Human Epo Immunoassay Kurzfassung der Arbeitsanleitung

Quantikine® IVD® ELISA

Katalognummer DEP00

Diese Kurzfassung der Arbeitsanleitung enthält das Assay-Protokoll und muß vor Gebrauch dieses Produktes vollständig gelesen werden. Die Leistungscharakteristika, eine Literaturliste sowie das Protokoll in Englisch finden Sie in der Hauptarbeitsanleitung.

ZUR IN-VITRO DIAGNOSTIK

DE

IVD

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EC REP

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Enzymgekoppelter Immunoassay (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) für die quantitative Bestimmung von Erythropoietin (Epo) Konzentrationen in Humanserum und plasma zur Unterstützung in der Diagnose der Anämie und der Polyzythämie.

BESTIMMUNGSGEMÄßE ANWENDUNGEN

Der Quantikine IVD Epo ELISA basiert auf der Doppel-Antikörper Sandwich Methode. Mikrotiterplatten-Vertiefungen, die mit Epo-spezifischem monoklonalem Antikörper aus der Maus vorbeschichtet wurden, werden mit Probenmaterial oder Standard inkubiert. Erythropoietin bindet an den immobilisierten Antikörper auf der Platte. Nach Entfernen von überschüssigem Probenmaterial oder Standard werden die Vertiefungen mit einem Epo-spezifischem polyklonalem Antikörper aus Kaninchen, der an Meerettichperoxidase gebunden ist, inkubiert. Während dieser zweiten Inkubationsphase bindet das Konjugat aus Antikörper und Enzym an das immobilisierte Epo. Überschüssiges Konjugat wird durch Waschen entfernt. Ein Chromogen wird in die Vertiefungen gegeben, und dort durch das Enzym unter Bildung eines blauen Farbkomplexes oxidiert. Diese Reaktion wird durch die Zugabe von Säure gestoppt, und bewirkt einen Farbumschlag von blau nach gelb. Die Intensität der Färbung ist direkt proportional zur Epo konzentration in der Probe oder Standard. Die Absorbenz dieses Komplexes wird gemessen, und eine Standardkurve wird erstellt indem man die Absorptionswerte der Standard konzentrationen gegen die Konzentration des Epostandards auftraegt. Die Epokonzentrationen der unbekannten Proben werden durch Vergleich ihrer optischen Dichte mit denen der Standardkurve bestimmt. Die im Assay verwendeten Standards sind rekombinantes humanes Epo und gegen die Second International Reference Preparation (67/343), eine aus Urin stammende Form des humanen Erythropoietins, kalibriert.

ASSAY-PRINZIP

INHALTSVERZEICHNISINHALT SEITE

INHALT DES KITS ....................................................................................................................................................................2LAGERUNG ...............................................................................................................................................................................2WARNUNGEN/VORSICHTSMAßNAHMEN ....................................................................................................................3ANZEICHEN VON INSTABILITÄT ODER QUALITÄTSVERLUST ................................................................................3WEITERE BENÖTIGTE GERÄTE UND REAGENZIEN ....................................................................................................4MIKROTITERPLATTEN-READER ........................................................................................................................................4EINSCHRÄNKUNGEN ............................................................................................................................................................4SAMMELN DER PROBEN UND LAGERUNG ..................................................................................................................5REAGENZIENVORBEREITUNG ...........................................................................................................................................5BESCHREIBUNG DER ARBEITSSCHRITTE ......................................................................................................................6PLATTENLAYOUT ...................................................................................................................................................................7AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE ....................................................................................................................................8REPRÄSENTATIVE ERGEBNISSE FÜR DIE STANDARDKURVEN ..............................................................................8VERDÜNNUNG VON PROBEN MIT HOHER EPO KONZENTRATION ...................................................................9QUALITÄTSKONTROLLE ......................................................................................................................................................9PROBLEMLÖSUNGEN ........................................................................................................................................................ 10ZU ERWARTENDE ERGEBNISSE ..................................................................................................................................... 11

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INHALT DES KITSErythropoietin Mikrotiterplatte (Part 890126) - Polystyrol Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (12 Streifen mit 8 Vertiefungen), beschichtet mit monoklonalem Maus-Antikörper spezifisch für humanes ErythropoietinErythropoietin-Konjugat (Part 890127) - 21,5 mL polyklonaler Kaninchenantikörper spezifisch für humanes Erythropoietin, gebunden an Meerrettichperoxidase (enthält Konservierungsmittel.Erythropoietin 0.0 mIU/ml Standard (Part 890128) - 2,1 mL eines auf Proteinen basierenden Puffers mit Konservierungsmittel.Erythropoietin 2.5 mIU/ml Standard (Part 890129) - 2,1 mL von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel.Erythropoietin 5.0 mIU/ml Standard (Part 890130) - 2,1 mL von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel.Erythropoietin 20.0 mIU/ml Standard (Part 890131) - 2,1 mL von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel.Erythropoietin 50.0 mIU/ml Standard (Part 890132) - 2,1 mL von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel.Erythropoietin 100.0 mIU/ml Standard (Part 890133) - 2,1 mL von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel.Erythropoietin 200.0 mIU/ml Standard (Part 890134) - 2,1 mL von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel.Erythropoietin Assay-Verdünnungspuffer (Part 895057) - 11 mL eines auf Proteinen basierenden Puffers mit Konservierungsmittel NatriumazidProben-Verdünnungspuffer (Part 895058) - 26 mL eines proteinstabilisierten Puffers mit Konservierungsmittel.Erythropoietin Waschpufferkonzentrat (Part 995059) - 100 mL eines 25fachen Konzentrats mit Konservierungsmittel.Farbreagenz A (Part 895549) -12 mL Farbreagenz A (0,01 N gepuffertes Wasserstoffperoxid)Farbreagenz B (Part 895550) - 12 mL Farbreagenz B (0,35 g/L TMB)Stoplösung (Part 895060) - 11 mL 2 N Schwefelsäure. Achtung: ätzende Substanz; es wird empfohlen, Augen, Hände, Gesicht und Kleidung zu schützenAbdeckfolien - 4 selbstklebende Folienstreifen

SORB

CONJ

CAL 0

CAL 2.5

CAL 5

CAL 20

CAL 50

CAL 100

CAL 200

DIL AS

DIL SPE

SUBS A

SUBS B

SOLN STOP

BUF WASH 25X

Ungeöffneter Kit Lagerung bei 2-8° C. Nicht nach Verfallsdatum gebrauchen.

Geöffnetes Kit/ Verdünnte Reagenzien

Verdünnter Waschpuffer Kann bei Raumtemperatur (20-25° C) bis zum Verfallsdatum gelagert werden.

Stoplösung

Können bei 2-8° C bis zum Verfallsdatum gelagert werden.

Proben-Verdünnungspuffer

Assay-Verdünnungspuffer

Konjugat

Ungemischtes Farbreagenz A

Ungemischtes Farbreagenz B

Standards (0,0-200 mlU/ml)

Mikrotiterplatten-Vertiefungen Legen Sie die nicht gebrauchten Streifen zurück in den Trockenmittel enthaltenden Folienbeutel, und versiegeln Sie entlang des ganzen Klebesiegels. Kann bei 2-8° C bis zum Verfallsdatum gelagert werden.

LAGERUNG

3

• Benutzen Sie den Kit nicht mehr nach dem Verfallsdatum.

• Für optimale Resultate sollte jedes Labor seine spezifische Assay-Methode etablieren (Laborbank-oder Schüttler-Protokoll) und jeden weiteren Assay nach dieser Methode durchführen.

• Um Variationen innerhalb des Assays zu minimieren wird empfohlen, den Assay innerhalb von 15 Minuten zu pipettieren.

• Ersetzen Sie in keinem Fall Reagenzien dieses Kits durch solche anderer Chargen oder fremder Kits.

• Setzen Sie die Reagenzien während der Lagerung und Inkubationen keinem starken Licht aus.

• Vermeiden Sie Kontakt zwischen Reagenzien und oxidierenden Stoffen sowie Metallen.

• Bei Kontakt mit Natriumazid verliert das Konjugat seine Aktivität.

• Nicht mit dem Mund pipettieren.

• Vermeiden Sie den Verzehr von Nahrungsmitteln und das Rauchen während der Handhabung mit Kitreagenzien und Probenmaterial.

• Vermeiden Sie den Kontakt von Haut und Schleimhäuten mit Kitreagenzien oder Probenmaterial.

• Bei Kontakt von Farbreagenzlösungen oder Stoplösung (2 N Schwefelsäure!!) mit Haut oder Augen muss unverzüglich mit reichlich Wasser gewaschen werden. Kontaktieren Sie anschließend einen Arzt.

• Behandeln Sie Serum und Materialien die mit dem Serum in Kontakt kommen, in Übereinstimmung mit den CLSI-Richtlinien zur Vermeidung der Übertragung von Krankheitserregern aus dem Blut während Laborarbeiten.

• Andere Inkubationszeiten und Temperaturen als die in dieser Anleitung angegeben, können zu fehlerhaften Ergebnissen führen.

• Kontaminierung von Kitreagenzien kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen.

• Verwenden Sie, wenn möglich, Einwegpipetten, -spitzen und-behälter zur Vorbereitung und Lagerung der Reagenzien. Glasgeräte sollten gänzlich mit 1 N Schwefel-oder Salzsäure und anschließend mindestens dreimal mit destilliertem Wasser gespült werden. Weder Säure-noch Detergenzienreste sollten auf der Glasoberfläche verbleiben.

• Verwenden Sie Polypropylen-oder hochdichte Polyethylen (HDPE) Teströhrchen zur Probenverdünnung. Verwenden Sie keine Glasröhrchen.

• Einige Komponenten dieses Kits enthalten Natriumazid, das mit Blei oder Kupfer hochexplosive Metallazide bilden kann. Spülen Sie mit viel Wasser bei deren Beseitigung nach.

WARNUNGEN/VORSICHTSMAßNAHMEN

ANZEICHEN VON INSTABILITÄT ODER QUALITÄTSVERLUSTDie Substratlösungen sollten vor und nach der Vermischung farblos sein. Niederschläge in den Reagenzlösungen sind in der Regel Anzeichen für Instabilität oder Qualitätsverlust. Sollten irgendwelche Anzeichen für Instabilität oder Qualitätsverlust beobachtet werden, oder der Korrelationskoeffizient der Standardkurve kleiner als 0,95 sein, bewahren sie die fragwürdigen Reagenzien bei 2-8°C auf und kontaktieren Sie R&D Systems GmbH unter 0800 909 4455.

Zur in-vitro Diagnostik

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• Pipetten und Pipettenspitzen

• Horizontal umlaufender Rotationsmischer (Umlauf 0,3 cm), einstellbar auf 500 ± 50 U/min (erforderlich für das Schüttler-Protokoll)

• 4 Liter und 100 mL Messzylinder

• Mehrkanalpipette, Waschflasche, Mehrfachspender oder Mikrotiterplattenwaschautomat

• Papiertücher oder Ähnliches zum Ausklopfen der Vertiefungen

• Mikrotiterplatten-Reader, einstellbar auf eine Absorbanz von 450 nm und eine Korrekturwellenlänge von 600 nm

• Immunoassay-Reagenzienwanne

• Deionisiertes oder destilliertes Wasser

• Software für 4PL Kurven an passung

• Erythropoietin Serumkontrolle(n), z.B. Quantikine IVD Human Serum Control 1 und 2, sowie 3 (erhältlich bei R&D Systems, Kat.-Nr. CEP01 bzw. CEP03) oder gleichwertige Kontrollen

WEITERE BENÖTIGTE GERÄTE UND REAGENZIEN

MIKROTITERPLATTEN-READERDie Assay-Ergebnisse werden spektrometrisch bei 450 nm mit einem Mikrotiterplatten-Reader bestimmt. Für genauere Ergebnisse sollte eine Korrekturwellenlänge von 600 nm berücksichtigt werden, die optische Ungenauigkeiten in der Polystyrol-Mikrotiterplatte ausgleicht (540 nm, 570 nm und 650 nm sind ebenso möglich). Geräte ohne Korrekturfilter können mit der Einschränkung benutzt werden das die Assay-Genauigkeit leidet. Ein Mikrotiterplatten-Reader mit einem Bereich von 0 bis 3 O.D. und einer Genauigkeit von ± 0,005 O.D. ist erforderlich. Mikrotiterplatten-Reader mit einem Bereich von 0 bis 3 O.D. können verwendet werden, schränken aber den Messbereich des Assays ein.

EINSCHRÄNKUNGEN• Die Ergebnisse dieses Assays sollten in Verbindung mit Ergebnissen klinischer

Beobachtungen und diagnostischer Anwendungen interpretiert werden.

• Es wurden keine Interferenztests mit Medikamenten vorgenommen.

• Sobald Probenkonzentrationen oberhalb des höchsten Standardwertes liegen, sollten sie mit Proben-Verdünnungspuffer verdünnt and anschließend noch einmal gemessen werden.

• Jede Veränderung, sei es beim durchführenden Laboranten, bei der Pipettiertechnik, Waschtechnik, Inkubationszeit oder Temperatur, sowie bei fortschreitendem Alter des Kits, hat Variationen im Bindungsverhalten zur Folge.

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Serum - Verwenden Sie einen Serumseparator [serum separator] oder ein gerinnungsröhrchen [clot tube] und ermöglichen Sie der Probe bei Raumtemperatur (20-25° C) zu koagulieren. Zentrifugieren Sie bei 760 x g (1 x g = 1,118 x 10-5 (Radius[cm])(U/min)2) und Raumtemperatur 15 Minuten innerhalb von 30 Minuten nach Probengewinnung, um eine Hämolyse zu vermeiden. Aliquotieren Sie bei Bedarf und lagern Sie die Proben in sterilen Teströhrchen bei 2-8° C bis zu 7 Tage oder bei weniger als -10° C unbegrenzt in einem nicht selbstenteisenden Gefrierschrank. Vermeiden Sie wiederholte Auftau-Einfrier-Zyklen.

Plasma - Sammeln Sie Plasma unter Verwendung von EDTA als Antikoagulanz. Zentrifugieren Sie bei 760 x g und Raumtemperatur 15 Minuten lang innerhalb von 30 Minuten nac Probengewimn. Aliquotieren Sie bei Bedarf und lagern Sie die Proben in sterilen Teströhrchen bei 2-8° C bis zu 7 Tage oder bei weniger als -10°C unbegrenzt in einem nicht selbstenteisenden Gefrierschrank. Vermeiden Sie wiederholte Auftau-Einfrier-Zyklen.

Es wird empfohlen, daß jedes Labor den Assay entweder mit Serum-oder EDTA Plasma-Proben standardisiert.

Lipämische, hämolysierte oder kontaminierte Proben können ungenaue Ergebnisse ergeben und sollten nicht mit dieser Anleitung getestet werden. Weiterhin sind keine Medikamente bezüglich Interferenzen im Assay getestet worden.

Siehe die CLSI-Richtlinien: Verfahren zur Handhabung und Verarbeitung von Blutproben für allgemeine Laboruntersuchungen (CLSI-Dokument GP44; 4. Ausgabe).

SAMMELN DER PROBEN UND LAGERUNG

REAGENZIENVORBEREITUNGBringen Sie vor Gebrauch alle Reagenzien auf Raumtemperatur (20-25° C).

Waschpuffer (1X) - Kristalle im Konzentrat können durch Erwärmung auf Raumtemperatur und vorsichtiges Schütteln wieder aufgelöst werden. Verdünnen Sie 100 mL Waschpufferkonzentrat mit 2400 mL deionisiertem oder destilliertem Wasser zur Herstellung von 2500 mL Waschpuffer (1X).

Substratlösung - Die Farbreagenzien A und B werden zu gleichen Teilen zusammengegeben und müssen innerhalb von 15 Minuten verwendet werden. Pro Vertiefung werden 200 µL benötigt. Verwerfen Sie nichtgebrauchte fertige Substratlösung.

HERSTELLUNG DER SUBSTRATLÖSUNG JE NACH ASSAYGRÖßE

Anzahl der benötigten Vertiefungen für den Assay

Volumen Farbreagenz A

Volumen Farbreagenz B

96 11 mL 11 mL

48 6 mL 6 mL

32 4 mL 4 mL

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Alle Reagenzien und Proben vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20-25° C) erwärmen lassen. Es wird empfohlen, alle Proben und Standards als Doppelbestimmungen zu messen. Laborbank-und Schüttler-Protokolle werden mitgeliefert. Der vollständige Assay muss nach demselben Protokoll durchgeführt werden.

1. Alle Reagenzien wie beschrieben vorbereiten.

2. Nichtbenötigte Streifen der Mikrotiterplatte aus dem Plattenrahmen nehmen, und zusammen mit dem Kieselgel-Säckchen wieder im Folienbeutel verpacken und verschließen.

3. 100 mL Epo Assay-Verdünnungspuffer in jede Vertiefung pipettieren.

4. Je 100 mL Standard, Kontrolle oder Probe in die jeweiligen Vertiefungen pipettieren. Vorsichtig für 1 Minute an den Plattenrahmen klopfen um sicherzustellen, dass der Inhalt der Vertiefungen durchmischt wurde. Platte mit der mitgelieferten selbstklebenden Folie verschliessen. Ein Platten-Layout mit einem Beispiel für Standards, Kontrollen und Proben ist auf Seite 20 beschrieben. Für Laborbank-Protokoll: 2 Stunden (± 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Für Schüttler-Protokoll: 1 Stunde (± 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem horizontalen Rotationsmischer (Umlauf 0,3 cm) bei 500 ± 100 U/min inkubieren.

5. Den Inhalt der Vertiefungen gründlich absaugen bzw, die Platte umgekehrt auf einem Papiertuch kräftig ausklopfen. Nicht waschen.

6. In jede Vertiefung 200 mL Epo7-Konjugat pipettieren. Mit einer neuen selbsthaftenden Folie verschließen. Für Laborbank-Protokoll: 2 Stunden ± 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Für Schüttler-Protokoll: 1 Stunde ± 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem horizontalen Rotationsmischer inkubieren.

7. Inhalt der Vertiefungen entleeren und waschen. Den Waschvorgang dreimal wiederholen, also insgesamt viermal waschen. Beim Waschen mit Spritzflasche, Mehrfachspender oder Plattenwaschautomat jede Vertiefung mit Waschpuffer auffüllen (400 mL). Um gute Ergebnisse zu erzielen, ist es sehr wichtig, die Flüssigkeit bei jedem Schritt vollständig zu entfernen. Um alle Reste von Waschpuffer zu entfernen, nach dem letzten Waschschritt den restlichen Waschpuffer absaugen oder die Platte umdrehen und auf einem Papiertuch Kröftig ausklopfen.

8. 200 mL Substratlösung in jede Vertiefung pipettieren (Anmerkung: Substratlösung muss innerhalb von 15 Minuten nach dem Ansetzen verwendet werden). 20-25 Minuten bei Raumtemperatur auf der Laborbank inkubieren.

9. 100 mL Stoplösung in jede Vertiefung pipettieren, dabei in derselben Reihenfolge vorgehen wie bei der Substratzugabe. Ist der Farbumschlag nicht gleichmäßig, kann die Platte zum Mischen leicht gerüttelt werden.

10. Innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stoplösung die optische Dichte aller Vertiefungen mit einem Mikrotiterplatten-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmen. Wenn möglich, die Korrektur-Wellenlänge auf 600 nm einstellen. Ist das Gerät nicht mit einer Wellenlängen-Korrekturfunktion ausgestattet, müssen die Messwerte bei 600 nm von denen bei 450 nm abgezogen werden. Dies dient zum Ausgleich optischer Fehler der Mikrotitierplatte. Bestimmung der Absorption bei 450 nm ohne Korrektur führt zu höheren und weniger genauen Messwerten.

BESCHREIBUNG DER ARBEITSSCHRITTE

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PLATTENLAYOUTMusterdiagramm für Standards, Kontrollen und Proben (S...)

8

Bestimmen Sie die Absorption jeder Vertiefung mit einem Mikrotiterplatten-Reader bei 450 nm als primäre Wellenlänge und bei 600 nm als Korrekturwellenlänge (540, 570 oder 650 nm sind ebenso möglich).Berechnen Sie den Absorptionsmittelwert der Doppelbestimmungen für jede Standardkonzentration, Kontrolle und Probe und subtrahieren Sie von diesen Mittelwerten den Absorptionsmittelwert des Leerwertes.Berechnen Sie eine Standardkurve durch Datenreduzierung mittels der 4 PL-Kurvenanpassung. Alternativ ist eine Auftragung der mittleren optischen Dichte jedes Standards auf der y-Achse gegen die Konzentrationen auf der x-Achse zur Ermittlung der Standardkurve und anschließender Anpassung möglich. Die Daten können ebenso durch doppelt-logarithmisches Auftragen linearisiert und die Standardkurve anschließend durch lineare Regression bestimmt werden. Diese Methode erzeugt akzeptable aber weniger präzise Ergebnisse als die vorher beschriebenen Methoden.Dokumentieren Sie die Werte für alle Proben, die innerhalb des Messbereichs von 2,5 bis 200 mIU/mL des Assays liegen. Für Proben, die oberhalb dieses Bereichs liegen, verfahren Sie wie im "Abschnitt Verdünnung von Proben mit hoher Epo Konzentration" beschrieben. Werte unterhalb dieses Bereichs sollten als nicht detektierbar oder < 2,5 mIU/mL interpretiert werden.

SCHÜTTLER-PROTOKOLL

LABORBANK-PROTOKOLL LABORBANK-PROTOKOLL

SCHÜTTLER-PROTOKOLL(mIU/mL) O.D. Mittelwert Korrigiert

0 0,0450 0,047 0,046 —

2,5 0,0702,5 0,076 0,073 0,0275 0,1075 0,108 0,108 0,062

20 0,26320 0,263 0,263 0,21750 0,59750 0,608 0,602 0,556

100 1,081100 1,098 1,090 1,044200 2,008200 2,136 2,072 2,026

(mIU/mL) O.D. Mittelwert Korrigiert0 0,0720 0,074 0,073 —

2,5 0,1062,5 0,108 0,107 0,0345 0,1445 0,146 0,145 0,072

20 0,34220 0,353 0,348 0,27550 0,74350 0,746 0,744 0,671

100 1,298100 1,340 1,319 1,246200 2,366200 2,463 2,414 2,341

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE

REPRÄSENTATIVE ERGEBNISSE FÜR DIE STANDARDKURVENDiese Standardkurven werden zu Demonstrationszwecken zur Verfügung gestellt und sollten in keinem Fall als Ersatz für eigene Standardkurven verwendet werden. Eine entsprechende Standardkurve muß für jede Messung eines Probensatzes neu bestimmt werden.

Opt

isch

e D

icht

eO

ptis

che

Dic

hte

Erythropoietin (mIU/mL)

Erythropoietin (mIU/mL)

9

Liegen Serum-oder Plasmaproben oberhalb einer Konzentration von 200 mlU/mL, verdünnen Sie mit Proben-Verdünnungspuffer. Zum Beispiel:• Für Proben mit Epo-Konzentrationen zwischen 200 mIU/mL und 2000 mIU/mL ist eine

10fache Verdünnung notwendig. Verdünnen Sie dazu 25 mL der Probe mit 225 µL des Proben-Verdünnungspuffers.

• Für Proben mit Epo-Konzentrationen oberhalb 2000 mIU/mL ist eine höhere Verdünnung notwendig, um die Epo-Konzentrationen in den Konzentrationsbereich der Standardkurve zu bringen (d.h. 20fache, 40fache und höhere Verdünnungen)

Anmerkung: Verwenden Sie bitte Polypropylen-oder hochdichte Polyethylen (HDPE)-Teströhrchen für die Verdünnung der Proben. Verwenden Sie in keinem Fall Glasröhrchen. Der Gebrauch von Glasröhrchen verursacht fehlerhafte Ergebnisse, da Epo an Glas haftet!

Zur Berechnung der Epo-Konzentration in verdűnnten Serum-oder Plasmaproben müßen die ermittelten Werte mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert werden.

VERDÜNNUNG VON PROBEN MIT HOHER EPO KONZENTRATION

QUALITÄTSKONTROLLEJedes Labor sollte ein eigenes Qualitätskontrollprogramm zur Handhabung des Quantikine IVD Epo Immunoassays entwickeln. Als Teil dieses Programmes sollten Kontrollen mit bekannten Epo-Konzentrationen (erhältlich bei R&D Systems) in jedem Assay mitgemessen werden. R&D Systems empfiehlt pro Assay mindestens zwei dieser Kontrollen, mit zulaufen verläßliche Durchführung des Assays zu gewährleisten. Um die von Tag zu Tag variierenden Assayergebnisse zu validieren ist es empfehlenswert, jeweils eine Kontrolle mit unteren bis mittleren Normalwerten einzuschliessen, sowie eine Kontrolle die im mittleren Konzentrationsbereich der Standardkurve liegt. Eine Kontrolle kann auch im unteren Bereich der Standardkurve mitgeführt werden, um auch in diesem Bereich eine verläßliche Assaydurchführung zu etablieren. Liegen die erhaltenen Werte nicht innerhalb des etablierten Bereichs, können die Assayergebnisse fehlerhaft sein.

Die Ergebnisse eines einzelnen Assays sind verlässlich, wenn die Kontrollwerte innerhalb veröffentlichter Bereiche einer kommerziell erhältlichen Kontrolle oder des etablierten Bereichs einer hausinternen Kontrolle liegen. Der Korrelationskoeffizient der angepaßten Standardkurve sollte ≥ 0,95 sein.

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Im Allgemeinen sind Assayprobleme auf technische Anwendungsfehler, sowie auf Probleme mit den Reagenzien und Geräten zurueckzu führen. Sollte ein Assay misslingen, überprüfen Sie bitte die Verfallsdaten der einzelnen Reagenzien und versichern Sie sich, dass alle Reagenzien wie auf den Etiketten vorgeschrieben gelagert worden sind. Beachten Sie bitte auch den Abschnitt "Anzeichen von Instabilität oder Verschlechterung". Wenn die Assayqualität fragwürdig sein sollte oder Probleme während der Durchführung auftreten sollten, können Sie zur Eingrenzung des Problems folgende Tabelle zu Hilfe nehmen.

PROBLEM MÖGLICHE URSACHE TEST ODER ABHILFE

Hohe Standardabweichung (%) (große Variabilität der Doppelmessungen im Vergleich zu den laborindividuellen Anforderung an deren Präzision)

Unvollständiges Waschen der Vertiefungen

Checken sie das einwandfreie Arbeiten des wasch automaten

Nicht ausreichendes Entfernen der Waschlösung aus den Vertiefungen

Vertiefungen sollen nach Entfernen der Waschlösung "trocken" erscheinen

Unvollständiges Mischen der Farbreagenz A u. B

Kalibrieren Sie den Schüttler auf 500 ± 50 U/m

Rotationsmischer spritzt Material aus den Vertiefungen auf die Plattenabdeckfolie

Stellen Sie Sicher das Pipetten kalibriert oind und einwandfrei arbeiten

Unterschiedliche Volumenzugaben in die Vertiefungen

Kalibrieren Sie den Rotationsmischer auf 500 ± 50 U/m

Reduziertes niedriges Delta (< 0,015 O.D.) oder starker Hintergrund

Unvollständiges Waschen der Vertiefungen

Stellen Sie sicher, daß der Waschautomat ein wandfrei arbeitet

Nicht ausreichendes Entfernen der Waschlösung aus den Vertiefungen

Vertiefungen sollten nach Entfernen der Waschlösung "trocken" erscheinen

Unterschiedliche Volumenzugaben in die Vertiefungen

Stellen Sie sicher, daß die Pipetten sauber und kalibriert sind

Farbreagenzien A und B wurden zu früh gemischt

Substratlösungen dürfen frühestens 15 min vor Gebrauch gemischt werden

Schlechte Korrelation der Standardkurve (r < 0,95)

Pipettierfehler Berücksichtigen Sie nach individuellen Laborprozeduren erstellte Daten

Nicht ausreichende Farbentwicklung

Nicht ausreichendes Entfernen der Waschlösung aus den Vertiefungen

Vertiefungen sollten nach Entfernen der Waschlösung "trocken" erscheinen

Unterschiedliche Volumenzugaben in die Vertiefungen

Stellen Sie sicher, dass die Pipetten sauber und kalibriert sind

Inkorrekte Inkubationszeiten oder Temperaturen

Halten Sie sich an vorgegebene Inkubationszeiten und Temperaturen

Fehlfunktion von Konjugat oder Substratlösung

Mischen Sie gleiche Volumina von Farbreagenz A, Farbreagenz B und Epo-Konjugat. Die Farbentwicklung sollte sofort eintreten

Material spritzt aus den Vertiefungen auf die Plattenabdeckfolie

Rotationsmischer zu hock eingestellt Kalibrieren Sie den Rotationsmischer auf 500 ± 50 U/min

PROBLEMLÖSUNGEN

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Die Normalbereiche für Serum und EDTA-Plasma wurden mit einem Quantikine IVD Epo ELISA bestimmt. Erythropoietin Konzentrationen wurden bei 123 gesunden Probanden aus dem Gebiet Minneapolis/St.Paul, Minnesota, USA bestimmt. Unter Anwendung der nichtparametrischen Methode zur Analyse von Referenzwerten, beschrieben in der NCCLS Veröffentlichung "How to define, determine, and utilize Reference Intervals in the Clinical Labaratory" (NCCLS Dokument C28-P; Vol. 12, No. 2), wurden die folgenden Referenzbereiche (2,5 bis 97,5 Perzentile) für Epo in Serum und Plasma bestimmt. Jedes Labor sollte jedoch seinen eigenen Normalbereich etablieren.

Epo NormalbereicheSerum EDTA plasma

3,3-16,6 mIU/mL 3,1-14,9 mIU/mL

Erythropoietin Konzentration (mIU/mL)

24

20

16

12

8

4

0

Freq

uenz

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

SerumPlasma

Verteilung der Normalwerte(n=123)

Patienten, die an Polycythaemia rubra vera leiden, können Epo Konzentrationen innerhalb des Normalbereiches aufweisen, während solche, die an sekundärer Polyzythämie leiden, erhöhte Werte an Serum Epo aufweisen. Polycythaemia rubra vera-Patienten, die sich einer Phlebotomie unterzogen haben, weisen ebenso erhöhte Serum Epo Konzentrationen auf.

Patienten, die an den häufigsten Anämieformen leiden, liegen mit höheren Werten außerhalb des Normalbereiches, wohingegen Patienten, die an Anämie in Verbindung mit chronischer Niereninsuffizienz leiden Werte aufzeigen, die im Normalbereich dieses Assays liegen. Anämische Patienten, die Bluttransfusionen erhalten, können niedrigere Werte als erwartet zeigen.

Ungewöhnlich hohe Konzentrationen von Serum Epo können auch in diversen anderen pathologischen Zuständen beobachtet werden, eingeschlossen renale Neoplasmen, gutartige Tumore, polyzystische Nierenerkrankungen, Nierenzysten und Hydronephrosen.

Die Ergebnisse dieses Assays sollten in Verbindung mit Informationen aus klinischen Daten und anderen diagnostischen Anwendungen betrachtet werden.

ZU ERWARTENDE ERGEBNISSENormalbereich

Assoziierte Erkrankungen

08.11 749157.1 8/18

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