Polarisationsmikroskopische Untersuchungen zur Qualität ... · Der maternale wie auch der paternale Gamet sind hochdifferenzierte Zellen und Ursprung eines jeden Individuums. Im

Aus dem Institut für Reproduktionsbiologie der

Tierärztlichen Hochschule Hannover

und

der Abteilung für Gynäkologische Endokrinologie und Reproduktionsmedizin

der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

___________________________________________________________________

Polarisationsmikroskopische Untersuchungen zur Qualität humaner und boviner Eizellen

I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N

Zur Erlangung des Grades einer

DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Maria Köster aus Kleve

Hannover 2008

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Burkhard Meinecke

PD Dr. Markus Montag

1. Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Meinecke

2. Gutachter: PD Dr. Christine Wrenzycki

Tag der mündlichen Prüfung: 19. Mai 2008

Für meine Eltern

und Geschwister

Mit der Zeit wird aus Gras Milch.

(Sprichwort)

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG...........................................................................................1 2 LITERATURÜBERSICHT.....................................................................3 2.1 Oogenese........................................................................................................................3

2.2. Maturation und ihre Regulation..................................................................................4

2.2.1 Nukleäre Maturation.......................................................................................................5

2.2.2 Cytoplasmatische Maturation.........................................................................................6

2.3. Aktivierung....................................................................................................................7

2.3.1 Physiologische Aktivierung............................................................................................7

2.3.2 Artifizielle Aktivierung...................................................................................................8

2.4 Frühembryonale Entwicklung...................................................................................10

2.5 Meiotische Spindel......................................................................................................12

2.5.1 Physiologische Grundlagen...........................................................................................12

2.5.2 Bedeutung der Spindelpräsenz......................................................................................13

2.5.3 Lokalisation der Spindel in der maturen Eizelle...........................................................14

2.5.4 Spindelmorphometrie....................................................................................................14

2.5.5 Einfluss der in vitro Maturation....................................................................................15

2.5.6 Polarisationsmikroskopische Studien über die bovine Spindel.....................................15

2.6 Zona pellucida.............................................................................................................15

2.6.1 Morphologie und Genese der Zona pellucida...............................................................16

2.6.2 Funktion der Zona pellucida.........................................................................................17

2.6.3 Zona hardening.............................................................................................................18

2.6.4 Polarisationsmikroskopische Untersuchungen.............................................................19

2.7 Evaluation der Eizell-Qualität...................................................................................20

2.7.1 Follikel..........................................................................................................................21

2.7.2 Cumulus-Oocyten-Komplex.........................................................................................21

Inhaltsverzeichnis

2.7.3 Morphologie der Eizelle................................................................................................21

2.7.4 Polkörperdiagnostik......................................................................................................22

2.8 Das Rind (Bos taurus) als Tiermodell........................................................................23

3 MATERIAL UND METHODEN........................................................24 3.1 Untersuchungen an humanen Oocyten..................................................................24

3.1.1 Gewinnung und Präparation der in vivo maturierten Oocyten..................................24

3.1.2 Polarisationsmikroskopische Spindel- und Zona pellucida-Analyse.........................25

3.1.3 Gewinnung und Präparation der paternalen Gameten...............................................26

3.1.4 Intracytoplasmatische Spermieninjektion..................................................................26

3.1.5 Vorkernbeurteilung und in vitro Kultivierung...........................................................27

3.1.6 Embryotransfer und Graviditätsermittlung................................................................27

3.1.7 Untersuchung der Spindeldynamik in Metaphase II-Eizellen...................................28

3.1.8 Prospektive Zona pellucida-Imaging-Studie..............................................................28

3.1.9 Versuche mit therapeutisch nicht verwendbaren Oocyten.........................................29

3.1.9.1 Zeitrafferstudie von Metaphase I-Eizellen.................................................................29

3.1.9.2 Parthenogenetische Aktivierung................................................................................29

3.1.9.3 Zona pellucida-Imaging bei immaturen Oocyten......................................................30

3.2 Untersuchungen an bovinen Oocyten....................................................................31

3.2.1 Gewinnung der bovinen immaturen Cumulus-Oocyten-Komplexe..........................31

3.2.2 In vitro Maturation.....................................................................................................31

3.2.3 Polarisationsmikroskopische Ermittlung des Maturationsstatus und

Zonaparameter...........................................................................................................32

3.2.4 Parthenogenetische Aktivierung................................................................................32

3.2.4.1 Einzelaktivierung nach Spindel- und Zona-Imaging.................................................32

3.2.4.2 Gruppenaktivierung vor Zona-Imaging.....................................................................33

3.2.5 In vitro Kultivierung im MiniWell-System...............................................................33

3.2.6 Beurteilung der DNA-Konfiguration mit Hoechst 33342..........................................34

3.2.7 Fluoreszenzoptischer Nachweis der initialen [Ca2+]i-Freisetzung..............................34

Inhaltsverzeichnis

3.2.8 Brilliant Cresyl Blue-Färbung immaturer Oocyten...................................................35

3.2.9 In vitro Fertilisation............................................................................................…...36

3.3 Statistische Auswertung..........................................................................................37

4 ERGEBNISSE.......................................................................................38 4.1 Ergebnisse der Untersuchungen an humanen Oocyten........................................38

4.1.1 Polarisationsmikroskopische Analyse der meiotischen Spindel................................38

4.1.1.1 Spindeldynamik im Verlauf der Maturation humaner Oocyten.................................38

4.1.1.2 Spindeldynamik in humanen Metaphase II-Oocyten vor ICSI..................................39

4.1.1.3 Ergebnisse nach ICSI in Abhängigkeit von der Spindeldynamik..............................39

4.1.1.4 Auswirkung der Eizell-Aktivierung während der Spindelbrückenphase...................39

4.1.2 Zona pellucida-Imaging humaner Oocyten................................................................41

4.1.2.1 Prospektive Zona pellucida-Imaging-Studie..............................................................41

4.1.2.2 Zona pellucida-Imaging immaturer humaner Oocyten..............................................42

4.2 Ergebnisse der Untersuchungen an bovinen Oocyten..........................................44

4.2.1 Einfluss des Meiosestadiums boviner Oocyten bei parthenogenetischer

Aktivierung................................................................................................................44

4.2.1.1 Auswirkung der Maturationsdauer boviner Oocyten auf den Aktivierungserfolg....44

4.2.1.2 Ergebnisse nach Aktivierung in Abhängigkeit vom Maturationsstadium.................44

4.2.1.3 Hoechst-Färbung 20 h nach Aktivierung boviner Oocyten.......................................46

4.2.1.4 Messung der initialen Ca2+-Freisetzung in bovinen Oocyten....................................47

4.2.2 Zona pellucida-Imaging boviner Oocyten.................................................................49

4.2.2.1 Zona pellucida-Imaging immaturer boviner Oocyten nach BCB-Färbung...............49

4.2.2.2 Zona pellucida-Imaging maturer boviner Oocyten...................................................50

4.2.2.3 Vergleich der parthenogenetischen Entwicklung nach Zona pellucida-Imaging......50

4.2.2.4 Zona pellucida-Imaging 21 h p.ins. – Vergleich der frühembryonalen

Entwicklung...............................................................................................................51

Inhaltsverzeichnis

5 DISKUSSION..........................................................................................54 5.1 Meiotische Spindel in humanen Oocyten..................................................................54

5.2 Zona pellucida in humanen Oocyten.........................................................................57

5.3 Maturationsstatus als Qualitätsmerkmal der bovinen Eizelle................................58

5.4 Zona pellucida in bovinen Oocyten...........................................................................62

5.5 Vergleichsmöglichkeiten zwischen humaner und boviner Zona pellucida............65

6 ZUSAMMENFASSUNG.........................................................................67 7 SUMMARY..............................................................................................70 8 LITERATURVERZEICHNIS...............................................................73

9 ANHANG.................................................................................................97 9.1 Material........................................................................................................................97

9.1.1 Reagenzien....................................................................................................................97

9.1.2 Zusammengesetzte Reagenzien....................................................................................98

9.1.3 Verbrauchsmaterialien..................................................................................................99

9.1.4 Geräte..........................................................................................................................100

9.1.5 Software......................................................................................................................100

9.2 Abbildungsverzeichnis..............................................................................................101

9.3 Tabellenverzeichnis...................................................................................................102

Abkürzungsverzeichnis


Abb. Abbildung

Abs. Absorption

AM Acetomethylester

ART Assisted Reproductive Technology

BCB Brilliant Cresyl Blue

BSA Bovines Serumalbumin

c centi

°C Grad Celsius

Ca Calcium

cAMP Cyclisches AdenosinMonoPhosphat

Cai intrazelluläres Calcium

cdc2 Cell-Division-Cycle-Gene 2

COC Cumulus-Oocyten-Komplex

CR1aa Kulturmedium nach Charles Rosenkrans

cRNA complementary RNA

CSF Cytostatic Factor

d Tag

dd bidestilliert

DMAP 6-Dimethylaminopurin

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

D-PBS Dulbecco’s Phosphate buffered Saline

Emis. Emission

FSH Follikel stimulierendes Hormon

g Gramm

GnRH Gonadotropin Releasing Hormon

G6PDH Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase

GV GerminalVesikel


GVBD GerminalVesicle BreakDown

h Stunde

hCG humanes Choriongonadotropin

HEPES N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N’-[Ethansulfonsäure]

hMG humanes Menopausalgonadotropin

ICSI Intracytoplasmatische Spermieninjektion

IE Internationale Einheit

IU International Unit

IP3 Inositol-1,4,5-Trisphosphat

IVM In vitro Maturation

IVF In vitro Fertilisation

IVP In vitro Produktion

l Liter

LH Luteinisierendes Hormon

M Molar

m Meter

m milli

min Minuten

µ micro

MAP Mitogen Aktivated Protein

MPF Maturation Promoting Factor

mRNA messenger RNA

MTOC Mikrotubulusorganisationszentrum

p pico

p Probabilität (Irrtumswahrscheinlichkeit)

PLCζ Phospholipase C zeta

p.ins. post inseminationem

p.ov. post ovulationem

PVP Polyvinylpyrrolidon

RNA Ribonukleinsäure

s Sekunde


SD Standardabweichung

Tab. Tabelle

TCM Tissue Culture Medium

vs. versus

WHO World Health Organization

x Mittelwert

ZP Zona pellucida

Einleitung 1

1 Einleitung Der maternale wie auch der paternale Gamet sind hochdifferenzierte Zellen und Ursprung

eines jeden Individuums. Im Gegensatz zur kontinuierlichen Spermiogenese ist der

Gametenpool im Ovar jedoch von Geburt an limitiert. Bereits Anfang des 20. Jahrhunderts

wurde die besondere Bedeutung der Eizelle für die frühembryonale Entwicklung erkannt und

postuliert, dass die Embryogenese schon während der Oogenese beginnt. Um erfolgreich von

einem Spermatozoon befruchtet zu werden, muss die Oocyte vorher einen komplexen

Reifungsprozess durchlaufen. Dabei wird einerseits die Meiose eingeleitet und der diploide

Chromosomensatz reduziert, was auch als nukleäre Maturation definiert wird. Parallel dazu

findet andererseits die cytoplasmatische Maturation statt, die sich in einer Vielzahl von

molekularen und strukturellen Veränderungen im und um das Ooplasma widerspiegelt.

Können die Maturationsvorgänge nicht koordiniert ablaufen, kann die Eizelle nicht

physiologisch auf das Spermatozoon reagieren.

Nachdem 1978 mit der Geburt von Louise Brown die extrakorporale Fertilisation Realität

wurde, hat sich die Reproduktionsmedizin stetig weiter entwickelt. Doch obwohl mit

Etablierung der intracytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) die assistierte Reproduktion

zusätzlich revolutioniert wurde (PALERMO et al. 1992), liegt die durchschnittliche klinische

Schwangerschaftsrate in Deutschland bei etwa 28 % und die letztendlich entscheidende Baby-

take-home-Rate bei ca. 18 % (FELBERBAUM et al. 2007). Um dies weiter zu optimieren,

liegt ein Schwerpunkt der Forschung auf der Suche nach objektiven Beurteilungskriterien der

Eizell-Qualität. Ein prognostischer Marker zur Identifizierung der Eizelle mit dem höchsten

Entwicklungspotential könnte idealerweise zur Geburt eines Kindes nach Transfer nur eines

Embryos führen, was zudem die Mehrlingsproblematik egalisieren würde.

Auch in der Veterinärmedizin gewinnen seit der Geburt des ersten in vitro produzierten

Kalbes im Jahr 1982 die biotechnologischen Verfahren immer mehr an Bedeutung. Die in

vitro Produktion boviner Embryonen ermöglicht durch die verstärkte Nutzung genetisch

bedeutender weiblicher Tiere einen schnelleren züchterischen Fortschritt und ist

Ausgangspunkt für weitere Biotechniken sowie Basisforschung. Die durchschnittlich

erreichte Blastozystenrate von 25 bis 40 % könnte durch eine effiziente Selektion der

qualitativ guten Eizellen mit Hilfe eines prognostischen Kriteriums weiter optimiert werden.

Einleitung 2

Die Polarisationsmikroskopie ermöglicht die non-invasive Darstellung von hoch geordneten

und damit optisch anisotropen Molekülverbänden. Durch eine weiter entwickelte Technologie

ist in den letzten Jahren die klinische Anwendung in der assistierten Reproduktion möglich

geworden.

Visualisierbar in polarisiertem Licht ist die meiotische Spindel der Eizelle (Hamster, Maus,

Mensch, Rind: LIU et al. 2000a), essentiell für die korrekte Chromosomensegregation und

zusammen mit einem abgeschnürten ersten Polkörper morphologisches Zeichen der maturen

Eizelle. In der Literatur wird sie überwiegend mit einer höheren Fertilisations- und

Entwicklungsrate assoziiert (Mensch: WANG et al. 2001a). Trotzdem wird die qualitative

und prognostische Bedeutung hinsichtlich des Entwicklungspotentials diskutiert. Ein Grund

für widersprüchliche Ergebnisse könnte in der statischen Erfassung dieser dynamischen

Struktur liegen.

Licht- und polarisationsmikroskopisch darstellbar ist die extrazelluläre Zona pellucida, eine

Syntheseleistung des Cytoplasmas der heranreifenden Eizelle (Hamster: KEEFE et al. 1997,

Mensch: PELLETIER et al. 2004). In polarisiertem Licht ist ihre konzentrische Schichtung

erkennbar. In zwei retrospektiven humanmedizinischen Studien wurden die

doppelbrechenden Eigenschaften der inneren Zonaschicht mit Blastozystenrate und Gravidität

korreliert (RAMA RAJU et al. 2007, SHEN et al. 2005). Somit könnte die polarisations-

mikroskopische Analyse der Zona pellucida eine klinisch anwendbare Möglichkeit zur

Beurteilung der Eizell-Qualität sein.

Ziel dieser Arbeit war es zum einen, die meiotische Spindel humaner und boviner Eizellen als

qualitativen Marker der nukleären Maturation zu untersuchen. Dazu wurde

polarisationsmikroskopisch die Spindeldynamik analysiert und die Auswirkung der Eizell-

Aktivierung in Abhängigkeit vom Meiose-Stadium beobachtet. Zum anderen sollte geprüft

werden, ob die humane und bovine Zona pellucida durch eine Beurteilung in polarisiertem

Licht ein Kriterium für die cytoplasmatische Maturation und damit Eizell-Qualität ist. Hierfür

wurde eine prospektive Studie an humanen Oocyten durchgeführt. Außerdem wurde die

bovine Zona pellucida in unterschiedlichen Stadien der Maturation objektiv beurteilt und mit

der frühembryonalen Entwicklung nach in vitro Fertilisation (IVF) sowie nach

parthenogenetischer Aktivierung in Relation gesetzt.

Literaturübersicht 3

2 Literaturübersicht 2.1 Oogenese Die Oogenese beschreibt die Entstehung von haploiden Oocyten aus diploiden Urkeimzellen

und gliedert sich in eine Periode der mitotischen Vermehrung und eine Phase der meiotischen

Differenzierung (PSCHYREMBEL 1994, LÜLLMANN-RAUCH 2003).

Die Entwicklung beginnt bereits während den ersten Furchungsteilungen durch die Bildung

des „germinativen Plasmas“ in einigen Blastomeren, aus dem die Urkeimzellen hervorgehen

(PICTON u. GOSDEN 1995). Diese Primordialkeimzellen, die sich durch ihre Morphologie

(Größe, große Nucleus/Cytoplasma-Relation) sowie einen hohen Gehalt an alkalischer

Phosphatase und Glykogen von den kleineren somatischen Zellen unterscheiden, sind bei

Mammaliae zunächst extragonadal im Dottersackentoderm lokalisiert (LEICHTHAMMER et

al. 1990). Vorwiegend durch amöboide Bewegung wandern sie in die Gonadenanlage ein –

beim menschlichen Embryo bis zum Ende der 4. Woche (SCHNORR u. KRESSIN 2006).

Dort erfolgen im Cortex neben der Differenzierung zu Oogonien weitere mitotische

Teilungen. Noch pränatal treten die Oogonien in die Prophase der ersten meiotischen Teilung

ein und werden dann als primäre Oocyten definiert, die mitotisch inaktiv sind. Damit ist die

Gesamtzellzahl an weiblichen Keimzellen festgelegt; sie wird beim Mensch im 5. Monat der

Gravidität mit einem Maximum von ca. 7 Millionen angegeben (LÜLLMANN-RAUCH

2003). Bis zur Geburt hat sich diese Zahl durch kontrollierten Zelluntergang bereits auf etwa

eine Million vermindert (BAKER 1982, HIMELSTEIN-BRAW et al. 1976). Die primären

Oocyten arretieren über Jahre im Diplotän-Stadium der Prophase I (Germinalvesikel-

Stadium), bis die präovulaturische Follikelreifung durch postpuberale hormonelle Einflüsse

einsetzt. Während dieses Diktyotäns sind die Eizellen bei Mensch und Rind etwa 30 bis 50

µm groß und von einschichtigen flachen Epithelzellen sowie einer Basalmembran umgeben.

Diese funktionelle Einheit wird als Primordialfollikel bezeichnet. Während der reproduktiven

Lebensphase wird jeweils ein Teil der Primordialfollikel für die weitere Follikulogenese

rekrutiert. Das einschichtige Follikelepithel wird kubisch bis hochprismatisch

(Primärfollikel), schließlich mehrschichtig (Sekundärfollikel) und bildet Liquor follicularis

(Tertiärfollikel; BUCHER u. WARTENBERG 1989). Die Eizelle selbst zeichnet sich durch


eine sehr hohe Syntheseleistung und einen regen Metabolismus aus. Morphologisch zeigt sie

eine mehr als 100-fache Volumenzunahme. In dieser Phase wird außerdem die extrazelluläre

Zona pellucida gebildet (WASSARMAN u. ALBERTINI 1994, ERICKSON 1986,

GOUGEON 1996). Im ovulationsfähigen Graafschen Follikel wird durch die präovulatorische

LH-Freisetzung (Luteinisierendes Hormon) die Meiose I fortgesetzt; dabei entsteht durch

ungleiche Cytokinese die sekundäre Oozyte mit einem haploiden Chromosomensatz und der

erste Polkörper (TSAFRIRI et al. 1982). Es folgt der Beginn der zweiten meiotischen Teilung,

die im Metaphase II-Stadium arretiert. Die Ovulation erfolgt, und die Eizelle mit umgebenden

Cumuluszellen (Cumulus-Oocyten-Komplex, COC) gelangt in die Tuba uterina (SCHNORR

u. KRESSIN 2006). Physiologisch wird die Eizelle erst durch ein penetrierendes

Spermatozoon aktiviert, was den Abschluss der Meiose II mit Abschnürung des zweiten

Polkörpers initiiert (THIBAULT et al. 1987). Bei den monoparen Spezies Rind und Mensch

gelangt in der Regel nur ein Follikel pro Zyklus zur Ovulation, die anderen verfallen der

Atresie (BYSKOV 1978).

2.2 Maturation und ihre Regulation

Die Zeitspanne von der Aufhebung des 1. meiotischen Arrests mit beginnender Auflösung der

Kernmembran (GVBD, Germinal Vesicle Breakdown) bis zum 2. Arrest wird als Maturation

definiert. Während dieser Phase finden sowohl die nukleären als auch die finalen

cytoplasmatischen Reifungsprozesse statt, die die Eizelle zur Fertilisation und der weiteren

embryonalen Entwicklung befähigen (CARROLL et al. 1996, TROUNSON et al. 2001,

SIRARD et al. 2006).

Es ist inzwischen allgemein anerkannt, dass ein hoher intrazellulärer cAMP-Spiegel den

primären Arrest aufrechterhält (CONTI et al. 2002). Hingegen sind die fein aufeinander

abgestimmten regulativen Mechanismen der Maturation seit Jahren zentraler Schwerpunkt der

Forschung (FULKA et al. 1998, TROUNSON et al. 2001, MEHLMANN 2005). Es scheint,

dass hier der zentrale Regulationsweg im Tierreich im Verlauf der Evolution konserviert

wurde, jedoch existieren diverse speziesspezifische Unterschiede in den komplexen

molekulären Kaskaden (FULKA et al. 1998, SIRARD et al. 2006).


2.2.1 Nukleäre Maturation

In vivo wird die Wiederaufnahme der Meiose durch den präovulatorischen LH-Peak

ausgelöst. Über LH-Rezeptoren findet eine Signaltransduktion statt, die zur Phosphorylierung

von Connexin43-Proteinen führt. Dadurch wird die Kommunikation zwischen Oocyte und

Cumuluszellen über die Gap Junctions mehr und mehr reduziert (GRANOT u. DEKEL 1994,

2002). Der intrazelluläre cAMP-Level sinkt. Dies bedingt die Aktivierung des Maturation

Promoting Factor (MPF). Der MPF ist ein Serin-Threonin-Kinase-Heterodimer und wurde

bereits vor 37 Jahren identifiziert (MASUI u. MAKERT 1971). Eine Untereinheit bildet die

enzymatische Komponente (p34cdc2), eine die regulatorische (Cyclin B). Die Aktivierung

erfolgt neben der Assoziation über eine Dephosphorylierung von p34cdc2 und einer

Phosphorylierung von Cyclin B (GAUTIER et al. 1990, CLARKE u. KARSENTI 1991).

Über weitere Zwischenschritte initiiert der MPF den GVBD, die Kondensation des

Chromatins und die progressive Organisation von Mikrotubuli zu einer bipolaren Spindel

(MURRAY u. HUNT 1993). Außerdem wird die Transkription durch Inhibition der RNA-

Polymerase II minimiert (CISEK u. GORDEN 1989). Beim Übergang in die Telophase I wird

die MPF-Aktivität durch proteolytischen Abbau von Cyclin B und Dissoziation der

Untereinheiten kurzzeitig drastisch reduziert (CHOI et al. 1991, WINSTON 1997). Dies wird

durch einen Kontrollmechanismus bewirkt, der in der Literatur „Spindle assembly

checkpoint“ genannt wird (FULKA et al. 1998, BRUNET u. MARO 2005). Durch

Enzyminhibierung wird die Cyclin B-Degradation verhindert, bis die Chromosomen korrekt

in der Metaphase-Position und über die Kinetochore mit Spindelfasern assoziiert sind. Dann

folgt die Aufhebung der Inhibierung und so die Degradation von Cyclin B, was die

Abschnürung des ersten Polkörpers möglich macht (LEDAN et al. 2001, HERBERT et al.

2003). Anschließend steigt die MPF-Aktivität durch die Synthese von Cyclin B wieder. Für

die Beibehaltung des hohen Niveaus von aktivem MPF spielt beim 2. Arrest das Proto-

Onkogen c-mos eine Rolle. Es kodiert eine Serin-Threonin-Protein-Kinase, die Cyclin B

phosphoryliert und die Mitogen-activated Protein Kinase (MAP-Kinase) aktiviert. Außerdem

wird ihr eine positive Interaktion mit dem CSF (Cytostatic factor) zugeschrieben, so dass sie

über mehrere Effekte zum Arrest beiträgt (ROY et al.1990, 1996). Der CSF ist ebenfalls ein

Faktor, der den MPF während des Arrestes stabilisiert (TROUNSON et al. 2001). Die MAP-

Kinase-Aktivität nimmt langsamer zu als die MPF-Aktivität. Es ist eine Serin-Threonin-


Kinase, die primär extrazellulär über eine Proteinkinase-Kaskade reguliert wird. Ihr kommt

verstärkend zum MPF eine Rolle bei der Assozitation der Spindel und der Mikrotubuli-

Dynamik sowie der Kondensation der Chromosomen zu (VERLHAC et al. 1993, DEDIEU et

al. 1996). So verbleibt die Eizelle post ovulationem (p.ov.) bis zu ihrer Aktivierung im

Metaphase II-Arrest.

In vitro fehlt der initiale Stimulus von LH, jedoch wurde schon 1935 nachgewiesen, dass

Eizellen spontan den Arrest überwinden können (PINCUS u. ENZMANN 1935). Bei der

Spezies Rind haben Eizellen mit einem Eizell-Durchmesser ab 100 µm aus antralen Follikeln

die Fähigkeit, die Maturation in vitro zu vollenden. Präantrale Follikel besitzen diese

Fähigkeit nicht (FAIR et al. 1995). Es wird postuliert, dass das Follikelmilieu einen

inhibitorischen Einfluss ausübt, bis neben den nukleären auch die cytoplasmatischen

Veränderungen so weit abgeschlossen sind, dass die Eizelle bereit für die Befruchtung und die

Entstehung eines neuen Individuums ist (RICHARD u. SIRARD 1996, RODRIGUEZ u.

FARIN 2004).

2.2.2 Cytoplasmatische Maturation

Die vorbereitenden Ereignisse im Ooplasma sind ebenso bedeutend wie die korrekte

Reduktion des Chromosomensatzes während der Meiose. Viele der Reaktionen sind jedoch

lichtmikroskopisch nicht zu erkennen (SIRARD et al. 2006).

Durch eine hohe Transkription findet eine Akkumulation von RNA, insbesondere mRNA

statt. Mit Aufhebung des 1. Arrests wird die RNA-Synthese durch die steigende Aktivität des

MPF blockiert. Die Regulation der Translation findet vorwiegend über die Länge der

Polyadenylierung statt. So wird kontrolliert ein Pool diverser Proteine hergestellt. Es findet

eine Umorganisation der Zellorganellen statt; die Zahl der Mitochondrien steigt, Cortical-

Granula werden gebildet. Ca2+-Speicher werden im endoplasmatischen Retikulum angelegt

und gegen Ende der Maturation peripher in die Cortikalregion umgelagert, parallel dazu

findet eine Konzentraion von membranständigen Inositol-1,4,5-Trisphosphat-Rezeptoren (IP3-

Rezeptoren) statt (SHIRAISHI et al. 1995). Zusätzlich zum zellinternen Metabolismus gibt es

einen Austausch mit den somatischen Zellen des Follikels (WASSERMANN u. ALBERTINI

1994, FAIR et al. 1995, RICHARD u. SIRARD 1996).


Durch die Gesamtheit dieser Prozesse wird so die Basis nicht nur für die Aktivierung der

Eizelle, sondern auch für die spätere embryonale Genom-Aktivierung und Entwicklung gelegt

(SIRARD et al. 2006).

2.3 Aktivierung 2.3.1 Physiologische Aktivierung

In vivo findet die Befruchtung durch ein Spermatozoon in der Eileiterampulle statt. Dieses

wird durch die Kapazitation befähigt, an einen Rezeptor der Zona pellucida zu binden und

durch die anschließende Akrosomenreaktion in den perivitellinen Spalt vorzudringen. Mit der

Anlagerung an das Oolemm und der Fusion der Zellmembranen im postakrosomalen Bereich

gelangt zum einen der paternale haploide Chromosomensatz in die Eizelle (YANAGIMACHI

1994), zum anderen induziert eine spermienspezifische Isoform der Phospholipase C (PLCζ)

die Aktivierung der arretierten Eizelle.

Die PLCζ katalysiert die Hydrolyse eines Phospholipids, bei der IP3 produziert wird.

(SAUNDERS et al. 2002). IP3 bindet an IP3-Rezeptoren, was zu einer Ca2+-Freisetzung aus

den intrazellulären Ca2+-Speichern führt. Über positive Feedbackmechanismen wird die

Reaktion verstärkt, so dass es zu Ca2+-Oszillationen kommt, die beim Rind bis zur Einleitung

des mitotischen Zellzyklus’ anhalten (NAKADA et al. 1995). Diese Ca2+-Oszillationen

steuern über Enzymaktivierungskaskaden die Aufhebung des Metaphase II-Arrests. Die MPF-

Aktivität sinkt, die zweite meiotische Reifeteilung wird vollendet. Die Exocytose der

Cortikal-Granula bewirkt innerhalb von Minuten eine Modifikation der Zona pellucida, was

zum Polyspermie-Block führt (ABBOTT u. DULCIBELLA 2001, BLEIL u. WASSARMAN

1981). Das paternale Chromatin dekondensiert; Protamine werden durch maternale Histone

ersetzt. Paternaler und maternaler Vorkern formieren sich. Mit ihrer Verschmelzung entsteht

die Zygote und der Beginn der embryonalen Entwicklung (SCHULTZ u. KOPF 1995).

Analog zur Maturation sind auch die zellulären und molekularen Ereignisse im Verlauf der

Eizell-Aktivierung noch nicht völlig entschlüsselt; beim Rind scheint im Vergleich zur Maus

die MAP-Kinase eine wichtigere Funktion auszuüben (MALCUIT et al. 2006, LEE et al.

2006).


2.3.2 Artifizielle Aktivierung

In vitro kann eine parthenogenetische Aktivierung, d.h. eine Eientwicklung ohne Beteiligung

eines Spermiums (REMANE et al. 1985), durch physikalische oder chemische Stimuli

ausgelöst werden (YANAGIMACHI 1994). Im Rahmen moderner Reproduktionstechniken

(ICSI, Klonierung) hat die künstliche Aktivierung von Eizellen in den letzten Jahren immer

mehr an Bedeutung gewonnen.

In der Humanmedizin werden Ca2+-Ionophore eingesetzt, die Ca2+-Ionen über die

Zellkompartimente hinweg durch Lipidmembranen transportieren, so dass es zu einer Ionen-

Umverteilung kommt und die intrazelluläre Ca2+-Konzentration steigt. Obwohl Ca2+-

Ionophore keine Ca2+-Oszillationen hervorrufen, reicht der initiale Ca2+-Anstieg im

Ooplasma, um die Aktivierungsereignisse auszulösen (OZIL u. SWANN 1995,

STEINHARDT et al. 1974, SCHULTZ u. KOPF 1995, NAKADA u. MIZUMO 1998,

WINSTON et al. 1991). Laborinterne Daten (MONTAG et al. 2005) und Einzelfall-

Veröffentlichungen (ELDAR-GEVA et al. 2003, HEINDRYCKX et al. 2005) zeigen, dass

Ca2+-Ionophore nach ICSI bereits erfolgreich bei Patienten mit schlechten Befruchtungsraten

eingesetzt werden.

Bei der Spezies Rind wurde eine Vielfalt an Methoden getestet, um die Parthenogenese nach

artifizieller Aktivierung zu optimieren. Mit physikalischen Stimuli in Form von elektrischen

Pulsen kann eine Aktivierung boviner Eizellen induziert werden, jedoch ist die weitere

parthenogenetische Entwicklung nicht zufriedenstellend (KONO et al. 1989). Eine Erhöhung

des intrazellulären Ca2+-Spiegels gelingt darüber hinaus auf chemischem Weg mit dem

Einsatz von Ethanol (NAGAI et al. 1987), Strontium (WANG et al. 2007), Ca2+-Ionophore

(SHI et al. 1993) oder auch das spezifischere Ionomycin (RHO et al. 1998). Dabei wirkt

Ethanol über eine verstärkte Bildung von IP3, Strontium induziert multiple Ca2+-Wellen über

eine intrazelluläre Ca2+-Freisetzung, vermutlich gekoppelt mit Ca2+-Verlagerungen innerhalb

der Eizell-Kompartimente (ALBERIO et al. 2001). Eine vergleichende Untersuchung von

WANG et al. (2007) zeigt allerdings, dass mit Blastozystenraten von etwa 5 % diese Form der

parthenogenetischen Aktivierung zu ineffizient ist. Ein weiterer Ansatzpunkt bietet sich über

eine unspezifische Hemmung der Proteinsynthese durch Cycloheximid (SHI et al. 1993).

Durch die fehlende Neusynthese von Cyclin B wird der Plasmaspiegel von aktivem MPF

gesenkt und damit der Metaphase II-Arrest aufgehoben. Gute Ergebnisse werden dabei in


kombinierten Aktivierungsprotokollen mit Ethanol unter Zugabe von Cytochalasin B, das die

Extrusion des zweiten Polkörpers verhindert, erzielt (PRESICCE u. YANG 1994, WANG et

al. 2007). Etabliert hat sich außerdem eine Kombination aus Ca2+-Ionophor und 6-

Dimethylaminopurin (DMAP, RHO et al. 1998, WANG et al. 2007). DMAP ist ein Serin-

Threonin-Proteinkinase-Inhibitor (RIME et al. 1989). Als Mediumzusatz im GV-Stadium

wird der GVBD durch Hemmung der MPF- und MAP-Kinase-Aktivierung reversibel

verhindert. Die artifizielle Verlängerung der Prämaturationsphase soll der Eizelle in vitro

mehr Zeit geben, cytoplasmatische Reifungsprozesse abzuschließen (LIU et al. 1998,

ANDERIESZ et al. 2000a). Allerdings ist hier zu beachten, dass die Inkubation in DMAP

direkt nach Ca2+-Ionophor-Gabe zu einer Aktivierung ohne Abschnürung des zweiten

Polkörpers führt, d.h. beide Schwester-Chromatiden verbleiben im parthenogenetischen

Embryo (SZÖLLÖSI et al. 1993, SUSCO-PARRISH et al. 1994). Nachteilig an

Cycloheximid wie auch zu einem geringeren Grad an DMAP ist ihre unspezifische

Inhibierung, so dass die Entwicklung durch weitere inaktive Enzyme negativ beeinflusst

werden kann (ALBERIO et al. 2001). Um diese unerwünschte Nebeneffekte zu verhindern,

werden selektivere Proteinkinase-Inhibitoren wie Butyrolacton I und Purinanaloga (Bohemin,

Roscovitin) eingesetzt (ALBERIO et al. 2000 u. 2001).

Die entwickelten Aktivierungsprotokolle finden ihre Anwendung beim Rind insbesondere

beim somatischen Kerntransfer. Zum einen werden hier parthenogenetisch aktivierte Oocyten

als Kontrollgruppe genutzt, zum anderen müssen die rekonstruierten Kerntransferkomplexe

für eine weitere Entwicklung artifiziell aktiviert werden. Insgesamt hat sich gezeigt, dass eine

zeitlich versetzte Aktivierung nach der elektrisch eingeleiteten Fusion bessere

Entwicklungsraten bewirkt (LIU et al. 2001). Erfolgreich eingesetzt werden dabei

kombinierte Verfahren von Ca2+-Ionophor bzw. Ionomycin mit DMAP (CIBELLI et al. 1998,

WELLS et al. 1999, WRENZYCKI et al. 2001b, VAJTA et al. 2003) sowie Ethanol mit

Cycloheximid/Cytochalasin B (ZAKHARTCHENKO et al. 1999, BRÜGGERHOFF et al.

2002). GALLI et al. (2002) verglichen beide Methoden und konnten dabei keine signifikanten

Unterschiede nachweisen. Ebenso konnte mit den spezifischeren Proteinkinase-Inhibitoren

(Butyrolacton I, Bohemin) keine Verbesserung hinsichtlich Trächtigkeits- sowie

Überlebensrate erreicht werden (ALBERIO et al. 2001). Ein neuer Ansatz mit einer

Kombination von Ionomycin und Strontium wurde von YAMAZAKI et al. (2005)


veröffentlicht. Über eine erfolgreiche Aktivierung im Rahmen des somatischen Kerntransfers

wurde zudem nach Injektion eines porcinen Spermienfaktors in bovine Oocyten berichtet,

obwohl die Effizienz gering war (KNOTT et al. 2002). Da auch bei humanen Oocyten nach

Injektion von humaner PLCζ cRNA eine parthenogenetische Entwicklung beobachtet werden

konnte, könnte dies ein vielversprechender Ansatz sein, um sich der physiologischen

Aktivierungskaskade anzunähern (ROGERS et al. 2004).

2.4 Frühembryonale Entwicklung Mit der Syngamie beginnt die embryonale Entwicklung. Bei Mammaliae erfolgt die Furchung

total adäqual, allerdings nicht immer synchron. Da der Embryo zunächst nicht an Größe

zunimmt, werden die Blastomeren zunehmend kleiner. Dadurch nähert sich die bei Zygoten

niedrige Relation zwischen Nucleus und Cytoplasma an das Verhältnis in somatischen Zellen

an.

Bovine Embryonen durchlaufen nach etwa 2 Tagen die erste Furchung, nach etwa 4 Tagen

wird das 8-Zell-Stadium erreicht. Nach 5 bis 6 Tagen gelangt der Embryo über den

Eileiteristhmus in das ipsilaterale Cornu uteri. Aus den weiteren Zellteilungen geht dabei die

Morula hervor, die zunächst ein Zellkonglomerat mit unregelmäßiger Oberfläche darstellt.

Während der Kompaktierung flachen die äußeren Blastomeren ab; interzelluläre Tight

junctions werden gebildet. Die Differenzierung in zwei Zellpopulationen setzt ein. Aus den

innen lokalisierten Zellen, der sogenannten Inneren Zellmasse (ICM), entwickelt sich der

größte Teil zum eigentlichen Embryo. Die äußeren Zellen werden als Trophektoderm

bezeichnet, aus denen später das Fruchthüllenepithel hervorgeht. Über Ionengradienten erfolgt

ein Influx von Flüssigkeit und damit die Bildung des Blastocoels. Das Blastozystenstadium

wird nach 7 bis 8 Tagen erreicht. Nach einer vorangehenden Expansion schlüpft die

Blastozyste im mittleren Uterushornabschnitt etwa am neunten Tag der Gravidität aus der

Zona pellucida (Hatching), wobei die kugelige Form zunächst beibehalten wird. An Tag 13

beginnt der Embryo zu elongieren und an Tag 18/19 sich zu implantieren. Bis zum 22. Tag

der Trächtigkeit ist das Wachstum so weit fortgeschritten, dass die elongierte Blastozyste als

langes, fadenförmiges Gebilde auch das nicht gravide Uterushorn ganz ausfüllt. Der


embryomaternale Dialog, essentiell für die Aufrechterhaltung der Gravidität, setzt dagegen

schon zu einem früheren Zeitpunkt ein (SCHNORR u. KRESSIN 2006, VAN SOOM u. DE

KRUIF 1996, MICHEL 1995, RÜSSE 1998).

Die menschliche präimplantative Entwicklung ist etwas schneller als die des Rindes. So

gelangt der Embryo in vivo ca. 4 Tage p.ov. in den Uterus. Der Embryotransfer beim Mensch

findet in Deutschland überwiegend am Tag 3 statt, wenn in der Regel das 8-Zell-Stadium

erreicht ist. Da in manchen Ländern die Selektion an Embryonen legal ist, wird dort am Tag 5

im Blastozystenstadium transferiert. Dies ist allerdings aufgrund der längeren in vitro

Kultivierung nicht unumstritten. Der humane Embryo schlüpft implantationsnah bereits am

Tag 5 bis 6 aus der Zona pellucida, die Einnistung ist Ende der zweiten

Schwangerschaftswoche abgeschlossen (LÜTJEN-DRECOLL 1996, LÜLLMANN-RAUCH

2003, MONTAG u. VAN DER VEN 2002a).

Speziesübergreifend ist die frühembryonale Entwicklung ein komplexer Prozess, der durch

die fein choreographierte Expression der relevanten Gene reguliert wird. Dabei zeigt sich die

Bedeutung der cytoplasmatischen Maturation, da bis zur Aktivierung des embryonalen

Genoms die akkumulierten maternalen mRNAs und Proteine unerlässlich sind (TELFORD et

al. 1990, WRENZYCKI et al. 2007, MINAMI et al. 2007). Auch das Vorhandensein

paternaler mRNA wurde nachgewiesen (OSTERMEIER et al. 2004). Die Phase des

Übergangs von der maternalen auf die embryonale Expression (maternal-embryonic

transition) wird beim Menschen im 4- bis 8-Zell-Stadium beschrieben (BRAUDE et al. 1988).

Bei der genauer untersuchten bovinen Spezies erfolgt die Hauptaktivierung (major activation)

im 8- bis 16-Zell-Stadium (TELFORD et al. 1990), wobei schon in der Zygote eine erste

„kleine“ Aktivierung (minor activation) beobachtet werden kann (MEMILI u. FIRST 2000).

Insbesondere im Hinblick auf die Tatsache, dass die Bedingungen im Verlauf der in vitro

Kultivierung grundlegenden Einfluss auf das embryonale Expressionsmuster haben, bedarf es

für das weitere Verständnis und Verbesserung der Biotechniken noch weiterer Forschung

(NIEMANN u. WRENZYCKI 2000, LONERGAN et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2004).


2.5 Meiotische Spindel

2.5.1 Physiologische Grundlagen

Die meiotische Spindel ist wie jene der Mitose aus Mikrotubuli aufgebaut. Diese sind

Polymere aus Tubulin, das seinerseits ein Dimer aus einer α- und β-Tubulin-Untereinheit

darstellt. Durch eine helikale Anordnung entsteht eine röhrenartige Struktur. Initiationsorte

des Mikrotubuluswachstums sind die Mikrotubulusorganisationszentren (MTOCs), wobei die

Polymerisation der Tubulineinheiten ein energiefordernder Prozess ist. Astral von den

MTOCs ausgehend herrscht an den exponierten Enden spontan eine rege Dissoziation oder

Assoziation, bis durch ein chromosomales Kinetochor eine Stabilität erzeugt wird. Durch

diese dynamische Instabilität kann die Spindel einerseits ihre Funktion, die korrekte Trennung

der Chromosomen bzw. Chromatiden, ausüben; andererseits ist sie so anfällig gegenüber

Temperatur und pH-Veränderungen (STRYER 1990, WANG et al. 2001c, AMAN u. PARKS

1994). Auch ein mangelnder Energiemetabolismus kann eine Polymerisierung der

Mikrotubuli verhindern (ZENG et al. 2007). Eine Spindeldysfunktion kann zu anomalen

Chromosomensegregationen und damit Aneuploidien führen (EICHENLAUB-RITTER 2002,

WANG u. KEEFE 2002).

Die Struktur der Spindel wird als bipolar und symmetrisch beschrieben, jedoch existieren

auch Formen, die sich fassartig mit flachen Spindelpolen darstellen und bei der Maus

vermehrt bei in vitro maturierten Eizellen auftreten. Sowohl die humane als auch die bovine

Spindel sind kleiner als die der Maus. Die flachen Pole werden durch die vermehrte Anzahl

von MTOCs in der meiotischen Spindel erklärt (SANFINS et al. 2003, KIM et al. 2000,

EICHENLAUB-RITTER 2002). Postovulatorisch nicht fertilisierte Eizellen zeigen im Laufe

der Zeit durch degenerative Prozesse abnorme oder dissoziierte Spindeln (LIU et al. 2000a,

SUN et al. 2004).

1975 zeigten SATO et al., dass die meiotische Spindel aufgrund ihrer optischen Anisotropie

in polarisiertem Licht darstellbar ist. Die weiter entwickelte Technologie der

Polarisationsmikroskopie ermöglicht inzwischen nicht nur die non-invasive Untersuchung in

vitalen Eizellen, sondern auch die Einsetzbarkeit in der Routine der assistierten Reproduktion.

Die Spindel kann durch die neuen Technologien nicht nur qualitativ, sondern auch quantitativ


erfasst werden. Dabei ist die Stärke der Doppelbrechung direkt proportional zur Mikrotubuli-

Dichte und kann metrisch in Nanometern berechnet werden (OLDENBOURG et al. 1998).

2.5.2 Bedeutung der Spindelpräsenz

Die Metaphase II-Spindel spiegelt gemeinsam mit dem ersten Polkörper die nukleäre

Maturation wider. Zahlreiche Studien untersuchten, ob eine darstellbare Spindel zum

Zeitpunkt der ICSI positiv mit der Befruchtungsrate korreliert. Durchschnittlich lag der

Prozentsatz von spindel-positiven Eizellen zwischen 70 und 80 % und mit einer Ausnahme

(MOON et al. 2003) wurde ein Zusammenhang zwischen Spindelpräsenz und

Fertilisationsrate festgestellt (WANG et al. 2001a u. 2001b, RIENZI et al. 2003, COHEN et

al. 2004, GASSNER et al. 2004, SHEN et al. 2006, RAMA RAJU et al. 2007, MADASCHI et

al. 2007).

Bezogen auf die spätere Embryoqualität am Tag 3 fanden einige Arbeitsgruppen eine positive

Korrelation mit einer sichtbaren Metaphase II-Spindel (WANG et al. 2001a, COOKE et al.

2003, MOON et al. 2003, MADASCHI et al. 2007), die jedoch von anderen Studien nicht

belegt werden konnte (RIENZI et al. 2003, COHEN et al. 2004). RAMA RAJU et al. (2007)

wiesen bei visualisierbaren Spindeln eine höhere Blastozystenrate am Tag 5 nach.

Die Aussagekraft der Spindelpräsenz auf die spätere Graviditätsrate ist umstrittener. Es wurde

eine Studie veröffentlicht, die sie als prognostischen Marker beschreibt (MADASCHI et al.

2007), während hingegen zwei Veröffentlichungen keinen Zusammenhang sehen konnten

(GASSNER et al. 2004, CHAMAYOU et al. 2006).

Eine Abhängigkeit vom Patientenalter konnte mit der Spindelpräsenz nicht korreliert werden

(WANG et al. 2001a). Konfokalmikroskopische Untersuchungen (BATTAGLIA et al. 1996)

haben jedoch einen Zusammenhang sowohl zwischen abnormer Spindel als auch zwischen

abnormen Chromosomenanordnungen und zunehmendem Patientenalter ergeben.


2.5.3 Lokalisation der Spindel in der maturen Eizelle

Bei bisherigen Untersuchungen zur Spindellokalisation (RIENZI et al. 2003, COOKE et al.

2003) wurde außerdem deutlich, dass man lichtmikroskopisch nicht unbedingt von der Lage

des ersten Polkörpers auf die der Spindel rückschließen kann. Damit kann bei der

konventionellen ICSI eine mechanische Schädigung der Spindel nicht ausgeschlossen werden.

Bei einer Abweichung von mehr als 90° wurde eine niedrigere Fertilisationsrate beobachet

(RIENZI et al. 2003). COOKE et al. (2003) konnten im Vergleich zwischen konventioneller

ICSI und ICSI unter Berücksichtigung der Spindelposition eine bessere Embryoqualität

feststellen, jedoch keinen Zusammenhang mit der Befruchtungsrate herstellen. Die Ergebnisse

anderer Autoren zeigen, dass bei Spindel-schonender ICSI die Stärke der Abweichung keine

Rolle spielt (MOON et al. 2003) bzw. die Durchführung einer Spindelposition-kontrollierten

ICSI nicht zu besseren Befruchtungsraten und Embryoqualität führt (WOODWARD et al.

2008). Insgesamt ist die Bedeutung der Abweichung noch umstritten. Eine mögliche

Erklärung ist die perivitelline Verlagerung des Polkörpers durch die mechanische

Manipulation während des Denudierungspozesses (RIENZI et al. 2003).

2.5.4 Spindelmorphometrie

Die Aussagekraft der quantitativen Messungen der Spindellichtbrechung wird kontrovers

diskutiert.

Es gibt Studien, die einen positiven Zusammenhang zwischen Doppelbrechungsintensität und

Pronucleus-Score, Zellzahl der Tag 3-Embryonen sowie Blastozystenrate beschreiben (SHEN

et al. 2006, TRIMARCHI et al. 2004, RAMA RAJU et. al. 2007). Andere Autoren sehen eine

negative Korrelation zum Patientenalter, jedoch sind die Fallzahlen gering (DE SANTIS et al.

2005, SHEN et al. 2006). LIU et al. (2000b) und NAVARRO et al. (2005) konnten an

murinen Eizellen nach Aktivierung eine Intensitätszunahme der Doppelbrechung beobachten.

Für vergleichbare Messungen scheinen die Technik sowie der Zeitpunkt der Messung

essentiell (DE SANTIS et al. 2005).


2.5.5 Einfluss der in vitro Maturation

Die in vitro Maturation (IVM) ist verglichen mit den biotechnologischen Verfahren beim

Rind in der humanen assistierten Reproduktion noch nicht ausgereift. Die Aneuploidie-Rate

ist bei in vitro maturierten Eizellen hoch, was auf Störungen im Verlauf der Maturation durch

suboptimale Kultivierungsbedingungen hindeutet (LI et al. 2006). Es gibt Hinweise auf einen

möglichen Zusammenhang mit einer unzureichenden oder anomalen Spindelbildung, da nach

Hyperstimulation gewonnene, immature humane Eizellen im Anschluss an eine 3- bis 48-

stündigen in vitro Maturation mit etwa 50 % seltener eine Spindelpräsenz in der Metaphase II

zeigen (RIENZI et al. 2003, ZENG et al. 2007). Genauere Studien gibt es im murinen System,

wo deutliche Unterschiede in der Spindelorganisation existieren (SANFINS et al. 2003).

Analog zu der Bedeutung der Spindelpräsenz in der konventionellen ICSI wiesen PAES et al.

(2007) bei humanen in vitro maturierten Oocyten einen Zusammenhang zwischen

visualisierbarer Metaphase II-Spindel und Befruchtungsrate nach.

2.5.6 Polarisationsmikroskopische Studien über die bovine Spindel

LIU et al. (2000a) zeigten in ihrer grundlegenden Veröffentlichung zum Einsatz der

Polarisationsmikroskopie bei der Enukleation von Eizellen auch die Aufnahme einer bovinen

Eizelle. Sie konnten zeigen, dass eine Metaphase II-Spindel auch beim Rind trotz des hohen

Lipidgehalts der bovinen Oocyte auf diese Weise darstellbar ist. Weiterführende

polarisationsmikroskopische Studien sind in der Literatur nicht zu finden.

2.6 Zona pellucida

Die die Oocyte und den präimplantativen Embryo umgebende extrazelluläre Matrix wird

aufgrund ihrer lichtmikroskopischen Transparenz Zona pellucida (ZP) genannt. Sie ist nicht

nur während der Spermien-Eizell-Interaktion von unverzichtbarer Bedeutung, sondern bietet

bis zum Schlupf einen biomechanischen Schutz (WASSARMAN 1987, YANAGIMACHI

1994).


2.6.1 Morphologie und Genese der Zona pellucida

Mit Beginn des Eizellwachstums werden Zona pellucida-Proteine ohne Beteiligung der

Granulosazellen synthetisiert (EPIFANO et al. 1995). Die humane wie auch die bovine Zona

pellucida sind zu einem geringeren Grad auch eine Syntheseleistung der umgebenden

Follikelzellen (GROOTENHUIS et al. 1996, SINOWATZ et al. 2001). Während bei der Maus

3 codierende Gene für 3 ZP-Proteine (mZP1, mZP2, mZP3) identifiziert wurden, wird die

Zona bei Mensch und Rind von 4 ZP-Proteinen (Mensch: hZP1, hZP2, hZP3, hZP4 / Rind:

bZP1, bZP2, bZP3-α, bZP3-β, bZP4) und entsprechend 4 codierenden Genen gebildet

(WASSARMAN 1988, LEFIEVRE et al. 2004, TOPPER et al. 1997). Innerhalb des Tiereichs

weisen die Gensequenzen hohe Homologien auf (HARRIS et al. 1994); als Modell wurde

insbesondere die murine Zona intensiv untersucht. Aus glykolisierten ZP2 und ZP3 formieren

sich Dimere, die extrazellulär zu langen Ketten assoziieren und quer durch ZP1 vernetzt sind.

So wird speziesübergreifend eine dreidimensionale Glycoproteinschicht gebildet, die von

Granulosazellfortsätzen zur interzellulären Kommunikation durchsetzt ist (GREVE u.

WASSARMAN 1985, GREEN 1997). Beim Mensch ist die Zona ca. 20 µm dick, beim Rind

etwa 12 µm (PELLETIER et al. 2004, NAKAGAWA et al. 1991).

Elektronenmikroskopisch stellt sich bei Mensch und Maus die innere Oberfläche fein und

glatt dar, während die äußere Oberfläche bei maturen Eizellen als poröses, großmaschiges

Netzwerk charakterisiert wird (PHILIPS u. SHALGI 1985, FAMILIARI et al. 1989). Die

Oberfläche immaturer wie auch atretischer Oocyten wird dagegen als engmaschig und

homogen beschrieben (FAMILIARI et al. 1989). Auch die Modifikation post fertilisationem

spiegelt sich in Untersuchungen an der Maus in der Ultrastruktur durch ein Abnehmen der

retikulären Struktur wider (JACKOWSKI u. DUMONT 1979). Eine lockere, poröse

Oberflächenstruktur scheint für die Interaktion mit den Spermatozoen vorteilhaft zu sein

(FAMILIARI et al. 2006). Eine Arbeitsgruppe begründete die unterschiedlichen Ergebnisse

mit Fixationsartefakten (MAGERKURTH et al. 1999). Dieses Phänomen konnte jedoch nach

Wiederholung der Experimente mit verschiedenen Aufbereitungstechniken von anderen

Autoren nahezu ausgeschlossen werden (FAMILIARI et al. 2006).

Gleiche Veränderungen an der Oberflächentextur wurden von VANROOSE et al. (2000) in

bovinen immaturen, in vitro maturierten Eizellen und in vitro produzierten Zygoten gefunden.

SUZUKI et al. (1994) und MERTENS (2006) beschreiben dagegen die bovine Zona


pellucida-Oberfläche von immaturen Eizellen als weitmaschig und porös. Ein Vergleich in

vivo versus in vitro zeigt beträchtliche Diversitäten bei maturierten Eizellen und Zygoten. In

vitro maturierte Oocyten und in vitro produzierte Zygoten zeigen deutlich weniger Poren und

eine glattere Struktur, was auf suboptimale Kultivierungsbedingungen hindeutet. Die

porenarme Architektur könnte Folge einer wenig ausgeprägten Penetration bzw. vorzeitigen

Retraktion und damit eines unzureichenden Kontaktes der Granulosazellfortsätze unter in

vitro Bedingungen sein. Ein Einfluss der Fertilisation konnte von MERTENS (2006) nicht

bestätigt werden. SUZUKI et al. (2000) zeigten in einer Untersuchung eine ultrastrukturelle

Veränderung der Oberfläche boviner in vitro maturierter Eizellen nach parthenogenetischer

Aktivierung mit Ca2+-Ionophor und DMAP oder Cycloheximid. Dabei war die beobachtete

Abnahme der porösen Struktur reversibel.

Im Verlauf der Passage durch den Eileiter werden verschiedene Moleküle in die Zona

eingelagert (HERRLER et al. 1999). Trotzdem nimmt die Zonadicke während der

embryonalen Entwicklung bis zum Schlupf ab (MONTAG et al. 1999a, PELLETIER et al.

2004, KILANI et al. 2006).

2.6.2 Funktion der Zona pellucida

Die Rolle der Zona pellucida bei der Befruchtung und frühembryonalen Entwicklung ist

wesentlich und vielfältig. Phylogenetisch betrachtet sind die extraembryonalen Hüllen sehr

alte Strukturen. Traditionell wird postuliert, dass heterologe Spermatozoen nicht an die Zona

binden und penetrieren können (HERRLER et al. 1999, YANAGIMACHI 1994, TOPPER et

al. 1997, WASSERMAN et al. 1999).

Während ihrer Passage durch den weiblichen Genitaltrakt durchlaufen die Spermien die

Kapazitation, die sie zur Bindung an die Zona pellucida und Akrosomenreaktion befähigt.

Primärer Bindungsort an der Zona ist ein Rezeptor, der beim Rind als das Glycoprotein bZP3-

α definiert ist, beim Mensch hZP3. Diese Rezeptorenbindung induziert die

Akrosomenreaktion, bei der der enzymatische Inhalt des Akrosoms freigesetzt wird, so dass

die Zona penetriert werden kann. Anschließend kann das Spermatozoon mit der

Ooplasmamembran fusionieren. Dabei fungiert ZP2 als sekundärer Rezeptor für das

akrosomenreagierte Spermium (TOPPER et al. 1997, BLEIL u. WASSARMAN 1981,

WASSARMAN 1987 u. 1988). Im weiteren Wechselspiel zwischen männlichem und


weiblichem Gamet entsteht ein Polyspermieblock, der durch die sogenannte Zonareaktion

möglich wird. Diese Reaktion wurzelt in der exocytotischen Ausschleusung der während der

Maturation akkumulierten Corticalgranula, die über den perivitellinen Spalt die

Zonaarchitektur modifizieren. Dabei werden die Glycoproteine ZP2 und ZP3 zu ZP2f bzw.

ZP3f konvertiert. Die genaue molekulare Basis dieser Reaktionen ist Gegenstand aktueller

Forschung (YANAGIMACHI 1994, WASSARMAN et al. 1999, NARA et al. 2006).

In der weiteren präimplantativen Entwicklung unterbindet die Zona pellucida eine mögliche

Disaggregation des zunächst nur lockeren Blastomeren-Zellverbands durch die Ovidukt- bzw.

Uterusmotilität und erleichtert den Transport des Embryos an seinen Implantationsort. So

wird auch eine vorzeitige Adhäsion an das maternale Epithel verhindert. Eine weitere

Funktion kommt ihr als eine Art Mailbox in der embryomaternalen Kommunikation zu

(WASSARMAN et al. 1999, HERRLER 1999).

2.6.3 Zona hardening Polyspermie stellt bei Insekten-, Reptilien- und Vogelarten durchaus ein physiologisches

Phänomen dar (REMANE et al. 1985). Bei Mammaliae wird im Verlauf der

Befruchtungskaskade jedoch die Penetration von mehr als einem Spermatozoon durch die

Zonareaktion vereitelt (YANAGIMACHI 1994). Dieser Effekt wird in der Literatur auch als

Zona hardening bezeichnet, da die Modifikation der Zonaproteine mit einer erhöhten

Resistenz gegen proteolytische Enzyme, wie z.B. Chymotrypsin, einhergeht (HOODBHOY u.

TALBOT 1994, DE FELICI u. SIRACUSA 1982).

Zona hardening kann auch spontan bei gealterten Eizellen auftreten und wurde sowohl beim

Menschen (COHEN et al. 1992) als auch beim Rind beschrieben (KATSKA et al. 1989). Eine

weitere Form des Zona hardenings wird als Folge von suboptimalen

Kultivierungsbedingungen in vitro diskutiert, wodurch der für die Implantation essentiellen

Schlupf der Blastozyste beeinträchtigt wird. Untersuchungen an murinen Eizellen zeigten,

dass Follikelflüssigkeit, Cumulus- und Granulosazellen, Serum sowie Fetuin, eine

Hauptkomponente des fetalen Kälberserums, eine derartige Veränderung der Zonastruktur

verhindern können (DE FELICI u. SIRACUSA 1982, SCHRÖDER et al. 1990). Beim Rind

scheinen insbesondere der Zusatz von fetalem Kälberserum sowie ein Cumulus-intakter COC

dem Zona hardening entgegenzuwirken (LANDIM-ALVARENGA et al. 2002, KATSKA et


al. 1989). Zonaveränderungen einhergehend mit niedrigeren Schlupfraten sind auch in

Zusammenhang mit Kryokonservierung bei Maus, Mensch und Rind dargestellt worden

(MATSON et al. 1997, TUCKER et al. 1991, VATJA et al. 1997). In der humanen

assistierten Reproduktion scheinen außerdem die kontrollierte hormonelle Hyperstimulation

sowie patientenspezifische Parameter zu einer Zonaverhärtung zu führen (LORET DE MOLA

et al. 1997, MONTAG et al. 1999b, 2000). Eine Schlupfhilfe ist durch das Assisted Hatching

vor dem Embryotransfer bei Mensch und Rind möglich geworden (COHEN et al. 1992,

MONTAG et al. 1999b, SCHMOLL et al. 2003, RÜTHER 2005).

2.6.4 Polarisationsmikroskopische Untersuchungen

Auf der Suche nach einer Untersuchungsmöglichkeit ohne vorherige Fixierung nutzten

KEEFE et al. 1997 die Polarisationsmikroskopie und bestätigten an Hamster-Eizellen eine

auch elektronenmikrokopisch und histochemisch diskutierte Schichtung der Zona

(KAUFMANN et al. 1989). Polarisationsmikroskopisch kann diese Schichtung aufgrund der

unterschiedlichen optischen Eigenschaften nachgewiesen werden. Dabei stellt sich die Zona

als eine dreischichtige Struktur von Zonafilamenten dar. Während die schmale mittlere

Lamina keine Anisotropie aufweist, sind sowohl die innere als auch die äußere Schicht

doppelbrechend. Da die innerste Schicht die stärkste Anisotropie besitzt, sind im vorgestellten

Modell die Filamente dort radiär angeordnet, während sie in der äußeren Zone tangential

gruppiert sind (Abb. 1).

Die Ergebnisse konnten von PELLETIER et al. (2004) auf die humane ZP übertragen werden.

Der Vergleich zwischen immaturen und maturen Eizellen zeigte keine signifikanten

Unterschiede; jedoch gab es eine Korrelation zwischen Zonadicke und Zonadichte und damit

der Stärke der anisotropen Eigenschaften. KILANI et al. (2006) wiesen nach, dass mit

zunehmender Kultivierungsdauer eine zunehmende Dichte – gleichzusetzen mit zunehmender

Anisotropie – auftritt, was gleichzeitig im Rahmen der fortschreitenden Embryonal-

entwicklung mit abnehmender Zonadicke einhergeht.

In einer retrospektiven Studie beobachteten SHEN et al. (2005), dass eine hohe Anisotropie

der inneren Zonaschicht besonders bei Eizellen zu finden ist, bei denen der Embryotransfer zu

einer Gravidität führt. In einer weiteren retrospektiven Evaluation wurde ein Zusammenhang


zwischen der Doppelbrechung der inneren Zonaschicht mit der embryonalen

Blastozystenentwicklung hergestellt (RAMA RAJU et al. 2007).

Abbildung 1: Schematische Struktur der Zona pellucida (nach KEEFE et al. 1997)

2.7 Evaluation der Eizell-Qualität Sowohl für die klinische Anwendung in der Sterilitätsbehandlung als auch zur

Effizienzsteigerung der bovinen in vitro Produktion sind non-invasive Kriterien der Eizell-

Qualität enorm wichtig. Die beschriebenen traditionellen Methoden werden in der Literatur

kontrovers diskutiert. Sie sind ein Ansatzpunkt zur Identifizierung der Eizellen mit dem

höchsten Entwicklungspotential, scheinen jedoch nicht aussagekräftig genug zu sein (EBNER

2006, WANG u. SUN 2007). Die Beurteilung der embryonalen Qualität humaner

Furchungsstadien hat in Deutschland nur beobachtenden Charakter, da aufgrund der

Gesetzgebung keine Selektion erfolgen darf.

Äußere Schicht mit tangentialen Mikrofilamenten

Mittlere Schicht, optisch isotrop

Innere Schicht mit radiären Mikrofilamenten

Oolemm


2.7.1 Follikel

Die Follikelgröße gibt erste Rückschlüsse auf das Entwicklungspotential der Oocyte. Nach

ovarieller Hyperstimulation haben humane Eizellen aus Follikeln mit einem Durchmesser von

15 bis 23 mm die höchste Entwicklungskompetenz. Kleinere Follikel sind aufgrund ihrer

unzureichenden Entwicklung trotz Hormonsubstitution ein Hinweis auf anatomische oder

metabolische Defekte (SMITZ et al. 2001). Für die in vitro Maturation von bovinen Eizellen

werden entsprechend der follikulogenetischen Entwicklung Follikel von 2 bis 8 mm punktiert

(FAIR et al. 1995).

Es gibt Ansätze, das Entwicklungspotential von Eizellen durch biochemische Nachweise in

der Follikelflüssigkeit zu bestimmen, jedoch sind die Methoden für den praktischen Einsatz

noch zu aufwendig (MENDOZA et al. 2002, WANG u. SUN 2007).

2.7.2 Cumulus-Oocyten-Komplex

Die Morphologie des COCs hat eine Aussagekraft über den Maturationsstatus der Eizelle und

wird zur Selektion in der bovinen IVP eingesetzt, da eine Beurteilung der Oocyte selbst durch

die umschließenden Cumuluszellen nicht exakt möglich ist. Für eine genaue

Charakterisierung der Eizell-Qualität sind die morphologischen Kriterien bislang

unzureichend (VAN SOOM u. DE KRUIF 1996). Durch die Evaluierung eines

Schlüsselenzyms der wachsenden Eizelle mittels einer Vitalfärbung (Brilliant Cresyl

Blue(BCB)-Färbung) ist es möglich, selektiv den Anteil an entwicklungskompetenten

Oocyten für die in vitro Maturation zu erhöhen (ALM et al. 2005).

In der humanen assistierten Reproduktion werden aufgrund der begrenzten Anzahl alle

maturen Eizellen aus den gewonnenen COCs verwendet.

2.7.3 Morphologie der Eizelle

Per definitionem sollte eine humane Oocyte bester Qualität ein klares, moderat granuliertes

Ooplasma ohne Einschlüsse, umgeben von einer gleichmäßigen Zona pellucida, aufweisen.

Punktierte und denudierte Eizellen zeigen jedoch eine enorme Variabilität. Mehr als die

Hälfte aller gewonnenen Eizellen haben eine oder mehrere morphologische Auffälligkeiten


(EBNER 2006). In der Literatur findet man widersprüchliche Aussagen über die Bedeutung

dieser Dysmorphismen hinsichtlich der Entwicklungskompetenz.

Einige Autoren berichteten von einer positiven Korrelation zwischen einem intaktem ersten

Polkörper und dem Entwicklungspotential der Eizelle (EBNER et al. 2000). In mehreren

neueren Studien wurde dies widerlegt, so dass das Erscheinungsbild des ersten Polkörpers

nicht prognostisch genutzt werden kann (DE SANTIS et al. 2005, VERLINSKY et al. 2003).

Manche Arbeitsgruppen belegen mit hohen Fallzahlen, dass weder cytoplasmatische

(Granulation, Einschlüsse, Farbe) noch extrazytoplasmatische (irreguläre Form, perivitelliner

Debris, Zona pellucida-Homogenität) Dysmorphismen die Fertilitätsrate,

Embryonalentwicklung und Implantationsrate beeinflussen (DE SUTTER et al. 1996,

BALABAN et al. 1998, CHAMAYOU et al. 2006, TEN et al. 2007). Trotzdem sollten

insbesondere die cytoplasmatischen Defekte kritisch betrachtet werden. Extensive

Zentralgranulierung scheint ebenso wie eine ausgeprägte Vakuolisierung die Eizell-Qualität

negativ zu beeinflussen (KAHRAMAN et at. 2000, DE SUTTER et al. 1996). EBNER (2006)

berichtete von einem positiven Zusammenhang zwischen Viskosität und Qualität der Oocyte.

Problematisch ist hier aber die Tatsache, dass die cytoplasmatische Konsistenz nur während

der invasiven ICSI bestimmt werden kann und eine Objektivierung schwierig ist.

Im Gegensatz zur Vorkern- sowie Embryonenbeurteilung (MONTAG et al. 2001, STEER et

al. 1992) konnte bislang kein vergleichbarer, auf die Morphologie basierender Oocyten-Score

etabliert werden; die lichtmikroskopisch erkennbaren Anomalien stellen negative

Selektionskriterien dar.

2.7.4 Polkörperdiagnostik

Die Polkörperbiopsie hat sich in den letzten Jahren zur Aneuploidiediagnostik bewährt.

Obwohl bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) nicht alle Chromosomen parallel

untersucht werden können, kann ein hoher Prozentsatz von genetisch abnormen Eizellen

identifiziert werden (VERLINSKY et al. 2003). Eine innovative Möglichkeit zur genetischen

Diagnostik ist die Comparative Genomische Hybridisierung (CGH), bei der die Untersuchung

aller Chromosomen erfolgt (FRAGOULI et al. 2006). Diese Technik ist allerdings bislang nur

in der Forschung erprobt (LANDWEHR et al. 2007). Da sie sehr arbeitsaufwendig ist, ist sie

nicht mit dem engen gesetzlich vorgegebenen Zeitfenster in Deutschland zu vereinen.


Um sowohl den ersten als auch den zweiten Polkörper biopsieren zu können, kann die

Entnahme nur nach der ICSI erfolgen. Die Beurteilung der Eizelle hinsichtlich ihrer

chromosomalen Integrität kann also erst zu einem späteren Zeitpunkt vorgenommen werden.

2.8 Das Rind (Bos taurus) als Tiermodell Aufgrund ethischer Aspekte können und sollen nicht alle Untersuchungen an humanen

Eizellen vorgenommen werden. Auf der Suche nach geeigneten Tiermodellen für die

Humanmedizin scheint das bovine Modell in mancher Hinsicht vorteilhaft zu sein

(CHANSON et al. 2001, MENEZO 2003).

Das Rind ist polyoestrisch und asaisonal; die Geschwindigkeit der frühembryonalen

Entwicklung ähnelt der des Menschen. Die Eizellgröße ist vergleichbar, und im Gegensatz zur

Maus wird das Centrosom paternal vererbt (SATHANANTHAN et al. 1999, MENEZO

2003). Bekannt ist außerdem, dass die Größe der meiotischen Spindel zwischen Mensch und

Rind eine größere Ähnlichkeit aufweist. Andere Autoren führen eine größere

Übereinstimmung im Bereich der Genomaktivierung, intermediärem Metabolismus und

Interaktionen mit dem Kulturmedium an (ANDERIESZ et al. 2000b, NEUBER u. POWERS

2000, MENEZO 2003, WRENZYCKI et al. 2001a).

Obwohl beispielsweise die Maus (Mus musculus) ein klassisches Labortier ist und als Modell

viele Vorteile bietet, sind in den letzten Jahren kritische Meinungen im Bereich der

reproduktionsmedizinischen Forschung geäußert worden. Vor dem Hintergrund der

bedeutenden intensiven Forschungsarbeit an bovinen Embryonen wird bei vielen

Fragestellungen wird nun zunehmend der Rinderembryo als Modell für den humanen Embryo

angesehen (NEUBER u. POWERS 2000, CHANSON et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2001a,

MENEZO 2003).

Material und Methoden 24

3 Material und Methoden Genaue Angaben über die Zusammensetzung und Herkunft der verwendeten Reagenzien,

Verbrauchsmaterialien und Geräte sind im Anhang (siehe 9.1) aufgeführt.

3.1 Untersuchungen an humanen Oocyten Die Untersuchungen an humanen Eizellen wurden im Rahmen des IVF-Programms der

Universitätsfrauenklinik Bonn durchgeführt. Für polarisationsmikroskopische

Langzeitbeobachtungen sowie Experimente mit parthenogenetischer Aktivierung wurden

unter Berücksichtigung des Embryonenschutzgesetzes therapeutisch nicht nutzbare Oocyten

verwendet. Ein Ethikvotum für Untersuchungen an unreifen Eizellen liegt vor. Über die

durchgeführten Versuche ist eine Übersicht auf Seite 30 (Abb. 3) dargestellt.

3.1.1 Gewinnung und Präparation der in vivo maturierten Oocyten

Im Unterschied zu den geläufigen Superovulationsprotokollen in der Veterinärmedizin

werden in der Humanmedizin zusätzlich Präparate verabreicht, die eine

Hypophysensuppression induzieren. Dies erfolgt mittels einer Down-Regulation durch

GnRH-Agonisten oder durch GnRH-Antagonisten.

Zur hormonellen ovariellen Hyperstimulation wurden Patienten mit patientenspezifisch

angepassten Standardprotokollen behandelt. Im am häufigsten verwendeten langen Protokoll

(„long protocoll“) begann die Applikation von GnRH-Agonisten (Triptorelin / Decapeptyl®,

Nafarelin / Synarela®, Leuprorelin / Enantone®, Dosierung: 0,1 mg/d) im Vorzyklus ca. am

20. bis 22. Zyklustag und wurde bis zur Ovulationsauslösung beibehalten. Bei einer

Hypophysensuppression durch GnRH-Antagonisten (Cetrorelix / Cetrotide®, Ganirelix /

Orgalutran®, Dosierung: 0,25 mg/d) wurden die Präparate eingesetzt, wenn der Leitfollikel

einen Durchmesser von 13 mm erreicht hatte. Dies war meist ab dem 5. bis 6. Stimulationstag

der Fall.

Zur kontrollierten ovariellen Hyperstimulation wurde rekombinantes FSH (Follikel

stimulierendes Hormon: Gonal F®, Puregon®) oder hMG (humanes Menopausalgonadotropin:


Menogon HP®) ab dem zweiten Zyklustag in einer Anfangsdosierung von etwa 150 IE

appliziert. Auch Kombinationen der Präparate kamen vielfach zum Einsatz. Die Dosierung

variierte individuell zwischen 75 und 375 IE. Durch transvaginale Sonographie wurde die

ovarielle Response, d.h. das Follikelwachstum, kontrolliert, parallel dazu wurde der Estradiol-

sowie LH-Spiegel im Serum als weiterer Marker bestimmt. Die tägliche Dosierung der

Gonadotropine wurde jeweils angepasst. An der Universitätsfrauenklinik Bonn durchgeführte

Standard-Stimulationsprotokolle sowie Verlaufskontrollen sind in MONTAG et al. (1997)

beschrieben.

Erreichte der Leitfollikel einen Durchmesser von 18 bis 20 mm oder der Estradiol-Spiegel im

Serum einen Wert von 100 pg/ml pro 14 mm-Follikel, wurde die Ovulation mit hCG

(humanes Choriongonadotropin: Predalon®, Ovitrelle®, Dosis: 10.000 IE) ausgelöst.

Die transvaginale Punktion der Follikel wurde 34 bis 36 h nach Ovulationsinduktion unter

operativen Bedingungen und sonographischer Kontrolle durchgeführt (GEMBRUCH et al.

1988, VAN DER VEN et al. 1988). Das aspirierte Follikelpunktat wurde in Petrischalen (Ø

10 cm) gegeben und stereomikroskopisch durchsucht, die COCs in Gamete Medium® gespült

und in vorbereiteten 4-Well-Schalen mit je 400 µl äquilibriertem Fertilization Medium®

überführt. Nach einer Inkubation von 2 h wurden die Eizellen in Hyaluronidase (80 IU/ml,

Cook) enzymatisch und mechanisch durch Pipettieren mit Denudierungspipetten (Ø 170 µm,

Ø 140 µm, Ø 130 µm) frei präpariert. Danach erfolgte ein dreimaliges Waschen in Cleavage

Medium®. Bis zur polarisationsmikroskopischen Untersuchung und Ermittlung des

Maturationsstatus verblieben die Oocyten bei einer Temperatur von 37 °C und 6 % CO2 in

feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre in Cleavage Medium® unter Mineralöl (Cook) im

Inkubator. Das Mineralöl wurde zum Schutz gegen osmotischen Stress durch Verdunstung,

schnellen pH-Veränderungen und als Temperatur-Puffer verwendet.

3.1.2 Polarisationsmikroskopische Spindel- und Zona pellucida-Analyse

Die Polarisationsmikroskopie erlaubt die non-invasive Visualisierung von Objekten, die in

der herkömmlichen Lichtmikroskopie zu wenig Kontrast aufweisen, aber aufgrund ihrer

molekular hoch geordneten Struktur doppelbrechende Eigenschaften besitzen.

Hierfür wurde ein Inversmikroskop (Nikon) mit einer optischen Polarisationseinheit,

bestehend aus einem Grünfilter, einem zirkularen Polarisator und einem steuerbaren


Flüssigkristall-Analysator, aufgerüstet. Dadurch wird vor dem zu untersuchenden Objekt

zirkulär polarisiertes Licht erzeugt, was den unverzichtbaren Vorteil hat, dass im Gegensatz

zu konventionellen linear polarisierenden Filtern eine Unabhängigkeit von der Orientierung

der Strukturen erreicht wird. Hinter dem Objekt befindet sich der Flüssigkristall, mit dem das

zirkulär polarisierte Licht synchron gefiltert wird. Die erzeugten Bilder wurden von einer

hochauflösenden USB2-Kamera aufgenommen und durch die OCTAX polarAIDETM-

Bildverarbeitungssoftware ausgewertet und visualisiert. Das System verfügte zusätzlich über

eine Autokalibrierungsfunktion. Zudem wurde das Mikroskop mit einem beheizbarem

Objektträgertisch ausgestattet. Um eine Konstanthaltung der Temperatur zu gewährleisten,

erfolgten alle labortechnischen Manipulationen mit den Gameten bzw. Embryonen auf

beheizten Arbeitsflächen (37 °C). Da Kunststoff mit polarisiertem Licht interagiert, wurden

für die polarisationsmikroskopische Analysen stets Glasbodenschalen verwendet.

Für das Imaging in polarisiertem Licht wurden die denudierten Eizellen in 4 µl Mikrotropfen

mit Cleavage Medium® unter Mineralöl vereinzelt. Jede Eizelle wurde fotografiert und ihre

Daten erfasst. Von diesem Punkt an erfolgte die weitere Kultivierung rückverfolgbar in

Einzeltropfen.

3.1.3 Gewinnung und Präparation der paternalen Gameten

Die Gewinnung erfolgte orthograd durch Masturbation nach einer Karenz von 3 bis 5 Tagen.

Nach 30 minütiger Liquifizierung wurde ein Spermiogramm nach WHO-Richtlinien (WHO-

Laborhandbuch 1999) erstellt und das Ejakulat mit einem Mini-Swim Up in Fertilization

Medium® aufbereitet. Details sind in MONTAG et al. (1997) aufgeführt.

3.1.4 Intracytoplasmatische Spermieninjektion

Die ICSI wurde an einem Inversmikroskop (Leica) mit zwei identischen Mikromanipulatoren

(Narishige) nach einem modifizierten Standardprotokoll von PALERMO et al. (1995)

durchgeführt (MONTAG et al. 1997). Dabei wurde die Eizelle mit einer Haltekapillare in

Cleavage Medium® so fixiert, dass der Polkörper sich wahlweise in der 6- oder 12 Uhr-

Position befand. Ein morphologisch möglichst unauffälliges und vitales Spermatozoon wurde

nach mechanischer Immobilisierung mit einer Injektionskapillare in PVP auf der 3 Uhr-


Position injiziert (Abb. 2). Nach der Injektion wurden die Oocyten in Einzelkultur für 16 bis

20 h in je 50 µl mit Mineralöl überschichteten Cleavage Medium®-Tropfen unter

Kultivierungsbedingungen inkubiert. Nicht ausreichend maturierte Oocyten, d.h. Eizellen

ohne Polkörper, wurden von der Behandlung ausgeschlossen.

Abbildung 2: Intracytoplasmatische Spermieninjektion. Das zu injizierende Spermatozoon ist

durch einen Pfeil markiert.

3.1.5 Vorkernbeurteilung und in vitro Kultivierung

Nach 16 bis 20 h wurden die Eizellen unter einem Inversmikroskop lichtmikroskopisch mit

Hoffmann-Kontrast begutachtet. Die Formation von 2 Pronuclei und 2 Polkörpern galt als

physiologisch fertilisiert. Bei mehr als 2 befruchteten Eizellen wurde für den späteren

Embryotransfer eine Selektion anhand des Zona-Imagings getroffen. Sekundäres Kriterium

war die Vorkern-Morphologie (MONTAG et al. 2001). Die Weiterkultivierung der zum

Transfer bestimmten Eizellen im Vorkernstadium erfolgte einzeln in mit Mineralöl

überschichteten 50 µl Tropfen mit Cleavage Medium® in Petrischalen (Ø 6 cm). Alle 24 h

wurde die Entwicklung der Embryonen morphologisch beurteilt und dokumentiert.

3.1.6 Embryotransfer und Graviditätsermittlung

Der Embryotransfer wurde am Tag 2 oder 3 nach der Punktion durchgeführt. Dazu wurden

die Embryonen 2 h vor dem Transfer in eine CenterWell-Schale mit 750 µl äquilibriertem


Blastocyst Medium® ohne Ölüberschichtung verbracht. Mit einem Flüssigkeitsvolumen von

50 µl wurden die Embryonen mittels eines Embryotransfer-Katheters transcervical in das

Cavum uteri abgesetzt. Die genaue Technik ist in MONTAG et al. (2002b) beschrieben. Um

einem durch die Therapie mit GnRH-Analoga induzierten Lutealphasendefizit

entgegenzuwirken, erfolgte ab dem ersten Tag nach der Ovulationsinduktion eine

intravaginale Applikation von Progesteron. Eine klinische Schwangerschaft wurde 14 Tage

nach der Follikelpunktion über einen positiven β-hCG-Spiegel im Serum ermittelt und nach

weiteren 2 Wochen sonographisch durch darstellbare Fruchthöhlen bestätigt (MONTAG et

al. 1997). Anschließend erfolgte die Kontrolle durch einen niedergelassenen Gynäkologen.

Geburt bzw. Abort wurde von den Patienten selbst übermittelt.

Die klinische Schwangerschaftsrate wurde definiert als Anzahl der klinischen

Schwangerschaften bezogen auf die Gesamtanzahl der Embryotransfers. Über die Anzahl der

sonographisch darstellbaren Fruchthöhlen in Relation zu der Gesamtanzahl der transferierten

Embryonen wurde die Implantationsrate errechnet.

3.1.7 Untersuchung der Spindeldynamik in Metaphase II-Eizellen

Nach einer Ruhephase von 30 bis 40 min im Inkubator wurde an den denudierten Eizellen ein

erstes polarisationsmikroskopisches Spindel-Imaging durchgeführt. Jede Oocyte wurde mit

Hilfe einer Injektionskapillare an der mikromanipulatorischen Einheit (Eppendorf) vorsichtig

gedreht und gewendet, bis ein Polkörper und/oder ein Spindelapparat sichtbar wurde oder ein

solches Vorhandensein sicher ausgeschlossen werden konnte. Nach einer weiteren Phase im

Inkubator für 2 h wurde die Untersuchung auf die gleiche Weise wiederholt. Lediglich die

Daten der Eizellen, die bereits bei der ersten Analyse einen Polkörper aufwiesen, wurden

erfasst. Im Anschluss wurde bei allen maturen Eizellen die ICSI vorgenommen.

3.1.8 Prospektive Zona pellucida-Imaging-Studie

Zwischen September 2005 und September 2006 wurden alle ICSI-Zyklen mit einem Transfer

von 2 Embryonen in die Studie aufgenommen. Die Rückübertragung von 2 Embryonen

entspricht dem deutschen Standard. Der Transfer von 3 Embryonen wird nur bei prognostisch

schlechter Situation (mütterliches Alter >35 Jahre und mehrere erfolglose Vorversuche) und


auf ausdrücklichen Patientenwunsch durchgeführt, daher galt die Anzahl von 3 Embryonen

als Ausschlusskriterium. Ebenso ausgeschlossen wurden Zyklen, bei denen wegen der

schlechten Befruchtungsrate nur 1 Embryo für den Transfer zur Verfügung stand, sowie

Zyklen, bei denen zusätzlich eine Polkörperbiopsie zur Aneuploidie-Diagnostik durchgeführt

wurde.

Das polarisationsmikroskopische Zona-Imaging wurde vor der ICSI von nur einem

Untersucher vorgenommen, der die doppelbrechenden Eigenschaften der Zonae subjektiv

nach Homogenität und Intensität beurteilte.

3.1.9 Versuche mit therapeutisch nicht verwendbaren Oocyten

3.1.9.1 Zeitrafferstudie von Metaphase I-Oocyten

Um die Rolle der meiotischen Spindel während der Maturation bis zum physiologischen

Metaphase II-Arrest zu untersuchen, wurden Metaphase I-Eizellen ohne assoziierte Spindel

einer polarisationsmikroskopischen Langzeitbeobachtung unterzogen. Dazu wurden Eizellen

im Metaphase I-Stadium in HEPES-gepuffertes Gamete Medium® transferiert und im

polarisierten Licht analysiert. Die Software speicherte in definierten Zeitintervallen Bilder,

die dann zu Videosequenzen zusammengefügt wurden. Nach jeweils ca. 3 h wurde die

Beobachtung beendet.

3.1.9.2 Parthenogenetische Aktivierung

Für die Beobachtung des Spindelverhaltens nach einer Aktivierung während der

Spindelbrückenphase wurden Metaphase I-Eizellen in vitro in Fertilization Medium® unter

Mineralöl im Inkubator nachmaturiert und polarisationsmikroskopisch kontrolliert, bis diese

meiotische Phase erreicht war. Sodann erfolgte eine artifizielle Aktivierung, indem dem

Medium 20 µM Ca2+-Ionophor A23187 zugesetzt wurde (WINSTON et al. 1991, TESARIK

u. SOUSA 1995). Nach 10 min wurden sie dreimalig in Gamete Medium® gewaschen und

direkt im Anschluss analog zu 3.1.9.1 einer Langzeitbeobachtung unterzogen.


3.1.9.3 Zona pellucida-Imaging bei immaturen Oocyten Auf der Basis der Ergebnisse der subjektiven Zona-Beurteilung (siehe 4.1.2.1) wurde seitens

des Herstellers ein automatisches Zona-Erkennungsmodul entwickelt, welches die Eizelle

objektiv beurteilt, indem über einen auf den Messwerten basierenden Algorithmus ein Score

errechnet wird.

Die Zona pellucida von immaturen Eizellen (stereomikroskopisch klassifiziert) wurde am Tag

der Punktion polarisationsmikroskopisch über den Score beurteilt. Anschließend wurden sie

in Mineralöl überschichteten 50 µl Fertilization Medium® Tropfen einzeln bei 37 °C in

feuchtigkeitsgesättigter CO2-Atmosphäre inkubiert. Nach 24 h erfolgte eine erneute

Bestimmung des Scores und die Veränderung zum Vortag wurde dokumentiert.

Abbildung 3: Untersuchungen an humanen Oocyten. Schematische Darstellung der

Parametererhebungen.

24 h Kultivierung

in vitro Kultivierung

humane in vivo Maturation

Spindel-Imaging

Zona-Imaging

Zona-Imaging

Aktivierung Spindelbrücken-

Phase

Zeitraffer-Studie

Maturation

Zona-Imaging

ICSI

Embryotransfer

immature Eizellen mature Eizellen


3.2 Untersuchungen an bovinen Oocyten 3.2.1 Gewinnung der bovinen immaturen Cumulus-Oocyten-Komplexe

Auf nahe gelegenen Schlachthöfen wurden Ovarien noch am Schlachtband mittels einer

Schere vom Eingeweidekonvolut separiert, in einer mit 0,9%iger NaCl-Lösung gefüllten

Thermoskanne bei 38 °C gesammelt und innerhalb von 3 Stunden in ein kooperierendes

Labor (Biotechnologisches Labor, Versuchsgut Frankenforst, Uni Bonn) transportiert. Dort

erfolgte eine Spülung mit auf 39 °C temperierten Ethanol (70%) sowie eine dreimalige

Wiederholung der Waschung mit ebenfalls vorgewärmter physiologischer NaCl-Lösung.

Zur Gewinnung der COCs wurden 2 bis 8 mm große Follikel punktiert. Stereomikroskopisch

selektierte COCs wurden zunächst in HEPES-gepuffertem TCM-air-Medium gesammelt. Nur

Eizellen mit einem homogen dunklem Ooplasma, eingebettet in einem weitestgehend

geschlossenen, kompakten Cumulus wurden durch dreimaliges Waschen in äquilibriertem

Maturationsmedium ohne Zusatz von FSH auf die weitere in vitro Kultivierung vorbereitet.

Details sind in HOELKER et al. (2007) beschrieben.

Eine Übersicht der Versuche ist auf Seite 37 (Abb. 4) dargestellt.

3.2.2 In vitro Maturation

Für die Untersuchungen an maturen Oocyten wurden die selektierten COCs innerhalb von 40

bis 50 min in einem tragbaren Inkubator bei 39°C zum Hauptlabor

(Reproduktionsbiologisches Labor, Uni-Frauenklinik Bonn) überführt. Der Transport erfolgte

in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 1,5 ml äquilibriertem Medium und 10 µg/ml FSH

(Folltropin®) möglichst ohne Lufteinschlüsse, um den pH-Wert konstant zu halten. Zur

weiteren Maturation wurden die COCs direkt im Anschluss in Gruppen à 50 in vorbereitete 4-

Well-Schalen transferiert und bei 39 °C sowie 5 % CO2 in feuchtigkeitsgesättigter

Atmosphäre für 20,5 bis 24 h kultiviert. Zuvor waren die Wells der Multischalen mit je 400 µl

präinkubiertem Maturationsmedium unter Zusatz von 10 µg/ml FSH und Überschichtung mit

Mineralöl (Sigma) präpariert worden.


3.2.3 Polarisationsmikroskopische Ermittlung des Maturationsstatus und Zona-parameter

Jeweils 50 in vitro maturierte COCs wurden zunächst enzymatisch und mechanisch denudiert,

indem anhaftende Granulosazellen kurzzeitig in Hyaluronidase (Cook) durch mehrmaliges

Auf- und Abpipettieren (Ø 170 µm, Cook) grob entfernt wurden. Mit Flexipetten noch

kleineren Durchmessers bis 130 µm wurden die Oocyten in Maturationsmedium noch feiner

denudiert und viermal gespült. Diese Vorgänge fanden in 50 µl Tropfen unter Mineralöl statt.

Für die polarisationsmikroskopische Analyse (siehe 3.1.2) wurden je 16 Eizellen pro

Glasschale in 4 µl TCM-air Mikrotropfen vereinzelt, die zuvor mit Mineralöl überschichtet

worden waren. Analog zu humanen Eizellen wurde durch Drehen und Wenden das

Vorhandensein eines Polkörpers und einer Spindel festgestellt und damit der

Maturationsstatus bestimmt. Dabei wurden Eizellen mit Polkörper als Metaphase II-Stadium

diagnostiziert. Alle Oocyten ohne erkennbaren Polkörper wurden als Metaphase I definiert, da

eine genauere Differenzierung des Meiose-Stadiums ohne weitere Techniken aufgrund der

Granulation boviner Eizellen nicht möglich war.

Außerdem wurden von jeder Eizelle objektive Zonaparameter mit Hilfe des Zona-

Erkennungsmoduls der Software erhoben (siehe 3.1.9.3). Neben dem Score wurde anhand

von 180 Messpunkten entlang der Zona auch der CV- und PV-Wert bestimmt. CV beschreibt

die Dicke der inneren Zonaschicht; PV mittelt die Intensität des Peaks.

3.2.4 Parthenogenetische Aktivierung

3.2.4.1 Einzelaktivierung nach Spindel- und Zona-Imaging

Die Aktivierung wurde in 20 µl Tropfen unter Mineralöl nach der Methode von RHO et al.

(1998) durchgeführt. Jede Eizelle wurde einzeln aktiviert, um die Rückverfolgbarkeit zu

gewährleisten.

Im Anschluss an die polarisationsmikoskopische Untersuchung wurden die Oocyten für die

Dauer von 4 min in ein 5 µmolares Ionomycin-Aktivierungsmedium verbracht und

anschließend dreimal in TCM-air gewaschen. Danach wurden sie in das DMAP-

Aktivierungsmedium mit einer Konzentration von 2 mM überführt, worin sie für 3,5 h unter


Kultivierungsbedingungen verblieben. Nach dreimaligem Waschen in TCM-air und

einmaligem Waschen in CR1aa-Kulturmedium (ROSENKRANS u. FIRST 1994) wurden sie

für die weitere in vitro Kultivierung in eine vorbereitete Schale transferiert.

3.2.4.2 Gruppenaktivierung vor Zona-Imaging

In einem weiteren Versuchsansatz erfolgte das Zona-Imaging erst nach der artifiziellen

Aktivierung, um die Inkubation mit den Aktivierungsmedien in Gruppen zu je 50 durchführen

zu können. Dazu wurden die COCs nach 22 h Maturation aus dem Medium entnommen und

durch Vortexen in 500 µl Hyaluronidase (1 mg/ml in D-PBS, ohne Ca2+, Mg2+, Sigma) für 3

min denudiert. Die anschließenden Wasch- und Aktivierungsschritte erfolgten wie oben

beschrieben mit dem Unterschied, dass keine Einzelaktivierung stattfand und die Tropfen ein

Volumen von 400 µl hatten. Der Transport ins Hauptlabor erfolgte im Anschluss in TCM-air.

Vor der in vitro Kultivierung wurde das Zona-Imaging durchgeführt.

3.2.5 In vitro Kultivierung im MiniWell-System

5-Well-Schalen wurden in Anlehnung an VAJTA et al. (2000) durch 16 Bohrlöcher pro Well

mit einem Durchmesser von Ø 0,7 mm modifiziert. Dies ermöglichte die Rückverfolgbarkeit

jeder aktivierten Oocyte; gleichzeitig aber auch eine Kultivierung in Gruppen à 16. Innerhalb

der Minivertiefungen entstand so um jede Eizelle ein Mikromilieu, in dem sich autocrine und

paracrine Faktoren akkumulieren konnten. Andererseits wurde durch den Kontakt zum

Medium im gesamten Well eine konstante Zufuhr von essentiellen Substanzen gewährleistet

und eine Konzentration von toxischen Stoffwechselprodukten verhindert. Weiterer Vorteil

dieses Systems war, dass durch die Unterbindung des direkten Gruppenkontakts negative

Einflüsse durch die Cokultivierung mit degenerierten Eizellen minimiert wurden.

Die vorpräparierten Vertiefungen wurden mit 500 µl Kulturmedium (CR1aa) gespült, wobei

Luftbläschen aus den MiniWells entfernt wurden. Nach Entfernen des Mediums wurden

erneut 500 µl äquilibriertes Medium in die Wells gegeben und mit 450 µl Mineralöl (Sigma)

überschichtet.

Nach der Aktivierung wurde jede Eizelle vorsichtig in eine Minivertiefung gelegt und bei 39

°C und 5 % CO2 in feuchtigkeitsgesättigter Luft weiterkultiviert. Die Teilungsrate wurde nach


72 h erfasst; an den Tagen 7, 8 und 9 wurden entstandene Blastozysten gezählt und als

Blastozystenrate gewertet.

Aktivierte Kontrolloocyten wurden ohne vorheriges Imaging in Gruppen à 50 in 4-Well-

Schalen mit Mineralöl überschichteten 400 µl Kulturmedium pro Vertiefung parallel

kultiviert.

3.2.6 Beurteilung der DNA-Konfiguration mit Hoechst 33342

Um Vorkernformationen auch im bovinen System beurteilen zu können, wurde die in vitro

Kultivierung der aktivierten Oocyten in 4 Versuchen nach 20 h beendet und eine DNA-

Färbung durchgeführt. Hierzu wurden die Eizellen für 10 min abgedunkelt in TCM-air

inkubiert, das mit Hoechst 33342 in einer Konzentration von 1 mg/ml supplementiert war.

Für die mikroskopische Untersuchung wurden Objektträger mit herkömmlichen

Verstärkungsringen aus dem Bürobedarf präpariert. Nach Ablauf der Einwirkzeit und

dreimaligem Waschen wurden die gefärbten Eizellen in 7 µl Mikrotropfen verbracht, die

zuvor zentral in die Ringe pipettiert worden waren, und mit einem runden Deckgläschen (Ø 8

mm) fixiert. Der zwischengelagerte Ring verhinderte einen übergroßen Druck durch das

Deckglas und damit ein mögliches Zerplatzen der Oocyten. Unter einem

Fluoreszenzmikroskop mit integrierter UV-Dampfleuchte (Fluoreszenzfilter DAPI: Abs.:

360/40 nm, Emis.: 425 nm) wurde dann die DNA-Konfiguration beurteilt.

3.2.7 Fluoreszenzoptischer Nachweis der initialen [Ca2+]i-Freisetzung

In einem separaten Versuch sollte untersucht werden, ob sich initial Unterschiede in der

Aktivierungskaskade von Oocyten in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der artifiziellen

Aktivierung aufzeigen lassen.

Dazu wurden in vitro maturierte Eizellen nach Erhebung des Meiosestadiums mittels

Polarisationsmikroskopie für die Dauer von 1 h mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenz-

Farbstoff Fluo-4AM unter Kultivierungsbedingungen inkubiert. Die AM-Form

(Acetoxymethylester) verleiht dem Farbstoff die Eigenschaft der Zellpermeabilität;

intrazellulär wird der Indikator dann durch unspezifische Esterasen zu Fluo-4 umgewandelt.

Die Konzentration in den 10 µl Tropfen, die mit Mineralöl überschichtet waren, betrug 100


µM bei einem DMSO-Gehalt von 10 %. Nach Ablauf der Zeitspanne wurden die gefärbten

Eizellen mehrmals in Maturationsmedium gewaschen. In einer Petrischale (Ø 6 cm) wurde

ein 40 µl Tropfen TCM-air mit Mineralöl überschichtet und die Eizellen in diesen Tropfen zur

fluoreszenzoptischen Messung transferiert.

Unter einem Fluoreszenzmikroskop konnte das intrazelluläre Ca2+ nun durch den Farbstoff

visualisiert werden. Nach Zugabe von Ionomycin mit einer Endkonzentration von 5 µM

erfolgte eine computer-gestützte Messung der [Ca2+]i-Konzentration (HEYERS et al. 2000).

Nach Anregung mit einer Wellenlänge von λ = 497 nm wurde das emittierte Licht (λ = 516

nm) von einer CCD-Kamera aufgezeichnet. Die Intensität wurde durch die Software

Aquacosmos 1.3 in Form einer Messkurve dargestellt.

3.2.8 Brilliant Cresyl Blue-Färbung immaturer Oocyten

Vor dem Zona-Imaging an immaturen Eizellen wurde eine Vitalfärbung mit dem Farbstoff

BCB durchgeführt, der ein Marker für die Glukose-6-Phosphatdehydrogenase (G6PDH)-

Aktivität ist. Das Enzym, eine Komponente des Pentosephosphatzyklus, katalysiert eine

Reaktion, wodurch der Farbstoff in ein farbloses Derivat umgewandelt wird (ERICSSON et

al. 1993).

Wachsende Eizellen zeichnen sich aufgrund ihres Bedarfs an Ribose-6-Phosphat für die

Nukleotidsynthese durch eine hohe Aktivität aus (MANGIA et al. 1975). Der in das

Ooplasma penetrierte Farbstoff wird in solchen Eizellen durch die hohe Aktivität von G6PDH

schnell metabolisiert, wodurch das Cytoplasma lichtmikroskopisch nur eine schwache oder

gar keine Blaufärbung aufweist. Diese Eizellen wurden nach der durchgeführten Färbung als

BCB- bezeichnet. Eizellen mit deutlich blauer Cytoplasma-Farbe nach Inkubation mit dem

BCB-Farbstoff sind durch eine niedrige G6PDH-Enzymaktivität charakterisiert und können

BCB nicht oder nur in geringem Maße verstoffwechseln. Ein blau koloriertes Ooplasma

(BCB+) zeigt also den Abschluss cytoplasmatischer Ausreifungsprozesse an, was mit einer

vorhandenen Entwicklungskompetenz gleichgesetzt wird (WASSARMAN 1988).

Die Färbung wurde in Anlehnung an ALM et al. (2005) und BHOJWANI et al. (2007)

durchgeführt. Dazu wurden morphologisch vorselektierte immature COCs dreimal in einer

BCB-Lösung (26 µM BCB in D-PBS mit 0,4 % BSA) gewaschen und verblieben in der mit

Mineralöl überschichteten 400 µl Färbelösung abgedunkelt bei 39 °C für eine Dauer von 30


min. Danach wurde stereomikroskopisch die Intensität der Blaufärbung beurteilt. Anhand

dessen wurden die Eizellen in 2 Gruppen unterteilt: Eine Gruppe wurde von Eizellen mit

starker dunkelblauer Cytoplasma-Färbung (BCB+) gebildet; die andere enthielt alle Eizellen

mit nicht oder nur schwach angefärbtem Ooplasma (BCB-). Anschließend wurden die

Cumuluszellen wie oben beschrieben durch Vortexen in Hyaluronidase entfernt. Nach

dreimaligem Spülen in TCM-air wurden die beiden Gruppen in je einem 0,6 ml

Reaktionsgefäß mit TCM-air in das Hauptlabor transportiert. Dort erfolgte das Zona-Imaging

(siehe 3.2.3).

3.2.9 In vitro Fertilisation

Für die Beurteilung der embryonalen Entwicklungskompetenz wurde das Zona-Imaging 21 h

p.ins. durchgeführt. Die Manipulationen bis zum Zona-Imaging wurden im kooperierenden

Labor durchgeführt.

In Mini-Pailletten kryokonserviertes Bullensperma (Rinderunion West) wurde für die in vitro

Fertilisaton im Wasserbad bei 40 °C für 10 Sekunden aufgetaut und mit der Swim Up

Technik in modifiziertem Fert-TALP (PARRISH et al. 1988) aufbereitet. Nach 22 h

Maturation wurden die COCs für weitere 19 h mit den Spermien in einer Konzentration von 2

Mio/ml bei 39 °C und 5 % CO2 in feuchtigkeitsgesättiger Luft cokultiviert. Genaue Angaben

der IVF sind in HOELKER et al. (2007) beschrieben.

Nach Beendigung der Gameten-Coinkubation wurden die Granulosazellen durch 2-minütiges

Vortexen in TCM-air entfernt; anschließend wurden sie in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit

1,5 ml CR1aa für das Zona-Imaging und die weitere in vitro Kultivierung im MiniWell-

System in das Hauptlabor transportiert.

Eine Gruppe von fertilisierten Oocyten verblieb als Kontrolle im kooperierenden Labor, eine

andere wurde in das Hauptlabor mitgeführt und dort gruppenweise in einer Multischale

kultiviert.


3.3 Statistische Auswertung Die statistische Analyse bezüglich der embryonalen Entwicklungsraten wurde mit dem Chi-

Quadrat-Test durchgeführt. Unterschiede in Patientenalter und Anzahl der punktierten

Eizellen innerhalb der Zona pellucida-Studie wurden mit ANOVA (zweiseitiger t-Test)

überprüft. Ebenso erfolgte die statistische Auswertung der Zonaparameter mit ANOVA

(zweiseitiger t-Test). Unterschiede galten ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von P < 0,05 als

signifikant, P < 0,001 wurde als hochsignifikant definiert.

Abbildung 4: Untersuchungen an bovinen Oocyten. Schematische Darstellung der

Parametererhebungen.

BCB-Färbung IVM IVM/IVF

immature Oocyten mature Oocyten Oocyten 21 h p.ins.

Gewinnung von bovinen COCs

Zona-Imaging

Zona-Imaging

Zona-Imaging

Parthenogenetische Aktivierung

Ca2+-Messung


Spindel-Imaging

Hoechst-Färbung


Ergebnisse 38

4 Ergebnisse 4.2 Ergebnisse der Untersuchungen an humanen Oocyten 4.1.1 Polarisationsmikroskopische Analyse der meiotischen Spindel 4.1.1.1 Spindeldynamik im Verlauf der Maturation humaner Oocyten In 3 von 9 polarisationsmikroskopisch untersuchten humanen Metaphase I-Oocyten konnte in

Zeitrafferstudien die finale Maturation bis zum Metaphase II-Arrest dargestellt werden. Bei

den übrigen Eizellen schnürte sich der Polkörper entweder gar nicht oder nicht in der

fokussierten Ebene ab. Die Spindel zeigte sich als hochdynamischer Teil des Cytoskeletts:

Die Metaphase I-Spindel lagerte sich peripher (Abb. 5A) und nahm in ihrer Intensität bis zur

Bildung des ersten Polkörpers zu (Abb. 5B). Für die Dauer von 75 bis 90 min bildeten die

Mikrotubuli eine Verbindung zwischen Polkörper und Ooplasma (Spindelbrücke, Abb. 5C,

5D); anschließend war eine Dissoziation für die Dauer von 40 bis 60 min zu beobachten

(Abb. 5E). 115 bis 150 min nach der Ausschleusung des ersten Polkörpers polymerisierten die

Mikrotubuli zur zweiten meiotischen Spindel (Abb. 5F).

Abbildung 5: Spindeldynamik während der Meiose I (Eizelle ovoid geformt)

A B C

D E F

Ergebnisse 39

4.1.1.2 Spindeldynamik in humanen Metaphase II-Oocyten vor ICSI

493 mature Eizellen wurden im Rahmen des Standard-ICSI-Programms eines zweimaligen

Imagings im Abstand von 2 h unterzogen, wobei beim ersten Imaging bereits 80,7 % der

Oocyten eine Spindel aufwiesen. Nach 2 h konnte bei der Mehrzahl der Eizellen, die bei der

ersten Untersuchung eine dissoziierte, also nicht sichtbare Spindel hatten, eine Spindel

dargestellt werden (Tab. 1).

4.1.1.3 Ergebnisse nach ICSI in Abhängigkeit von der Spindeldynamik

16 bis 20 h nach der ICSI und einem zweimaligem Spindel-Imaging wurde die Befruchtung

beurteilt (Tab. 2). Dabei gab es nur einen geringfügigen Unterschied in der Fertilisation

zwischen der Gruppe, die bereits beim ersten Imaging eine Spindel aufwies, und jener

Gruppe, die bis zur zweiten Untersuchung eine Spindel entwickelt hatte (78,3 % versus 78,2

%). Dagegen zeigten die Eizellen ohne Spindel eine signifikant schlechtere Fertilisationsrate

(62,5 %, p < 0,025).

4.1.1.4 Auswirkung der Eizell-Aktivierung während der Spindelbrückenphase

15 humane Metaphase I-Oocyten wurden in vitro bis zur Spindelbrückenphase (Abb. 5C, 5D)

nachmaturiert und mit Ca2+-Ionophor aktiviert. 10 von 15 Eizellen bildeten 16 bis 20 h nach

Aktivierung 2 Vorkerne, jedoch keinen zweiten Polkörper.

Exemplarische Zeitrafferstudien im Anschluss an die artifizielle Aktivierung zeigten, dass aus

der bestehenden Spindelbrücke die Spindel vollständig in den sich bildenden ersten Polkörper

ausgeschleust wurde und dort dissoziierte (Abb. 6). Eine Assoziation von Mikrotubuli zur

zweiten meiotischen Spindel unterblieb auch bei Langzeitbeobachtungen.

Nach Aktivierung durch ein Spermatozoon während der Routine-ICSI zum Zeitpunkt einer

bestehenden Spindelbrücke zeigten 18 von 20 Eizellen eine anomale Fertilisation mit 3

Pronuclei und fehlendem zweiten Polkörper. 2 Oocyten bildeten einen zweiten Polkörper und

2 Vorkerne (Abb. 7).

Ergebnisse 40

Tabelle 1: Spindeldynamik in humanen Metaphase II-Eizellen vor ICSI

2. Imaging nach 2 h Metaphase II

(n = 493) 1. Imaging

darstellbare Spindel nicht darstellbare Spindel

darstellbare

Spindel 80,7 %

(398/493) 99,5 %

(396/398) 0,5 %

(2/398)

nicht darstellbare

Spindel 19,3 %

(95/493) 57,9 % (55/95)

42,1 % (40/95)

Tabelle 2: Fertilisationsrate von humanen Metaphase II-Eizellen nach ICSI in

Abhängigkeit von der Spindelpräsenz

1. Imaging 2. Imaging nach 2 h Fertilisationsrate

darstellbare

Spindel 398 darstellbare Spindel 396 78,3 %

(310/396)a

darstellbare Spindel 55 78,2 % (43/55) nicht darstellbare

Spindel 95

nicht darstellbare Spindel 40 62,5 % (25/40)b

a:b p < 0,025

Abbildung 6: Spindeldissoziation im ersten Polkörper nach artifizieller Aktivierung einer

humanen Oocyte in der Spindelbrückenphase

A B

C D

Ergebnisse 41

Abbildung 7: A. Humane Oocyte nach ICSI in der Spindelbrücken-Phase mit 3 Vorkernen

B. Humane Oocyte nach ICSI in der Metaphase II mit sichtbarem zweitem

Polkörper und 2 Vorkernen

4.1.2 Zona pellucida-Imaging humaner Oocyten

4.1.2.1 Prospektive Zona pellucida-Imaging-Studie

In die Studie wurden 1029 Metaphase II-Oocyten aus 135 Zyklen von 124 Patienten

eingeschlossen. Nach den Kriterien Intensität und Homogenität erfolgte eine subjektive

Einteilung in 2 Gruppen: Eizellen mit einer homogen-intensiven inneren Zona-Schicht

wurden als „hoch doppelbrechend“ (HZB, high zona birefringence) bezeichnet, jene mit

inhomogenen, schwach anisotropen Eigenschaften als „niedrig doppelbrechend“ (LZB, low

zona birefringence) eingestuft (Abb. 8).

Abbildung 8: Humane Metaphase II-Oocyten. Zona pellucida hoch doppelbrechend (A),

Zona pellucida niedrig doppelbrechend (B)

A B

BA

Ergebnisse 42

197 (19,1 %) der untersuchten Eizellen zeigten eine hohe Anisotropie, wobei in 44 Zyklen

keine Eizellen dieser Klassifikation zu finden waren. Subtrahiert man diese Zyklen, so

entspricht das einem Durchschnitt von 2,16 HZB-Eizellen pro Zyklus.

Die Fertilisationsrate der Studie lag bei 69,4 % (714/1029); zwischen HZB- und LZB-

Eizellen gab es keine signifikanten Unterschiede. Jedoch unterscheiden sich beide Gruppen

signifikant (p < 0,025) in der Embryonalenwicklung am Tag 3. Während 41,7 % (n = 57) der

befruchteten Eizellen mit hoher Doppelbrechung sich zu Embryonen mit mindestens 8

Blastomeren und sehr guter Qualiät teilten, taten dies in der LZB-Gruppe nur 24,4 % (n =

119).

Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse nach Transfer von 2 Embryonen, wobei – wenn möglich – bei

der Selektion für den Embryotransfer befruchtete HZB-Eizellen bevorzugt wurden. Das

Patientenalter zwischen den Gruppen war nicht signifikant unterschiedlich, doch war die

Anzahl der punktierten Metaphase II-Eizellen in der Gruppe mit Transfer von 2 Embryonen

aus Eizellen mit hoher Doppelbrechung signifikant höher. Konnte ein Transfer nur mit 2

Embryonen aus LZB-Eizellen vorgenommen werden, lag die klinische Schwangerschaftsrate

bei 24,6 % und unterschied sich damit signifikant von den Schwangerschaftsraten aus

Transfers, bei denen 2 Embryonen aus HZB-Eizellen bzw. aus je einer HZB- und LZB-

Eizelle transferiert wurden (65,0 % bzw. 50,0 %). Entsprechende Unterschiede sind auch bei

der Implantationsrate und Geburtenrate wiederzufinden. Mit einer Implantationsrate von 13,1

% und einer Geburtenrate von 20,0 % hatte die LZB/LZB-Gruppe die schlechtesten

Ergebnisse. Die besten Implantations- und Geburtenraten mit 40,0 % bzw. 60,0 % resultierten

aus Transfers von Embryonen, die sich aus fertilisierten Eizellen mit hoher Anisotropie

entwickelten.

4.1.2.2 Zona pellucida-Imaging immaturer humaner Oocyten

Der über einen Algorithmus berechnete objektive Score von 54 immaturen Oocyten im GV-

oder Metaphase I-Stadium wurde am Tag der Punktion erfasst. Nach einer 24-stündigen in

vitro Kultivierung wiesen 48 Eizellen (88,9 %) eine Veränderung der doppelbrechenden

Eigenschaften auf (Abb. 9). Die Mehrheit der Eizellen tendierte zu einem niedrigeren Score,

jedoch konnten aufgrund des geringen Stichprobenumfangs keine signifikanten Unterschiede

nachgewiesen werden.

Ergebnisse 43

Tabelle 3: Ergebnisse der prospektiven Zona pellucida-Imaging-Studie

Embryotransfer von HZB+HZB HZB+LZB LZB+LZB p

Anzahl ICSI-Zyklen 20 50 65

Patientenalter 33,9 ± 3,6 34,6 ± 4,0 35,4 ± 4,1 n.s.

Anzahl punktierter Oocyten (Metaphase II)

10,9 ± 3,9a 7,6 ± 3,4b 6,7 ± 2,7c a:bc p < 0,005

Anzahl Oocyten HZB 33,5 %a (73/218)

23,3 %b (88/378)

8,3 %c

(36/433) a:b p < 0,01

c:ab p < 0,001

Fertilisationsrate 74,3 %

(162/218) 67,7 %

(256/378) 68,4 %

(296/433) n.s.

Implantationsrate 40,0 %a

(16/40) 26,0 %b (26/100)

13,1 %c (17/130) c:ab p < 0,025

Schwangerschaftsrate 65,0 %a (13/20)

50,0 %b (25/50)

24,6 %c (16/65) c:ab p < 0,005

Abortrate 1/13 5/25 3/13 n.s.

Geburtenrate 60,0 %a (12/20)

40,0 %b (20/50)

20,0 %c (13/65)

a:c p < 0,001 b:c p < 0,025

HZB+HZB = Transfer von 2 Embryonen mit hoch doppelbrechender Zona pellucida, HZB+LZB = Transfer von einem Embryo mit hoch doppelbrechender und einem mit niedrig doppelbrechender Zona pellucida, LZB+LZB= Transfer von 2 Embryonen mit niedrig doppelbrechender Zona pellucida

Abbildung 9: Veränderung des Scores von humanen immaturen Oocyten nach einer 24-

stündigen Kultivierung

0

10

20

30

40

50

60re lativeAnzahl

(%)

höher unverändert niedriger

Zona-Score nach 24 h

GV

Metaphase I

n = 54

Ergebnisse 44

4.2 Ergebnisse der Untersuchungen an bovinen Oocyten

4.2.1 Einfluss des Meiosestadiums boviner Oocyten bei parthenogenetischer

Aktivierung

4.2.1.1 Auswirkung der Maturationsdauer boviner Oocyten auf den Aktivierungs-

erfolg

Insgesamt 218 Eizellen wurden nach 20,5 bis 24 h in vitro Maturation einzeln aktiviert. Die

erhobenen Daten (Tab. 4) zeigen deutlich, dass eine verkürzte Maturation zu einer signifikant

niedrigeren Teilungsrate sowie Blastozystenrate führte (34,2 % bzw. 7,6 %). Mit einer

Teilungsrate von 72,1 % und einer Blastozystenrate von 29,5 % wies eine Maturationsdauer

von 22,5 h die besten Resultate auf. Nach einer längeren Maturation war ein Abfall der Raten

zu beobachten, der jedoch aufgrund des geringen Probenvolumens in der letzten Gruppe

statistisch nicht signifikant war.

Tabelle 4: Teilungsrate und Blastozystenrate am Tag 9 nach parthenogenetischer

Aktivierung boviner Oocyten in Abhängigkeit von der Maturationsdauer

Maturationsdauer 20,5 h 22,5 h 23,5 h 24 h

Teilungsrate 34,2 %a (27/79) 72,1 %b (44/61) 64,8 %c (35/54) 62,5 %d (15/24)

Blastozysten d9 7,6 %e (6/79) 29,5 %f (18/61) 20,4 %g (11/54) 16,7 % (4/24)

a:bc p < 0,001; e:f p < 0,005; a:d p < 0,025; e:g p < 0,05

4.2.1.2 Ergebnisse nach Aktivierung in Abhängigkeit vom Maturationsstadium

In 4 Versuchen wurde das Maturationsstadium in vitro maturierter boviner Oocyten

polarisationsmikroskopisch erfasst. 73,6 % der Eizellen befanden sich im Metaphase II-

Stadium der Meiose, davon waren 64,1 % spindelpositiv (107/167). Insgesamt 227 Eizellen

wurden anschließend einzeln artifiziell aktiviert und bis zum Tag 9 kultiviert. Die

frühembryonale Entwicklung war zwischen Metaphase I- und Metaphase II-Eizellen

signifikant unterschiedlich. Sowohl die Teilungsrate als auch die Blastozystenraten waren bei

der Gruppe signifikant höher, bei der die Aktivierung zum physiologischen Zeitpunkt, also in

Ergebnisse 45

der Metaphase II, erfolgte (Abb. 10). Das höchste parthenogenetische Entwicklungspotential

besaßen dabei die Oocyten, die neben einem Polkörper auch eine Spindel aufwiesen. Eine

darstellbare Spindel im Metaphase I-Stadium führte dagegen nicht zu besseren

Entwicklungsraten. 71,7 % (43/60) der Eizellen mit fehlendem Polkörper waren

spindelpositiv (Tab. 5).

Abbildung 10: Teilungs- und Blastozystenraten nach parthenogenetischer Aktivierung boviner

Metaphase I und Metaphase II-Eizellen

Tabelle 5: Teilungs- und Blastozystenraten nach parthenogenetischer Aktivierung boviner

Oocyten unter Einbeziehung der Spindelkonfiguration

Maturationsstadium Anzahl

(n = 227)

Teilungsrate Blastozystenrate

d7

Blastozystenrate

d9

Metaphase II

Spindel darstellbar 47,1 % ± 18,9

(107/227) 67,3 % ± 20,1a

(72/107) 22,4 % ± 14,4c

(24/107) 34,6 % ± 18,2g

(37/107)

Metaphase II

Spindel nicht darstellbar 26,4 % ± 15,6

(60/227) 56,7 % ± 18,6

(34/60) 28,3 % ±24,4d

(17/60) 31,7 % ± 8,6h

(19/60)

Metaphase I

Spindel darstellbar 19,0 % ± 13,5

(43/227) 46,5 % ± 28,3b

(20/43) 9,3 % ± 7,8e

(4/43) 9,3 % ± 7,8i

(4/43)

Metaphase

Spindel nicht darstellbar 7,5 % ± 11,5

(17/227) 47,1% ± 23,4

(8/17) 11,8 % ± 10,6f

(2/17) 11,8 % ± 10,6

(2/17)

d:e p < 0,001; a:b p < 0,025; c:d p < 0,005; g:i p < 0,005; d:f p < 0,01; h:i p < 0,005 (x ± SD)

0

10

20

30

40

50

60

70relativeAnzahl

(%)

TR Bl d7 Bl d9

Metaphase I (n=60)Metaphase II (n=167)

p < 0,025 p < 0,025 p < 0,001

63,47 ±13,2

24,6 ±12,3

33,5 ±14,2

46,7 ±17,2

10,0 ±9,3

10,0 ±9,3

(x ± SD)

Ergebnisse 46

4.2.1.3 Hoechst-Färbung 20 h nach Aktivierung boviner Oocyten

Vor der parthenogenetischen Aktivierung wurden 132 in vitro maturierte Oocyten auf das

Vorhandensein eines Polkörpers und einer Spindel überprüft. 75,8 % wurden auf diese Weise

als Metaphase II-Eizellen eingestuft. Am Tag 1 befanden sich über 50 % der untersuchten

Eizellen im Pronucleus-Stadium, 24 % hatten bereits die erste Teilung durchlaufen. 22 %

waren in einem Meiose-Stadium arretiert (Abb.11).

In Tabelle 6 zeichnet sich eine Abhängigkeit von der Maturationsdauer ab. Bei verkürzter

Maturation war die Zahl der Eizellen, die im Meiose-Stadium stagnierten, höher (33,3 % vs.

17,8 %). Entsprechend war der Prozentsatz der Eizellen, die sich geteilt hatten, niedriger (13,9

% vs. 28,1 %). Dieser Zusammenhang ließ sich jedoch nur zum Teil biometrisch absichern.

Zwischen Metaphase I- und Metaphase II-Stadium zum Aktivierungszeitpunkt gab es keine

signifikanten Unterschiede, jedoch war nach 22-stündiger Maturation eine höherer

Prozentsatz von Meiose-Stadien in der Metaphase I-Gruppe zu erkennen (25,9 % vs. 14,5 %).

Tabelle 7 differenziert die Oocyten detailliert nach der Spindeldarstellbarkeit. Auch in diesen

Versuchen war zu erkennen, dass spindelpositive Metaphase II-Eizellen zu den besten

Ergebnissen führten: Im Vergleich mit Metaphase II-Stadien ohne Spindel hatte diese Gruppe

signifikant mehr Teilungsstadien (28,9 % vs. 8,3 %) und weniger Meiose-Stadien (18,4 % vs.

33,3 %), was jedoch nicht signifikant war. Die Spindelexistenz schien bei Eizellen ohne

Polkörper für die Aktivierung keinen entscheidenden Einfluss zu besitzen, jedoch waren die

Fallzahlen zu gering, um dies statistisch abzusichern.

Abbildung 11: DNA-Konfiguration 20 h nach Aktivierung boviner Oocyten. Meiose-Stadium

(A), Vorkernstadium (B), 2-Zellstadium (C)

A B C

Ergebnisse 47

Tabelle 6: Ergebnisse der DNA-Färbung 20 h nach parthenogenetischer Aktivierung

boviner Oocyten

Maturationsdauer Maturationsstadium

(vor Aktivierung)

Anzahl

Oocyten

20 h nach

Aktivierung 20 h 22 h Gesamt

Meiose-Stadium 38,7 %a

(12/31) 14,50 %b

(10/69) 22,0 %

(22/100)

Vorkernstadium 48,4 % (15/31)

56,5 % (39/69)

54,0 % (54/100)

Metaphase II 75,8 %

(100/132)

2-Zell-Stadium 12,9 % (4/31)

29,0 % (20/69)

24,0 % (54/100)

Meiose-Stadium 0,0 % (0/5)

25,9 % (7/27)

21,9 % (7/32)


48,2 % (13/27)

53,1 % (17/32)

Metaphase I 24,2 %

(32/132)

2-Zell-Stadium 20,0 % (1/5)

25,9 % (7/27)

25,0 % (8/32)


17,7 % (17/96)

22,0 % (29/132)


54,2 % (52/96)

53,8 % (71/132)

Gesamt 132

2-Zell-Stadium 13,9 %c

(5/36) 28,1 %d

(27/96) 24,2 %

(32/132)

a:b p < 0,001; c:d p < 0,01

4.2.1.4 Messung der initialen Ca2+-Freisetzung in bovinen Oocyten

Exemplarisch wurden an bovinen in vitro maturierten Eizellen im Metaphase I- und

Metaphase II-Stadium [Ca2+]i-Messungen nach Zugabe von Ionomycin vorgenommen (Abb.

12). Unabhängig vom Meiosestadium reagierten die Eizellen mit einem sofortigen Anstieg

der intrazellulären Konzentration freier Ca2+-Ionen. Wie bereits in der Literatur beschrieben

(NAKADA u. MIZUMO 1998), produzierten die Oocyten nach Ionomycin-Zugabe einen

einzelnen Peak und fielen dann auf ihr basales Niveau der [Ca2+]i zurück. Eizellen mit einem

Polkörper hatten dabei initial eine höhere Amplitude der relativen Fluoreszenz-Intensität und

damit eine stärkere Freisetzung von Ca2+-Ionen.

Ergebnisse 48

Tabelle 7: Ergebnisse der DNA-Färbung 20 h nach parthenogenetischer Aktivierung

boviner Oocyten unter Einbeziehung der Spindelkonfiguration

Maturationsstadium Anzahl Oocyten 20 h nach Aktivierung



Metaphase II

Spindel darstellbar

76,0 %

(76/100)

2-Zell-Stadium 29,0 % (22/76)a


Vorkernstadium 58,4 % (14,24)

Metaphase II

Spindel nicht darstellbar

24,0 %

(24/100)

2-Zell-Stadium 8,3 % (2/24)b



Metaphase I

Spindel darstellbar

59,4 %

(19/32)

2-Zell-Stadium 21,1 % (4/19)



Metaphase I

Spindel nicht darstellbar

40,6 %

(13/32)

2-Zell-Stadium 30,8 % (4/13)

a:b p < 0,05

Abbildung 12: Messung der Ca2+-Freisetzung nach Aktivierung mit Ionomycin (Pfeil) in 3

bovinen Oocyten im Metaphase I-Stadium. Die kleineren Schwankungen sind

durch äußere Lichteinflüsse bedingt.

Metaphase I

2.000

2.500

3.000

3.500

0.0 300.0 600.0 900.0

Zeit (s)

rela

tive

Inte

nsitä

t

Ergebnisse 49

4.2.2 Zona pellucida-Imaging boviner Oocyten

2142 polarisationsmikroskopische Zona pellucida-Messungen wurden im bovinen Modell mit

dem objektiven Messmodul vorgenommen. Bereits bei den ersten Untersuchungen wurde

zum einen deutlich, dass die innere Schicht der bovinen Zona sehr viel höhere

doppelbrechende Eigenschaften besitzt als jene humaner Eizellen (Abb. 13). So liegt der

Zona-Score deutlich im positiven Bereich. Zum anderen waren jedoch auch individuelle

Unterschiede zu erkennen.

Abbildung 13: Bovine Oocyte nach in vitro Maturation. Hoffmann-Kontrast-Aufnahme (A),

Polarisationsmikroskopisches Bild (B).

4.2.2.1 Zona pellucida-Imaging immaturer boviner Oocyten nach BCB-Färbung

Als qualitatives Unterscheidungsmerkmal für die Entwicklungskompetenz von Oocyten

wurde zunächst eine BCB-Vitalfärbung in vorselektierten immaturen COCs vorgenommen

und damit die G6PDH-Aktivität festgestellt. Auf diese Weise wurden 772 Oocyten (47,3 %)

als BCB+ klassifiziert und mit guter Qualität bewertet; das Ooplasma von 859 Eizellen (52,7

%) war nicht oder nur schwach gefärbt. Diese wurden mit BCB- bezeichnet.

Bei 836 Oocyten wurde ein Zona-Imaging durchgeführt. Die zuvor als qualitativ gut

bewerteten Eizellen unterschieden sich hochsignifikant in allen erhobenen Parametern von

den schlechter klassifizierten. Die Mittelwerte der BCB-positiven Eizellen lagen unter denen

der anderen Gruppe (Tab. 8).

A B

Ergebnisse 50

Tabelle 8: Zona-Imaging in immaturen bovinen Oocyten nach BCB-Färbung

Immature Oocyten Anzahl CV-Wert PV-Wert Score

BCB + 406 21,67 ± 4,62a 41,59 ± 9,12c 33,09 ± 14,51e

BCB - 430 24,92 ± 4,94b 46,16 ± 9,30d 39,04 ± 14,70f

a:b p < 0,001; c:d p < 0,001; e:f p < 0,001

4.2.2.2 Zona pellucida-Imaging maturer boviner Oocyten

In Tabelle 9 sind die Zonaparameter von 446 bovinen Eizellen nach in vitro Maturation

aufgeführt. Auffällig ist, dass die Durchschnittswerte der nicht bis zum Metaphase II-Arrest

maturierten Eizellen höher sind als die, bei denen ein Polkörper nachgewiesen werden konnte.

Die Unterschiede erwiesen sich als statistisch hoch signifikant.

Tabelle 9: Zona-Imaging in maturen bovinen Oocyten

Mature Oocyten Anzahl CV-Wert PV-Wert Score

Metaphase II 75,6 % (337/446) 24,63 ± 6,73a 48,13 ± 13,44c 39,67 ± 18,04e

Metaphase I 24,4 % (109/446) 28,99 ± 7,33b 56,52 ± 14,77d 51,80 ± 20,57f

a:b p < 0,001; c:d p < 0,001; e:f p < 0,001

4.2.2.3 Vergleich der parthenogenetischen Entwicklung nach Zona pellucida-Imaging

365 maturierte Eizellen wurden in 3 Versuchen artifiziell aktiviert und vor der in vitro

Kultivierung einem Zona-Imaging unterzogen. Die Teilungsrate betrug 78,6 % (287/365); am

Tag 7 waren 31,5 % (115/365) zu Blastozysten entwickelt. Diese Rate steigerte sich bis zum

Tag 9 der Kultivierung auf 36,7 % (134/365). Ein Schlüpfen konnte bei 50 Eizellen

beobachtet werden (13,7 % der aktivierten Eizellen bzw. 37,3 % der Blastozysten). Die

parallel durchgeführte Kontrollen (n = 196), die ohne polarisationsmikroskopische

Untersuchung und nicht im MiniWell-System kultiviert wurden, waren von diesen

Ergebnissen nicht signifikant unterschiedlich. Nach künstlicher Aktivierung teilten sich 140

Eizellen der Kontrollgruppe (71,4 %). Am Tag 9 wurden 83 Blastozysten gezählt (42,3 %).

(x ± SD)

(x ± SD)

Ergebnisse 51

Davon waren 31 aus der Zona pellucida geschlüpft (15,8 % der aktivierten Kontrolleizellen

bzw. 37,3 % der Kontroll-Blastozysten).

Der Vergleich des Zona-Imagings zwischen den Oocyten mit positiver parthenogenetischer

Entwicklung und denen mit weniger großem Potential ist in Tabelle 10 wiedergegeben. Die

oben beschriebenen Ergebnisse, dass die Zonaparameter bei den qualitativ überlegenen

Oocyten niedriger angesiedelt sind, spiegeln sich tendenziell auch in diesem Versuch wider.

Tabelle 10: Vergleich der PV-, CV- und Scorewerte nach parthenogenetischer Aktivierung

Anzahl CV-Wert PV-Wert Score

geteilt 287 22,07 ± 4,16 42,33 ± 7,69 31,25 ± 9,91 Teilungsrate

d3 nicht geteilt 78 23,06 ± 5,05 43,87 ± 8,76 33,24 ± 11,86

Blastozyste 115 21,39 ± 3,94a 41,50 ± 7,42 30,51 ± 9,39 Blastozystenrate

d7 keine Blastozyste 172 22,53 ± 4,23b 42,88 ± 7,82 31,74 ± 10,21

geschlüpft 50 21,19 ± 4,08 41,04 ± 7,41 29,41 ± 8,75 Schlupfrate

d9 nicht geschlüpft 84 21,98 ± 4,09 42,51 ± 7,67 31,70 ± 9,69

a:b p < 0,025

4.2.2.4 Zona pellucida-Imaging 21 h p.ins. – Vergleich der frühembryonalen

Entwicklung

Für den Vergleich der Zona pellucida-Eigenschaften in polarisiertem Licht im Hinblick auf

die weitere embryonale Entwicklungsfähigkeit der Eizellen wurde das Imaging 21 h nach

Zugabe der paternalen Gameten vorgenommen, da Eizellen ohne umgebenden

Cumuluskomplex nicht physiologisch befruchtet werden können, eine Denudierung für die

polarisationsmikroskopische Zona-Analyse aber unverzichtbar ist. Die Cumuluszellen bilden

während der Fertilisation ein spermienselektierendes Mikromilieu für die Eizell-Spermien-

Interaktion (ZHANG et al. 1995, TANGHE et al. 2002).

Die Teilungs- sowie Blastozystenraten von Versuch und Kontrollen sind in Tabelle 11

aufgeführt. Der Transport nach der in vitro Fertilisation vom kooperierenden Labor ins

Hauptlabor bedingte eine niedrigere Teilungsrate sowie d9-Blastozystenrate. Mit einer

(x ± SD)

Ergebnisse 52

Teilungsrate von über 80 % und über 30 % entwickelten Blastozysten waren die IVF-

Ergebnisse der Versuche vergleichbar mit denen der mittransportierten Kontrolloocyten.

Tabelle 11: Übersicht über Teilungs- und Blastozystenraten im Vergleich mit Kontrollen

Versuch Kontrolle mit Transport

Kontrolle ohne Transport

Teilungsrate d3 80,5 % ± 3,5a

(334/415) 76,3 % ± 5,7b

(161/211) 88,3 % ± 2,2c

(188/213)

Blastozystenrate d7 26,0 % ± 3,5 (108/415)

26,1 % ± 3,7 (55/211)

25,8 % ± 7,6 (55/213)

Blastozystenrate d9 39,4 % ± 5,3d

(196/495) 34,1 % ± 8,5e

(72/211) 49,3 % ± 7,4f

(105/213)

a:c p < 0,01; d:f p < 0,01; b:c p < 0,005; e:f p < 0,005

Der Vergleich der embryonalen Entwicklung am Tag 3 zeigte signifikante Unterschiede

zwischen Eizellen, die sich zu Embryonen mit mindestens 2 Blastomeren entwickelten, und

solchen, die ungeteilt arretierten. Dabei wiesen die später geteilten Eizellen die niedrigeren

Durchschnittswerte aller Zonaparameter auf. Die Oocyten, die sich am Tag 7 der Kultivierung

bis zum Blastozystenstadium gefurcht hatten, besaßen ebenso die hochsignifikant niedrigeren

Zona-Mittelwerte verglichen mit den Eizellen, deren Entwicklung nicht so fortgeschritten

war. Innerhalb dieser Gruppe hatte die Zona der Eizellen, die bereits am Tag 7 expandierte

Blastozysten waren, signifikant niedrigere doppelbrechenden Eigenschaften als die Zona jener

Eizellen, die noch nicht so weit entwickelt waren. Auch bis zum Tag 9 geschlüpfte

Blastozysten gingen im Vergleich mit den nicht gehatchten aus Eizellen mit niedrigeren

Zona-Mittelwerten hervor (Tab.12).

Insgesamt war die durchschnittliche Doppelbrechung der Zonae von Oocyten mit dem

größeren embryonalen Entwicklungspotential signifikant niedriger.

(x ± SD)

Ergebnisse 53

Tabelle 12: Vergleich von PV-, CV- und Scorewerten und des embryonalen Entwicklungs-

potentials

Anzahl CV-Wert PV-Wert Score

geteilt 334 25,28 ± 6,00 48,25 ± 12,11 38,71 ± 15,08

nicht geteilt 81 27,38 ± 6,89 51,79 ± 13,37 43,73 ± 16,87

Teilungsrate

d3 p p < 0,02 p < 0,05 p < 0,02

Blastozyste 108 23,72 ± 5,72 44,93 ± 11,09 34,38 ± 13,18

keine Blastozyste 226 26,03 ± 5,98 49,83 ± 12,26 40,77 ± 15,49

Blastozysten

rate d7 p p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001

expandiert 32 21,39 ± 3,80 40,75 ± 8,02 30,02 ± 10,16

nicht expaniert 76 24,69 ± 6,10 46,69 ± 11,72 36,21 ± 13,85

Expansion d7

p p < 0,002 p < 0,005 p < 0,02

geschlüpft 102 23,66 ± 5,67 44,28 ± 10,98 32,83 ± 13,45

nicht geschlüpft 94 25,79 ± 6,15 48,01 ± 11,81 37,51 ± 14,75

Schlupfrate

d9 p p < 0,02 p < 0,025 p 0,025

(x ± SD)

Diskussion 54

5 Diskussion

Die Beurteilung der Eizell-Qualität gewinnt sowohl in der humanen wie auch in der bovinen

assistierten Reproduktionsmedizin als Beitrag zum besseren Verständnis der physiologischen

Abläufe und zur weiteren Optimierung der Erfolgsraten immer mehr an Bedeutung. In der

vorliegenden Arbeit sollte überprüft werden, ob die polarisationsmikroskopische Darstellung

des meiotischen Spindelapparats sowie der Zona pellucida ein geeignetes Verfahren zur

Charakterisierung des Entwicklungspotentials von Eizellen ist.

5.1. Meiotische Spindel in humanen Oocyten

Aufgrund ihres Aufbaus aus Mikrotubuli ist die Spindel eine dynamische Struktur, die sich

polarisationsmikroskopisch visualisieren lässt. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin,

dass die Untersuchungen keine spezielle Färbetechnik erfordern und daher nicht-invasiv und

zellerhaltend erfolgen. Darüber hinaus ermöglichen Zeitrafferaufnahmen ein direktes

Verfolgen dieser Dynamik. So zeigte sich in initialen zeitabhängigen Studien bei der

Metaphase I-Spindel während der weiteren Maturation eine Intensitätszunahme der

Anisotropie, wobei die Spindel zur Abschnürung des ersten Polkörpers eine Brücke zwischen

Polkörper und Cytoplasma bildete. Vor der Entstehung der Metaphase II-Spindel war eine

zwischenzeitliche Dissoziation zu beobachten.

Eine Verstärkung der Doppelbrechung konnte nach artifizieller Aktivierung bereits in

murinen Metaphase II-Spindeln nachgewiesen werden (LIU et al. 2000b, NAVARRO et al.

2005). Vermutlich wird sie durch eine höhere Konzentration an Mikrotubuli, einhergehend

mit einer noch geordneteren Ausrichtung, verursacht.

Die beobachtete Spindelbrücke zeigt eine noch nicht abgeschlossene Meiose I an, obwohl der

erste Polkörper schon sichtbar ist. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist somit, dass nicht

jede Eizelle, die lichtmikroskopisch aufgrund ihres abgeschnürten ersten Polkörpers als

Metaphase II klassifiziert wird, sich auch tatsächlich in diesem Stadium befindet. In

polarisiertem Licht lässt sich vielmehr nachweisen, dass sie noch die späte Telophase I

durchlaufen kann und die Aktivierung durch ICSI zu einem unphysiologischen Zeitpunkt

Diskussion 55

erfolgen würde. Dieses Phänomen bestätigt Berichte von EICHENLAUB-RITTER (2002)

und DE SANTIS et al. (2005).

Der weitere Verlauf der Langzeitbeobachtung zeigte, dass eine dissoziierte Spindel nicht

unbedingt eine Dysfunktion impliziert, sondern während des Übergangs in die Meiose II auch

physiologisch sein kann. Dies wird durch eine zweimalige Spindel-Untersuchung vor der

ICSI mit einer größeren Fallzahl belegt. Mehr als die Hälfte der Eizellen, die bei der ersten

Untersuchung spindel-negativ waren, wies bei der Wiederholung nach 2 h einen

visualisierbaren Spindelapparat auf. Das bedeutet, dass eine einmalige

polarisationsmikroskopische Analyse nicht ausreicht, um eine Eizelle als eindeutig spindel-

negativ zu klassifizieren.

Im Einklang mit anderen Autoren (WANG et al. 2001b, COHEN et al. 2004, SHEN et al.

2006) korrelierte eine Spindelpräsenz mit einer signifikant höheren Fertilisationsrate im

Vergleich zur Befruchtungsrate spindel-negativer Eizellen. Dabei spielte der Zeitpunkt der

Darstellbarkeit (1. oder 2. Imaging) keine Rolle. Schon beim ersten Imaging konnte bei

80,7% der Oocyten eine Spindel dargestellt werden, beim zweiten Imaging betrug die Quote

91,4 %. Diese Zahlen stimmen mit anderen veröffentlichten Studien überein (DE SANTIS et

al. 2005, SHEN et al. 2006, RAMA RAJU et al. 2007). Außerdem sind sie ein Zeichen dafür,

dass die Rahmenbedingungen im Labor, die die Polymerisation von Mikrotubuli

beispielsweise durch suboptimale Temperaturbedingungen negativ beeinflussen können,

akzeptabel sind. Ebenso ist die durchschnittliche Fertilisationrate von 76,7 % nach ICSI

vergleichbar mit den Daten aus dem deutschen IVF-Register (FELBERBAUM et al. 2007).

Da die Spindelbrücke zwischen Polkörper und Ooplasma nur in polarisiertem Licht erkennbar

ist, jene Eizellen aber mit herkömmlichen lichtmikroskopischen Verfahren als matur

diagnostiziert werden, ist dieses Meiose-Stadium kritisch zu betrachten.

Eine zu diesem unphysiologischen Zeitpunkt durchgeführte ICSI führte größtenteils zu einer

anomalen Fertilisation mit fehlendem 2. Polkörper und Ausbildung von 3 Vorkernen. Analog

zeigte die Mehrzahl der Eizellen nach artifizieller Aktivierung durch Ca2+-Ionophor ebenfalls

keinen 2. Polkörper und 2 Vorkerne. Metaphase II-Oocyten schnüren dagegen nach

Aktivierung einen zweiten Polkörper ab; nach ICSI bilden sich 2 Vorkerne, nach

parthenogenetischer Aktivierung dementsprechend ein Vorkern (YAMANO et al. 2000).

Diskussion 56

Eine Erklärung für diese Entwicklung ist das Spindel-Verhalten, das in Zeitrafferstudien nach

artifizieller Aktivierung beobachtet werden konnte. Die Metaphase I-Spindel wurde mit dem

sich bildenden ersten Polkörper abgeschnürt und dissoziierte dort. Eine erneute

Polymerisation von Mikrotubuli zur zweiten meiotischen Spindel konnte nicht dargestellt

werden. Somit erfolgt zwar eine Aktivierung der Eizelle, jedoch kann die Meiose II nicht

beendet werden und eine physiologische Segregation der Schwester-Chromatiden unterbleibt.

Dadurch wird ein zusätzlicher Vorkern formiert, während die Bildung eines 2. Polkörpers

nicht stattfindet. Für eine endgültige Verifizierung dieser Erklärung müsste eine

Chromosomenfärbung durchgeführt werden.

Eine Studie von BALAKIER et al (2004) mit in vitro nachgereiften Oocyten sowie eine

weitere Veröffentlichung von HYUN et al. (2007) mit in vitro maturierten Eizellen belegen,

dass die ICSI innerhalb von 3 h bzw. 1 h nach Abschnürung des ersten Polkörpers zu

schlechteren Befruchtungsraten führt.

Diese Ergebnisse sowie die eigenen Resultate zeigen, dass mit dem lichtmikroskopisch

sichtbaren ersten Polkörper erst zeitlich verzögert der Meiose II-Arrest erreicht wird. Eine

Eizell-Aktivierung vor Vollendung der Maturation führt zu anomalen und schlechteren

Fertilisationsraten.

Insgesamt ist die polarisationsmikroskopisch darstellbare Metaphase II-Spindel ein Zeichen

der abgeschlossenen nukleären Maturation und als solches ein positives Qualitätsmerkmal der

Eizelle. Die mitunter widersprüchlichen Studien könnten auf die spindeleigene Dynamik

zurückzuführen sein.

Etwa 80 % der untersuchten Eizellen sind in der Spindelanalyse unauffällig. Außerdem

bedeutet die Untersuchung durch das Drehen und Wenden zusätzliche Zeit außerhalb des

Inkubators und muss aufgrund der zwischenzeitlichen Dissoziation zweimal durchgeführt

werden. In der Literatur beschriebene quantitative Messungen (SHEN et al. 2006) bedeuten

einen weiteren Zeitaufwand und sind auch in der Metaphase II-Spindel variabel (MONTAG

et al. 2007). Aktuelle Untersuchungen haben zudem ergeben, dass eine Spindel-schonende

ICSI nicht zu besseren Ergebnissen hinsichtlich Fertilisationsrate und Embryoqualität führt

(WOODWARD et al. 2008).

Daher scheint das Verfahren für die tägliche Routine in Relation zur Aussage zu aufwendig

zu sein, ist aber ein wichtiges Hilfsmittel bei Problempatienten, um die nukleäre Reife

Diskussion 57

darzustellen und den Zeitpunkt der ICSI zu optimieren. Dieses Ergebnis ist insbesondere bei

Patienten im ART-Programm mit wenigen Eizellen von Bedeutung, da durch die

polarisationsmikroskopische Spindelbetrachtung jede Eizelle zum optimalen Zeitpunkt

injiziert und letztlich verwendet werden kann.

5.2 Zona pellucida in humanen Oocyten

Polarisationsmikroskopisch stellt sich die Zona pellucida als multilaminäre Matrix dar. Die

zentrale Aussage der hier durchgeführten prospektiven Studie ist, dass die optisch

doppelbrechenden Eigenschaften der inneren Zonaschicht Rückschlüsse auf das

Entwicklungspotential der Eizelle zulassen. Oocyten mit einer subjektiv stark

doppelbrechenden inneren Zonaschicht wiesen nach ICSI am Tag 3 eine signifikant bessere

embryonale Entwicklung auf und hatten nach Transfer signifikant höhere Implantations-,

Graviditäts- sowie Geburtenraten. Dabei liegen die Werte sehr deutlich über dem

Durchschnitt, der dem deutschen IVF-Register zu entnehmen ist (FELBERBAUM et al.

2007).

Die vorliegende Studie stärkt mit einem wesentlich größeren Datenumfang die Ergebnisse

von SHEN et al. (2005) und RAMA RAJU et al. (2007), die eine Korrelation zwischen

Gravidität bzw. Blastozystenentwicklung und hoher Anisotropie der inneren Lamina

feststellen konnten. Dagegen kann man mit herkömmlichen lichtmikroskopischen Verfahren

über die Beurteilung der Zona pellucida keine Aussage über die Eizell-Qualität machen (TEN

et al. 2007).

Eine höhere Anisotropie wird vermutlich durch eine geordnetere oder auch dichtere Textur

der Mikrofilamente hervorgerufen. Es ist naheliegend zu interpretieren, dass diese Struktur

eine optimalere Follikulogenese reflektiert, zumal bereits elektronenmikroskopisch

ultrastrukturelle Unterschiede der Zona pellucida zwischen unterschiedlichen Maturations-

und Entwicklungsstadien sowie zwischen in vivo und in vitro Kultivierung festgestellt

wurden (FAMILIARI et al. 2006, MERTENS 2006). Da insbesondere die innere Zonaschicht

vorwiegend aus eizelleigenen Glycoproteinen besteht (QI et al. 2002), könnten niedrige

doppelbrechende Eigenschaften der inneren Lamina somit Ausdruck einer cytoplasmatischen

Diskussion 58

Dysfunktion sein. Dagegen spiegelt eine homogen-intensive Doppelbrechung eine gute

Eizell-Qualität wider.

Ein weiteres Resultat der eigenen Studie war außerdem, dass nur 19,1 % aller untersuchten

Eizellen als hoch doppelbrechend klassifiziert wurden. Das bedeutet, dass der gewonnene

Eizell-Pool nach kontrollierter ovarieller Hyperstimulation vorwiegend aus Eizellen besteht,

die eine suboptimale Follikulogenese durchlaufen haben oder auch Follikel punktiert werden,

die in einem atretischen Stadium sind. Die Anzahl der entwicklungskompetenten Eizellen

könnte daher durch Optimierung der Stimulationsprotokolle erhöht werden.

Das nach 24stündiger in vitro Kultivierung wiederholte Zona-Imaging an immaturen Oocyten

zeigte eine Veränderung der optischen Eigenschaften und damit auch eine Veränderung des

strukturellen Aufbaus der inneren Zonaschicht. Tendentiell war eine abnehmende Intensität

der Doppelbrechung zu beobachten. JELINKOVA et al. (2007) analysierten immature Stadien

mit dem objektivierten Meßsystem und berichteten von sehr hohen Werten. In der hier

vorliegenden Arbeit wurde der Maturationsstatus nicht erneut erfasst, jedoch könnte es sein,

dass eine extrem hohe Anisotropie auch Ausdruck einer fehlenden Reife sein kann.

Die Ergebnisse zeigen, dass durch die subjektive Beurteilung der inneren Zonaschicht in

polarisiertem Licht eine effizientere Selektion der Eizellen und eine höhere klinische

Schwangerschaftsrate möglich sind. Damit ist die polarisationsmikroskopische Analyse der

Zona pellucida eine aussagekräftige Möglichkeit, die Eizell-Qualität näher zu bestimmen.

Da aufwendige quantitative Messungen entfallen, ist diese Methode mit etwas Training leicht

in die Labor-Routine zu integrieren. Inzwischen ist außerdem seitens des Herstellers ein

zusätzliches Software-Modul entwickelt worden, durch das eine Objektivierung erreicht wird

(siehe 3.3.3.3). Dieses System wird bereits in mehreren Laboren angewendet.

5.3 Maturationsstatus als Qualitätsmerkmal der bovinen Eizelle

Im Unterschied zu den Untersuchungen an humanen Oocyten wurden alle bovinen Oocyten in

vitro maturiert. Um das Entwicklungspotential bewerten zu können, wurden die Eizellen

artifiziell aktiviert, da eine konventionelle IVF aufgrund der entfernten Cumuluszellen keine

Diskussion 59

erfolgversprechende Alternative war. Aus den diversen Möglichkeiten der künstlichen

Aktivierung von Eizellen wurde in dieser Arbeit ein etabliertes Aktivierungsprotokoll

bestehend aus der Kombination eines Ca2+-Ionophors mit nachfolgender mehrstündiger

Inkubation von DMAP benutzt. Dieses Vorgehen wurde in den letzten Jahren von vielen

Autoren zur Aktivierung im Rahmen des somatischen Kerntransfers beim Rind erfolgreich

verwendet (CIBELLI et al. 1998, WELLS et al. 1999, WRENZYCKI et al. 2001b, VAJTA et

al. 2003). Spezifischer als Cycloheximid inhibiert DMAP Serin-Threonin-Proteinkinasen und

inaktiviert damit MPF sowie die MAP-Kinase. Nachteilig ist, dass auch andere Serin-

Threonin-Proteinkinasen gehemmt werden, so dass weitere negative Effekte nicht

auszuschließen sind. Kürzlich berichtete eine Autorengruppe von einer erhöhten Anzahl an

chromosomalen Abnormalitäten nach Aktivierung mit DMAP (BHAK et al. 2006). Die

Verbesserung der Aktivierungseffizienz bleibt weiterhin im Fokus der Forschung, jedoch

konnten mit dem hier eingesetzten Protokoll und der danach beobachteten

parthenogenetischen Entwicklung Rückschlüsse auf die Eizell-Qualität gezogen werden.

Ein erstes Ergebnis war, dass die Länge der in vitro Maturation einen Einfluss auf den

parthenogenetischen Aktivierungserfolg hat. Die besten Ergebnisse konnten nach 22,5 h IVM

mit einer Teilungsrate von 72,1 % und einer Blastozystenrate von 29,5 % erreicht werden.

Die Daten sind vergleichbar mit den Versuchen von RHO et al. (1998) sowie WANG et al.

(2007). Eine verkürzte IVM führte zu signifikant schlechteren Ergebnissen. Sie ist dadurch zu

erklären, dass ein Großteil der Eizellen noch nicht ausreichend ausgereift war und daher nicht

adäquat auf den externen Stimulus reagieren konnte. Dies kann außerdem durch eine Studie

von WEHREND u. MEINECKE (2001) belegt werden; sie zeigten, dass in bovinen Oocyten

der Übergang Anaphase I/Telophase I etwa nach 19 h IVM stattfindet, parallel dazu sinkt

zwischenzeitlich die MPF-Aktivität.

Die genauere Analyse des Maturationsstatus enthüllte, dass 73,6 % der Eizellen das

Metaphase II-Stadium erreicht hatten, davon besaßen 64,1 % eine polarisationsmikroskopisch

darstellbare Spindel. Der Prozentsatz der maturen Eizellen nach IVM ist mit den Daten

anderer Autoren vergleichbar (ALM et al. 2005). In dieser Arbeit wurden alle bovinen

Eizellen ohne ersten Polkörper als Metaphase I definiert, da im Gegensatz zu humanen oder

murinen Oocyten ein GV-Stadium nicht lichtmikroskopisch zu erkennen ist. Da aber 71,7 %

dieser Oocyten spindel-positiv waren, kann man davon ausgehen, dass sich der größte Anteil

Diskussion 60

tatsächlich in der Metaphase I befand. Insgesamt gestaltete sich aufgrund der Granulation die

Spindeldarstellung schwieriger als bei anderen Spezies. Der Anteil an Eizellen mit in

polarisiertem Licht darstellbaren Spindeln lag im Vergleich zu den humanen Spindelanalysen

niedriger; dies kann unterschiedliche Ursachen haben. Zum einen stammen die bovinen

Oocyten aus in vitro Maturation, zum anderen wurde die Maturationsdauer teilweise bewusst

verkürzt. Ein weiterer Grund für eine in polarisiertem Licht nicht sichtbare Spindel

insbesondere in Metaphase II-Eizellen liegt darin, dass die bovinen COCs aus

Schlachthofovarien stammen und ein gewisser Prozentsatz an atretischen oder gealterten

Eizellen nicht nach den morphologischen Kriterien zu selektieren ist. Außerdem sind

Spindeln bedingt durch ihren Aufbau aus Mikrotubuli dynamische Strukturen. Die Sensitivität

gegenüber Temperatur- und pH-Veränderungen sowie Energieimbalanzen wurde bereits von

humanen und murinen Spindeln beschrieben (WANG et al. 2001c, SUN et al. 2004, ZENG et

al. 2007). AMAN u. PARKS (1994) berichten über bis zu 30 % nicht darstellbare Spindeln in

bovinen Eizellen bereits nach 5 min Exposition bei 25 °C. Nicht gänzlich auszuschließen sind

geringgradige Temperaturabweichungen während des zweimaligen Transports (Schlachthof-

kooperierendes Labor-Hauptlabor), die die Spindelstruktur negativ beeinflusst haben könnten.

Da darauf geachtet wurde, dass längere Manipulationen außerhalb des Brutschranks in

HEPES-gepuffertem Medium vorgenommen wurden, ist ein abweichender pH-Wert als

mögliche Ursache für eine deorganisierte Spindel eher auszugrenzen. Um einen möglichen

negativen Einfluss durch die in vitro Maturation genauer zu untersuchen, wäre eine

polarisationsmikroskopische Analyse von bovinen Eizellen nach in vivo Maturation äußerst

aufschlussreich.

Das parthenogenetische Entwicklungspotential der Metaphase II-Eizellen war signifikant

höher als das der Eizellen ohne ersten Polkörper. Dieses Ergebnis war zu erwarten, da

Eizellen mit abgeschnürtem ersten Polkörper in ihrem Reifungsprozess weiter fortgeschritten

sind. Ein darstellbarer Spindelapparat während der Metaphase I führte zu keinen besseren

Resultaten, da die Aktivierung in beiden Gruppen zu einem unphysiologischen Zeitpunkt

stattfand. Im Gegensatz dazu hatten Metaphase II-Eizellen mit Spindel nach artifizieller

Aktivierung ein höheres Entwicklungspotential. Dieses Ergebnis entspricht den Erfahrungen

nach ICSI in der humanen assistierten Reproduktion.

Diskussion 61

Für weitere Analysen wurde in einer zweiten Versuchsreihe die Kultivierung 20 h nach

Aktivierung beendet und eine DNA-Färbung durchgeführt. Insgesamt hatten sich bereits 24 %

der Eizellen geteilt, 22 % waren in einem Meiose-Stadium arretiert. BHAK et al. (2006) und

SZÖLLÖSI et al. (1993) beobachteten ebenfalls nach artifizieller Aktivierung von bovinen

bzw. murinen Oocyten mit der Kombination Ca2+-Ionophor und DMAP eine schnellere

Entwicklung. Vermutlich wird die höhere Geschwindigkeit durch die Wirkungsweise von

DMAP hervorgerufen, das eine schnellere Inaktivierung von MPF sowie der MAP-Kinase

induziert.

Nach IVM von 20 h waren mehr Eizellen in einem Meiose-Stadium arretiert, während

signifikant weniger schon die erste Teilung vollendet hatten. Diese Ergebnisse sind analog zu

den schlechteren Blastozystenraten nach verkürzter Maturation und sind durch die frühzeitige

Aktivierung zu erklären. Auch Eizellen, die sich nach 20 h bereits im Metaphase II-Stadium

befanden, zeigten im Vergleich zu einer 22-stündigen Maturation eine signifikant höhere

Anzahl an arretierten Stadien. Eine Erklärung hierfür ist, dass teilweise die cytoplasmatischen

Reifungsvorgänge noch nicht abgeschlossen waren und diese Eizellen daher nicht die

Reaktionskaskade bis zur Vorkernbildung bzw. Furchung durchlaufen können. Diese These

wird gestützt durch eine Studie von DOMINKO u. FIRST (1997), die bei IVF nach einer

frühen Insemination unmittelbar nach Erreichen des Metaphase II-Arrests schlechtere

Entwicklungsraten beobachteten. Bei einer Differenzierung in Eizellen mit bzw. ohne

Polkörper konnten keine signifikanten Unterschiede ausgemacht werden. Tendenziell wiesen

Metaphase I-Eizellen eine höhere Anzahl an arretierten Stadien auf. Auch die Ergebnisse der

eigenen Untersuchungen sprechen für diese Annahme. Analog zu Teilungs- sowie

Entwicklungsraten führte ein darstellbarer Spindelapparat in der Metaphase II zu einer

schnelleren Entwicklung, während er im früheren Meiose-Stadium keinen Einfluss auf die

Parthenogenese zu haben scheint. Hierbei ist allerdings der Stichprobenumfang relativ gering,

so dass dies nicht statistisch abgesichert werden konnte.

Um einen Vergleich schon in der frühen Aktivierungsphase ziehen zu können, wurde eine

Messung der initialen intrazellulären Ca2+-Freisetzung nach Zugabe von Ca2+-Ionophor

durchgeführt. Unabhängig vom Meiose-Stadium wurde ein einzelner Peak induziert, wobei

Metaphase II-Eizellen eine höhere Amplitude aufwiesen. Ca2+-Ionophor hat für bivalente

Ionen eine membranpermeabilisierende Wirkung, so dass sich die Ca2+-Speicher ins

Diskussion 62

Ooplasma entleeren und zudem Ca2+-Ionen aus dem umgebenden Medium in das Cytoplasma

diffundieren können. Die Ca2+-Speicher werden im Verlauf der Maturation im

endoplasmatischen Retikulum angelegt. Eine höhere Amplitude ist gleichzusetzen mit einer

stärkeren Freisetzung, was mit einem ausgereifteren Cytoplasma und einem größeren Ca2+-

Reservoir der Metaphase II-Oocyten zu begründen ist. Vergleichbare Unterschiede wurden

bereits an murinen Eizellen nach Injektion von Spermatozoen nachgewiesen. Immature

Oocyten zeigten dabei kleinere Amplituden und eine niedrigere Frequenz der Oszillation

(MEHLMANN u. KLINE 1994, CARROLL et al. 1996). Die [Ca2+]i-Messung nach Ca2+-

Ionophor ist letztendlich aufgrund des charakteristischen einzelnen Peaks nicht aussagekräftig

genug. Für genauere Aussagen müsste die Analyse auf eine Injektion mit einem

Spermienextrakt ausgedehnt werden, da dort eventuelle Unterschiede im Oszillationsmuster

festzustellen wären. Es scheint jedoch so zu sein, dass die meiotische Spindel hierbei keinen

großen Einfluss hat.

Der Maturationsstatus ist ein wichtiges Qualitätsmerkmal der bovinen Eizelle. Das belegen

nicht nur die hier aufgezeigten Unterschiede während der Parthenogenese, sondern auch

Untersuchungen der präimplantativen Entwicklung nach IVF in Abhängigkeit von der

Maturationsdauer (WARD et al. 2002, PARK et al. 2005).

Die polarisationsmikroskopische Analyse der bovinen meiotischen Spindel gibt Hinweise auf

ein höheres Entwicklungspotential in Metaphase II-Oocyten, jedoch wird diese Methode

aufgrund des Zeitaufwandes und der erforderlichen Denudierung der Eizellen für die

Untersuchung nicht in die konventionelle in vitro Produktion boviner Embryonen zu

integrieren sein. Sie könnte aber zur Verbesserung der ICSI-Raten, bei der Klonierung sowie

für weitergehende Untersuchungen der Spindel-Dynamik eingesetzt werden.

5.4 Zona pellucida in bovinen Oocyten

Bislang existieren in der Literatur wenige Veröffentlichungen über die optischen

Eigenschaften der Zona pellucida in polarisiertem Licht; diese sind auf die Spezies Hamster

(KEEFE et al. 1997) und Mensch (PELLETIER et al. 2004) beschränkt. Nachdem in der

Diskussion 63

eigenen Arbeit übereinstimmend mit anderen Studien (SHEN et al. 2005, RAMA RAJU et al.

2007) die Doppelbrechung der inneren Zonaschicht als potentieller Marker des

Entwicklungspotentials von Eizellen identifiziert wurde, erfolgte die Ausdehnung der

Fragestellung auf das bovine Modell. Da durch eine sehr viel höhere Anisotropie eine

subjektive Einteilung problematisch erschien, wurde die Auswertung mit den entwickelten

objektiven Messparametern vorgenommen. Neben den Parametern CV (Dicke der innneren

Zonaschicht) und PV (mittlere Peak-Intensität) wurde als ein zentraler Wert auch der Score

einbezogen, ein Algorithmus, der auf den ermittelten Messwerten basiert. Ein positiver Score

in humanen Metaphase II-Oocyten steht für eine gute Eizell-Qualität; allerdings wurden

extrem hohe Score-Werte mit schlechterer Blastozystenrate korreliert (JELINKOVA et al.

2007).

Zunächst wurde zur qualitativen Differenzierung immaturer Eizellen eine BCB-Vitalfärbung

durchgeführt. Dabei wurden 47,3 % als BCB+ und damit mit metabolisch guter Qualität

klassifiziert. In einer anderen Arbeitsgruppe rangieren die BCB+ bei 57,9 bis 59,4 % (ALM et

al. 2005, BHOJWANI et al. 2007), dies ist einerseits durch die hier strengere Selektion nur

deutlich angefärbter Oocyten zu erklären, andererseits könnte bereits eine unterschiedliche

Vorselektion der COCs ein Grund sein. Die polarisationsmikroskopische Analyse ergab hoch

signifikante Unterschiede aller polarisationsmikroskopisch erfasster Zonaparameter.

Interessanterweise wies dabei die BCB+ Gruppe die niedrigeren Durchschnittswerte auf.

Hohe Zonawerte, gleichzusetzen mit einer dichteren und geordneteren Struktur der

Mikrofilamente, scheinen in bovinen immaturen Eizellen ein schlechteres

Entwicklungspotential zu bedeuten. Möglicherweise besitzen die Eizellen, deren

Prämaturation noch nicht abgeschlossen ist, eine dichtere innere Zonaschicht, die eine

Penetration von Spermatozoen auch zu einem späteren Zeitpunkt verhindert.

Auch beim Zona-Imaging maturer Eizellen waren statistisch hoch signifikante Unterschiede

zwischen Oocyten mit und ohne Polkörper zu beobachten. Dabei hatten ausgereifte Eizellen

niedrigere Zonaparameter als jene, die noch keinen ersten Polkörper ausgeschleust hatten.

Damit ist die Konstellation ähnlich den immaturen Oocyten, da auch nach Maturation die

qualitativ höher einzuordnenden Metaphase II-Eizellen niedrigere Doppelbrechungs-

intensitäten besitzen. Eine dickere, hoch anisotrope innere Schicht ist also vermehrt in

Eizellen, die trotz in vitro Maturation nicht den Metaphase II-Arrest erreicht haben und so als

Diskussion 64

qualitativ schlechter beurteilt werden. Ursache könnte eine strukturelle Veränderung während

der Entwicklung von Metaphase I zu Metaphase II sein, jedoch konnten PELLETIER et al.

(2004) in humanen Oocyten weder einen Unterschied in der Dicke noch in der

Doppelbrechung zwischen immaturen und maturen Eizellen nachweisen. Der

wahrscheinlichere Grund ist eine suboptimale Maturation, die zur Retardierung führt und sich

auch in der inneren Zonaschicht widerspiegelt. Die in vitro Bedingungen können ebenfalls

einen Einfluss im Sinne des sogenannten Zona hardening ausüben, der hier nicht überprüft

werden konnte.

Um die frühembryonale Entwicklung beurteilen zu können, wurde in einem weiteren Versuch

eine artifizielle Aktivierung durchgeführt. Auch hier hatten qualitativ bessere Eizellen, d.h.

die sich parthenogenetisch teilten und zu Blastozysten entwickelten, niedrigere

Zonaparameter. Dies konnte jedoch überwiegend nicht biometrisch abgesichert werden. Ein

Grund für die nicht so deutlich darstellbare Differenz könnte in der Art der Aktivierung

liegen. Die membranpermeabilisierende Wirkung von Ca2+-Ionophor könnte unspezifischer

wirken als die konventionelle IVF.

Um dies näher zu prüfen, wurde in einem letzten Versuchsansatz die Furchungs- sowie

Blastozystenrate nach IVF als Qualitätsmerkmal untersucht. Das Ergebnis ist analog zu den

vorher gewonnenen Erkenntnissen zu werten. Die qualitativ besseren Eizellen mit dem

höheren Entwicklungspotential, ausgedrückt in ihrer Entwicklungsfähigkeit und

Entwicklungsgeschwindigkeit zur Blastozyste sowie der Fähigkeit zu schlüpfen, hatten

signifikant niedrigere durchschnittliche Zonaparameter.

In jedem dieser Analyseansätze ist das Ergebnis, dass bovine, qualitativ bessere Eizellen

niedrigere Mittelwerte der Zonaparameter haben. Dabei ist sowohl die durchschnittliche

Dicke der inneren Zonaschicht als auch die mittlere Peak-Intensität der Doppelbrechung

niedriger. Insgesamt zeichnet sich die innere Lamina der bovinen Zona pellucida durch eine

sehr hohe Anisotropie aus. Da es in der Literatur vorwiegend Studien gibt, die sich

elektronenmikroskopisch nach Fixation mit der Oberflächenstruktur auseinandersetzen, ist es

schwierig, für diese Ergebnisse eine fundierte Ätiologie zu finden. Naheliegend ist, dass

durch eine sehr dichte Zona eine Fertilisation verhindert wird. Darüber hinaus ist es möglich,

dass diese konzentrierte Textur über die ganze präimplantative Periode beibehalten wird und

so das Hatchen des Embryos unmöglich wird. Ein Indiz dafür ist die Tatsache, dass Oocyten,

Diskussion 65

die bis zum Tag 9 erfolgreich geschlüpft sind, niedrigere Mittelwerte der Zonaparameter

hatten als jene, die als Blastozyste arretierten. Polarisationmikroskopische Untersuchungen

von Blastozysten würden hierzu eventuell weiteren Aufschluss geben. In der Literatur ist

dieses Zona hardening, hervorgerufen durch suboptimale in vitro Kultivierungsbedingungen

sowie Kryokonservierung, eingehend beschrieben (DE FELICI u. SIRACUSA 1982,

MERTENS 2006) und Lösungsmöglichkeiten für ein erfolgreiches Schlüpfen mit

nachfolgender Implantation sind durch das Assisted Hatching beim Mensch und beim Rind

dargestellt worden (COHEN et al. 1992, MONTAG et al. 1999b, SCHMOLL et al. 2003,

RÜTHER 2005). Da bereits in immaturen Oocyten qualitative Unterschiede nachweisbar

waren, scheint die Basis dieser Eigenschaften der Zona pellucida bereits während der

Follikulogenese gelegt zu werden. Die optischen Eigenschaften der inneren Zonaschicht

spiegeln also die cytoplasmatische Integrität der Eizelle wider.

5.5 Vergleichsmöglichkeiten zwischen humaner und boviner Zona

pellucida

Ein unmittelbarer Vergleich zwischen humaner und boviner Zona pellucida in der

vorliegenden Arbeit ist schwierig, da die humanen Eizellen nach Hyperstimulation in vivo

maturiert gewonnen wurden, während die bovinen Oocyten aus dem heterogenen Pool von

Schlachthofovarien stammen und in vitro maturiert wurden. Da aber auch in der humanen

assistierten Reproduktion bei extrem hohen Scores eine schlechte embryonale Entwicklung

beobachtet wurde (JELINKOVA et al. 2007), scheinen sowohl eine sehr konzentrierte

Struktur der inneren Schicht (hoher Score) als auch eine sehr ungeordnete Struktur (niedriger

Score) den Ursprung in einer suboptimalen cytoplasmatischen Maturation zu haben und daher

Marker für ein schlechtes Entwicklungspotential zu sein.

Da die Zonaparameter beim Rind teilweise eine große Varianz innerhalb der Gruppen

aufweisen und der Score-Algorithmus für humane Eizellen konzipiert wurde, ist es schwer

möglich, konkret auf die Eizell-Qualität rückzuschließen. Es wäre hilfreich, den dem Score

zugrunde liegenden Algorithmus rinderspezifisch zu optimieren.

Diskussion 66

Ob sich die in vitro Maturation tatsächlich nicht nur auf die Oberflächenstruktur der Zona

pellucida auswirkt (FAMILIARI et al. 2006, MERTENS 2006), sondern auch auf die innere

Schicht, sollte durch weitere Versuche abgeklärt werden. Ein Vergleich in vivo versus in vitro

würde zudem in beiden Spezies die Aussagefähigkeit erheblich erhöhen.

Denkbar ist außerdem, dass unterschiedliche Stimulationsprotokolle während der

Follikulogenese einen unterschiedlichen Einfluss auf die Qualität der Eizelle und damit auch

auf die Zona pellucida ausüben. Möglicherweise können sowohl die Hormonsubstitutionen

als auch die Kulturmedien in vitro mit Hilfe der polarisationsmikroskopischen Analyse der

Zona pellucida weiter optimiert werden.

Zusammenfassung 67

6 Zusammenfassung

Maria Köster

Polarisationsmikroskopische Untersuchungen zur Qualität humaner und boviner Eizellen

Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu prüfen, ob die polarisationsmikroskopische Analyse

der meiotischen Spindel, deren Dysfunktion beispielsweise zu Aneuploidien führen kann, eine

klinisch anwendbare Methode zur Bewertung der nukleären Reife und Eizell-Qualität ist.

Parallel dazu sollte in polarisiertem Licht die Zona pellucida als potentieller Marker der

cytoplasmatischen Maturation und Integrität untersucht werden.

Dazu wurde zunächst in polarisationsmikroskopischen Zeitrafferstudien an humanen Eizellen

die Spindeldynamik im Verlauf der Maturation dargestellt. Nach einer Zunahme der

Doppelbrechung der Metaphase I-Spindel bis zur Formierung des ersten Polkörpers bildete

der Spindelapparat eine Brücke zwischen Polkörper und Ooplasma. Danach dissoziierten die

Mikrotubuli zwischenzeitlich und polymerisierten schließlich zur Metaphase II-Spindel.

Durch eine zweimalige Spindel-Untersuchung vor der intracytoplasmatischen

Spermieninjektion (ICSI) konnte belegt werden, dass 57,9 % der Eizellen, die bei der ersten

Untersuchung spindel-negativ waren, nach 2 h eine Spindel aufwiesen. Insgesamt führte eine

Spindelpräsenz zu einer signifikant besseren Fertilisationsrate. Eine nicht darstellbare Spindel

ist jedoch ohne eine zweite Analyse nicht gleichzusetzen mit einer schlechteren

Entwicklungskompetenz, da eine kurzzeitige Dissoziation während der Meiose physiologisch

ist. Kritisch zu bewerten ist außerdem das Ergebnis, dass mit Ausbildung des ersten

Polkörpers erst zeitlich versetzt die Maturation abgeschlossen wird, was mit konventioneller

Lichtmikroskopie nicht erkennbar ist. Eigene Untersuchungen ergaben zudem, dass eine

frühzeitige Eizell-Aktivierung während der Phase mit ausgebildeter Spindelbrücke in einer

anomalen Fertilisation mit Ausbildung von einem überzähligen Vorkern ohne Abschnürung

des zweiten Polkörpers resultiert.

Für die Analyse der Zona pellucida wurde eine prospektive Studie konzipiert, bei der an 1029

humanen Metaphase II-Oocyten vor der ICSI eine subjektive Einteilung nach den anisotropen

Zusammenfassung 68

Eigenschaften der inneren Zonaschicht erfolgte. Nur 19,1 % der Eizellen zeigten eine

homogen-intensive Anisotropie, jedoch konnte diese signifikant sowohl mit einer besseren

embryonalen Entwicklung am Tag 3 als auch mit einer höheren Implantations-, Graviditäts-

sowie Geburtenrate korreliert werden.

Weiterhin wurden bovine Eizellen in vitro maturiert und nach polarisationsmikroskopischer

Ermittlung des Meiose-Stadiums artifiziell aktiviert. Die parthenogenetische Entwicklung

wurde in einer ersten Versuchsreihe bis zum Tag 9 verfolgt; in einem zweiten Ansatz wurde

sie nach 20 h beendet und eine DNA-Färbung durchgeführt. In einem dritten Versuch wurde

die initiale intrazelluläre Ca2+-Freisetzung nach Zugabe von Ca2+-Ionophor gemessen. Nach

einer verkürzten Maturation konnte eine signifikant niedrigere Teilungs- und Blastozystenrate

beobachtet werden. Dies ist mit einer noch nicht beendeten Reifung zu erklären, da

Metaphase I-Eizellen im Vergleich zu maturen Eizellen eine schlechtere parthenogenetische

Entwicklung zeigten. Spindel-positive Metaphase II-Oocyten wiesen tendenziell das höchste

Entwicklungspotential auf.

An 2142 bovinen Eizellen erfolgte in polarisiertem Licht eine objektive Beurteilung der

inneren Zonaschicht. Dabei wurde eine Gruppe im immaturen Stadium untersucht, nachdem

sie zuvor mittels einer Brilliant Cresyl Blau-Färbung qualitativ bewertet worden war. Eine

weitere Gruppe wurde in vitro maturiert, hier erfolgte eine qualitative Einteilung durch das

Maturationsstadium. Außerdem wurde eine artifizielle Aktivierung durchgeführt und die

Teilungs- sowie Blastozystenrate als Qualtitätsmerkmal erfasst. In einer letzten Versuchsreihe

erfolgte das Imaging nach IVF, so dass die frühembryonale Entwicklungsrate in Bezug zu den

Zonaparametern gesetzt werden konnte. Insgesamt zeigte sich, dass im Vergleich mit

humanen Eizellen die anisotropen Eigenschaften der bovinen Zona pellucida deutlich höher

sind. Zentrale Aussage dieses Zona-Imagings ist, dass die qualitativ besseren Oocyten

signifikant niedrigere mittlere Zonaparameter aufwiesen. Eizellen mit schlechterem

Entwicklungspotential besaßen dagegen eine wesentlich konzentriertere und dickere innere

Zonaschicht.

Insgesamt ist festzuhalten, dass die Polarisationsmikroskopie durch die Beurteilung der

anisotropen Strukturen eine neue non-invasive Möglichkeit darstellt, um vitale Eizellen

hinsichtlich ihrer Entwicklungskompetenz zu untersuchen. Ausdruck der abgeschlossenen

nukleären Maturation und Eizell-Qualität ist dabei eine visualisierbare Metaphase II-Spindel.

Zusammenfassung 69

Klinische Anwendungsmöglichkeiten bieten sich vorwiegend bei Problempatienten in der

humanen assistierten Reproduktion zur Optimierung des Zeitpunktes für die Durchführung

der ICSI sowie bei der Enukleation boviner Eizellen im Rahmen der Klonierung.

Insbesondere die optischen Eigenschaften der inneren Zona pellucida-Schicht haben sich als

prognostisches Kriterium für das Entwicklungspotential als geeignet erwiesen. Dabei

scheinen eine inhomogene, niedrige Anisotropie, gleichzusetzen mit einer wenig geordneten

Textur, wie auch eine sehr hohe Anisotropie, die einer sehr dichten und kompakten Struktur

entspringt, Marker qualitativ schlechter Eizellen zu sein. Die innere Schicht der Zona

pellucida spiegelt somit die cytoplasmatische Integrität der Eizelle wider. Diese Methode ist

nicht nur in der humanen Sterilitätsbehandlung einsetzbar, sondern kann außerdem bei der

weiteren Verbesserung der in vitro Kultivierung und von Stimulationsprotokollen nützlich

sein.

Summary 70

7 Summary Maria Köster

Evaluation of human and bovine oocyte quality using polarized light microscopy

The objective of this study was to evaluate whether the analysis of the meiotic spindle with

polarized light microscopy may serve as a clinically applicable method for the assessment of

nuclear maturity and oocyte quality. Spindle dysfunction may result in aneuploidies.

Furthermore, the zona pellucida also was investigated in polarized light as a potential marker

of cytoplasmic maturation and integrity.

In the initial phase spindle dynamics of human oocytes during maturation were observed

using time-lapse video-imaging in polarized light. After an increase in birefringence in the

metaphase I spindle until extrusion of the first polar body, the spindle formed a connecting

strand between the polar body and ooplasm. In the interim then, microtubules dissociated, and

finally polymerized to the metaphase II spindle. When spindle imaging was performed twice

before intracytoplasmic sperm injection (ICSI), it was found that 57.9 % of oocytes that were

spindle-negative at the first examination possessed a spindle after 2 h. Overall it was found

that the presence of a spindle was associated with significantly higher fertilization rates.

However the absence of a spindle without performing a second analysis is not equated with

inferior developmental competence, since a temporary dissociation during maturation is

normal. The result that completion of maturation occurs only after formation of the first polar

body should be viewed critically, as this cannot be detected with conventional light

microscopy. Investigations performed as part of this study demonstrate that premature oocyte

activation during the phase with a connective strand between oocyte and polar body results in

abnormal fertilization with formation of a supernumerary pronucleus without extrusion of the

second polar body.

In order to analyze the zona pellucida, a propective study was designed with 1029 human

metaphase II oocytes before ICSI, which were subjectively classified according to anisotropic

properties of the inner layer of the zona pellucida. Although only 19.1 % of the oocytes

Summary 71

demonstrated a uniformly intensive birefringence, these characterictics were correlated with

significantly better embryonic development on day 3 as well as significantly higher

implantation rates, conception rates and birth rates.

In the next phase of the present study, bovine oocytes were matured in vitro and were

artificially activated after determination of meiotic stage using polarized light microscopy. In

the first series of tests, parthenogenetic development was studied until day 9; in the second

series, in vitro culture was terminated after 20 h and DNA-staining was performed. In the

third test series, initial intracellular release of Ca2+ was measured after adding a Ca2+-

ionophore. Significantly lower cleavage and blastocyst rates were observed after a shortened

maturation. This finding is a result of the incomplete maturation process due to the fact that

metaphase I oocytes had poorer rates of parthenogenetic development compared to mature

oocytes. Spindle-positive metaphase II oocytes tended to have the highest developmental

potential.

The inner zona layer of 2142 bovine oocytes was objectively evaluated in polarized light. One

group of immature oocytes was examined after qualitative assessment with brilliant cresyl

blue staining. A second group was matured in vitro, and qualitative classified according to

maturational status. Mature oocytes were additionally subjected to artificial activation, and

cleavage and blastocyst rates were measured. In a final series of tests, zona imaging was

performed after in vitro fertilization (IVF), in order to correlate early embryonic

developmental rates to zona parameters. Overall the birefringence of the bovine zona

pellucida was much higher in comparison with human oocytes. The decisive result of the zona

imaging in this study is that higher quality oocytes had significantly lower average zona

parameters. In contrast, oocytes with inferior developmental potential had a significantly

more concentrated and thicker inner zona layer.

In conclusion, this study demonstrates that the evaluation of birefringent structures by

polarization light microscopy shows potential as a new, non-invasive method to assess the

developmental competence of vital oocytes. Visualization of the metaphase II spindle is a

good indicator for nuclear maturity and oocyte quality. The clinical application of this

research will likely be most significant in human assisted reproduction for certain patients for

optimizing of ICSI timing as well as in enucleation of bovine oocytes for cloning. Especially

the optical properties of the inner zona layer were shown to be a suitable indicator of

Summary 72

developmental potential. Inhomogeneous, low birefringence, which equated with a low

ordered texture, as well as very high birefringence, which arises from a very dense and

compact structure, appear to be markers of low quality oocytes. The inner layer of the zona

pellucida is a reflection of the cytoplasmatic integrity of the oocyte. This method will not only

be valuable for use in human sterility therapy, but also to improve in vitro culture and

stimulation protocols.

Literaturverzeichnis 73

8 Literaturverzeichnis ABBOTT, A.L., u. T. DULCIBELLA (2001): Calcium and the control of mammalian cortical granules exocytosis. Front. Biosci. 6, D792-D806 ALBERIO, R., M. KUBELKA, V. ZAKHARCHENKO, M. HAJDUCH, E. WOLF u. J. MOTLIK (2000) : Activation of bovine oocytes by specific inhibition of cyclin-dependent kinases. Mol. Reprod. Dev. 55, 422-432 ALBERIO, R., V. ZAKHARCHENKO, J. MOTLIK u. E. WOLF (2001) : Mammalian oocyte activation: lessons from the sperm and implications for nuclear transfer. Int. J. Dev. Biol. 45, 797-809 ALM, H., H. TORNER, B. LÖHRKE, T. VIERGUTZ, I. GHONEIM u. W. KANITZ (2005): Bovine blastocyst development rate in vitro is influenced by selection of oocytes by brilliant cresyl blue staining before IVM as indicator for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. Theriogenology 63, 2194-2205 AMAN, R.R., u. J.E. PARKS (1994): Effects of cooling and rewarming on the meiotic spindle and chromosomes of in vitro-matured bovine oocytes. Biol. Reprod. 50, 103-110 ANDERIESZ, C., C.Y. FONG, A. BONGSO u. A.O. TROUNSON (2000a): Regulation of human and mouse oocyte maturation in vitro with 6-dimethylaminopurine. Hum. Reprod. 15, 379-388 ANDERIESZ, C., A.P. FERRARETTI, C. MAGLI, A. FIORENTINO, D. FORTINI, L. GIANAROLI, G.M. JONES u. A.O. TROUNSON (2000b): Effect of recombinant human gonadotrophins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Hum. Reprod. 15, 1140-1148 BALABAN, B., B. URMAN, A. SERTAC, C. ALATAS, S. AKSOY u. R. MERCAN (1998): Oocyte morphology does not affect fertilization rate, embryo quality and implantation rate after intracytoplasmic sperm injection. Hum. Reprod. 13, 3431-3433 BALAKIER, H., A. SOJECKI, G. MOTAMEDI u. C. LIBRACH (2004): Time-dependent capability of human oocytes for activation and pronuclear formation during metaphase II arrest. Hum. Reprod. 19, 982-987


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Anhang 97

9 Anhang 9.1 Material 9.1.1 Reagenzien

♦ BisBenzimid (Hoechst 33342) Fa. Sigma, Taufkirchen

♦ Blastocyst Medium® Fa. Cook, Australien

♦ Bovines Serum Albumin (BSA) Fa. Sigma, Taufkirchen

♦ Brilliant Cresyl Blue (BCB) Fa. Sigma, Taufkirchen

♦ Ca-Ionophor A23187 Fa. Sigma, Taufkirchen

♦ Cleavage Medium® Fa. Cook, Australien

♦ Culture Oil (Mineralöl) Fa. Cook, Australien

♦ Dimethylsulfoxid (DMSO) Fa. Sigma, Taufkirchen

♦ 6-Dimethylaminopurin (DMAP) Fa. Sigma, Taufkirchen

♦ Dulbecco’s phosphate buffered saline

(D-PBS, ohne Ca2+, Mg2+) Fa. Sigma, Taufkirchen

♦ Fertilization Medium® Fa. Cook, Australien

♦ Fluo-4, AM Fa. Molecular Probes, USA

♦ FSH (Folltropin®) Fa. Vetrepharm, Irland

♦ Gamete Buffer® (Medium) Fa. Cook, Australien

♦ GnRH-Agonisten:

• Leuprorelin (Enantone®) Fa. Takeda Pharma, Japan

• Nafrelin (Synarela®) Fa. Pfizer, Biberach

• Triptorelin (Decapeptyl®) Fa. Ferring, Kiel

♦ GnRH-Antagonisten:

• Cetrorelin (Cetrotide®) Fa. Merck-Serono, Darmstadt

• Ganirelix (Organlutran®) Fa. Organon, Oberschleißheim

♦ hCG:

• Ovitrelle® Fa. Merck-Serono, Darmstadt

• Predalon® Fa. Organon, Oberschleißheim

Anhang 98

♦ Humanes rekombinantes FSH:

• Gonal F® Fa. Merck-Serono, Darmstadt

• Puregon® Fa. Organon, Oberschleißheim

♦ Humanes Menopausalgonadotropin:

• Menogon HP® Fa. Ferring, Kiel

♦ Hyaluronidase Fa. Cook, Australien

♦ Hyaluronidase von bovinen Testes Fa. Sigma, Taufkirchen

♦ Mineralöl Fa. Sigma, Taufkirchen

♦ Polyvinylpyrrolidon (PVP) Fa. Cook, Australien

9.1.2 Zusammengesetzte Reagenzien

♦ TCM-air

1500 mg Medium 199

HEPES-modifiziert Fa. Sigma, Taufkirchen (M-2520)

100 mg BSA Fa. Sigma, Taufkirchen

2,2 mg NaPyruvat Fa. Sigma, Taufkirchen

35 mg NaHCO3 [getrennt lösen] Fa. Sigma, Taufkirchen

5 mg Gentamycinsulfat Fa. Sigma, Taufkirchen

ad 100 ml ddH2O

pH 7,2 mit 1 M NaOH (Fa. Sigma) einstellen, sterilfiltrieren

♦ Maturationsmedium

Lösung 1: 10 mg L-Glutamin Fa. Sigma, Taufkirchen

25 mg NaPyruvat Fa. Sigma, Taufkirchen

80 mg NaHCO3 Fa. Sigma, Taufkirchen

140 mg HEPES Fa. Sigma, Taufkirchen

500 µl Gentamycin (10 mg/ml) Fa. Gibco, USA

ad 100 ml Medium 199 Fa. Sigma, Taufkirchen (M-2154)

Lösung 2: 60 mg Hemicalciumlactat Fa. Sigma, Taufkirchen

ad 10 ml dd H2O

beide Lösungen gut mischen, vor Gebrauch 12 % Östrisches Kuhserum dazugeben

sterilfiltrieren

Anhang 99

♦ Kulturmedium

54,6 mg Hemicalciumlactat Fa. Sigma, Taufkirchen

4,4 mg NaPyruvat Fa. Sigma, Taufkirchen

14,6 mg L-Glutamin Fa. Sigma, Taufkirchen

210 mg NaHCO3 Fa. Sigma, Taufkirchen

631,2 mg NaCl Fa. Sigma, Taufkirchen

22,4 mg KCl Fa. Sigma, Taufkirchen

3,8 mg Penicillin G Fa. Sigma, Taufkirchen

7,8 mg Streptomycinsulfat Fa. Sigma, Taufkirchen

200 µl Phenolrot Fa. Sigma, Taufkirchen

ad 100 ml ddH2O

vor Gebrauch 10 % Östrisches Kuhserum, 1 % Basal Medium Eagle (Fa.

Sigma), 1 % Minimal Essential Medium (Fa. Sigma) dazugeben,

sterilfiltrieren

♦ Ionomycin-Aktivierungsmedium (5 µM)

7,5 µl Ionomycin-Stock-Lösung

(1 mg/ml in DMSO) Fa. Sigma, Taufkirchen

1992,5 µl TCM-air

♦ DMAP-Aktivierungsmedium (2mM)

20 µl DMAP-Stock-Lösung

(100 mM in DMSO) Fa. Sigma, Taufkirchen

1980 µl Kulturmedium CR1aa

9.1.3 Verbrauchsmaterialien

♦ 4-Well-Schale (Multidish) Fa. Nunc, Dänemark

♦ 5-Well-Schale Fa. Minitüb, Tiefenbach

♦ Deckgläschen (Ø 8 mm) Fa. Menzel, Braunschweig

♦ Embryotransfer-Set (ET-Katheter) Fa. Cook, Australien

♦ Flexipette, Denuding Pipette

(130 µm, 140 µm, 170 µm) Fa. Cook, Australien

Anhang 100

♦ Glasbodenschale Fa. WillCo, Niederlande

♦ Haltekapillare (HPIP-1035) Fa. Cook, Australien

♦ Injektionskapillare (MPIP-3335) Fa. Cook, Australien

♦ Objektträger Fa. Menzel, Braunschweig

♦ Petrischale (Ø 6 cm) Fa. Nunc, Dänemark

♦ Petrischale CenterWell (Ø 6cm) Fa. Falcon/BD, USA

♦ Petrischale (Ø 10 cm) Fa. Falcon/BD, USA

♦ Reaktionsgefäß 0,6 ml Fa. Eppendorf, Hamburg

♦ Reaktionsgefäß 1,5 ml Fa. Eppendorf, Hamburg

♦ Sterilfilter Fa. Millipore, Frankreich

♦ Verstärkungsringe (Bürobedarf) Fa. Avery Dennison, Dänemark

9.1.4 Geräte

♦ Inversmikroskop mit Fluoreszenzeinrichtung

DM-IRB Fa. Leica, Wetzlar

♦ Inkubator Heracell 150 Fa. Heraeus, Osterode

♦ Inkubator MiniGalaxy A Fa. RS Biotech, Schottland

♦ Inversmikroskop Eclipse TE 2000-S Fa. Nikon, Japan

♦ Polarisationseinheit für Inversmikroskop Nikon Fa. MTG, Altdorf

♦ Mikromanipulator Fa. Narishige, Japan

♦ Mikromanipulator Transfer Man NK2 Fa. Eppendorf, Hamburg

♦ Präzisionswaage 2007MP Fa. Sartorius, Göttingen

♦ Stereomikroskope SMZ 2B und SMZ 1500 Fa. Nikon, Japan

♦ Tragbarer Inkubator G93E Fa. K-Systems, Dänemark

♦ Vortex-Genie 2TM Fa. Scientific Industries, USA

9.1.5 Software

♦ OCTAX-Eyeware mit Modul polarAIDETM Fa. MTG, Altdorf

♦ Aquacosmos Version 1.3 Fa. Hamamatsu, Japan

Anhang 101

9.2 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Schematische Struktur der Zona pellucida.................................................20

Abbildung 2: Intracytoplasmatische Spermieninjektion...................................................27

Abbildung 3: Untersuchungen an humanen Oocyten. Schematische Darstellung

der Parametererhebungen...........................................................................30

Abbildung 4: Untersuchungen an bovinen Oocyten. Schematische Darstellung

der Parametererhebungen...........................................................................37

Abbildung 5: Spindeldynamik während der Meiose I......................................................38

Abbildung 6: Spindeldissoziation im ersten Polkörper nach artifizieller Aktivierung

einer humanen Oocyte in der Spindelbrückenphase...................................40

Abbildung 7: A. Humane Oocyte nach ICSI in der Spindelbrückenphase mit

3 Vorkernen

B. Humane Oocyte nach ICSI in der Metaphase II mit sichtbarem

zweitem Polkörper und 2 Vorkernen....................................................35

Abbildung 8: Humane Metaphase II-Oocyten. Zona pellucida hoch doppelbrechend

(A), Zona pellucida niedrig doppelbrechend (B)........................................41

Abbildung 9: Veränderung des Scores von humanen immaturen Oocyten nach 24 h......43

Abbildung 10: Teilungs- und Blastozystenraten nach parthenogenetischer

Aktivierung boviner Metaphase I und Metaphase II-Eizellen....................45

Abbildung 11: DNA-Konfiguration 20 h nach Aktivierung boviner Oocyten.

Meiose-Stadium (A), Vorkernstadium (B), 2-Zellstadium (C)..................46

Abbildung 12: Messung der Ca2+-Freisetzung nach Aktivierung mit Ionomycin

(Pfeil) in einer bovinen Oocyte im Metaphase II-Stadium........................48

Abbildung 13: Bovine Oocyte nach in vitro Maturation. Hoffmann-Kontrast-

Aufnahme (A), Polarisationsmikroskopisches Bild (B)............................49

Anhang 102

9.3 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Spindeldynamik in humanen Metaphase II-Eizellen vor ICSI..........................40

Tabelle 2: Fertilisationsrate von humanen Metaphase II-Eizellen nach

ICSI in Abhängigkeit von der Spindelpräsenz..................................................40

Tabelle 3: Ergebnisse der prospektiven Zona pellucida-Imaging-Studie...........................43

Tabelle 4: Teilungsrate und Blastozystenrate am Tag 9 nach

parthenogenetischer Aktivierung boviner Oocyten in Abhängigkeit

von der Maturationsdauer..................................................................................44

Tabelle 5: Teilungs- und Blastozystenraten nach parthenogenetischer Aktivierung

boviner Oocyten unter Einbeziehung der Spindelkonfiguration.......................45

Tabelle 6: Ergebnisse der DNA-Färbung 20 h nach parthenogenetischer

Aktivierung boviner Oocyten............................................................................47

Tabelle 7: Ergebnisse der DNA-Färbung 20 h nach parthenogenetischer

Aktivierung boviner Oocyten unter Einbeziehung der

Spindelkonfiguration........................................................................................48

Tabelle 8: Zona-Imaging in immaturen bovinen Oocyten nach BCB-Färbung.................50

Tabelle 9: Zona-Imaging in maturen bovinen Oocyten.....................................................50

Tabelle 10: Vergleich der PV-, CV- und Scorewerte nach parthenogenetischer

Aktivierung........................................................................................................51

Tabelle 11: Übersicht über Teilungs- und Blastozystenraten im Vergleich mit

Kontrollen..........................................................................................................52

Tabelle 12: Vergleich von PV-, CV- und Scorewerten und des embryonalen

Entwicklungspotentials......................................................................................53

Teile der Dissertation wurden bereits veröffentlicht: MONTAG M, M. KÖSTER, T. SCHIMMING u. H. VAN DER VEN (2006): Zellzyklus-bedinger Einfluss der Eizellaktivierung. Journal für Reproduktionsmedizin und Endokrinologie 3, 334-335 MONTAG M., T. SCHIMMING, M. KÖSTER, C. ZHOU, C. DORN, B. RÖSING, H. VAN DER VEN u. K. VAN DER VEN (2008): Oocyte zona birefringence intensity is associated with embryonic implantation potential in ICSI cycles. Reprod. Biomed.Online 16, 239-244

Danksagung Diese Seite gehört all denen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Herrn Prof. Dr. Burkhard Meinecke danke ich sehr herzlich für die außerordentlich

hilfsbereite Betreuung, für die langjährige Geduld und für die jederzeit gewährte

Unterstützung bei der Abfassung dieser Arbeit.

Mein besonderer Dank geht an Herrn PD Dr. Markus Montag für die Überlassung des

Themas und die tatkräftige, großzügige und unermüdliche Hilfe. Ich möchte mich bedanken

für das immerwährende Vertrauen und das freundschaftliche Verhältnis, das mir entgegen

gebracht wurde sowie für die stets vorhandene Diskussionsbereitschaft, fachlichen Rat und

qualitatives Engagement.

Herrn Prof. Dr. Hans van der Ven und Frau Prof. Dr. Katrin van der Ven danke ich für ihr

Interesse und für die Möglichkeit, diese Dissertation in der Uni-Frauenklinik Bonn

anzufertigen sowie parallel in der faszinierenden Reproduktionsmedizin arbeiten zu können.

Ich danke Dr. Michael Hölker und Franca Rings für die intensive Mithilfe und vielfältige

Unterstützung sowie den fleißigen Händen im biotechnologischen Labor des Versuchsgutes

Frankenforst (Uni Bonn) für die Bereitstellung von bovinen Eizellen. Annika Naumann sei

für zahlreiche Eizell-Transporte gedankt. Darüber hinaus gilt mein Dank den Ehemaligen

Markus Gilles, Dr. Heike Müller und Dr. Esther Mahabir für viele hilfreiche Anregungen und

immer offene Ohren in jeder Lebenslage.

Ausdrücklich bedanken möchte ich mich außerdem bei Heike Tosello, Elke Dunkel, Ariane

Schild und Violetta Weißenfeld für die gute Zusammenarbeit im IVF-Labor und die

großartige Entlastung während der akuten Schreibephase. Dr. Evgenia Isachenko und Dr.

Vladimir Isachenko gebührt ebenso ein Dankeschön für ihre bereitwilligen Hilfestellungen.

Ein rückblickender Dank geht an Herrn Prof. Dr. Karl Schellander für die profunde

Einarbeitung in die bovine Biotechnologie und an alle Mitarbeiter des Instituts für

Tierzuchtwissenschaften (Uni Bonn), insbesondere an die einstigen Doktoranden, für eine

wertvolle Zeit in einer multikulturellen Arbeitsatmosphäre.

Edita Podhajski danke ich als immer hilfsbereite Ansprechpartnerin im Institut für

Reproduktionsbiologie der TiHo Hannover.

Schließlich möchte ich von Herzen allen Freunden danken, die mir treu, geduldig und

aufmunternd zur Seite standen. Mein schönster Dank gilt Juan Carlos Barrientos.

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Polarisationsmikroskopische Untersuchungen zur Qualität ... · Der maternale wie auch der paternale Gamet sind hochdifferenzierte Zellen und Ursprung eines jeden Individuums. Im