402 J. SCHORMlJLL]~R, H.-D. B ~ z und E. BActtl~IAI~I~:

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind nach steigenden p~-Zahlen geordnet in der Tab. 1 zusammen- gefaSt.

Von den untersuchten Si~ften hat der handelsiibliche Citronensaft bei weitem den h6ehsten Gehalt an freier Phosphors~ure in der GrSBenordnung yon 1 retool/1 dank seinem niedrigen PH und dem hohen Gehalt an a. 1 ). Der Salt einer friseh aus- gedr/iekten Citrone enth~lt welt weniger a. P. und damit aueh Phosphorsi~ure. Often- sichtlich sind bei der industriellen Sa~therstellung labile organische Phosphatbin- dungen hydrolysiert worden.

Das Vorkommen ~reier Phosphors~ure ist nicht nur yon theoretisehem, sondern aueh yon einigem praktisehen Interesse, da die Phosphorsi~ure als Fremdstoff gilt. Iqach der Allgemeinen Fremdstoffverordnung ist der Zusatz yon Orthophosphors~ure nut bei der Herstellung coffeinhaltiger Erfrischungsgetr£nke in einer Menge bis zu 0,7 g auf ein Kilogramm zugelassen, das sind rund 7 retool/1. Wie die vorliegenden Unter- suehungen zeigen, kommen in einigen Obsts~ften verg]eichbare Mengen Phosphor- si~ure schon natfirlieherweise vor.

Die relativ hohe Phosphors~ure-Konzentration in den Obsts/~ften ist organolep- tisch sicher nieht ohne Bedeutung und dfirfte ffir den Geschmack der Frfichte und S~fte eine groBe Rolle spielen.

Zusammen]assung

Phosphate sind obligate Bestandteile aller lebenden Gewebe und damit aueh aller pflanzlichen und tierischen Iqahrungsmittel. Ein Tell des Gesamtphosphates liegt in anorganischer Form und je naeh dem pg als freie Phosphors~ure, prim£res, sekun- di~res oder terti~res Phosphat vor. Lebensmittel, die yon l~atur aus sauer genug sind (pH unter 4,0), dab in ihnen freie Phosphors~ure vorkommen muB, sind in erster Linie Obsts~Ite und Weine. Den hSchsten Phosphorsi~ure-Gehalt unter den unter- suehten Obsts~ften hatte ein handelsfiblicher Citronensaft mit einer Konzentration yon rund 1 retool/1.

Phosphate und organische Phosphorverbindungen in Lebensmitteln

X . Mitteilung

Phosphopeptide aus enzymatischen I Iydrolysaten yon ~-und r -Case in

Von

J. SCHORM~LLER, H.-D. BELITZ und E. BACHMANN* Mitteilung aus dem lnstitut /iir Lebe~smitteIchemie uncl Lebensmitteltechnologie

der Technischen Universit5t Berlin

~it 1 Textabbildung (Eingegangen am 12. April 1961)

In fffiheren Arbeiten hat ten wit uns mit der Isolierung, A~ftrennung und Kenn- zeichnung yon Phosphopeptiden aus Mager- und Fettkiisen besch~ftigt 1. Wit haben anschliel~end tryptische und peptische Hydrolysate yon ~- and r-Casein in ver-

* Fiir die FSrderung der Arbeit sind wir dem Verband der Chemischen Industrie, ~onds der Chemisehen Industrie, zu Dank verpflichtet.

1 SC~O~i~LL~, J., G. B~nssAv u. H.-D. BELITZ: Diese Z. 108, 346 (1958). - - Se~O~iiLLEI~, J., K. LEm~A~ u. tt.-D. BEIZTZ: Diese Z. 111, 180 (1960).

Phosphate und organische Phosphorverbindungen in Lebensmitteln. X 403

schiedene Fraktionen getrennt und dieVerteilung des Proteinstickstoffs und-phosphors auf diese ~raktionen untersueht 1. Im folgenden soll fiber die weitere Auftrennung einer dieser Fraktionen, und zwar der mit Blei-Ionen bei pH 4,6 f/~llbaren Phosphopeptid- fraktion dureh Ablenkungselektrophorese ~, beriehtet werden.

1. Darsgellung yon Phosphopeptiden aus a- und p-Casein

a) 50 g ~-Casein (analytische Daten vgl. Zit. 2) wurden in 550 ml Wasser suspendiert, mit n-NaO~ auf p~ 8,2 eingestellt und mit 0,5 g Trypsin (Merck, mind. 40000 Fuld-GroB-Einheiten pro g) bei 37 ° C 70 Std verdant. Der pH-Wert wurde yon Zeit zu Zeit mit n-NaOl:f nachgestellt. Insgesamt wurden 28,5 ml n-NaOI~ verbraucht.

b) 14 g/?-Casein (analytische Daten vgl. Zit. 3) wurden in 150 ml Wasser bei 37 ° C und bei p~ 8,2 mit 0,14 g Trypsin 70 Std verdaut. Zum ~achstellen des p~-Wertes wurden 11,95 ral n- NaOI-I verbraucht.

c) 50 g ~-Casein wurden in 550 ml Wasser bei 37 ° C und p~ 1,8 mit 0,5 g Pepsin (Merck, DAB 6) 70 Std verdant. Zum NaehsteHen des p~-Wertes wurden 24 ml n-I-IC1 verbraueht. Allen Ans~tzen wurden einige ml Toluol zugeffigt.

Nach beende~er Verdauung warden die drei Ans/~tze auf pi~ 4,6 gebracht und nach einigem Stehen bei 0 ° C zentrifugiert. Aus den ldaren Zentrifugaten wurden Phosphopeptide mit ges/~ttig- ter BleiacetatlSsung gef/~llt. Die Bleisalze wurden abgetrenn$, gewasehen, in Wasser suspendiert und mit H2S zersetzt. Die ~iltrate der PbS-F~llung wurden im Vakuum bei 3 5 ~ 0 ° C auf ein Volumen yon etwa 25 ml eingeengt. Die Phosphopeptide wurden mit dem 8--10fachen Volumen an Aeeton gef$11t.

In Tab. 1 sind die Ausbeuten und analytischen Daten zusammengestell~. Vor der Analyse wurden die Produk~e im Vakuum bei 56 ° C fiber P205 getrocknet. Hier und im folgenden wurde der Aminostickstoff (NA) durch direkte AnfKrbung yon Peptid- 16sungen mit ~qinhydrinreagens, der Gesamtstickstoff nach Veraschen mit I-I~SO~/ tt202 ebenfalls nach der ~inhydrinmethode und der Phosphor im gleiehen Ver- aschungsansatz nach F~s~:v,-Sc]~A~ow x ermittelt. Unter dem Weft ~q/P is~ bier und auch weiterhin das atomare VerhKltnis zu verstehen.

~r.

Tabelle 1. Analytische Daten der Phos:

Protein

c~-Casein a-Casein fl-Casein

~ermen~

Pepsin Trypsin Trypsin

~phopeptide aus Casein/raktionen

Ausbeute I (bet. auf l Protein) NA ~ P ~/NA

% %. % %

6,8 1,08 12,2 3,2 11,3 3,0 0,88 11.6 4,1 13,2 9,3 0,67 1215 3,2 18,7

N/P

8,4 6,3 8,6

2. Trennung der Phosphopeptide dureh Ablenkungselektrophorese

Die erhaltenen Phosphopeptide konnten dutch Ablenkungselektrophorese ~ in verschiedene Frak~ionen ge t r enn t werden. Dazu wurden je e twa 300 nag Subs~anz mi~ e~wa 4 ml n-Essigs/~ure verrfihr~. Vom Unl6sl ichen wurde abzent r i fugier t . I n L6sung gingen 82% yore P e p t i d 1, 65% yore P e p t i d 2 und 41% v o m P e p t i d 3. Wei~ere L6sungsversuche zeigten, dab diese W e r t e yon F a l l zu l~all schwanken, aber durehaus yon gleicher Gr6Benordnung sind. I n den LSsungen wurden p rak t i s eh die gleiehen N / N A- und ~/P-Verh/~ltnlsse gemessen wie an den Ausgangssubs tanzen , so dab eine se lekt ive L6sung einzelner Komponen~en auszuschl ie~en ist .

1 SCHOI~iYLLEI¢, J., U. R. FI~ESENIUS: Diese Z. 114, 279 (1961). SCHOR~0LLE~, J., u. K. LEHmAn: Diese Z. 110, 363 (1959).

404 J. SCIIOR1KULLER, H.-D. B]~LITZ und E. BAOH~a~NN:

Die elektrophoretisehe Auftrennung erfolgte in n-Essigs~iure (pH 2,5) bei 500 V (10 mA) Aufgeg~eben wurde an einem Punkt, der fiber dem Auffanggef~B Nr. 21 liegt. Die Laufzeit des Puffers betrug etwa 4,5 Std; yon den einzeinen LSsungen wurden 0,09 ml pro Std zugeffihrt. Aliquote Teile der Fraktionen wurden mit lqinhydrinreagens an gef~rbt.

In Abb. 1 sind die Werte fiir N A in #g/ml gegen die Frakt ionsnummern aufgetra- gen. Anhand orientierender N- und P-Analysen wurden zusammengeh6rige Frak- tionen vereinigt und dann auf NA, ~ und P analysiort. Die Ergebnisse bringt Tab. 2.

Tabelle 2. Elelctrophoretische Trennung von Phosphopeptiden

aus :c-Casein naeh Hydrolyse mlt Pepsin 8--15 1,2 17,6

16--18 2,9 49,2 19--20 40,2 447,0 21--23 41,5 472,0 24--26 21,4 330,0 28--31 4,8 60,7 32--42 2,1 44,4

aus or-Casein nach Hydrotyse mit Trypsin 7---10 1,7 66,0

11--13 1,8 75,0 14--19 5,8 134,4 21--23 11,5 175,3 26--29 2,0 54,5 30---42 1,8 33,0

aus fl-Casein nach Hydrolyse mit Trypsin 9--17 1,0 67,9

18--20 8,4 188,5 21--23 5,7 120,0 24--25 2,0 70,5 26--31 6,2 59,4 32--42 1,9 35,2

Vereinigte NA N P Fraktionen N]NA

~g/ml ~g/ml /~g/ml

N bez. auf Gesamt-N (F 1--42)

in %

10,2 20,8

162,0 116,0 62,0 8,8 0,9

14,7 17,0 11,1 11,4 15,4 12,7 21,2

3,9 5,2 6,1 9,0

11,8 15,3

109,0

3,1 3,4

21,0 35,4 22,0 4,3

11,0

P bez. auf Gesamt-P (F 1--42)

in %

7,6 6,0

32,1 36,8 13,9 2,6 9,4

25,8 32,8 59,1 35,2 6,7 1,5

38,8 41,6 23,1 15,3 27,3 18,3

5 , 7 5,2 5,0

11,1 18,0 48,7

9,1 10,O 36,9 22,4 8,0

13,7

11,7 14,5 53,6 14,9 3,2 2,1

22,4 76,5 20,5 7,4

16,2 3,2

(67,9) 22,5 21,0 35,2

9,6 18,5

6,7 5,5

13,0 21,1

8,1 24,3

(22,8) 27,1 14,9 6,0

15,1 13,9

27,8 40,5

9,5 2,3

15,2 4,7

D i s k u s s i o n

Gelegentlich friiherer, elngangs zitierter Untersuchungen unseres Arbeitskreises hat ten wir an verschiedenen Stellen auf die Ergebnisse ~nderer Autoren hingewiesen. Es erscheint jedoch zweckm~l~ig, alle uns bek~nntgewordenen Daten fiber die aus Casein und Caseinfraktionen isolierten Phosphopeptide bier nochmals in tabellari- sober Form zusammenzustellen (Tab. 3), um einen Vergleich aller bisher yon den einzeluen Arbeitskreisen gewonnenen und untersuchten Pr£parate zu ermSglichen.

Aus dieser Zusammenstellung ergibt sich folgendes Bild: die kleinsten N/P- Werte weisen mit 3,0--3,6 die Peptide •r. 2, 3, 4 und 10 aul; auch die Kettenl~ingen sind mit 8--10 Aminosi~ureresten niedrig. Es handelt sich dabei durchweg um ~ltere Produkte aus den Jahren 1940/41. Andere Autoren erhielten spi~ter beim ersch6pfen- den Abbau yon Gesamteasein mit Pepsin und Trypsin bzw. Pankre~tin Peptide yon anniihernd doppelter Molekiilgr61~e mit 51/P-Wer~en um 5,0 (5Ir. 1 und 5). Kurzzeitiger Abb~u mit Pepsin allein fiihrte zu Produkten mit 57/P ----- 12,9 bei Gesamtcasein (Nr. 8), 51/I ) = 12,7 bei ~-Casein (Nr. 12) und 5lIP = 11,9 b e i E-Casein (Nr. 15).

Phosphate und organische Phosphorverbindungen in Lebensmitteln. X 405

Es ents~ehen bier also hochmolekulare, relativ phosphorarme Produkte. Ersch6pfende Pepsinspaltung lieferte dagegen bei e-Casein ein Peptid mit N/P -- 6,84 (Nr. 13). Es tr i t t demnaeh gegenfiber dam Kurzzeitversuch schon allein durch weitere Pepsin- einwirkung eine starke Anreieherung yon Phosphor in der hier betraehteten Phos- phopeptidfraktion anf. B el Trypsin dagegen sind die Unterschiede zwischen kurz- zeitiger nnd erschSpfender Spaltung nur gering: aus c~-Casein resultieren Peptide mit N i P : 6,2 (Nr. 16) und N/P-~ 7,25 (Nr. 18) bzw. NIP = 5,55 (Nr. 20), aus fl-Casein Peptide mit N/P ~ 7,0 (Nr. 22) bzw. NIP -= 7,15 (Nr. 21). Die Spaltungskurven yon Casein- fraktionen, wie sic bei der Ity- drolyse dutch Pepsin bzw. Trypsin 1 erhalten warden, er- klfiren diese Befunde: mit Trypsin wird sehr schnell ein hoher Spaltungsgrad erreicht, der sich spgter nur noah wenig /indert. Die Pepsinspaltung hingegen verl/~uft fiber 1/~ngere Zeiten hin mit relativ starker Steigung.

Die N/P-Werte unserer Pep- tide (Tab. 1) ffigen sieh in das allgemeine Bild ein. Sic sind durchweg etwas gr6Ber als ver- gleiehbare Literaturwerte; der N/P-Wart des Produktes aus peptiseh gespaltenem e-Casein liegt zwisehen den Literatur- angaben ffir kurzzeitige und er- seh6pfende Hydrolyse. Die Ab- weichungen sind wahrschein- lieh darauf zurfiekznffihren, dag fast alle in Tab. 3 ange- ffihrten Phosphopeptide sehon in irgendeiner Form vorge- reinigg wurden.

!i J

~9 + I -

i l l ii ILl I ~ ! ii ' ~1 "~

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1o go ~o ¢o ppfl,4¢l'O/7 N~.

Abb. 1. Trennung yon Phosphopeptiden aus a- und J-Casein dutch Ab- lenkungselektrophorese. - - . - - . a-Casein (Pepsin); ..... u-Casein (Trypsin);

- - fl-Casein (Trypsin)

Damit kommen wit zur Frage, ob es sieh bei derartigen Phosphopeptiden um einheitliehe Produkte oder um Gemisehe handelL Bei der Darstellung aus G e s a m t -

c a s e i n oder bei der Verwendung undefinierter Fermentpr/~parate ist ohnehin ein Ge- miseh zu erwarten. So wurden aus Peptid Nr. 1 durch Ionophorese vier Fraktionen mit N/P-Wer~en zwisehen 3,47 und 11,9 (Nr. 23--26) isoliert, die ihrerseits aueh noah nieht einheitlieh sind, sondern am Anionenaustauseher Dowex 2 waiter zerlegt warden konnten. Bei den Peptiden Nr. 2, 3, 4 und 10 finden sieh keine n/~heren Angaben fiber Einheitliehkeit. Das Peptid Nr. 5 konnte an Dowex 50 in versehiedene Fraktionen getrennt warden; die zwei wiehtigsten sind als Peptide Nr. 6 nnd 7 in

1 SC~O~M/)LLE~, J., u. R. F~s~.~i~s: Zit. S. 403, Anm. 1. Z, L e b e n s m i t t . - U n t e r s u c h . , B a n d 115 2 7

406 J. S c ~ o ~ i ) ~ , H.-D. BELITZ und E. B A C ~ A ~ :

Tabelle 3. Literaturzusammenstellung i~ber Phosphopeptide aus Casein. * = kristaUisiert; • * = P bedeutet in dieser Spalte Phosphors~ure

Nr.

8

9

10 11

12

13

14

15

16 17

18 19

20

21

22

23

Protein

~asein

?asein

Jasein

~asein

~asein

Ferment

Pepsin, Trypsin, Pepsin, Trypsin Pepsin, Trypsin Pepsin, Trypsin Pepsin, Pan- kreatin 2. ttydr, mit Trypsin*

Pepsin*

Pepsin*

Trypsin Pepsin*

Pepsin*

Pepsin (DAB 6)

Pepsin*

Pepsin*

Trypsin*

Trypsin*

Trypsin

Trypsin

Trypsin*

Hydrolyse

erseh5pfend

ersehSpfend

erseh5pfend

erschSpfend

ersehSpfend

1,5--2,5 Std

1,5--2,5 Std

ersch5pfend 1,5--2,5 Std

1,5--2,5 Std

ersch5pfend

1,5--2,5 Std

1,5--2,5 Std I

50 min

65 mill

ersch6pfend

ersch6pfend

20 min

Isolierung dutch

pb++

pb++

C u ++

C u ++

pb++

Chromat. Dowex 50 aus Nr. 5 Chromat. Dowex 50 aus Nr. 5 :B& ++ ~ u s

Gel Ba ÷+ aus Nicht-Gel pb++ B a ++ a u s Gel B ~ ++ &US Nieht-Gel B a + +

B ~ ++ 3~LIS

Gel Ba ++ aus Niche-Gel pb++ Elektro- phorese aus Nr. 16 ~ + +

Chromat. Dowex 1 aus Nr. 18 pb++

pb++

Ba++

I o n o - phorese aus Nr. 1

Aus- beute

%

2,88

[ Amino- s~iure- roste

pro tool

10

9

10

2O

10

8

22

3O

35

20

21

24

NfP

4,87

3,22

3,0

3,3

5,0

4,5

Summenformel

Ser4GluaIleueP2**

Ser4GlusP3

Ser~GlusIleu P3

Ser3GluaThr Val Ileu His P3

Ser~Glu2XtP2

Ser4GlusAsp2Thr~Gly Ala Val Met2Leu Ileu: Phe P4

SersThr Glu~Asp3Pro Gly Ala2Val2Met2Ileu3 Lysl-2P6

Asp4Thr Ser, GluloPro Gly Ala2Val2Met~lleu4 Lys~P~ Ser4GluGThr Asp Gly AlaaVal~Met Ileu Leu P4 Ser~GlusThr Asp3Ala Val Met Ileu~ Leu P3 Ser4Thr GluTAsp Pro Gly Val~Ileu2LeusArg ~ P5

Lit .

7

3

12

8

14

14

10

11

Phosphate und organische Phosphorverbindungen in Lebensmitteln. X 407

Protein Fermen~

J

Trypti- case

Hydrolyse

(handelsfibl. pankreati- sehes Casein- hydrolysat)

NiP

Tabelle 3 (Fortsetzung)

Isolierung durch

Iono- p h o r e s c aus Nr. 1 Iono - phorese aus Nr. 1 Iono- phorese aus Nr. 1 Chromat. Dowex 1

Amino- I Aus- saure- beute reste

% pro mol ~r .

24

25

26

27

Summenformel

4,52

5,98

11,9

3,32

Lit.

1 BExme~, I-I., B. JolzANSSO~ u. R. 0STE~EE~G: Acta Chem. Seand. 13, 1171 (1959). ZkGI~EN, G., u. J. GLOMSET: Acta Chem. Seand. 7, 1071 (1953).

3 DA~ODARA~, M., U. B. V. RAMACE~I)~A~: Biochem. J. 35, 122 (1940). 4 G~ovEs, M. L., lq. J. HIe]~ u. T. L. McMEEKIN: J. Amer. chem. See. 80, 716 (1958). 5 G~ti~Dm, E., u. M. PA~TLITSCm~O: Monatsh. Chemie 90, 891 (1959).

Low~ES, J., T. J. R. IM~CA~A u. R. H. A. PLOWMEn: Biochem. J. 35, 315 (1941). I-~ELL~DER, O. : Upsala L~k. FSren. FSrh. 52, 107 (1947),

s 0STEREE~O, R. Arkiv Kemi 13, 409 (1959). 9 PA~TLITSC]rKO, M., u. E. GR~)~Dm: Monatsh. Chemie 89, 274 (1958).

10 PAI~TLISCI:ITKO, ~. , u. E. GRUI~DIG: Monatsh. Chemie 89, 489 (1958). n PETE~SO~, 1~. F., L. W. I~AU~A~ u. T. L. ~¢[CME~.K~: J. Amer. chem. See. 80, 95 (1958). 1~ RIMINGTO~, C.: Biochem. J. 35, 321 (1941). ~a REEVES, R. E., u. N. G. L~TOU~: Science 128, 472 (1958). ~ 0STE~BERO, R. Biochim. biophys. Acta 42, 312 (1960).

die Tab. 3 ~ufgenommen worden. Aueh P e p t i d Nr. 9 is t erwartungsgem/~B elektro- phore t i sch n ich t einheit l ich.

Doch werden auch aus par t i e l l en H y d r o l y s a t e n yon Casein]raktionen durch Ble i - Ionen bei p~ 4,6 Peptidgemische gef/~llt; z. B. is t P e p t i d •r. 12 aus ~-Casein e lek t rophore t i sch uneinhei t l ich. Auch P e p t i d Nr. 13 konn te bei p ~ 7,2 dureh Elek t ro - phorese in zwei K o m p o n e n t e n ge t renn t werden; nach mehrmal ige r Umf/ i l lung des Ba-Salzes erwies sich dieses Pr i tpa ra t als e lek t rophore t i sch ein_heitlich. Aueh das , , R o h " - P e p t i d Nr. 20 wurde auf diese Weise gereinigt , doch fehlen A nga be n fiber Einhei t l ichkei t . Das P e p t i d Nr. 16 wurde bei pH 2,8 e lek t rophore t i sch sogar in sechs F r a k t i o n e n zerlegt, yon denen vier Phosphor enthiel ten. Die sauers te F r a k t i o n wurde isol ier t und ana lys ie r t (Nr. 17). Das Pep~id /qr. 18 warde an Dowex 1-X 2 durch Grad ien te lu t ion m i t Mg-aceta t lSsung f rakt ionier t . Aus einer F r a k t i o n wurde naeh wei terer zweimMiger Chromatograph ie ein wahrscheinl ich einheit l iehes P e p t i d (Nr. 19) erh~lten. Man k6nn te solche Ergebnisse be im ~-Casein auf die bekann te 1 Uneinhei t - l ichkei t dieser C~seinfrakt ion zurfiekfiihren, dock wurden auch bei der Spa l tung yon fl-Casein P r o d u k t e erhal ten , die erst nach mehrmal igem Umf/i l len der Ba-Sa lze (Nr. 21) einhei t l ieh erschienen oder aus denen durch Chromatograph ic an Dowex 50 mehrere K o m p o n e n t e n isolier~ werden konn t en (Nr. 22).

1 B~VNNER, J. R., C. A. EI~Sm~OM, R. A. HOLLIS, B. L. LA~SO~, R. McL. WITNE:~ u. C. A. ZITTLE: J. Dairy Sei. 43, 901 (1960).

27*

408 J. So~o~iinL~R, H.-D. BELITZ und E. B~C~MANN:

Da bei der Fallung mit Blei- bzw. Barium-Ionen in saurer LSsung naeh unseren bishorigen Kenntnissen in jedem Fall Gemisehe yon Peptiden zu erwarten sind, haben wir wie oben besehrieben die gesamte fallbare Fraktion der Elektrophorese bei pH 2,5 unterworfen, ohne eine Vorreinigung durehzuffihren. Allerdings ist ein Tell der Produkte in n-Essigsaure nieht 15slieh. Diese Rfickstande sollen in einer spateren Arbeit noeh untersneht werden. Die Ergebnisse dieser elektrophoretisehen Trennung sind in Abb. 1 und Tab. 2 zusammengestellt. Jedes Peptidgemiseh wurde in 6 bis 7 Fraktionen zerlegt, deren 1N/P-Werte yon etwa 4,0 bis zu etwa 100 variierten. Alle drei Produkte lieferten jedoch deutliehe Sehwerpunkte: bei den aus ~-Casein dureh Popsinhydrolyse erhaltenen Phosphopeptiden finden sich 32 bzw. 37 % des Phosphors in Fraktionen mit 1N/P-Werten yon 6,1 nnd 9,0. 13% des Phosphors liegen in saureren, die restliehen 26% in phosphorarmen bzw. praktisch phosphor- freien Fraktionen vor. Unter den phosphorhaltigen tryptisehen Spaltprodukten des g-Caseins, bei denen infolge der im Vergleich zum Pepsin weitergehenden Spaltung der Phosphor starker angereiehert ist, finder sich eine Hauptfraktion, die bei einem 1N/P-Wert yon 5,0 etwa 54% des bei der Elektrophorese eingesetzten Phosphors enthalt. Weitere 26 % des Phosphors finden sieh in Produkten mit sehr ahnlichen 1N/P- Werten (5,2 bzw. 5,7), die welter zur Anode gelaufen sind als die eben erwahnte t tauptfraktion. Es handelt sich am h5hermoleknlare Peptide, die also pro tool mehr Phosphorsauregruppen enthalten und dadurch eine gr6•ere negative Ladung tragen. Aueh bei der Trennung der Peptide aus tryptisch gespaltenem fl-Casein konzentrieren sich 41% des eingesetzten Phosphors in einer Fraktion mit 1N/P ---- 5,5.28 % sind in einer Fraktion enthalten, die ebenfalls trotz eines iN/P-Verhaltnisses yon 6,7 welter zur Anode gewandert ist. 1Naeh dem iN/Na-Verhaltnis zu urteilen, liegen auch hier grS~ere Molekiile vor.

Es ist nicht anznnehmen, daI~ es sich bei allen Fraktionen um einheitliche Kom- ponenten handelt. Versuehe zur Trennung phosphorhaltiger Peptide an Kationen- austausehern, die wir in einem anderen Zusammenhang durehgeffihrt haben, deuten vielmehr darauf hin, dab durch Elektrophorese in der hier gesehilderten Weise zwar die stark sauren Produkte relativ gut abgetrennt werden, da~ aber in den iibrigen Bereiehen Gemisehe yon phosphorreiehen, stark sauren mit phosphorarmen und phos- phorfreien Verbindnngen vorliegen kSnnen. Die erhaltenen Fraktionen miissen vor der Durchfiihrung yon Aminos~ureanalysen durch erneute Elektrophorese bzw. dnrch andere Verfahren weiter zerlegt werden.

Aus den Ergebnissen folgt, dab die ,,Hauptfraktion" der mit Blei-Ioneniallbaren Peptide bei tryptiseher Spaltung yon ~- und fi-Casein vier Phosphorsauregruppen pro Molekfil enthalt, die wahrscheinlich einen stark sauren Kern in diesem Molekfil bilden. Es ist mSgHch, daI~ eine Gruppierung (P-Ser)4 vorliegt, denn yon SA~GE~ 1 wurden aus partiell saurehydrolysiertem Casein Peptide der Art (P-Ser)n dutch Elektrophorese abgetrennt, wobei der Index n Werte yon 1--3 zeigte. Die Existenz des entsprechenden Tetrapeptids wird yon den Autoren nicht ausgeschlossen, zumal auch POSTE~NA]¢ 2 wesentlieh friiher zu dem Schlul~ gekommen war, er habe ein Peptid Ser 4 aus Casein isoliert. Die yon uns isolierten hShermolekularen Produkte (F 7--10, F 11--13 bzw. 9--17) enthalten 7--8 PhosphorsiiuregTuppen pro Molekiil und kSnnten als Vorlaufer der ,,Hauptfraktionen" aufgefal3t werden, aus denen bei langerer Trypsineinwirkung die Pa-Verbindungen entstehen mfiBten. Es folgt daraus, dab in den Peptidketten yon ~- und fl-Casein mindestens zwei stark saure Zentren

WILLI_~S, S., u. F. SA~(~n~: Biochim. biophys. Acta ~3, 294 (1959). 2 POSTE~AK, S. : C. R. Soc. Biol. (Paris) 184, 306 (1927).

Phosphate und organische Phosphorverbindungen in Lebensmitteln. X 409

vorhanden sein miissen, wobei often bleibt, ob die Umgebung dieser beiden Zentren die gleiehe Sequenz aufweist. Diese in F 7--10 und F 11--13 vorliegenden hoch- molekularen Peptide entspreehen wahrscheinlich dem yon (~S~E~B~G 1 aus einem tryptisehen t tydrolysat yon a-Casein durch Chromatographie an Dowex 1-X 2 isolierten Pep~id (Nr. 19 in Tab. 3), denn MolekiilgrSl~e ~, N/P-Wert und damit die Anzahl der Phosphors~uregruppen pro Molekfil stimmen gut fiberein. Das Peptid yon (~STERBE~a weist einen mittelsti~ndigen Lysinrest auf und damit eine ffir Trypsin spaltbare Bindung. In der genannten Arbeit wird darauf hingewiesen, dal3 diese Bindung schwer spaltbar sein muB. Aus unseren Ergebnissen folgt, dab auch naeh langdauernder Trypsineinwirkung anscheinend keine vollstiindige Spaltung eintritt, wenn auch ein Grol3teil des bei der elektrophoretischen Trennung eingesetzten Phos- phors (etwa 54% in F 14--19) in Form yon Peptiden mit 4 Phosphors~uregruppen vorliegt. Es ware yon Interesse, festzus~ellen, ob sieh bei Kurzzeitbebrfitung mR Trypsin dieses Verh~ltnis yon P~-s- zu P~-Peptiden zu Gunsten der hShermoleknlaren Produkte verschiebt.

Daneben existieren anseheinend Produkte mit 1--2 Phosphors~uregruppen, wie wir sie aueh frfiher in Phosphopeptidfrak~ionen aus reifenden K~sen naehgewiesen batten. Ffir die Phosphopeptide, wie sie bei der Pepsinspaltung yon a-Casein an- fallen, sind die Verh~l~nisse e~was unfibersichtlicher. Wir haben auch hier eine Frak- ~ion mit durchschnittlieh vier Phosphorsiiuregruppen pro Molekfil, doch repr~sentiert sie nur 7,6 % des Gesamtphosphors. Der Sehwerpunkt liegt au~ Produkten mit 1 bis 2 PO~H~-Gruppen. Das ist nicht recht verstandlich, da gerade bei der Pepsinspaltung relativ hoehmolekulare Peptide erwartet werden mfi~ten. AUerdings wurden auch in der eingangs zitierten Arbei~ kleine N/NA-Werte gefunden a. GRff~Dm a erhielt dagegen beim ersehSpfenden Abbau yon a-Casein mit Pepsin ein Phosphopeptid mit 22 Aminos~ureresten. Die bier bestehenden Uns~immigkeiten sollen dutch weitere Untersuehungen gekli~rt werden.

Zusammen/assung a- und fl-Casein wurden mR Pepsin und Trypsin hydrolysiert. Durch F~llung mit

Blei-Ionen bei pH 4,6 wurden Phosphopeptidgemische erhalten, die durch Ablenkungs- elektrophorese in verschiedene Fraktionen zerlegt werden konnten. Diese Fraktionen wurden auf Aminostiekstoff, Stickstoff und Phosphor analysier~. Alle uns aus der Litera¢ur verffigbaren Daten fiber Casein-Phosphopeptide wurden tabellariseh zu- sammengefa~t und mit unseren Ergebnissen verglichen. In den Peptidketten der Caseinfraktionen liegen anseheinend mindestens zwei stark saure Zentren mi~ jeweils drei bis vier Phosphorsi~uregruppen vor.

1 ()ST~B~G, R. : Biochim. biophys. Acta 42, 312 (1960). Aus dem N]N~-Verhaltnis ergeben sich 39--42 Aminos~urereste pro l~olekiil. Dieser Wer~

ist etwas zu hoch, da I~ in unserem 1%11 den Gesamtstickstoff und nich~ nur den ~-Aminos~ickstoff umfaBt.

s SC~OI~iiLL~R, J., u. R. F~ESE~VS: Zit. S. 403, Anm. 1. 4 G~ff~I)IG, E., u. M. P~TLrrSCH~O: Monatsh. Chemie 90, 891 (1959).

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