Vorgetragen durch:

Lenore K. Beitel, Ph.D.Forschungswissenschaftlerin

Lady Davis Institute for Medical ResearchMontreal, Canada

Proteasom* Funktion und Kennedy Syndrom (SBMA)

* Begriffsbedeutung siehe Fachbegriffe

Wissenschaftler undKennedy Syndrom

AndrogenAndrogen--unempfindlichkeitunempfindlichkeit

KeimbahnKeimbahn MutationenMutationen

ProstatakrebsProstatakrebsCAG RepeatsCAG Repeats

CAG RepeatsCAG RepeatsKennedy Kennedy SyndromSyndrom

Androgenrezeptor-Forschung

o Erforderlich für normale männliche

Entwicklung

o AR reguliert Expression* bestimmter

Gene als Reaktion auf Androgene

(CAG è Glutamin = Gln = Q)

3'

N-terminal

((Gln)Gln)nn

2 3 4 5 6 7 8Exon 1

AndrogenDNABindungsbereich

Protein

Gen (Xq11-12)5'

((CAG)CAG)nn

AndrogenrezeptorGen und Protein

* Begriffsbedeutung siehe Fachbegriffe

o Erforderlich für normale männliche

Entwicklung

o AR reguliert Expression bestimmter

Gene als Reaktion auf Androgene

(CAG è Glutamin = Gln = Q)

3'

N-terminal

((Gln)Gln)nn

2 3 4 5 6 7 8Exon 1

AndrogenDNABindungsbereich

Protein

Gen (Xq11-12)5'

((CAG)CAG)nn

AndrogenrezeptorGen und Protein

Keine andere AR-Mutation verursacht den

Verlust von Motoneuronen. Folglich ist das

polyGln-erweiterte AR-Protein schädlich

für bestimmte Motoneuronen, da es eine

Funktion erzielt (gains a function(s))

≠ LBD

DBD

50Q

DBD

LBD20Q

Hypothese vom Funktionsgewinn

o Ein Recycling-Behälter für die Zelle, um Proteine loszuwerden, die sie nichtbrauchen kann

o Proteine, die recycelt werden sollen, werden mit Ubiquitin* (Ub) markiert

Ub

PeptidePeptideProteasom

ProteinProteinUbUbUbUb

Ub

ATP

Ciechanover, Hershko & Rose,Nobel Prize in Chemistry 2004

Was ist ein Proteasom?

* siehe Fachbegriffe

Hypothese:

Der Androgenrezeptor, besonders die erweiterteForm, könnte ein guter Träger für die

Transglutaminase (TG) sein

o TG bildet stabile Isopeptid-Bindungenzwischen Glutaminen and Lysinen

o Kann sowohl inter- als auchintramolekulare Bindungen bilden

o Vernetzung könnte zur Aggregatbildungbeitragen oder die Zellfunktion beeinflussen

Protein Gln~LysGln~Lys Prot.GlnGlnLysLys( ProteinProtein

Transglutaminase

75

50

35

kDa

Protein Gln~LysGln~Lys Prot.

0Q 0Q 20Q 20Q 50Q50Q

N-terminal Fragmente a.a. 11-341

TG: + - + - + - +

** *

Mandrusiak LM et al. Hum. Mol. Genet. 12:1497-1506, 2003

AR ist ein Träger für TG

75

50

35

kDa

0Q 0Q 20Q 20Q 50Q50Q

* **

TG: - + - + - + +

GlnGlnLysLys( ProteinProtein

Mandrusiak LM et al. Hum. Mol. Genet. 12:1497-1506, 2003

Intramolekulare AR-Bindunggebildet durch TG

Intra-molekular verbundene AR kanndas Proteasom blockieren, damit

beitragen zu neuronaler Fehlfunktion

Umgekehrte Hypothese

ATP

GFPu GFPu

Hemmung

HEK-GFPu-1 + MG132 + TG

Mandrusiak LM et al. Hum. Mol. Genet. 12:1497-1506, 2003

Messung der Proteasom Funktion

ATP

GFPu GFPu

Hemmung

HEK-GFPu-1 + MG132 + TG

- + +AR20Q +TG AR20Q AR20Q + TG

Androgen Androgen

Mandrusiak LM et al. Hum. Mol. Genet. 12:1497-1506, 2003

Messung der Proteasom Funktion

HEK-GFPu-1 + MG132 + TG

- + +AR50Q + TG AR50Q AR50Q + TG

Androgen Androgen

Inhibition of TG by cystamine prevents

proteasome dysfunction

Mandrusiak LM et al. Hum. Mol. Genet. 12:1497-1506, 2003

AR50Q induziert Proteasom-Fehlfunktion bei Anwesenheit

von Androgenen und TG

HEK-GFPu-1 + MG132 + TG

- + +AR50Q + TG AR50Q AR50Q + TG

Androgen Androgen

GFPu

Hemmung

Inhibition of TG by cystamine prevents

proteasome dysfunction

Mandrusiak LM et al. Hum. Mol. Genet. 12:1497-1506, 2003

AR50Q induziert Proteasom-Fehlfunktion bei Anwesenheit

von Androgenen und TG

normal

SBMA Modell Maus

Immunostaining with antibody to TG specific Nε (γ-glutamyl)-

lysine isopeptide bondsin brain sections

Mandrusiak LM et al. Hum. Mol. Genet. 12:1497-1506, 2003

TG-Isopeptid-Bindungengefunden im Gehirnvon Modell Mäusen

Ansatz: Proteasome werdenblockiert durch

querverbundene PolyGln-AR

TG querverbunden (vernetzt) mit polyGlnAR könnte ein Schlüsselereignis beim

Kennedy-Syndrom sein:

o Menschliches AR ist ein Träger(-substrat) fürTransglutaminase

o Androgen-abhängige Proteasom-Hemmungkonnte in HEK-GFPu-1 Zellen mit AR50Q & TG beobachtet werden

o TG Isopeptid Bindungsformation wurde in transgenen Mäusen beobachtet

Neuronale Fehlfunktionen der Zellenkönnten daraus resultieren, dass PolyGln-erweiterte, quervernetzte AR die ordnungs-gemäße Proteasom-Funktion stören.

Zusammenfassung

Mark A. Trifiro, MD

Lenore K. Beitel, PhD

Lisa Mandrusiak, MSc

Tom Scanlon

Jason Southwell

Danksagung