3. Auf Pharmazie beziigliche. 225

10 ml Wasser versetzt und mit b ml 0,1 n Natronlauge bis zur l~otf~rbung yon Phenolphthalein und naeh Zusatz yon 25 ml Toluol zu Ende a~f Rotf~rbung der

unteren Schicht titriert. Nieotingehalt ergibt sieh daraus zu b. 2,028 %.

H. ZELL~E~.

3. A u f P h a r m a z i e b e z i i g l i e h e M e t h o d e n .

Penicillin. I)O~OT~Y J. t I I seox 1 beschreibt eine Methode zur chemi- sehen Bes t immung yon krystallisiertem Penicillin. Die Methode ist nu r fiir reine Pr~para te anwendba r u n d beruht auf der Oxydat ion des Peniei i l ins du tch Ka l iumeisen( I I I ) - cyan id in alkalischer L5sung. Das durch l~edukt ion en t s t andene Eisen( I I ) -cyanid wird dureh Cer(IV)- sulfat t i t r imet r i seh bes t immt . Die Cer(IV)-sulfatlSsung wird gegen eine s tandardis ier te Eisen(II)-sulfat lSsung eingestellt .

Man nimmt eine 1--5 ml messende Probe mit 0,75--1,25 mg Penicillin und gibt dazu 5 ml 1,5%ger Kaliumeisen(III)-eyanidlSsung. Zu einer zweiten Probe gibt man 5 ml 1,5%iger Eisen(II)-cyanidlSsung, die 4% NaOH enth~lt. ]~eide Proben werden 15 rain im Wasserbad gekocht, abgekiihlt, mit 5 ml 10 n Schwefel- s~ure anges~uert und unter Verwendulig yon Setopalin als Indicator mit 0,1 n Ceri(IV)-sulfatlSsung zuriiektitriert. Ein Leerwert muB in beiden t0gllen ab- gezogen werden. Das Titrationsergebnis der Eisen(II)-cyanidprobe vermindert um das Titrationsergebnis der Eisen(III)-eyanidl0robe ist ein lVial~ fiir c!en Pe- nieillingehalt in tier Probe. Die Menge in Penicillin mg erreehnet sieh naeh der Gleichung: mg P. = 0,0489 + 0,1809996 X, X = ml verbrauehter Cer(IV)- sulfat-L6sung. Der ~ehler betr~gt • 0,04 mg. Bei Verwendung yon Procain- Penicillin lautet die Gleichung: mg P. ~ 0,0054 ~-0,145615 X. Da das 3~ole- kalargewieht yon Penicillin G 334 und yon Procain 236 ist, lassen sich die Er- gebnisse ineinander umreehnen. Ftir Penicillin G stimmen die biologische, jodo- metrische un6 Eisen(III)-cyanidmethode miteinander iiberein. Fiir das Pro- cain-Penicillin werden nach der biologisehen Methode z. ]3. 1003 Einheiten pro mg gefunden, iodometriseh 764 und mi~ Eisen(III)-eyanid 966. Die jodometrisehe Methode liegt also viel zu tier. Die Eisen(III)-eyanidmethode hat den VorteiI, dab sic innerhalb 30 rain ausgefiihr~ werden kann.

K. HIGUO~I lmd W. It . PETE~SO~ 2 bes t immen Penicillin in Fleisch- briihen und Endprodukten auf Grund der A b t r e n n u n g und Bes t immung der sogenann ten l~-S~uregruppe, durch welche die verschiedenen Pen ie i l l i n typen eharakter is ier t werden.

Das Penieillin wird dureh 3stiindiges Koehen mit 5 n Natronlauge hydro- lysiert und die in Freiheit gesetzten S~uren werc!en mit 3 ml Benzol aufgenommen. Diese Si~uren werden dureh Verteilungschromatographie getrennt. Als statio- n~re Phase dient 30 n Sehwefels~ure oder ein Gemiseh yon konz. Schwefels/iure und 85%iger Phosphors~ure, an Celite 545 (einer Infusorienerde) adsorbiert. Die bewegliehe Phase ist Benzol. Die mit Benzol eluierten Fraktionen werden in :Mengen yon je 1 ml aufgefangen und titriert. Es erseheint zuerst die Capril- ~s~ure, dann die Phenylessigs/iure und schlieBlieh die Capronsiiure, wie in Vor- versuehen festgesteltt werden konnte. Das Penicillin F konnte nieht bestimmt werden, well sieh die dabei abgespaltene A -3-IcIexans~ure nicht ehromatographieren

1 Analytic. Chemistry 21, 658 (1949). Analytic. Chemistry 21, 659 (1949).

226 Berich~: Spezielle an~lytische Methoden.

l/~13t. Fermentansi~tze werden analysiert, indem das Penicillin in Xther und dann in w/~13riges Alkali aufgenommen wird, mit naehheriger Benzolextraktion, um stSrende Substanzen zu entfernen. Ein Fermentansatz mit Penicillium chrysogenum Q 176 zeigte folgende Zusammensetzungen: kein G, 30% X, 40% F nnd 20% Dihydro-F-Penieillin. In einem ,,Corn Steep medium" fand sieh t8% G, 20% X, 32% lv und 16% Dihydro-F, wurde dem Ansatz 0,1% Phenylessigsaure zugesetzt, so stieg der Gehalt auf 80% G. ttandelspraparate versehiedenen Ur- sprungs enthielten 90% und mehr G, alte amorphe Produ]~e etwa 70% G und noch ttltere Materialien nur 18% G. Die analytischen Daten auch fiber die Ans- beuten an zugesetzten Sauren mfissen im Original nachgelesen werden.

K. HII~SB]~(~.

Die Bes t lmmung yon Benzylpenicillin (Penicillin G) durch Fgllung mit N-Athylpiperidin wird im I. Teil des Berichts des ,,Analysts Sub- Committee o/the Ministry o/Health Con/erence on the Di//erential Assay o/ Penicillin 1'' eingehend beschrieben. Voraussetzung fiir r icht ige Er- gebnisse is t hohe Re inhe i t der zu benu tzenden Reagenzien, die nu r gekiihlt verwendet werden dttrfen.

Reagenzien: I. AeetonlSsung mit nieht mehr als 0,3% Wasser, mit dem N- Xthylpiperidiniumsalz des Benzylpenicillins bei Raumtemperatur gesgttigt, in Eiswasser gekfihlt und dekantiert. Der Wassergehalt wird nach modifizierter Methode nach D. M. S~ITg und W. M. D. B~YANT e bestimmt, indem naeh der ersten Zugabe absoluten Alkohols die L5sung wenigstens w&hrend 10 rain ge- legentlich umgeschfittelt und ~-Nuphtholphthalein als Indicator verwandt wird. Man ffigt einen geringen Alkali-l~Tberschul3 zu und titriert mit 0,2 n Sgure nach Zusatz friseh bereiteten Indicators zurtiek. / / . AmylacetatlSsung, gesgttigt mit dem N-Xthylpiperidiniumsalz des Benzylpenicillins und wie I behandelt. III. Ace- ton-AmylacetatlSsung, ein Gemisch gleieher Volnmina I und II. IV. Phosphor- sgurelSsung, erhalten dureh Verdfi~nen yon 2 ml mit 10 ml destilliertem Wasser. V. N-XthylpiperidinlSsnng, gewonnen durch Verdfinnung yon 2 ml der Base mit 8 ml II, mit dem N-Xthylpiperidiniumsalz des Benzylpenieillins bei Raum- tempergtur ges~ttigt, behandelt sonst wie I, H usw. An die Base werden felgende Anforderungen gestellt: Die. Reinheit, aeidimetriseh gegen Bromphenolblau bestimmt, mul~ 99,5--100,5% betragen. Zwisehen 129,5 und 131,5~ mfissen 95% der Base fiberdestillieren nnd die Destillation mul3 bei dieser Temperatur beendet sein. Der Brechungsindex bei 20 ~ C sell 1,4438--1,4440 betragen. Das spezifisehe Gewieht (15,5/15,5 ~ C):0,827--0,829 bzw. (20/20~ Beim Lugern unter Luftzutritt im diffusen Tageslieht bei 20 ~ C w~hrend 3 Tagen daft weder Farbgnderung, noeh ein ~qiedersehlag auftreten. ]~eim SchwefeL kohlenstofftest werden 0,5 ml mit 5 ml Leichtpetroleum versetzt. Die LSsung mull ld~r und farblos bleiben. Bei Zugabe yon 1 mI Sehwefelkohlenstoff dfirfen ebenfalls keine Vergnderungen sich zeigen. Der Piperidingehalt darf nieht mehr als 0,4% betragen. Zur Prfifung wird 1 ml ~q-Xthylpiperidin im l~eagensglas unter kr~ftigem Schfitteln mit I ml s destilliertem Schwefelkohlenstoff, mit 5 ml 20%iger KupfersulfatlSsung (g/100 ml), 10 ml Chloroform und bus einer Biirette mit 25 Vol.%iger Schwefelsgure tropfenweise-solange verse~zt, bis der blaugrfine gelatinSse Niedersehlag sich wieder auflSst un4 beide Schichten klar geworden-sind. Man vergleieht die Farbe der unteren Schieht im durehfallenden Licht mit der tier Blindproben, die 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 und 1,0 ml einer 0,5%igen (g/100 ml) wg~rigen PiperidinlSsung anstatt N-Xthylpiperidin enthalten. Schliel~-

Analyst (Lond.) 74, 79 (1949). J. Amer. Chem. Soc. 57, 841 (1935).

3. Auf Pharmazie bezfigliche. 227

lieh muB die Base frei yon Trfibungen un4 farblos sein. Nieht entsprechende ]Base muB noehmals destilliert werden. VI. Natriumsulfat, friseh entw/~ssert und gepnlvert.

Aus/i~hrung der Bestimmung: Aus einem kleinen, nicht mehr Ms 15 g sehweren W/~gegl~sehen werden etwa 120 mg der Probe in ein 15 ml-Zentrifugierr6hrchen eingewogen. Man 10st in 5 ml Wasser und stellt das l~Shrehen in Eiswasser, ftigt genau 5 ml H und 0,5 ml IV zu, versehlieBt mit einem angefeuehteten l~iorken und seh/ittelt 15 see lang. Dann zentrifugiert man 30 sec lang. Die w~B- rige Sehicht pipettiert man vollkommen ab, setzt 0,5 g VI dem Zentrifugier- r6hrehen zu, rfihrt usa, bel~gt 5 rain im Eiswasser und zentrifugiert anschlieBend 30 see. l~an gibt in das Eiswasserbad auf 5 rain zurfiek, pipettiert 3 ml in ein gewogenes ZentrifugierrShrchen, das mit einem ldeinen, unten leicht gebogenem Glasstab versehen ist, setzt 3 ml I u n d 1,5 ml V zu, riihrt urn, verschlieBt mit einer Gummikappe, gibt d~s ~6hrehen in ein l~eagensglas, das mit einem Xorken verschlossen wird und kfihlt 2 Std in Eiswasser. Dann zentrifugiert man den l~6hrcheninhalt 1 rain. Die fiberstehende Flfissigkeit dekantier t man ab und w&seht den l~fiekstand dutch Aufrfihren mit 2 ml I I I mit nachfolgendem Zen- trifugieren und Dekantieren. Ferner w/~soht man 2mal mit 2 ml •ther dutch ~iihren, Zentrifugierel~ und Dekantieren. Den Rfiekstand versehmiert man mit dem gebogenen Glasst~behen auf der Innenwandung des Zentrifugierr6hrehens und troeknet bei t~aumtemperatnr im Vakuum his zur Gewiehtskonstanz:

Gew.-% Na-Salz des Benzyll0enieillins ~ 132,8 (Niedersehlagsgewieht-Ein- waage).

Ansffihrliehe Vergleiehe des ~.U.- und A.S.C.-Standards werden wieder- gegeben in Verbindung mit Mikroehromatogramm- nnd Infrarogspektralprfi- fungen sowie der mikrobiologisehen Bestimmnng der Prgparatenst/irke.

H. FREYTAG.

G. B. L~VY, D. FE~GVS und J . 3/[. CALDAS 1 geben auf Grund eingehen- der Unte r suehungen folgende Arbei t svorsehr i f t ffir die Bes t immu~g yon Benzylpenicillin in Fleischbri~hen durch F~l lung mi t N-Athy lp ipe r id in :

Man nimmt genau 11 N~hrbrfihe in ein 21-Beeherglas, kfihlt auf 4 ~ ab und gibt ungef~hr 100 ml analytisch reines Amylaeetat zu. Unter elektrometriseher Kontrolle wird die LSsung auf Pn: 2,3 ~= 0,05 mit 42,5%iger Phosphors~ure eingestellt. Dann wird in den F_,xtraktionskolben iibergeffihrt, weleher aus einem 1000 m l - E R L E ~ u besteht, der mit einem kugelf6rmigen Ansatz yon etwa 300 mI versehen ist; er kann durch einen Normalsehliffstopfen ver- sehlossen werden. Den 2 l-Beeher spiilt man mit etwa 50 ml Amylaeetat aus, so dab nun insgesamt genau 150 ml Amylaeetat gebraueht werden. Nan miseht den Inhalt der Flasehe gut dureh, setzt die Flasehe in ein Eisbad und l~gt die beiden Pbasen sieh trennen. Man sammelt die Amylaeetatphase in einen 1000 m]- El~L~MEu wiederholt die Extraktion noeh einmal mit genau 150, dann ein drittes 1Vial mit 210 ml Amylaeetat, indem man dutch Zusatz yon Wasser jeweils daffir sorgt, dab zwisehen den beiden Phasen eine mSgliehst kleine Trennungsfl.~ehe besteht. Die Amylaeetatphase wird dureh wasserfreies Natrium- sulfat getrocknet, dm'eh Zentrifugieren gekl/~rt and eine abgemessene Menge yon etwa 450 ml im Vakuum bei 25 ~ und 5 mm Druek auf 3--5 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird fiber 1 g Natriumsulfat filtriert, dann mit 2 ml wasser- freiem Aeeton und mi~ 3 ml N~hylpiloeridin in einem vorgewogenen Gins gef/illt. Naeh 15--30 rain wird mit einem 3/iikrokrystall des N-~thylpiperidinsalzes yon Penicillin G geimpft, die l~/illung ist naeh 18--24 Std beendet. Naeh dieser Zeit

Analytic. Chemistry 21, 664 (I949).

228 Berieht: Spezielle analy~ische 3d[ethoden.

wird die Fliissigkeit durch ein vorgewogenes Filter abgesaugt, das Filtrat ge- s~namelt, das Filter mit Aceton gewaschen, die gesamnaelten Filtrate werden auf 25 nal aufgeftillt, tIiervon nimnat man 2 nal, gibt 20 nal 50%igen ~thylalkohol zu un4 bestimnat den p~-Wert mit 4er Glaselektrode. Der Niedersehl~g wird nait 2 nal einer ~isehung aus Anaylaeetat, Aceton und ~thylpiperidin gewaschen, 1 Std im Vakuuna getroeknet und gewogen. Wurden z. B. 35 nag ausgewogen unc! betrug der p~-Wert 10,8, so ist die Korrektnr + 0,6 rag fiir den Verlust beim Wasehen und @ 3,3 nag fiir Verlust in der Mutterlauge. Das wirldiehe Gewicht betrug also 38,9 nag, welches entspreehend auf den Gesanatextr~kt unagerechnet wird. Die geringste L5slichkeit des Niederschlages ergibt sich bei einer ~isehung yon Aeeton zu Amylacetat zu ~thylpiperidin wie 2:2:3. Bei p~ 11,7 sind 0,11 nag im Liter gelSst, bei PH 10,8 0,3 nag, bei p~ 10,2 0,6 nag. Der naittlere Fehler wird auf ~= 5% angegeben, gelegentlieh konanaen Schwan- kungen bis 10% vor. Ein synthetisches Konzentrat welches aufdie vorgeschriebene Weise anulysiert wurde, enthielt fund 8%0% Penicillin G, 6,5% ~', und 4% Dihydro-F.

1~. :B. BARNES, t{. C. GORE, E . F . WILLIAMS, S. G. LINSLEY und E. ~ . PET]~SEN 1 best immten das krystallisierte Natriumsalz des Benzyl- penicillins auf Grund seiner charakteristischen ultraroten Absorptions- bande yon 14,2 #. Die Autoren fanden augerdem, dab alle Typen des Penicillins ein charakteristische Bande bei 5,6 # besitzen, die kein Ab- bauprodukt des Penicil]ins besitzt.

N. H. CoY, C. W. SABO und B. T' KEELE~ ~ verwenden die Bande bei 5,6 # zur Best immung des Proeainsalzes des Benzylpenicillins in seiner LSsung in Chloroform. Das LSsungsmittel selbst ist in dem Gebiet yon 5,0--5,2 # fiir infrarote Sbrahlen durchsichtig.

Die Best immung erfolgt in einer Absorptionszelle yon 0,5 m m Schicht- d icke 'mit Natr iumchloridplat ten.

Es besteht lineare Abh~ngigkeit zwisehen der optisehen Diehte und cler Konzentrat ion fiber eir~ Konzentrat ionsgebiet yon 0,2--0,8%. ])as Ver- h~ltnis der optisehen ])iehte zu dem Gehalt in ~/o ist k=0,77 . Um aus k den Gehalt zu bestimmen, mug mi t einem Faktor 1290 multipliziert werden. Der Fehler betr~gt • 2% f~r reine LSs~mgen. Es werden aueh einige Versuehe fiber die Ver~nderungen beim Altern yon LSsungen mitgeteilt .

G. E. BoxE~ und PATRICIA ~ . EVERETT ~ besehreiben eine eolorime- trisehe 3/Iethode fiir die Bestimmung von Benzyllgenicillin (Penicillin G) in vorgereinigten Proben und in N~hrans~ttzen, die darauf be- ruht, dab die Phenylessigsaure-Seitenkette naeh der Methode yon 1%. K A r E L L ~ - A D ~ a ~ dutch Nitrierung und darauf folger~de vorsichtige l%eduktion in ammoniakaliseher LSsung bes t immt wird. Es t r i t t eine intensive ]31auviolettfarbung auf. SbSrende Nebensubstanzen k6mten durch Extrakt ion entfernt werden und Leerwerte werden naeh In~kti- vierung dutch Alkalibehandlung erhalten. Die Ergebnisse s t immen bis

Analytic. Chemistry 19, 620 (1947). Analytic. Chemistry 21, 669 (i949). Analytic. Chemistry ~1, 670 (1949). gioehena. Z. ~g,o, 185 (1932); vgl. diese Z. 100; 56 (1935).

3. Auf Pharmazie beziigliehe. 229

auf 4- 3 ~o mi te inander i iberein und yon zugesetz tem Penici l l in G werden 97 4 - 5 % wiedergefunden. Es wird aueh eine vere infachte Hydroxy l - aminmethode beschrieben, die mi t der gleiohen Genauigkei t arbei te t , doch is t die Fa rbe nicht sehr stabil .

Bei der Untersuehung k6nnen nur Ganzglasapp~ra~uren verwendet werden. Zur Eichung verwendet man Mengen yon 100--500 y rekrystallisiertes Benzyl- penieillin-Natrium. Zu jeder Probe setzt man 5 ml eines Puffers yon p~ 2,0, der aus 9 g Glycin, 7 g NaC1 und 9 ml konz. Salzsaure in 1000 ml besteht. Diese Mischung wird mit 25 mI Chloroform in einem Seheidetriehter 2 min geschiittelt, 2 rain absitzen lassen, dann das Chloroform mit 0,5 g wasserfreiem Natrium getrocknet. Man bringt 20 ml des Extraktes zur Trockne, setzt 1 ml 10%ige NatriumnitratlSsung in konz. Schwefelsi~ure zu und erhitzt 30 rain im Dampf- bad. Unter Kfihhng mit Eis gibt man 2 ml Wasser, dann 2 ml Ammoniak (0,900) zu, lgl]t auf Zimmertemperatur kommen und setzt 2 ml einer 15%igen w~grigen I:IydroxylaminlSsung zu. Nach weiterem Zusatz von 5 ml Ammoniak l/~Bt man 45 min stehen unc! miBt die Farbe bei 580 m/~ mit einer Ktivette yon 13 mm Sehiehtdieke. Nghransgtze werden soweit verdiinnt, dab sic 25--150 y Peni- cillin G pro ml enthalten. 60 ml dieser Proben werden in 120 ml Amylaeetat und 60 ml Glycinpuffer 2 rain geschfittelt unct wie oben extrahiert. Der troekene Amylaeetatextrakt wird in einem Scheidetriehter mit 15 ml 0,15 molarer Na2I-IPO4-LSsung 1 min geschiittelt, der wi~Brige Extrakt gesammelt und in der K~lte aufgehoben. Zu 6 ml dieses w/~Brigen Extraktes gibt man 3 Inl 1,3 n Natriumhydroxyd-LSsung uncl erwi~rmt 1 m i n i m koehenden Wasserbad. Nach dem Abkfihlen werden 3 ml 2 n Salzs~ure zugesetzt uncl ein 10 ml betragender Anteil wird mi~ 25 ml Chloroform extrahiert. Dieser Chloroformextrakt wird wie oben besehrieben verarbeiteg und stellt den Leerwert dar. Zur Bestimmung der eigent- lichen Probe werden 5 ml des w/~Brigen Phosphatextraktes mit 5 ml 0,35 n Salz- si~ure angesi~uert und mit 25 ml eiskaltem Chloroform extrahiert. Dieser Chloro- formextrakt wird wie oben besehrieben behandelt. Die Absorptionskurve zeigt ein flaehes Maximum bei 580 m/~, ein flaehes Minimum bei 530 m# und ein sehr starkes Maximum unterhalb 400 m#, welches aber wegen stSrender Substanzen nicht zu benutzen ist. Nach den Angaben der Autoren betr~gt die Ausbeute 97 ~ 5% mit gelegentlichen Abweichungen bis • 12%. Die Bestimmung des Gesamtpenicillins erfolgt naeh der Hydroxylaminmethode unter Bildung der entsprechenden I-Iydroxams~ure: Nan nimmt 2 Proben zu je 1 ml. Zu der ersten setzt man 0,05 ml einer PenicillaselSsung, welche in 10 rain das ganze Penicillin zerstSrt. In beide Gli~ser gibt man alsdann 3 ml einer neutralisierten 5 molaren HydroxylaminlSsung in %_thylalkohol und nach 3 min 1 ml Eisen(III)-ammonium- sulfatl6sung. Man miBt in einem Colorimeter bei 515 m/~ gegen den Leerwert. Die F~rbe ist innerhalb 2--5 min konstant, danach nimmt sic fiir je 10 rain um rund 8% ab. Auch hier soll die Genauigkeit 97 ~= 5% betragen, mit gelegentiiehen Abweichungen bis zu 13%. Bei der gleiehzeitigen Analyse yon Zwisehenprodukten ergab sieh eine sehr gute Ubereinstimmung mit tier jodometrisehen Methode.

K. HI~SBm~O.

StreptGmycin. Einige Farbreaktionen des Streptomycins werden yon A. l~oux 1 beschrieben, der aueh die Kons t i t u t i on des S breptomycin- Molektils angibt . ~r Alkal i lauge en t s t eh t ein weiB~r Niederschlag, die / ib~rstehende Fl i iss igkei t wird in der I t i t ze gelb, auf Zusatz yon Molyb- d~ns~ure i s t die Fa rbe in der Hi tze ge]b, nach Aas~uern mi t iiber-

1 Ann. Pharmac. ~ran 9. 7, 477 (1949).

Z. anal. Chem. Bd. 131. 16