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Aus der Klinik für Pferde und
dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Pharmakologische Beeinflussung der Bronchokonstriktion
an „Precision Cut Lung Slices“ (PCLS)
beim Pferd
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Ann Kristin Barton
aus Lippstadt
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. B. Ohnesorge
Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: PD Dr. B. Ohnesorge
Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. J. Rehage
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2005
Carpe Diem
Inhaltsverzeichnis I. Einleitung ………………………………………………………………………………………………………………………… II. Literatur …………………………………………………………………………………………………………………………. 1. Anatomische und histologische Grundlagen………………………………..………………… 1.1. Lunge ……………………………………………………………………………………………………………………. 1.2. Bronchialbaum ……….………………………………………………………………………………………… 1.3. Feinbau der Lunge…………………………………………………………..………………………………. 1.4. Innervation und Gefäßversorgung .…………………………………………………………. 2. Chronisch obstruktive Bronchitis (COB) ..……………………………………………………….. 2.1. Terminologie …………………………………………………………………………………………………….. 2.2. Anatomisch-histologische Veränderungen bei COB……………………….. 2.3 Pathogenese der COB …………………………………………………………………………………. 2.4. Therapie der COB …………………………………………………………………………………………. 3. Regulation des Bronchotonus ………………………………………………………………………………. 3.1. nervale Regulation …………………………………………………………………………………………. 3.1.1. Vegetative Innervation ……………….…………………………………………………… 3.1.2. Nicht adrenerges, nicht cholinerges System ….……………………… 4. Lungendiagnostik …………………………………………………………………………………………………….. 4.1. klinische Untersuchung …………………………………………………………………………………. 4.2. Bronchoskopie …………………………………………………………………………………………………… 4.3. TBS-Analyse ………………………………………………………………………………………………………. 4.4. Blutgasanalyse …………………………………………………………………………………………………… 4.5. Provokationstests …………………………………………………………………………………………….. 4.5.1. HIP-Test nach Deegen und Klein (In-Vivo-Modell) ……………… 4.5.2. Bronchialringe, Tracheal und Parenchymstrips (In-Vitro-
Modell) ………………………………………………………………………………………………...... 4.5.3. Precision Cut Lung Slices …………………………………………………………….... 5. Pharmaka mit Einfluß auf den Bronchotonus …………………………………………………. 5.1. Parasympathomimetika (Metacholin und Acetylcholin) …………………. 5.2. Parasympatholytika (Atropin, Ipratropium und Tiotropium)………….. 5.3. PDE-4-Hemmer (Cilomilast) ……………………………………………………………………….. 5.4. Histamin und Antihistaminika ……………………………………………………………………… 5.4.1. Histamin …………………………………………………………………………………………………. 5.4.2. Antihistaminika ………………………………………………………………..…………………. 5.4.2.1. Diphenhydramin …………………………………………………………………. 5.4.2.2. Azelastin ……………………………………………………………………………….. III. Eigene Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung der
Bronchokonstriktion an Precision Cut Lung Slices (PCLS) ……………………… 1. Material und Methodik ………………………………………………………………………………………………. 1.1. Patientengut ………………………………………………………………………………………………………… 1.2. Allgemeiner Versuchsablauf ………………………………………………………………………..
11 13 13 13 13 14 19 20 20 21 22 24 26 27 27 32 33 33 34 35 36 36 37 38 39 41 41 43 45 48 48 50 51 51 55 55 55 55
1.3. Klinische Allgemeinuntersuchung und spezielle Untersuchung
der Atemwege ………………………………………………………………………………………………… 1.4. Euthanasie und Entnahme des Lungengewebes………………………………
1.5 Histopathologische Untersuchung ……………………………………………………………. 1.6 Herstellung der PCLS …………………………………………………………………………………….. 1.6.1. Gewinung des Untersuchungsmaterials …………………………………. 1.6.2. Befüllung des Lungengewebes mit Agarose …………………………. 1.6.3. Herstellung der PCLS ………………………………………………………………………. 1.6.3.1. Feststellung der Vitalität ………………………………………………… 1.6.3.2. Mikroskopie der Lungenschnitte ………………………………… 1.6.4. Versuchsaufbau unter Standardbedingungen ………………………. 1.6.4.1. Digitalisierung der mikroskopischen Bilder …………… 1.7. Behandlung der Schnitte mit pharmakologisch wirksamen
Substanzen ……………………………………………………………………………………………………… 1.7.1. Vorversuche zur Konzentrationsermittlung der zu
untersuchenden Pharmaka ……………………………………………………….. 1.7.1.1. PDE4-Hemmer (Cilomilast) …………………………………….. 1.7.1.2. Atropin ………………………………………………………………………………. 1.7.1.3. Ipratropium ………………………………………………………………………. 1.7.1.4. Tiotropium ……………………………………………………………………….. 1.7.1.5. Diphenhydramin ……………………………………………………………. 1.7.1.6. Azelastin ……………………………………………………………………………
1.7.2. Versuch 1: Präkontraktionsreihe mit Metacholin und Acetylcholin Vergleich ………………………………………….
1.7.3. Versuch 2: MCh-Reihe nach Vorinkubation in PDE-4-Hemmer ………………………………………………………………………
1.7.4. Versuch 3: MCh-Reihe nach Vorinkubation in Atropin …. 1.7.5. Versuch 4: MCh-Reihe nach Vorinkubation in
Ipratropium ………………………………………………………………… 1.7.6. Versuch 5: MCh-Reihe nach Vorinkubation in
Tiotropium …………………………………………………………………. 1.7.7. Versuch 6: Vorkontraktionsreihe mit Histamin …………………. 1.6.8. Versuch 7: Histamin-Reihe nach Vorinkubation in
Diphenhydramin ……………………………………………………… 1.7.9. Versuch 8: Histamin-Reihe nach Vorinkubation in
Azelastin …………………………………………………………………….. 1.8. Auswertung der mikroskopischen Bilder …………………………………………… 1.9. Statistische Auswertung …………………………………………………………………………….
2. Ergebnisse der eigenen Versuche ……………………………………………………………………
2.1. Probandengut …………………………………………………………………………………………………. 2.2. Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung ……………………… 2.3. Ergebnisse der Vorversuche zur Konzentrationsermittlung der
zu untersuchenden Pharmaka ……………………………………………………………. 2.3.1 Cilomilast ……………………………………………………………………………………………… 2.3.2. Atropin …………………………………………………………………………………………………. 2.3.3. Ipratropium ………………………………………………………………………………………… 2.3.4. Tiotropium …………………………………………………………………………………………… 2.3.5. Diphenhydramin ………………………………………………………………………………. 2.3.6. Azelastin ……………………………………………………………………………………………..
58 63 63 64 64 65 66 67 67 68 68 70 70 71 71 71 72 72 72 72 74 74 75 75 75 76 77 78 78 80 80 83 86 86 86 87 87 87 87
2.4 Versuch 1: Präkontraktionsreihe mit Metacholin und Acetylcholin Vergleich …………………………………………………………
2.5. Versuch 2: MCh-Reihe nach Vorinkubation in PDE-4-Hemmer. 2.6. Versuch 3: MCh-Reihe nach Vorinkubation in Atropin ……………….. 2.7. Versuch 4: MCh-Reihe nach Vorinkubation in Ipratropium ………. 2.8. Versuch 5: MCh-Reihe nach Vorinkubation in Tiotropium ……….. 2.9. Versuch 6: Präkontraktionsreihe mit Histamin ……………………………….. 2.10. Versuch 7: Histamin-Reihe nach Vorinkubation in
Diphenhydramin ……………………………………………………………………. 2.11. Versuch 8: Histamin-Reihe nach Vorinkubation in Azelastin …… 2.12. Statistische Auswertung der Ergebnisse der Versuche 1-5………. IV. Diskussion ……………………………………………………………………………………………………………………… 1. Probandengut ………………………………………………………………………………………………………… 2. Herstellung, Mikroskopie und Auswertung der PCLS …………………………. 3. Vitalitätsbestimmung …………………………………………………………………………………………… 4. Pharmakologische Untersuchungen …………………………………………………………… 4.1. Vergleich zwischen MCh/ACh und Histamin-Kontraktion …………. 4.2. Parasympatholytika (Atropin, Ipra- und Tiotropium) ……………………. 4.3. PDE-4-Hemmer (Cilomilast) …………………………………………………………………… 4.4. Antihistaminika (Diphenhydramin und Azelastin) …………………………. 5. Zusammenhang zwischen Erkrankungsgrad, Reagibilität und
histopathologischer Untersuchung ………………………………………………………………. 6. Streuungsanalyse ………………………………………………………………………………………………… V. Zusammenfassung …………………………………………………………………………………………………….. VI. Summary …………………………………………………………………………………………………………………………. VII. Literaturverzeichnis …………………………………………………………………………………………………. VIII. Anhang: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung der
einzelnen Probanden………………………………………………………………….
Darstellung der Kurvenverläufe der einzelnen PCLS Versuch 2: Cilomilast…………………………………………………………………………….. Versuch 3: Atropin …………………………………………………………………………………. Versuch 4: Ipratropium ………………………………………………………………………… Versuch 5: Tiotropium …………………………………………………………………………. Versuch 7: Diphenhydramin ……………………………………………………………… Versuch 8: Azelastin ……………………………………………………………………………..
IX. Danksagung ………………………………………………………………………………………………………………….
88 90 92 95 97 100 101 104 106 108 108 110 113 114 114 114 115 116 117 118 120 122 124 143 146 152 158 164 170 176 182
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Abb
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LPS
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LTD4
MCh
MEM
PAD
PCLS
PCO2
PMN
PO2
PDE
Abbildung
Acetylcholin
Airway hyperreactivity
Broncho-alveolar lavage fluid
Zyklisches Adenomonophosphat
Chronisch obstruktive Bronchitis
Chronic obstructive pulmonary disease
Effektive Konzentration, die zu 50%
Lumenreduktion führte
Epithel derived relaxing factor
Exspiratory work of breathing
Electric field stimulation
Exhibitory non-adrenergic non-cholinergic system
Forciertes exspiratorisches Volumen / 1 Sekunde
High affinity rolipram binding site
Histamin-Inhalations-Provokationstest
Inhibitory non-adrenergic non-cholinergic system
Inflammatory airway disease
Iodo-cyano-pindolol Radioligand
Interleukin-8
Late airway response
Lipopolysaccharid
Leukotrien B4
Leukotrien C4
Leukotrien D4
Metacholin
Minimum essential medium
Peripheral airway disease
Precision cut lung slice
Kohlendioxidpartialdruck
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
Sauerstoffpartialdruck
Phosphodiesterase
PGD-2
PGE2
RAD
RAO
RPMI
SAD
STABW
TBS
TNF-α
VIP
Prostaglandin D2
Prostaglandin E2
Reactive airway disease
Recurrend airway obstruction
Roswell-Park-Memorial-Institute Zellkulturmedium
Small airway disease
Standardabweichung
Tracheobronchialsekret
Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha
Vasoactive intestinal peptide
11
I. Einleitung
Erkrankungen des Atmungstraktes haben beim Pferd eine große Bedeutung. Sie sind
oft der Grund dafür, dass die Tiere aus dem Turniersport ausscheiden müssen
(LEKEUX und DUVIVIER, 2001; DEEGEN, 1986). Forschung auf diesem Gebiet hat
aber nicht nur für das Pferd selber eine Bedeutung: Der Atmungstrakt des Pferdes
ähnelt in anatomischer und physiologischer Hinsicht dem des Menschen, so kann
das Pferd viel eher als typische Labortiere als Modell für die humane Asthma- und
COPD-Forschung dienen (DOUCET et al, 1991). Die chronisch obstruktive Bronchitis
(COB) des Pferdes weist sowohl Merkmale des Asthma bronchiale als auch der
humanen COPD (chronic obstructive pulmonary disease) auf (ROBINSON, 2000).
Diese komplexe Erkrankung ist daher seit langem Gegenstand der Forschung,
insbesondere da die Möglichkeiten der pharmakologischen Beeinflussung der
Symptome unverändert noch unbefriedigend gelöst sind.
Provokationstests, wie der von DEEGEN und KLEIN (1986) entwickelte
Histamininhalationsprovokationstest (HIPT), bieten die Möglichkeit, am lebenden
Patienten funktionell auf COB zu untersuchen und neu entwickelte Substanzen zu
testen. Sie stellen aber für den Patienten eine große Belastung dar und sind aufgrund
der vielfältigen Einflussfaktoren schwer zu standardisieren. In-vitro-
Untersuchungsmethoden an isolierten Trachealmuskel- oder Lungenparenchym-
streifen sowie kleinen Bronchien liefern hingegen oft Ergebnisse, die nicht ohne
Weiteres auf das lebende Pferd übertragen werden können.
Das von DANDRURAND et al (1993) erstmals vorgestellte, von MARTIN et al (1996)
präzisierte und von VIETMEIER (2004) für das Pferd etablierte Verfahren,
präzisionsgeschnittene Lungenschnitte (Precision Cut Lung Slices, PCLS) der
kleinen Bronchien herzustellen, bietet die Möglichkeit, funktionelle Untersuchungen
der kleinen Atemwege zwar außerhalb des Patienten, aber dennoch im natürlichen
Gewebeverband durchzuführen. Diese Ex-vivo-Methode verbindet somit die Vorteile
der Untersuchung in vivo und in vitro.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die von VIETMEIER etablierte PCLS-Technik für
Reihenuntersuchungen weiterzuentwickeln und Wirkstoffe vergleichend an diesem
Modell zu untersuchen. Da die Inhalation in der Therapie der COB eine sinnvolle
12
Therapiemöglichkeit darstellt (KAMPMANN, 1998) und eine zunehmend größere
Rolle spielt, ist es zur Verringerung der Versuche am lebenden Tier und zum tieferen
Verständnis der Abläufe in vivo relevant zu beobachten, wie sich die Bronchien und
das gesamte Lungengewebe bei direktem Kontakt mit einem Wirkstoff verhalten,
ohne dass der Organismus durch systemische Nebenwirkungen belastet wird.
13
II. Literatur
1. Anatomische und histologische Grundlagen
Die anatomischen und histologischen Grundlagen der equinen Lunge seien an
dieser Stelle nur zusammenfassend dargestellt, eine vertiefende Darstellung
findet sich in NICKEL et al. (1999) und WISDORF et al. (2002).
1.1 Lunge
Die Lungen des Pferdes sind im Vergleich zu den anderen Haussäugetieren
kaum gegliedert, da Einschnitte fehlen. Lediglich im Bereich des ventralen
Lungenrandes besteht die Incisura cardiaca pulmonis dextri bzw. sinistri, wodurch
beide Lungen in einen Lobus cranialis und einen Lobus caudalis geteilt werden.
Die rechte Lunge verfügt zusätzlich über den Lobus accessorius, der dem Lobus
caudalis dextri angegliedert ist. Ein Lobus medius fehlt dem Pferd. Die
Läppchenzeichung tritt nur wenig hervor; es schimmern nur kleine, unregelmäßig
polygonale Felder schwach durch die Pleura und sind auch auf der Schnittfläche
erkennbar.
1.2 Bronchialbaum
Der Arbor bronchialis beginnt mit der Bifurkation der Trachea, aus der die beiden
kräftigen, aber kurzen Haupt- und Stammbronchen, Bronchi principales,
hervorgehen. Diese teilen sich sogleich nach ihrem Eintritt in die beiden Lungen
unterschiedlich in die Lappenbronchen, Bronchi lobares. Analog zu den
Lungenlappen besitzt das Pferd in der linken Lunge einen Bronchus lobaris
cranialis und einen Bronchus lobaris caudalis, an der rechten Lunge dagegen
zusätzlich den Bronchus lobaris accessorius. Der Bronchus lobaris cranialis teilt
sich in beiden Lungen in einen dorsalen und einen kranialen Bronchus
14
segmentalis. Der Bronchus segmentalis cranialis, der vier bis fünf dorsale sowie
ventrale Äste besitzt, ist bedeutend größer als der dorsale. Der jeweils rechts und
links den Lobus caudalis bedienende Bronchus lobaris caudalis entlässt vier
kräftige ventrale sowie fünf bis sieben kurze dorsale Bronchi segmentales und
läuft als Bronchus segmentalis caudalis aus. Der Bronchus lobaris accessorius
führt an der rechten Lunge zum Anhangslappen und gabelt sich in einen dorsalen
und einen ventralen Bronchus segmentalis. Im endoskopischen Bild wird die
physiologische Asymmetrie der durch die im gesunden Zustand scharfrandige
Carina tracheae geteilten Stammbronchen und Abgänge der Lappenbronchen zur
rechten bzw. linken Lunge deutlich.
Die Segmentbronchen belüften je ein in sich abgeschlossenes, kegelförmiges
Lungengebiet, ein Segmentum brochopulmonale, innerhalb der Lungenlappen.
Die Basis dieser Lungensegmente liegt peripher unter der Pleura, ihre Spitze
zeigt hiluswärts. Die Segmentbronchen teilen sich zunächst subsegmental und
dann weiter in Bronchuli auf, denen im Gegensatz zu den bisher beschriebenen
Bronchi die knorpelige Stütze sowie Drüsen fehlen.
Aus mehreren Teilungen der Bronchuli gehen die letzten luftleitenden Äste des
Bronchialbaums, die Bronchuli respiratorii, hervor. Sie besitzen schon
bläschenförmige Ausbuchtungen ihrer Wand, die Alveolen. Kurz hinterher teilen
sie sich noch ein- bis zweimal, um dann in die rundum mit Alveolen besetzten
Alveolengänge, die Ductuli alveolares, und deren endständige Teilungsgebilde,
die Sacculi alveolares, zu führen. In den Alveolen erfolgt letztendlich der
Gasaustausch.
1.3 Feinbau der Lunge
Die Lunge besteht grundsätzlich aus Interstitium und Parenchym. Das Interstitium
beginnt unter dem oberflächlichen einschichtigen Plattenepithel der Pleura
pulmonalis mit der Lamina propria serosae. Die Fasern dieser sehr elastischen
Eigenschicht der Lungenkapsel dringen auch in das Organ ein und stellen als
inter- und intralobuläres sowie als peribronchiales und perivaskuläres
15
Bindegewebe das Interstitium der Lunge dar. Aufgrund seiner großen
Ausdehnungs- und Retraktionsfähigkeit wird der Atmungsvorgang überhaupt erst
möglich. Bei der Inspiration erweitern die Atmungsmuskeln, v.a. das Zwerchfell,
aktiv die Thorakalhöhle, wobei die in die luftleeren Pleurahöhlen eingefügten und
über ihren Bronchialbaum unter dem Druck der atmosphärischen Luft stehenden
Lungen den Bewegungen gleichzeitig passiv folgen müssen und die elastischen
Fasern des Interstitiums gedehnt werden. Bei der Exspiration entspannen sich die
Atmungsmuskeln, so dass sich der Brustraum wieder verkleinert und die
elastischen Elemente der Lunge retrahieren, so dass die Luft entweicht.
Physiologischerweise beruht der Exspirationsvorgang also auf der Eigenelastizität
der Lungen, die aber bei bestimmten Erkrankungen herabgesetzt sein kann. In
diesen Fällen bzw. bei angestrengter Atmung unter Belastung wird die
Ausatmung durch die Bauchmuskulatur, die so genannte Bauchpresse
unterstützt. Insbesondere der Muskulus abdominis obliquus externus spielt
hierbei eine Rolle, der bei ständiger Überlastung hypertrophiert und die äußerlich
sichtbare „Dampfrinne“ durch seinen Übergang zwischen sehniger Endplatte und
muskulösem Anteil bildet.
Die Gliederung des Lungenparenchyms gleicht der einer tubulo-alveolären Drüse.
Dem Ausführungsgangsystem entspricht das luftleitende Bronchialsystem, den
sezernierenden Endstücken der Drüse sind die dem Gaswechsel dienenden
Alveolen vergleichbar. Der Bronchialbaum ist schon zum Zeitpunkt der Geburt
vollständig angelegt, nur die Größe der Atemwege ändert sich während des
Wachstums noch (JEFFREY, 1998). In seinen Anfangsabschnitten besitzt das
luftleitende System noch knorpelige Anteile, die sich zum Ende hin verlieren. Die
Bronchen besitzen ähnlich der Trachea hyaline Knorpelspangen, um das
Kollabieren zu verhindern, die sich mit fortschreitender Aufzweigung zu
Knorpelplatten und –inseln verringern und schließlich in Form der „Reiterknorpel“
enden, welche die Teilungsstellen in die Bronchuli stützen (JEFFREY, 1998). Von
hier ab fehlt dem luftleitenden System ein Knorpelgerüst; Bronchuli und Alveolen
werden alleinig durch elastische Faserhäute offen gehalten.
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Die Innenauskleidung der Bronchen besteht aus einer den Atmungswegen
eigenen Schleimhaut, deren von Becherzellen durchsetztes, mehrreihiges
hochprismatisches Epithel Zilien trägt, welche durch ihre ständige Bewegung
(Zilienschlag) eine fortwährende Reinigung der luftleitenden Wege gewährleisten.
Die Lamina propria mukosae enthält gemischte Drüsen sowie
Lymphozytenansammlungen. Das Epithel verliert nach peripher seine
Mehrreihigkeit, die Zilien und die Becherzellen (JEFFREY, 1998), so dass am
Ende nur noch ein einschichtiges Epithel besteht, durch das der Gasaustausch
erfolgen kann. Die zwischen Schleimhaut und Knorpel bzw. Faserhaut einfügte
Muskulatur besteht anfänglich aus zirkulär, später schraubig verlaufenden Fasern
glatter Muskulatur, die mit den Bronchuli respiratorii auslaufen. Im Bereich der
Alveolen finden sich nur noch einzelne Muskelfasern an den Rändern der
Alveolarsepten.
Bei chronisch-obstruktiven Lungenerkrankungen ist die Atemwegswand deutlich
verdickt. Wenn die glatte Bronchialmuskulatur kontrahiert, faltet und wellt sich das
Epithel. Eine Verdickung oder Versteifung des Epithels führt zu einer kritischen
Einengung des Lumens (WIGGS et al., 1997).
Durch die enorme Zahl der Lungenalveolen wird die für den Austausch von O2
und CO2 erforderliche Größe der respiratorischen Oberfläche der Lunge
garantiert, während der Luftaustausch durch die reversible Dehnbarkeit der
Alveolen sichergestellt wird. Der Durchmesser der Alveolen schwankt zwischen
0,3 mm in der Inspiration und 0,1 mm in der Exspiration.
Die Innenauskleidung der Alveolen besteht aus einer geschlossenen Decke von
Epithelzellen, den Pneumozyten vom Typ I. Das mit Mitochondrien und
verschiedenen Granula ausgestattete Zytoplasma umgibt den rundlichen Zellkern,
breitet sich als hauchdünne Lamelle von nur 0,1-0,2 μm Stärke aus und grenzt an
die Zellwände benachbarter Zellen. Dieses lückenlos geschlossene
Alveolarepithel lagert auf einer Basalmembran, der zum Teil mit ihr verschmolzen
die Basalmembran der Kapillaren folgt, deren flaches Endothel nicht fenestriert
ist. Der Weg, den die Atmungsgase durch Diffusion zu überwinden haben, ist
somit auf ein Minimum reduziert, um die Effizienz der Atmung zu gewährleisten.
Durch das lumenwärtige Vorbuchten der Alveolenwand durch die Kapillaren
19
entstehen Nischen, in denen sich die so genannten Nischenzellen, Pneumozyten
vom Typ II, befinden. Die Aufgabe dieser Zellen ist es, einen Phospolipidfilm
(Surfactant) abzugeben, welcher die notwendige Verringerung der
Oberflächenspannung am Alveolarepithel bewirkt, damit die Alveolen nicht
kollabieren. Hier finden sich als dritte Zellform häufig auch die
Alveolarmakrophagen, die nach Phagozytose von Fremdstoffen und Verlagerung
in die großen Bronchen ausgehustet werden und somit das Gebiet des
Gasaustausches sauber halten.
1.4 Innervation und Gefäßversorgung
Bei der Gefäßversorung der Lunge wird grundsätzlich zwischen einem
funktionellen und einem nutritiven System unterschieden.
Das funktionelle System umfasst den Lungenkreislauf mit den Pulmonalgefäßen.
Er beginnt mit dem aus der rechten Herzkammer entspringenden Truncus
pulmonalis, der sich dorsal des linken Vorhofs in die Arteriae pulmonalis dextra
bzw sinistra gabelt. Typischerweise folgen beim Equiden die pulmonaren Arterien
mit ihren Verzweigungen innerhalb der Segmente dem Bronchialbaum
(bonchoarterieller Versorgungstyp), während die Venen intersegmental verlaufen
und das Blut aus zwei benachbarten Segmenten abführen (NICKEL et al., 1999).
Drei Bronchialarterien gehen aus der Arteria broncho-oesophagea hervor: Die
Arteriae bronchiales craniales dextra und sinistra versorgen hilusnahe Abschnitte
der Lobi craniales sowie die rechten und linken Lymphonodii tracheobronchiales.
Die unpaare Arteria bronchialis media teilt sich an der Luftröhrenbifurkation auf
und bedient hilusnah die beiden Lobi caudales. Eine Bronchialvene fehlt. Der
Abfluss des durch die Bronchialarterien zugeführten Blutes erfolgt deshalb über
die Kapillaren der Bronchen und der Alveolen durch die Venae pulmonales.
Zudem bestehen zwischen den Zweigen der Arteriae bronchiales und schwachen
Ästen der Arteriae pulmonales zahlreiche präkapilläre Anastomosen.
Das nutritive Gefäßsystem der Lunge besteht aus dem nur schwachen Ramus
bronchialis der Arteria broncho-oesophagea sowie aus den Venae bronchiales,
20
die ihr Blut an die Vena azygos abgeben. Das Versorgungsgebiet dieses Systems
beschränkt sich jedoch auf begrenzte Anteile der Lungen um die großen
Bronchen.
Die Nerven der Lunge entstammen den parasympathischen Rami bronchiales des
Nervus vagus und sympathisch dem Ganglion cervicothoracicum sowie dem
anschließenden Brustteil des Truncus sympathicus. Beide Faserqualitäten formen
den Plexus pulmonalis und verlaufen mit den Bronchen und den Blutgefäßen. Sie
steuern die Lungenfunktionen in Abhängigkeit von den Daten der Presso-,
Chemo- und Dehnungsrezeptoren an den Gefäßen und luftführenden Abschnitten
der Lungen.
2. Chronisch obstruktive Bronchitis (COB)
2.1 Terminologie
Für den Begriff der chronisch obstruktiven Bronchitis (COB) des Pferdes werden
in der Literatur verschiedene Begriffe, z.T. synonym verwendet: „Heaves“ im
englischen Sprachraum, RAD (reactive airway disease), SAD (small airway
disease), IAD (inflammatory airway disease), COPD (chronic obstructive
pulmonary disease), allergische Bronchitis, PAD (peripheral airway disease) und
RAO (recurrent airway obstruction). Der Begriff RAO sollte den Begriff der COPD
ersetzen (ROBINSON, 2003), da der Begriff der COPD bereits durch eine
humane Erkrankung besetzt ist, die vor allem ältere Raucher betrifft und die
deutlich schlechter behandelbar ist als die COB des Pferdes.
ROBINSON (2001) definiert die RAO als entzündliche, obstruktive Erkrankung der
Atemwege, die in der Regel bei Pferden mittleren Alters klinisch manifest wird.
Typische Anfälle werden provoziert, wenn die Patienten organischem Staub (v.a.
aus Heu und Stroh) ausgesetzt sind. Es kommt zum massiven Einstrom von
neutrophilen Granulozyten in die Atemwege, was von Bronchospasmus (vermittelt
über Mediatoren, die auf cholinerge Nerven und glatte Muskulatur wirken) und
Schleimansammlung (durch gesteigerte Produktion und erhöhte Viskosität)
21
begleitet wird. Der Patient zeigt klinische Besserung, sobald die auslösenden
Faktoren eliminiert werden. Betroffene Pferde benötigen daher ihr Leben lang
eine staubarme Umgebung, Fütterung und Einsteu. Die Behandlung mit
Glukokortikoiden, systemisch oder durch Inhalation, reduziert die Entzündung und
Obstruktion. Unterstützend sollten Bronchodilatatoren bei respiratorischem Stress
eingesetzt werden.
Bei der IAD handelt es sich nach ROBINSON um ein ähnliches Krankheitsbild in
milderer Ausprägung. Die meist jüngeren Pferde zeigen bereits entzündliche
Veränderungen der Atemwege, aber noch keine klinisch erkennbare Dyspnoe.
Aus der IAD kann die RAO hervorgehen, es handelt sich aber grundsätzlich um
zwei voneinander abzugrenzende Erkrankungen.
Der im deutschen Sprachraum verwendete Begriff der COB beim Pferd beschreibt
im Wesentlichen die Morphologie der vorliegenden Veränderungen. Werden wie
in der vorliegenden Arbeit Probanden verwendet, über deren Haltung und
Fütterung wenig bekannt ist, erscheint es daher sinnvoll, diesen Terminus anstelle
des Begriffes der RAO zu verwenden, da die reaktive Komponente auf Haltungs-
und Fütterungsvorgeschichte nicht ausreichend bekannt war.
2.2. Anatomisch-histologische Veränderungen bei COB
Bei licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen (DAMSCH,1988;
KAUP et al, 1985, 1990; SCHOON und DEEGEN, 1993) an gesunden und
unterschiedlich stark an COB erkrankten Pferdelungen wurde festgestellt, dass
fast alle Pferde mit COB herdförmige Alterationen in den terminalen Atemwegen
und den Alveolen zeigen, wobei Grad und Ausdehnung nicht immer mit dem
klinischen Status korrelieren. Die Hauptbefunde sind in den größeren Atemwegen
an den zilientragenden Zellen zu finden. Neben fokalem Verlust der Zilien zeigen
sich unabhängig vom Grad der Erkrankung verschiedene Arten der Malformation.
Dilatierte Zellzwischenräume und Ansammlungen von Mastzellen können als
nicht-spezifische Schleimhautreaktion in Form einer Hyperreagibilität interpretiert
werden. Außerdem finden sich viele interstitielle Zellen mit kristallinen
22
intracytoplasmatischen Einschlüssen (IREGUI, 1985), deren Herkunft nicht
geklärt werden konnte.
Befunde an den terminalen Atemwegen und den Alveolen bestehen in
Veränderungen der Clarazellen, die bereits bei geringer Erkrankung degenerative
Veränderungen und Differenzierungsprobleme zeigen. Diese initialen
histopathologischen Veränderungen zeigt das bronchioläre Epithel in Form von
Verlust der Clara-Zell-Granula, Auftreten von Zellen mit lamellären Einschlüssen
und Becherzellmetaplasie (KAUP et al., 1985, 1986).
Die hochgradigen Stadien sind charakterisiert durch Epitheldegeneration, Hyper-
und Metaplasie sowie Fehldifferenzierungen, teilweise in Verbindung mit
Entzündungsprozessen und Infiltrationen mit eosinophilen Granulozyten.
Fibrozyten und glatte Muskelzellen enthalten massiv Charcot-Lyden-Kristall
ähnliche Einschlüsse. In Abhängigkeit von den bronchiolären Schädigungen
kommt es herdförmig zur Mitbeteiligung des Alveolarbereichs: Ödeme und
erhöhter Gehalt an kollagenen und elastischen Fasern in den Alveolarsepten,
Degeneration und Nekrose der Alveolarepithelzellen in Verbindung mit Typ-II-
Zellproliferationen. In Fällen von hochgradiger COB sind die alveolären
Oberflächen durch kubische Epithelzellen ausgekleidet, die meistens durch
extrem vergrößerte Lamellarbodies stark geschwollen sind. Die Typ-II-Zellen
zeigen Verfettungen und vereinzelt intrazytoplasmatische Glykogenspeicherung.
2.3 Pathogenese der COB
Ursachen und beteiligte Mechanismen der COB waren bereits Gegenstand vieler
wissenschaftlicher Untersuchungen. Die Pathogenese sei daher an dieser Stelle
nur noch einmal kurz in Abb. 2 dargestellt. Nach BINGOLD (1988) kann man im
Verlauf von Atemwegsschädigungen von zwei Komponenten ausgehen: dem
initialen Zellschaden und der einhergehenden entzündlichen Reaktion. Diese
beiden Prozesse bedingen sich gegenseitig und führen bei anhaltener Reizung zu
chronischen Veränderungen im Sinne der COB. Als initiale Noxe spielen virale
Infektionen der Atemwege sowie chemische und physikalische Reize eine große
23
Rolle. Aktivierte polymorphkernige Granulozyten setzten vermehrt
Entzündungsmediatoren frei (v.a. LTB-4 spielt beim Pferd eine Rolle), die
ihrerseits die Entzündung des Epithels verstärken, lokale Umbauvorgänge
aktivieren und so eine Hyperreagibilität auf wiederholt auftretende Reize – z.B.
Heu- und Strohexposition- verursachen.
PMN: Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
Abb. 2: Circulus Vitiosus zur COB des Pferdes (nach BINGOLD, 1988)
initiale Noxe
konsekutive repetitive Noxen
SchädigungEpithel
Reizung
Hyperreagibilität
COB
E n t z ü n d u n g
Mediatoren der Entzündung, z.B. LTB-4
Aktivierung PMN
Influx
Chemotaxine
Sensibilisierung verschiedener Zellen
lokale Gewebszerstörungs- und
Umbauvorgänge
24
2.4 Therapie der COB
Vor jeder Arzneimitteltherapie der chronisch obstruktiven Bronchitis des Pferdes
steht die Haltungsoptimierung, um den Kontakt mit reaktionsauslösendem Staub,
v.a. aus Heu und Stroh, zu minimieren (VANDENPUT et al., 1998; LAVOIE,
2003). Obwohl die COB primär kein allergisches Geschehen ist, kann es dennoch
zur sekundären Allergisierung kommen. Die Haltung im Offenstall, auf staubarmer
Einstreu (Späne) und die Fütterung von nassem Heu oder Silage bewirkt in vielen
Fällen bereits eine deutliche klinische Besserung. Staubreduziertes Management
und dem Krankheitsbild individuell angepasste Bewegung tragen ihrerseits zur
Linderung der Symptome bei. In weiter fortgeschrittenen Fällen, bei denen bereits
chronische Veränderungen der Lunge aufgetreten sind oder eine deutliche
klinische Beeinträchtigung des Patienten vorliegt, ist die kombinierte
Arzneimitteltherapie sinnvoll.
Im Vergleich zur systemischen Behandlung bietet sich insbesondere die
Inhalationstherapie an, da hierbei durch eine geringere Gesamtdosis die
Belastung des Organismus sinkt, während lokal gute Wirkstoffspiegel erreicht
werden (KAMPMANN, 1998; BUSCH, 2002; LAVOIE, 2003). In schweren Fällen
kann die Inhalationstherapie auch in Kombination mit einer systemischen
Verabreichung zum Einsatz kommen. Pferde tolerieren die Inhalation nach einer
Gewöhnungsphase im Allgemeinen gut, haben ein großes Atemzugvolumen und
atmen obligat durch die Nase. Die Effizienz, mit der ein Wirkstoff in die kleinen
Atemwege gelangt (Partikelgröße) und die einfache Handhabung sind wichtige
Faktoren bei dieser Therapieform (BUSCH, 2002).
Die entzündungshemmende Therapie ist der Schlüssel zur erfolgreichen
Behandlung der nicht infektiösen Atemwegserkrankungen (LAVOIE, 2003).
Bronchodilatatoren verschaffen zwar unverzügliche Linderung der obstruktiven
Symptome, ändern aber nichts am ihnen zugrunde liegenden entzündlichen
Prozess. Mastzellstabilisatoren zur Prophylaxe sowie inhalierte und systemische
Kortikosteroide bekämpfen die Entzündung, während ß2-Agonisten und
Anticholinergika als Bronchodilatatoren wirken (siehe auch Kapitel „5. Pharmaka
mit Einfluss auf den Bronchotonus“). Während Kortikosteroide erst nach einer
25
Woche volle Wirkung entfalten, verschaffen ß2-Adrenergika eine sofortige
Verbesserung der klinischen Symptome (LAVOIE, 2003).
Der einzige in der Pferdemedizin zugelassene ß2-Agonist ist Clenbuterol
(Ventipulmin®), welches jedoch bei längerem Gebrauch zu einer reversiblen
Toleranzentwicklung führt. ABRAHAM et al. (2001) untersuchten die
Veränderungen der ß-Adrenozeptoren-Dichte und -affinität bzw. deren
Ansprechbarkeit (zyklische AMP-Antwort auf Isoprenalin) bei 12 klinisch
gesunden Pferden unter dem Einfluss des ß2-Agonisten Clenbuterol und des
Glukokortikoids Dexamethason. Bereits 48 Stunden nach Clenbuterolgabe kam
es zu einer signifikanten Desensibilisierung der ß-adrenergen Rezeptoren in Form
eines 30-40%igen Verlustes von ICYP-Bindungsstellen (Iodo-cyano-pindolol
Radioligand) und des durch Isoprenalin induzierten Anstieges des intrazellulären
cAMP-Gehaltes. Erst vier Tage nach Absetzen des Medikamentes wurden wieder
Werte erreicht, die sich von den Ausgangswerten nicht signifikant unterschieden.
Dexamethason beschleunigte die Erholung der ß2-Adrenoceptorendichte, drei
Tage nach Dexamethasongabe kam es sogar zur Verdopplung im Vergleich zu
den Werten der Kontrollgruppe. Wurde Dexamethason gleichzeitig mit
Clenbuterol gegeben, wurde der desensibilisierende Effekt vollständig
aufgehoben. Die kombinierte Therapie mit ß2-Agonisten und Glukokortikoiden
erscheint somit sinnvoll.
ERICHSEN et al. (1994) zeigten in einer Feldstudie an 239 Pferden mit COB den
erfolgreichen Einsatz des Clenbuterols; abhängig von der Schwere der
Erkrankung musste die Dosis jedoch bis auf das 4-fache der Herstellerangabe
(0,8 μg/kg KGW) gesteigert werden, um eine Verbesserung zu erzielen. Als
Nebenwirkungen traten in höherer Dosierung in 7% der Fälle Schwitzen,
Muskeltremor und Nervosität auf. SASSE (1988) hingegen fand eine signifikante
Wirkung des Clenbuterols auf die Lungenfunktion COB-kranker Pferde auch in
der angegebenen Dosierung.
Glukokortikoide werden in der Therapie sowohl systemisch als auch inhalativ
verabreicht. Die inhalative Anwendung (z.B. mit Budenosid, KAMPMANN, 1998)
empfielt sich sich, da bronchiale Epithelzellen und Endothelzellen der
Alveolargefäße über eine große Anzahl empfänglicher Rezeptoren verfügen, und
26
systemische Nebenwirkungen vermieden werden (LAVOIE, 2003). Neben dem
Einsatz von Bronchodilatatoren soll hierdurch die Ursache der Obstruktion,
nämlich die Entzündung angegangen werden. Glukokortikoide verringern den
Tonus der glatten Atemwegsmuskulatur sowie Epithelschäden, indem sie
Entzündungszellen, deren Mediatoren, den bronchodilatierenden Effekt von
Katecholaminen und die Mukusproduktion hemmen (LAVOIE, 2003).
Beim Menschen hingegen wird die Entzündung bei COPD nicht durch
Kortikosteroide unterdrückt, da Neutrophile eine viel stärkere Rolle in der
Pathogenese spielen als Eosinophile (BARNES, 2000). In der BALF finden sich
deutlich erhöhte Zahlen von neutrophilen Granulozyten. Allerdings sind ebenfalls
vermehrt eosinophile Proteine (eosinophil cationic proteins und eosinophil
peroxidase) vorhanden, auch wenn die Eosinophilen selbst nicht erhöht sind.
3. Regulation des Bronchotonus
Der Bronchotonus wird grundsätzlich durch die Aktivität von drei grundsätzlich
seperaten Systemen bestimmt (LEFF, 1986):
1. direkte Innervation der Atemwege
2. zirkulierende humorale Mediatoren
3. regionale Sekretion von Gewebshormonen
Der Ursprung der dabei zum Einsatz kommenden Transmitter und Mediatoren
sind:
1. nervale Zellen der Lunge (und Hormone produzierende Zellen außerhalb der
Lunge)
2. andere fixe Zellen in der Lunge (Alveozyten, Fibrozyten, Endothelzellen,
Epithelzellen, glatte Muskulatur etc)
3. mobile Zellen (Entzündungs- und Immunzellen)
Diese drei Zellsysteme agieren nicht unabhängig voneinander, sondern sind in ein
Netzwerk von gegenseitigen Beeinflussungen eingebunden (LAZARUS et al.
1987). Es ist daher nicht verwunderlich, wenn In-vitro Ergebnisse von In-vivo
27
Befunden abweichen und Resultate von kontrollierten, eng definierten Versuchen
sich nicht mit klinischen Erfahrungen decken.
Abb. 3 zeigt das Zusammenspiel der verschiedenen nervalen Systeme auf den
Bronchotonus.
3.1 Nervale Regulation
Die equine Lunge wird sowohl sympathisch als auch parasympathisch innerviert
(siehe auch Abschnitt 1.4. Innervation und Gefäßversorgung). Sympathikus und
Parasympathikus steuern die Lungenfunktionen in Abhängigkeit von den Daten
der Presso-, Chemo- und Dehnungsrezeptoren an den Gefäßen und
luftführenden Abschnitten der Lungen. Der Einfluss von Sympathikus und
Parasympathikus werden jedoch von verschiedenen Autoren unterschiedlich
beurteilt.
3.1.1 Vegetative Innervation
Hauptsächlich wird die equine Lunge, ebenso wie die des Menschen und die der
meisten anderen bisher untersuchten Tierarten (MINETTE u. BARNES, 1990; YU
et al, 1993) durch das parasympathische Nervensystem innerviert (ZHANG et al.,
1995). Als Überträgerstoff des Parasympathikus dient Acetylcholin, welches über
muskarinerge Rezeptoren an der prä- und postsynaptischen Membran
konstriktorisch wirkt.
Verschiedene Typen muskarinerger Rezeptoren sind beim Pferd bekannt (M1-
M5), wobei bisher vier mit Hilfe verschiedener subtypspezifischer Agonisten und
Antagonisten, die Isolation einzelner Rezeptoren und Klonierungstechniken
nachgewiesen werden konnten (VAN NIEWSTADT et al., 1997; TÖRNECKE et
al., 2002 und MATERA et al., 2002). Diese Subtypen unterscheiden sich
hinsichtlich ihres molekularen Aufbaus, der Art der Signaltransduktion und der
Affinität unterschiedlicher Liganden. Während im Lungenparenchym M1, M2 und
28
Abb. 3: Nervale Systeme mit Einfluss auf den Bronchotonus
(nach Bingold 1988)
RELAXIERUNG
Glatte Muskulatur der Atemwege
KONTRATION
adrenerges System
nicht-adrenerges inhibitorisches System
Noradrenalin Adrenalin
VIP
Acetylcholin Substanz P
Vagus
Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid Eledoisin
Sympathikus Nebenniere
Parasympathikus
nicht cholinerges
excitatorisches System
29
M3 gleichmäßig verteilt sind, überwiegt der M2-Rezeptor in den Membranen von
Tracheal- und Bronchienepithel mit darunter liegender glatter Muskulatur
(ABRAHAM et al., 2003). Die Bedeutung der verschiedenen Subtypen für die
Bronchokonstriktion beim Pferd ist noch unzureichend geklärt. Wichtigster
Rezeptor zur Vermittlung der Konstriktion der glatten Muskulatur an der Trachea
scheint der M3-Subtyp zu sein (VAN NIEWSTADT et al., 1997, EGLEN et al.,
1996, YU et al., 1992). Bei Erregung dieses Rezeptors kommt es zur
intrazellulären Ca2+-Spiegel-Erhöhung, wodurch die glatte Muskulatur kontrahiert.
Der M1-Subtyp fördert an Nervenzellen die Fortleitung von Aktionspotentialen
(VAN NIEUWSTADT et al., 1997). Der M2-Rezeptor findet sich präsynaptisch an
der Nervenfaser und postsynaptisch an der glatten Muskulatur, wo sie als
Autorezeptoren die Acetylcholinfreisetzung verhindern. Ihre Bedeutung ist wie die
des M4-Subtyps bisher noch unzureichend geklärt. M2-Rezeptoren finden sich
ebenfalls auf „effector“ Zellen, genauso wie M3-Rezeptoren. Die M2-Rezeptoren
verstärken die Kontraktion der glatten Muskulatur, indem sie die ß-adrenerge
Entspannung hemmen. YU et al. (1992) konnten den M2-Subtyp zwar
präsynaptisch nicht nachweisen, konnten aber auch nicht das Gegenteil
beweisen.
ZHANG et al. (1995) untersuchten die Wirkung verschiedener Katecholamine auf
die Acetylcholinfreisetzung aus parasympathischen Nervenendigungen an
equinen Tracheal strips. Epinephrin und Norepinephrin hemmten
konzentrationsabhängig die ACh-Freisetzung. Isoproterenol, ein selektiver ß-
Adrenoceptor-Agonist, verstärkte dagegen die Freisetzung von Acetylcholin.
Dieser Effekt konnte durch einen ß2-Antagonisten aufgehoben werden, nicht
jedoch durch einen ß1-Antagonisten. ß2-Agonisten hemmen bei anderen Tierarten
präsynaptisch die cholinerge Neurotransmission, und führen so zur Relaxierung
der glatten Muskulatur. Beim Pferd hingegen trat das Gegenteil ein (siehe auch
Kapitel „3.2 Nicht adrenerges, nicht cholinerges System“). ZHANG et al.
schlossen daraus, dass equine Atemwege von hemmenden α2 und erregenden
ß2-Adrenozeptoren moduliert werden, wobei Erstere dominant sind.
Zahl und Ausprägung der Rezeptoren scheinen altersabhängig zu sein
(JEFFREY, 1998). In fetalen Lungen von Kaninchen und Ratten finden sich
30
weniger ß-Rezeptoren (Bronchodilatator) als beim Adulten. Muskarinerge
Rezeptoren (Bronchokonstriktor) nehmen hingegen bei der Ratte mit steigendem
Alter ab.
Die Antwort der glatten Muskulatur auf cholinerge Aktivierung ist beim COB-
kranken Pferd herabgesetzt, die Produktion des EDRF (epithelial-derived relaxing
factor) hingegen ist verstärkt, die inhibitorische Funktion der Prostanoide reduziert
(YU et al., 1994). Der Einsatz anticholinerger Pharmaka ist daher umstritten.
Der Transmitter des Sympathikus ist das Noradrenalin, welches auf α1, α2, ß1 und
ß2 Rezeptoren wirkt. ß1-Rezeptoren sprechen vorwiegend auf Noradrenalin an
und können somit als nervaler Rezeptor verstanden werden, während ß2-
Rezeptoren vermehrt auf Adrenalin ansprechen und den humoralen Rezeptor
repräsentieren (IND u. DOLERY 1983).
ß1-Rezeptoren dominieren am Herzen, stimulieren die Adenylatzyklase und
wirken depolarisierend. Auch ß2-Rezeptoren vermitteln ihre Wirkung über die
Erhöhung der cAMP-Synthese durch Adenylatzyklase, die an den Rezeptor
gekoppelt wird (NELSON 1986). ß2-Rezeptoren werden vorwiegend in den
Bronchien (von der Trachea bis in die terminalen Bronchiolen) gefunden. Sie
vermitteln an der glatten Muskulatur eine direkte Bronchodilatation. Je selektiver
eine Substanz auf ß2-Rezeptoren wirkt, desto weniger kardiale Nebenwirkungen
sind zu erwarten. Am Atemwegsepithel sind ß2-Rezeptoren an der Regulation der
Surfactant-Synthese beteiligt, ferner werden sie an den submukösen Drüsen und
an den Gefäßen gefunden (FABISIAK, 1986). Sie befinden sich außerdem auf
praktisch allen Entzündungs- und Immunzellen und nehmen Einfluss auf deren
Aktivitäten –durchgehend im Sinne einer Entzündungshemmung (KALINER,
1985).
Die Bronchodilatation nach Applikation von ß-Agonisten wird beim Pferd, wie bei
den meisten anderen Tierarten, durch ß2-Rezeptoren vermittelt (SCOTT et al.,
1991). Einige ß-Rezeptorblocker verursachen bei Asthmatikern eine Broncho-
konstriktion, nicht aber bei Gesunden (BARNES, 1986). So kommt es bei an COB
erkrankten Pferden zu einem signifikant erhöhten Lungenwiderstand, während
gesunde Pferde keine Reaktion zeigen. DERKSEN et al. (1987) stellten fest, dass
Clenbuterol an gesunden Ponies nicht als Bronchodilatator wirkt und keinen
31
protektiven Effekt gegenüber einer Bronchokonstriktion nach folgender
Histamininhalation bewirkte.
Eine bei der Therapie mit ß-Mimetika unerwünschte Reaktion des Organismus im
Rahmen seines Homöosthasebestrebens ist die sich einstellende verminderte
Ansprechbarkeit auf ß-mimetische Substanzen (siehe auch Kapitel „1.3 Therapie
der COB“). Ursache ist die so genannte Toleranz („subsensitivity“), die bei
rezeptorvermittelten Reaktionen als Antwort auf erhöhte Mengen eines Agonisten
eintritt (NELSON, 1986).
Speziell PGE2, das nach ß-Rezeptorstimulation freigesetzt wird und extrazellulär
bronchodilatatorisch wirkt, aber auch andere Arachidonsäuremetaboliten
scheinen die Adenylatcyclase abzukoppeln und die Zahl der reaktiven Rezeptoren
zu verringern (DEFONCHO et al., 1985; OMINI et al., 1985). Die Ursache des
längerfristigen Wirkungsverlustes wird in einer verminderten Ansprechbarkeit oder
in der Abnahme der Zahl der Rezeptoren gesehen- als Folge der oben genannten
Vorgänge, wobei dieses Phänomen beim Menschen aber ohne klinische
Relevanz zu sein scheint, da immer ausreichende Ansprechbarkeit erhalten bleibt
(REED 1985, LÖLLGEN 1987). Beim Pferd hingegen ist eine deutliche
Toleranzentwicklung bei langfristiger Verabreichung des Clenbuterols
(Ventipulmin®) zu verzeichnen (ABRAHAM, 2001), siehe hierzu auch Kapitel 1.3
„Therapie der COB“.
In der Humanmedizin sind ß2-Agonisten bei Asthma deutlich effektivere
Bronchodilatatoren als bei COPD, da sie als funktionelle Antagonisten agieren
und die bronchokonstriktorische Wirkung beim Asthma bronchiale
ausgeschütteter Mediatoren aufheben. Diese bronchokonstriktionsauslösenden
Mediatoren werden bei COPD viel weniger ausgeschüttet, so dass nur auf die
cholinerge Kompenente eingewirkt werden kann. Anticholinergika sind daher in
der COPD-Therapie erfolgreicher als ß2-Agonisten (BARNES, 2000). Auf die
Spezies Pferd ist dieses jedoch nur begrenzt zu übertragen, da die COB des
Pferdes sowohl Merkmale des humanen Asthma bronchiale als auch der COPD
aufweist (Abb. 4).
32
Abb. 4: Merkmale der COPD und des Asthma bronchiale beim Menschen (nach
BARNES, 2000), ca. 10% der humanen Patienten zeigen Symptome beider
Erkrankungen. Unterstrichene Merkmale kennzeichnen die COB des Pferdes.
3.1.2 Nicht-adrenerges, nicht cholinerges System (NANC)
Equine Atemwege besitzen zusätzlich zur vegetativen eine nicht adrenerge und
nicht cholinerge neurale Innervation (NANC). Man unterscheidet das
inhibitorische NANC (iNANC) mit dem Überträgerstoff Stickstoffmonoxid (NO) und
das exzitatorische NANC (eNANC) mit dem Neurotransmitter Substanz P sowie
einigen Co-Transmittern (Abb. 3).
MATERA et al. (2002) zeigten, dass eNANC Nervenfasern Drüsen, Blutgefäße
und Muskulatur direkt innervieren und unter dem Epithel ein Netzwerk bilden,
welches teilweise die Epithelschicht durchbricht. Die Effekte des eNANC
bestehen in Vasodilatation, erhöhter Kontraktilität der glatten Muskulatur,
Aktivierung von Entzündungszellen und Schleimsekretion.
COPD
• Neutrophile
• keine Hyperreagibilität
• keine Reaktion auf Bronchodilatatoren
• keine Reaktion auf Kortikosteroide
ASTHMA
• Eosinophile
• Hyperreagibilität
• Reaktion auf Bronchodilatatoren
• Reaktion auf Kortikosteroide
10%
33
Nervenfasern des iNANC innervieren die glatte Muskulatur der Trachea und der
großen Bronchien. Die Funktion des NO beim Pferd ist strittig. Während
DERSKEN und ROBINSON (2002) seine Funktion als unklar beschreiben,
nehmen MATERA et al. (2002) an, dass NO als Antagonist des Parasympathikus
wirkt und sensorische Nervenfasern moduliert. Durch elektrische Feldstimulation
(EFS) werden sowohl cholinerge als auch iNANC Nerven gleichzeitig aktiviert.
Das freigesetzte Stickstoffmonoxid beeinflusst die cholinerge Neurotransmission.
Es ist möglich, dass ß-Agonisten die iNANC-Antwort modulieren und die
Acetylcholinfreisetzung verstärkt wird (ZHANG et al, 1995). Präsynaptische ß2-
Adrenoceptoren in parasympathischen Nervenfasern werden durch ß-Agonisten
aktiviert.
YU et al. (1994) bewiesen am Bronchialringmodell die Dysfunktion des iNANC-
Systems bei Pferden mit COB. Dies ist bedingt durch den raschen Abbau des NO
durch freie Sauerstoffradikale, die im Rahmen der Entzündung auftreten
(MATERA et al., 2002; ROBINSON u. DERSKSEN, 2002).
4. Lungendiagnostik
4.1 Klinische Untersuchung
Nach einer kurzen Allgemeinuntersuchung (Geschlecht, Alter, Kennzeichen,
Ernährungs- und Pflegezustand, Verhalten, Haltung, Habitus, Atmung, Puls,
Temperatur) schließt sich die spezielle Untersuchung des Atmungsapparates
nach dem klinischen Untersuchungsscore nach OHENSORGE et al. (1998), hier
insbesondere der Lunge an, die nun näher beschrieben werden soll.
Zu Beginn der Untersuchung des Atmungsapparates werden Frequenz, Typus,
Rhythmus und Qualität der Atmung festgestellt, um bereits durch diese einfachen
klinischen Parameter Hinweise auf eine eventuell vorliegende Dyspnoe zu
erhalten.
34
Die Atmungsfrequenz des gesunden adulten Pferdes in Ruhe beträgt 8-16 Züge
pro Minute, es liegt ein kostoabdominaler Atmungstyp bei rhythmischer,
geringgradig vertiefter Qualität vor. Hinweise auf eine Dyspnoe ergeben sich
durch Brady- oder Tachykardie, betont abdominaler oder costaler Atmung sowie
extrem flache oder vertiefte Qualität (Flankenschlagen). Außerdem werden
Nasenausfluss (ggr. serös physiologisch), die Auslösbarkeit oder das Auftreten
spontanen Hustens sowie der Zustand der Mandibularlymphknoten protokolliert.
Bei der Feststellung einer Dyspnoe muss zwischen inspiratorischen oder
exspiratorischen Komponente unterschieden werden. Für eine inspiratorische
Dyspnoe sprechen verlängerte Einatmung, Einsinken der Interkostalräume und
Nüsternblähen, für eine exspiratorische Dyspnoe verlängerte Ausatmung,
Doppelschlägigkeit, Dampfrinnenbildung und Afteratmen (BAUMGARTNER et al.,
1999). Zwischen Inspiration und Exspiration besteht physiologischerweise ein
Verhältnis von 1 : 1,2.
Bei der Untersuchung nach dem Score-System (OHNESORGE et al., 1998)
erhalten die Patienten Punkte, wenn bestimmte Parameter erfüllt sind bzw.
vorliegen. Am Ende werden diese Punkte aufaddiert und anhand dessen ihr COB-
Erkrankungsgrad ermittelt. 0-1 Punkte bedeuten gesund, 2-3 Punkte geringgradig,
4-6 Punkte mittelgradig und über sieben Punkten hochgradig erkrankt.
4.2 Bronchoskopie
Mit Hilfe der Endoskopie können die meisten Abschnitte des Atmungsapparates
direkt betrachtet werden. Die Verwendung flexibler Faseroptiken in Kombination
mit Video-Endoskopietechnik ist zum wichtigen Hilfsmittel bei der Einschätzung
von Atemwegserkrankungen geworden (FISCHER, 1980; TAYLOR und HILLYER,
2001).
Das Pferd muss zur bronchoskopischen Untersuchung gut fixiert sein, d.h. es
sollte in einem Stand stehen und mittels einer Oberlippenbremse oder einer
Sedation mit α2-Agonisten ruhig gehalten werden.
35
Die Bronchoskopie ist Teil des Untersuchungsscores nach OHNESORGE et al.
(1998), zu den hierbei berücksichtigten Befunde siehe Tabelle 2c.
4.3 Tracheobronchialsekret-Analyse
Die TBS-Analyse kann einen Hinweis auf eine Lungenerkrankung geben, bevor
das Pferd klinisch auffällt (BEECH, 1975). Im TBS gesunder Pferde werden
Epithelzellen, mononukleäre Zellen, wenige Neutrophile und Schleim gefunden; in
den TBS COB kranker Pferde fallen vermehrt Neutrophile und große Mengen
Mukus auf. In fortgeschrittenen Entzündungsstadien degenerieren die Zellen und
man findet so genannte „Curschmann Spiralen“. Eosinophile werden selbst bei
Pferden, dessen Vorbericht ein allergischen Geschehen vermuten lässt, selten
gefunden. Bei Pferden mit Epistaxis finden sich Makrophagen mit Hämosiderin-
Einschlüssen.
DIEKMANN und DEEGEN (1990) zeigten, dass anhand der TBS-Zytologie die
jeweilige Diagnose eingegrenzt werden kann. Interstitielle Lungenerkrankungen
sind gekennzeichnet durch das gehäufte Auftreten von Makrophagen. Bei COB,
Bronchopneumonie, akuter Pneumonie und akuter Bronchitis bestimmen
neutrophile Granulozyten das Zellbild (DERKSEN, 1993), ihre Anzahl nimmt mit
der Schwere der Erkrankung zu. Eosinophile werden überwiegend bei parasitären
Erkrankungen (Dictyocaulus arnfieldi) gefunden. Quantitative Aussagen über die
Ausdehnung eventueller Veränderungen sind durch die TBS-Analyse nur sehr
eingeschränkt möglich.
Zwischen der Zellzahl in der Leukozytensuspension und der Histaminfreisetzung
besteht eine positiv proportionale Korrelation, wobei die Histaminfreisetzung im
Tracheobronchialsekret (TBS) deutlicher ausgeprägt ist als im Blut (ABDEL-
SALAM, 1989).
DERKSEN et al. (1990) verglichen TBS mit BALF (bronchoalveoläre
Lavageflüssigkeit) von 50 chronisch lungenkranken und 10 gesunden Pferden. Es
gab keinen signifikanten Zusammenhang zwischen den Ergebnissen des TBS
und der BALF, so dass die Zellpopulation in der Trachea zwar einen Hinweis auf
36
die mögliche Ätiologie der Erkrankung des Patienten geben, nicht aber als
repräsentativ für die tiefen Atemwege gelten kann.
4.4 Blutgasanalyse
Relevante Parameter der arteriellen Blutgasanalyse zur Beurteilung einer COB-
Erkrankung des Probanden sind der pO2, der pCO2, die arterio-alveoläre
Druckdifferenz (AaDO2) sowie zur Beurteilung des Säure-Base-Haushaltes pH,
Base Excess (BE) und HCO3. Im Untersuchungsscore nach OHNESORGE et al.
(1998) wird eine erhöhte AaDO2 bei gleichzeitig ausgeglichenem Säure-
Basehaushalt mit eingerechnet (Tabelle 2c).
WEIDELI (1981) untersuchte an 162 Pferden, ob sich die Ergebnisse der
arteriellen Blutgasanalyse zwischen gesunden und an COB (mit und ohne
Lungenerweiterung) erkrankten Probanden vor und nach Belastung sowie
medikamentell stimulierter Atmung ändern. Die stärksten Abweichungen
zwischen Gesunden und an COB erkrankten Probanden fanden sich im
Sauerstoffpartialdruck sowie in der Sauerstoffsättigung des Hämoglobins in Ruhe.
Bei allen Gruppen nahm der O2-Partialdruck unter Belastung ab; da die COB-
Gruppe mit Lungenerweiterung von Anfang an den geringsten Wert aufwies, war
die Differenz hier am kleinsten.
4.5 Provokationstests
Die Reaktion der Atemwege auf intrinsische chemische Mediatoren wie Histamin,
Acetylcholin oder Prostaglandin F2α , sowie synthetische Analoga wie Metacholin
oder Carbachol wird als nicht-spezifische bronchiale Reagibilität bezeichnet
(JUNIPER et al., 1978). Die nicht-spezifische bronchiale Reagibilität wird in der
Regel mit Histamin oder Metacholin gemessen. Beim Pferd wurden derartige
„Provokationstests“ zur Untersuchung der Atemwegsreagibilität auf unspezifische
Reize von OBEL und SCHMITERLÖW (1948), MIRBAHAR et al. (1985),
37
ROBINSON et al. (1985), ARMSTRONG et al. (1986) sowie KLEIN und DEEGEN
(1986) etabliert. Die Untersuchung am Pferd ist jedoch aufgrund der großen
Variation zwischen den Atemzügen, intraindividuellen Unterschieden und
Tagesschwankungen in der Atemmechanik schwer zu beurteilen (STADLER,
1985; GUTHRIE et al., 1992).
4.5.1 Histamininhalationsprovokationstest (HIPT)
Der HIPT dient beim Menschen zur Bestimmung der unspezifischen Reagibilität
der Atemwege. Diese Hyperreagibilität der Atemwege tritt vor allem beim Asthma
bronchiale auf. Der HIPT kann beim Pferd in ähnlicher Weise wie beim Menschen
durchgeführt werden (KLEIN und DEEGEN, 1984, 1986), wobei die dynamische
Compliance der geeignetste Lungenfunktionsparameter ist, um die
bronchokonstriktorische Antwort auf das inhalierte Histaminhydrochlorid zu
messen. Die dynamische Compliance als Volumendehnbarkeit in Bewegung wird
berechnet als Verhältnis zwischen Atemzugvolumen und der Differenz der
intrapleuralen Drücke am Punkt der maximalen In- bzw. Exspiration (MUYLLE
und OYAERT, 1973).
DEEGEN und KLEIN (1986) konnten bei keinem Pferd ohne respiratorische
Symptomatik eine unspezifische Hyperreagibilität nachweisen, dagegen lag bei
25% der geringgradig COPD erkrankten und bei 100% der hochgradig erkrankten
eine unspezifische Hyperreagibilität vor.
Gesunde Pferde reagieren auf die Inhalation von Histamin mit erhöhtem
Lungenwiderstand (RL) und herabgesetzter dynamischer Compliance (Cdyn),
während COB-Patienten hyperreagieren und relativ große Veränderungen in
exspiratorischer Atemarbeit (EEW, exspiratory work of breathing), dynamischer
Compliance und transpulmonalem Druck (∆ Ppl) zeigten, der Lungenwiderstand
aber deutlich weniger variierte. Der HIPT ist somit für die Diagnostik von
unspezifischer Reagibilität beim Pferd geeignet (DOUCET et al, 1991; DEEGEN
und KLEIN, 1984, 1986).
38
Pferde mit chronisch-obstruktiven Lungenerkrankungen zeigen eine erhöhte
durchschnittliche inspiratorische und exspiratorische Durchflussrate, eine
herabgesetzte dynamische Compliance und erhöhte Werte für die Atemarbeit
(MUYLLE und OYAERT, 1973).
Nach HOFFMANN et al. (1998 & 2002) weisen Pferde mit durch BAL-Zytologie
nachgewiesener IAD, der möglichen Vorgängererkrankung zur COB, eine extrem
erhöhte Histamin-Reaktivität auf. Der HIPT an Nicht-COB-Pferden ist daher als
diagnostisches Instrument zur Erkennung geringgradiger Atemwegsbefunde und
damit in Zusammenhang stehender Leistungsschwäche anzusehen.
4.5.2 Bronchialringe, Tracheal- und supleurale Parenchymstreifen (In-vitro-
Modell)
In-Vitro-Modelle bieten die Möglichkeit, den Ablauf der Bronchokonstriktion bis ins
Detail nachzuvollziehen und den Einfluss verschiedener Pharmaka auf das
Lungengewebe und die Atemwege zu untersuchen. Die Muskel- bzw.
Gewebestreifen werden dabei durch Elektrische Feldstimulation (EFS) zur
Kontraktion angeregt. Bronchialringe und Trachealmuskelstreifen sind relativ
einfach zu präparieren, die Ergebnisse können aber nicht ohne weiteres auf
weiter distal gelegene Abschnitte des Atmungstraktes übertragen werden.
Parenchymstreifen liefern hingegen Ergebnisse vom eigentlichen Lungengewebe,
die Reaktionen verlaufen jedoch deutlich indifferenter. OLSZEWSKI et al. (1997)
zeigten, dass die kontraktile Reaktion von Lungenparenchym auf applizierte
Spasmogene deutlich geringer ausfiel als die Reaktion isolierter Atemwege. Sie
vermuteten eine geringere Anzahl kontraktiler Elemente.
Bronchialringe und subpleurale Parenchymstreifen zeigen nach Sensibilisierung
mit Ovalbumin eine Kontraktion in der Challengereaktion (NAGASE et al., 1995).
ZHANG et al. (1995) untersuchten die Wirkung verschiedener Katecholamine auf
die Acetylcholinfreisetzung aus parasympathischen Nervenendigungen an
equinen Trachealstreifen. Epinephrin und Norepinephrin hemmten
konzentrationsabhängig die Freisetzung von Acetylcholin (ACh). Isoproterenol,
39
ein selektiver ß-Adrenoceptor-Agonist, verstärkte dagegen die Freisetzung von
ACh. Dieser Effekt konnte durch einen ß2-Antagonisten aufgehoben werden, nicht
jedoch durch einen ß1-Antagonisten. ß2-Agonisten hemmen bei anderen Tierarten
präsynaptisch die cholinerge Neurotransmission, und führen so zur Relaxierung
der glatten Muskulatur. Beim Pferd hingegen trat das Gegenteil ein (siehe auch
iNANC). ZHANG et al. schlossen daraus, dass equine Atemwege von
hemmenden α2- und erregenden ß2-Adrenozeptoren moduliert werden, wobei
Erstere dominant sind.
Yu et al. (1994) benutzen das Modell der Bronchialringe, um die vier
Mechanismen, die beim gesunden Pferd die glatte Muskulatur der Atemwege
modulieren, bei Pferden mit obstruktiven Atemwegserkrankungen zu untersuchen.
Sie stellten dabei eine Dysfunktion des iNANC, eine verringerte cholinerge
Aktivierung, die erhöhte Produktion des „epithelial-derived relaxing factor“ (EDRF)
und eine hemmende Wirkung der Prostanoide fest.
NIEWSTADT et al. (1997) wiesen an Tracheal Strips die Existenz von mindestens
vier Subtypen selektiver muskarinerger Rezeptoren im Atmungstrakt des Pferdes
nach, siehe hierzu auch Kapitel 3.1.1. „Vegetative Innervation“.
4.5.3 Precision Cut Lung Slices (PCLS)
Die Kontraktion von Atemwegen verschiedener Größe kann anhand von lebenden
Lungenschnitten durch Videomikroskopie untersucht werden. Aufgrund der
Heterogenität dieser Schnitte sind die Ergebnisse allerdings sehr variabel.
Insbesondere die Untersuchung der kleinen Atemwege z.B. im Rahmen der
Asthmaforschung stellte wegen der Schwierigkeit der Entnahme von Proben und
der mangelnden Spezifität physiologischer Messungen ein Problem dar
(HOWARTH, 1998). Die Tatsache, dass die kleinen Atemwege sich durch
Pharmaka kontrahieren und dilatieren lassen, ist in vitro seit langem bekannt
(WOOLCOCK, 1998), ein zuverlässiges Modell für den In-vivo-Bereich fehlte
allerdings bisher. Herkömmliche Lungenfunktionstests geben ebenfalls nur
unzureichende Einblicke in die Funktion kleiner Atemwege, da ihre Obstruktion
40
nur einen geringen Effekt auf die Lungenmechanik hat, für die
Ventilationsverteilung hingegen bedeutsam ist (MACKLEM, 1998).
Erstmals wurde die Herstellung von Lungenschnitten, um die Bronchokonstriktion
zu untersuchen, von DANDURAND et al. (1993) beschrieben. Die von Ratten
stammenden Schnitte hatten eine schwankende Schichtdicke von 500-1000 μm.
MARTIN et al. (1996) entwickelten an Ratten ein Verfahren, Schnitte exakt
gleicher Dicke herzustellen, die Precision Cut Lung Slices (PCLS) mit einer
Schnittdicke von 250 ± 20 μm. In MEM-Medium (serum-free minimum essential
medium) überleben diese Schnitte für bis zu 70 Stunden. Sie liefern präzise und
gut reproduzierbare Ergebnisse über die Kontraktilität von Atemwegen
verschiedener Größe, die anhand der Reduktion der Atemwegsfläche berechnet
wird.
PCLS bieten die Möglichkeit der Betrachtung von Ex-vivo-Reaktionen. Vorteile
der In-vivo-Methodik werden so mit den Vorteilen der Betrachtung in vitro
kombiniert. PCLS sind auch geeignet, die Reaktionen von Atemwegen und
Blutgefäßen in demselben Schnitt zu vergleichen (HELD et al., 1999).
WOHLSEN et al. (2001) stellten an PCLS von zuvor sensibilisierten Ratten fest,
dass die Bronchokonstriktion der kleinen Atemwege stärker und schneller abläuft,
sie aber ebenso schneller relaxierten. Die IAR (immediate allergic response) bei
der Ratte basiert vor allem auf Serotonin und tritt in Atemwegen jeder Größe auf,
nimmt aber mit abnehmender Größe der Atemwege bis zu den terminalen
Bronchiolen zu.
Die Untersuchung der Wirkung von Zytokinen auf die Lungenfunktion war bisher
in vivo wegen der Chemotaxis von Leukozyten zum Entzündungsherd nur schwer
zu untersuchen. MARTIN et al. (2001) nutzten daher das PCLS-Modell für die
Untersuchung an isolierten Atemwegen mit intakter Morphologie. Sie stellten fest,
dass TNFα und Interleukin-1 zum Bronchospasmus bei entzündlichen
Lungenerkrankungen beitragen könnten.
41
5. Pharmaka mit Einfluss auf den Bronchotonus
In der Behandlung der COB des Pferdes sind Bronchodilatatoren (kurz- und
langwirksame ß-Adrenergika und Anticholinergika) und Kortikosteroide bereits im
Einsatz; neuere Wirkstoffe wie Phosphodiesterase-Hemmer und
Leukotriensynthese-Inhibitoren befinden sich in der Entwicklung bzw. sind bereits
in der Humanmedizin zur Behandlung der COPD und des
Asthma bronchiale vorhanden. Die COB des Pferdes ist im fortgeschrittenen
Stadium charakterisiert durch irreversible Zerstörung der Alveolarwand, Verlust
an Elastizität und peribronchialer Fibrosierung, so dass für die ursächliche
Verbesserung nur wenig Raum bleibt und die Behandlung meist nur
symptomatisch erfolgen kann.
5.1 Parasympathomimetika (Metacholin und Acetylcholin)
Direkt wirkende Parasympathomimetika, also Agonisten an cholinergen
Rezeptoren des muskarinartigen Typs, werden in Cholinester und Alkaloide mit
parasympathischer Wirkung unterteilt. Sie bewirken eine Kontraktion der glatten
Muskulatur der Atemwege und führen so zur Bronchokonstriktion. Zu den
Cholinestern gehört auch das Acetylcholin, das aber aufgrund seines sehr
schnellen enzymatischen Abbaus und der bei parenteraler Applikation im
Vordergrund stehenden starken kreislauf- und herzdepressiven Wirkungen nicht
als Arzneimittel geeignet ist.
Im Gegensatz zu Acetylcholin wird der Carbaminsäureester Carbachol nur sehr
langsam durch die Cholinesterase hydrolysiert. Wie Acetylcholin stimuliert auch
Carbachol sowohl muskarinartige als auch in hoher Dosierung nicotinartige
Rezeptoren. Es bleibt in seiner Wirkung auf die Peripherie beschränkt. Weitere
synthetische Cholinester sind Metacholin und Bethanechol, die durch Substitution
mit einer Methylgruppe in ß-Stellung aus Acetylcholin bzw. Carbachol entwickelt
wurden.
42
In Abb. 5 sind die Strukturformeln der direkt wirkenden Parasympathomimetika
Acetylcholin und Metacholin dargestellt.
Abb. 5: Strukturformeln direkt wirkender Parasympathomimetika
Acetylcholin
CCH3 O CH2 CH2 N+CH3
CH3CH3
O
Metacholin
CCH3 O CH CH2 N+CH3
CH3CH3
O CH3
Cholinerge Agonisten und Histamin bewirken beim COB-Patienten eine verstärkte
Bronchokonstriktion, obwohl die AHR (airway hyperreactivity) kein Merkmal der
COB ist (BARNES, 2000).
O’CONNOR et al. (1995) stellten in einer Langzeitstudie mit 912 Männern
mittleren und fortgeschrittenen Alters fest, dass eine unspezifische Überreaktion
der Atemwege auf Metacholin einen Hinweis gibt auf spätere
Lungenfunktionsverschlechterung und die Entwicklung chronisch-obstruktiver
Atemwegserkrankungen.
FAIRBAIRN et al. (1993) untersuchten die bronchokonstriktorische Wirkung des
Metacholins an gesunden und an COB-erkrankten Pferden vor, 24, 48 und 72
Stunden nach einer kurzfristigen (7 Stunden) Heu- und Stroh-Exposition. Die
COB-Pferde reagierten signifikant deutlicher auf Metacholin als die Gesunden;
außerdem gab es einen signifikanten Zusammenhang zwischen dem
interpleuralen Druck am Ende der siebenstündigen Konfrontationsphase und der
erhöhten bronchokonstriktorischen Wirkung des Metacholins.
43
5.2 Parasympatholytika (Atropin, Ipratropium und Tiotropium)
Parasympatholytica hemmen kompetitiv die Wirkung von Acetylcholin an den
postganglionären muskarinergen Cholinoceptoren und bewirken so eine
Hemmung der durch Acetylcholin oder ein synthetisches Analogon ausgelösten
Bronchokonstriktion. Erst in hohen (toxischen) Dosen wird auch die Übertragung
an autonomen Ganglien und der motorischen Endplatte durch eine Blockierung
nicotinartiger Cholinoceptoren gehemmt. Prototyp der Gruppe ist Atropin, eine
pflanzliches Alkaloid, das in zahlreichen Nachtschattengewächsen (z.B. in der
Tollkirsche, Atropa belladonna) vorkommt. Atropin ist ein Ester aus Tropasäure
und Troponin (L-Hyoscyamin), der beim Aufarbeiten der Pflanzen oder in
wässriger Lösung zu D,L-Hyoscyamin razemiert (FREY et al., 1996).
Neben halbsynthetischen gibt es auch zahlreiche synthetische Verbindungen
(z.B. Ipra- und Tiotropium), bei denen zum Teil versucht wurde, durch die
Ausnutzung der Heterogenität der muskarinartigen Rezeptoren selektivere
Wirkungen auf bestimmte Organe oder Organsysteme zu erreichen. Während
Atropin noch auf die M-Rezeptoren 1-3 wirkt, und dadurch eine starke
Herzwirkung hat, haben Ipra- und Tiotropium keine Wirkung auf M2. Atropin ist
außerdem gehirngängig und führt durch Blockade zentraler Cholinoceptoren zu
zentralen Erregungserscheinungen (Halluzinationen, Tremor, Delirium), bei
Vergiftungen zu Delirium, Koma und Atemlähmung.
An den Bronchien haben Parasympatholytika eine hemmende Wirkung auf die
Bronchialmuskulatur und –sekretion. Sie haben dadurch broncholytische Wirkung
bei vagal bedingten Bronchospasmen (Bronchitis), führen aber zur Bildung zähen
Schleims, so dass die Kombination mit anderen Wirkstoffen in der Therapie der
COB sinnvoll erscheint (FREY et al., 1996).
44
Abb. 6: Strukturformeln von Parasympatholytica
Atropin (D,L-Hyoscyamin)
NH3C O C CH CH2OH
O
Ipratropium
N O C CH CH2OH
OH7C3
H3C
BROADSTONE et al. (1988) untersuchten die Wirkung des Atropins auf die
Atemwege gesunder und an COB erkrankten Ponies während eines akuten
Schubes bzw. in Remission. Bei den gesunden Ponies und bei den an COB
Erkrankten in Remission zeigte Atropin keine Wirkung, während der akuten Phase
verringerte es den Lungenwiderstand erkrankter Tiere, hatte aber keinen Einfluss
auf die dynamische Compliance.
DUVIVIER et al. (1997) untersuchten die Wirkung der Inhalation von
Ipratropiumbromid an fünf gesunden und sechs an COB erkrankten Pferden,
deren Lungenfunktion vor, 15 und 60 Minuten nach Gabe von Ipratropium oder
Placebo getestet wurde. Bei einer Dosis von 1200 Mikrogramm/Pferd verringerte
sich der Lungenwiderstand und erhöhte sich die dynamische Compliance
innerhalb von 15 Minuten; dieser Effekt hielt während der Dauer des Experiments
(1 Stunde) an. Eine weitere Steigerung der Dosis brachte keine weitere,
signifikante Besserung der Symptome. Systemische Nebenwirkungen wurden
weder bei den gesunden, noch bei den an COB erkrankten Tieren gefunden.
45
Das kurzwirksame Anticholinergikum Ipratropium scheint in der Wirkung
kurzwirksamen ß-Adrenergika wie dem Albuterol überlegen zu sein,
langwirksame ß-Adrenergika ( z.B. Salmeterol oder Formoterol) sind in der
Wirkungsstärke etwa gleich, in der Wirkungsdauer jedoch überlegen. Das
Salmeterol zeigt außerdem entzündungshemmende Wirkungen, die nicht auf
Bronchodilatation beruhen: Es stimuliert die mukoziliäre Clearence, hemmt die
allergenbedingte Ödematisierung der Atemwege und schützt die Bronchien vor
der Zerstörung durch Haemophilus influencae und Pseudomonaden. Es verringert
somit die Frequenz der COB- Verschlechterungen.
Das langwirksame Anticholinergikum Tiotropium zeigt beim Menschen eine
Wirkungsdauer von 24 Stunden. Seine bronchodilatatorischen Eigenschaften sind
stärker als die des Salbutamols. Da es außerdem das FEV1 (forciertes
exspiratorisches Volumen in einer Sekunde) bei COPD-Patienten deutlich erhöht,
zeigt es nicht nur symptomatische, sondern ursächliche Wirkung.
Eine negative Nebenwirkung des Ipratropiums ist die Verringerung des
transepithelialen Widerstandes, so dass der Elektrolytransport der nasalen
Atemwegsschleimhaut beeinflusst wird (JEPSEN et al., 2000).
5.3 PDE4-Hemmstoffe (z.B. Cilomilast)
Die Phosphodiesterase (PDE) ist ein intrazelluläres Enzym, das den Abbau von
cAMP oder von cGMP bewirkt. Diese beiden Stoffe sind Second Messenger für
eine Reihe von Rezeptor-vermittelten Effekten und nur eine Stufe in der Kaskade,
in deren Folge weitere Enzyme (z.B. Kinasen) aktiviert werden. Eine Erhöhung
der intrazellulären cAMP-Konzentrationen erfolgt z.B. bei Stimulation der ß-
Rezeptoren. Wenn der Abbau des cAMP durch PDE-Hemmer vermindert wird,
kommt es zu einer Erhöhung von cAMP, was einer indirekten
sympathomimetischen Wirkung entspricht (FREY et al., 1996; KANEHIRO et al.,
2000). Seit wenigen Jahren ist bekannt, dass zur PDE mehrere Isoenzyme
gehören. Während für die kardialen Effekte die PDE-3 von ausschlaggebender
Bedeutung ist (FREY et al., 1996), scheint für die Lunge PDE4 eine größere Rolle
46
zu spielen. Je selektiver eine Substanz die PDE4 hemmt, desto beschränkter ist
ihre Wirkung beispielsweise auf die Lunge, wo sie auf Entzündungszellen wirkt,
so dass Nebenwirkungen reduziert werden können.
PDE4-Inhibitoren besitzen bronchospasmolytische und entzündungshemmende
Eigenschaften, was sie für die Behandlung von Asthma bronchiale und COPD
beim Menschen sehr attraktiv macht (SPINA, 2003). Leider rufen viele dieser
Wirkstoffe auch Nebenwirkungen am ZNS und Gastrointestinaltrakt hervor. Die
PDE4 hat zwei Bindungsstellen, an die Inhibitoren ankoppeln können; die
Verbindung mit der HARBS-Bindungsstelle (high affinity rolipram binding site)
wird für die Nebenwirkungen verantwortlich gemacht (MARTIN et al., 2002). Die
Autoren stellten jedoch an PCLS von Ratten fest, dass auch PDE4- Inhibitoren mit
niedriger Affinität für die HARBS-Bindungstelle bronchospasmolytische und
entzündungshemmende Eigenschaften besitzen.
PDE4-Hemmstoffe verhindern die Hydrolyse des intrazellulären cAMP in
Neutrophilen, was deren Aktivierung erschwert und somit zu Bronchodilatation
und Entzündungshemmung führt (GROOTENDORST et al., 2003). Intrazelluläres
cAMP reguliert die Funktion vieler Zellen, die in der Pathogenese der COPD eine
Rolle spielen und selektiv PDE4 exprimieren (SPINA, 2003). Sie hemmen
neutrophile Chemotaxis, Adhäsion, Degranulation und Freisetzung von
Proteasen, zudem verringern sie die Freisetzung von LTB4 und IL-8 aus
Makrophagen. Sie verstärken hingegen die Freisetzung des
entzündungshemmenden Interleukins-10.
Die Freisetzung der Mediatoren Histamin, Leukotriene und PGD2 aus
Lungenmakrophagen kann hingegen nicht durch PDE4-Hemmer in sinnvoller
Konzentration verhindert werden (SHICHIJO et al., 1998).
KANEHIRO et al. (2000) zeigten, dass Rolipram, ein PDE4-Hemmer der ersten
Generation, Lungenresistance und dynamische Compliance in hyperreagiblen
Atemwegen herabsetzen, ebenso wie den Gehalt an Eosinophilen, Lymphozyten,
Neutrophilen und der Interleukine 4 und 5 in der BALF.
TOWARD und BROADLEY (2004) zeigten am mit Ovalbumin sensibilisierten
Meerschweinchen, dass Rolipram (Gabe 24 und 0,5 Stunde vor Ovalbumin sowie
6 Stunden danach) den Leukozytenzustrom, die AHR (airway hyperreactivity) und
47
den anfänglichen Mangel sowie späteren Überschuss an Stickstoffmonoxid
hemmte. Die LAR (late phase asthmatic response) konnte dagegen nicht
beeinflusst werden.
Cilomilast ist ein Wirkstoff aus der zweiten Generation der PDE4-Inhibitoren zum
Einsatz bei Asthma bronchiale und COPD in der Humanmedizin. Es bindet
hochselektiv an PDE4 und zeigt gegenüber Rolipram ein stark verbessertes
Nebenwirkungsprofil (GIEMBYCZ, 2001). Die Bioverfügbarkeit beim Menschen
beträgt nach oraler Aufnahme 100%, die Halbwertszeit beträgt sieben Stunden.
Cilomilast wird durch die Leber metabolisiert; die Exkretion erfolgt hauptsächlich
über Niere (90%) und Darm (6-7%). Der bisherige Einsatz bei der COPD des
Menschen ist vielversprechender als beim Asthma bronchiale, so dass sein
Einsatz bei der COB des Pferdes erwägenswert erscheint.
Abb. 7: Strukturformel von Cilomilast
OMeO
NC
CO2H
Cilomilast verringert wie Roflomilast die Hyperinflation, die Häufigkeit der COB
Verschlechterungen und steigert das FEV. Beide sind potente und selektive
PDE4- Hemmer (VIGNOLA, 2004). Das Erbrechen ist aber bei beiden Wirkstoffen
eine unerwünschte Nebenwirkung, wenn auch in bereits abgeschwächter Form
(SPINA, 2003). KUSS et al. (2003) zeigten, dass die Substanz AWD 12-281
aufgrund ihres metabolischen Profils weniger Brechreiz hervorruft als Cilomilast
und Roflumilast, trotzdem aber ein potenter PDE4-Hemmer ist und die Allergen-
bedingte-Bronchokonstriktion um 68% verringert.
48
KUMAR et al. (2003) verglichen an einem Mäusemodell (BALB/c-Maus) die
Wirkung des PDE-Hemmers Roflumilast mit dem nichtselektiven Hemmer
Pentoxifyllin und dem Glukokortikoid Dexamethason. Roflumilast und
Dexamethason verringerten signifikant Eosinophile und chronische
Entzündungszellen, subepitheliale Kollagenisierung und die Verdickung des
Atemwegepithels. Die AHR (airway hyperreactivity) wurde durch Roflumilast und
Dexamethason geringfügig verringert, durch Pentoxifyllin jedoch signifikant.
BUNDSCHUH et al. (2001) stellten einen Wirkungsvergleich verschiedener
PDE4-Inhibitoren an. Dabei führte Roflumilast vor Piclomilast, Rolipram und
Cilomilast.
Deutlich potenter ist allerdings die Substanz SCH 351591 mit einer 10-30fach
stärkeren Wirkung als Cilomilast. Außerdem kann SCH 351591 in fünffach
höherer Dosierung verwendet werden, bis Erbrechen auftritt (BILLAH et al.,
2002).
Der PDE4-Hemmer Bay 19-8004 beeinflusst nach einwöchiger Behandlung beim
Menschen das FEV1 und die Zellzahl im Sputum nicht, verringert aber den Gehalt
an Albumin und eosinophilem kationischem Protein im Sputum
(GROOTENDORST et al., 2003).
5.4 Histamin und Antihistaminika
5.4.1 Histamin
Bei Histamin handelt es sich um ein biogenes Amin, welches durch
Decarboxylierung des L-(+)-Histidins gebildet wird. Es kommt hauptsächlich, an
Heparin gebunden (Speicherform), in Mastzellen in verschiedenen Geweben
(abhängig vom Mastzellgehalt) und in bestimmten Regionen des Stammhirns, v.a.
im Hypothalamus vor.
49
Abb. 8: Strukturformel von Histamin
NHN
NH2CH2CH2
Die Histaminwirkung lässt sich verschiedenen Rezeptoren (H1, H2 und H3)
zuordnen. An der Lunge wird über H1-Rezeptoren eine Bronchokonstriktion, über
H2-Rezeptoren eine Bronchodilatation bewirkt (CHAND u. EYRE, 1978). H1-
Antihistaminika blockieren die H1-Rezeptoren, so dass die Bronchokonstriktion
verhindert wird und somit die H2-vermittelte Bronchodilatation überwiegt. Im
Rahmen eines anaphylaktischen Schocks führt Histamin in der equinen Lunge
klinisch zu Dyspnoe, die Rolle des Histamins im Rahmen der COB-Erkrankung
wird hingegen kontrovers diskutiert. Offenbar handelt es sich weniger um ein
allergisches, als vielmehr um ein entzündliches Geschehen, da das Zellbild durch
neutrophile Granulozyten und nicht durch Eosinophile bestimmt ist (BARNES,
2000).
DERKSEN et al. (1982 und 1987) zeigten, dass Histamin auch am gesunden
Pony den Sauerstoffpartialdruck im arteriellen Blut und die dynamische
Compliance verringert, Lungenwiderstand, Atemfrequenz und
Atemminutenvolumen werden erhöht. Der arterielle Kohlendioxidpartialdruck, pH,
und mittlerer arterieller Blutdruck bleiben dagegen unbeeinflusst. Durch IgE
stimulierte Makrophagen der Lunge sezernieren Histamin, Leukotriene und PGD2.
Dieser Effekt konnte auch in vitro nachgewiesen werden (SHICHIJO et al., 1998).
Die bronchokonstriktorische Antwort auf Histamin nimmt grundsätzlich mit
zunehmendem Alter ab, solange keine sekundäre Allergisierung auftritt
(JEFFREY, 1998).
50
5.4.2 Antihistaminika
Die Grundstruktur fast aller H1-Rezeptor-Antagonisten ist Ethylamin, welches
auch in Histamin vorhanden ist und für die kompetitive Hemmung am Rezeptor
verantwortlich zu sein scheint. Im Gegensatz zu Histamin selbst, das eine primäre
Aminogruppe enthält, besitzen die meisten H1-Rezeptor-Antagonisten eine
tertiäre Aminogruppe, verbunden über eine zwei bis drei C-Atome enthaltene
Kette mit zwei aromatischen Substituenten.
Die Wirkung der H1-Antihistaminika beruht auf einer selektiven, kompetetiven
Histaminverdrängung am H1-Rezeptor; sie besitzen keine Wirkung auf H2-
Rezeptoren. Damit werden die konstriktorischen Histaminwirkungen an der
glatten Muskulatur und die permeabilitätserhöhende Wirkung im Kapillarbereich
unterdrückt, nicht aber die relaxierenden und sekretionsfördernden
Histaminwirkungen. Auch die Wirkungen von Histamin auf den Kreislauf werden –
in Abhängigkeit von der Species- nur partiell gehemmt, da dort auch H2-
Wirkungen beteiligt sind.
H1-Antihistaminika besitzen nur eine geringe Rezeptorspezifität, es werden auch
andere Rezeptoren für biogene Amine blockiert. Neben der histamin-
antagonisierenden Wirkung treten auch antiadrenerge, anticholinerge und
antitryptaminerge Wirkungen auf (GOLBS u. SCHERKL, 2002). Im allgemeinen
gilt, dass Antihistaminika gegen exogen verabreichtes Histamin wirksamer sind
als gegen endogen freigesetztes. Außerdem gilt, dass Antihistaminika den
Wirkungseintritt von Histamin besser zu verhindern vermögen als eine bereits
vorhandene Wirkung von Histamin rückgängig zu machen (ADAMS, 2001). In
niedrigen Dosierungen hemmen sie die Freisetzung von Histamin aus den
Mastzellen und den Basophilen, in hoher Dosierung können sie die
Histaminfreisetzung stimulieren. Sie wirken der bronchialen-, intestinalen-,
uterinen- und vaskulären Histaminwirkung entgegen. An der glatten Muskulatur
der Gefäße antagonisieren sie beides, die vasokonstriktorische Wirkung von
Histamin und die wichtigere vasodilatative Wirkung.
51
5.4.2.1 Diphenhydramin
Diphenhydramin (2-Diphenylmethoxy-N,N-dimethylethanamin) gehört zur
Wirkstoffklasse der Ethanoldiamine. Als verhältnismäßig altes Antihistaminikum
hemmt es zwar kompetitiv die H1-Rezeptoren, zusätzlich zeigt es aber auch eine
erhebliche sedative, anticholinerge, antitussive und antiemetische Wirkung. Diese
Wirkungen werden auch therapeutisch genutzt, z.B. als Sedativa oder
Antiemetika bei Reisekrankheit. Diphenhydramin hat auch eine starke
lokalanästhetische Wirkung, die bei lokaler Anwendung (z.B. allergisch bedingtem
Juckreiz) ausgenutzt werden kann. Beim Pferd wird Diphenhydramin bei
paroxysomaler Myoglobinurie oder Azoturie, periodischer Konjunktivitis und
pulmonalem Emphysem einsetzt (ADAMS, 2001).
Abb. 9: Strukturformel von Diphenhydramin
CHOCH2CH2NCH3
CH3
5.4.2.2 Azelastin
Das Phthalazinon-Derivat Azelastin (4-(4-Chlorbenzyl)-2-(perhydro-1-methyl-
azepin-4-yl)-1(2H)-phthalzinon) wird in der Humanmedizin aufgrund seiner
antiallergenen und antiasthmatischen Effizienz eingesetzt. Die Substanz bewirkt
Bronchodilatation, hemmt die Antwort der glatten Atemwegsmuskulatur auf
Allergene, die Freisetzung von Entzündungsmediatoren, die beim Asthma
bronchiale eine Rolle spielen, und die Bildung von Sauerstoffradikalen. Es
52
blockiert Kalziumkanäle, zeigt entzündungshemmende Aktivität und hemmt
allergische Reaktionen der Früh- und Spätphase, indem es Histamin-, LTD4 und
LTC4-Rezeptoren besetzt. Am sensibilisierten Lungengewebe des
Meerschweinchens verringert es außerdem konzentrationsabhängig die
Freisetzung von Peptidylleukotrienen (ZECHEL et al., 1981; CHAND et al, 1986a,
1986b).
BAUER et al. (1990) testeten Azelastin in verschiedenen Dosierungen an 12
symptomfreien Asthmapatienten, deren Hyperreagibilität auf Histamin zuvor
festgestellt worden war. Azelastin konnte die Patienten gegenüber dem Placebo
signifikant gegen Bronchokonstriktion schützen und wirkte sogar bei höherer
Dosierung in geringem Maße bronchodilatatorisch.
Abb. 10: Strukturformel von Azelastin
CH3N
N
N
O
CH2 Cl
SZELENYI et al. (1991) zeigten, dass Azelastin die Produktion freier Radikale in
Alveolarmakrophagen sowie des IL-1 in vivo und in vitro reduziert und
bronchosekretolytische Aktivität besitzt.
ACHTERRATH-TUCKERMANN et al. (1992) untersuchten den Effekt des
Azelastins auf die Zilienschlaggeschwindigkeit in vitro am humanen
Atemwegsschleimhautmodell und in vivo am anästhesierten Meerschweinchen.
Obwohl Azelastin keinen Effekt auf den Zilienschlag zeigte, wurde die mukoziliäre
Clearence durch verstärke bronchiale Sekretion erhöht.
53
Andere Ergebnisse hatten hingegen TAMAOKI et al. (1993), die am humanen
Bronchialepithel fanden, dass Azelastin nicht nur den Zilienschlag verstärkte und
damit die mukoziliäre Transportfunktion, sondern auch noch eine Dysfunktion,
ausgelöst durch Schwefeldioxid, verhindern konnte, wahrscheinlich durch
Verhinderung intrazellulären cAMP-Verlustes.
ADUSUMALLI et al. (1992) untersuchten den Metabolismus des Azelastins und
seines aktiven Metaboliten, des Desmethylazelastins. Sie zeigten, dass die Lunge
als „target tissue“ für den Wirkstoff fungiert, die Aufnahme des aktiven
Metaboliten sogar noch sechsmal stärker ist. Desmeythylazelastin verbleibt
außerdem deutlich länger im Organismus als das Azelastin selber.
CHAND et al. (1993) untersuchten ebenfalls am Meerschweinchen den
Zusammenhang zwischen antiasthmatischer Aktivität des Azelastins und seiner
Konzentration bzw. des Hauptmetaboliten Desmethylazelastin in Blut und Lunge.
Azelastin schützte vor IARs (immediate allergic responses), gekennzeichnet
durch Atemnot und spastische Bronchienkrämpfe, verringerte deren Intensität und
Mortalität. Die bevorzugte Aufnahme des Wirkstoffes in die Lunge spiegelte sich
in einem Verhältnis Lunge/Blut von 22 (Azelastin) bzw. 146 (Desmetylazelastin).
CHAND und SOFIA (1995) führten die Wirkung des Azelastins darauf zurück,
dass es den Ca2+-abhängigen Transport der 5-Lipooxygenase vom Zytosol in den
Zellkern von Lungenmakrophagen hemmt. 5-Lipooxygenase ist nötig für die
Synthese von Leukotrienen aus Arachidonsäure. Somit kann Azelastin durch
Leukotriene vermittelte allergische Reaktionen beeinflussen und damit
Bronchokonstriktion verhindern.
Azelastin hemmt eine durch Metacholin ausgelöste Bronchokonstriktion. KONNO
et al. (1995) lösten durch Lipopolysaccharide (LPS) einen entzündlichen Prozess
an Mäuselungen aus, wobei Interleukin-1 (IL-1) und Tumornekrosefaktor-alpha
(TNF-α) freigesetzt werden. Azelastin hemmt die Produktion dieser Zytokine in
den Lungenmakrophagen und verringert damit die AHR (airway
hyperresponsiveness) auf Metacholin.
HOSHINO und NAKAMURA (1997) erklärten den Effekt des Azelastins dadurch,
dass es die Infiltration lokaler bronchialer Entzündungszellen moduliert, indem es
Eosinophile und die durch CD 3,4,8 und 25 aktivierten T-Lymphozyten signifikant
54
verringert. Sie verglichen Lungenfunktion und Reagibilität auf Metacholin vor und
nach dreimonatiger Behandlung. In einem ähnlichen Versuch bestätigte
SHIMOJO (1998) diese Ergebnisse. Das mastzellstabilisierende Azelastin
verringert signifikant die Freisetzung der Mediatoren Histamin, Leukotriene und
PGD2 (SHICHIJO et al., 1998).
Eine negative Nebenwirkung des Azelastins ist die Verringerung des
transepithelialen Widerstandes, so dass der Elektrolytransport der nasalen
Atemwegsschleimhaut beeinflusst wird (JEPSEN et al., 2000).
55
III. Eigene Untersuchungen
Im folgenden werden die eigenen Untersuchungen zu der pharmakologischen
Beeinflussung der Bronchokonstriktion an PCLS des Pferdes beschrieben.
1. Material und Methodik
1.1 Patientengut
Die Untersuchung erfolgte an 27 Pferden, die zwischen September 2004 und April
2005 zum Zweck der studentischen Ausbildung im Institut für Anatomie oder
aufgrund einer krankheitsbedingt infausten Prognose in der Klinik für Pferde der
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover euthanasiert wurden. Das Alter der
Pferde lag zwischen 1 und 37 Jahren. In Tabelle 1 sind in chronologischer
Reihenfolge der Euthanasie die Rassen- und Altersverteilung, sowie das jeweilige
Gewicht, Stockmaß, Geschlecht der Probanden, Grund der Euthanasie und der
Verwendungszweck der Lunge dargestellt.
1.2 Allgemeiner Versuchsablauf
Bei den Probanden Nr. 1-7 (Tabelle 1), die aufgrund einer Notfallsituation
euthanasiert werden mussten, wurde eine kurze Allgemeinuntersuchung und –
sofern möglich - eine Blutgasanlayse durchgeführt. Die von diesen Pferden
gewonnen Lungen dienten nur dem Erlernen und der Verbesserung der Methodik.
Versuche wurden nur an PCLS von Probanden durchgeführt, bei denen eine
vollständige Untersuchung möglich war. Bei diesen Probanden (Nr. 8-27, Tabelle
1), die nicht aufgrund einer Notfallsituation sofort euthanasiert werden mussten,
erfolgte am Vortag der Euthanasie eine allgemeine klinische Untersuchung, eine
spezielle Untersuchung der Atemwege inklusive Tracheobronchoskopie und
Analyse von Tracheobronchialsekret (TBS) sowie eine arterielle Blutgasanalyse.
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57
58
PCLS von sieben dieser Probanden konnten aus verschiedenen Gründen (in vier
Fällen Verkeimung, in zwei Fällen mangelnde Befüllbarkeit wegen Pleuraschäden
und in einem Fall ungenügende Kontraktilität aus ungeklärten Gründen) nicht
ausgewertet werden. Unmittelbar post mortem wurde der Lobus accessorius
entfernt sowie Gewebeproben aus dem Lobus cranialis, Lobus caudalis und
Lobus accessorius der rechten Lunge zur histopathologischen Untersuchung
entnommen und in Formalin fixiert. Für die Dauer des Transportes wurde der
Lobus accessorius in steriler Kochsalzlösung auf Eis gelagert.
Die weitere Bearbeitung sowie die Herstellung und Untersuchung der PCLS
erfolgte im Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover nach dem von VIETMEIER (2004) etablierten
Verfahren. Das Befüllen der Lunge mit Agarose und das Erstellen der PCLS fand
eine halbe bis drei Stunden nach Entnahme des Lungengewebes statt.
Nach dem Schneidevorgang wurde die Agarose in mehreren Medienwechseln
wieder ausgewaschen und die PCLS über Nacht im Wärmeschrank inkubiert.
Die Versuche mit Applikation verschiedener bronchokonstriktorischer und
bronchodilatatorischer Substanzen fanden am folgenden Tag unter einem
inversen Mikroskop mit Hilfe einer angeschlossenen Digitalkamera statt. Die
Daten wurden auf einen Laptop übertragen und dort ausgewertet.
1.3 Klinische Allgemeinuntersuchung und spezielle Untersuchung der Atemwege
Zu Beginn der Allgemeinuntersuchung wurden die Kennzeichen des Pferdes
(Name, Alter, Geschlecht, Rasse, Farbe, Stockmaß, Gewicht) aufgenommen
sowie, falls möglich, Angaben zum Vorbericht erfragt.
Bei der Allgemeinuntersuchung wurden der Ernährungs- und Pflegezustand
beurteilt, Ruhepulsfrequenz, Ruheatemfrequenz und Körperinnentemperatur
ermittelt, die Schleimhautbeschaffenheit der Lidbindehäute und Maulschleimhaut
überprüft und das Herz auskultiert. Außerdem wurden Haltung, Verhalten und
Habitus des Pferdes protokolliert.
59
Die spezielle Untersuchung des Atmungsapparates beinhaltete eine
Lungenauskultation, Lungenperkussion, Tracheobronchoskopie mit TBS-
Entnahme und Analyse sowie eine arterielle Blutgasanalyse.
Bei der zunächst erfolgenden Adspektion wurde auf Nasenausfluss geachtet und
sofern vorhanden, seine Lokalisation und der Sekretcharakter bestimmt.
Außerdem wurde auf den Atemtyp (kostal, kostoabdominal, abdominal) und das
Vorhandensein einer inspiratorischen (Nüsternblähen, Afteratmung, Einziehung
der Interkostalräume), exspiratorischen (Doppelschlägigkeit, Dampfrinne,
Afteratmung) oder gemischten Dyspnoe geachtet. Das Auftreten von spontanem
Husten bzw. seine Auslösbarkeit durch Druck auf die erste Trachealspange waren
ein weiteres Kriterium. Weiterhin wurden die Kehlgangslymphknoten auf ihre
Größe, Konsistenz und eventuelle Schmerzhaftigkeit untersucht.
Die Auskultation der Lunge fand in Ruhe am stehenden Patienten statt. Dabei
wurden beide Lungenflügel miteinander verglichen. Das Auftreten von
verschärften vesikulären Atemgeräuschen in der Inspirationsphase, ein
bronchiales Atemgeräusch in der In- und Exspirationsphase, sowie Rasseln,
Giemen und Knistern wurden festgehalten und fanden durch das Score-System
Eingang in die Bewertung des Lungenstatus des Pferdes.
Die Perkussion zur Ermittlung der caudo-ventralen Lungengrenzen wurde nach
der Hammer-Plessimeter-Methode (DEEGEN und ZIRCHNER, 1970)
durchgeführt.
Für die Blutgasanalyse wurde die rechte Arteria carotis communis eine gute
Handbreit oberhalb des Übergangs von Hals in Brust in der Drosselrinne in
Richtung gegenüberliegender Hüfthöcker mit einer Kanüle (BD MikrolanceTM , 0,7
x 30 mm) punktiert und je drei Glaskapillaren blasenfrei entnommen. Die Analyse
des arteriellen Blutes erfolgte unmittelbar durch ein automatisches
Blutgasanalysegerät (AVL OMNITM, AVL Medizintechnik GmbH, Bad Homburg,
Deutschland), wobei der Sauerstoff- und Kohlendioxid-Partialdruck sowie die
alveooarterielle Sauerstoffdifferenz (AaDO2) in mm Hg gemessen wurden. Im
Score System wird allerdings nur die AaDO2 berücksichtigt, da sie neben pO2 und
pCO2 den herrschenden Luftdruck, Temperatur und Ventilation mitberücksichtigt.
Zur Tracheobronchoskopie wurden die Pferde in einem Untersuchungsstand
60
fixiert und mit Xylazin (Xylapan®, 0,2-1,1 mg/kg KGW i.v.) bzw. Detomidin
(Domosedan®, 20-40 μg/kg KGW i.v.) sediert. Die Untersuchung wurde mit einem
flexiblen Endoskop durchgeführt. Es wurden die Farbe der tracheobronchialen
Schleimhaut, die Breite der Carina tracheae, die Sekretmenge und –viskosität in
Trachea und Hauptbronchien beurteilt. Unter Sichtkontrolle wurde eine
Tracheobronchialsekretprobe möglichst weit kaudal entnommen und zytologisch
im hauseigenen Labor der Klinik für Pferde untersucht. Die Beurteilung der
Sekretmenge sowie der Sekretviskosität erfolgten nach DIEKMANN (1987),
(Tabelle 2a).
Tabelle 2a : Beurteilung des TBS nach DIEKMANN (1987)
Sekretmenge Sekretviskosität
0 = keine Sekretansammlungen keine Sekretflocken
0 = Schleimhaut feucht, nur geringe Mengen wässrigen Sekretes aspi- rierbar
1 = keine Sekretansammlungen einzelne Sekretflocken
1 = Schleimhaut feucht, einzelne feine Sekretflocken in wässrigem Sekret, leicht aspirierbar
2 = flache ventrale Sekretansamm- lung einzelne größere Sekretflocken
2 = Schleimhaut feucht, seromuköses Sekret, ventral gelegen, homogen, leicht aspirierbar
3 = deutliche ventrale Sekretan- sammlung reichlich Sekretflocken
3 = Schleimhaut feucht, seromuköses Sekret mit einzelnen konsisten- teren Sekretflocken, ventral gelegen, leicht aspirierbar
4 = durchgehende ventrale Sekret- straße, Sekretseebildung
4 = Schleimhaut feucht / pappig, muköses bis mukopurulentes Sekret, einige dorsale Schleim- flocken, deutlich erschwerte Aspi- ration
5 = mehr als ein Viertel des Tracheallumens füllende(r) Sekretstraße/- see
5 = Schleimhaut pappig / trocken, muköses bis purulentes Sekret, reichlich dorsale Schleimflocken, z.T. spinnwebenartige Schleim- formationen, erschwerte Aspira- tion (kaum noch möglich)
61
Im Labor der Klinik für Pferde wurde aus dem gewonnenen
Tracheobronchialsekret zwischen zwei Objektträgern ein Quetschpräparat
angefertigt, welches nach Lufttrocknung nach Pappenheim gefärbt wurde. Die
Untersuchung wurde bei 500-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop
durchgeführt. Nach einer semiquantitativen Schätzung wurde das Sekret beurteilt
(Tabelle 2b).
Tabelle 2b: Beurteilung des TBS Ausstriches
Beurteilung Beschreibung Punkte im Score-System
- keine (Zellen) im gesamten Untersuchungs-pfad
+ vereinzelte im gesamten Untersuchungs-pfad
gesund-ggr. erkrankt 0 Punkte
++ auf jeder Gerade einzelne
+++ auf jeder Geraden häufig auftretend
++++ das Zellbild dominierend
mgr-hgr erkrankt 1 Punkt
Für die Probanden wurden gemäß des Score-Systems (OHNESORGE et al.,
1998, Tabelle 2c) eine Punktzahl errechnet, die der Bedeutung der erhobenen
Lungenbefunde entspricht, und die Probanden anhand dieser Punktzahl in vier
verschiedene Erkrankungsgrade einer COB (gesund, geringgradig, mittelgradig
und hochgradig erkrankt) eingeordnet.
62
Tabelle 2c: Score-System zur Untersuchung des Atmungsapparates beim Pferd
(OHNESORGE et al., 1998)
Untersuchungsmerkmal Befunde Punktzahl
nicht auslösbar 0
mehrfach 1
Auswurf 1
Hustenauslösung
(max 1 Punkt)
spontaner Husten 1
Einsinken der IC-Räume 3
Nüsternblähen 3
verlängerte Ausatmung 1
Dampfrinne 3
Ruhedyspnoe
(max 3 Punkte)
Afteratmung 3
Rassel 2
Knistern 2
Lungenauskultation
(max 2 Punkte)
Giemen 2
Erweiterung 3 Finger 0
Erweiterung handbreit 1
Lungenperkussion
(max 2 Punkte)
Dämpfung 2
Sekret deutlich vermehrt u./o. mäßig viskös
1
Sekret hochgradig vermehrt u./o. zähviskös
2
Tracheobronchoskopie
(max 2 Punkte)
Carina tracheae deutlich verdickt 1
TBS-Analyse
(max 1 Punkt)
Neutrophilie, Makrophagen oder Eosinophile mgr-hgr vermehrt
1
AaDo2 7-14 mmHg 1 Blutgasanalyse
(max 2 Punkte) AaDo2 > 14 mmHg 2
63
1.4 Euthanasie und Entnahme des Lungengewebes
Zur Euthanasie der Probanden (Erkrankung mit aussichtsloser Prognose,
studentische Ausbildung, Tierversuchsanzeige Az 04A 251) wurde Pentobarbital
(Eutha 77, 80 mg/kg KGW, Essex Tierarznei München) verwendet.
Umgehend nach Feststellung der Herzstillstandes und Erlöschen der Reflexe am
Auge wurde der Lobus accessorius entfernt und zum Transport in steriler
Kochsalzlösung mit Hilfe von gecrushtem Eis auf ca. 4°C gekühlt. Außerdem
wurden aus dem Lobus cranialis, dem Lobus caudalis und dem Lobus
accessorius der rechten Lunge Biopsieproben für die histologische Untersuchung
zur Feststellung des Lungengesundheitsstatus entnommen und in 10%igem
Formalin fixiert.
1.5 Histopathologische Untersuchung
Unmittelbar post mortem wurden aus dem Lobus cranialis, caudalis und
accessorius der rechten Lunge Gewebe entnommen (ca 1 cm Kantenlänge),
welches in 10%igem Formalin fixiert wurde. Diese Gewebeproben wurden im
Institut für Veterinär-Pathologie der Freien Universität Berlin hinsichtlich des
Erkrankungsgrades an COB histopathologisch befundet.
Die histopathologischen Einzelbefunde wurden mittels eines Score-Systems
ausgewertet. Dabei wurden jeweils Punkte von 1-5 (1=minimal, 2=vereinzelt,
3=geringgradig, 4=mittelgradig, 5=hochgradig) für die Ausbildung von Fibrosen
und einer Hypertrophie der Bronchialmuskulatur in jedem einzelnen Lobus
vergeben. Außerdem wurde das Auftreten von eosinophilen Granulozyten und
lymphozytäre Infiltration protokolliert.
64
1.6 Herstellung der PCLS
1. 6.1 Gewinnung des Untersuchungsmaterials
Zur Entnahme des Lobus accessorius der rechten Lunge sowie der
Biopsieproben aus Lobus cranialis, caudalis und accessorius wurde ein
interkostaler Schnitt gesetzt und die Thorakalhöhle eröffnet. Der knapp 30 cm
lange Schnitt wurde im sechsten Interkostalraum angesetzt, etwas dorsal des
Buggelenks beginnend, und dann nach ventral fortgesetzt. In den Schnitt wurde
ein Rippenspreizer (Aesculap, B. Braun Melsungen AG, Deutschland) eingesetzt
und der Zugang unter Schonung der Rippen weitestmöglich erweitert, so dass
genug Platz war, um mit beiden Armen und dem Entnahmegerät einzugehen.
Dieses von VIETMEIER (2004) entwickelte Entnahmegerät ähnelt im Aufbau
einem Fetotom nach Thygesen, jedoch mit dem Unterschied, dass die vordere
Hälfte flexibel gestaltet ist, um den Lobus accessorius zu erreichen. Der linke Arm
wurde ventral unter dem Lobus caudalis nach medial geführt, so dass die linke
Hand den Lobus accessorius hinter der Vena cava auffinden, fixieren und die
Pleura vor der Säge schützen konnte, dann wurde mit der rechten Hand die
Schlinge der Lies’schen Säge um den fixierten Lobus gelegt und das Ende des
Entnahmegerätes unter langsamem Anzug der Drahtsäge an der Basis des Lobus
accessorius platziert. Ein Helfer trennte dann mit einigen langen Zügen den
Anhangslappen ab. Das Lungensegment wurde mit steriler Kochsalzlösung vom
Blut gesäubert und dann bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis gelagert, ebenfalls
in steriler Kochsalzlösung. Der Stoffwechsel der Zellen wird bei unter 4°C so stark
herabgesetzt, dass die Vitalität des Lungengewebes ohne Einbußen der
Funktionalität über mehrere Stunden erhalten bleibt (MARTIN et al., 2003,
persönliche Mitteilung).
65
1.6.2 Befüllung des Lungengewebes mit Agarose
Bei Lungenparenchym handelt es sich um ein sehr schlaffes, flexibles Gewebe,
das erst einer gewissen Stabilisierung bedarf, bevor Schnitte mit einer geringen
Schichtdicke (hier 250 μm) hergestellt werden können. Hierzu wurde „Low melting
point“ Agarose (Typ VII, Sigma-Aldrich Chemie, Deutschland) über die Atemwege
in das Gewebe instilliert. Dieses Verfahren wurde durch VIETMEIER (2004) für
das Pferd etabliert.
Diese Agarose verflüssigt sich bei 37°C, so dass das vitale Lungenparenchym bei
der Befüllung keinen Schaden nimmt. Bei Raumtemperatur und erst recht bei
Kühlung auf Eis bzw. im Kühlschrank nimmt sie den Gelzustand an. Zur Befüllung
des Lobus accessorius wurde eine 3% Agarose Lösung mit destilliertem Wasser
hergestellt und diese in der Mikrowelle kurz aufgekocht, bis sie glasklar ohne
erkennbare Schlierenbildung war. Danach wurde sie zu gleichen Teilen mit
Zellkulturmedium (RPMI-1640 Medium, Biochrom AG Berlin) versetzt, da es sonst
wegen einer Hypotonie zu Gewebeschädigung kommt. Außerdem erhalten die
Zellen dadurch eine Nährlösung, was ihre Vitalität erhält. Die Endkonzentration
der Lösung betrug somit 1,5%.
Eine 100 ml-Einmalspritze mit aufgesetzter Knopfkanüle wurde in den Bronchus
accessorius im Anschnitt des Bronchus accessorius eingeführt und dieser mittels
einer Arterienklemme abgedichtet. Da der Lobus accessorius nur über einen
einzigen Hauptbronchus verfügt, kann über diesen das gesamte Lungensegment
befüllt werden. Die gesamte Anschnittsflächen des Lobus accessorius, der
exklusive der Basis allseits von Pleura visceralis umschlossen wird, kann
problemlos mit Arterienklemmen (16 cm, ca. 2-4 Stück) abgedichtet werden, um
den für die vollständige Befüllung notwendigen Druck aufzubauen. Nach der
langsamen und vollständigen Befüllung wurde das Lungensegment mitsamt
Klemmen und Spritze umgehend auf 4°C gekühlt und bis zur vollständigen
Aushärtung der Agarose im Kühlschrank im Eis belassen.
66
1.6.3 Herstellung der PCLS
Nachdem die Agarose im Lungengewebe vollständig erstarrt war, wurde das
befüllte Lungengewebe mit einer speziellen Schneidemaschine (OTS Tissue
Slicer 5000, Electron Mikroscopy Sciences, Washington) in 250 μm dicke
Gewebescheiben geschnitten. Die Klinge des Tissue Slicers ist an einem
oszillierenden, in alle drei Raumrichtungen beweglichen Operationsarm befestigt.
Oszillationsgeschwindigkeit (60-5000/min), Schnittdicke (1-999 μm),
Vorwärtsschub der Klinge (0-5 mm/sec), Anfangs- und Endpunkt des
Schneidevorgangs können an einem Control Pad manuell festgelegt werden.
Vor dem eigentlichen Schneidevorgang wurden von Hand mit einer Rasierklinge
aus dem mit Agarose gefüllten und auf 4°C gefüllten Lungenparenchym ca. 3-4
mm dicke Scheiben senkrecht zum Verlauf der Atemwege geschnitten, so dass
man die Bronchien im Anschnitt sehen konnte. Die Quader mit einer Kantenlänge
von 0,8 x 0,8 cm wurden dabei so zugeschnitten, dass sie den Bronchus
möglichst im Zentrum hatten, um ein Ausreißen während des Schneidevorganges
weitestmöglich zu verhindern. Dieses Kernstück wurde dann mit Hilfe von
Sekundenkleber auf der abgetrockneten Schneideunterlage des Tissue Slicers
befestigt.
Um das Lungengewebe schneiden zu können, war eine hochfrequente Oszillation
(4500-5000 /min) der Klinge bei minimalem Vorwärtsschub (ca 0,1 mm/sec) des
Operationsarms notwendig. Die Dauer des Schneidevorganges lag so pro
Proband zwischen 60 und 120 Minuten. Optimal, d.h. prall gefülltes und vor allem
gut gekühltes Lungengewebe war wesentlich einfacher und effektiver zu
schneiden. Die Tatsache, dass nicht bei allen Probanden ein optimales
Füllungsergebnis erreicht werden konnte, war ein ausschlaggebender Faktor für
die wechselnde Menge der von dem jeweiligen Probanden gewonnenen PCLS.
Diese variierte zwischen 16 und 70 Bronchienschnitten, deren Epithelgrenzen
ringsum scharf erkennbar waren und somit inkubiert werden konnten.
67
1.6.3.1 Feststellung der Vitalität
Nachdem die Schnitte über Nacht in RPMI-Medium im Wärmeschrank bei 37°C
inkubiert worden waren, erfolgte am nächsten Tag ein erneuter Medienwechsel
mit anschließender Feststellung der Vitalität. Die Vitalität wurde dabei anhand
zweier Merkmale festgestellt, erstens dem kräftigen, hochfrequenten Zilienschlag
und zweitens der deutlichen Bronchokonstriktion im Rahmen der
Präkontraktionsreihe nach Metacholinchallenge, welche unter dem Mikroskop bei
50-100 facher Vergrößerung beobachtet wurde. Zeigten die Schnitte eine mit
bloßem Auge erkennbare, deutliche Kontraktion, wurde das Metacholin bzw.
Histamin wieder mit RPMI-Medium ausgewaschen und ca. eine halbe Stunde
später mit den Versuchen begonnen. Die spätere digitale Auswertung der
Präkontraktion zeigte, dass 96 % der PCLS in Versuchsreihe 1 visuell korrekt als
kontraktil beurteilt worden waren (Bronchuslumendifferenz um mindestens 50%),
12% der aussortierten PCLS jedoch falsch als nicht ausreichend kontraktil
beurteilt worden waren. Dennoch wurde auch in Versuchsreihe 2 auf eine digitale
Auswertung im laufenden Versuch verzichtet, um die Gesamtdauer der Versuche
für den einzelnen PCLS möglichst kurz zu halten und so den Ermüdungsfaktor zu
minimieren.
1.6.3.2 Mikroskopie der Lungenschnitte
Die Lungenschnitte wurden an verschiedenen Stadien des Versuchsablaufes
mikroskopiert. Verwendet wurde dazu ein inverses Mikroskop der Firma Carl
Zeiss, Schweiz. Die erste Mikroskopie bei 50-100 facher Vergrößerung erfolgte
zur Überprüfung der Schnittqualität (zirkulär scharf erkennbare Epithelgrenzen)
und der Vitalität. Jeder Schnitt musste avor Versuchsbeginn auf Zilienschlag und
Kontraktionsbereitschaft nach Metacholin- bzw. Histamingabe hin überprüft
werden, um nicht kontrahierende PCLS vor Beginn des Hauptversuchs
auszuschliessen. Auch die erneute Dilatation, nachdem der Bronchokonstriktor
68
ausgewaschen war, wurde mikroskopisch überprüft, abfotographiert und digital
ausgewertet.
1.6.4 Versuchsaufbau unter Standardbedingungen
Zur Behandlung der Lungenschnitte mit verschiedenen pharmakologischen
Substanzen wurden die Schnitte nach Inkubation über Nacht in frischem Medium
auf Vitalität geprüft und die Präkontraktion durch Metacholin durch Auswaschen
mit RPMI-Medium wieder gelöst. In 37°C warmem RPMI-Medium wurde dann den
PCLS, jeder in einer Ausbuchtung einer 12-well-Platte, die zu testende
pharmakologische Substanz zupipettiert. Dies geschah jeweils in einer Menge
von 20 μl unter Beobachtung durch das Mikroskop. Die Reaktion des Schnittes
wurde drei Minuten nach Zugabe mit der digitalen Kamera fotografiert bzw. bei
fehlender Reaktion die nächsthöhere Konzentration nach 5 Minuten zugegeben.
Es wurden 6-12 PCLS, je nach Schnittausbeute, parallel untersucht, indem die
Konzentrationen zeitversetzt zugegeben wurde und ebenso zeitversetzt
fotografiert wurde.
Abb. 11 zeigt exemplarisch einen vollständig geöffneten und einen vollständig
kontrahierten Bronchus nach Zugabe von Metacholin (10-5 mol/L im Medium).
Ausführliche Darstellungen und mikroskopische Bilder der Bronchokonstriktion
nach aufsteigenden Metacholin- bzw. Histaminkonzentrationen finden sich in der
Arbeit von VIETMEIER (2004), die wiederholte ausführliche Darstellung entfällt
daher an dieser Stelle.
1.6.4.1 Digitalisierung der mikroskopischen Bilder
Das inverse Mikroskop war direkt mit einer digitalen Camera (Canon Powershot
P70) verbunden. Die Kamera ihrerseits übertrug die Bilder über einen Adapter auf
einen Laptop zur digitalen Auswertung. Diese Auswertung erfolgte mit dem
Programmen „Irfan View“ und „Scion Image Version Beta 4.0.2“
69
(www.scioncorp.com), welches das Lumen der Bronchien erfasst und
Veränderungen der Fläche durch Bronchokonstriktion und –dilatation berechnet.
Abb. 11: Vollständig geöffneter Bronchus vor Auslösung der Bronchokonstriktion
(oben) und vollständig kontrahierter Bronchus 3 min nach Applikation von
Metacholin (10-5 mol/L im Medium, unten), verschiedene PCLS
70
1.7 Behandlung der Schnitte mit pharmakologisch wirksamen Substanzen
Zur Auslösung der Bronchokonstriktion wurden Acetylcholin-, Metacholin- und
Histaminstammlösungen mit einer Konzentration von 10-2 mol/L steriler
Kochsalzlösung hergestellt. Diese Stammlösung wurde dann am jeweiligen
Versuchstag in Zehnerschritten auf 10-3 bis 10-6 mol/L mit RPMI-Medium weiter
verdünnt und in den Versuchen verwendet.
Auch für die Hemmer der Bronchokonstriktion (Cilomilast, Atropin, Ipratropium,
Tiotropium, Diphenhydramin und Azelastin) wurden Stammlösungen hergestellt,
die dann direkt vor Versuchsbeginn frisch verdünnt wurden.
1.7.1 Vorversuche zur Konzentrationsermittlung der zu untersuchenden
Pharmaka
Die Vorversuche hatten zum Ziel, die Konzentration der jeweiligen Substanz zu
ermitteln, die zwar zu einer deutlichen Hemmung der Bronchokonstriktion durch
Metacholin bzw. Histamin führte, diese aber bei höherer Konzentration des
Bronchokonstriktors noch zuließ. In den Hauptversuchen wurden die PCLS der
Versuchsgruppe mit einer Konzentration der jeweiligen Substanz für 20 Minuten
im Wärmeschrank bei 37° Celsius vorinkubiert, die dann zu einer visuell
sichtbaren Hemmung der Bronchokonstriktion im Vergleich zur Präkontraktion
bzw zur parallel mitlaufenden Kontrollgruppe führen sollte. Diese Konzentration
musste für jede einzelne Substanz in Vorversuchen ermittelt werden. Da bereits
Richtwerte durch die Arbeiten von VIETMEYER et al (2004) zur Pferdelunge und
MARTIN et al (1996) zu anderen Tierspezies vorlagen, konnten diese
Vorversuche mit Ausnahme des Azelastins auf jeweils ein Pferd beschränkt
werden.
71
1.7.1.1 PDE4-Hemmer (Cilomilast)
Nach Feststellung der Vitalität durch mikroskopische Betrachtung des
Zilienschlages und der morphologischen Intaktheit des Bronchus sowie
Präkontraktionsreihe mit Metacholin (10-8 bis 10-5 mol/L) wurden die Schnitte
dreimalig mit reinem RPMI-Medium gespült und 30 Minuten im Wärmeschrank bei
37°C inkubiert, wobei nach 10, 20 und 30 Minuten ein weiterer Medienwechsel
erfolgte. Nach Wiederöffnung wurden sechs Schnitte in sechs verschiedenen
Konzentrationen Cilomilast-Lösung (10-8 bis 10-3 mol/L) für weitere 20 Minuten
inkubiert. Danach wurde die MCh-Reihe wiederholt, wobei die Reduktion des
Bronchuslumens im Vergleich zur jeweiligen Präkontraktionsreihe abfotographiert
und vermessen wurde, um die Hemmung der Bronchokonstriktion durch
Cilomilast zu beurteilen. Nach digitaler Auswertung wurde dann die Konzentration
bestimmt, die zwar eine deutliche Rechtsverschiebung der Kurve auslöst, aber
dennoch eine mit bloßem Auge erkennbare, deutliche Kontraktion zulässt. Zu den
Ergebnissen der Vorversuche siehe Kapitel 2.3.
1.7.1.2 Atropin
Analog zu Kapitel 1.7.1.1 wurde auch der Vorversuch für Atropin durchgeführt.
Die sechs Schnitte wurden in aufsteigender Konzentration von 10-9 bis 10-4 mol/L
Atropin-Lösung inkubiert, der Metacholin-Reihe ausgesetzt und die
Bronchuslumina fotografiert und digital ausgewertet.
1.7.1.3 Ipratropium
Aufgrund des ähnlichen Wirkungsmechanismus des Ipratropiums zu Atropin
wurde für diese Substanz keine eigene Vorversuchsreihe durchgeführt, sondern
die Ergebnisse des Atropin-Vorversuchs auf diese Substanz übertragen.
72
1.7.1.4 Tiotropium
Da das Tiotropium in die gleiche Wirkstoffgruppe wie Atropin und Ipratropium fällt,
wurde auch hier kein eigener Vorversuch durchgeführt und die Ergebnisse des
Vorversuchs mit Atropin übernommen und die dort ermittelte molare
Konzentration auch für Tiotropium in den Versuchen verwendet.
1.7.1.5 Diphenhydramin
Die Vorversuche für Diphenhydramin und Azelastin wurden analog Kapitel 1.7.1.1
durchgeführt; die Bronchokonstriktion wurde für diese beiden Antihistaminika
allerdings durch Histamin ausgelöst, wobei die Schnitte eine Versuchsreihe mit
Konzentrationen von 10-8 mol/L bis 10-4 mol/L Histamin durchliefen.
1.7.1.6 Azelastin
Da der Wirkungsmechanismus des Azelastins dem des Diphenhydramin
vergleichbar ist, wurde der Vorversuch zunächst mit Konzentrationen in einem
nahe gelegenen Bereich durchgeführt. Da nach Vorinkubation in 10-4 bis 10-8
molarer Azelastin-Lösung jedoch keinerlei Konstriktion mehr auslösbar war,
wurde der Vorversuch mit geringeren Konzentrationen wiederholt, wobei hierbei
Verdünnungen bis zu 10-14 mol/L verwendet wurden.
1.7.2 Versuch 1: Präkontraktionsreihe mit Metacholin und Acetylcholin im
Vergleich
Die Präkontraktionsreihe mittels Metacholin und Acetylcholin diente nicht nur dem
Vergleich der beiden Substanzen, sondern stellte auch einen wichtigen Parameter
zur Feststellung der Vitalität dar. Nur Schnitte, die neben deutlichem Zilienschlag,
73
Agarosefreiheit und vollständiger Muskularis und Epithel eine visuell sichtbare
Lumenreduktion unter eine Metacholin- bzw. Acetylcholinkonzentration zwischen
10-8 und 10-5 mol/L zeigten, wurden im weiteren für die Versuche 2-5 sowie deren
Kontrollgruppen verwendet.
Vor Versuchsbeginn wurden die Schnitte in frisches 37°C warmes RPMI-Medium
ohne Antibiotika-Zusatz umgebettet und ihr Zustand nach Inkubation über Nacht
auf Agarosefreiheit, Wandkontraktion und Zilienschlag mikroskopisch überprüft,
dokumentiert und fotografiert.
Die PCLS wurden dann jeweils akkumulierend dem Metacholin bzw. Acetylcholin
in steigender Konzentration von 10-8 bis 10-5 mol/L ausgesetzt (Tabelle 3). Dabei
wurden jeweils 20µl der Bronchokonstriktor-Lösung (wegen der 100fachen
Verdünnung in den Konzentrationen 10-6 bis 10-3 mol/L) zu dem sich in 2 ml
RPMI-Medium befindlichen Schnitt pipettiert. Das Bronchuslumen wurde drei
Minuten nach Zugabe des Pharmakons fotografiert, nach fünf Minuten erfolgte die
Zugabe der nächsthöheren Konzentration. Zeigte ein Schnitt bereits unter einer
leichteren Konzentration einen vollständigen Lumenverschluss, wurden die
nächsthöheren Konzentrationen Metacholin/ Acetylcholin nicht mehr zugegeben,
um die Wiederöffnung für die folgenden Versuche nicht unnötig zu erschweren.
Jeweils die Hälfte aller vorhandenen Schnitte einer Lunge wurden mit Metacholin
getestet, die andere Hälfte mit Acetylcholin. Die Verteilung erfolgte zufällig.
Nachdem die Präkontraktionsreihe beendet war, wurden die Schnitte, die keine
visuell sichtbare Kontraktion gezeigt hatten, aussortiert und verworfen. Daher war
es nicht immer möglich, für die folgenden im Doppelansatz laufenden Versuche 2-
5 jeweils einen mit Metacholin und einen mit Acetylcholin vorkontrahierten Schnitt
zu verwenden; es zeigte sich jedoch früh, dass in diesem Versuchsansatz mit
PCLS kein nennenswerter Unterschied zwischen den beiden Substanzen bestand
und auch die Wiederöffnung in der gleichen Zeit mit den gleichen
Spülwiederholungen hinreichend erfolgte.
Zur Wiederöffnung wurden die Schnitte dreimal direkt hintereinander mit 37°C
warmem RPMI-Medium gespült, 30 Minuten im Wärmeschrank inkubiert und nach
10, 20, und 30 Minuten erneut gespült.
74
1.7.3 Versuch 2: Metacholin-Reihe nach Vorinkubation in PDE-4-Hemmer
Zu Versuchsbeginn wurde die Wiederöffnung Bronchien nach Präkontraktion mit
Metacholin bzw. Acetylcholin und 20 minütiger Inkubation in Cilomilast-Lösung
(10-5 mol/L) mikroskopisch kontrolliert und fotografiert.
Genau wie in der Präkontraktionsreihe wurde dann in fünfminütigen Abständen je
20 µl Metacholin in einer Konzentration von 10-6 bis 10-2 mol/L (entspricht 10-8 bis
10-4 mol/L in der 12-well-Platte) zugegeben (Tabelle 3), und die Reaktion des
Bronchus je drei Minuten nach Zugabe fotografiert. Die Konzentration im Medium
war aufgrund der Tatsache, daß die vorherige Konzentrationstufe
Bronchokonstriktor nicht wieder ausgewaschen wurde, um ca. 10% erhöht, um
den Ermüdungseffekt der PCLS (Reaktion auf Konstriktionshemmer) über die
Versuchsdauer auszugleichen.
Um zusätzlich sicherzustellen, dass die spätere Reaktion des Bronchus unter
einer bronchodilatatorisch wirkenden Substanz nicht nur auf Ermüdung des
Schnittes (Reaktion auf Konstriktor) beruht, wurden alle Schnitte mittels oben
beschriebenem Spülverfahren nochmals wiedergeöffnet und nochmals mit der in
der Präkontraktionsreihe als wirksam ermittelten Konzentration MCh kontrahiert.
Zusätzlich wurden die Versuche 2-5 immer im Doppel- oder Dreifachansatz (je
nach Schnittmenge) durchgeführt und eine unbehandelte Kontrollgruppe im
Doppel- bzw. Dreifachansatz parallel mitfotografiert.
1.7.4 Versuch 3: Metacholin-Reihe nach Vorinkubation in Atropin
Zu Versuchsbeginn wurde die Wiederöffnung der Bronchien nach Präkontraktion
mit Metacholin bzw. Acetylcholin und 20 minütiger Inkubation in Atropin-Lösung
(10-7 mol/L,) mikroskopisch kontrolliert und fotografiert.
Die weitere Versuchsdurchführung entsprach Kapitel 1.7.3., siehe auch Tabelle 3.
75
1.7.5 Versuch 4: Metacholin-Reihe nach Vorinkubation in Ipratropium
Zu Versuchsbeginn wurde die Wiederöffnung der Bronchien nach Präkontraktion
mit Metacholin bzw. Acetylcholin und 20 minütiger Inkubation in Ipratropium-
Lösung (10-7 mol/L, Itrop® Injektionslösung, Wirkstoff Ipratropiumbromid,
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH&Co. KG, Ingelheim am Rhein)
mikroskopisch kontrolliert und fotografiert.
Die weitere Versuchsdurchführung entsprach Kapitel 1.7.3., siehe auch Tabelle 3.
1.7.6 Versuch 5: Metacholin-Reihe nach Vorinkubation in Tiotropium
Zu Versuchsbeginn wurde die Wiederöffnung der Bronchien nach Präkontraktion
mit Metacholin bzw. Acetylcholin und 20 minütiger Inkubation in Tiotropium-
Lösung (10-7 mol/L,Spiriva® Kapsel mit Inhalationspulver, Wirkstoff
Tiotropiumbromid, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH &Co.KG, Ingelheim am
Rhein und Pfizer GmbH, Karlsruhe) mikroskopisch kontrolliert und fotografiert.
Die weitere Versuchsdurchführung entsprach Kapitel 1.7.3., siehe auch Tabelle 3.
1.7.7 Versuch 6: Präkontraktionsreihe mit Histamin
Die Präkontraktionsreihe mit Histamin war ähnlich wie die Präkontraktion mit
Metacholin /Acetylcholin für die Versuche 2-5 ein Ausschlusskriterium und
Vorstufe der Versuche 6-7.
Vor Versuchsbeginn wurden die Schnitte in frisches 37°C warmes RPMI-Medium
ohne Antibiotika-Zusatz umgebettet und ihr Zustand nach Inkubation über Nacht
auf Agarosefreiheit, Wandkontraktion und Zilienschlag mikroskopisch überprüft,
dokumentiert und fotografiert.
Die PCLS wurden dann akkumulierend dem Histamin in steigender Konzentration
von 10-8 bis 10-4 mol/L ausgesetzt (Tabelle 3), wobei jeweils 20µl der Histamin-
Lösung (wegen der 100fachen Verdünnung in Konzentrationen von 10-6 bis 10-2
76
mol/L) zu dem sich in 2 ml RPMI-Medium befindlichen Schnitt pipettiert wurden.
Die Reaktion des Schnittes wurde drei Minuten nach Zugabe des Pharmakons
fotografiert, nach fünf Minuten erfolgte die Zugabe der nächsthöheren
Konzentration. Zeigte ein Schnitt bereits unter einer leichteren Konzentration
einen vollständigen Lumenverschluss, wurden die nächsthöheren
Konzentrationen Histamin nicht mehr zugegeben, um die Wiederöffnung für die
folgenden Versuche nicht unnötig zu erschweren.
Zur Wiederöffnung wurden die Schnitte analog zu den Versuchen 1-5 dreimal
direkt hintereinander mit 37°C warmem RPMI-Medium gespült, 30 Minuten im
Wärmeschrank inkubiert und nach 10, 20, und 30 Minuten erneut gespült.
1.7.8 Versuch 7: Histamin-Reihe nach Vorinkubation in Diphenhydramin
Zu Versuchsbeginn wurde die Wiederöffnung der Bronchien nach Präkontraktion
mit Histamin und 20 minütiger Inkubation in Dipenhydramin-Lösung (10-6 mol/L)
mikroskopisch kontrolliert und fotografiert.
Genau wie in der Präkontraktionsreihe wurde dann in fünfminütigen Abständen je
20 µl Histamin-Lösung in einer Konzentration von 10-6 bis 10-2 mol/L (entspricht
10-8 bis 10-4 mol/L in der 12-well-Platte) zugegeben (Tabelle 3) und die Reaktion
des Bronchus bzw. das Bronchuslumen je drei Minuten nach Zugabe fotografiert.
Um sicherzustellen, dass die spätere Reaktion des Bronchus unter einer
bronchodilatatorisch wirkenden Substanz nicht nur auf Ermüdung des Schnittes
beruht, wurden alle Schnitte mittels oben beschriebenem Spülverfahren nochmals
wiedergeöffnet und nochmals mit Metacholin in einer Konzentration von 10-5
mol/L kontrahiert, da aus der Literatur bekannt war, dass die Histaminkontraktion
in der Regel schwächer ausfällt als eine Kontraktion durch Metacholin. Die
Substanzen Histamin und Metacholin konnten so am selben Schnitt miteinander
verglichen werden; außerdem schloss die starke, für den Schnitt die dritte
Kontraktion insgesamt eine Ermüdung als Grund für die schwächere Kontraktion
unter Diphenhydramin aus. Zusätzlich wurden auch die Versuche 6-7 immer im
77
Doppelansatz durchgeführt und eine unbehandelte Kontrollgruppe im
Doppelansatz parallel mitfotografiert.
1.7.9 Versuch 8: Histamin-Reihe nach Vorinkubation in Azelastin
Zu Versuchsbeginn wurde die Wiederöffnung der Bronchien nach Präkontraktion
mit Histamin und 20 minütiger Inkubation in Azelastin-Lösung (10-11 mol/L)
mikroskopisch kontrolliert und fotografiert.
Die weitere Versuchsdurchführung entsprach Kapitel 1.7.8 (Tabelle 3).
Zur besseren Übersicht sind die Versuche 1-8 in Tabelle 3 noch einmal
dargestellt.
Tabelle 3: Versuchsübersicht über verwendete Konzentrationen und Substanzen
Reihe Versuch untersuchte Substanz
Inkubations-konzentration
[mol/L]
Broncho-konstriktor
Konstriktions-konzentration
[mol/L]
1 ACh /MCh --- ACh/MCh 10-8 bis 10-5
2 Cilomilast 10-5 MCh 10-8 bis 10-5
3 Atropin 10-7 MCh 10-8 bis 10-5
4 Ipratropium 10-7 MCh 10-8 bis 10-5
1
5 Tiotropium 10-7 MCh 10-8 bis 10-5
6 Histamin --- Histamin 10-8 bis 10-4
7 Diphenhydramin 10-6 Histamin 10-8 bis 10-4
2
8 Azelastin 10-11 Histamin 10-8 bis 10-4
78
1.8 Auswertung der mikroskopischen Bilder
Die Auswertung der mikroskopischen Bilder erfolgte mittels der Software-
Programme „Irfan View“ und „Scion Image“. Mittels „Irfan View“ wurden die von
der Kamera-Software „Remote Capture“ gelieferten Bilder zunächst in eine für
Scion Image lesbare Form gebracht, d.h. sie wurden in ihrer Größe dem
Bildschirm angepasst, von Farbe in Schwarz-Weiß umgewandelt und in das TIFF-
Format überführt. Diese Bilder konnten dann in „Scion Image“ etwas abgedunkelt
werden, um die Epithelgrenzen besser darzustellen und dann manuell vermessen
werden. Dazu wurden die Epithelgrenzen je dreimal mit dem Cursur umfahren,
die Fläche des Bronchuslumens vom Programm berechnet und das Ergebnis
gemittelt. Die vom Programm errechneten Pixelzahlen wurden dann in Prozent
umgerechnet, wobei die Ursprungs- bzw. Wiederöffnungsfläche des Bronchus
gleich 100% gesetzt wurde. Die Bronchokonstriktion als Abnahme des
Bronchuslumens wurde ebenfalls in Prozent dargestellt, z.B. 70% des jeweiligen
Ausgangslumens. Bronchienanschnitte verschiedener Größe konnten so
miteinander verglichen werden.
1.9 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der ersten Versuchsreihe (Cilomilast, Atropin,
Ipratropium und Tiotropium) wurde mit SAS (SAS, 2005) durchgeführt. Eine
statistische Auswertung der zweiten Versuchsreihe (Diphenhydramin und
Azelastin) war nicht möglich, da einige Kurvenverläufe nicht auswertbar waren
(Konzentration, die eine 50% Bronchuslumenreduktion bewirkt, war nicht
ablesbar) und so nicht genügend Daten für eine statistische Auswertung vorlagen.
Die weitere Darstellung der statistischen Auswertung bezieht sich daher
ausschließlich auf Versuchsreihe 1 (Versuch 1-5).
Aufgrund einer Linksverschiebung der Messwerte wurden diese logarithmisch
transformiert, um sie in eine annähernde Normalverteilung zu überführen. Der
79
Test auf Normalverteilung wurde mit Hilfe des Shapiro-Wilk-Test unter SAS
durchgeführt.
Die PCLS eines Pferdes wurden jeweils zur Hälfte durch ACh bzw. MCh in einer
aufsteigenden Konzentrationsreihe präkontrahiert. Mit einer 2-faktoriellen
Varianzanalyse (Procedure GLM, SAS 2005) wurde auf signifikante Unterschiede
zwischen den beiden Substanzen bei verschiedenen Konzentrationsstufen
getestet.
Die PCLS eines Pferdes wurden nach Wiederöffnung vergleichend nach
Inkubation in einer konstriktionshemmenden Substanz (Versuchsgruppe) und
nach Inkubation in einer äquivalenten Menge physiologischer Kochsalzlösung
(Kontrollgruppe) untersucht. Die einzelnen PCLS wurden dabei mehrfach
(repeated measurements) unter vier Konzentrationsstufen des Metacholins
abfotographiert und die Bronchuslumenfläche digital ausgewertet. Aus den
entstandenen Kurven wurde die EC50 der einzelnen PCLS errechnet.
Anschließend wurde eine Varianzanalyse der Präkontraktions- und
Hauptkontraktionswerte für Repeated Measurements durchgeführt. Unter der
Nullhypothese, zwischen Prä- und Hauptkontraktion bestehe kein Unterschied,
wurde die MANOVA durchgeführt. Mit Hilfe des Wilks’ Lambda Test wurde dann
auf Signifikanz getestet. War p < 0,05 wurde diese Hypothese abgelehnt, d.h. es
bestand ein statistisch signifikanter (p ≤ 0,05), hochsignifikanter (p ≤ 0,01) oder
höchstsignifikanter (p ≤ 0,001) Unterschied zwischen Prä- und Hauptkontraktion.
Des Weiteren wurde die Streuung zwischen den PCLS (Kapitel 2.12, Tabelle 12),
hinsichtlich der Frage untersucht, ob diese Streuung hauptsächlich zwischen den
PCLS verschiedener Pferde (interindividueller Unterschied) oder zwischen den
PCLS des einzelnen Pferdes (intraindividueller Unterschied) begründet lag.
Hierzu wurde ebenfalls eine MANOVA unter der Nullhypothese, zwischen den
Mittelwerten der einzelnen Pferde bzw. zwischen den einzelnen PCLS eines
Pferdes bestehe kein Unterschied, durchgeführt. Zu den Ergebnissen siehe
Kapitel 2.12.
80
2. Ergebnisse der eigenen Versuche
2.1 Probandengut
Insgesamt wurden für die Arbeit 27 Pferde verwendet. Einzelne PCLS bzw. in
einigen Fällen auch alle PCLS aus einer Lunge zeigten jedoch mangelhafte
Kontraktilität für die Verwendung in den Versuchen. So dienten sieben Lungen
zunächst dem Erlernen und Verfeinern der Methodik, eine Lunge konnte aufgrund
verklebungsbedingter Pleuraläsionen nicht mit Agarose befüllt werden, die aus
vier Lungen gewonnenen und inkubierten PCLS verkeimten und zeigten
Vitalitätsverlust nach der Agaroseauswaschphase, die PCLS einer Lunge zeigten
in Prä- und Kontrollkontraktion unzureichende Reagibilität und in einem Fall
verloren die PCLS ihre Vitalität aus ungeklärten Gründen (Tabelle 1). Aus 13
Lungen konnten auswertbare Ergebnisse in den Vor- und Hauptversuchen
gewonnen werden.
Alle Probanden der Hauptversuchsreihe (Nr. 8-27, Tabelle 1) wurden nach dem
Score-System (OHNESORGE et al., 1998) mittels klinischer Untersuchung,
Tracheobronchoskopie, TBS- und Blutgasanalyse untersucht und konnten hierbei
eine Punktzahl zwischen 0 und 14 Punkten erreichen. Patienten mit 0-1 Punkt
galten hierbei als lungengesund, bei 2-3 Punkten als geringgradig, bei 4-6
Punkten als mittelgradig und bei sieben und mehr Punkten als hochgradig
erkrankt. Von den 20 Pferden in den Hauptversuchsreihen konnten sechs als
lungengesund (Pferd 12, 13, 20, 23, 25, und 27), drei als geringradig (Pferd 8, 10,
11), neun als mittelgradig (Pferd 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 und 22) und zwei als
hochgradig (Pferd 24 und 26) erkrankt eingestuft werden.
In Tabelle 4 sind die Ergebnisse der Einzeltieruntersuchungen, ausgewertet mit
dem Score-System nach OHNESORGE et al. (1998) dargestellt.
Ein Zusammenhang zwischen dem klinischen Score und den Ergebnissen der
Untersuchungen an den PCLS wird in entsprechendem Abschnitt dargestellt
(Kapitel 4.4.4 und 4.5).
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83
2.2 Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung
Die histopathologische Untersuchung (jeweils aus Lobus accessorius, cranialis
und caudalis) durch das Institut für Veterinär-Pathologie der Freien Universität
Berlin ergab überwiegend keine Hinweise auf eine klinisch bedeutsame
Pneumopathie. Der Nachweis von eosinophilen Granulozyten peribronchial bzw.
vereinzelt auch interstitiell zusammen mit vermehrter lymphozytärer Infiltration,
einer Hypertrophie der Bronchialmuskulatur, Fibrosen sowie
Sekretansammlungen in den Luftwegen ist mit dem Bestehen einer COB
vereinbar.
Bei einigen Pferden ergaben sich zusätzlich Anhaltspunkte für ein entzündliches
Geschehen im Sinne einer katarrhalisch-eitrigen Bronchitis bzw. eitrigen
Peribronchitis. Zusätzlich lagen an allen Proben Veränderungen (u.a. Blutungen,
subpleuraler und interstitieller Lymphstau, Zerreißungen von Alveolarwänden)
vor, die vermutlich durch Entnahme und Bearbeitung bedingt waren.
Die detaillierten Untersuchungsergebnisse der einzelnen Lobi sind in Tabelle 15
im Anhang dargestellt. Zur Auswertung der Ergebnisse siehe Tabelle 5.
Tab
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5:
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10
3
13
86
2.3 Ergebnisse der Vorversuche zur Konzentrationsermittlung der zu untersuchen-den Pharmaka
2.3.1 PDE-4-Hemmer (Cilomilast)
Im Vorversuch (zur Durchführung siehe Kapitel 1.7.1.1) zeigte sich nach
Inkubation des PCLS in Cilomilast in einer Konzentration von 10-5 mol/L eine
Rechtsverschiebung der visuell sichtbaren Bronchokonstriktion um zwei
Zehnerpotenzen, d.h. der Schnitt kontrahierte nach Inkubation in Cilomilast erst
bei 10-5 mol/L Metacholin visuell deutlich, während er dies in der
Präkontraktionsreihe ohne Cilomilast bereits bei 10-7 mol/L getan hatte. Eine
Inkubation in 10-3 molarer Cilomilast-Lösung führte nur noch zu einer 19%igen
Lumenreduktion durch Metacholin (10-5 mol/L), während der Schnitt in der
Präkontraktionsreihe eine 98%ige Lumenreduktion bei gleicher
Metacholinkonzentration gezeigt hatte. Diese Hemmung wurde als zu stark für
den folgenden Versuch angesehen, da sich durch eine zu starke Hemmung keine
Kurven mehr darstellen lassen. Für die folgenden Reihenuntersuchungen wurde
Cilomilast in einer Konzentration von 10-5 mol/L verwendet.
2.3.2 Atropin
Analog zu Kapitel 1.7.1.1 wurde auch der Vorversuch für Atropin durchgeführt.
Die sechs Schnitte wurden in aufsteigender Konzentration von 10-9 bis 10-4
mol/LAtropin-Lösung inkubiert, wobei sich eine wirksame Konzentration von 10-7
mol/L ergab. Bei dieser Konzentration zeigte der Schnitt eine Lumenreduktion um
29% durch Metacholin (10-5 mol/L) gegenüber 62% in der Präkontraktion, d.h.
eine Differenz von 33%. Bei 10-9 mol/L betrug die Lumenreduktionsdifferenz 0%,
bei 10-4 mol/L zeigte der Schnitt nur noch 22% Lumenreduktion.
87
2.3.3 Ipratropium
Aufgrund des ähnlichen Wirkungsmechanismus des Ipratropiums zu Atropin
wurde für diese Substanz keine eigene Vorversuchsreihe durchgeführt. Wie die
Ergebnisse der ersten Versuchsreihen bestätigten, kann auch für das Ipratropium
eine Konzentration von 10-7 mol/L für den Ex-Vivo-Versuch als wirksam betrachtet
werden.
2.3.4 Tiotropium
Da das Tiotropium in die gleiche Wirkstoffgruppe wie Atropin und Ipratropium fällt,
wurde auch hier kein eigener Vorversuch durchgeführt und in den folgenden
Versuchsreihen mit einer Konzentration von 10-7 mol/L gearbeitet.
2.3.5 Diphenhydramin
Die Vorversuche für Diphenhydramin und Azelastin wurden analog Kapitel 1.7.1.1
durchgeführt; die Bronchokonstriktion wurde für diese beiden Antihistaminika
allerdings durch Histamin ausgelöst, wobei die Schnitte eine Versuchsreihe mit
Konzentrationen von 10-8 mol/L bis 10-4 mol/L Histamin durchliefen. Wie bereits
durch VIETMEYER et al (2004) an PCLS der Pferdelunge gezeigt, bestätigte sich
10-6 mol/L Diphenhydramin als wirksame Konzentration, die in den folgenden
Versuchen verwendet wurde.
2.3.6 Azelastin
Da der Wirkungsmechanismus des Azelastins dem des Diphenhydramin
vergleichbar ist, wurde der Vorversuch zunächst mit Konzentrationen ein einem
nahegelegenen Bereich durchgeführt. Da die Schnitte nach Inkubation in 10-4 bis
10-8 molarer Azelastin-Lösung jedoch keinerlei Konstriktion mehr zeigten, wurde
der Vorversuch mit geringeren Konzentrationen wiederholt, wobei hierbei
88
Verdünnungen bis auf 10-14 mol/L verwendet wurden. Als bestgeeignetste
Konzentration ergab sich 10-11 mol/L Azelastin, da bei 10-10 mol/L Azelastin bis zu
einer Histaminkonzentration von 10-6 mol/L keine nennenswerte Kontraktion
auftrat und erst bei 10-5 mol/L Histamin eine Lumenreduktion um 35% zu
beobachten war. Bei 10-12 mol/L Azelastin war eine sehr steile Kurve zu sehen,
wobei der Schnitt unter 10-5 mol/L Histamin einen vollständigen Verschluss des
Lumens zeigte.
2.4 Versuch 1: Präkontraktionsreihe mit Metacholin und Acetylcholin im Vergleich
Der Versuch zur vergleichenden bronchokonstriktorischen Wirkung von Meta- und
Acetylcholin wurde an sechs Pferden (Nr. 8, 9, 10,12, 16 und 17) und insgesamt
65 PCLS durchgeführt. Diese PCLS entstammten Bronchien des Lobus
accessorius mit einem Durchmesser von 0,1 cm und weniger. Von jedem Pferd
wurde jeweils die Hälfte aller inkubierten PCLS ohne Vitalitätsmängel mit
Acetylcholin (33 Schnitte) in aufsteigender Konzentration, die andere Hälfte mit
Metacholin (32 Schnitte) behandelt. Die Einteilung in die beiden Gruppen erfolgte
dabei zufällig. An einem weiteren Pferd (Nr. 18), das zur Konzentrationsermittlung
in den Vorversuchen diente, wurden ebenfalls 18 PCLS mit Metacholin behandelt.
Da hier jedoch kein Vergleich mit Acetylcholin durchgeführt wurde, sind diese
PCLS in Auswertung dieses Versuches nicht enthalten.
Die PCLS der Metacholin-Reihe erreichten bei der Endkonzentration von 10-5
mol/L ein Bronchuslumen von durchschnittlich 10,85% des Ausgangslumens, die
PCLS der Acetylcholin-Reihe erreichten 19,45%. Eine Bronchuslumenreduktion
um 50% wurde bei Metacholin durchschnittlich durch 6,64 [10-x mol/L] erreicht, bei
Acetylcholin durch 6,88 [10-x mol/L]. Zwischen den beiden Substanzen fand sich
bei keiner Konzentrationsstufe ein signifkanter Unterschied (Tabelle 6).
Abbildung 12 zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion nach
Applikation der zu vergleichenden Substanzen.
89
Abb. 12: Bronchokonstriktion beim Pferd nach Metacholin bzw. Acetylcholin,
Dosis-Wirkungsbeziehung mit einer Steigerung der ACh/MCh-Konzentration im
Medium in Zehnerpotenzen in einem Abstand von 5 min, Angabe der Fläche des
Bronchuslumen in % des Ausgangswertes (n = 6 Pferde), Darstellung der
Mittelwerte ± Standardabweichung
Tabelle 6: Darstellung der p-Werte für Bronchusluminadifferenzen bei
verschiedenen Konzentrationstufen ACh/MCh [mol-x/L] im Medium und die
dadurch ausgelöste Bronchuslumenreduktion, zwischen ACh und MCh besteht
bei keiner Konzentrationsstufe ein signifikanter Unterschied (p > 0,05)
Konzentration MCh/ACh
im Medium [mol-x/L]
8
7
6
5
p-Wert zwischen
ACh/MCh
0,5647
0,4795
0,2227
0,1537
0
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60
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120
vorher 8 7 6 5Konzentration MCh/ACh [10-x mol/L]
Bron
chus
lum
en [%
]
AChMCh
90
2.3 Versuch 2: MCh-Reihe nach Inkubation in PDE-4-Hemmer
Der Versuch wurde an sechs Pferden (Nr. 8, 9, 10, 12, 16 und 17) und insgesamt
29 PCLS durchgeführt. Dabei waren 14 PCLS in der Versuchs- und 15 PCLS in
der parallel laufenden Kontrollgruppe. Von jedem Pferd nahmen –je nach
Schnittausbeute- mindestens zwei Schnitte an der Versuchs- und an der
Kontrollstudie teil. Alle Schnitte wurden zunächst Versuch 1 unterzogen, um
anhand der Metacholin- bzw. Acetylcholin-Präkontraktion ihre Vitalität und
Kontraktilität zu überprüfen. Nach der 30-minütigen Wiederöffnungsphase und
insgesamt fünfmaligem Spülen mit 37°C warmem RPMI-Medium wurden die
PCLS der Versuchsgruppe für 20 Minuten in Cilomilast (10-5 mol/L) inkubiert; der
Kontrollgruppe wurde eine äquivalente Menge physiologischer Kochsalzlösung
zugegeben und diese ebenfalls für 20 Minuten im Wärmeschrank inkubiert.
Nach der Inkubationsphase wurde zunächst das wieder erreichte Bronchuslumen
abfotographiert und für die Hauptkontraktion als 100% angenommen. Danach
wurde erneut eine Metacholin-Reihe durchgeführt. Die Metacholin-
Konzentrationen wurden in Zehnerpotenzen von 10-8 mol/L auf 10-5 mol/L im
Medium gesteigert und so eine Konzentrations-Wirkungsbeziehung für die
Versuchs- und Kontrollgruppe ermittelt.
Bei den PCLS von vier aus sechs Pferden war ein deutlicher Effekt durch die
Inkubation in Cilomilast messbar. Im geometrischen Mittel betrug dieser Effekt
mehr als eine halbe Zehnerpotenz. So wurde in der Versuchsgruppe eine 50%ige
Bronchuslumenreduktion im geometrischen Mittel durch 5,84 [10-x mol/L] */: 7,55
(geometrische Standardabweichung) ausgelöst, während in der
Präkontraktionsreihe 6,55 [10-x mol/L] */: 9,20 den gleichen Effekt erreicht hatten.
In der Kontrollgruppe waren während der Präkontraktion 6,53 [10-x mol/L] */: 7,15
notwendig, in der Hauptkontraktion 6,56 [10-x mol/L] */: 5,67 (Tabelle 7). Der durch
Cilomilast verursachte Effekt war statistisch nicht signifikant (p=0,6238, siehe
hierzu auch Kapitel 2.12 Statistische Auswertung).
Abbildung 13a zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion während Prä-
und Versuchskontraktion. Abbildung 13b zeigt die einzelnen Stadien der
Bronchokonstriktion während Prä- und Kontrollkontraktion. Die
Einzeltierdarstellungen mit den einzelnen PCLS finden sich im Anhang.
91
[a]
[b]
Abb. 13a/b: Bronchokonstriktion nach Metacholin der Präkontraktion versus
Hauptkontraktion nach Inkubation in Cilomilast (20 min, 10-5 mol/L) [a] bzw.
versus Hauptkontraktion der Kontrollgruppe [b]. Dosis-Wirkungsbeziehung mit
einer Steigerung der MCh-Konzentration im Medium in Zehnerpotenzen in einem
Abstand von 5 min, Angabe der Fläche des Bronchuslumen in % des
Ausgangswertes (n=6 Pferde), p-Wert zwischen Prä- und Hauptkontraktion =
0,6238 (n.s.), p-Wert zwischen Prä- und Kontrollkontraktion = 0,5075 (n.s.)
0
20
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60
80
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vorher 8 7 6 5
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
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en [%
]
PräkontraktionHauptkontraktion
0
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120
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160
180
vorher 8 7 6 5
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
PräkontraktionHauptkontraktion
Cilomilast
Kontrolle
92
Tabelle 7: Vergleichende Darstellung der negativen Exponenten der molaren
Konzentrationen von Metacholin [10-x mol/L], welche eine 50%ige
Bronchuslumenreduktion in der Präkontraktion, Hauptkontraktion nach Inkubation
in Cilomilast bzw. Hauptkontraktion der Kontrollgruppe verursachten,
geometrischer Mittelwert [10-x mol/L] und geometrische Standardabweichung
Pferd Präkontraktion Cilomilast Präkontraktion Kontrolle
8 7,19 6,41 7,29 7,45 9 6,63 6,50 6,31 7,12
10 7,56 5,44 7,40 6,84 12 5,33 6,59 5,30 5,73 16 7,20 4,30 7,03 6,64 17 5,41 5,85 5,82 5,58
geom. Mittelwert 6,55 5,84 6,53 6,56 geom. Standardabw. 9,20 7,55 7,15 5,67
2.6 Versuch 3: MCh-Reihe nach Inkubation in Atropin
Der Versuch wurde an sechs Pferden (Nr. 8, 9, 10, 12, 16 und 17) und insgesamt
26 PCLS durchgeführt. Dabei waren 12 PCLS in der Versuchs- und 14 PCLS in
der parallel laufenden Kontrollgruppe. Die unterschiedliche Anzahl in Versuchs-
und Kontrollgruppe ergab sich durch die Tatsache, daß nach der Präkontraktion
unterschiedlich viele PCLS aussortiert werden mussten. Von jedem Pferd nahmen
jeweils mindestens zwei Schnitte an der Versuchs- bzw. an der Kontrollstudie teil.
Alle Schnitte wurden zunächst Versuch 1 unterzogen, um anhand der Metacholin-
bzw. Acetylcholin-Präkontraktion ihre Vitaliät und Kontraktilität zu überprüfen.
Nach der 30-minütigen Wiederöffnungsphase und insgesamt fünfmaligem Spülen
mit 37°C warmem RPMI-Medium wurden die PCLS der Versuchsgruppe für 20
Minuten in Atropin (10-7 mol/L) inkubiert; der Kontrollgruppe wurde eine
äquivalente Menge physiologischer Kochsalzlösung zugegeben und diese PCLS
ebenfalls für 20 Minuten im Wärmeschrank inkubiert.
Nach der Inkubationsphase wurde zunächst das wieder erreichte Bronchuslumen
abfotographiert, danach wurde erneut eine Metacholin-Reihe durchgeführt. Die
93
applizierten Metacholin -Konzentrationen wurden in Zehnerpotenzen von 10-8
mol/L auf 10-5 mol/L gesteigert und so eine Konzentrations-Wirkungsbeziehung
für die Versuchs- und Kontrollgruppe ermittelt.
Bei fünf von sechs Pferden war ein deutlicher Unterschied durch die Inkubation in
Atropin zu erkennen. Im Mittel betrug dieser Effekt mehr als eine Zehnerpotenz.
So wurde in der Versuchsgruppe eine 50%ige Bronchuslumenreduktion im
geometrischen Mittel durch <5,95 [10-x mol/L] */: 52,28 ausgelöst, während in der
Präkontraktionsreihe 6,85 [10-x mol/L] */: 9,88 den gleichen Effekt erreicht hatten.
In der Kontrollgruppe waren während der Hauptkontraktion 6,56 [10-x mol/L] */:
5,67 notwendig, in der Präkontraktion durchschnittlich 6,53 [10-x mol/L] */: 7,15
(Tabelle 8). Der durch Atropin hervorgerufene Effekt war statistisch
hochsignifikant (p = 0,0031, siehe hierzu auch Kapitel 2.12 Statistische
Auswertung).
Abbildung 14a zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion während Prä-
und Versuchskontraktion. Abbildung 14b zeigt die einzelnen Stadien der
Bronchokonstriktion während Prä- und Kontrollkontraktion.Die Darstellungen mit
den einzelnen PCLS finden sich im Anhang.
Tabelle 8: Vergleichende Darstellung der negativen Exponenten der molaren
Konzentrationen von Metacholin [10-x mol/L], welche eine 50%ige
Bronchuslumenreduktion in der Präkontraktion, Hauptkontraktion nach Inkubation
in Atropin bzw. Hauptkontraktion der Kontrollgruppe verursachten, geometrischer
Mittelwert [10-x mol/L] und geometrische Standardabweichung
Pferd Präkontraktion Atropin Präkontraktion Kontrolle
8 7,23 6,76 7,29 7,45 9 6,42 < 4,00 6,31 7,12
10 7,57 5,57 7,40 6,84 12 5,27 < 4,00 5,30 5,73 16 8,08 7,20 7,03 6,64 17 6,55 8,14 5,82 5,58
geom. Mittelwert 6,85 < 5,95 6,53 6,56 geom. Standardabw. 9,88 52,28 7,15 5,67
94
[a]
[b]
Abb. 14a/b Bronchokonstriktion nach Metacholin der Präkontraktion versus
Hauptkontraktion nach Inkubation in Atropin (20 min, 10-7 mol/L) [a] bzw. versus
Hauptkontraktion der Kontrollgruppe [b]. Dosis-Wirkungsbeziehung mit einer
Steigerung der MCh-Konzentration im Medium in Zehnerpotenzen in einem
Abstand von 5 min, Angabe der Fläche des Bronchuslumen in % des
Ausgangswertes (n=6 Pferde), p-Wert zwischen Prä- und Hauptkontraktion =
0,0031 (**), p-Wert zwischen Prä- und Kontrollkontraktion = 0,5075 (n.s.)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
vorher 8 7 6 5
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
PräkontraktionHauptkontraktion
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
vorher 8 7 6 5
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
PräkontraktionHauptkontraktion
Atropin
Kontrolle
95
2.7 Versuch 4: MCh-Reihe nach Inkubation in Ipratropium
Der Versuch wurde an sechs Pferden (Nr. 9, 10, 12, 16, 17 und 18) und
insgesamt 26 PCLS durchgeführt. Dabei waren 12 PCLS in der Versuchs- und 14
PCLS in der parallel laufenden Kontrollgruppe. Von jedem Pferd nahmen jeweils
mindestens zwei Schnitte an der Versuchs- bzw. an der Kontrollstudie teil. Alle
Schnitte wurden zunächst Versuch 1 unterzogen, um anhand der Metacholin-
bzw. Acetylcholin-Präkontraktion ihre Vitaliät und Kontraktilität zu überprüfen.
Nach der 30-minütigen Wiederöffnungsphase und insgesamt fünfmaligem Spülen
mit 37°C warmem RPMI-Medium wurden die PCLS der Versuchsgruppe für 20
Minuten in Ipratropium (10-7 mol/L) inkubiert; der Kontrollgruppe wurde eine
äquivalente Menge physiologischer Kochsalzlösung zugegeben und diese PCLS
ebenfalls für 20 Minuten im Wärmeschrank inkubiert.
Nach der Inkubationsphase wurde zunächst das wieder erreichte Bronchuslumen
abfotographiert, danach wurde erneut eine Metacholin-Reihe durchgeführt. Die
applizierten Metacholin -Konzentrationen wurden in Zehnerpotenzen von 10-8
mol/L auf 10-5 mol/L gesteigert und so eine Konzentrations-Wirkungsbeziehung
für die Versuchs- und Kontrollgruppe ermittelt.
Bei vier von sechs Pferden war ein deutlicher Effekt durch die Inkubation in
Iptratropium zu erkennen. Im geometrischen Mittel betrug dieser Effekt mehr als
eine halbe Zehnerpotenz. So wurde in der Versuchsgruppe eine 50%ige
Bronchuslumenreduktion durch 6,49 [10-x mol/L] */: 17,78 ausgelöst, während in
der Präkontraktionsreihe 7,01 [10-x mol/L] */: 7,94 den gleichen Effekt erreicht
hatten. In der Kontrollgruppe waren während der Hauptkontraktion 6,40 [10-x
mol/L] */: 4,13 notwendig, in der Präkontraktion durchschnittlich 6,51 [10-x mol/L]
*/: 6,85 (Tabelle 9). Der durch Ipratropium hervorgerufene Effekt war statistisch
hochsignifikant (p-Wert = 0,0058, siehe hierzu auch Kapitel 2.12 Statistische
Auswertung).
Abbildung 15a zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion während Prä-
und Versuchskontraktion. Abbildung 15b zeigt die einzelnen Stadien der
Bronchokonstriktion während Prä- und Kontrollkontraktion. Die
Einzeltierdarstellungen mit den einzelnen PCLS finden sich im Anhang.
96
[a]
[b]
Abb. 15a/b: Bronchokonstriktion nach Metacholin der Präkontraktion versus
Hauptkontraktion nach Inkubation in Ipratropium (20 min, 10-7 mol/L) [a] bzw.
versus Hauptkontraktion der Kontrollgruppe [b]. Dosis-Wirkungsbeziehung mit
einer Steigerung der MCh-Konzentration im Medium in Zehnerpotenzen in einem
Abstand von 5 min, Angabe der Fläche des Bronchuslumen in % des
Ausgangswertes (n=6 Pferde) , p-Wert zwischen Prä- und Hauptkontraktion =
0,0058 (**), p-Wert zwischen Prä- und Kontrollkontraktion =0,5075 (n.s.)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
vorher 8 7 6 5
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
PräkontraktionHauptkontraktion
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vorher 8 7 6 5
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
PräkontraktionHauptkontraktion
Ipratropium
Kontrolle
97
Tabelle 9: Vergleichende Darstellung der negativen Exponenten der molaren
Konzentrationen von Metacholin [10-x mol/L], welche eine 50%ige
Bronchuslumenreduktion in der Präkontraktion, Hauptkontraktion nach Inkubation
in Ipratropium bzw. Hauptkontraktion der Kontrollgruppe verursachten,
geometrischer Mittelwert [10-x mol/L] und geometrische Standardabweichung
Pferd Präkontraktion Ipratropium Präkontraktion Kontrolle
9 6,63 7,28 6,31 7,12 10 7,08 4,95 7,40 6,84 12 5,38 5,22 5,30 5,73 16 7,67 7,19 7,03 6,64 17 7,73 8,11 5,82 5,58 18 7,55 6,19 7,18 6,46
geom. Mittelwert 7,01 6,49 6,51 6,40 geom. Standardabw. 7,94 17,78 6,85 4,13
2.8 Versuch 5: MCh-Reihe nach Inkubation in Tiotropium
Der Versuch wurde an sechs Pferden (Nr 9, 10, 16, 12, 17 und 18) und insgesamt
26 PCLS durchgeführt. Dabei waren 12 PCLS in der Versuchs- und 14 PCLS in
der parallel laufenden Kontrollgruppe. Von jedem Pferd nahmen jeweils
mindestens zwei Schnitte an der Versuchs- bzw. an der Kontrollstudie teil. Alle
Schnitte wurden zunächst Versuch 1 unterzogen, um anhand der Metacholin-
bzw. Acetylcholin-Präkontraktion ihre Vitaliät und Kontraktilität zu überprüfen.
Nach der 30-minütigen Wiederöffnungsphase und insgesamt fünfmaligem Spülen
mit 37°C warmem RPMI-Medium wurden die PCLS der Versuchsgruppe für 20
Minuten in Tiotropium (10-7 mol/L) inkubiert; der Kontrollgruppe wurde eine
äquivalente Menge physiologischer Kochsalzlösung zugegeben und diese PCLS
ebenfalls für 20 Minuten im Wärmeschrank inkubiert.
Nach der Inkubationsphase wurde zunächst das wieder erreichte Bronchuslumen
abfotographiert, danach wurde erneut eine Metacholin-Reihe durchgeführt. Die
applizierten Metacholin-Konzentrationen wurden in Zehnerpotenzen von 10-8
mol/L auf 10-5 mol/L gesteigert und so eine Konzentrations-Wirkungsbeziehung
für die Versuchs- und Kontrollgruppe ermittelt.
98
Bei vier von sechs Pferden war ein deutlicher Effekt durch die Inkubation in
Tiotropium zu erkennen. Im geometrischen Mittel betrug dieser Effekt fast eine
Zehnerpotenz. So wurde in der Versuchsgruppe eine 50%ige Bronchuslumen-
reduktion durch 6,09 [10-x mol/L] */: 11,00 ausgelöst, während in der Präkontrak-
tionsreihe 7,06 [10-x mol/L] */: 11,60 den gleichen Effekt erreicht hatten. In der
Kontrollgruppe waren während der Hauptkontraktion 6,40 [10-x mol/L] */: 4,13
notwendig, in der Präkontraktion durchschnittlich 6,51 [10-x mol/L] */: 6,85 (Tabelle
10). Der durch Tiotropium verursachte Effekt war statistisch signifikant (p-
Wert=0,0162, siehe hierzu auch Kapitel 2.12 Statistische Auswertung).
Abbildung 16a zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion während Prä-
und Versuchskontraktion. Abbildung 16b zeigt die einzelnen Stadien der
Bronchokonstriktion während Prä- und Kontrollkontraktion. Die
Einzeltierdarstellungen mit den einzelnen PCLS finden sich im Anhang.
Tabelle 10: Vergleichende Darstellung der negativen Exponenten der molaren
Konzentrationen von Metacholin [10-x mol/L], welche eine 50%ige
Bronchuslumenreduktion in der Präkontraktion, Hauptkontraktion nach Inkubation
in Tiotropium bzw. Kontrollkontraktion verursachten, geometrischer Mittelwert
[10-x mol/L] und geometrische Standardabweichung
Pferd Präkontraktion Tiotropium Präkontraktion Kontrolle
9 6,29 7,15 6,31 7,12 10 7,48 4,29 7,40 6,84 12 5,33 5,51 5,30 5,73 16 7,58 6,26 7,03 6,64 17 8,30 6,49 5,82 5,58 18 7,37 6,82 7,18 6,46
geom. Mittelwert 7,06 6,09 6,51 6,40 geom. Standardabw. 11,60 11,00 6,85 4,13
99
[a]
[b]
Abb. 16a/b: Bronchokonstriktion nach Metacholin der Präkontraktion versus
Hauptkontraktion nach Inkubation in Tiotropium (20 min, 10-7 mol/L) [a] bzw.
versus Hauptkontraktion der Kontrollgruppe [b]. Dosis-Wirkungsbeziehung mit
einer Steigerung der MCh-Konzentration im Medium in Zehnerpotenzen in einem
Abstand von 5 min, Angabe der Fläche des Bronchuslumen in % des
Ausgangswertes (n=6 Pferde), p-Wert zwischen Prä- und Hauptkontraktion =
0,0162 (*), p-Wert zwischen Prä- und Kontrollkontraktion = 0,5075 (n.s.)
0
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Konzentration MCh [10-x mol/L]
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]
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vorher 8 7 6 5
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
PräkontraktionHauptkontraktion
Tiotropium
Kontrolle
100
2.9 Versuch 6: Präkontraktionsreihe mit Histamin
Dieser Versuch ging, ähnlich wie Versuch 1 den Versuchen 2-5 vorgeschaltet
war, den Versuchen 7-8 voraus, um die PCLS vor Kontakt mit den zu prüfenden
Substanzen auf ihre Reagibilität und Kontraktilität zu prüfen. Außerdem sollte
durch den Vergleich der Präkontraktionsreihe mit Histamin mit der
Nachkontraktion mit Metacholin in Versuch 7-8 der Reaktionsunterschied der
PCLS auf Histamin und Metacholin untersucht werden, da aus der Literatur von
anderen Spezies bekannt war, dass die Reaktion auf Histamin deutlich schwächer
zu erwarten ist als auf Metacholin. Ziel war es, diesen Reaktionsunterschied für
das Pferd zu objektivieren und auszuschließen, dass die PCLS bereits
ursprünglich schwach reagibel waren.
Der Versuch wurde durchgeführt mit 49 PCLS von sieben Probanden (18, 26, 23,
20, 25, 19 und 21). Nach Fotographie des Ausgangszustandes wurde die
applizierte Histamin-Konzentrationen in Zehnerpotenzen von 10-8 mol/L auf 10-4
mol/L gesteigert und so eine Konzentrations-Wirkungsbeziehung ermittelt. Das
Ausgangslumen wurde für alle PCLS auf 100% gesetzt und die prozentuale
Bronchokonstriktion errechnet. Die PCLS erreichten bei der Endkonzentration von
10-4 mol/L ein Bronchuslumen von durchschnittlich 39,78%; die PCLS der
Metacholin-Reihe aus Versuch 1 erreichte dagegen bereits bei 10-5 mol/L ein
Bronchuslumen von 10,85%. Eine Bronchuslumenreduktion um 50% wurde bei
7,4 [10-x mol/L] Histamin erreicht, bei Metacholin durchschnittlich durch 6,64 [10-x
mol/L].
Abbildung 17 zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion nach
Applikation des Histamins.
101
Abb. 17: Bronchokonstriktion der Präkontraktion durch Applikation von Histamin.
Dosis-Wirkungsbeziehung mit einer Steigerung der Histamin-Konzentration in
Zehnerpotenzen in einem Abstand von 5 min, Angabe der Fläche des
Bronchuslumen in % des Ausgangswertes (n=7 Pferde), Darstellung der
Mittelwerte ± Standardabweichung
2.10 Versuch 7: Histamin-Reihe nach Inkubation in Diphenhydramin
Der Versuch wurde an sechs Pferden (Nr. 21, 20, 23, 26, 25 und 27) und
insgesamt 25 PCLS durchgeführt. Dabei waren 13 PCLS in der Versuchs- und 12
PCLS in der parallel laufenden Kontrollgruppe. Von jedem Pferd nahmen jeweils
mindestens zwei Schnitte an der Versuchs- bzw. an der Kontrollstudie teil. Alle
Schnitte wurden zunächst Versuch 6 unterzogen, um anhand der Histamin-
Präkontraktion ihre Vitaliät und Kontraktilität zu überprüfen. Nach der 30-
minütigen Wiederöffnungsphase und insgesamt fünfmaligem Spülen mit 37°C
warmem RPMI-Medium wurden die PCLS der Versuchsgruppe für 20 Minuten in
Diphenhydramin (10-6 mol/L) inkubiert; der Kontrollgruppe wurde eine äquivalente
0
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Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bron
chus
lum
en [%
]
102
Menge physiologischer Kochsalzlösung zugegeben und diese PCLS ebenfalls für
20 Minuten im Wärmeschrank inkubiert.
Nach der Inkubationsphase wurde zunächst das wieder erreichte Bronchuslumen
abfotographiert, danach wurde erneut eine Histamin-Reihe durchgeführt. Die
applizierten Histamin-Konzentrationen wurden in Zehnerpotenzen von 10-8 mol/L
auf 10-4 mol/L im Medium gesteigert und so eine Konzentrations-
Wirkungsbeziehung für die Versuchs- und Kontrollgruppe ermittelt.
In der Versuchsgruppe war nur bei drei Pferden eine die 50%ige
Bronchuslumenreduktion auslösende Konzentration zu ermitteln, da die
Kurvenverläufe der übrigen Pferde zu indifferent verliefen, und so der Punkt der
50%igen Bronchuslumenreduktion scheinbar mehrmals überschritten wurde
(siehe Einzeltierdarstellungen im Anhang). In der Kontrollgruppe schwächte sich
die Reagibilität der PCLS in der zweiten Kontraktion bei mehreren Pferden
ebenfalls so stark ab, dass keine ausreichende Anzahl Probanden messbar war
(Tabelle 11). Eine statistische Auswertung erfolgte daher nicht.
Abbildung 18a zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion während Prä-
und Versuchskontraktion.
Abbildung 18b zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion während Prä-
und Kontrollkontraktion.
Tabelle 11: Vergleichende Darstellung der negativen Exponenten der molaren
Konzentrationen von Histamin [10-x mol/L], welche eine 50%ige
Bronchuslumenreduktion in der Präkontraktion, Hauptkontraktion nach Inkubation
in Diphenhydramin (DPH) bzw. Kontrollkontraktion verursachten, geometrischer
Mittelwert [10-x mol/L] und geometrische Standardabweichung
Pferd Präkontraktion DPH Präkontraktion Kontrolle
20 6,90 n.a. 6,12 5,33 21 6,90 4,67 8,10 5,30 23 7,63 n.a. 5,37 n.a. 25 6,37 5,20 7,23 n.a. 26 7,60 4,83 6,90 6,30 27 n.a. n.a. 5,75 n.a.
geom. Mittelwert 7,08 n.a. 6,58 n.a. geom. Standardabw. 3,42 n.a. 10,47 n.a.
103
[a]
[b]
Abb. 18a/b: Bronchokonstriktion nach Histamin der Präkontraktion versus
Hauptkontraktion nach Inkubation in Diphenhydramin (20 min, 10-6 mol/L) [a] bzw.
versus der Hauptkontraktion der Kontrollgruppe [b]. Dosis-Wirkungsbeziehung mit
einer Steigerung der Histamin-Konzentration in Zehnerpotenzen in einem Abstand
von 5 min, Angabe der Fläche des Bronchuslumen in % des Ausgangswertes (n=6
Pferde)
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Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
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en [%
]
PräkontraktionHauptkontraktion
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vorher 8 7 6 5 4
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
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en [%
]
PräkontraktionHauptkontraktion
Diphenhydramin
Kontrolle
104
2.11 Versuch 8: Histamin-Reihe nach Inkubation in Azelastin
Der Versuch wurde an fünf Pferden (Nr. 21, 20, 23, 25 und 26 und 27) und
insgesamt 25 PCLS durchgeführt. Dabei waren 13 PCLS in der Versuchs- und 12
PCLS in der parallel laufenden Kontrollgruppe. Der Versuchsablauf erfolgte
analog Versuch 9, die Inkubation erfolge in 10-11 molarem Azelastin.
In der Versuchsgruppe war nur bei drei Pferden eine die 50%ige
Bronchuslumenreduktion auslösende Konzentration messbar, da die
Kurvenverläufe der übrigen Pferde zu indifferent verliefen (siehe
Einzeltierdarstellungen im Anhang). In der Kontrollgruppe schwächte sich die
Reagibilität der PCLS bei der zweiten Kontraktion ebenfalls so stark ab, dass
keine ausreichende Anzahl Pferde messbar war (Tabelle 12). Eine statistische
Auswertung erfolgte daher nicht.
Abbildung 19a zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion während Prä-
und Versuchskontraktion.
Abbildung 19b zeigt die einzelnen Stadien der Bronchokonstriktion während Prä-
und Kontrollkontraktion.
Tabelle 12: Vergleichende Darstellung der negativen Exponenten der molaren
Konzentrationen von Histamin [10-x mol/L], welche eine 50%ige
Bronchuslumenreduktion in der Präkontraktion, Hauptkontraktion nach Inkubation
in Azelastin bzw. Kontrollkontraktion verursachten, geometrischer Mittelwert [10-x
mol/L] und geometrische Standardabweichung
Pferd Präkontraktion Azelastin Präkontraktion Kontrolle
20 n.a. n.a. 6,12 5,33 21 7,60 n.a. 8,10 5,30 23 6,43 5,27 5,37 n.a. 25 8,23 4,70 7,23 n.a. 26 7,70 5,50 6,90 6,30 27 n.a. n.a. 5,75 n.a.
geom. Mittelwert 7,49 n.a. 6,58 n.a. geom. Standardabw. 5,74 n.a. 10,47 n.a.
105
[a]
[b]
Abb. 19a/b: Bronchokonstriktion nach Histamin der Präkontraktion versus der
Hauptkontraktion nach Inkubation in Azelastin (20 min, 10-11 mol/L) [a] bzw. versus
Hauptkontraktion der Kontrollgruppe [b]. Dosis-Wirkungsbeziehung mit einer
Steigerung der Histamin-Konzentration in Zehnerpotenzen in einem Abstand von 5
min, Angabe der Fläche des Bronchuslumen in % des Ausgangswertes (n=6 Pferde)
0
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Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
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en [%
]
PräkontraktionHauptkontraktion
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20
40
60
80
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140
160
180
vorher 8 7 6 5 4
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
PräkontraktionHauptkontraktion
Azelastin
106
2.12 Statistische Auswertung der Ergebnisse aus Versuch 1-5
Es zeigte sich im Shapiro-Wilk-Test unter SAS (SAS, 2005), dass alle Daten nach
logarithmischer Transformierung normalverteilt waren. Ausnahmen bildeten nur
die Präkontraktionswerte von Versuch 2 (Cilomilast) und 4 (Ipratropium), die aber
graphisch normalverteilt waren und somit im weiteren auch als normalverteilt
angenommen wurden. Für die weiteren Auswertungen wurde deshalb mit den
logarithmierten Werten gerechnet.
Zwischen der durch Metacholin bzw. Acetylcholin induzierten Präkontraktion
(Versuch 1) konnte bei keiner Konzentrationsstufe ein signifikanter Unterschied
zwischen dem natürlichen Transmitter und dem synthetischen Derivat
nachgewiesen werden (Tabelle 6)
Im Wilks’ Lambda Test konnte ein statistisch signifikanter bzw. hochsignifikanter
Unterschied zwischen Prä- und Hauptkontraktion bei Atropin, Ipratropium und
Tiotropium nachgewiesen werden. Bei Cilomilast und den Kontrollen wurde kein
statistischer Unterschied zwischen Prä- und Hauptkontraktion nachgewiesen
(Tabelle 13).
Bei der Untersuchung der Streuung zwischen den PCLS zeigte sich, dass bei
keinem der Versuche bzw. der Kontrollen ein signifikanter Unterschied zwischen
den einzelnen PCLS eines Probanden bestand (p > 0,05). Zwischen den Pferden
bestanden hingegen zum Teil hoch- bis höchstsignifikante Unterschiede (Tabelle
14).
107
Tabelle 13: Darstellung der Mittelwerte der EC 50, Standardabweichung
(Standardabw.) und Ergebnisse der statistischen Tests (F-Wert, p-Wert, P:
Signifikanz) auf Unterschiede zwischen Präkontraktion (PK) und Hauptkontraktion
(HK)
Wirkstoff EC 50 PK EC 50 HK Unterschied PK ↔ HK
(Standardabw.) (Standardabw.) F p P
Cilomilast 6,60 (0,91) 6,15 (0,98) 0,27 0,6238 n.s.
Atropin 6,95 (1,01) <5,66 (>2,09) 28,51 0,0031 **
Ipratropium 7,05 (0,92) 6,49 (1,18) 21,23 0,0058 **
Tiotropium 7,10 (1,04) 6,27 (1,03) 12,66 0,0162 *
Kontrolle 6,60 (0,87) 6,75 (0,73) 0,47 0,5075 n.s.
n.s. = nicht signifikant; * = signifikant, p ≤ 0,05; ** = hochsignifikant, p ≤ 0,01; *** =
höchstsignifikant, p ≤ 0,001
Tabelle 14: Darstellung der Ergebnisse der statistischen Tests (F-Wert, p-Wert, P:
Signifikanz) auf interindividuelle Unterschiede zwischen den Pferden sowie
intraindividuelle Unterschiede zwischen den PCLS
interindividueller Unterschied (Pferde)
intraindividueller Unterschied (PCLS)
Wirkstoff F p P F p P
Cilomilast 1,01 0,4964 n.s. 2,22 0,2037 n.s.
Atropin 24,98 0,0015 ** 0,18 0,6907 n.s.
Ipratropium 35,84 0,0006 *** 0,03 0,8739 n.s.
Tiotropium 3,43 0,1013 n.s. 0,01 0,9368 n.s.
Kontrolle
n.s. = nicht signifikant
7,26 0,0025 ** 0,27 0,8928 n.s.
108
IV. Diskussion
Ziel der durchgeführten Studie war es, die Methodik zur Gewinnung von PCLS
aus equinem Lungengewebe und zur Erfassung der Bronchokonstriktion
weiterzuentwickeln und die pharmakologische Beeinflussung der
Bronchokonstriktion an PCLS durch verschiedene Substanzen vergleichend zu
untersuchen. Außerdem sollte festgestellt werden, ob ein Zusammenhang
zwischen Erkrankungsgrad der Pferde, Reagibilität der PCLS und
histopathologischen Befunden am Lungengewebe besteht (Tabelle 4 und 5).
Die PCLS-Technik bietet als Ex-vivo-Methode den Vorteil, dass funktionelle
Untersuchungen im natürlichen Gewebeverband durchgeführt werden können,
ohne dass der Proband darunter leiden muss. Die Technik wurde erstmalig von
DANDURAND et al. (1993) vorgestellt, von MARTIN et al. (1996) präzisiert und
schließlich von VIETMEIER (2004) für das Pferd etabliert. Die Studie verbindet
die Verwendung einer noch neuen Technik mit der Untersuchung von Wirkstoffen,
für die beim Pferd noch wenig bzw. keine Erkenntnisse vorliegen. Daher wurden
bekannte Pharmaka wie das Atropin und Diphenhydramin parallel mituntersucht,
was weniger der Gewinnung neuer Erkenntnisse über diese Substanzen, als
vielmehr der Absicherung der noch wenig genutzten Methodik diente.
1. Probandengut
Insgesamt wurden die Lungen von 27 Pferden in der Studie verwendet. Das
Probandengut war bezüglich Alter, Rasse, Geschlecht und COB-Erkrankungsgrad
sehr inhomogen. Nicht von allen Pferden konnten vitale, verwertbare PCLS
hergestellt werden. Die ersten sieben Pferden dienten dem Erlernen der Methodik
bzw. die aus ihren Lungen hergestellten PCLS waren nach Inkubation nicht mehr
vital. Zwei Pferde dienten der Durchführung der Vorversuche. Von sechs Pferden
konnten Ergebnisse in der ersten Versuchsreihe (Ach/MCh-Vergleich, PDE-4-
Hemmer, Parasympatholytika) gewonnen werden, von sechs in der zweiten
(Antihistaminika). Die PCLS der restlichen Pferde waren nicht ausreichend vital,
109
starben während der Versuchsdurchführung ab, verkeimten oder zeigten
mangelnde Kontraktilität während der Präkontraktion. Trotz der geringen
Probandenzahl waren die Ergebnisse statistisch auswertbar, da nicht ausreichend
vitale und kontrahierende PCLS nach der Präkontraktion verworfen und alle
Versuche im Zwei- oder Dreifachansatz mit doppelter Kontrolle durchgeführt
worden waren. In der Auswertung standen so, trotz im Vergleich zu klinischen
Studien geringer Probandenzahl, genug Daten für die statistische Auswertung zur
Verfügung, außerdem konnte die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen
mehreren PCLS eines Probanden überprüft werden.
Die Herstellung und Untersuchung von PCLS ermöglicht es, an einem Pferd
mehrere Substanzen parallel zu testen, was die Vergleichbarkeit der Ergebnisse
verbessert.
Allerdings ist es nicht möglich, aus jeder Lunge PCLS herzustellen. In der
Anfangsphase der Studie zeigte sich, dass PCLS von Pferden, die bei schlechtem
Allgemeinbefinden bzw. im Schock oder während einer Operation (nach
Beatmung) euthanasiert worden waren, mangelnde Vitalilität (Zilienschlag) sowie
Kontraktilität (Präkontraktion) zeigten und daher für pharmakologische Studien
nicht geeignet waren. Die metabolische Belastung des Organismus im Schock
oder bei hochgradig gestörtem Allgemeinbefinden reduziert die Energiereserven
der Lungenmuskulatur wahrscheinlich in so starkem Maße, dass sie nach
Inkubation über Nacht keine messbare Kontraktion mehr bewirken kann. Durch
Beatmung in der Narkose, insbesondere bei kurzfristiger, aber mehrmaliger
Druckerhöhung zur Verbesserung der funktionellen Lungenoberfläche intra
operationem wird die Bronchialmuskulatur stark gedehnt, vermutlich in den
kleinen Atemwegen auch überdehnt, so dass keine Kontraktion durch chemische
Stimulation mehr ausgelöst werden kann. Studien bestätigen eine funktionelle
Beeinträchtigung der equinen Lunge, v.a. der arterioalveoläre Druckdifferenz
(AaDO2), über mehrere Tage nach Narkose (HOFFMANN, 1999).
Die starke Heterogenität des Probandengutes v.a. in Hinsicht auf Alter und
Erkrankungsgrad erklärt die starke interindividuelle Streuung der Ergebnisse.
Innerhalb des einzelnen Probanden zeigten die Schnitte eine geringe
intraindividuelle Streuung und Ermüdung zwischen Prä-, Haupt- und
110
Nachkontraktion, so dass für das einzelne Pferd oftmals deutliche Effekte
ausgemacht werden konnten, eine allgemeine Aussage über die Wirkung einer
Substanz jedoch aufgrund der geringen Probandenzahl und der großen
interindividuellen Streuung in den statistisch nicht signifikanten Bereich geriet.
2. Herstellung, Mikroskopie und Auswertung der PCLS
Bei der Herstellung der PCLS zeigte sich die enorme Bedeutung der Vorauswahl
geeigneter Probanden. Aus Lungengewebe von intraoperativ oder im Schock
euthanasierte Patienten konnten keine kontraktionsfähigen PCLS gewonnen
werden, auch wenn diese PCLS zum Teil deutlichen Zilienschlag zeigten. Ein
weiterer Faktor ist die Unversehrtheit der Pleura, da Verklebungen und Läsionen
dazu führten, dass sich das Lungengewebe nicht mehr mit ausreichend Druck mit
Agarose füllen ließ. Die Agarose lief entweder aus oder bildete zwischen Pleura
und Parenchym Blasen, während das eigentliche Lungengewebe nicht weiter
aufzufüllen war. Auch zu tiefes Absetzen des Lobus accessorius verschlechterte
den Füllungsgrad: der Lungenlappen konnte nicht mehr vollständig gefüllt
werden, wenn sich die Bronchien bereits verzweigt hatten, außerdem war das
Abdichten erschwert. Eine zu starke Füllung des Lobus accessorius –erkennbar
am „Ausschwitzen“ von Agarose durch die Pleura- verhinderte die Kontraktion der
Bronchien, vermutlich durch Überdehnung der Muskulatur ähnlich der Beatmung
unter großem Druck in Narkose. Ein optimaler Füllungszustand und konsequente
Kühlung des gefüllten Lobus accessorius in zerstoßenem Eis (Beginn des
Schneidevorgangs frühestens 15 min nach Befüllung) führten zu guten
Schneideergebnissen; Pleuraläsionen, starke bindegewebige Durchwachsung
des Parenchyms und Bronchiendurchmesser über 0,1 cm verschlechterten das
Ergebnis. Eine bessere Fixierung des Lungengewebes während des
Schneidevorganges wäre wünschenswert, um die Zahl der Fehlschnitte zur
verringern und somit aus einer höheren Anzahl verwertbarer PCLS für die
Versuche Bronchienschnitte ähnlichen Durchmessers wählen zu können, da
111
MARTIN et al. (1996) unterschiedliche Sensitivität auf Metacholin bei PCLS
verschiedener Bronchiengrößen feststellten.
Das Auswaschen der Agarose durch vier Medienwechsel im Abstand von 30
Minuten nach dem Schneidevorgang, einem weiteren Mediumwechsel vor und
nach Inkubation über Nacht und vor Versuchsbeginn, gelang bei vorhandenem
Zilienschlag vollständig; ein Verbleiben von Agarose im Bronchuslumen nach
diesem Waschvorgang deutete auf mangelnde Flimmerbewegung hin und führte
daher zum Ausschluss dieser PCLS. Für die halbstündigem Medienwechsel
unmittelbar nach dem Schneidevorgang, sowie für die Medienwechsel im Laufe
des Versuchs, wurde reines RPMI-Medium (37°C) verwendet. Für die
Inkubationsphase über Nacht bis Versuchsbeginn wurde das Medium hingegen
mit einem Penicillin/Streptomycin-Zusatz versehen, um ein Verkeimen der
Schnitte zu verhindern. Trotzdem verkeimten die PCLS aus 4 von 27 Lungen, was
sich in einer Trübung des Mediums zeigte und zum Ausschluss führte. Trotz
Verkeimung zeigten die PCLS anfangs noch Zilienschlag und Kontraktilität, im
weiteren Verlauf zeigte sich jedoch im mikroskopischen Bild, dass das Epithel
deutlich angegriffen wurde und keine klar abgrenzbaren Epithelgrenzen mehr
auszumachen waren. Damit verlor sich auch die Kontraktionsfähigkeit der PCLS,
so dass solche PCLS nicht zur Durchführung von Versuchen geeignet sind.
Die Lagerung der PCLS in 12-well-Platten während der Mikroskopie erwies sich
zwar als einfach und handlich, problematisch war jedoch die Tatsache, dass die
PCLS frei im Medium bzw. auf dem Boden der Platte liegen und sich daher bei
Verschieben der Platte (parallele Untersuchung mehrerer Schnitte) bewegen.
Verändert sich der Abstand zwischen Bronchus und Linse, verändert sich in der
Folge auch das Bronchuslumen unabhängig von einer möglichen
Bronchokonstriktion oder –dilatation im mikroskopischen Bild. Paradoxe
Erscheinungen bei einzelnen Pferden, die beispielsweise plötzlich eine
Vergrößerung des Bronchuslumen unter Einfluss eines starken
Bronchokonstriktors zeigten, lassen sich hierdurch erklären und bedingen z.T. die
starke Streuung der Ergebnisse. In Folge dessen sollten die PLCS zukünftig fixiert
werden, wodurch auch die Untersuchung in ständig durchströmendem Medium
möglich wäre, was die Überlebensdauer der PLCS erhöht und eine
112
gleichbleibende Temperatur garantiert (MARTIN, 1996; VIETMEIER, 2004). Ein
weiteres Problem der parallelen Reihenuntersuchung mehrerer PCLS bestand
darin, dass das Mikroskop für jeden Schnitt von neuem in Belichtung und
Bildschärfe manuell eingestellt werden musste, um die Epithelgrenzen optimal
darzustellen. Für den einzelnen Schnitt ergaben sich daher geringe
Abweichungen der Einstellungen zwischen den Konzentrationsstufen, auch
dadurch verändert sich das Bronchuslumen im digitalen Bild. Optimal wäre daher
eine Fixierung der PCLS und die Untersuchung nur eines Schnittes, so dass
keine Adaptationen der Einstellung zwischenzeitlich notwendig wären. Der Reiz
der PCLS-Technik besteht jedoch genau darin, an einem Probanden mehrere
Substanzen im Vergleich testen zu können, weil viele Schnitte zur Verfügung
stehen.
Die Auswertung der digitalen Bilder erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms
„Scion Image“ (www.scioncorp.com). Die ehemals farbigen Bilder mussten dazu
vorher mittels „Irfan View“ in ein Graustufenbild überführt werden. Der Kontrast
zwischen Bronchuslumen und Epithelgrenze stellte sich bei schwacher
Beleuchtung besser da. Starke Beleuchtung führte leicht zu einem Überstrahlen
der Epithelgrenze, so dass das Lumen leicht falsch vergrößert erschien. Die
Fotographie bei schwacher Beleuchtung hatte jedoch den Nachteil, dass das
Programm Probleme hatte, die Epithelgrenzen zu erkennen und somit die
automatische Flächenberechnung zu ungenau wurde. Die Epithelgrenze des
Bronchuslumen wurde daher manuell dreimalig mit der Maus umfahren und das
Ergebnis gemittelt. Das ursprüngliche Bronchuslumen wurde gleich 100% gesetzt
und die Bronchuslumenreduktion bei verschiedenen Konzentrationen prozentual
berechnet. Somit konnten Bronchien unterschiedlicher Ausgangsgröße
miteinander verglichen werden. Bei weiterer Verbesserung der Methodik und
wenn mehr PCLS pro Pferd zur Verfügung stehen, wäre es wünschenswert
Gruppen ähnlich großer Lumina zu bilden, da die Sensitivität gegenüber
Metacholin mit kleinerem Lumen zunimmt (MARTIN et al., 1996; WOHLSEN et
al., 2001).
113
3. Vitalitätsbestimmung
In der Anfangsphase der Studie zeigte sich, dass morphologische Unversehrtheit
und visuell deutliche Flimmerbewegungen des Atemwegsepithels (Zilienschlag)
kein ausreichendes Kriterium zur Vitalitätsbestimmung waren, obwohl dies bei
anderen Tierspezies wie Ratte oder Maus der Fall ist (WOHLSEN et al., 2003;
EBSEN et al., 2002). Dies ist darauf zurückzuführen, dass die verwendeten
Pferde vor der Euthanasie nicht unter standartisierten Bedingungen wie typische
Labortiere gehalten wurden und bei einigen Probanden ein medizinisch
zwingender Grund zur Euthanasie vorlag. PCLS von beatmeten oder im Schock
euthanasierten Pferden zeigten zwar oftmals deutlichen Zilienschlag, verloren
diesen aber nach Inkubation über Nacht oder zeigten trotz vorhandenen
Zilienschlags mangelnde Reagibilität in der Präkontraktionsreihe. 21,8% der
morphologisch intakten PCLS wurden aufgrund visuell sichtbarer schlechter
Kontraktilität bereits nach der Präkontraktion aussortiert. Nach digitaler
Auswertung zeigte sich, dass sogar noch mehr hätten aussortiert werden müssen.
Da die digitale Auswertung der Bilder jedoch einige Stunden Zeit in Anspruch
nimmt, wurde auf die Auswertung im laufenden Versuch verzichtet, um die
Versuchszeit möglichst kurz und den Ermüdungsfaktor gering zu halten. In der
statistischen Auswertung konnte gezeigt werden, dass die PCLS keine
nennenswerte Ermüdung zwischen Prä- und Hauptkontraktion in den
Kontrollgruppen gezeigt hatten. Die Präkontraktion ist somit ein essentieller
Parameter zur Vitalitätsbestimmung und erfolgreichen Versuchsdurchführung, der
keine negativen Auswirkungen auf das Versuchsergebnis hat.
114
4. Pharmakologische Versuche
4.1 Vergleich zwischen MCh/Ach und Histamin-Kontraktion
VIETMEIER (2004) ermittelte für Metacholin eine EC50 im Bereich von 1,6 x 10-7
mol/L, was 6,63 [10-x mol/L] entspricht. In den eigenen Versuchen konnte für
Metacholin eine EC50 von 6,64 [10-x mol/L] und für Acetylcholin von 6,88 [10-x
mol/L] ermittelt werden. Die Ergebnisse waren somit vergleichbar und für Acetyl-
und Metacholin konnte eine vergleichbare Wirkung gezeigt werden. Aufgrund der
höheren Stabilität des synthetischen Metacholins wurde es in den nachfolgenden
Versuchen verwendet.
In den eigenen Versuchen lag die EC50 für Histamin bei 7,4 [10-x mol/L],
VIETMEIER (2004) errechnete hingegen einen Wert von 6,7 [10-x mol/L].
Insgesamt fällt der deutlich flachere Kurvenverlauf bei Histamin im Vergleich zu
ACh/MCh auf. Durch Untersuchungen an anderen Modellen wird jedoch bestätigt,
dass Histamin eine deutlich schwächere Bronchokonstriktion beim Pferd auslöst
als Metacholin. Die von DOUCET et al. (1990) durchgeführten Versuche wurden
an equinen Trachealstreifen und Lungenparenchym durchgeführt.
4.2 Parasympatholytica (Atropin, Ipratropium und Tiotropium)
Die PCLS aus fünf von sechs (Atropin) bzw. vier von sechs (Ipratropium und
Tiotropium) Lungen benötigten nach Inkubation in einem Parasympatholytikum
eine höhere Konzentration Metacholin, um eine 50%ige Bronchuslumenreduktion
zu zeigen. Dabei war die Differenz zwischen Präkontraktion und Versuchsgruppe
jeweils größer als zwischen Präkontraktion und Kontrollgruppe, so dass am
Einzeltier ein über die Ermüdung (Differenz zwischen Präkontraktion und
Hauptkontraktion in der Kontrollgruppe, statistisch nicht signifikant)
hinausgehender Effekt (gemessen an der parallel laufenden Kontrolle) durch das
Parasympatholytikum in 13 von 18 Versuchen erkennbar ist. Abzüglich der
Ermüdung beträgt dieser Effekt bei Atropin im Mittel 0,87 Zehnerpotenzen, bei
115
Ipratropium 0,41 Zehnerpotenzen und bei Tiotropium 0,86 Zehnerpotenzen
(Tabelle 13). Trotz der relativ starken Streuung, die sich dadurch ergibt, dass die
verschiedenen Individuen bei unterschiedlichen Konzentrationen ihr
Reaktionsmaximum zeigen (Tabelle 14), ergibt sich für diese Substanzen ein
signifikanter Effekt.
Der Versuchsaufbau war nicht geeignet, um die durch die Literatur bekannten
Unterschiede (Besetzung verschiedener M-Rezeptoren) zwischen Atropin,
Ipratropium und Tiotropium deutlich zu machen. Ein statistisch absicherbarer
Unterschied in der Wirkungspotenz war ebenfalls nicht auszumachen. Klinische
Studien aus der Humanmedizin haben jedoch bereits die Überlegenheit von
Ipratropium und Tiotropium gegenüber dem Atropin gezeigt (Vermeidung
systemischer Nebenwirkungen, v.a. auf das Herz), jedoch ist die Anwendung per
inhalationem aufwendig für den Besitzer. Ein Vorteil des Tiotropiums gegenüber
dem Ipratropium liegt in seiner 24-stündigen Wirkungsdauer und der Erhöhung
des FEV. Klinische Studien am Patienten liegen für das Tiotropium jedoch noch
nicht vor, so dass noch nicht mit Sicherheit gesagt werden kann, dass Tiotropium
auch beim Pferd eine deutlich längere Wirkung zeigt als das Ipratropium (24
versus 8 Stunden).
4.3 PDE-4-Hemmer (Cilomilast)
Die PCLS aus vier von sechs Lungen benötigten nach Inkubation in Cilomilast
eine höhere Konzentration Metacholin, um eine 50%ige Bronchuslumenreduktion
zu zeigen. Dabei war die Differenz zwischen Präkontraktion und Versuchsgruppe
jeweils größer als zwischen Präkontraktion und Kontrollgruppe, so dass am
Einzeltier ein über die Ermüdung hinausgehender Effekt durch den PDE-4-
Hemmer erkennbar ist. Abzüglich der mittels der Kontrollgruppe gemessenen
Ermüdung beträgt dieser Effekt im Mittel 0,68 Zehnerpotenzen. Hierbei führte
jedoch die starke interindividuelle Streuung dazu, dass kein statistisch
signifikanter Effekt des Cilomilast absicherbar war. Versuche an PCLS von Ratten
(MARTIN et al., 2002) zeigten jedoch eine bronchospasmolytische und
116
entzündungshemmende Wirkung, so dass bei höherer Fallzahl auch beim Pferd
eine Wirkung zu erwarten ist.
4.4 Antihistaminika (Diphenhydramin und Azelastin)
Die Antihistaminika wurden an PCLS von sechs Pferden getestet. Allerdings
waren die Kontrollkurven von drei Lungen aufgrund indifferenter Reaktion auf
Histamin nicht auswertbar, bei einem Pferd (Nr.27) war zusätzlich die
Versuchskurve nicht auswertbar, so dass eine statistische Auswertung der durch
Antihistaminika hervorgerufenen Effekte nicht möglich war. Ein Zusammenhang
zwischen Erkrankungsgrad und Reagibilität auf Histamin könnte vermutet werden,
da die nicht auswertbaren PCLS von lungengesunden Probanden stammten,
während mittel- bis hochgradig erkrankte Lungen dagegen bessere Ergebnisse
lieferten (siehe auch Kapitel 4.5). Dieser Zusammenhang wurde auch von
DEEGEN und KLEIN (1986) am lebenden Pferd im Histamin-Inhalationstest
nachgewiesen. PCLS-Untersuchungen mit größeren Probandenzahlen wären
wünschenswert, um weitere Erkenntnisse zum Zusammenhang zwischen
Erkrankungsgrad und Reagibilität auf Histamin zu gewinnen.
Die generell schwächere Reagibilität auf Histamin im Vergleich zum Metacholin
liegt wahrscheinlich im Wirkungsmechanismus. Metacholin ist ein direkt
wirksames Parasympathomimetikum und zeigt am PCLS-Modell eine dem
natürlichen Transmitter Acetylcholin analoge Wirkung. Histamin wird hingegen
aus durch IgE stimulierten Makrophagen der Lunge sezerniert, ebenso jedoch
Leukotriene und PGD2. Dieser Effekt konnte auch in vitro nachgewiesen werden
(SHICHIJO et al., 1998). Die Bedeutung des Histamins beim Pferd wird von den
Autoren jedoch im Vergleich zu den Leukotrienen als gering eingeschätzt. Die
bronchokonstriktorische Antwort auf Histamin nimmt außerdem mit
zunehmendem Alter ab, solange keine sekundäre Allergisierung auftritt
(JEFFREY, 1998). Beim lungengesunden, adulten bis alten Pferd ist daher keine
starke Reaktion auf Histamin zu erwarten.
117
Der durch klinische Studien in der Humanmedizin nachgewiesene Effekt des
Azelastins (BAUER et al., 1990) war daher am Histamin-Modell wegen der in
einigen Fällen schwachen Reaktion auf Histamin nicht zu bestätigen, das gleiche
traf auf Diphenhydramin zu.
CHAND u. SOPHIA (1995) zeigten außerdem die größere Wirkung von
Leukotrienen im Vergleich zu Diphenhydramin.
5. Zusammenhang zwischen Erkrankungsgrad, Reagibilität und histopathologischer
Untersuchung
FAIRBAIRN et al. (1993) untersuchten die bronchokonstriktorische Wirkung des
Metacholins an gesunden und an COB-erkrankten Pferden, bevor, 24, 48 und 72
Stunden nachdem diese über kurze Zeit (7 h) Heu und Stroh ausgesetzt worden
waren. Die COB-Pferde reagierten signifikant deutlicher auf Metacholin als die
Gesunden. Am PCLS-Modell dagegen konnte kein Zusammenhang zwischen
Erkrankungsgrad (ermittelt nach klinischem Score nach OHNESORGE et al.,
1998) und späterer Reagibilität festgestellt werden. Die von Acetylcholin und
seinem synthetisch hergestellten Derivat Metacholin ausgelöste
Bronchokonstriktion war selbst beim gesunden Pferd visuell deutlich sichtbar
(siehe Einzelkurven im Anhang).
DEEGEN und KLEIN (1986) untersuchten die unspezifische Hyperreagibilität auf
Histamin. Sie konnten bei keinem Pferd ohne respiratorische Symptomatik eine
unspezifische Hyperreagibilität nachweisen, dagegen lag bei 25% der
geringgradig COB erkrankten und bei 100% der hochgradig erkrankten eine
unspezifische Hyperreagibilität vor. Ein Zusammenhang zwischen klinischem
Erkrankungsgrad der Probanden und Reagibilität im Versuch konnte zwar nicht
nachgewiesen werden, ist aber bei Betrachtung der Kontrollkurven, die ohne
Einfluss eines Hemmers entstanden, nicht auszuschließen. So zeigten die
lungengesunden Probanden Nr. 20, 23, 25 und 27 eine so indifferente Reaktion
auf Histamin, dass die Kurven zum Teil nicht auswertbar waren (siehe
Darstellungen im Anhang), während mittel- bis hochgradig an COB erkrankte
118
Probanden (Nr. 21 und 26) deutlichere Reaktionen zeigten. Dieser Eindruck sollte
jedoch in Zukunft durch weitere Untersuchungen mit größeren Probandenzahlen
weiter untersucht werden.
Bei Untersuchungen an PCLS zur Histamin-Reagibilität sollte daher der klinische
Erkrankungsgrad des Probanden mitberücksichtigt werden. Außerdem erscheint
eine spätere diagnostische Nutzung des PCLS-Modells zur Untersuchung auf
COB (wenn die Entnahme von befüllbarem Lungengewebe am lebenden Pferd
möglich wäre) mit Histamin denkbar, da hierdurch möglicherweise zwischen
geringen und schweren Erkrankungsgraden differenziert werden könnte. Auch in
der Arbeit von VIETMEIER (2004) ergaben sich Hinweise darauf, dass an COB
erkrankte Pferde nach histamininduzierter Kontraktion eine verzögerte
Wiederöffnung aufwiesen.
Zwischen klinischen Untersuchungsergebnissen (Score-System nach
OHNESORGE et al., 1998) und den Ergebnissen des histopathologischen Score-
System (Punktvergabe für Fibrosen und Hypertrophie der Bronchialmuskulatur als
Leitsymptome der COB) konnte kein Zusammenhang festgestellt werden. Von
den Histologie-Ergebnissen konnte auch kein Rückschluss auf die weitere
Reagibilität der PCLS im Versuch getroffen werden. Hierbei ist jedoch zu
berücksichtigen, dass das untersuchte Gewebe nicht mit dem Gewebe, aus dem
die PCLS gefertigt wurden, übereinstimmte.
6. Streuungsanalyse
Da aufgrund der starken Streuung beim Cilomilast kein statisch signifikanter
Effekt nachgewiesen werden konnte, wurden die Ursachen dieser Streuung
statistisch mittels MANOVA untersucht. Dabei wurde ein Vergleich zwischen Prä-
und Hauptkontraktionsreihe (Ermüdung) der Kontrollgruppe, zwischen den
einzelnen PCLS einer Lunge (intraindividuelle Streuung) und zwischen den
Individuen (interindividuelle Streuung) angestellt. Es ergab sich übereinstimmend
für alle Substanzen, dass die starke Streuung hauptsächlich auf große
interindividuelle Unterschiede zurückzuführen ist, während intraindividuelle
119
Streuung und Ermüdung (Unterschied zwischen Prä- und Hauptkontraktion in der
Kontrollgruppe) keine signifikante Rolle spielten (siehe Kapitel 2.12 Statistische
Auswertung).
In Folge dessen sollte in Zukunft entweder eine größere Zahl von Probanden
verwendet oder eine größere Homogenität der Probanden hinsichtlich Alter und
Erkrankungsgrad angestrebt werden, um eine allgemeine Aussage über die
Wirksamkeit einer Substanz treffen zu können. Für den möglichen klinischen
Einsatz der PCLS-Technik in der Zukunft am lebenden Patienten sind
interindividuelle Vergleiche zu vermeiden, und die Betrachtung der Differenzen
zwischen Prä- und Hauptkontraktion des einzelnen Probanden in den Mittelpunkt
zu stellen. Außerdem ist zu bedenken, dass beim Einsatz des Histamins als
Bronchokonstriktor nur bei mittel- bis hochgradig erkrankten Pferden mit
verwertbaren Ergebnissen zu rechnen ist. Dieses ist für diagnostische Zwecke
interessant, schränkt aber die Auswahl an Probanden für pharmakologische
Studien ein. Bei geeignetem Probandenmaterial erscheint die PCLS-Technik
dennoch eine geeignete Ex-vivo-Methode zu sein, um die Wirksamkeit einer
Substanz am Einzeltier zu testen. Falls es gelingt, eine Entnahmetechnik von
befüllbarem Lungengewebe am lebenden Patienten zu entwickeln, könnte so eine
optimale Therapie für das an COB-erkrankte Pferd entwickelt und zeitraubendes
Suchen eines geeigneten Wirkstoffes vermieden werden.
120
V. Zusammenfassung
Ann Kristin Barton
Pharmakologische Beeinflussung der Bronchokonstriktion an „Precision Cut Lung
Slices“ (PCLS) vom Pferd
Ziel dieser Arbeit war es, die von VIETMEIER (2004) etablierte Technik zur
Gewinnung von Precision Cut Lung Slices (PCLS) aus equinem Lungengewebe
weiterzuentwickeln und mittels dieser Methode verschiedene hemmende Substanzen
der Bronchokonstriktion vergleichend zu untersuchen.
Lungen von 27 Pferden wurden in der Studie verwendet. Sieben Lungen dienten dem
Erlernen und der Verbesserung der Methodik, die restlichen Lungen fanden in Vor-
und Hauptversuchen Verwendung. Vor der Euthanasie fanden eine
Allgemeinuntersuchung, eine spezielle Untersuchung der Atemwege, eine arterielle
Blutgasanalyse, eine Bronchoskopie und eine Tracheobronchialsekretanalyse statt.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden mittels des Score-Systems nach
OHNESORGE et al. (1998) hinsichtlich des Erkrankungsgrades an chronisch
obstruktiver Bronchitis (COB) ausgewertet. Unmittelbar post mortem folgte die
Entnahme des Lobus accessorius, der auf Eis in steriler Kochsalzlösung gelagert
wurde und kurz darauf der Erstellung der PCLS diente. Außerdem wurden
Gewebeproben aus Lobus cranialis, caudalis und accessorius der rechten Lunge.
entnommen. Diese wurden in 10%igem Formalin fixiert und histopathologisch
untersucht.
Die 250 μm dicken PCLS wurden unter Zellkulturbedingungen bei 37°C inkubiert.
Nach mehreren Medienwechseln wurde die Vitalität anhand des Zilienschlags des
Flimmerepithels und der Kontraktionsfähigkeit auf steigende Konzentrationen der
Bronchokonstriktoren Acetylcholin oder Metacholin (Reihe 1) bzw. Histamin (Reihe 2)
mikroskopisch beurteilt.
Nach mehreren Medienwechsel fand eine Wiederöffnung des Bronchuslumens statt.
Die Schnitte der Reihe 1 wurden dann für zwanzig Minuten in einer
konstriktionshemmenden Cilomilast- (10-5 mol/L), Atropin-, Ipratropium-, oder
121
Tiotropiumlösung (10-7 mol/L) inkubiert und anschließend noch einmal aufsteigenden
Konzentrationen des jeweiligen Bronchokonstriktors (10-8 bis 10-4 mol/L) ausgesetzt.
Nach erneuter Wiederöffnung wurde noch einmal eine Nachkontraktion ohne
Konstriktionshemmer ausgelöst, um die Vitalität der PCLS bis Versuchsende
sicherzustellen. Die Reaktion der Schnitte in Bezug auf Änderungen des
Bronchusquerschnittes wurde fotografiert und digital ausgewertet. Parallel zu den
Versuchen (Doppelt- bis Dreifachansatz) wurden jeweils 2-5 PCLS als Kontrollgruppe
mituntersucht. In Reihe 2 wurden die PCLS in Diphenhydramin (10-6 mol/L) bzw.
Azelastin-Lösung (10-11 mol/L) inkubiert, als Bronchokonstriktor diente hier Histamin,
im weiteren entsprach die Versuchsdurchführung der der Reihe 1.
Für Atropin, Ipratropium und Tiotropium konnte ein statistisch signifikanter
Unterschied zwischen Präkontraktion (ohne Hemmer) und Hauptkontraktion (mit
Hemmer) nachgewiesen werden, für Cilomilast und die Kontrolle hingegen nicht. Die
statistische Streuungsanalyse zeigte den großen interindividuelle Unterschied
zwischen den einzelnen Probanden auf. Im Gegensatz zum intraindividuellen
Unterschied zwischen den einzelnen PCLS war dieser z.T. hoch- bis
höchstsignifikant. Durch Histamin konnte nur bei PCLS von mittel- bis hochgradig
erkrankten Pferden eine auswertbare Bronchokonstriktion ausgelöst werden, nicht
aber an PCLS von gesunden bzw. geringgradig erkrankten Probanden. Eine
statistische Auswertung war daher nicht möglich.
Es ergab sich kein Zusammenhang zwischen den Ergebnissen der
histopathologischen Untersuchung und den Reaktionen der PCLS in den
Versuchsreihen 1 und 2.
In der vorliegenden Studie wurden grundlegende Erkenntnisse zur Hyperreagibilität
und Beeinflussung der Reagibilität durch verschiedene pharmakologische
Substanzen an PCLS des Pferdes erarbeitet. Die Methodik erlaubt die Untersuchung
mehrerer Substanzen an einem Probanden, was die Vergleichbarkeit der Ergebnisse
erhöht und die Anzahl erforderlicher Tierversuche verringert.
122
VI. Summary Ann Kristin Barton Pharmacological studies of bronchoconstriction on „Precision Cut Lung Slices“
(PCLS) in the horse
The aim of the study was to upgrade the technique to produce Precision Cut Lung
Slices from equine lung tissue established by VIETMEIER (2004), which was used to
test and compare several bronchoconstrictive substances.
The lungs from 27 horses were used in the study. Seven lungs were needed for
learning and upgrading the technique, the others served their purpose in pre- and
main experiments. Before the horses were euthanized, a clinical examination, an
examination of the respiratory tract, an arterial blood gas analysis, a bronchoscopy
and an analysis of aspirated tracheobronchial secrete were performed. The results of
these examinations were graduated in view of severeness of COB (chronic
obstructive bronchitis) using a score-system (OHNESORGE et al, 1998). Immediately
post mortem, the lobus accessorius was taken out. It was stored on ice in sterile
saline (0,9%) until production of PCLS began. Furthermore, tissue samples were
taken from lobus cranialis, caudalis and accessorius of the right lung. They were
fixated in formaldehyde solution (10%) and were examined for histo-diagnosis.
The PLCS of 250 μm thickness were incubated under cell culture conditions at 37°C.
After medium had been changed several times, the vitality was evaluated under the
microscope in regard of cilia movement and contraction after increasing
concentrations of bronchoconstrictors acetylcholine, metacholine (project 1) or
histamine (project 2) were added. By changing the medium several times, the
bronchial tubes reopened again. Then the PCLS of project 1 were incubated for 20
minutes in a constriction inhibiting solution of cilomilast (10-5 mol/L), atropine,
ipratropiume or tiotropiume (10-7 mol/L). Afterwards they were faced again with
increasing concentrations of the former bronchoconstrictor (10-8 bis 10-4 mol/L). After
a further reopening, a post-constriction was triggered without a constriction inhibitor.
Photographs were taken of the PCLS’ reaction to examine changes in the bronchial
123
cross-section, which were analysed digitally. Each experiment was performed using
2-3 PCLS and there was also a control group of 2-5 PCLS, which were tested at the
same time. In project 2, PCLS were incubated in a solution of diphenhydramine (10-6
mol/L) or azelastine (10-11 mol/L) and the bronchoconstriction was triggered by
histamine. Further details were the same as in project 1.
A significant difference between pre-contraction (without constriction inhibitor) and
main contraction (after incubation in inhibitor) was found for atropine, ipratropiume
and tiotropiume, whereas there was no difference in cilomilast and the control groups.
Statistic analysis of dissemination showed big interindividual differences between
single subjects. In contrast to this, there was no significant difference between single
PCLS of the single horse. Histamine caused a measurable bronchoconstriction in
horses suffering from severe COB only, whereas data from healthy horses or those
suffering from mild forms of COB did not reveal any measurable reaction, and
consequently no statistic analysis was possible.
There was no relation found between the results of histo-diagnosis and the PCLS’
reagibility in projects 1 or 2.
In this study, basic scientific findings on hyperreagibility and the influence on
reagibility through several pharmacons were found for PCLS of the horse. This
technique allows the assessment of different substances in a single subject, and thus
it increases the possibility to compare results and decreases the number of animals
needed for these studies.
124
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143
VIII. Anhang
Tabelle 15: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung der einzelnen
Probanden , differenziert dargestellt nach Lobus accesorius (LAC), Lobus
cranialis (LCR) und Lobus caudalis (LCA)
Pferd Lobus Befund
LAC mgr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur minmale, katharrhalische Bronchitis ggr, eosinophile Peribronchitits multifokale, mgr. Fibrosen
LCR mgr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur minimale Dyskrinie multifokale, mgr Fibrosen
Nr. 8
LCA mgr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur minimale Dyskrinie multifikale, mgr Fibrosen
LAC ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur multifokale, ggr Fibrosen
LCR minimale Hypertrophie der Bronchialmuskulatur minimale, lymphozytäre Peribronchitis
Nr. 9
LCA multifokale, ggr Fibrosen minimale Dyskrinie
LAC mgr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur ggr Dyskrinie multifokale, mgr Fibrosen
LCR mgr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur ggr Dyskrinie multifokale, mgr Fibrosen ggr, interstitielle, eosinophile Infiltration
Nr. 10
LCA mgr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur geringgradige Dyskrinie multifokale, geringgradige Fibrosen
LAC ggr Alveolarhistiozytose minimale Fibrosen ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur
LCR ggr Alveolarhistiozytose minimale Fibrosen ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur
Nr. 12
LCA minimale, chronisch-eitrige Pneumonie ggr Alveolarhistiozytose minimale Fibrosen ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur
144
LAC ggr Dyskrinie ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur vereinzelt eosinophile Infiltration der Alveolarsepten multifokal mgr Fibrosen
LCR vereinzelte, ggr Fibrosen
Nr. 16
LCA vereinzelte, ggr Fibrosen LAC mgr, eosinophile Peribronchitis
ggr Dyskrinie ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur vereinzelte, ggr Fibrosen
LCR mgr, eosinophile Peribronchitis ggr Dyskrinie ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur vereinzelte, ggr Fibrosen
Nr. 17
LCA mgr, eosinophile Peribronchitis ggr Dyskrinie ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur
LAC multifokale, mgr Fibrosen ggr, lymphozytäre und eosinophile Peribronchitis minimale Dyskrinie
LCR multifokale, mgr Fibrosen ggr, eosinophile Peribronchitis minimale Dyskrinie ggr Alveolarhistiozytose
Nr. 18
LCA ggr-mgr, lymphozytäre und eosinophile Peribronchitis ggr Dyskrinie ggr Alveolarhistiozytose minimale, eitrige Herdpneumonie multifokale, mgr Fibrosen
LAC minimale, katarrhalisch-eitrige Bronchitis ggr Dyskrinie multifokale, ggr Fibrosen mgr, peribronchiale, lymphozytäre Infiltration
LCR multifokal ggr, eitrige Peribronchitis ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur mgr, peribronchiale Infiltration mit Eosinphilen ggr Alveolarhistiozytose multifokale, ggr Fibrosen
Nr. 20
LCA ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur mgr, peribronchiale, lymphozytäre Infiltration minimale, peribronchiale Infiltration mit Eosinphilen ggr Alveolarhistiozytose multifokale, ggr Fibrosen
Nr. 21 LAC ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur minimale, peribronchiale Infiltration mit Eosinphilen ggr Alveolarhistiozytose multifokale, ggr Fibrosen
145
ggr Dyskrinie LCR ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur
minimale, peribronchiale Infiltration mit Eosinphilen ggr Alveolarhistiozytose multifokale, ggr Fibrosen
LCA ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur minimale, peribronchiale Infiltration mit Eosinphilen und Lymphozyten multifokale, ggr Fibrosen ggr Dyskrinie
LAC ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur minimale Dyskrinie multifokale, ggr Fibrosen
LCR multifokale, ggr Fibrosen multifokale, peribronchiale Lymphfollikelausbildung
Nr. 23
LCA ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur minimale Dyskrinie multifokale, ggr Fibrosen
LAC fokale, ggr Fibrosen LCR fokale, ggr Fibrosen
ggr Dyskrinie
Nr. 25
LCA multifokale, minimale Fibrosen minimale Hypertrophie der Bronchialmuskulatur
LAC multifokale, minimale Fibrosen ggr. Dyskrinie
LCR multifokale, mgr Fibrosen ggr Dyskrinie
Nr. 26
LCA multifokale, mgr Fibrosen LAC multifokale, ggr Fibrosen
mgr Dyskrinie mgr, peribronchiale und –vaskuläre, lymphozytäre Infiltration ggr Hypertrophie der Bronchialmuskulatur
LCR multifokale, ggr Fibrosen mgr Dyskrinie minimale, katarrhalisch-eitrige Bronchitis mgr, peribronchiale, lymphozytäre und minimale, eosinophile Infiltration
Nr. 27
LCR multifokale, ggr Fibrosen minimale, katarrhalische Bronchitis mgr, peribronchiale, lymphozytäre und minimal eosinophile Infiltration
146
Darstellungen der Kurvenverläufe der einzelnen PCLS
Versuch 2: Cilomilast
Pferd Nr. 8: Cilomilast
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 8 7 6 5
Wied
eröff.
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bron
chus
lum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2Schnitt 3
Pferd Nr. 8: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 8 7 6 5
Wied
eröff.
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2Schnitt 3
147
Pferd Nr. 9: Cilomilast
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr.9: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
148
Pferd Nr. 10: Cilomilast
020406080
100120140160
Schnit
t 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 10: Kontrolle
0
50
100
150
200
250
300
8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2Schnitt 3
149
Pferd Nr. 12: Cilomilast
020406080
100120140160
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 12: Kontrolle
020406080
100120140160
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2abgestorben
150
Pferd Nr. 16: Cilomilast
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 16: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1abgestorben
151
Pferd Nr. 17: Cilomilast
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 44
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1abgestorben
Pferd Nr. 17: Kontrolle
020406080
100120140160
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
152
Versuch 3: Atropin
Pferd Nr. 8: Atropin
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 8 7 6 5
Wied
eröff.
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/l]
Bron
chus
lum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 8: Kontrolle Atropin
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 8 7 6 5
Wied
eröff.
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
153
Pferd Nr.9: Atropin
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr.9: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
154
Pferd Nr. 10: Atropin
0
50
100
150
200
250
300
350
8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 10: Kontrolle
0
50
100
150
200
250
300
8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2Schnitt 3
155
Pferd Nr. 12: Atropin
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 12: Kontrolle
020406080
100120140160
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2abgestorben
156
Pferd Nr. 16: Atropin
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 16: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1abgestorben
157
Pferd Nr. 17: Atropin
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 17: Kontrolle
020406080
100120140160
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
158
Versuch 4: Ipratropium
Pferd Nr 9: Ipratropium
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bron
chus
lum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr.9: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 7 6 5 5
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
159
Pferd Nr. 10: Ipratropium
0
20
40
60
80
100
120
8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/l]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 10: Kontrolle
0
50
100
150
200
250
300
8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2Schnitt 3
160
Pferd Nr. 12: Ipratropium
020406080
100120140160
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 12: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2Schnitt 3
161
Pferd Nr. 16: Ipratropium
020406080
100120140160
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 16: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1abgestorben
162
Pferd Nr. 17: Ipratropium
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 17: Kontrolle
020406080
100120140160
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
163
Pferd Nr. 18: Ipratropium
020406080
100120140160
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 18: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
164
Versuch 5: Tiotropium
Pferd Nr.9: Tiotropium
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bron
chus
lum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr.9: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff. 7 6 5 5
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
165
Pferd Nr. 10: Tiotropium
0
20
40
60
80
100
120
8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1abgestorben
Pferd Nr. 10: Kontrolle
0
50
100
150
200
250
300
8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2Schnitt 3
166
Pferd Nr. 12: Tiotropium
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 12: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2Schnitt 3
167
Pferd Nr. 16: Tiotropium
020406080
100120140160
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bron
chus
lum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 16: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1abgestorben
168
Pferd Nr.17: Tiotropium
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 17: Kontrolle
020406080
100120140160
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
169
Pferd Nr. 18: Tiotropium
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 18: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5
Wied
eröff 8 7 6 5
Wied
eröff
Kontra
ktion
Konzentration MCh [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
170
Versuch 7: Diphenhydramin
Pferd Nr. 20: Diphenhydramin
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bron
chus
lum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 20: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bron
chus
lum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
171
Pferd Nr. 21: Diphenhydramin
0
50
100
150
200
250
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 21: Kontrolle
0
50
100
150
200
250
300
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
172
Pferd Nr. 23: Diphenhydramin
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 23: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
173
Pferd Nr. 25: Diphenhydramin
020406080
100120140160180
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2Schnitt 3
Pferd Nr. 25: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1abgestorben
174
Pferd Nr. 26: Diphenhydramin
0
20
40
60
80
100
120
140
160
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 26: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
175
Pferd Nr. 27: Diphenhydramin
0
20
40
60
80
100
120
140
160
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr.27: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
176
Versuch 8: Azelastin
Pferd Nr. 20: Azelastin
0
20
40
60
80
100
120
140
160
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bron
chus
lum
en [%
]
Schnitt 1 Schnitt 2
Pferd Nr. 20: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
177
Pferd Nr. 21: Azelastin
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 21: Kontrolle
0
50
100
150
200
250
300
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
178
Pferd Nr. 23: Azelastin
0
20
40
60
80
100
120
140
160
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 23: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
179
Pferd Nr. 25: Azelastin
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2Schnitt 3
Pferd Nr. 25: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1abgestorben
180
Pferd Nr. 26: Azelastin
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr. 26: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
181
Pferd Nr. 27: Azelastin
0
20
40
60
80
100
120
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
Pferd Nr.27: Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
140
vorhe
r 8 7 6 5 4
Wied
eröff 8 7 6 5 4
Wied
eröff
MCh 5
Konzentration Histamin [10-x mol/L]
Bro
nchu
slum
en [%
]
Schnitt 1Schnitt 2
182
Teile der Dissertation wurden bereits veröffentlicht in:
Niedorf, F., A.-K. Barton, J. Vietmeier, S. Schenk, B. Ohnesorge u. M. Kietzmann
(2005):
Inhibition of metacholine-induced bronchoconstriction by parasympatholytics and
cilomilast in equine precision-cut lung slices.
Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol., 369 (Suppl. 1), R 102
183
IX Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Privatdozent Dr. B. Ohnesorge und Herrn
Prof. Dr. M. Kietzmann für die Bereitstellung des Themas und die stets
unkomplizierte und sehr freundliche Unterstützung in Durchführung, Beratung und
Fertigstellung der Arbeit bedanken.
Meinen Kollegen aus der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule
danke ich für ihre Kooperativität und Hilfe bei der Untersuchung der Probanden und
ihre fachliche und moralische Unterstützung in dieser Zeit.
Allen Mitarbeitern des pharmakologischen Instituts möchte ich für ihre
immerwährende Hilfsbereitschaft und Geduld danken, allen voran Frank Niedorf.
Den Mitarbeitern der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. S. Uhlig aus dem
Lungenforschungszentrum in Borstel danke ich für die Einblicke, die sie mir in die
Technik der Erstellung von PCLS gewährten.
Ein ganz besonderer Dank gilt Frerich DeVries für die Abwendung einer persönlichen
statistischen Krise.
Julia Vietmeier danke ich für ihre Kooperativität bei der Einarbeitung in die Methodik.
Rolf Wagels danke ich für die freundschaftliche Unterstützung und die Hilfestellung
bei der Lösung diverser computertechnischer Probleme.
Last but not least bedanke ich mich sehr herzlich bei Mariàn Kusenda und meinen
Eltern für ihre Hilfe und Unterstützung in allen Lebenslagen. Diese Arbeit wäre ohne
ihre Unterstützung nicht möglich gewesen!
![WINNINGER · • Kurzarm • Anatomischer Schnitt • Hoch Atmungsaktives Stretchgewebe • Verdeckter Reißverschluss • 2 klassische Rückentaschen [430 3747] 64,99 Factor Ladyy](https://img.pdfslide.org/doc/110x75/5fc75150df31484cf31e0c44/winninger-a-kurzarm-a-anatomischer-schnitt-a-hoch-atmungsaktives-stretchgewebe.jpg)
