Physiologische und mikrospektrophotometrische Analytik bestrahlter Gewebekulturzellen

Physiological and Spectrophotometric Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells

GERNOT THIESSEN

Mit 53 Abbildungen

GUSTAV FISCHER VERLAG· STUTTGART PORTLAND-OREGON-USA·1972

GERNOT THIESSEN, Dr., Dipl.Ing.

Department Radiologie

Institut fUr Nuklearmedizin und spezielle Biophysik

Medizinische Hochschule Hannover

3 Hannover-Kleefe1d, Postfach ISO

(Deutschland)

ISBN 3-437-10290-7

© Gustav Fischer Verlag· Stuttgart· 1972 . Aile Rechte vorbehalten Gesamtherstellung: Druckerei Mayr, Miesbach Printed in Germany

Inhalt

Abstract. . 1

I. Einleitung und Problematik 6

2. Literaturiibersicht .. 8

3. Populationsdynamische Untersuchungen iiber die Kolonie-GroBenverteilung und das karyologische Verhalten von Stamm­kulturen und Einzelzell-Isolationen . 10

Material und Methodik . I I

Synthetisches Nahrmedium II,

Vitamin-Losung II, Zellsuspension II, Testmedium II, KulturgefaBe II,

InokulationsgroBe II, Einstellung und Regulation des pH -W ertes II,

Klonisolation II, Kolonie-GroBen­analyse 12, Chromosomen­Analyse 12

Wirkungsweise des pH-Regulations­systems auf die zellulare Populations­dynamik. 12

Heterogene Stammkultur .. 14 Homogene Klonisolationen (Cl/II­C2/II - C3/II) .. 17 Karyologische Analyse der Zell­stamme .. 19

4. Ultraviolettmikrospektrometrische Untersuchungen anlebenden Zellen 26

Z ytologische Methodik . 26

Apparative Methodik . . 26

Absorptionsspektren und raumliche Verteilung der N ukleinsauren .. 28 Strahlenbelastung lebender Zellen wah rend der Messung . . 30

5· UV - Dosimetrie und Berechnung der absorbiertcn UV - Dosis bestrahlter lebender Zellen .. 31

6. Untersuchungen der nach UV - und Rontgenbestrahlung induzierten zellu­liiren Effekte 37

Dosiseffekt-Beziehung . 37

Populationsdynamische Unter­suchungen des Bestrahlungseffektes 40 a) Mitosehemmung und -verzogerung 40 b) Wachstumskinetik nach Bestrah­

lung mit subletalen UV - und Rontgen-Dosen sowie deren EinfluB auf die Teilung nachfolgender Generationen .. 41

c) Morphologische Strahlenschiiden .. 46 d) Induktion von Riesenzellen .. 50 e) Chromosomale Strahlenschaden 58

7. Zytophotometrische Bestimmung des Nukleinsauregehaltes von unbestrahlten und bestrahlten Zellen 64

Fixierung 64 Hydrolyse und Feulgenfarbung . . 65 Spermien als Referenzsystem fiir quantitative und relative D NS­Bestimmungen 66 Zellzyklus und DNS-Synthese unbe­strahlter Einzelzellen .. 68

EinfluB von UV- und Rontgen­bestrahlung auf die zellularen Zyklus­phasen .. 69

8. Molekulare Wirkungsweise der UV ­Strahlung auf die DNS-Synthese 83

9· Zusammenfassung 90

Literatur 93

Register 100

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 1

Abstract

Out of the complex connections of biological problems arising after irradiation of cellular objects, suppositions were made and therefore a few questions evaluated which permit further investigations with respect to tissue culture tech­niques, cytologic-cytochemical, radiation gene­tics, and molecular biological aspects. The basis of such intentions are the study of interactions occuring between the radiation and the bio­logical object. Among biological radiation experiments many of them are performed with mammalian tissue culture cells. During the past, the course determination of the survival curves under various modified conditions were a major problem of the investigations. The radiation effect in this respect is consequently represented as a two-dimensional function between the surviving fraction and its dose rate dependence in the sense of a "yes-no-reaction".

It may be seen in the review of the literature that the applied radiation doses vary over a wide range from 4' 103 to I,5 . 105 R for the definition of survival, limited or non-survival of irradiated cells. At the present time, several new micro-techniques are available for detailed analysis of radiation induced cell damage, e. g. the application of micro spectrophotometry for the determination of intracellular distribution of substance concentrations. The examination of the effect of uv- and x-irradiation on living cells and the comparison of both radiation sources with each other are, in this connection, of parti­cular interest.

Corresponding to the differential characteristic of both radiation sources the differences in behaviour between the high specificity of the uv-light to certain cell metabolism and the general cell damage resulting from x-rays has to be considered. Preliminary conditions for the identification of radiation damage, in addition to selection of a suitable object, are the number of analyzeable parameters which permit further informative facts, to be appraised beyond the "yes-no-reaction" in form of a dose effect relationship, as a basis for various extended

radiation experiments. Therefore the analysis of the radiation efficiency should include investiga­tions of population dynamics, the radiation influence on mitosis, the growth kinetics of sub­lethal irradiated cells, and secondary reactions which appear after several cell divisions. Furthermore morphologic changes occur during the colony development, the formation of giant cells induced by radiation as well as chromosomal damage. As a scale of cellular biochemical chan­ges induced by radiation, cytophotometric measurements of the DNA contents of living and fixed cells are conveyed including the radia­tion modifying influence on the different phases of the cell cycle.

An essential component under the aspect of which the investigations were performed, is the quantitative uv-microspectrophotometric deter­mination of the nucleic acid content of living cells including the spectral representation of absorption and the demonstration of nucleic acid mass distribution within interphase cells.

The decisive problem of the uv-radiation ability of the nucleus and plasma during the spectra registration is investigated and the conse­quences to the molecular function of the nucleic acids after uv-energy absorption which arise are considered. The real uv-energy absorbed by a living cell has first been determined, as far as it is known, through the application of a new uv­microdosimetrical method.

A simple operating system for control of pH­variation and cell multiplication was used to attain constant culture conditions so that devia­tions which are not derived from radiation are eliminated. As shown by the course of the growth curves the pH-regulation prolonged the log. phase and increased the cell concentration over a determined range of time. Furthermore through the retaining of the max. cell divisions the P.E. of single cell isolations were enhanced and increase as much as 80-95%. Changes in cell divisions of the so-called "heterogene stemline" were investigated at daily intervals. A broaden­ing of the colony size distribution was observed

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2 . G. TmESSEN

over a prolonged period preceeding culture time; and especially between 24 to 72 hours the curves showed a uniform, symmetrical course and a simultaneous linear decrease of the division maxima of about 10%.

Integrated curves of the colony-size distribu­tion demonstrated a remarkable parallelity. The parallel course of all closely positioned integra­tion curves resulted in four exponential curves deviating only slightly from each other. The parallel course of the curves points out a relatively high degree of homogenous composition within the colonies with their averaged 13-hourly generation time, corresponding to 10,9 divisions during the seven daily experimental duration.

As a basis for further evaluation of the growth kinetics, the heterogenous stemline was com­pared with three clones (Cl/II-C2/II-C3/II) which were established after repeating single cell isolations. The clones Cl/II and C3/II showed in contrast to C2/II a differentially pronounced rhythmical course of cell divisions. Their repeated cyclic behaviour is expressed by the variable distances of the integration curves. The presence of karyological variants within the clones Cl/II and C3/II has been taken into consideration. Maximal deviations of up to 20% in the average duration of the cell cycle were observed between the three clones.

In respect to radiation experiments it was necessary to establish preliminary conditions under which the evaluation of chromosomal changes after irradiation were made possible. Therefore to understand the spontaneous variabilities of the karyotyp, 200 metaphases were analyzed according to their chromosomal numbers from all cell lines after 17, 34 and 51 sub-cultivations. The analysis of the chromo­somal numbers presented a broad spectrum of polyploidy varying from diploid to octaploid karyotypes. The variation of the chromosomal number was different among the clones. One or two chromosomal numbers, so-called stem­line numbers, were dominant in all cell lines. Equivalent DNA-stemlines are determined analogously to the stemline numbers.

By a significantly improved analysis of the colony-size distribution and by karyological

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examinations, consequently undertaken, of the cells not only valuable criteria for the deter­mination of effects induced by radiation were given, but further defined and useful facts for following interpretations of the results were expected.

The uv-microspectrophotometry permits the determination of the nucleic acid and protein contents as well as changes in the concentration of these uv-absorbing substances within micro­scopic dimensions inside a cell. The majority of experiments of this kind is performed with fixed cells. Basic problems had to be solved before uv-spectrophotometric absorption meas­urements on living cells could be made.

The preliminary conditions are that the cells should not be damaged by uv-absorption during the measurement. A method is described by which fundamentally precise dose-values after uv-irradiation of living cells can be evaluated. A uv-microspectrophotometer for measuring absorption spectra of living cells, especially developed for this problem, was used. The intensity and radiation dose of the uv-measuring beam had to be kept very low to prevent radiation damage to the living cell during the absorption measurements.

The absorption spectra, registrated under these conditions, corresponded to actual living cells and not to cells which died during measure­ment or which were damaged through errors in preparation. Absorption spectra of nuclei and plasm of a greater number of living cells were measured over a range of wavelength between 248-300 nm and the averaged values of absorp­tion were represented. An exact separation of the absorption maxima of nucleic acids (A260nm) from the proteins (A 280 nm) of the nucleus and plasma absorption curves is not possible because of cellular heterogeneity. Measurements of living cells showed, through the simultaneous presence of nucleic acids and proteins, that a distinct overlapping effect of the protein absorption with acids had taken place which increased the nucleic acid absorption spectrum.

The deviations from measured averaged values of points on the absorption curves from nuclei and plasm are caused by the cell cycle

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 3

phase itself, and secondly by the time depend­ence of the heterogenetic variation of the present uv-absorbing substances within a determined phase. The appearance of a remarkable high degree of heterogeneity in the distribution of uv-absorbing substances within the nucleus and the surrounding cell regions can be seen by the represented model. The differentiated mass distribution of the uv-absorbing nucleic acids has been quantitatively evaluated.

Investigations of the radiation exposure upon living cells during measurements with uv-light were carried out and their possible radiation­damaging effects to cells were analyzed. The results of the course of the absorbed energy by nucleus and plasma over a range of wavelength between 250-310 nm showed that the radiation dose upon the nucleus and plasma during the registration of the absorption for living cells corresponded to 5% 0 for the nucleus and 2 %

0

for the plasma of that radiation dose (5.I . 10-3

erg/sec), which was used in uv-radiation experiments, is equivalent to the smallest uv­radiation-damaging dose. The difficulties in­volved in the dose determination of living cells are considerable, but nevertheless the uv-micro­spectrophotometer, described here, is an appa­ratus to render a real dose specification and lies in its radiation exposure far below the damaging point of living cells. The actual uv-energy absorption of living cells can be calculated.

There existed preliminary conditions, which on one hand allowed the possibility of a uv­microspectrometric registration of absorption spectra from nuclei and plasm and also on the other hand a sufficiently low absorbed radiation dose at the time of spectra registration, so that effects influencing cell damage were eliminated. Therefore the calculation of the real absorbed uv-energy, because the whole cells received uv-radiation, and since measurements of the absorption spectra are insufficiently uniform due to the fact that data obtained in this way reflects only the situation in single defined measured points within the cell, the calculation is an extrapolation over the irradiated area.

In respect to the heterogenous nucleic acid mass distribution, as demonstrated in a model,

investigating the absorbed uv-dose, it is necessary to take further facts into consideration. In the investigations a HQA I25 W (Filter UG 4/2 mm) was used throughout all experiments as a radia­tion source. For the spectral line group 365 to 366 nm a radiation efficiency of I420 erg/cm2

. sec was determined. The relative spectral distribution of the HQA was known, and from this data further radiation efficiencies of the other lines were calculated by inclusion of the uv-normal. For the wavelength 265 nm a uv­energy of 303 erg/cm 2 • sec in the level (So) of the object was calculated.

Through the application of the filter UG 5/r mm, the loss of transmittance of the uv-light caused by the filter and the introduction of correlation factors for reflexions, the uv-energy of the cell surface level (So).265nm) was dimin­ished to 2I8 erg/cm2 • sec. From the incident radiation dose (So) only a certain part of the energy is absorbed by the living or fixed cells, and other parts are transmitted, scattered or reflected.

For the dose calculation it is necessary to determine the wavelength and regional depend­ency arising from the internal cellular position, and the cell-to-cell uv-energy absorption. The differences dependent on the dominant position in the absorption of the dose determinations are caused by the structuraly differentiated com­position of the cell into nucleus and plasma, as well as particularly within the two cellular ingredients.

These structural differences were determined in fixed cells by the contents of absorbing substantial mass distribution, while the absorp­tion was measured by the wavelength of 260, 280 and 313 nm. Out of this resulted the relative distribution or the relative contribution of both absorbing substances in the two cellular constituents. Even this does not correspondend yet to the real absorption by the living cell.

The measured absorption spectra of living cells for nucleus and plasma are integrated into the calculations, because they show the relative course of absorption, but not the average spectral absorption over the whole cell. Further­more the absorption is also measured too high

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4 . G. THIESSEN

because of light scattering. Therefore the measurements at the wavelength 313 nm are used for correction of the scattered light ("A 4-laW). The exponent (y) (I/AY; Y=4) can be varied between 1-4, whereby a lower exponent is more probable. Calculations of the absorbed uv-dose permit the assumption that the exponent (y) is not of a critical magnitude.

The contributions of the nucleus and plasma absorption in relation to the total absorption were computed. The absorbed dose from nucleus and plasma, differentiated by spectral lines and continuum with dependence on the wavelength, is demonstrated.

The absorbed uv-energy from a Chinese Hamster cell was limited according to the described experimental conditions with 165.34 erg/cm2 • sec as reference energy. If to each cell a defined constant integration-area is coordinated the absorbed uv-radiation energy yields 1,273 . IO-3 erg/sec per cell. A Chinese Hamster cell absorbed about 25% of the incident uv-radiation dose to the level (So) of the object.

Such dosimetric considerations are especially important, when it is necessary to interpret similar induced radiation damage, which is the result of radiation experiments, when various kinds of rays with different action mechanism are involved. An example of such intensive dosimetric considerations is shown in the application of two differently reacting kinds of rays which are compared with the induced radiation effects in order to find a common dose unit, e. g. to distinguish between the specific acting non-iolllzmg uv-light and the non­specific but ionizing x-rays on certain meta­bolism.

Extensive evaluations are necessary to obtain sufficient informations about cellular effects directly induced by radiation and further concerning the secondary consequences. The survival curves permit only a general view regarding the maintenance of cell division, and the ability of irradiated cells to develop colonies. Population-dynamic investigations of the radiation effects are concerned with various problems of growth kinetics of cells after irradiation with sublethal uv- and x-doses and

their influence on cell divisions over several succeeding generations, e. g. visible morpho­logical radiation damage such as giant cells, chromosome aberrations etc.

UV - and x-radiation caused mitotic delay depending on the kind of radiation and doses as well even in a very low range of doses around 0.01 . IOS erg/g or 0.04' IOs erg/g respectively. The proliferation ability after uv- (0,01-1,8 . IOs erg/g) and x-irradiation (0.04-5.5' IOs

erg/g) was hindered for a duration of 50 hrs. The growth kinetics influenced by irradiation with x-rays (5.5 . IOs erg/g) and uv-light (I.8 . IO S erg/g) resulted in prolongation of the cell cycle of up to 20 hrs. As seen by a comparison of equal radiation doses, uv-light was about 3 times more effective than x-rays.

Microdensitrometric DNA absorption meas­urements of so-called "cell-tetrades" showed distinctly a partial synchronization of the unirradiated and sublethally irradiated cells which maintained their reproduction within the tetrade-stage. It was found that synchronization induced by radiation is possible and to a certain extent influenceable. In contrast to the control (72 hrs), all the cell cultures irradiated with uv and roentgen showed a distinct delimitation of their colony-size distribution 48 1m later.

Within a continous interval of time after the period of radiation, a dose dependence broaden­ing of the colony-size distribution spectra was observed. An exact classification of the morpho­logical changes, induced by the source of radi­ation or doses, was impossible. The only differ­ence which could be determined concerned the degree of a defined characteristic occurence and the frequency of certain symptoms.

Only a few among many changes could be identified: (a) variations induced by irradiation of the nucleus and cell division mechanism, (b) visible destruction of individual regions or of the whole cytoplasma, (c) giant cells (single­nucleated), (d) multinucleated cells, as well as the development of "nuclei-rosettes" originating from asynchronic divisions of multinucleated cells and the presence of micronuclei located within or without the cell plasma. The nuclei

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Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 5

showed after uv- (0.24 . 105 erg/g) and x-irra­diation (1.4' roS erg/g) very similar induced symptoms.

Both radiation sources acted differentially in the manner of their plasma damaging ability. Distinct changes of the measured DNA distri­bution were observed within a certain time after the irradiation of the cells.

With the appearance of 6c and 8c DNA values per nucleus the induction of giant cells or polyploid cells were concluded. The dis­organisation of the cell functions increased the generation time of giant cells by up to 22.4 hrs. During the forming of giant cells the following two phases of development (a) induction and (b) stabilization of the giant cell formation were established.

UV-light and x-rays acted differently on the basis of the causal mechanism of chromosomal aberration induction. The majority of the chromosomal anomalies induced by radiation are chromosome and chromatide aberrations. The rate of aberrations per roo erg/g absorbed energy after x-irradiation amounted to 0.005 to 0.00! and following uv-light to between 0.003 to 0.001 per cell. In this complex of questions no investigations are included which concern the kinetics of the nucleic acids and protein meta­bolism immediatly after irradiation.

The freeze-substitution technique seemed for physicochemical and histochemical reasons to be the most satisfactory technique of fixation, especially concerning the optical behaviour of the object to uv-microspectrometric measure­ments. If the cells are considered as a multi­phasic protoplasm system, the control of the speed course during the freezing and thawing process is essential for the constitution of the cell preparations. The immediate decrease of temperature diminishes the risk of cellular damage, e. g. vacuolization of the nucleus­plasma-region. Such preparative errors may easily be mistaken for induced morphologic radiation damage within similar regions. Through the application of quick freezing, secondarily induced dislocations of intracellular substances and changes in cell volume were

diminished to a minimum without leaving any effects on quantitative microspectrometric meas­urements.

The DNA and chromosomes are demon­strated by Feulgen staining. The relationship between the duration and temperature of hydrolysis and the influence of the pH-value of the staining solution and their colour intensity are tested with sperms. As a reference system for all DNA determinations bull sperms were used.

Quantitative and relative cytospectrometric determinations of the contents of nuclear acids or DNA are performed on unirradiated, irra­diated, living, fixed, unstained as well as stained single ovary cells at the wavelengths 260 and 560 nm.

At the same time the duration of the cycle phases, the nucleic acids corresponding per time unit or DNA contents of the cells were settled after irradiation with different uv and x-doses. The radiation effects are determined by the kind of radiation and dose dependency, the delaying, the beginning of the DNA synthesis and the reduction of the synthesis per time unit. Addi­tional information about the action of uv on the molecular level of irradiated DNA is evaluated.

Some experiments are concentrated on the relationship between uv-light and the DNA molecule. Although many effects are induced by uv-radiation, the efficiency, i. e. the active spectrum of the biological changes, depends on the knowledge of the percentual spectral composition of the absorbed uv-radiation from the range of wavelength between 240-300 nm and the energy content of individual wavelength.

The uv-induced thymine dimerization is one of the most important process in molecular dimensions through which the biological activ­ity in general and the DNA replication, espe­cially during the synthetic phase, are influenced. The DNA synthesis will not be interrupted by the development of dimers; only the speed of replication per time unit is reduced.

As proved, the absorbed uv-radiation dose constitutes 1.275' ro-3 erg/sec· cell. The ab­sorbed energy per second from a nucleus has

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6 . G. THIESSEN

been calculated at 0.958 . 10-3 erg/sec· nucleus. This absorbed uv-radiation dose is sufficient to induce 0.22 . 106 dimers/sec . nucleus. The ab­sorption of 5.8' 102 quanta on an average is necessary for the induction of one thymine dimer.

This value is related to a uv-radiation source with a well-known percentual spectral compo­sition and depends on the number of absorbed quanta/sec· nm over a range of wavelength between 250-300 nm. The investigation demon­strated that an absorbed uv-energy of 0.1 . 105

erg/g (=2.3' 106 absorbed quanta/nucleus) decreased the DNA synthetic efficiency during the S-phase by 10-12 g DNA/nucleus, i. e. through the irradiation 2 • 109 nucleotides less are formed.

Consequently one uv-quantum hindered the DNA synthesis of about 870 nucleotides. An equal depression of DNA synthesis correspond­ing to 870 nucleotides occurred by an energy absorption of 10 e V after x-irradiation.

For the induction of one thymine dimer at A 265 nm about 1.1' 103 quanta are needed. Proceeding from an energy of 4.7 eV/quantum atA 265 nm 1.1 . 103 quanta/dimer correspond to 5.2 KeV/dimer.

1. Einleitung und Problematik

Das Eindringen in den strahlenbiologischen Problemkreis wird erschwert durch die kom­plexen Zusammenhange innerhalb dieses Fach­gebietes. Es ware deshalb zweckmaBig, solche naturwissenschaftlichen Grenzgebiete, wie die Strahlenbiologie, in erster Naherung in die medizinische Strahlenbiologie und die natur­wissenschaftlich orientierte Richtung mit ihren klassischen biologischen Arbeitsgebieten, der Strahlengenetik, Strahlenzytologie, moleku­laren Strahlenbiologie und Photobiologie, als Bereiche der Grundlagenforschung zu unter­teilen.

Mit fortschreitender Erweiterung der An­wendungsmoglichkeiten von Strahlen und aus der Tatsache heraus, daB jedes biologische Objekt durch Strahlung beeinfluBt wird, ist die

The action of radiation by uv-light and x-rays is comparable on the basis of the number of modified molecules per 100 eV (G-value). For the dimer-producing uv-radiation the G-value corresponds to 0,019. Under the preliminary conditions that after x-radiation 10 eV diminish the rate of DNA synthesis by 870 nucleotides, the calculated G-value which is equal to the related synthesis reduction is therefore 8700.

Besides dimer induction as a reason for radiation damage, the reduction of DNA replication is also caused, to an essential part, by the photo­hydration and cross-linking of the DNA mole­cule.

After the application of the modifying radia­tion on cellular basis, the evaluated results describe at least for some cases tendencies of behaviour which are also might be expected by other biological objects.

Besides the subjective impression of morpho­logical and cytochemical changes, occured, additional quantitatively objectivated aspects are needed for further progressive computer evaluation. Essential in this respect are the search for descriptors and the discrimination of such parameters of which the radiation damage is constituted.

Erkennung und Analyse der den Strahleneffekt induzierenden Wechselwirkungsprozesse we­sentlich.

Bei strahlenbiologischen Untersuchungen finden tierische und menschliche Gewebe­kulturzellen eine zunehmende Verwendung. Sie teilen mit den Mikroorganismen, den haufig bevorzugten Objekten, u. a. den Vorteil der Kultivierbarkeit in vitro, stehen aber anderer­seits den Zellen eines Organismus weitaus naher. Ergebnisse, die sich durch die Applikation des modifizierenden Agens «Strahlung» auf zellu­larer Basis ergeben, konnen zumindest als Trenddeskriptoren des Reaktionsverhaltens auf hohere Organismen iibertragen werden.

Die Periode der qualitativen Strahlenbiologie, in deren Vordergnmd die subjektive Erfassung

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morphologischer Veranderungen stand, wurde durch quantitative Aspekte nach Eiufiihrung mathematisch-statistischer Methoden zur Inter­pretation der Ergebnisse erweitert. Diese aiteren Untersuchungen (1923-1947) bestanden vor­nehmlich in der Aufnahme von Dosiseffekt­Kurven. Der durch Strahlung induzierte Effekt kann im Sinne einer JA-NEIN-Reaktion nach dem ALLES- oder NICHTS-Gesetz defmiert werden und fiihrt zur Darstellung der Ober­lebensrate ais Funktion der Dosis. Diese Art des V orgehens ist nicht geeignet, die zwischen der Absorption von Strahlungsenergie und dem induzierten Effekt abgelaufenen Reaktions­schritte aufzuklaren; dennoch ist die Dosis­effekt-Kurve das gegenwartlg wichtigste strahlenbiologische Diagramm ftir den orien­tierenden Oberblick geblieben.

Die quantitative Strahlenbiologie wurde durch die Einftihrung modifizierender Para­meter erweitert, so daB die Strahlenschadigung aus der Kombination mehrerer Parameter resul­tiert. Das Ziel zeitgemaBer Untersuchungen sollte nicht nur die Feststellung kausaler Schadi­gungsergebnisse ais Folge komplexer Reaktio­nen sein; von groBter Bedeutung ist hingegen die Feststellung und Aufklarung von Einzel­ereignissen. Dies zu analysieren, ist selbst auf zellularer Basis ein umfangreiches V orhaben.

Der Strahlenbiologie stehen differenzierte Untersuchungsmethoden zur Verfiigung, so-­z. B. die Technik der Mikrobeambestrahlung, bei der nur einzelne Teile einer Zelle der Strahlenwirkung ausgesetzt werden. Auch die zytotechnologischen verfahren der Analyse eines zellularen Strahlenschadens haben sich auBerordentlich entwickelt. In Verbindung mit den genannten Mikrobeambestrahlungen liegt es nahe, quantitative zytophotometrische MeB­verfahren anzuwenden, die ftir die Einzelzelle (THIESSEN, a. u. b in Vorber.) oder einzelner ihrer Bestandteile Angaben tiber die Konzen­tration bestimmter wichtiger Substanzen ermog­lichen. Insbesondere die Entwicklung der Scanning-Mikrospektrophotometrie zum Ab­tasten kleinster intrazellularer Bezirke ftihrt zur Objektivierung deskriptiver, subjektiver mor­phologischer Eindrticke auf zytochemischer

Grundlage und schafft V oraussetzungen zur Defmition von Bestrahlungseffekten in digitali­sierter Form.

Grundiage fiir die Anwendung der Methode zur Partiaibestrahlung von Gewebekulturzellen ist jedoch die Priifung des Objektes auf dessen Eignung und die Aussagekraft nach Gesamt­bestrahlung. Hierbei ist von besonderer Bedeu­tung, die Wirkung von UV - und Rontgen­strahlung zu prtifen und miteinander zu ver­gieichen. Beginnt die Ereigniskette mit der Energieabsorption im zu untersuchenden Ob­jekt selbst, entsprechend der Wirkungsweise der UV-Strahlung, die vornehmlich von den Biomolektilen der Nnkleinsauren und einigen Aminosauren der Proteine bestimmter bio­logischer Strukturen absorbiert wird, so ist der durch direkte Strahlenwirkung induzierte Effekt zytochemisch-zytophotometrisch aus­wertbar. 1m Gegensatz zur hochgradig spezifisch wirksamen UV-Strahlung wirkt die Rontgen­strahlung weitgehend unspezifisch durch inter­molekulare Energieleitung auf ungesattigte Molektile, so daB indirekte Strahlenwirkungen erfolgen.

Die durch beide Strahlenarten hervorgerufe­nen irreparablen molekularen Veranderungen innerhalb des biologischen Objektes fiihren zur Manifestation von Strahlenschaden unterschied­licher GroBenordnung. Flir sich allein betrachtet, wiirden Untersuchungen der UV-Strahlen­wirkung in den Bereich der Photobiologie fallen, sie werden aber zum besseren Verstand­nis der Vorgange, die durch ionisierende Strahlen ausgelost werden, zum Vergleich in strahlenbiologische Experimente einbezogen. Des weiteren werden Ergebnisse tiber die Wirkungsweise der UV-Strahlung bei mikro­spektrometrischen Untersuchungen benotigt, die zur Abschatzung der kritischen StrahIen­belastung wahrend des MeBvorganges von lebenden Zellen im UV -Bereich dienen.

Die durchgeftihrten Untersuchungen, tiber die in den folgenden Kapiteln zu berichten ist, sollten ais Grundlage weiterfiihrender Bestrah­lungsexperimente in Verbindung mit differen­zierten zytotopographischen Datenerfassungs­und -verarbeitungstechniken an Gewebe­

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8 . G. THIESSEN

kulturzellen verstanden werden (THIESSEN, 1971). Die Experimente wurden an emem Objekt mit guter Reproduzierbarkeit durch­gefuhrt. Da auch zytologische Kriterien in die Untersuchungen einbezogen wurden, konnte als Objekt nur eine Spezies mit wenigen, aber relativ leicht analysierbaren Chromosomen in Frage kommen. Die ovarialen Zellen des Chinesischen Hamsters, Cricetulus barabensis griseus Milne-Edwards, mit 22 Chromosomen des normalen diploiden Karyotypes entsprachen diesen Anforderungen.

Aus der nachstehenden Literaturubersicht geht deutlich hervor, daB Ergebnisse, die an ganz bestimmten Zellkulturen erarbeitet wur­den, nur zeitlich begrenzt ohne V orbehalte auf spatere Experimente ubertragbar sind. Ursache fur hauhg widerlegbare Deutungen und Er­klarungen ist die unzuverlassige Dbertragbar­keit detaillierter Ergebnisse von Allgemein­gultigkeit, weil eine Vielzahl von Abweichungen innerhalb einer in vitro kultivierten Gewebeart auftreten und sich schon unter leicht veranderten Versuchsbedingungen entgegengesetzte Resul­tate ergeben konnen. Jedes permanent in vitro gehaltene Gewebe unterliegt im Laufe der Zeit aufgrund der kunstlichen Umweltbedingungen einer Fluktuation in morphologischer, zyto­logischer und biochemischer Hinsicht, die durch

2. Literaturiibersicht

Mit Fragen der physiologisch und genetisch bedingten Variabilitat, deren Auswirkung auf den Mitosezyklus, die Dauer der Teilphasen sowie uber die allgemeine Multiplikations­fahigkeit von Zellkulturen haben sich eine Reihe von Autoren befaBt. NIAS et al. (1965) konnten an HeLa-Populationen zeitlich bis zu 140% abweichende Zellteilungsspektren des Koloniewachstums nachweisen. Diese negative Eigenschaft genannter und anderer Gewebe­arten erweitert den Schwierigkeitsgrad der exakten Versuchsdurchfiihrung, weil eine zeit­lich unkontrollierbare Verschiebung der D NS­Synthesephase zu befurchten ist. Die hiermit 1m Zusammenhang stehenden genetischen

kulturtechnische MaBnahmen nur in begrenz­tem Umfang beeinfluBbar ist. Von dies en V oraussetzungen ausgehend ergab sich die aus mehreren voneinander abhangigen Fragen­komplexen bestehende Thematik:

Die genaue Kenntnis des allgemeinen und speziellen populationsdynamischen und karyo­logischen Verhaltens der betreffenden Gewebe­kultur-Zellart sind Grundlage aller weiter­fuhrenden Untersuchungen. UV -dosimetrische Probleme und mikrospektrophotometrische Messungen im UV-Bereich an lebenden Zellen sind notwendige Voraussetzungen fur die ver­gleichende Interpretation von Effekten, die durch UV - und Rontgenbestrahlung induziert werden. Hierzu bedarf es einer Anzahl von Techniken und Kriterien, die in ihrem Aussage­wert ausreichend sind, um die durch Bestrahlung hervorgerufenen Veranderungen nach morpho­logisch-genetischen, zytologischen und bio­chemischen Gesichtspunkten analysieren zu konnen. 1m subletalen Dosisbereich konnen zytophotometrische Bestimmungen des Nuk­leinsaure-Gehaltes an Einzelzellen AufschluB uber die Strahlensensibilitat einzelner phasen innerhalb des Zellzyklus geben. Diese Ergeb­nisse wurden Ruckschlusse tiber die molekulare Wirkungsweise absorbierter UV-Energie auf den zellularen DNS-Stoffwechsel erlauben.

Ursachen sind seit langerer Zeit an einer Anzahl von Zellstammen bekannt und berucksichtigt worden (Hsuu. MOORHEAD, 1957; Hsuu. KLATT, 1958; YERGANIAN U. LEONARD, 1961; AUERSPERG, 1966).

Viele temporar und permanent in vitro kulti­vierte Zellstamme, einschlieBlich denen des Chinesischen Hamsters, weisen Instabilitat und spontane Veranderungen des Karyotypes auf, so daB sich hieraus die Notwendigkeit ergab, diesen Faktor an einer Anzahl Einzelzell-Isola­tionen zytologisch naher zu analysieren, und falls moglich, durch GegenmaBnahmen kontrol­lierbar zu beeinflussen. Karyologische Varianten unterschiedlichen AusmaBes wurden in anderen

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Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 9

Gewebekulturen festgestellt und konnten z. T. autoradiographisch nachgewiesen werden (PENTTINEN, 1957; HAUSCHKA u. LEVAN, 1958; PUCK et aI., 1958; PENTTINEN u. SAXEN, 1959; SAKSELA, et aI., 1960; TAYLOR, 1960; MURPHY et aI., 1962; HAYRY et aI. 1966).

Ein weiteres Kriterium fUr die vergleichende Strahlenwirkung beider Strahlenarten ist die Darstellung der Dosiseffekt-Kurve, die an ver­schiedenen Objekten unter anderer Frage­stellung bearbeitet wurde (PUCK, 1959; ALPER et aI., 1960; ELKIND et aI., 1963; CULLEN u. HORNSEY, 1966; HAHN u. BAGSHAW, 1966). Hinzu kommen Fragen des speziellen Kurven­verlaufes der Dosiseffekt-Beziehung, da gerade in der neueren Literatur durch modifizierte Umweltbedingungen Veranderungen des Kurventypes, dessen Teilstiicken und dement­sprechender Dberlebensraten stattgefunden haben (BARENDSEN, 1962; LUND u. ROSENGREEN, 1966; ARLETT, 1970; LANGE, 1970; STROUD et aI., 1971).

Des weiteren ergaben sich, auf die zellulare Strahlensensibilitat bezogen, auBerordentlich groBe Differenzen, die zwischen applizierten Rontgen-Strahlendosen von 600-150000 R vari­ierten. So berichtet GOLDFEDER (1961) von Rontgen-Dosen zur volligen Inhibition des Zellwachstums, die zwischen 80000-150000 R liegen, wahrend LUND u. ROSENGREEN (1966) ebenfalls 60000 rad einer 6OCo-Quelle zur all­gemeinen Hemmung benotigten, aber anderer­seits fUr HeLa selbst noch nach 120000 rad eine Zellvermehrung mutierter Zellen feststellen konnten. PUCK u. MARCUS (1955) hingegen hatten bereits nach Bestrahlung mit 600 rad nur noch 0,5% uberlebende HeLa-Zellen. PUCK et aI. (1958) stellten am gleichen Objekt etwas spater dessen Letalitat bei 4000 R fest.

Am Beispiel dieser Ergebnisse zeigt sich deut­lich, in welchen Dosisbereichen die Strahlen­sensibilitat liegen kann, so daB von einer Dber­nahme der Resultate aus den zitierten Literatur­quellen abgesehen wurde. Aus diesen GrUnden hatte, wie einleitend dargelegt, die Bestimmung der Strahlensensibilitat erneut zu erfolgen.

Wie vorstehend angedeutet, abgesehen davon, daB es sich hierbei nur urn JA-NEIN-Reak­

tionen handelt, miissen andere durch verschie­denartige Bestrahlungen beeinfluBbare, emp­frndlichere intrazellulare Systeme berUcksichtigt werden, wie z. B. die von REVESZ u. NORMAN (1960) und Yu (1964) angedeutete Sensibilitats­gradation in Abhangigkeit yom Ploidiegrad flir genetisch inhomogene Kulturen der Ehrlich Ascites Zellen und Lungenzellen des Chines i­schen Hamsters. Aus diesen GrUnden sind Vor­untersuchungen empfehlenswert, die sich mit der Stabilitat des diploiden Chromosomensatzes befassen, damit eine maximal mogliche, einheit­liche Strahlenwirkung auf die Zellen voraus­gesetzt werden kann. Hinzu kommen Fragen der Strahlenselektion und die zum Teil beschrie­bene «Resistenz» wiederholt bestrahlter Zell­sramme und der hieraus resultierenden Mutan­ten (WHITFIELD u. RIXON, 1960; YERGANIAN u. LEONARD, 1961; MUTA u. KOIWAI, 1970).

Betrachtungen Uber die wirksamkeit der aufgestrahlten UV -Energie oder die «biologische» Dosimetrie an T2- bzw. <Dx-174 Phagen standen im V ordergrund vieler bisheriger uv-dosimetri­scher Publikationen (LEE u. PUCK, 1960; SINCLAIR u. MORTON, 1965; RAUTH u. WHITH­MOORE, 1966). Es lag deshalb nahe, Untersuchun­gen durchzufUhren, die sich nicht nur mit der in der Objektebene einfallenden Strahlungs­leistung befaBten, sondern viel wesentlicher erschienen Experimente, die einen Dberblick von der tatsachlich durch die lebende Zelle absorbierten UV -Energie vermitteln. FUr diese uv-mikrospektrophotometrischen Untersuchun­gen an lebenden Zellen mUssen kritische Fak­toren der Objektbehandlung bedacht werden (SANDRITTER, 1958; RUTHMANN, 1966), urn Fehler, die besonders zur Heterogenitatszunahme der absorbierenden Nukleinsaure fLihren, bei der Aufnahme von Absorptionsspektren und Dar­stellung der raumlichen Verteilung vermeiden zu konnen. AuBerst selten wurden in den publikationen Fragen der UV-Strahlenbela­stung von Zellkern und Plasma wahrend der Messung lebender Zellen berUcksichtigt.

Ein weiteres Problem ist die Erfassung und Interpretation des induzierten Strahlenschadens. Dazu gehort u. a. die Beurteilung des Verhal­tens bestrahlter Zellen im Hinblick auf ihre

99

10 . G. THIESSEN

Teilungsfahigkeit und -geschwindigkeit, des genetischen und reproduktiven Zelltodes, die Bildung biochemischer Varianten (SHEEK et al., 1960; PAINTER U. HUGHES, 1961; TERASIMA u. TOLMACH, 1963; NIAS et al., 1965) sowie der EinfluB modiflzierter, subletaler Strahlendosen auf die Dauer oder zeitliche Verschiebung der phasen innerhalb des Zellzyklus (LAJTHA et al., 1958; COOPER U. ALPEN, 1959; BERRY et al., 196 I; SISKEN et al., 1965; DEWEY et al., 1966; DJORDJEVIC U. TOLMACH, 1967; HOPWOOD u. TOLMACH, 1971; WESTRA U. DEWEY, 1971). ROBBINS U. SCHARFF (1967) konnten nach Inkor­poration von 14C-Thymidin keine GcPhase bei partiell synchronisierten Lungenzellen des Chinesischen Hamsters nachweisen. Verande­rungen der DNS-Synthese und die von der speziflschen UV-Strahlung hervorgerufenen

molekularen Veranderungen der DNS, wie sie in vitro nachgewiesen werden konnten, tragen zur Abrundung der vielseitigen Fragestellung der vorstehend genannten Problematik bei (HOWARD u. PELC, 1953; BEUKERS u. BERENDS, 1961; ERIKSON u. SZYBALSKI, 1961; WACKER, 1961; WULF u. RUPERT, 1962; TROSKO et al., 1965; KLIMEK, 1966; KLIMEK U. VLASINOWA, I966; KUZIN U. WAINSON, I966; RASSMUSSEN U.

PAINTER, I966; SMETS U. DEWALDE, I966; FAHR, I967; BAKER et al., I970; EVANS et al., I970; HABAZIN U. HAN, I970; HUMPHREY et al., I970; PAINTER et al., I970; PETROVIC, I970; POLLARD U. DAVIES, I970; SANDERS et al., I970; SAWADA U. OKADA, I970; TROSKO U. ISOUN, 1970; BRENT U. WHEATLEY, I97I; PETERSON et al., 197I; SMETS U. BROHEE, I971; SMETS U. CORNELIS,

I97I).

3. Populationsdynamische Untersuchungen iiber die KoloniegroBenverteilung und das karyologische Verhalten von Stammkulturen und Einzelzell-Isolationen

Die im Zusammenhang mit den Unter­suchungen erarbeiteten Ergebnisse wurden aus­schlieBlich an ovarialen Zellen des Chinesischen Hamsters (CHO), Klon A (Herkunft: Strange­ways Laboratory, Cambridge, England) durch­ge£uhrt.

Reproduzierbare Kulturbedingungen wurden durch die Anwendung eines regulierbaren, auf pH-Veranderungen und Zellvermehrung unab­hangig voneinander wirkenden Systems erreicht. Durch diese Anordnung wurde keine zusatz­liche Komponente eingefuhrt, die zur Steige­rung einer bereits vorhandenen genetisch be­dingten Variabilitat beitrug. Heterogenitaten innerhalb von Zellpopulationen machen sich besonders bei strahlenbiologischen Unter­suchungen nachteilig bemerkbar, weil die aus Einzelzellen hervorgegangenen Koionien eine groBe Streuung hinsichtlich ihrer Zellzahien aufweisen. Dieses Verhalten soUte zunachst genauer analysiert werden. Man konnte erwar­ten, daB sich Zellen, die sich aus mehrfach isolier­ten Klonen ableiten, bei der Koioniebildung an­

ders verhalten als jene der Stamrnkultur. Ferner sollte die Analyse ergeben, in welchem AusmaB sich die Zellen einer Kolonie synchron teilen und innerhalb welcher Grenzen die Mitosedauer variiert.

Dies ist um so wichtiger, ais die Anwendung chemischer Substanzen zur Synchronisation zunachst vermieden werden sollte, da sie bei strahienbiologischen Versuchen zu schwer uber­sehbaren, zusatzlichen Einflussen fuhren kann. Andererseits konnten nicht erfaBte, naturliche Schwankungen der Teilungsrate faischlich ais Bestrahlungseffekte gedeutet werden.

Um in dieser Richtung gezielte Untersuchun­gen durchfuhren zu konnen, muBten im folgen­den Kapitel die nachstehenden Fragen experi­men tell gepriift werden:

a) Wirkungsweise der pH-Regulationssysteme auf die zellulare Populationsdynamik?

b) Bestehen Unterschiede hinsichtlich der Dauer und Variationsbreite des Mitosezykius zwi­schen der Stamrnkultur und den aus Einzel­zell-Selektionen hervorgegangenen Kionen?

100

c) Wie ist das Verhalten der Klone unterein­ander zu beurteilen?

d) Welchen EinfluB haben die Abweichungen der Chromosomenzahlen vom normalen diploiden Chromosomensatz auf die Dauer des Mitosezyklus?

Material und Methodik]

Synthetisches Niihrmedium. Das synthetische Nahr­medium TMC 199 wurde von MORGAN, MORTON und PARKER als Nahrfliissigkeit flir tierische Zellen in die Gewebekultur eingefiihrt. Es ist eiweiBfrei und enthalt in chemisch genau definierten Verbindungen die flir das Zellwachstum notwendigen 50 Baustoffe in optimaler Zusammensetzung.

Vitamin-Losung. AuBerdem wurden in 120 ml Aqua bidest. 1,12 g TC-Medium NCTC 109 (Difco 0 927) und 0,3 g TC-Eagles Vitamine (Difco 5 879) gelast und das TMC 199 mit jeweils 40 ml dieser Vitamin-Lasung pro Liter angereichert (= Gebrauchslasung). Das zur Kultur angewandte Vollmedium setzt sich aus der Gebrauchslasung (85%) und Kalberserum (15%) zusammen. Es erfolgte ein Zusatz der Antibiotika Penicillin (200 E/ml) und Streptomycin (100 r/ml).

Zellsuspension. Die AblOsung des Zellverbandes von der Glasoberflache zur Herstellung von Einzel­zell-Suspensionen wurde mit einer o,l%igen Tryp­sin-Lasung (Di£Co 1:250) durchgefiihrt. Die resul­tierende Zellsuspension wurde 5 Minuten bei 1000 g zentrifugiert und das Sediment zur Beseitigung toter Zellen in Hanks-Lasung (pH 7,2-7,4) 2-3 mal resuspendiert; eine MaBnahme, die zur Erhahung der sogenannten «plating efficiency» fiibrt.

Yestmedium. Thioglycollate Broth (Difco 440 705) wurde als Testmedium bei allen Nahrlasungen zu deren Sterilitatspriifung angewandt. Ein sichtbares Zeichen flir Verunreinigungen ist die Bildnng eines kristallinen, triiben Niederschlages nach 5tagiger Bebriitung bei 37° C.

KulturgefiiJ3e. Fiir die Versnchsdurchflihrung wur­den Petrischalen (9 cm 0) mit Deckglasern (24 X 24 mm) so ausgelegt, daB nur etwa z/3 der Grund­flache bedeckt waren, nm Randwirkungen aus­schlieBen zn kannen. Die Deckglaser wurden mit in CC141) gelastem Vakuumfett unterseits bestrichen und durch leichten Druck befestigt. Die Haftfahig­keit der Zellen auf der Glasoberflache ist nur dann gewahrleistet, wenn diese fettfrei bleibt. Obgleich das Fett an den Randern der Deckglaser mit dem Kulturmedium in Beriihrung kommt, zeigt es keinen EinfluB auf das Zellwachstum. Die Beseitigung des noch in geringen Mengen sehr toxisch wirkenden CCl4-Anteiles aus den geaffneten GefaBen erfolgt

I) CCI4 = Tetrachlorkohlenstoff

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . II

durch Verdampfung bei 160° Cf2 Stunden. An­schlieBende Sterilisation bei 1600 Cf3 Stunden.

InokulationsgroJ3e. Die Auszahlung erfolgte in der Thoma-Zahlkammer. Die inokulierte Zellkonzen­tration muB so gewahlt werden, daB bei einer durchschnittlich zu erwartenden P. E.Z) von 70% und einer Kulturdauer von 144 Stunden geniigend Kolonien zur Auswertung zur Verfiigung stehen und gleichzeitig deutlich voneinander zu unter­scheiden sind. So ergaben sich der Kulturdauer angepaBte optimale Zellkonzentrationen von 5000 (24 Stunden Versuchsdauer) bis 1200 Zellen (120 bis 144 Stunden Versuchsdauer) pro Petrischale mit entsprechend 320 bzw. 80 auswertbaren Kolonien pro Deckglas. Die trypsinierte Zellsuspension bestand zur Zeit der Impfung zu 98% aus Einzel­zellen. Die beimpften Petrischalen werden mehrmals rotierend bewegt, so daB sich die in 20 ml Medium gelasten Zellen gleichmaBig iiber die Grundflache verteilen. AnschlieBend erfolgt eine Inkubationszeit bei 37° C und 2% COz-Atmosphare.

Einstellung und Regulation des pH-Wertes. Die Ein­stellung des pH-Wertes (pH 7,4-7,6) im Kultur­medium erfolgte im AnschluB an die Mischung der einzelnen Komponenten je nach Bedarf mit 0,3 N NaOH oder 0,3 N HC!. Die Zugabe des Indikators Phenolrot in den nicht toxisch wirkenden Konzen­trationen zwischen 0,001-0,005% ermaglichte eine schnelle visuelle Abschatzung des pH-Wertes. Die EinfluBnahme auf den Verlauf des pH-Wertes erfolgte je nach Zielsetzung durch ein sogenanntes «geschlossenes System» zur Erhaltung der Zell­kulturen oder mit Hil£e eines flexibel zu hand­habenden «regulierbaren Systems», welches sich bei den Versuchsdurchflihrungen als gut geeignet erwies.

Klonisolation. Voraussetzung ist eine stark ver­diinnte, aus Einzelzellen bestehende Zellsuspension (ca. 1000 Zellenjml Medium). Hiervon werden jeweils 0,1 ml Lasung in eine mit kleinen Glasfrag­menten ausgelegte Petrischale iibertragen. Die auf Glassplittern wachsenden Einzelzellen entwickeln sich in 9-12 Tagen zu ausreichend groBen Kolonien, deren Ausbreitung durch einen grauen Belag von 1-2 mm 0 flir das Auge sichtbar wird. Diese einmal isolierten Klone werden in Reagenzglaser iiber­tragen, trypsiniert und nach Erreichung entsprechen­der Populationsdichte (2,5-3,0' 104 Zellen/ml) aus Sicherheitsgriinden einer wiederholten Einzelzell­Isolation unterzogen. Die in diesem speziellen Zu­sammenhang stehenden, durch wiederholte Selek­tion isolierten 3 Klone werden im folgenden als C I /II, C 2/1I, C3/ll bezeichnet. Bezugnehmend auf die genetische Abstammung der Klone aus Einzelzellen

Z) P. E. (= Plating efficiency) : prozentualer Anteil der aus Einzelzellen hervorgegangenen und nach einer bestimmten Zeit visuell nachweisbaren Anzahl gewachsener Zellkolonien, der auf die Einzelzell­Konzentration z. Z. der Impfung bezogen wurde.

lor

12 . G. THIESSEN

und der damit fUr einen kurzeren Zeitabstand zu erwartenden geringen biologischen Variabilitat, werden sie als «homo gene» Kulturen bezeichnet und mit den sinngemaB als «heterogen» zu betrachtenden Stamm- oder Parentalkulturen verglichen. 18 bis 25 Tage nach der zweiten Auslese dieser Klone standen ausreichend Zellen fUr die Durch£iihrung der Versuche zur Verfugung.

Kolonie-Grii.f3enanalyse. Die Randwirkung der Petrischalen konnte unberucksichtigt bleiben, somit wnrden bei allen Versnchsgliedern je Zeiteinheit (24 Std. Intervall) 300-500 Kolonien ausgewertet. Nach der Probeentnahme wurden die Kulturen in Hanks-Losung (37° C) gewaschen, in Bouin-Allen fixiert, die abgehobenen Deckglaser in Mayer's Hamatoxylin geiarbt und in Eukitt eingebettet.

Chromosomen-Analyse. Fur Chromosomen-Unter­suchungen wurden ca. 2 . 105 Zellen/ml Zellsuspen­sion mit 10 ml Medium verdlinnt. Die Kultur der Zellen erfolgte auf Deckglasern, die in Petrischalen befestigt waren, bei 37° C in 2% CO2-Atmosphare. In der exponentiellen Wachstumsphase, entspre­chend 4-6 Teilungen, wurde die Kultur nach 60 bis 72 Stunden unterbrochen, die Zellen £iir 6-8 Stunden in colchicinhaltigem Medium (ro-5 M) behandelt und anschlieBend in einer I,I2%igen Natriumcitrat­Losung (10 Minuten, 37° C) zur osmotischen Expan­sion belassen. Es wurden Chromosomen-Quetsch­praparate in Anlehnung an die Techniken von CONGER und FAIRCHILD (1953), TJro und LEVAN (1954), FORD und HAMERTON (1956), TJro und PUCK (1968) hergestellt.

Wirkungsweise des pH-Regulationssystems auf die zellulare Populationsdynamik

Eine pH-V erschiebung kann sich storend aus­wirken, wenn die Strahlenwirkung auf Dber­lebensrate und Teilungshaungkeit der Zell­kolonien untersucht werden solI.

Eine wahrend der gesamten Kulturzeit eines Versuches regulierbare pH-Einstellung ermog­lichte die Begasung mit CO 2 durch Schaffung einer 2%igen C02-Atmosphare innerhalb von ExsikkatorgefaBen (Abb. I a). Das Gasgemisch

zur pH-Einstellung besteht aus 5% C02 und 95% Luft. Das Gasgemisch wird durch sterile Wattenlter gedriickt, in Waschflaschen durch

1%ige CUS04-Losung zum Schutz gegen die Entwicklung von Pilzinfektionen geleitet und durchspiilt anschlieBend den als KulturgefaB dienenden Exsikkator. Eine 2%ige C02-Atmos­

102

Wattefilter

COz

o~~~~~~~~~~ 20 40 60 80 100 Minuten

b aP 7,6 7,5 7,47.3 7.27.16~57.06,g 6,8 PH -Wert

Abb.Ia. Anlage zur Regulation des pH-Wertes in Zellkulturen. Abb. lb. Verlauf der pH-Anderung im Kultur­medium TCM 199 nach 6 Minuten Begasungszeit. Gemessen wurde die Differenz der Absorptions­anderung (~O. D.) des Indikators Phenolrot bei der Wellenlange 560 nm.

phare innerhalb eines 121 Exsikkators wird bei einer DurchfluBgeschwindigkeit des Gases von 41/Min. und I atu Druck kurzfristig erreicht. Die pH-Einstellung in dem physiologischen Bereich 7,2-7,6 erfolgt ca. 50 Minuten nach der Begasung und bleibt flir 36-48 Stunden unver­andert (Abb.lb). Um einer Verdunstung des Nahrmediums bei 37° C innerhalb des Exsik­kators entgegenwirken zu konnen, wird eine sterile, Aqua bidest. enthaltende Petrischale auf­gestellt, die aus Sicherheitsgriinden jeweils nach VersuchsabschluB auszuwechseln ist. Die Exsik­katoren werden zwar vor den Experimenten sterilisiert, miissen aber wahrend einer Ver­suchsserie zu Probeentnahmcn mehrmals geoff­net werden. Da hierbei Kontaminationen auf­treten konnen und insbesondere Hefe- und Schimmelpilze in einem IOo%ig mit H20 gesattigten Dampfraum gute Entwicklungs­bedingungen vornnden, enthielt das Wasser

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells· 13

cinen Zusatz von I mg Nystatin/25ml, ent­ Phase. Das «gesehlossene System» ist zwar fur die spreehend einer Aktivitat von 2500 Einheiten. Erhaltung der Kulturen ausreiehend, nieht Das dureh Glyzerinzusatz geloste Antibiotikum jedoeh fur Versuehszweeke geeignet. Der Vor­ist in Form einer feinen Suspension ausreiehend teil des «regulierbaren Systems» tritt insbesondere fungizid wirksam. dann hervor, wenn man berlieksiehtigt, daB

Die Waehstumskurven der Abb.2 zeigen hierbei der Dbergang in die stationare Phase deutlieh die zeitliehe Abhangigkeit der Zell­ dureh zu groBe Zelldiehte der Population auf konzentration yom pH-Wert der Nahrlosung. der Glasoberflaehe von Petrisehalen erfolgtel

Beide Kurven weisen eine gleiehlange Ruhe- (I) wahrend cr in den Kolbenversuehen dureh den (unterhalb 24 Std. Kulturdauer) und Besehleuni- pH-Wert bedingt wurde.

5,50 PH 0

1

7,6 -" 5,25 1

:r: « ',,, / .~ ZELLZAHL-EXSIKKATOR

\~j 5,00 \ '\ ~V 7,5 w 4,75 0,

N 4,50 , , ,

\ . I / 0---- ZELLZAHL-KOLBEN '\ ,/

4,25 , I \ I t IV-V \ \

7,4 \

4,00 \

3.75 \ \ 0

7.3 \ \ 3,50 \( \0 \ /

3.25 \ \ \ \ /III \

7,2 3, 00 2,75

7,1 2,50 P -EXSIKKATOR H

2,25 \ 0/ t,·· \

,I 7,0 2,00 I,

1.75 / \ 6,9 1,50 / .\ , I / 1.25 \

6,8 1,00 f \\ 0,75

o \, 6,7 0,50 , ­

1 --0-_- PH -KOLBEN 0,25 II)//

/: II 1/

0,10 0 24 48 72 96 120 STD KULTURDAUER

6,6

Abb.2. EinfluB der Versuchsanordnung auf den pH-Wert und die Zellvermehrung. (I) Ruhe-, (II) Beschleuni­gungsphase, (III) log. Phase, (IV) Verzogerungs-, (V) stationare Phase.

gungsphase (II) der Zellvermehrung innerhalb Gewebekulturen, deren Zellen dureh zu groBe 48 Stunden naeh der Impfung auf. Untersehiede Zelldiehte oder ansteigende Aziditat in ihrer zwischen den Versuehen in roo ml Erlenmeyer­ Teilungsgesehwindigkeit behindert wurden oder Kolben (= geschlossenes System) und der Exsik­ teilweise absterbende bzw. autolysierende Zellen katorgefaB-Anordnung (= regulierbares Sy­ enthielten, ergaben eine relativ niedrige P. E. stem) ergaben sieh aus den Zellkonzentrationen von 40-60%. Fur Versuehszweeke erfolgte die naeh 120 Stunden Kulturdauer als Folge einer Unterbreehung der Kulturen wahrend der zeitlieh verkurztenlog. Phase (III) mitmaximaler mittleren zeitliehen Dauer der log. Waehstums­Zellteilungsgesehwindigkeit. Dureh die Ver­ phase, d. h. ca. 60-80 Stunden naeh Versuehs­kiirzung der log. Phase resultierte ein fruhzeitiger beginn. Dureh diese MaBnahme konnte die Dbergang der Kulturen des «gesehlossenen P. E. aller Einzelzellen auf 80-95% erhoht Systems» in die Verzogenmgs- bzw. stationare werden.

103

14 • G. THIESSEN

Heterogene Stammkultur nien. Da sich die Zellen nach jeder Teilung zahlenmaBig verdoppeln, die Zellzahlen theo­

Aus Versuchen der als heterogen bezeichneten retisch der geometrischen Reihe folgen, d. h. (,Parental- oder Stammkulturen» (CHO/ST) dies dem Logarithmus zur Basis 2 entsprache, wurden im Abstand von 24 Stunden uber einen wurden die Zellzahlen aller individuell aus­Zeitraum von 5-6 Tagen Proben entnommen, gezahlten Kolonien gruppenweise zusammen­fixiert, gefarbt und die KoloniegroBe zu jedem gefaBt. Die Gruppierung konnte nicht, wie es im entsprechenden Zeitpunkt bestimmt. Fall synchronisierter Kulturen moglich ware,

NIAS et aL (1965) analysierten in ahnlicher nur beschrankt auf den 2n-Wert eines betreffen­Weise HeLa-Populationen und stellten ein den Zeitpunktes vorgenommen werden, son­breites Spektrum der Teilungsrate fest. Die Aus­ dem es bedurfte der Erweiterung, so daB wertung ergab, daB sich die fiir HeLa-Kulturen 2n±0,5 Teilungen in eine Gruppe mit einbe­als normal angegebene Generationszeit von zogen werden mussen. So wurden z. B. fur 22 Stunden urn durchschnittlich 32% auf 2 3 und 24 in synchronisierten Kulturen die 28 Stunden verHingerte. Mit Hilfe von HeLa­ Zellzahlen 8 bzw. 16, entsprechend 3 bzw. Einzelzell-Isolationen konnten die Autoren die 4 Teilungen, zu erwarten sein. Bei den sich naturliche Variabilitat des Mitosezyklus ein­ asynchron teilenden CHO-Zellen muBten je­engen. doch die uberwiegende Mehrzahl, d. h. ins­

In Abb. 3 werden die wahrend der Versuchs­ besondere soIche Kolonien berucksichtigt und dauer mit einer «heterogenen» Stammkultur sich eingeordnet werden, die sich z. B. zwischen dem ergebenden Veranderungen hinsichtlich der 3. und 4. Teilungsabschnitt befanden, so daB die Anzahl an Zellteilungen in taglichen Intervallen in den Darstellungen 3, 6, 7 und 8 angezeigten dargestellt. Auf der Abszisse ist die Kolonie­ Intervalle mit der Klassifizierung von 2,6-3,5 groBe aIs Anzah! der durchschnittlich erfolgten oder 3,6-4,5 Teilungen und den entsprechenden Zellteilungen aufgetragen, auf der Ordinate zu Zellzahlen 7-12 bzw. 13-24 identisch sind. sechs verschiedenen Zeiten nach der Inokulation Diese Gruppeneinteilung wird folgend allge­der dazugehorige prozentuale Anteil an Kolo- mein als «N» bezeichnet, wobei «N» im engeren

'f,

z 80 w z 0 70 0 -' 24 STD. ~

48 STD. 72 STD

60

50 ~/·\ ~ 96STD 120 STD 144 STD. . I ,

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I I I I Iii i~ 0 3 4 5 6 8 10 1 i 12 13 14

ANZAHL OER TEiLUNGEN

Abb.3. Analyse der Kolonie-GroBenverteilung als Funktion der Zeit einer heterogenen Stammkultur nach 25 Subkulturen.

104

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells· 15

Sinne den Mittelwert einer Gruppe darstellt. Die Abb.3 zeigt deutlich eine mit der Kultur­dauer einhergehende Verbreiterung der Kolonie­GroBenverteilung bei einer durchschnittlichen Generationsdauer der Zellen von 13,0 Stunden. Insbesondere die Kurven der 1.-3.Probeent­nahme weisen einen kontinuierlichen, sym­metrischen Verlauf auf, der bei gleichzeitiger linearer Abnahme der prozentualen Teilungs­maxima um 10% innerhalb eines Zeitraumes von 72 Stunden konstant bleibt. Am 4. Kultur­tag treten die sich sichtbar langsamer teilenden Kolonien hervor. Diese Erscheinung fuhrt zur Verbreiterung des Spektrums der Kolonie­GroBenverteilung und bewirkt gleichzeitig eine Verminderung des Maximums der Verteilungs­kurve innerhalb 24 Stunden um weitere 10%. Die Verteilungskurven fur die sich anschlieBen­den zeitlichen Intervalle von 96-120-144 Stun­den zeigen einen typischen asymmetrischen Verlauf und gleichzeitig ein gemeinsames Plateau beziiglich der Teilungshauugkeit.

Betrachtet man den prozentualen Teilungs­verlauf der ersten 24 Stunden, so haben sich entgegen der ermittelten durchschnittlichen Generationsdauer nicht ca. 60-70% aller Zellen zweimal geteilt, sondern nur 20% der gesamten Population haben zwei vollstandige Zellzyklen durchlaufen. Die Ursachen dieser Hemmung konnen vielfaltig sein und lassen sich auf folgende komplexe Zusammenhange zuruck­fuhren:

a) Methodische MaBnahmen, wie die Enzym­behandlung zur Herstellung der Einzelzell­Suspensionen fuhren anschlieBend zur Behin­derung der Haftfahigkeit abgerundeter Einzel­zellen auf Glasoberflachen und verzogern somit die Zellmigration und Teilung nach der Impfung.

b) Das unterschiedliche Alter der Zellen zur Zeit der Enzymbehandlung, d. h. die Dauer bis zur ersten Zellteilung ist abhangig von der phase (G C S-G2), in der sich die Zellen gerade wahrend dieser Zeit befmden. Dies ware zu­gleich eine Erklarung fur das V oreilen bzw. zuruckbleiben von insgesamt 40% aller Kolo­nien um einen ZelIzyklus, bezogen auf das Teilungsmaximum.

c) Die Einzelzellen innerhalb des trypsinierten Gewebes verhalten sich im Hinblick auf die Teilungsgeschwindigkeit wie genetische Varian­ten. Dies tritt deutlich nach einer Kulturzeit von 96 Stunden hervor, also zu einem Zeitpunkt, zu dem schon Verzogerungen bis zu 3 ZelIzyklen augenfallig werden.

Sieht man von den besonderen Verhaltnissen wahrend des ersten Kulturtages und des sen hohem Teilungsmaximum von 61% ab, so ergibt sich fur die «heterogene» Stammkultur uber einen Zeitraum von weiteren 120 Stunden eine regelmaBige Verdoppelung 46,4% aller Zellen innerhalb 24 Stunden.

Zur Sicherung des Ergebnisses der in Abb.3 eng miteinander in Beziehung stehenden Kurven lag es nahe, andere Darstellungsmoglichkeiten zu suchen, um eine vergleichende Auswertung in mehrfacher Hinsicht durchfuhren zu konnen. Zu diesem Zweck wird die Anzahl der ZelI­teilungen der in Abb. 3 aufgetragenen Resultate umgewandelt, und die KoloniegroBe als Zell­zahl «N» auf der logarithmisch eingeteilten Ordinate abgetragen. Der entsprechende pro­zentuale Anteil der Kolonien unterschiedlicher GroBe ist auf der Abszisse von links beginnend

-z --' I ...: N --' --' W N

KOLONIEN OER ZELLZAHL ,,;;W·

Abb.4. Integrierte Kolonie-GroBenverteilung der heterogenen Stammkultur (CHO/ST) als Funktion der Zeit.

105

r6 . G. THIESSEN

mit wenig proliferierten Kolonien der Zellzahl «~ N» verzeichnet, urn fortschreitend in Rich­tung groBer Kolonien integrieren zu konnen (Abb.4).

Obgleich der Versuch mit drei zeitlich von­einander getrennten Wiederholungen durch­gefiihrt und die Proben jeweils nach 24 Stunden entnommen wurden, zeigten die Integralkurven der Kolonie-GroBenverteilung selbst unter die­sen Bedingungen eine erstaunliche Parallelitat. Dieser parallele Kurvenverlauf deutet auf einen relativ hohen Grad homogener Zusammen­setzung innerhalb der Kolonien hin. Letzteres kommt insbesondere dann zum Ausdruck, wenn man beriicksichtigt, daB der prozentuale Anteil an Kolonien, die rechts und links dem Maximum der Verteilungskurve benachbart sind, insgesamt gleich hoch ist, so daB diese eine indirekte Aus­gleichsfunktion iibernehmen (Abb. 3).

Die besonders gekennzeichnete Integralkurve der ersten24 Stunden nach Versuchsbeginn kann nicht mit in die Betrachtungen einbezogen werden. Diese Kurve setzt sich zum Teil aus Zellzahlen zusammen, die «<N» sind oder gerade den niedrigsten «N»-Wert erreichen, d. h. noch keine bzw. nur die erste Zellteilung vollzogen haben. Der Obergang yom Einzell­in ein Zweizellstadium erlaubt keine Riick­schliisse auf eine sich anbahnende Weiterent­wicklung hinsichtlich der spateren Kolonie­GroBenverteilung.

Da sich, wie experimentell nachweisbar, 46,4% aller Zellen zwischen dem 2.-7. Tag innerhalb von 24 Stunden zweimal verdoppelt haben und der prozentuale Anteil solcher Kolonien, deren Zellteilungsrate einen Z yklus vor oder hinter dem Maximum liegt, ebenfalls wahrend des gleichen Zeitraumes konstant bei durchschnittlich 41,6% (38-44%) verblieben ist, so ergibt dies einen mittleren Wert von 87,6% (83,5-92,5%) aller Kolonien, deren GroBenzuwachs keiner taglichen Variabilitat unterlag.

Dieser hohe Anteil sich mit konstanter Geschwindigkeit teilender Kolonien verdeut­licht, daB keine storenden Faktoren, z. B. Medium- und pH-Veranderungen oder Tem­

ro6

peratureinfliisse, wahrend der logarithmischen Wachstumsphase aufgetreten sind und die Versuchsergebnisse beeinflussen konnten (Abb. 1 und2).

Onter V oraussetzung der nachweislich kon­stanten Zyklusdauer von durchschnittlich 13,0 Stunden ergibt sich nun die Moglichkeit (s. Abb.4) aufgrund des Abstandes der parallel zueinander verlaufenden Integralkurven, die Generationsdauer fiir Kolonien unterschiedlicher GroBe detaillierter zu bestimmen. Hierbei blieb die logarithmisch eingeteilte Ordinate aus Abb. 4 mit der Zellzahl «N» pro Kolonie erhalten und nur die Ahzisse wurde durch das Abtragen der Kulturdauer (Tage) verandert. Solche Wachs­tumsraten wurden an verschiedenen Kolonien unterschiedlicher GroBe aus den in Abb.4 ent­haltenen Werten fLir «40, 60, 80 und 90%» Kolonien mit «~N» Zellen bestimmt (Abb.5).

Eine durch die Parallelitat der Integralkurven bedingte dichte Lage samtlicher in Abb.5 ent­haltener Kurven ergab 4 nur wenig voneinander getrennte Exponentialkurven mit den ent­sprechenden Teilungsgeschwindigkeiten.

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I<ULTURTAGE

Abb.5. Untersuchung der Wachstumsrate und Be­stimmung der Generationszeit einzelner Kolonien der Stammkultur (CHOjST).

Die Berechnung der Zyklusdauer wurde nach folgender Forme1 durchgefuhrt:

I logz Nt = logz No + ---' t

g

Nt = PopulationsgroBe der Kolonie zur Zeit t, N o= Ausgangspopulation (Einze1zelle), t = Zeit (Std.), g = Generationsdauer (Std.).

Die Ergebnisse der Zyklusdauer dieser 4 ana­lysierten KoloniegroBen mit«~ N» Zellen zeig­ten, wie nachstehend ersichtlich, nur geringe Unterschiede.

Generations- Zellteilungen Kolonien

dauer nach 144 Std. (%)«~N»

(Stunden) Kulturdauer

«90» 12,6 11,4 «80» 12,9 II,2 «60» 13,6 10,6 «40» 14,1 10,2

Die Abweichungen von der durchschnitt­lichen, 13stundigen Generationsdauer, ent­sprechend 10,9 Zellteilungen, sind auBerst ge­ring und lassen die als «heterogen» bezeichnete Stammkultur hinsichtlich der Wachstums­geschwindigkeit als sehr einheitlich erscheinen.

Homogene Klonisolationen (C1jII-C2jIl-C3jII)

Diese zweifach isolierten, gesichert aus Einze1­zellen herangewachsenen Klone bilden die Grundlage fur eine vergleichende Auswertung mit den Parentalkulturen. Analysiert man die Kolonie-GroBenverteilung der Klone, so unter­scheiden sie sich scheinbar nur geringfugig von­einander. Mit der Stammkultur auf gleicher Ebene liegt das durchschnittliche Maximum der Verteilungskurve von ca. 54% mit ausgegliche­nem Wachstum. Nach 4 Tagen Kulturdauer zeigen die Klone Cl/II und C3/II den bereits im Zusammenhang mit der Stammkultur beschrie­benen Trend zur asymmetrischen Haufigkeits­verteilung als Folge einiger in der Teilung ver­zogerter Kolonien (Abb. 6,7,8).

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells' 17

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70 1205m 125m 965m

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8 9' 10 11 12 ANZAHL DER TEILUNGEN

Abb.6

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245m

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8 9 10 11 12 ANZAH. DER TEILUNGEN

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10

B 10 11 12

ANZAHL DER TEILUNGEN

Abb.8

Abb.6-8. Kolonie-Gri::iBenverteilung der «homo­genen» Klonisolationen C 1jII - C 2 jII - C 3 jII nach 120 Std. Kulturdauer.

107

------

18 • G. THIESSEN

Wahrend die Verteilungskurven-Maxima der Stammkultur, als Funktion der Zeit betrachtet, durch einen Iinearen AbfaH mit anschIieBendem Plateau gekennzeichnet waren, wiesen die Klone Cl/II und C3/II, im Gegensatz zu C2/II, auf einen klonabhangigen, unterschiedlich stark betonten, rhythmischen Verlauf der Zel1teilung hin. Diese sich konstant jeweils nach zwei Zellteilungen

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KOLONIEN MIT .. ~N" ZELLEN

Abb. II

Abb. 9-11. Integrierte Kolonie-GroBenverteilung der «homogenen» Klonisolationen C1/ II - C 2/ II - C3/ II nach 120 Std. Kulturdauer.

wiederholende zykIische Bewegung findet ihren Ausdruck in den variablen Abstanden der Inte­gralkurven (Abb.9, IO, II).

Der Proliferationsverlauf der Klone Cl/II und C3/II laBt auf das V orhandensein von karyo­

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Abb.I2

108

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Abb.I3

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10

I.

KUL TURTAGE

Abb.I4

Abb.I2-14. Bestimmung der Wachstumsrate und Generationsdauer einzelner Kolonien in den Klon­isolationen C1/Il - Cz/Il - C3/II nach 5 Kulturtagen.

typischen Varianten sehlieBen, deren zei tlieh untersehiedliche Mitosezyklen sieh in 48stundi­gem Abstand kompensieren und zur Ausbildung der Maxima fuhren konnten. Anders laBt sich

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 19

dementsprechend das Verhalten von CZjII er­klaren. Mit Ausnahme der allen Klonen und der Stammkultur gemeinsamen hohen Teilungsrate nach 24stiindiger Versuehsdauer la13t sieh eine fast synehrone Zellteilung ais Zeiehen einer homogenen Kultur in den darauffolgenden 3 Tagen beobaehten.

Beim Vergleieh der Waehstumskurven von Cl - Cz - C31II ergaben sieh keine nennenswerten Untersehied~ bezuglich des Neigungswinkels. Selbst ein geringes Auffaehern der Kurven am 5. Kulturtage von Cl und C3 konnte nieht ais eindeutiger Beweis fur die zuvor genannten Unterschiede der Klone untereinander dienen (Abb. 12,13,14).

Die Gegenuberstellung von Stammkultur und Klonen zeigt hinsiehtlieh der Generationsdauer folgende Differenzen:

Kolo­men CHO/ST C 1/Il Cz/Il C3/Il (%) (Std.) (Std.) (Std.) (Std.) «~N»

«90» 12,6 12,7 14,0 12,4 «80» 12,9 14,1 14,8 13,7 «60» 13,6 14,6 15,2 14,4 «40» 14,1 15,0 15,8 15,4

M 13,0 14,0 15,0 14,0

Betraehtet man den Mitosezyklus in seiner Gesamtheit, so sind maximale Untersehiede von 2,4 Stunden (=20%) zu verzeiehnen, d.h. es konnten ahnliche zeitliche Veranderungen inner­halb der Phasendauer wahrend der Nuklein­saure und Proteinsynthese erwartet werden.

Karyologische Analyse der Zellstamme

Die zytogenetisehe Bestimmung der Chromo­somenzahl und -morphologie ermoglicht die Beurteilung des karyologisehen Verhaltens def CHO-Zellen in vitro. Dureh den EinfluB der Bestrahlung auf den zellularen Stoffweehsel tre­ten ehromosomale Veranderungen auf, die in ihrer Erfassungsgenauigkeit von der Qualitat der Praparationstechnik mitbestimmt werden.

109

20 . G. THIESSEN

RoutinemaBige Untersuchungen des Chromo­somensatzes sind Vorbedingungen £lil' die Kon­trolle der Stabilitat von Klonselektionen, weil spontane Veranderungen des Karyotypes in Gewebekulturen allgemein ublich sind (Hsu u. MOORHEAD, 1957; Hsu U. KLATT, 1958; YERGANIAN, 1961; RIEGER, 1963; AUERSPERG, 1966).

In den beschriebenen Untersuchungen wurde die Variation del' Chromosomenzahl des Karyo­types der Stammkulturen und der Klonselek­tionen ci, Cz, C3/U in Abhangigkeit von der Zeit untersucht. Die Zellen des Chinesischen Hamsters sind im Vergleich zu anderen Objek­ten wegen ihrer geringen Chromosomenzahl flir derartige Analysen besonders geeignet.

Durel1 eine IO-I2stundige Einwirkungs­dauer des colchicins auf die CHO-Zellen wur­den 80% aller Zellen in der MetaphJse arretiert. Die mikroskopische Betrachtung ergab jedoeh, daB davon nur 40,5-48,6% der dureh vollstan­dige Spindelhemmung (= Stathmokinese) an­gereicherten Metaphasen auswertbar waren. Die Bloekierung des Kernteilungsablaufes in der Metaphase verhindert den Aufbau der Spindel­molekule und sekundar die Ausbildung des auf die Chromosomen wahrend der Anaphasen­bewegung vorhandenen, funktionell richtungs­orientierend wirkenden, anisotropen Faser­systems der Spindeln. Da eine Verteilung der Chromosomen zu den Zellpolen unterbunden wurde, fuhrte dies als Folge einer zu lang en Behandlungsdauer zur Verklumpung und stern­formigen Anordnung der Chromosomen inner­halb der Zelle. Partielle Spindelhemmung (= Merostathmokinese) oder Orientierungs­storungen der Spindel (=Tropokinese) sind fur die ungleiehmaBige Chromosomenverteilung nicht verantwortlieh zu machen, da diese Erscheinungen erst bei einer Colchieinkonzen­tration im Bereich von IO-8 M auftreten.

Die Verkurzung der Colchicineinwirkung auf 6-8 Stunden fuhrte zur Metaphasenanreicherung von 63,3-67,8% und dem angestrebten maximal mogliehen Anteil auswertbarer Zellen ohne das V orhandensein der zuvor genannten storenden Nebenerseheinungen (Abb. 15). AuBer der Ver­klumpung des gesamten Chromosomensatzes

lIO

bewirkte das Colchicin starke Kontraktion der einzelnen Chromosomen. Bei diesen sogenann­ten C-Paaren entfernen sich die Chromatiden voneinander und bleiben oftmals nur noeh am Centromer miteinander verbunden, so daB x­formige Figuren entstehen.

Unmittelbar naeh AbsehluB der in Kapitel 3 durehgefiihrten Versuehe (Termin A) erfolgte die Bestimmung der Chromosomenzahl in je­weils 200 Metaphasen der Parentalkultur und der Klonsdektionen C 1, C 2 und C3 /u. Aufgrund dieser chromosomalen «Bestandsaufnahme» wur­den die Versuche auf weitere 6 Monate ausge­dehnt und das Verhalten des Genoms im Hinbliek auf die Variation in Abhangigkeit zur Zeit aus­gewertet. Die Probeentnahme erfolgte im Ab­stand von 60 Tagen resp. nach 17 (Termin B), 34 (Termin C) und 51 (Termin D) Subkulturen mit entspreehend ca. I03 Generationszyklen bzw. 1031 Naehkommenschaften pro Einzelzelle und Auswertungstermin. In den Abbildungen 16-19 sind die Ergebnisse wahrend der halb­jahrigen Versuchsdauer (A-D) fur jede Zell­Linie getrennt dargestellt worden.

Vergleicht man alle Zellstamme und deren 4 Auswertungsergebnisse hinsichtlich ihrer Chromosomenzahlen -Verteilung miteinander, so weisen alle in vitro gezuchteten Populationen heteroploides Verhalten auf. selbst die Klon­selektionen, die nur 2 W oehen vor der ersten Auswertung (Termin A) isoliert wurden, zeig­ten eine ausgepragte somatische Inkonstanz der Chromosomenzahl.

Der prozentuale Anteil «diploider» Zellkerne liegt je naeh Zellstamm durchschnittlich zwi­schen 81,5-90,8%, wobei Schwankungen bis zu IO% zwischen den einzelnen Probeentnahmen zu verzeichnen sind. Die triploiden und tetra­ploiden Chromosomenklassen sind zwar wesent­lich geringer vorhanden, aber ebenso wie die diploiden Klassen, deren Analyse an einem Beispiel durehgeflihrt wird, sehr heterogen zu­sammengesetzt :

Stammkultur (ST)

A. (Termin A) Zu diesem Termin hatte die Stammkultur 78 Passagen durchlaufen, wahrend die aus ihr hervorgegangenen Klone erst 3-5mal

Analysis o f Irradiated Tissue Culture Cells . 2J

Abb. IS. Durch Colchicin-Behandlung induzierte Metaphasen-Anreicherwlg.

subkultiviert worden waren. 86,5% diploide Zellkerne, davon sind jedoch nur 19,5% eudi­ploid (2n = 22) und 67% aneuploid. Die aneu­ploiden Genome setzten sich prozentual unter­schiedlich aus den hyperdiploiden 23- (2,5%), 24- (25,5%), 25- (9%), 26- (20%) und 27- (10%) chromosomigen Karyotypen zusammen. 9,5% hypotriploide Chromosomensatze mit 28- (8%), 30- (1%) und 32- (0,5%) chromosomigenKaryo­typen. Es konnte kein exakt triploider Chromo­somensatz innerhalb 200 Metaphasen festgestellt werden.

2% tetraploide Zellkerne, innerhalb derer nur 0,5% als eutetraploid (2n = 44) betrachtet wer­den konnen, wahrend 1,5% hypertetraploide 46- (0,5%), 48- (1%), sowie 2% hypopentaploide

50- (0,5%), 52- (0,5%) und 54- (1%) chromo­somige Ploidiemutanten darstellen.

B. (Termin B) 86% diploide Zellkerne, davon sind 38% e udiploide und 48% aneuploide mit den hyperdiploiden 24- (38%) und 26- (10%) chromosomigen Karyotypen. Von den hoheren Polyploidiestufen kOll11ten nur 2% 28chromo­somige hypotriploide und 12% 44chromo­somige eutetraploide Zellkerne nachgewiesen werden.

C. (Termin C) 94% diploide Zellen, wovon 36% eudiploide und 58% als aneuploide Genome mit 24- (32%) und 26- (26%) chromosomigen zellkernenidentifiziert werden konnten. Das Vorhandensein triploider Zellen konnte nicht festgestellt werden.

III

22 . G. THIESSEN

1m Vergleich zu B. verminderte sich die zusammen. Ferner waren 6% 28chromosomige Anzahl der eutetraploiden Zellen auf 6%. hypotriploide, 8% eutetraploide und im Gegen­

D. (Termin D) 84% diploide Zellen mit satz zu allen anderen Probeentnahmen 2% der einem Anteil der eudiploiden Chromosomen­ 88chromosomigen euoktoploiden Karyotypen satze von 26%. Die verbliebenen 58% aneu­ nachweisbar. ploider Genome setzten sich aus den 24- (38%) Wie aus den graphischen Darstellungen LInd 26- (20%) chromosomigen Karyotypen (Abb. 16-19) zu ersehen ist, verhalten sich die in

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ANZAHL DER CHROMOSOMEN

Abb.17

Abb.16- I 7. Vergleichencle Untersuchung cler Chromosomenzahlen-Verteilung von Stammkultur (ST) (Abb. 16) und Klonisolation (C1 jII) (Abb. 17) wahrend einer 6monatigen Kulturclauer.

II2

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 23

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22 23 2, 25 26 27 28 29 32 36 « 46 48 50 52 54 88 96 ANZAHL DER CHROMOSOMEN

Abb.I9

Abb.I8-I9. Vergleichende Untersuchung der Chromosomenzahlen-Verteilnng der beiden Klonisolationen (C2/ U) (Abb. 18) und (C3/ U) (Abb. 19) wahrend einer 6monatigen Kulturdauer.

gleicher Weise auswertbaren Klone (C1, C2, Herkunft schon in den ersten 4-5 Subkulturen

C3/II) im Vergleich zur Stammkultur sehr ahn­ nach der Inokulation hervor. Die Inkonstanz der lich. Selbst nach kiirzeren Zeitabstanden weisen Chromosomenzahl eines Genoms ist von Klan alle Zellstamme drastische Veranderungen des zu Klon variabel. Eine oder zwei Chromosomen­Karyotypes auf. Die heteroploiden Eigenschaf­ zahlen, sogenannte «sternline numbers» oder ten der Klone traten ohne Riicksicht auf deren «s-Zahlen», traten jedoch, wie aus Tabelle I her­

II3

24 . G. THIESSEN

vorgeht, zeitweilig bei allen Zell-Linien beson­ders haufig auf.

Die Variationsbreite der Chromosomenzahlen ist beschrankt. Sie pendelt in allen Versuchen um die bevorzugte «Stemline» und nahert sich prin­zipiell in ihrer Verteilung der GauBschen Glockenkurve.

Nur in einigen Fallen (ST/B, ST/C, Cl/A, C 2/D) traten 2-3 diploide Karyotypen als Trager der s-Zahlen zeitweilig gemeinsam auf. Hierbei ist bemerkenswert, daB sowohl die Parental­kultur als auch aIle Klonisolationen zur gleichen Zeit dieselben Stemline-Elemente enthielten. Diese Stemlines sind Karyotypen mit zusatz­lichen Chromosomengarnituren, die in vivo nicht vorhanden waren und als charakteristisch fur die Chromosomenlabilitat in vitro gezuch­teter Zellkulturen angesehen werden miissen. Eine besonders ausgepragte Tendenz zur Aneu­ploidie zeigen die eudiploiden Genome mit bevorzugt 24- und 26-chromosomalen Stem­lines. Diese Stemline-Elemente bilden Formen­gruppen, deren Genome aus einer spezifischen Chromosomenzahl zusammengesetzt sind und

Tab.1. Prozentuale Variation der Chromosomen­Stemlines von Stammkultur (ST) und den Klonen (C 1-C2-C3jII) (Termine: A-D) wahrend emer 6monatigen Versuchsdauer.

Zellstamm/ Chromosomen Anteil Termin Stemline (%)

ST/A 24 25,5 ST/B 22/24 38/38 ST/C 22/24 36/32 ST/D 24 38

CdA 24/26 35/32 CltB 22 46 CdC 24 46 C1/D 24 48

C2/A 24 35 C2/B 22 64 C2/C 22 50 Cz/D 22/24/26 30/30/26

C3/A 26 30,5 C3/B 22 44 C3/C 26 42 C3/D 24 40

II4

in genetischer Hinsicht in vitro eine balancierte Einheit darstellen. Als genetisch unbalancierte Genome sind die ungeradzahligen, durch Mono­oder Trisomie aus dem eudiploiden Chromo­somensatz und des sen geradzahligen, hyper­ploiden Varianten entstandenen, mit zeitweise geringerem prozentualen Anteil vorhandenen 23-,25-, 27-, 30- und pchromosomigen hyper­diploiden und hypotriploiden Mutanten abzu­leiten. Bei solchen Karyotypen ist nicht aus­zuschlieBen, daB durch zusatzliche Chromo­somen eine Verschiebung bestimmter Kopp­lungsgruppen eintreten bnn, die fur eine be­grenzte Reproduzierbarkeit dieser Zellen ver­antwortlich sind. Wie aus der Analyse der Chromosomenzahlen des ST/A (Termin A) hervorgeht, laBt sich die sekundare Entstehung der 46-, 50- und 54chromosomigen Karyotypen von den 23-, 25- und 27chromosomigen Genomen durch Orthoploidie ableiten. In Analogie sind die eutetraploiden Zellen sekundar durch Polyploidisierung aus eudiploiden Chro­mosomensatzen entstanden. 1m Gegensatz zu den eutetraploiden, die mit maximal r6% an der Zu­sammensetzung der Population beteiligt waren, verminderte sich der Anteil hypertetraploider Zellen auf durchschnittlich r%, dafur konnte der «Dosiseffekt» im Sinne RIEGERS (r967) verant­wortlich sein.

Die Dominanz der heteroploiden Stemlines gegeniiber den eudiploiden Chromosomen­satzen aller Zell-Linien beinhaltet zwangslaufig einen selektiven Effekt morphologischer und biochemischer Mutanten innerhalb einer Popu­lation.

Messungen mit Hilfe zytophotometrischer Methoden haben bewiesen, daB der DNS­Gehalt pro Zelle objektspezifisch und innerhalb eudiploider Zellen konstant ist. Tritt Polyploidie ein, so erhoht sich der Gehalt der als genetischer Informationstrager fungierenden DNS ent­sprechend der jeweiligen Ploidiestufe.

Die in Abbildung 20 dargestellten Ergebnisse sind an 225 Interphase-Zellen gemessen worden und zeigen eine gute Korrelation zwischen Feulgen-DNS-Gehalt und Chromosomenzahl (200 Metaphasen der Parentalkultur; Termin D). Die relative DNS-Menge wurde mit einem inte­

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Abb.20. Mikrodensitometrisch bestimmte korrela­tive Beziehung zwischen Chromosomenzahlen und Feulgen-DNS-Absorptionseinheiten.

grierenden Mikrodensitometer bestimmt und in Feulgen-DNS-Absorptionseinheiten (AE) ab­getragen (s. Kap.6). Abweichungen des DNS­Verteilungsmusters von der Norm des eudi­ploiden Karyotypes (einschlieBlich der statisti­schen Verteilung der Absorptionswerte von Interphasekernen tiber die G j - S - Gz-Phase) kennzeichnen den Polyploidiegrad. Die Fest­legung des einer diploiden und tetraploiden Zelle, unter Beriicksichtigung des Synthese­stadiums, entsprechenden DNS-Wertes (2C u. 4c) erfolgte empirisch mit Hilfe von Bullen­spermien (r c) als Referenzsystem (s. Kap. 7).

Vergleicht man die Ergebnisse der chemisch und uv-mikrospektrophotometrisch bestimm­ten DNS-Mengen in den Spermien von Mensch, Bulle, Kaninchen, Maus und Ratte miteinander, so haben die einzelnen Species untereinander

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells· 25

einen annahernd iibereinstimmenden DNS­Gehalt (SANDRITTER, 1958). Spermien- und Zellen-DNS-AE in Verbindung mit der Chro­mosomenzahl ergeben eine gute Obereinstim­mung.

Die Anordnung der MeBwerte in Haufig­keitsgruppen fiihrt zu einem der Stemline charakteristischen DNS -V erteilungsmuster. Es variiert von den hyperdiploiden Stemlines bis zu tetraploiden Zellen entsprechenden MeBwerten. In Analogie zm Chromosomen-Stemline (di­ploid, triploid und tetraploid) konnen aufgrund der im Histogramm auftretenden Haufigkeits­maxima bestimmter DNS-Absorptionseinheiten Anhaltspunkte iiber die Position einer aqui­valenten DNS-Stemline bzw. biochemischen Mutanten ermittelt werden (s. Kap. 6).

Die normal diploiden und tetraploiden Zellen tiberleben und proliferieren in vitro, scheinen jedoch mit zunehmender Anzahl durchgefUhrter Subkulturen, ihre Reproduzierbarkeit graduell zu verlieren, wahrend sich die heteroploiden Zellen besser an die Bedingungen einer In-Vitro­Kultur zu adaptieren vermogen. '

Eine heterogen zusammengesetzte Population findet primar ihren Ausdruck in der Zell- und Kolonie-Morphologie, in einer variablen «plat­ing-efficiency» sowie in ihrem populations­kinetischen Verhalten. Sekundar kann bei diesen Populationen eine abweichende Strahlensensi­bilitat auftreten, so daB storende EinflUsse auf die Bestrahlungsversuche zur Feststellung der Ober­lebensrate, chromosomaler Strahlenschaden und tertiar auf Untersuchungen zur Bestimmung der DNS-Synthese in Abhangigkeit des Zellalters berUcksichtigt werden mUssen.

Nach vergleichenden Untersuchungen (TJIO und PUCK, 1958) ist das AusmaB spontan auf­tretender karyotypischer Anomalien von der Gewebeart abhangig. Obgleich spontane Ver­andenmgen des Genotypes fiir die Zellpopula­tionen in vitro charakteristisch sind, so mUssen dennoch MaBnahmen ergriffen werden, welche die Variationsbreite auf ein Minimum ein­schranken, um Kulturen mit maximal einheit­lichem Karyotyp und konstantem Mitosezyklus zu erhalten.

!I5

26 • G. THIESSEN

4. Ultraviolettmikrospektrometrische Untersuchungen an lebenden Zellen

Die im wesentlichen von CASPERS SON (1936) eingefiihrte UV - Mikrospektrometrie ermog­licht die Bestimmung von Nukleinsauren und Proteinen sowie deren Verteilung und Konzen­trationsanderungen innerhalb zellularer Objekte.

Die meisten mikrospektrometrischen Unter­suchungen zur Bestimmung von DNS, RNS und Proteinen wurden bei mehreren Wellen­langen im UV -und sichtbaren Spektralbereich an hxierten pflanzlichen, tierischen oder mensch­lichen, seltener jedoch an lebenden Zellen durch­gefiihrt (WALKER undDAVIES, 1950; LEUCHTEN­BERGER et aI., 1952; BLOCH und GODMAN, 1955; SANDRITTER et aI., 1958; GLUBRECHT, 1963 a. u. b.; ZETTERBERG und KrLLANDER, 1965; LEDERER und SANDRITTER, 1966; SEED, 1966; SCHULZE, 1968; THIESSEN, 1968; WIED, 1970).

Das grundsatzliche Problem bei absorptions­spektrometrischen Messungen lebender Zellen liegt darin, daB wahrend der Messung im ultra­violetten Wellenlangenbereich keine Schadi­gungen des Objektes hervorgerufen werden diirfen.

Durch die Anwendung dieser mikrotech­nischen Methode verfiigt man iiber ein Ver­fahren, mit dessen Hilfe echte Dosiswerte fiir UV-Strahlung wahrend der Messung lebender Zellen ermittelt werden konnen. Bedingung fiir die Durchfiihrung solcher Experimente ist je­doch das Vorhandensein einer Abtasteinrichtung, mit der in kiirzester Zeit und kleinsten Abstan­den die Zelle gescannt werden kann. Dieses Fein­scanning-Verfahren ermoglicht, geringfiigige Absorptionsanderungen innerhalb zellularer Strukturen zu erfassen. Ferner miissen Voraus­setzungen erfiillt werden, die wahrend des Scannens die lebende Zelle weit unter der Strah­lenschadigungsgrenze belasten.

Zytologische Methodik

Wahrend der logarithmischen Wachstumsphase ca. 50 Stunden nach der Inokulation (37° C) wurde die Gewebekultur trypsiniert und aliquote Zell­konzentrationen (104 Zellen(ml) auf Quarzobjekt­trager iibertragen, die in Petrischalen be£estigt waren. Nach 48stiindiger Weiterkultur in s%iger

CO2-Atmosphare (PH 7,2) standen die Zellen nach zweimaligem Waschen in Hanks-Lasung den Ver­suchen zur Verfligung.

Die zur Messung benatigten, einschichtig wach­senden Zellen wurden mit QuarzdeckgEisern abge­deckt. Der Abstand beider Glaser voneinander kann mit Folie festgesetzt werden, so daB sich die Zellen wahrend der Messung (Dunkelheit und Zimmer­temperatur) in einer provisorischen Kulturkammer beflllden. Die herabgesetzte Temperatur wirkte sich bei anschlieBender Weiterkultur der gemessenen Zellen nicht nachteilig aus, zumal Zellen selbst mehrere Wochen bei +4° C lebensfahig sind und Teilungen durchflihren. Wesentlich flir die Lebens­fahigkeit der Zellen war die Erhaltung der Feuchtig­keit innerhalb der Folienkammer durch physio­logische Hanks-Lasung. Unter Beriicksichtigung der Strahlenempfindlichkeit der Zellen erfolgten die mikroskopischen Einstellungen kurzfristig bei ge­ringer Lichtintensitat.

Apparative Methodik

Bei Messungen von UV -Absorptionsspektren an lebenden Zellen sind erhebliche Schwierigkeiten zu iiberwinden, so daB ein flir diese speziellen Anf­gaben entwickeltes UV-Mikrospektrophotometer solche konstruktiv bedingten Intensitats- und Dosis­leistungen aufweisen miiBte, damit wahrend der Absorptionsmessung lebender Zellen keine Schadi­gungen durch den UV-MeBstrahl eintreten.

1m Gegensatz zu kommerziell zur Verfiigung stehenden Geraten wird bei dieser Apparatur mit einer geringstmaglichen UV -Strahlungsleistung wahrend der Messung gearbeitet. Hieraus ergeben sich betrachtliche Anforderungen an die Justage def Anlage und die Empfindlichkeit der MeBverstarker­einrichtung. Die Abbildung 21 zeigt den prinzi­piellen Aufbau der Apparatur. Des weiteren sind folgende Einzelheiten erganzend mitzuteilen:

Als UV-Lichtquelle (I) wird eine Deuterium­Lampe (WHS 200) (Firma Kern, Gattingen) mit einer Leistungsaufnahme bis ISO Watt benutzt. Sie wird an einem Stromstabilisierungsgerat betrieben, wodurch gewahrleistet ist, daB man auch im Ein­strahl-Verfahren mit geniigender Konstanz und Reproduzierbarkeit der MeBergebnisse rechnen kann.

Urn einen groBen Brummspannungsabstand im Verstarker zu erreichen, arbeitet die MeBanordnung mit Wechsellicht bei einer Frequenz von 79 Hz. Als Modulator (2) erwies sich ein selbstanlaufender Synchronmotor (Firma AEG) als besonders vorteil­haft, da der Rotor selbst mit 8 Bohrungen versehen ist und somit den Einbau einer besonderen Loch­scheibe iiberfliissig macht. Der Modulator befindet

u6

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 27

2 , 16

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I I V ® ® 6 7 10 12 15

Abb.2I. Schematischer Oberblick uber die wesentlichen optischen Systeme des UV-Mikrospektrophoto­meters. (In der Anlage selbst ist der Strahlengang mehrfach geknickt). (I) UV-Lichtquelle, (2) Modulator, (3) Doppelmonochromator, (4) Blendenrevolver, (S) MeBfeldbeleuchtung, (6) Microbeam-Strahler, (7) Ob­jekteinstellbeleuchtung, (8) Kondensor, (9) Verschiebetisch f. Objekttrager, (!O) Objekt, (II) Objektiv, (12) Seiteneinblick, (13) Projektiv, (14) PhotoverschluB, (IS) Mattscheibe, (16) Kamera, (17) Streulichtblende, (18) Multiplier.

sich unmittelbar vor dem Eintrittsspalt des Spiegel­Doppelmonochromators (3) (Firma Kipp & Zonen, Delft). Der WellenHingenantrieb kann mittels Synchronmotor erfolgen, so daB die Registrierung von Spektren moglich ist.

Die GroBe des MeBfeldes wird durch eine Anzahl verschiedener Lochblenden bestimmt, welche auf dem Blendenrevolver (4) montiert sind. Die GroBe der Blenden im Revolver ist so gewahlt worden, daB sie bei der Verkleinerung im Objekt die Durch­messer von 1,2; 2,0; 3,8 und 6,4 [.I. ergeben. Die Blenden werden mit Hilfe des Kondensors (8) ver­kleinert im Objekt (!O) abgebildet. Die beiden Hilfslichtquellen (S u. 7) dienen zur Justage des MeBfeldes und zur Einstellung des Objektes. Bei gleichem Anordnungsprinzip besteht des weiteren die Moglichkeit, in Verbindung mit einer starken UV-Lichtquelle (6) ein Microbeam zur partiellen Bestrahlung und zur Schadigung des betreffenden Objektes anzuwenden.

Zur messenden Abtastung des Objektes dient ein Verschiebetisch (Firma Carl Zeiss), dessen serien­maBiger Einbau im UMSP I durchgefuhrt wird. Der Antrieb dieses Tisches erfolgt in der X-Richtung mittels eines Schrittschaltwerkes und in der Y -Rich­tung mit Hilfe eines Synchronmotors, dessen Dreh­richtung umschaltbar ist.

Zum Abbildungsstrahlengang gehOreu die beiden Achromate, das UV-Objekt (= Ultrafluar) (II) und das UV-Projektiv (13). Die Abbildung erfolgt wahl­weise auf der Streulichtblende (17) vor dem Multi­plier (18) oder auf der Mattscheibe (IS) bzw. in der Filmebene der Polaroid-Kamera. Zur schnellen Orientierung kann ein znsatzlich vorhandener Seiten­einblick (12) benutzt werden. Fiir photographische Aufnahmen ist ein elektromagnetisch betatigter nnd elektronisch gesteuerter PhotoverschluB (14) vor­gesehen.

Die geringe wellenlangenabhangige Strahlen­belastung des Objektes ist einerseits durch die geringe Leistung der Deuterium-Lampe erreichbar und

andererseits wird nur gerade die FlachengroBe im Objekt der Strahlung ausgesetzt, die wirklich zur Messung benotigt wird. Dieses Prinzip ist funktions­fahig, wenn die Moglichkeit besteht, die Blende im Blendenrevolver (4) iiber die Zwischenabbildung in der Objektivebene (10) exakt auf der Streulicht­blende (17) abzubilden. Bereits kleine Temperatur­schwankungen im MeBraum machen sich nachteilig bemerkbar.

Das yom Multiplier aufgenommene Signal liegt wenig iiber dem Rauschen, deshalb wurden beson­dere MaBnahmen zur VergroBerung des Signal­Rausch-Abstandes erforderlich. Zunachst schneidet ein in seiner Verstarkung sehr stabiler V orverstarker die hohen Frequenzen abo Der wesentliche Teil der Verstarkereinrichtung ist jedoch ein Lock-In-Ver­starker (Firma Princeton Applied Research, USA). 1m Prinzip handelt es sich hierbei urn einen Schmalband­verstarker mit einer einstellbaren Bandbreite zwischen 1000 Hz und 1/10 Hz. Bei den Messungen an lebenden ovarialen Zellen des Chinesischen Hamsters wurden Bandbreiten von 10-1 Hz ver­wendet. Der groBe Signal-Rausch-Abstand kann jedoch nicht nur durch die geringe Bandbreite er­reicht werden, sondern durch die zusatzliche Bewertung der Phasenlage des Signals zu einer Vergleichsspannung. Nur das Signal, welches die richtige Phasenlage hat, kommt mit der vollen Amplitude zur Wirkung. Die im Lock-In-Verstarker erzeugte Vergleichsspannung treibt uber einen Kraftverstarker den Synchronmotor zur Lichtmodu­lation.

Das Ausgangssignal des Lock-In-Verstarkers ist eine Gleichspannung, die proportional zu dem Lichtstrom ist, der auf den Multiplier (SEV) trifft.

Fur Transmissionsmessungen (T = _1_) wird diese 10

Gleichspannung direkt zu einem Kompensations­schreiber iibertragen, wahrend bei Extinktions­

messungen (E = log ~) die Gleichspannung iiber I

II7

28 . G. TmESSEN

einen Transmissions-Extinktions-Wandler (T jE­Wandler) der Firma Carl Zeiss geleitet wird. Der TjE-Wandler wurde den speziellen MeBaufgaben angepaBt, da anstelle des sonst tiblichen Wechsel­spannungseinganges der Gleichspannungseingang getreten ist.

Man erhalt die Transmissionsspektren, indem zunachst das Spektrum in einer Leerstelle des Pra­parates aufgenommen, die zweite Messung an der beabsichtigten MeBstelle innerhalb des Objektes durchgeftihrt wird. Zur Auswertung muB der Quotient aus jeweils zwei zusammengehorigen MeBwerten gebildet werden.

Da die absuchende Messung (Scanning) einen erheblichen Zeitaufwand erfordert, wurde sie weit­gehend automatisiert (SCHULZE, 1968). Durch die Abtastautomatik gelingt es, das Scanning tiber eine fast beliebig krummlinig begrenzte Flache durch­zufiihren. Ein Schrittschaltwerk, das je nach Wahl 1-6 Schritte machen kann, wobei die Schrittweite 0,5 oder I fL betragt, gewahrt ein maanderformiges Abtasten der Flache.

Absorptionsspektren und raumliche Verteilung der Nukleinsauren

Die Absorptionsspektren von Kern und plasma lebender Zellen wurden uber den Wellenlangenbereich von 248-300 nm gemessen und die Mittelwerte der Absorption als Kurven­verlauf dargestellt (Abb.22).

Als Absorption (A) wird hier zunachst die

G "B T 10 - 1 db' 1 d' ro e I - = -- verstan en, wo el 0 Ie 10

Intensitat der einfallenden und I die der durch­gelassenen Strahlung ist. Die erforderlichen Korrekturen fur den reflektierten (R) und ge­streuten (S) Strahlungsanteil wurden durch­gduhrt (THIESSEN, 1971).

Der unterschiedlich hohe Absorptionsfaktor von zelIkern und Zytoplasma, im Bereich von 260-285 nm, wird durch den Gehalt an UV­absorbierenden Nukleinsauren und Proteinen mit deren jeweiligen Absorptionsmaxima bei 260 bzw. 280 nm bestimmt. Wahrend die ab­sorbierenden Gruppen der Nukleinsauren vor­wiegend aus den konjugierten Doppelbindungen der heterozyklischen Purin- und Pyrimidin­verbindungen bestehen, laBt sich die UV­Absorption der Proteine bei A280 nm auf die Anwesenheit chromophorer Gruppen der aro­matischen Aminosauren Tryptophan und Tyro­

II8

sin zuruckfuhren; freie N ukleotide und Amino­sauren absorbieren ebenfalls in den entsprechen­den Spektralbereichen. Bei den Messungen von lebenden CHO-Zellen werden diese Verbindun­gen mit erfaBt, wahrend bei der Aufnahme von Absorptionsspektren fixierter und mikrotech­nisch nachbehandelter Zellen die zuvor genarm­ten leichtloslichen, niedermolekularen Substan­zen unter Umstanden entfernt oder verandert sein konnen.

Eine exakte Trennung der Absorptions­maxima von Nukleinsauren bei A260 nm und Proteinen bei A280 nm ist nur in reinen Losun­gen dieser Verbindungen moglich. Anders hin­gegen laBt sich der Verlauf der Absorptions­kurve des zelIkerns innerhalb des Wellenlangen­bereiches zwischen 260-280 nm erklaren. Bei Messung lebender Zellen tritt bei gleichzeitiger Anwesenheit von Nukleinsauren und Proteinen im Objekt eine Oberlagerung der Protein- zu Gunsten der Nukleinsaure-Absorption ein.

Wie aus Abbildung 22 ersichtlich ist und in den «durchfahrenen» Absorptionsspektren der

~'Io ~ - 100

z 0 90 ;:::

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240 250 260 270 280 290 300 A[nml

Abb.22. Registrierung des Absorptionsspektrums (Felddurchmesser 3,8 fL) von Zellkern und Plasma lebender Zellen tiber den WellenIangen-Bereich von A 245-300 nm. Die Kurven stellen Mittelwerte aus 20 Lebendmessungen mit einem mittleren Fehler von ±IO%dar.

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 29

einzelnen lebenden Zellen beobachtet werden konnte, kann bei der Messung mit dem Fehlen der charakteristischen Ausbuchtung der Proteine bei A280 nm gerechnet werden trotz Anwesen­heit von Tryptophan und Tyrosin (s. Plasma­kurve). Unabhangig von MeBfehlern konnte aus den vorstehenden Grunden eine Verlagerung des Absorptionsmaximums der Nukleinsauren um 5-10 nm vonnormalerweise260aufz65-270nm beobachtet werden (THIESSEN, 1971).

Die in Abbildung 22 dargestellten Absorp­tionskurven wurden an Interphase-Zellen er­mittelt, so daB die mittlere Streuung um den Mittelwert der einzelnen MeBpunkte nicht nur von dem biologischen, obj ektbedingten Inhomo­genitatsfaktor, sondern auch von den vorhande­nen Mengen absorbierender Substanzen z. Z. der einzelnen DNS-Synthese-Phasen mit­bestimmt wird. Sehr extreme Inhomogenitats­verhaltnisse liegen vor, wenn sich die UV -absor­bierenden Substanzen der zellkerne wahrend der Mitose auf die Chromosomen konzentrieren. Da eine inhomogene VerteilLmg der UV -absor­bierenden Verbindungen innerhalb der Zelle schlechthin und wahrend der Interphase je nach Synthese-Stadium schon unterschiedlich stark ausgepragt ist, wurde auf die Einbeziehung wei­terer, vom Zellzyklus abhangiger Stadien ver­zichtet. In diesen prinzipiellen orientierenden Versuchen sind deshalb keine Zellteilungs­stadien in die Untersuchungen der Absorptions­kurven mit einbezogen worden.

Die unterschiedliche Konzentrationsvertei­lung der Substanzmengen schon innerhalb klein­ster Bezirke fuhrt mit Zunahme des Inhomo­genitatsgrades zu MeBfehlern selbst bei kleinsten MeBfeldern, so daB nicht jeder beliebige Punkt der Zelle als geeignete MeBflache herangezogen werden kaun (GLUBRECHT, 1963; RUTHMANN, 1966).

Bei Anwendung des Absuch -V erfahrens zur Messung der Gesamtkonzentration mitteln sich die Verteilungsfehler der Einzelmessungen durch die Integration heraus. Es wurden Scanning­Messungen bei 265, 280 und 313 nm Wellen­lange uber den Bereich einer Zellflache von IOfLX38fL mit einer MeBfeldgroBe von IfL2 durchgefuhrt. Hieraus kann nach einer empiri­

schen Formel von SANDRITTER (1958) die Sub­stanzmenge der Nukleinsaure in Abhangigkeit vom Ort erreclmet werden.

Die in der Formel als Extinktion bezeichneten Werte beriicksichtigen nicht nur die absorbierte, sondern auch die reflektierte und gestreute Energie. Der Anteil, der durch Streuung und Reflexion verloren geht, wird durch das Hinzu­nehmen des Gliedes E,,313 berucksichtigt.

reI. M= F [0,92 EA265 nm - 0,75 E,,280 nm - 0,25 E,,313 nm]

F = Flache (fL 2) E,,265 nm = Extinktion bei der Wellenlange

265nm, E,,280 nm = Extinktion bei der Wellenlange

280nm, E,,313 nm = Extinktion bei der Wellenlange

3 I 3 nm, Streulicht und Reflexion (Korrekturglied)

Das Modell der Abbildung 23 verdeutlicht die unterschiedliche Massenbelegung UV -zyto­photometrisch nachweisbarer Nukleinsaure­mengen uber den bescmiebenen MeBbereich.

Wie aus dem Modell ersichtlich, treten die ausgepragten Inhomogenitaten innerhalb des Zellkerns und benachbarter Zellbezirke deutlich in Erscheinung. Die raumliche Darstellung wurde an einer in der mittleren S-Phase befmd­lichen Zelle vorgenommen. Die quantitative Auswertung dieses Objektes ergab einen Nu­kleinsauregehalt von insgesamt 6,5· 10-12 g, der sich uberwiegend auf die Kernflache inner­halb des dargestellten Ausschnittes von 380 fL2 konzentriert. Unter der V oraussetzung eines durchschnittlichen Kern: Plasma-Verhaltnisses von I: 4, bezogen auf die Zellflache, entfallen von 380 fL 2 in der raumlichen Darstellung 200 fL 2

auf den Zellkern. Einige der extrem hohen, im Modell hervortretenden Absorptionsgipfel lie­gen zum Teil im Bereich zwischen Zellkern und Zytoplasma, so daB die Kernmembran deutlich zu Absorptionsveranderungen beitragen kann.

Unter Beriicksichtigung der vorstehend ge­nannten V oraussetzungen einer inhomogenen N ukleinsa ure-Verteilung scheint es sehr bedenk­lich, ob Messungen zur Ermittlung der absor­bierten Dosis durch UV-Bestrahlung an einzel­

II9

30 . G. THIESSEN

Abb.23 . Raumliche Darstellung der regis trier ten UV-Absorption (A 265 nm) eines Zellkerns mit angrenzen­den zytoplasmatischen Flachenteilen von insgesamt 380 {L2.

nen Punkten der Zelle durchgefiihrt werden konnen. Aus diesem Bedenken heraus mussen komplizierte Methoden zur Errechnung der absorbierten UV-Dosis Iebender Zellen wah­rend der Bestrahlung angewandt werden.

Strahlenbelastung lebender Zellen wahrend der Messung

Bei Messung lebender Zellen im ultravioletten Wellenlangenbereich ist die wichtigste Fehler­quelie die Schadigung des Objektes durch die Messung selbst. Ais Folge der Strahlenschadi­gung bnnen an den lebenden Zellen Quellungs­und Entquellungsprozesse beobachtet werden (s. Kap.6), sowie strukturelie Veranderungen der Nukleinsaure-Molekiile, die zur Absorp­tionsanderung bzw. Verschiebung des fiir die Nukleinsaure charakteristischen Absorptions­maximums fiihren (KLIMEK, 1966). Anderungen der Zellform oder des Zellkernes, zur Zeit der Registrierung hervorgerufen ais Folge zu hoher Strahlenbelastung, hihren zu veranderten opti­schen Bedingungen, so daB es leicht zu einer Er­hohung des Streulichtes kommen kann.

Es lag deshalb nahe zu untersuchen, inwieweit die lebenden Zelien in den beschriebenen Ver­suchen bereits Schadigungen durch die Messung

infolge der absorbierten UV-Energie erlitten haben. Aus dies em Grund wurden Ermittlungen uber die Strahlenbelastung wahrend der Mes­sung angestellt. Durch fruhere Untersuchungen von SCHULZE (1968) lagen die Werte liber die absolute spektrale Empfindlichkeit des Multi­pliers und Messungen in der Objektebene vor, deren Ergebnisse die Spalte 2 der Tabelle 2 ent­halt. Urn hieraus die in der lebenden Zelle absorbierte Energie errechnen zu kOIinen, miis­sen diese Werte noch mit der MeBzeit lmd der spektralen Absorption einzelner Zellbestandteile multipliziert werden. Die absorbierte Energie (E) errechnet sich nach folgender Formel:

E = ~ So().)· T().) . A().) . dA ).

T().) = Zeit (sec), die zum Durchfahren eines Wellenlangenintervalls von 1 nrn be­notigt wird.

A().) = Absorption im Kern oder plasma bei der Wellenlange A.

SO = einfallende Strahlungsleistung.

Die Registrierzeit fur 1 nm Wellenlangen­anderung ist von der Wellenlange selbst ab­hangig, wie Spalte 3 zeigt. In den Spalten 4 und 5 wurden die Mittelwerte flir Kern und Plasma

120

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells' 31

Tab.2. MeBwerte zur Errechnnng der UV-Strahlenbelastung wahrend der Aufnahme von Absorptions­spektren lebender Zellen.

Spalte (1) (2) (5) (6)

Einstrahlung Absorbierte Absorbierte

A mn

in die Objektebene

(So) [erg/sec' fL2]

(. 10-9)

Registrierzeit (T)

[sec/nm]

Absorption (Kem) (AK)

Absorption (Plasma)

(AP)

Strahlungs­leistung (Kem)

[erg/fL2 . nm] (. 10-9)

Strahlnngs­leistung (Plasma)

[erg/fL2 . nm] (. 10-9)

250 4,73 4,6 0,68 260 II,OO 4,0 0,74 270 16,40 3,4 0,76 280 24,30 3,0 0,72 290 31,00 2,6 0,58 300 34,30 2,4 0,44 310 39,50 2,2 0,32

-9 ·10

60 E 50 c:

N' 40 "­

-;;, 30 :;; 20

O~~~--~--~~~~--~--~ 250 260 270 280 290 300 310 A [nm]

Abb.24. Verlauf der absorbierten Strahlungsleistung von Kem und Plasma tiber den Wellenlangenbereich von 250-310nm.

aus den Absorptionsmessungen der lebenden Zellen von Abbildung 22 eingesetzt. Die Werte der Integranden (So(A) . T (A) . A(A)) sind aus den Spalten 6 und 7 zu entnehmen. Der Verlauf der sich daraus ergebenden Kurven fiir Kern und plasma wird in Abbildung 24 dargestellt.

Die Werte der Integranden (Kern 2350' ro-9

erg/fL2 und Plasma 8ro· ro-9 erg/fL2) wurden durcll Planimetrie der Kern- und Plasmakurve ermittelt. Unter Beriicksichtigung des MaBstab­faktors und der MeBfeldgroBe von 3,8 fL Durch­messer bzw. II,3 fL2 Querschnitt ergaben sich fiir den Kern 26,6 . ro-6 erg/Zelle und fiir das

0,50 14,8 10,9 0,52 32,6 22,9 0,48 42,4 26,8 0,30 52,5 21,8

- 46,7 -- 36,2 -- 27,8 -

plasma 9,15 . 10-6 erg/Zelle. Wird das Spektrum des Kerns einer lebenden Zelle registriert, dann entspricht die damit verbundene Strahlen­belastlmg 50/00 derjenigen Energieabsorption, die bei kleinsten angewandten UV-Dosen bei Bestrahlungsversuchen (5,1 . ro-3 erg/sec' Zelle) zu ersten erkennbaren, zellularen Veranderun­gen fiihrt. Der entsprechende Wert fiir die Strahlenbehandlung des Zytoplasmas liegt bei 2 %

0 ,

MUNRO (1970) untersuchte die relative Strah­lenempfindlichkeit von Zellkern und Zyto­plasma der Chinesischen Hamster-Zellen. Aus­gewahlte Stellen innerhalb der Zelle wurden mit 0;-Teilchen (Polonium-Mikronadel-Technik) bestrahlt und anschlieBend 14 Tage lang be­obachtet. Zytoplasmabestrahlung mit hohen o;-Strahlendosen «25000 rad) hatte keinen Ein­fluB auf die Proliferation der Zellen. Der Zell­kern reagierte auf subletale o;-Strahlendosen mit Riesen- oder Multikernbildung. Zellkern und Kern-Plasma-Grenzbereich reagierten am sen­sibelsten, das Zytoplasma jedoch nur germg­fiigig auf die o;-Strahlung.

5. UV -Dosimetrie und Berechnung der absorbierten UV -Dosis bestrahlter lebender Zellen

UV-Dosisbestimmungen an lebenden Zellen strahlenbiologische Untersuchungen. Mit dem sind zwar nur mit erheblichem Aufwand durch­ in Kapitel 4 beschriebenen UV-Mikrospektro­fiihrbar aber von grundsatzlicher Bedeutung fiir photometer, das mit seiner Strahlenbelastung

121

32 • G. THIESSEN

weit unterhalb der Schadigungsgrenze der lebenden Zelle liegt, verfiigt man iiber ein Gerat, mit dem man in der Lage ist, wirkliche Dosisangaben, d. h. die tatsachlich von lebenden Zellen absorbierten UV-Energien, zu ermitteln.

Unter Beriicksichtigung der am Modell (s. Kap.4, Abb.23) dargestellten, inhomogenen Nukleinsaure-Massenbelegung scheint es sehr bedenklich zu sein, ob in den dort durchgefiihr­ten Messungen an einzelnen Punkten innerhalb der lebenden Zellen schon ausreichende Voraus­setzungen fiir genaue Bestimmungen zur Ermitt­lung der absorbierten Dosis geschaffen worden sind, wenn die Zellkulturen als Ganzes UV­Bestrahlung erhalten. SoIche dosimetrischen Dberlegungen treten insbesondere dann in den V ordergrund, wenn es gilt, ahnlich induzierte Strahlenschaden vergleichend zu interpretieren, die das Resultat von Bestrahlungsexperimenten sind, bei denen verschiedene Strahlenarten mit unterschiedlichem zellularen Wirkungsmecha­nismus angewandt werden.

Die aufwendige UV-dosimetrische Methode zur Bestimmung der Energieabsorption leben­der Zellen ist gerechtfertigt, wenn man die hochgradig auf bestimmte Metabolismen spe­zifisch wirksame UV-Strahlung mit den un­spezifisch wirkenden Rontgenstrahlen verglei­chen mochte. Voraussetzung zur Gegeniiber­stellung beider Strahlenarten ist eine gemein­same Dosisangabe (erg/g). Neben diesen soeben genannten Kriterien miissen noch eine Reihe anderer Faktoren Beriicksichtigung finden.

Aus vorstehend aufgefiihrten biophysikali­schen Dberlegungen heraus und im Hinblick auf nachfolgendeBestrahlungsexperimente(s. Kap. 6) be£aBt sich dieses Kapitel mit einer Methode zur Errechnung der absorbierten UV-Dosis leben­der Zellen w:ihrend der UV-Bestrahlung.

Als Strahlenquelle fiir die Bestrahlung ovaria­ler Zellen des Chinesischen Hamsters in Gewebekultur wurde eine HQA I25 W (Firma Osram) benutzt. Die Bestimmung der Bestrah­lungsstarke am Objektort kann mit Hilfe eines geeichten Luxmeters bei gleichzeitiger Verwen­dung des Filters UG 4/2 mm (Firma Schott) durchgefiihrt werden. Bei der benutzten Lampe ergab sich fLir die Liniengruppe 365-366 nm in

I22

einem senkrechten Abstand von 36 em eine Strahlungsleistung von 1420 erg/cm2 • sec. Da die relative spektrale Verteilung der HQA be­kannt war, konnte auch die Strahlungsleistung fur die anderen Linien bestimmt werden. Als Vergleichslampe diente das UV-NormaL Fur die Wellenlange 265 nm wurden 303 erg/cm2 •

sec in der Objektebene bestimmt. Fiir die Bestrahlungsversuche wurde das Filter

UG 5/1 mm (Firma Schott) vorgeschaltet, urn den sichtbaren Bereich zu unterdriicken. Bei Verwendung des UV-durchlassigenFilters UG 5 miissen Durchlassigkeitsverluste (z. B. 79% Durchlassigkeit bei 265 nm) und ein Reflexions­faktor (Pd = 0,91) in den Berechnungen beriick­sichtigt werden. Dementsprechend vermindert sich die Bestrahlungsenergie bei A265 nm von 303 erg/cm2 • sec urn 28% auf 218 erg/cm2 • sec.

Die am Bestrahlungsort einfallende, spektrale UV-Strahlungsleistung (erg/cm2 • sec· nm),mit und ohne Filter sowie die Filter-Durchlassig­keitskurve sind aus Abbildung 25 zu ersehen.

Den alleinigen Angaben der Bestrahlungszeit oder iiber die einfallende Strahlungsleistung kann kein bzw. nur ein verminderter Aussage­wert beigemessen werden, weil derartige Ver­suche aufgrund der variablen Strahlungsleistung der einzelnen Strahlenquellen einerseits nicht reproduzierbar sind und andererseits keine Angaben iiber die tatsachliche, yom Organismus aufgenommene Strahlungsenergie enthalten oder diesbeziigliche Riickschliisse erlauben. Die von den lebenden Zellkulturen in den Bestrah­lungsversuchen wahrend der UV-Bestrahlung absorbierte Dosis steht zur einfallenden Strah­lung in folgender Beziehung:

E = t ~ ~ So().)· A (A; x; y) df dA (I)

Ai

Hierin bedeuten:

= Bestrahlungszeit = am Objektort einfallende Strah­

lungsleistung hinter dem Filter UG 5/I mm (erg/cm2 • sec' nm)

A (A; x; y) = in der Zelle absorbierter Teil der einfallenden Strahlung in Abhan­gigkeit yom Ort und Wellenlange

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells' 33

D 351,12

336,49 1,0 Fi(terkurve

321,86 0,9

307,23 0,8 --'-' .------. 0,7 ~.

~ ~ 277,97 0,6 ~ "'" /' : .. : 263,34 0,5 /' ~

,I ~ 248,71 0,4 ,I <!> ,I

231.,08 0,3 z II 2 219,45 0,2 'I Vl II!

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131,67 I UJ

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'" 102,1. 1 5 UJ '" ~

<L 87,78 Vl

73,15

58,52

43,89

29,26

14,63

21.0 250 260 270 280 290 300;l. [nm]

Abb.25. Spektrum der einfallenden UV-Strahlnng einer Quecksilberdampflampe (HQA 125 W) am Ort des Objektes vor (S) und hinter (So) dem Filter UG 5/1 mm sowie die Filterdurchlassigkeitskurve in Abhangig­keit von der Wellenlange.

Die Formel (r) zeigt, daB von der einfallenden Strahlung nur der Teil (A) von der lebenden Zelle absorbiert wird. Ein anderer Anteil der Strahlungsleistung wird entweder durchgelassen, gestreut oder reflektiert. Flir die Dosisbestim­mung ist es erforderlich, die Absorption so genau wie moglich zu ermitteln. Die absorbierte UV­Dosis ist wellenlangen- und ortsabhangig und sicherlich von Zelle zu Zelle unterschiedlich. Es bleibt jedoch zu berlicksichtigen, daB die an fixierten Praparaten gemessenen Werte nicht einfach auf die lebenden Zellen iibertragen wer­den diirfen. AuBerdem wird die Absorption wegen des Streulichtes zu hoch gemessen und bedarf einer nachtraglichen Korrektur. Es ist also zur Errechnung der absorbierten Dosis not­wendig, die Absorption in Abhangigkeit vom Ort und der Wellenlange zu kennen.

Die ortsabhangigen Absorptionsunterschiede beruhen auf der strukturell differenzierten Zusammensetzung der Zelle in Kern und plasma.

Diese Strukturdifferenzierung kann mit ge­nligender Sicherheit an fixierten Pdparaten bestimmt werden aufgrund des Gehaltes an absorbierender substantieller Massenbelegung, indem die Absorption bei A260 und A280 nm gemessen wird. Auf diese Weise gewinnt man einen Dberblick liber die relative Verteilung bzw. die relativen Anteile der bei den beiden Wellenlangen charakteristisch absorbierenden Substanzen, nicht aber tiber die tatsachliche Absorption der lebenden Zelle. Urn hieriiber jedoch eine Aussage machen zu konnen, mlissen die an den lebenden Zellen ermittelten spek­tralen Absorptionen im Kern und Plasma in die Betrachtungen mit einbezogen werden (s. Kap.4, Abb. 22). Diese Kurven sind Mittelwerts­kurven aus mehreren Messungen, bei denen die Einzelergebnisse infolge der verhaltnismaBig unscharfen Angabe des MeBortes (Kern und Plasma) und bei gleichzeitig unterschiedlicher DNS-Synthese-Phase der Zellen zur Zeit der

123

34 . G. THIESSEN

Messung berucksichtigt werden mussen, so daB beide Kriterien einen EinfluB auf die mittlere Streuung des Mittelwertes ausuben. Trotzdem durfte der Vedauf der Mittelwertskurven die richtigen vorliegenden Verhaltnisse hinsichtlich des Gehaltes an UV-absorbierenden Substanz­mengen der beiden Wellenlangen in Kern und plasma wiedergeben. Die sich hieraus erg eben­den Werte sind aber fiir die Berechnung der absorbierten Energie einer lebenden Zelle noch nicht direkt anwendbar.

Fur die Berechnung der durchschnittlich absorbierten Energie liegen folgende MeBdaten vor:

1. Eine Anzahl Messungen an fixierten Prapara­ten, die AufschluB uber die strukturelle Zu­sammensetzung der Zelle ermoglichen, aber nicht direkte Ruckschlusse uber die spektrale Absorption der lebenden Zelle erlauben.

2. Bine Anzahl von Messungen, die den relativen spektralen Verlauf der Absorption von Kern und Plasma der lebenden Zellen aber nicht die mittlere spektrale Absorption tiber die ge­samte Zelle ergeben.

Unter diesen V oraussetzungen kanu zur Ermittlung der Energieabsorption folgender­maBen verfahren werden:

von einer groBen Anzahl fixierter CHO-Zel­len liegen Messllngen der drei Wellenlangen bei A260, 280 und 313 run als Registrierungen tiber ein Rechteck vor. Dieses schlieBt die gesamte Zellflache ein. Die Messungen bei A313 nm werden herangezogen zur Allsschaltllng des Strelllichtanteils. Nach SANDRITTER (1958) be­steht eine Korrektllrformel zur Elimination des Streulichtanteils, wobei E die Extinktion bei der betreffenden Wellenlange darstellt.

313 )Y EAkorr = EAmess - -A- . E 313 (

Der Exponent (y) schwankt nach Angaben verschiedener Autoren zwischen lund 4 (A 4-Gesetz), wo bei ein ni edriger Exponent wahr­scheinlicher sein sollte.

Da fur die Bestimmung der absorbierten Dosis jedoch nicht die Extinktion sondern die Absorption maBgebend ist, muB die Formel (2)

auf die Absorption umgerechnet werden. Hier­bei wird der Exponent y in den weiteren Be­trachtungen gleich 2 gesetzt. Setzt man fur E = -log T, so geht Formel (2) mit y = 2 uber m:

( 313 )2 log TAkorr = log TAmess- -A- logT313

Hieraus ergibt sich

Wird nun T=I-A gleichgesetzt, wobei A die Absorption bedeutet, so erhalt man:

I-AAkorr = (I-AAmess) . (I-A313)

Da die Absorption Am eine sehr kleine GroBe ist, kann dieser Ausdruck in einer Reihe ent­wickelt werden.

Es ist:

313 )2 I-AAkorr = (I-AAmess)· (1 + ( -A- . A 313-· .)

Nach Umrechnung ergibt sich bei Abbruch nach dem I. Glied die folgende Korrekturformel:

Parallel zu Formel (3) wurde eine einfachere Korrekturformel erprobt und auf ihre Anwend­barkeit uberprlift:

Durch den Vergleich der Berechnung ergab sich zwischen den Ergebnissen der Formel (3) und (4) nur ein Unterschied in der GroBen­ordmmg von maximal 2%. Dieses Resultat berechtigt zu der Annahme, daB die Hohe des Exponenten schlechthin keine kritische GroBe darstellt.

Wenn Absorptionsmessungen an fixierten Zellen bei den Wellenlangen 260, 280 und 313 nm vorliegen, danu konuen Rtickschlusse auf den Anteil von Kern und Plasma an der Gesamtabsorption gezogen werden. Den Kern­

124

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 35

bzw. Plasma-Anteil an der Gesamtabsorption erhalt man durch folgendes Gleichungssystem:

A260 = IX' A (260)Kl + ~ . A (260)Pl (Nukleinsaure-Absorption bei"A 260 nm)

A280 = IX' A (280)Kl + ~. A (280)Pl (Protein-Absorption bei "A 280 nm)

A260 bzw. A280 stellen die Mittelwerte der Absorption dar, die aus den Messungen mit den fixierten Zellen ermittelt wurden und bei denen der Streulichtanteil eliminiert worden ist. A(260)Kl bzw. A(280)Kl sind die Absorptions­werte, die an lebenden Zellen im Zellkern gemessen wurden und A(260)Pl bzw. A(280)Pl sind in Analogie die entsprechenden MeBwerte fur das Zytoplasma. Die Faktoren IX und ~, also die relativen Anteile der Kern- und Plasma­absorption, werden aus diesem Gleichungs­system errechnet. Mit Hilfe von IX und ~ werden

18

17

16

15

14

13

,.----, 11

f 4> ~

N

S

11

10

co z 2 <il W -'

OJ

'" 0 <il OJ <l:

nur die Werte A(260)Kl' A(260)Pl, A(280)Kl und A(280)Pl korrigiert. Die Werte gelten namlich nur fur eine bestimmte Stelle im Kern bzw. plasma. Wir benotigen aber die Anteile [A("A)K2 und A("A)P2], die sich auf die gesamte Zelle beziehen und erhalten sie mit Hilfe von IX

und ~ und zwar flir jede Wellenlange.

Manerhalt:

A("A)K2 = A("A)Kl . IX

(6) A("A)P2 = A("A)Pl . ~ Mit der Errechnung dieser Werte geht Formel (r) uberin:

EZelle = t . F f SO(A) . (A("A)K2 + A ("A)P2 ). d"A (7) A

Da die Ortsabhangigkeit der Absorption hier vereinfacht bei der Berechnung von A("A) durch die Mittelwertsbildung berucksichtigt wurde,

140 250 260 170 280 190 300 A Inmj

Abb.26. Die von Zellkern und Plasma absorbierte Leistung [SO(A)· A ("Ak2 und SO(A) . A ("A)P2] in Abhangig­keit der Wellenlange.

125

36 . G. THIESSEN

kann die Flache (F), tiber der die Messung erfolgte, als Konstante vor das Integral gezogen werden. Das Integral selbst wird in die Anteile fiir Kern und Plasma aufgespalten und die Werte durch Planimetrie der Flkhe bestimmt (Abb.26). Die Anteile des Linienspektrums wurden dabei extra berechnet.

Bei der Durchfiihrung zur Errechnung der absorbierten Energie lebender Zellen ergaben sich folgende Werte:

A).mess (Formel3) wurde aus vorliegenden Registrierkurven des UMSP I ermittelt. Zur Feststellung der mittleren Absorption wurden die Registrierkurven ausgeschnitten und zwar nur der Teil, der sich zwischen der Kurve und der 100%-Linie befmdet, weil der Schreiber des Gerates die Transmission aufzeichnet, aber die Absorption fiir die Berechnung benotigt wird. Samtliche ausgeschnittenen Kurven (25 Stiick je Wellenlange) wurden, nach WellenIangen getremlt, gemeinsam gewogen und mittels der Flachenmasse (40 g/cmz) das Verhaltnis zur Absorption I (= 100%) bestimmt.

Hieraus ergaben sich folgende Werte:

"A (nm) Ai-mess A i-korr

260 0,172 0, 125 280 0,149 0,107

313 0,039

Mit den Absorptionswerten der Absorptions­spektren lebender Zellen aus Abb.22 (s. Kap.4) A(260)Kl = 0,74 A(260)Pl = 0,52 A(280)Kl = 0,72 A(280)Pl = 0,30 ergaben sich fiir IX und ~ die folgenden Werte: IX = 0,II9 ~ = 0,071

Die mit Formel (6) errechneten Werte A("A)K2 und A("A)P2 sind der nachstehenden Tab.3 zu entnehmen.

Die Werte (Formel 8) fiir So().) . A("A)K2 und So().) . A(A)P2 sind aus Abb.26 ersichtlich. Die Auswertung der Darstellung ergibt folgende WerteHir:

126

Tab.3. Umrechnung der reI. Kern- und Plasma­absorption tiber die Faktoren IX und ~ in absolute Werte.

"A AKl . IX Ap, ' ~ [nm]

248,0 0,0785 0,0341 250,0 0,0809 0,0355 255,0 0,0845 0,03 69 257,5 0,0845 0,03 69 260,0 0,0880 0,03 69 265,0 0,09°5 0,0355 270,0 0,09°5 0,0341

275,0 0,0881 0,0270 280,0 0,0857 0,021 3 285,0 0,0832 0,0092 290,0 0,0690

295,0 0,0595 300,0 0,0524

Spektrallinien = 55,68 erg/cmz . sec Kern:

Kontinuum = 68,44 erg/cmz . sec

124,12 erg/cmz . sec

Spektrallinien = 16,65 erg/cmz . sec Plasma:

Kontinuum = 24,57 erg/cmz . sec

41,22 erg/cmZ . sec

Die von ovarialen Zellen des Chinesischen Hamsters absorbierte Energie betragt insgesamt 165,34 erg/cmz , sec, wenn jeder Zelle eine Registrierflache von 770 fL Z zugeordnet wird. Die pro Zelle absorbierte Energie ergibt sich durch Multiplikation mit der Registrierl1ache (F). Diese ergibt sich, wie folgt aus: Papiervorschub des Schreibers 10 cm/Minute Tischgeschwindigkeit 40 fL/Minute d. h. I cm Papiervorschub entspricht einem Tischvorschub von 4 fL oder unter Beriicksichti­gung der Zeilenbreite von I fL einer iiber­strichenen Flache von 4 fLz. Somit gehort zu der gemessenen PapierstreifenIange von 192,5 cm eine Integrationsflache von 770 fLz. Aufgrund dieses Wertes erhalt man eine absorbierte UV­Strahlungsleistung von 1,275' 10-3 erg/sec je Zelle.

Zur Kontrolle dieser Berechnung wurde die der Zelle zur Verfiigung stehende Strahlungs­leis tung abgeschatzt. Aus Abb. 25 ergibt sich eine

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells' 37

Strahlungsleistung So von 1525 erg/cm2 • sec. Wenn man als Beispiel fiir die durchschnittliche Zc1lflache das Modell (s. Kap.4, Abb.23) mit 350 fL 2 in die Kalkulation einbezieht, so ergibt sich daraus, daB der Zelle eine Strahlungs­leis tung von 5,35 . 10-3 erg/sec zur Verfiigung steht. Nach der zuvorgenannten Beziehung wiirde die ovariale Zelle des Chinesischen Hamsters etwa 25% der UV-Strahlungsleistung So absorbieren.

Dieses durch Vereinfachung und Mittelwerts­bildung gewonnene Ergebnis ist fiir die Ab­stufung der UV -Dosen und den Vergleich mit Rontgenstrahlen-Dosen wichtig. Die mikro­spektrometrische Messung der UV-Absorption, von der hier ausgegangen wurde, leistet natiir­lich mehr. Bei genaueren Analysen kann sowohl auf die spektrale wie auf die ortliche Verteilung der absorbierten Energie innerhalb individueller Zellen zuriickgegriffen werden.

6. Untersuchungen der nach UV - und Rontgenbestrahlung induzierten zelluHiren Effekte

1922 fiihrte DES SAUER die physikalischen Erkenntnisse iiber die quantenhafte Absorption der Strahlen in die allgemeine Strahlenbiologie ein. Von dem Gedanken der quantenhaften Absorption biologischer Substanzen ausgehend entwickelte sich die sogenannte formale Treffer­theorie. Diese Theorie dient der statistischen Auswertung von Untersuchungen, deren Ergeb­nisse in Dosis-Wirkungskurven zum Ausdruck kommen, und setzt sich die AufHirung der pnmaren V organge, welche biologische Strahlenwirkungen einleiten, zum Ziel.

1m wesentlichen ist die Energetik der pri­maren Reaktionen Gegenstand dieser Theorie. Die Unterscheidung jedoch zwischen Bereichen unterschiedlicher Strahlenempfindlichkeit ein­zelner Zellbestandteile (Zellkern, Chromo­somen, Plasma) kann nur durch die Ergebnisse partieller Bestrahlungsversuche bestimmt wer­den. DaB zwischen Bereichen verschiedener Strahlensensibilitat innerhalb der Zellen unter­schieden werden muB, geht u. a. aus den Unter­suchungen von ZIRKLE und BLOOM (1957) her­VOL Primar wird eine Schadigung der Zelle durch partielle Bestrahlung des Zellkernes weniger durch Plasmabestrahlung erreicht (MUNRO, 1970).

Obgleich sich die Treffertheorie an die bio­logischen Gegebenheiten durch Einfiihrung der biologischen Variabilitat innerhalb der bestrahl­ten Zellpopulationen und an die biologische Wirksamkeit angepaBt hat, bleiben dennoch viele strahleninduzierte, zellulare Prozesse inner­

halb des zellkernes oder Plasmas, die sowohl zu morphologischen, zytologischen oder zu Ver­anderungen des molekularen Bereiches in der Zelle fiihren, unberiicksichtigt.

Diese Tatsache und andere Kriterien fiihren zu einschrankenden Anwendungsmoglichkeiten dieser theoretischen Betrachtungen, da die Dosiseffektkurven ohnehin in ihrem Aussage­wert auf eine «Ja-Nein-Reaktion» limitiert sind. Deshalb miissen mehrere Gesichtspunkte zur Interpretation der Dosis-Effektkurve selbst und anderweitige Faktoren hinsichtlich der Wechsel­wirkungen zwischen Zellen und Bestrahlungs­einfluB in die Untersuchungen einbezogen werden.

Dosiseffekt-Beziehung

Die Zellzahl in trypsinierten Zellsuspensionen (ca. 97% Einzelzellen) kann mit einer Thoma­Zahlkammer bestimmt werden. Fiir einzelne Bestrahlungsdosen abgestimmte, aliquote Zell­konzentrationen der Suspension werden in Petrischalen mit 8 ml Nahrmedium iibertragen. Aus Vorversuchen ermittelte zellkonzentratio­nen variierten iiber den angewandten Dosis­bereich von 500 bis 4' 104 Zellen pro Petri­schale. Die Bestrahlung der Zellen erfolgte 4 Stunden nach der Inokulation.

Zur Bestrahlung wurde das Nahrmedium von den nunmehr haftenden Zellen entfernt, so daB die zugeflihrte Strahlungsenergie auf die ein­schichtigen zellkulturen einwirken konnte. Die

127

38 . G. THIESSEN

Bestrahlung selbst erfolgte unter normalen atmospharischen Bedingungen bei 35° C und anschlieBender Zugabe frischen Kulturmediums. Wahrend der Bestrahlung (maximal 2 Minuten) konnten keine Austrocknungserscheinungen beobachtet werden, so daB diesbezugliche Nebenwirkungen unberucksichtigt bleiben konnten (Inkubation der Zellen bei 37° C in 2%iger CO2-Atmosphare). Ein wesentlicher Faktor filr die spatere Auswertung der 11ber­lebenden Kolonien ist die Mischung der Zellen mit dem Medium und eine durch rotierende Bewegung erreichbare gleichmaBige Verteilung der Zellen uber die verfugbare Glasflache. Die Weiterkultur der bestrahlten Versuchsglieder erstreckte sich je nach Zellkonzentration und Dosis auf IQ-14 Tage, so daB die Zellkolonien mit dem Auge als grauer Belag sichtbar wurden. Fur die Auswertung wurden die Kolonien mit Bouin-Allen fixiert und mit Hamalaun gefarbt. Bei der Auszahlung der uberlebenden Kolonien wurde eine I cm breite Randwirkung der P etrischalen berucksichtigt.

Ein ERESCO-Rontgengerat (Firma Seifert) wurde fur die nachfolgenden Bestrahlungs­versuche als Strahlenquelle benutzt. Das Gerat ist stufenweise tiber einen Energiebereich von 5-30 KeV regelbar. Die Dosierung wurde mit

, , , , (S) 'f, 100 .-.~. 50

, "": -t- Do ~o 1.5,10

4ergfg ~ 10

5

dem Ionisationskammer-Dosimeter «Simplex» (Firma Pychlau) in Luft durchgefuhrt. Die Dosisleistung im Abstand von 14 cm zur Objekt­ebene bei 5 mA und 30 KeV wahrend der Bestrahlungsversuche betrug 1250 R/Min. Dies entspricht einer Gewebe-Dosis (rad) von:

DGewebe (rad) = 0,97 DLuft(R) Die UV-Bestrahlungen wurden nach den in

Kapitel4 und 5 angegebenen Bedingungen durchgeflihrt.

Die Oberlebenskurve ermoglicht auf der Basis der Dosiseffekt-Beziehung als Funktion der Zeit den Vergleich zwischen verschiedenen Strahlenarten, Dosen und Bestrahlungseffekten. Zum spateren Vergleich der Strahlenwirkung von Rontgen- und UV-Strahlung wurde die £iir beide Strahlenarten gemeinsame Dosisangabe (erg/g) gewahlt. Da zunachst (s. Kap.4 u. 5) die absorbierte UV -Energie pro Zelle berechnet wurde, muBte noeh ein mittlerer Wert £iir die Masse der Zelle eingesetzt werden. Bei einem gemessenen Durehmesser der kugelformigen, trypsinierten Zelle von 12 [1. (Zellvolumen 904 [1.3) und einer angenommenen mittleren Diehte von 1,15 g/em3 betragt die mittlere Zellmasse 1,04' IQ-9 g. Die in Abb.27 als Beispiel wiedergegebene Dosiseffekt-Kurve (DE) erstreekt sieh tiber einen Dosisbereieh von

.~

.~ 0,5

.~ .~

0,1 +--.---,----,--,--r--,------,--,-----,..----"-r­

o 1,0 2P 3.0 4.0 5.06.0 8.0 10, 104 erg fg UV- STRAHLUNG

Abb.27· Prozentuale Oberlebensrate (S) asynchroner Chin.-Hamster-Zellen in Abhangigkeit von der absor­bierten UV-Energie.

I2S

9,6· ro4 ergjg absorbierter UV-Energie und wurde in Form der Beziehung

f = I - (I - e-DJDo)n

dargestellt, wobei (f) die Fraktion der iiber­lebenden Zellen zur Dosis (D), Do eine Ab­totungsrate von 37% im exponentiellen Kurven­bereich und n die Extrapolationszahl bedeuten. Der Do-Wert von 1,54· ro4 ergjg absorbierter Energie steht in guter Dbereinstimmung mit den umgerechneten Werten aus den Unter­suchungen von LEGRY und HALL (1969) nach Rontgenbestrahlung synchronisierter Zellen in der S-phase unter normalen atmospharischen Bedingungen. Der Extrapolationswert von 2 liegt jedoch bei den Autoren um den Faktor 3 hCiher.

LANGE (1970) erarbeitete eine Methode zur Bestimmung von Extrapolationswerten bei DE-Kurven fiir einzelne Teildosen nach frak­tionierter Bestrahlung. Die DE-Kurven von Maus-Milzzellen weisen unter modifizierten U mweltbedingungen nach Rontgenbestrahlung einen variablen Verlauf auf. Der D37-Wert liegt auf der DE-Kurve unter normalen Bedingungen (Luft) bei 80 rad und unter Sauerstoffatmosphare bei 200 rad. Nach PHILLIPS und HANKS (1968) betragt der O.E.R.-Wert3) 2,4. Wird die Strahlendosis fraktioniert appliziert, dann konnen subletale Schaden innerhalb weniger Stunden repariert werden (LANGE, 1968). BROESE und BARENDSEN (1969) benutzten als Dberlebenskriterien nach fraktionierter Be­strahlung die Proliferationsfahigkeit mensch­licher Gewebekulturzellen. Der fiir Neutronen­bestrahlung bestimmte Erholungswert ist um den Faktor 2 kleiner als nach Rontgenbestrah­lung. NIAS et al. (1970) ermittelten nach Puls­Bestrahlung mit ro MeV Elektronen fiir die DE-Kurven von HeLa-Zellen den O.E.R.­Faktor 3,2.

PETROVIC et al. (1970) untersuchten die Wir­kung von Rontgenstrahlung auf die DNS­Synthese und Dberlebensrate von Maus L-Zellen in Gegenwart exogener DNS, Desoxyribonu­kleotiden und Desoxyribonukleosiden. Durch den Zusatz von DNS oder Desoxyribonukleo­

3) O.E.R.-Wert = Oxygen Enhanced Ratio

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells· 39

siden unmittelbar nach Bestrahlung lieB sich ein Anstieg der DNS erreichen. Der EinfluB exogener DNS auf die Dberlebensrate ist nach PETROVIC abhangig von der Zellzyklusphase und in der S-phase am groBten. Aufgrund der Ergebnisse nehmen die Autoren an, daB die bestrahlten Zellen zur Reparatur von Strahlen­schaden niedermolekulare DNS-Bausteine be­notigen.

Aus der DE-Kurve (Abb.27) asynchroner Kulturen kann keine zyklusphasenabhangige Strahlensensibilitat abgeleitet werden, sie zeigt lediglich, daB ein Teil der zur Zeit in der Be­strahlung vorhandenen Initialzellen bis zum Ablauf der ro-I4tagigen Versuchsdauer den Strahlenschaden reparieren konnte. Die unter­schiedliche, inokulierte Zellkonzentration wurde mit Hilfe des P.E.-Wertes (78%) normiert, um die einzelnen Versuchsglieder als Kurvenverlauf darstellen zu konnen. Einen ahnlichen Verlauf der DE-Beziehung zeigten Ehrlich-Landschiitz Ascites-Zellen, sowie HeLa- und andere Zell­stamme nach UV - und Rontgenbestrahlung (PUCK und MARCUS, 1955; PUCK, 1959; ALPER et al., 1960; LEE und PUCK, 1960; RrxON und WHITFIELD, 1960; ELKIND, 1963; CULLEN und HORNSEY, 1966; HAHN und BAGSHAW, 1966; LUND und ROSENGREEN, 1966; RAUTH und WHITMOORE, 1966; WHITFIELD und RrXON 1966; CHAPMAN et al., 1970). '

ARLETT (1970) untersuchte den EinfluB ver­schiedener Substanzen auf die Oberlebensrate bestrahlter Zellen zur Nachbehandlung. Die Hemmung der DNS- und Proteinsynthese, sowie Temperaturverminderung oder Zusatz von Koffein zeigten keine Wirkungen auf die Dberlebensrate. Bestrahlte Zellen reagierten auf Zusatze wie Actinomycin D, Akriflavin oder Ethidiumbromid, die mit den Nukleinsauren Komplexverbindungen bilden, durch Vermin­derung der Dberlebensrate. In ahnlicher Weise verglichen MAURO und ELKIND (1968) und MAURO et al. (1968) den chemotherapeutischen Effekt des «Sulfur-Mustard» nach Rontgen­strahleneinwirkung auf die Dberlebensrate. Die Dberlebenskurven weisen nach Applikation unterschiedlicher Sulfur-Mustard-Konzentra­tionen den typischen sigmoiden Verlauf auf.

129

40 . G. THIESSEN

Ein Teil der Zellen speicherte Schaden bis zur Letalitat, wahrend die Oberlebenden nach einer rekonstruktiven Periode primar aus subletal geschadigten Zellen hervorgingen.

Bei dies en Ergebnissen bleibt jedoch zu berucksichtigen, daB die Oberlebensrate das Resultat mehrerer durch Bestrahlung induzier­ter strahlenart- und dosisabhangiger Ereignisse darstellt. Hierzu zahlt der unmittelbar nach Bestrahlung bei einer Anzahl von Zellcn ein­getretene sogenannte «Interphase-Tod» und der durch indirekten StrahleneiniluB erzeugte «reproduktive Tod», der nach einigen Genera­tionen als Folge metabolischer oder genetischer (zytologischer) Schadigung eintritt. Hierbei ist die selektive Wirkungsweise des UV auf die intrazellularen Synthesemechanismen der ein­zelnen Zyklusphasen, insbesondere im Wellen­langenbereich zwischen 260-280 nm, zu beruck­sichtigen. Die Nukleinsauren und Proteine uber­nehmen bei UV-Bestrahlung die Funktion eines sensiblen, zellularen Targets. Die Schadbilder der mit UV - und Rontgenstrahlung bestrahlten Chinesischen Hamster-Zellen lassen solche Interaktionen zwischen Strahlung und zellkern bzw. Plasma erkennen.

Die DE-Kurven gestatten keine Aussage iiber das Verhalten strahleninduzierter Polyploidie und uber Beziehungen von Strahlenresistenz und -sensibilitat in Abhangigkeit yom Ploidie­grad. REVESZ und NORMAN (1960) und Yu (1964) konnten an hyperdiploiden und -tetraploiden Ehrlich-Ascites-Zellen resp. quasitetraploiden Lungenzellen des Chinesischen Hamsters das V orhandensein solcher Korrelationen bei zyto­logischen Untersuchungen nachweisen. Eine nahere Analyse einiger in der DE-Kurve ent­haltenen Strahlenschaden wurde in den nach­stehenden Kapiteln durchgefuhrt.

Populationsdynamische Untersuchungen des Bestrahlungseffektes

Wahrend in den vorstehenden Untersuchun­gen die Strahlenwirkung vornehmlich im Hin­blick auf die Erhaltung der Zellteilung uber eine Zeitspanne von 10-14 Tagen und somit die

130

Fahigkeit bestrahlter Zellen zur Kolonieent­wicklung betrachtet wurde, deren Ergebnisse in Form der Oberlebenskurve zum Ausdruck hm, sind zur Erganzung detailliertere Auswertungen notwendig. Sie sollen AufschluB liber den direkten Bestrahlungseffekt erlauben und sekun­dare Folgeerscheinungen erkennen lassen, aus denen Rtickschlusse auf Zellreaktionen abge­leitet werden konnen.

a) Mitosehemmung und Verzogerung

Rontgen- und UV -Strahlung wirken sich selbst im Bereich niedrigster Dosen von 0,04 bzw. 0,01.105 erg/g auf eine Verminderung der Mitaserate in den bestrahlten Kulturen aus. Die Mitoseaktivitatsabnahme erfolgte schon bei kleinen Dosen ohne groBe Latenzzeit. Die Mitoserate der beabachteten Kantrollversuche liber einen Zeitraum von 48 Stunden zeigte leicht schwankende Tendenz und variierte urn den mittleren Mitose-Index von n% ± 2,6. Zur Bestimmung der Mitoserate wurden insgesamt 1000 Zellen banitiert, wavon jeweils 25a pro Objekttrager in die Auswertung ein­bezogen wurden.

Nach Bestrahlung mit Rontgenstrahlen­Dasen von 0,02 und 0,25· 105 erg/g vollzog sich eine spontane, fast lineare Abnahme des prozentualen Anteils mitotischer Zellen der bestrahlten Populationen innerhalb 4 Stunden von II% (= Kontrolle) auf 6,2 bzw. 2,4%. Ein Anstieg der Mitoserate trat unabhangig von der Bestrahlungsstarke nach weiteren II-28 Stun­den ein. Er erreichte zwischen 24-35 Stunden einen maximalen Wert mit 16,3-28,6%. Aus den Auswertungen nach 48stlindiger Versuchs­dauer ging hervor, daB sich die Mitoseindices bei den applizierten Strahlendosen bis a,l . 105 erg/g auf das Niveau der Kontrolle eingependelt hatten. Populationen, die mit Dasen von 0,1 bis a,25· 105 erg/g bestrahlt worden waren, wiesen nach einem mitotischen Hohepunkt auf eine anschlieBende Reduktion der Teilungsrate von 8,5-6,7%, die unterhalb der BezugsgroBe ver­lief, hin.

Die UV-bestrahlten Zellen (0,01-0,24· 105 erg/g) reagierten entsprechend den Rontgenbe­strahlungen in den folgenden 4-6 Stunden mit

einer ahnlichen, der Dosis proportionalen Ver­minderung an Mitose-Stadien. Nach dem Mitose-Minimum (2,8-1,4%) folgte, im Gegen­satz zur Rontgenbestrahlung, keine sprunghafte Zunahme des Mitose-Index sondern nach 48 Stunden nur ein langsamer den Strahlen­schadenkompensierender Anstieg auf 7,2-9,3%. Dies deutet auf eine ausgepragte Hemmwirkung schon relativ kleiner UV -Dosen hin. Der mitose­hemmende EinfluB von UV - und Rontgen­strahlung in Abhangigkeit der applizierten Dosen tritt sichtbar in dem zellteilungsvermin­derten Abschnitt, der sogenannten lag-Phase, (Abb. 28 a-b) in Erscheinung. Das differenzierte Verhalten und die groBe Oszillation des Mitose­Index, dies betrifft insbesondere die Rontgen­bestrahlung, deutet auf einen yom Entwick­lungsstadium abhangigen Empfindlichkeitsgrad der Zellpopulation zur Zeit der Exposition hin.

Der unterschiedliche, fur den untersuchten Dosisbereich strahlenartabhangige, mitotische Kompensationsgrad im AnschluB an die Mitose­depression ermoglichte einigen bestrahlten Zellen, die sich bereits zur Zeit der Bestrahlung in einem Mitosestadium befanden, ungehindert eine stark verzogerte Zellteilung durchzufuhren. Diese Zellen durchlaufen die Teilung dann gemeinsam mit denen, die wahrend der Inter­phase gehemmt wurden, woraus sich der kumu­lative Anstieg von Mitosezellen ergab.

Nach ELKIND et al. (1963) tritt als Bestrah­lungseffekt nicht nur eine Verzogerung der Zellteilung der schon am Anfang der Teilung befindlichen Zellen sondern gleichzeitig eine unmittelbare Wirkung auf bestrahlte Interphase­Zellen ein. Diese Verzogerung ist insofern denk­bar, wenn man berucksichtigt, daB die verur­sachten Strahlenschaden der unterschiedlich sensiblen Interphase-Abschnitte bis spatestens am Ende der G2-Phase ausgebessert werden mussen, damit ilberhaupt eine funktionell mogliche, verzogerte Teilung eingeleitet werden kaun.

SCAIFE (1969) untersuchte die RBW4) von mcs, 250 KV und roo KV Rontgenstrahlung im Hinblick auf die Oberlebensrate und Mitose­

4) RBW = Relative Biologische Wirksamkeit

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 41

verzogerung von menschlichen Nierenzellen. Der RBW-Faktorfur 137CS betrug im Vergleich zur Rontgenstrahlung 0,87. Die Rontgen­strahlung von roo KV und 250 KV wirkten unterschiedlich auf die Mitoseverzogerung, wobei Strahlung von roo KV die Mitose um den Faktor 1,2 wirksamer verzogerte als 250 KV bei Bestrahlung der Zellen in G2-Phase.

Aus den publikationen einiger Autoren (KLEIN und FORSSBERG, 1954; SWANSON, 1960; WATANABE und OKADA, 1966) geht ebenfalls hervor, daB iunerhalb des subletalen Dosis­bereiches eine graduelle Erhohung des mito­tischen Kompensationspunktes moglich ist. Diese Tatsache gibt AnlaB zur Aunahme, daB ein dosisregulierbarer Mitoseblock mit an­schlieBend kurzfristig partiell synchron verlau­fendem Wachs tum hervorgerufen werden kann.

b) Wachstumskinetik nach Bestrahlung mit subletalen UV - und Rontgen-Dosen sowie deren EinfluB auf die Teilung nachfolgender Generationen

Betrachtet man die Herabsetzung des Mitose­Index und die Mitoseverzogerung, die selbst im Bereich kleiner UV - und Rontgenstrahlen­Dosen in Erscheinung tritt, als primare sichtbare Einleitungsphase des Bestrahlungseffektes, so konnen weitere strahleninduzierte Veranderun­gen in morphologischer und biochemischer Hinsicht erst mehrere Generationen nach Ab­schluB einer pramutativen phase als sekundare Folgen festgestellt werden. Wie aus Abb. 28 a-b ersichtlich, wirken sich beide Strahlenarten hemmend auf die Wachstumskinetik subletal bestrahlter, teilweise unbegrenzt entwicklungs­fahiger Zellkolonien aus. Die Proliferations­fahigkeit nach UV- (0,01-1,8 . ro5 erg/g) und Rontgenbestrahlung (0,04-5,5 . ro5 erg/g) wur­de von normalerweise 20 Stunden nach Inoku­lation bis zu 72 Stunden behindert bzw. unter­brochen. Erst nach einer 3tagigen lag.-Periode ist der wachstumskinetisch wirkende Bestrah­lungseinfluB bei allen Versuchsgliedern auf­gehoben, so daB aus dem Anstieg der Zellzahlen pro Kolonie der Obergang in die exponentielle

131

-' r ~ N -' -' W N

42 . G. THIESSEN

1000 800 UV- BESTRAHLUNG 600

400

300

200

100 80

60

40

30

20

10

~f 24 48 72 96 120 STD KULTURDAUER

a

KONTROLLE /~0,01 105

erg/g ! · ___ 0,05·10 5 erg/g

~:......-- 0,03105

erg/g

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IJ '~lf

1000 800 RONTGEN-STRAHLUNG 600

400

300

200

100 80

60

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10

KONTROLLE /0,05105 erg/g

• ~ 0, 10 10 5 erg/g

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5 IA'~ ~:: ::: :::;: A; 6,00 10 erg/g

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0 24 48 72 96 120 STD KULTURDAUER

b

Abb. 28 a u. b. Wachstumskurven mit unterschiedlichen UV - und Rontgen-Dosen bestrahlter ovarialer Zellen des Chin. Hamsters.

Wachstumsphase deutlich zu ersehen ist. Ob­gleich die Auszahlungen der Zellzahlen pro Kolonie in 24stiindigen Intervallen durchgefiihrt und jeweils 150 Kolonien je Einheit in die Aus­wertung einbezogen wurden, stellen die Kurven nur Mittelwerte dar, ohne dabei den individuell erfolgten Grad der Strahlenschadigung zu berucksichtigen. Es konnte keine Korrelation zwischen Zellzahl und KoloniegroBe festgestellt werden. Die Zellen der Kontrolle durchliefen innerhalb 120 Stunden Kulturdauer durch­schnittlich 8,2 Zellteilungen. Dies entspricht in hinreichender Obereinstimmung den ermit­telten Generationszeiten fur Stammkultur und Klonisolationen Cc C 2-C3 /II (s. Kap.3) von 14,6 Stunden Zyklusdauer.

In Abhangigkeit von Strahlenart und steigen­der Dosis ist eine Verlangerung der Generations­zeit zu beobachten. Die Zyklusdauer nach 5,5 . 105 erg!g Rontgen- und 1,8' 105 erg!g UV -S trahlendosis betragt bei gleicher Anzahl

132

erfolgter Zellteilungen (= 6,7 Teilungen) 19,2 Stunden. Vergleicht man diese Dosen miteinander im Hinblick auf die Wachstums­kinetik, so wirkte sich die UV -Strahlung 3 mal mitosehemmender als Rontgenstrahlung aus. Die Wachstumskurven vermitteln einen Ober­blick tiber die Strahlenwirkung, konnen aber nicht als ein ausreichend sensibler Indikator des Strahlenschadens betrachtet werden.

Die in diesem Zusammenhang nicht erfaB­baren, sekundaren Folgen betreffen insbesondere die zeitlich begrenzte Teilungsfahigkeit, den sogenannten reproduktiven Tod. GOLDSTEIN und OKADA (1969) untersuchten im Hinblick auf biochemische Veranderungen an bestrahlten Maus-Leukemia-Zellen das Verhaltnis von reproduktivem Tod zu Interphasetod. Wie aus den Ergebnissen von CULLEN und HORNSEY (1966) sowie FROESE und CORMACK (1968) er­sichtlich ist, konnte selbst 6 W ochen nach Rontgenbestrahlung (20000 R) eine graduelle

Verminderung der zellularen Reproduktivitat nachgewiesen werden. Die in ihrer Prolifera­tionsfahigkeit gehemmt gebliebenen Zellkolo­nien wirkten sich negativ durch indirekte Erhohung der Oberlebensrate aus, wenn die Auswertung nach unzureichend langer Kultur­dauer z. B. bereits 72-96 Stunden nach Be­strahlung erfolgte (PUCK et aI., 1958).

Die Strahlenwirkung in Abhangigkeit von Strahlenart, -dosis und Zeit und deren EinfluB auf die Folgegenerationen, sowie im Hinblick auf die KoloniegroBenverteilung von iiber­lebenden und begrenzt reproduktiv verbliebe­nen, ovarialen Zellen wurden als zusatzliche Kriterien in die Untersuchungen einbezogen.

Mikrodensitometrische DNS-Absorptions­messungen in Feulgen-Absorptionseinheiten (AE) bei A 560 nm ergaben mit einem mittleren Fehler der Einzelmessungen von 5% sowohl flir die unbestrahlten als auch bei den bestrahlten sogenannten «Zelltetraden», wie aus den auf­

UV - STRAHLUNG

0.24 0.9

25 25 25 I

20 20 20

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells' 43

gefuhrten Beispielen zu ersehen ist, uber­raschend gut ubereinstimmende Ergebnisse:

Tab.4. Beispiele des DNS-Gehaltes verwandter und nichtverwandter Zellen des 4-Zellstadiums.

I. II. III. IV. Zelle Tetrade Tetrade Tetrade Tetrade

(AE) (AE) (AE) (AE)

I 31 31 30 32 2 32 31 33 33 3 34 31 30 32 4 33 34 30 35

Die Werte der Absorptionseinheiten fur die «Schwesterzellen» innerhalb einer Tetrade und die Zell-Tetraden untereinander erwiesen sich als sehr einheitlich nach der zeitlichen Ober­schreitung des mitotischen Kompensations­punktes. Der durch die Bestrahlung induzierte Mitoseblock und die gute verwandtschaftliche Obereinstimmung der DNS-Werte sind als

RONTGEN - STRAHLUNG

1.4 2.8 4.2.105 erg/g

60 60 60

50 50 so

40 40 40 z KONTROLLE UJ [72STDl Z 9 o ::<:

15 15 15 30 30

0:: UJ o

I! 10 10 20 20 <l: N Z <l:

5 5 10

Ii! ,I

o o 0 - ""

o 00 -N

ZELLEN / KOLONIE ZELLEN / KOLONIE ZELLEN / KOLONIE Abb.29 a

Abb.29a-c. In ungerad- (U) und geradzahlig (G) differenzierte KoloniegroBen-Verteilung in Abhangigkeit von der Strahlenart, Dosis und Zeit nach der Bestrahlung im Vergleich zur Kontrolle. G: --U: -----. Abb.29a. Zellzahlen pro Kolonie (U/G) 72. Std. nach Rontgen- u. UV-Bestrahlung mit 1,4, 2,8 und 4,2' 105 erg/g bzw. 0,24, 0,9 und 1,8 . ro S erg/g im Vergleich zur Kontrolle.

133

44 . G. TmESSEN

11 KONTROLLE (96 STD I

9

7

5

3

o 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

2,8.105 erg/g 4,2.105 erg /g z RONTGEN - STRAHLUNG 11 RONTGEN - STRAHLUNG !:!:! 11 z [96 STDI I [96 STDI g 9 9

! ;:,c 7 o

7 0::

~ 5 5

~ 3 3 <{ N Z <t o 20 40 60 80 100 120 20 40 60 80 100 120 140

0,9.105 erg/g 1.8.105 erg /g UV - STRAHLUNG UV - STRAHLUNG 11 11 [96 STD I [96 STDI

9 9

7 7

5 5

3 3

l'

o 20 40 60 80 100 120 ZELLZAHL / KOLONIE

Abb.29b

Abb.29bu. c. Zellzahlen pro Kolonie (U/G) 96 und 120 Std. nach Rontgen- und UV-Bestrahlnng mit 2,8­4,2' 105 erg/g bzw. 0,9-1,8 . 105 erg/g im Vergleich zur KoloniegroBen-Verteilung der Kontrolle.

eine partielle Synchronisation reproduktions­ iiberhaupt und weIche Zeit ein synchroni­fahiger Zellen zu bewerten. sierend wirkender Bestrahlungseffekt induziert

Betrachtet man die ausgezahlten Zellzahlen bzw. beibehalten werden kann. MUTA und je Kolonie aus den unbestrahlten Versuchen, so KOIWAI (I970) stellten nach sukzessiver Be­ist ein Ablauf gleichmaBiger Teilungsschritte strahlung (3-8 KR) bei HeLa-Zellen einen pro­nur in den ersten 2-3 Teilungen gewahrleistet. gressiven Anstieg der Strahlenresistenz fest. Die DaB diese natiirlich vorhandene Synchroni­ Generationszeit vergroBerte sich ebenfalls mit sation tatsachlich sehr schnell verloren geht, ist dem Grad dieser Resistenz. aus den exponentiell verlaufenden Wachstums­ Eine empfindlichere Methode zur Messung kurven zu ersehen, die man nur dann erhalt, einer moglichen strahleninduzierten Synchroni­wenn man die durchschnittliche KoloniegroBe sation erfolgte durch die Klassifizierung der als Funktion der Zeit nach der Inokulation Kolonien nach ihren Zellzahlen, jeweils Ibis abtragt. Es bleibt deshalb zu untersuchen, ob 10 Zellen pro Klasse und dem relativen Verhaltnis

134

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 45

KONTROLLE 5 [120STDl

3

( i i 1 iii iii iii i

~~mm~~Dm~~B~~~~~~~ ZELLEN / KOLONIE

5 2.8.10 erg I 9 RONTGEN - STRAHLUNG

5 [120STDl

3

, , , ,

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 ZELLEN 1 KOLONIE

z UJ Z 4,2.105erg/g RONTGEN-STRAHLUNG 0 -' [120 STD] 5 0 ~

0::: 3 UJ 0

-' J: 60 80 [0 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 <i N ZELLEN 1 KOLONIE Z <i

0,9.105 erg 1 9 UV - STRAHLUNG 5 [120STDl

3

~~m~~~~~m~~~Dm~~B~ ZELLEN 1 KOLONIE

1.8.105 erg Ig UV - STRAHLUNG

: 1 [120 STD 1 I

1 11 1111n: II IH 1:::::1::1::1 IPFII: ::11:11:11:1:11: :lInIJiIIIIIIIIH! I: , ," I 1 I I , , I , ". ,I { I ( 1 " • " I I I ,

40 60 80 100 120 140 160 180200220240260280300320340360·380 ZELLEN 1 KOLON{E

Abb.29C

der Anzahl Kolonien je Klasse mit gerad- und ungeradzahligen ZelIzahlen. selbst unter der V oraussetzung, daB sich die N achkommen ciner «InitialzelIe» mit zunehmender Zeitspanne aus physiologischen Griinden nicht immer simultan teilen, mtissen Kolonien mit geraden und ungeraden ZelIzahlen zu einem bestimmten Zeitpunkt im gleichen Verhaltnis zueinander vorhanden sein, wenn keine weiteren sekun­daren Strahlenwirkungen in den Folgegenera­tionen auftreten.

Die KoloniegroBenverteilung nach erfolgter UV- (0,24; 0,9 und I,8 . lOS erg/g) und Ront­genbestrahlung (I,4; 2,8 und 4,2' lOS erg/g) wird in den Abb. 29 a-c dargestellt.

Diese Teiluntersuchung ermoglicht einen Einblick in das wachstumskinetische Verhalten unbestrahlter und bestrahlter CHO-Zellen tiber eine 120sttindige Versuchsdauer. Alle Versuchs­glieder wurden zur gleichen Zeit inokuliert, die Bestrahlung erfolgte 24 Stunden danach, so daB die auftretenden Differenzen gleicher Alters­

135

46 . G. THIESSEN

stufen (die Werte 48 Stunden nach Bestrahlung entsprechend den 72 Stunden alten Kontrollen) unmitte1bar als Bestrahlungseffekt bestimmter UV- bzw. Rontgendosen zu verstehen sind. Fiir die Auswertung wurden Proben 72, 96 und 120 Stundennacherfolgter Impfung entnommen. Jede Darstellung enthalt die Werte von 50-100 ausgezahlten Kolonien und deren Klassifizierung in gerad- und ungeradzahlige Zellzahlen.

1m Gegensatz zur Kontrolle (72 Stunden) zeigten die mit unterschiedlichen UV - und Rontgendosen bestrahlten Kulturen 48 Stun­den spater eine deutliche Limitierung der Kolo­niegroBenverteilung. Mit fortschreitender zeit­licher Entfernung yom Bestrahlungszeitpunkt tritt eine dosisabhangige Verbreiterung des Verteilungsspektrums ein, welches deutlich aus der Gegeniiberstellung der Quotienten fiir ungerad- zu geradzahligen (U/G) Zellzahlen verschiedener Zeiten ersichtlich wird.

Die durchschnittlichen Klassenquotienten aller Dosen und Zeiten lassen eine deutliche Domi­nanz der geradzahligen iiber die ungerad­zahligen Zellzahlen der rontgenbestrahlten Kolonien erscheinen. UV - und Rontgendosen <1,8 bzw. 2,8· 105 erg/g wirken sich nicht oder nur kurzfristig regulierend auf die Zell­teilung aus. Die UV-Dosen 0,24 und 0,9· 105

erg/g weisen auf einen innerhalb des Zellzyklus von der DNS-Synthese abhangigen se1ektiven Mechanismus hin, der zur Anreicherung ungeradzahliger Kolonien fiihrte.

Die allmahliche Anpassung der Werte an den Quotienten 1,0 oder >1,0 laBt sich auf den

Tab. 5. Klassenquotienten (UjG) in Abhangigkeit der Strahlenart, Dosis und Zeit nach Bestrahlung.

Dosis (. lOS

ergjg)

UjG (72 Std.)

UjG (96 Std.)

U/G (I20 Std.)

Kontrolle - 0,64 I,37 1,68

UV­ 0,24 0,87 - -Strahlung 0,90 0,64 0,95 I,33

1,80 0,26 0,73 0,80

Rontgen­ I,4° 0,39 - -Strahlung 2,80 0,I4 0,80 0,86

4,20 0,20 0,93 0,97

Ausfall einze1ner Zellen nach mehreren Teilun­gen als Folge eines nachwirkenden genetischen oder physiologischen Strahlenschadens (= repro­duktiver Tod) zuriickzufiihren. Die UV-Dosis 1,8.105 erg/g, bezogen auf das Verhaltnis U/G, ist um den dosisabhangigen Faktor 1,5-2,3 wirk­samer als die beiden hochsten Rontgendosen.

c) Morphologische Strahlenschaden

Die Bestrahlung der Zellen mit subletalen UV - oder Rontgendosen beeintrachtigt zwangslaufig den Ablauf zellularer Metabolis­men. Ais erste sichtbare Reaktionen konnten Teilungsverzogerungen oder Mitoseunter­brechungen beobachtet werden. Einige dieser Zellen behalten nur die Fahigkeit, fiir eine begrenzte Zeit nach der Bestrahlung Teilungen durchzufiihren, und sterben dann infolge Degenerationserscheinungen ab oder vollziehen Kernteilungen ohne Zellteilungen.

Wirkt sich die Bestrahlung auf den Zell- oder Kernteilungsmechanismus aus, so konnen schon 24 Stunden nach der Bestrahlung morpholo­gische Veranderungen in Erscheinung treten. Obgleich eine Vie1zahl strahleninduzierter Veranderungen moglich ist, konnten nur folgende markante Abweichungen erfaBt wer­den: 1. Sichtbare Zerstorung einze1ner Plasma­bezirke oder des gesamten Z ytoplasmas. 2. Mehr­kernige Zellen durch verhinderte Zellteilung. 3. Auftreten von deutlich vergroBerten, ein­kernigen Zellen, sogenannten «Riesenzellen» (s. Kap.6).

Die strahleninduzierten morphologischen Veranderungen lassen sich nicht exakt nach Strahlenart und -dosis klassifizieren, sondern nur nach dem Grad der Merkmalsausbildung und der Auspragungshaufigkeit unterscheiden. Das unterschiedliche Verhalten der Ze1lkulturen nach erfolgter Rontgenbestrahlung mit 0,7 . 105 erg/g ist aus den Abb.30-32 ersichtlich. Bereits 60 Stunden nach der Bestrahlung treten im Vergleich zur Kontrolle deutliche Kern­deformationen und Plasmaschaden in Erschei­nung. Wird die Beobachtung auf 120 Stunden ausgedehnt, so zeigt sich fast standig nach Rontgenbestrahlung, daB die meisten Zellen der Population die Strahlenwirkung iiberwunden

Abb. 30. Unbestrahlte Popnlation.

Abb·3 1

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells' 47

Abb·32 Abb.31-32. Durch 0,7' 105 erg(g Rontgen-Strah­lung nach 60 und 120 Stunden hervorgerufene strahleninduzierte morphologische Veranderungen.

hatten und die morphologisch, strukturell geschadigten Zellen in einigem Abstand ring­formig umschlossen. Aus der Abb. 3 list sowohl die gleichzeitige Anwesenheit von mehrkernigen als auch stark vergroBerten einkernigen Zellen (= Riesenzellen) zu ersehen. Schon nach Be­strahlung mit 0,09 . 105 erg/g Rontgenstrahlung konnte die Entstehung mehrkerniger Zellen und ein weiterer prozentualer Anstieg bei hoheren Dosen nachgewiesen werden. Dementsprechend ist eine Induktion dosisabhangig und wird ent­scheidend von der Zyklusphase, in der die Bestrahlung erfolgte, bestimmt. Die Anwesen­heit 10- oder mehrkerniger Zellen kann als Nachweis beibehaltener, partieller Reproduzier­barkeit angesehen werden. In UV -bestrahlten Populationen zeigten sich ebenfalls mehrkernige Zellen, jedoch wirkte sich die Bestrahlung unwesentlicher auf die Bildung karyotypischer Anomalien aus.

137

48 . G. THIESSEN

a b

Abb. 33 a u. b. Ho£zone und vakuolisiertes Plasma im Plasma-Kern-Grenzbereich nach UV-Bestrahlung mit 0,24· 105 erg/g.

Die Schadbilder nach UV- (0,24· lOs erg/g) und Rontgenbestrahlung (l,4· lOs erg/g) sind auf den Kern bezogen sehr ahnlich. Sie unter­scheiden sich aber in der Art der Plasma­schadigung. 1m Gegensatz zu dem granular erscheinenden plasma nach Rontgenbestrahlung (Abb. 34a u. b) flihrt die UV-Bestrahlung (Abb. 33 a-b) zur Vakuolisierung und Abhebung des Zytoplasmas von der Kernwand.

Die Abb. 33 und 34 lassen gleichartiges Ver­halten UV- oder rontgenstrahleninduzierter, mehrkerniger Zellen im Hinblick auf ihre Umgebung erkennen. Betrachtet man die Entstehung mehrkerniger Zellen als einen spezifischen Effekt, so kann die Ausscheidung toxisch wirkender, zellularer Stoffwechsel­produkte angesichts der «Hofzone» nicht aus­geschlossen werden.

Selbst in sehr dichten Zellkulturen wurden die mehrkernigen Zellen stets in respektier­lichem Abstand von normal erscheinenden

Zellen umgeben, es erfolgte keine Migration der morphologisch unveranderten Zellen in den «Hofbereich», selbst dann nicht, wenn die urnlie­genden Zellen infolge Dberbevolkerung schon Absterbeerscheinungen zeigten.

Als ein weiterer Strahlenschaden konnte eine kurzfristige Quellung der Zellen und allgemeine Hypertrophie der Kerne nachgewiesen werden (s. Kap. 6, Tab. 7). Der zytoplasmatische Schwellungseffekt flihrte zum ZerreiBen des plasmas und Ausbildung intrazellularer Plasma­brlicken (-£aden). Die Kernteilungen innerhalb mehrkerniger Zellen verlaufen selten synchron sondern meistens asynchron (Abb. 35). In beiden Fallen entstehen nach mehreren Kernteilungen sogenannte «Kernrosetten», deren innere Flache mit Zytoplasma ausgefi.illt wird (Abb. 36 u. 37).

Wurde eine UV- (0,l-O,24 . lOS erg/g) oder Rontgenbestrahlung (0,l2-0,5 . lOS erg/g) kurz vor oder wahrend der Zellteilung durchgeftihrt, dann erhielten die Zellen der folgenden Gene­

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 49

a b

Abb. 34a u. b. GranuHires Plasma mehrkemiger Zellen mit deutlich ausgepragter Hofzone nach 1,4' !OS erg/g RCintgen-Bestrahlung.

I I 25JJI

Abb. 3 5. Mehrkemige Zelle mit asynchroner Teilung.

139

50 . G. THIESSEN

1----1 10jJi

Abb. 36. «Kernrosette» mit innerem PlasmaeinschluB (1,4· lOs ergjg Rontgen-Strahlung).

ration einen odcr mehrere Mikrokerne. Letztere sind im Zytoplasma eingebettet oder innerhalb des Kernbereiches durch einen Plasmastrang yom Hauptkern getrennt. Einkernige und mehrkernige Zellen konnen im Durchschnitt 1-5, in Ausnahmefiillen bis zu IS, solcher Mikro­kerne enthalten (Abb.37). Nach mikrodensito­metrischen Messungen entsprach die anfiirbbare Substanz der Mikrokerne 3-10 Feulgen-DNS­AE. Werden diese Werte auf die Rinderspermien als Referenzpraparat mit 14 AE = 3,25 . 10-12 g DNS bezogen, so enthalten die Mikrokerne 1/3-1/10 des normalen DNS-Gehaltes einer diploiden, in der GcPhase befindlichen Zelle.

d) Induktion von Riesenzellen

AuBer den zytoplasmatischen Schiiden und der Anwesenheit mehrkerniger Zellen konnte die Entstehung von «Riesenzellen» nachge­wiesen werden, die entweder einzeln innerhalb

140

Abb.37. «Kernrosette» und im Plasma verstreute Mikrokerne (0,24· lOS ergjg UV-Strahlung).

anderer Kolonien anzutreffen waren oder sich zu einer eigenstiindigen Kolonie entwickelten.

Es ist seit einigen Jahren bekannt, daB mit der durch Strahlung verursachten Inhibition der Zellkernteilung eine Vermehrung des Zyto­plasmas und VergroBerung des N ukleus sowie der Nukleoli einhergeht. Die allgemeine Zell­vergroBerung liiBt sich auf eine kontinuierliche Synthese sich nicht teilender Zellen zuruckzu­fuhren.

Es konnte bei Bestrahlungsversuchen mit HeLa- und Maus-L-Zellen bis zur Verdoppe­lung der Zellmasse eine normal verlaufende DNS-, RNS- und Proteinsynthese nachge­wiesen und zum Teil Riesenzellen induziert werden (SHEEK, 1960; TOLMACH und MARCUS, 1960; WHITFIELD und R1XON, 1960; N1AS und PAUL, 1961; PAINTER und HUGHES, 1961; TERAS1MA und TOLMACH, 1963). Danach wurde die Biosynthese der DNS durch die Einstellung des Proteinstoffwechsels beendet.

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells' 51

In den vorliegenden Untersuchungen wurden suchsglieder wurden gemeinsam vorbehandelt, exponentiell wachsende zellkulturen mit UV­ so daB praparativ bedingte MeBfehler aus­(0,9 und 1,8' 105 erg/g) und Rontgendosen geschlossen werden konnten. Die MeBblenden­(r,o und 2,0 . 105 erg/g) bestrahlt. Die Strahlen­ groBe wurde so gewahlt, daB auBer der An­wirkung auf die Zellmorphologie und deren passung an die unterschiedlichen KerngroBen EinfluB auf die DNS-Synthese sind 24-120 Stun­ noch ein freier Rand im Bereich der Leerstelle den nach Bestrahlung untersucht worden. Die von 5 fL verblieb. Die Bestimmung der relativen Messung der DNS erfolgte nach vorheriger DNS-Menge in Absorptionseinheiten (AE) Fixierung der Zellen in fliissiger Luft und erfolgte aus einer 3 maligen Vergleichsmesslmg anschlieBender Feulgenfarbung mit Hilfe eines zwischen der Leerstelle und den entsprechenden integrierenden Mikrodensitometers bei A 560 nm Zellkernen. Die Auswahl der zu messen beab­(Firma Barr & Stroud) (s. Kap.7). AIle Ver- sichtigten Kerne erfolgte willkilrlich, um zu

. KONTROLLE 24 - 120 STD

:~ III I. 1~-r-r., , , , , 'rT-, """""""

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2e 4 e 6e 8e FEULGEN - DNS I AE

1.0.10 5 erg/g RONTGEN -STRAHLUNG

[24 STDJ

:j III·!~II., k , ,I,' ,I, ,IIh 'I, , , , , I I I I , , I

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 180 190 200 210 FEULGEN - DNS I AE

[48 STD]

I "~I~II,~I~I II, ,I 1,111, I, , ,1,1111 " ,,' '" 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

FEULGEN - DNS I AE

I ~ I '1,1, , , , , , , , 100' 110 120 130 140 150 200 210 220 230

FEULGEN - DNS I AE

[96 STD]

~L.I, U.Jt,,, I" " "" '" , 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 1'70' 180' 190' 100

FEULGEN - DNS I AE

[120 STD ]

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30 40 50 60 70 80 90 120 130 140 150 160 170 180 190 200 FEULGEN - DNS I AE

Abb·3 8. Veranderung des DNS-Gehaltes 24-120 Std. nach Rontgen-Bestrahlung mit 1,0' 105 erg/g im Vergleich zur Kontrolle.

141

52 • G. THIESSEN

2.0, 10 5 erg/g RONTGEN - STRAHLUNG

[24 STD J

~ ~ I , U~I ~ ~ ~b ~~ 1,1 L, ,II ,U ~I,I ~ 1 ",,' .. , 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

FEULGEN - DNS / AE

[48 STD ]

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FEULGEN - DNS / AE

[72 STD ]

~ ~ 1.U I ,I,~I." IIJ,I, I'~u:l 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 ' 160 1'70 1130 ' 190 200 N FEULGEN - DNS / AE

[96 STD ]

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FEULGEN - DNS / AE

[120 STD]

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FEULGEN - DNS / AE

Abb. 39. Rontgen-Bestrahlung mit 2,0' 105 erg/g.

verhindern, daB eine subjektive Selektion brauchbarer Kerne erfolgte. Je Zeiteinheit und Dosis sind die Absorptionswerte von 3 verschie­denen Objekttragern fUr 50 Zellen bestimmt worden.

Aus den Abb. 38-41 ist der mikrodensito­metrisch bestimmte Feulgen-DNS-Gehalt indi­vidueller ovarialer Zellen vor und nach der UV­bzw. Rontgenbestrahlung ersichtlich. Ein Ver­gleich der unbestrahlten und bestrahlten Zell..: kulturen in Abhangigkeit von Strahlenart, -dosis und Zeit ist nur moglich, wenn die MeB­werte der Kontrolle eindeutig zur Festlegung der 2 c- (= 30 AE) und 4-W erte (= 60 AE) heran­gezogen werden kOl1l1en. Wird der relativ und quantitativ (UMSP I -Bestimmung) ermitte1te

142

DNS-Gehalt von Bullenspermien (3,25 . 10-12 g DNS A 14-16 AE) als Referenzsystem benutzt, so entsprechen die 2C- (GcPhase) bzw. 4C­

(Gz-Phase) DNS-Werte der Kontrolle einer zelluIaren DNS-Menge von durchschnittlich 6,0-6,5 bzw. 12-13 . IQ-12 g.

Da fur den Zeitraum zwischen 24-120 Stun­den keine Werte oberhalb 4C ermittelt werden konnten, darf auf die Abwesenheit polyploider Zellen geschlossen werden.

In den bestrahlten Kulturen konnte im Ver­gleich zu den Zellen unbestrahlter Kolonien eine sichtbar veranderte Verteilung der MeB­werte durch eine unterschiedliche Anzahl Zellen mit erhohtem DNS-Gehalt beobachtet werden. Mit dem Erscheinen von 6 c-, 8 c- und verein­

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 53

0,9.10 5 erg/g UV - STRAHLUNG

[21. STD ]

~ 111~1 '''I ~., n, l.,dl,1 ., ,,","",., .. 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

FEULGEN - DNS / AE

5 [1.8 STD ]

~llil. n.l'lll \, ,II 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 170 180 190 200 210 220

FEULGEN-DNS / AE

....l [72 STD ]

~ : 1L....,.1111,~~l~I,.....II~...-+J'-rt-" '+-c-, rr+~~1,+-C-,' ,rr+, ,.,..,.-f, ,,...,....,..,..,.,, I, 1

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 11.0 150 160 170 180 190 200 FEULGEN -DNS / AE

[96 STD ]

~ ~ ,ll~ ~,., ,I • ~ J , 1 , , , , , II , I., , , , ,1\1, , , 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 11.0 150 160 170 180 190200

FEULGEN - DNS / AE

[120STDJ

~111J ,,1.1.11111, I , 30 1.0 50 60 70 80 90 laO' 110 ' 120' 130' 11.0 150 160 170 180 190200

FEUL GEN - DNS / AE

Abb.40. Veranderungen des DNS-Gehaltes 24-120 Std. nach UV-Bestrahlung mit 0,9 . 105 erg/g im Ver­gleich zur Kontrolle.

zelten r6c-WertenmuB auf die Entstehung von Riesenzellen (giant cells) geschlossen werden.

1m Gegensatz zu vielen Literaturangaben, in denen auch mehr- und fragmentkernige Zellen als Riesenzellen bezeichnet werden, sind in diesem Zusammenhang unter dem Begriff «Riesenzellem nur einkernige, innerhalb einer Kolonie morphologisch untereinander einheit­liche Zellen mit nachweisbarer Volumen- und DNS-Zunahme zu verstehen.

Die Anwesenheit von Zellen, deren DNS­Gehalt dem 6c-, 8c- oder gar dem r6c-Wert entspricht, kann als Beweis dafiir angesehen werden, daB die DNS-Synthese nach UV- und Rontgenbestrahlung nicht sofort nach Erreichen des normalen 4C-Wertes unterbrochen und auf

ihre natiirliche postmitotische Menge reduziert wird, sondern erst auf dem Niveau weiterer premitotischer und postmitotischer Synthese­stmen zum Stillstand kommt. Der progressive Anstieg laBt sich somit auf den Ablam mehrerer nacheinander folgender S-Phasen ohne Zell­teilungen zuriickfiihren. Durch die Strahlung wurde weniger die Chromosomenteilung, son­dern vielmehr deren Trennung verhindert. Diese DNS-W erte sind durch einfache oder doppelte Endoreplikation der Chromosomen­satze entstanden. Unter diesen Voraussetzungen miissen die Riesenzellen als polyploide Zellen und die Spindelzerstorung als primarer Bestrah­lungseffekt betrachtet werden. Die Fahigkeit einzelner Zellen, nach der Bestrahlung eine

143

54 . G. THIESSEN

1.8 10 5 erg/g UV - STRAHLUNG

[24 STDj

~ ~ II~~.I j I,Jll J IA-T I ~-. ,--i,IL,I-I,L---1 ~~~,

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 FEULGEN -DNS / AE

II I I -,--,L, ~I-,---,---r-r-r-,-,-'r--l 80 . 90 100 110 120' 130 200 210' 220 230 240 250

FEULGEN - DNS / AE

~ '1 f'ST,DJ I ~ ~ Ulilll~ "1 I II l I 11 ,--,-,J,,1,,-,-,-,,,-,~~ 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

FEULGEN - DNS / AE

[96 STDJ

~~~'I, .T,L,---,_~II I 30 40 50 60 70 80 90' 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190200

FEULGEN -ONS / AE

[120 STDJ

:tJJ1"J'OT~~~'~30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 13U 140 150 160 170 180 I 190 200 FEULGEN - ONS / AE

Abb.4I. UV-Bestrahlung mit 1,8· 105 erg/g.

zeitlich begrenzte DNS-Synthese durchftihren zu konnen, und das Auftreten von Diplo­chromosomen entscheidet tiber ihre Volumen­zunahme in Abhangigkeit des betreffenden Ploidiegrades (s. Abb.42a-d). Nicht nur Ront­gen- auch UV-Bestrahlung kann zur Ent­stehung von Riesenzellen fiihren.

In Anbetracht der Strahlenschadigung des Mitosemechanismus kounten nur selten Zell­teilungen bei den gefarbten Praparatcn in Riesenzellen beobachtet werden. Die Schadi­gung der Zellstruktur oder spezifischer Sub­stanzen und eine zusatzliche Disorganisation der Zellfunktionen fiihrten infolge genetischer Storungen zur Verlangerung der Generations­zeiten auf durchschnittlich I6,0-22,4 Stunden.

Nach Bestrahlung der Zellell entstand eine hinsichtlich ihres D NS-Gehaltes zu bezeichnende «gemischte Population». Die Fluktuation der MeBwerte kaun auf die dosisabhangige und somit zeitlich unterschiedlich lange Verhinde­rung bzw. Arretierung der Zellteilung zurtick­gefiihrt werden, da einige Zellen metabolisch aktiv geblieben sind und wahrenddessen variable DNS-Mengen synthetisiert haben. Diese Tat­sache kann durch die Mittelwertsbildung der in den Versuchen (Abb. 38-4I) gemessenen indi­viduellen D NS-W crte veranschaulicht werden.

Der durchschnittliche Anstieg des DNS­Gehaltes bestrahlter Zellen um 22-90% im Vergleich zur Kontrolle ist auf eine unter­schiedliche Anzahl vorhandener Riesenzellen

144

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 55

Abb.42 a

Abb.42 b

145

56 . G. TmEssEN

Tab. 6. Darstellung der DNS-Mittelwerte, gemessen in Feulgen-Absorptionseinheiten (AE), als Funktion der Strahlenart, Dosis und Zeit nach der Bestrahlung.

Rontgen­Kontrolle UV-Dosis dosis

Zeit (Std.) 0,9 1,8 1,0 I 2,0

.105 . 105 I . 105 • I05

erg/g erg/g erg/g I erg/g

24 I 60 66 I 77 I 86 74 48 Durch- 61 65 62

72 schnittl. 60 58 77 62 96 45AE=3C 61 58 53 66

120 55 80 64 61

zuriickzl1H1hren. Al1Berdem ermi:iglichen die DNS-Einzel- und -Mittelwerte einen Einblick in die biochemisch differenzierten Verhaltnisse uberlebender Zellen im Sinne der Dosiseffekt­Kurven.

Betrachtet man die Mittelwerte der ersten 24-48 Stunden nach der Bestrahlung, so scheint die l1nspezifisch schadigende Ri:intgenstrahll1ng starker mitoseinhibierend und riesenzellen­induzierend zu wirken als UV-Strahlung an­

nahernd gleicher Dosis. Da jedoch fur beide Strahlenarten die Fahigkeit der Riesenzellen­Induktion nachgewiesen werden konnte, die Werte aber 120 Stunden nach erfolgter Be­strahll1ng eine allgemeine kontinl1ierliche Ab­

Tab. 7. Planimetrisch ermittelte, dl1rchschnittliche Zellfhichen differenziert in Kern- und Plasma­anteile in Abhangigkeit von Strahlenart, Dosis und Zeit.

Zeit nach Plasma­Be- Zelle Kern anteil

strah- (fl.2) (fl.2) (%) lung

(Std.)

Kontrolle 48-96 660 158 100

UV- 48 6}0 ISO 96 Strahlwlg 72 900 250 130 (1,8· 105) 96 940 230 142 erg/g

Rontgen- 48 770 193 II5 StraWung 72 750 173 II5 (2,7· 105) 96 700 167 I06 erg/g

Abb·42C

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 57

d

Abb. 42 a-d. Dureh UV- und Rontgen-Strahllmg induzierte, 120 Std. naeh Bestrahlung in Erseheinung tretende, eigenstandige Riesenzellen-Kolonien untersehiedliehen Ploidiegrades. a) Kontrolle, b) naeh Bestrah­lung mit 0,45' 105 ergjg Rontgen-Strahlung, e) naeh Bestrahlung mit 1,8· 105 ergjg UV-Strahlung, d) Gemisehte Population, bestehend aus mutierten und normalen Zellen, 96 Std. naeh Bestrahlung mit 1,5 . 105 ergjg Rontgen-Strahlung.

nahme aufweisen, konnte man deshalb eine Verminderung der Vitali tat bei den Zellen mit DNS-Werten >4e annehmen.

Aus Abb.43 und Tab.7 sind die Mittelwerte der zellflaehen sowie deren Kern- und Plasma­anteile zu ersehen. Diese zusammengefaBten Ergebnisse sind von allgemeiner Aussage und lassen die dureh Bestrahlung hervorgerufenen individuellen Strahlensehaden, temporare und permanente Lasionen der Zellstrukturen, unbe­riieksiehtigt.

Fiir beide Strahlenarten gilt, daB eine mit der Dosis einhergehende zeitliehe relative Abnahme der durehsehnittliehen ZellgroBe eintritt.

Wie aus den Beispielen der Abb.43 hervor­geht, verhalt sieh die ZellgroBe naeh UV - und Rontgenbestrahlung, differenziert in Kern- und Plasmaanteil, in Analogie zu den DNS-Werten. Da sieh sowohl die DNS-W erte als aueh die durehsehnittliehe ZellgroBe bei der Etablierung

der Riesenzellen ahnlieh verhalten, so miissen mindestens die beiden folgenden Absehnitte ihrer Entwieklung untersehieden werden:

1. Phase: Induktion und kurzfristige Riesen­zellen-Formation. Zeitlieh begrenzt entsteht naeh der Bestrahlung (24-48 Std.) fiir 1-3 Zell­zyklen ein prozentual relativ hoher Anteil voll­standig oder partiell gehemmter Zellen, die keine bzw. mehrere anomale Kernteilungen durehfiihren kOl1l1en und infolge des Strahlen­sehadens nieht iiberleben.

2. Phase: Stabilisierung und Erhaltung des Zustandes. Diese Zellen haben die subletale physiologisehe Gleiehgewiehtsstorung hinsieht­lieh ihres Mitosemeehanismus ausgegliehen, synthetisieren ihrem Ploidiegrad entspreehend DNS und treten in eigenstandigen Kolonien oder vereinzelt innerhalb normaler Kolonien, siehtbar dureh ihre GroBenzunahme, als elll­kernige iiberlebende Riesenzellen hervor.

147

58 G. THIESSEN

Al' JJ.'

1900 1900 1900 1900

1800 1800 1800 1800

1700

1600 KONTROLLE 1700

1600 48 STUNDEN

1700

1600 \ • 72 STUNDEN

1700

1600 \ "'WNDEN

1500 1500 1500 1500

1400 1400 1400 1400 I..

1300 1300 1300 i 1300 1 ~

.~ u ,4: ...J U. , ...J ...J

~

1200

1100

1000

900

800

700

600

500

400

300

\ PLASMA i ' . \ '.

..,. ... -. •.. "-...

...... ­......

KERN

1200

1100

1000

900

800

700

600

1200

1100

1000

900

800

700

600

500

300

400

i '\. PLASMA-UV

i ". . L ~ ~

~\ '--\ \ \,

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PLASMA-RO"4.\:: .. "' . \\ KERN \i

".' .. ' \. ... ''".~..... : : ,.: ~.

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1200

1100

1000

900

800

700

600 500

400

\ \ PLASMA-UV

l \ ~. "\ \ '1 .... i \

... ~,. "\ ... \ . \

PLASMA-RO"'\

KERN

~ h \\ ..

200 ,',

100

I r iii Ii' ii, j I lit I I , I j j j i it iii, i i

01020304050 01020304050 01020304050 01020304050

ZELL - NUMMER ZELL - NUMMER ZELL-NUMMER ZELL - NUMMER

Abb·43. Veranderungen der durchschnittlichen ZelIfHiche ([1.2), differenziert in Kern- und Plasmaanteile flir 48, 72 und 96 Stunden nach 1,8' 105 erg/g UV- und 2,7' 105 erg/g Rontgen-Bestrahlung. KontrolIe: Plasma AAAA Kern l::,l::,l::,l::,; UV-Bestr.: Plasma •••• Kern 0000; Rontgen-Bestr.: Plasma AAAA Kern l::,l::,l::,l::,.

Es sei abschlieBend in diesem Zusammenhang beschriebenen Technik durchgefuhrt. Zur Fest­darauf hingewiesen, daB fiir die Auslosung der in stellung der strahleninduzierten Chromo so men­Kapitel6 beobachteten Reaktionen die Moglich­ aberrationsrate je Strahlenart, -dosis und Zeit keit der genaueren Analyse durch UV - und sind 50-100 Metaphasen ausgewertet worden. Rontgen-Partialbestrahlung erfolgen konnte Basis fur die kausalen Mechanismen der Aber­(MUNRO, 1970). rationsinduktion ist die unterschiedliche Wir­

kung beider Strahlenquellen. In energetischer Hinsicht hat UV einen sehr e) Chromosomale Strahlenschaden

viel geringeren Wirkungsgrad als die ionisieren­Die physiologischen und genetischen Unter­ den Rontgenstrahlen, wenn es darum geht,

suchungen vermitteln eine gewisse V orstellung Strukturumbauten in Chromosomen zu erzeu­daruber, wie die ovarialen Zellen durch Strah­ gen. Wahrend die Wirksamkeit der Rontgen­lung vorubergehend oder dauemd verandert strahlung von der Anzahl vorhandener Chromo­bzw. abgetotet werden. Die experimentelle Aus­ somen im Zellkem und deren GroBe (= Target­losung chromosomaler Aberrationen schafft die GroBe) abhangig ist, wird das UV selektiv von Moglichkeit, die zytologische Wirkung ver­ den N ukleoproteiden der Chromosomen schiedenartiger Strahlung zu untersuchen und absorbiert, so daB aus dem Schadigungsgrad, den EinfluB auf die lebende Zelle besser zu insbesondere bei den Wellenlangen 265-270 nm, verstehen. Ruckschliisse auf die Beschaffenheit der absor­

Zytologische Beobachtungen wurden an bierenden Strukturen im Chromosom moglich colchicinierten Metaphasen nach der in Kapitel3 sind. V oraussetzung hir die Untersuchungen der

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 59

0,7

0,6

0,5 UJ ...J ...J UJ N

0,4 +

z + \.---- RONTGEN - STRAHLUNG

UJ z 0 ;:: ..:

0,3

'" '" UJ tIl ..: 0,2

'-.--'---"<:- UV - STRAHLUNG

0,1

~:----pB"

a B 10 12 14 16 18 STD

Abb.44. Anzahl induzierter Chromosomenaberrationen nach Bestrahlung mit 0,8 • 104 erg/g bzw. 1,0' 104

erg/g UV- und Rontgen-Strahlung in Abhangigkeit der Zeit zwischen Bestrahlungstermin und Fixierung.

UV -Sensibilitat einzelner Zellstadien ist eme einschichtige Gewebekultur. Rontgen- und UV-Strahlung induzieren in den verschiedenen Stadien des Mitosezyklus unterschiedliche Typen und Haufigkeiten von Chromosomen­aberationen.

Das summarische Ergebnis aller strukturellen Chromosomenveranderungen nach Bestrahlung mit 0,8' 104 erg/g bzw. 1,0' 104 erg/g UV- und Rontgenstrahlung wird inAbb. 44 dargestellt.

Aus dem Kurvenverlauf ist in Abhangigkeit der Zeit nach Bestrahlung fur beide Strahlen­arten eine lineare Abnahme der Aberrationsrate zu erkennen. Dies setzt restituierende V organge des Strahlenschadens voraus, die in der Zwi­schenzeit bis zur Auswertung an den Bruch­stellen der Chromosomen stattgefunden haben miissen, so daB eine einfache Addition der Bruchvorgange iiber die in die Auswertung ein­bezogene Zeitspanne infolge der Herabsetzung der Aberrationsausbeute nicht der tatsachlichen Strahlenwirkung entspricht. Wahrend der I4­stiindigen Probeentnahme tritt eine Abnahme der Aberrationsrate fur Rontgen- und UV­Strahlung von 75% bzw. 64% ein. Die iiber­

wiegende Mehrzahl der strahleninduzierten, strukturellen Chromosomenanomalien setzte sich aus Chromosomen- und Chromatidver­anderungen zusammen und betrug fur Rontgen­strahlung 0,005-0,00I bzw. nach UV-Bestrah­lung 0,003-0,00I Aberrationen pro Zelle je 100 erg/g.

N ach der Anzahl, Verteilung und Lokalisa­tion lassen sich die in der Abbildung 44 dar­gestellten Chromosomenschaden klassifizieren:

a) Bruche an Chromosomen konnten nach Bestrahlung mit 104 erg/g UV- und Rontgen­strahlung nachgewiesen werden. Die Abbildun­gen 45 a-b zeigen potentielle Chromosomen­und Chromatidbrikhe, die nach DARLINGTON und LA COUR (I945) als pBo bzw. pB' symboli­siert werden. Die aus den beiden Abbildungen ersichtlichen Strahlenschaden erlauben keine eindeutige Unterscheidung zwischen einem Bruch oder einem feulgen-negativen, als «Gap» bezeichneten Chromosomenabschnitt. Die inter­chromosomalen potentiellen Bruche, resp. Gaps, der Abb. 45 a-b konnen, bezogen auf Einzelchromosomen, allgemein als inter­und intrabrachiale, zum Teil als Isochromatid­

149

60 • G. THIESSEN

, 5U

Abb.45a: Potentieller Bruch, resp. Gap (pB')

5U

Abb. 45 b: Potentieller Bruch, resp. Gap (pB")

5U

Abb. 45 c: Chromatid en-Translokation

150

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 6r

Deletionen, oder aber als intrakinetische Briiche des Centromerbereiches charakterisiert werden, zu deren Entstehtmg die Bestrahhmg wahrend der G1jG2 (=pB'jpB") und S-Phase (=pB') fiihrte. Interpretiert man diesen Strahlenschaden als Gap, so sind die aus Abb. 45 a-b er­sichtlichen Chromosomenschaden als Bruch­vorstufen des Chromosoms bzw. des Chroma­tids zu verstehen. Diese strahleninduzierten Chromosomenfragmentationen iiber den gan­zen Chromosomenquerschnitt (pB") oder ein­zeIner Chromatiden (pB ') sind die notwendige V oraussetzung zur Entstehung von Chromo­somenmutationen, d. h. von Chromosomen­umbauten oder dem Verlust von Chromosomen­

bruchstiicken. Andererseits sind Briiche und Stiickverluste auf halbchromatidaler Ebene moglich.

b) Die Abbildungen 45c-d enthalten Strah­lenschaden, die auf chromatidaler und chromo­somaler Ebene eingetreten sind und dement­sprechend nach ihrem Symptom als Chromatid­bzw. Chromosomentranslokation bezeichnet werden konnen.

c) Als selten nachgewiesene, strahlenindu­zierte chromosomale Veranderung konnte die Entstehung von Ringchromosomen beobachtet werden. Das in Abbildung 45 e dargestellte und in der Metaphase nach Einwirkung von Strah­lung induzierte, ring£ormig geschlossene chro­

•

5U Abb. 45 d: Cmomosomen-Translokation

Abb. 45 e: Ringbildung

151

62 . G. THIESSEN

Abb. 45 f: Duplikation-Deletion

mosom kann auf die Fusion der beiden Bruch­flachen eines interkalaren Chromosomen­bruchstiickes zuriickgefiihrt werden. Die Bil­dung des geschlossenen Ringes eines Einzel­chromosoms kann als «Restitution» des Strahlen­schadens interpretiert werden. N ach RIEGER und MICHAELIS (1958) entstehen in der Mitose im Normal£all aus jedem Ring zwei Tochterringe gleicher GroBe, die auf Tochterkerne verteilt werden, d. h. daB die Ringe soma tisch stabil sind und selbst nach mehreren Zellzyklen in den Gewebezellen nachweis bar sein miiBten.

d) Der Verlust eines interkalar lokalisierten Chromatid- und Chromosomensegmentes nach Eintritt von normalerweise zwei Briichen fiihrt, wie aus Abb. 45 f ersichtlich, zu Deletio­nen. Der interkalare Stiickausfall der Dupli­kation-Deletion eines Chromatids kann unter dem Begriff «Dehzienz» zusammengefaBt wer­den.

Die wahrend der Mitose in Erscheinung tre­tenden verschiedenen strahleninduzierten Aber­rationstypen sind abhangig vom physiologi­schen Stadium der Zelle zur Zeit der Bestrah­lung und von der Strahlenart. AuEer in der Anzahl an sichtbar bleibender und vortiber­gehend vorhandener (= Restitution) Strahlen­wirkung unterscheiden sich UV - und Rontgen­strahlung durch ihre quantitative Wirkungs­weise, wobei flir beide Strahlenarten nur die Chromosomenveranderungen, nicht hingegen

152

die durch UV-Strahlung ausgelosten gene­tischen DNS-Mutationen, nachgewiesen werden konnten.

Etwa 90% der innerhalb von 14 Stunden nach Bestrahlung ' in den Versuchen beobachteten Chromosomenschaden lagen als Chromatid­aberrationen eines oder beider Chroma tide in unterschiedlicher Position auf einem Chromo­som. Da Chromosomenaberrationen in Form von Brtkhen bzw. Gaps aber erst zu einem spateren Zeitpunkt auftraten, muBte eine Bezie­hung zwischen Zyklusphase und Aberrations­typ bestehen. Die zeitliche Folge des Oberganges von Chromatid- in Chromosomenaberrationen muE wahrend eines sehr kurzen Zeitraums er­folgen, weil in den ausgewerteten Praparaten die beidenAberrationstypennichtgemeinsaminner­halb eines Chromosomensatzes nachweis bar waren. Es muB deshalb eine enge Korrelation zwischen dem Aberrationstyp, der Chromo­somentrennung, dem sogenannten Splitting, und der DNS-Synthese insbesondere zur Zeit des Phasenwechsels G1- --+ S- bestehen. Obgleich der Bruchtyp unmittelbar mit der Trennung der DNS-Doppelhelix zur Zeit der Replikation verknlipft ist, mtiBte die Chromosomenverdop­pelung als solche, die kurz vor dem Einsetzen der Replikation oder wahrend der friihen S­phase erfolgt, ein sehr schneller Vorgang sein, wenn man die Strahlenwirkung mit dem Aber­rationstyp vergleicht.

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 63

Strahlenschaden, die vor der Chromosomen­duplikation erfolgten, betreffen namentlich die Chromosomen- oder Presplit-Aberrationen der Gl-Phase, d. h. Bruche, respektive Gaps, wurden zu einer Zeit induziert, als das Chromo­som noch unrepliziert vorlag, so daB die gemein­same Strahlenschadigung beider DNS-Strange nach der Duplikation in der Gz-Phase zum Aus­druck kommt.

Beschrankt sich der uberwiegende Anteil der Chromosomenaberrationen auf die Zellstadien der DNS-Pre- und DNS-Postreplikation, so dominiert wahrend der S-phase der chromati­dale bzw. Postspliting-Aberrationstyp. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, inwieweit Isolocusbriiche zur Zeit der DNS-Synthese­phase infolge der Instabilitat der replizierenden DNS moglich sind.

Die vom Zyklusstadium abhangige Strahlen­sensibilitat wird in Kapitel7 untersucht. Aus den Ergebnissen von PUCK und STEFFEN (1963) geht eine auf die Anzahl induzierter Chromosomen­aberrationen bezogene Sensibilitat hervor, daB die Zellen der Gz-Phase gegenuber einer Ront­genstrahlung von 25-100 rad ca. 5mal empfind­licher waren als die der Gl- und S-Phase, wah­rend HUMPHREY et aI. (1963) fur UV zur Zeit der S-phase 10 mal mehr chromosomale Schaden als in der Gl- und G2-Phase nachweisen konnten. Nach LEE und PUCK (1960) wird die Energie einer Rontgenstrahlung von 40-50 r (ca. 0,4 bis 0,5 . 104 erg/g) pro Chromosomenbruch be­notigt. Vergleicht man die Summe der in Abbil­dung 44 abgetragenen Chromosomenanomalien 4 Stunden nach Bestrahlung, d. h. ohne even­tuelle Restitutionen zu berucksichtigen, so steht das vorliegende Ergebnis in guter Dberein­stimmung mit den Resultaten von LEE und PUCK (1960) als auch mit der induzierten Aberrations­rate pro Ruckenmarkzelle bei gleicher Dosis in vitro bestrahlter Chinesischer Hamster nach Rontgenbestrahlung (BENDER und GOOCH, 1960). DEWEY et aI. (1966) konnten fiir Chine­sische Hamster-Zellen nach Bestrahlung mit 60CO (600 rad) eine 3 mal groBere Sensibilitat der Gz-Phase gegenuber der Syntheseperiode und nur einen geringen Unterschied zwischen G,­und S-phase nachweisen.

Bestimmungen uber die Reparaturrate strah­leninduzierter Chromatid- und Isochromatid­Deletionen wahrend der ersten 24 Stunden nach Bestrahlung mit 60CO ergaben pro 100 rad Dosis 1,15 Bruche/Zelle bei den Testes und 0,5 Brikhe/ Zelle bei den Ruckenmarkzellen des Chinesi­schen Hamsters (BROOKS und LENGEMANN, 1965). Die Behandlung der Zellen mit 5-Fluoro­deoxyuridin (FUdR) wahrend der G2-Phase reduzierte die Chromatid-Austauschfrequenz. Die Substanz hatte keinen EinfluB auf chroma­tidale oder isochromatidale Bruchereignisse, sondern fiihrte nach RUSHTON (1969) lediglich bei Applikation wahrend der S-phase zum zeit­lich verzogerten Erscheinen der Aberrationen. Rontgenbestrahlung von Mitosezellen induzierte doppelt so viele Chromosomenaberrationen als GcBestrahlung. Nach DEWEY und MILLER (1969) fuhrte Colcemid-Vorbehandlung zur Synchronisation der Zellen zu einer Erhohung der Aberrationsfrequenz um den Faktor 2-3. Durch Inkorporation von 131} konnten MOORE und COLVIN (1965) bereits in dem sehr niedrigen Dosisbereich von ca. 6 rad klassifizierbare Chromosomenschaden ermitteln.

FETNER (1970) verglich in seinen Untersuchun­gen das strahleninduzierte Absterben und den Chromosomenaustausch unter verschiedenen Umweltbedingungen miteinander. Rontgen­strahlung (250 KV) induzierte pro 100 rad bei Raumtemperatur 0,22, im Temperaturbereich des flussigen Stickstoffs 0,02 Chromosomenaus­tauschvorgange/Zelle. Die induzierten Aber­rationsraten sind bei In-Vivo-Bestrahlungen signifikant hoher als in in vitro feststellbar (McFEE et aI., 1970). DEWEY et aI. (1970) analy­sierten die zyklusphasenabhangige Aberrations­induktion. Um eine bestimmte Anzahl Chro­mosomenaberrationen induzieren zu konnen, benotigen die Zellen der GcPhase eine um den Faktor 1,5 -1,S und Zellen derfruhen und spaten S-Phase eine 2,S-4,2fach hohere Dosis als be­strahlte Metaphasen. Die Autoren fuhren die positive Korrelation zwischen Letalitat und chromosomalen Aberrationen auf strukturelle Chromatidschaden nach Rontgenbestrahlung zuruck. Die Mitoseverzogerung und chromo­somale Aberrationsrate konnen durch die An­

153

64 . G. THIESSEN

wendung sogenannter Strahlenschutzstoffe, wie Cysteamin und Cystamin verringert werden (Yu und SINCLAIR, 1970). Der differenzielle Schutzeffekt des Cysteamins ist abhangig von der Zyklusposition der Zelle. Der die Strahlen­dosis modifizierende Faktor auf die Mitose nach Applikation von Cysteamin liegt bei 2,5. Die konzentrationsabhangige Wirkung von Cyste­amin und Cystamin als Schutzfunktion gegen­iiber Strahlenschaden, deren Hemmung auf die DNS-Synthese sowie den EinfluB auf den ReparaturprozeB untersuchten SAWADA und OKADA (I970a, 1970b).

Die Wahrscheinlichkeit des gememsamen V orhandenseins chromatidaler und chromo­somaler Aberrationstypen innerhalb einer Meta­phase wird mit I: 50 angegeben (HEDDLE und TROSKO, 1965). Vergleicht man die vom ZeIl­kern absorbierte UV-Energie von 5,8 . 10-3 erg mit der hierdurch induzierten durchschnitt­lichen Anzahl Chromosomenanomalien pro Chromosomensatz, so ist die Entstehung von 0,5 Aberrationen pro Zelle mit der Bildung von 0,66' 106 Dimeren je zellkern gleichzusetzen (s. Kap. 8).

7. Zytophotometrische Bestimmung des Nukleinsauregehaltes von unbestrahlten und bestrahlten Zellen

Urn lnformationen tiber den EinfluB der Bestrahlung auf die Nukleinsauren in Gewebe­kulturzellen des Chinesischen Hamsters zu er­halten, kann man sich zytochemischer Metho­den bedienen. Unter diesem Begriff sollten Ver­fahren verstanden werden, die durch Anwen­dung optischer Methoden Daten tiber die Ver­teilung und Konzentration bestimmter Sub­stanzen innerhalb der Zelle vermittelu.

lm Gegensatz zu biochemischen Analysen, die an fraktioniertem Zellmaterial durchgeftihrt werden und statistische Aussagen tiber eine Zell­population ergeben, gestattet die Zytophoto­metrie individuelle Auswertungen. Man kann deshalb erwarten, einige der zuvor beschriebe­nen morphologischen Veranderungen auf die­sem Wege objektiver beurteilen zu konnen (TmESSEN, 1971).

Die folgenden mikrospektrophotometrischen Untersuchungen umfassen quantitative Absorp­tionsmessungen des Nukleinsauregehaltes (DNS und RNS) einzeluer Zellen im UV und relative Bestimmungen des DNS-Gehaltes angefarbter Zellkerne im sichtbaren Wellenlangenbereich bei A560 nm. Die beiden in diesem Zusammen­hang angewandten zytochemischen Methoden zum Nachweis der Nukleinsauren (NS) sind abhangig von deren Nukleotid-Bestandteilen.

a) UV-Absorption von DNS und RNS durch die konjugierten Doppelbindungen C = C - C = N der Purine und Pyrimidine.

b) DNS-Bestimmung nach hydrolytischer Spal­tung der Desoxyribose durch die Feulgen­Reaktion.

Als Referenzsystem mit bekanntem NS- bzw. DNS-Gehalt wurden Bullenspermien verwandt. AuBerdem muBten aIle technischen Methoden wie Fixierung, Hydrolyse, Farbung und Nach­behandlung der Zellen auf ihre physiologische Wirksamkeit geprtift und so abgewandelt wer­den, daB sie quantitativ reproduzierbare Ergeb­nisse ermoglichten.

Fixierung

Die Fixierung der Zellen erfolgte im AnschluB an ihre Eehandlung mit warmer Hanks-Lasung (37° C) zur Entfernung des restlichen Kultur­mediums nach einem im Prinzip von SIMPSON (1941) entwickelten Gefrieraustauschverfahren (Freezing substitution). Sowohl histochemisch als auch physiko-chemisch insbesondere die optischen Eedin­gungen der UV-Mikrospektrophotometrie bertick­sichtigend dtirfte das Gefrieraustauschverfahren die am meisten befriedigende Fixiertechnik sein. Sie wird in zwei voneinander abhangigen Teilschritten mit unterschiedlicher physiologischer Wirkungs­weise durchgeftihrt :

154

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 65

a. Gefriervorgang: Als Kiihlmedium wird fliis­siger Stickstoff (-196° C) in Verbindung mit orga­nischen Losungen verwandt. Die Zellpraparate werden nicht direkt in fliissigem Stickstoff fixiert, sondern in vorgekiihltem Isopentan (Gefrierpunkt -195° C) als Kontaktmittel eingefiihrt. Die Vor­kiihlung von 40-60 ml Isopentan je Becherglas (Duran 50-Glas) in fliissigem Stickstoffkann infolge der hohen Verdampfungswarme (ca. 50 cal/g) des Kiihlmediums nach 5-8 Minuten beendet werdeu. Als AbschluB der Vorkiihlung des Isopentans kann die fiihlbare Viskositatszunahme und die Bildung eines weiBen kristallinen Niederschlages urn -160° C als beginnende Erstarrung betrachtet werden.

b. AuftauprozeB: Die in Isopentan fixierten Zellen werden schnell in ein zweites Deward-GefaB mit gekiihltem Butanol iibertragen. Die Kiihlung des Butanols wurde mit einem Trockeneis-Athanol­Gemisch durchgefiihrt. Die hohe Sublimations­warme des Trockeneises (C0 2) (ca. 90 cal/g) macht zur Kiihlung des Butanols llld zur Erreichung der Betriebstemperatur des Trockeneis-Athanol-Ge­misches (-75° C) eine anfanglich haufige Nach­kiihlung notwendig. Erst nach dem Verbleiben ungeloster Trockeneisstiicke ist eine maximale Kalteleistung des Butanols gewahrleistet. Bei Styropor-Abdeckung (ca. 3 em) ist der Auf tau­prozeB durch Erwarmung des Kiihlmediums auf Raumtemperatur nach 34-36 Stunden beendet.

Die Steuerung des Einfrier- und Auftauprozesses, insbesondere deren Geschwindigkeitsverlauf, ist aus physikalischen und physiologischen Griinden £iir die Beschaffenheit der Zellpdparate wesentlich. Die beschleunigte Gefrierung verhindert zellulare Be­schadigungen, die zur Vakuolisierung des Kern­Plasma-Bereiches sowie zum ZerreiBen des zyto­plasmatischen Zellanteiles £iihren konnen und auf­grund pdparativer Fehler zur Maskierung der mit ahnlichen Symptomen in Erscheinung tretenden morphologischen Strahlenschaden beitragen.

Fiir die quantitative Absorptionsmessung miissen durch die Fixierung verursachte ZellgroBen-Ver­anderungen unbedingt vermieden werden, weil die Auswertung stets auf die Kern- bzw. Zellflache oder das Volumen bezogen wird. Die in den lebenden Zellen bereits vorhandene, insbesondere bei der Registrierung von Kern- oder Plasma-Absorptions­spektren in Erscheinung tretende, natiirliche ortliche Inhomogenitat sowie starke Unterschiede der Brechungsindices innerhalb kleiner Bezirke des Objektes fiihren bei unkontrollierter Fixierung zu MeBfehlern.

Nach den Untersuchungen von DAVIS et aI. (1954), SANDRITTER (1958) und SEED (1966) ist bei jeder Fixierung eine Abnahme UV-absorbierender Substanzen zu beriicksichtigen. DAVIS et al. stellten an Herzfibroblasten nach chemischer Fixierung mit Carnoy im Vergleich zu lebend gemessenen

Zellen eine Absorptionsminderung urn 40% fest, die auf die Losung von Nukleinsaureanteilen wahrend der Fixierung zuriickgefiihrt werden konnte. Unter der vorliegenden Versuchsdurch£iihrung kann wahrend des I8stiindigen Auftauvorganges ein diffusionsbedingter Verlust niedermolekularer, bei A 265-270 nm absorbierender Substanzen nicht aus­geschlossen werden. Eine pdparativ bedingte, zu­satzliche Kontraktion bereits granular oder faden­formiger nach Feulgen-Farbung sichtbarer Chromo­somenstrukturen mitotischer Zellen £iihrt bei mikrodensitometrischer Absorptionsmessung zur «Unterschneidung» des MeBwertes.

Hydrolyse und Feulgenfiirbung

Die Chromosomen bzw. die chromosomale Substanz der Zellen kaun in situ durch ihre Eigen­schaft, sich mit einem spezifischen Farbstoff zu ver­verbinden, sichtbar gemacht werden. Die Intensitat der Anfarbung wird auEer von der vorhandenen DNS-Menge auch von der Dauer und Temperatur der HCl-Hydrolyse sowie yom pH-Wert der Farb­stoff-Losung beeinfluBt. Die Konstanz der zuletzt genannten Faktoren ist Voraussetzung £iir die rela­tive DNS-Bestimmung und deren Reproduzier­barkeit. Obgleich der stochiometrische Reaktions­mechanismus des Feulgen-Nachweises noch zum Teil als ungeklart zu betrachten ist, erfolgt mit Sicherheit die Freisetzung von Aldehyd-Gruppen der DNS durch eine partielle HCl-Hydrolyse und deren Reaktion mit dem basischen Leucofuchsin (Schiff­Reagenz) unter Bildung eines rotlichen Farbstoffes. LESSLER (1953) konnte in Modellversuchen eine Linearitat zwischen DNS-Menge und Farbstoff­intensitat nachweisen. Die Spezifitat der Feulgen­Reaktion ist abhangig von der hydrolytischen Aldehydbildung der Deoxypentose. Die Farbstoff­entwicklung ist somit nur auf DNS-haltige Zell­oder Spermienbezirke lokalisiert. Damit eine zusatz­liche pdparative Variation der Farbintensitat ver­mieden werden konnte, wurden aile Versuchsglieder gruppenweise gemeinsam mit der gleichen Farbstoff­charge ge£arbt. Die Anpassung dieser Versuchs­glieder aneinander erfolgte iiber Korrekturfaktoren gleichzeitig gefarbter Spermien als Standardptapa­rate.

Die Art der Fixierung scheint von groEer Bedeu­tung zur Erreichung der einer bestimmten Hydro­lysedauer entsprechenden maximalen Farbstoff­intensitat zu seill. Zwischen der Fixierung in neu­tralem Formalin oder Eisessig-Alkohol-Gemisch konnten SWIFT (1955) und KLEINHANS (1966) Unter­schiede der UV-Absorption bei A 260 nm urn 50% bzw. eine Verminderung fixativabhangiger Farb­stoffintensitat bis zu 30% nachweisen. Es wurden in den vorliegenden Untersuchungen keine ahnlichen Konzentrations- und Farbintensitatsgradienten nach Gefrierfixierung festgestellt. Somit konnen ptapara­

155

66 . G. THIESSEN

tiv verursachte, substantiell bedingte Unterschiede innerhalb der Zellpopulation, die auftretende Diffe­renzen der Farbstoffintensitat pro Zelle hervorrufen, vermieden werden.

Zur Herstellung des Schiff-Reagenz (pH 2,5-2,6) wurde Pararosanilin der Firma Merck verwandt. Hydrolyse in I n HCl bei 60° C von II Minuten Dauer. AnschlieBende Entfernnng haftender HCl in eisgekiihltem Aqua dest. Nach Farbnng der Prapa­rate (2 Std.), Bisulfid-Bleiche (4 Min.) und stufen­weiser Dehydration erfolgte die Einbettung in wasserfreiem Glycerin (n = 1,494). Der Brechungs­index der Zellen wird von SANDRITTER (1958) mit n=1,53 angegeben.

Die relative Bestimmung des DNS-Gehaltes durch die Zytophotometrie im sichtbaren Licht nach Feulgen-Farbung ist technisch leichter als eine zytophotometrische Bestimmung der Nukleinsaure­Absorption fixierter oder gar lebender Zellen durch­zufiihren.

Spermien als Referenzsystem fur quantitative und relative DNS-Bestimmungen

Fur quantitative und relative DNS-Bestim­mungen wurde stets das erste Ejakulat Bullen­spermien des gleichen Tieres verwandt. Etwa 4-5 Stunden nach der Ejakulation hat sich ein Spermiensediment gebildet. Die obenstehende Flussigkeit (pH 6,48-6,61) muE wegen ihres Proteingehaltes und dessen storend wirkenden Einflusses auf die quantitative Bestimmung ent­fernt werden. Das Sediment wird langsam mit einer 1,I2%igen Natriumzitrat-L6sung (37°e) resuspendiert, fur 4-5 Minuten bei 1000 g zentrifugiert, verdunnt und je nach Verwen­dungszweck auf Glas- oder Quarzobjekttragern als Ausstrichpraparat flxiert. Die Natrium­zitrat-Behandlung darf nur kurzfristig vor der Fixierung angewandt werden, um einen os­motisch bedingten Schwellungseffekt insbeson­dere des Spermienkopfes zu vermeiden. Steril entnommene, in ihrem naturlichen Sekret ver­bliebene Spermien konnten 2 Tage bei +40 C aufbewahrt werden. Wahrenddessen verminderte sich die Anzahllebensfahiger Spermien um 50%. Die obere Hal£te des Spermienkopfes verhalt sich in ihrer Farbintensitat nach Feulgen­Farbung anders als der untere Abschnitt im Bereich des Halsansatzes (THIESSEN, c, in Vor­ber.).

Die quantitative Bestimmung der DNS in Glyzerin eingebetteter Spermien dient als Bezugswert zur Errechnung des DNS-Gehaltes in den Zellkernen von Chinesischen Hamster­Zellen und gleichzeitig zur Ermittlung des Umrechnungsfaktors, der diesem DNS-Wert entsprechenden Farbintensitat nach Feulgen­Farbung. Die Messungen wurden mit dem UMSP I (Firma Carl Zeiss) bei den Wellen­langen 265, 280 und 313 nm durchgefiihrt und konnten auEerdem zur Eichung des in Kapitel 5 beschriebenen Gerates unter Angabe des inte­gralen Extinktionswertes herangezogen werden.

Bei diesen Messungen errechnete sich die Menge der absorbierenden Nukleinsauren aus dem Integral der Extinktion von 1.265, 280 und 3 13 nm nach der empirischen Formel (SAND­RITTER, 1958) (s. Kap.4).

Das UMSP I gibt das Integral der Extinktion, also das Produkt aus Extinktion pro Flachen­einheit . Flache, bereits an, so daE nach Korrek­tur mit den gerateeigenen Faktoren (Integra­tionskonstante Kj = 0,04477; Papiervorschub = 100 mm/Min.; Tischvorschub = 40 fL/Min.) der Nukleinsaure-Gehalt bestimmt werden kann. Wahrend fur die DNS ein spezifischer Extink­tionskoeffizient von 20000 angenommen wurde, k6nnen bei RNS groEere Schwankungen vor­kommen, die zu einem gewissen Unsicherheits­faktor fiihren. Zur Errechnung der Nuklein­sauren muE die unspezifische Absorption bei A3I3 nm berucksichtigt werden. Fur Spermien betrug sie 2-4% der gemessenen Extinktion von 1.265 nm. 1m Spermium und zellkern der CHO­Zellen darf die Proteinabsorption bei 1.265 nm nicht vernachlassigt werden.

Die UV - mikrospektrophotometrischenD NS­Bestimmungen ergaben 3,25' 10-12 g DNS pro Spermienkopf. Dieses Ergebnis steht in guter Obereinstimmung zu den chemisch oder spek­trophotometrisch ermittelten Werten (MIRSKY und R1S, 1949; LEUCHTENBERGER et a1., 1952; WALKER und YATES, 1952; VENDRELY, 1955).

Der DNS-Gehalt von 3,25' 10-12 g ent­spricht der Anzeige eines Extinktionswertes des in Kapitel4 beschriebenen Gerates von 172,2 ± 0,9 bei 1.265 nm. Obertragen auf die mikro­

densitometrische Auswertung der Farbintensitat ergab dieses 14-16 Absorptionseinheiten (AE) bzw. entsprechend einem angezeigten Extink­tionswert von 143,7 ± 1,5 bei 1.560 nm. Diese flir Spermien UV - oder feulgenphotometrisch ermittelten Werte sind dem halben DNS­Gehalt (I c) einer in der G1-Phase benndlichen eudiploiden Zelle des Chinesischen Hamsters gleichzusetzen, vorausgesetzt, daB die Feulgen­Reaktion bei verschiedenen Objekten gleich­artig verlauft. Die vorliegenden Untersuchungen, gemessen bei 1.265 nm an diploiden CHO-Zellen der GcPhase ergaben einen Nukleinsaure­Gehalt von 6,0-6,5' 10-12 g bzw. einen 2C­Wert mit 28-34 AE. Einschrankend muB jedoch gesagt werden, daB die UV-Absorption nxierter Spermien weitgehend der DNS entspricht, wahrend die von SANDRITTER (1958) gemessenen Maus-L- und HeLa-Zellen noch ca. 5 - 10% RNS enthielten. Gilt das ebenfalls flir Chinesische Hamster-Zellen, so ware die RNS-Absorption im DNS-MeBwert bei 1.265 nm mit inbegriffen. Betrachtet man die quantitativen Aspekte zwi­schen Spermien und diploiden Zellen, so besteht:

eine Korrelation zum DNS-Gehalt der G1­

phase (I :2) und der G2-Phase (I :4).

Aus dieser Interphase-Relation innerhalb eines Zellzyklus ergaben sich Verdoppelungsreihen (s. Kap.6, Abb. 3S), deren Farbintensitat, aus­gehend von der Konstanz des DNS-Gehaltes pro Zellkern (BOIVIN-VENDRELy-Gesetz) pro­portional der Chromosomenzahl ist. Die genetische Variabilitat kann unter Vernach­lassigung der bei 1.265 nm enthaltenen RNS­Anteile innerhalb einer Zellpopulation mit Hilfe des relativen DNS-Wertes (1'10-12 g DNS A 5 AE) in AE dargestellt werden.

Dementsprechend erlauben Abweichungen der Farbstoffintensitat von der charakteristi­schen DNS-Menge eines diploiden Zellkernes die genaue Anzeige der 3C-, 4C- und Sc­Werte. Die zwischen den Ploidiestufen liegen­den Absorptionseinheiten konnen auf synthe­tisierende Interphasenzellen zurlickgeflihrt werden.

Im Gegensatz zu den quantitativen, chemischen DNS-Analysen ermoglicht die mikrospektro­

Analysis of Irradiated Tissne Cnlture Cells . 67

metrische Methodik im UV - und sichtbaren Licht die Bestimmung des individuellen, yom Polyploidiegrad abhangigen DNS-Wertes.

Flir feulgenphotometrische Absorptions­messungen wurden Spermien und CHO-Zellen einer zeitlich gleichen HCl-Einwirkung unter­zogen. Die Hydrolysedauer und der pH-Wert beeinflussen die Hohe des Absorptionswertes. Wie aus Abbildung 46 ersichtlich tritt eine Ver­schiebung des Absorptionsmaximums bei 1.560 nm in Abhangigkeit der Hydrolysedauer und dem pH-Wert des Schiff-Reagenz ein. Prinzipiell zeigten die sich entsprechenden Hydrolysekurven beider Objekte den gleichen Verlauf. Aus dem Vergleich des Kurvenverlau­fes kann auf das V orhandensein von mindestens zwei miteinander gekoppelter, pH-Wert- und zeitabhangiger Reaktionen geschlossen werden (BOHM und SEIBERT, 1966).

20

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2 6 e 10 12 14 16 18 MIN HYDROLYSEDAUER

Abb.46. Abhangigkeit des Feulgen-DNS-Absorp­tionswertes (Spermien) von der Hydrolysedauer, dem PH-Wert des Farbstoffes und der Farbezeit bei der Wellenlange 560 nm.

Farbezeit (Std.) PH-Wert 1,0 2,5 0--0 1,5 2,5 X--X 2,0 1,5 .... --.... 2,0 2,0 .--.

157

68 . G. THIESSEN

Zellzyklus und DNS-Synthese unbestrahlter Einzelzellen

Fur die Einzelzell-V ersuche wurden stark ver­dunnte Suspensionen (ca. 100 Zellen/ml Me­dium) in kleine Kulturkammern (0 = I cm, Hohe= I cm) ubertragen, zwischen 24-36 Stun­den bei 37° C inkubiert und die Lage abgerun­deter Telophasen innerhalb 3- bis 4zelligen Mikrokolonien mit Hilfe eines Objektfmders (Firma Carl Zeiss) bestimmt.

Die Bestimmung der Koordinaten erfolgte bei Dunkelheit und 35° C, so daB sich weder ein hemmender LichteinfluB noch Temperatur­schwankungen auf die Zyklusdauer auswirken konnten. Unmittelbarvor der Bestrahlung wurde das Medium entfernt, anschlieBend erfolgte Reinkubation der Zellen und stundliche Ent­nahme der Proben ilber einen Zeitraum von 14 Stunden. Urn Verwechslungen auszuschalten, wurden nach der Fixierung diejenigen Zellen innerhalb der Mikrokolonien mit Mikronadeln entfernt, deren DNS-Gehalt nicht bestimmt werden sollte. Die in NaOH elektrolytisch an­gespitzten Mikronadeln aus W olframdraht konnen in Metallrohrchen mit Araldit AT I

(Firma Ciba) bei 180° C/60 Min. befestigt wer­den. Gleichzeitig kann durch diese Technik der storende EinfluB benachbarter Zellen auf das maanderformige Abtasten des Objektes (I (1­

KONTROLLE 60

50 UJ « I

~ 40 o I

Z UJ '3 30 => UJ U.

20

Zeilenhub) wahrend des MeBvorganges ver­mieden werden.

Die nachstehenden Ergebnisse wurden nicht an lebenden, sondern an fixierten Zellen ermit­telt, weil Lebenduntersuchungen von groBeren Serien schwierig durchzufuhren sind. Unter­suchungen, in denen quantitative Veranderun­gen des DNS-Metabolismus in Abhangigkeit des Zellalters analysiert werden sollten, wurden unter moglichst einheitlichen Bedingungen mit homogenen PopuIationen vorgenommen, so daB die Dauer des Zellzyklus eines hohen pro­zentualen Anteiles aller Einzelzellen als uniform betrachtet werden konnte.

Analog der Terminologie von HOWARD und PELC (1953) sind aus den Kontrollversuchen (Abb.47) fur jede Tochterzelle nach der Tei­lung 3 deutlich voneinander unterscheidbare Teilabschnitte zu differenzieren.

Die metabolischen Stadien des DNS-Zyklus konnten mit der angewandten Technik zyto­photometrisch bestimmt werden:

I. 1m AnschluB an die Telophase bleibt der DNS-Gehalt in den Tochterzellen wahrend der G1-Phase (= I. gap) fur 4,0-4,5 Stunden konstant. Dieser anfangliche Synthesestillstand kann als Erholungsstadium nach der Mitose betrachtet werden.

10 T 1 ... --- INTERPHASE ----.!-MITOSE

o 8 10 12 STD

ZYKLUSZEIT

Abb.47. Relativer DNS-Gehalt in Abhangigkeit cler Zellzyklusphase.

158

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells' 69

2. Die Periode der DNS-Synthese (S-Phase) fin­det ihren AbschluB in der Verdoppelung des DNS-Gehaltes nach 6 Stunden. Die auting­lich relativ laugsam beginnende Syntheserate (1,0-1,5 Std.) wird in ihrer Geschwindigkeit nach dem verzogerten Anlauf der Protein­synthese beschleunigt. Die Untersuchungen von BLOCH und GODMAN (1955) ergabeneinen parallel zur DNS verlaufenden Histon­Anstieg.

3. Nach Verdoppelung der DNS erfolgte eine, der GcPhase sehr ahnliche aber auf 2,5 Stun­den verkurzte, zweite Ruheperiode, die so­genannte G2-Phase (=2. gap). Danach berei­ten sich die Zellen auf die Mitose vor.

4. Die Mitosedauer kann aus der Lange der ein­zelnen Zyklusphasen im Vergleich zur durch­schnittlichen Generationsdauer ermittelt oder aus der Mitoserate errechnet werden. Enthalt eine logarithmisch wachsende Kolonie bei einem 13- bis 14stundigen Generationszyklus 4-6% Mitosezellen, dann errechnet sich die eigentliche Mitosedauer aus 13-14' 0,04-0,06 mit 0,52-0,56 bzw. 0,76-0,84 Stunden.

Inwieweit die genaue Bestimmung der ein­zelnen phasen innerhalb des Zellzyklus nach der vorstehend beschriebenen Technik durchHihrbar ist und mit welchen yom Zelltyp des Chinesi­schen Hamsters abhangigen Variationen gerech­net werden muE, wird aus dem Vergleich der mit 3H-Thymidin autoradiographisch ermittel­ten Resultate verschiedener Autoren veranschau­licht (s. Tab. 8).

Die relative absorptionsspektrophotometri­sche Ermittlung der Phasenlangen (THIESSEN, 1968) (Tab. 8) steht in guter Obereinstimmung

mit den Ergebnissen von PUCK et al. (1964) und der errechneten durchschnittlichen Generations­dauer von Stammkultur und Klonisolationen.

Einflu6 von UV - und Rontgenstrahlung auf die zellularen Zyklusphasen

Die Analyse des Zellzyklus und des sen Einzel­phasen sind V oraussetzung fur das Verstandnis der induzierten strahlenart-, dosis- und phasen­abhangigen biologischen Effekte. Mit Ausnahme der quantitativen UV-mikrospektrophoto­metrischen DNS-Bestimmung (Abb.48) wur­den alle weiteren Untersuchungen mit UV - und Rontgenstrahlung in den Dosisbereichen von 0,1; 0,24 und 0,45 . 105 erg/g bzw. 0,12; 0,25 und 0,5 . 105 erg/g vorgenommen. Absicht der nachstehenden Experimente war, eine moglichst hohe Oberlebensrate zu erhalten, d. h. die zu applizierenden Strahlendosen ergaben sich aus dem Verlauf der Oberlebenskurve.

Hieraus ging hervor, daB sich die Zellen schon gegenuber relativ kleinen Dosen als sehr sen­sibel erwiesen. Diesbezuglich durchgefiihrte quantitative UV - mikrospektrophotometrische Voruntersuchungen (Abb.48) lieBen den Trend einer differenzierten Sensibilitat der DNS­Synthese innerhalb der einzelnen Interphase­Stadien gegenuber UV - und Rontgenbestrah­lung erkennen. Die theoretisch erfolgende Ver­doppelung des Nukleinsaure-Gehaltes (vor­wiegend DNS) wahrend eines Zellzyklus von 13-14 Stunden Dauer konnte experimentell au dem Substanzanstieg unbestrahlter Zellen und unter Einbeziehung des Spermien-Bezugswertes mit einer Genauigkeit bis zu 10% nachgewiesen

Tab. 8. Variation der Zyklus-PhasenHinge in Abhangigkeit von Gewebeart und Bestimmungstechnik.

Gewebeart Ch. Hamster

Dauer der Zyklusphase (Std.)

I S I G2 I M Autoren

Fibroblasten 2,7 5,8 2,1 0,4 Hsu et al. 1962 Fibroblasten 5-6 6 2-3 - TAYLOR 1960 Embryonale Zellen 12-14 8 2-4 - CHU 1962

(G1 +M) Ovariale Zellen 4,71 4,13 2,81 0,81 PUCK et al. 1964 Ovariale Zellen 4,0-4,5 5,5-6 2,5 0,5-0,75 THIESSEN 1968

159

70 . G. THIESSEN

14

12 _-::: _ ~ KONTROLLE

w g; ... III

B

/'

&::---_.-.

RONTGEN

UV

0,50'10 5 erg I g

0,45 .105 .rg I g Z

iii ,; 6 ::> z

5

BESTRAHLUNG BESTRAHLUNG BESTRAHLUNG

10 12 14 ST D ZYKLUSZEIT

Abb.48. EinfluB von UV- (-----) und Rontgen-Bestrahlung (-.-.-.) mit 0,45 bzw. 0,5 . lOs ergjg auf den DNS-Gehalt einzelner Zyklusphasen. (Der mittlere Fehler des Mittelwertes betragt ± 8%).

werden. Verfolgt man den Gehalt an Nuklein­sauren unbestrahlter Zellen in Abhangigkeit des Zellalters, so fand eine konstante Syntheserate wahrend der 5,5stiindigen S-phase von 6,S auf II,S' 10-12 g Nukleinsaure pro Zelle statt. Die stiindliche Syntheseleistung betrug 0,9 . 10-12 g Nukleinsaure. Dies steht unter Beriicksichtigung des in der Messung enthaltenen RNS-Anteiles (ca. 5 - 10%) in guterObereinstimmung mit dem feulgenphotometrisch ermittelten Absorptions­anstieg von 4,3-4,5 AE/Std. (s. Abb.47, 49-5I). UV- und Rontgenbestrahlungen mit 0,45 bzw. 0,50 . 105 erg/g wurden in der GcPhase ca. I Stunde nach der Teilung, in der S-phase zu Beginn der maximalen Syntheseleistung und in der Gz-Phase an 10-I I Stunden alten Zellen vor­genommen. Stets erfolgte die quantitative Bestimmung 3 Stunden nach der Bestrahlung. Wahrend sich die Zellen der G1-Phase gegen­tiber beiden Strahlenarten unempfindlich, die der G2-Phase im Vergleich zur Kontrolle als sensibler erwiesen, traten die groBten meta­bolischen Veranderungen in der S-phase in Erscheinung.

Sowohl Rontgen- als auch UV-Strahlung fiihrten zu einer strahlenart- und dosisabhangi­

gen Verzogerung der normalen Syntheserate. Der anfanglichen Verzogerung der Synthese­leis tung folgte ein steter Substanzanstieg, olme jedoch durch die Bestrahlung selbst eine Um­stimmung einer bereits angelaufenen Zyklus­phase bewirken zu konnen (s. Kap. S). Die Bestrahlung fiihrte zu einer Verminderung der Syntheserate von 0,4 . 10-12 g nach Rontgenbe­strahlung bzw. o,S . 10-12 g Nukleinsaure/Stunde nach UV-Bestrahlung, bezogen auf eine Dosis von 0,5' 105 erg/g beider Strahlenarten. Dies ent­spricht einer stiindlichen Syntheseleistung im Vergleich zur Kontrolle anstatt 0,9' 10-12 g Nukleinsaure von nur 0,5' 10-12 g bzw. O,I . 10-12 g, d. h. die spezifisch durch die N ukleinsauren absorbierte Energie der UV­Strahlung erwies sich urn den Faktor 5 wirk­samer als Rontgenstrahlung gleicher Dosis.

Der geringfiigig zu beobachtende Nuklein­saure-Anstieg nach Rontgenbestrahlung zur Zeit der Messungen in G2-Phase befindlicher Zellen ist nicht nur durch eine unterschiedliche phasen­abhangige Strahlensensibilitat sondern auch durch die individuelle Variation einzelner Pha­senlangen bedingt, so daB am Dbergang von der S- zur G2-Phase Zellen beider Interphasestadien

I60

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 71

bestrahlt worden sein miissen. Dies wiirde je­doch gleichbedeutend sein mit einer partiellen Umstimmung der betreffenden Phasen, wenn die Rontgenbestrahlung wahrend des Phasen­wechsels erfolgt. Bine detailliertere Analyse der Strahlensensibilitat verschiedener Interphase­stadien im Hinblick auf den Syntheseverlauf und die Syntheserate sowie deren Abhangigkeit von der Strahlenart erlauben die in den Abbildungen 49-5 I a u. b dargestellten Ergebnisse an feulgen­

G,·- PHASE

601 sJ

gefarbten Praparaten. Die Messungen wurden in stiindlichen Intervallen durchgefiihrt, urn den zeitlichen Verlauf der Strahlenwirkung auf die Z yklusphasen verfolgen zu konnen.

Bei GcBestrahlungen mit UV- und Rontgen­strahlen (Abb.49au. b) zeigen die Zellen ver­spateten Wechsel in die S-Phase. Die von Strahlenart und Dosis abhangige, strahlen­induzierte Verlangerung der GcPhase erfolgt nicht proportional der Dosis.

KONTROLLE

w BES TRAHLU NG

<t 1,0

(/)

z o

z 30 w <!) -' ::J W "­ 20 --1­ 5

INTERPHASE

o " 6 8 10 12 II, ST 0 ZYKLUSZEI T

a

G,- PHASE 60

KONTROLLE

50

w BESTRAHLUNG <t I

(/)

z 40 1

0

I z w 30 <!) -' ::J III "­

20 .M 1_ G1

__ 1_ 5

o 8 10 12 II, STD

ZYKLUSZEIT

b Abb. 49 a u. b. Wirkung von UV - und R6ntgen-Bestrahlung wahrend der G,-Phase auf den Beginn und Ver­lauf der DNS-Synthese.

161

72 • G. THIESSEN

Aus dem Kurvenverlauf ist zu entnehmen, daB kleine Dosen (0,1 . 105 erg/g) relativ wirk­samer die G1-Phase verzogerten als 4,5£ache Energien. Die vorubergehende Hemmung des Syntheseanlaufes in G1-Phase bestrahlter Zellen tritt nach Rontgenbestrahlung deutlicher als nach UV-Bestrahlung hervor. In Abbildung 52a wird der von beiden Strahlenarten in der Gc phase ausgeloste Bestrahlungseffekt, bezogen auf die DNS-Syntheseleistung der Kontrolle als Syntheseverlust dargestellt.

Die stiindliche S yntheseleistung der unbestrahl­ten Zellen wahrend der S-phase (Zellalter 5 bis 10 Std.) verlauft mit einer konstanten Synthese­rate von 4,5 AE/Std., entsprechend einem Sub­stanzanstieg von 0,9 . 10-12 g Nukleinsaure pro Stunde. Nach UV- und Rontgenbestrahlung entspricht die Verzogerung des Synthese­beginns einem stundlichen strahlenart- und dosisabhangigen Syntheseverlust von 1,3; 1,5 und 2,0 AE bzw. 2,0; 2,5 und 3,0 AE. Dies ware einem Substanzverlust nach Umrechnung von AE uber den Spermien-Bezugswert von 0,26; 0,3 oder 0,4' 10-12 g Nukleinsaure bzw. 0,4; 0,5 oder 0,6 . 10-12 g Nukleinsaure pro Stunde gleichzusetzen. Ein 26-40%iger (0,1-0,45 . 105 erg/g) bzw. 40-60%iger (0,12-0,5 . 105 erg/g) Verlust der Syntheseleistung nach UV - oder Rontgenbestrahlung ist insofern denkbar, wenn man die Spezifitat der Strahlenart, das Zell­stadium und deren EinfluB auf die Synthese der DNS -Vorstufen und morphologische Verande­rung en berucksichtigt. Die nicht DNS syntheti­sierenden GcZellen erwiesen sich, bezogen auf die Verzogerung des Synthesebeginns gegenuber Rontgenbestrahlung (0,1 . 105 erg/g), ca. 4mal sensibler als nach UV-Bestrahlung mit 0,45 . 105 erg/g. 1m allgemeinen aber wirkte sich die Rontgenstrahlung tiber den angewandten Dosis­bereich von 0,1-0,5 . 105 erg/g durchschnittlich 1,5-1,6mal hemmender auf die Verzogerung des Syntheseanlaufes aus als UV-Strahlung.

Die dominierende Wirkung der unspezi­fischen Rontgenstrahlung gegenuber der spezi­fisch schadigenden UV-Strahlung auf die Ver­langerung der GcPhase laBt sich einerseits durch die Hemmung des Syntheseanlaufes infolge Stoffwechselveranderungen der in G1-Phase

162

befmdlichen Zellen und andererseits durch die Art des hervorgerufenen Strahlenschadens er­klaren. Wahrend bei der unspezifisch wirkenden Rontgenbestrahlung metabolische und morpho­logische Schaden eintreten, beschrankt sich die Strahlenschadigung der spezifisch von den Nukleinsauren absorbierten UV-Energie primar auf die «inaktive» DNS, deren Strahlenschaden abztiglich der zwischenzeitlichen Reparatur­leis tung in der verminderten Verzogerung des Syntheseanlaufes zum Ausdruck kommt.

Der durch einen verzogerten Synthesebeginn oder reduzierte Syntheseleistung pro Zeiteinheit gekennzeichnete Bestrahlungseffekt in Gn S­und S-/Gz-phase bestrahlter Zellen wurde im Vergleich zu den unbestrahlten Zellen als relativer Syntheseverlust definiert, tabellarisch zusammenge£aBt (Tab. 9); er ist fur die Zellen der GcPhase den Abbildungen 49a u. b und 52a zu entnehmen.

Tab. 9. Wirkung von UV- und Rontgenstrahlung auf Zellen verschiedener Zyklusphasen. I. Quantitative UV-Bestimmung des Nukleinsiiure­Gehaltes.

Strahlenart I N kl'" S hI' IS d und -dosis u emsaure- yut Ese elstung t.

Kontrolle 0,9' 10-12 g (~4,5 AE)

UV -Strahlung 0,1' 10-12 g 0,5 . lOs erg/g Rontgen­strahlung 0,5' 10-12 g 0,5 . lOs erg/g

Bei einer Strahlendosis von 0,5' 105 erg/g erwies sich UV - um den Faktor 4 wirksamer als Rontgenstrahlung.

Der relative Verlust der Syntheseleistung im Vergleich zur Kontrolle bei Zellen desselben Alters wurde einer GcPhasen-Verlangerung nach UV - und Rontgenbestrahlung von 2-4 bzw. 3,5-7,0 Stunden entsprechen.

Zellen der G1-Phase zeigten gegenuber Ront­genstrahlung von 0,12' 105 erg/g die gleiche Sensibilitat wie die 4fache UV - Dosis.

Die Verzogerung der S-phase nach UV- und Rontgenbestrahlung entsprach einer Verlange­

II. Relative DNS-Bestimmung

Bestrahlung in der G1-Phase

Relativer Synthese- Relativer Strahlenart verlust/Std. (als Ver- Synthese­und -dosis zogerung des DNS- verlust

(. 105 erg/g) Synthesebeginns) (%)

UV -Strahlung 0,10 1,3 AE = 0,26· 10-12 g 0,24 1,5 AE = 0,30· 10-12 g 26-40 0,45 2,0 AE = 0,40· 10-12 g

Rontgen­strahlung 0,12 2,0 AE = 0,40· 10-12 g 0,25 2,5 AE = 0,50· 10-12 g 40- 60 0,50 3,0 AE = 0,60.10-12 g

rung von 20-145% bzw. 12-96% eines durch­schnittlichen 13stiindigen Zellzyklus.

Bestrahlung am Ubergang der S- zur G 2- oder friihen G 2-Phase

Verglichen mit dem Kontrollwert entspre­chenderZeitfiihrte UV-Strahlung (0,1-0,45.105 erg/g) zur Herabsetzung des Feulgen-DNS-AE­Wertes um durchschnittlich 2,5 AE (=0,5· 10-12 g DNS). Zellen der G2-Phase erwiesen sich gegeniiber Rontgenstrahlung (0,12-0,5 . 105 erg/g) sensibler als nach UV-Bestrahlung. In Abhangigkeit von der Rontgenstrahlen-Dosis

Bestrahlung in der S-Phase

Strahlenart Relative Relative Vermin­und-dosis Verzogerung derung der DNS­

S yntheseleistung/ der S-Phase Std. im Vergleich (Std.)

zur Kontrolle bezogen auf denAE-Wert

(. 105 erg/g) der (. 10-12 AE Kontrolle g) I

UV -Strahlung 0,10 1,7 0,34 2,5 0,24 2,5 0,50 5,5 0,45 3,6 0,75 18,5 Rontgen­strahlung 0,12 I,3 0,26 I,5 0,25 1,8 0,36 2,7 0,50 2,7 0,54 I2,5

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 73

konnten 2 verschiedene Effekte beobachtet wer­den:

a) Fortsetzung der DNS-Synthese (0, 12-0,25.105 erg/g), wahrscheinlich zeitlich begrenzte Ver­langerung der S-Phase um 3,0-3,5 AE/Std. = 0,6-0,7.10-12 g DNS/Std.

b) Syntheseabnahme (0,5.105 erg/g) im Ver­gleich des AE-W ertes der Kontrolle ent­sprechender Zeit.

Die strahleninduzierte Dauer der G1-Phase wurde, bezogen auf die konstante Synthese­leistung der Kontrolle, durch die applizierten UV- und Rontgendosen um 2-4 Stunden bzw. 3,5-7,0 Stunden verlangert. Diese auf die nor­male Syntheseleistung bezogenen Werte setzen eine konstante Lange der G1-Phase voraus und lassen eine eventuelle natiirlich vorhandene Variabilitat der Phasendauer unberiicksichtigt. Abgesehen von dem stiindlichen Syntheseverlust im Vergleich zur Syntheseleistung der Kontrolle kann die Synthese als solche beeinfluBt, nicht aber der Phasenwechsel von der G1- zur S-phase verhindert werden.

1m Gegensatz zur Phasenverlangerung in G1 bestrahlter Zellen fiihren UV - und Rontgen­bestrahlung zur Zeit des Phasenwechsels in der friihen S-phase (Zellalter 5 Std.) zu einer tat­sachlichen Verminderung der Syntheseleistung. Aus den Abbildungen 50a-b und 52 b ist zu entnehmen, daB sich die beiden Strahlenarten in ihrer Wirkung auf die S-phase umgekehrt wie in der G1-Phase verhalten. Der Unterschied steht im Zusammenhang mit der erhohten Sensibilitat der spezifisch bei Ie 265 nm absor­bierten UV-Energie der zu dies em Zeitpunkt replizierenden DNS. Die strahleninduzierte, temporare stiindliche Verminderung der Syn­theseleistung von 1,7; 2,5 und 3,6 AE/Std. bzw. 1,3; 1,8 und 2,7 AE/Std. nach UV- oder Ront­genbestrahlung schreitet zeitlich linear fort und fiihrt sekundar zur Verlangerung der S-Phase. Die stiindliche Verminderung der Synthese­leistung ist bei beiden Strahlenarten nicht der Dosis proportional, sondern fiihrt nach Ver­doppelung der Bestrahlungsdosis zu einer Ab­nahme um den Faktor 1,3-1,5. Die Verzogerung der S-Phase, hervorgerufen durch Abnahme der

74 . G. THIESSEN

S - PHASE

60

KONTROLLE __ x_x

7 X 50

BESTRAHLUNG x UJ ~ 0,10.105erg/g <l: I

40 x ,,/ ~ 0,24 .10 5 erg Ig Ul /' / / 1 z x .--- y.' 0

I x/ ... /'./ 6 0,45 .10 5 erg/g /6.""""",.o _tJ..'­z _°_'0 6'­

UJ 30 x_-_X-x ~-;-~'6" -,.­l'l X X -' ::J UJ U.

20 S M 1_ G 1 -I- -r-G2 ..... ' .. M

10

0 2 6 8 10 12 14 STD

ZYKLUSZEIT

a

S - PHASE

60

KONTROLLE x __ x_x

UJ 50 ~ <l: BESTRAHLUNG /.' 0,12.10 erg 1 9 x ,. 5 1 / /'

5

Ul ,.0" 0,25.10 erg 1 9 z /,.1. o '0 /x/ ;",0"'"

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5 erg/g

UJ "" lJ," C> x~tt'" ._11"­-' 30 x--_x-x .. -t,. .. J;. ~ x x u.

S 20 -I'

o 2 4 6 8 10 12 14 STO ZYKLUSZEIT

b

Abb.50au. b. EinfluB von UV- und Rontgen-Bestrahlung wahrend der S-Phase auf den DNS-Synthese­verlauf.

stiindlichen Syntheseleistung nach Bestrahlung spricht der Verlangerung von 20-14S% bzw. mit verschiedenen Dosen, wurde auf den 10- 12-96% eines durchschnittlich 13 Stunden stiindigen AE-Wert des DNS-Syntheseverlaufes daueruden Zellzyklus ohne Bertlcksichtigung der Kontrolle bezogen. Die zeitliche Verlange­ sekundarerer Einfliisse in S-phase bestrahlter rung der S-phase bei aufsteigenden UV- und Zellen auf die nachfolgende G2-Phase. Rontgenstrahlendosen betrug 2,S; s,s und AuBer der S-Phasenverlangerung infolge der 18,S bzw. I,S; 2,7 und 12,S Stunden bis zur depressiven Syntheseleistung pro Zeiteinheit im Erreichung des DNS-Kontrollniveaus. Dies ent- Vergleich zur Kontrolle miissen feruer mole­

kulare und chromosomale Strahlenschaden be­riicksichtigt werden, deren AusmaB erst in der folgenden Generation nachgewiesen werden kann (s. Kap.6).

Die Strahlenschadigung einze1ner Zellphasen ist abhangig vom Bestrahlungszeitpunkt und der Phasensensibilitat, sie korre1iert mit einer partie1­len voriibergehenden Verminderung der DNS­

60

50

w « I

(f) 40 z 0

I z w

30 S ::J W lL

20

10

60

50

w « I 40

If)

z o I

Gz - PHASE

x __ X_x~ x x

MI-- G1

G PHASE 2

­

x

z 30 w x--X-x~

x x o ...J ::J

lJ.. W MI--- -1­

20 G 1

a 2 6

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells' 7S

Syntheserate proliferierender Zellen und fiihrt zur Mitoseverzogerung und Inhibition sowie zur Polyploidie. Generell konnen alle Phasen des Z yklus j e nach S trahlenart primar durch Energie­absorption und sekundar durch morphologische Strahlenschaden in ihrer DNS-Syntheserate verzogert oder gehemmt werden. Wie aus den Abbildungen 5 I a u. b und 52 c ersichtlich ist, er­

BESTRAHLUNG

x x KONTROLLE %x'::~.::,:~ 0,1.10 5 .'g/g 1 A:::'':"~·'-'' • 0,25 .105.,gl 9

/'~;_ .-'- 0," ,,,' .","

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5 --\..- G2 -+I M

10 12 14 STO

ZYKLUSZEIT

a

.. 0,12 .10 5 erg I g 5 BESTRAHLUNG ,/,<> 0,25.10 erg I g

..-7 /~~x_x KONTROLLE

/,Yx _~ .. ~ 0,50 .10 5 erglg 1 /'-'-'

5

B 10 12 14 STO ZYKLUSZEIT

b

Abb. 51 a u. b. Differenzierte Wirkung von UV- und Rontgen-Bestrahlung auf den Phasenwechsel S - G2­

bzw. friihe GrPhase.

165

76 ' G, THIESSEN

folgte der markanteste Unterschied nach UV­und Rontgenbestrahlung zur Zeit des Phasen­wechsels S-Gz- oder in der fruhen Gz-Phase nach AbschluB der DNS-Synthese, Aus dem Kurven­verlauf der Abbildung 51 a u, b im AnschluB an die Bestrahlung ist jedoch zu entnehmen, daB die Zellen uberwiegend kurz vor dem Phasen­wechsel bestrahlt worden sein mussen, Erfolgte nach UV-Bestrahlung mit 0,1-0,45 ' lOs erg/g eine durchschnittliche Verminderung der Syntheserate/Stunde von 2,5 AE, so fiihrte dieses zur Verzogerung der Mitose, Zellen, die 2 Stunden vor der Mitose - dies stimmt mit der G2-Periodedauer uberein - bestrahlt wurden, erwiesen sich gegenuber Rontgenbestrahlung am sensibelsten, In Abhangigkeit der applizier­ten Rontgendosis wurden zwei voneinander unterschiedliche Effekte beobachtet:

a) Die Fortsetzung der DNS-Synthese mit einer Geschwindigkeit von 3,0-3,5 AE/Std, nach Rontgenbestrahlung mit 0,12-0,25 ' lOs erg/g entspricht annahemd der Syntheserate un­bestrahlter Zellen.

b) 1m Gegensatz zu einer kurzfristigen Synthese­abnahme mit anschlieBender Mitoseverzoge­rung nach Bestrahlung mit 0,5' lOs erg/g Rontgenstrahlung muB im Bereich niederer

G1- PHASE

1,0

O,B ..... Ul :::> -' 0:: w 0,6 > w Ul w :r ..... z 0,4 > Ul I

Ul z 0 0,2

Dosen angenommen werden, daB es sich hier­bei auBer einer moglichen Mitosehemmung des weiteren um Strahlenschaden des Tei­lungsmechanismus, insbesondere in der Aus­bildung der Mitosespindel, handelt. Unter Berucksichtigung dieser Kriterien kann an die Entstehung phanotypisch in Erscheinung tre­tender, strahleninduzierter mehrkemiger oder einkemiger Riesenzellen polyploiden Karyo­types gedacht werden,

Densitometrische MeBfehler konnen nicht als Ursache fur eine Vortauschung des kontinuier­lich ansteigenden Kurvenverlaufes verantwort­lich gemacht werden, Es konnte zwar eine an die Kemstruktur gebundene «Unterschneidung» der Absorptionswerte nachgewiesen werden, nicht jedoch deren Erhohung, Somit scheinen in Ab­hangigkeit der Dosis und des Bestrahlungszeit­punktes fiir Rontgenbestrahlung (0,12-0,5 . lOs

erg/g) mindestens 2 Bestrahlungseffekte mog­lich zu sein, die einerseits einen zeitlich gehemm­ten normalen Verlauf des Zellzyklus erlauben und andererseits eine eventuelle Verlangerung der S-phase uber eine oder mehrere Synthese­perioden hervorrufen konnten, die bis zur Aus­besserung der subletal geschadigten, teilweise funktionsunfahig gewordenen Teilungsmecha­

KONTROLL-NIVEAU

UV-STRAHLUNG

RONTGEN -STRAHLUNG

o +--.--.--.--,-,---------­o 0,2 O,4.10 5 .r9 / 9

DOSIS

Abb,52a

r66

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells ' 77

S -PHASE

KONTROLL- NIVEAU 1,0

..... V) O,B :::l ..J

W "" > W 0,5 V) w :z: ..... z > RONTGEN-STRAHLUNG V) 0,4 I

V)

z o

0,2 UV- STRAHLUNG

° .10 5 erg/g 0,2 0,4 DOSIS °

b

- PHASE G2

0,4 ~ Cl Z ::::J ..... 0,2 V)

W ..J uJ

~ ±Op :z: ..... z >

---­ KONTROLL-NIVEAU

RONTGEN-STRAHLUNG V)

I 0,2 V)

z UV- STRAHLUNG 0

0",

° 0,2 0,4 10 5 erg I 9

DOSIS

c

Abb, 52a-c, Bestrahlungseffekt, dargestellt als DNS-Syntheseverlust einzelner Zyklusphasen in Abhangigkeit von Strahlenart und Dosis, bezogen auf die Syntheserate der Kontrolle,

nismen andauern wiirden. Die sekundaren Fol­ Synthese (Abb, 52 a-c) und in Abhangigkeit von gen des Bestrahlungseffektes konnen iiber­ der Strahlenart, konnte eine maximale Sensibili­lebende, polyploide Riesenzellen oder aufgrund tat der Zellen wahrend der S-phase festgestellt der unspezifischen Strahlung metabolisch und werden. Die Kurven der Abbildungen 52a u. b morphologisch geschadigte, mehrkernige Zellen weisen einen biphasischen Verlauf auf, ahnlich sein, die in der Regel einige Generationen spater wie in einigen Fallen bei DE-Kurven beobachtet absterben (s, Kap, 6), werden konnte.

Als Ergebnis der Strahlenempfmdlichkeit ein­ Wahrend in Abbildung 52 a der Bestrahlungs­zeIner Interphasestadien, bezogen auf die DNS- einfluB auf die Phasenverlangerung der G i , d.h.

78 . G. THIESSEN

die Verzogerung des Syntheseanlaufes (1,0 = 100%) dargestellt wurde, zeigt die Abbildung 52 b den direkten strahleninduzierten Synthese­verlust pro Stunde im Vergleich zur Kontrolle (DNS-Synthese als % der Kontrolle). Der Bestrahlungseffekt auf die Syntheserate der S­phase von Einzelzellen definierten Alters konnte aufgrund stiindlicher Messungen und in Abhan­gigkeit von Strahlenart und Dosis festgestellt werden. Obgleich die Bestrahlung in der friihen S-phase zur Synthesehemmung fiihrt, erreichen die Zellen den 4c-Wert verspatet, d. h. die Bestrahlung hat einen dosisabhangigen EinfluB auf die zeitliche Syntheseleistung, nicht jedoch auf den zellularen Synthesekreislauf als solchen, so daB diese subletal geschadigten Zellen iiber­lebende der Dosiseffekt-Kurve sind. Aus der Dar­stellung des Bestrahlungseffektes als Dosis­effekt-Kurve der S-phase (Abb. 52 b) in Abhan­gigkeit yom DNS-Gehalt, der Strahlenart und graduierten Dosen kOl1l1en wahrscheinlich noch weitere Empfindlichkeitsbereiche il1l1erhalb der Syntheseperiode unterschieden werden.

Der biphasische Verlauf der UV - und Ront­gen-Dosiseffekt-Kurven der G j in Vorbereitung des Syntheseanlaufes (Abb. 52 a) und zur Zeit der S-phase (Abb. 52 b) wahrend der DNS­Replikation deuten auf das Vorhandensein von mindestens zwei voneinander dosisabhangigen, strahleninduzierten Mechanismen, sogenal1l1te SENS j (;2; 0,1 . 105 erg/g) und SENSz (s 0,1' lOS

erg/g) hin. Bei Versuchen in vivo und in vitro an mensch­

lichen Knochenmark-Zellen, Ehrlich-Ascites Tumor-Zellen, Ratten- und Maus-Lymphozyten wurde eine unterschiedliche triphasische Strah­lensensibilitat synthetisierender Zellen nach­gewiesen (LAJTHA et aI., 1958; COOPER und ALPEN, 1959; BERRY et aI., 1961; HUNTLEY und LAJTHA, 1962). Als sensibelste Strahlenreaktion (SENSo) wurde die Hemmung des intra­nuklearen ADP ~ ATP-Energiestoffwechsels bezeichnet. Die nicht nachweisbare oder der Verlust der SENSo-Sensibilitat der vorstehend genal1l1ten In-Vitro-Untersuchungen gegeniiber den In-Vivo-Experimenten der Autoren ist denk­bar, wenn deren Ergebnisse auf die Zellen des Chinesischen Hamsters iibertragbar sind.

168

Diese an Lymphozyten erarbeiteten Resultatc, bei denen nur durch den Dbergang von 1n-Vivo­zu 1n-Vitro-Bedingungen bereits eine 35%ige Verminderung des D NS-Gehaltes pro Zellkern eintrat, kOl1l1te auf eine in vitro stattgefundene Hemmung der ~ pH-Verbindungen bei gleich­zeitiger DNS-Abnahme zuriickgeflihrt werden. Somit kOl1l1te der biphasische Kurvenverlauf (Abb. 52 au. b) auf zwei weitere, inihrer Strahlen­sensibilitat im Vergleich zu SENSo unempfind­lichere Systeme, auf die durch UV- und Ront­genstrahlen induzierte Hemmung der Nukleo­sid-Phosphorylisation (=SENS j ) undfiir SENS 2

die Inhibition der Deoxyuridylsaure-Methylie­rung, die tempo rare Beschadigung (=Dimeri­sation) (s. Kap. 8) bzw. Zerstorung der DNS­Bausteine zuriickgefiihrt werden. Betrachtet man die biphasische Depression der DNS-Syn­theserate pro Stunde wahrend der friihen bis mittleren S-phase (Abb. 52 b) im Vergleich zum Verhalten der Zellen am Dbergang von der S­zur Gz-Phase (Abb.5U), so deutet der Kurven­verlauf auf einenAnstieg differenzierter Strahlen­sensibilitat im Bereich des Phasenwechsels hin.

Die Korrelation zwischen Position und In­hibition der Zelle il1l1erhalb der Syntheseperiode ist der wesentlichste Faktor im Hinblick auf die mutagene Strahlenwirkung (s. Kap. 8). Auf­grund der Sensibilitatsveranderungen SENS j /

SENS2 ist deshalb anzunehmen, daB die DNS­Synthese nach Bestrahlung mit hoheren Dosen einen disorganisierten Typ darstellt. Unter dem EinfluB von UV - und Rontgenbestrahlung wird dann eine zufallige Replikation kurzer DNS­Absclmitte wahrscheinlicher als die normaler­weise sequentiell ablaufende Replikation des ganzen Chromosomen-Komplements (s. Kap. 8). V oraussetzung fiir die exakte Analyse des Sensi­bilitatsgefalles ist jedoch eine in bezug auf die Generations- und S-Phasendauer homogene Zellpopulation.

SIS KEN und KINOSATO (1961) und SISKEN et aI. (1965) kOl1l1ten cinen die Kinetik des Mitose­zyklus beeinflussenden Temperatureffekt fest­stellen. Auf Temperaturanstieg (43-46° C, 4 bis 100 Min.) reagierten Zellen der S-phase und wahrend der Mitose am empfindlichsten. Nach WESTRA und DEWEY (1971) waren mitotische

Zellen nicht imstande, die Zellteilung vollstan­dig zu durchlaufen, und erschienen in der nach­folgenden Teilung als tetraploide Zellen. Neben einer Reduktion der Dberlebensrate auf 50% trat eine Verzogerung der Mitose urn II Stun­den ein. Veranderungen der Generationszeiten durch TemperatureinfluB bewirkten eine Ver­langerung der G1-Phase. Sensibilitatszunahmen einzelner Zellstadien in der Reihenfolge Gz - P - A < S < G1 - M (5) gegeniiber Tem­peraturen « 37° C) wurden von verschiedenen Autoren nachgewiesen. Temperaturerniedri­gung (16° C/24 Std.) und anschlieBende Erwar­mung auf 37° C fiihrten zur Verkiirzung der G2-Phase bei HeLa- und Maus-L-Zellen. Einen weiteren, die Untersuchungen beeinflussenden Umweltfaktor stellt die Sauerstoffkonzentration dar. DICKSON und PAUL (1961) konnten eine dem Sauerstoffgehalt direkt proportionale DNS­Depression bestrahlter Maus-L-Zellen nach­weisen. Weitere im Zusammenhang dieser Untersuchungen zu beriicksichtigende Para­meter zur Bestimmung der Phasenlangen und deren Strahlensensibilitat ergeben sich aus ihrer natiirlichen Variabilitat. Wahrend die Dauer der S-phase annahernd konstant verblieb, ermittel­ten MENDELSON (1960) sowie DEFEND! und MANSON (1961) hir die G1-Phase der Chinesi­schen Hamster-Zellen eine I -2stiindige und hir Maus-L-Zellen mit 12 Stunden die groBte zeit­liche Schwankung.

Durch die zeitliche und metabolische Stabilitat der DNS-Syntheserate wahrend der S-Phase in unbestrahlten Zellen ist es moglich, diesen Inter­phaseabschnitt zum Vergleich strahleninduzier­ter, zeitlicher und substantieller Veranderungen heranzuziehen. LAJTHA und OLIVER (1958), PAINTER und ROBERTSON (1959) und TILL (1961) konnten nach Rontgenbestrahlung bis 500 r bei HeLa-Zellen und mit Dosen bis 2000 r an Knochenmarkzellen und Lymphozyten Ver­zogerungen aller phasen feststellen. N ach DEWEY et ai. (1966) tritt nach Bestrahlung mit 60CO bei Chinesischen Hamster-Zellen eine Ver­zogerung der G1- und S-phase von 2-3 Stunden und der Gz- von 4 Stunden ein, wahrend sich die

(5) P = Prophase, M = Metaphase, A = Anaphase

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 79

S-phase von Maus-L-Zellen und Ascites­Tumor-Zellen am strahlensensibelsten erwies (HUMPHREyet aI., 1963). In den Untersuchungen an Chinesischen Hamster-Zellen von RAss­MUSSEN und PAINTER (1966) verhielt sich die S-phase gegeniiber UV-Bestrahlung wesentlich sensibler als die G2 (s. Abb. 52 b). UV-Strahlung induzierte bei synthetisierenden Zellen IOmal mehr Chromosomenaberrationen als bei solchen der G1- und Gz-Phase. Unter Einwirkung von Rontgenstrahlen erwiesen sich die Chinesischen Hamster-Zellen in G1/G2 im Vergleich zur S-phase sensibler, wobei sich die Gz durch ihre extreme Sensibilitat auszeichnete. Dieses Ver­halten wurde dem Ergebnis der Abbildung 52C entsprechen. Fur HeLa-Zellen konnten PUCK und STEFFEN (1963) nach Rontgenbestrahlung mit 100 rad eine Verzogerung der Gz-Phase mit 0,1 Std./rad und der Ge/S-Phase mit 0,01 bis 0,02 Std./rad nachweisen.

Proliferationskinetische Untersuchungen von THOMPSON und SUIT (1969) ergaben fUr Maus­L-Zellen bei Rontgenbestrahlung der Gz-Phase eine Abnahme der Teilungswahrscheinlichkeit, einen Anstieg anomaler Mitosen und Verlange­rung des Zellzyklus. Nach SINCLAIR undMoRTON (1966) sind die Chinesischen Hamster-Zellen der Gz- und Mitosetadien gegenuber Rontgen­strahlung am sensibelsten, wahrend Zellen der spaten S-phase die groBte Resistenz in Dber­lebenskurven aufwiesen. Das differenzierte Ver­halten der zur Zeit des Phasenwechsels S-Gz oder in der Gz mit UV - und Rontgenstrahlung bestrahlten Zellen (s. Abb. 5 Ia-b, 52 c) ist denk­bar, wenn die von PAINTER et al. (1960) an HeLa-Zellen ermittelten Ergebnisse in die Dber­legungen mit einbezogen werden. Hierbei ver­lief die DNS-Synthese in der mittleren S-phase weitgehend simultan, wahrend zu Beginn und AbschluB dieser phase einzelne Chromosomen Syntheseunterschiede aufwiesen. Letzteres Kri­terium kann mitbestimmend fUr das unterschied­liche Reaktionsvermogen nach UV - und Ront­genbestrahlung (Abb.5Ia u. b, 52C) sein, wenn die physiologisch bedingten (TAYLOR, 1960) und morphologisch (autoradiographisch) nach­gewiesenen Unterschiede der Autosomen gegen­uber den Heterosomen und die der Hetero­

169

80 • G. THIESSEN

somen untereinander im Hinblick auf die DNS­Synthese der CHO-Zellen betrachtet werden. HOLFORD (1966) konnte, wie ebenfalls den vor­liegenden Untersuchungen zu entnehmen ist (Abb.5Ia), eine Abnahme der UV-Empfind­lichkeit in der spaten S-phase nachweis en, gegenuber Rontgenstrahlung aber im Gegensatz zu SINCLAIR und MORTON (1966) eine maximale Sensibilitat feststellen. BOOTSMA (1964) ermit­telte nach Rontgenbestrahlung (200 rad) bei asynchronen menschlichen Nierenzellen durch autoradiographische Doppelmarkierung fol­gende Sensibilitatsanordnung respektive phasen­abhangige Verzogerung: Gj =2Std., S=3,4 Std., G2 =4-I8 Std.

Gleiche Resultate einer progressiven Sensibili­tatszunahme mit Annaherung an die GrPhase gegeniiber Rontgenbestrahlung ergaben die Untersuchungen vonDJoRDJEVIC und TOLMACH (1967). Die etwa gleich lange Verzogerung von Gj- und S-Phase nach Bestrahlung fuhrt nach einer anfanglichen Hemmung zu einer partiellen Synchronisation durch anschlieRende Mitose­kompensation (s. Kap.6). SCAIFE und BROHEE (1969) untersuchten Faktoren, die die Mitose synchronisierter menschlicher Nierenzellen nach Rontgenbestrahlung beeinflussen, und fuhrten biochemische Messungen durch, die mit der Position der Zellen innerhalb des Zellzyklus von der S-phase zur Mitose korrelierten. Die Mitose­verzogerung als Bestrahlungseffekt war bei Gz-Zellen groRer als bei synthetisierenden.

Die Mitoseverzogerung bestrahlter Zellen ist abhangig von deren Position innerhalb des Zellzyklus. Der Reihenfolge entsprechend S-, Gz- und Gj-Phase konnte FIRKET (1969) eine Abnahme der Mitoseverzogerung nachRontgen­bestrahlung (450 rad) nachweisen. Die DNS­Synthese, d. h. die Inkorporation von 3H­Thymidin wurde um 25% (600 rad) fur einige Stunden vermindert. Eine starkere Hemmung fand nach Bestrahlung der spaten S-phase statt. Es konnte keine Abnahme der Inkorporations­rate von 3H-Orotsaure in die RNS nach Be­strahlung von Zellen der S- oder Gz-Phase beobachtet werden. SMETS (I969) stellte nach Rontgenbestrahlung (250 KV) menschlicher Nierenzellen bis zu einer Dosis von 3000 rad,

I70

drei die Zykluskinetik beeinflussende Effekte fest: nach Bestrahlung asynchroner Zellen erfolgte (a) eine Verlangerung der S-phase und eine temporare Akkumulation der Zellen. Wahrend (b) der Dbergang von der Gc zur S-phase unbeeinfluRt blieb (kontinuierlicher 3H-TdR-Markierungsindex), wurde (c) die Transitionsrate von der S- zur Gz-Phase redu­ziert. HILL (I969) untersuchte diesen Effekt an Maus-L-Zellen, konnte aber keine strahlen­induzierte Degradation (4000 rad) der DNS nachweisen. CLEAVER und TROSKO (I969) stellten nach UV-Bestrahlung (140 u. 700 erg/ mm2) von Chinesischen Hamster-Zellen einige Abbauprodukte fest, deren Mehrheit als makro­molekulare DNS, Thymin und Thymidin identifiziert wurden. Untersuchungen der In­korporationsrate von 3H_ Thymidin und 3H­Deoxycytidin in die DNS menschlicher Lym­phozyten nach Rontgenbestrahlung lassen auf das V orhandensein von zwei Prozessen schlieRen. Die Wirkung der Strahlung ist bei der schnellen Reaktion nach ca. I Stunde, beim langsameren ProzeR etwa nach 7 Stunden abgeschlossen. SPIEGLER und NORMAN (1969) hihren dieses Verhalten auf Syntheseschaden zuruck.

Bei Untersuchungen uber Sensibilitat und Phasenverzogerung muR die Strahlenwirkung auf die RNS- und Proteinsynthese mit beruck­sichtigt werden. Nach WHITFIELD und RIXON (1960), CR1PPA (1966), TERASHIMA und YASU­KAWA (1966) werden Protein-, RNS- und DNS­Synthese nach Bestrahlung in gleicher Rate reduziert. Der Proteinsynthese wahrend der GcPhase und ihrem Verhalten nach der Be­strahlung ist besondere Bedeutung beizumessen, weil sie die V oraussetzung fur den Beginn und die Fortfuhrung der DNS-Synthese schafft. Somit beschrankt sich die strahleninduzierte Verzogerung der Gj nicht nur auf die DNS, sondern auf mindestens 3 strahlengeschadigte Synthesemechanismen. O'BRIEN (1962) fuhrte die im Vergleich zur Kontrolle als Synthese­verlust bezeichnete, verminderte DNS-Syn­theseleistung auf die Hemmung der Methylie­rung der Deoxyuridylsaure zuruck, von deren Funktionieren die Produktion des Thymins ab­hangig ist, das den limitierenden Faktor fur die

DNS-Synthese darstellt und tertiar die Rate der Zellteilungen bestimmt. HOLMES (1956) sowie COLE und ROSEN (1961) stellten eine verzogerte 3H_ Thymidin-Inkorporation in die DNS kurz zuvor mit Rontgen bestrahlter HeLa-ZeIlen fest. KUSZIN und W AINSON (1966) deuteten die Herabsetzung der Syntheseleistung nachBestrah­lung der zellkerne mit einem o:-Microbeam als Aktivitatsverminderung der beiden strahlen­sensiblen Enzyme Kinase und Polymerase. Es ist bekannt, daB ionisierende Strahlung weniger hemmend auf die Proteinsynthese als auf die DNS-Synthese wirkt. Geringere Kenntnisse liegen iiber Veranderungen funktioneller Ab­laufe spezifischer Proteine in bestrahlten Zellen vor. GELBARD et aI. (1971) untersuchten die periodische Fluktuation mehrerer Enzyme (Thymidin-Kinase; Thymidylat-Kinase, Deo­xycytidin-Monophosphat-Deaminase) in syn­chronisierten HeLa-ZeIlen nach Rontgen­bestrahlung in Abhangigkeit der ZeIlzyklus­phase.

Ein monochromatischer, koharenter Laser­strahl hoher Intensitat (A 260 nm, 150-300 KW, 230-460 erg/mm2) fiihrte erwartungsgemaB zu DE-Kurven mit Eintreffer-charakteristik und zu einer von der Laserstrahlendosis abhangigen DNS-Reduktion. Die durch UV-Strahlung anfanglich reduzierte Tritium- und Uridinauf­nahme wurde nach 7 Stunden Erholungszeit ausgeglichen (STROUD et aI., 1971). Die Aus­wertung fiir den RNS-Stoffwechsel ergab, daB 75% des Kontrollwertes 7-24 Stunden nach Bestrahlung erreicht wurden.

BRENT und WHEATLEY (1971) untersuchten den zeitlichen Verlauf des Reparaturprozesses nach Rontgenbestrahlung. Wahrend der ersten beiden Stunden nach Bestrahlung wurden 80% der DNS in HeLa-ZeIlen repariert. Auch HOPWOOD und TOLMACH (1971) konnten bei HeLa-ZeIlen wahrend der Erholungsphase nach Bestrahlung eine bis zu 80% an den normalen DNS-Gehalt angeglichenen Wert vor der ZeIl­teilung nachweisen. Autoradiographische Aus­wertungen zeigten, daB die 3H_ Thymidin­inkorporation wahrend der S-phase auf 2/3 des normalen Niveaus nach Bestrahlung (500 rad) reduziert wurde. AIle Zellen durchliefen die

Analysis of Irradiated Tissne Culture Cells· 81

G1-, S- und Gz-Phase. Ca. 25% der Zellen wurden in der Mitose arretiert, ihr DNS-Gehalt entsprach nur 30% des Kontrollwertes. Dber die GroBe des Reparaturvorganges von DNS nach Bestrahlung der Zellen liegen wider­spriichliche Ergebnisse vor. SMETS und BROHEE (1971) betrachten die 3H-Thymidininkorpo­ration als ein ungenaues MaB £iir die DNS­Synthese. Die 3H_ TdR-Inkorporation zeigte den typischen Verlauf einer biphasischen DE-Kurve. Durch einen von den Autoren beschriebenen «Pool Effekt» wird die Inkorporation des 3H_ T dR verringert und der Einbau von Deoxycytidin stimuliert. Die Inkorporation von 3H-TdR in neu synthetisierte DNS nimmt nicht linear zu mit steigender tritium-markierter Thymidin­konzentration konstanter spezifischer Aktivitat (PETERSON, 1971). Eine temperaturabhangige 3H-TdR-Inkorporation durch UV-Bestrahlung stimulierter reparativer DNS konnte EVANS et aI. (1970) wahrend der G1 autoradiographisch nachweisen.

Die Ergebnisse der Untersuchungen von HUMPHREY et aI. (1970) beweisen, daB die Fahigkeit einen ErholungsprozeB (S-Phasen) nach UV-Bestrahlung durchfiihren zu konnen, vom Zellstamm selbst und von der Position der Einzelzellen innerhalb der Interphase zur Zeit der Bestrahlung abhangig ist; ein Kriterium, das insbesondere bei fraktionierter Bestrahlung zu beriicksichtigen ware. Diese sogenannte DNS­Reparaturreplikation verhielt sich bei euploiden und aneuploiden menschlichen Zellen umge­kehrt proportional zur UV -Strahlendosis (PAINTER et aI., 1970). HABAZIN und HAN (1970) untersuchten eine durch UV-Strahlung (500 bis 3000 erg/mm2) induzierte DNS-Protein-Bin­dung bei HeLa-Zellen. Die Menge der an Pro­teine gebundenen DNS blieb wahrend einer 10stiindigen Dauer nach Bestrahlung konstant. Gleichzeitig mit der Hemmung der Protein­synthese trat eine Reduktion der RNS-Synthese ein (KIM et aI., 1970).

SMETS und DEWAIDE (1966) diskutieren den DNS-Anstieg nach Rontgenbestrahlung als eine reparative DNS-Syntheseleistung. Die Gewebe­kulturen von Rinderleberzellen wurden durch Colchicinierung synchronisiert, in der S-Phase

171

82 • G. THIESSEN

mit 400 r bestrahlt und in anschlieBender Mitose untersucht. 1m Vergleich zur Kontrolle lag die spezifische Aktivitat (32P) bestrahlter Zellen aufgrund der Reparaturleistung neosyntheti­sierter DNS urn 140% hoher. Die Autoren haben nur die nach der Bestrahlung neu syn­thetisierte DNS, nicht jedoch den eigentlichen Reparaturmechanismus nachweis en konnen. Der Einbau radioaktiven 32p in die neusyntheti­sierte DNS bestrahlter Zellen kann von einem sogenannten Pool-Effekt hervorgerufen werden, wahrscheinlicher fiir den Aktivitatsanstieg be­strahlter Zellen ist jedoch die Fortsetzung der S-phase (s. Abb. 51 b, 52C). BLOCH (1953) konnte nach CoIchicin-Behandlung eine Er­hohung des DNS-Gehaltes feststellen. CoIchicin greift auch in soIche metabolischen Prozesse ein, die nicht nur direkt mit dem Mechanismus der Zellteilung (Spindel£unktion) in Zusammenhang stehen. Trotz der Mitoseblockierung durch CoIchicin (IO-5 M) inhibierte diese Substanz nicht die DNS-Synthese. Nach 26stiindiger Behandlung verlie£ die DNS-Synthese in gleicher Rate wie die der Kontrolle. Ein strahlen­induzierter Spindelschaden alleine konnte die Ursache in den Versuchen von SMETS und DEWAIDE (1966) fiir die Neosynthese der DNS ohne eigentliche zellulare Reparaturleistung sein. Die Dauer der Peri ode ohne Mitose infolge Bestrahlung und ein sekundar kompensatori­scher Mitosegipfel sind das kombinierte Ergeb­nis von S- und G2-Bestrahlung (s. Kap. 6).

In den vorstehenden Untersuchungen iiber den EinfluB von UV - und Rontgenstrahlung auf die einzelnen phasen des Zellzyklus wurde bewuBt auf die Anwendung von Anti-Metabo­liten (FUdR) zur Synchronisation der Zellen verzichtet, seitdem CHU (1965) durch Zusatz von 5-AU zwar eine Unterbrechung der DNS­Synthese erzielen konnte, gleichzeitig aber eine Chromosomenaberrationen induzierende Eigen­schaft dieser Substanz nachwies. Ca. 50% aller Chromosomensatze enthielten mindestens einen Chromatidbruch. Ferner bewirkte 5-AU einen uneinheitlichen Verlauf der Syntheserate in der darauffolgenden S-Phase. ERIKSON und SYBALSKI (1961) sowie RASSMUSSEN und PAINTER (1966) stellten in Gegenwart von 5-BUdR eine Zu­

172

nahme der Strahlensensibilitat des Halogen substituierten DNS-Molekiils gegeniiber UV­Strahlung fest. Die Anwendung von Anti­Metaboliten bzw. der Einbau von 5-halogenier­ten Thymidin-Analogen und ihre allgemeine sensibilisierende Eigenschaft der Zellen gegen­iiber Bestrahlung wiirde zu weiteren, in die Untersuchungen einzubeziehenden unbekannten Parametern fiihren.

Komplizierter sind soIche Ereignisse zu analy­sieren, die aus der Strahlenwirkung und dem Zusatz chemischer Substanzen resultieren. Caffein (2 mM) verursacht nach UV-Bestrah­lung (IOO erg/mm2) eine Abnahme der Kolonie­bildungsfahigkeit bei Maus-L-Zellen (DoMaN und RAUTH, 1969), es induziert einen spezi­fischen Block bestrahlter Zellen in der S-Phase. Die Anzahl derjenigen Zellen, die in der S-Phase blockiert werden, korreliert mit der Abnahme der Koloniebildungsfahigkeit. Zellen anderer Zyklusphasen werden nur geringfiigig beein­fluBt. Die Verlangerung der Zyklusdauer ist primar auf die spezifische Wirkung des Caffein wahrend der Syntheseperiode zuruckzufiihren. Ahnlich wachstumshemmend und auf syntheti­sierende Zellen letal wirkt Hydroxyurea (HU) (BACCHETTI und WHITMORE, 1969). Maus-L­Zellen der Gn spaten S-, Gz-Phase und Mitose werden durch HU in ihrem Verlauf innerhalb des Zyklus nicht beeinfluBt. Die Hemmung findet beim Phasenwechsel G1/S statt. Modi­fizierend auf den zellularen Stoffwechsel wirken sich z. B. Verbindungen wie Acriflavin aus. Nicht toxische Mengen dieser Substanz redu­zierten die Synthese «auBerordentlicher» DNS (unscheduled DNA) in G1-befindlicher HeLa­Zellen nach Bestrahlung mit niederen «50 erg/mm2), nicht hingegen bei hoheren UV­Dosen (EVANS und DJORDJEVIC, 1969). Maus­L-Zellen zeigten eine zyklische 32P-Markierung der DNS nach Rontgenbestrahlung. Dieser Effekt konnte bei den Zellen beobachtet werden, die mit 2,4-Dinitrophenol behandelt wurden (SANDERS et aI., 1970). Dieses Verhalten deutet auf eine beschleunigte Reparatur des Strahlen­schadens hin. Entkoppler der oxydativen Phos­phorylierung, wie Z. B. 2,4-Dinitrophenol, fiihrten zu einer Herabsetzung der Strahlen­

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells' 83

sensibilitat trotz Abnahme der DNS-, RNS-, Protein- und ATP-Synthese (BAKER et aI., 1970). Arsenate und Dinitrophenole als Entkoppler bewirkten einen Anstieg der Dberlebensfraktion.

Untersuchungen der Bestrahlungseinfllisse von UV- und Rontgenstrahlung auf die DNS­Synthese bedlirfen besonderer Aufmerksamkeit im Hinblick auf die Molekularstruktur der DNS und sekundarer mutagener Effekte, die als genetische Strahlenschaden in Erscheinung

treten. Der Effekt des UV auf die zellularen Makromoleklile ist selektiv, wirkt spezifisch inhibierend auf die DNS-Synthese und indu­ziert auBer anderen Photoprodukten insbeson­dere Thymindimeren im DNS-Moieklii.

Es bestehen Beziehungen zwischen der Induk­tion von Chromosomenaberrationen, der Syn­theserate und der Thymindimerisation, die im Zusammenhang mit den folgenden Unter­suchungen (s. Kap. 8) naher zu betrachten waren.

8. Molekulare Wirkungsweise der UV -Strahlung auf die DNS-Synthese

Die Arbeiten der letzten Jahre haben sich iiberwiegend auf die Wechselbeziehungen zwischen UV-Strahlung und DNS-Moleklil konzentriert (BEUKERS und BERENDS, 1961; SMELLIE, 1961 ; WACKER, 1961; WULF und RUPERT, 1962). Es werden eine ganze Reihe von Effekten unterschiedlichen Wirkungsgrades durch die UV-Strahlung ausgelost. Das Wir­kungsspektrum der biologischen Veranderungen ist abhangig von der prozentualen, spektralen Zusammensetzung des Wellenlangenbereiches 240-300 nm der absorbierten UV-Strahlung und yom Energiegehalt einzelner Wellenlangen. Die starkste Wirkung auf die biologische Akti­vitat der DNS-Doppdhdix lebender Zellen haben die Wellenlangen 260-270 nm (s. Kap.4 und 5).

Von den primar UV -absorbierenden Basen der DNS sind Thymin und Cytosin (Pyrimidine) sensibler gegenliber dieser Strahlung als die Purine Adenin und Guanin. Nach DEERING (1961) wird von LOO UV-Quanten nur die Energie eines Quantes von den Pyrimidinen absorbiert. Das entsprechende Purin-Absorp­tionsverhaltnis wurde mit I: LOOOO angegeben. Die Energie weniger absorbierter Quanten kann zu effektiven Molekiilveranderungen fiihren, deshalb ist den Pyrimidinen und speziell dem Thymin besondere Bedeutung beizumessen.

Erfolgt die UV-Bestrahlung wahrend der DNS-Replikation in der S-Phase, so werden cinige Thyminbasen aufgrund der absorbierten

Energie veranlaBt, sich mit den Thyminein­heiten des gegenliberliegenden Stranges der Doppelhelix zu verbinden, was zur Entstehung doppdmolekularer Kettenabschnitte oder soge­nannter Dimeren (Interchain-Dimeren) fiihrt. Wenn die Doppelbindungen des Thymins in die einfache Bindung zum Dimer libergeht, verliert es die Fahigkeit, im ultravioletten Wellenbereich bei A 260 nm maximal zu ab­sorbieren. Die Absorptionsanderung bei A 260 nm mit UV bestrahlter, lebender Zellen gibt AufschluB liber das Verhaltnis zwischen Thy­min-Monomeren: Thymin-Dimeren. Diese UV -induzierte Thymin-Dimerisation ist einer der wichtigsten Faktoren im molekularen Bereich, durch den die biologische Aktivitat der DNS verandert werden kann.

Thymin- bzw. Uracil-Thymin-Dimeren .. bildung konnte an Escherichia coli K12 , an Maus-L-Zellen und an Gewebekulturen embryo­naler Zellen des Chinesischen Hamsters nach­gewiesen werden (SETLOW und SETLOW, 1962; SETLOW et aI., 1963; BOYCE und HOWARD­FLANDERS, 1964; TROSKO et aI., 1965; KLIMEK, 1966; KLIMEK und VLASINOWA, 1966). TROSKO et ai. fiihrten die Bestrahlungen mit mono­chromatischem UV -Licht der Wellenlangen 265 nm durch. Die Trennung der radioaktiven Thymin-Monomeren und Dimeren erfolgte papierchromatographisch. AnschlieBende Li­quid-Szintilationsmessungen der Radioaktivitat ergaben nach Bestrahlung bei A 265 nm mit

173

84 . G. THIESSEN

einer aufgestrahlten Energie von roo erg/mm2

einen Anteil der Thymin-Dimeren von 0,05% bezogen auf den gesamten Thymingehalt.

Wesentlich interessanter als die aufgestrahlte Energie hir das Verstandnis der molekularen Wirkung der UV-Strahlung auf die DNS ist es, die von der lebenden Zelle absorbierte Energie zu kennen. Unter Voraussetzung bestimmter, insbesondere die DNS betreffende Annahmen und nach Berucksichtigung der an lebenden Zellen mikrospektrophotometrisch ermittelten Absorptionsspektren (s. Kap.4) sowie der errechneten absorbierten UV-Energie/Zellkern (s. Kap.5) konnen die von TROSKO et al. (1965) ermittelten Resultate auf die vorliegenden Untersuchungen iibertragen werden. Als 2C­Wert fur die ovarialen Zellen wurde ein DNS­Gehalt von 6 . 10-12 g!Zellkern bestimmt.

Nach HAGGIS et al. (1964) entspricht diese DNS-Menge ca. 25000 Molekulen mit einem jeweiligen Molekulargewicht von 120' 106,

d. h. das Molekulargewicht der DNS pro Zell­kern kann mit 30' roll berechnet werden. Wird das durchschnittliche Molekulargewicht pro Nukleotid mit 300 angenommen, so sind ro lD Basen im Zellkern enthalten. Die Unter­suchungen von SUEOKA (1961) iiber die Varia­tion und Heterogenitat der DNS-Basenzusam­

ro1a mensetzung ergaben, daB ca. 30% der Basen pro Zellkern auf das Thymin entfallen.

Unter V oraussetzung der Richtigkeit des zuvor genannten DNS-Molekulargewichtes konnten TROSKO et al. (1965) mit einer auf­gestrahlten monochromatischen UV -Dosis von roo erg/mm2 der Wellenlange 265 nm 0,05% Dimeren erzeugen. Diese Energie war aus­reichend, um 1,5' 106 (verbesserte TROSKO­Berechnung anstatt von 1,5' 105) Thymin­Dimeren pro Zellkern zu induzieren.

Um die Versuchsergebnisse TROSKO'S auf die vorliegenden Experimente ubertragen Zl1 kon­nen, bedurfte es der Anpassung des monochro­matisch bei I-. 265 nm aufgestrahlten UV-Lichtes an die spektrale Energieverteilung der HQA 125 W in der Objektebene iiber den Wellen­langenbereich von 1-.245-300 nm und deren Umrechnl1ng auf die absorbierte UV-Energie beil-.265 nm.

I74

In den Untersuchungen uber die UV-Dosi­metrie (s. Kap.5) konnte eine Strahlungs­leistung (So) der am Ort des Objektes einfallen­den UV-Energie (1-.245-300 nm) von 1525 erg/cm2 . sec ermittelt werden. Der Anteil des Zellkerns an der absorbierten Energie (s. Kap.5, Formel (8): So' AK2) betragt 1,84' 10-7 erg/ fL 2 . sec.

Fur den Vergleich beider Untersuchungen miteinander ist einschrankend zu berucksichti­gen, daB die Zelle tiber den gesamten UV-Be­reich Energie absorbiert. Um trotz der unter­schiedlichen Versuchsvoraussetzungen eine Ge­geniiberstellung der Resultate vornehmen zu konnen, wurde nur ein Teil der UV-Strahlen­wirkung Hir die Wellenlange 265 nm auf die Dimerenbildung ausgewertet.

Die Anpassung an das von TROSKO ange­wandte monochromatische UV -Licht (1-.265nm) erfolgt durch die Multiplikation mit der Registrierflache von 770 fL2 und ergibt die vom Kern bei 1-.265 nm absorbierte UV-Energie von 0,142' ro-3 erg/sec je Zellkern. Wie aus Abb.25 (Kap.5) zu entnehmen ist, betragt So fur die Spektrallinie 265 nm=218 erg/cm2. sec bzw. 2,18' ro-6 erg/fL2 . sec. Bei einer Zellkernflache von 180 fL2 konnte als eingestrahlte Strahlen­leistung 0,392 . 10-3 erg/sec j e Zellkern errechnet werden. Die relative, absorbierte Energie von 1-.265 nm betragt dann 36,2%.

Bei der Umrechnung der von TROSKO ein­gestrahlten Leistung in absorbierte Werte zum Vergleich der eigenen MeBergebnisse ergab sich fiir So von roo erg/mm2=r . 10-4 erg/fL2 eine entsprechende, absorbierteEnergie von 0, 3 6· 10-4

erg!fL2 (= 36,2%). Durch die Multiplikation dieses Wertes mit der Zellkernflache von 18o fL 2

ermittelt sich eine absorbierte Dosis des CHO­Zellkerns von 6,48 . ro-3 erg/Zellkern. Dies gilt jedoch nur unter der Voraussetzung, daB die Einstrahlung genauso groB ware wie bei TROSKO:

6,48 . 10-3 erg/Zellkern induzieren nach TROSKO (verbesserter Wert) 1,5 . 106 Thymin­Dimeren/Zellkern und

1,00' lO-3 erg/Zellkern erzeugen dementspre­chend 0,23' lO6 Thymin-Dimeren/ zellkern.

Wie aus den Versuchen des Kapitel 5 zu ent­nehmen ist, betragt die absorbierte UV­Strahlungsleistung 1,275' lO-3 erg/sec· Zelle. Nach der Aufschliisselung in Kern- und Plasma­absorption errechnet sich aus den Werten der Abb.26 (Kap.5) und Formel (8) das Verhaltnis der Kernabsorption zur Gesamtabsorption mit 0,752. Man erhalt somit die im Zellkern pro Sekunde absorbierte Energie von 0,958 . lO-3

erg/sec· zellkern. Diese absorbierte UV -Strahlungsleistung ist

ausreichend zur Induktion von 0,22 . lO6 Dime­ren/sec . Zellkern. Bei dies en Berechnungen wird einschrankend die Annahme vorausgesetzt, daB die Dimerenbildung direkt proportional

1,8

',6

1,'

1,2

1,0

u w en

0,8

z

~ ~ 0 0,6

0,'

240 250 260

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells' 85

der absorbierten Energie ist, also unabhangig von der Wellenlange erfolgt. Um feststellen zu konnen, wieviele Quanten zur Bildung einer Thymin-Dimere im Durchschnitt benotigt werden, wurde die vom zellkern absorbierte Energie mit Hilfe der Quantenenergie in absor­bierte Quanten/sec· nm in Abhangigkeit der Wellenlange (Abb.53) errechnet. Die Integra­tion dieser Kurve ergibt 1,27 . lOs Quanten/sec . Zellkern, entsprechend 0,22 . lO6 Dimeren/sec . zellkern. Hieraus erhalt man

Quanten 5,8, lO2 ---­

Dimer

Vergleicht man die umgerechneten Werte von TROSKO bei A 265 nm mit den Resultaten vorliegender Untersuchungen, so induzieren

270 280 290 300 X [!"1m]

Abb. 53. Die vom Zellkern absorbierten UV -Quanten/sec in Abhangigkeit von der WellenEinge.

I75

86 . G. THIESSEN

6,48 . 10-3 erg/Zellkern etwa 1,) . 106 Dimeren/ Zellkern. Die Quantenenergie bei A 265 nm betragt 7,478' 10-12 erg/Quant, so daB die absorbierte Energie 0,867' 109 Quanten ent­spricht. Benutzt man diese Werte fiir die Berech­nung, dann werden 5,78 . 102 Qnanten/Dimere benotigt.

Aus diesen Berechnungen lassen sich wesent­liche zusatzliche Informationen der Strahlen­wirkung wahrend der Aufnahme von Kern­Absorptionsspektren lebender Interphase-Zellen ableiten (s. Kap.4). Da sich beim «Durchfahren» des Spektrums der MeBstrahl auf eine MeB­blendenflache von II,3 fL2 konzentriert, werden nicht alle DNS-Doppelhelices gleichmaBig mit Dimeren belegt, sondern dieses ist nur fiir einen Teil in der Mitte des Zellkernes zutreffend. Wenn man bei dieser Dberschlagsrechn ung die spezielle Form des Kernes unberucksichtigt laBt, so kann man an stelle des Verhaltnisses des yom MeBstrahl getroffenen Volumens zum gesamten Kernvolumen, das Verhaltnis der MeBflache zur Kernflache mit 6,3% einsetzen. Dies be­dentet, daB die UV-Strahlenbelastung (s. Kap.4) der lebend gemessenen Zelle, die mit 50/00 fiir den gesamten Kern angegeben wurde 16mal hoher in dieser durchstrahlten Kernflache ist. Damit wurde die Strahlenbelastung am Ort des MeBfeldes 8% der Belastung bei der kleinsten angewandten, absorbierten Schadigungsdosis von 3,83' 10-3 erg/sec· zellkern entsprechen. Es konnen sich wahrend der Messung 4,4 . 103

Dimeren gebildet haben. Der mittlere Abstand der Dimeren miiBte dementsprechend 12,5mal groBer sein als bei der kleinsten Schadigungs­dosis, und zwar 3,87 fL' 12,5 = 50 fL Dimeren­Distanz. Dimeren dieses definierten Abstandes waren jedoch nur im Bereich der MeBflache lokalisiert.

Aus den Ergebnissen iiber die UV-Absorp­tion lebender Zellen (s. Kap.4) konnte in Spalte (3)-(6) der Tab.ro die Anzahl induzierter Dimeren je Zellkern, das Verhaltnis der Nukleo­tide pro einem erzeugten Dimer, der Anteil Thymin-Nukleotide pro induzierter Thymin­Dimere sowie der durchschnittliche Abstand (fL) der Thymin-Dimeren voneinander auf der DNS-Doppelhelix bestrahlter CHO-Zellen als

Funktion der vom Zellkern absorbierten UV­Strahlendosis (Spalte [2]) ermittelt werden. Wie aus Spalte (7) und den Abb. 51 a-b (Kap.7) hervorgeht, tritt bei Zellkernen nach einer absorbierten UV-Dosis von 3,83-8,6' 10-3

erg/Zellkern eine betonte Abnahme der DNS­Syntheseleistung wahrend der S-phase bestrahlter Zellen auf 66% im Vergleich zur Kontrolle ein. Eine absorbierte Dosis bis 8,6 . 10-3 erg/Zellkern entspricht in ihrer Wirkung dem Empfindlich­keitsbereich der SENS1-Phase (Kap.7, Abb. 52). Nach dem Dberschreiten dieses «Knickpunktes» im Dosisbereich von> 8,6-3 5.4 . 10-3 erg/Zell­kern absorbierter UV-Energie erfolgt eine lineare Abnahme der DNS-Syntheseleistung bis auf 28% des Kontrollwcrtes (SENS 2) bei gleich­zeitiger Verkleinerung des Verhaltnisses Thy­min: Thymin-Dimeren zugunsten der Dimeren. Die DNS-Synthese wird durch die Dimeren­bildung nicht gestoppt, sondern nur die Repli­kationsgeschwindigkeit vermindert. Die Ver­zogerung der Syntheseleistung sowie die Anzahl induzierter Thymin-Dimeren sind nicht pro­portional der Dosis. 1m Bereich der SENS 1

werden zur Reduktion der DNS-Synthese­leistung urn 1% etwa 0,6-0,65' 105 und in SENS 2 0,66-1,16' 105 induzierte Dimeren benotigt. Diese Werte weisen auf die relativ groBe Wirksamkeit kleiner UV-Dosen bis 8,6 . 10-3 erg/Zellkern gegeniiber syntheti­sierenden Zellen hin, wahrend hohere absor­bierte Strahlungsleistungen >8,6-35,4' 10-3

erg/Zellkern einer Sensibilitatsabnahme urn den Faktor 4,1 entsprechen. Der verlauf der dosis­abhangigen Dberlebenskurve (s. Kap.6), die Verminderung der DNS-Syntheseleistung (s. Kap.7, Abb. 52 b), die unterschiedliche Anzahl Dimeren, die zur Herabsetzung der DNS­Syntheserate um 1% bis 8,6 . 10-3 erg/Zellkern und daruber hinaus benotigt werden, sowie die Entstehung von Uracil-Thymin-Dimeren im Bereich der absorbierten UV-Dosen >8,0 . 10-3

erg/zellkern (WACKER, 1961) lassen auf die Richtigkeit der Annahme eines biphasischen Reaktionsvermogens der Zellen innerhalb der S-phase schlieBen.

Von der Verzogerung des DNS-Synthese­beginns und der Abnahme der Syntheserate

Analysis of Irradiated Tissne Cnltnre Cells . 87

Tab.lo. Die Wirknng absorbierter UV-Strahlung (A 265 nm) anf die Molekularstruktnr der DNS eines Zellkernes.

(I) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

Anzahl der Thymin­

Anzahl der nukleotide Dnrchschnitt­Absorbierte Absorbierte Nukleotide pro indu­Anzahl licher

Dosis- Dosis- pro indu­ zierter induzierter Abstand (fL) Leistung Leistung zierter Thymin­Dimeren der Dimeren (erg/sec· (erg/sec· Dimere

(.106 Dimere auf der DNS­Zelle) Zellkern) (bezogen auf (bezogen auf Dimeren/sec) Doppelhelix (.10-3) (.10-3) 1010 Nukleo­

tide)

5,10 3,83 0,88 II400 7,65 5,75 1,32 7600

II,47 8,62 1,98 5050

15,30 II,50 2,64 3780 24,22 18,20 4,18 2390 38,25 28,80 6,60 1510 47,17 35,40 8,13 1230

76,50 57,50 13,20 760

II4,75 86,20 19,80 505 153,00 II 5,00 26,40 378 306,00 23 0,00 52,80 189 382,50 288,00 66,00 151 612,00 460,00 105,60 95

nach UV - und Rontgenbestrahlung zur Zeit der Gc , S- und G2-Phase ausgehend (s. Kap.7, Abb.49, 50-52a-b) besteht die Moglichkeit, aus dem Kurvenverlauf einige Werte zu errechnen, die den Vergleich der vorliegenden Ergebnisse mit gegenwartigen Vorstellungen molekularer Strahlenwirkung erlauben.

Da fur die UV-Strahlendosis die Anzahl ab­sorbierter Quanten pro Zellkern ermittelt wurde und das durchschnittliche Molekulargewicht eines Nukleotides mit 300 (5· 10-22 g) ange­nommen wird, kann die Anzahl der nach UV­Bestrahlung durchschnittlich weniger gebildeten Nukleotide wahrend eines bestimmten Inter­valls der S-phase durch die Absorption eines UV -Quants berechnet werden.

Geht man von einer absorbierten UV-Energie von 0,1 . 105 erg/g aus (s. Kap.7, Abb. 51 a-b), so ergibt sich bei einer Quantenenergie von 7,5 . 10-12 erg/Quant, daB 1,3 . 1015 Quanten/g Masse absorbiert werden. Wird des weiteren

0,3 . 1010 des Zellkernes Thymin­

nukleotide)

3420 3,870 2280 2,580 1520 1,720

II3 0 1,290

716 0,810

453 0,510

369 0,420 228 0,260 152 0,170 II3 0,130

57 0,065

45 0,05 1 28 0,032

DNS-Synthese­

leis tung in %, bezogen auf

die Kontrolle

86 80 SENS 1

66

60 50 41 SENS2

28 ---

-

--

fur die Berechnung ein kugelformiger zellkern mit einer Frache von 180 [J. 2 und dessen Dichte mit I g/cm3 zugrunde gelegt, dann betragt die Masse des zellkernes 1,8 . 10-9 g. Unter diesen Voraussetzungen werden 2,3 . 106 Quanten pro zellkern absorbiert.

Wie aus der Abb. 51 a hervorgeht, vermindert eine absorbierte UV-Energie von 0,1 . 105 erg/g (2,3 . 106 Quanten/Kern) die DNS-Synthese­leistung wahrend der S-Phase um 10-12 g DNS/ Kern, d. h. es wurden 2· 109 Nukleotide durch die Bestrahlung weniger gebildet. Wenn 2,3 . 106 Quanten/Kern die N ukleotidbildung um 2· 109 Nukleotide hemmen, so reduziert ein Quant die Synthese von 870 Nukleotiden. Es sollte jedoch bei diesem uberraschend hohen Wert berucksichtigt werden, daB die UV­Strahlenwirkung nicht unbedingt eine Zersto­rung der Nukleotide bedeutet, sondern vielmehr einer Verzogerung ihrer Entstehlmg wahrend des Replikationsprozesses gleichkommen kann.

177

88 . G. THIESSEN

Die gleiche DNS-Syntheseabnahme, ent­sprechend 870 Nukleotiden, wird durch Ront­genstrahlung erzeugt, wenn eine Energie von 10 e V absorbiert worden ist.

Diese Angaben gestatten den Vergleich mit den von TROSKO et al. (1965) erarbeiteten Resul­taten tiber die Rate der Dimeren-Erzeugung. Aus diesen Werten konnte die Anzahl absor­bierter UV -Quanten, die zur Entstehung einer Dimere erforderlich sind, errechnet werden. Bei einer eingestrahlten UV-Energie von 100 erg/ mm2 bei A 265 nm, entsprechend 1,8 . 10-2 erg/ Zellkernflache, einer Energieabsorption von 72% und bei einer Quantenenergie von 7,5 . ro-12 erg/Quant ergibt sich, daB 1,7· 109

Quanten/Zellkern absorbiert werden. Da 100 erg/mm2 1,5· ro6 Dimeren/Kern erzeugen, betragt die Anzahl benotigter Quanten bei A 265 nm 1,1· 103 Quanten pro Dimer. Aus­gehend von einer Quantenenergie mit 4,7 e V bei A 265 nm entsprechen I, I . ro3 Quanten/ Dimer 5200 eV/Dimer.

Ein Vergleich der Strahlenwirkung von UV­und Rontgenbestrahlung wird auf der Grund­lage der Anzahl veranderter Molehile pro 100 eV (G-Wert) ermoglicht. Flir die dimeren­erzeugende UV-Strahlung betragt der G-Wert 0,019. Unter der Voraussetzung, daB bei Rontgenstrahlung ro e V zur Verminderung der DNS-Syntheserate urn 870 Nukleotide fuhren, errechnet sich der entsprechende auf die Syn­thesereduktion bezogene G-Wert von 8700. Vergleicht man die Anzahl Quanten, die zur Erzeugung einer Dimere notwendig sind, mit der Effektivitat der UV-Strahlung auf die DNS­Synthese, dann wurde dies bedeuten, daB durch die Entstehung einer Dimere die Bildung von ca. 950000 Nukleotiden gehemmt bzw. ver­zogert wurde. Dies ist jedoch ein sehr hoher Wert, so daB mit Sicherheit auch andere Pro­zesse der UV -Wirkung bei der Herabsetzung der DNS-Syntheseaktivitat bestrahlter Chine­sischer Hamster-Zellen einen EinfluB ausiiben mussen.

N eben den Thymin-Dimeren entsteht als zweites Photoprodukt die Uracil-Thymin­Dimere durch Deaminierung der Cytosin­

Thymin-Dimeren (WACKER, 1961). KLIMEK (1966) konnte eine 24stundige Lebensfahigkeit von Thymin-, Uracil-Thymin-Dimeren in Maus-L-Zellen nachweisen. Eine Anzahl anderer Autoren fuhrte photochemische, photobiolo­gische und biochemische Untersuchungen aus und konnten keine Spaltung der Dimeren in Monomeren durch spezifische photo enzyme in tierischen Zellen erfassen im Gegensatz zu SETLOW und SETLOW (1962) an Escherichia coli durch Endonuklease, obgleich eine Reparatur des UV -Schadens nach fraktionierter Bestrah­lung (sog. «Elkind-Effekt») beobachtet werden konnte.

SMETS und CORNELIS (1971) untersuchten die Frage der reparablen und irreparablen Schaden in 5-Bromuracil (BU) snbstituierter DNS nach UV-Bestrahlung. Die Substitution von Thymin in der DNS durch halogene Analoge wie 5-Bromuracil sensibilisierte die Zellen im Hin­blick auf letale Effekte, ausgelost durch ioni­sierende und ultraviolette Strahlung. Der Sensi­bilisierungseffekt wurde der Entstehung ver­schiedener photoprodukte und der Erzeugung irreparabler Lasionen zugeschrieben. Das haufig­ste Umwandlungsprodukt des Bromuracils konnte als Uracil identifiziert werden. Das Uracil wurde aus der DNS durch Einzelstrang­brtiche entfernt und die Bruchstellen mit hoherer Geschwindigkeit geschlossen als es der Lebens­dauer von pyrimidin-Dimeren entspricht. Die Autoren fuhren die Sensibilisierung durch BU auf Doppelbruche und Vernetzung von DNS und Proteinen zurlick. Die Ergebnisse besagen auBerdem, daB ein der Bestrahlung folgender Einbau markierter Nukleoside sich von der normalen DNS-Synthese durch seine Spezifitat fur Pyrimidin-Baustoffe auszeichnet. Die Zellen hatten damit die Moglichkeit, die durch Bestrahlung verursachten Bruche in den einzel­nen DNS-Strangen zu reparieren (SMETS, 1969).

Andererseits mussen bei der UV-Strahlung selbst mehrere den Strahlenschaden induzierende Wirkungsmechanismen unterschieden werden. Aus Bestimmungen des Inaktivierungsquer­schnittes von infektioser <I> X-174-DNS durch monochromatische V akuum-UV -Strahlung (58,4nm) muB nach Inaktivierung und Elek­

tronenemission unterschieden werden. Licht­quanten unterhalb 7 e V inaktivieren ausschlieB­lich durch Anregung, hingegen ist oberhalb 10,2 e V Ionisation der dominante Inaktivie­rungsmechanismus (BERGER, I969). Die strahlen­induzierte molekulare Anregung wird als Radiolumineszenz gemessen. STEEN (I970) bestimmte die Radiolumineszenz bei den Aminosauren Tryptophan und Tyrosin nach UV - und Rontgenbestrahlung.

TROSKO und ISOUN (I970) untersuchten, ob eine direkte Photoreaktivierung, d. h. Mono­merisation strahleninduzierter Pyrimidin-Dime­ren, in menschlichen Amnion- und HeLa-Zellen stattfindet. Fiir dieses Ereignis konnte kein ein­deutiger Nachweis erbracht werden. Es diirfte nicht nur die DNS sondern auch RNS und Enzyme geschadigt werden (POLLARD und DAVIES, I970). Wie aus Abb.5Ia (s. Kap.7) ersichtlich und aus dem Vergleich der unter­schiedlichen Organisation der DNS-Replikation im tierischen Zellkern und Bakterium ableitbar ist, blockieren die Dimeren die DNS-Replika­tion nur unvollstandig:

I. 1m Vergleich zum einchromosomigen Bak­terium enthalten die CHO-Zellen 2 n = 22 Chromosomen.

2. Jedes Chromosom setzt sich aus einer Anzahl DNS-Molekiilen zusammen, die nach einer bestimmten Folge angeordnet sind. Diese Baseneinheiten diirften im Bakterium und tierischen Zellkern sehr ahnlich sein.

3. Setzt man voraus, daB die DNS-Replikation in einem kreisformigen Molekiil irgendwo beginnt und endet und die Dimeren die Replikation vollstandig blockieren, so konnte die Replikation nur bis zur Blockadestelle fortschreiten.

Die Initialeffekte nach UV-Bestrahlung sind gekennzeichnet durch das A uftreten von Knicken an vielen Stellen des Molekiils als Folge der Dimerisation von Pyrimidinen und der Bildung einfacher Briiche. Mit dem Erscheinen von Knicken wird das Molekiil gleichzeitig zusam­mengefaltet und erhalt an einigen Stellen sein ringformiges Aussehen durch Cross-Linking. Mit dem Anstieg der Dosis erfolgt das Auf­

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 89

brechen von Doppelstrangen als Konsequenz von Strangbriichen. Nach BAGCHI et al. (I969) stellt sich nach Bestrahlung mit hoheren UV­Dosen ein konstantes Gleichgewicht zwischen Absorptions- und Sedimentationskoeffizient ein. Da die UV-bestrahlten CHO-Zellen jedoch mit verminderter stiindlicher Syntheseleistung DNS replizieren, konnen die Dimeren je nach Dime­ren-Art und Typ zwar zu einer dosisabhangigen Verlangsamung der Replikationsgeschwindig­keit fiihren, nicht aber den V organg als solchen blockieren. Es kann nicht nur die Bildung von Interchain-Dimeren sondern auch die lokale Entstehung von Intrachain-Dimeren benach­barter Thymine eines DNS-Einzelstranges durch die Aufhebung der dazwischen liegenden H-Bindungen stattfinden.

Beide Dimerentypen des Thymins konnen UV -induzierte Pramutationen hervorrufen, so daB die wahrend der Perfektionsphase neu synthetisierte DNS in ihrer Riickbildungs­geschwindigkeit behindernde Dimeren enthalt, deren Anwesenheit zu Kopierfehlern fiihrt. AuBer der Vernetzung zwischen den Strangen durch Dimeren (= Interchain-Dimeren), die zur Unterbrechung der Trennung und partiellen Blockade zur Zeit der DNS-Replikation bei­tragen, beeintrachtigen die Dimeren zwischen benachbarten Thymin-Basen auf dem gleichen Strang (= Intrachain-Dimeren) die Folge­richtigkeit der Basenpaarung. Normalerweise sollte das Adenin gegeniiber jedem Thymin des Schwesternstranges liegen, die Verkniipfung zweier benachbarter Thymine jedoch fUhrt wahrscheinlich schon zu ausreichenden Ver­anderungen, um den folgerichtigen Einbau des Adenins zu verhindern. Die Replikation kann an dieser Stelle kurz unterbrochen werden oder verlauft auf dem replizierten Strang mit ver­anderter Basensequenz weiter. In der nach­folgenden Replikation des Stranges entsteht ein hinsichtlich seiner veranderten Basensequenz mutiertes DNS-Molekiil. Setzt man voraus, daB die DNS der primare Target fiir UV-Schaden ist und sowohl UV - als auch Rontgenstrahllmg zu Chromosomenaberrationen fiihren, so bleibt die Frage nach der GroBe der zu diesem Ereignis benotigten UV-Energie bzw. die Art der

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90 . G. THIESSEN

Energieubertragung der Rontgenstrahlung zu untersuchen.

Werden bei der Rontgenstrahlung mehrere Ionisationen/fL3 je Zelle zur Chromosomen­verandenmg benotigt, so reichen die spezifische UV -Wirkung und die Primarprozesse nach Rontgenstrahlung bis in die kleinsten Erbein­heiten der GroBenordnung einzelner N ukleo­tide hinein, deren Anderung gerade noch eine Mutation (z. B. Kopierfehler) verursacht. Die Letalitat UV -bestrahlter Zellen ist nicht nur abhangig von der GroBe eines sogenannten «Mutons», sondern wird weitgehend beeinfluBt von der Anzahl gebildeter Photoprodukte, so­wie von deren Entstehungs- und Ruckbildungs­geschwindigkeit. Entscheidend fur die Induk­tion von Chromosomenaberrationen scheint jedoch, die GroBe und Art der Mutonen und deren Abstand auf der Einzel- oder Doppelhelix zu sein, so daB die Dimerisation eine allgemeine Labilitat des DNS-Molekuls herbeifiihrt und dadurch regionale Chromosomenbruche in Erscheinung treten. Wahrend sich die Chromo­somenbruche auf Interchain-Dimeren zuriick­fiihren lassen, kann die Entstehung von Chromatidenbriichen oder Gaps auf die An­

9. Zusammenfassung

Aus dem strahlenbiologischen Problemkreis werden einige Fragen herausgenommen und V oraussetzungen geschaffen, die in kultur­technischer, zytologisch-zytochemischer, strah­lengenetischer und molekularbiologischer Hin­sicht weitere Untersuchungen gestatten. 1m V ordergrund des V orhabens an tierischen Gewebekulturzellen stehen die durch Strahlung induzierten Wechselwirkungen mit dem bio­logischen Objekt. Ergebnisse, die sich durch die Applikation der modifizierend wirkenden Strahlung ergeben, konnten in einigen Fallen als richtungsweisend fiir das Reaktionsvermogen anderer Objekte angesehen werden. Neben der qualitativen, subjektiven Erfassung morpho­logischer und zytochemischer Veranderungen sind quantitative objektivierte Aspekte anzu­streben, d. h. die Analyse derjenigen Parameter,

180

wesenheit von Intrachain-Dimeren bezogen werden. Die Klassifizierung der Chromatiden­aberrationen als Bruch oder Gap ist sehr schwie­rig, da in beiden Fallen an den entsprechenden Stellen farberisch keine DNS nachgewiesen werden kann. Die Entstehung der Gaps durch Intrachain-Dimeren ware infolge mangelnder DNS-Massenbelegung kurzer Chromatid­segmente denkbar.

Die UV -Bestrahlung in der anfanglich sehr sensiblen, frMen S-Phase bedeutet einen funda­mentalen EinfluB auf die DNS-Synthese der Zelle. Als Ursache der Strahlenschadigung durften die Dimeren auBer der Photohydration und dem Crosslinking des DNS-Molekuls wesentlich in den molekularen Mechanismus der DNS-Replikation eingreifen.

Bei den UV -mikrospektrophotometrischen Untersuchungen an lebenden Zellen muB ferner berucksichtigt werden, daB die UV -Strahlung nicht nur einen Effekt auf die DNS ausubt, sondern eine Energieabsorption ebenfalls von der RNS, den Proteinen und anderen Ver­bindungen erfolgen kann, die an den Zellmeta­bolismen teilhaben und durch Strukturande­rungen reagieren konnen.

die einen Strahlenschaden ausmachen, ist durch­zufiihren.

Zur Erreichung konstanter Kulturbedingun­gen erfolgte die Anwendung eines regulier­baren, auf pH-V eranderungen und Zellver­mehrung wirkenden Systems. Dies fiihrte zur Erhohung der Zellkonzentration und plating efficiency. Des weiteren wurde die Kolonie­groBenverteilung einer Stammkultur und aus Einzelzell-Isolation hervorgegangener Klone (C1/II-C2/II-C3/II) untersucht.

Mit fortschreitender Kulturdauer trat eine Verbreiterung der KoloniegroBenverteilung ein. Die Integralkurven der KoloniegroBenvertei­lung wiesen eine erstaunliche Parallelitat auf. Demzufolge ergab sich eine dichte Lage samt­licher Exponentialkurven mit entsprechenden Teilungsgeschwindigkeiten. Die einzelnen Zell­

stamme wichen von der durchschnittlich 13stundigen Generationsdauer um maximal 20% abo

1m Hinblick auf Bestrahlungsversuche wurde die spontane Variabilitat des Karyotypes wieder­holt untersucht. Durch Chromosomen-Ana­lysen konnte ein breites Spektrum ausgepragter Polyploidie festgestellt werden. Die Inkonstanz der Chromosomenzahl eines Genoms war von Klon zu Klon variabel. Eine oder zwei Chromo­somenzahbn traten bei allen Zell-Linien beson­ders haufig auf.

Absorptionsspektren von Kern und plasma lebender Zellen wurden iiber einen Wellen­langenbereich von I- 248-310 nm mit einem UV-Mikrospektrophotometer bestimmt und die Mittelwerte der Absorption als Kurve dar­gestellt. Gleichzeitig konnte die Strahlen­belastuhg, die wahrend dieser Messung auftrat, ermittelt werden. Wurde das Absorptions­spektrum des Kerns einer lebenden Zelle be­stimmt, dann betrug die Strahlenbelastung 5%0

derjenigen Energieabsorption, die bei der klein­sten angewandten UV-Dosis (5,1 . 10-3 erg/sec) in den Bestrahlungsversuchen erfolgte. Der ent­sprechende Wert fur das Zytoplasma lag bei 2%0. Die inhomogene Nukleinsaure-Vertei­lung fuhrte zu erheblichen Komplikationen, wenn die von lebenden Zellen absorbierte Dosis ermittelt werden sollte.

Es wird eine Methode zur Errechnung der absorbierten UV-Energie lebender Zellen wahrend der Bestrahlung beschrieben.

V oraussetzung war einerseits die Moglichkeit der UV -mikrospektrometrischen Aufnahme von Absorptionsspektren von Kern und Zyto­plasma, andererseits muBte die Strahlenbelastung zur Registrierung der Spektren weit unter der Schadigungsgrenze der lebenden Zelle liegen. Um die tatsachlich absorbierte UV-Energie berechnen zu konnen, wenn die Zelle UV ­Bestrahlung erhalt, sind Messungen der Absorp­tionsspektren unzureichend, weil sie nur an einzelnen Punkten innerhalb der Zelle durch­gefuhrt werden. Berucksichtigt man die im Modell dargestellte inhomogene Nukleinsaure­Massenbelegung zur Ermittlung der absorbier­

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 91

ten UV-Dosis, so muB dieses Kriterium mit in die Oberlegungen einbezogen werden. Dosi­metrisch unzureichend sind diejenigen Unter­suchungen, die sich ausschlieBlich auf die Angabe der in die Objektebene einfallenden Strahlungs­leis tung beschranken. Fur die Dosisbestimmung ist es erforderlich, die wellenlangen- und orts­abhangige, von Zelle zu Zelle unterschiedliche absorbierte UV-Energie zu ermitteln.

Die Strukturdifferenzierung (Plasma - Kern) wurde bestimmt durch den Gehalt an absor­bierender, substantieller Massenbelegung, indem die Absorptionen bei I- 260, 280 und 313 nm gemessen wurden. Aus diesen Messungen ergaben sich die relativen Anteile der beiden absorbierenden Verbindungen. Die Werte fur I- 313 nm wurden zur Korrektur des Streulicht­anteiles (lh"Y; 1-=4) benutzt. DerExponent (y) kann zwischen 1-4 schwanken, stellt aber, wie nachgewiesen, keine kritische GroBe dar. Die von zellkern und Plasma absorbierte Dosis, getrennt nach Spektrallinien und Kontinuum in Abhangigkeit der Wellenlange, wird dargestellt. Die von den Zellen des Chinesischen Hamsters absorbierte UV-Energie betragt ca. 25% der am Objektort einfallenden UV-Strahlungsleistung (So). Diese dosimetrischen Oberlegungen treten insbesondere dann in den Vordergrund, wenn es gilt, ahnliche, induzierte Strahlenschaden zu interpretieren, die das Resultat von Bestrahlungs­expcrimenten sind, bei denen verschiedene Strahlenarten mit unterschiedlichem zellularen Wirkungsmechanismus angewandt werden.

Nach UV-Bestrahlung mit Energien bis 9,6· 104 erg/g wurde eine Oberlebensrate der Chinesischen Hamster-Zellen von 0,1% fest­gestellt. Der Do-Wert erstreckte sich uber einen Dosisbereich von 1,54· 104 erg/g absorbierter UV-Energie.

Populationsdynamische Untersuchungen des Bestrahlungseffektes befaBten sich mit verschie­denen Kriterien der zellularen Wachstumskine­tik nach Bestrahlung mit subletalen UV - und Rontgendosen und deren EinfluB auf die Zell­teilung in den folgenden Generationen, wie mit morphologischen Strahlenschaden, Induktion von Riesenzellen und Chromosomenaberratio­nen. Rontgen- und UV-Strahlung bewirkten

181

92 . G. THIESSEN

eine von der Strahlenart differenzierte, dosis­abhangige Mitosehemmung und Verzogerung.

Die zellulare Proliferationsfahigkeit nach UV- (1,8' roS erg/g) und Rontgenbestrahlung (5,5 . roS erg/g) wurde bis zu 50 Stunden behin­dert. Der wachstumskinetische Bestrahlungs­einfluB fuhrte zur Verlangerung der Zyklusdauer auf ca. 20 Stunden. UV-Strahlung erwies sich diesbezuglich um den Faktor 3 wirksamer als Rontgenstrahlung.

Die Bestrahlungen flihrten zu einer dosis­abhangigen, temporaren partiellen Synchroni­sation der Zellen. Strahleninduzierte, morpho­logische Veranderungen wurden nach dem Grad der Merkmalsausbildung und Haufigkeit der Symptome unterschieden.

Aus der Vielzahl der Veranderungen lieBen sich (a) strahleninduzierte Abweichungen des Zell- und Kernteilungsmechanismus, (b) sicht­bare Zerstorung einzelner Plasmabezirke oder des gesamten Zytoplasmas, (c) Riesenzellen und mehrkernige Zellen sowie die Entstehung von Kernrosetten und Mikrokernen mit verander­tem DNS-Gehalt nachweisen. Unterschiedlich wirkten beide Strahlenarten bei der chromo­somalen Aberrationsinduktion. Die Mehrzahl der strahleninduzierten Chromosomenanoma­lien setzte sich aus Chromosomen- wld Chroma­tidaberrationen zusammen und betrug fur Rontgenbestrahlung 0,005-0,001 bzw. fur UV­Bestrahlung 0,003-0,001 Aberrationen pro Zelle je roo erg/g absorbierte Energie.

Aus physiko-chemischen und histochemischen Grunden durfte das Gefrieraustauschverfahren die am meisten befriedigende Fixiertechnik sein, insbesondere unter Beriicksichtigung des opti­schen verhaltens der Objekte bei UV-mikro­spektrometrischen Messungen. Betrachtet man die Zelle als multiphasisches Protoplasmasystem, so ist die Steuerung des Geschwindigkeits·. verlaufes von Einfrier- und AuftauprozeB wesentlich fur die Beschaffenheit des Zellpra­parates.

Die unmittelbare Temperaturabnahme ver­mindert die Gefahr zellularer Beschadigungen, z. B. Vakuolisierung im Kern-Plasma-Bereich. Solche praparativen Fehler konnen leicht zu Verwechslungen mit induzierten morphologi­

r82

schen Strahlenschaden innerhalb der gleichen Bezirke fuhren. Durch die Schnellgefrierung konnen sekundar bedingte, intrazellulare Sub­stanzverlagerungen und Volumenveranderun­gen auf ein Minimum herabgesetzt werden, ohne Auswirkungen auf quantitative mikro­spektrometrische Messungen zu hinterlassen.

Die DNS der zellkerne bzw. Chromosomen wurde durch Feulgen-Farbung dargestellt. Die Abhangigkeit von Hydrolyse-Dauer und -Tem­peratur und der EinfluB des pH-Wertes der Farb­losung auf die Farbintensitat wurden an Sper­mien untersucht. Als Referenzsystem fur aIle Nukleinsaure-Bestimmungen wurden Bullen­sperrnien benutzt.

Quantitative und relative zytophotometrische Bestimmungen des Nukleinsaure- bzw. DNS­Gehaltes erfolgten an unbestrahlten und be­strahlten, lebenden, fixierten, ungefarbten sowie gefarbten ovarialen Einze1zellcn des Chine­sis chen Hamsters bei den Wellenlangen 260 und 560 nm. Gleichzeitig konnte die Zeit der ein­zelnen Zyklusphasen und der pro Zeiteinheit entsprechende Nukleinsaure- bzw. DNS-Gehalt der mit verschiedenen UV - und Rontgendosen bestrahlten Zellen bestimmt werden. Der Bestrahlungseffekt bestand in einer strahlenart­und dosisabhangigen Verzogerung des D NS­Syntheseanlaufs und einer Reduktion der Syn­theseleistung pro Zeiteinheit. Aus der moleku­laren Wirkungsweise der UV-Strahlung auf die DNS konnen zusatzliche Informationen gewon­nen werden.

Die Untersuchungen konzentrieren sich auf die Wechselbeziehungen zwischen UV-Strah­lung und DNS-Molekul, durch die eine Reihe von Effekten ausgelost werden. Der Wirkungs­grad der UV-Strahlung, d. h. das Wirkungs­spektrum der biologischen Veranderungen ist abhangig von der prozentualen spektralen Zusammensetzung des Wellenlangenbereiches 240-300 nm der absorbierten UV-Strall1ung und vom Energiegehalt einzelner Wellenlangen.

Die UV-induzierte Thymin-Dimerisation ist einer der wichtigsten Prozesse im molekularen Bereich, durch den die biologische Aktivitat und die DNS-Replikation wahrend der S-phase besonders verandert werden kann. Die DNS­

Analysis of Irradiated Tissue Culture Cells . 93

Synthese wird durch die Dimerenbildung nicht gestoppt, sondern nur in ihrer Replikations­geschwindigkeit vermindert.

Wie aus Kapitel 5 zu entnehmen ist, betragt die absorbierte UV-Strahlungsleistung 1,275

. 10-3 erg/sec· Zelle. Die vom Zellkern pro Sekunde absorbierte Energie konnte mit 0,958

. 10-3 erg/sec· Zellkern errechnet werden. Diese absorbierte UV -Strahlungsleistung ist aus­reichend zur Induktion von 0,22 . 106 Dimeren/ sec' Zellkern. Die Absorption von 5,8' 102

Quanten wird zur Bildung einer Thymin­Dimere durchschnittlich benotigt. Dieser Wert bezieht sich auf eine UV -Strahlenquelle mit bekannter prozentualer spektraler Zusammen­setzung und ist abhangig von der Anzahl absor­bierter Quanten/sec· nm uber den Wellen­langenbereich von 250-300 nm.

Aus den Untersuchungen geht hervor, daB eine absorbierte UV-Energie von 0,1 . 105 erg/g (A. 2,3 . 106 absorbierte Quanten/Kern) die DNS-Syntheseleistung wahrend der S-phase urn 10-12 g DNS/Kern vermindert, d. h. es wurden 2' 109 Nukleotide durch die Bestrah­lung weniger gebildet. Ein UV -Quant hemmt demzufolge die DNS-Synthese von 870 Nukleo­tiden. Die gleiche DNS-Syntheseabnahme, entsprechend 870 Nukleotiden wird durch eine

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Rontgenstrahlung erzeugt, wenn eine Energie von 10 eV absorbiert wird. Fiir die Entstehung einer Thymin-Dimere wurden bei A 265 nm 1,1 . 103 Quanten benotigt. Ausgehend von einer Quantenenergie von 4,7 eV bei A 265 nm entsprechen 1,1' 103Quanten/Dimer 5,2 KeV/ Dimer.

Ein Vergleich der Strahlenwirkung von UV­und Rontgenstrahlung wird auf der Grundlage der Anzahl veranderter Molekule pro 100 eV (G-Wert) ermoglicht. Fur die Dimeren erzeu­gende UV -Strahlung betragt der G-Wert 0,019.

Unter der Voraussetzung, daB bei Rontgen­strahlung 10 eV zur Verminderung der DNS­Syntheserate urn 870 Nukleotide hihren, er­rechnet sich der entsprechend auf die Synthese­reduktion bezogene G-Wert von 8700. AuBer der Dimerenbildung als Ursache fur die Strahlen­schadigung durfte die Photohydration und das Cross-Linking des DNS-Molekuls wesentlichen Anteil an der gehemmten DNS-Replikation haben.

Die durchgefiihrten Untersuchungen sollten als Grundlage hir weiterfuhrende UV - und Rontgenbestrahlungen verstanden werden, denen sich eine objektivierende Analytik strahleninduzierter Effekte in zytochemischer Hinsicht anschlieBen muBte.

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