Praktisches Training:

Nachweis eines Pathogens im Waschwasser von Kartoffeln

mittels PCR

Eine Probe des Waschwassers wurde entnommen und wird in einem LB-Medium aufbewahrt. Der Versuch untersucht die Bakterienkolonien, die in diesem Medium isoliert vorkommen.

1. Extraktion der DNA

1.1. Pipettieren Sie 50µL destilliertes steriles Wasser in ein steriles Tube (P1).

! Versuchen Sie, die Lösung so weit wie möglich zu homogenisieren!

1.3. Fügen Sie die Kolonie der Lösung in P1 hinzu.

1.2. Messen Sie 1 µL der Bakterienkolonie mittels einer Impföse ab.

1.4. Geben Sie das Tube P1 für eine Minute in ein 100°C heißes Wasserbad.

1.5. Platzieren Sie P1 in einer Zentrifuge.1.6 Zentrifugieren Sie das Tube 5 Minuten lang bei 4500 rpm.

1.7. Nehmen Sie das Tube heraus und geben Sie den Überstand (enthält die DNA) in ein weiteres steriles Tube (P2).

3. Amplifizierung der DNA

3.1. Geben Sie in ein PCR-Tube (A) 10 µL der DNA-Lösung aus P2.3.2. Fügen Sie 20µL des PCR-Mixes (M) hinzu.3.3. Geben Sie 10µL aus jeweils einer der Tubes metkRPECTO und metkFPECTO oder 16SR und 16SF hinzu.

Mischen Sie ihre Ansätze durch Auf- und Abpipettieren!

Sie können beide Paare der Lösungen auch gleichzeitig verwenden. Die Volumina der Lösungen betragen hierbei jeweils 5 µL.

3.4. Zentrifogieren Sie ihren Ansatz schnell.

3.5. Stellen Sie das Tube (A) in den Thermocycler und merken Sie sich seine Position.

!Merken Sie sich seine Position!

T°CNb cycles

3.6. 3.6. Bereiten Sie 2 weitere Proben vor (Arbeitsschritte 3.1. bis 3.5.), indem Sie die DNA-Lösung (P2) mit folgendem ersetzen:

Wasser für die Negativkontrolle (C-)

DNA-Lösung des Pectobacterium atrosepticum für die Positivkontrolle (C+)

Controls for the DNA amplification

3.7. Programmieren Sie den Thermocycler :

96°C, 5min40 Zyklen :

•94°C, 30s •58°C, 30s •72°C, 50s

72°C 5minLagerung bei 4°C

5`, 72 °CFertigstellung

30``, 94 ° Denaturierung

40 Zyklen

5`, 96°C Denaturierung

30``, 58°CAnlagerung

30``, 72 °CElongation

3.8. Starten Sie die Amplifizierung.T°CNb cycles

4. Elektrophorese der DNA-Fragmente

4.1. Geben Sie in 3 sterile Tubes (E1, E2, E3) 10µL der PCR-Lösungen (A, C-, C+).

4.2. Fügen Sie 2 µL des Ladepuffers (X) hinzu und schütteln Sie die Tubes.

4.3. Nehmen Sie das Gel für die Elektrophorese heraus und entfernen sie die Schutzstreifen.

4.4. Spülen Sie die Slots mit destilliertem Wasser aus. Kippen Sie die Kassette leicht, um überschüssiges Wasser aufzusaugen.

4.5. Geben Sie in den ersten Slot 5 µL der zu testenden Lösung E1.4.6. Geben Sie in die nächsten 2 Slots jeweils 5 µL der Lösungen E2 und E3.

4.7. Geben Sie in den mittleren Slot 5 µL der Lösung des Molekular-markers (W).

T + - T + - W T + - T + -

Befüllen Sie die Slots anhand des folgenden Schemas:

Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4

4.8. Lassen Sie die Elektrophorese ca. 10 Minuten bei 220V laufen.

4.9. Beenden Sie die Elektrophorese, wenn die ersten Banden des Molekularmarkers das untere Ende des Gels erreicht haben.

5. Analysieren Sie ihre Resultate.