Click here to load reader
Upload
georg-manecke
View
215
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
Die Angewandte Makromolekulare Chemie 78 (1979) 21-44 (Nr. 1244)
Institut fur Organische Chemie der Freien Universitat Berlin D-1000 Berlin 33, TakustraBe 3
Reaktive Trager zur Immobilisierung von Enzymen auf der Grundlage von Polyvinylalkohol
Georg Manecke und Hans-Gunter Vogt
Herm Prof. Dr. Horst Pommer zum 60. Geburtstag gewidmet
(Eingegangen am 18. Dezember 1978)
ZUSAMMENFASSUNG: Verschiedene reaktive Trager fur die Immobilisierung von Enzymen wurden auf der
Basis von Polyvinylalkohol synthetisiert. Ausgehend von einem Hydrolysat eines Perlpo- lymeren aus vernetztem Polyvinylacetat sowie von mit Polyvinylalkohol beschichteten Schlauchen aus Poly(viny1acetat-co-ethylen) bzw. von Polyvinylalkohol enthaltendem Synthesepulp wurden reaktive Trager durch Umsetzung rnit 2-(3-Aminophenyl)-l,3-di- oxolan und nachfolgender Diazotierung hergestellt. Weiterhin wurden in Gele eines rnit Terephthalaldehyd vernetzten Polyvinylalkohols reaktive Isothiocyanatgruppen sowie 2- Thiopyridingruppen enthaltende gemischte polymere Disulfide eingefuhrt. Die Enzyme Papain, Trypsin, Glucose-Oxydase und Katalase wurden immobilisiert und die Eigen- schaften der immobilisierten Enzympraparate untersucht.
SUMMARY On the basis of poly(viny1 alcohol) various reactive camers for the immobilization of en-
zymes were synthesized. Starting as well from hydrolyzed beads of crosslinked poly(viny1 acetate), as from tubes of poly(viny1 acetate-co-ethylene) which have been coated with poly(viny1 alcohol) resp. from poly(viny1 alcohol) containing synthetic pulp reactive car- riers were synthesized by reaction with 2-(3-aminophenyl)-1,3-dioxolane followed by di- azotization. Furthermore reactive isothiocyanato groups as well as mixed polymeric disul- fides with 2-thiopyridine groups were introduced into gels of poly(viny1 alcohol) which were crosslinked with terephthalaldehyde. The immobilization of enzymes was camed out with papain, trypsin, glucose oxidase, and catalase. The properties of the immobilized en- zymes were investigated.
Vernetzte Polyvinylalkoholderivate erwiesen sich bereits in friiheren Arbei- ten',' fur die kovalente Immobilisierung von Enzymen als geeignete Tragerma- terialien. Gute Eigenschaften zeigten hierbei Derivate, die aus rnit Terephthalal- dehyd vernetztem Polyvinylalkohol (PVAL) durch Umsetzung mit 2-(3-Amho- phenyl)-1,3-dioxolan hergestellt wurden und durch Umsetzung mit NaNOJ
21
G. Manecke und H.-G. Vogt
HC1 in die reaktive Diazoniumform uberfuhrt wurden. Die Enzymbindung ge- schah hierbei uber eine Azokupplung. Diese Kupplungsmethode ist, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt wird, allgemein bei polymeren Tragern, die Polyvi- nylalkohol (PVAL) oder Hydrolysate von Copolymeren des Vinylacetats ent- halten, anwendbar. Fur kovalente Enzymimmobilisierungen uber Azokupplun- gen wurden folgende polymeren Produkte eingesetzt:
a) PVAL-Perlpolymere (Hydrolysate des Polyvinylacetat-Gels FractogeP; Merck, Darmstadt)
b) PVAL-beschichtete Schlauche aus Poly(viny1acetat-co-ethylen) c) PVAL enthaltendes Synthesepulp (SWP@; Hoechst Zellerbach, Frank-
In allen Fallen wurden die polymeren Trager nach folgendem Reaktionssche- furt)
ma zu den reaktiven Diazoniumderivaten umgesetzt:
5 E q NHz N;CI-
1 11 111
Neben der Einfuhrung von Diazoniumgruppen wurden ebenfalls Isothiocya- nat- sowie Disulfidgruppierungen als reaktive Gruppen in den mit Terephthal- aldehyd vernetzten PVAL eingefuhrt. Die so erstellten reaktiven Trager konnten zur Immobilisierung von Enzymen erfolgreich eingesetzt werden.
P VA L- Trager mit Diazoniumgmppen
Im Falle des Polyvinylacetat-Gels (Fractogel-PVA) wurde die Vinylalkohol- form I dieses Polymeren durch alkalische Hydrolyse in Methanol3 erhalten. Fractogel-PVA 2000, das als Perlpolymeres (KorngroBe 0,032-0,063 mm) vor- lag, ergab nach der Hydrolyse unter Erhaltung der Perlstruktur einen mecha- nisch stabilen Polyvinylalkoholtrager. Das Aminoderivat I1 wurde durch Um- setzung von Fractogel-PVA 2000-1 mit 2-(3-Aminophenyl)-l,3-dioxolan mit ei- nem Gehalt von 1,25 mmol Aminogruppen pro g erhalten. Nach der Diazotie- rung zu Derivat I11 konnten an diesem Trager 88 mg Trypsin pro g Fractogel- PVA 2000-111 immobilisiert werden.
Ein weiterer fur die Immobilisierung von Enzymen geeigneter Polyvinylalko- holtrager ist ein fur die Papierherstellung von Crown-Zellerbach entwickelter
22
Immobilisierung von Enzymen auf P VA L- Tragern
Synthe~epulp~. Fur die Untersuchungen wurde ein Synthesepulp des Typs SWP-R 830 eingesetzt, der aus Niederdruckpolyethylen mit einem PVAL-Ge- halt von ca. 4,2% bestand. Dieses Fasermaterial besitzt aufgrund des inerten Polyethylenkerns der Einzelfasern gegenuber porosen Matrizes den Vorteil, daB Derivatisierungen und die Immobilisierung von Enzymen nur im Bereich einer dunnen Oberflachenschicht stattfinden. Daraus ergeben sich kurzere Diffu- sionswege von Substrat und Produkt bei enzymatischen Reaktionen von an die- sen Tragern immobilisierten Enzymen. Weiterhin eroffnen deren Faserstruktur und deren Verwendbarkeit fur die Herstellung von Filterpapieren spezielle Moglichkeiten fur ihre Anwendung.
In Synthesepulp SWP-R 830 lieBen sich folgende fur die Immobilisierung von Enzymen geeignete reaktive Gruppen einfuhren: Diazonium-, Isothiocyanat-, Imidocarbonat- sowie Disulfidgruppen'. Durch Umsetzung des Synthesepulps SWP-R 830 mit 2-(3-Aminophenyl)-l,3-dioxolan lieB sich ein Aminoderivat der Struktur I1 darstellen und durch Diazotierung in das Derivat I11 (SWP-R 830- 111) uberfuhren. Es lieBen sich 34 mg Trypsin pro g SWP-R 830-Trager immobi- lisieren.
In Tab. 1 sind die Aktivitaten von an Fractogel-PVA 2000-111 und an Synthe- sepulp SWP-R 830-111 immobilisiertem Trypsin in ungepufferten und gepuffer- ten Losungen gegenuber dem Substrat N"-Benzoyl-L-argininethylester (BAEE) aufgefuhrt. Als Produkt der enzymatischen Reaktion werden Sauren, also auch Protonen, gebildet, die sich in der Mikroumgebung des immobilisierten Enzyms anreichern. Daraus resultiert eine Verschiebung des pH-Optimums in den alka- lischen pH-Bereich, die besonders stark ist, wenn ungepufferte Substratlosungen verwendet werden. Bei pH 8, dem pH-Optimum des nativen Trypsins, zeigen die immobilisierten Trypsinderivate im ungepufferten Medium nur 16 bzw. 25% ih- rer maximalen Aktivitat (Tab. 1). Der pH-Gradient zwischen Losung und Mi- kroumgebung des immobilisierten Enzyms laDt sich durch Zugabe von Puffer- substanzen abbauen.
Es wurde sowohl der EinfluB von Tris(hydroxymethy1) aminomethan als auch von Acetat auf die enzymatische Aktivitat untersucht. Die Wirkung von Acetat, das fast keine Pufferkapazitat im untersuchten pH-Bereich besitzt, wurde in Ar- beiten von Engasser und Horvath durch eine Erleichterung des Transportes der Reaktanden erklad.
Wie aus Tab. 1 zu ersehen ist, erweist sich ein Zusatz von 1 M CH,COONa bei den Aktivitatsbestimmungen im Fall von an SWP-R 830-111 immobilisiertem Trypsin wirkungsvoller (94% der maximalen Aktivitat bei pH 8,OO) als beim an Fractogel-PVA 2000-111 gebundenem Trypsin (37% der maximalen Aktivitat bei
23
h)
P
Tab.
1.
Akt
ivita
t von
imm
obili
sier
tem
Tryp
sin g
egen
iiber
BA
EE in
gep
uffe
rten u
nd u
ngep
uffe
rten L
osun
gen
(Tra
ger:
Dia
zoni
umde
ri-
vate
I11
von
Frac
toge
l-PV
A 2
000
und
Synt
hese
pulp
SW
P-R
830
).
9
Kon
zent
ratio
nen
im T
est
PH
Akt
ivita
t von
Try
psin
imm
obili
sier
t an
BA
EE
NaC
l C
H,C
OO
Na
Tris
Fr
acto
gel-P
VA
200
0-11
1 SW
P-R
830
-111
(MI
(MI
(M)
(M)
in U
a/g
in %
der
in
Ua/
g in
% d
er
H Tr
ager
m
ax. A
kt.b
Tr
ager
m
ax. A
kt.b
8 6 x e a
0,02
-
-
-
8,O
19
25
27
16
0,O
l -
0,O
l -
8,O
95
58
0,O
l -
1,OO
-
8,O
27
37
156
94
0,O
l 0,
20
-
0,O
l 8,O
44
59
0,O
l 0,
20
-
0,IO
9,O
74
10
0 16
6 10
0
h c 9
0
0,O
l 0,
20
-
0,lO
8,O
64
86
14
9 90
a U
Sub
stra
tum
satz
in p
mol
pro
min
. be
zoge
n au
f di
e A
ktiv
itat d
es im
mob
ilisi
erte
n En
zym
s im
pH
-Opt
imum
.
Immobilisierung von Enzymen auf PVAL-Tragern
pH 8,OO). Dies laBt sich durch die gunstigeren Diffusionsverhaltnisse beim Syn- thesepulp-Trypsinderivat erklaren. Die pH-Optima von an Synthesepulp und an Fractogel immobilisiertem Trypsin gegenuber BAEE wurden in 0,l -M- Tris(hydroxymethy1)aminomethan-Puffer aufgenommen (Abb. 1). In Gegen- wart dieses Puffers zeigten beide immobilisierten Trypsinderivate maximale Ak- tivitat bei pHr9,O.
I I I I I
7 8 9 10 PH
Abb. 1. pH-Aktivitatsprofil von freiem Trypsin (0) und von an Synthesepulp SWP-R 830-111 (A) bzw. an Fractogel-PVA 2000-111 0 immobilisiertem Trypsin (Sub- strat: 0,Ol M BAEE, 0,2 M NaC1, 0,l M Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 25 "C).
Verglichen mit dem pH-Aktivitatsprofil des freien Trypsins tritt bei dem pH- Optimum des an Fractogel-PVA 2000-111 gebundenen Trypsins eine etwas star- kere Abweichung im Kurvenverlauf auf als bei dem entsprechenden Synthese- pulp-Trypsinderivat. Die relative Aktivitat im pH-Optimum betrug bei dem an Fractogel-PVA 2000-111 gebundenen Trypsin 2% und beim an SWP-R 830-111 gebundenen Trypsin etwa 12%.
Reaktive Trager mit Diazoniumgruppen der Struktur I11 lieRen sich auch, ausgehend von Schlauchen, die aus einem Vinylacetat-Ethylen-Copolymeren bestanden, synthetisieren. Es wurden Schlauche mit einem elementaranalytisch ermittelten Vinylacetatgehalt von etwa 10 mol-% eingesetzt, die einen inneren Schlauchdurchmesser von 0,2 cm aufwiesen. An der inneren Schlauchwand wurden durch Hydrolyse mit 2Oproz. NaOH Vinylalkoholgruppen gebildet. Fur die anschlieBende Derivatisierung zu I1 und I11 envies es sich als vorteilhaft, wenn der Gehalt an Hydroxylgruppen an der inneren Schlauchwand durch Be-
25
G. Manecke und H.-G. Vogt
schichtung rnit PVAL-Gel erhoht wurde. Die Beschichtung der inneren Schlauchwand erfolgte nach folgendem Reaktionsschema:
OH LCH~-O-@CHO 0 tO-CH2-CH-CH2-O-@H0 t - OH I
Die Reaktion von 4-(2,3-Epoxypropoxy)benzaldehyd rnit den Hydroxylgrup- pen der Schlauchoberflache fuhrte zu einem Derivat mit Aldehydgruppen, die sich in saurer Losung rnit PVAL acetalisieren lieBen. In Gegenwart von Tere- phthalaldehyd lieB sich bei der Acetalisierungsreaktion an der inneren Schlauchwand ein polymeres Netzwerk aufbauen. In dieser Form wurde die in- nere Schlauchwand in Folgereaktionen zu den Strukturen I1 und I11 derivatisiert und die Azokupplung von Trypsin am Derivat I11 des Schlauches durchgefuhrt. Pro 100 cm Schlauch lieBen sich auf diese Weise 0,6 mg Trypsin immobilisieren, das gegenuber BAEE (in Tris-Puffer pH S,O) eine Aktivitat von 4,s U aufwies (20% relative Aktivitat).
P VAL- Trager rnit Isothiocyanatgruppen
Die beschriebenen Aminoderivate des PVAL lieBen sich mit Thiophosgen zu reaktiven PVAL-Tragern rnit Isothiocyanatgruppen umsetzen. Fur die Immobi- lisierung von Enzymen wurden derartige Trager u. a. auf der Basis von rnit Te- rephthalaldehyd vernetztem PVAL (IV)' hergestellt.
IV Va-c VIa-c
26
Immobilisierung von Enzymen auf P VA L- Tragern
Fur die Umsetzung von IV mit 2-(3-Aminophenyl)-1,3-dioxolan wurden die in Tab. 2 angegebenen Mengen eingesetzt und die Aminoderivate Va-c erhalten, aus denen die polymeren Isothiocyanattrager VIaX hergestellt wurden.
Tab. 2. Darstellung reaktiver Derivate des vernetzten Polyvinylalkohols rnit Isothiocya- natgruppen und Gehalt der Polymeren Va-c und VIa-c an funktionellen Grup- pen.
a b C
pro g PVAL (mit 5 mol-96 Terephthalaldehyd vernetzt) eingesetztes 2-(3-Aminophenyl)- 1,3-dioxolan in cm' 0,80 0,50 0,IO in mmol 5,84 3,65 0,73 Gehalt der Polymeren V an Aminogruppen in mmol/g" 1,50 1,Ol 0,30 Gehalt der Polymeren VI an Isothio- cyanatgruppen in mmol/gb 1,33 0,97 0,25
a berechnet aus den Stickstoffanalysenwerten. berechnet aus den Stickstoff- und Schwefelanalysenwerten.
Die in Tab. 2 angegebenen Gehalte der Polymeren an funktionellen Gruppen wurden bei Va-c aus den Stickstoffwerten und bei VIaX aus den Stickstoff- und Schwefelwerten der Elementaranalyse berechnet. Die Analysenwerte zeigten, daB sich die Aminogruppen nahezu vollstandig zu Isothiocyanatgruppen umset- Zen lieBen. Im IR-Spektrum zeigten die NCS-gruppenhaltigen reaktiven Trager bei 2 040-2 120 cm-' eine Absorptionsbande der NCS-Gruppe, deren Intensitat gemaB dem Gehalt der Trager VIa-c an NCS-Gruppen abgestuft war. Vergli- chen mit den aus Va-c hergestellten Diazoniumtragern'.* verhielten sich die Trager mit Isothiocyanatgruppen bei gleicher Zusammensetzung des polymeren Netzwerkes hydrophober. Dies auBerte sich vor allem beim Trager VIa, der in- folge des hohen Gehaltes an hydrophoben Gruppen in waarigen Pufferlosungen erst nach langerem Ruhren vollstandig benetzt werden konnte.
Das Bindungsvermogen des Tragers VIc gegenuber Papain wurde in Abhan- gigkeit vom Kupplungs-pH untersucht. Es wurden hierfur 0,Sproz. Losungen des Enzyms in Phosphatpuffern (~=0,15) rnit pH-Werten im Bereich pH 5,O-8,0 eingesetzt. Die pH-Abhangigkeit des Enzymbindungsvermogens eines reakti- ven Tragers wird sowohl von den Reaktivitaten der verwendeten reaktiven Gruppen als auch von eventuell auftretenden Nebenreaktionen, wie z. B. Hy-
21
G. Manecke und H.-G. Vogt
drolyse von reaktiven Gruppen, und von dem Quellungsverhalten des Polyme- ren im untersuchten pH-Bereich bestimmt. Im Bereich pH 5,O-8,0 kann die Hydrolyse der NCS-Gruppen vernachlassigt werden. Auch Effekte, die sich aus unterschiedlichen Quellungszustanden ergeben wiirden, treten hier nicht auf, da beim Trager VIc eine Neutralmatrix vorliegt und daher in diesem pH-Bereich keine Quellungsunterschiede auftreten. Die pH-Abhangigkeit des Bindungsver- mogens von Trager VIc gegeniiber Papain kann demnach direkt als Malj fur die Reaktivitat der NCS-Gruppen in diesem pH-Bereich gewertet werden (Tab. 3).
Tab. 3. Immobilisierung von Papain an Trager VIc". Abhangigkeit der gebundenen Menge Papain und der Aktivitat gegeniiber BAEE vom Kupplungs-pH.
Kupplungs- immobilisiertes Aktivitatb von immobilisiertem Papain PH Papain in in U' pro g Trager VIc (relative Aktivitat in %)
mg/g Trager VIc 1. Bestimmung 2. Bestimmung 3. Bestimmung
33,8 (39,s) 32,9 (38,5) 33,l (38,7)
52,8 (23,8) 61,4 (27,7) 65,2 (29,4) 79,9 (23,l) 89,2 (25,8) 90,9 (26,3)
45,2 (37,3) 45,4 (37,4) 45,7 (37,7)
a 50 mg Trager VIc, 50 mg Papain in 10 cm3 Phosphatpuffer (p=0,15), 16 h, 25 "C. Substrat: 0,05 M BAEE, pH 6,0, 30 "C. U: Substratumsatz in pmol pro min.
Das Papainbindungsvermogen von Trager VIc nimmt von pH 5,O zu pH 8,0 um etwa das Vierfache zu. Die Aktivitat der immobilisierten Papainpraparate, die mit BAEE bei pH 6,OO und 30 "C gemessen wurde, steigt in gleicher Rich- tung. Die relativen Enzymaktivitaten sind fur das bei niedrigeren pH-Werten immobilisierte Papain hoher. Dies laBt sich einmal durch die geringere Enzym- dichte am Trager und das damit verbundene giinstigere Verhaltnis zwisch& an- gebotener Substrat- und immobilisierter Enzymmenge erklaren. Zum anderen ist die Stabilitat des freien Enzyms in Pufferlosungen bei niedrigeren pH-Werten groljer, so dalj in diesen Fallen wahrend der Immobilisierung weniger an Enzym denaturiert wird. Dies fallt insbesondere ins Gewicht, wenn die Kupplungsreak- tion mehrere Stunden dauert. Der EinfluB des Gehalts der Trager V1a-C an reaktiven Gruppen auf das Bindungsvermogen fur Papain ist in Tab. 4 darge- stellt. Die Kupplung des Enzyms wurde bei pH 8,0 durchgefuhrt.
28
Tab
. 4.
Imm
obili
sier
ung
von
Papa
in a
n Tr
ager
VIa
-c".
Abh
angi
gkei
t de
r ge
bund
enen
Men
ge P
apai
n un
d de
r Akt
ivita
t geg
eniib
er
P
BA
EE v
om G
ehal
t an
reak
tiven
Gru
ppen
. 2 $.
Trag
er
mm
ol re
akt.
imm
obili
sier
tes P
apai
n A
ktiv
itatb
von
imm
obili
sier
tem
Pa
pain
in U
' pr
o g
Tra
ger V
I rs B
1. B
estim
mun
g 2.
Bes
timm
ung
3. B
estim
mun
g & e 3
VIa
1,
33
110
83
11,6
( 5,
O)
13,6
( 5,
9)
133
( 5,
9)
3 V
Ib
497
130
134
223 (
8,4)
36
,7 (1
3,7)
40
,2 (1
5,O)
a Q
'a
VI
C 0,
25
170
680
79,9
(23,
l)
89,2
(25,
8)
90,9
(26,
3)
3 t? a: % 3
in m
g/m
mol
Gru
ppen
Gru
ppen
/g
in m
g/g
Trag
er V
I T
rage
r VI
reak
tive
(rel
ativ
e A
ktiv
itat i
n %
)
50 mg
Trag
er V
I, 50
mg
Papa
in i
n 10
cm
3 Ph
osph
atpu
ffer
pH
8,0
(~
=0,
15),
16 h
, 25
"C
. Su
bstra
t: 0,
05 M
BA
EE, p
H 6
,0, 3
0 "C
. Y
'
U: S
ubst
ratu
msa
tz in
bm
ol p
ro m
in.
w 0
Tab
. 5.
Imm
obili
sier
ung
von
Try
psin
an
Tra
ger V
Ia-c
". A
bhan
gigk
eit
der g
ebun
dene
n M
enge
Try
psin
und
der
Akt
ivita
t ge
genu
ber
BA
PA v
om G
ehal
t an
reak
tiven
Gru
ppen
.
Tra
ger
mm
ol re
akt.
imm
obili
sier
tes
Try
psin
A
ktiv
itatb
von
imm
obili
sier
tem
?
Tra
ger V
I T
rage
r VI
reak
tive
prod
ukt (
rela
tive
Akt
ivita
t in
%)
0
VIa
1,
33
65
49
2,4
(3,9
) 29
4 (3
99)
2,4
(3,9
) a
VIb
0,
97
62
64
22
(3,8
) 1,
9 (3
2)
2,o
(3,4
) 7
VIC
0,
25
48
192
2s
(5s)
2
4 (5
,6)
224
(594
) 6 3
a 50
mg
Trl
ger V
I, 50
mg
Try
psin
in 1
0 cm
3 Ph
osph
atpu
ffer
pH
8,O
(p=O
,15)
, 16
h, 2
5 "C
.
F G
rupp
en/g
in
mg/
g in
mg/
mm
ol
Try
psin
in U
c/g
Imm
obili
sier
ungs
-
G r u p p
e n
1. B
estim
mun
g 2.
Bes
timm
ung
3. B
estim
mun
g $ d
B
P.
Subs
trat:
2,s .
I0 -3
M D
,L-B
APA
, Ph
osph
atpu
ffer
pH
7,8
(p=O
,15)
, 25
"C
. U
: Sub
stra
tum
satz
in p
mol
pro
min
.
Immobilisierung von Enzymen auf PVA L- Tragern
Das Bindungsvermogen fur Papain sinkt mit zunehmendem Gehalt an reakti- ven Gruppen, was durch die abnehmende Hydrophilie der Trager bedingt ist. Das an Trager VIa gebundene Papain weist auch die niedrigsten relativen Akti- vitaten auf. Da die pro mmol reaktiver Gruppen gebundene Enzymmenge bei Trager VIa am niedrigsten ist, ist bei diesem Trager auch die Wahrscheinlich- keit, daB das Enzymmolekul mehrfach gebunden ist, groBer. Dies konnte der Grund fur die AktivitatseinbuBen sein.
Tab. 5 zeigt den EinfluB des Gehalts an Isothiocyanatgruppen der Trager VIa-c auf das Trypsinbindungsvermogen und die Eigenschaften der immobili- sierten Trypsinpraparate.
Im Gegensatz zur Papainbindung nimmt das Bindungsvermogen fur Trypsin mit zunehmendem Gehalt der Trager an reaktiven Gruppen leicht zu. Offen- sichtlich ist hier der EinfluB der Hydrophobisierung der Matrix auf das Bin- dungsvermogen nicht in dem MaBe entscheidend wie bei der Immobilisierung von Papain. Die pro mmol NCS-Gruppen gebundenen Mengen Trypsin neh- men jedoch, wie bereits bei Papain beschrieben, auch hier mit zunehmendem Gehalt an reaktiven Gruppen ab. Die relativen Enzymaktivitaten zeigen keine so deutliche Abhangigkeit von der Tragerzusammensetzung wie beim immobili- sierten Papain, jedoch scheint auch hier ein geringerer Gehalt an reaktiven Gruppen gunstiger zu sein.
Im Fall von immobilisierter Glucose-Oxydase verhielten sich die Trager VIa- c praktisch identisch. Alle drei Trager ergaben Immobilisierungsprodukte mit Glucose-Oxydase-Aktivitaten von ca. 80 U/g eingesetztem Trager.
Die am Trager VIc beim pH 8,0 immobilisierten Hydrolasen Papain und Trypsin wurden hinsichtlich ihrer pH-Aktivitatsprofile charakterisiert.
Das pH-Aktivitatsprofil von freiem und immobilisiertem Papain wurde ge- genuber 0,05 M BAEE in Anwesenheit von 9. lop3 M Cystein und 1,8. 104M Ethylendiamintetraessigsaure (EDTA) aufgenommen. Das pH-Optimum von freiem Papain lag bei pH 6,O. Das pH-Aktivitatsprofil von immobilisiertem Pa- pain zeigte eine optimale Aktivitat bei pH 8,5-8,8 und wies zwischen pH 4,5-6,5 ein breites Plateau auf (Abb. 2).
Fuhrte man die Aktivitatsbestimmungen in Gegenwart von 0,3 M KC1 durch, so wurde das Plateau schmaler, und das pH-Optimum trat bei pH 8,O auf. Beim pH-Optimum war die relative Aktivitat etwa 65%, d. h., sie ist beim pH-Opti- mum etwa um den Faktor 2,5 groljer als die beim pH 6 gefundene relative Aktivi- tat. Die Verschiebung der pH-Optima in den alkalischen pH-Bereich laBt sich hier auf Produktanreicherung zuriickfuhren.
31
G. Manecke und H.-G. Vogt
50-
4 5 6 7 8 9 10 PH
Abb. 2. pH-Aktivitatsprofil von freiem und an Trager VIc immobilisiertem Papain (Kupplungs-pH 8,O): (0): freies Papain (0,05 M BAEE, 30 "C); (A): immobili- siertes Papain (0,05 M BAEE, 30 "C); (0): immobilisiertes Papain (0,05 M BAEE, 0,3 M KCl, 30 "C).
Vom glockenformigen Verlauf des pH-Optimums des freien Papains abwei- chende pH-Aktivitatsprofile bei immobilisierten Papainderivaten sind bereits von anderen Autoren beschrieben worden'. Eine theoretische Erklarung gaben Engasser und Horvath6 in ihren Arbeiten uber die dynamische Funktion von Puffersubstanzen. Danach sind Cystein und EDTA, die bei den Aktivitatsbe- stimmungen des immobilisierten Papains hinzugefugt werden, aufgrund ihrer
32
Immobilisierung von Enzymen auf PVAL-Tragern
Pufferwirkung in der Lage, den Protonentransport zu erleichtern. Die Plateau- bildung ist nach Engasser und Horvath auf die verhaltnismaflig niedrige Kon- zentration dieser Substanzen zuriickzufuhren. Erst bei hoheren Pufferkonzen- trationen ist eine Ruckverschiebung und Angleichung der pH-Aktivitatsprofile der immobilisierten Enzyme an den glockenfonnigen Verlauf des Profils des freien Enzyms zu erreichen.
Das pH-Aktivitatsprofil von an Trager VIc immobilisiertem Trypsin wurde mit Na-Benzoyl-DL-arginin-4-nitroanilid (DL-BAPA) als Substrat in Gegen- wart von Phosphatpuffer der Ionenstarke p=0,15 aufgenommen (Abb. 3).
Abb. 3. pH-Aktivitatsprofil von freiem Trypsin (0) und von an Trager VIc (A) sowie an Diazoniumderivat I11 eines mit PVAL beschichteten Schlauches aus Poly(viny1- acetat-co-ethylen) (0) immobilisiertem Trypsin (Substrat: 2 , 5 . M D,L- BAPA, Phosphatpuffier, p=0,15, 25 "C).
Zum Vergleich ist in Abb. 3 das pH-Aktivitatsprofil von immobilisiertem Trypsin, das uber Azokupplung an einem entsprechend modifuierten Schlauch immobilisiert wurde, aufgefuhrt. Beide immobilisierten Trypsinderivate zeigten eine nur leichte Verschiebung in den alkalischen pH-Bereich, was auf die Anwe- senheit relativ hoher Mengen Phosphatpuffer zuriickzufuhren ist.
33
G. Manecke und H.-G. Vogt
Fur das an Trager VIc immobilisierte Papain wurde die scheinbare Michaelis- Konstante mit BAEE als Substrat bei pH 6,O und 30 "C bestimmt.
Die Michaelis-Menten-Kinetik wurde fur den Konzentrationsbereich 5 . M bis 0,l M BAEE untersucht. Innerhalb dieses Bereichs konnte auch bei den hoheren BAEE-Konzentrationen keine Substratinhibierung festgestellt werden, wie sie an einem uber Azokupplung an vernetztem PVAL immobilisier- tem Papainderivat beobachtet wurde'. Die MeBwerte lieBen sich sowohl durch die Lineweaver-Burk-Auftragung als auch durch die Eadie-Hofstee-Auftragung linearisieren und ergaben fur das an TrPger VIc immobilisierte Papain einen KMcapp,,-Wert von 6 . lor2 mol dm-3, der sich von dem unter gleichen Bedingun- gen ermittelten K, des freien Papains (K,=4. lo-' mol dm-3) nicht wesentlich unterscheidet.
P VA L- Trager mit DisulJidgruppen
Reaktive Disulfidderivate mit 2-Thiopyridingruppen auf der Basis von Aga- rose sind von der Arbeitsgruppe urn Axen in zahlreichen Veroffentlichungen be- schrieben worden'. Ein Thiolderivat von unvernetztem loslichen PVAL, das durch Acetalisierung von PVAL mit Chloracetaldehyd und anschlieBendem Austausch von Chlor gegen Thiolgruppen erhalten wurde, wurde bereits von Okawara und Sumitorno'' beschrieben. Auf der Grundlage dieser Reaktionen wurden nach folgendem Reaktionsschema ausgehend von vernetztem PVAL IV fur die Enzymimmobilisierung geeignete Trager IX hergestellt:
IV VII VlIl
34
Immobilisierung von Enzymen auf P VA L- Tragern
Abb. 4. pH-Aktivitatsprofil von freier (0) und von an Trager IX (V) immobilisierter Ka- talase (Substrat: 0,Ol M H202, Phosphatpuffer, p=O,I, 25 "C).
Nach obiger Reaktionsfolge wurde ein vernetztes PVAL-Derivat IX syntheti- siert, dessen Gehalt an Disulfidgruppen 50 pmol pro g IX betrug. An diesem Trager IaBt sich die Immobilisierung von SH-gruppenhaltigen bzw. von thiolier- ten Enzymen durchfuhren. Als ein Enzym, das von Natur aus SH-Gruppen ent- halt, wurde Katalase an Trager IX immobilisiert. An 1 g Trager IX lieBen sich 12 mg Katalase immobilisieren. Die Aktivitat gegenuber 0,Ol M H,O, betrug bei 25 "C 3 900 U/g Immobilisierungsprodukt. Die relative Aktivitat lag dabei bei ca. 0,6%.
Das pH-Optimum wurde sowohl von freier als auch von an Trager IX immo- bilisierter Katalase aufgenommen (Abb. 4). In beiden Fallen lag das pH-Opti- mum bei pH 7,0, jedoch zeigte das pH-Aktivitatsprofil fur die immobilisierte Katalase einen breiteren Verlauf des pH-Optimums. Fur die immobilisierte Ka- talase ist keine Verschiebung des pH-Optimums zu erwarten, da die von der Ka- talase bewirkte enzymatische Reaktion keine Protonen einschliefit.
AbschlieBend kann festgestellt werden, dafi an allen PVAL-Produkten eine erfolgreiche Immobilisierung von Enzymen moglich war, die zu aktiven immo- bilisierten Enzympraparaten fuhrte. In keinem Falle wurde ein Auswaschen von enzymatischer Aktivitat aus den Immobilisierungsprodukten beobachtet. Alle in dieser Arbeit beschriebenen immobilisierten Enzyme zeigten keine feststell- baren Aktivitatsverluste bei wiederholten Bestimmungen derselben Probe mit den angegebenen Substraten.
Detaillierte Veroffentlichungen iiber Enzymimmobilisierungen an Synthese- pulp und an Poly(viny1acetat-co-ethylen)-Schlauchen sind in Vorbereitung.
35
G. Manecke und H.-G. Vogt
Experimenteller Teil
Herkunft der verwendeten Substanzen
Polyvinylalkohol (Merck-Schuchardt, Polymerisationsgrad 1600, Hydrolysegrad 97,5- 99,5%); Fractoge1"-PVA 2000 (Merck); Synthesepulp SWP@-R 830 (Hoechst-Zellerbach); Papain EC 3.4.22.2 (Merck, Kat. Nr. 7144); Trypsin, EC 3.4.21.4 (Boehringer/Mannheim, Kat. Nr. 109819; Merck, Kat. Nr. 24579); Glucose-Oxydase, EC 1.1.3.4 (GOD, Grad I, Boehringer/Mannheim); Peroxydase, EC 1.1 1.1.7 (POD, Grad I, Boehringer/Mann- heim); Katalase, EC 1.11.1.6 (Boehringer/Mannheim, Kat. Nr. 106810); N"-Benzoyl-L- arginin-ethylester . HC1 (BAEE, Merck); Nu-Benzoy1-D,L-arginin-4-nitroanilid. HC1 (D,L-BAPA, Boehringer/Mannheim); 2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonat) (ABTS, Boehringer/Mannheim); 2,2'-Dipyridyldisulfid (Merck).
Gerate
IR-Spektren: Perkin-Elmer-257; Absorptionsmessungen: Beckman Spectrophotometer DB-GT mit Schreiber; titrimetrische Aktivitatsbestimmungen: automatischer Titrier- stand (Fa. Metrohm, Schweiz; bestehend aus: Dosimat E 535-5, pH-Meter E 500, Impulso- mat E 473 und einem Schreiber E 478).
1. Darstellung der reaktiven Polyvinylalkoholtrager und der immobilisierten En- zympraparate
1.1 Darstellung eines reaktiven Diazoniumtragers ausgehend von Fractogel-P VA 2000
1.1.1 Hydrolyse v o n Fractogel-PVA 2000
10,OO g Fractogel-PVA 2000 wurden bei Raumtemp. in 500 cm3 Methanol gequollen und 5 cm3 40proz. NaOH hinzugefugt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 40 "C und weitere 12 h bei Raumtemp. geriihrt. Die Losung wurde abgesaugt und das Hydrolysepro- dukt nacheinander mit Methanol, Wasser und Methanol gewaschen und i. Vak. getrock- net.
Ausb. 5,2 g Fractogel-PVA 2000-1.
1.1.2 Darstellung des Aminoderivates Fractogel-PVA 2000-11
2,OO g Fractogel-PVA 2000-1 wurden in 80 cm3 Wasser gequollen, 2 cm3 konz. HCl (D=1,19) hinzugefugt und unter Riihren 1,OO cm3 (7,30 mmol) 2-(3-Aminophenyl)-l,3-
36
Immobilisierung von Enzymen auf P VAL- Tragern
dioxolan innerhalb von 45 min hinzugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf 50 C erwarmt und 18 h bei dieser Temp. geriihrt. Die Losung wurde abgesaugt, der Trager nacheinander mit 500 cm3 0,Ol M HC1, dann mit Wasser, Aceton/Wasser (4: 1) und rnit Aceton gewaschen und 24 h rnit Aceton extrahiert.
Gef. N 1,75 (= 1,25 mmol Arninogruppedg Fractogel-PVA 2000-11).
1.1.3 Diazotierung von Fractogel-PVA 2000-11
50 mg Fractogel-PVA 2000-11 wurden in 2 cm3 Wasser gequollen, bei 0 "C rnit 10 cm3 0,s M HCl und 1 cm3 1 M NaNO, 30 min geriihrt, abfiltriert und rnit Eiswasser gewa- schen.
1.1.4 Kupplung des diazotierten Tragers Fractogel-PVA 2000-111 rnit Trypsin
Der nach 1.1.3 hergestellte Trager Fractogel-PVA 2000-111 wurde in 5 cm3 Phosphat- puffer pH 8,OO (~=0,15) mit 50 mg Trypsin 2 h bei 0 "C unter Riihren umgesetzt. Das Pro- dukt wurde unter Riihren portionsweise rnit insgesamt 60 cm3 Phosphatpuffer pH 8,00,85 cm3 0,s M NaCl und 100 cm3 tndest. Wasser gewaschen. Der EiweiBgehalt der in einem 250 cm3 MeBkolben gesammelten Waschlosung wurde rnit Folin-Reagenz (Lowry et al. ") bestimmt. Das immobilisierte Trypsin wurde gefriergetrocknet und bei 4 "C im Kiihl- schrank aufbewahrt.
1.2 Darstellung von Derivaten des Synthesepulps mit Diazoniumgruppen als re- aktive Komponente
1.2.1 Umsetzung v o n Synthesepulp rnit 2-(3-Aminophenyl)-l ,3- dioxolan
10,OO g Synthesepulp SWP-R 830 wurden in 200 cm3 Wasser suspendiert, 5 cm3 konz. HC1 (D=1,19) hinzugefugt und unter Riihren rnit 2,OO cm3 (14,6 mmol) 2-U-Aminophe- nyl)-1,3-dioxolan versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 15 h bei 50 "C geriihrt, anschlie- Bend abfiltriert und unter Riihren portionsweise rnit Wasser neutral gewaschen. Das Pro- dukt wurde rnit Aceton gewaschen, 15 h rnit Aceton extrahiert und i. Vak. getrocknet.
37
G. Manecke und H.-G. Vogt
1.2.2 Diazotierung des Aminoderivates von Synthesepulp SWP-R 830
1,000 g SWP-R 830-11 wurden in 100 cm3 Wasser bei etwa 50 "C suspendiert, abfiltriert, anschlieBend bei 0 "C rnit 100 cm3 0,5 M HCl versetzt und nach Zusatz von 5 cm3 1 M NaNO, 30 min bei 0 "C geriihrt. Das diazotierte Synhtesepulp-Derivat I11 wurde abfil- triert, intensiv mit Eiswasser gewaschen und direkt fur die Enzymimmobilisierung einge- setzt.
1.2.3 Immobilisierung von Trypsin an Synthesepulp SWP-R 830- I11
Das nach 1.2.2 hergestellte Diazoniumderivat von Synthesepulp SWP-R 830 wurde mit 100 mg Trypsin in 50 cm3 Phosphatpuffer pH 8,O (1*.=0,15) bei 0 "C 2 h unter Riihren um- gesetzt. Das Produkt wurde unter Riihren portionsweise rnit insgesamt 150 cm3 Phosphat- puffer pH 8,0,200 cm3 0,5 M NaCl und 100 cm3 tridest. Wasser gewaschen. Der EiweiBge- halt der in einem 500 cm3 MeBkolben gesammelten Waschlosung wurde mit Folin-Rea- genz (Lowry et al.") bestimmt. Das immobilisierte Trypsinderivat wurde gefriergetrock- net und bei 4 "C im Kiihlschrank aufbewahrt.
1.3 Einfuhrung reaktionsfiihiger Diazoniumgruppen und Immobilisierung von En- zymen an Schlauchen auf der Basis eines Vinylacetat-Ethylen-Copolymeren
1.3.1 Hydrolyse der inneren Schlauchwand
500 cm Poly(viny1acetat-co-ethylen)-Schlauch (Innendurchmesser 0,2 cm) wurden mit 25 cm3 20proz. NaOH bei 40 "C 2 h hydrolysiert, indem die Losung in einem Umlaufver- fahren mit einer peristaltischen Pumpe durch den Schlauch gepumpt wurde.
1.3.2 Derivatisierung der inneren Schlauchwand rnit 4-(2,3-Epo- xypropoxy)-benzaldehyd
25 cm3 einer 1 M Losung von 4-(2,3-Epoxypropoxy)-benzaldehyd in Dioxan wurden im AnschluB zu Reaktion 1.3.1 in einem Umlaufverfahren bei Raumtemp. 2 h durch den Schlauch gepumpt und der Schlauch abwechselnd mit Dioxan und Wasser gespiilt.
38
Immobilisierung von Enzymen auf P VAL- Tragern
1 . 3 . 3 Beschichtung der inneren Schlauchwand mit PVAL
20 cm3 einer 2,2proz. (0,5 M bezogen auf Vinylalkoholeinheiten) PVAL-Losung in Was- ser wurden rnit 0,20cm3 konz. HC1 (D= 1,19) und rnit 1,00 cm3 einer 0,l M Losung von Te- rephthalaldehyd in Dioxan versetzt und das Reaktionsgemisch bei 25 "C 30 min in einem Umlaufverfahren durch den nach 1.3.2 praparierten Schlauch gepumpt. AnschlieBend wurde der Schlauch rnit Wasser gespult, dann 0,l M HC1 15 h durch den Schlauch ge- pumpt und der Schlauch rnit Wasser gewaschen.
1.3.4 Umsetzung der rnit PVAL beschichteten inneren Schlauch- wand rnit 2-(3-Aminophenyl)-l,3-dioxolan
20 cm3 einer 2,2proz. waBrigen PVAL-Losung wurden mit 2,00 cm3 einer 1 M Losung von 2-(3-Aminophenyl)-l,3-dioxolan in Dioxan versetzt, 0,5 cm3 konz. HC1 hinzugefugt und das Reaktionsgemisch 4 h bei 40 "C in einem Umlaufverfahren durch 500 cm des nach 1.3.3 modifizierten Schlauchmaterials gepumpt. AnschlieBend wurde das Schlauchmate- rial rnit 0,Ol M HC1 und rnit Wasser gespult.
1 . 3 . 5 Diazotierung des Aminoderivates I1 der mit PVAL beschich- teten inneren Schlauchwand
10 cm3 0,5 M HC1 wurden rnit 1 cm3 1 M NaNO, bei 0 "C vermischt und 30 min bei 0 "C in einem Umlaufverfahren durch 100 cm des nach 1.3.4 modifizierten Schlauchderivates gepumpt. AnschlieBend wurde der Schlauch rnit Eiswasser gespult und fur die Enzymim- mobilisierung eingesetzt.
1.3.6 Azokupplung von Trypsin
In einem Umlaufverfahren wurden 100 cm eines nach 1.3.5 rnit Diazoniumgruppen mo- difizierten Schlauches rnit einer Losung von 5 mg Trypsin in 5 cm3 Phosphatpuffer pH 8,O (k = 0,15) 2 h bei 0 "C umgesetzt. Danach wurde der Schlauch zur Entfernung nicht gebun- denen Enzyms nacheinander rnit Phosphatpuffer pH 8,0,0,5 M NaCl und tridest. Wasser gewaschen. Der EiweiRgehalt der in einem 100 cm3 MeBkolben gesammelten Waschlo- sung wurde rnit Folin-Reagenz (Lowry et al. ") bestimmt. Das Immobilisierungsprodukt wurde rnit Wasser im Kuhlschrank bei 4 "C aufbewahrt.
39
G. Manecke und H.-G. Vogt
1.4 Darstellung reaktiver P VAL- Trager mit Isothiocyanatgruppen
1.4.1 Dars te l lung vernetzter aminogruppenhal t iger PVAL-Tra- ger'
Mit Terephthalaldehyd vernetzter PVAL (Korngroae 0,l-0,2 mm) wurde mit 2-(3-Ami- nophenyl)-1,3-dioxolan analog zu der in Lit.' angegebenen Methode umgesetzt. Fur Ami- notrager Va wurden 0,8 cm3, fur Vb 0,s cm3 und fur Vc 0,l cm3 2-(3-Aminophenyl)-l,3- dioxolan pro g vernetztem PVAL eingesetzt. Der Aminogruppengehalt der Produkte wur- de aus den Stickstoffanalysewerten ermittelt.
Va Gef. N 2,lO (=1,50 mmol Aminogruppen/g) Vb Gef. N 1,41 (=1,01 mmol Aminogruppen/g) Vc Gef. N 0,42 (=0,30 mmol Aminogruppen/g)
1.4.2 Umsetzung von Va-c rnit Thiophosgen
1,OO g Va-c (KorngroBe 0,l-0,2 mm) wurde rnit 10 cm3 einer IOproz. (v/v) Losung von CSCl, in CHCl, versetzt, 20 cm3 1 M NaHCO, hinzugefugt und bei Raumtemp. 16 h ge- riihrt. Die Produkte wurden abfiltriert und unter Ruhren rnit Wasser und Aceton gewa- schen. AnschlieBend wurde rnit Aceton 24 h extrahiert und der lufttrockene Trager i. Vak. getrocknet.
VIa Ber. N 1,98 S 4,52
VIb Ber. N 1,35 S 3,lO
VIC Ber. N 0,41 S 0,95
IR (KBr): 2040-2 120 cm-' (-NCS)
Gef. N 1,89 S 4,21 (=1,33 mmol NCS-Gruppen/g)
Gef. N 1,21 S 3,47 (=0,97 mmol NCS-Gruppen/g)
Gef. N 0,25 S 1,04 (=0,25 mmol NCS-Gruppen/g)
1.4.3 Immobil is ierung von Enzymen a n Trager VIa-c
1.4.3.1 Immobilisierung von Papain bzw. Trypsin
50 mg VIa-c (KorngroBe 0,l-0,2 mm) wurden bei 25 "C 16 h rnit 10 cm3 einer 0,Sproz. Losung von Papain bzw. Trypsin in Phosphatpuffer (p=O,15) pH 8,O (bzw. bei definiertem pH im Bereich pH 5-8) unter Ruhren umgesetzt. Das immobilisierte Enzym wurde abge- saugt, unter Ruhren portionsweise rnit 40 cm3 des zur Kupplung eingesetzten Phosphat- puffers, 100 cm3 0,5 M NaCl und 100 cm3 tridest. Wasser gewaschen. Die vom Trager
40
Immobilisierung von Enzymen auf PVA L-Tragern
gebundene Menge Enzym wurde aus dem EiweiBgehalt der Waschlosung rnit Folin- Reagenz (Lowry et al.") ermittelt. Die Immobilisierungsprodukte wurden gefriergetrock- net und bei 4 "C gelagert.
1.4.3.2 Immobilisierung von Glucose-Oxydase
10,O mg VIa-c (KomgroBe 0 , 1 4 2 mm) wurden bei 25 "C 16 h mit einer Losung von 5,O mg Glucose-Oxydase in 1 cm3 Phosphatpuffer pH 7,O (p=0,15) unter Riihren umgesetzt. Das Immobilisierungsprodukt wurde abgesaugt und unter Riihren portionsweise rnit 25 cm3 Phosphatpuffer pH 7,O (p=0,15), 25 cm3 0,5 M NaCl und 50cm3 tridest. Wasser gewa- schen. Die immobilisierte Glucose-Oxydase wurde in Wasser bei 4 "C gelagert.
1.5 Darstellung eines reaktiondahigen Disulfdderivates von mit Terephthalalde- hyd vernetztem PVAL
1 .5 .1 Acetalisierung von vernetztem PVAL rnit Chloracetaldehyd- diet hylace ta l
2,OO g rnit 5 mol-% Terephthalaldehyd vernetzter PVAL'.' der KomgroBe 0,l-0,2 mm wurden mit 20 cm3 0,5 M HCl versetzt, 0,30 cm3 (2,O mmol) Chloracetaldehyddiethylace- tal hinzugefugt und bei 50 "C 18 h geriihrt. Das Produkt VII wurde abfiltriert, rnit Wasser neutral gewaschen, dann rnit Ethanol gewaschen und i. Vak. getrocknet.
Ber. C1 3,33 Gef. C1 2,02 (=0,57 mmol Cl/g; 57proz. Umsatz)
1 . 5 . 2 Darstellung des Thiolderivates VIII
1,OO g Derivat VII wurden in 20 cm3 0,5 M NaHS-Losung 24 h bei 80°C geriihrt. Das Produkt VIII wurde abfiltriert, rnit Wasser gewaschen und nach 1.5.3 weiter umge- setzt.
1 . 5 . 3 Umsetzung des Thiolderivates VIII rnit 2,2'-Dipyridyldisul- fid
1,00 g Thiolderivat VIII wurden in 50 cm3 einer 0,02 M Losung von 2,2'-Dipyridyldisul- fid in Aceton/Wasser (1 : 1) 15 h bei Raumtemp. geriihrt. Die Losung wurde iiber eine Frit- te in einen 500 cm3 MeBkolben iiberfuhrt und das Produkt IX rnit 50proz. Aceton unter Riihren gewaschen. Trager IX wurde i. Vak. getrocknet und die Absorption der auf 500
41
G. Manecke und H.-G. Vogt
cm3 aufgefullten Waschlosung bei 343 nm in einer 1 cm Kiivette gegen 0,002M 2,2'-Dipy- ridyldisulfid als Referenz gemessen (molarer Absorptionskoeffizient fur 2-Thiopyridon bei 343 nm E= 8,08 cm2 p.mol-')'* und daraus der Gehalt des Tragers an reaktiven Disul- fidgruppen berechnet. Pro g Trager IX wurde ein Gehalt von 50 pmol Disulfidgruppen er- mittelt.
Gef. N 0,11 S 1,46
1.5.4 Umsetzung von Trager IX rnit Katalase
25,Omg Trager IX wurdenin 10 cm3 PhosphatpufferpH 8,O (p=0,15) rnit 0,250 cm3 (5,O mg) einer Katalasesuspension versetzt und bei 25 "C 3 h geriihrt. Der umgesetzte Trager wurde abfiltriert und unter Riihren portionsweise mit insgesamt 30 cm3 Phosphatpuffer pH 8,O (p,=0,15), 40 cm3 0,5 M NaCl und rnit tridest. Wasser gewaschen und die in einem 100 cm3 MeBkolben gesammelte Waschlosung bis zur Marke aufgefullt. Das Immobilisie- rungsprodukt wurde gefriergetrocknet und im Kiihlschrank bei 4 O C aufbewahrt.
2. Charakterisierung der immobilisierten Enzympraparate
2.1 Bestimmung der an den Trager gebunden Menge Enzym
Die von dem jeweiligen Trager gebundene Menge Enzym wurde aus dem Proteingehalt der Waschlosung und dem einer entsprechend verdiinnten Enzymeichlosung durch Be- stimmung rnit Folin-Reagenz (Lowry et al.'') ermittelt.
2.2 Bestimmung der Aktiuitaten der immobilisierten Enzympraparate
2-15 mg der gefriergetrockneten immobilisierten Enzympraparate wurden eingewogen und in Wasser gequollen. Die immobilisierten Enzyme wurden rnit den jeweiligen Sub- straten unter Riihren, bzw. im Falle der an Schlauchen immobilisierten Enzyme unter Umpumpen der Substratlosung bei einer Pumpgeschwindigkeit von etwa 500 cm3 h-' um- gesetzt.
2.2.1 Bestimmung de r Aktivi ta t von immobilisiertem Papain
Die Bestimmung der Aktivitat von immobilisiertem Papain erfolgte wie bereits be- schrieben' gegeniiber dem Substrat BAEE durch Titration bei konstantem pH bei 30 "C. Die Konzentrationen im Test waren: 0,05 M BAEE, 9 . M Cystein, 1,8. lo4 M EDTA. Zur Bestimmung des pH-Optimums von immobilisiertem Papain wurde zusatzlich eine Substratlosung, die 0,3 M KC1 enthielt, eingesetzt.
42
lmmobilisierung von Enzymen auf P VAL- Tragern
Tab. 6. Aktivitatsbestimmungen von immobilisiertem Trypsin mit BAEE als Sub- strat.
Methode Konzentrationen im Test BAEE NaCl CH,COONa Tris (M) (M) (MI (M)
- - - titrimetrisch 0,02 titrimetrisch 0,Ol - 0,Ol -
titrimetrisch 0,Ol - titrimetrisch 0,Ol 0,20 - 0,Ol spektralphotometrisch 0,Ol 0,02 - 0,lO
- 1,oo
2.2.2 Bestimmmung der Aktivitat von immobilisiertem Trypsin
Die Aktivitat von immobilisiertem Trypsin wurde gegenuber D,L-BAPA wie bereits be- schrieben' bestimmt. Gegeniiber dem Substrat BAEE wurde die Aktivitat bei 25 "C so- wohl durch Titration bei konstantem pH d s auch spektralphotometrisch durch Messung der Absorptionszunahme bei 255 nm (~=0,808 cm2 ~ m o l - ' ) ' ~ bestimmt. Tab. 6 zeigt die Konzentrationen der fur die Aktivitatsbestimmungen eingesetzten Substanzen.
2.2.3 Bestimmung der Aktivitat von immobilisierter Glucose-Oxy- dase
Die Bestimmung der Aktivitat von immobilisierter Glucose-Oxydase erfolgte wie be- reits beschrieben' mit Peroxydase und ABTS (modifizierte Methode nach Werner et a1.14).
2.2.4 Bestimmung der Aktivitat von immobilisierter Katalase
Die Aktivitatsbestimmung von immobilisierter Katalase erfolgte mit 0,Ol M H,O, in Gegenwart von Phosphatpuffer (p=O,l) im pH-Bereich pH 4,5-9,0 bei 25 "C. Die Sub- stratlosung wurde in einem Umlaufverfahren durch eine 1 cm DurchfluBkuvette gepumpt und die Absorption bei 240 nm (~=0,040 cm2 pmol-')'' gemessen.
Fur die Bereitstellung von Poly(viny1acetat-co-ethylen)-Schlauchen sei H e m Dr. D. Jaworek (Fa. Boehringer, Mannheim) und fur die Bereitstellung von Syn- thesepulp Herrn Prof. Dr. H. Cherdron (Hoechst AG) gedankt.
43
G. Manecke und H.-G. Vogt
G. Manecke, H.-G. Vogt, Makromol. Chem. 177 (1976) 725 * G. Manecke, H.-G. Vogt, Immobilized Enzymes on Poly(viny1 alcohol) Carriers, in
,,Analysis and Control of Immobilized Enzyme Systems", Hrsg. D. Thomas, J.-P. Ker- nevez, North Holland Publishing Company, Amsterdam 1976, S. 105 I. Sakurada, N. Fujikawa, Kobunshi Kagaku 2 (1945) 143, C. A. 44 (1950) 5148c Ger. 2249604 (1973), Crown Zellerbach International, C. A. 79 (1973) 7064p G. Manecke, H.G. Vogt, Veroffentlichung in Vorbereitung J. M. Engasser, C. Horvath, Diffusion and Kinetics with Immobilized Enzymes, in ,,Applied Biochemistry and Bioengineering", Hrsg. L. B. Wingard Jr., E. Katchalski- Katzir, L. Goldstein, Academic Press, New York 1976, Bd. 1, S. 127
R. Goldman, 0. Kedem, H. I. Silman, S. R. Caplan, E. Katchalski, Biochemistry 7 (1968) 486 J. Porath, R. Axen, Immobilization of Enzymes to Agar, Agarose, and Sephadex Sup- ports, in ,,Methods in Enzymology", Bd. 44 ,,Immobilized Enzymes", Hrsg. K. Mos- bach, Academic Press, New York 1976, s. 19 und dort zitierte Lit.
lo M. Okawara, Y. Sumitomo, Bull. Univ. Osaka Prefect. Ser. A 6 (1958) 119, C. A. 53 (1959) 7003
l1 0. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr, R. J. Randall, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265
l2 T. Stuchbury, M. Shipton, R. Norris, Y. P. G. Malthouse, K. Brocklehurst, Y. A. L. Herbert, H. Suschitzky, Biochem. J. 151 (1975) 417 J. F. Kezdy, L. Lorand, K. D. Miller, Biochemistry 4 (1965) 2302 W. Werner, H. G. Rey, H. Wielinger, Fresenius' Z. Anal. Chem. 252 (1970) 224
1 5 H. U. Bergmeyer, ,,Methoden der enzymatischen Analyse", 3. Aufl., Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1974, Bd. 1, S. 713
' W. Kuhn, G. Balmer, J. Polym. Sci. 57 (1962) 311
44