Auswirkungen die Prostaglandine, vor allem Prostaglandin

E2, auf die Nierenfunktion haben und wie darin eingegriffen wird, ist es wichtig,

deren Entstehung aus der Fettsäure Arachidonsäure zu kennen. Auch die möglichen

Regulationsmechanismen spielen eine wichtige Rolle.

Abb. 3

Arachidonsäuremetabolismus

ProstaglandinSynthase (Peroxidase und Cyclooxygenase)

Hydro(pero)xy-Fettsäuren

Leukotriene

Prostaglandine z.B. ProstaglandinE2Thromboxane

Prostaglandin H2

Lipoxygenase

Arachidonsäure

Phospholipase A2

Phospholipid (in Zellmembranen)

Prostacycline

Arachidonsäure ist eine essentielle Fettsäure, das heißt, sie muss dem Körper

zugeführt, bzw. kann, nur aus dem Körper zugeführten Fettsäuren, synthetisiert

werden. Sie wird vor allem für den Einbau in Phospholipide der Plasmamembranen

gebraucht.

Durch das Enzym Phospholipase A2 wird sie wieder aus der Plasmamembran

freigesetzt und steht für die Bildung von Eicosanoiden zur Verfügung. Über ver-

schiedene enzymatische Stoffwechselwege (Prostaglandinsynthase, Lipoxygenase)

kann sie in Prostaglandine (PG), Prostacycline, Thromboxane und Leukotriene

überführt werden.

Einleitung 18

Diese Stoffe werden auch als Gewebshormone bezeichnet und werden in allen

Organsystemen gebildet. Sie wirken im direkten Umfeld ihres Produktionsortes

(auto- oder parakrine Wirkung) und regulieren vielfältige Zellfunktionen.

In der Niere ist vor allem das PGE2 von Bedeutung. Lokal in der Niere erhöhte

PGE2-Werte sind als Ursache für die hypokalämische Alkalose des antenatalen

Bartter-Syndroms bekannt (Gill et al. 1976). Der vermutete Pathomechanismus spielt

sich im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife ab. Es wird angenommen, dass

PGE2, vermittelt über einen EP3-Rezeptor und ein inhibitorisches G-Protein, die

Adenylatcyclase hemmt. Dadurch wird ATP vermindert zu cAMP abgebaut, das den

Chlorid-Kanal (ClC-K) (Köckerling et al. 1998), sowie den Na+-K+-2Cl—Kotrans-

porter (NKCC2) (reviewed in Shankar, Brater, 2003) stimuliert und damit die Reab-

sorption fördert. Fällt dieser Stimulus weg, können dem Chlorid kein Natrium,

Magnesium und Calcium folgen bzw. kann Natriumchlorid nicht resorbiert werden

und damit kommt es zu einer verminderten Konzentrierungsfähigkeit des Harns.

Darüber hinaus sind in der Macula Densa, die den aufsteigenden Ast der Henle

Schleife mit dem Glomerulus verbindet, der NKCC2 und der ROMK Transporter

exprimiert. In der Macula Densa wird die Salzionenkonzentration gemessen und es

kann per Feedbackmechanismus das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS)

aktiviert werden. Man vermutet, dass dieser Mechanismus über COX-2 und PGE2

reguliert wird. Wenn nun, wie es beim antenatalen Bartter-Syndrom/ Hyperprosta-

glandin-E2 Syndrom der Fall ist, NKCC2 oder ROMK ausfallen, ist über den oben

beschriebenen Mechanismus auch die Chloridkonzentration erniedrigt. Dies führt zu

einer erhöhten COX-2 Expression und somit auch zu erhöhter Produktion von PGE2.

In diesem Zusammenhang ist noch die Bedeutung des Prostaglandinrezeptors EP4 zu

nennen, über dessen Vermittlung, in den juxtaglomerulären Zellen, vermutlich das

RAAS durch eine erhöhte cAMP Konzentration stimuliert wird. (Nüsing et al. 2001;

Nüsing et al. 2005). Laut Tang et al. führt die über EP4 erhöhte cAMP Konzentration

zusätzlich zu einer Vasodilatation der afferenten Arteriole (Tang et al. 2000).

PGE2 entsteht aus PGH2. Dieses wird aus der Arachidonsäure durch die

Prostaglandinsynthase synthetisiert, die als membrangebundenes Haem- und

Glykoprotein sowohl Peroxidase- als auch Cyclooxygenaseaktivität besitzt. Dies

erklärt, dass bei Hemmung der Cyclooxygenase PGH2 und somit auch PGE2

vermindert gebildet werden.

Einleitung 19

Es gibt verschiedene Cyclooxygenasen (COX). In der Niere spielen besonders COX-

1 und COX-2 eine Rolle, die dort vermutlich eine antagonistische Rolle spielen.

COX-2 Inhibition führt zu einer Verminderung des Blutflusses im Nierenmark,

daraus resultierend wird der Urin-Fluss vermindert und damit der Druckeffekt von

Angiotensin II erhöht (Qi et al. 2002).

COX-1 und 2 unterscheiden sich aber auch in der Expression in der Niere. Während

beide im Glomerulus, den papillären interstitiellen Zellen und den renalen Gefäßen

nachweisbar sind, ist COX-1 im Sammelrohr besonders ausgeprägt exprimiert, wo-

hingegen COX-2 dort bisher nur bei Mäusen nachgewiesen wurde. In der Macula

densa und dem dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife ist COX-2 bei Versuchs-

tieren nachweisbar, bei Primaten und Menschen ist es bisher nur gelungen, bei über

60 jährigen COX-2 in diesen Regionen zu detektieren, wobei dies mit dem erhöhten

Renin Wert bei älteren Menschen in Verbindung gebracht wurde (reviewed in Khan

et al. 2002). Das COX-2 auch bei Patienten mit antenatalem Bartter-Syndrom in der

Macula densa vorkommt, wiesen Kömhoff et al. nach (Kömhoff et al. 2000).

Bei der Beobachtung der Wirkung von selektiven COX-2 Hemmern im Vergleich zu

COX-1 und -2-Hemmern (NSAR) fiel auf, das die renale Wirkung der NSARs, akute

Verschlechterung der Nierenfunktion, mit Natrium-Retention, Ödemen, Hypertens-

ion und Hyperkaliämie, ebenfalls bei den selektiven COX-2 Hemmern auftreten.

Dies gilt vor allem für die Situation des physiologischen Stresses, was sich daraus

erklärt, dass in diesem Fall die Konzentration der Vasokonstriktoren im Blut erhöht

ist, und als Gegengewicht die Prostaglandine, vor allem PGE2, vermehrt gebildet

werden, um eine ausreichende renale Durchblutung zu sichern. (Breyer et al. 2001).

Diese Wirkung macht man sich bei hohem Salz- und Wasserverlust, wie dies beim

antenatalen Bartter-Syndrom der Fall ist, zunutze.

Besonders mit dem nichtselektiven COX-Hemmer Indomethacin wurden hier gute

Erfahrungen gemacht (Seyberth et al. 1994). In neueren Studien wurde eine ebenso

gute Wirksamkeit, wie die von Indomethacin, bei den selektiven COX-2 Hemmern

Nimesulide und Rofecoxib beobachtet, außerdem sind die Nebenwirkungen auf den

Gastrointestinaltrakt geringer (Nüsing et al. 2001, Reinalter et al. 2002).

Material und Methoden 20

II. Material und Methoden

II.1. Material

II.1.1. (Bio-) Chemikalien Bromophenol blue Roth, Karlsruhe

Chloroform Merck, Darmstadt

DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) Sigma, Steinheim

DTT (0,1M) Invitrogen, Karlsruhe

EDTA (25mM) (pH 8,0) Invitrogen, Karlsruhe

EDTA (0,5M) (pH 8,0) Sigma, Steinheim

Eisessig Merck, Darmstadt

Ethanol (absolut) Riedel-de Haen®, Seelze

Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe

First Strand Buffer (5x) Invitrogen, Karlsruhe

H2O (RNAse frei) Ambion, Huntingdon,

Cambridgeshire (UK)

Isopropanol (2-Propanol) Merck, Darmstadt

PCR-Puffer (10x) Sigma, Steinheim

peq Gold RNA Pure™ peq lab Biotechnologie, Erlangen

rRNasin® (Rnase Inhibitor) (40 U/μl) Promega, Madison Wi (USA)

SeaKem® LE Agarose Cambrex Biosciences,

Rockland M.E. (USA)

Sucrose (w/v) Sigma, Steinheim

TRIS Base Roth, Karlsruhe

Xylene cyanol ff Sigma, Steinheim

II.1.2. Enzyme und Nucleinsäuren 100 Base-Pair-Ladder Amersham Biosciences,

Buckinghamshire (GB)

DNAse I (Amplification Grade) Invitrogen, Karlsruhe

dNTP (10mM) Amersham Biosciences,

Buckinghamshire (GB)

oligo(dT) 12-18 Primer 0,5 μg/μl Invitrogen, Karlsruhe


Primer Eurogentec, Köln

SuperScript™ II (RNAse H- RT) Invitrogen, Karlsruhe

Taq DNA Polymerase (5 U/μl) Sigma, Steinheim

II.1.3. Tiere, Tierfutter und Medikamente Altromin Standard Diät 1320 (Ratten/Mäuse) Altromin Gesellschaft für

Tierernährung mbH, Lage

C57B16 Mäuse Charles River Lab. Inc. Wilmington,

MA, USA

COX-2-/- Mäuse Prof. Robert Langenbach, Research

Triangle Park, North Carolina, USA

EP4-Rezeptor-/- Mäuse Prof. Schuh Narumija, Kyoto

University, Japan

Forene (Isofluran) Abbot, Wiesbaden

Furosemide Sigma, Steinheim

Ketavet (Ketaminhydrochlorid) 100 mg/ml Pharmacia, Erlangen

Rompun (Xylazinhydrochlorid) 2 %ig Bayer Vital, Leverkusen

II.1.4. Instrumente und Apparaturen Elektrophoresebecken: Model B1 OWL Separation Systems,

Porthsmouth HN (USA)

Gelbilddokumentationssystem Vilber Lourmat, Marne la Vallée

(France)

Heizblock: Digi-Block® JR Laboratory Devices, Holliston MA

(USA)

Heizblock: Dri-Block® DB-2D Techne Duxford, Cambridge (UK)

Heizblock: Eppendorf Thermomixer 5436 Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg

PCR-Automat: T-Gradient Thermoblock Biometra, Göttingen

Photometer: Gene Quant II

(RNA/DNA Calc.) Pharmacia Biotech, Cambridge (UK)

Polytron Typ PTA 10-35 Kinematica, Luzern (CH)

Präzisionsküvette

aus Quarzglas (SUPRASIL®) Hellma®, Müllheim


Spannungsgerät: Consort E321 (250/100) Consort nV, Turnhout (Belgien)

Vortexer: VF2 Janke & Kunkel;

IKA®-Labortechnik, Staufen

Waage: KB 600-2 Kern & Sohn, Balingen

Zentrifuge: Biofuge fresco Heraeus Instruments, Hanau

Zentrifuge,Vortex: Combi Spin FVL-2400 BioSan Medical-Biological Research

& Technologies, Riga (Latvia)

Zentrifuge: Sigma 110 Sigma Laborzentrifugen,

Osterode am Harz

II.1.5. Sonstige Materialien Epi-Cups (1,5ml) Eppendorf, Hamburg

Falcon® Tubes (14ml, sterile) Becton Dickinson Labware,

Le Pont de Claix (France)

PCR Soft Tubes (0,2ml) Biozym scientific, Hess. Oldendorf

II.1.6. Software Bio Capt MW Version 11.01 for Windows M8S Instruments Trading Inc.

ImageJ 1,32j Wayne Rasband,

National Institiutes of Health (USA)

GraphPad Prism Version 4.02 for Windows GraphPad Software, San Diego

California USA


II.2. Methoden

II.2.1. Versuchsbedingungen und Präparation der Nieren

Versuchsbedingungen Es wurden für die Versuche unterschiedliche Linien von Mäusen genutzt. Die

Genehmigung der Tierversuche war durch das Regierungspräsidium Gießen ge-

geben. Die Tiere wurden nach 21 Tagen von ihren Eltern getrennt und genotypisiert.

Zu Beginn der Versuche waren die Tiere zwischen 8 und 12 Wochen alt. Die

Versuchstiere wurden unter Standardbedingungen gehalten: das Licht war täglich

von 6 Uhr morgens bis 18 Uhr abends an, und es herrschten konstant 23 °C in den

Versuchsräumen, die Tiere bekamen Futter (Altromin Standard-Diät 1320) und

Wasser ad libitum. Die Versuche dauerten jeweils 10 Tage. Es wurden pro Gruppe

zwölf Referenz- sowie zwölf Versuchstiere eingesetzt. In der ersten Gruppe waren

zwölf C57Bl6 Kontrolltiere, sowie zwölf Mäuse, deren Trinkwasser 1 mg/ml

Furosemid enthielt. Diese Tiere hatten zusätzlich Zugang zu einem Salzstein, um die

hohen Salzverluste ausgleichen zu können. In der zweiten Gruppe gab es den

gleichen Versuchsaufbau, allerdings wurden hier COX-2-/- Mäuse verwendet und in

der dritten Gruppe, wiederum unter gleichen Bedingungen, EP4-Rezeptor-/- Mäuse.

Präparation der Nieren Zur Entnahme der Nieren wurden die Tiere narkotisiert.

Narkose:

Nach einer Kurznarkose mit Isofluran bekam die Maus eine i. p. (intra peritoneale)

Narkose mit Ketamin(Ketaminhydrochlorid 100 mg/ml)-Xylazin(Xylazinhydro-

chlorid 2 %ig) 1:1 2 μl/g Maus. Die Spritze mit Narkotikum wurde von der rechte

Leistenbeuge nach oben medial eingestochen, bis das Peritoneum durchstochen war,

die Nadel nach oben medial ventral ausgerichtet und dann das Narkotikum

eingespritzt.

Bei tiefer Narkose (die Maus reagiert nicht, wenn sie am Zehenansatz gezwickt

wird), wurde die Maus mit Kanülen auf einer Styroporplatte fixiert (an der Achsel-

und Leistenfalte).


Der so fixierten Maus wurde am Übergang von der Regio inguinalis zur Regio pubis

die Haut mit der Schere durchtrennt, und der Schnitt nach distal zu den Hinterpfoten

und nach oben bis zum Diaphragma verlängert.

Nun wurde die Bauchaorta der Maus freigelegt und mit einer Kanüle punktiert, das

Blut wurde auf diese Weise so weit wie möglich aus dem Blutkreislauf der Maus

entfernt (etwa 0,5 ml). Nachdem man die Nieren freigelegt hatte, konnte man diese

mit der Schere heraustrennen. Die so entnommenen Nieren wurden in flüssigem

Stickstoff gekühlt, bis sie, bei – 80 °C eingefroren wurden, um dann weiterver-

arbeitet zu werden.

II.2.2. Isolierung und Quantifizierung von RNA

Die Isolierung der RNA aus den gefrorenen Nieren erfolgte nun in 4 Schritten:

1. Homogenisierung

Jeweils eine halbe Niere wurde im gefrorenen Zustand in ein Rundröhrchen, in das

zuvor 1 ml peq Gold RNA Pure™ gegeben wurde, überführt, anschließend wurde die

Probe für einige Sekunden im Polytron homogenisiert und für 5 Minuten auf Eis

gestellt.

2. RNA-Extraktion

In eine Probe wurden 150 μl Chloroform gegeben und diese 15 Sekunden kräftig

vermischt. Nachdem die Probe erneut für 15 Minuten auf Eis gestanden hatte, wurde

1 ml der Gewebelösung in ein 1,5 ml Epi-Cup überführt und anschließend für 20

Minuten zentrifugiert (13000 g, 4°C). Dadurch bildeten sich 2 Phasen: eine untere

gelbliche Phenol-Chloroform-Phase, die DNA und Proteine enthielt, und eine obere

wässrige, in der die RNA enthalten war.

3. RNA-Präzipitation

Die wässrige Phase wurde nun in ein neues Cup überführt, und das entsprechende

Volumen an Isopropanol zugefügt. Nach erneutem Vermischen und Kühlen bei –80

°C für 30 Minuten wurde die Probe nochmals 30 Minuten zentrifugiert (13000 G,

4°C).

4. Waschen der RNA

Der wässrige Überstand wurde abgenommen und das RNA-Präzipitat mit 1 ml

70%igen Ethanol durch Vortexen und anschließendes Zentrifugieren (10 Minuten,


13000 G, 4°C) gewaschen. Dieser Waschschritt wurde wiederholt und der wässrige

Überstand soweit wie möglich abgenommen. Anschließend wurde die Probe für 10

Minuten an der Luft trocknen gelassen. Zuletzt wurde das Präzipitat in 50 μl RNAse

freiem TE (pH = 8) gelöst, die Probe 10 Minuten bei 70°C erwärmt und anschließend

wieder auf Eis gestellt.

Quantifizierung der isolierten RNA

Die Konzentration der RNA in den Proben wurde mit Hilfe eines

Spektralphotometers bestimmt. Dafür wurden die Proben 1:100 verdünnt. Das Gerät

maß RNA-Proben in UV-Zellen gleichzeitig bei Wellenlängen von 230 nm, 260 nm

und 280 nm. Dabei dienten 260 nm und 280 nm der Quantifizierung und Berechnung

zur Reinheitsprüfung, während 230 nm zur Hintergrundskompensation (Proteine)

gebraucht wurde. Die Nucleinsäureprobe galt als ausreichend rein, d.h. frei von

Proteinen, wenn galt: 2 > A260/A280 ≥ 1,7 und A230 < A260 > A280. Nur

dementsprechende Proben wurden zur reversen Transkription weiterverwendet. Die

RNA-Proben wurden auf 1 μg/ 7,5 μl eingestellt und bei –80°C gelagert.

T(RIS)E(DTA) (RNAse frei) (pH =8):

TRIS (1 M, pH 8,0) 1 ml

EDTA (0,5 M (pH 8,0) 200 μl ad 100 ml mit MQ H2O

autoklavieren

Diethyl-Pyrocarbonate-H2O:

Reinst H2O wird mit 0,1% DEPC versetzt, über Nacht stehen gelassen und dann

autoklaviert.


II.2.3. DNAse-Verdau und Reverse Transkiption DNAse-Verdau

Um zu gewährleisten, dass bei der später folgenden Polymerase-Kettenreaktion

(PCR) keine DNA mehr vorhanden ist, die das Ergebnis verfälschen könnte, wurde

vor der reversen Transkiption ein DNAse Verdau vorgenommen. Dies erfolgte nach

folgendem Protokoll:

• 7,5 μl der RNA (= 1μg RNA) wurden in ein 1,5 ml Eppi-Cup pipettiert.

• Zu jeder Probe wurden nun 2,5 μl des DNAse-Mastermixes (2 μl 5 X Puffer,

0,5 μl DNAse I) zugefügt und das Gemisch 15 Minuten bei 37°C inkubiert.

• Anschließend wurde zu jeder Probe 1 μl EDTA (25 mM) gegeben und die

Proben kurz durchmischt und abzentrifugiert.

• Dann blieben die Proben 10 Minuten bei 65°C stehen, kamen kurz auf Eis,

und wurden dann erneut abzentrifugiert.

Reverse Transkiption

Um die RNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelelektrophorese zu

detektieren und quantifizieren, musste die mRNA zuvor in copyDNA (cDNA) um-

geschrieben werden. Die Synthese der cDNA mittels einer reversen Transkiptase

(einer RNase-H--Mutante der Moloney-Maus-Leukämie-Virus-Reversen-Transkript-

ase, SuperScript™ II der Firma Invitrogen), sowie entweder oligo(dt) als Primer (um

die komplette RNA umzuschreiben) oder einem Gemisch aus spezifischen Primern

für folgende Proteine: SGK, KCC1, KCC3, KCC4. Für diese Proteine wurde eine

spezifische Transkription gewählt, um die Selektivität zu erhöhen und das Signal zu

verbessern. Die reverse Transkription erfolgte unter folgenden Bedingungen:

• Zu den 11 μl (enthielten die RNA) aus dem oben beschriebenen DNAse-

Verdau wurde entweder 1 μl oligo(dt) oder 1 μl des spezifischen Primer-

Gemisches (10μM) hinzugegeben. Wichtig war, dass auf Eis pipettiert und

mit der Pipette gemixt wurde.

• Nachdem die Proben 10 Minuten bei 70°C inkubiert wurden, kamen sie für

eine Minute auf Eis und wurden anschließend zentrifugiert.

• Der während der Inkubation vorbereitete RT-Mastermix aus 2 μl 5 X Puffer


(250 mM TRIS-HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) + 1 μl d NTP

(10 mM) + 2 μl DTT (0,1 M) + 1 μl DEPC-H2O + 1 μl SuperScript™ II + 1 μl

rRNasin® (Rnase Inhibitor) (40 U/μl) wurde kurz durchmischt und zentrifu-

giert, danach wurden 8 μl des Mastermixes zu den bestehenden 12 μl gegeben

und die so entstandene Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.

• Nun erfolgte eine Inkubation von 50 Minuten bei 42°C und eine weitere für 5

Minuten bei 95°C.

• Dann kam die Probe erneut auf Eis und wurde noch einmal abzentrifugiert.

Die so gewonnene cDNA diente als Vorlage für die PCR und wurde zwischenzeitlich

bei –20°C gelagert. Zur Vermeidung von Kontamination bzw. Reaktion der RNA-

Proben mit Ribonucleasen wurde stets mit Einmalhandschuhen und autoklavierten

Plastikartikeln auf Eis bzw. bei 4°C gearbeitet.

Primer für die reverse Transkription:

SGK 5’-CGA GAC TGC CAA GCT TCC-3’

KCC1 5’-CGG ATC CAT TTC CAC TGC-3’

KCC3 5’-AGC TGG CAC CTG TCA ACC-3’

KCC4 5’-GGC CTG GCT TTT CTC TCC-3’


II.2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelelektrophorese Die PCR erlaubt es, gezielt DNA-Abschnitte, die von zwei bekannten DNA-

Sequenzen eingerahmt werden, zu amplifizieren. Die Stränge der Ziel-DNA werden

durch Erhitzen in Einzelstränge getrennt. Danach wird die Reaktion abgekühlt, um

die Hybridisierung der Primer zu ermöglichen. Von diesen ausgehend synthetisiert

die DNA-Polymerase in Gegenwart von allen vier dNTPs neue komplementäre

DNA-Stränge. Dieser Zyklus wird mit derselben Reaktionsmischung 20-40 mal

wiederholt, so dass es zu einem exponentiellen Anstieg der Produkte kommt, die

zwischen diesen Sequenzen liegen. Hierzu wurde in dieser Arbeit folgender Ansatz

und folgendes Programm benutzt.

PCR-Ansatz:

DEPC-H2O 12,5 μl

cDNA (1 :10 verdünnt) 2 μl

10 X Taq-Puffer 2 μl

dNTP (2mM) 1 μl

Vorwärts-Primer (10 μM) 1 μl

Rückwärts-Primer (10 μM) 1 μl

Taq-Polymerase (5 U/μl) 0,5 μl

PCR-Programm

Schritt 1: Denaturierung 95°C 5 min

Beginn Schleife

Schritt 2: Denaturierung 95°C 45 sec

Schritt 3: Anlagerung der Primer 65°C 60 sec

Schritt 4: Verlängerung der Primer 72°C 60 sec

Ende Schleife Wiederholung: 34 Mal


Primer für die PCR (in Klammern: Accessionsnumber der Gendatenbank):

GAPDH vorwärts 5’-GAC CAC AGT CCA TGC CAT CAC TGC-3’

(M32599) rückwärts 5’-GCT GTT GAA GTC GCA GGA GAC AAC-3’

(Chan et al. 2002) 340 Basenpaare

ROMK vorwärts 5’-TGG TCT CCA AAG ATG GAA GG-3’

(AF012834) rückwärts 5’-AAG CAG AAA AAT GGC AGT GG-3’

356 Basenpaare

NCCT vorwärts 5’-TTT TCT GGA CCA CCA TCT CC-3’

(U61085) rückwärts 5’-GTT CTT GCC ATA GCC TTT GC-3’

371 Basenpaare

ClC-K1 vorwärts 5’-CAG CCC TCT TTC TAC GAT GG-3’

(NM_024412) rückwärts 5’-CTC TCT GGT CTC CAC CAA GG-3’

213 Basenpaare

Na+-K+- vorwärts 5’-TGT GAT TCT GGC TGA GAA CG-3’

ATPase α1 rückwärts 5’-TCT TGC AGA TGA CCA AGT CG-3’

(BC010319) 206 Basenpaare

NKCC2 vorwärts 5’-GGA TCC AAC CAA TGA CAT CC-3’

(U20973) rückwärts 5’-CCA GCA AGA ATC CCA GTA GC-3’

306 Basenpaare

ENaC β vorwärts 5’-CCC CAC CCA GCA ACT AGT GAA CTC AAA-3’

(NM_011325) rückwärts 5’-AAA GCA CGT GTT CCC CTT TCA AGA CTT-3’


ENaC γ vorwärts 5’-GAC TCT CTT CCT GAC ACA AAT GGT CCT-3’

(NM_011326) rückwärts 5’-ACA CAC ATT CTC ACA CAT ACA CAT ACT-3’



NEDD-4 vorwärts 5’-GCG ATT TGT GAA CCG TAT CC-3’

(U96635) rückwärts 5’-GCT CTT GGC AGC TTA TCA GG-3’

375 Basenpaare

SGK vorwärts 5’-GAA CAC GGC TGA GAT GTA CG-3’

(NM_011361) rückwärts 5’-ATA GGA GAA GCC GAG GAA GG-3’

370 Basenpaare

KCC1 vorwärts 5’-GGC TGT GGA CTT TCT TCT GC-3’

(AF121118) rückwärts 5’-GGT AAC AAT GGC CAG AAT GG-3’

374 Basenpaare

KCC3 vorwärts 5’-ACA CTT CCC GGT CTG TAT GC-3’

(AF211854) rückwärts 5’-GAC CGA GGG AAA GAA GAT CC-3’

379 Basenpaare

KCC4 vorwärts 5’-CTG GTA CTA CGC CCT TTT CG-3’

(AF087436) rückwärts 5’-GTG CCC TCT AGC ACA GAT CC-3’

300 Basenpaare

Für den PCR-Ansatz wurden je ein genspezifisches Primerpaar für GAPDH, ROMK,

NCCT, ClC-K1, Na+-K+-ATPase α1, NKCC2, ENaC β, ENaC γ, NEDD-4, SGK,

KCC1, KCC3 oder KCC4 verwendet.

Die PCR-Produkte wurden mit 6x-Probenpuffer (4 μl pro Ansatz) versetzt, je 10 μl

davon auf ein 1,6 %iges Agarosegel aufgetragen, dem 0,75 μl Ethidiumbromid bei-

gegeben waren und elektrophoretisch in 1x TAE-Puffer aufgetrennt (35 Minuten,

120 V/100 mA). Als Längenstandard diente eine 100-Basenpaare-Leiter. Die Banden

konnten nun unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Die Dokumentation erfolgte

mit einer Dokumentationseinrichtung der Firma Vilber Lourmat, sowie des Pro-

gramms Bio Capt MW Version 11.01 for Windows.


6x Probenpuffer:

Bromphenol blue 0,25 %

Xylene cyanol ff 0,25 %

Sucrose (w/v) 40 % in MQ-H2O

50x TAE-Puffer:

TRIS Base (2 M) 242 g

Eisessig (100 %) 57,1 ml

EDTA (0,5 M, pH 8) 100 ml ad 1 l mit MQ-H2O

Agarosegel 1,6 %ig:

1,2 g Agarose

75 ml 1x TAE

0,75 μl Ethidiumbromid

Die Methode, welche reverse Transkription und PCR kombiniert, wird RT-PCR

genannt. Sie ist sehr sensitiv, selbst geringe RNA-Mengen können detektiert werden

(Wang et. al 1989). Dies liegt daran, dass die cDNA exponentiell vervielfältigt wird.

Die Schwierigkeit liegt nun darin, eine quantitative Aussage zu treffen, da Unter-

schiede in der Effizienz bei der RNA-Isolierung, der reversen Transkription und der

Amplifikation auftreten können (Chelly et. al 1988). Deshalb wurde die endogene

GAPDH-Sequenz als interner Standard gewählt. Da es sich bei GAPDH um ein

konstitutiv exprimiertes Protein handelt, konnte man davon ausgehen, dass die

Konzentration an GAPDH-RNA in den zu vergleichenden Proben immer gleich hoch

war. Wichtig war nun, das sich GAPDH während der PCR noch im linearen Bereich

befand, da man zwar theoretisch davon ausgehen kann, dass sich die Ziel-DNA wie

in der folgenden Formel verhält: N = N0 * 2 n (N = Anzahl der Amplifikate, N0 =

Anzahl der Kopien der ursprünglichen DNA-Matritze, n = Anzahl der Vermehr-

ungszyklen), unter experimentellen Bedingungen sich die zu vervielfältigenden

Sequenzen jedoch nicht beliebig lange exponentiell vermehren. Es kommt im Laufe

späterer Zyklen irgendwann zu einem Plateau- oder Sättigungseffekt, da sich die

Produktionsrate vermindert. Daher wurde GAPDH in einer Verdünnungsreihe

getestet, wobei man bei einer Verdünnung von 1:500, der aus der mRNA result-

ierenden cDNA, im linearen Bereich arbeitete. Auch für die cDNA der anderen


untersuchten Proteine wurden entsprechende Verdünnungsreihen durchgeführt, und

es wurde mit den in Tab. 2 (s. Ergebnisteil) aufgeführten Verdünnungen gearbeitet.

Die cDNA-Konzentration der anderen Kanalproteine wurde ins Verhältnis zur

GAPDH-cDNA gesetzt, womit man das relative Expressionsniveau der Kanäle

berechnen und sie damit vergleichen konnte.

Mit dem Programm Imagej konnten die verschiedenen Banden aufgrund ihrer Grau-

stufen quantitativ verglichen werden. Jede PCR-Reaktion wurde im Doppel durchge-

führt. Nach Auswertung wurde der Mittelwert hieraus ermittelt.

Anschließend wurden die Ergebnisse mithilfe des t-Tests auf signifikante Unter-

schiede getestet. Das Konfidenzintervall betrug p < 0,05 das heißt bei einem p ≤ 0,05

wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den Probereihen festgestellt. In den

Abbildungen wurden Signifikanzen mit einem * gekennzeichnet.

Ergebnisse 33

III. Ergebnisse

III.1. Verdünnungen

Wie schon unter Material und Methoden beschrieben bleibt die Amplifikation der

c-DNA bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), nicht beliebig lange im expo-

nentiellen Bereich, sondern es kommt im Laufe der Zeit zu einem Sättigungs- oder

Plateaueffekt. Daher ist es vor Durchführung der Versuche wichtig, festzustellen, bei

welchen Verdünnungen die Amplifikation noch im linearen Bereich liegt. Aus

diesem Grund wurde eine Verdünnungsreihe der c-DNA mit den Primern aller

verwendeten Proteine durchgeführt. Diese sind sowohl in den Abbildungen 3-15 als

Ergebnis der Gelelektrophorese als auch graphisch dargestellt.

Abb. 3b: GAPDH Verdünnung - Grafik

R2 = 0,9295

02000400060008000

10000

1:1 1:5 1:10 1:100 1:1000 1:10000

Verdünnungrel.

Ein

heit

Abb. 4b: NKCC2 Verdünnung - Grafik

R2 = 0,9206

0

2000

4000

6000

8000

1:100 1:500 1:1000 1:5000 1:10000

Verdünnungrel.

Ein

heit

Abb. 5b: ROMK Verdünnung - Grafik

Abb. 3.a: GAPDH Verdünnungsreihe

Verd. 1:10000 1:1000 1:100 1:10 1:5 1:1

Abb. 4a: NKCC2 Verdünnungsreihe

Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:500 1:100

Abb. 5a: ROMK Verdünnungsreihe

Verd. 1:100 1:10 1:1

R2 = 0,8545

0

2000

4000

6000

8000

1:1 1:10 1:100 1:1000

Verdünnungrel.

Ein

heit

Ergebnisse 34

Abb. 6b: KCC1 Verdünnung - Grafik


R2 = 0,9916

0

2000

4000

6000

8000

1:1 1:10 1:100 1:1000

Verdünnungrel.

Ein

heit


R2 = 0,8552

0

2000

4000

6000

8000

1:1 1:10 1:100 1:1000 1:10000

Verdünnungrel.

Ein

heit

Abb. 9b: ClC-K1 Verdünnung - Grafik

Abb. 6a: KCC1 Verdünnungsreihe

Verd. 1:1000 1:100 1:10 1:1


Verd. 1:1000 1:100 1:10 1:1


Verd. 1:10000 1:1000 1:100 1:10 1:1

Abb. 9a: ClC-K1 Verdünnungsreihe

Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10

R2 = 0,9899

02000400060008000

10000

1:1 1:10 1:100 1:1000

Verdünnungrel.

Ein

heit

R2 = 0,9516

0

2000

4000

6000

8000

1:10 1:100 1:1000 1:10000

Verdünnungrel.

Ein

heit

Ergebnisse 35

Abb. 10b: NCCT Verdünnung - Grafik

R2 = 0,8903

02000400060008000

10000

1:10 1:100 1:1000 1:10000

Verdünnungrel.

Ein

heit

Abb. 11b: Na+-K+-ATPase Verd. - Grafik

R2 = 0,8389

02000400060008000

10000

1:10 1:100 1:1000 1:10000

Verdünnungrel.

Ein

heit

Abb. 12b: ENaC-β Verdünnung - Grafik

R2 = 0,893

0

2000

4000

6000

8000

1:100 1:500 1:1000 1:5000 1:10000

Verdünnungrel.

Ein

heit

Abb. 13b: ENaC-γ Verdünnung - Grafik

Abb. 10a: NCCT Verdünnungsreihe

Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10

Abb. 12a: ENaC-β Verdünnungsreihe

Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:500 1:100

Abb. 13a: ENaC-γ Verdünnungsreihe

Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10

Abb. 11a: Na+-K+-ATPase Verdünnungsreihe

Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10

R2 = 0,9704

02000400060008000

1000012000

1:10 1:100 1:1000 1:10000

Verdünnungrel.

Ein

heit

Ergebnisse 36

Abb. 14b: Nedd-4 Verdünnung - Grafik

R2 = 0,965

0

2000

4000

6000

1:10 1:100 1:1000 1:10000

Verdünnungrel.

Ein

heit

Abb. 15b: SGK Verdünnung - Grafik

Abb. 14a: Nedd-4 Verdünnungsreihe

Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10

Abb. 15a: SGK Verdünnungsreihe

Verd. 1:10000 1:1000 1:100 1:10

R2 = 0,7397

0

2000

4000

6000

8000

1:10 1:100 1:1000 1:10000

Verdünnungrel.

Ein

heit

Aus der Auswertung der Abbildungen ergaben sich für die c-DNA der Proteine

folgende Verdünnungen, die bei allen weiteren PCRs verwendet wurden.

Kanalprotein bzw. Protein Verdünnung der c-DNA Größe der Fragmente

GAPDH (Chan et al. 2002) 1 : 500 340 Basenpaare NKCC 2 1 : 2000 306 Basenpaare ROMK-2 1 : 20 356 Basenpaare KCC1 1 : 50 374 Basenpaare KCC3 1 : 50 379 Basenpaare KCC4 1 : 500 300 Basenpaare ClC-K1 1 : 500 213 Basenpaare NCCT 1 : 600 371 Basenpaare Na+-K+-ATPase α1 1 : 1200 206 Basenpaare ENaC β (Chan et al. 2002) 1 : 2000 420 Basenpaare ENaC γ (Chan et al. 2002) 1 : 500 749 Basenpaare NEDD-4 1 : 500 375 Basenpaare SGK 1 : 2000 370 Basenpaare Tab. 2 Verwendete Verdünnungen der c-DNA für die PCR; Größe der jeweiligen DNA-Fragmente

Ergebnisse 37

III.2. C57Bl6-Mäuse im Vergleich zu COX-2-/- und EP4-/- Mäusen: Expression

von Nierenproteinen ohne und mit Furosemidgabe

Einer Gruppe von jeweils zwölf C57Bl6-, COX-2-/-- sowie EP4-/--Mäusen wurde

zehn Tage lang mit dem Trinkwasser Furosemid zugeführt, während eine ent-

sprechende Kontrollgruppe von ebenfalls je zwölf Mäusen unter Standardbeding-

ungen gehalten wurde. Danach wurden die Tiere getötet. Die Nieren wurden ent-

nommen, bei – 80°C tiefgefroren und anschließend die RNA aufbereitet und in

cDNA umgeschrieben. In den aus den Vorversuchen gewonnenen Verdünnungen

wurde die cDNA zusammen mit den jeweiligen Primern in der PCR vervielfältigt.

Nachdem die Ergebnisse der Proben unter Zuhilfenahme der Gelelektrophorese

dargestellt und mittels eines Videodokumentationssystems gespeichert wurden,

konnten sie aufgrund der unterschiedlichen Graustufen mithilfe des Programms

ImageJ miteinander verglichen werden. Als Bezugsgröße diente GAPDH, ein

konstituiv exprimiertes Protein (Haushaltsfunktion), zu dem alle Ergebnisse in

Relation gesetzt wurden und so vergleichbar sind.

In den Abbildungen (Abb. 19-54) sind die PCR-Ergebnisse der Furosemid-

behandelten Gruppen sowie der Kontrollgruppen im Original dargestellt (n=12).

Rechts dargestellt ist die Mittlung der jeweiligen Graustufenauswertung, die die

relative Expression zu GAPDH (Abb. 16-18) darstellt. Diese Weise der semi-

quantitativen Analyse erlaubt den relativen Vergleich zwischen den jeweiligen

Verum- und Plazebogruppen.

Ergebnisse 38

Abb. 16: GAPDH (Referenz) – C57Bl6-Mäuse

ohne Furosemid

mit Furosemid

Abb. 17: GAPDH (Referenz) – COX-2-/- Mäuse

ohne Furosemid

mit Furosemid

Abb. 18: GAPDH (Referenz) – EP4-/- Mäuse

ohne Furosemid

mit Furosemid

Der bumetanide-sensitive Natrium-Kalium-2Chlorid Kotransporter (NKCC2) ist für

die Netto-Resorption von Natrium und Chlorid, aus dem Tubulus ins Interstitium, im

dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife verantwortlich. Er wird durch das

Schleifendiuretikum Furosemid gehemmt.

Die Ergebnisse zeigen, dass Furosemid bei den C57Bl6-Mäusen langfristig zu einer

Abnahme der NKCC2 mRNA-Konzentration in der Niere führt, in Zahlen ausge-

drückt findet eine Reduktion von 100 % auf 59 % statt, was einer signifikanten

Abnahme entspricht.

Dagegen findet sich bei den COX-2-/- sowie den EP4-/- Mäusen im Versuch mit

Furosemid eine Zunahme der mRNA-Konzentration von 100 % auf 134 % bzw.

113 % gegenüber den nicht mit Furosemid behandelten Mäusen. Dies ist aber

lediglich als Tendenz zu werten, da es sich in beiden Fällen um keine signifikanten

Unter-schiede handelt.

Ergebnisse 39

Abb. 19: NKCC2 – C57Bl6-Mäuse

ohne Furosemid

mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05

Abb. 20: NKCC2 – COX-2-/- Mäuse

ohne Furosemid

mit Furosemid n=12 ± SEM

Abb. 21: NKCC2 – EP4-/- Mäuse

ohne Furosemid


Ergebnisse 40

Abb. 22: ROMK – C57Bl6-Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 23: ROMK – COX-2-/- Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 24: ROMK – EP4-/- Mäuse

ohne Furosemid


Der ROMK-Kanal (renal outer-medullary K+) ist in der Niere im dicken

aufsteigenden Ast der Henle Schleife lokalisiert, wo er in der apikalen Membran sitzt

und den Gradienten für NKCC2 aufrechterhält. Außerdem befindet er sich im

kortikalen Sammelrohr, in dem er an der Kaliumsekretion teilnimmt. Unter Furo-

semidgabe an die C57Bl6-Mäuse ist ein signifikanter Abfall der mRNA-Konzen-

tration von ROMK in der Niere von 100 % auf 68 % zu verzeichnen.

Ergebnisse 41

Dagegen kommt es im Versuchsaufbau mit den COX-2-/- Mäusen unter der Furo-

semidbehandlung zur Zunahme der ROMK mRNA-Konzentration von 100 % auf

170 %. Dies ist ein signifikanter Anstieg.

Bei den EP4-/- Mäusen ist die Tendenz eines Anstieges der renalen mRNA-Kon-

zentration unter der Gabe des Schleifendiuretikums zu erkennen (100 % zu 118 %;

nicht signifikant).

Abb. 25: KCC1 – C57Bl6-Mäuse

ohne Furosemid



ohne Furosemid



ohne Furosemid


Ergebnisse 42

Abb. 28: KCC1 – COX-2-/- Mäuse

ohne Furosemid



ohne Furosemid



ohne Furosemid


Ergebnisse 43

Abb. 31: KCC1 – EP4-/- Mäuse

ohne Furosemid



ohne Furosemid



ohne Furosemid


Die Kaliumchlorid-Kotransporter (KCC) werden im hypotonen Zustand aktiviert und

dienen somit als Volumenregulatoren (Cossins, Gibson, 1997; Lauf et al. 1992). Die

Expression der KCC1, 3 und 4 findet entlang des gesamten Nephrons statt (Liapis et

al. 1998). Unter den Versuchsbedingungen ohne Furosemid, war für die C57Bl6-

Mäuse, im Vergleich zu denen mit Furosemid, ein Abfall der mRNA in der Niere um

Ergebnisse 44

etwa die Hälfte erkennbar, für KCC1 von 100 % auf 45 %, für KCC3 von 100 % auf

54 % und für KCC4 von 100 % auf 42 % (signifikante Abfälle).

Dagegen zeigten die COX-2-/- Mäuse eine tendenzielle Zunahme der mRNA Kon-

zentration bei allen drei Kanälen, wenn sie mit dem Schleifendiuretikum behandelt

wurden, im Vergleich zu den Standardbedingungen; im einzelnen waren das: bei

KCC1 von 100 % auf 156 %, bei KCC3 von 100 % auf 131 %, bei KCC4 von 100 %

auf 108 % (alle nicht signifikant).

Bei den EP4-/- Mäusen ist erneut eine signifikant reduzierte mRNA-Konzentration zu

sehen, wenn die Mäuse das Medikament bekamen. Es handelt sich hierbei um fol-

gende Abnahmen (gegenüber Standardbedingungen): Die KCC1 mRNA-Konzentrat-

ion nimmt von 100 % auf 57 % ab, während die für KCC3 und KCC4 von 100 % auf

61 bzw. 63 % abnimmt.

Ergebnisse 45

Abb. 34: ClC-K1 – C57Bl6-Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 35: ClC-K1 – COX-2-/- Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 36: ClC-K1 – EP4-/- Mäuse

ohne Furosemid


Der Chloridtransporter ClC-K1 ist für die hohe Chlorid-Permeabilität im dünnen

aufsteigenden Ast der Henle-Schleife verantwortlich und ist somit notwendig für die

Urinkonzentration. Die mRNA-Konzentration dieses Transporters wird in der Niere,

Ergebnisse 46

unter der Gabe von Furosemid an die C57Bl6-Mäuse, nahezu nicht verändert.

Gleiches gilt für die COX-2-/- Mäuse.

Bei den EP4-/- Mäusen kommt es jedoch zu einer deutlichen Abnahme der mRNA

Konzentration von ClC-K1. Bei den Versuchen zeigte sich ein Abfall der ClC-K1

mRNA-Konzentration, unter der Verabreichung von Furosemid, von 100 % auf

49 %, gegenüber den nicht mit Furosemid behandelten Mäusen.

Abb. 37: NCCT – C57Bl6-Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 38: NCCT – COX-2-/- Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 39: NCCT – EP4-/- Mäuse

ohne Furosemid


Ergebnisse 47

Der Thiazide-sensitive Natriumchlorid-Kotransporter (NCCT) wird im distalen

Konvolut exprimiert. Dort ist er an der Natriumchlorid-Resorption beteiligt. Unter

Furosemidbehandlung der C57Bl6-Mäuse zeigt sich auf der Ebene der mRNA der

Niere, im Vergleich zum Versuch ohne Furosemid, eine signifikante Abnahme der

Expression von 100 % auf 67 %.

Im Gegensatz dazu, kommt es bei den COX-2-/- Mäusen zu keiner signifikanten

Veränderung der NCCT mRNA-Konzentration, unter der Behandlung mit dem

Schleifendiuretikum. Es ist von der Tendenz her jedoch eine Zunahme zu erkennen;

von 100 % auf 123 %.

Für die EP4-/- Mäuse ändert sich die mRNA-Konzentration ebenfalls nicht

signifikant.

Ergebnisse 48

Abb. 40: Na+-K+-ATPase – C57Bl6-Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 41: Na+-K+-ATPase – COX-2-/- Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 42: Na+-K+-ATPase – EP4-/- Mäuse

ohne Furosemid


Die Natrium-Kalium-ATPase (Na+-K+-ATPase) ist eine von Energie in Form von

Adenosintriphosphat (ATP) abhängige Ionenpumpe. In der Niere kommt sie vor

allem an der basolateralen Seite der Tubuluszellen vor und ist dort für den Austausch

von 3 Natrium gegen 2 Kalium zuständig, wobei das Natrium aus der Zelle ins Inter-

stitium transportiert wird und das Kalium den umgekehrten Weg nimmt. Daher

Ergebnisse 49

nimmt die Na+-K+-ATPase an der Resorption von Natrium ins Interstitium und der

Sekretion von Kalium in den Tubulus teil.

Als Resultat des Versuches kann man festhalten, das die mRNA der Na+-K+-ATPase

unter den Bedingungen des erhöhten Salz- und Wasserverlustes, wie dies unter Furo-

semid der Fall ist, in der Niere hochreguliert wird. Effektiv findet eine signifikante

Zunahme um 38 %, von 100 % auf 138 %, statt.

Das Ergebnis der COX-2-/- Mäuse unterscheidet sich von dem der C57Bl6-Mäuse.

Unter Furosemidbehandlung ergibt sich hier nahezu keine Veränderung der mRNA

Konzentration in der Niere.

Ein ähnliches Ergebnis ist bei den EP4-/- Mäusen zu beobachten. Hier findet sich

ebenfalls keine signifikante Veränderung.

Abb. 43: ENaC β – C57Bl6-Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 44: ENaC γ – C57Bl6-Mäuse

ohne Furosemid


Ergebnisse 50

Abb. 45: ENaC β – COX-2-/- Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 46: ENaC γ – COX-2-/- Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 47: ENaC β – EP4-/- Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 48: ENaC γ – EP4-/- Mäuse

ohne Furosemid


Ergebnisse 51

Der Amilorid-sensitive ephiteliale Natrium-Kanal (ENaC) wird in der Niere im

distalen Nephron exprimiert und nimmt dort an der Feinregulation der Natrium-

reabsorption teil. Er besteht aus drei homologen Untereinheiten. Neben der nicht

untersuchten α-Untereinheit gibt es noch β- und γ-ENaC, die in Vesikeln

vorkommen und aus diesen in die apikale Zellmembran eingebaut werden. Die

mRNA-Konzentration in der Niere dieser beiden Einheiten der C57Bl6-Mäuse, ist

unter der Behandlung mit Furosemid (β-ENaC: 146 %; γ-ENaC: 137 %) signifikant

erhöht, im Vergleich zu Standardbedingungen (100 %).

Eine ähnliche Beobachtung lässt sich unter der Gabe von Furosemid an die COX-2-/-

Mäuse machen. Hier findet sich zwar keine signifikante Änderung der mRNA

Expression der β- und γ-ENaC Untereinheiten im Vergleich zu Normalbedingungen,

allerdings ist eine tendenzielle Zunahme unter der Diuretikagabe zu erkennen.

Bei den EP4-/- Mäusen lässt sich dagegen keine einheitliche Aussage machen. Die

mRNA-Konzentration der β-Untereinheit zeigt eine deutliche Abnahme um 54 %,

von 100 % auf 46 % unter der Behandlung mit dem Schleifendiuretikum. Dies ist

signifikant. Bei der γ- Untereinheit ändert sich die mRNA-Konzentration jedoch

nicht (100 % zu 100 %).

Ergebnisse 52

Abb. 49: Nedd 4 – C57Bl6-Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 50: Nedd 4 – COX-2-/- Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 51: Nedd 4 – EP4-/- Mäuse

ohne Furosemid


Nedd-4 ist ein Protein, das beim Abbau von ENaC eine Rolle spielt, ENaC wird

markiert (‚ubiquitiniert’), endozytiert und lysosomal/proteosomal abgebaut (Malik et

al. 2001).

Unter den Versuchsbedingungen zeigt sich, dass die in der Niere vorkommende

mRNA unter Furosemidbehandlung, im Vergleich mit den Standardbedingungen,

Ergebnisse 53

tendenziell erniedrigt wird und zwar um 16 %, dieser Wert ist jedoch nicht

signifikant.

Die Behandlung mit dem Schleifendiuretikum führt auch bei den COX-2-/- Mäusen

eher zu einer Abnahme der Nedd-4 mRNA-Konzentration in der Niere. Auch hier

handelt es sich aber um keinen signifikanten Unterschied.

Demgegenüber zeigen die EP4-/- Mäuse, die mit Furosemid behandelt wurden,

gegenüber denen die keines erhielten, einen kleinen Anstieg der Nedd-4 mRNA-

Konzentration, der jedoch ebenfalls nicht signifikant ausfällt.

Abb. 52: SGK 1 – C57Bl6-Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 53: SGK 1 – COX-2-/- Mäuse

ohne Furosemid


Abb. 54: SGK 1 – EP4-/- Mäuse

ohne Furosemid


Ergebnisse 54

Die SGK 1 (Serum- und Glucocorticoid-regulierte Kinase 1) wirkt vermutlich auf der

einen Seite direkt stimulierend auf ENaC, andererseits aber auch indirekt durch die

Inaktivierung von Nedd-4. In der Niere findet unter den Versuchsbedingungen bei

den C57Bl6-Mäusen mit Furosemidbehandlung, gegenüber dem Versuch ohne Furo-

semid, eine Abnahme der SGK 1 mRNA-Konzentration von 100 % auf 57 % statt

(signifikanter Unterschied).

Bei den COX-2-/- Mäusen ist zwar eine Zunahme der mRNA-Konzentration von

100 % auf 120 % bei Furosemidgabe gegenüber Standardbedingungen zu beobach-

ten, dieser Unterschied ist jedoch nicht signifikant.

Beim EP4-/- kommt es, wie auch schon bei den C57Bl6-Mäusen, zu einem signi-

fikanten Abfall der SGK 1 mRNA-Konzentration unter der Gabe des Diuretikums. In

diesem Fall war eine Abnahme von 100 % auf 72 % zu sehen.

Diskussion 55

IV. Diskussion

IV.1. Behandlung der Mäuse mit Furosemid: Modell für das antenatale

Bartter-Syndrom zur Untersuchung der Veränderungen von Protein-

expressionen in der Niere

Warum ist es wichtig, zu wissen wie sich verschiedene (Kanal)proteinexpressionen

in der Niere beim antenatalen Bartter-Syndrom sowie bei dessen Behandlung verän-

dern?

Es ist bekannt, dass das antenatale Bartter-Syndrom mithilfe eines Cyclooxygenase-

Inhibitors (COX-Hemmer) positiv beeinflusst werden kann, indem die übermäßige

Produktion von Prostaglandin-E2 unterdrückt wird. Wie sich aber die Expressionen

der Kanalproteine und deren Steuerungsproteine verändern, ist bisher nur in An-

sätzen beschrieben. Hier könnte demnach ein weiterer Ansatzpunkt liegen, das

antenatale Bartter-Syndrom zu behandeln und mit einer spezifischeren Therapie die

Nebenwirkungen, die bei der Behandlung mit COX-Hemmern auftreten, zu

reduzieren.

IV.2. C57Bl6-Mäuse ohne und mit Furosemidbehandlung im Vergleich zu

COX-2-/- und EP4-/- Mäusen

Die COX-2 spielt bei der Pathogenese des antenatalen Bartter-Syndroms eine

wichtige Rolle. Die verminderte Chlorid-Aufnahme in die Zelle durch Ausfall oder

Blockade des Natrium-Kalium-2Chlorid-Kotransporter (NKCC2), in der luminalen

Membran des kortikalen Teils der Henle Schleife, führt durch die erniedrigte

Chloridkonzentration zur Aktivierung der p38MAP-Kinase, die eine Erhöhung der

COX-2 Transkription bedingt. Dadurch erhöht sich der Prostaglandin-E2-Spiegel und

es kommt zur vermehrten cAMP Bildung in den juxtaglomerulären Zellen, die

wiederum zu einer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS)

führt. Es wird vermutet, dass der Prostaglandinrezeptor EP4 bei dieser Signalkette

eine wichtige Rolle spielt (Nüsing et al. 2005; Breyer & Breyer, 2000). Zusätzlich ist

ein direkter Zusammenhang zwischen Reninkonzentration und der Konzentration

von COX-2 bekannt, was nicht zuletzt durch die parallele Abnahme beider

Konzentrationen (wenn sie, wie oben beschrieben, erhöht sind), unter der

Diskussion 56

Behandlung mit COX-2 Hemmern ersichtlich ist (reviewed in Breyer et al. 2001). Da

das von COX-2 produzierte Prostaglandin E2 (PGE2), vermutlich über die Rezept-

oren EP2 und/oder EP4, in der Niere vasodilatatorisch wirkt (Breyer & Breyer,

2000), ist somit neben der vermuteten Hemmung von bestimmten Kanalproteinen,

ein Teil der erhöhten Ausscheidung von Salz und Wasser durch die erhöhte

Durchblutung der Niere erklärbar.

PGE2 inhibiert in vitro im medullären dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife

und im Sammelrohr die Natriumchlorid Absorption, vermutlich über die PGE2-

Rezeptoren EP3 und EP1. Außerdem ist es dafür bekannt, die renale Wasser-

Exkretion zu erhöhen (reviewed in Breyer et al. 2001).

Die oben genannten Beobachtungen erklären, warum Indomethacin, als unspezifi-

scher COX-Hemmer, sowie spezifische COX-2-Hemmer wie Rofecoxib oder Nime-

sulide, sich positiv auf die Erkrankung des antenatalen Bartter-Syndroms auswirken.

Durch COX-2 Hemmung ist eine deutliche Abnahme der renalen PGE2-Produktion

zu sehen, aber auch das Urinvolumen, die Natriumausscheidung und der medulläre

Blutfluss in der Niere sind erniedrigt (Reinalter et al. 2002, Nüsing et al. 2001).

Die hier aufgeführten Hypothesen führen zwangsläufig zu der Fragestellung, welche

Veränderungen auf Kanalproteinebene durch das Schleifendiuretikum Furosemid, als

Modell für den diuretikaähnlichen Wasser- und Salzverlust, wie er beim antenatalen

Bartter-Symptomenkomplex zu finden ist, stattfinden. Außerdem interessiert es

welche Rolle in diesem Zusammenhang COX-2 und der Prostaglandinrezeptor EP4

spielen, respektive wie sich durch COX-2 und EP4 die Kanalexpressionen in der

Niere verändern.

Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass der

durch Furosemid blockierte NKCC2, bei Wildtyp Mäusen (C57Bl6) unter der Be-

handlung mit Furosemid auf mRNA Ebene bedeutsam herunterreguliert wird.

Dies steht im Gegensatz zu den Arbeiten von Moreno et al., sowie Wolf et al., bei

denen keine signifikanten Veränderungen der mRNA Expression gefunden werden

konnten (Moreno et al. 1998; Wolf et al. 2001). Moreno et al. untersuchten nur den

Kortex, hingegen fanden Wolf et al. sowohl im Kortex, als auch in äußerer und

innerer Medulla keinen Unterschied in der mRNA Expression. Eine Möglichkeit für

diesen Widerspruch ist, dass Moreno et al. und Wolf et al. Ratten und nicht Mäuse

verwendeten und außerdem die mRNA nicht mit der Polymerase-Kettenreaktion

Diskussion 57

(PCR), sondern mithilfe anderer Methoden dargestellt wurde (s. Tab. 3). Ein weiterer

Unterschied liegt in der jeweiligen Versuchsdauer, sowie der Art der Furosemid-

applikation. Während Moreno et al. den Tieren über 7 Tage Furosemid intra-

peritoneal spritzten, verwendeten Wolf et al. eine osmotische Pumpe über 6 Tage

Versuchsdauer. In der vorliegenden Arbeit wurde den Tieren das Furosemid über 10

Tage per Trinkwasser zugeführt. Aus diesen Angaben lässt sich die Hypothese

aufstellen, dass Furosemid längere Zeit braucht, um die Veränderungen auf mRNA

Ebene zu bewirken. Dies deckt sich mit der Beobachtung von Juliane Wolf (ebenfalls

Forschungsgruppe Prof. Dr. Nüsing, nicht veröffentlichter Versuch), dass ein Teil-

effekt des Furosemids, der über Prostaglandin-E2 vermittelt wird, erst nach mehreren

Tagen der Applikation des Schleifendiuretikums zum Tragen kommt.

In einer weiteren Arbeit von 2003 zeigten Na et al., dass das NKCC2-Protein unter

Furosemidgabe im Kortex, sowie der äußeren Medulla vermehrt exprimiert wurde

(Na et al. 2003). Die abweichenden Ergebnisse lassen sich durch die Tatsache er-

klären, dass nicht die mRNA, wie in der vorliegenden Arbeit, sondern das Protein

NKCC2 untersucht wurde, was auf eine posttranskriptionale Veränderung schließen

lässt. Es bleibt zu erwähnen, dass es sich beim Versuch von Na et al. ebenfalls um

Ratten und nicht um Mäuse handelte und auch nicht, wie in dieser Arbeit, die

komplette Niere untersucht wurde, sondern nur Teilbereiche (Kortex und äußere

Medulla).

Es ist auch durchaus denkbar, dass sich NKCC2, nach der Gabe eines Schleifen-

diuretikums, in bestimmten Teilbereichen der Niere unterschiedlich verändert. Hier

sind genauere Untersuchungen erforderlich um diesen Sachverhalt zu klären.

Betrachtet man die Ergebnisse der COX-2-/- und EP4-/- Mäuse, so wird deutlich, dass

bei diesen Mäusen NKCC2 unter Furosemidgabe nicht, wie bei den Wildtypmäusen,

herunterreguliert wird. Hier findet sich kein signifikanter Unterschied beider

Versuchsgruppen, es ist aber eine Tendenz zu erkennen, dass NKCC2 durch das

Schleifendiuretikum hochreguliert wird. Bei den COX-2-/- Mäusen ist Prostaglandin-

E2 vermindert, da COX-2 fehlt, während es bei den EP4-/- Mäusen nicht mehr am

Prostaglandinrezeptor EP4 binden kann.

Dies führt zu der Hypothese, dass die Transkription des NKCC2-Transporters, der im

dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife lokalisiert und für die hohe Ionen-

konzentration im Mark der Niere mit verantwortlich ist, durch erhöhte Prostaglandin-

E2-Werte, über den EP4-Rezeptor gehemmt wird. Bei der Gabe von Furosemid und

Diskussion 58

beim Hyperprostaglandin-E2-Syndrom (HPS), ist PGE2 erhöht. Es ist somit denkbar,

dass PGE2 auf diese Art und Weise zusätzlich zum Wasser- und Salzverlust beiträgt,

was auch mit den Beobachtungen übereinstimmt, dass COX-2-Hemmer zu einer

wesentlichen Verbesserung des HPS beitragen, indem die Urinausscheidung ver-

mindert wird.

Eine Antwort auf die Frage, warum das Renin in der Niere hochreguliert wird liefert

folgender Sachverhalt, der sich durch die Aufgabe des juxtaglomerulären Apparates

erklären lässt. Wird NKCC2 in den juxtaglomerulären-Zellen unter Furosemidgabe

herunterreguliert, bzw. gehemmt, sinkt in diesen Zellen die Chloridkonzentration. Es

wird vermutet, dass diese erniedrigte Ionenkonzentration zur vermehrten Bildung

von PGE2 über COX-2 führt und über den PG-Rezeptor EP4 eine Aktivierung des

Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems stattfindet (Nüsing et al. 2005), um mehr

Wasser und Salze zu resorbieren. Zusätzlich würde, wie oben bereits angenommen,

die NKCC2-Transporterkonzentration weiter abnehmen. Der Kreislauf von

erniedrigtem NKCC2 erhöhtem PGE2 weiter erniedrigtem NKCC2 würde sich

somit im Sinne eines Circulus Vitiosus verstärken und könnte durch die Gabe eines

COX-2-Hemmers durchbrochen werden.

Natürlich muss bei diesen Hypothesen berücksichtigt werden, dass NKCC2 unter der

Furosemidgabe ohnehin blockiert ist und beim HPS ein Defekt dieses Transporters

vorliegen kann. Eine Restfunktion des Transporters ist aber in beiden Fällen noch zu

erwarten, so dass sich die Erklärungen auf eben diese Restfunktionen beziehen.

Auch für den Kaliumkanal ROMK (renal outer-medullary K+) machten Wolf et al.

die Beobachtung, dass sich die mRNA Konzentration unter 6 tägiger Furosemidgabe

nicht veränderte (Wolf et al. 2001). Der Vergleich der Versuchsbedingungen, die für

die unterschiedlichen Ergebnisse verantwortlich sein können, wurde schon für

NKCC2 abgehandelt (s. oben und Tab.). ROMK, sowohl im dicken aufsteigenden

Ast der Henle Schleife, als auch in den juxtaglomerulären Zellen mit NKCC2 co-

lokalisiert, ist für eine Art ‚Recycling’ zuständig, das heißt für den Rücktransport

von Kalium aus der Zelle in den Tubulus, wodurch die notwendige Kaliumkon-

zentration für das Funktionieren des NKCC2-Kotransporters aufrechterhalten wird.

Somit ist die signifikante Abnahme der mRNA-Expression von ROMK in dieser

Arbeit bei den C57Bl6 Mäusen, unter Furosemidgabe und die Zunahme bei den

COX-2-/- (signifikant) und den EP4-/- Mäusen (tendenziell ansteigend, nicht

Diskussion 59

signifikant) unter der Gabe des Diuretikums nicht überraschend. Auch hier darf an-

genommen werden, dass über erhöhtes PGE2 und die Wirkung am EP4-Rezeptor der

ROMK-Kanal herunterreguliert wird.

Abb. 55 Schaubild zur möglichen Wirkung von PGE2 auf die Kanäle NKCC2 und ROMK

Furosemid NKCC2 ⇓

COX-2 ⇑ PGE2 ⇑ vermehrte Bindung am Rezeptor EP4

HPS ROMK ⇓ HPS = Hyperprostaglandin-E2-Syndrom

Um diese Theorie zu stützen ist es jedoch erforderlich, genauere Untersuchungen zu

machen, in welchen Bereichen des Nephrons NKCC2 und ROMK in welcher Weise

verändert und beeinflusst werden, da es durchaus möglich ist, dass sich die Kanal-

expressionen beispielsweise im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife anders

verhalten, als in den juxtaglomerulären Zellen, wobei aber auch eine parallele

Entwicklung möglich ist. Darüber hinaus muss die Proteinexpression nicht zwangs-

läufig mit der mRNA Konzentration übereinstimmen, da es auch andere Regulations-

mechanismen, wie beispielsweise eine vermehrte oder verminderte Translation, gibt.

Diskussion 60

Tab. 3 Veränderungen ausgewählter Kanalproteine unter Furosemidgabe

Kanal-

protein

Veränderung bei

Furosemidgabe

Lokalisation

in der Niere

Verwendete

Verfahren

Versuchstier Autor

NKCC2 mRNA: ⇔ äußere

Medulla

nichtradioaktiver

Northern-Blot

Wistar Ratte Moreno

et al.

1998

mRNA: ⇔ Kortex,

äußere/innere

Medulla

Ribonuclease

Protection Assay

Sprague-

Dawley Ratte

Wolf et

al. 2001

Protein: ⇑

Protein: ⇑

Kortex

äußere

Medulla

Immunblotting/

Immunhistochemie

Sprague-

Dawley Ratte

Na et al.

2003

ROMK mRNA: ⇔ Kortex,

äußere/innere

Medulla

Ribonuclease

Protection Assay

Sprague-

Dawley Ratte

Wolf et

al. 2001

ClC-K1 mRNA : ⇔

mRNA : ⇔

mRNA : ⇓

Kortex

äußere

Medulla

innere

Medulla

mRNA in situ

Hybridisierung,

Microdissektion,

Real-Time-PCR

Sprague-

Dawley Ratte

Wolf et

al. 2003

Na+-K+-

ATPase

mRNA : ⇔

(α1-Untereinheit)

Kortex,

äußere/innere

Medulla

nichtradioaktive

Dot-Blot-Analyse

Wistar Ratte Merino

et al.

2000

Proteinaktivität: ⇑ Sammelrohr Mikrodissektion,

Aktivitätsassay

Sprague-

Dawley Ratte

Buffin-

Meyer et

al. 2004

NCCT mRNA: ⇔ Kortex semiquantitative

PCR

Wistar Ratte Moreno

et al.

1998

mRNA : ⇑

mRNA: ⇔

Kortex

äußere/innere

Medulla

Ribonuclease

Protection Assay

Sprague-

Dawley Ratte

Wolf et

al. 2001

Protein:

∅_Spironolacton_⇑

⊕_Spironolacton_⇔

mRNA : ⇔

Kortex Immunoblotting

(Protein)/ Northern-

Blot-Analyse

(mRNA)

Sprague-

Dawley Ratte

Abdallah

et al.

2001

Protein : ⇔ Kortex Immunblotting/

Immunhistochemie

Sprague-

Dawley Ratte

Na et al.

2003

Diskussion 61

α-ENaC mRNA: ⇑ Kortex,

äußere/innere

Medulla

Ribonuclease

Protection Assay

Sprague-

Dawley Ratte

Wolf et

al. 2001

Protein: ⇑

Protein: ⇑

Kortex

äußere

Medulla

Immunblotting/

Immunhistochemie

Sprague-

Dawley Ratte

Na et al.

2003

β-ENaC Protein: ⇑

Protein: ⇑⇑⇑⇑

Kortex

äußere

Medulla

Immunblotting/

Immunhistochemie

Sprague-

Dawley Ratte

Na et al.

2003

γ-ENaC Protein: ⇑

Protein: ⇑⇑

Kortex

äußere

Medulla

Immunblotting/

Immunhistochemie

Sprague-

Dawley Ratte

Na et al.

2003

Betrachtet man nun die apikal im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife lokal-

isierten Kaliumtransporter KCC1, 3, 4, so sind auch hier ähnliche Beobachtungen

wie bei den luminal gelegenen NKCC2 und ROMK zu machen, was durch das Zu-

sammenspiel der verschiedenen Kanäle erklärbar ist (s. auch Abb. 1, Abschnitt I.).

Aus den im Ergebnisteil dargestellten Grafiken (s. Abschnitt III.) wird ersichtlich,

dass bei den C57Bl6 Mäusen, unter der Behandlung von Furosemid, ein signifikanter

Abfall der mRNA-Konzentrationen der Kanäle KCC1, 3 und 4 zu beobachten ist,

während die COX-2-/- Mäuse unter der Gabe von Furosemid keine signifikante Ver-

änderung, tendenziell aber eine leichte Zunahme, bei allen drei KCC-Kanälen zeigen.

Dieselbe Beobachtung konnte man auch bei den Kanälen ROMK und NKCC2

machen, so dass hier von einem ähnlichen Wirkprinzip ausgegangen werden kann

(siehe oben), allerdings mit dem Unterschied, dass diese Downregulation der mRNA,

im Falle der KCC-Kanäle, nicht EP4 vermittelt zu sein scheint. Hier lässt sich im

Gegensatz zu den oben genannten Kanälen eine signifikante Abnahme der KCC

mRNA Konzentrationen unter der Gabe von Furosemid an die EP4-/- Mäuse beo-

bachten, ähnlich wie zuvor bei den Wildtypmäusen. Demzufolge besteht die

Möglichkeit, dass das erhöhte PGE2 hier über einen anderen EP-Rezeptor wirkt.

An dieser Stelle muss natürlich ebenfalls berücksichtigt werden, dass Furosemid die

KCC-Kanäle hemmt, wenn auch nicht so stark wie NKCC2 (Gillen et al. 1996;

Payne 1997) und sich die Regulation nur auf die nicht gehemmten Anteile auswirkt.

Diskussion 62

Außerdem sind die Kanäle nicht nur in der Henle Schleife, sondern entlang des

gesamten Nephrons exprimiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit beziehen sich auf die

ganze Niere.

Abb. 56 Schaubild zur möglichen Wirkung von PGE2 auf die Kanäle KCC1, 3, 4

Furosemid

COX-2 ⇑ PGE2 ⇑ vermehrte Bindung am Rezeptor KCC1, 3, 4 ⇓

HPS (nicht EP4) HPS = Hyperprostaglandin-E2-Syndrom

Ein weiterer Kanal der im aufsteigenden Ast der Henle Schleife lokalisiert ist, ist der

Chloridkanal ClC-K1, der im Unterschied zu den bisher behandelten Kanälen nicht

im dicken Teil, sondern im dünnen Teil dieses Astes vorkommt. In dieser Arbeit ist

auf mRNA Ebene ein tendenzieller Abfall unter der Gabe von Furosemid bei den

C57Bl6-Mäusen, zu beobachten (nicht signifikant). Wolf et al. haben bei ihren

Versuchen ebenfalls keinen signifikanten Unterschied der mRNA-Konzentration für

ClC-K1 im Kortex und in der äußeren Medulla beobachten können. Dagegen war in

der inneren Medulla ein Abfall der mRNA-Konzentration unter der Gabe des

Schleifendiuretikums zu sehen (Wolf et al. 2003). In dieser Arbeit ist für die ClC-K1

mRNA unter Furosemidgabe bei den C57Bl6- und COX-2-/- Mäusen kein signi-

fikanter Unterschied zu sehen (minimaler Abfall), während bei den EP4-/- Mäusen

bei Gabe des Schleifendiuretikums eine signifikante Abnahme zu erkennen ist. Es

scheint hier keine Regulation über COX-2 unter der Furosemidgabe stattzufinden.

Das Ergebnis der EP4-/- Mäuse passt allerdings nicht ins Bild. Eine mögliche

Erklärung: ein anderer Mechanismus führt bei Furosemidgabe zu Veränderungen am

EP4 Rezeptor, dieser fiele im Knockoutfall weg; es muss aber auch an eine mögliche

Regulation über COX-1 gedacht werden. Hier sind weitere Versuche zu diesem

Thema nötig.

Diskussion 63

Im distalen Tubulus der Niere befindet sich der Thiazid-sensitive Natrium-Chlorid-

Kotransporter (NCCT). In einigen Versuchen wurde bisher, vornehmlich an Ratten,

die Veränderung des NCCT-Kanals auf die Gabe von Furosemid getestet. So fanden

Wolf et al. heraus, dass die mRNA des Kanals sich unter Furosemidgabe in innerer

und äußerer Medulla nicht verändert, während sie für den Kortex eine Zunahme der

mRNA feststellten (Wolf et al. 2001). Dagegen wurde bei den Versuchen von

Moreno et al., Abdallah et al., sowie Na et al. keine Veränderung der Kortex mRNA-

Konzentration des NCCT-Kanals gefunden, wenn die Tiere mit Furosemid behandelt

wurden (Na et al. 2003; Abdallah et al. 2001; Moreno et al. 1998; s. auch Tab. 3).

Abdallah et al. beobachteten eine Zunahme der Proteinkonzentration, die durch

Spironolacton unterdrückt wurde, wofür sie einen Aldosteroneffekt verantwortlich

machten (Abdallah et al. 2001).

Die unterschiedlichen Ergebnisse in den Arbeiten, sowie der hier vorliegenden, sind

möglicherweise auf die differierenden Versuchsbedingungen zurückzuführen (s.

Tab.).

In den Versuchen an den C57Bl6 Mäusen in dieser Arbeit, konnte auf mRNA Ebene

eine signifikante Abnahme zwischen den Mäusen, die das Schleifendiuretikum be-

kamen und denen die es nicht bekamen, festgestellt werden. War hingegen das COX-

2 Gen ausgeschaltet (COX-2-/- Mäuse), war eine leichte Zunahme der mRNA unter

Furosemid zu erkennen (nicht signifikant), was auf eine Unterdrückung der NCCT-

Expression durch das PGE2 hinweist. Dieser Mechanismus scheint, wie bei NKCC2

und ROMK auch, über den EP4-Rezeptor zu laufen, da die EP4-/- Mäuse ebenfalls

keine signifikante Veränderung der mRNA unter der Behandlung zeigten. Dies gilt,

wie auch bei den anderen Kanälen, immer mit der Einschränkung, das andere EP-

Rezeptor-/--Tiere nicht getestet wurden.

Auch hier erklärt sich die Wirkung einer Herunterregulation dieses Kanals aus seiner

Funktion. Der in der luminalen Membran des distalen Tubulus der Niere vor-

kommende Transporter sorgt für die Netto-Resorption von NaCl, aus dem Tubulus in

die Zelle. Der Antrieb stammt aus der basolateral sitzenden Na+-K+-ATPase.

Unter Furosemidgabe wird die NaCl Resorption erniedrigt, daher kommt es zur

erhöhten Ausscheidung von Salzen und Wasser, diese Wirkung ist teilweise durch

einen COX-2 Hemmer blockierbar, der eine erniedrigte PGE2 Konzentration zur

Folge hat, dessen Wirkung über EP4 vermittelt zu sein scheint. Daraus ergibt sich

Diskussion 64

auch hier eine weitere Möglichkeit, wie der COX-2 Hemmer auf das antenatale

Bartter-Syndrom wirken könnte.

Abb. 57 Schaubild zur möglichen Wirkung von PGE2 auf den NCCT Kanal

Furosemid

COX-2 ⇑ PGE2 ⇑ vermehrte Bindung am EP4-Rezeptor NCCT ⇓

HPS HPS = Hyperprostaglandin-E2-Syndrom

Die Natrium-Kalium-ATPase (Na+-K+-ATPase) ist in der Niere weit verbreitet und

erfüllt dort die Funktion, Natrium aus der Zelle ins Interstitium zu transportieren,

meist um einen Gradienten für die Natriumresorption aus dem Tubulus in die Zelle

zu schaffen, und im Gegenzug Kalium in die Zelle zu bringen, das diese dann durch

Kaliumkanäle entsprechend des Gradienten wieder verlässt. Damit ist sie ent-

scheidender Antrieb für die Salz- und Wasserresorption. Da die Na+-K+-ATPase in

der Niere so weit verbreitet ist, lässt sich durch die Ergebnisse dieser Arbeit natürlich

keine Aussage machen wie sie sich in bestimmten Bereichen der Niere verändert,

sondern es ist nur eine Aussage für die komplette Niere möglich. Für diese lässt sich

die Beobachtung machen, dass sich unter der Furosemidgabe an die C57Bl6-Mäuse

eine Zunahme der Konzentration der Na+-K+-ATPase mRNA feststellen lässt, wobei

in dieser Arbeit die α-1 Untereinheit untersucht wurde.

Im Jahr 2000 machten Merino et al. die Beobachtung, dass sich die mRNA der Na+-

K+-ATPase (α-1 Untereinheit) in Kortex, sowie äußerer Medulla und innerer

Medulla nicht verändert, wenn den Versuchstieren Furosemid verabreicht wurde.

Allerdings muss angemerkt werden, dass es sich bei den verwendeten Tieren um

Ratten handelte, andere Verfahren zur Bestimmung der mRNA-Konzentration ver-

wendet wurden und natürlich muss auch der Aspekt in Betracht gezogen werden,

dass die Versuchsdauer in diesem Fall nur 7 Tage (Merino et al. 2000, s. auch Tab.

3) und nicht wie in vorliegender Arbeit 10 Tage betrug, so dass die Unterschiede

auch hierdurch begründet sein können .

Buffin-Meyer et al. beschrieben 2004, dass die Proteinaktivität der Na+-K+-ATPase

unter der Gabe des Schleifendiuretikums Furosemid im Sammelrohr zunahm

(Buffin-Meyer et al. 2004). Hier besteht natürlich die Möglichkeit, dass diese

Diskussion 65

Erhöhung der Aktivität durch eine erhöhte Konzentration oder durch katalytische

Faktoren gesteuert sein kann. Demnach ist auch eine erhöhte Transkription der

mRNA in Betracht zu ziehen.

Eine weitere Beobachtung in der vorliegenden Arbeit ist, dass sich die mRNA-

Konzentrationen der ATPase unter Furosemidgabe bei den COX-2-/-, sowie den

EP4-/- Mäusen nicht signifikant ändern, wenn die Mäuse das Schleifendiuretikum

erhalten. Aus diesen Daten lässt sich vermuten, dass es, vermittelt über COX-2,

dadurch erhöhtem PGE2 und dessen Wirkung am Rezeptor EP4, unter der Gabe von

Furosemid zu einer vermehrten Transkription der Na+-K+-ATPase kommt. Betrachtet

man diese Annahme im Zusammenhang mit der Beobachtung von Buffin-Meyer et

al., dass die Proteinaktivität im Sammelrohr zunimmt, lässt sich die folgende

Hypothese aufstellen: Zum Ausgleich des erhöhten Wasser- und Salzverlustes unter

Furosemidgabe, wird die Konzentration der Na+-K+-ATPase im Sammelrohr

(wahrscheinlich über die vermehrte Transkription) erhöht, um im Zusammenspiel

mit anderen Kanälen (z.B. dem epithelialen Natrium-Kanal - ENaC, siehe unten) die

Natriumrückresorption zu fördern. Um weiteren Aufschluss über diese These zu

erhalten, sind detailliertere Untersuchungen der Veränderung der Na+-K+-ATPase

sowohl auf Protein, als auch auf mRNA Ebene in bestimmten Bereichen der Niere

notwendig.

Wie bereits erwähnt befindet sich der epitheliale Natriumkanal (ENaC) vor allem im

Sammelrohr der Niere. Na et al. konnten 2003 an Ratten zeigen, dass die Expression

der Untereinheiten β und γ dieses Kanals auf Proteinebene im Kortex zunimmt, wenn

den Ratten Furosemid verabreicht wurde. In der äußeren Medulla fanden sie sogar

für die β-Untereinheit eine sehr starke und die γ-Untereinheit eine starke Zunahme,

unter den zuvor genannten Bedingungen (Na et al. 2003).

Wie oben gezeigt, war auch in der vorliegenden Arbeit bei den C57Bl6-Mäusen eine

signifikante Zunahme unter derselben Medikation zu beobachten, die mRNA

Konzentration stieg sowohl für die β-, als auch für die γ-Untereinheit an.

Eine andere Beobachtung lässt sich bei den COX-2-/- Mäusen machen. Bei beiden

Untereinheiten ist keine signifikante Veränderung zu erkennen, bei ENaC β ist aber

ein tendenzieller Anstieg zu sehen.

Diskussion 66

Dagegen ist aus den Ergebnissen für die EP4-/- Mäuse ersichtlich, dass die Unter-

einheit β des ENaC-Kanals unter der Gabe des Schleifendiuretikums einen signi-

fikanten Einbruch in der Konzentration der mRNA zeigt, während es für die γ-

Untereinheit zu keiner Konzentrationsveränderung kommt.

Aus diesen Daten lässt sich die Hypothese aufstellen, dass COX-2 einen positiven

Einfluss auf die Kanalexpression von ENaC (γ-, aber auch β-Untereinheit) hat und

diese über PGE2 und den EP4-Rezeptor ablaufen. Da es sich bei EP4 um einen

Prostaglandin-E2-Rezeptor handelt und es bei der β-Untereinheit zu einer derart

starken Abnahme kommt, ist die Annahme berechtigt, dass es sich bei dem hier be-

teiligten Prostaglandin, um zusätzlich von der Cyclooxygenase-1 katalysiertes

handelt. Dazu passt die Beobachtung, dass im Sammelrohr sehr viel COX-1 ex-

primiert ist und bei den COX-2-/- Mäusen, für ENaC β tendenziell ein Anstieg der

mRNA-Konzentration zu verzeichnen ist, der ähnlich hoch wie bei den C57Bl6-

Mäusen ausfällt (im Gegensatz dazu aber nicht signifikant ist). Es liegt hier also die

Vermutung nahe, das ENaC β vornehmlich über COX-1 und ENaC γ zum größten

Teil über COX-2 reguliert werden, es also für beide Untereinheiten unterschiedliche

Regulationsmechanismen gibt. Diese Beobachtung ist insofern interessant, als dass

man weiß, das ENaC α unabhängig von den beiden anderen Kanaluntereinheiten

reguliert wird.

Wie auch schon bei der Na+-K+-ATPase erwähnt, passt der vermutete Regulations-

mechanismus gut zu der Annahme, dass unter der Gabe des Diuretikums versucht

wird, in den distalen Bereichen des Nephrons das zuvor entstandene Resorptions-

defizit auszugleichen. Der größte Resorptionsanteil liegt aber im proximalen

Tubulus, daher ist dies nur bedingt möglich.

Da der Verlust von Wasser und Salzen bei den COX-2-/- und den EP4-/- Mäusen nicht

mehr so hoch ist, ist die reaktive Zunahme bei Gabe des Diuretikums an diese Mäuse

auch nicht mehr nötig.

Bei der Hochregulation von ENaC und der Na+-K+-ATPase darf aber auch die

Möglichkeit eines anderen Feedbackmechanismus nicht vergessen werden. In diesem

Fall wäre durch den hohen renalen Wasser- und Mineralienverlust ebenfalls eine

erhöhte Rückresorption nötig. Da durch die in der Henle Schleife runterregulierten

Kanäle, sowie der Downregulierung von NCCT, ein Konzentrationsdefizit bestünde,

würde die Niere in diesem Fall versuchen, dieses dann über distal gelegene Kanäle

auszugleichen. Dabei würden ENaC und die Na+-K+-ATPase nur indirekt über das

Diskussion 67

von den Cyclooxygenasen produzierte PGE2 beeinflusst, nämlich über die Re-

gulation der Kanäle in der Henle-Schleife und von NCCT. Auch hier sind weitere

Untersuchungen nötig.

Zusätzlich wurden die SGK (Serum- und Glucocorticoid-regulierte Kinase) als

Stimulator von ENaC und Nedd-4 (neuronal precusor cell expressed developmentally

down-regulated 4), das beim ENaC Abbau eine Rolle spielt, untersucht.

Erstaunlicherweise war bei SGK eine Abnahme (signifikant) der mRNA-Kon-

zentration zu sehen, wenn man den C57Bl6-Mäusen das Schleifendiuretikum

verabreichte. Ebenso verhielt es sich bei den EP4-/- Mäusen, während sich für die

COX-2-/- Mäuse kein signifikanter Unterschied feststellen ließ. Diese Ergebnisse

passen nicht zu der Erwartung, dass SGK, wie auch ENaC hochreguliert werden,

wenn der Salz- und Wasserverlust steigt. Möglicherweise handelt es sich hierbei um

einen Feedbackmechanismus mit ENaC.

Betrachtet man die Nedd-4 Ergebnisse, so wird klar, dass es hier nicht zu

signifikanten Veränderungen der Protein-mRNA kommt. Nedd-4 scheint daher an

der Regulation bei Furosemidgabe nicht entscheidend teilzunehmen.

Diskussion 68

Abb. 58 Schaubild zur möglichen Wirkung der Cyclooxygenase-1 und -2 im Sammelrohr der Niere

Furosemid

COX-2 ⇑ vermehrter NaCl-/H2O-Verlust COX-1/-2 ⇑ PGE2 ⇑

HPS vermehrte Bindung EP4-Rezeptor Na+-K+-ATPase α1 ⇑

ENaC β,γ ⇑ HPS = Hyperprostaglandin-E2-Syndrom

Daraus lässt sich abschließend die Vermutung aufstellen, dass unter den Beding-

ungen des vermehrten Wasser- und Salzverlustes, wie es beim antenatalen Bartter-

Syndrom sowie bei der Furosemidgabe der Fall ist, folgendes Kompensationsschema

greift: Die Cyclooxygenase-2 bildet vermehrt Prostaglandin-E2, dieses stimuliert den

EP4-Rezeptor, der seinerseits auf mRNA-Ebene dafür sorgt, dass die Natrium-

Kalium-ATPase (α1-Untereinheit) und ENaC γ vermehrt, während SGK, eventuell

über einen Feedbackmechanismus, vermindert produziert werden. Die COX-1 ist

möglicherweise für die Hochregulation von ENaC β, über EP4, verantwortlich.

Natürlich müssen diese Vermutungen durch weitere Versuche, vor allem der tat-

sächlichen Proteinexpression und auch der Messung der Cyclooxygenase-1 Kon-

zentration, weiter untersucht werden.

Unterstützend könnte in diesem Fall die über das Renin-Angiotensin-Aldosteron-

System (RAAS) erhöhte ENaC-Konzentration wirken, so dass sich diese Mech-

anismen vermutlich ergänzen, da durch Aldosteron vor allem die α-Untereinheit des

ENaC-Proteins erhöht wird (Masilamani et al. 1999).

Auch die Beobachtung, dass die Hemmung der Cyclooxygenase-2 zu einer

verringerten Ausscheidung führt, steht dazu nicht im Widerspruch, da, wie oben be-

reits diskutiert, die Regulation der Urinmenge und Konzentration hauptsächlich über

die Kanäle des dicken aufsteigenden Astes der Henle Schleife und des proximalen

Tubulus abläuft.

Diskussion 69

Wenn man nun alle Ergebnisse der vorliegenden Arbeit im Zusammenhang be-

trachtet, lässt sich sagen, dass die Kanalexpressionen von NKCC2, ROMK, KCC1,

3, 4, sowie NCCT von COX-2 produziertem PGE2 vermindert werden können und

zusätzlich ein oder mehrere Kanäle gehemmt bzw. defekt sein können, was im Zu-

sammenspiel zum exzessiven Salz- und Wasserverlust führt. Auf der anderen Seite

wird, wie oben bereits erläutert, versucht, durch die im Sammelrohr exprimierten

Cyclooxygenase-1 und -2, dadurch erhöhtes PGE2, dessen Bindung an EP4 und die

resultierende Hochregulation der Proteine Na+-K+-ATPase und ENaC, den zuvor

entstandenen Verlust auszugleichen. Dies geschieht im Zusammenspiel mit dem über

COX-2 aktivierten RAAS (s. Abb. 59). Dass ein Ausgleich dieses Verlustes nicht

vollständig möglich ist, hängt damit zusammen, dass im Sammelrohr normalerweise

nur noch die Feinregulation stattfindet und daher der große Verlust aus dem Bereich

der Henle Schleife nur eingeschränkt werden kann.

Es stellt sich an dieser Stelle die Frage, warum es durch erhöhtes PGE2 überhaupt zu

einer Steigerung der Ausscheidung kommt.

Im gesunden Organismus ist dies durchaus als sinnvoll anzusehen, da PGE2 als

Entzündungsmediator zu einer erhöhten Durchblutung im Bereich des Entzündungs-

gebiets, sowie der Niere führt und es durch die vermehrte Ausscheidung über die

Niere zu einer Reduktion eventueller Giftstoffe im Körper kommen kann. Im Falle

einer Erkrankung wie dem antenatalen Bartter-Syndrom aber, kann es durch die

vermehrte renale Ausscheidung zu lebensbedrohlichen Dehydratationszuständen,

sowie Mineralstoffmangel kommen. Um die Behandlungsmöglichkeiten für die meist

jungen Patienten zu verbessern, sind zusätzliche und weiterführende Grundlagen-

forschungen auf diesem Gebiet unverzichtbar.

Diskussion 70

Abb. 59 Schaubild zur möglichen Wirkung des Furosemid/ Pathogenese des antenatalen Bartter-Syndroms

Furosemid

Blockade bzw. Defekt von NKCC2 oder ROMK NaCl- und H2O-Ver Cl--Konz. in

HPS im dicken aufsteigenden Teil der Henle Schleife lust über Niere ⇑ JG-Zellen ⇓

COX-2 in TAL

Henle-Schleife, dist. Tubulus JG-Zellen ⇑

COX-2 ⇑ NKCC2/ROMK

COX-1 und -2 Bindung am PGE2 mRNA in TAL/ PGE2 in TAL

im Sammelrohr ⇑ EP4-Rezeptor NKCC-2 ⇓ JG-Zellen ⇓ JG-Zellen ⇑

ROMK ⇓

PGE2 im KCC1,3,4 ⇓ Bindung am

Sammelrohr ⇑ NCCT ⇓ EP4-Rezeptor

Na+-K+-ATPase α1 ⇑ Natriumrückresorption Renin

ENaC β,γ ⇑ im Sammelrohr über ENaC α ⇑ Aktivierung des

erhöhtes ENaC RAAS

HPS = Hyperprostaglandin-E2-Syndrom; NKCC2 = Natrium-Kalium-2Chlorid-Kotransporter; ROMK =

Kaliumkanal; COX = Cyclooxygenase; PGE2 = Prostaglandin-E2; TAL = dicker aufsteigender Ast der Henle

Schleife; JG-Zellen = juxtaglomeruläre Zellen; RAAS = Renin-Angiotensin-Aldosteron-System; Na+-K+-ATPase

= Natrium-Kalium-ATPase; ENaC = epithelialer Natriumkanal; SGK = Serum- und Glucocorticoid-regulierte

Kinase; Nedd-4 = neuronal precusor cell expressed developmentally down-regulated 4; EP4 =

Prostaglandinrezeptor

Zusammenfassung und Abstract 71

V. Zusammenfassung und Abstract V.1. Zusammenfassung

Das Hyperprostaglandinsyndrom (HPS), auch antenatales Bartter-Syndrom genannt,

stellt eine Salzverlusttubulopathie dar, die durch Mutationen in den Genen für die

Proteine NKCC2, ROMK, Barttin oder ClC-Kb hervorgerufen werden kann.

Klinisch ist ein massiver Salzverlust zu beobachten, der einhergeht mit stark erhöhter

Reninaktivität (aktiviertes RAAS) und einer hohen PGE2-Ausscheidung. Unbe-

handelt führt diese Erkrankung zum Tod des Kindes. Durch lebenslange Gabe eines

Prostglandinsynthese-Hemmers, wie dem Indomethacin, und ausreichende Salz- und

Wasseraufnahme, ist eine wesentliche Unterdrückung der Symptomatik zu erreichen.

Verschiedene Arbeiten weisen auf eine pathogenetische Rolle des Enzyms COX-2

(verantwortlich für die PGE2-Bildung) und des PGE2-Rezeptorsubtyps EP4 hin.

Die Erkrankung des HPS wurde im Tiermodell durch die Gabe des NKCC2-Hemm-

stoffs Furosemid, einem Schleifendiuretikum, simuliert. Dieses wurde über 10 Tage

mittels Trinkwasser kontinuierlich zugeführt. Ziel der Arbeit war, Expressionsver-

änderungen verschiedener Proteine, die am Elektrolyttransport der Niere beteiligt

sind, zu untersuchen. Diese Untersuchungen wurden an C57Bl6-Wildtypmäusen ver-

gleichend zu COX-2- und EP4-Knockout-Mäusen durchgeführt.

Die Nieren behandelter und nichtbehandelter Tiere (Gruppengröße n=12) wurden

entnommen, die RNA isoliert und anschließend die mRNA der Proteine NKCC2,

ROMK, KCC1, 3, 4, ClC-K1, NCCT, Na+-K+-ATPase, ENaC β und γ, SGK und

Nedd-4 mittels PCR-Technik untersucht. Die relative mRNA-Expression wurde auf

die von GAPDH normiert.

Die durchgeführten Analysen zeigen, dass NKCC2, ROMK, sowie die Kalium-

chloridkanäle KCC1, 3, 4 und auch NCCT unter der Gabe von Furosemid bei den

Wildtypmäusen (C57Bl6), herunterreguliert wurden, bei den COX-2-/- Mäusen

hingegen waren die mRNA-Konzentrationen nicht erniedrigt, beim ROMK-Kanal

waren sie sogar erhöht. Diese Beobachtung weist auf eine Expressionsregulation

über die Cyclooxygenase-2 und PGE2 hin und dies könnte zum klinisch beobachteten

Wasser- und Salzverlust beitragen. Untersuchungen an EP4-/- Mäusen weisen darauf

hin, dass diese PGE2-abhängige Regulation, außer im Fall von KCC1, 3 und 4, über

den EP4 Rezeptor vermittelt wird.


Ein anderes Bild ist für die Expression des Natriumkanals ENaC zu beobachten. Die

untersuchten β- und γ- Untereinheiten zeigen unter der Gabe von Furosemid eine

Zunahme der mRNA-Konzentrationen beim Wildtyp, während sich bei den COX-2-/-

Mäusen keine signifikanten Änderungen zeigen. Erstaunlicherweise war bei den

EP4-Rezeptor-/- Mäusen ein deutlicher Abfall der β-Untereinheit zu verzeichnen,

während bei der γ-Untereinheit kein Unterschied nachzuweisen war.

Es ist bekannt, dass infolge des Ausfalls bzw. der Hemmung von NKCC2 oder

ROMK ein erhöhter renaler Wasser- und Salzverlust aufgrund mangelnder Konzen-

trierungsfähigkeit im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife vorliegt. Außer-

dem wird vermutet, dass aus dem gleichen Grund im juxtaglomerulären Apparat,

über die verminderte Chloridkonzentration, die COX-2 und die Reninexpression

gesteigert wird. Würden nun die ohnehin gehemmten oder vermindert exprimierten

Kanäle noch zusätzlich über COX-2 herunterreguliert, wie es die Ergebnisse

annehmen lassen, wäre ein Circulus vitiosus von erniedrigter Kanalkonzentration

erhöhter COX-2 Konzentration erniedrigter Kanalkonzentration gegeben, der

durch die Gabe eines COX-2 Hemmers durchbrochen werden könnte.

Auf der anderen Seite lassen die Ergebnisse eine weitere Annahme zu: Neben dem

schon bekannten Regulationsmechanismus über das erhöhte Renin, der über eine

Aktivierung des RAAS zu einer erhöhten α-ENaC Konzentration führt, scheinen

parallel dazu die β- und γ-Untereinheiten des Natriumkanals hochreguliert zu wer-

den. Dieser Mechanismus läuft im Fall von ENaC γ vermutlich über die Cyclo-

oxygenase-2 und den Rezeptor EP4 ab. Die Cyclooxygenase-1, die wie ENaC auch

stark im Sammelrohr exprimiert wird, könnte für das erhöhte PGE2 verantwortlich

sein, das möglicherweise ebenfalls über EP4 zur Hochregulation von ENaC β führt.

Dieser Mechanismus wurde in der vorliegenden Studie jedoch nicht überprüft. Damit

würden die drei Untereinheiten zwar parallel zueinander hochreguliert und somit

eine Wirkungsverstärkung erreichen, allerdings über unterschiedliche Mechanismen.

Es bleibt zu bedenken, dass der Salz- und Wasserverlust durch die Vorgänge im

Sammelrohr nur vermindert wird, da ein wesentlicher Teil der Harnkonzentrierung

im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife stattfindet, in der ein defekter oder

blockierter Kanal die Ausschöpfung des vollen Konzentrationspotentials nicht zu-

lässt.


Um diese Hypothese weiter zu verfolgen, sind in Zukunft weitere Versuche auf

Grundlage dieser Arbeit nötig, die neben den mRNA-Konzentrationen auch die ent-

sprechenden Proteinkonzentrationen bzw. Kanalaktivitäten messen.


V.2. Abstract

The hyperprostaglandin E syndrome (HPS), which is also known as antenatal Bartter

syndrome, is a salt loss tubulopathy, evoked by mutations in the genes of the proteins

NKCC2, ROMK, Barttin or ClC-Kb. Clinically, a massive salt loss can be seen,

accompanied by enormously increased renin activity (activated RAAS) and high

prostaglandine E2 (PGE2) excretion. If not treated, this disease leads to the death of

the affected child. By lifelong administration of a prostaglandin synthesis inhibitor,

like Indomethacin, and sufficient salt and water intake, considerable suppression of

the symptoms can be achieved. Different papers point out a pathogenetic role of the

enzyme COX-2 (responsible for the generation of PGE2) and the PGE2 receptor-

subtype EP4.

In this study, the HPS was simulated in an animal model, by administering the

NKCC2-inhibitor furosemide, a loop diuretic. It was mixed into the drinking water

for ten days. The aim of this dissertation was to investigate the modifications of

expression of different proteins, which are involved in the transport of electrolytes in

the kidney. These investigations were carried out on C57Bl6 wildtype mice

compared to COX-2 and EP4 knockout mice.

The kidneys of treated and untreated animals (n = 12) were extracted and the RNA

was isolated. Afterwards, the mRNA of the proteins NKCC2, ROMK, KCC1, 3, 4,

ClC-K1, NCCT, Na+-K+-ATPase, EnaC β and γ, SGK and Nedd-4 was examined

using the PCR-technique. The relative expression of mRNA was standardized to that

of GAPDH.

The results of the analysis show that NKCC2, ROMK, as well as the potassium-

chloride-channels KCC1, 3, 4 and NCCT were downregulated by administering

furosemid to C57Bl6-mice, while the mRNA concentrations of the COX-2-/- mice

were not decreased and in the case of ROMK even increased. These observations

indicate that the expression is regulated by Cyclooxygenase-2 and PGE2 and that this

could be one of the reasons for the clinically seen salt and water loss. The

investigations of the EP4-/- mice allow the assumption that this PGE2 related

regulation could be mediated by the EP4 receptor, with the exception of KCC1, 3, 4.

The results are different in terms of the ENaC channel. The investigated subunits β

and γ show an increase of the mRNA-concentrations in the wildtype mice when

furosemide is given, however there were no significant differences for the COX-2-/-


mice. Astonishingly, a significant β subunit decrease of EP4-receptor-/- mice could

be noticed whereas the γ-subunit expression remained stable.

It is postulated that there is an increased water and salt loss caused by the deficit or

the inhibition of NKCC2 or ROMK which leads to inadequate ability for urine to

concentrate in the thick ascending limb of Henle. Furthermore, it is suspected that,

for the same reason, the expression of COX-2 and renin in the juxtaglomerular

apparatus is increased by a decreased chloride concentration. If the already decreased

or inhibited exprimated channels were additionally downregulated by COX-2, as

could be supposed according to the previous results, there would be a circulus

vitiosus of decreased channel concentration increased COX-2 concentration

decreased channel concentration, which could be interrupted by the administering of

a COX-2 inhibitor.

The results also permit a further assumption: Besides the already known mechanism

of regulation by increased renin, which leads to an increased α-ENaC concentration

by RAAS, β- and γ-subunits seem to be simultaneously upregulated to this. This

mechanism is probably regulated by Cyclooxygenase-2 and the receptor EP4 for

ENaC γ. Cyclooxygenase-1, which is, like ENaC, also strongly exprimated in the

collecting duct, could be responsible for the increased PGE2 which, perhaps via EP4

as well, leads to an increase of ENaC β. This mechanism was not investigated in this

essay. According to that thesis, the three subunits would be simultaneously up-

regulated which would cause a stronger effect, although this would be achieved by

different mechanisms.

It should be considered, that salt and water loss is only decreased by the processes in

the collecting duct. The reason for this is that a big part of the urine concentration

takes place in the thick ascending limb of Henle, where a defect or inhibited channel

does not allow the exhaustion of the full potential of concentration.

In order to investigate this hypothesis further, more experiments would be necessary

that base on the present examination, which, apart from the mRNA concentration,

measure protein concentration and channel activities as well.

Literatur

VI. Literatur

1. Abdallah JG, Schrier RW, Edelstein C, Jennings SD, Wyse B, Ellison DH

(2001) Loop Diuretic Infusion Increases Thiazide-Sensitive Na+/Cl--

Cotransporter Abundance: Role of Aldosterone. J Am Soc Nephrol 12: 1335–

1341

2. Awayda MS (1999) Regulation of the epithelial Na+ channel by intracellular

Na+. Am J Physiol Cell Physiol 277: C216–C224

3. Barrter FC, Pronove P, Gill JR, MacCardle RC (1962) Hyperplasia of the

juxtaglomerular complex with hyperaldosteronism and hypokalemic

alkalosis. Am J Med 33: 811-828

4. Biner HL, Arpin-Bott MP, Loffing J, Wang X, Knepper M, Hebert SC,

Kaissling B (2002) Human Cortical Distal Nephron: Distribution of

Electrolyte and Water Transport Pathways. J Am Soc Nephrol 13: 836–847

5. Blanco G, Mercer RW (1998) Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogenity in

structure, diversity in function. Am J Physiol 275: F633-F650

6. Bommen M, Brook CGD (1982) Pseudohypoaldosteronism. Response to

long-term treatment with indomethacin. Arch Dis Child 57: 718-720

7. Breyer MD, Breyer RM (2000) Prostaglandin receptors: their role in

regulating renal function. Curr Opin Nephrol Hypertens 9: 23-29

8. Breyer MD, Hao CM, Qi Z (2001) Cyclooxygenase-2 selective inhibitors and

the kidney. Opin Crit Care 7: 393-400

9. Buffin-Meyer B, Younes-Ibrahim M, El Mernissi G, Cheval L, Marsy S,

Grima M, Girolami JP, Doucet A (2004) Differential Regulation of

Collecting Duct Na+,K+-ATPase and K+ Excretion by Furosemide and

Piretanide: Role of Bradykinin. J Am Soc Nephrol 15: 876–884

10. Canessa CM, Schild L, Buell G, Thorens B, Gautschi I, Horisberger JD,

Rossier BC (1994) Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel is made of

three homologous subunits, Nature 367: 463–467

11. Chalfant ML, Denton JS, Berdiev BK, Ismailov, Benos DJ II, Stanton BA

(1999) Intracellular H+ regulates the alphasubunit of ENaC, the epithelial Na+

channel. Am J Physiol Cell Physiol 276: C477–C486

12. Chan LN, Tsang LL, Rowlands DK, Rochelle LG, Boucher RC, Liu CQ,

Chan HC (2002) Distribution and Regulation of ENaC Subunit and CFTR

Literatur

mRNA Expression in Murine Female Reproductive Tract. J Membrane Biol

185: 165-176

13. Chang SS, Grunder S, Hanukoglu A, Rosler A, Mathew PM, Hanukoglu I,

Schild L, Lu Y, Shimkets RA, Nelson-Williams C, Rossier BC, Lifton RP

(1996) Mutations in subunits of the epithelial sodium channel cause salt

wasting with hyperkalaemic acidosis, pseudohypoaldosteronism type 1. Nat

Genet 12: 248–253

14. Chelly J, Kaplan JC, Maire P, Gautron S, Kahn A (1988) Transcription of the

dystrophin gene in human muscle and non-muscle tissue. Nature 333: 858-

860

15. Chen SY, Bhargava A, Mastroberardino L, Meijer OC, Wang J, Buse P,

Firestone GL, Verrey F, Pearce D (1999) Epithelial sodium channel regulated

by aldosterone-induced protein sgk. Proc Natl Acad Sci USA 96: 2514-2519

16. Cossins AR, Gibson JS (1997) Volume-sensitive transport systems and

volume homeostasis in vertebrate red blood cells. J Exp Biol 200: 343–352

17. Crambert G, Geering K (2003) FXDY proteins: new tissue-specific regulators

of the ubiquitous Na,K-ATPase. Sci STKE 2003: RE1

18. Duc C, Farman N, Canessa CM, Bonvalet JP, Rossier BC (1994) Cell-

specific expression of epithelial sodium channel alpha, beta, and gamma

subunits in aldosterone-responsive epithelia from the rat: localization by in

situ hybridization and immunocytochemistry. J Cell Biol 127: 1907–1921

19. Fanconi A, Schachenmann G, Nüssli R, Prader A (1971) Chronic

hypokalemia with growth retardation, normotensive hyperrenin-

hyperaldosteronism (“Bartter’s syndrome“), and hypercalciuria: report of two

cases with emphasis on natural history and catch-up growth during treatment.

Helv Paed Acta 26: 144-163

20. Frengen E, Brede G, Larsen F, Skretting G, Prydz H (1995) Physical linkage

of the gene cluster containing the LCAT gene to the DNA marker D16S124

at human chromosome region 16q22.1. Cytogenet Cell Genet 68: 194–196

21. Frindt G, Palmer LG (1989) Low-conductance K channels in apical

membrane of rat cortical collecting tubule. Am J Physiol 256: F143-F151

22. Garty H, Palmer LG (1997) Epithelial sodium channels: function, structure,

and regulation. Physiol Rev 77: 359–396

Literatur

23. Giebisch G (1995) Renal potassium channels: an overview. Kidney Int 48:

1004-1009

24. Gill JR, Frölich JC, Bowden RE, Taylor AA, Keiser HR, Seyberth HW,

Oates JA, Bartter FC (1976) Bartter’s syndrome: a disorder characterized by

high urinary prostaglandins and a dependence of hyperreninemia on

prostaglandin synthesis. Am J Med 61: 43-51

25. Gillen CM, Brill S, Payne JA, Forbush B III (1996) Molecular cloning and

functional expression of the K-Cl cotransporter from rabbit, rat, and human. J

Biol Chem 271: 16237–16244

26. Gitelman HJ, Graham JB, Welt LG (1966) A new familial disorder

characterized by hypokalemia and hypomagnesemia. Trans Assoc Am

Physicians 79: 221-235

27. Gormley K, Dong Y, Sagnella GA (2003) Regulation of the epithelial sodium

channel by accessory proteins. Biochem J 371: 1-14

28. Greger R, Schlatter E (1983) Properties of the basolateral membrane of the

cortical thick ascending limb of Henle’s loop of rabbit kidney. A model for

secondary active chloride transport. Pflügers Arch 396: 325–334

29. Haas M, Forbush B III (2000) The Na-K-Cl cotransporter of secretory

epithelia. Annu Rev Physiol 62: 515–534

30. Hager H, Kwon TH, Vinnikova AK, Masilamani S, Brooks HL, Frøkiaer J,

Knepper MA, Nielsen S (2001) Immunocytochemical and immunoelectron

microscopic localization of α-, β-, and γ-ENaC in rat kidney. Am J Physiol

Renal Physiol 280: F1093–F1106

31. Hansson JH, Nelson-Williams C, Suzuki H, Schild L, Shimkets R, Lu Y,

Canessa C, Iwasaki T, Rossier B, Lifton RP (1995) Hypertension caused by a

truncated epithelial sodium channel gamma subunit: genetic heterogeneity of

Liddle’s syndrome. Nat Genet 11: 76–82

32. Hasler U, Wang X, Crambert G, Beguin P, Jaisser F, Horisberger JD, Geering

K (1998) Role of beta-subunit domains in the assembly, stable expression,

intracellular routing, and functional properties of Na,K-ATPase. J Biol Chem

273: 30826-30835

33. Hebert SC (2003) Bartter syndrome. Curr Opin Nephrol Hypertens 12: 527-

532

Literatur

34. Holtzman EJ, Kumar S, Faaland CA, Warner F, Logue PJ, Erickson SJ,

Ricken G, Waldman J, Kumar S, Dunham PB (1998) Cloning,

characterization and gene organization of K-Cl cotransporter from pig and

human kidney and C. elegans. Am J Physiol 275 (Renal Physiol 44): F550–

F564

35. Kahn KNM, Paulson SK, Verburg KM, Lefkowith JB, Maziasz TJ (2002)

Pharmacology of cyclooxygenase-2 inhibition in the kidney. Kidney Int 61:

1210-1219

36. Kamynina E, Tauxe C, Staub O (2001) Distinct characteristics of two human

Nedd4 proteins with respect to epithelial Na+ channel regulation. Am J

Physiol 281: F469-F477

37. Károlyi L, Konrad M, Köckerling A, Ziegler A, Zimmermann DK, Roth B,

Wieg C, Grzeschik KH, Koch MC, Seyberth HW, Vargas R, Forestier L, Jean

G, Deschaux M, Rizzoni GF, Niaudet P, Antignac C, Feldmann D, Lorridon

F, Cougoureux E, Laroze F, Alessandri JL, David L, Saunier P, Deschenes G,

Hildebrandt F, Vollmer M, Proesmans W, Brandis M, van den Heuvel LPWJ,

Lemmink HH, Nillesen W, Monnens LAH, Knoers NVAM, Guay-Woodford

LM, Wright CJ, Madrigal G, Hebert SC (1997) Mutations in the gene

encoding the inwardlyrectifying renal potassium channel, ROMK, cause the

antenatal variant of Bartter syndrome: Evidence for genetic heterogeneity.

Hum Mol Genet 6: 17–26

38. Kemendy AE, Kleyman TR, Eaton DC (1992) Aldosterone alters the open

probability of amiloride-blockable sodium channels in A6 epithelia. Am J

Physiol Cell Physiol 263: C825–C837

39. Kleyman TR, Ernst SA, Coupaye-Gerard B (1994) Arginine vasopressin and

forskolin regulate apical cell surface expression of epithelial Na+ channels in

A6 cells. Am J Physiol Renal Fluid Electrolyte Physiol 266: F506–F511

40. Köckerling A, Reinalter S, Seyberth HW (1996) Impaired response to

furosemide in hyperprostaglandin E syndrome: evidence for a tubular defect

in the Loop of Henle. J Pediatr 129: 519-528

41. Köckerling A, Konrad M, Seyberth HW (1998) Hereditäre Tubulopathien mit

Diuretika-ähnlichem Salzverlust. Dt Ärztebl 95, Heft 30: A 1841-1846

Literatur

42. Kömhoff M, Jeck ND, Seyberth HW, Grone HJ, Nüsing RM, Breyer MD

(2000) Cyclooxygenase-2 expression is associated with the renal macula

densa of patients with Bartter-like syndrome. Kidney Int 58: 2420-2424

43. Kumar S, Warner F, Logue P, Dunham PB, Holtzman EJ (1996) Cloning of a

novel member of the bumetanide/ thiazide-sensitive inorganic ion

cotransporter family: a new subgroup and a candidate gene for the K-Cl

cotransporter (Abstract). J Am Soc Nephrol 7: 1283

44. Landau D, Shalev H, Ohaly M, Carmi R (1995) Infantile variant of Bartter

syndrome and sensorineural deafness: A new autosomaal recessive disorder.

Am J Med Genet 59: 454–459

45. Lauf PK, Bauer J, Adragna NC, Fujise H, Zade-Oppen AM, Ryu KH, Delpire

E (1992) Erythrocyte K-Cl cotransport: properties and regulation. Am J

Physiol Cell Physiol 263: C917–C932

46. Lemmink HH, Knoers NVAM, Károlyi L, van Dijk H, Niaudet P, Antignac

C, Guay-Woodford LM, Goodyer PR, Carel JC, Hermes A, Seyberth HW,

Monnens LAH, van den Heuvel LPWJ (1998) Novel mutations in the

thiazide-sensitive NaCl cotransporter gene in patients with Gitelman

syndrome with predominant localization to the C-terminal domain. Kidney

Int 54: 720–730

47. Liapis H, Nag M, Kaji DM (1998) K-Cl cotransporter expression in the

human kidney. Am J Physiol 275 (Cell Physiol. 44): C1432–C1437

48. Liddle GW, Bledsoe T, Coppage WS Jr. (1963) A familial renal disorder

simulating primary aldosteronism but with negligible aldosterone secretion.

Trans Assoc Am Physicians 76: 199-213

49. Loffing J, Pietri L, Aregger F, Bloch-Faure M, Ziegler U, Meneton P, Rossier

BC, Kaissling B (2000) Differential subcellular localization of ENaC subunits

in mouse kidney in response to high- and low-Na diets. Am J Physiol Renal

Physiol 279: F252–F258

50. Lucking K, Nielsen JM, Pedersen PA, Jorgensen PL (1996) Na-K-ATPase

isoform (alpha 3, alpha 2, alpha 1) abundance in rat kidney estimated by

competitive RT-PCR and ouabain binding. Am J Physiol 271: F253-F260

51. Lytle C, Xu JC, Biemesderfer D, Forbush B III (1995) Distribution and

diversity of Na-K-Cl cotransport proteins: a study with monoclonal

antibodies. Am J Physiol 269: C1496–1505

Literatur

52. Malik B, Schlanger L, Al-Khalili O, Bao HF, Yue G, Price SR, Mitch WE,

Eaton DC (2001) Enac degradation in A6 cells by the ubiquitin-proteosome

proteolytic pathway. J Biol Chem 276: 12903-12910

53. Marunaka Y, Hagiwara N, Tohda H (1992) Insulin activates single amiloride-

blockable Na channels in a distal nephron cell line (A6). Am J Physiol Renal

Fluid Electrolyte Physiol 263: F392–F400

54. Masilamani S, Kim GH, Mitchell C, Wade JB, Knepper MA (1999)

Aldosterone-mediated regulation of ENaC α, β, and γ subunit proteins in rat

kidney. J Clin Invest 104: R19-R23

55. Merino A, Moreno G, Mercado A, Bobadilla NA, Gamba G (2000)

Na(+):K(+):ATPase mRNA expression in the kidney during adaptation to

sodium intake and furosemide treatment. Arch Med Res 31(5):486-492

56. Moreno G, Merino A, Mercado A, Herrera JP, Gonzalez-Salazar J, Correa-

Rotter R, Hebert SC, Gamba G (1998) Electroneutral Na-coupled

cotransporter expression in the kidney during variations of NaCl and water

metabolism. Hypertension 31:1002–1006

57. Mount DB, Baekgaard A, Hall AE, Plata C, Xu J, Beier DR, Gamba G,

Hebert SC (1999) Isoforms of the Na-K-2Cl cotransporter in murine TAL. I.

Molecular characterization and intrarenal localization. Am J Physiol Renal

Physiol 276: F347– F358

58. Mount DB, Delpire E, Gamba G, Hall AE, Poch E, Hoover RS, Hebert SC

(1998) The electroneutral cation-chloride cotransporters. J Exp Biol 201:

2091–2102

59. Mount DB, Mercado A, Song L, Xu J, George AL, Delpire E Jr., Gamba G

(1999) Cloning and Characterization of KCC3 and KCC4, New Members of

the Cation-Chloride Cotransporter Gene Family. J Biol Chem 274: 16355-

16362

60. Na KY, Oh YK, Han JS, Joo KW, Lee JS, Earm JH, Knepper MA, Kim GH

(2003) Upregulation of Na+ transporter abundances in response to chronic

thiazide or loop diuretic treatment in rats. Am J Physiol Renal Physiol 284:

F133–F143

61. Naesens M, Steels P, Verberckmoes R, Vanrenterghem Y, Kuypers D (2004)

Bartter’s and Gitelman’s Syndromes: From Gene To Clinic. Nephron Physiol

96: 65-78

Literatur

62. Naray-Fejes-Toth A, Fejes-Toth G (2000) The sgk, an aldosterone-induced

gene in mineralcorticoid target cells, regulates the epithelial sodium channel.

Kidney Int 57: 1290-1294

63. Nielsen S, Maunsbach AB, Ecelbarger CA, Knepper MA (1998)

Ultrastructural localization of Na-K-2Cl cotransporter in thick ascending limb

and macula densa of rat kidney. Am J Physiol Renal Physiol 275: F885–F893

64. Nüsing RM, Reinalter SC, Peters M, Kömhoff M, Seyberth HW (2001)

Pathogenetic role of cyclooxygenase-2 in hyperprostaglandin E Syndrome /

antenatal Bartter syndrome: Therapeutic use of the cyclooxygenase-2

inhibitor nimesulide. Clin Pharmacol Ther 70: 384-390

65. Nüsing RM, Treude A, Weissenberger C, Jensen B, Bek M, Wagner C,

Narumiya S, Seyberth HW (2005) Dominant role of prostaglandin E2 EP4-

receptor in furosemide-induced salt losing tubulopathy: a model for the

hyperprostaglandin E syndrome/antenatal Bartter syndrome. J Am Soc

Nephrol 16: 2354-2362

66. Obermuller N, Kunchaparty S, Ellison DH, Bachmann S (1996) Expression

of the Na-K-2Cl cotransporter by macula densa and thick ascending limb

cells of rat and rabbit nephron. J Clin Invest 98: 635–640

67. Palmer LG, Frindt G (1987) Effects of cell Ca and pH on Na channels from

rat cortical collecting tubule. Am J Physiol Renal Fluid Electrolyte Physiol

253: F333–F339

68. Payne JA (1997) Functional characterization of the neuronal-specific K-Cl

cotransporter: implications for [K] regulation. Am J Physiol 273 (Cell Physiol

42): C1516–C1525

69. Payne JA, Stevenson TJ, Donaldson LF (1996) Molecular characterization of

a putative K-Cl cotransporter. J Biol Chem 271: 16245–16252

70. Plotkin MD, Kaplan MR, Verlander JW, Lee W-S, Brown D, Poch E,

Gullans SR, Hebert SC (1996) Localization of the thiazide sensitive Na-Cl

cotransporter, rTSC, in the rat kidney. Kidney Int 50: 174 –183

71. Qi Z, Hao CM, Langenbach RI, Breyer RM, Redha R, Morrow JD, Breyer

MD (2002) Opposite effects of cyclooxygenase-1 and -2 activity on the

pressor response to angiotensin II. J Clin Invest 110: 61-69

Literatur

72. Rampini S, Furrer J, Keller HP, Bucher H, Zachmann M (1978) Congenital

pseudohypoaldosteronism: case report and review. Helv Paediat Acta 33:

153-167

73. Reinalter SC, Jeck N, Brochhausen C, Watzer B, Nüsing RM, Seyberth HW,

Kömhoff M (2002) Role of cyclooxygenase-2 in hyperprostaglandin E

syndrome/antenatal Bartter syndrome. Kidney Int 62: 253-260

74. Rosenbaum P, Hughes M (1957) Persistent, probaply congenital,

hypokalemic metabolic alkalosis with hyaline degeneration of renal tubules

and normal urinary aldosterone. Am J Dis Child 94: 56

75. Saito-Ohara F, Uchida S, Takeuchi Y, Sasaki S, Hayashi A, Marsumo F,

Ikeuchi T (1996) Assignment of the genes encoding the human chloride

channels, CLCNKA and CLCNKB, to 1p36 and of CLCN3 to 4q32–q33 by

in situ hybridization. Genomics 36: 372–374

76. Schlingmann KP, Konrad M, Jeck N, Waldegger P, Reinalter SC, Holder M,

Seyberth HW, Waldegger S (2004) Brief Report: Salt Wasting and Deafness

Resulting from Mutations in Two Chloride Channels. N Engl J Med Volume

350 (13): 1314-1319

77. Schmitt R, Ellison DH, Farman N, Rossier BC, Reilly RF, Reeves WB,

Oberbaumer I, Tapp R, Bachmann S (1999) Developmental expression of

sodium entry pathways in rat nephron. Am J Physiol Renal Physiol 276:

F367–F381

78. Schwartz ID, Alon US (1996) Bartter syndrome revisited. J Nephrol 9: 81-87

79. Seidel C, Reinalter SC, Seyberth HW, Schärer K (1995) Prepubertal growth

in the hyperprostaglandin E syndrome. Pediatr Nephrol 9: 723-728

80. Seyberth HW, Leonhardt A, Soergel M (1994) Das Hyperprostaglandin-E2-

Syndrom. Monatsschr Kinderheilkd 142: 392-395

81. Seyberth HW, Rascher W, Schweer H, Kühl PG, Mehls O, Schärer K (1985)

Congenital hypokalemia with hypercalciuria in preterm infants: a

hyperprostaglandinuric tubular syndrome different from Bartter syndrome. J

Pediatr 107: 694-701

82. Seyberth WH, Soergel M, Köckerling A (1998) Hypokalaemic tubular

disorders: the hyperprostaglandin E syndrome and Gitelman-Bartter

syndrome. In: Davison AM, Cameron JS, Grünfeldt JP, Kerr DNS, Ritz E,

Literatur

Winearls CG: Oxford Textbook of Clinical Nephrology, 2nd edition. Oxford,

New York, Tokyo: Oxford University Press, 1085-1093

83. Shankar SS, Brater DC (2003) Loop diuretics: from the Na-K-2Cl transporter

to clinical use. Am J Physiol Renal Physiol 284: F11-F21

84. Shimkets RA, Warnock DG, Bositis CM, Nelson-Williams C, Hansson JH,

Schambelan M, Gill JR Jr, Ulick S, Milora RV, Findling JW (1994) Liddle’s

syndrome: heritable human hypertension caused by mutations in the beta

subunit of the epithelial sodium channel. Cell 79: 407–414

85. Shuck ME, Bock JH, Benjamin CW, Tsai TD, Lee KS, Slightom JL,

Bienkowski MJ (1994) Cloning and characterization of multiple forms of the

human kidney ROM-K potassium channel. J Biol Chem 269: 24261-24270

86. Simon DB, Karet FE, Rodriguez-Soriano J, Hamdan JH, DiPietro A,

Trachtman H, Sanjad SA, Lifton RP (1996) Genetic heterogeneity of

Bartter’s syndrome revealed by mutations in the K+ channel, ROMK. Nat

Genet 14: 152–156

87. Simon DB, Nelson-Williams C, Bia MJ, Ellison D, Karet FE, Molina AM,

Vaara I, Iwata F, Cushner HM, Koolen M, Gainza FJ, Gitelman HJ, Lifton

RP (1996) Gitelman’s variant of Bartter’s syndrome, inherited hypokalaemic

alkalosis, is caused by mutations in the thiazide-sensitive Na-Cl

cotransporter. Nat Genet 12: 24–30

88. Snyder PM, Olson DR, Thomas BC (2002) Serum and glucocorticoid-

regulated kinase modulates Nedd4-2 mediated inhibition of the epithelial Na+

channel. J Biol Chem 277: 5-8

89. Staub O, Dho S, Henry P, Correa J, Ishikawa T, McGlade J, Rotin D (1996)

WW domains of Nedd4 bind to the proline-rich PY motifs in the epithelial

Na+ channel deleted in Liddle’s syndrome. EMBO J 15: 2371-2380

90. Staub O, Yeger H, Plant P, Kim H, Ernst SA, Rotin D (1997)

Immunolocalization of the ubiquitin-protein ligase Nedd4 in tissues

expressing the epithelial Na channel (ENaC). Am J Physiol 272: C1871-

C1880

91. Summa V, Camargo SMR, Bauch C, Zecevic M, Verrey F (2003) Isoform

specifity of human Na+,K+-ATPase localization and aldosterone regulation in

mouse kidney cells. J Physiol 555.2: 355-364

Literatur

92. Takahashi N, Chernavvsky DR, Gomez RA, Igarashi P, Gitelman HJ,

Smithies O (2000) Uncompensated polyuria in a mouse model of Bartter’s

syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 97 No. 10: 5434-5439

93. Tang L, Loutzenhiser K, Loutzenhiser R (2000) Biphasic Actions of

Prostaglandin E2 on the Renal Afferent Arteriole – Role of EP3 and EP4

Receptors. Circ Res 86: 663-670

94. Uchida S (2000) Physiolocical role of CLC-K1 chloride channel in the

kidney. Nephrol Dial Transplant 15 [Suppl 6]: 14-15

95. Vallet V, Chraibi A, Gaeggeler HP, Horisberger JD, Rossier BC (1997) An

epithelial serine protease activates the amiloride-sensitive sodium channel.

Nature 389: 607–610

96. Waldegger S, Jeck N, Barth P, Peters M, Vitzthum H, Wolf K, Kurtz A,

Konrad M, Seyberth HW (2002) Barttin increases surface expression and

changes current properties of ClC-K channels. Eur J Physiol 444: 411-418

97. Wang AM, Doyle MV, Mark DF (1989) Quantitation of m-RNA by the

polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA 86: 9717-9721

98. Warnock DG (1998) Liddle Syndrome: an autosomal dominant form of

human hypertension. Kidney Int 53: 18–24

99. Wolf K, Castrop H, Riegger GA, Kurtz A, Kramer BK (2001) Differential

gene regulation of renal salt entry pathways by salt load in the distal nephron

of the rat. Pflugers Arch 442:498–504

100. Wolf K, Meier-Meitinger M, Bergler T, Castrop H, Vitzthum H, Riegger

GAJ, Kurtz A, Krämer BK (2003) Parallel down-regulation of chloride

channel CLC-K1 and barttin mRNA in the thin ascending limb of the rat

nephron by furosemide. Eur J Physiol 446: 665-671

101. Yoshikawa M, Uchida S, Yamauchi A, Miyai A, Tanaka Y, Sasaki S,

Marumo F (1999) Localization of rat CLC-K2 chloride channel mRNA in the

kidney. Am J Physiol 276: F552–F558

Anhang

VII. Anhang

Verzeichnis der akademischen Lehrer

Meine akademischen Lehrer waren die Damen und Herren:

In Marburg: Aumüller, Adamkiewicz, Barth, Basler, Baum, Becker, Behr,

Bertalanffy, Bien, Christiansen, Cetin, Czubayko, Daut, Eilers, Feuser, Fuchs,

Gerdes, Geus, Gotzen, Gress, Griss, Grzeschik, Gudermann, Hasilik, Hertl,

Hofmann, Jungclas, Kann, Kill, Klenk, Klose, Koolman, Krause, Kretschmer, Krieg,

Kroll, Lang, Langer, Lill, Löffler, Maier, Maisch, Mandrek, Moll, Moosdorf, Müller,

Mueller, Mutters, Neubauer, Nüsing, Oertel, Remschmidt, Renz, Röhm, Rothmund,

Schäfer, Schmidt, Schnabel, Schuhmacher, Seitz, Seyberth, Steiniger, Stiletto,

Studer, Vogelmeier, Voigt, Wagner, Weihe, Werner, Wulf

In Kassel Siebert und in London (St. Helier) Bending

Anhang

Danksagung

Als erstes möchte ich meinem Doktorvater Prof. Dr. Rolf Nüsing für die Überlassung

des Themas und die sehr gute Betreuung während der Durchführung der Arbeit

danken. Er hatte immer ein offenes Ohr und ihm verdanke ich produktive Gespräche,

die sich positiv auf den Fortgang der Arbeit ausgewirkt haben, sowie viele

zusätzliche Ideen.

Des weiteren möchte ich mich bei Anika Schuster und Antje Treude für die

Unterstützung vor allem im Zusammenhang mit den Tierversuchen bedanken, die

mir vieles erleichtert haben, sowie allen anderen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen

der AG Molekulare und Experimentelle Pharmakologie in der Kinderklinik Marburg

für freundliche Hilfe oder einfach nur nette Gespräche, durch die die Arbeit sehr viel

kurzweiliger wurde. Kym Turner danke ich für die Korrektur des Abstracts.

Ein ganz besonderer Dank geht an meine Familie und Großeltern, vor allem aber

meine Eltern für die tolle Unterstützung nicht nur während der Doktorarbeit, sondern

auch für die Ermöglichung des Studiums, ohne das die Arbeit nie zustande

gekommen wäre. Auch bei meiner Freundin Sandra möchte ich mich für den

Beistand, insbesondere während der Abfassung der Arbeit, bedanken.

Documents

mRNA Expression elektrolytregulierender Proteine an der Maus · Prostaglandinbildung und deren Enzym Cyclooxygenase von Bedeutung. I.1. Bartter-Syndrom I.1.1. Einführung Die erste