Physikalische Kartierung und Genexpressionsanalysen im

Physikalische Kartierungund

Genexpressionsanalysenim Genom von Neurospora crassa

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Gradeseines Doktors der Naturwissenschaften

an der Universität Konstanz

Mathematisch-Naturwissenschaftliche SektionFachbereich Biologie

vorgelegt von

Verena Aign

Tag der mündlichen Prüfung: 21. Februar 2002

Referent: Prof. Dr. R. Knippers

Referent: Prof. Dr. K.-P. Schäfer

Diese Arbeit wurde von November 1997 bis August 2001 unter der Leitung von Herrn

Prof. Dr. R. Knippers, Fachbereich für Biologie der Universität Konstanz, am Deut-

schen Krebsforschungszentrum Heidelberg in der Abteilung „Funktionelle Genomana-

lyse“ unter der Leitung von Dr. J. D. Hoheisel angefertigt.

Herrn Prof. Dr. Rolf Knippers danke ich herzlich für die Betreuung meiner Promotions-

arbeit.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Jörg Hoheisel für die Möglickeit, die Promotion in

seiner Abteilung durchführen zu können, für seine stete Diskussionsbereitschaft und

seine vielen Lösungsvorschläge bei Fragen, die im Laufe meiner praktischen Arbeit

auftraten. Ebenso danke ich ihm für die Ermöglichung eines Forschungsaufenthaltes in

USA sowie vieler Kongressbesuche im In- und Ausland.

Besonders herzlich möchte ich mich bedanken bei Mareike Grees für ihre engagierte

Mitarbeit vorallem bei der Etablierung und Durchführung der Versuche zu den Genex-

pressionsanalysen. Ausserdem danke ich ihr und Sandra Schwarz für viele nette Stun-

den im Labor X021 und beim „Chinesen“.

Carmen Fischer danke ich für viele Hybridisierungen zur physikalischen Kartierung.

Für Tips und Tricks bezüglich des physikalischen Kartierens möchte ich mich bei Jens

Hanke und Marcus Frohme bedanken, für die hilfreiche Unterstützung beim „expression

profiling“ danke ich vorallem Andrea Bauer, Frank Diehl und Boris Beckmann.

Bei Ole Brandt und Boris Beckmann bedanke ich mich für ihre stete Hilfsbereitschaft

bei allen geklärten und ungeklärten Fragen rund um UNIX und PC, bei Kurt Fellenberg

bedanke ich mich für seine unermüdliche Geduld und seine Einführung in die uner-

gründlichen Tiefen von M-Chips.

Ebenso möchte ich mich auch bei allen anderen Mitarbeitern der AG Hoheisel für die

angenehme Arbeitsatmosphäre im Container bedanken.

Mein herzlichster Dank gilt Markus für sein grosses Verständnis, seine ausdauernde

Geduld und die moralische Unterstützung, die er mir nicht zuletzt durch etliche wissen-

schaftliche Anregungen und wertvolle Diskussionen gewährleistet hat.

Inhaltsverzeichnis

I

A Abkürzungen ...................................................................................................1

B Zusammenfassung .........................................................................................2

1. Einleitung.........................................................................................................4

1.1. Der Modellorganismus Neurospora crassa ..................................................................4

1.1.1. Historischer Hintergrund ......................................................................................................4

1.1.2. Lebenszyklus .......................................................................................................................5

1.1.3. Das Genom von Neurospora crassa......................................................................................7

1.1.4. Neurospora crassa Genom-Projekt .......................................................................................8

1.2. Physikalische Kartierung .............................................................................................9

1.3. DNA-Chip-Technologie ..............................................................................................10

1.4. Genexpressionsanalysen.............................................................................................12

2. Material und Methoden................................................................................16

2.1. Material ......................................................................................................................16

2.1.1. Chemikalien und Biochemikalien .......................................................................................16

2.1.2. Enzyme..............................................................................................................................17

2.1.3. DNA-Längenstandards .......................................................................................................18

2.1.4. Primer für PCR ..................................................................................................................18

2.1.5. Häufig verwendete Puffer, Medien und Lösungen...............................................................18

2.1.6. Verwendete Chemikaliensätze ............................................................................................21

2.1.7. Materialien.........................................................................................................................21

2.1.8. Geräte ................................................................................................................................22

2.1.9. Bibliotheken.......................................................................................................................23

2.1.9.1. Genomische Cosmid-Bibliothek..................................................................................23

2.1.9.2. Genomische BAC-Bibliothek......................................................................................23

2.1.9.3. cDNA-Bibliothek........................................................................................................24

2.2. Methoden Physikalische Kartierung..........................................................................25

2.2.1. Anzucht und Replikation von genomischen Bibliotheken ....................................................25

2.2.2. Herstellung genomische Cosmid-Bibliothek .......................................................................25

2.2.2.1. Präparation genomischer DNA aus Neurospora crassa ................................................25

2.2.2.2. Partialrestriktion genomischer DNA und Dephosphorylierung .....................................26

2.2.2.3. Ligation der N. crassa-DNA in den Vektor pLawrist-4 ................................................27

2.2.2.4. Transfektion ...............................................................................................................27

2.2.2.5. Überführung von Klonen in Mikrotiterplatten..............................................................27

2.2.3. Herstellung von DNA-Filtern .............................................................................................28

2.2.4. Selektion Chromosom II- bzw. V spezifischer Cosmid-Bibliotheken ...................................29

Inhaltsverzeichnis

II

2.2.5. Selektion einer Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek ..............................................30

2.2.6. Präparation von Cosmid-DNA............................................................................................30

2.2.7. Präparation von BAC-DNA................................................................................................31

2.2.8. Hybridisierung mit radioaktiv markierter DNA...................................................................32

2.2.8.1. Radioaktive Markierung der DNA...............................................................................32

2.2.8.2. Hybridisierung der radioaktiv markierten Sonden ........................................................32

2.2.8.3. Autoradiographien ......................................................................................................33

2.2.8.4. Regeneration der Filter................................................................................................33

2.2.9. Hybridisierung mit Digoxigenin-markierter DNA ...............................................................33

2.2.9.1. Markierung von DNA mit Digoxigenin .......................................................................33

2.2.9.2. Hybridisierung der mit Digoxigenin markierten DNA..................................................33

2.2.9.3. Chemilumineszente Signaldetektion mit CSPD®.........................................................34

2.2.9.4. Regeneration der Filter................................................................................................34

2.2.10. Analyse der Hybridisierungsdaten ....................................................................................34

2.3. Methoden Genexpressionsanalysen ...........................................................................36

2.3.1. Anzucht und Replikation der cDNA-Bibliothek ..................................................................36

2.3.2. PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek ..........................................................................36

2.3.3. Herstellung heterologer Kontrollen.....................................................................................37

2.3.4. Herstellung der DNA-Chips ...............................................................................................38

2.3.4.1. Beschichtung von Glas-Objektträgern mit Poly-L-Lysin ..............................................38

2.3.4.2. Aufbringen der DNA auf die Chips .............................................................................38

2.3.5. Mycelproben von Neurospora crassa .................................................................................40

2.3.6. Isolierung von RNA aus Neurospora crassa .......................................................................40

2.3.7. Markierung von komplexen Proben durch cDNA-Erststrangsynthese ..................................41

2.3.7.1. Reverse Transkription unter Verwendung von aa-dUTP...............................................41

2.3.7.2. Kupplung von reaktiven Fluoreszenzfarbstoff-Estern an aa-dUTP................................42

2.3.7.3. Photometrische Einbaubestimmung von Cy3/Cy5........................................................42

2.3.8. Hybridisierung auf Glas-Chips ...........................................................................................43

2.3.9. Auswertung der Hybridisierungsdaten ................................................................................45

2.3.9.1. Detektion....................................................................................................................45

2.3.9.2. Quantifizierung der Signalintensitäten mit GenePix™ .................................................45

2.3.9.3. Datenanalyse mit M-Chips..........................................................................................45

3. Ergebnisse .......................................................................................................49

3.1. Physikalische Kartierung ...........................................................................................49

3.1.1. Herstellung der gesamt-genomischen Cosmid-Bibliothek....................................................49

3.1.2. Selektion chromosomenspezifischer Cosmid-Bibliotheken..................................................52

3.1.3. Selektion Chromosom II-spezifische BAC-Bibliothek.........................................................54

3.1.4. Präparation von Cosmid-DNA............................................................................................55


Inhaltsverzeichnis

III

3.1.6. Physikalische Kartierung....................................................................................................57

3.1.7. Sequenzanalyse ..................................................................................................................65

3.2. Genexpressionsanalysen.............................................................................................69

3.2.1. PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek ..........................................................................69

3.2.2. Herstellung heterologer Kontrollen.....................................................................................70

3.2.3. Herstellung der DNA-Chips ...............................................................................................71

3.2.4. Isolierung von RNA aus Neurospora crassa .......................................................................72

3.2.5. Generierung der Hybridisierungsdaten................................................................................72

3.2.6. Datenanalyse mit M-Chips .................................................................................................74

3.2.7. Vergleich der Transkriptionsprofile von N. crassa mit S. cerevisisae ...................................76

3.2.8. Genexpression von N.crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien..........................78

4. Diskussion .......................................................................................................90

4.1. Das Neurospora crassa Genom-Projekt .....................................................................91

4.2. Physikalische Kartierung ...........................................................................................92

4.2.1. Verwendete Bibliotheken ...................................................................................................92

4.2.2. Selektion von Sub-Bibliotheken .........................................................................................95


4.2.4. Hybridisierungstechniken ...................................................................................................97

4.2.5. Kartierungsstrategie Chromosom V ....................................................................................98

4.2.6. Kartierungsstrategie Chromosom II ..................................................................................100

4.3. Genexpressionsanalysen...........................................................................................101

4.3.1. DNA-Chip-Technologie ...................................................................................................101

4.3.2. Verwendete cDNA-Bibliothek..........................................................................................102

4.3.3. Amplifikation der cDNA-Bibliothek.................................................................................103

4.3.4. Markierungsreaktion ........................................................................................................103

4.3.5. Hybridisierung .................................................................................................................105

4.3.6. Genexpression von N.crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien........................106

4.4. Ausblick ....................................................................................................................110

5. Literaturverzeichnis........................................................................................112

6. Eigene Publikationen.....................................................................................121

7. Lebenslauf ........................................................................................................122

Abkürzungen

1

A) Abkürzungsverzeichnisaa-dUTP Aminoallyl-2´-Desoxyuridin-5´-triphosphatATP Adenosin-5´-triphosphatBAC bacterial artificial chromosomebp BasenpaareBSA Rinderserumalbumin (bovine serume albumine)cDNA komplementäre DNA (complementary DNA)CSPD 3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetan-3,2 -(5 chloro)tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan}-4-yl Phenylphosphat

dATP 2´-Desoxyadenosin-5´-triphosphatdCTP 2´-Desoxycytidin-5´-triphosphatDEPC DiethylpyrocarbonatdGTP 2´-Desoxyguanosin-5´-triphosphatDIG-11-dUTP Digoxigenin-11-2´-desoxyuridin-5´-triphosphatDMSO DimethylsulfoxidDNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid )dNTP 2´-Desoxyribonukleosid-5´-triphosphatDTT DithiothreitoldTTP 2´-Desoxythymidin-5´-triphosphatdUTP 2´-Desoxyuridin-5´-triphosphatE. coli Escerichia coliEDTA EthylendiamintetraessigsäureFGSC Fungal Genetic Stock Centerg Grammh Stundekb Kilobasenpaare (= 1000 )l LiterM Molarm~ milli (10-3)Mb Megabasenpaare (=1.000.000 )min MinutemRNA kodierende RNA (messenger RNA)n~ nano (10-9)ORF offener Leserahmen (open reading frame)PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)SDS NatriumdodecylsulfatTris Tris (hydroxymethyl)-aminomethantRNA Transfer-RNAU Einheit (Unit)µ~ Mikro (10-6)

Zusammenfassung

2

B) Zusammenfassung

Der filamentöse Ascomycet Neurospora crassa dient seit mehr als 50 Jahren als Mo-

dellorganismus vor allem für genetische Studien. Um das bisher erlangte Wissen, das in

mehr als 5000 Veröffentlichungen publiziert wurde, für das gesamte Genom zu kom-

plettieren und um daraus tiefere Einblicke in die Biologie von Pilzen gewinnen zu kön-

nen, wurde eine Genom-Initiative ins Leben gerufen, deren erstes Ziel die vollständige

Sequenzierung von N. crassa ist. Das deutsche Neurospora crassa Genom-Projekt, dass

1998 initiiert wurde, machte es sich zur Aufgabe, die Chromosomen II und V, die zu-

sammen etwa ein Drittel der Gesamtsequenz ausmachen, zu sequenzieren.

Die im ersten Teil dieser Arbeit erstellten physikalischen Klonkarten von Chromosom II

und V dienten als Basis für die Sequenzierung. Für die Kartierung wurde zunächst eine

genomische Cosmid-Bibliothek hergestellt, zu der eine bereits bestehende Cosmid-

Bibliothek hinzugefügt wurde, so dass man insgesamt eine 17-fache Abdeckung des

Genoms auf Cosmid-Ebene erreichte. Weiterhin wurde eine genomische BAC-

Bibliothek mit einer 15-fachen statistischen Abdeckung zur Verfügung gestellt. Aus

diesen Bibliotheken wurden zunächst Chromosomen-spezifische Sub-Bibliotheken se-

lektiert. Dazu wurden die Klone der genomischen Bibliotheken in einem hochdichten

Raster auf Nylonmembranen angeordnet. Die Selektion der Cosmid-Sub-Bibliotheken

erfolgte durch Hybridisierung radioaktiv markierter chromosomaler DNA auf die Mem-

branen mit der genomischen Cosmid-Bibliothek. Im Falle der BAC-Sub-Bibliothek

wurden Chromosom-spezifische Cosmide auf die Membranen mit der genomischen

BAC-Bibliothek hybridisiert. Die bei diesen Hybridisierungen positiven BAC-Klone

wurden als Chromosom-spezifisch identifiziert und selektiert.

Ausgehend von den Sub-Bibliotheken wurde die physikalische Kartierung durch Hybri-

disierung begonnen. Die DNA einzelner Klone wurde nach Markierung auf die Mem-

branen der Sub-Bibliotheken hybridisiert, wodurch benachbarte Klone identifiziert wer-

den konnten. Die Anordnung der Klone anhand ihrer Hybridisierungsmuster zu einer

physikalischen Karte erfolgte mit einem Softwarepaket. Um Lücken in den Karten

schliessen zu können, wurden in der Endphase die Hybridisierungen auf die Membra-

nen mit den genomischen Bibliotheken durchgeführt. Die resultierende Karte von

Chromosom II besteht aus 13, die Karte von Chromosom V aus 21 Bereichen zusam-

menhängender Klone. Basierend auf diesen physikalischen Klonkarten wurde die Se-

quenzierung der beiden Chromosomen begonnen.

Zusammenfassung

3

Im zweiten Teil der Arbeit wurden Genexpressionsanalysen mit Hilfe der DNA-Chip-

Technologie durchgeführt. Die klonierten Fragmente einer zur Verfügung gestellten

cDNA-Bibliothek, die 4700 Klone enthielt, wurden mittels PCR amplifiziert und in ei-

nem hochdichten Raster auf Glas-Chips aufgebracht. Durch Hybridisierung komplexer

RNA-Proben wurden die Transkriptionsprofile für drei verschiedene Wachstumsbedin-

gungen für Mycel von N. crassa erstellt. Zwei Mycel-Proben waren auf Minimalmedi-

um gewachsen, wobei bei einer Probe als Kohlenstoff-Quelle im Minimalmedium Sac-

charose enthalten war, bei der zweiten Probe stattdessen Natriumacetat. Die dritte Probe

war auf sogenanntem Vollmedium gewachsen, dass ausser Saccharose zusätzlich Hefe-

Extrakt und Caseinhydrolysat enthielt. Für den Vergleich der Genexpression wurden

jeweils zwei mRNA-Populationen nach Markierung durch reverse Transkription mit

unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen auf die Chips cohybridisiert. Nach Detektion

und Quantifizierung der Signalintensitäten, die direkt mit der Häufigkeit des entspre-

chenden Transkripts korrelieren, wurden aus dem Verhältnis der Signalintensitäten bei-

der Proben Faktoren für Induktion bzw. Repression der zugehörigen Gene bestimmt.

Die bioinformatische Datenanalyse erfolgte mit einem eigens in der Arbeitsgruppe für

Genexpressionsanalysen auf DNA-Chips entwickelten Programm. Neben der Normali-

sierung der Daten wurde mit dem Programm die Durchführung einer Korrespondenza-

nalyse ermöglicht. Mit dieser Methode wurden die Transkriptionsprofile der drei zu

vergleichenden Proben analysiert und in einem anschaulichen Diagramm visualisiert.

Es konnte gezeigt werden, dass bei Proben, die auf Minimalmedium gewachsen sind,

mehr Stoffwechselwege aktiviert sind als bei Wachstum auf einem nährstoffreichen

Vollmedium. Bei Wachstum auf Acetat-haltigem Medium sind ebenfalls mehr Stoff-

wechselwege induziert, wenn auch vergleichsweise schwächer als in Minimalmedium.

Da Acetat eine unzureichende Nährstoffquelle für N. crassa ist, ist die Stoffwechselak-

tivität insgesamt geringer.

Einleitung

4

1. Einleitung

1.1. Der Modellorganismus Neurospora crassa

1.1.1. Historischer Hintergrund

Der filamentöse Pilz Neurospora crassa wurde bekannt, als mit der „Ein-Gen-ein-

Enzym“-Hypothese (Beadle, 1945) die erste Verbindung zwischen Genen und ihrer

biochemischen Funktion hergestellt wurde. Entdeckt wurde er bereits ein Jahrhundert

früher, als im warmen und feuchten Sommer von 1842 Brot aus den Bäckereien von

Paris mit einem orangen Pilz bedeckt war. Seinen heutigen Namen bekam er 1927 von

Shear und Dodge (Shear & Dodge, 1927). Seit über 50 Jahren gilt er als Modellorga-

nismus, bedingt einerseits durch sein schnelles Wachstum, seine kurze Replikationszeit

und seine hohe Fruchtbarkeit, durch die er routinemässig und unkompliziert im Labor

kultiviert werden kann, aber auch durch andere Vorteile wie eine geringe Chromoso-

menzahl, cytologisch leicht zugängliche Produkte der Meiose oder seine fehlende Pa-

thogenität. Seither wurden zahlreiche genetische und biochemische Studien an Neu-

rospora durchgeführt, die in über 5000 Veröffentlichungen festgehalten wurden. So

wurden beispielsweise mit Neurospora die ersten biochemischen Mutanten isoliert

(Beadle & Tatum 1941) und grundlegende Erkenntnisse über die Rekombination (Mit-

chell, 1955; Catcheside et al., 1964) erhalten. Bis heute wurden über 1000 Gen-Loci

charakterisiert und auf den sieben Chromosomen kartiert (Perkins et al., 2000). Im Fun-

gal Genetic Stock Center (http://www.fgsc.net/) in Kansas, USA, werden mehr als 8000

verschiedene Neurospora-Stämme und -Mutanten gelagert und verwaltet. Gerade in den

letzten Jahren diente Neurospora als einer der führenden Organismen zur Untersuchung

von Photobiologie (Lauter, 1996) und zirkadianem Rhythmus (Bell-Pedersen, 2000;

Dunlap, 1999).

1.1.2. Lebenszyklus

Der Lebenszyklus von Neurospora crassa (Davis, 2000) teilt sich in zwei Stadien auf,

die Haplophase und die Diplophase (siehe Abb.1.1).

Während der Haplophase bilden sich die fadenförmigen Mycelien aus, die vielkernig

Einleitung

5

sind. Das Mycel verzweigt sich in einzelne Hyphen, aus denen durch Abschnürung die

haploiden Macroconidien gebildet werden, die eine intensive orange Farbe haben.

Macroconidien haben einen bis mehrere, am häufigsten jedoch zwei Zellkerne. Die

Macroconidien können bei geeigneten Wachstumsbedingungen wiederum zu Mycelien

auskeimen. Durch einen hydrophoben Protein-Mantel werden die Macroconidien vor

Feuchtigkeit geschützt, wodurch sie schon durch leichte Luftbewegungen weiträumig

verteilt werden können. Daraus kann eine sehr rasche Kolonisierung neuer Bereiche

durch N. crassa resultieren.

Abb. 1.1: Lebenszyklus von N. crassa (Davis, 2000)

Vereinzelt werden während der Haplophase auch einkernige Microconidien gebildet.

Diese enstehen im Gegensatz zu den Macroconidien nicht durch Abschnürung, sondern

werden direkt aus den Zellen der sogenannten Microconidiophoren ausgestossen.

Mitose,Bildung derAscosporen

Ascosporen-Mikrokolonie

keimendeAscospore Vegetative

Hyphen

Ascus mitAscosporen

Meiose II

Meiose I

Zellkern-Fusion

KonjugierteTeilung

AscogonialeHyphen

Diplophase

Haplophase,Bildung der Macroconidien

Conidium desentgegengesetztenPaarungstyps

AscogoniumAscogonium-Zellkern

befruchtender Kern

Einleitung

6

N. crassa als heterothallischer Organismus bildet Mycelien zweier verschiedener Paa-

rungstypen aus, Typ a und Typ A. Der Eintritt in die Diplophase erfolgt, wenn Conidien

des einen Paarungstyps auf Mycel des anderen Paarungstyps treffen. Bei dem als weib-

lichen Elternteil dienenden Mycel, das sowohl Typ a als auch Typ A sein kann, hat sich

zuvor ein mehrzelliges Protoperithecium ausgebildet. Dieses besteht aus einem Knoten

von Hyphen, die mehrere spezielle Zellen, die Ascogonien, umgeben. Eine der Ascogo-

nien dient als weibliche Keimzelle. Die umliegenden Hyphen bilden eine dichte Schutz-

schicht, durch die, ausgehend von der Keimzelle, eine oder mehrere filamentöse

Trichogynen ragt. Diese Trichogyne wächst Pheromon-gesteuert auf ein Conidium des

entgegengesetzten Paarungstyps zu, bis es zu Kontakt und Zellfusion kommt. Der Zell-

kern des Conidiums wandert nun durch die Trichgyne zum Ascogonium im Inneren des

Protoperitheciums. In dem sich nun vergrössernden Perithecium kommt es zunächst zu

mehreren synchronen mitotischen Teilungen, bevor es durch Verschmelzung von Zell-

kernen entgegengesetzten Paarungstyps zur Ausbildung mehrerer Zygoten kommt. Die

Zygoten befinden sich in sich allmählich ausformenden sackartigen Gebilden, den Asci.

Hier durchlaufen sie zwei meiotische Teilungen mit einer sich anschliessenden mitoti-

schen Teilung, so dass jeder Ascus acht Zellkerne, die Ascosporen, enthält. Die Ascos-

poren sind von einer harten, melanisierten Zellwand umgeben. In einem Perithecium

können 200-400 Asci enthalten sein. Die Perithecien sind zum Schutz ebenfalls mit ei-

ner melanisierten harten Wand umgeben. Unter geeigneten Bedingungen wie z.B. Hit-

zeschock brechen die Asci auf und entlassen die haploiden Ascosporen. Mit dem Kei-

men der Ascosporen zu Mycelien beginnt erneut die Haplophase des Lebenszyklus.

1.1.3. Das Genom von Neurospora crassa

Der Modellorganismus Neurospora crassa gehört zu den filamentösen Ascomyceten,

auch Schlauchpilze genannt.

Abb. 1.2: Phylogenetischer Stammbaum von N.crassa

Überreich: EukaryotenReich: Pilze

Stamm: AscomycetaUnterstamm: Pezizomycotina

Klasse: SordariamycetesOrdnung: Sordariales

Familie: SordariaceaeGattung: Neurospora

Art: crassa

Einleitung

7

Das Genom von N. crassa hat eine Länge von ca. 43 Mb. Der Chromosomensatz ist

haploid, es gibt sieben Chromosomen, von denen das kleinste 4,0 Mb und das grösste

10,3 Mb umfasst (Orbach et al., 1988). Die DNA hat einen GC-Gehalt von durch-

schnittlich 54%, in codierenden Bereichen kann der GC-Gehalt bis zu 64% betragen.

Das Genom beinhaltet etwa 8% repetitive Sequenzen, die meisten davon codieren für

ribosomale RNA oder tRNA (Radford & Parish, 1997). Die Gesamtzahl der Gene von

Neurospora crassa wurde auf 10-12.000 geschätzt (Nelson et al., 1997; Kelkar et al.,

2001). Das Genom von N. crassa ist im Vergleich zum Genom von Saccharomyces

cerevisiae (Goffeau et al., 1997), ebenfalls ein Ascomycet und erster vollständig se-

quenzierter eukaryotischer Organismus, dreimal so gross und besitzt schätzungsweise

1,5 bis 2,2 mal so viele Gene (Braun et al., 2000).

1.1.4. Neurospora crassa Genom-Projekt

Im Jahr 1997 wurde eine internationale Genom-Initiative ins Leben gerufen (Bennett,

1997), deren erstes grosses Ziel die Sequenzierung des Modellorganismus N. crassa ist.

Durch die Entschlüsselung der Sequenz von N. crassa soll die Grundlage geschaffen

werden, um mehr Erkenntnisse über die Biologie von Pilzen zu gewinnen. Denn obwohl

N. crassa selbst keine industrielle und wirtschaftliche Bedeutung hat, ist er phylogene-

tisch sehr nah verwandt mit einigen Pflanzenpathogenen wie Cochliobolus, dem Erreger

von Braunfleckenkrankheit bei Mais, dem weitverbreiteten, u.a. Wurzel- und Stengel-

fäulnis verursachenden Fusarium oder dem Reisbranderreger Magnaporthe grisea.

Durch eine detailierte Sequenzanalyse von N. crassa erhofft man sich, Rückschlüsse auf

diese weniger gut untersuchten Pflanzenpathogene ziehen zu können. Weiterhin soll mit

der Sequenzierung der Grundstein gelegt werden für eine intensive Untersuchung von

Transkriptom und Proteom von N crassa. Dem Genom-Projekt kommt zugute, dass

N. crassa ein bislang schon sehr detailiert untersuchter Organismus ist. Die Grösse des

Genoms sowie die Anzahl und Grösse der einzelnen Chromosomen sind bekannt, eben-

so wie die Loci von mehr als 1000 Genen (Perkins et al., 2000).

Das deutsche Neurospora crassa Genom-Projekt, gefördert von der Deutschen For-

schungsgemeinschaft (DFG), wurde 1998 initiiert. Sein Ziel war es, Chromosom II mit

einer Grösse von 4,6 Mb und Chromosom V mit einer Grösse von 9,2 Mb zu sequenzie-

ren. Dazu wurden zunächst, wie in dieser Arbeit beschrieben, geordnete physikalische

Klon-Karten der beiden Chromosomen erstellt. Aus diesen Karten wurden zum Sequen-

Einleitung

8

zieren Klone ausgewählt, die eine möglichst minimale Überlappung aufweisen, wo-

durch die Redundanz der erzeugten Sequenzdaten deutlich reduziert werden konnte.

Dieses Vorgehen wurde bereits in früheren Sequenzierungs-Projekten erfolgreich an-

gewandt (Schizosaccharomyces pombe : Hoheisel et al., 1993, Saccharomyces cerevi-

siae, Chromosom XII : Scholler et al., 1995).

Die Sequenzierung wurde bei MWG Biotech AG (Ebersberg) durchgeführt, bei MIPS

(Martinsried Institute for Protein Sequences, München) wurden die Sequenzdaten zu-

sammengeführt, annotiert und in einer Datenbank veröffentlicht (Mewes et al., 2000;

MNCDB : "MIPS Neurospora crassa database", http://www.mips.biochem.mpg.de/proj

/neurospora/ ). Zum gegenwärtigen Zeitpunkt liegen von Chromosom II 3,5 Mb anno-

tierte Sequenzdaten vor, was ca. 76% von Chromosom II entspricht. Es bestehen noch

12 Lücken, ca. 1 Mb des Chromosoms konnte noch nicht erfasst werden. Von Chromo-

som V wurden bisher 4,2 Mb sequenziert und annotiert, was ca. 46% des Chromosoms

entspricht. Hier gibt es noch 14 Lücken, es fehlen an Sequenz noch 5 Mb, von denen

ca. 2 Mb ein hoch-repetetives rRNA-Gencluster beinhalten, das nicht sequenziert wer-

den soll.

Die restlichen Chromosomen sollten in einer Kollaboration mit dem amerikanischen

"Neurospora Genome Project" sequenziert werden. Inzwischen wurde jedoch das ge-

samte Genom im sogenannten "Whole Genome Shotgun"-Verfahren, also ohne vorheri-

ges Kartieren der einzelnen Chromosomen, vom Whitehead Institute Center for Genome

Research (WICGR, Massachusetts, USA) sequenziert. Innerhalb eines halben Jahres

wurden hier knapp über 38 Mb sequenziert und ebenfalls in einer Datenbank öffentlich

zugänglich gemacht (WICGR Neurospora Database, http://www-

genome.wi.mit.edu/annotation/fungi/neurospora/). Der Abschluss der Sequenzierung

und die vollständige Annotation des gesamten Genoms sollen bis Januar 2002 durchge-

führt werden.

1.2. Physikalische Kartierung

Am Anfang fast aller Genomprojekte steht die Sequenzierung des zu untersuchenden

Genoms. Da auch moderne Sequenziergeräte nur DNA-Stücke bis zu 1 kb Länge am

Stück sequenzieren können, muss die genomische DNA zunächst fragmentiert werden.

Die Fragmente werden je nach Grösse in entsprechende Vektoren kloniert und anschlie-

Einleitung

9

ssend sequenziert. Die Erstellung einer physikalischen Karte hilft dabei, die Redundanz

der erzeugten Sequenzdaten zu verringern, da sie eine geordnete, lineare Anordnung der

Fragmente darstellt, aus denen dann zum Sequenzieren diejenigen ausgesucht werden

können, die eine minimale Überlappung aufweisen. Dem gegenüber steht der soge-

nannte "shotgun"-Sequenzierungsansatz, bei dem zufällig ausgewählte Fragmente se-

quenziert werden, die erst nachträglich mit erheblichem Rechenaufwand zur vollständi-

gen Sequenz angeordnet werden. Durch die rein zufällige Auswahl der zu sequenzie-

renden Fragmente wird ein hoher Überschuss an redundanten Daten erzeugt.

Für das Erstellen von physikalischen Karten gibt es im Wesentlichen zwei verschiedene

Methoden:

Bei der älteren Restriktionskartierung werden überlappende Fragmente nach Restrikti-

onshydrolyse und Analyse durch Gelelektrophorese aufgrund der entstandenen Ban-

denmuster identifiziert und geordnet (Coulson et al. 1986). Bei der physikalischen Kar-

tierung durch Hybridisierung, die im Rahmen dieser Arbeit angewendet wurde, werden

überlappende Klone aufgrund ihrer Hybridisierungsmuster angeordnet und zu "contigs"

(von engl. contigous = benachbart; zusammenhängende Bereiche überlappender Frag-

mente) zusammengefasst (Hoheisel et al., 1993; Scholler et al., 1995). Dazu werden die

zu ordnenden Fragmente in einem definierten Raster auf eine Membran aufgebracht.

Als Hybridisierungssonden können die Fragmente selbst, aber auch Oligonukleotide

(Craig et. al., 1990), genetische Marker oder Klone aus anderen Bibliotheken (Hoheisel

& Lehrach, 1993, Aign et al., 2001) dienen. Die Auswahl der Sonden erfolgt zunächst

nach dem als "sampling without replacement" bezeichneten Verfahren (Press et al.,

1988), bei dem nur solche Klone als Sonden ausgewählt werden, die in den vorange-

gangenen Hybridisierungen noch kein positives Hybridisierungssignal erzeugt haben.

Später werden zum Schliessen der Lücken diejenigen Klone als Sonde ausgewählt, die

an contig-Enden liegen, um bestehende contigs zu verlängern oder gar mit anderen con-

tigs verbinden zu können.

Einleitung

10

1.3. DNA-Chip-Technologie

Die DNA-Chips werden je nach Trägermaterial, Art der Nukleinsäuremoleküle und

Mechanismus der Immobilisierung unterschieden in "macroarrays", "microarrays" und

"oligo-arrays" (Granjeaud et al., 1999; DeRisi & Iyer, 1999). Die Terminologie für die

DNA-Chip-Technologie wurde dahingehend definiert, dass die auf dem Chip immobili-

sierte DNA als Sonde bezeichnet wird, auf die die Probe in Form von markierter DNA

oder RNA hybridisiert wird ("The Chipping Forecast", 1999).

In Anlehnung an die von Southern (1975) entwickelten Hybridisierungstechniken be-

stehen macroarrays aus flexiblen Membranen wie Nitrocellulose, Nylon oder Polypro-

pylen, auf die durch mechanische Dispensierung die Sonden in Form von PCR-

Produkten, Plasmid-Klonen oder langen Oligonukleotiden (50-70 bp) (Kane et al.,

2000) aufgebracht werden. Zu den macroarrays gehören deshalb auch die für die physi-

kalische Kartierung durch Hybridisierung verwendeten Klonfilter. Die Bindung der

DNA erfolgt elektrostatisch über die positiv geladene Oberfläche der Membranen.

Durch das poröse Trägermaterial und die dadurch erforderliche grössere Menge an Son-

denmaterial können Raster mit einer Dichte von nicht mehr als 100 Sonden pro cm2

erstellt werden, bei einer Membrangrösse von 22x22 cm entspricht dies ca. 36.000 Son-

denpunkten. Die Hybridisierung muss durch die Grösse und die Porösität der Membra-

nen in relativ grossen Volumina von bis zu 20 ml stattfinden, wodurch die zu hybridi-

sierende Probe stark verdünnt wird. Die Proben sind meist radioaktiv markiert, in selte-

nen Fällen auch chemilumineszent.

Für die Herstellung von microarrays werden feste Trägermaterialien, meist Glas, ver-

wendet. Auch hier werden meist PCR-Produkte, seltener auch Plasmid-Klone oder lan-

ge Oligonukleotide mit Hilfe von Robotern mechanisch in einem definierten, hoch-

dichten Raster aufgebracht. Die Glasoberfläche ist derart modifiziert, dass die Nuklein-

säuremoleküle entweder kovalent gebunden werden oder nicht-kovalent durch La-

dungswechselwirkungen an der Oberfläche haften. Für diese nicht-poröse Trägermatrix

sind im Gegensatz zu den porösen Membranen der macroarrays geringere Mengen an

Sondenmaterial erforderlich. Dadurch und durch die Verwendung von Fluoreszenz-

markierten Hybridisierungsproben, die mit hochauflösenden CCD-Kameras oder konfo-

calen Lasermikroskopen detektiert werden können, wurde eine Miniaturisierung der

microarrays gegenüber den macroarrays erreicht. Die Raster der microarrays können

eine Dichte von bis zu 2000 Sondenpunkten pro cm2 erreichen. Die Grösse der verwen-

Einleitung

11

deten Glas-Chips beträgt üblicherweise 25x75 mm. Die Hybridisierung kann daher in

sehr kleinen Volumina von 10-40 µl durchgeführt werden, meist unter einem Deckglas,

wodurch eine hohe Probenkonzentration und somit eine verstärkte Sensitivität erreicht

wird.

Die sogenannten oligoarrays sind eine Untergruppe der microarrays und unterscheiden

sich von diesen dadurch, dass die Sonden in Form von kurzen Oligonukleotiden in situ

auf der Chip-Oberfläche, die meistens aus Glas besteht, synthetisiert werden. Die Syn-

these erfolgt photolithographisch oder nasschemisch, wobei die Oligonukleotide

schrittweise um jeweils ein Nukleotid verlängert werden (Fodor et al., 1991; Maskos

und Southern, 1992; Lipshutz et al., 1999). Die höchsten Rasterdichten werden zur Zeit

durch photolithographische Verfahren erreicht. So werden beispielsweise bei Affyme-

trix Raster mit einer Dichte von bis zu 400.000 Oligonukleotiden auf einer Fläche von

1,6 cm2 synthetisiert (Schena et al., 1998; http://www.affymetrix.com). Da jeder Syn-

theseschritt eine Ausbeute von nur ca. 95% hat, werden vorzugsweise Oligonukleotide

synthetisiert, die maximal eine Basenlänge von 20-30 bp haben, da bei längeren Oligo-

nukleotiden die Rate unvollständiger Sequenzen zu stark ansteigen würde. Da bei die-

sen kurzen Oligonukleotiden die Spezifität für ein Gen nicht immer gewährleiset ist,

werden meist mehrere verschiedene Oligonukleotide für ein Gen ausgewählt, die das

Gen über seine Länge hinweg abdecken. Ausserdem wird zur besseren Differenzierung

von unspezifischen Kreuzhybridisierungen zu jedem der Sequenz exakt entsprechenden

Oligonukleotid („perfect match“) ein zweites Oligonukleotid synthetisiert, das in der

Mittelposition ein sequenzfremdes Nukleotid enthält („mismatch“). Die oligoarrays

werden ausser für Genexpressionsanalysen vorallem auch für die Detektion von SNPs

(single nucleotide polymorphism) eingesetzt.

Einleitung

12

1.4. Genexpressionsanalysen

Die Untersuchung von Genexpression mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie basiert auf

der Hybridisierung von mRNA auf ein hochdichtes Raster von immobilisierten Nu-

kleinsäuremolekülen, die mit den Sequenzen der zu untersuchenden Gene korrelieren.

Im Gegensatz zu älteren Techniken wie dem "Northern Blot", bei dem nur einzelne Ge-

ne analysiert werden können, ist es mit der DNA-Chip-Technologie möglich, die

Genexpression von mehreren tausend Genen gleichzeitig zu untersuchen (Brown &

Botstein, 1999; Lockhart & Winzeler, 2000).

Die für Genexpressionsanalysen verwendeten DNA-Chips basieren häufig auf cDNA-

Bibliotheken. Mittels PCR werden die klonierten cDNA-Fragmente amplifiziert, die

PCR-Produkte werden anschliessend auf Chips aufgebracht. Alternativ werden auch

oligoarrays mit bis zu 25 bp langen Oligonukleotiden verwendet, seltener sind micro-

arrays im Einsatz, auf die synthetisierte Oligonukleotide mit einer Länge von 50-70 bp

aufgebracht wurden. Ein Vorteil in der Verwendung von cDNA-Bibliotheken für

Genexpressionsanalysen liegt darin, dass weder die Sequenz des zu untersuchenden

Genoms, noch nähere Informationen über einzelne Gene bekannt sein müssen. Dadurch

ist es aber nicht möglich, zwischen eventuell vorhandenen Spleiss-Varianten einzelner

Gene zu differenzieren. Ist die Sequenz des Genoms bekannt, können gezielt Primer-

Paare für eine Amplifikation oder lange Oligonukleotide ausgewählt werden, mit denen

ganz spezielle Fragestellungen beantwortet werden können. Auch bei der Verwendung

oligoarrays muss die Sequenz des zu analysierenden Genoms bekannt sein.

Für die Hybridisierung wird die RNA als komplexe Probe markiert, sie enthält also jede

in dem zu untersuchenden biologischen Material vorhandene mRNA-Spezies entspre-

chend ihrer Transkriptmenge. Je höher die Expression eines Gens ist, desto grösser ist

sein Anteil in der markierten RNA und desto stärker ist das zugehörige Hybridisie-

rungssignal (Freeman et al., 2000; Schena et al., 1995). Werden für die Markierung

zweier Proben unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die aufgrund ihrer

Exzitations- und Emissionsspektren unabhängig voneinander detektiert werden können,

ist die kompetitive Hybridisierung dieser beiden Proben möglich. Dazu werden die zu

vergleichenden Zellzustände, respektive deren mRNA-Populationen, mit unterschiedli-

chen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und parallel auf einen Chip hybridisiert. Diese

zwei Zellzustände können somit in einer einzelnen Hybridisierung direkt quantitativ

miteinander verglichen werden.

Einleitung

13

Abb. 1.3: Genexpressionsanalysen mittels DNA-Chip-Technologie (Duggan et al., 1999). A) Zwei zuvergleichende RNA-Proben werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen mar-kiert und gemeinsam auf einen Chip cohybridisert. B) Nach sukzessiver Anregung undDetektion der beiden Farbstoffe werden die erhaltenen Bilder als Falschfarbendarstel-lung übereinandergelegt.

Bei radioaktiver Markierung der Proben können die Hybridisierungen der verschiede-

nen Proben nur einzeln erfolgen, die Signalintensitäten müssen dann von Chip zu Chip

verglichen werden.

In beiden Fällen schliesst sich an die Detektion und Quantifizierung der durch die Hy-

bridisierung erhaltenen Signalintensitäten eine ausführliche bioinformatische Datena-

nalyse an (Schuchhardt et al., 2000; Schadt et al., 2000; Tseng et al., 2001). Dabei wer-

den die Daten zunächst normalisiert, um Hybridisierungen direkt miteinander ver-

gleichbar zu machen. Unterschiede zwischen einzelnen Hybridisierungen, die eine

Normalisierung erforderlich machen, können hervorgerufen werden durch ungleiche

Ausgangsmengen von RNA oder cDNA, abweichende Effizienz der Markierungsreakti-

on, Unterschiede in der Hybridisierungseffizienz oder dem abweichenden Verhalten der

beiden Fluoreszenzfarbstoffe bei Markierung und Detektion. Da die Experimente zur

statistischen Validierung der Ergebnisse meist mehrmals wiederholt werden (Lee et al.,

2000), muss auch bei kompetitiven Hybridisierungen nicht nur eine Normalisierung

innerhalb des Chips erfolgen, sondern auch zwischen verschiedenen Chips.

Wird in einem Experiment nur ein Zellzustand mit einem Kontrollzustand verglichen,

können die Ergebnisse der Datenanalyse in einem zweidimensionalen Koordinatensy-

ExzitationLaser 2Laser 1

Emission

Datenanalyse

Darstellung inFalschfarben

Kombination derFalschfarbenbilder

cDNA-Bibliothek Referenz

PCR-Amplifikation

Hybridisierungder Probe aufden Chip

RNA

Spotten auf Glas

ReverseTranskription

Markierungmit

Fluoreszenz

Test

A) B)

Einleitung

14

stem dargestellt werden (Beißbarth et al., 2000). Die normalisierten Signalintensitäten

des einen Zellzustands werden gegen die normalisierten Signalintensitäten des Kon-

trollzustands aufgetragen (Abb. 1.4). Der Faktor für Induktion bzw. Repression eines

Gens ergibt sich, indem die Signalintensitäten beider Bedingungen für dieses Gen ins

Verhältnis gesetzt werden (DeRisi et al., 1996; Chen et al.,1997). Gene, die unter bei-

den Bedingungen gleich stark exprimiert werden, liegen in dem Koordinatensystem

entlang der Winkelhalbierenden mit der Steigung eins. Gene, die in dem zu untersu-

chenden Zellzustand stärker exprimiert werden als unter der Kontrollbedingung, liegen

oberhalb, Gene, die schwächer exprimiert werden, liegen unterhalb dieser Diagonale.

Abb. 1.4: Darstellung der Genexpression zweier zu vergleichender RNA-Proben im Diagramm

In dieser Arbeit wurde zur Normalisierung und Datenanalyse die Software M-Chips

(Fellenberg et al., eingereicht) verwendet, die eigens für diesen Zweck entwickelt wur-

de. Ein Bestandteil dieser Software ist die Korrespondenzanalyse (Greenacre, 1984).

Mit diesem Algorithmus, der seinen Ursprung in der Soziologie hat und nun speziell auf

die Datenanalyse von Genexpressionsstudien mittels DNA-Chiptechnologie angepasst

wurde, werden die Gene als Vektoren in einem multidimensionalen Raum dargestellt.

Die Anzahl der Dimensionen entspricht der Anzahl der untersuchten Bedingungen.

Ebenso wird jede Bedingung in einem multidimensionalen Raum dargestellt. Hier ergibt

sich die Anzahl der Dimensionen aus der Anzahl der untersuchten Gene. Beide Räume

werden anschliessend mit minimalem Informationsverlust kombiniert auf eine einzelne

Signalintensitäten

Kontrolle

Gene, die im untersuchten Zellzustand

gleich stark exprimiert werden wie im

Kontrollzustand


stärker exprimiert werden als im Kontroll-

zustand


schwächer exprimiert werden als im

Kontrollzustand

Signalintensitäten

Zellzustand 1

Einleitung

15

zweidimensionale Ebene projeziert. Induktion bzw. Repression der Gene kann nun di-

rekt aus ihrer Lage in der Ebene abgelesen werden. Gene, die im Diagramm dicht bei-

einander liegen, verhalten sich unter den untersuchten Bedingungen gleich oder sehr

ähnlich (Fellenberg et al., 2001).

Material und Methoden

16

2. Material und Methoden

2.1. Material

2.1.1. Chemikalien und Biochemikalien

Allgemeine Laborchemikalien Merck, Darmstadt

(Reinheitsgrad: pro analysii

oder höchst möglich) Sigma, Deisenhofen

Serva, Heidelberg

Fluka, Neu-Ulm

Roth, Karlsruhe

[α-32P]-dCTP Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg

Adenosin-5´-triphosphat Roche Diagnostics, Mannheim

Agarose Life Technologies, Karlsruhe

Aminoallyl-dUTP Sigma, Deisenhofen

Ampicillin Serva, Heidelberg

Bacto Agar Difco, Detroit, MI, USA

Bacto Tryptone Difco, Detroit, MI, USA

Bacto Yeast Extract Difco, Detroit, MI, USA

Bernsteinsäureanhydrid Fluka, Neu-Ulm

Betain Sigma, Deisenhofen

Blockierungsreagenz Roche Diagnostics, Mannheim

CSPD Roche Diagnostics, Mannheim

Cy3-monoreaktiver Ester Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg

Cy5-monoreaktiver Ester Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg

DEPC Roth, Karlsruhe

Desoxy-Ribonukleotid-5´-Triphosphate Larova Biochemie GmbH, Teltow

Dextransulfat Sigma, Deisenhofen

Dichlorethan Fluka, Neu-Ulm

DIG-11-dUTP Roche Diagnostics, Mannheim


17

Dimethylsulfoxid Fluka, Neu-Ulm

Dithiothreitol Life Technologies, Karlsruhe

Heringsperma-DNA Roche Diagnostics, Mannheim

Hexamer-Nukleotid-Gemisch Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg

Kanamycin Serva, Heidelberg

Kresolrot Sigma, Deisenhofen

Natriumdodecylsulfat Merck, Darmstadt

N-Methylimidazol Fluka, Neu-Ulm

Oligo(dT)12-18 Life Technologies, Karlsruhe

Poly-L-Lysin Sigma, Deisenhofen

Rinderserumalbumin Serva, Heidelberg

RotiPhenol, pH 8.0 Roth, Karlsruhe

tRNA Roche Diagnostics, Mannheim

2.1.2. Enzyme

Taq Polymerase wurde aus dem überproduzierenden Stamm DH5α/pTP4 (L. Schalk-

wyk, ICRF, London, UK) isoliert (Pluthero, 1993).

DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment MBI Fermentas, St. Leon-Roth

EcoRI MBI Fermentas, St. Leon-Roth

MboI New England Biolabs, Schwalbach

Proteinase K Roche Diagnostics, Mannheim

Pronase E Serva, Heidelberg

Ribonuklease A Sigma, Deisenhofen

SuperScriptII Life Technologies, Karlsruhe

T4-DNA-Ligase Life Technologies, Karlsruhe

Taq DNA-Polymerase Qiagen, Hilden


18

2.1.3. DNA-Längenstandards

Für die Gelelektrophorese wurden folgende Längenstandards verwendet:

SmartLadder (Eurogentec, Brüssel), Banden bei:

200 bp; 400 bp; 600 bp; 800 bp; 1000 bp; 1500 bp; 2000 bp; 2500 bp; 3000 bp;

4000 bp; 5000 bp; 6000 bp; 8000 bp; 10.000 bp.

GeneRuler™ (MBI Fermentas, St. Leon-Roth), Banden bei:

100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 600 bp; 700 bp; 800 bp; 900 bp; 1031 bp;

1200 bp; 1500 bp; 2000 bp; 3000 bp.

2.1.4. Primer für PCR

Alle PCR-Primer wurden von ThermoHybaid, Ulm bezogen. Sie hatten alle die Quali-

tätsstufe "gereinigt durch RP-HPLC".

Die Primer-Sequenzen wurden mit dem Programm "primer3" (http://www-

genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi, Whitehead Institute, USA) ermittelt.

PCR-Primerpaare DNA-Sequenz

T7 5`- TAATACGACTCACTATAGGG –3`T3 5`- AATTAACCCTCACTAAAGGG –3`

rabbit-α-globin-forward 5`- CTCTGAGCAGATCAAAGCCC –3`rabbit-α-globin-reverse 5`- ATATTTGGAGGTCAGCACGG –3`

rabbit-β-globin-forward 5`- GTGAGGAGAAGTCTGCGGTC –3`rabbit-b-globin-reverse 5`- GAAGTCAGATGCTCAAGGGG – 3`

2.1.5. Häufig verwendete Puffer, Medien und Lösungen

DEPC-H2O 1 ml DEPCad 1 l H2O,ÜN bei 37°C inkubieren, autoklavieren

DNA-Auftragspuffer 0,25 % Bromphenolblau0,25 % Xylencyanol

30 % Glycerinin H2O

Medien


19

2YT-Medium 1,6 % (w/w) Bacto Tryptone1 % (w/w) Bacto Yeast Extract

0.5 % (w/w) NaCl96.9 % (w/w) H2O

autoklavieren

2YT-Agar 1.5 % (w/w) Bacto Agar1,6 % (w/w) Bacto Tryptone

1 % (w/w) Bacto Yeast Extract0.5 % (w/w) NaCl

96.9 % (w/w) H2Oautoklavieren

10x H.M.F.M.: 3 mM MgSO4 x 7 H2O15 mM Tri-Natriumcitrat x 2 H2O70 mM (NH4)2SO4

55 % (w/v) Glyzerinad 800 ml H2O, autoklavieren

270 mM KH2PO4

130 mM K2HPO4

ad 200 ml H2O, autoklavieren,nach getrenntem Autoklavieren beide Lösungen vereinigen

2YT-F: 2YT10 % 10x H.M.F.M

50x Vogels Medium 150 g Na3-citrat x 5 H2O250 g KH2PO4

100 g NH4NO3

10 g MgSO4 x 7 H2O5 g CaCl2 x 2 H2O

ad 1 l H2O+ 2-3 ml Chloroform

1x Vogels Medium 20 ml 50x Vogels Medium1 ml 10 mg/ml Biotin (in 50% EtOH)1 ml Spurenelemente-Lsg.

autoklavieren

Spurenelemente-Lsg. 5g Citronensäure x 1 H2O5g ZnSO4

1g Fe(NH4)2(SO4)2 x 6 H2O0,25 g CuSO4 x 5 H2O0,05 g MnSo4 x 1 H2O0,05 g H3BO3

0,05 g Na2MoO4 x 4 H2Oad 100 ml H2O+ 1 ml Chloroform

Alkalische Lyse


20

Lösung I: 50 mM Glucose25 mM Tris-HCl, pH 8.010 mM EDTA

Lösung II: 0.2 M NaOH1 % SDS

Lösung III: 5 M KOAc2 M HOAc

Hybridisierung auf Klonfilter

Church-Puffer: 0.5 M Na-phosphat, pH 7.27 % (w/w) SDS

1 mM EDTA

Waschpuffer: 40 mM Na2HPO4, pH 7.20.1 % (w/w) SDS

Hybridisierungspuffer: Church-Puffer0.1 mg/ml Fischsperma-DNA

Regenerations-Puffer: 5 mM Na-phosphat0.1 % (w/w) SDS

Radioaktive Markierung von DNA

LS-Mix: 5 �

l Oligo-Puffer OL175

�l TM-Puffer

175 �

l Hepes, pH 6.6

Oligo-Puffer OL: 45 U/ml Primer dN61 mM Tris-HCl, pH 8.01 mM EDTA, pH 8.0

TM-Puffer: 250 mM Tris-HCl, pH 8.025 mM MgCl250 mM β-Mercaptoethanol

Prozessieren von Nylon-Filtern

Denaturierungspuffer: 0.5 M NaOH1.5 M NaCl

Neutralisierungspuffer: 1 M Tris-HCl, pH 7.61.5 M NaCl

Pronase-Puffer: 50 mM EDTA


21

100 mM NaCl1% (v/v) Sarcosyl NL-30

50 mM Tris-HCl, pH 8.50.25 mg/ml Pronase (frisch einwiegen!)

Digoxigenin-Detektion mit CSPD®

Maleinsäure-Puffer: 0.1 M Maleinsäure1.15 M NaCl

mit NaOH auf pH 7.5 einstellen,autoklavieren

CSPD®-Waschpuffer : Maleinsäurepuffer0.3% (v/v) Tween 20

10x Blocking: 10% (w/v) Blockierungsreagenzin Maleinsäurepuffer, autoklavieren

Detektionspuffer: 0.1 M Tris-HCl, pH 9.50.1 M NaCl

Antikörper-Verdünnung: Anti-DIG-AP-Konjugate 1:10000in Maleinsäurepuffer

CSPD®-Lösung: CSPD® 1:100in Detektionspuffer

PCR

10x PCR-Puffer 500 mM KCl100 mM Tris-HCl, pH 8,3

2.1.6. Verwendete Chemikaliensätze

Gigapack® III XL Packaging Extract Stratagene, La Jolla, CA, USA

QIAprep® Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden

QIAGEN® Plasmid Mini Kit Qiagen, Hilden

2.1.7. Materialien

Agarplatten, 12x8 cm Nunc, Wiesbaden

Agarplatten, 22x22cm Nunc, Wiesbaden

Autoradiographie-Film Hyperfilm™-MPAmersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg

Autoradiographie-Kassetten AGS, Heidelberg

Deckgläschen, 20x20 mm + 20x40 mm Merck Eurolab, Darmstadt


22

Eppendorfgefäße, 1.5 ml und 2.0 ml Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg

Falcon, 50 ml und 15 ml Becton Dickinson, Heidelberg

Glas-Chips Menzel, Braunschweig

Hybond™-N+-membranen, 22x22 cm Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg

Hybridisierungsflaschen Glasbläser, DKFZ Heidelberg

Hybridisierungskammern Telechem, Sunnyvale, USA

Kimwipes lite Präzisionstücher Roth, Karlsruhe

Lumi-Film Roche Diagnostics, Mannheim

Mikrotiterplatten, 384er Nunc, Wiesbaden

Mikrotiterplatten, 384er Nunc, Wiesbaden

MultiScreen-PCR Platten Millipore, Eschborn

PCR-Mikrotiterplatten, 384er MJ Research, Waltham MA, USA

Pizza-Boxen Genetix, Christchurch, UK

Plastikreplikatoren, 384er, NrX5050 Genetix, Christchurch, UK

Polyfiltronics, 384er Whatman Inc., Clifton, USA

Spotting-Pins SMP3 Telechem, Sunnyvale, USA

UV-Küvette (Uvette) Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg

Whatman 3MM-Papier Bender und Hobein, Bruchsal

2.1.8. Geräte

Heizblock Grant Instruments, Cambridge, UK

Photometer Ultrospec 2000 Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg

Roboter "BioGrid" BioRobotics, Cambridge, UK

Rotationsofen H. Saur Laborbedarf, Reutlingen

ScanArray 5000 GSI Lumonics, Unterschleissheim

Schüttler mit Wasserbad "Belly Dancer" CLF Laborgeräte, Emersacker

SDDC-2 MicroArrayer Eurogentec, Darmstadt

Sparc-V-Computer Sun Microsystems, Langen

Thermocycler PTC-200 MJ Research, Waltham MA, USA

UV-Crosslinker UVC 500 Hoefer, San Francisco, USA

Vakuum-Konzentrator H. Saur Laborbedarf, Reutlingen

Videosystem Geldoc 1000 Biorad, München

Zentrifuge "Biofuge pico" Heraeus Instruments, Hanau


23

Zentrifuge "Megafuge 1.0R" Heraeus Instruments, Hanau

Zentrifuge, Sorval RC 2-B Dupont Instruments, Bad Homburg

2.1.9. Bibliotheken

2.1.9.1. Genomische Cosmid-Bibliothek

Für die physikalische Kartierung wurde von Dr. J. Arnold (University of Georgia,

Athens, USA) und dem Fungal Genetics Stock Center (FGSC, Kansas, USA) eine ge-

nomische Cosmid-Bibliothek zur Verfügung gestellt, die sich aus zwei Sub-

Bibliotheken zusammensetzt. Die Sub-Bibliotheken unterschieden sich in ihrer Größe

und in den ihnen zugrunde liegenden Klonierungsvektoren.

Tabelle 2.1: Genomische Cosmid-Bibliotheken vom FGSC

Vektor Antibiotika-

Resistenz

Anzahl

Klone

Anzahl

96er PlattenHersteller

pLORIST6Xh Kanamycin 12000 125 H. Kelkar, 2001

pMOcosX Ampicillin 4800 50 M. Orbach, 1994

Die durchschnittliche Insertgrösse beträgt 34 kb (Kelkar et al., 2001), beide Bibliothe-

ken zusammen haben damit eine 13-fache Abdeckung des Genoms von N. crassa.

2.1.9.2. Genomische BAC-Bibliothek

Die genomische BAC-Bibliothek wurde von LION Bioscience (Heidelberg) zur Verfü-

gung gestellt.

Tabelle 2.2: Genomische BAC-Bibliothek

Vektor Antibiotika-

Resistenz

Anzahl

Klone

Anzahl

96er PlattenHersteller

pBeloBACKan Kanamycin 9216 24 LION Bioscience

Die durchschnittliche Insertgrösse, ermittelt aus 20 zufällig ausgewählten Klonen, be-

trägt 69 kb (persönl. Mitteilung, T. Schlüter). Damit ergibt sich für die Bibliothek eine

statistische Abdeckung von 15 Genomäquivalenten.


24

2.1.9.3. cDNA-Bibliothek

Vom "Neurospora Genome Project" (University of New Mexico, USA) wurde eine uni-

direktionale cDNA-Bibliothek zur Verfügung gestellt. Sie beinhaltet 4700 Klone und

wurde mit dem Uni-ZAP XR Vektorsystem (Stratagene, La Jolla, USA) hergestellt

(Nelson et al., 1997). Dabei wurde mRNA aus drei verschiedenen Entwicklungsstadien

verwendet, Conidien, Mycel und Perithecium. Für diese drei Sub-Bibliotheken ergaben

sich folgende durchschnittliche Insertgrössen (Nelson et al., 1997):

Tabelle 2.3: Insertgrössen cDNA-Bibliothek

Gewebe Insertgrö-

sseConidien 1,3 kb

Mycel 1,5 kb

Perithecium 1,7 kb

Die bisher ermittelten cDNA-Sequenzen wurden in der Genome Sequence DataBase

(GSDB) des National Center for Genome Resources (NCGR) und unter

http://biology.unm.edu/~ngp/home.html veröffentlicht.


25

2.2. Methoden Physikalische Kartierung

2.2.1. Anzucht und Replikation von genomischen Bibliotheken

Die genomische Cosmid-Bibliothek, die freundlicherweise von Dr. J. Arnold (Univer-

sity of Georgia, Athens, USA) und dem FGSC (Kansas, USA) zur Verfügung gestellt

wurde, lag zunächst in insgesamt 175 Mikrotiterplatten im 96er Format vor. Für eine

einfachere Handhabung wurde die Bibliothek mit Hilfe des Roboters "BioGrid" in 384er

Platten repliziert, so dass sich der Umfang der Bibliothek auf 44 Platten reduzierte. Die

Platten waren mit 2YT-F-Medium gefüllt, dem je nach Vektor (siehe 2.1.9.1.) 50 µg/ml

Ampicillin oder 50 µg/ml Kanamycin zugesetzt war. Nach Inkubation bei 37°C für 16 h

wurden durch Animpfen frischer Mikrotiterplatten mit 384er Plastikreplikatoren zwei

Kopien der Bibliothek erstellt, die ebenfalls über Nacht bei 37°C inkubiert wurden. Die

Bibliotheken wurden bei -80°C gelagert. Die Benennung der Klone erfolgte entspre-

chend ihrer Positionierung in den Koordinaten der 384er Mikrotiterplatten.

Die genomische BAC-Bibliothek, die von der Firma LION Bioscience (Heidelberg) zur

Verfügung gestellt wurde, lag in 24 Mikrotiterplatten im 384er Format vor. Mit Hilfe

des Roboters "BioGrid" wurde die Bibliothek sechsmal in mit 2YT-F-Medium und

30 µg/ml Kanamycin gefüllte 384er Mikrotiterplatten kopiert. Nach Inkubation für 16 h

bei 37°C wurden die Platten bei -80°C gelagert.

2.2.2. Herstellung genomische Cosmid-Bibliothek

Zusätzlich zu der Cosmid-Bibliothek vom FGSC (Kansas, USA) wurde eine weitere

Cosmid-Bibliothek hergestellt. Als Klonierungsvektor diente hierbei pLawrist4.

2.2.2.1. Präparation genomischer DNA aus Neurospora crassa

Als Material für die Präparation hoch-molekularer genomischer DNA aus Neurospora

crassa diente bei -80°C gefrorenes Mycel vom Wildtypstamm 74-OR23-1A, das

freundlicherweise von Dr. U. Schulte (Uni Düsseldorf) zur Verfügung gestellt wurde.

Zunächst wurde ein 500 ml Erlenmeyerkolben mit 20 ml TEN9 (100 mM EDTA,

50 mM Tris-HCl, pH 9.0, 200 mM NaCl) und 100 µg/ml RNase A bereit gestellt.

Etwa 2 g gefrorenes Mycel wurden in einem sterilen Mörser, der auf -80°C vorgekühlt


26

war, unter Zugabe von flüssigem Stickstoff pulverisiert und sofort unter vorsichtigem

Schwenken portionsweise mit einem vorgekühlten Löffel in den Erlenmeyerkolben

überführt. Die Lösung wurde in ein 50 ml Falcon-Reaktionsgefäß gefüllt, mehrmals

vorsichtig invertiert und 10 min bei 30 rpm auf dem Rollschüttler bewegt. Nach Zugabe

von 1 ml 20 %igem SDS folgten nach mehrmaligem Invertieren weitere 10 min auf dem

Rollschüttler bei 30 rpm. Anschließend wurde 1 ml 10 mg/ml Proteinase K zugegeben

und die Lösung über Nacht bei 37°C auf dem Rollschüttler bei 30 rpm inkubiert. Die

Lösung wurde 10 min bei 3000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit

20 ml Phenol, pH 8.0, versetzt, zwei Stunden bei 30 rpm geschüttelt und anschliessend

10 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Mit der wässrigen Phase wurde die Phenol-

Extraktion wiederholt und anschliessend 20 min bei 9000 rpm und 25°C zentrifugiert.

Der Überstand wurde zur Fällung mit dem 0.8-fachen Volumen Isopropanol und dem

0.1-fachen Volumen 3 M NaOAc versetzt. Nach 20 min Zentrifugation bei 9000 rpm

und 4°C wurde das DNA-Sediment in 400 µl H2O gelöst. Zur Kontrolle wurde ein Ali-

quot der DNA auf einem Agarosegel überprüft, die Bestimmung der Konzentration er-

folgte photometrisch oder fluorimetrisch.

2.2.2.2. Partialrestriktion genomischer DNA und Dephosphorylierung

35 µg genomische DNA von N. crassa wurden in einem Endvolumen von 200 µl

1x NEB-4-Puffer mit 5 U MboI bei 37°C hydrolysiert. Nach 1 min, 2 min, 3 min, 4 min,

5 min, 8 min, 30 min und 60 min wurden Aliquots von je 25 µl entnommen; die Re-

striktionshydrolyse wurde in den Aliquots durch Zugabe von je 25 µl 0.5 M EDTA und

anschliessender Inkubation bei 68°C für 10 min gestoppt.

Nach einer Phenol- und einer Chloroform/Isoamylalkohol (24:1)-Extraktion mit jeweils

gleichen Volumina wurde die DNA durch Zugabe vom 0.1-fachen Volumen 5 M NaCl

und dem 2.5-fachen Volumen Ethanol gefällt. Nach einer Zentrifugation bei 15000 rpm

und 4°C für 20 min wurde das DNA-Sediment in 44 µl H2O gelöst.

Die DNA-Lösung wurde mit 5 µl 10x NEB-4-Puffer und 1 µl alkalischer Phosphatase

versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch 10 minütiges Inkubieren

bei 70°C gestoppt. Zur vollständigen Inaktivierung der alkalischen Phosphatase wurden

zum Reaktionsansatz 2 µl 0.5 M EDTA, 2 µl 20% SDS und 2 µl 10 mg/ml Proteinase K

gegeben und 30 min bei 56°C inkubiert. Nach Phenol- und Chloroform/Isoamylalkohol

(24:1)-Extraktion mit anschliessender Ethanol-Fällung und Zentrifugation (siehe oben)


27

wurde die DNA in 16 µl H2O aufgenommen. Ein Aliquot der Partialrestriktionsansätze

wurde auf einem Agarosegel überprüft.

2.2.2.3. Ligation der N. crassa-DNA in den Vektor pLawrist-4

5 µl aus den Partialrestriktionsansätzen wurden in einem Endvolumen von 15 µl 1x T4-

DNA-Ligasepuffer mit 2 µg pLawrist-4 Vektorarmen, 4 mM ATP und 1 µl T4-DNA-

Ligase (1U/µl ) über Nacht bei 16°C ligiert. Die Lagerung der Ligationsprodukte er-

folgte bei 4°C für maximal 4 Wochen.

2.2.2.4. Transfektion

Die Transfektion der Ligationsprodukte in E. coli DH5α erfolgte mit dem Gigapack®

III XL Packaging Extract nach Anweisungen des Herstellers. Je 600 µl des Transfekti-

onsansatzes wurden auf 2YT/Kanamycin (30 µg/ml)- Agarplatten (22x22 cm) ausge-

strichen und für 12-16 h bei 37 °C inkubiert.

2.2.2.5. Überführung von Klonen in Mikrotiterplatten

Mit Hilfe von sterilen Zahnstochern wurden einzelne Kolonien in 384er Mikrotiterplat-

ten überführt, die zuvor mit 2YT-F-Medium und 30 µg/ml Kanamycin befüllt worden

waren. Die Platten wurden bis zu 24 h bei 37°C inkubiert. Durch Animpfen frischer

Mikrotiterplatten mit 384er Plastikreplikatoren wurden zwei Kopien der Bibliothek er-

stellt. Die Lagerung der Bibliothek erfolgte bei -80°C.


28

2.2.3. Herstellung von DNA-Filtern

Zunächst wurden Hybond N+-Membranen luftblasenfrei auf mit 300 ml

2YT/Antibiotikum-Agar gefüllte Nunc-Schalen (22x22 cm) gelegt. Der Transfer der

Klone auf die Filter erfolgte mit Hilfe des Roboters "BioGrid", der das Erstellen eines

hochdichten Rasters mit bis zu 70 Klonen pro cm2 ermöglichte. Ein 384er Metallnadel-

replikator brachte jeden Klon doppelt in einer definierten Anordnung auf die Filter auf.

Je nach Anzahl der Klone können verschiedene Raster gewählt werden, in der vorlie-

genden Arbeit wurde meist das 4x4-Raster, aber auch das 2x2-Raster verwendet. Dabei

wird der Filter in 6 Felder unterteilt, jedes 7x11 cm gross, entsprechend der Grösse ei-

ner Mikrotiterplatte und somit des Metallnadelreplikators.

Abb. 2.1: Raster, in dem die Klone auf die Filter aufgebracht werden. A): Einteilung des Filters in6 Felder, B) Ansicht eines Feldes mit der Koordinatenbenennung mit Anordnung derdoppelt aufgebrachten Klone im C) 4x4-Raster oder D) 2x2-Raster

1 2

Feld 1

Feld 3

Feld 2

Feld 4

Feld 5 Feld 6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 21 22 23 2417

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

M

N

O

P

1 2 3 4

5 6 7 8

A)

C) D)

B)


29

Wird in Abhängigkeit der zu transferierenden Klon-Bibliothek nicht die gesamte Filter-

grösse beansprucht, können bis zu sechs Kopien einer Bibliothek auf die sechs Felder

eines Filters transferiert werden, die nach der anschliessenden Prozessierung mit einem

Skalpell in einzelne Filter zerschnitten werden.

Anschliessend wurden die Agar-Platten mit den Membranen über Nacht bei 37°C inku-

biert. Die Inkubationszeit wurde dabei so gewählt, dass die Kolonien zwar möglichst

gross wurden, benachbarte Kolonien aber noch deutlich voneinander getrennt waren.

Die DNA wurde in situ auf dem Filter gebunden (Hoheisel et al., 1991). Dazu wurden

die Filter zunächst zweimal für je 4 min auf mit Denaturierungspuffer getränktem

Whatman 3MM-Papier bei Raumtemperatur inkubiert, anschliessend wurden die Filter

für mindestens 5 min auf ein mit Neutralisierungspuffer getränktes Whatman 3MM-

Papier gelegt. Die neutralisierten Filter wurden in 400 ml Pronase-Puffer 1 h bei 37°C

inkubiert, das Einbringen der Filter in den Puffer erfolgte so vorsichtig und langsam,

dass die Filter zwar vollständig von Puffer bedeckt waren, die Kolonien jedoch nicht

abgespült wurden. Anschliessend wurden die Filter auf Whatman 3MM-Papier bei

Raumtemperatur vollständig getrocknet. Die trockenen Filter wurden im Crosslinker

mit UV-Licht mit einer Energie von 1200 x 100 µJ/cm2 bestrahlt, wodurch die DNA

auf den Filtern fixiert wurde. Zwischen den Hybridisierungen wurden die Filter in

Church-Puffer gelagert, zur längerfristigen Lagerung wurden sie getrocknet.

2.2.4. Selektion Chromosom II- bzw. V spezifischer Cosmid-Bibliotheken

Zunächst wurden DNA-Filter hergestellt (siehe 2.2.3.), die sowohl die Cosmid-

Bibliothek vom FGSC in den Vektoren pLORIST6Xh und pMOcosX als auch die Cos-

mid-Bibliothek im Vektor pLawrist-4, die im Rahmen dieser Arbeit angefertigt wurde

(siehe 2.2.2.), enthielten. Jeweils 70 ng chromosomale DNA der Chromosomen II und

V, die freundlicherweise von Dr. U. Schulte zur Verfügung gestellt wurde, wurde wie in

2.2.8. beschrieben radioaktiv markiert und auf die Cosmid-Filter hybridisert. Die Aus-

wertung der Autoradiographien erfolgte manuell. Frische Mikrotiterplatten wurden mit

Hilfe von sterilen Zahnstochern mit den Cosmid-Klonen, die positive Signale zeigten,

angeimpft, von den chromosomenspezifischen Bibliotheken wurden je 3 Kopien ange-

legt (2.2.1.).


30

2.2.5. Selektion einer Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek

Zur Selektion einer Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek wurden zunächst

DNA-Filter mit der gesamten BAC-Bibliothek hergestellt (2.2.3.). Auf diese wurde

DNA von Cosmid-Klonen, die schon, wie in 2.2.4. beschrieben, als Chromosom-II-

spezifisch identifiziert worden waren, hybridisiert. Die Markierung der DNA erfolgte

unter Verwendung von Digoxigenin (2.2.9.). Die Klone wurden entweder einzeln oder

in Gruppen von zwei oder drei Klonen hybridisiert. Die BAC-Klone mit positivem Hy-

bridisierungssignal wurden in frische Mikrotiterplatten transferiert, die Platten wurden

anschliessend mehrfach kopiert (2.2.1).

2.2.6. Präparation von Cosmid-DNA

Die Präparation von Cosmid-DNA erfolgte durch alkalische Lyse (Birnboim & Doly,

1979). Flüssigkulturen wurden durch Animpfen von je 5 ml 2YT-Medium und 30 µg/ml

Kanamycin bzw. 50 µg/ml Ampicillin mit Bakterienklonen angelegt und 16 h bei 37 °C

unter Schütteln bei 220 rpm inkubiert. Die Kulturen wurden 10 min bei 4000 rpm zen-

trifugiert, die sedimentierten Zellen wurden in 100 µl Lösung I resuspendiert, in ein

1.5 ml Eppendorfgefäss überführt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschlie-

ssend wurden zur alkalischen Lyse 200 µl Lösung II zugegeben, vorsichtig gemischt

und 5 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 150 µl Lösung III wurde 15 min auf Eis

inkubiert, anschliessend wurden die festen Zellbestandteile 10 min bei 13000 rpm ab-

zentrifugiert. Zur Entfernung von RNA wurde der Überstand mit 10 µl 10 mg/ml RNase

A versetzt und mindestens 1 h bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde zunächst mit dem

gleichen Volumen Phenol, pH 8.0, anschliessend mit dem gleichen Volumen Chloro-

form/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Durch Zugabe vom 2.5-fachen Volumen Ethanol

und dem 0.1-fachen Volumen 3 M NaOAc, pH 5.2 wurde die DNA bei -70°C für min-

destens 30 min gefällt. Nach Abzentrifugation für 30 min bei 13000 rpm, Waschen mit

70 %igem Ethanol und Trocknen wurde die DNA in 50 µl H2O gelöst. Zur Überprüfung

der DNA-Qualität durch Restriktionsanalyse wurden 3 µl der DNA-Lösung mit 0.5 µl

EcoRI, 1 µl 10x EcoRI-Puffer und 5.5 µl H2O versetzt, 1 h bei 37°C inkubiert und auf

einem 1 %igem Agarosegel überprüft.


31

2.2.7. Präparation von BAC-DNA

Die Präparation von BAC-DNA erfolgte nach einem modifiziertem Protokoll des QIA-

prep® Spin Miniprep Kits. Verwendet wurden die vom Hersteller gelieferten Säulen und

Puffer, lediglich Puffer N3 wurde durch den Puffer P3 aus dem QIAGEN® Plasmid Mini

Kit ersetzt. Zunächst wurden Flüssigkulturen angelegt, indem 7 ml 2YT-Medium und

30 µg/ml Kanamycin mit Hilfe eines Zahnstochers mit Bakterienklonen aus der gefro-

renen Bibliothek angeimpft wurden und ca. 16 h bei 37°C unter Schütteln bei 220 rpm

inkubiert wurden. Die Bakterienzellen wurden durch 20 minütige Zentrifugation bei

4000 rpm sedimentiert. Um die Ausbeute an BAC-DNA zu maximieren, erwies es sich

als unerlässlich, die Resuspension der Zellen in Puffer P1, die Lyse der Zellen in Puffer

P2 und die Neutralisation des Lysats mit Puffer P3 für jeden Klon direkt nacheinander

und ohne Verzögerung durchzuführen und nicht etwa bei der parallelen Präparation

vieler Klone zunächst alle mit Puffer P1, dann alle mit Puffer P2 und anschliessend alle

mit Puffer P3 zu behandeln, wie dies z.B. bei Plasmid- oder auch Cosmid-Präparationen

möglich ist.

Das Zellsediment wurde in 250 µl Puffer P1 und 200 µg/ml RNase A resupendiert und

in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss überführt. Nach sofortiger Zugabe von 250 µl

Puffer P2 und Mischen durch mehrmaliges Invertieren wurden 350 µl Puffer P3 zuge-

geben und vorsichtig gemischt. Nach Zentrifugation für 10 min bei 13000 rpm wurde

der Überstand durch Zugabe von 590 µl Isopropanol 30 min bei -20°C gefällt. Die DNA

wurde 30 min bei 13000 rpm zentrifugiert, mit 500 µl 70 %igem Ethanol gewaschen

und nach Trocknen bei Raumtemperatur in 26 µl H2O aufgenommen. Nach der Zugabe

von 3 µl 10x EcoRI-Puffer und 0.5 µl EcoRI wurde 1 h bei 37°C inkubiert. Der Re-

striktionsansatz wurde mit 150 µl Puffer PB versetzt und auf die QIAprep®-Säule auf-

getragen. Die Säule wurde 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert und der Durchfluss ver-

worfen. Anschliessend wurde die Säule mit 750 µl Puffer PE gewaschen, 1 min zentri-

fugiert, und nach Verwerfen des Durchflusses erneut 1 min zentrifugiert. Die Elution

erfolgte mit 30 µl 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, das auf 65°C temperiert worden war. Auf

einem 1 %igem Agarosegel wurden 8 µl des Eluats überprüft.


32

2.2.8. Hybridisierung mit radioaktiv markierter DNA

2.2.8.1. Radioaktive Markierung der DNA

Die radioaktive Markierung der Sonden erfolgte nach der Methode des "Random Hexa-

mer Priming" von Feinberg und Vogelstein (1983). Bei dieser Methode wird die DNA

ausgehend von zufälligen Hexamer-Primern mit dem Klenow-Fragment repliziert, wo-

bei durch den Einbau von [α-32P]-dCTP eine radioaktive Markierung erfolgt.

Für die Herstellung von radioaktiv markierten Sonden wurden 20-500 ng Cosmid-DNA

(2.2.6.) in 15 µl H2O 5 min bei 95°C denaturiert, anschliessend sofort auf Eis gekühlt

und mit 18 µl LS-Mix, 0.75 µl 20 mg/ml BSA, 1 µl AGT-dNTP-Mix (je 0.5 M dATP,

dGTP und dTTP), 10 µCi [α-32P]-dCTP und 6 U Klenow-Fragment für mindestens 3 h

bei 37°C inkubiert.

Zur Entfernung nicht eingebauter Nukleotide wurde die DNA durch Zugabe von 2 µl

10 mg/ml tRNA oder Heringsperma-DNA, 2 µl 0.5 M EDTA, 2 µl H2O, 10 µl 3 M

NaOAc und 40 µl Isopropanol 30 min bei -80°C gefällt. Nach Zentrifugation für 30

min bei 13000 rpm wurde das Sediment in 100 µl H2O aufgenommen und direkt in die

Hybridisierung eingesetzt.

2.2.8.2. Hybridisierung der radioaktiv markierten Sonden

Die Hybridisierungen wurden in Glasflaschen (Durchmesser 3.5 cm, Länge 16 cm für

13x8 cm große Filter, Länge 30 cm für 22x22 cm große Filter) in einem beheizbaren

Hybridisierschrank unter ständiger Rotation durchgeführt. Um einen Druckausgleich zu

gewährleisten, waren die Schraubverschlüsse der Glasflaschen in der Mitte durchbohrt.

Die Filter wurden mit der DNA-Seite nach innen luftblasenfrei an die Innenwand der

Flaschen gelegt, je nach Filterzahl und Größe auch überlappend. Zunächst wurde eine

Vorhybridisierung mit 10 ml (kleine Flaschen) bzw. 15 ml (große Flaschen) Hybridisie-

rungspuffer für 2 h bei 65°C durchgeführt. Anschliessend wurde die markierte Sonde

(2.2.8.1.) 5 min bei 95 °C denaturiert, auf Eis gekühlt und direkt in den Hybridisie-

rungspuffer der Vorhybridisierung gegeben. Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C für

12-16 h. Zum Waschen wurden die Filter zunächst einzeln bei Raumtemperatur kurz

mit Waschpuffer gespült. Anschliessend wurden bis zu 20 kleine Filter oder bis zu

5 große Filter gemeinsam in einer Plastikbox in 500 ml Waschpuffer bei 65°C unter

leichtem Schwenken 10-30 min gewaschen.


33

2.2.8.3. Autoradiographien

Die gewaschenen Filter wurden auf Whatman 3MM-Papier kurz angetrocknet, luftdicht

in Klarsichtfolie verpackt und für die Autoradiographie in mit Verstärkerfolien versehe-

nen Filmkassetten mit Hyperfilm™-MP-Filmen exponiert. Je nach Menge der gebunde-

nen Radioaktivität, die mit einem Geigerzähler grob abgeschätzt wurde, wurden die

Filme für 2-24 h bei -80°C exponiert. Die Entwicklung der Autoradiographien erfolgte

manuell in Tauchbädern.

2.2.8.4. Regeneration der Filter

Durch zweimaliges Inkubieren in 500 ml Regenerationspuffer für 30 min bei 95°C wur-

den bis zu 5 große oder 20 kleine Filter gleichzeitig regeneriert. Die Lagerung der Filter

zwischen den Hybridisierungen erfolgte in Church-Puffer, oder bei längeren Zeiträumen

in getrockneter Form.

2.2.9. Hybridisierung mit Digoxigenin-markierter DNA

2.2.9.1. Markierung von DNA mit Digoxigenin

Die Markierung von DNA mit Digoxigenin erfolgte ebenfalls nach der Methode des

"Random Hexamer Priming" (2.2.8.1.).

20-500 ng Cosmid- oder BAC-DNA (2.2.6., bzw. 2.2.7.) in 16 µl H2O wurden nach

Zugabe von 18 µl LS-Mix, 1.5 µl 10 mg/ml BSA, 1 µl dNTP-Mix ( je 1 mM dATP,

dGTP und dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP) und 6 U Klenow-Fragment

mindestens 2 h bei 37°C inkubiert. Die markierte DNA wurde durch Zugabe von 4 µl

0.5 M EDTA, 2 µl 10 mg/ml tRNA oder Heringsperma-DNA, 4 µl H2O, 10 µl

3 M NaOAc, pH 6.0 und 10 µl Isopropanol 30 min bei -80°C gefällt. Nach Zentrifugati-

on für 30 min bei 13000 rpm wurde die DNA in 100 µl H2O aufgenommen.

2.2.9.2. Hybridisierung der mit Digoxigenin markierten DNA

Die Vorhybridisierung und Hybridisierung der mit Digoxigenin markierten Sonden er-

folgte analog der Hybridisierung von radioaktiv markierten Sonden wie in 2.2.8.2. be-

schrieben. Zum Waschen der Filter wurde die Hybridisierungslösung verworfen und

durch 15 ml Waschpuffer ersetzt. Die Filter wurden 15 min bei 65°C unter Rotation

gewaschen.


34

2.2.9.3. Chemilumineszente Signaldetektion mit CSPD®

Bei den folgenden Schritten wurden jeweils bis zu 5 große oder 16 kleine Filter zusam-

men in einer Plastikbox auf einem Schüttler behandelt. Zunächst wurden die Filter kurz

mit 250 ml CSPD®-Waschpuffer gespült. Nach einer 30-minütigen Inkubation in

250 ml 1 x Blocking-Lösung wurden die Filter für weitere 30 min in 200 ml Antikörper-

Verdünnung (Antidigoxigenin-Alkalische-Phosphatase-Konjugat) inkubiert. Anschlie-

ssend wurden die Filter zweimal je 15 min in 200 ml CSPD®-Waschpuffer gewaschen

und für mindestens 2 min in Detektionspuffer äquilibriert. Die Filter wurden einzeln

1 min in 200 ml CSPD®-Verdünnung inkubiert, anschliessend luftblasenfrei in Plastik-

folie eingeschweisst, wobei überschüssige CSPD®-Lösung durch Reiben aus dem Beu-

tel herausgedrückt wurde. Die Exposition von Röntgenfilmen oder Lumi-Filmen er-

folgte bei 37°C für 2-12 h in Filmkassetten. Die Entwicklung der Filme wurde manuell

in Tauchbädern durchgeführt.

2.2.9.4. Regeneration der Filter

Zur Regeneration wurden bis zu 5 große oder 16 kleine Filter in einer Plastikbox 5 mal

für 5 min mit 300 ml frisch aufgekochtem Regenerationspuffer gewaschen. Zwischen

den Hybridisierungen wurden die Filter in Church-Puffer, bei längeren Zeiträumen in

getrockneter Form aufbewahrt.

2.2.10. Analyse der Hybridisierungsdaten

Die Auswertung der Autoradiographien bzw. der durch Chemilumineszenz belichteten

Filme erfolgte manuell. Für jede verwendete Sonde wurde eine Datei erstellt, die mit

dem Sondennamen benannt wurde. In diesen Dateien waren alle Klonnamen enthalten,

die mit der jeweiligen Sonde ein Hybridisierungssignal ergaben. Diese Dateien dienten

als Ausgangspunkt für die Kartierungs-Software.

Die Kartierung erfolgte mittels des Softwarepaketes "Contig" (Mott et al. 1993,

http://www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/~andy/welcome.html).


35

Der folgende Algorithmus berechnet aus den Hybridisierungsmustern Distanzen zwi-

schen allen möglichen Sondenpaar-Kombinationen:

Dab = ( Nab - Pab ) / Nab

mit:Dab = Distanz zwischen den Sonden á` und ´b`Nab = Summe der Klone, die mit á` oder ´b` hybridisierenPab = Summe der Klone, die mit á` und ´b` hybridisieren

Die Werte für alle Sondenpaarkombinationen liegen zwischen 0 und 1. Im Falle eines

identischen Hybridisierungsmusters ergibt sich Dab = 0, im anderen Extrem ergibt sich

für zwei völlig verschiedene Hybridisierungsmuster eine Distanz Dab = 1, die Sonden

sind also mindestens eine Klonlänge voneinander entfernt. Nach der Ermittlung der Di-

stanzen berechnet das Programm in einem als "simulated annealing" bezeichneten Ver-

fahren (Press et al. 1988) eine Sondenanordnung, die den kürzesten Gesamtabstand

aufweist. Anschliessend werden die Klone anhand dieser Sondenreihenfolge angeord-

net, wodurch Bereiche überlappender Klone, sogenannte "contigs" gebildet werden.


36

2.3. Methoden Genexpressionsanalysen

2.3.1. Anzucht und Replikation der cDNA-Bibliothek

Die vom "Neurospora Genome Project" (University of New Mexico, USA) zur Verfü-

gung gestellte cDNA-Bibliothek lag zunächst in insgesamt 49 Mikrotiterplatten im

96er-Format vor. Mit Hilfe des Roboters "BioGrid" wurden 3 Kopien der Bibliothek in

je 15 mit 2YT-F-Medium und 50 µg/ml Ampicillin gefüllte 384er Mikrotiterplatten er-

stellt. Nach Inkubation für 16 h bei 37°C wurden die Bibliotheken bei -80°C gelagert.

2.3.2. PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek

Die PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek wurde in 384er Mikrotiterplatten in ei-

nem Reaktionsvolumen von je 25 µl durchgeführt.

Tabelle 2.4: Pipettierschema für die PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek

Reagenzien 1x 25 µµµµl Mix für 384er Platte

400 x 25 µµµµl

Endkonzentration

H2O 12.525 µl 4850 µl

10x PCR-Puffer 2.5 µl 1000 µl 1x

37.5 mM MgCl2 1.5 µl 600 µl 2.25 mM

dNTPs (je 25 mM) 0.2 µl 80 µl 0.2 mM

5 M Betain 7.5 µl 3000 µl 1.5 mM

30 mM Cresolrot 0.075 µl 30 µl 0.09 mM

100 µM Primer T3 0.1 µl 40 µl 0.4 µM

100 µM Primer T7 0.1 µl 40 µl 0.4 µM

Taq-Polymerase 0.1 µl 40 µl

Der Reaktionsmix wurde in der 384er-PCR-Mikrotiterplatte vorgelegt, anschliessend

wurde jeder 25 µl-PCR-Ansatz mit Hilfe steriler 384er Plastikreplikatoren mit Bakteri-

en-DNA aus der cDNA-Klon-Bibliothek angeimpft.

Nach einem ersten Denaturierungsschritt bei 95°C für 5 min folgten 36 Zyklen mit

30 sec bei 95°C, 30 sec bei 52°C und 2 min bei 72°C. Nach einem abschliessenden Po-


37

lymerisationsschritt bei 72°C für 10 min wurden die PCR-Ansätze auf 4°C gekühlt.

Je 2,5 µl der PCR-Ansätze wurden anschliessend hinsichtlich der Effizienz der PCR-

Reaktion mittels Gelelektrophorese überprüft.

2.3.3. Herstellung heterologer Kontrollen

Für die Herstellung heterologer Kontrollen, die zusätzlich zur cDNA-Bibliothek auf die

DNA-Chips aufgebracht werden sollten, wurde Globin aus Kaninchen gewählt. Einer-

seits sollte ein Oligonukleotid („rabbitspot3“) mit einer Länge von 80 Basen, dessen

Sequenz aus der Kaninchenglobin-mRNA-Sequenz gewählt wurde, als heterologe Kon-

trolle verwendet werden. Die Sequenz von „rabbitspot3“ wurde mit dem Programm

"primer3" (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi, Whitehead In-

stitute, Massachusetts, USA) ermittelt. Es ist ein 80mer mit einem GC-Gehalt von 50%

und einer theoretischen Schmelztemperatur von 90,4°C. Die Sequenz von „rabbitspot3“

lautet:

5´-GGC AAC GTG CTG GTT GTT GTG CTG TCT CAT CAT TTT GGC AAA GAA

TTC ACT CCT CAG GCA TGC CTA TCA GAA GGT-3´

Weiterhin wurde je ein PCR-Produkt aus α-Globin bzw. β-Globin amplifiziert. Dazu

wurde in einem ersten Schritt aus Kaninchenglobin-mRNA über reverse Transkription

einzelsträngige cDNA hergestellt. 100 ng Kaninchenglobin-mRNA und 1 µg Oli-

go(dT)12-18 wurden in einem Volumen von 11 µl H2O mit 1 µl dNTP-Mix (je 10 mM

dATP, dCTP, dGTP, dTTP) versetzt und 10 min bei 65°C inkubiert. Der Ansatz wurde

auf Eis gestellt, kurz zentrifugiert und mit 4 µl 5x Reaktionspuffer, 2 µl 0.1 M DTT,

1 µl Rnasin und 1 µl SuperScript II (200 U/µl) versetzt. Nach Inkubation für 1 h bei

42°C wurde die Reaktion bei –20°C gestoppt. Der Ansatz wurde mit 1 µl Rnase I ver-

setzt und 15 min bei 37°C inkubiert. Die resultierende einzelsträngige cDNA diente als

Matrize in der nun folgenden PCR-Reaktion. Die PCR wurde in 96er Mikrotiterplatten

durchgeführt, mit einem Reaktionsvolumen von je 50 µl. Für eine Reaktion wurden 5 µl

10x PCR-Puffer (Qiagen), 1 µl dNTP-Mix (je 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 µl

10 µM forward-Primer, 1 µl 10 µM reverse-Primer, 0.4 µl Taq-Polymerase (Qiagen)

und 39.6 µl H2O mit 0.2 µl cDNA (siehe oben) versetzt. Nach einer anfänglichen De-

naturierung für 3 min bei 94°C wurden 35 Zyklen mit 1 min bei 94°C, 30 sec bei 54°C


38

und 1 min bei 72°C durchlaufen. Nach einem weiteren Polymerisationsschritt für

10 min bei 72°C wurde auf 4°C gekühlt. In einem 1%igem Agarosegel wurden die

PCR-Produkte auf Qualität und Grösse überprüft. Die Reinung der PCR-Produkte er-

folgte mit MultiScreen-PCR-Reinigungsplatten. Die Konzentration der PCR-Produkte

wurde fluorimetrisch bestimmt. Anschliessend wurden mit 3x SSC/1.5 M Betain Lö-

sungen mit 300 ng/µl, 200 ng/µl und 100 ng/µl hergestellt.

2.3.4. Herstellung der DNA-Chips

2.3.4.1. Beschichtung von Glas-Objektträgern mit Poly-L-Lysin

Die Beschichtung der Objekträger mit Poly-L-Lysin wurde von Achim Stephan nach

einem in Stanford entwickelten Protokoll (http://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/

index.html) durchgeführt. Zunächst wurden je 20 Objektträger zusammen in einem Pla-

stikhalter kurz in EtOH gewaschen. Alle weiteren Schritte erfolgten bei Raumtempera-

tur auf dem Schüttler, dabei wurden je 40 Objektträger parallel in Plastikbehältern in

einem Volumen von 400 ml behandelt. Im ersten Schritt wurde die Glasoberfläche mit

10 %iger NaOH angeätzt, zunächst 1 h auf dem Schüttler, anschliessend 15 min im Ul-

traschallbad. Anschliessend wurden die Objektträger 3-4mal mit H2O gewaschen, um

Reste von NaOH gründlich zu entfernen. Zur Beschichtung wurden die Objektträger

60 min auf dem Schüttler und 15 min im Ultraschallbad in einer Lösung aus 40 ml Po-

ly-L-Lysinlösung, 40 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,

2 mM KH2PO4) und 320 ml 95 %igem EtOH inkubiert. Anschliessend wurden die Ob-

jektträger zweimal in H2O und dreimal in EtOH für 30 sec gewaschen. Nachdem die

beschichteten Objektträger mit N2 trocken geblasen worden waren, wurden sie für

15 min bei 45°C inkubiert. Die Lagerung der mit Poly-L-Lysin beschichteten Glas-

Chips erfolgte bei 4°C in vor Luftfeuchtigkeit geschützten Plastikbehältern.

2.3.4.2. Aufbringen der DNA auf die Chips

Zur Konzentrierung der DNA wurde das Volumen der PCR-Ansätze von 25 µl auf

ca. 12-15 µl reduziert, indem die Platten nur mit Mull abgedeckt für 40 h bei 7°C inku-

biert wurden. Von diesen eingeengten PCR-Ansätzen wurden je 5 µl aus den PCR-

Platten in Polyfiltronics-Mikrotiterplatten umpipettiert. Die Herstellung des hochdichten

Rasters auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Glas-Chips erfolgte mit dem Roboter


39

SDDC-2 MicroArrayer, der die DNA-Lösung mit 16 Mikrodispensierungs-Nadeln

(SMP3, TeleChem) auf die Glasoberfläche transferierte (Abb. 2.2). Die Luftfeuchtigkeit

im Inneren des Robotergehäuses wurde dabei konstant auf 55%, die Temperatur auf

21°C gehalten.

Abb. 2.2: Raster, in dem die cDNA-Bibliothek auf die Objektträger (25x75 mm) aufgetragen wur-de. Mit jeder der 16 Nadeln wurden 18 spots in x-Richtung und 20 spots in y-Richtungaufgetragen. Der Abstand der spots in x-Richtung betrug 250 µµµµm, in y-Richtung 220 µµµµm

Nachdem die gesamte cDNA-Bibliothek auf die Glas-Chips transferiert war, wurde der

Umriss des Rasters mit einem Diamantschreiber markiert. Die Chips wurden durch kur-

zes Auflegen auf einen 80°C-warmen Heizblock getrocknet und im Crosslinker mit UV-

Strahlung einer Energie von 600x100 µJ/cm2 behandelt.

Für die Blockierung der positiv geladenen Poly-L-Lysin-Oberfläche wurden zunächst

1 g Bernsteinsäureanhydrid vollständig in 200 ml Dichlorethan gelöst und anschliessend

mit 2.5 ml N-Methylimidazol versetzt. Die Lösung wurde in einen Behälter gefüllt, in

dem die Chips in einem Plastikhalter 1 h bei Raumtemperatur abgedeckt unter leichtem

Schütteln inkubiert wurden. Anschliessend wurden die Chips in 200 ml Dichlorethan

kurz gewaschen. Zur Denaturierung der DNA auf den Chips wurden diese im Halter in

95°C-heissem Wasser für 2 min inkubiert. Nach einem Waschschritt in 95 %igem Etha-

nol liess man die Chips bei Raumtemperatur trocknen.

Block 1

Block 2

y-Richtung

1 2 3 4

5 6 7 8

9 10 11 12

13 14 15 16

1 2 3 4

5 6 7 8

9 10 11 12

13 14 15 16

x-Richtung


40

2.3.5. Mycelproben von Neurospora crassa

Die Mycelproben von N. crassa wurden von Dr. U. Schulte (Uni Düsseldorf) und von

Dr. H. Linden (Uni Konstanz) zur Verfügung gestellt. Der verwendete Stamm war der

Wildtyp-Stamm 74-OR23-1A. Die drei Proben, die zur Untersuchung der Genexpressi-

on von N. crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien verwendet wurden,

wuchsen in Vogels-Medium für 22 h bei 28°C, jeweils mit folgenden Nährstoff-

Zusätzen:

Tabelle 2.5: Wachstumsbedingungen der Mycel-Proben

Probe Nährstoff-Zusatz

„Minimalmedium“ 2% Saccharose

„Vollmedium“ 2% Saccharose, 0,25% Hefeextrakt, 0.1% Caseinhydrolysat

„Acetat“ 0.5% Natriumacetat

Die Probe, die zum Vergleich mit S. cerevisiae verwendet wurde, war 48 h in Vogels-

Medium im Dunkeln kultiviert worden.

2.3.6. Isolierung von RNA aus Neurospora crassa

Alle Puffer und Lösungen wurden mit DEPC-H2O angesetzt, die Mörser und Spatel

wurden zur Sterilisation 2 h bei 160°C gebacken.

Für die Isolierung von RNA aus N. crassa wurden etwa 2 g gefrorenes Mycel in einem

gekühlten Mörser mit flüssigem Stickstoff pulverisiert. In 2 ml Eppendorfgefässen wur-

den 750 µl Lysis-Puffer (0.6 M NaCl, 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0 und

4 % SDS) und 750 µl Phenol vorgelegt, diese wurden dann mit pulverisiertem Mycel

aufgefüllt.

Nach kräftigem Schütteln für 20 min wurde 10 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Der

Überstand wurde erneut mit 750 µl Phenol versetzt, 2 min kräftig geschüttelt und

10 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Zur Fällung wurde der Überstand mit 560 µl 8 M

LiCl gemischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach Zentrifugation für 10 min bei

10000 rpm wurde der Niederschlag in 300 µl H2O aufgenommen und durch Zugabe von


41

30 µl 3 M NaOAc und 750 µl EtOH erneut bei -70°C für mindestens 30 min gefällt. Die

RNA wurde 10 min bei 10000 rpm abzentrifugiert, mit 70%igem EtOH gewaschen,

getrocknet und in 100 µl H2O aufgenommen. Die Qualität der isolierten RNA wurde in

einem 1,2 %igem Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch

überprüft.

2.3.7. Markierung von komplexen Proben durch cDNA-Erststrangsynthese

Die Markierung der Proben mit Fluoreszenzfarbstoffen erfolgte in einem zweistufigen

Prozess: zunächst wurde ausgehend von RNA durch reverse Transkription cDNA syn-

thetisiert, wobei Aminoallyl-markiertes dUTP verwendet wurde. Im zweiten Schritt

wurde ein monoreaktiver Fluoreszenzfarbstoff-NHS-Ester an die Amino-Gruppe des

markierten dUTP gebunden. Bei anschliessender Hybridisierung auf Chips, die als he-

terologe Kontrollen Sequenzen aus Kaninchenglobin enthielten, wurde ausserdem zu

jeder Markierungreaktion eine definierte Menge an Kaninchenglobin-mRNA hinzuge-

fügt.

2.3.7.1. Reverse Transkription unter Verwendung von aa-dUTP

15 µg Gesamt-RNA (2.3.6.) wurden mit 2.5 µg Oligo(dT)12-18 und, bei Verwendung der

heterologen Kontrollen, mit 7.5 ng Kaninchenglobin-mRNA in 14.5 µl H2O 10 min bei

70°C inkubiert und anschliessend auf Eis gekühlt. Nach Zugabe von 6 µl 5x Reakti-

onspuffer, 0.6 µl 50x dNTP-Mix (je 25 mM dATP, dCTP, dGTP, 10 mM aa-dUTP,

15 mM dTTP), 3 µl 0.1 M DTT, 1.9 µl SuperScriptII (200 U/µl) und 3 µl H2O wurde

die reverse Transkription für mindestens 3 h bei 42°C inkubiert. Die Reaktion wurde

mit 10 µl 0.5 M EDTA abgestoppt und die RNA durch Zugabe von 10 µl 1 N NaOH für

15 min bei 65°C hydrolysiert. Die Reaktion wurde anschliessend mit 25 µl 1 M Hepes,

pH 7.5 neutralisiert. Zur Entfernung von Puffer und nicht eingebauter Nukleotide wurde

die cDNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt. Zunächst wurden zum

neutralisierten Reaktionsansatz 25 µl H2O und 100 µl Puffer PB zugegeben. Die Lösung

wurde auf eine QIAquick-Säule aufgetragen, 1 min zentrifugiert und nach Verwerfen

des Durchflusses zweimal mit 750 µl Puffer PE gewaschen. Dazwischen wurde jeweils

1 min zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Nach dem zweiten Waschschritt

wurde zweimal zentrifugiert, um den Puffer PE vollständig zu entfernen. Die cDNA

wurde mit zweimal 30 µl 0.6 µM NaOH, pH 7.5 eluiert.


42

2.3.7.2. Kupplung von reaktiven Fluoreszenzfarbstoff-Estern an aa-dUTP

Die reaktiven Farbstoffester wurden für die Kupplungsreaktion aliquotiert, indem ein

vom Hersteller geliefertes Aliquot in 72 µl DMSO gelöst wurde und auf 16 Aliquots

à 4.5 µl verteilt wurde. Diese Aliquots wurden im Vakuum-Konzentrator getrocknet und

bei 4°C im Exsiccator lichtgeschützt gelagert.

Die mit aa-dUTP markierte cDNA (2.3.7.1) wurde in einem Vakuum-Konzentrator ge-

trocknet. Anschliessend wurde die cDNA in 9 µl 0.1 M NaHCO3 gelöst und zu einem

Aliquot des monoreaktiven NHS-Farbstoffesters (Cy3 bzw. Cy5) gegeben. Die Kupp-

lungsreaktion wurde für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Um nicht ge-

bundenen NHS-Farbstoffester zu blockieren, wurde der Ansatz mit 4.5 µl 4 M Hy-

droxylamin gemischt und weitere 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.

Für die anschliessende Reinigung mit dem QIAquick PCR Purification Kit wurden bei

einer nachfolgenden Zweifarben-Hybridisierung die entsprechenden Cy3- und Cy5-

Reaktionen vereint, ansonsten erfolgte die Reinigung getrennt. Die Ansätze wurden mit

H2O auf ein Volumen von 100 µl aufgefüllt, mit 500 µl Puffer PB gemischt, auf die

Säulen aufgetragen, 1 min zentrifugiert und anschliessend zweimal mit je 750 µl Puffer

PE gewaschen. Die Elution erfolgte mit zweimal 30 µl Puffer EB. Die markierte cDNA

wurde nach der photometrischen Einbaubestimmung (2.3.7.3.) im Vakuum-

Konzentrator getrocknet und entweder direkt in die Hybridisierung eingesetzt oder bei

4°C lichtgeschützt bis zu 1 Woche gelagert.

2.3.7.3. Photometrische Einbaubestimmung von Cy3/Cy5

Der Einbau der Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und Cy5 wurde photometrisch bestimmt.

Dazu wurden 50 µl des Eluats (2.3.7.2.) in einer sterilen UV-Küvette (Uvette, Eppen-

dorf) im Photometer bei 260 nm, 550 nm und 650 nm vermessen.


43

Über das Lambert-Beer´sche Gesetz:

Axx = εxx · c · l

mit A : Absorption, gemessen bei xx nmε : Extinktionskoeffizient für die gemessene Substanz bei xx nmc : Konzentration der gemessenen Substanzl : Schichtdicke der Küvette

und den Extinktionskoeffizienten für

cDNA : ε260 = 10000 l/mol · cm

Cy3 : ε550 = 150000 l /mol · cm

Cy5 : ε650 = 250000 l /mol · cm

wurden die Konzentrationen der cDNA und der beiden Fluoreszenzfarbstoffe berechnet.

Die gemessene Absorption bei 260 nm wurde zunächst mit folgenden Formeln korri-

giert, um die gleichzeitige Absorption durch die Farbstoffmoleküle zu berücksichtigen:

A260 korrigiert = A260 - (0.08 · A550)

A260 korrigiert = A260 - (0.05 · A650)

Über die folgenden Formeln wurde anschliessend über das Verhältnis der Konzentratio-

nen die prozentuale Einbaurate von Cy3 bzw. Cy5 bestimmt.

( [Cy3] / [cDNA] ) x 100 = % Einbau Cy3

( [Cy5] / [cDNA] ) x 100 = % Einbau Cy5

2.3.8. Hybridisierung auf Glas-Chips

Alle Hybridisierungen wurden als Zweifarben-Experiment durchgeführt, d.h. dass eine

Probe, die mit Cy3 markiert war, zusammen mit einer zweiten Probe, die mit Cy5 mar-

kiert war, auf einen Chip hybridisiert wurde.

Um das benötigte Probenvolumen möglichst klein zu halten, wurden die Hybridisierun-

gen unter einem Deckgläschen durchgeführt. Je nach Grösse des Deckgläschens werden

so nur zwischen 12 und 40 µl an Probenvolumen benötigt. Zur Hybridisierung wird der


44

DNA-Chip mit Deckglas in eine Hybridisierungskammer eingebracht

(http://arrayit.com), die anschliessend in ein Wasserbad gelegt wird. Damit die Hybridi-

sierungslösung unter dem Deckglas während der Hybridisierung nicht eintrocknet, wird

im Inneren der Hybridisierungskammer ein feuchtes Milieu geschaffen, indem in ent-

sprechende Vertiefungen in der Hybridisierungskammer Wasser gegeben wird.

Die für die Hybridisierung benötigten Deckgläschen (24x40 mm) wurden in 0.5 %igem

SDS gereinigt, mit ddH2O gespült und abgetrocknet, wobei darauf geachtet wurde, dass

die Oberfläche staubfrei war. In die Hybridisierungskammer wurde in beide Vertiefun-

gen je 5 µl H2O pipettiert.

Die markierte cDNA (2.3.7.) wurde in 25 µl Hybridisierungspuffer (5 % (w/v) Dextran-

sulfat, 3x SSC, 1 % (v/v) SDS, 5x Denhardt´s, 50 % Formamid) und 1.5 µl 10 mg/ml

poly(dA) gelöst, 10 min bei 80°C denaturiert und auf Eis gekühlt. 24 µl der Probe wur-

den auf das Deckglas pipettiert. Anschliessend wurde das Deckglas mit einer Pinzette

vorsichtig umgedreht und luftblasenfrei auf dem Chip plaziert. Der Chip wurde sofort in

die Hybridisierungskammer eingebracht, die Kammer wurde verschlossen und in ein

auf 42°C temperiertes Wasserbad gelegt. Die Hybridisierung erfolgte für 16 h im Dun-

keln bei 42°C.

Anschliessend wurde der DNA-Chip der Hybridisierungskammer entnommen und zur

Ablösung des Deckglases in ein mit 50 ml Waschpuffer I (2x SSC, 0.1 % SDS) gefüll-

tes Falcon-Gefäss gestellt. Nach Ablösung des Deckglases wurde der Chip mehrmals

kurz im Waschpuffer I geschwenkt, anschliessend in einem Plastikhalter in ein mit

500 ml Waschpuffer II (1x SSC) gefülltes Becherglas transferiert und unter leichtem

Schwenken 3 min bei Raumtemperatur gewaschen. Der Chip wurde anschliessend

30 sec in 500 ml Waschpuffer III (0.2x SSC) gewaschen, gut abgeschüttelt und zum

Trocknen in einer mit Whatmann 3MM-Papier ausgelegten Plastikschale 1 min bei

1800 rpm zentrifugiert. Bis zur Detektion, die direkt im Anschluss erfolgte, wurden die

DNA-Chips bei Raumtemperatur in lichtgeschützten Behältern gelagert.


45

2.3.9. Auswertung der Hybridisierungsdaten

2.3.9.1. Detektion

Die DNA-Chips wurden mit dem Lasermikroskop ScanArray 5000 detektiert. Die An-

regung von Cy3 bzw. Cy5 erfolgte seriell. Zunächst wurden die durch Cy5 erzeugten

Signale mit einem Laser mit einer Anregungswelle von 633 nm und einer Emissions-

wellenlänge von 670 nm detektiert. Anschliessend wurde mit einem zweiten Laser, der

eine Anregungswelle von 543 nm und eine Emissionswellenlänge von 570 nm hat, die

durch Cy3 erzeugten Signale detektiert. Die erzeugten Bilder wurden getrennt im

16bit-TIFF-Format gespeichert.

2.3.9.2. Quantifizierung der Signalintensitäten mit GenePix™

Die Quantifizierung der Signalintensitäten erfolgte mit der Software GenePix™. Dabei

wurden die detektierten Bilder zunächst in Falschfarben wiedergegeben, wobei entspre-

chend der Laser-Wellenlängen für Cy3 die Farbe Grün und für Cy5 die Farbe Rot ge-

wählt wurde. Die Software überlagert anschliessend diese beiden Bilder. Hat ein Signal

in beiden Laser-Kanälen die gleiche Intensität, ergibt sich die Mischfarbe gelb, das zu-

gehörige Gen wird also in beiden Proben in gleicher Menge transkribiert. Wird ein Gen

nur in einer der beiden Proben exprimiert, dann erhält man nur in einem der beiden Ka-

näle ein Signal, dass dementsprechend entweder rot oder grün dargestellt wird. Für dif-

ferentiell exprimierte Gene ergeben sich zwischen diesen beiden Extrema alle Misch-

farben zwischen rot und grün, je nach Transkripthäufigkeit in den zu vergleichenden

Proben.

Zur Quantifizierung der Signalintensitäten wird über das Falschfarbenbild ein Raster

gelegt, dass automatisch oder manuell an das Bild angepasst werden kann. Die Intensi-

täten beider Fluoreszenzfarbstoffe werden für jedes Signal berechnet und in einer

Tabelle mit der eindeutigen Zuordnung zu den Genfragmenten ausgegeben.

2.3.9.3. Datenanalyse mit M-Chips

Die Software M-Chips („Multi-Conditional Hybridization Intensity Processing Soft-

ware"), die eigens am DKFZ für die Datenverarbeitung von Expressionsanalysen auf

DNA-Chips entwickelt wurde, beinhaltet die Normalisierung der Daten, verschiedene

Filtermethoden zur Bewertung der Relevanz der aquirierten Daten und mit der Korre-

spondenzanalyse eine Methode, um Experimente mit mehr als zwei verschiedenen Be-


46

dingungen zu beschreiben und übersichtlich darzustellen.

Normalisierung:

Eine Normalisierung der generierten Signalintensitäten war erforderlich, da diese an-

sonsten aufgrund von Unterschieden, die u. a. durch verschiedene Einbauraten bei der

Markierung der RNA, unterschiedliches Verhalten der beiden Fluoreszenzfarbstoffe

oder abweichende Effizienz der einzelnen Hybridisierungen auftreten können, nicht

direkt miteinander vergleichbar waren.

Zur Normalisierung wurden die Signalintensitäten der zu untersuchenden Bedingung

gegen die Signalintensitäten der Kontrollbedingung in einem zweidimensionalen Koor-

dinatensystem aufgetragen. Bei mehrfacher Wiederholung des Experiments wurden die

individuellen Datensätze der zu untersuchenden Bedingung gegen den Median der zu-

sammengefassten Datensätze der Kontrollbedingung aufgetragen. Anschliessend wurde

die Regressionsgerade mit y=mx+b wird bestimmt. Die Steigung der Regressionsgera-

den wurde durch multiplikative Korrektur auf den Wert 1 gebracht, nach additiver

Korrektur des Y-Achsenabschnitts verlief die Gerade durch den Ursprung des Koordi-

natensystems.

Die Berechnung der Regressionsgeraden kann nach drei verschiedenen Methoden erfol-

gen. Zum einen werden für die Berechnung die Signalintensitäten aller oder zumindest

einer Mehrheit der Gene verwendet. Zum anderen kann die Berechnung anhand der

Signalintensitäten einzelner ausgewählter Gene erfolgen, wobei einerseits konstitutiv

exprimierte Gene, sogenannte „Haushaltsgene“, verwendet werden können, andererseits

heterologe Kontrollsequenzen (Eickhoff et al., 1999), deren komplementäre, organis-

musfremde RNA zur Markierungsreaktion in definierter Menge hinzugefügt werden

muss.

Datenfilterung:

Vor einer weiteren Analyse wurden die normalisierten Daten nach verschiedenen Qua-

litätskriterien gefiltert. Zum einen wurden solche Gene aussortiert, deren Signalintensi-

täten unterhalb eines Schwellenwerts lagen. Ein zweites Qualitätskriterium war der

Faktor der Induktion bzw. Repression, der aus dem Verhältnis der normalisierten Si-

gnalintensitäten berechnet wurde. Ausserdem erfolgte eine Filterung der Daten nach der

Stringenz der Änderung der Genexpression.

Signalintensitätsschwellenwert: Zu vielen Sonden auf dem DNA-Chip gibt es unter den

zu untersuchenden Bedingungen keine komplementäre mRNA-Spezies in der Probe.


47

Die bei diesen Sonden resultierenden Signale werden durch unspezifische Kreuzhybri-

disierungen verursacht. Signale mit sehr geringer Intensität können nicht vom durch

unspezifische Signale verursachten Hintergrundrauschen unterschieden werden. In ei-

nem solchen Fall können keine fundierten Aussagen über eventuelle Änderungen in der

Genexpression gemacht werden. Deshalb werden durch Definition eines Signalintensi-

tätsschwellenwertes zu schwache oder unspezifische Signale herausgefiltert. Dieser

Schwellenwert wurde für jedes Experiment individuell bestimmt.

Verhältnis der Signalintensitäten von Cy3 zu Cy5: Das Verhältnis der Signalintensitäten

von Cy3-markierter Probe zu Cy5-markierter Probe ergibt den Induktions- bzw. Re-

pressionsfaktor eines Gens. Mit diesem zweiten Qualitätskriterium werden diejenigen

Gene herausgefiltert, die unter den untersuchten Bedingungen nicht differentiell expri-

miert werden, d.h. deren Expression sich um weniger als ein zu definierendes Vielfa-

ches ändert.

Stringenzkriterium: Zur Bestimmung, ob bei einem Gen eine statistisch signifikante

Änderung der Expression vorliegt, wurden zwei Methoden verwendet. Die stringentere

Methode ist die Min/Max-Separation der Signalintensitäten. Wird ein Gen in Probe 1

stärker exprimiert als in Probe 2, müssen alle Intensitätswerte für dieses Gen aus

Probe 1 höher liegen als die Intensitätswerte aus Probe 2 (siehe Abb.2.3). Durch Defi-

nition einer bestimmten Differenz zwischen dem Minimal-Wert min(x) der Datenpunkte

mit der höheren Intensität und dem Maximal-Wert max(o) der Datenpunkte mit der

niedrigeren Intensität kann die Stringenz der Min/Max-Separation noch erhöht werden.

Weniger stringent dagegen ist die Methode der Standardabweichung-Separation. Hier-

bei wird die Differenz berechnet zwischen dem arithmetischen Mittel der Datenpunkte

mit der höheren Intensität �

(x) verringert um eine Standardabweichung σ(x) und dem

arithmetischen Mittel der Datenpunkte mit der niedrigeren Intensität �

(o) erhöht um

eine Standardabweichung σ(o). Die Standardabweichung-Separation ist weniger anfäl-

lig für einzelne, von den übrigen Messungen abweichende Datenpunkte.


48

Abb. 2.3: Methoden für die Beurteilung der statistischen Signifikanz von Genexpressionsände-rungen

Korrespondenzanalyse:

Mit Hilfe der Korrespondenzanalyse (Greenacre, 1984) ist es möglich, Beziehungen

sowohl von Genen untereinander, als auch zwischen Genen und den zu untersuchenden

Bedingungen zu visualisieren und zu erklären. Dazu werden die normalisierten und ge-

filterten Hybridisierungsdaten in einer Matrix zusammengestellt. Die Anzahl der Gene

sei dabei g, die Anzahl der zu untersuchenden Bedingungen b. Die Gene werden in den

Reihen aufgetragen, die Bedingungen in den Spalten. Mit Hilfe dieser Matrix lässt sich

jedes Gen als Vektor in einem entsprechend der Anzahl der Bedingungen

b-dimensionalen Raum darstellen, jede Bedingung analog in einem g-dimensionalen

Raum. Anschliessend werden diese beiden multidimensionalen Räume mit minimalem

Informationsverlust auf eine zweidimensionale Ebene projeziert. Um den Grad des In-

formationsverlusts beurteilen zu können, wird für jede Korrespondenzanalyse der In-

formationsgehalt für die Darstellung der Varianz in den einzelnen Dimensionen berech-

net. Werden, wie in der vorliegenden Arbeit, nur drei Bedingungen miteinander vergli-

chen, können in den ersten beiden Dimensionen 100% der Varianz dargestellt werden.

ooo

o

x

x

x

x

Min/Max-Separation

ooo

ox

x

x

x

Standardabweichung-Separation

min(x)

max(o)

(x)�

(x)

�(x)-σ(x)

�(o)+σ(o)

�(o)

Ergebnisse

49

3. Ergebnisse


Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden im Rahmen des Neurospora crassa Ge-

nom-Projekts physikalische Klonkarten der Chromosomen II und V von N. crassa er-

stellt. Als Basis dafür diente eine genomische Cosmid-Bibliothek, von der Teile im

Rahmen dieser Arbeit hergestellt wurden, die mit einer vom Fungal Genetic Stock

Center (FGSC) und der University of Georgia bereit gestellten Cosmid-Bibliothek er-

gänzt wurden. Weiterhin wurde im Lauf des Kartierungsprojekts zusätzlich eine geno-

mische BAC-Bibliothek von LION Bioscience zur Verfügung gestellt. Die folgende

Tabelle zeigt eine Übersicht über die zur physikalischen Kartierung verwendeten Bi-

bliotheken.

Tabelle 3.1: Verwendete Klon-Bibliotheken für die physikalische Kartierung von Chr. II und V vonN. crassa

Bibliothek Klonierungsvektor Herkunft AnzahlKlone

theoretischeAbdeckung

pLawrist-4 V. Aignsiehe unten 2.600

pLORIST6Xh Universityof Georgia 12.000genomische Cosmid-

Bibliothek

pMOcosX FGSC 4.800

17-fach

genomische BAC-Bibliothek pBeloBAC11 LION Bio-

science 9.216 15-fach

Ausgehend von den physikalischen Klonkarten wurde bei MWG Biotech die Sequen-

zierung der beiden Chromosomen begonnen.

3.1.1. Herstellung der gesamt-genomischen Cosmid-Bibliothek

Zu Beginn des Neurospora crassa Genom-Projekts standen für die physikalische Kar-

tierung und anschliessende Sequenzierung weder die Cosmid-Bibliotheken aus den

USA noch die BAC-Bibliothek zur Verfügung. Deshalb wurde zunächst eine gesamt-

genomische Cosmid-Bibliothek hergestellt. Dazu wurde hochmolekulare genomische

DNA aus N. crassa isoliert, die anschliessend fragmentiert und in einen Cosmid-Vektor

kloniert wurde.

Ergebnisse

50

genomische DNA

1 2

1 kb

10 kb

Präparation genomischer DNA aus N. crassa

Zellen von N. crassa-Mycel wurden in gefrorenem Zustand in einem Mörser aufge-

schlossen und durch Zugabe von SDS und Proteinase K lysiert. Nach Abtrennung der

Zellbestandteile durch Zentrifuation und der Entfernung von Proteinen durch Phenolex-

traktion wurde die genomische DNA mit Hilfe von Isopropanol gefällt (siehe 2.2.2.1.)

Ein Aliquot der genomischen DNA wurde gelelektrophoretisch in einem 1.5 %igem

Agarosegel überprüft.

Abb. 3.1: In Spur 1 wurde der Marker (SmartLadder) aufgetragen, Spur 2 enthält 500 ng genomi-sche DNA von N. crassa

Als hochmolekulare Bande oberhalb der 10 kb-Bande des Markers ist die genomische

DNA gut zu erkennen. Im unteren Bereich ist ein geringer Anteil an degradierter RNA

zu sehen. Die fluorimetrische Konzentrationsbestimmung ergab eine Konzentration von

580 µg/ml.

Klonierung der DNA von N. crassa in den Cosmid-Vektor pLawrist-4

Für die Herstellung der genomischen Cosmid-Bibliothek wurde der Vektor pLawrist-4

(de Jong et al., 1989) verwendet. Er besitzt neben zwei cos-Sequenzen des Bacteriopha-

gen λ , durch die das Verpacken der Cosmide in den Phagenkopf ermöglicht wird, ein

Kanamycin-Resistenzgen. Bei dem verwendeten Cosmid-Klonierungssystem wird zu-

nächst partiell fragmentierte DNA an linearisierte Cosmid-Vektorarme ligiert. Die Li-

gationsprodukte werden in vitro in λ-Phagenköpfe verpackt und in E. coli-Zellen trans-

fiziert. Nach erfolgreicher Transfektion werden die Cosmide über die cos-Sequenzen

zirkularisiert. Da in den Cosmid-Vektor nur Fragmente mit einer Länge von 28-44 kb

Ergebnisse

51

kloniert werden können, wurde die hochmolekulare genomische DNA zunächst mit der

Restriktionsendonuclease MboI fragmentiert. Der an der Schnittstelle enstehende 5`-

Überhang ist zu der BamHI-Schnittstelle des Cosmid-Vektors komplementär. Um

Fragmente im gewünschten Längenbereich zu erhalten, wurde die Restriktionshydroly-

se, kontrolliert über die Dauer der Reaktion, nur partiell durchgeführt (siehe 2.2.2.2.).

Gleichzeitig wird durch die partielle Durchführung der Restriktionshydrolyse gewähr-

leistet, dass überlappende DNA-Fragmente entstehen. Anhand dieser Überlappungen

können bei der physikalischen Kartierung benachbarte Fragmente identifiziert und ent-

sprechend ihrer Reihenfolge im Genom angeordnet werden. Nach der partiellen Re-

striktion wurden die DNA-Fragmente dephosphoryliert, um zu verhindern, dass es zur

Ligation zweier Fragmente kommen kann. Die zu verschiedenen Zeitpunkten abge-

stoppten Reaktionen wurden zur Bestimmung der idealen Reaktionsbedingungen über

ein Agarosegel analysiert.

Abb. 3.2: Spur M enthält den Marker (SmartLadder). In den folgenden Spuren sind die nach ver-schiedenen Zeiten abgestoppten Aliquots der Partialrestriktion aufgetragen: 1) 1min; 2)2min; 3) 3 min; 4) 4 min; 5) 5 min; 6) 8 min; 7) 30 min; 8) 60 min.

Während in Spur 1) und 2) noch die hochmolekulare Bande der genomischen DNA zu

sehen ist, erkennt man in den restlichen Spuren mit zunehmender Dauer der Restriktion

einen stetig grösser werdenden Anteil an niedermolekularem Abbauprodukten. Nach 30

min ist keine hochmolekulare DNA mehr sichtbar.

Für die Ligation der fragmentierten DNA in den Vektor pLawrist-4 (siehe 2.2.2.3.)

wurden die Reaktionen verwendet, die nach 3 min und 4 min abgestoppt wurden. Eine

Größenselektion der klonierten Fragmente wurde durch die anschliessende Verpackung

in λ-Phagen erreicht (siehe 2.2.2.4.), da in die Phagenköpfe nur klonierte Fragmente mit

1 2 3 4M 5 6 7 8

1 kb

10 kb

Ergebnisse

52

einer Länge von 28-44 kb verpackt werden können. Insgesamt wurden 10 Ligationsan-

sätze in Phagen verpackt und in frisch kultivierte E. coli-Zellen transfiziert. Nach Aus-

plattieren der Transfektionsansätze auf Agarplatten konnten ca. 4000 Klone identifiziert

werden. Da in einigen Bereichen der Agarplatten die Klondichte zu hoch war, um kon-

taminationsfrei einzelne Klone separieren zu können, konnten insgesamt nur 2600 Klo-

ne in Mikrotiterplatten überführt werden. Die so gewonnene pLawrist-4-Bibliothek

wurde aus Sicherheitsgründen wie in 2.2.1. beschrieben mehrmals kopiert.

Herstellung von DNA-Filtern

Die 2.600 Klone der pLawrist-4-Bibliothek wurden zusammen mit den 12.000 Klonen

der pLORIST6Xh-Bibliothek auf 22x22 cm grosse Nylonmembranen im 4x4-Raster

transferiert. Dabei wurden nur 5/6tel des Filters beansprucht (siehe 2.2.3.). Die 4.800

Klone der pMOcosX-Bibliothek wurden wegen ihrer abweichenden Antibiotika-

Resistenz ebenfalls im 4x4-Raster separat auf Nylonmembranen transferiert. Da hierfür

nur ein Drittel eines Filters beansprucht wurden, konnte die Bibliothek insgesamt in

dreifacher Kopie je Nylonmembran aufgebracht werden.

3.1.2. Selektion chromosomenspezifischer Cosmid-Bibliotheken

Für das physikalische Kartieren der Chromosomen II und V war es zunächst erforder-

lich, aus den gesamt-genomischen Bibliotheken für jedes Chromosom spezifische Sub-

Bibliotheken zu selektionieren. Dies erfolgte im Fall der Cosmid-Bibliothek durch Hy-

bridisierung von chromosomaler DNA auf Filter, die die gesamt-genomische Cosmid-

Bibliothek enthielten. Die Klone mit positivem Hybridisierungsergebniss wurden dann

als Chromosom II– bzw. Chromosom V-spezifisch identifiziert. Die für die Hybridisie-

rung verwendete chromosmale DNA, die von Dr. U. Schulte zur Verfügung gestellt

wurde, war durch Auftrennen genomischer DNA in einem Pulsfeldgel und Ausschnei-

den der entsprechenden Banden von Chromosom II bzw. Chromosom V erhalten wor-

den.

Cosmid-Bibliothek Chromosom II

Durch die Hybridisierung DNA von Chromosom II, die durch Replikation ausgehend

von Hexamer-Oligonukleotiden ("random hexamer priming") radioaktiv markiert wor-

den war, auf die gesamt-genomische Cosmid-Bibliothek und die anschliessende Aus-

Ergebnisse

53

wertung der Autoradiographien konnten insgesamt 1369 Klone als Chromosom II-

spezifisch identifiziert werden (siehe Abb. 3.3). Diese wurden unterschieden in 864

Klone mit starker Signalintensität und 505 Klone mit schwacher Signalintensität. Die

Stärke der Signalintensität hängt unter anderem vom Überlappungsgrad von Sonde und

Probe ab, aber auch von der auf dem Filter gebundenen DNA-Menge. Die Klonanzahl

entspricht bei einer durchschnittlichen Insert-Länge von 34 kb (Kelkar et al., 2000) ei-

ner 10fachen statistischen Abdeckung des 4,6 Mb grossen Chromosoms. Da die Ge-

samt-Bibliothek eine Abdeckung von 17 Genomäquivalenten hat, wurden mit grosser

Wahrscheinlichkeit nicht alle Klone, die zu Chromosom II gehören, durch die Hybridi-

sierung identifiziert. Für die Anfangsphase der physikalischen Kartierung war diese

Sub-Bibliothek dennoch ausreichend.

Abb. 3.3: Selektion der Chromosom II-Sub-Bibliothek durch Hybridisierung radioaktiv-markierter chromosomaler DNA auf die genomische Cosmid-Bibliothek. Gezeigt ist ex-emplarisch die Hybridisierung auf den Filter, der die 14.600 Klone der pLawrist-4- undder pLORIST6Xh-Bibliothek enthält.

Die Klone wurden nach Signalintensität getrennt in insgesamt sechs Mikrotiterplatten

im 384er Format überführt. Im weiteren Verlauf wurden für diese Klone nicht mehr die

ursprünglichen Bezeichnungen aus der gesamt-genomischen Bibliothek verwendet,

sondern die Namen entsprechend ihrer Positionierung in den Mikrotiterplatten der

Chromosom II-spezifischen Cosmid-Bibliothek.

Ergebnisse

54

Cosmid-Bibliothek Chromosom V

Analog zur Selektion der Chromosom II-spezifischen Cosmid-Bibliothek wurde DNA

von Chromosom V radioaktiv markiert und auf die gesamt-genomische Cosmid-

Bibliothek hybridisiert. Durch Auswertung der Autoradiographien konnten insgesamt

2163 Klone identifiziert werden, was statistisch einer 8,5 fachen Abdeckung der 9,2 Mb

des Chromosoms entspricht. Auch hier lag die theoretische Abdeckung deutlich unter

der 17-fachen Abdeckung der genomischen Bibliothek, folglich wurden nicht alle

Chromosom V-Klone durch die Hybridisierung selektiert. Diese Sub-Bibliothek wurde

dennoch als Basis für die physikalische Kartierung eingesetzt. Die Klone wurden unter-

schieden in 778 Klone mit starker Signalintensität und 1385 Klone mit schwacher Si-

gnalintensität und entsprechend dieser Unterscheidung getrennt in insgesamt sieben

Mikrotiterplatten im 384er Format überführt. Die Benennung der Klone erfolgte auch

hier im folgenden nach den Koordinaten der Mikrotiterplatten der Chromosom V-

spezifischen Cosmid-Bibliothek.

Herstellung von DNA-Filtern der Cosmid-Sub-Bibliotheken

Die Klone der chromosomenspezifischen Cosmid-Bibliotheken wurden auf Nylon-

Membranen im 4x4-Raster transferiert. Entsprechend ihrer Antibiotika-Resistenz wur-

den die pMOcosX-Klone getrennt von den pLawist-4- und den pLORIST6Xh-Klonen

auf die Membranen aufgebracht. Für jedes Chromosom erhielt man deshalb zwei 7x11

cm grosse Filter.

3.1.3. Selektion Chromosom II-spezifische BAC-Bibliothek

Da die BAC-Bibliothek erst zu einem späteren Zeitpunkt zur Verfügung stand, an dem

die Kartierung von Chromosom V auf Cosmid-Ebene schon weit fortgeschritten war,

wurde darauf verzichtet, eine Chromosom V-spezifische BAC-Bibliothek zu selektie-

ren. Dagegen wurde für die Kartierung von Chromosom II eine Auswahl der Chromo-

som II-spezifischen BAC-Klone vorgenommen.

Da für eine Hybridisierung von chromosomaler DNA analog zu 3.1.2. nicht mehr genü-

gend Material vorhanden war, wurde zur Selektion der chromosomenspezifischen BAC-

Bibliothek eine andere Strategie gewählt: 190 zufällig ausgewählte Klone der Chromo-

som II-spezifischen Cosmid-Bibliothek wurden mit Digoxigenin-11-dUTP markiert und

auf die gesamt-genomische BAC-Bibliothek hybridisiert. Dadurch konnten insgesamt

Ergebnisse

55

751 BAC-Klone identifiziert werden, die in 2 Mikrotiterplatten im 384er Format über-

führt wurden. Durch die Hybridisierung weiterer Chromosom II-spezifischer Cosmid-

Klone konnten keine neuen BAC-Klone identifiziert werden, so dass man die Selektion

nach der Hybridisierung von 190 Cosmid-Sonden beendete. Bei einer durchschnittli-

chen Insertgrösse von 69 kb hat die Chromosom II-spezifische Bibliothek eine 11-fache

theoretische Abdeckung.

Herstellung von DNA-Filtern der BAC-Sub-Bibliothek

Die Klone der Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek wurden im 2x2-Raster auf

je ein Feld der 22x22 cm grossen Nylon-Membranen transferiert.

3.1.4. Präparation von Cosmid-DNA

Die als Sonde für die physikalische Kartierung verwendete Cosmid-DNA wurde durch

alkalische Lyse der E. coli-Wirtszellen und anschliessender Phenol-Extraktion wie in

2.2.6. beschrieben präpariert. Ein Aliquot der Ansätze wurde nach Restriktionshydroly-

se auf einem Agarosegel elektrophoretisch hinsichtlich Qualität und Ausbeute der prä-

parierten Cosmid-DNA überprüft.

Abb. 3.4: Spur M enthält den Marker (SmartLadder). In den Spuren 1)-12) wurde die DNA von 12zufällig ausgewählten Cosmid-Klonen aufgetragen.

Das Gel zeigt, dass die DNA in allen 12 Ansätzen seine ausreichende Reinheit aufwies,

um von der Restriktionsendonuklease EcoRI hydrolysiert zu werden. In einigen weni-

gen Fällen konnte bei der Cosmid-DNA-Präparation nur sehr wenig (siehe Spur 2 in

Abb. 3.4) oder gar keine DNA isoliert werden. Dies traf aber nur bei etwa 1% aller prä-

parierten Cosmid-Klone zu.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 kb

10 kb

Ergebnisse

56


Während Cosmid-Vektoren in bis zu 50-facher Kopie pro E. coli-Zelle vorkommen,

liegen BAC-Vektoren nur in ein- bis maximal zweifacher Kopie vor. Bei gleichem

Ausgangsvolumen an Bakterienkultur ist die Ausbeute an Vektor-DNA bei einer BAC-

DNA-Präparation daher sehr viel geringer als bei einer Cosmid-DNA-Präparation.

Durch einige Modifikationen konnte das bestehende Protokoll für den QIAprep® Spin

Miniprep Kit soweit optimiert werden, dass bei geringem Zeitaufwand eine höhere

Ausbeute an BAC-DNA als durch herkömmliche Minipräparationsprotokolle erhalten

werden konnte. Neben der Verwendung eines grösseren Volumens an Bakterienkultur,

der Steigerung der verwendeten RNase A-Konzentration und dem Austausch eines im

Kit enthaltenen Puffers war vor allem die Fragmentierung der BAC-DNA durch die

Restriktionsendonuklease EcoRI vor dem Auftrag auf die Anionenaustauscher-Säulen

ein wichtiger Optimierungsschritt, da die Elution kleinerer Fragmente wesentlich effizi-

enter ist als die der intakten BACs. Von jedem Ansatz wurde ein Aliquot gelelektropho-

retisch auf Qualität und Ausbeute der BAC-DNA überprüft.

Abb. 3.5: Das Gel zeigt die DNA von vier zufällig ausgewählten BAC-Klonen. Spur M enthält denMarker (SmartLadder). Die Spuren a)-d) zeigen die DNA, die durch Präparation nachdem modifiziertem Protokoll gewonnen wurde (siehe 2.2.7.), die Spuren A)-D) zeigen dieDNA nach Präparation durch das herkömmliche Protokoll des QIAprep® Spin MiniprepKits.

Deutlich auf dem Gel zu sehen ist die erheblich geringere DNA-Menge in den Spuren

A)-D). In den Spuren a)-d) ist im niedermolekularen Bereich degradierte Bakterien-

RNA zu sehen, die trotz erhöhter Zugabe von RNaseA noch vorhanden ist.

M Ma b c d A B C D

1 kb

10 kb

Ergebnisse

57

3.1.6. Physikalische Kartierung

Zur physikalischen Kartierung durch Hybridisierung werden einzelne Klone auf die

Filter der zu kartierenden Klon-Bibliothek hybridisiert. Anhand der Hybridisierungsmu-

ster können Klone mit überlappenden Sequenzen identifiziert werden. Daraus ergibt

sich eine relative Anordnung der Klone zueinander, die eine sequenzabhängige Rekon-

struktion des zu kartierenden DNA-Abschnitts darstellt.

Hybridisierung

Die Hybridisierungen zur Kartierung wurden in der Anfangsphase mit radioaktiv mar-

kierten Sonden durchgeführt (siehe 2.2.8.). Hinsichtlich einer vereinfachten Handha-

bung wurde jedoch bald dazu übergegangen, die Sonden mit Digoxigenin zu markieren

und über Chemilumineszenz zu detektieren (siehe 2.2.9.). Die Markierung sowohl der

radioaktiv markierten als auch der mit Digoxigenin markierten Sonden erfolgte durch

Replikation der Sonden-DNA, wobei mit Hilfe einer DNA-Polymerase ausgehend von

Hexamer-Oligonukleotiden entsprechend markierte Nukleotide eingebaut wurden

("random hexamer priming"). Die Detektion der durch radioaktive Sondenmarkierung

erhaltenen Signale erfolgte auf Röntgenfilmen, die durch radioaktive Strahlung ge-

schwärzt werden. Für die Detektion der mit Digoxigenin-markierten Sonden wurden die

Klon-Filter nach entsprechenden Wasch- und Blockierungsschritten in einer Antikör-

perlösung inkubiert. Dieser gegen Digoxigenin gerichtete Antikörper war mit alkali-

scher Phosphatase konjugiert. Nach Bindung des Antikörpers wurden die Filter kurz in

einer Lösung mit dem chemilumineszenten Substrat CSPD® inkubiert. Die alkalische

Phosphatase reagiert mit CSPD®, wobei dieses zerfällt und Energie in Form von Licht

freisetzt. Dieses Licht kann durch die Schwärzung von speziellen Lumi-Filmen detek-

tiert werden.

Als Sonden wurden ausschliesslich Klone der Cosmid- und BAC-Bibliotheken ver-

wendet.

Ergebnisse

58

Abb. 3.6: Hybridisierung auf Klonfilter. Exemplarisch sind gezeigt A) die Hybridisierung einerradioaktiv markierten Cosmid-Sonde auf einen Filter der Cosmid-Sub-Bibliothek vonChr. V und B) die Hybridisierung einer mit Digoxigenin markierten BAC-Sonde auf diegenomische BAC-Bibliothek (Ausschnitt).

Auswertung

Die Autoradiographien bzw. die durch Chemilumineszenz belichteten Filme wurden

manuell ausgewertet. Dazu wurden mit Hilfe einer transparenten Rastervorlage, die auf

den Film gelegt wurde, die Koordinaten der Klone mit positivem Signal bestimmt. Ein

Klon wurde nur dann als positiv gewertet, wenn beide zum Klon gehörenden Signale

positiv waren. Die Herkunftsplatte der Klone ergab sich aus der relativen Anordnung

der beiden Doppel-Signale zueinander (siehe Abb. 2.1). Anhand der Platten-Nummer

und der Koordinaten konnten die Klone eindeutig identifiziert werden. Eine Betrach-

tung der Signalintensität war insofern für die Auswertung irrelevant, da nur zwischen

positivem und nicht-positivem Signal unterschieden wurde. Für jede Hybridisierungs-

sonde wurde eine eigene Textdatei erstellt, die mit dem Namen der Sonde bezeichnet

wurde und die Namen aller Klone mit positivem Hybridisierungssignal für diese Sonde

beinhaltete. Diese Textdateien dienten als Berechnungsgrundlage für das Softwarepaket

AA)

B)

Ergebnisse

59

"Contig" (Mott et al., 1993). Aus der Anzahl von gemeinsam getroffenen Klonen wur-

den für jede mögliche Sondenpaarkombination Distanzwerte berechnet (siehe 2.2.10.).

Anschliessend wurde die Sondenreihenfolge kalkuliert, die den kleinsten Wert für die

Gesamtdistanz aufweist. Anhand dieser Sondenreihenfolge wurden die Klone einem

zweiten Schritt entsprechend ihrem Hybridisierungsmuster angeordnet. Die Darstellung

der so berechneten physikalischen Karte erfolgte in einer zweidimensionalen Matrix.

Die Sonden sind in den Zeilen dargestellt, die Spalten beinhalten, dargestellt durch

schwarze Balken, die bei der Hybridisierung der jeweiligen Sonde positiven Klone

(Abb. 3.8).

Kartierungsstrategie Chromosom II

Folgende Bibliotheken wurden für die physikalische Kartierung von Chromosom II

verwendet:

Tabelle 3.2: Bibliotheken, die zur physikalischen Kartierung von Chr. II verwendet wurden

Bibliothek Anzahl KloneInsertgrösse

(Durchschnitt)

Beispiel für

Klonbenennung

Chr.II-Cosmid-Bibliothek

Genomische Cosmid-Bibliothek

1369

19.40034 kb

1k20

1a9g

Chr. II-BAC-Bibliothek

Genomische BAC-Bibliothek

2163

921669 kb

3d7bac

9a16bac-g

Für die Kartierung von Chromosom II wurde anfangs sowohl die Chromosom II-

spezifische BAC-Bibliothek als auch die Chromosom II-spezifische Cosmid-Bibliothek

verwendet (siehe Abb. 3.7). Zunächst wurden nur BAC-Klone als Sonden verwendet.

Die Sonden wurden fortlaufend aus den Mikrotiterplatten, beginnend mit Mikrotiter-

platte 1, ausgewählt, wobei ab der zweiten Hybridisierungsrunde nur diejenigen Klone

als Sonde verwendet wurden, die in den vorherigen Hybridisierungsexperimenten noch

kein positives Signal aufwiesen. Durch dieses als "sampling without replacement" be-

zeichnete Verfahren wurde ermöglicht, dass nach nur 50 Hybridisierungen 96 % der

Klone in mindestens einer Hybridisierung detektiert werden konnten. Anschliessend

wurden sowohl aus der Cosmid- als auch aus der BAC-Sub-Bibliothek solche Klone als

Sonde ausgewählt, die in der physikalischen Karte am Rand von Bereichen zusammen-

Ergebnisse

60

hängender Klone (="contigs") lagen, um eventuelle Anschluss- oder Verbindungsklone

zu anderen contigs zu finden. Als keine signifikanten Fortschritte beim Schliessen der

Lücken mehr erzielt werden konnten, wurden die Sonden nicht mehr auf die Sub-

Bibliotheken, sondern auf Filter mit den gesamt-genomischen Bibliotheken hybridisiert.

Somit sollte sichergestellt werden, dass auch diejenigen Chromosom II-Klone detektiert

werden, die bei der Selektion der Sub-Bibliotheken nicht erfasst worden waren.

Abb. 3.7: Kartierungsstrategie Chromosom II

Nach der Hybridisierung von insgesamt 191 BAC-Klonen und 273 Cosmid-Klonen

resultierte schliesslich eine physikalische Karte, die nur noch 13 contigs beinhaltete. Die

relative Anordnung der einzelnen contigs zueinander erfolgte durch den Vergleich mit

der genetischen Karte (Perkins et al., 2000). Dabei wurden die contigs so angeordnet,

dass die Reihenfolge der durch Sequenzanalyse einzelner Klone gefundenen Gene mit

der Reihenfolge der Genloci in der genetischen Karte übereinstimmt.

1.) „sampling without replacement“

2.) Schliessen der Lücken mit Sub-Bibliotheken

ca. 50 contigs

ca. 20 contigs

genomische BAC-Bibliothek

genomische Cosmid-Bibliothek

3.) Schliessen der Lücken mit genomischen Bibliotheken

13 contigs

Klone BAC-Chr.II-Bibliothek

BAC-Chr.II-Bibliothek

Cosmid-Chr.II-Bibliothek

Hybridisierung

Klone an contig-Rändern(BACs oder Cosmide)

BAC-Chr.II-Bibliothek

Cosmid-Chr.II-Bibliothek

Hybridisierung


Hybridisierung

Ergebnisse

61

Abb. 3.8: Physikalische Karte von Chromosom II. Die Sonden sind in den Spalten dargestellt, diebei ihrer Hybridisierung positiven Klone als schwarze Balken in den Spalten. Oberhalbder physikalischen Karte ist die genetische Karte (Perkins et al., 2000) gezeigt.

2g19

1

1k

20

3

2f17

bac

5

1p

12ba

c

7

2l11

bac

9

1f

17ba

c 1

1

1h9b

ac

13

1c15

abac

15

3j

18

17

2j24

bac-

g 1

9

1h5b

ac

21

1g7b

ac

23

1d2b

ac

25

1l24

27

5b

5 2

9

X3l

10g

31

3n

24

33

1o6p

3 3

5

1o8

37

16

f19b

ac-g

39

1g

16ba

c 4

1

1b1a

bac

43

1o

16

45

1o13

47

1b

17

49

1l9b

ac

51

2h23

bac

53

7k

22ba

c-g

55

1e

6bac

57

1o

17

59

1o12

61

2c

18

63

1i15

bac

65

2c

19ba

c 6

7

6c6

69

1j

8 7

1

1l16

bac

73

1a

24

75

2a13

bac

77

1d

16ab

ac

79

1a9g

81

9a

16ba

c-g

83

1k

6bac

85

1k

15p2

87

1i

11ba

c 8

9

1k17

91

1n

9bac

93

2a

13

95

X6l

13g

97

2

1o2

4

3a1

1

6 1

b19b

ac

8 1

c2ba

c

10 1

c12

12

1l1

7

14 1

k2

16 1

b10

18

1f1

9bac

20

1i1

6bac

22

1b1

2

24 1

n8

26 1

0m7g

28

1i1

3a

30 1

m8

32

7j1

9bac

-g

34 1

b1

36 1

d12b

ac

38 1

c10

40

1m

20ba

c

42 2

c16b

ac

44 1

p23b

ac

46 1

n14b

ac

48 2

g1ba

c

50 1

6g14

g

52 2

g12

54

1h1

bac

56

1i5

bac

58

6e3

60

1m

10

62 1

i1ba

c

64 2

4n4b

ac-g

66

1n2

2

68 1

f1ba

c

70 2

h18b

ac

72 1

c16

74

1m

24ba

c

76 2

d10

78

1a1

3bac

80

1n1

6bac

82

1e8

a

84 2

e8ba

c

86 5

a24a

88

5o2

2bac

-g

90 G

1o19

g

92 1

e18

94

G4i

18g

96

1p1

5

mus

-23

arg-

5, a

ro-3

het-

6

ro-7

leu-

6

leu-

6: B

etw

een

trp-

3 an

d Te

l-II

R

Ergebnisse

62

Kartierungsstrategie Chromosom V

Für die physikalische Kartierung von Chromosom V wurden folgende Klon-

Bibliotheken verwendet:

Tabelle 3.3: Bibliotheken, die zur physikalischen Kartierung von Chr. V verwendet wurden

Bibliothek Anzahl KloneBeispiel für Klon-

benennung

Chr.V-Cosmid-Bibliothek

Genomische Cosmid-Bibliothek

1369

19.400

4g12

8c4g

Genomische BAC-Bibliothek 9216 1c16bac-g

Die physikalische Kartierung von Chromosom V wurde zunächst ausschliesslich mit

der Chromosom V-spezifischen Cosmid-Bibliothek durchgeführt. Analog zur Kartie-

rung von Chromosom II wurden, nachdem alle Klone mindestens in einer Hybridisie-

rung ein positives Signal gezeigt hatten, Klone an contig-Enden als Sonden verwendet

(Abb. 3.9). Als nach über 1000 Hybridisierungen die sehr grosse Anzahl von über 100

contigs nicht weiter reduziert werden konnte, wurde dazu übergegangen, die Sonden auf

die gesamt-genomische Cosmid- und BAC-Bibliothek zu hybridisieren. Dadurch konnte

die Zahl der contigs in der physikalischen Karte von Chromosom V letztendlich auf 21

reduziert werden.

Ergebnisse

63

Abb. 3.9: Kartierungsstrategie Chromosom V

Insgesamt wurden 1192 Cosmid-Klone und 82 BAC-Klone als Sonden verwendet.

Auch hier wurden die contigs relativ zueinander angeordnet, indem die Reihenfolge von

Klonen, die durch Sequenzanalyse identifizierte Gene enthielten, mit der Reihenfolge

dieser Genloci in der genetischen Karte (Perkins et al., 2000) verglichen wurde.

1.) „sampling without replacement“

2.) Schliessen der Lücken mit Sub-Bibliotheken

ca. 100 contigs

ca. 40 contigs

genomische BAC-Bibliothek

genomische Cosmid-Bibliothek

3.) Schliessen der Lücken mit genomischen Bibliotheken

21 contigs

Klone Cosmid-Chr.V-Bibliothek

Cosmid-Chr.V-Bibliothek

Hybridisierung

Klone an contig-Rändern(Cosmide)

Cosmid-Chr.V-Bibliothek

Hybridisierung


Hybridisierung

Ergebnisse

64

Abb. 3.10: Physikalische Karte von Chromosom V. Oberhalb der physikalischen Karte ist die gene-tische Karte (Perkins et al., 2000) gezeigt.

4k1

3

1

4o12

3

5a

1

5

4k2

3

7

7d19

bac

9

5n

16

11

3b14

13

6c

5 1

5

4n1

17

2f

24

19

4l1

7 2

1

7h2

23

5d

2

25

1n12

27

3c

8 2

9

3p15

31

3n

19

33

7f24

35

1e

18

37

1k1

a 3

9

5b13

41

5i

2

43

1p19

45

4b

24

47

7j1

4 4

9

1a23

51

1b

10

53

4d2

55

13

l16

bac

57

1

k10

59

5

i23

61

7a

14

63

4b15

65

5n

13

67

6d12

69

3g

15ba

c 7

1

6b23

73

5k

7 7

5

5e11

77

1b

18

79

4h13

81

8k

1bac

8

3

4n1

bac

85

3e

7

87

7g9

89

7a

12

91

6f16

93

4d

4

95

5i1

1 9

7

5l4b

ac

99

5k

10

101

7

b24

103

2

a18

105

1f

1 1

07

4m23

109

4

h17

111

6

c8 1

13

5f5

115

3h

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17

4a4b

ac

119

3o

6 1

21

7a4

123

2

e24

125

4p

6 1

27

3l1

129

7

k9 1

31

5p20

bac

133

1

e16

135

1d

4 1

37

1n2

2 1

39

2b1

4 1

41

10i5

bac

143

3

l24

145

3

n18

147

1f

14ba

c 1

49

X4i

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151

6f

13 1

53

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ac

155

5

k2 1

57

7i4

159

3o

9 1

61

4f15

163

3

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165

4

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167

4

l18

169

7c

12

171

4

b14

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4f

13 1

75

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9 1

77

3d12

bac

179

7

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183

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21

185

4j

3bac

18

7

5m7

189

5

h19

191

4h

19ba

c 1

93

4o9b

ac

195

5b

7 1

97

12l8

bac

199

2

4f2

bac

4

2e1

2

6 5

l4

8 5

l5

10 1

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12

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5

14 6

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16 1

m20

18

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1

20 1

l16

22

6l1

8bac

24

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26

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3

28 4

j24

30

1d1

2

32 7

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34 3

b17

36

4c6

38

1l9

40

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1

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44 3

c12

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7

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66

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68

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1 1

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c 1

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3

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2

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arg-

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1%;

11%

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; 4%

)er

g-2:

Lef

t of i

nl (

6%)

sod-

2: L

inke

d to

cyh

-2

Ergebnisse

65

3.1.7. Sequenzanalyse

Bisher wurden bei MWG Biotech AG 3,5 Mb von Chromosom II und 4,2 Mb von

Chromosom V sequenziert. Das entspricht 76% von Chromosom II und 46% des

Chromosom V. Die Assemblierung und Annotierung der Sequenzdaten erfolgte bei

MIPS (Martinsried Institute for Protein Sequences).

Bei der Analyse der bisher erhaltenen Sequenzen von Chromosom II und V konnten

insgesamt 2256 offene Leserahmen (engl. „ORF“= open reading frame) identifiziert

werden (http://www.mips.biochem.mpg.de/proj/neurospora/). Durch ausführliche Da-

tenbankvergleiche erfolgte eine Klassifikation der ORFs entsprechend ihrer Homologie

zu bereits bekannten Proteinen nach einem bei MIPS entwickelten System in sechs

Klassen. Danach konnten 94 ORFs (4%) einem bekanntem Protein zugeordnet werden,

41 davon auf Chromosom II, 53 auf Chromosom V (G. Mannhaupt, persönl. Mittei-

lung). Diese sind in den Tabellen 3.4 und 3.5 aufgeführt. Von diesen bekannten Protei-

nen haben nur 19 einen kartierten Gen-Locus auf Chromosom II, 25 sind als Locus auf

Chromosom V kartiert (Perkins et al., 2000).

Tabelle 3.4: Gene, die bei der Sequenzanalyse auf Chromosom II lokalisiert wurden

Klon/contigLänge

(Amino-

säuren

Beschreibung Gen-Locus

bac24m22 792 Vermutlich C6 Zink-Cluster Transkriptionsfaktorbac24m22 412 homolog zu Alkohol-Dehydrogenase bli-4bac23h20 977 Glycin-reiches Protein het-CORbac23h20 571 RNA-Splicingfaktor pad-1bac23h20 397 Orotidin-5-phosphatdecarboxylase pyr-4bac23b10 115 Vacuolare ATP-Synthase, Untereinheit Gbac23b10 1287 DNA-abhängige RNA-Polymerase II RPB140bac10k17 1132 Leucin-tRNA-Ligase, cytosolischbac10k17 449 alpha-Tubulin Bbac11o9 760 rekombinatorisches Reparatur-Protein mus-23bac12n19 572 Aminosäurenpermease NAAP1bac17c10 744 NADH-Dehydrogenase (Ubichinon) 78K-Ketten-Vorläuferbac17c10 439 Actin-verwandtes Protein 3 arp3bac18e6 646 Hitzeschockprotein 70 hsp70bac19c19 290 Ribosom-assoziiertes Protein Rap-1bac19c19 364 H+-transportierende ATPase, Vakuole, 41 kDa-Untereinheitbac1d1 920 H+-transportierende ATPasebac1d1 469 mitochondriale Citratsynthasebac22k18 313 ADP,ATP carrier-Proteinbac23d6 667 Acetyl-CoA-synthetase

Ergebnisse

66

Fortsetzung Tabelle 3.4

bac24h17 483 negativer Regulationfaktor pregbac2a19 929 Ribonucleosid-Diphosphatreductase, grosse Kette un-24bac2a19 236 regulatorisches Protein cys-3bac2a19 680 Heterokaryon Inkompatibilitäts-Protein het-6ORbac2a19 297 3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein]-reductase oar-1bac2g14 490 c-14 Sterolreductase erg-3bac2g14 93 Conidiationsprotein 6 con-6bac5o22 626 Glucan-1,4-alpha-glucosidasebac7f21 432 Chorismatsynthase/Flavinreductase, NADPH-abhängigbac7f21 353 Deoxyhypusinsynthasebac7k22 103 Histon H4bac7k22 136 Histon H3bac7n14 644 Actin-verwandtes Protein ro-7bac7n14 454 Ubichinol-Cytochrom C-reductase Komplex Protein 2-Vorläuferbac8b20 171 Cytochrom C-Oxidase, Kette V-Vorläuferbac8b20 519 H+-transportierende ATP-Synthase (EC 3.6.1.34), beta-Kettebac8b8 354 Allantoicasebac8j24 856 Vacuolare ATP-Synthase, 98 Kda-Untereinheitbac8l21 1300 Dynactin (150 KDa Dynein-assoziiertes Polypeptid) ro-3bac9g16 338 Glyceraldehyd- 3-phosphatdehydrogenase ccg-7bac9j10 203 GTP-bindendes Protein ypt1

Tabelle 3.5: Gene, die bei der Sequenzanalyse auf Chromosom V lokalisiert wurden

Klon/contigLänge

(Amino-

säuren)

Beschreibung Gen-

Locus

12f11 161 H+-transportierende ATPase, Lipid-Bindeprotein2e4 548 Isocitratlyase acu-32e4 624 Mitochondriales Vorläufer-Protein, Import-Rezeptor tom702e4 380 Centractin ro-4g65a3 888 Chitinsynthase 3 chs-318a7 927 Transkriptionsaktivator-Protein acu-1565e11 324 Regulator der Conidiation rca-121d9 152 Nucleosiddiphosphatkinase18f11 245 Mangansuperoxid-Dismutase, Vorläufer sod-218f11 607 H+-transportierende ATPase, vacuolar, 67K-Kette18f11 454 Glutamatdehydrogenase NADP+g15d1 744 neutrale Trehalase alpha,alpha-Trehaloseglucohydrolase15e11 668 alkalische Phosphatasebac8g12 197 Dynactin Arp1 p25-Untereinheit RO1264c2 661 Clock-controlliertes Gen 8 ccg-893g11 71 Glucose-repressierendes Protein grg-117e5 369 vermutlich Protein-Disulfidisomerase-Vorläufer

Ergebnisse

67


bac11n2 229 RAS-2 Protein9g6 256 C-8 Sterolisomerase erg-19g6 705 Hitzeschockprotein 80 hsp809g6 120 FK506-Bindeprotein FKBPbac7h23 283 mitochondriales Porinbac7h23 301 60S-ribosomales Protein L594c8 149 Calmodulinbac8l3 600 Doppelstrangbruch-Reparaturprotein mus-11bac10h4 1646 cpc-3-Protein cpc-3bac10h4 349 mitochondrialer Importrezeptor MOM38g15g9 153 Ribonuclease T15e6 656 UV-Endonuclease uve-1bac11o8 797 Komplex I-Intermediat-assoziiertes Protein CIA84, Vorläufer20h10 202 NADH-Dehydrogenase Ubichinon 29/21K-Ketten-Vorläufer20h10 107 Ubichinol-Cytochrome-C-Reductase, Kette VIII123a4 347 Farnesylpyrophosphatsynthetase123a4 263 NADH-Ubichinon-Oxireductase, 24 kDa-Untereinheit-Vorläufer nuo24123a4 385 CAMP-abhängige Proteinkinase, regulatorische Kette mcb123a4 1032 Transkriptions-Elongations-Komplex, Untereinheit CDC68bac14a6 503 S-Adenosylmethionindecarboxylase spe-2bac14a6 696 L-Aminosäure-Oxidase7f4 706 Glycogensynthase99h12 517 Phosphoprotein-phosphatase, 3-alpha katalytische Kette99h12 149 ribosomales Protein L27a.e99h12 375 Formatdehydrogenase99h12 994 Leucin-tRNA-Ligase-Vorläufer, mitochondrialbac11h24 402 Ketol-Säure-Reductoisomerase ilv-2bac11h24 917 Chitinsynthase 1 chs-1bac11h7 291 Spermidinsynthase spe-3bac11h7 355 G-protein, alpha-Kettebac13o20 532 1,3-beta-Glucansynthasebac7a16 375 Actinbac7a16 488 Stickstoff-Metabolismus-Regulationsprotein nmrbac8p8 428 Farnesyltranstransferase al-3bac8p8 142 Clock-controlliertes Gen 6 ccg-6bac8p8 643 Ascosporen-Maturation-1-Protein Asm-1

Von den übrigen identifizierten offenen Leserahmen weisen 644 ORFs (29%) Ähnlich-

keit mit einem bekannten Protein auf, weitere 242 ORFs (11%) haben sogar eine grosse

Ähnlichkeit mit einem bekannten Protein. Ähnlichkeit mit einem unbekanntem Protein

war bei 568 ORFs (25%) zu finden, Ähnlichkeit mit einem nicht näher charakterisierten

EST bei 115 ORFs (5%). Bei 592 ORFs (26%) konnte keinerlei Homologie zu bereits

bekannten Proteinen festgestellt werden, hier handelt es sich also um völlig neue Gene.

Ergebnisse

68

Abb. 3.11: Klassifikation der bisher identifizierten offenen Leserahmen auf Chr. II und V nachihrer Homologie.

Eine Klassifikation der vorhergesagten offenen Leserahmen hinsichtlich ihrer Protein-

funktion ergab, dass ca. 12% (264) für den Stoffwechsel zuständig sind, 2% (46) für den

Energiehaushalt, 7% (160) für Zellwachstum, Zellteilung und DNA-Synthese, 7% (153)

für die Transkription und 3% (59) für die Proteinsynthese. 52% (1177) sind bisher nicht

klassifiziert, die restlichen Proteine übernehmen Funktionen wie zelluläre Organisation,

Signaltransduktion, Transportmechanismen oder Zellverteidigung, Alterungsprozesse

und Zelltod (17%).

Untersuchungen der bisher sequenzierten Genom-Abschnitte ergaben, dass die Gen-

dichte bei etwa 4 kb pro Gen liegt (G. Mannhaupt, mündliche Mitteilung; Nelson et al.,

1997). Legt man die daraus folgenden Schätzungen zugrunde, dass sich die Gesamtzahl

der Gene von N. crassa auf etwa 10-12.000 Gene beläuft, wurden auf den Chromoso-

men II und V, die zusammen etwa ein Drittel der Länge des Genoms ausmachen, bisher

zwischen 19 und 23% aller Gene identifiziert. Da aber weder die vollständige Sequenz

beider Chromosomen vorliegt, noch alle vorliegenden Sequenzen analysiert und anno-

tiert wurden, ist diese Zahl zum gegenwärtigen Zeitpunkt bei weitem nicht vollständig.

Desweiteren ergab sich, dass bei 75% der untersuchten Gene kein oder nur ein Intron

gefunden wurde. Diese Introns weisen eine durchschnittliche Länge von 50-100 kb auf.

Die eingehendere Analyse der Gene mit bisher unbekannter Funktion, in denen sich N.

crassa von allen bisher sequenzierten Organismen, vor allem aber auch von der sehr

nah verwandten Hefe S. cerevisiae unterscheidet, lässt viele neue Erkenntnisse über die

Biologie filamentöser Ascomyceten erwarten.

4%

26%

5%

29%

25%

11%

bekanntes Protein

keine Ähnlichkeit

Ähnlichkeit mit EST

Ähnlichkeit mitbekanntem Protein

Ähnlichkeit mitunbekanntem Protein

grosse Ähnlichkeit mitbekanntem Protein

Ergebnisse

69


Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Genexpressionsanalysen mit Hilfe der

DNA-Chip-Technologie durchgeführt. Ausgehend von einer cDNA-Bibliothek, die vom

amerikanischen Neurospora Genome Project zur Verfügung gestellt wurde, wurden

DNA-Chips hergestellt. Für die Genexpressionsanalysen wurden exemplarisch drei ver-

schiedene Wachstumsbedingungen für Mycel von N. crassa ausgesucht. RNA-Proben

aus diesen Mycelien wurden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und

paarweise auf die Chips hybridisert. Durch intensive bioinformatische Analyse der Hy-

bridisierungsdaten wurden die Transkriptionsprofile der Proben erstellt und in einer

Korrespondenz-Analyse miteinander verglichen.

Darüberhinaus wurde auf dem N.crassa-DNA-Chip eine Probe aus S. cerevisiae mit

einer Probe aus N. crassa verglichen. Dieser Versuch diente der Validierung der Quali-

tät der hergestellten DNA-Chips.

3.2.1. PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek

Zunächst wurden die klonierten Fragmente der cDNA-Bibliothek wie in 2.3.2. be-

schrieben mittels PCR amplifiziert. Die cDNA-Bibliothek lag in 15 Mikrotiterplatten im

384er Format vor, die Amplifikation erfolgte daher ebenfalls in 384er PCR-Platten. Jede

Mikrotiterplatte wurde in dreifacher Kopie amplifiziert. Dadurch wurde sichergestellt,

dass trotz des geringen Reaktionsvolumen von je 25 µl in den 384er-PCR-Platten genü-

gend Material für die Herstellung der DNA-Chips zur Verfügung stand. Startpunkte für

die Amplifikation waren Vektor-spezifische Oligonukleotide („T7“ und „T3“), durch

die gewährleistet wurde, dass ausschliesslich die Sequenz des klonierten cDNA-

Fragments amplifiziert wurde und nicht Teile des Vektors selbst. Die Effizienz der

PCR-Reaktionen wurde in einem 1%igem Agarosegel überprüft. Insgesamt konnten ca.

96% aller cDNA-Klone amplifiziert werden.

Ergebnisse

70

Abb. 3.12: Gelelektrophoretische Analyse der PCR-Amplifikation. Gezeigt sind exemplarisch 96PCR-Produkte. In den Spuren M wurde der Marker (GeneRuler) aufgetragen.

Nur wenige Spuren enthalten keine Bande, bei zwei Spuren sind zwei Banden zu erken-

nen, wahrscheinlich lag hier eine Kontamination mit einem zweiten cDNA-Klon vor.

3.2.2. Herstellung heterologer Kontrollen

Durch die Verwendung heterologer Kontrollen, die sowohl in Form von DNA-

Fragmenten als Sonde auf die Chips aufgebracht werden, als auch als mRNA in defi-

nierter Menge zur Markierungsreaktion der Probe hinzugefügt werden, ist eine Norma-

lisierung der Hybridisierungen leichter möglich, da diese Kontrollen feste Bezugs-

punkte für die Datenanalyse liefern (Eickhoff et al., 1999). Dadurch, dass die gemesse-

nen Signalintensitäten für diese Kontrollen immer konstant sein müssen, wird der Ver-

gleich von Datensätzen verschiedener Herkunft erleichtert. Wird die Kontroll-Sonde in

mehreren Verdünnungen aufgebracht, erhält man entsprechend Bezugspunkte für ver-

schieden starke Signalintensitäten.

Sequenzen, die als heterologe Kontrollen verwendet werden, dürfen keine Homologien

zum zu untersuchenden Organismus aufweisen, da sonst mit Kreuzhybridisierungen zu

rechnen wäre. Eine Kreuzhybridisierung würde zu Verfälschungen in der resultierenden

Signalintensität führen und somit die Verwendbarkeit als Bezugspunkt für die Normali-

sierung erheblich beeinträchtigen. Als N. crassa-fremde Kontrolle wurde Kanincheng-

lobin gewählt. Zum einen ist die Sequenz des Globins bei Säugetieren zwar stark kon-

serviert, beim Pilz N. crassa bisher jedoch nicht bekannt. Zum anderen ist die mRNA

von Kaninchenglobin kommerziell verfügbar und kann somit direkt als Probe verwen-

det werden. Um sicherzustellen, dass es bei der Verwendung von Kaninchenglobin als

heterologe Kontrolle nicht zu Kreuzhybridisierungen mit N. crassa-DNA kommen

kann, wurde die Sequenz des Kaninchenglobins zunächst mit Hilfe des BLAST-

Algorithmus („basic local alignment search tool“, Altschul et al., 1990) mit der bisher

M M

Ergebnisse

71

bekannten genomischen Sequenz von N. crassa verglichen. Dabei wurden keine Über-

einstimmungen festgestellt. Zusätzlich wurde markierte mRNA aus Kaninchenglobin

auf den Neurospora-DNA-Chip hybridisiert, wobei keine Kreuzhybridisierungen detek-

tiert werden konnten (Ergebnisse nicht gezeigt).

Wie in 2.3.3. beschrieben, wurde zunächst ausgehend von Kaninchenglobin-mRNA

eine cDNA-Erststrangsynthese durchgeführt. Diese cDNA diente dann in einem zweiten

Schritt als Matrize für die Amplifikation eines α- bzw. β-Globin-spezifischen Frag-

ments mittels PCR. Nach der Reinigung der PCR-Produkte wurde je ein Aliquot gele-

lektrophoretisch auf Grösse und Qualität überprüft.

Abb. 3.13: Gelelektrophoretische Analyse der PCR-Produkte der heterologen Kontrollen aus Ka-ninchen-Globin. In Spur M wurde der Marker (GeneRuler) aufgetragen. Spur 1 enthältdas 268 bp grosse αααα-Globin-spezifische PCR-Produkt, Spur 2 das 490 bp grosse ββββ-Globin-spezifische PCR-Produkt.

3.2.3. Herstellung der DNA-Chips

Für die Herstellung der DNA-Chips wurden zunächst Objektträger mit Poly-L-Lysin

beschichtet (2.3.4.1.). Anschliessend wurden wie in 2.3.4.2. beschrieben mit Hilfe des

Roboters SDDC-2 MicroArrayer die PCR-Produkte in einem definierten, hochdichten

Raster aufgebracht, wobei während eines Roboter-Laufs 50 Chips gleichzeitig herge-

stellt werden konnten. Anschliessend wurden die DNA-Chips einer Blockierungsreakti-

on unterzogen, bei der freie Amin-Gruppen von Poly-L-Lysin durch Reaktion mit

Bernsteinsäureanhydrid blockiert werden. Dadurch soll vermieden werden, dass es an

M 1 2

490 bp

268 bp

500 bp

200 bp

Ergebnisse

72

Stellen, an denen keine Sonden-DNA aufgebracht wurde, zu unspezifischen Hybridisie-

rungen kommen kann, die zu einem erhöhten Hintergrund führen.

3.2.4. Isolierung von RNA aus Neurospora crassa

Für die Isolierung der RNA aus den drei Mycel-Proben „Vollmedium“, „Minimalmedi-

um“ und „Acetat“ wurden zunächst die Zellen durch Pulverisieren des gefrorenen My-

cels im Mörser aufgeschlossen und anschliessend durch Zugabe von SDS lysiert. Nach

einer Phenolextraktion wurde die RNA mit LiCl gefällt (siehe 2.3.6.). Die Qualität der

RNA wurde in einem 1,2%igen Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen über-

prüft.

Abb. 3.14: RNA aus den Mycelproben 1) Vollmedium; 2) Minimalmedium und 3) Acetat

Aufgetragen wurden nach fluorimetrischer Konzentrationsbestimmung je 1 µg RNA. Zu

erkennen sind deutlich die Banden der ribosomalen RNA. Die RNA ist nicht degradiert,

da keine Abbauprodukte im niedermolekularen Bereich zu sehen sind.

3.2.5. Generierung der Hybridisierungsdaten

Die RNA-Proben wurden markiert, indem durch reverse Transkription unter Verwen-

dung von Aminoallyl-dUTP einzelsträngige cDNA synthetisiert wurde. In einem zwei-

ten Schritt wurden reaktive Fluoreszenzfarbstoffester an das eingebaute Amino-allyl-

dUTP gekoppelt (siehe 2.3.7.). Die durch Absorptionsmessung bestimmte Einbaurate

lag typischerweise bei 1-2%. Die Hybridisierungen erfolgten wie in 2.3.8. beschrieben

1 2 3 1 2 3

Ergebnisse

73

als Zweifarben-Experiment. Bei den Experimenten zur Genexpression bei Wachstum in

verschiedenen Nährmedien wurde jede Hybridisierung viermal wiederholt. Die Probe

„Vollmedium“ wurde jeweils als Kontrolle eingesetzt, die mit der Probe „Minimalme-

dium“ bzw. „Acetat“ cohybridisiert wurde. Dabei wurden die einzelnen Proben je

zweimal mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 und zweimal mit Cy5 markiert. Durch die

viermalige Wiederholung sollte eine statistische Validierung der Ergebnisse erreicht

werden (Lee et al., 2000). Darüber hinaus sollten durch den Wechsel des Farbstoff Ab-

weichungen durch unterschiedliches Verhalten der beiden Fluoreszenzfarbstoffe bei

Markierung und Detektion ausgeglichen werden (Taniguchi et al., 2001).

Die Hybridisierung zum Vergleich von N. crassa mit S. cerevisiae wurde aufgrund

mangelnden RNA-Materials nur zweimal wiederholt, ebenfalls mit Austausch der bei-

den Fluoreszenzfarbstoffe.

Nach Hybridisierung und Waschen wurden die Glas-Chips direkt detektiert, wobei auf-

grund der geringeren Photostabilität immer die durch Cy5 erhaltenen Signale zuerst

detektiert wurden.

Abb. 3.15: Gesamt-Chip und Ausschnittsvergrösserung nach Detektion der durch Cy3 erhaltenenSignale nach der Hybridisierung von Cy3-markierter Probe "Vollmedium".

Signalintensität

Ergebnisse

74

Die erhaltenen Signalintensitäten wurden mit der Software GenePix™ quantifiziert.

Abb. 3.16: Ausschnitt eines Chips in der Darstellung von GenePix, auf den die Cy3-markierte Pro-be "Vollmedium" zusammen mit der Cy5-markierten Probe "Minimalmedium" hybri-disiert wurde. Die Software GenePix überlagert die in Falschfarben dargestellten Bilder,die durch Detektion des Cy3-Kanals (=grün) und des Cy5-Kanals (=rot) resultieren undquantifiziert die Signalintensitäten.

Die Ergebnisse aus GenePix™ wurden in Form einer Tabelle abgespeichert, in der jeder

Sonde die zugehörigen Signalintensitäten für den Cy3- und den Cy5-Kanal sowie der

Wert für die Intensität des lokalen Hintergrunds zugeordnet wurden. Diese Daten dien-

ten als Grundlage für die Auswertung mit der Software M-Chips.

3.2.6. Datenanalyse mit M-Chips

Für die Datenanalyse mit M-Chips (Fellenberg et al., 2001) wurden zunächst die durch

die Quantifizierung mit GenePix™ erhaltenen Signalintensitäten für jede einzelne Hy-

bridisierung in die Datenbank geladen. Wiederholungen von Hybridisierungen unter

gleichen Bedingungen wurden dabei zu Experimenten zusammengefasst. Experimente

können mit M-Chips einzeln, aber auch in Kombination mit anderen Experimenten

analysiert werden. Wurden die Hybridisierungen wie in der vorliegenden Arbeit als

Zweifarben-Experiment durchgeführt, ist es von grosser Relevanz, dass bei den kombi-

nierten Experimenten jeweils die gleiche Kontrollbedingung gewählt wurde. Ansonsten

sind die Experimente durch den kompetitiven Charakter der Hybridisierungen nicht

miteinander vergleichbar.

Der erste Schritt der Datenanalyse besteht in der Normalisierung der Daten. Dazu wer-

den paarweise die Signalintensitäten der zu vergleichenden Datensätze in einem Koor-

Ergebnisse

75

dinatensystem gegeneinander aufgetragen. Anschliessend wird durch die Datenpunkte

eine Regressionsgerade gelegt. Grundlage für die Berechnung dieser Gerade war ein

Algorithmus, der eine signifikante Mehrheit aller Datenpunkte verwendet. Diese Me-

thode hatte sich schon in früheren Projekten in unserer Arbeitsgruppe

(A. thaliana, M. Scheideler; S. cerevisiae, N. Hauser) als robuster gegenüber der Be-

rechnung unter der Verwendung von heterologen Kontrollen erwiesen. Durch multipli-

kative und additive Korrektur wird die Regressionsgerade so angepasst, dass sie mit

einer Steigung von 1 durch den Ursprung des Koordinatensystems verläuft. Dadurch

erhält man die normalisierten Signalintensitäten für beide zu vergleichenden Bedingun-

gen (siehe 2.3.9.3.).

Anschliessend erfolgt eine Filterung der Daten, um die grosse Menge der anfallenden

Daten auf diejenigen Gene zu reduzieren, die eine signifikante Änderung in ihrer Ex-

pression zeigen. Die gemessenen Daten wurden durch Wiederholung auf zwei verschie-

denen Ebenen erhalten. Zum einen war jede Sonde doppelt auf den Chip aufgebracht

worden, so dass man bei einer Hybridisierung zwei Datenpunkte für jedes Gen erhielt.

Zum anderen wurden die Hybridisierungen zwei- bzw. viermal wiederholt, so dass man

insgesamt für jedes Gen vier bzw. acht Datenpunkte erhielt. Die Wiederholung von Ex-

perimenten ermöglicht durch die entstehende Redundanz eine statistische Validierung

der Ergebnisse. Desweiteren erlaubt eine grössere Datenmenge eine genauere Definition

eines Signalintensitätsschwellenwertes, der auswertbare Signale vom Hintergrundrau-

schen trennt. Durch verschiedene Filterkriterien (siehe unten) wurden Daten ohne Rele-

vanz aus dem Datensatz entfernt, so dass nur Daten, die eine Änderung im Expressions-

profil charakterisieren, für weitere Analysen verwendet wurden. In der vorliegenden

Arbeit wurden insgesamt drei verschiedene Filterkriterien verwendet: zum einen wur-

den die Daten anhand eines Signalintensitätsschwellenwertes gefiltert, zum anderen

wurden nur solche Daten verwendet, bei denen, gemessen am Verhältnis der Signalin-

tensitäten beider Fluoreszenzfarbstoffe zueinander, eine Änderung der Genexpression

vorlag, zum dritten erfolgte eine Filterung nach der Stringenz der Änderung (Beißbarth

et al., 2000).

Mit den gefilterten Daten kann im Anschluss eine Korrespondenzanalyse (Fellenberg et

al., 2001) durchgeführt werden, alternativ stehen auch noch andere cluster-Algorithmen

wie der des hierarchischen Clusterns zur Verfügung.

Ergebnisse

76

Farbkodierte Liste mit Induktions-/Repressionsfaktoren

Aus dem Verhältnis der normalisierten Signalintensitäten der Probe unter Testbedin-

gung zu den Intensitätswerten der Probe unter der Kontrollbedingung wird der Grad der

differentiellen Expression ermittelt. Die Signalintensitätsverhältnisse werden umge-

rechnet in Faktoren mit positivem Vorzeichen für die Induktion und Faktoren mit nega-

tivem Vorzeichen für die Repression eines Gens. Diese Faktoren werden in Form einer

farbkodierten Tabelle ausgegeben. Hierbei sind die Induktions- und Repressionsfakto-

ren je nach Stringenz der Genexpressionsänderung farblich unterlegt. Folgt die Ände-

rung statistisch signifikant dem hochstringenten "Min/Max-Separation"-Kriterium (sie-

he 2.3.9.3.), sind die Faktoren für eine Induktion rot unterlegt, für eine Repression blau.

Ist die Änderung der Genexpression durch das weniger stringente "Standardabwei-

chung-Separation"-Kriterium belegt, sind die Induktionsfaktoren gelb unterlegt, die

Repressionsfaktoren hellblau. Konnten die Ergebnisse durch keine dieser beiden Quali-

tätskriterien gesichert werden, erfolgt keine farbliche Unterlegung der Faktoren.

3.2.7. Vergleich der Transkriptionsprofile von N. crassa mit S. cerevisisae

Das Transkriptionsprofil einer RNA-Probe aus N. crassa wurde mit dem Transkripti-

onsprofil einer RNA-Probe aus S. cerevisiae (Wildtypstamm FY1679) verglichen, um

feststellen zu können, ob man grundsätzlichmit den N. crassa-DNA-Chips Änderungen

in der Genexpression detektieren kann. Für diesen Zweck wurde die Hefe S. cerevisiae

gewählt, da diese phylogenetisch mit N. crassa verwandt ist und somit aufgrund einer

Sequenzhomologie von ca. 40% (Braun et al., 2000) entsprechend gut mit zahlreichen

Proben auf dem Chip hybridisieren sollte. Andererseits bestehen zwischen beiden Orga-

nismen genug Unterschiede, die folglich auch mit Hilfe des N. crassa-DNA-Chips zu

detektieren sein sollten.

Die RNA aus S. cerevisiae wurde freundlicherweise von S. Bastuck und N. Hauser zu

Verfügung gestellt. Die RNA-Probe aus N. crassa war aus Mycel isoliert worden, dass

48 h im Dunkeln auf Vogels-Medium gewachsen war. Für den Vergleich wurden beide

Proben markiert und auf den N.crassa-DNA-Chip cohybridisert (3.2.5.). Nach der Hy-

bridisierung wurden die Signalintensitäten quantifiziert und mit M-Chips normalisiert

(3.2.6.). Die RNA-Probe aus S. cerevisiae wurde als Kontrollbedingung eingesetzt, mit

der die Probe aus N. crassa verglichen wurde. Zur Veranschaulichung wurden die Si-

gnalintensitäten, die aus der Hybridisierung der mRNA aus N. crassa resultierten, in

Ergebnisse

77

einem zweidimensionalen Koordinatensystem ("scatterplot") gegen die Signalintensi-

täten aufgetragen, die sich aus der Hybridisierung der Probe aus S. cerevisiae ergaben.

Abb. 3.17: Hybridisierung N. crassa vs. S. cerevisiae: Auftragung der Signalintensitäten in einemscatterplot. Gene, deren Signalintensitäten auf einer Gerade durch den Ursprung mit derSteigung 1 liegen, werden in beiden Proben gleich stark exprimiert. Gene, deren Si-gnalintensitäten oberhalb dieser Gerade liegen, werden in N. crassa stärker exprimiert,Gene, deren Signalintensitäten unterhalb dieser Gerade liegen, werden in S. cerevisiaestärker exprimiert.

Die mit M-Chips berechneten farbkodierten Listen (3.2.6.) wurden nur statistisch aus-

gewertet, da die beiden Proben aufgrund unterschiedlicher Wachstumsbedingungen in

biologischer Hinsicht nicht direkt miteinander vergleichbar waren. Während das Mycel

von N. crassa in Vogels-Medium gewachsen war, dem als einzige Kohlenstoffquelle

Saccharose zugesetzt worden war, wurde die Hefe in YPD-Medium kultiviert, in dem

ausser Glucose zusätzlich Hefe-Extrakt und Pepton enthalten war. Die Listen wurden

nach Induktions- und Repressionsfaktoren sortiert. Weiterhin wurden nur solche Gene

berücksichtigt, bei denen die statistische Signifikanz der Expressionsänderung entweder

durch die Min/Max-Separation oder die Standardabweichung-Separation der einzelnen

Datensätze validiert werden konnte. Die statistische Signifikanz beruht hierbei auf 4

Datensätzen, da die Hybridisierung auf die Chips mit den jeweils doppelt aufgebrachten

Genen zweimal wiederholt wurde. Eine signifikante Änderung der Genexpression wur-

de bei insgesamt 3275 (87%) der detektierten 3760 Gene beobachtet.

Nach dem "Min/Max-Separation"-Kriterium lag bei 1189 (36%) Genen eine signifi-

SignalintensitätenS. cerevisiae

Signal-intensitätenN. crassa

Steigung m=1

Ergebnisse

78

kante Induktion in N. crassa im Vergleich zu S. cerevisiae vor, reprimiert wurden 1407

(43%) Gene. Die meisten Expressionsänderungen lassen sich somit reproduzierbar de-

tektieren. Bei weiteren 167 (5%) Genen wurde eine Induktion zumindest durch das

"Standardabweichung-Separation"-Kriterium statistisch validiert, eine Repression bei

512 (16%) Genen.

Bei 2074 (63%) dieser statistisch validierten Gene lagen die Induktions- und Repressi-

onsfaktoren unter dem Wert 2, hier war die Genexpressionsänderung um weniger als

das zweifache geändert. Bei den restlichen 1201 (37%) Genen konnten Induktionen und

Repressionen um mehr als das zweifache beobachtet werden.

Durch diese Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass die N.crassa-DNA-Chips dafür

geeignet sind, für Genexpressionsanalysen eingesetzt zu werden, da sich selbst geringe

Änderungen im Transkriptionsprofil in vier Datensätzen reproduzierbar detektieren las-

sen.

3.2.8. Genexpression von N.crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien

Für die Genexpressionsanalysen bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien wurde als

Kontrolle die Probe "Vollmedium" verwendet, die erste Bedingung war die Probe "Mi-

nimalmedium", als zweite Bedingung wurde die Probe "Acetat" eingesetzt.

Nach der Normalisierung wurden die Daten gefiltert. Dabei wurde für die normalisiser-

ten Signalintensitäten von Kontrolle und Bedingungen ein Schwellenwert festgelegt,

bewertet wurde dabei für jedes Gen der maximale Wert aus allen wiederholten Hybridi-

sierungen. Als zweites Filterkriterium galt ein Verhältnis der Signalintensitäten von

Kontrolle zu mindestens einer der Bedingungen von 2, was einer mindestens zweifa-

chen Änderung der Genexpression entspricht. Mit dem dritten Kriterium wurden die

Daten nach der Stringenz der Genexpressionsänderung gefiltert, hier wurde die

Min/Max-Separation der Datensätze ausgewählt. Mit den gefilterten Daten wurde eine

Korrespondenzanalyse (siehe 2.3.9.3.) durchgeführt.

Ergebnisse

79

Abb. 3.18: Korrespondenzanalyse zum Vergleich der Proben "Vollmedium", "Minimalmedium"und "Acetat". Die Profile 1-3 zeigen die Transkriptionsprofile von "idealen" Genen(siehe Text). Die Gene bzw. Klone werden im Diagramm als schwarze Punkte darge-stellt, die Hybridisierungen dagegen farbig.

In dem resultierenden zweidimensionalen Diagramm (Abb. 3.18) sind Hilfslinien ein-

getragen. Sie beschreiben das Transkriptionsprofil (Profil 1-3) von hypothetischen Ge-

nen, deren gesamte Signalintensität auf eine Bedingung fokussiert ist, während sie in

allen anderen Bedingungen gleich Null ist. Die Koordinaten dieser Gene werden als

Standard-Koordinaten bezeichnet. Da diese hypothetischen Gene weit ausserhalb des

Diagramms liegen würden, sind in der Abbildung nicht deren Standard-Koordinaten,

sondern Geraden, die vom Ursprung des Diagramms in Richtung der Standardkoordi-

naten zeigen, als Hilfslinien dargestellt. Je näher ein Gen an diesen Hilfslinien liegt,

desto besser lässt sich sein Transkriptionsprofil durch das ideale Profil der hypotheti-

schen Gene beschreiben.

Folgende Beobachtungen können anhand der Korrespondenzanalyse gemacht werden:

I

II

Profil 1

Profil 2

Profil 3III

IV

Profil 1 Profil 2 Profil 3

Vollmedium Minimalmedium Acetat

Ergebnisse

80

Die zu der Bedingung „Minimalmedium“ (blau) bzw. zu der Bedingung „Acetat“ (grün)

gehörenden redundanten Datensätze liegen dicht beieinander, woraus sich eine hohe

Reproduzierbarkeit der Hybridisierungen ableiten lässt. Bei der als Kontrolle verwen-

dete Bedingung "Vollmedium" wurde für die Normalisierung der Median aus allen red-

undanten Datensätzen verwendet, der auch in der Korrespondenzanalyse anstelle der

einzelnen Datensätze aufgetragen ist. Zu erkennen sind vier deutlich voneinander sepa-

rierte Gruppierungen von Genen, die Transkriptionsprofile der drei Bedingungen sind

also gut voneinander getrennt. Die beiden rot umrandeten Gruppen I und II sind dem

Profil 1 zuzuordnen, hier handelt es sich um Gene, die bei Wachstum auf Vollmedium

induziert sind, bzw. bei Wachstum auf Minimalmedium oder einem Acetat-haltigen

Medium reprimiert sind. Die blau umrandete Gruppe III lässt sich weitgehend durch das

Profil 2 beschreiben. Die hier enthaltenen Gene sind bei Wachstum auf Minimalmedi-

um deutlich höher exprimiert als unter den anderen beiden Wachstumsbedingungen. Bei

der grün umrandeten Gruppe IV handelt es sich um Gene, die näherungsweise durch das

Profil 3 beschrieben werden können. Sie sind bei Wachstum auf dem Acetat-haltigen

Medium sehr viel stärker induziert als bei Wachstum auf Voll- oder Minimalmedium.

Insgesamt wurden für die Korrespondenzanalyse 170 Gene bzw. Klone ausgewählt, die

übrigen wurden durch die Qualitätskriterien als unsignifikant verändert herausgefiltert.

Gruppe III enthält 95 Klone, 57 Klone sind in Gruppe IV enthalten, und nur 10 Klone

bzw. 8 Klone in den Gruppe I und II. Falls vorhanden, wurde diesen 170 Klonen durch

Datenbankvergleich (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)

eine Sequenz und eventuelle Homologien zu bekannten Genen zugeordnet.

Im folgenden sind die Klone, die in diesen Gruppen zusammengefasst werden konnten,

in farbkodierten Listen (3.2.6.3.) mit Induktions- bzw. Repressionsfaktor und, falls vor-

handen, einer Zuordnung zu einem Gen und der accession-Nummer der Sequenz in der

NCBI-Datenbank gezeigt. Von diesen Klonen wurden 30% noch nicht sequenziert, bei

weiteren 16% wurde konnte keine Sequenzhomologie zu bereits bekannten Genen ge-

funden werden. Bei den restlichen 54% der Klone handelt es sich um identifizierte Ge-

ne, die teilweise aufgrund der hohen Redundanz der cDNA-Bibliothek in mehreren Ko-

pien vorliegen.

Ergebnisse

81

Tabelle 3.6: Klone, die in Gruppe I (rote Umrandung) der Korrespondenzanalyse (Abb. 3.18) zu-sammengefasst wurden. Die farbliche Kodierung entspricht der Stringenz, mit derGenexpressionsänderung belegt werden konnte: dunkelblau unterlegt sind Represssi-onsfaktoren, die durch Min/Max-Separation, hellblau unterlegt sind Repressionsfakto-ren, die durch Standard-Abweichungseparation der wiederholten Datensätze berechnetwerden konnten. Induktionsfaktoren sind rot unterlegt, wenn sie auf einer Min/Max-Separation der wiederholten Datensätze basieren, bei gelber Unterlegung liegt eineStandard-Abweichungseparation vor. Für Faktoren ohne farbliche Unterlegung giltkeines der beiden Qualitätskriterien.

Relative Änderungbezüglich der Kon-

trolle(„Vollmedium“)

"Minimal-medium" "Acetat"

Klon-Name Beschreibung Accession-Nr.

-3.18 +1.13 nm3e10 nicht sequenziert-4.88 +1.03 nm4e11 keine Homologie AA898270

-3.61 +1.05 nm4h11 Halorhodopsin (Licht-induzierte Chlo-rid-Pumpe) AI392478

-4.48 -1.23 nm6b7 keine Homologie AA901660-4.31 +1.07 nm8b5 nicht sequenziert-3.80 -1.40 sc7d8 nicht sequenziert

-4.14 -1.29 sm2c6 C. elegans C25D7.i Genprodukt,Chromosom III AI392184

-3.83 +1.28 sm6e6 nicht sequenziert-4.09 +1.32 sm7a4 nicht sequenziert-3.03 +1.06 sp8a8 nicht sequenziert

Neben sechs noch nicht sequenzierten Klonen enthält diese Gruppe nur vier Klone mit

bekannter Sequenz. Bei zwei dieser Klone wurde keine Homologie zu bekannten Genen

festgestellt, ein Klon enthält das für Halorhodopsin kodierende Gen, die Sequenz des

zweiten ist homolog zu einem Genprodukt mit unbekannter Funktion aus C. elegans. In

dieser Gruppe sind 7 Gene enthalten, die zwar eine Änderung ihrer Expression in Mi-

nimalmedium um mehr als den Faktor 3 aufweisen, bei denen diese Änderung jedoch

durch keins der Stringenzkriterien bestätigt werden konnte.

Ergebnisse

82

Tabelle 3.7: Klone, die in Gruppe II (rote Umrandung) der Korrespondenzanalyse (Abb. 3.18) zu-sammengefasst wurden





-1.14 -4.59 sc6b4 keine Homologie BF072412

-1.14 -4.61 sc7b4 hypothetisches Protein SPAC10F6.16, S.pombe BF739665

-1.25 -3.92 sc8b3 nicht sequenziert-1.26 -8.35 sc7c6 nicht sequenziert-1.28 -5.24 sc5b12 keine Homologie AI399009-1.29 -6.86 nc2d2 keine Homologie AI397728-2.79 -5.00 w6h2 keine Homologie AI398949-4.23 -4.76 sc10c2 nicht sequenziert

Diese Gruppe enthält insgesamt acht Klone, von denen fünf bereits sequenziert wurden.

Davon konnte nur ein Klon der Sequenz eines hypothetischen Proteins aus S. pombe

zugeordnet werden, dessen Funktion bislang noch unbekannt ist. In dieser Tabelle wird

deutlich, dass sich durch das stringente Qualitätskriterium der Min/Max-Separation oder

auch der weniger stringenten Standardabweichung-Separation selbst geringe Änderun-

gen in der Expression eines Genes um weniger als das 1,5-fache reproduzierbar belegen

lassen.

Tabelle 3.8: Klone, die in Gruppe III (blaue Umrandung) der Korrespondenzanalyse (Abb. 3.18)zusammengefasst wurden





+2.58 +1.19 w6e9 Stress-induzierbares Protein STI35 AI398924+3.13 +1.41 w10e2 ADP/ATP-Carrier Protein, N. crassa AI398885+3.14 +1.12 w9e5 nicht sequenziert

+3.40 +1.31 w13h9 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI397535

+3.41 +1.72 w7d9 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398642

+3.51 +1.52 w9c3 keine Homologie AI399353

+3.63 +1.31 w9g11 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398975

Ergebnisse

83

Fortsetzung Tab. 3.8+3.72 +1.11 w9e3 nicht sequenziert+3.76 +1.53 w9c5 nicht sequenziert

+3.79 +1.73 sc5f6 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399633



+3.93 +2.12 w13e4

Acylcarrier-Protein, mitochondrialerVorläufer (ACP), N. crassa (NADH-Ubichinonoxidoreductase 9.6 KD Unter-einheit)

AI398454

+4.11 -1.26 w1d12 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398520

+4.28 +1.32 nm7b10 keine Homologie AA901915+4.47 +1.41 w8h4 Stress-induzierbares Protein STI35 AI398472

+4.53 +2.07 w8c10 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398808

+4.63 +1.55 w7a6 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398533

+4.80 -1.24 w10d3 keine Homologie AI399034

+4.85 +1.33 w8b11 Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, N. crassa AI398835

+4.93 +1.05 w1f12 Stress-induzierbares Protein STI35 AI398574+5.14 +1.57 w1e3 nicht sequenziert+5.24 +1.70 w10c9 60S ribosomales Protein AI398507+5.40 +1.02 w13e12 keine Homologie AI398998

+5.44 +1.81 w7b8 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI398540

+5.44 +1.50 w6f8 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399213

+5.62 +1.25 w8d1 nicht sequenziert+5.68 -1.25 sm3b10 nicht sequenziert+5.75 -1.21 sc5h8 Translation-elongations-Faktor 2 AI416427+5.80 +2.07 w10g4 keine Homologie AI398902


+5.96 +1.24 w13b8 keine Homologie AI399378+6.07 +2.38 w8a10 nicht sequenziert+6.08 +1.09 w8b3 Stress-induzierbares Protein STI35 AI398663+6.60 +1.51 w13f8 ATP-Synthase, Untereinheit 9 AI399001+6.61 +1.59 nc3g6 keine Homologie AA901910+6.73 +3.27 w6e7 keine Homologie AI399322



+6.97 +1.15 w10h1 40.3 kD Protein C17C9.12 inChromosom I, S. pombe AI399263



Ergebnisse

84


+7.10 +1.88 w10e11 Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, N. crassa AI399527


+7.17 +1.58 sp1f9 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI392287

+7.28 +1.55 w10b9 Transaldolase AI398504




+7.72 +2.32 w13b6 60S ribosomales Protein AI398442

+7.72 +2.86 w1e12 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI399073

+7.77 +1.80 nm7c2 nicht sequenziert



+7.88 -1.06 sp8h3 nicht sequenziert




+8.27 +1.79 w8d9 vermutlich ATP-abhängige RNA-Helicase DBP5 (Helicase CA5/6) AI398873

+8.33 +2.46 w13e9 nicht sequenziert+8.37 +2.02 w9e12 keine Homologie AI397526+8.45 +1.00 sp3h4 nicht sequenziert



+8.57 +1.20 sp9a7 nicht sequenziert

+8.58 +2.72 w13c6 Peroxisomal-ähnliches Protein, Asper-gillus fumigatus AI398824



+9.05 +1.85 w13a4 keine Homologie AI398990



+9.32 +2.68 nc1b7 keine Homologie AA901911+9.36 +2.51 w13h4 nicht sequenziert+9.55 +2.80 w8h2 Histidin-3 Protein, N. crassa AI398704

Ergebnisse

85

Fortsetzung Tabelle 3.8+9.83 +1.17 sc5g1 Stress-induzierbares Protein STI35 AI397603


+9.94 +1.29 w10h7 Ubichinol-Cytochrom C-Reduktase-Komplex Untereinheit VIII AI399120

+10.02 +3.42 w13e1 minor allergen Alt A VII, Alternariaalternata AI398455


+10.37 +1.18 w10b8 Stress-induzierbares Protein STI35 AI398503

+10.70 +2.07 sc1h3 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI392532

+10.91 +2.33 nm7h12 keine Homologie AA898678+11.10 +2.13 w10a3 60S ribosomales Protein AI399017


+12.01 +2.87 sm4f8 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym BF072767


+12.27 +3.50 sc2h11 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI392549

+12.33 +3.16 w9a10 nicht sequenziert+12.72 +1.82 w10h9 Glucokinase AI399289

+13.28 +2.98 sc7f9 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym BF072529

+14.02 +2.61 sm3g7 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym BF072643

+14.20 +2.33 sc1c6 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym AI392375

+14.30 +4.14 sm6g12 nicht sequenziert

+18.74 +3.60 sm3c9 nmt1 Protein-homolog - Thiamin-Biosynthese Enzym BF072566

Die Gruppe III beinhaltet insgesamt 95 Klone, davon 80 mit bekannter Sequenz. Bei 12

der sequenzierten Klone handelt es sich um unbekannte Gene, 45 weitere Klone kodie-

ren für das nmt1-Protein. Die folgende Tabelle zeigt als Auszug aus Tabelle 3.8. die in

Gruppe II identifizierten Gene mit der Kopienanzahl, in der sie in dieser Gruppe vor-

kommen. Ausserdem erfolgt eine Zuordnung zum Gewebetyp, in dem sie exprimiert

werden und Klassifizierung nach ihrer Proteinfunktion.

Ergebnisse

86

Tabelle 3.9: Gene, die in Gruppe III der Korrespondenzanalyse identifiziert wurden

Gen

Anzahl der

Kopien in

Gruppe III

Gewebetyp Proteinfunktion

Stress-induzierbares Pro-tein STI35 6 Mycel, Co-

nidien Stress-Antwort

nmt1-Protein 45Mycel,Conidien,Perithecium

Metabolismus: Cofaktor

Acylcarrier-Protein (ACP) 1 Mycel

ATP-Synthase 1 Mycel

ADP/ATP-Carrier-Protein 1 MycelUbichinol-Cytochrom C-reduktase Komplex 1 Mycel

Metabolismus:Oxidative Phosphorylierung

Transaldolase 1 Mycel Metabolismus:Pentosephosphat-Zyklus

Glucokinase 1 MycelGlyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase 2 Mycel

Metabolismus:Glycolyse

ATP-abhängige RNA-Helicase DBP5 1 Mycel RNA-Synthese

Histidin-3-Protein-Komplex(Histidinoldehydrogenase,Phosphoribosyladenosin-5'-triphosphatpyrophospho-hydrolase, Phosphoribosyl-adenosin-5'-monophosphatcyclohydrolase)

1 Mycel Aminosäurestoffwechsel: Hi-stidin-Biosynthese

Translation-Elongationsfaktor 2 1 Conidien

60S ribosomales Protein 3 MycelProtein-Synthese

40.3 kD ProteinC17C9.12, S. pombe 1 Mycel

Kleines Allergen Alt AVIII, A. alternata 1 Mycel

Peroxisomal-ähnlichesProtein, A. niger 1 Mycel

Unklassifiziert

Ergebnisse

87

Die folgende Tabelle zeigt die Klone, die in Gruppe IV der Korrespondenzanalyse zu-sammengefasst wurden.

Tabelle 3.10: Klone, die in Gruppe IV (grüne Umrandung) der Korrespondenzanalyse (Abb. 3.18)zusammengefasst wurden





+2.16 +3.48 sc1a8 keine Homologie AI399383+2.63 +3.54 sc4f4 nicht sequenziert+1.08 +4.76 nc5h3 ccg-6, mögliches Polypeptid, N. crassa AI392069+1.17 +5.81 nc3a11 keine Homologie AA898660+1.96 +6.44 np2b10 keine Homologie AA898959+1.28 +6.78 nm8g3 nicht sequenziert

+3.56 +6.81 sc5h3 Pyruvatdecarboxylase (cfp Genpro-dukt), N. crassa AI397668

+3.13 +7.09 nc5e3 keine Homologie AI397785+2.15 +8.10 sc1b10 keine Homologie AI398298+2.47 +8.10 sc8d5 nicht sequenziert+2.64 +8.19 sc4d3 nicht sequenziert+2.55 +8.59 sm6b12 nicht sequenziert+1.92 +9.16 sc7f2 keine Homologie BF072523+2.11 +9.18 nc5g2 Acetolactatsynthase, kleine Untereinheit AI392061+3.71 +9.71 sc4f9 nicht sequenziert+7.30 +11.08 sc8d8 nicht sequenziert+3.41 +11.32 sc8d10 nicht sequenziert

+5.25 +14.19 sc1a2 Cyclophilin A, N. crassa, Translation-Elongationsfaktor 2 AI392522

+3.89 +15.56 sc9d8 nicht sequenziert

+2.59 +16.20 sc3d1 ORF YGL141w, hypothetisches 105.6kD Protein in MRF1-SEC27 AI392495

+3.54 +17.84 nc3e6 keine Homologie AI397804+4.46 +18.57 sc10e4 nicht sequenziert

+9.30 +18.80 sc7e8 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) BF072518

+12.70 +21.29 sc9a6 nicht sequenziert

+7.19 +23.21 nc5h1 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392068

+8.51 +23.65 sc5f2 Pyruvatdecarboxylase (cfp Genpro-dukt), N. crassa AI397597

+6.03 +24.42 sc10d12 nicht sequenziert+4.55 +25.66 sc2c11 nicht sequenziert

+8.50 +26.79 nc2c2 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392004

+13.85 +29.21 sc2h8 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392426

+10.26 +29.73 sc2h3 nicht sequenziert+12.75 +31.07 sc4f2 nicht sequenziert

Ergebnisse

88

Fortsetzung Tabelle 3.10+14.66 +31.53 nc3g3 nicht sequenziert

+12.55 +31.67 sc2a2 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392361

+13.92 +32.11 sc8d3 nicht sequenziert+17.34 +34.66 sc4h10 nicht sequenziert+15.70 +34.97 sc10e2 nicht sequenziert+8.43 +35.15 nc1e6 keine Homologie AA901617

+11.33 +36.81 nc5g7 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392064

+13.31 +37.86 sc4f7 nicht sequenziert+10.71 +38.84 sc4d1 nicht sequenziert+19.87 +39.44 sc10d10 nicht sequenziert+21.20 +40.12 sm6b10 nicht sequenziert

+13.75 +40.73 nc5d7 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392042

+16.92 +40.96 sc1e11 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392487

+18.34 +41.07 sc10c5 nicht sequenziert

+12.32 +42.56 nc3e4 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI392088

+18.90 +46.19 sc4c7 nicht sequenziert+8.14 +49.34 np1h1 nicht sequenziert+20.67 +52.93 sc4a7 nicht sequenziert+18.33 +53.63 sc8h11 nicht sequenziert

+19.81 +57.14 sc5h1 ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer; Licht-induziertes Protein 7) AI416425

+20.21 +68.86 sc3c3 keine Homologie AI398340



+14.29 +96.80 sc1c11 keine Homologie AI398326

Gruppe IV der Korrespondenzanalyse enthält 56 Klone, von denen 28 nicht sequenziert

wurden. Von den sequenzierten Klone zeigen 10 Klone keine Homologie zu bekannten

Genen. Die verbleibenden 18 Klone sind in der folgenden Tabelle unterteilt nach ihrer

Proteinfunktion aufgelistet.

Ergebnisse

89

Tabelle 3.11: Gene, die in Gruppe IV der Korrespondenzanalyse identifiziert wurden

GenAnzahl derKopien inGruppe IV

Gewebetyp Proteinfunktion

ccg-2 (Hydrophobin-Vorläufer) 12 Conidien

ccg-6 1 Conidienzirkadianer Rhythmus

Pyruvatdecarboxylase 2 Conidien Metabolismus

Acetolactatsynthase 1 Conidien Aminosäuremetabolismus

Cyclophilin A 1 Conidien Stress-Antwort

ORF YGL141w 1 Conidien Unklassifiziert

Bei den Genexpressionsanalysen, die mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie auf N. cras-

sa durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass bei Wachstum auf Minimal- oder

einem Acetat-haltigen Medium viele Gene im Vergleich zum Wachstum auf einem

nährstoffreichen Vollmedium induziert werden. Es handelt sich hierbei vorallem um

Gene, die an verschiedenen Stoffwechsel- oder Biosynthesewegen beteiligt sind. Zum

anderen scheinen ungünstige Nährstoffangebote einen gewissen Stress auf die Zellen

auszuüben, da auch eine höhere Expression von Stress-induzierten Genen beobachtet

werden konnte.

Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich die hergestellten Neurospora-DNA-Chips

gut für Genexpressionsanalysen eignen. Mit ihnen kann eine differentielle Expression

über einen grosen Bereich detektiert werden. Induktionen um das bis zu 96-fache wur-

den konnten genauso detektiert werden wie sehr geringe Änderungen um das 1,14-

fache. Durch die mehrmalige Wiederholung von Experimenten und die in M-Chips im-

plementierten Signifikanz-Kriterien konnten sowohl die sehr geringen Änderungen wie

auch die sehr grossen Unterschiede in der Genexpression statistisch validiert werden.

Diskussion

90

4. Diskussion

Im Februar 2001 wurde die Entschlüsselung der 2,9x109 bp langen Sequenz des huma-

nen Genoms bekannt gegeben (Venter et al., 2001). Dies war der bisherige Höhepunkt

in der Geschichte der Genomforschung. Der erste vollständig sequenzierte Organismus

war das Bakterium Haemophilus influenzae mit einer Grösse von 1,83 Mb (Fleisch-

mann et al., 1995). Weitere Meilensteine waren die Sequenzierung der Hefe Saccha-

romyces cerevisiae mit einer Genomgrösse von etwa 12 Mb als erster eukaryotischer

Organismus (Goffeau et al., 1997), der Taufliege Drosophila melanogaster mit 137 Mb

(Adams et al., 2000) und der Pflanze Arabidopsis thaliana mit 130 Mb (The Arabidop-

sis Genome Initiative, 2000).

Die Sequenzierung der DNA bildet nur die Grundlage der Genomforschung. Sie wird

ergänzt durch die Annotierung des sequenzierten Genoms, also die Identifizierung und

Lokalisierung der Gene. Hierbei wird der Sequenz als reiner Abfolge von DNA-

Bausteinen eine Funktion zugeordnet. Im Anschluss kann man sich der wesentlich um-

fangreicheren funktionellen Genomanalyse widmen, indem man beispielsweise in

Genexpressionsanalysen das Transkriptom des Organismus untersucht. Unter definier-

ten Bedingungen werden von verschiedenen biologischen Proben Transkriptionsprofile

erstellt, indem deren mRNA-Populationen bezüglich der Transkripthäufigkeit der in

ihnen enthaltenen Gene analysiert werden. Bei diesen Proben kann es sich zum Beispiel

um Tumorgewebe handeln, das im Vergleich zu gesundem Gewebe untersucht wird,

oder um Zellen, die unter verschiedenen Temperatur-, Licht- oder Nährstoffbedingun-

gen gewachsen sind. Da die Transkripthäufigkeit direkt mit der Genaktivität korreliert,

kann durch den Vergleich der Transkriptionsprofile die regulatorische Funktion der Ge-

ne festgestellt werden. Biochemische Vorgänge werden somit auf molekularer Ebene

untersucht und erklärt.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden physikalische Klonkarten zweier Chro-

mosomen des filamentösen Ascomyceten Neurospora crassa erstellt, die als Grundlage

für die anschliessende Sequenzierung dienten. Der zweite Teil der Arbeit widmet sich

im folgenden der funktionellen Genomanalyse. Mittels der DNA-Chip-Technologie

wurden exemplarisch für drei Wachstumsbedingungen Transkriptionsprofile von N.

crassa erstellt, die dann mit Hilfe bioinformatischer Werkzeuge analysiert und vergli-

chen wurden.

Diskussion

91

4.1. Das Neurospora crassa Genom-Projekt

Im Mittelpunkt des deutschen Neurospora crassa Genom-Projekts, dass 1998 initiiert

wurde, stand die Sequenzierung der Chromosomen II und V. Diese beiden Chromoso-

men decken mit 4,6 Mb von Chromosom II und 9,2 Mb von Chromosom V zusammen

etwa ein Drittel des Gesamtgenoms ab, das eine Grösse von 42,9 Mb hat. Die restlichen

fünf Chromosomen sollten im Rahmen des amerikanischen Neurospora Genome Pro-

ject an der University of Georgia sequenziert werden.

Da alle sieben Chromosomen von N. crassa mittels Pulsfeldgelelektrophorese physika-

lisch sehr gut separierbar sind (Orbach et al., 1988), wurde für die Sequenzierung zu-

nächst ein Chromosomen-orientierter Ansatz gewählt. Dabei werden für die einzelnen

Chromosomen physikalische Klonkarten erstellt, auf deren Basis anschliessend die Se-

quenzierung erfolgt. Aus der DNA derjenigen Klone, die aufgrund ihres minimalen

Überlappungsgrades aus der physikalischen Karte zur Sequenzierung ausgewählt wur-

den, werden durch Ultraschallbehandlung Fragmente generiert, die eine Länge von 0.8-

1.6 kb haben. Durch Klonierung dieser kurzen Fragmente wird eine sogenannte „shot-

gun“- oder Zufalls-Bibliothek erstellt. Die einzelnen Klone dieser shotgun-Bibliothek

werden sequenziert und durch Sequenzvergleiche mittels Computer-gestützter Algo-

rithmen zu einer durchgehenden Sequenz zusammengefügt. Der bioinformatische Auf-

wand ist dabei relativ gering, da die Sequenzdaten, die zusammengefügt werden müs-

sen, je nach verwendetem Klonierungsvektor insgesamt nur eine Länge von 35-70 kb

ergeben. Während das deutsche Neurospora crassa Genom-Projekt für die von ihm

übernommenen Chromosomen diesen Ansatz erfolgreich verfolgte, wird seit Herbst

2000 der gesamte Organismus im „Whole Genome Shotgun“-Verfahren vom Whitehead

Institute Center for Genome Research (WICGR, Massachusetts, USA) sequenziert. Da-

zu wurden zwei genomische Bibliotheken hergestellt, eine mit einer durchschnittlichen

Insertgrösse von 4 kb, die zweite mit einer durchschnittlichen Insertgrösse von 40 kb.

Jedes klonierte DNA-Fragment wurde von beiden Seiten auf einer Länge von etwa 500

bp ansequenziert. Die gesammelten Sequenzdaten wurden mit Hilfe hochentwickelter

Algorithmen zu lückenlosen Bereichen zusammenhängender Sequenzen (contigs) zu-

sammengefügt. Der hohe bioinformatische Aufwand, der sich daraus ergibt, ist nur mit

leistungsstarken und komplexen Computerprogrammen zu bewältigen. Bereits im Fe-

bruar 2001 wurden mit 38 Mb knapp 90% der Sequenz von N. crassa im Internet veröf-

fentlicht und zugänglich gemacht, darin enthalten sind noch über 900 Lücken. Zu dieser

Diskussion

92

Entwicklung kam es vor allem durch immense Fortschritte und Automatisation in der

Sequenziertechnik und die während der letzten Jahre ständig wachsenden Kapazitäten

an Sequenzierungs-Einrichtungen. Zudem wird durch hochentwickelte bioinformatische

Werkzeuge eine zuverlässige und schnelle Verarbeitung und Auswertung der bei einem

shotgun-Ansatz in hoher Redundanz generierten Sequenzdaten ermöglicht. Dadurch

können selbst grössere Genome wie N. crassa auch ohne vorherige physikalische Kar-

tierung in relativ kurzer Zeit sequenziert werden. Dies war noch zu Beginn des Neu-

rospora crassa Genom-Projekts nicht denkbar.


Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit ist die physikalische Kartierung der Chromoso-

men II und V von N. crassa beschrieben. Wie bereits in früheren Projekten gezeigt

wurde, kann durch die Erstellung von physikalischen Klonkarten als Grundlage für eine

Sequenzierung die Redundanz der generierten Sequenzdaten signifikant verringert wer-

den (Hoheisel et al., 1993, Scholler et al., 1995). Durch die vorherige Anordnung der

Klone können gezielt benachbarte Klone mit möglichst geringem Überlappungsgrad für

die Sequenzierung ausgewählt werden. Dies ist bei einem „shotgun“-

Sequenzierungsansatz nicht möglich, da hier Klone sequenziert werden, die rein zufällig

ausgewählt werden und über die keine Informationen bezüglich ihrer Lokalisierung im

Genom vorliegen.

4.2.1. Verwendete Bibliotheken

Für die physikalische Kartierung wurde eine genomische Cosmid-Bibliothek verwendet,

die eine 17-fache Abdeckung des Gesamtgenoms aufwies. Zu einem späteren Zeitpunkt

wurde zusätzlich eine genomische BAC-Bibliothek, die 15 Genom-Äquivalente bein-

haltete, herangezogen.

Der Vorteil bei der Verwendung einer BAC-Bibliothek liegt in der Klonierbarkeit von

grösseren DNA-Fragmenten. Dadurch kann der zu kartierende Abschnitt durch eine

geringere Anzahl an überlappenden Klonen abgedeckt werden als bei der Verwendung

von Klonbibliotheken mit kleinen Fragmenten. Während die Grösse von Fragmenten,

die in Cosmide kloniert werden können, bedingt durch die DNA-Menge, die maximal in

den Kopf des Bacteriophagen λ verpackt werden kann, auf etwa 40-50 kb limitiert ist,

Diskussion

93

konnten in BACs schon bis zu 1Mb grosse DNA-Fragmente kloniert werden (Cai et al.,

1995). Üblicherweise liegt die Fragmentgrösse von BAC-Bibliotheken jedoch bei

durchschnittlich 300 Mb. Die Inserierung solch grosser Fragmente wird unter anderem

dadurch ermöglicht, dass die Transformation von BACs in den Wirt E. coli durch Elek-

troporation mit grosser Effizienz durchführbar ist (Shizuya et al., 1992). Das Klonie-

rungssystem ist damit unabhängig von einer Verpackung in Bacteriophagen und die

damit verbundene Grössenselektion. Da die BAC-Vektoren auf dem F-Plasmid (engl.

fertility) des Bakteriums E. coli basieren, unterliegen sie dessen strenger Replikations-

kontrolle und liegen daher in nur in 1-2 Kopien pro Zelle vor. Eine Folge dieser Repli-

kationskontrolle ist die grosse Stabilität der Klone über viele Generationen hinweg. Bei

den inserierten Fragmenten kommt es trotz ihrer Grösse weniger zu Rekombination,

Insertion oder Deletion von DNA-Bruchstücken, wie dies häufig bei anderen Klonie-

rungsvektoren der Fall sein kann.

Cosmid-Vektoren, die dagegen in hoher Kopienzahl pro Zelle vorliegen, haben den

Nachteil, dass einige Sequenzen, die bedingt durch die hohe Kopienzahl zur Instabilität

der Klone führen, folglich nur schwer klonierbar sind. Dazu gehören vor allem repetiti-

ve Sequenzen.

Ein wichtiges Kriterium für Bibliotheken, die zur physikalischen Kartierung durch Hy-

bridisierung verwendet werden, ist, dass sie den zu kartierenden Bereich in überlappen-

den Fragmenten repräsentieren. Nur durch diese Überlappungen ist die Identifikation

benachbarter Klone möglich. Ein als Sonde verwendeter Klon kann benachbarte Klone

in einer Hybridisierung nur dann detektieren, wenn der Überlappungsgrad mehr als 30%

beträgt (J. Hoheisel, persönliche Mitteilung). Bei beiden verwendeten Bibliotheken

wurde die zu klonierende DNA durch Partialrestriktion mit einer Restriktionsendonu-

klease fragmentiert. Durch den partiellen Charakter der Restriktion wird gewährleistet,

dass überlappende Fragmente unterschiedlicher Länge entstehen. Bedingt durch die

zeitliche Begrenzung der Reaktion wird die DNA nicht vollständig fragmentiert, son-

dern nur an einzelnen, zufällig verteilten Schnittstellen. Nachteil dieser Methode ist,

dass die Schnittstellen der jeweiligen Restriktionsendonuklease nicht gleichmässig im

Genom verteilt sind. So kann es grosse Bereiche ohne die jeweiligen Schnittstellen ge-

ben, die folglich nicht fragmentiert werden können und somit aufgrund ihrer Grösse

nicht kloniert werden.

In frühereren Kartierungsprojekten wurde empirisch festgestellt, dass mindestens 10

Genom-Äquivalente erforderlich sind, um eine lückenlose physikalische Karte erstellen

Diskussion

94

zu können (Hoheisel et al., 1993). Die tatsächliche Abdeckung entlang eines Chromo-

soms kann aus diversen Gründen sehr stark variieren (Hoheisel et al., 1995; Frohme et

al., 2000). Bei einer geringen statistischen Redundanz ist es daher leicht möglich, dass

einzelne Regionen gar nicht oder nur unzureichend in der Bibliothek repräsentiert sind.

Für eine gleichmässigere Abdeckung kann nicht nur eine höhere Redundanz, sondern

auch die Verwendung von mehr als einer Bibliothek sorgen. Deshalb wurden in der

vorliegenden Arbeit sowohl eine Cosmid- als auch eine BAC-Bibliothek verwendet, die

sich nicht nur im verwendeten Klonierungsvektor und damit in der Insertgrösse unter-

schieden, sondern auch in der Fragmentierung der inserierten DNA. Im Fall der Cos-

mid-Biblothek wurde die Fragmentierung mit der Restriktionsendonuclease MboI

durchgeführt wurde, bei der BAC-Bibliothek dagegen wurde EcoRI verwendet. Eine

gute Alternative wäre auch die Verwendung einer Bibliothek gewesen, deren klonierte

DNA durch mechanische Scherung, etwa durch Ultraschallbehandlung, fragmentiert

wurde. Die durch Scherung entstehenden Fragmente sind sequenzunabhängig über den

zu kartierenden Abschnitt verteilt, man kann also eine sehr gleichmässige Abdeckung

erwarten. Da aber eine Klonierung von durch Scherung erhaltenen Fragmenten sehr

ineffizient ist, wurde in der vorliegenden Arbeit auf die Generierung einer solchen Bi-

bliothek verzichtet.

Ein weiteres Qualitäts-Kriterium einer zum physikalischen Kartieren verwendeten Bi-

bliothek ist ein möglichst geringer Gehalt an chimären Klonen. Dadurch, dass ein chi-

märer Klon zwei DNA-Fragmente enthält, die aus verschiedenen Regionen des Genoms

stammen, täuscht er in der Hybridisierung Überlappungen von Klonen oder contigs vor,

die in Wirklichkeit nicht bestehen. Bei der Erstellung der Cosmid-Bibliothek wurden

deshalb verschiedene Massnahmen ergriffen, um die Enstehung chimärer Klone zu ver-

hindern: die Ligation zweier genomischer Fragmente miteinander wurde zum einen

durch eine zuvorige Dephosporylierung der Fragmente unterbunden, zum anderen durch

einen deutlichen Überschuss des Cosmid-Vektors während der Ligation. Ausserdem

wurden die Bedingungen der Partialrestriktion so gewählt, dass hauptsächlich grosse

Fragmente entstanden, die aufgrund der durch die Verpackung in λ-Phagenköpfe gege-

benen Grössenselektion nur einzeln kloniert werden konnten. Bei der Verwendung von

BACs als Klonierungsvektor konnte gezeigt werden, dass die Anzahl an gebildeten

chimären Klonen üblicherweise sehr gering ist (Zimmer & Gibbins, 1997). Im Laufe

der Kartierung und später auch der Sequenzierung wurde festgestellt, dass etwa 10%

aller Klone aus beiden Bibliotheken trotz der im Vorfeld ergriffenen Massnahmen chi-

Diskussion

95

mär sind. Chimäre Klone, die als Sonden verwendet werden, können meist recht leicht

in der Karte anhand ihres Hybridisierungsmusters detektiert werden, da sie als einzige

Sonde zwei contigs miteinander verknüpfen. Diese Verknüpfung kann aber meist durch

die Hybridisierungsdaten anderer Sonden nicht bestätigt, teilweise sogar widerlegt wer-

den. Chimäre Klone, die nicht als Sonde verwendet wurden, sondern als positiver Klon

bei einer Hybridisierung detektiert werden, führen zu einem erhöhten Hintergrund an

falsch-positiven Klonen, oft werden aber auch hier die scheinbaren Verknüpfungen

durch die Hybridisierung anderer, nicht-chimärer Sonden widerlegt.

4.2.2. Selektion von Sub-Bibliotheken

Für die Kartierung wurden zunächst Sub-Bibliotheken der beiden betreffenden Chromo-

somen generiert. Dies geschah durch die Selektion der zu dem jeweiligen Chromosom

gehörenden Klone aus den gesamt-genomischen Bibliotheken. Dieser Ansatz wurde der

direkten Erstellung von Chromosom-spezifischen Bibliotheken durch die Klonierung

von chromosomaler DNA vorgezogen, da für eine Klonierung grosse Mengen an Aus-

gangsmaterial benötigt werden, die durch Separation und Isolierung der chromosomalen

DNA mittels Pulsfeldgelelektrophorese nur mit sehr grossem zeitlichen und materiellen

Aufwand erhältlich sind.

Die Selektion der Cosmid-Sub-Bibliotheken erfolgte durch Hybridisierung radioaktiv

markierter chromosomaler DNA auf Klonfilter der gesamt-genomischen Bibliothek,

eine Strategie, die bereits bei der Kartierung von Trypanosoma cruzi erfolgreich ange-

wendet wurde (Frohme et al., 1998). Alle Klone mit positivem Hybridisierungssignal

wurden als zum jeweiligen Chromosom zugehörig identifiziert und selektiert. Da die

generierten Sub-Bibliotheken aber nur eine 8,5-fache Abdeckung von Chromosom V

bzw. eine 10-fache Abdeckung von Chromosom II aufwiesen, was nur knapp der Hälfte

der Redundanz der gesamt-genomischen Cosmid-Bibliothek entspricht, ging man davon

aus, dass nicht alle Klone der jeweiligen Chromosomen identifiziert worden waren.

Dies könnte einerseits darin begründet sein, dass eine zu geringe Menge chromsomaler

DNA für die Markierungsreaktion eingesetzt wurde oder dass die Effizienz der Markie-

rung nicht ausreichend war. Andererseits kann auch eine schlechte Hybridisierungseffi-

zienz dazu führen, dass etliche, eigentlich positive Klone nur sehr schwache Signale

produzieren, die bei der Auswertung der Autoradiographien nicht identifiziert werden.

Da aber nur eine sehr begrenzte Menge an chromosomaler DNA zur Verfügung stand,

Diskussion

96

konnte die Hybridisierung nicht wiederholt werden. Ein weiteres Problem bei der Se-

lektion einer Sub-Bibliothek durch die Hybridisierung chromosomaler DNA kann das

Auftreten von falsch-positiven Klonen sein, die zu einem anderen als dem zu selektie-

renden Chromosom gehören. Bei der Chromosomenseparation mittels Pulsfeldgelelek-

trophorese kann es sowohl bei der Elektrophorese selbst als auch beim Ausschneiden

der chromosomalen Bande zu einer Kontamination mit DNA von anderen Chromoso-

men kommen. Diese Kontaminationen würden in der anschliessenden Hybridisierung

zu falsch-positiven Signalen führen. Ebenso kann es durch die Existenz von homologen

oder repetitiven Sequenzen während der Hybridisierung zur Identifikation falsch-

positiver Klone kommen.

Für die Selektion der BAC-Sub-Bibliothek wurde eine andere Strategie gewählt, da die

Hybridisierung chromosomaler DNA auf die Klonfilter der BAC-Bibliothek nur wenige

schwache Signale lieferte. Cosmidklone, die zuvor als zu Chromosom II gehörig identi-

fiziert worden waren, wurden einzeln oder in Gruppen von bis zu sechs Klonen auf die

genomische BAC-Bibliothek hybridisiert. Alle BAC-Klone mit positivem Hybridisie-

rungssignal wurden dann ebenfalls Chromosom II zugeordnet. Dieses Verfahren wurde

solange durchgeführt, bis keine neuen BAC-Klone mehr identifiziert werden konnten.

Es ergab sich eine Sub-Bibliothek mit einer rechnerischen 11-fachen Abdeckung von

Chromosom II. Auch hier liegt die Redundanz deutlich unter derjenigen der gesamt-

genomischen BAC-Bibliothek. Diese Differenz hat ihre Ursache unter anderem darin,

dass schon die zur Hybridisierung verwendeten Cosmid-Klone aus einer Sub-Bibliothek

mit geringer Redundanz stammten.

Auf eine Selektion einer BAC-Sub-Bibliothek von Chromosom V wurde verzichtet, da

hier die Kartierung zu dem Zeitpunkt, als die BAC-Bibliothek zur Verfügung gestellt

wurde, bereits mit der Cosmid-Bibliothek schon so weit fortgeschritten war, dass zum

Schliessen der Kartierungslücken die gesamt-genomische BAC-Bibliothek eingesetzt

wurde.


Da BAC-Vektoren bedingt durch die Replikationskontrolle des F-Plasmids, auf dem sie

basieren, nur in 1-2 Kopien pro E. coli-Zelle vorliegen, ist die Ausbeute bei einer BAC-

DNA-Präparation naturgemäss sehr gering. Um dennoch ohne erhöhtem Aufwand ge-

genüber der Cosmid-DNA-Minipräparation genügend DNA für die Markierungsreakti-

Diskussion

97

on von Sonden zu erhalten, wurden bestehende Minipräparationsprotokolle modifiziert.

Eine mit geringem Zeitaufwand verbundene Methode stellte der QIAprep® Spin Mini-

prep Kit dar. Dieser zeichnet sich dadurch aus, dass er es ermöglichte, die DNA von bis

zu 24 BAC-Sonden innerhalb weniger Stunden parallel zu isolieren. Mehrere Modifika-

tionen des vom Hersteller vorgesehenen Protokolls mussten eingeführt werden, um das

Verfahren für die Isolierung von BAC-DNA zu optimieren. Statt der üblichen 5 ml

Bakterien-Übernachtkultur wurden 7 ml angesetzt, um die Menge an E. coli-Zellen und

somit die Menge an BAC-DNA zu steigern. Ein noch grösseres Volumen wurde nicht

gewählt, da man aufgrund von Schüttler- und Zentrifugenkapazitäten die Bakterien in

15-ml-Falcon-Röhrchen kultivieren wollte. Da das Verhältnis von Bakterien-RNA zu

BAC-DNA sehr gross ist, wurde der Gehalt an RNase A, die im Resuspensionspuffer

enthalten ist, gegenüber der vom Hersteller empfohlenen Menge verdoppelt. Der im Kit

mitgelieferte Puffer N3, der zur Neutralisation nach der alkalischen Lyse und somit der

Fällung von Zellbestandteilen und Proteinen dient, wurde durch den in anderen von

Qiagen erhältlichen DNA-Präparations-Kits verwendeten Puffer P3 ersetzt. Dieser ent-

hält im Gegensatz zu N3 keine chaotropen Guanidiniumsalze. Letzteres inaktiviert Pro-

teine, würde also auch das zur Fragmentierung der BAC-DNA vor der Säulenreinigung

eingesetzte Restriktionsenzym unwirksam machen. Es erwies sich weiterhin als uner-

lässlich, die Klone seriell zu behandeln, also den Aufschluss der E. coli-Zellen für jeden

Klon einzeln nacheinander durchzuführen. Bei einer parallelen Präparation mehrerer

Klone hingegen, bei der man zunächst die Zellen aller Klone resuspendiert, dann alle

lysiert und anschliessend bei allen durch Neutralisation die Zellbestandteile fällt, wird

die Inkubationszeit der einzelnen Schritte zu lang. Dies wirkt sich aufgrund des ungün-

stigen Verhältnisses von Vektor-DNA zur chromosomalen DNA der E. coli-Zellen ne-

gativ auf die Ausbeute an BAC-DNA aus. Zur weiteren Ausbeutesteigerung wurde die

BAC-DNA vor der Säulenreinigung mit einer Restriktionsendonuclease fragmentiert, da

kleinere Fragmente sich besser von den Anionenaustauschersäulen eluieren lassen, wäh-

rend die sehr grosse intakte BAC-DNA sehr fest an das Säulenmaterial bindet.

4.2.4. Hybridisierungstechniken

Die Hybridisierungen zur physikalischen Kartierung wurden zunächst wie schon in frü-

heren Kartierungsprojekten (Hoheisel et al., 1993; Scholler et al., 1995; Hanke et al.,

1998) mit radioaktiv markierten Sonden durchgeführt. Da aber aufgrund der grossen

Diskussion

98

Sondenzahl mit einer erhöhten gesundheitlichen Belastung zu rechnen war, wurde nach

einer nicht-radioaktiven Markierungs- und Detektionsmethode gesucht. Auf das eben-

falls in unserer Arbeitsgruppe (P. Scholler, persönl. Mitteilung) schon etablierte Atto-

Phos-System (Boehringer, Mannheim) wurde dabei verzichtet, da die zur Detektion der

Fluoreszenzsignale benötigten Kapazitäten nicht verfügbar waren. Mit der chemilumi-

neszenten Detektion von mit Digoxigenin-markierten Sonden wurde eine Methode ge-

funden, die bei vergleichbarer Sensitivität der Hybridisierungen in der Handhabung

wesentlich unkomplizierter war als die Hybridisierung radioaktiv markierter Sonden.

Durch den hohen Durchsatz (bis zu 20 Hybridisierungen parallel) konnten die zur De-

tektion benötigten Mengen an Antikörper- und Substrat-Lösungen relativ gering gehal-

ten werden. Der grössere zeitliche Aufwand durch verschiedene Wasch- und Inkubati-

onsschritte wurde durch kürzere Expositionszeiten der Filme ausgeglichen. Durch die

Möglichkeit der Detektion der chemilumineszenten Signale auf Filmen konnte der be-

stehende Engpass bei den Scannerkapazitäten umgangen werden.

4.2.5. Kartierungsstrategie Chromosom V

Die Kartierung von Chromosom V wurde zunächst nur basierend auf der Cosmid-Sub-

Bibliothek begonnen. Dabei wurde in der Anfangsphase nach dem als „sampling wi-

thout replacement“ (Press et al., 1988) bezeichneten Verfahren vorgegangen, später

wurden zum Schliessen der Lücken Klone von contig-Enden als Sonde ausgewählt. Erst

zu einem sehr späten Zeitpunkt, als mit der Sub-Bibliothek keine Fortschritte mehr er-

zielt werden konnten, wurde zunächst die gesamt-genomische Cosmid-Bibliothek und

schliesslich auch die gesamt-genomische BAC-Bibliothek hinzugenommen. Durch die

Verwendung der gesamt-genomischen Bibliotheken in der späteren Phase des Kartie-

rens sollte sichergestellt werden, dass auch diejenigen Klone identifiziert werden konn-

ten, die aufgrund der relativ geringen Redundanz der Sub-Bibliotheken in diesen nicht

enthalten waren.

Sowohl praktische Erfahrung (Hoheisel et al., 1993) als auch theoretische Vorhersagen

(Grigoriev, 1993) haben gezeigt, dass zum lückenlosen Kartieren eine Anzahl von Son-

den ausreicht, die ungefähr der dreifachen Anzahl an Klonen entspricht, die zu einer

minimalen Klonabdeckung des zu kartierenden Abschnitts nötig sind. Für die Kartie-

rung von Chromosom V wurden jedoch mit 1192 Cosmidklonen und 82 BAC-Klonen

ca. 50% mehr als die berechneten 800 Cosmidsonden verwendet. Trotz dieser grossen

Zahl an Hybridisierungen gelang es nicht, die verbleibenden 20 Lücken in der physika-

Diskussion

99

lischen Karte zu schliessen. Die meisten der Sonden, die in der finalen Phase der Kartie-

rung hybridisiert wurden, lieferten nur redundante Informationen, ohne Lücken zwi-

schen contigs zu schliessen.

Da diese Lücken auch beim Sequenzieren lange bestehen blieben und sich hier trotz der

zusätzlichen Verwendung zweier Plasmid-Bibliotheken mit verschieden grossen Inserts

und einer YAC-Bibliothek bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt nur teilweise schliessen

liessen (B. Fartmann, persönl. Mitteilung), könnte es sich hier um Bereiche handeln, die

prinzipiell schlecht oder überhaupt nicht klonierbar sind. Eine Begründung dafür könnte

sein, dass auf diesen Abschnitten Gene lokalisiert sind, die für die beim Klonieren als

Wirtszellen verwendeten E. coli letal sind oder deren Wachstum stark hemmen. Solche

Abschnitte werden dann zwar kloniert, die betroffenen Zellen sterben jedoch ab und

werden dadurch nicht mit in die Bibliothek aufgenommen. In einem solchen Fall wäre

die Verwendung einer weiteren Bibliothek, die mit einem von E. coli-unabhängigen

Klonierungssystem generiert wurde, hilfreich gewesen. Da aber sowohl bei der Cosmid-

Bibliothek als auch bei der BAC-Bibliothek E. coli-Zellen als Wirt verwendet wurden,

kann ein Fehlen von Genomabschnitten durch eine letale oder stark wachstumshem-

mende Funktion der darauf befindlichen Gene nicht ausgeschlossen werden. Weiterhin

besteht die Möglichkeit, dass es Abschnitte im Genom gibt, die weder Schnittstellen für

die verwendete Restriktionsendonuklease EcoRI, noch für MboI haben. Sind solche

Abschnitte grösser als die durch die Klonierungsvektoren vorgegeben Ausschlussgrö-

ssen, können diese Abschnitte weder in den Cosmiden noch in BACs kloniert werden.

So ist z.B. von der Cosmid-Bibliothek bekannt, dass sie keine Klone mit telomeren Se-

quenzen enthält (Kelkar et al., 2001). Dies ist begründet durch die Sequenz der Telo-

mer-Region, die aus sehr vielen repetitiven Einheiten („repeats“) besteht, die keine

Schnittstellen für die beiden verwendeten Restriktionsendonukleasen beinhalten. Eben-

so ist das rRNA-Gencluster, das auf dem linken Arm von Chromosom V lokalisiert ist

(Radford & Parish, 1997), in der Cosmid-Bibliothek unterrepräsentiert (Kelkar et al.,

2001). Schon in früheren Genomprojekten wurde gezeigt, dass rRNA-Sequenzen

schwierig oder gar nicht zu klonieren sind (Johnston et al., 1997; Frohme et al., 2000).

Die Tatsache, dass trotz der Verwendung zweier verschiedener, theoretisch ausreichend

redundanter Bibliotheken und der Hybridisierung von weit mehr als der berechneten

Sondenanzahl noch Kartierungs- und Sequenzierungslücken bestehen blieben, lässt dar-

auf schliessen, dass die in den Lücken liegenden Abschnitte von Chromosom V in bei-

den Bibliotheken nicht vorhanden waren.

Diskussion

100

4.2.6. Kartierungsstrategie Chromosom II

Bei der physikalischen Kartierung von Chromosom II wurde eine andere Strategie ver-

folgt als bei der Kartierung von Chromosom V. Chromosom II wurde von Anfang an

basierend auf den Cosmid- und BAC-Sub-Bibliotheken kartiert, später wurden auch hier

in der Phase des Lücken-Schliessens beide gesamt-genomischen Bibliotheken verwen-

det. Während bei Chromosom V grösstenteils Cosmidklone als Sonden verwendet wur-

den, dienten bei Chromosom II sowohl BAC- als auch Cosmidklone als Sonde. Auch

für die Kartierung von Chromosom II wurde durch die Verwendung von 191 BAC-

Klonen und 273 Cosmidklonen die theoretische Zahl von 200 benötigten BAC-Sonden

überschritten. In der Endphase konnten trotz der Verwendung der hochredundanten ge-

samt-genomischen Bibliotheken analog zu Chromosom V bestehende contigs nur be-

stätigt werden, ohne die verbleibenden 12 Lücken zu schliessen. Deshalb wird auch hier

die Vermutung bestätigt, dass die in den Lücken plazierten Genomabschnitte nicht klo-

niert wurden.

Eine Methode zum Schliessen der bestehenden Sequenzlücken bestünde in der Verwen-

dung einer weiteren Bibliothek, die sich möglichst im Klonierungssystem und der

Insert-Grösse unterscheidet. Weiterhin besteht die Möglichkeit, Sequenzen an contig-

Enden als Primer zu verwenden, mit denen in einer PCR an genomischer DNA die feh-

lenden Sequenzen amplifiziert werden können. Dies ist aber nur bei Lücken möglich,

die kleiner als 3 kb sind. Eine aufwendigere Methode besteht darin, schrittweise be-

kannte Sequenzen durch Primerextension („primer walking“) auf genomischer DNA zu

verlängeren. Dies erfordert aber für jeden Schritt die Generierung neuer Primer und ist

dadurch sehr zeit- und kostenaufwendig.

Erst die genaue Analyse der vollständigen Sequenz beider Chromosomen wird zeigen,

welche Sequenzen in den zum jetzigen Zeitpunkt noch bestehenden Lücken liegen und

welche Gene in ihnen lokalisiert sind. Das wird erst letztendlich darüber Aufschluss

geben, welches die Ursachen für das Fehlen dieser Sequenzen in beiden Bibliotheken

waren.

Diskussion

101


Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Genexpressionsanalysen unter Ver-

wendung der DNA-Chip-Technologie durchgeführt. Dazu wurde zunächst eine cDNA-

Bibliothek mittels PCR amplifiziert, die PCR-Produkte wurden anschliessend in einem

hochdichten Raster auf Glas-Chips transferiert. Um dieses System zu etablieren, wurden

exemplarisch drei verschiedene Wachstumsbedingungen ausgewählt, deren Transkripti-

onsprofile auf dem N. crassa-Chip erstellt wurden. Weiterhin wurde die Genexpression

von N. crassa mit der Genexpression der Hefe S. cerevisiae verglichen, um die Qualität

der Chips zu validieren.

4.3.1. DNA-Chip-Technologie

Obwohl die DNA-Chip-Technologie eine noch sehr junge Technologie ist, existieren

schon viele verschiedene Systeme, die sich vorallem in der Beschaffenheit der Oberflä-

che und in Art und Länge der auf den Chip aufzubringenden Nukleinsäuren unterschei-

den.

Neben vielen anderen Möglichkeiten der Oberflächen-Modifikation werden vor allem

zwei Typen von Glas-Chips verwendet. Zum einen werden Glas-Chips mit Poly-L-

Lysin beschichtet (Schena et al., 1995), die aufzubringende DNA, die durch die Phos-

phatgruppen mit negativen Ladungen versehenen ist, haftet durch Ladungswechselwir-

kungen an der positiv geladenen Oberfläche. Zum anderen gibt es Glas-Chips, deren

Oberfläche mit Aldehyd-Gruppen funktionalisiert ist. Die zu transferierende DNA muss

zusätzliche Aminogruppen enthalten, über die sie kovalent mit den an der Oberfläche

gebundenen Aldehyd-Gruppen verknüpft wird. Die benötigten Amino-Gruppen können

beispielsweise durch Amplifikation unter Verwendung von Amino-modifizierten PCR-

Primern eingefügt werden.

In der vorliegenden Arbeit wurden ausschliesslich Glas-Chips verwendet, die mit Poly-

L-Lysin beschichtet waren. Die Beschichtung ist nach einem in Stanford entwickelten

Protokoll leicht für bis zu 40 Chips parallel durchzuführen, wodurch nicht nur qualitativ

hochwertigere, sondern auch kostengünstigere Chips als die kommerziell erhältlichen

zugänglich sind (M. Beier, persönl. Mitteilung). Für die Amplifikation der cDNA-

Bibliothek können Standard-PCR-Primer ohne Modifikation verwendet werden.

Diskussion

102

4.3.2. Verwendete cDNA-Bibliothek

Neben der Oberflächenmodifikation unterscheiden sich DNA-Chips in Art und Länge

der auf den Chip aufzubringenden DNA. Häufig werden cDNA-Bibliotheken verwen-

det. Die cDNA-Fragmente werden mittels PCR amplifiziert, wobei meistens die Ver-

wendung eines universellen Primer-Paares möglich ist. Eine zweite Möglichkeit besteht

darin, mit Gen-spezifischen Primern genomische DNA zu amplifizieren. Nachteil dieser

Methode ist das aufwendige Design der spezifischen Primer-Paare und der erhöhte

Aufwand bei der Durchführung der PCR. Weiterhin ist die Verwendung von 50-70 bp

langen Oligonukleotiden möglich, wobei auch hier ein aufwendiges Design der Gen-

spezifischen Sequenzen nötig ist.

Die in der vorliegenden Arbeit für die Genexpressionsanalysen an N. crassa verwendete

cDNA-Bibliothek wurde freundlicherweise vom „Neurospora Genome Project“ (Uni-

versity of New Mexico, USA) zur Verfügung gestellt. Diese cDNA-Bibliothek setzt sich

aus drei Sub-Bibliotheken zusammen, die jede ein bestimmtes Entwicklungsstadium des

Lebenszyklus von N. crassa repräsentiert: Perithecium, Conidien und Mycel. Von ei-

nem grossen Teil der Bibliothek sind die entsprechenden EST´s (expressed sequence

tag) bekannt und in einer Datenbank (Genome Sequence DataBase GSDB; National

Center for Genome Resources NCGR) öffentlich zugänglich. Es handelt sich um eine

nicht-normalisierte Bibliothek, viele Gene liegen also in mehrfacher Kopienzahl vor. Da

bisher nicht alle in der Bibliothek enthaltenen cDNA-Klone sequenziert und analysiert

wurden, ist der genaue Grad der Redundanz jedoch nicht bekannt. Bei einer Untersu-

chung von 1423 zufällig ausgewählten Klonen (Nelson et al., 1997) wurden insgesamt

994 verschiedene Gene identifiziert. Dabei kamen 838 Gene (59 %) nur einmal vor, 156

Gene dagegen in Kopienzahlen zwischen 2 und 55.

Da die Anzahl der Gene von N. crassa auf 10-12.000 geschätzt wurde (Nelson et al.,

1997; Kelkar et al., 2001), ist die cDNA-Bibliothek mit 4700, teils redundanten Klonen

bei weitem nicht vollständig. Solange aber weder die vollständige Sequenz vorliegt,

noch alle Gene identifiziert wurden, ist diese bestehende cDNA-Bibliothek ein guter

Ansatz, um die DNA-Chip-Technologie für N. crassa zu etablieren. Liegen vom voll-

ständigen Gensatz EST-Klone vor, kann das bestehende System entsprechend erweitert

werden.

Diskussion

103

4.3.3. Amplifikation der cDNA-Bibliothek

Die Amplifikation der cDNA-Bibliothek wurde in 384er Mikrotiterplatten durchgeführt.

Vorteil dabei war, dass man die PCR-Platten direkt und ohne kontaminationsgefährdete

Umpipettierschritte aus den 384er Mikrotiterplatten der cDNA-Bibliothek animpfen

konnte. Da das Reaktionsvolumen bedingt durch das 384er-Format nur 25 µl betrug,

wurde jede Platte insgesamt dreimal amplifiziert, um über eine ausreichende Menge an

PCR-Produkt für Vorversuche und das Herstellen der DNA-Chips zu verfügen.

In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass sich bei Verwendung von Betain

als Zusatz zur PCR die PCR-Produkte direkt auf die mit Poly-L-Lysin beschichteten

Chips aufbringen lassen (Diehl et al., 2001). Da Betain eine stabilisierende Wirkung auf

DNA und Proteine hat (Santoro et al., 1992) und ausserdem zu einer Angleichung der

Stabilität von A-T- und G-C-Basenpaaren führt (Rees et al., 1993), trägt es einerseits

zur Optimierung der PCR-Bedingungen bei (Henke et al., 1997). Andererseits erhöht

der Zusatz von Betain die Viskosität der auf den Chip aufzubringenden Lösung und

verringert so deren Evaporationsgeschwindigkeit. Im Gegensatz zur Verwendung von

herkömmlichen Puffern wie 3xSSC bleiben die transferierten Tropfen der DNA-Lösung

mit dem sehr geringen Volumen von maximal 1 nl länger feucht. Die DNA, die allein

durch Ladungswechselwirkung an der Oberfläche haftet, kann sich dadurch einerseits

gleichmässiger über die Fläche des Tropfens verteilen, andererseits wird die Reaktions-

dauer verlängert. Beide Effekte führen dazu, dass mehr DNA an der Oberfläche gebun-

den werden kann.

4.3.4. Markierungsreaktion

Die Markierung von RNA-Proben mit Fluoreszenzfarbstoffen durch reverse Transkrip-

tion kann mit zwei verschiedenen Methoden durchgeführt werden. Zum einen besteht

die Möglichkeit des direkten Einbaus von Fluoreszenz-markierten Nukleotiden während

der reversen Transkription. Dieses Verfahren wird auch bei der radioaktiven Markie-

rung von RNA-Proben verwendet. Nachteil dieser Methode ist, dass der Einbau der

modifizierten Nukleotide aufgrund der Grösse des Fluoreszenzfarbstoffmoleküls ste-

risch stark gehindert ist. So wird normalerweise ein Einbau von einem Fluoreszenzfarb-

stoffmolekül pro 1000 Nukleotide erreicht (Daten nicht gezeigt). Die Menge an Ge-

samt-RNA, die zu einer erfolgreichen Markierung benötigt wird, liegt zwischen 20 und

50 µg. Eine zweite Möglichkeit der Markierung bietet der indirekte Einbau von Mar-

Diskussion

104

kern. In einem zweistufigen Verfahren wird zunächst während der reversen Transkripti-

on einzelsträngige cDNA generiert, die durch Einbau von Aminoallyl-dUTP modifiziert

ist. Im einem zweiten Schritt wird an diese Aminoallyl-Reste ein monoreaktiver Fluo-

reszenzfarbstoffester gekuppelt. Dieses indirekte Markierungsverfahren wurde dem di-

rekten Einbau Fluoreszenz-markierter Nukleotide vorgezogen, da es aufgrund der ge-

ringen sterischen Hinderung des Aminoallyl-dUTP zu höheren Einbauraten führt. So

konnte ein Einbau von einem Fluoreszenzfarbstoffmolekül auf 50-150 Nukleotide er-

reicht werden. Da bei N. crassa die Ausbeute an RNA nicht der limitierende Faktor ist,

wurden jedoch in die Markierung mindestens 7.5-15 µg Gesamt-RNA eingesetzt. Durch

diesen Überschuss soll gesichert werden, dass auch weniger häufig vorkommende Tran-

skripte detektiert werden können.

Sowohl bei der direkten als auch bei der indirekten Markierungsreaktion durch reverse

Transkription wird die cDNA-Erststrangsynthese ausgehend von Gesamt-RNA unter

Verwendung von Oligo(dT)-Primern durchgeführt. Dadurch kann auf den zeitaufwen-

digen und mit Ausbeute-Verlusten verbundenen Zwischenschritt einer mRNA-

Isolierung verzichtet werden (Hauser et al., 1998). Die Verwendung von Oligo(dT)-

Primern bot sich auch deshalb an, weil schon die cDNA-Bibliothek auf mRNA basiert,

die durch Fraktionierung von Gesamt-RNA durch Chromatographie an Oligo(dT)-

Cellulose gewonnen wurde (Lucas et al., 1970). Die zu den Sonden korrespondierenden

Transkripte werden somit in jedem Fall auch mit der Markierungsreaktion erfasst. Al-

ternativ zur Verwendung von Oligo(dT)-Primern für die reverse Transkription können

auch Hexamer-Oligonukleotide eingesetzt werden (Feinberg & Vogelstein, 1983). Da-

bei würde aber nicht nur die mRNA transkribiert werden, sondern vor allem auch ribo-

somale RNA, die 95% der Gesamt-RNA ausmacht. Eine vorangehende Isolierung von

mRNA wäre hier unumgänglich. Vorteil bei der Verwendung von Hexamer-

Oligonukleotiden wäre, dass sehr lange Transkripte gleichmässiger über ihre gesamte

Länge markiert würden, während bei der Verwendung von Oligo(dT)-Primern naturge-

mäss nur die Bereiche des Transkripts ausgehend vom 3´-Ende mit einer Länge bis zu 2

kb markiert werden. Weiterhin wäre die Verwendung eines Gemischs von Gen-

spezifischen Primern möglich. Dabei würden aber immer nur einzelne Gene markiert

werden, nicht die gesamte mRNA-Population.

Die in der vorliegenden Arbeit für die Markierung verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe

Cy3 und Cy5 (Mujumdar et al., 1993) eignen sich aufgrund ihrer gut getrennten Excita-

tions- und Emissionsspektren sehr gut für Zweifarben-Experimente auf DNA-Chips.

Diskussion

105

Nachteil der beiden Farbstoffe ist, dass sie bei Lichteinstrahlung wenig stabil sind. Die-

ses Ausbleichen macht sich bei Cy5 stärker bemerkbar als bei Cy3, weshalb beim De-

tektieren immer zuerst der Cy5-Kanal eingelesen wird. Gute Alternativen bieten die

Alexa™-Fluoreszenzfarbstoffe (Molecular Probes, Niederlande), die sich durch eine

stärkere Fluoreszenz und eine grössere Photostabilität auszeichnen (Wildsmith et al.,

2001). Da die für das verwendete Markierungssystem benötigten monoreaktiven Farb-

stoffester jedoch nur als Bestandteil sehr teurer Reaktionskits verfügbar waren, wurde

auf die Verwendung von Alexa-Farbstoffen verzichtet.

4.3.5. Hybridisierung

Für die Hybridisierung der komplexen Proben auf die DNA-Chips wurde ein Forma-

mid-haltiger Puffer (Welford et al., 1998) verwendet. Da Formamid eine destabilisie-

rende Wirkung auf Wasserstoffbrückenbindungen und somit auf die DNA-Helix hat,

wird die Schmelztemperatur der DNA erheblich herabgesetzt. Dadurch kann die Hybri-

disierung statt bei in wässrigen Puffern erforderlichen 65°C bei nur 42°C durchgeführt

werden, ohne die Stringenz der Hybridisierung herabzusetzen. Die Durchführung der

Hybridisierung in einem temperierten Wasserbad wird dadurch erleichtert. Ein wesent-

licher Vorteil des Formamid-haltigen Puffers gegenüber wässrigen Puffersystemen be-

steht jedoch darin, dass bei der Hybridisierung ein höheres Verhältnis von Signal zu

Hintergrund erzielt wird (Cheung et al., 1999). Um unspezifische Hybridisierungen zu

vermeiden und dadurch die Hintergrundsignale möglichst niedrig zu halten, enthielt der

Hybridisierungspuffer Blockierungsreagenzien wie Denhardt´s-Lösung, SDS und po-

ly(dA). Das ebenfalls im Hybridisierungspuffer enthaltene Dextransulfat trägt dazu bei,

die Hybridisierungskinetik zu beschleunigen (Wahl et al., 1979).

Die Durchführung von Genexpressionsanalysen durch die Hybridisierung einer kom-

plexen RNA-Probe auf einen DNA-Chip basiert auf dem Prinzip, dass die für ein Gen

detektierte Signalintensität direkt mit der Transkripthäufigkeit dieses Gens korreliert

(Schena et al., 1995; Nguyen et al., 1995). Um dies zu gewährleisten, muss die auf den

Chip aufgebrachte Menge an Sondenmaterial in deutlichem Überschuss zu der hybridi-

sierten Probe vorhanden sein. Aus dem Durchmesser der einzelnen Sondenpunkte

(spots) und der Konzentration der aufzubringenden DNA-Lösung, die im vorliegenden

Fall zwischen 100 und 200 ng/µl betrug, kann die auf dem Chip immobilisierte DNA-

Menge kalkuliert werden (Cheung et al., 1999), sie wird bei einem spot-Durchmesser

Diskussion

106

von 100 µm auf etwa 0.2-0.4 ng geschätzt. In die Markierungsreaktion durch reverse

Transkription wurden 15 µg Gesamt-RNA eingesetzt, was bei einem mRNA-Anteil von

etwa 5% einer Menge von 0.75 µg mRNA entspricht. Die reverse Transkription hat üb-

licherweise eine Effizienz von 10% (Granjeaud et al., 1999), so dass man an markierter

Probe etwa 75 ng erhält, die sich auf alle in der komplexen Probe enthaltenen mRNA-

Spezies verteilen. Die tatsächlich gemessene cDNA-Menge lag sogar meist unter die-

sem Wert (Daten nicht gezeigt). Selbst wenn ein Transkript mit der relativ grossen Häu-

figkeit von 1/1000 vorhanden ist, liegt es mit einer Menge von 0.075 ng noch deutlich

unter der korrespondierenden Sonde. Die Hybridisierung erreicht also nie den Sätti-

gungszustand der 100%igen Abdeckung der Sonden mit Probe. Nur dadurch ist ge-

währleistet, dass die detektierte Signalintensität einer Sonde nach der Hybridisierung

proportional ist zu der Häufigkeit des komplementären Transkripts in der komplexen

Probe.

Die Hybridisierungen wurden unter einem Deckglas durchgeführt, wodurch das benö-

tigte Volumen an Hybridisierungspuffer mit 24 µl sehr gering gehalten werden konnte.

Nachteil dieser Methode ist, dass es unter dem Deckglas zu keiner aktiven Vermischung

des Hybridisierungspuffers kommt. Bei Luftblasen oder einer ungleichmässigen Ver-

teilung der Lösung unter dem Deckglas kann es zu einem unregelmässigen Hybridisie-

rungsergebniss mit Bereichen von allgemein schwächeren Signalintensitäten kommen.

Die Hybridisierungskinetik beruht allein auf der Braun´schen Molekülbewegung. Diese

Nachteile werden jedoch durch die hohe Probenkonzentration ausgeglichen.

4.3.6. Genexpression von N.crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien

Die Genexpressionsanalysen wurden durchgeführt, um RNA-Proben aus Mycel von N.

crassa zu vergleichen, dass in drei verschiedenen Nährmedien gewachsen war. Im Mi-

nimalmedium diente Saccharose als einzige Kohlenstoff-Quelle, während im Acetat-

haltigen Medium die Saccharose durch Natriumacetat ersetzt worden war. Im Vollme-

dium war neben Saccharose zusätzlich Casein-Hydrolysat und Hefe-Extrakt enthalten.

Die Bedingung „Vollmedium“ wurde als Kontrolle eingesetzt, mit der die beiden Be-

dingungen „Minimalmedium“ und „Acetat“ verglichen wurden. Wie zu erwarten war,

wurden bei Wachstum unter diesen beiden Bedingungen etliche Gene im Vergleich zur

Kontrolle „Vollmedium“ induziert. Bei nur sehr wenigen Genen kam es zu einer gerin-

geren Expression gegenüber der Kontrolle. Da in beiden Bedingungen weniger Nähr-

Diskussion

107

stoffe zur Verfügung stehen als in der Kontrolle, werden hier mehr Stoffwechselwege

aktiviert, um den nötigen Energiebedarf decken zu können.

Die Gene mit der grössten Änderung ihrer Expression können in drei Gruppen unterteilt

werden. Zum einen gibt es eine kleine Gruppe von Genen, deren Expression bei

Wachstum in Vollmedium niedriger ist als bei Wachstum in Minimalmedium oder in

einem Acetat-haltigen Medium. Hierbei handelt es sich entweder um nicht sequenzierte

Klone oder um Gene, die funktionell noch nicht charakterisiert werden konnten. Aus-

nahme bildet das Gen, das für Halorhodopsin kodiert. Bei diesem Gen konnte die Ex-

pressionsänderung aber weder durch Standardabweichung-Separation noch durch

Min/Max-Separation der einzelnen wiederholten Datensätze validiert werden. Damit ist

der hier angegebene Repressionsfaktor statistisch nicht signifikant genug, um im fol-

genden diskutiert zu werden.

Eine zweite Gruppe umfasst die Gene, die nur bei Wachstum in Minimalmedium indu-

ziert werden. Besonders auffällig ist hier das Gen, das für das nmt1-Protein kodiert und

das in 45 Kopien in dieser Gruppe vorliegt. Bei Wachstum in Minimalmedium ist es um

das 10-fache stärker exprimiert, bei Wachstum auf Acetat-haltigem Medium immerhin

noch um mehr als das Doppelte. Dieses Protein ist an der Thiamin-Biosynthese betei-

ligt. Schon in früheren Studien (Maundrell, 1990; Hansen et al., 1998) konnte gezeigt

werden, dass die Expression von nmt1 (= no message in thiamine) durch Thiamin (Vit-

amin B1) vollständig reprimiert wird. Da das im Vollmedium enthaltene Hefe-Extrakt

reich an Vitamin B1 ist, wird das nmt1-Gen hier nicht transkribiert. Dagegen ist sowohl

im Minimalmedium als auch im Acetat-haltigen Medium kein Thiamin enthalten, die

Expression von nmt1 ist induziert. Die schwächere Induktion von nmt1 im Acetat-

haltigen Medium im Vergleich zum Minimalmedium könnte dadurch erklärt werden,

dass Acetat eine schlechte Nährstoffquelle für N. crassa ist, so dass der gesamte Stoff-

wechselapparat weniger aktiv ist oder auf alternative Stoffwechselwege fokussiert ist.

Die stark induzierte Expression von nmt1 in Minimalmedium (Maundrell, 1990) erklärt

auch die hohe Kopienzahl dieses Transkripts in der cDNA-Bibliothek, zu deren Her-

stellung ebenfalls auf Minimalmedium gewachsenes Mycel verwendet wurde.

Weiterhin zeigen bei Wachstum in Minimalmedium zwei Enzyme der Glykolyse eine

stärkere Expression: Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Glucokinase. Mit

der ATP-Synthase, dem Acylcarrier-Protein, dem ADP/ATP-Carrier-Protein und dem

Ubichinol-Cytochrom C-Reduktase Komplex werden vier Gene induziert, die an der

oxidativen Phosphorylierung beteiligt sind. Transaldolase ist als Enzym aus dem Pento-

Diskussion

108

sephosphat-Zyklus ebenfalls in Minimalmedium stärker exprimiert als in Vollmedium.

Sowohl die oxidative Phorphorylierung als auch der Pentosephosphatweg dienen der

Bereitstellung von Energie-Äquivalenten (ATP bzw. NADPH), die bei Wachstum im

nährstoffärmeren Minimalmedium für die verstärkte Aktivierung zusätzlicher Stoff-

wechselwege nötig sind. Durch den Pentosephosphat-Zyklus werden zusätzlich Pento-

sen und Tetrosen in wechselnden Verhältnissen erzeugt, die bei der Biosynthese von

Nukleosiden und Aminosäuren benötigt werden.

Diese Stoffwechselaktivierung wird auch deutlich an der Induktion der Gene, die für die

an der RNA-Synthese beteiligten ATP-abhängigen RNA-Helicase und dem an der Pro-

tein-Synthese beteiligten 60S ribosomalen Protein sowie dem Translation-

Elongationsfaktor 2 kodieren. Ein erhöhter Bedarf an Enzymen bedingt auch einen An-

stieg derjenigen Enzyme, die an der Synthese dieser benötigten Enzyme beteiligt sind.

Weiterhin wird z.B. auch die Expression des am Aminosäurestoffwechsel beteiligten

Histidin-3-Protein induziert, bei Wachstum in Minimalmedium um den Faktor 9, im

Acetat-haltigen Medium immerhin noch um den Faktor 2,8. Es wird benötigt zur Bio-

synthese von Histidin. Mit Northern Blot-Analysen (Legerton & Yanofsky, 1985)

konnte schon früher gezeigt werden, dass die Transkripthäufigkeit des Genkomplexes

his-3 bei Histidin-Mangel stark induziert ist.

Studien an dem phytopathogenen Pilz Fusarium spp. zum Gen sti35 (Choi et al., 1990),

das ebenfalls bei Wachstum in Minimalmedium induziert ist, konnten zeigen, dass die-

ses Gen bei verschiedenen Stress-Bedingungen wie Behandlung mit Alkohol, diversen

Chemikalien oder Hitze stark induziert wird. Die Induktion von sti35 in Minimalmedi-

um liefert nun einen Hinweis, dass auch ein geringer Nährstoffgehalt ähnlichen Stress

auf die Zellen auszuüben scheint. Dies scheint jedoch nicht für das Wachstum auf Ace-

tat-haltigem Medium zu gelten, da hier keine Induktion von sti35 zu beobachten ist. Die

genauen Mechanismen der Stressantwort durch sti35 sind bislang unbekannt.

Die dritte Gruppe beinhaltet die Gene, deren Transkription am stärksten bei Wachstum

im Acetat-haltigen Medium induziert wird. Diese Gene sind, wenn auch vergleichswei-

se schwächer, ebenfalls bei Wachstum in Minimalmedium induziert. Auffällig ist hier

die Induktion zweier Gene, von denen bislang nur bekannt ist, dass sie durch Licht in-

duziert werden: ccg-2 und ccg-6 (= clock-controlled gene) (Loros & Dunlap, 1991;

Bell-Pedersen et al., 1996). Die sehr hohe Expression dieser beiden Gene, die in abge-

schwächter Form auch bei Wachstum auf Minimalmedium beobachtet wird, kann daher

nicht unmittelbar mit dem Wachstum auf Acetat-haltigem Medium in Verbindung ge-

Diskussion

109

bracht werden. Eine mögliche Erklärung wäre, dass das Mycel dieser Bedingung im

Gegensatz zu dem Mycel der anderen beiden Bedingungen zu einem Zeitpunkt geernet

wurde, an dem aufgrund des zirkadianen Rhythmus von N. crassa unabhängig vom

Nährstoffangebot diese Licht-induzierten Gene stark exprimiert waren. Daran wird er-

sichtlich, welchen Einfluss die genaue Einhaltung der experimentellen Bedingungen auf

die Analyse und vorallem den Vergleich von Transkriptionsprofilen haben kann. Durch

die grosse zeitliche und örtliche Distanz zwischen Kultivierung der Mycel-Proben und

der Hybridisierung ihrer mRNA-Populationen auf die DNA-Chips war es jedoch nicht

mehr möglich, die genauen Wachstums- und Ernte-Bedingungen der einzelnen Proben

nachzuvollziehen. Alternativ besteht auch die Möglichkeit, dass hier neue, bislang un-

bekannte Regulationsmechanismen vorliegen, die bei Wachstum sowohl auf Acetat als

auch auf Minimalmedium zur Induktion von ccg-2 und ccg-6 führen. Das Produkt von

ccg-2 ist Hydrophobin (Bell-Pedersen et al., 1992), das ein Bestandteil der Conidien-

wände ist. Eine denkbare Alternative zur Lichtinduktion wäre daher, dass der Organis-

mus unter suboptimalen Bedingungen wie dem Wachstum auf nährstoffarmen Medien

verstärkt Conidien ausbildet, um so seine Überlebenschancen zu vergrössern. Dies wür-

de unabhängig von zirkadianem Rhythmus oder Lichteinwirkung zu einer Induktion

von ccg-2 führen.Von ccg-6 ist bisher keine biochemische Funktion bekannt, seine In-

duktion könnte aber ein Hinweis dafür sein, dass es analog zu ccg-2 an der Bildung der

Conidien beteiligt ist.

Weiterhin wird bei Wachstum auf Acetat-haltigem Medium die Expression von Cyclo-

philin A um das 14-fache induziert, in Minimalmedium noch um das 5-fache. Von Cy-

clophilin ist bekannt, dass es als Antwort auf Stresseinwirkungen wie z.B Hitze indu-

ziert wird (Joseph et al., 1999). Auch hier könnten bislang unbekannte Mechanismen

vorliegen, durch die Cyclophilin auch bei Nährstoffmangel bzw. Zugabe von Natriuma-

cetat induziert wird.

Ebenfalls bei Wachstum im Acetat-haltigen Medium induziert ist das Gen, das für die

Acetolactatsynthase kodiert. Dieses Enzym ist beteiligt an der Biosynthese von Valin.

Bei Untersuchungen der Acetolactatsynthase im Cyanobakterium Synechocystis (Mae-

stri & Joset, 2000) konnte gezeigt werden, dass es in Gegenwart von Na+-Ionen zu einer

Induktion kommt. Da beim Kultivieren der Probe „Acetat“ dem Nährmedium Natriu-

macetat zugesetzt worden war, liesse sich dieser Induktionsmechanismus auch auf N.

crassa übertragen.

Die Gene, die in mehrfacher Kopie vorliegen, können hinsichtlich ihrer Gewebe-

Diskussion

110

Spezifität untersucht werden. Betrachtet werden die Gene mit drei und mehr Kopien,

bei weniger Kopien ist das Vorkommen in einem Gewebetyp nicht repräsentativ genug

für dieses Gewebe. Das mit der sehr hohen Redundanz von 45 Kopien vorkommende

Gen nmt1 wurde sowohl in Conidien als auch im Mycel und im Perithecium exprimiert.

Seine Expression ist also unabhängig vom Gewebetyp, es wird konstitutiv exprimiert.

Dagegen wurde das Licht-induzierte Gen ccg-2 mit 12 Kopien nur in Conidien expri-

miert. Da das Produkt von ccg-2 Hydrophobin ist, das nur in Conidien vorkommt, ist

diese Gewebespezifität leicht erklärbar. Das Gen für das Stress-induzierbare Protein

STI35 wurde mit sechs Kopien sowohl in Conidien als auch in Mycel induziert, eine

besondere Gewebespezifität liegt hier demnach nicht vor.

Die Genexpressionsanalysen, die auf dem N. crassa-DNA-Chip exemplarisch für drei

verschiedene Wachtumsbedingungen für N. crassa-Mycel durchgeführt wurden, konn-

ten zeigen, dass bei Wachstum auf nährstoffarmen Medium im Vergleich zu Wachstum

auf nährstoffreichem Vollmedium viele Gene induziert werden. Dazu gehören vor allem

Gene, die an verschiedenen Stoffwechselwegen beteiligt sind, aber auch Stress-

induzierbare Gene.

4.4. Ausblick

Die Sequenzierung eines Organismus legt den Grundstein für systematische Funktions-

analysen seines Genoms. Eine physikalische Kartierung, wie sie in der vorliegenden

Arbeit für zwei Chromosomen des filamentösen Ascomyceten Neurospora crassa

durchgeführt wurde, trägt dazu bei, die Redundanz der generierten Sequenzierungsdaten

zu verringern, da aus der physikalischen Karte als lineare Anordnung überlappender

Klone gezielt benachbarte Klone mit geringem Überlappungsgrad für die Sequenzie-

rung ausgewählt werden können. Durch die ständig wachsenden Ressourcen an

hochautomatisierten Sequenzierungseinrichtungen werden inzwischen aber auch Orga-

nismen in der Grössenordnung von N. crassa (43 Mb) im „whole-genome-shotgun“-

Verfahren sequenziert, also ohne vorherige physikalische Kartierung. Durch ein ent-

sprechend grosses Aufgebot an Geräten und bioinformatischen Werkzeugen konnte die

zu 90 % vollständige Sequenzierung von N. crassa am Whitehead Institute Center for

Genome Research (WICGR, Massachusetts, USA) innerhalb weniger Monate durchge-

führt werden.

Diskussion

111

Durch eine detailierte Analyse wurde bei 74 % der bislang im Rahmen des deutschen

Neurospora Genom-Projekts erhaltenen Sequenzen von Chromosom II und V eine Ho-

mologie zu bekannten oder noch nicht charakterisierten Proteinen aus öffentlichen Da-

tenbanken gefunden. Dies stellt eine deutliche Verbesserung zu früheren Studien dar,

bei denen durch Datenbankvergleiche von EST-Sequenzen aus N. crassa gerade 40 %

der untersuchten Sequenzen durch Homologie einem Protein zugeordnet werden konn-

ten (Nelson et al., 1997; Braun et al., 2000). Dies zeigt, welches Potential in der syste-

matischen Analyse und Annotation eines sequenzierten Genoms steckt. Ausführliche

Homologie-Vergleiche vor allem mit der nah verwandten Hefe S. cerevisiae, aber auch

mit anderen bereits sequenzierten Organismen werden Aufschlüsse über Verwand-

schaftsgrade und evolutive Vorgänge geben können.

Mit der DNA-Chip-Technologie wurde eine Technik entwickelt, die es ermöglicht, die

Genexpression vieler tausend Gene gleichzeitig zu untersuchen. Der in der vorliegenden

Arbeit entwickelte N. crassa-DNA-Chip enthält zwar nur einen Teil aller Gene von

N. crassa, ist aber, da der vollständige Gensatz noch nicht bekannt ist, ein wichtiger

Schritt, um die DNA-Chip-Technologie für diesen Organismus zu etablieren. Er diente

dazu, exemplarisch die Genexpression unter drei verschiedenen Wachstumsbedingun-

gen miteinander zu vergleichen. Zukünftige Experimente könnten sich damit befassen,

die Änderungen der Genexpression auch unter zeitlichen Verläufen zu beobachten. Die

detailierte Untersuchung der bei der Erstellung der Transkriptionsprofile identifizierten

Gene wird helfen, regulatorische Mechanismen und bislang unbekannte Zusammenhän-

ge verschiedener Stoffwechselwege aufzudecken und zu erklären.

Literatur

112

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Eigene Publikationen

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6. Eigene Publikationen

Aign, V., Schulte, U. und Hoheisel, J. D. (2001)

Hybridization-based mapping of Neurospora crassa linkage groups II and V

Genetics, 157, (3), 1015-1020

Hoheisel, J.D., Diehl, F., Scheideler, M., Hauser, N., Aign, V., Matysiak, S. &

Beier, M. (2001).

Improving DNA-chip technology; chemical aspects.

in: Novel Approaches in Biosensors and Rapid Diagnostic Assays

(Liron, Z., Brohmberg, A. and Fisher, M., eds.),

Kluwer Academic/Plenum Publishers, London, 165-172.

Lebenslauf

122

7. Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Verena Aign

Anschrift: Friedensstr. 39

69121 Heidelberg

Geburtsdatum: 24.05.1972

Geburtsort: Frankfurt/ Main

Familienstand: ledig

Eltern: Dr. phil Bernhard Aign und Dr. med Renate Aign

Staatsangehörigkeit: deutsch

Schulausbildung:

1978-1982: Grundschule Landgraf-Ludwig-Schule, Bad Homburg

1982-1991: Gymnasium Kaiserin-Friedrich-Schule, Bad Homburg

Studium:

10/91-09/97 : Studium an der Technischen Hochschule Darmstadt (THD)

• Studiengang: Chemie

• Diplomarbeit am Institut für Biochemie, THD

Thema: „Ermittlung der cDNA-Sequenz von 5-Oxo-L-

prolinase aus Schwein“

seit 11/97 Promotion am Deutschen Krebsforschungszentrum, Heidelberg

Abtlg. Funktionelle Genomanalyse, Dr. Jörg Hoheisel

Thema: „ Physikalische Kartierung und Genexpressionsanalysen

im Genom von Neurospora crassa“

Documents

Physikalische Kartierung und Genexpressionsanalysen im