Rolle des Onkoproteins Bmi-1 im Neuroblastomarchiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2007/0553/pdf/ddf.pdf · Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG 7 1.1 Das Neuroblastom 7 1.1.1 Histologie 7 1.1.2

Aus dem Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg

Direktor: Prof. Dr. R. Müller

Rolle des Onkoproteins Bmi-1 im Neuroblastom

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin

Dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von

Daniel Fehr

aus Ludwigshafen

Marburg, 2007

Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am 30.08.2007. Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs. Dekan: Prof. Dr. B. Maisch Referent: PD Dr. W. Lutz Korreferent: Prof. Dr. E. Schultz

Meiner Familie gewidmet.

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG 7

1.1 Das Neuroblastom 7 1.1.1 Histologie 7 1.1.2 Klinik 8 1.1.3 Diagnostik 9 1.1.4 Stadieneinteilung 10 1.1.5 Genetische Einflüsse 11 1.1.6 Therapie 12 1.1.7 Prognose 13

1.2 Die E2F-Transkriptionsfaktoren 13 1.2.1 Die E2F-Familie 14 1.2.2 p16/pRb als Tumorsuppressoren 16 1.2.3 E2F-1 als Onkogen und Tumorsuppressor 17 1.2.4 Funktionen von E2F in Neuroblastomen 18

1.3 Das Onkogen BMI1 18 1.3.1 Die Gruppe der Polycombproteine 19 1.3.2 Funktionen von Bmi-1 und Beziehung zum Zellzyklus 19 1.3.3 BMI1 als Zielgen von E2F-1 20 1.3.4 Kooperation zwischen Bmi-1 und Myc 21 1.3.5 BMI1-Expression in Neuroblastomen 22

2 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 23

3 MATERIAL UND METHODEN 24

3.1 Material 24 3.1.1 Zelllinien 24 3.1.2 Materialien für die Zellkultur 25 3.1.3 Fertige Lösungen und Chemikalien 26 3.1.4 Kits 26 3.1.5 Puffer 27 3.1.6 PCR und quantitative Realtime-PCR 28 3.1.7 Bakterienstämme 28 3.1.8 Plasmide 28 3.1.9 Oligonukleotide 28 3.1.10 Enzyme 29 3.1.11 Western Blot 30 3.1.12 Verbrauchsmaterial 31

3.2 Zellbiologische Methoden 31 3.2.1 Zellkultur 31 3.2.2 Einfrieren von Zellen 32 3.2.3 Auftauen von Zellen 32

3.3 Molekularbiologische Methoden 33 3.3.1 RNA-Extraktion 33 3.3.2 cDNA-Synthese 33 3.3.3 PCR 34 3.3.4 Quantitative Realtime-PCR 35 3.3.5 Agarose-Gelelektrophorese 36 3.3.6 Restriktionsendonukleasen-Verdau 37 3.3.7 Aufreinigung von PCR-Produkten 37 3.3.8 Ligation 38 3.3.9 Transformation von ultrakompetenten E.coli-Bakterien 39 3.3.10 Mini-Präparation von Plasmid-DNA 39 3.3.11 Maxi-Präparation von Plasmid-DNA 40 3.3.12 Sequenzierung 40 3.3.13 Transfektion 41 3.3.14 Herstellung und Expansion von Zellklonen 41 3.3.15 FACS-Analyse zur Bestimmung des DNA-Gehalts von Zellen 42

3.4 Methoden zur Analyse von Proteinen 43 3.4.1 Bradford-Assay 43 3.4.2 Luciferase-Assay 43 3.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von Proteinen 44 3.4.4 Western Blot 45

3.5 Geräte 46

3.6 Statistische Auswertungen 47

4 ERGEBNISSE 50

4.1 Funktionsprinzip der verwendeten Neuroblastom-Zelllinien 50 4.1.1 SK-N-SH-EP-Zelllinie 1A3 50 4.1.2 SK-N-SH-EP-Zelllinie TOR 50 4.1.3 SK-N-SH-EP-Zelllinie Tet21 50

4.2 Neuroblastomzellen mit induzierbarer Expression von Bmi-1 51 4.2.1 Klonierung von BMI1 in Tetrazyklin-regulierbare Vektoren 51 4.2.2 Das dominant negative BMI1-Allel 53 4.2.3 Untersuchung der Neuroblastom-Zelllinie Tet21 auf Induzierbarkeit durch Tetrazyklin 54 4.2.4 Transfektion und Selektion der Zelllinien TOR und Tet21 mit BMI1-tragenden Vektoren 55 4.2.5 Nachweis der Tetrazyklin-abhängigen Expression von Bmi-1 56

4.3 Induktion von Bmi-1 in induzierbaren Neuroblastomzellen 57 4.3.1 Tetrazyklin-abhängige Induktion von BMI1 auf mRNA-Ebene 57 4.3.2 Tetrazyklin-abhängige Induktion von Bmi-1 auf Proteinebene 59 4.3.3 Einfluss der erhöhten Bmi-1-Aktivität auf Zellzyklus und Apoptose 60 4.3.4 Expression von Bmi-1 im Verlauf des Zellzyklus 62

4.4 Induktion der Polycombproteine Hpc2 und Ring1 durch E2F-1 65

5 DISKUSSION 67

5.1 Etablierung eines Zellsystems mit induzierbarer Bmi-1-Expression 67

5.2 Bmi-1-Überexpression ohne Auswirkung auf S-Phase und Apoptose 69

5.3 Bmi-1-Expression verläuft unabhängig von Zellzyklus-Progression 70

5.4 Hpc2 und Ring1 werden nicht stabil durch E2F-1 induziert 72

5.5 Ausblick 73

6 ZUSAMMENFASSUNG 75

7 LITERATURVERZEICHNIS 77

8 ABKÜRZUNGEN 90

9 VERZEICHNIS DER AKADEMISCHEN LEHRER 93

10 DANKSAGUNG 94

1 Einleitung

1.1 Das Neuroblastom

Das Neuroblastom wurde 1863 zum ersten Mal von Rudolf Virchow beschrieben

und geht als häufigster extrakranieller, bösartiger Tumor des Kindesalters vom

sympathischen Grenzstrang, dem Nebennierenmark und den sympathischen

Ganglien aus (Klöppel, 2004). Obwohl bei rechtzeitiger Diagnose in vielen Fällen

im Säuglingsalter eine kurative Therapie durchgeführt werden kann, ist das

Neuroblastom insgesamt für etwa 15% der Todesfälle durch maligne, pädiatrische

Erkrankungen verantwortlich. Die Prävalenz der Neuerkrankungen beträgt 1/7000,

und die Inzidenz liegt bei 0,8-0,9 auf 100.000 Kinder unter 15 Jahren, wobei das

Durchschnittsalter des Erkrankungsbeginns bei 22 Monaten liegt (Miller, 1995;

Gurney, 1996; Brodeur, 1997a). Bei einer histopathologischen Untersuchung

fötaler Nebennieren Anfang der 1960er fand man jedoch 200mal häufiger ein sog.

Neuroblastoma in situ, als sich später klinisch manifestiert, so dass man von einer

relativ häufigen Anlage ausging, die sich in den meisten Fällen spontan

zurückbildet (Beckwith, 1963). Eine weitere Studie ergab 1974, dass es sich

hierbei um Reste der fötalen adrenalen Entwicklung handeln könnte, wobei eine

endgültige Klärung bis heute aussteht (Turkel, 1974).

1.1.1 Histologie

Die makroskopische Morphologie lässt einen lobulierten, weichen Tumor

erkennen, der leicht zerfällt, und dessen Schnittfläche durch Blutungen, Nekrosen

und Verkalkungen rotgrau erscheint. Die feingewebliche Untersuchung zeigt kleine

und unreife, basophile Tumorzellen mit schmalem Zytoplasmasaum, die durch

fibrovaskuläre Septen voneinander getrennt sind, sowie Neurofibrillen. Als Zeichen

der Malignität ist die Kern-Plasma-Relation zugunsten der hyperchromatischen

Kerne verschoben. Die Zellen, die sich typischerweise zu Pseudorosetten

zusammenlagern, lassen sich durch eine Färbemethode für die neuronspezifische

8 1 Einleitung

Enolase (NSE) darstellen, wobei eine weitere Charakterisierung durch bestimmte

Antikörper möglich ist (Bachmann, 1990; Klöppel, 2004). Das unreife

Neuroblastom kann ausreifen, so dass sich neben unreifen auch reife Zellen

finden. Bei diesem Ganglioneuroblastom wird die Prognose aber weiterhin durch

die unreifen Zellen bestimmt. In einigen Fällen reift das Neuroblastom auch

vollständig zu einem Ganglioneurom aus, das als gutartig zu werten ist

(Bachmann, 1990; Stallmach, 2004).

Abbildung 1.1: Histologisches Bild eines Neuroblastoms. Lockere Ansammlungen differen- zierter, kleiner Neuroblasten bilden sog. Pseudorosetten (Pfeil).

1.1.2 Klinik

Pränatal werden Neuroblastome gelegentlich zufallsbedingt bereits bei der

Sonographie während der Spätschwangerschaft diagnostiziert. Ein weiterer,

bedeutender Anteil symptomloser Kinder wird im Rahmen der

Vorsorgeuntersuchungen entdeckt. Sind bereits Symptome vorhanden, so teilt

man diese in lokale und allgemeine ein (Lentze, 2003).

Lokalisierte Beschwerden äußern sich neben auffälligem Tastbefund abhängig von

der Tumorausbreitung beispielsweise in Bauch- und Halsschmerzen, Obstipation

oder Durchfall. Respiratorischer Stridor mit Husten und Dysphagie oder

therapieresistente Bronchitiden und Pneumonien sind Hinweise auf den Sitz eines

1.1 Das Neuroblastom 9

Tumors im hinteren Mediastinum. Bei Komprimierung des Rückenmarks durch das

Neuroblastom, was bei 15% der betroffenen Kinder der Fall ist, kommt es zu

neurologischen Ausfällen, die bis zur kompletten Querschnittssymptomatik reichen

können. Die Manifestation einer arteriellen Hypertonie bei einem Teil der Patienten

ist durch die erhöhte Katecholaminproduktion des neuroendokrinen Tumors

bedingt.

Allgemeine Beschwerden, die durch Neuroblastome hervorgerufen werden

können, sind v.a. Knochenschmerzen, Kopfschmerzen, Fieber und generalisierte

Lymphknotenschwellungen. Auch zur sog. B-Symptomatik zählende klinische

Auffälligkeiten wie Gewichts-, Leistungs- und Appetitverlust sowie allgemeines

Unwohlsein kennzeichnen den konsumierenden Tumor. Bisweilen zeigt sich die

fortgeschrittene Erkrankung außerdem durch beidseitige Vorwölbung des

Orbitainhaltes sowie Einblutungen im Lidbereich (Brodeur, 1997a; Wargalla-Plate,

1995; Klöppel, 2004; Lentze, 2003).

1.1.3 Diagnostik

Die Labordiagnostik zeigt bei disseminiertem Befall eine erhebliche Erhöhung der

Blutkörpersenkungsgeschwindigkeit und eine normochrome Anämie. Die

Laktatdehydrogenase und das Ferritin im Serum, sowie Dopamin,

Homovanillinsäure und Vanillinmandelsäure im 24-h-Urin sind erhöht, wobei die

beiden erstgenannten Parameter weniger zur Sicherung der Diagnose, sondern

eher als prognostische Faktoren bzw. als Verlaufsparameter anzusehen sind

(Brodeur, 1997a; Stallmach, 2004). Desweiteren ermittelt man die

Serumkonzentration der neuronspezifischen Enolase (NSE), die auch als

Tumormarker bei kleinzelligen Lungentumoren eingesetzt wird. Eine

Blutdruckerhöhung findet sich nicht bei allen Patienten (Wargalla-Plate, 1995).

Mit Hilfe der Sonographie lässt sich der Tumor des Nebennierenmarks meist

deutlich von der Nebenniere abgrenzen und das Abdomen auf Metastasen in

Leber und Milz untersuchen. In der Computer- und Kernspintomographie findet

man eine Raumforderung, die von der Nebenniere ausgeht bzw. im

10 1 Einleitung

retroperitonealen Bereich lokalisiert ist (Lentze, 2003). Die unscharfe Außenkontur

erscheint durch Nekrosen und Blutungen inhomogen, während man in der

Binnenstruktur Verkalkungen erkennen kann. Die Einschätzung zur Ausdehnung

und Beziehung des Tumors zu Nachbarorganen sind ebenfalls präoperativ und

prognostisch von großer Bedeutung. Desweiteren führt man Lumbalpunktionen zur

Liquordiagnostik, Knochenmarkspunktionen und Technetium- bzw. Meta-

Jodobenzylguanidin-Szintigraphien durch (Bachmann, 1990; Brodeur, 1997a).

Abbildung 1.2: Deutlich erkennbare, inhomogene Raumforderung der rechten Nebenniere als Ausdruck des tumorösen Wachstums (MRT, T2-Wichtung, transversal).

1.1.4 Stadieneinteilung

Die Einteilung der Krankheitsstadien richtet sich nach klinischen und anatomischen

Gegebenheiten und lässt Rückschlüsse auf die Prognose zu (Brodeur, 1988).

Kann man den Tumor operativ vollständig entfernen, spricht man vom Stadium I,

während er im Stadium II die Begrenzung des Entstehungsorgans bereits

überschritten hat. Findet sich der Tumor auf beiden Seiten der Mittellinie, liegt ein

Stadium III vor, bei Metastasierung bzw. Generalisation ein Stadium IV. Eine

Sonderform des Stadium IV stellt das Stadium IV-S dar, das trotz Knochenmarks-,

Leber- oder Hautbefall eine gute Prognose aufweist und meist bei Kindern im

ersten Lebensjahr auftritt.

1.1 Das Neuroblastom 11

Die Patientenzahlen verteilen sich wie folgt auf die verschiedenen Stadien

(Wargalla-Plate, 1995; Matthay, 1998):

I 15,5%

II 11,8%

III 20,9%

IV 43,6%

IV-S 8,3%

1.1.5 Genetische Einflüsse

Die hereditäre Form des Neuroblastoms tritt in 30-40% in Zusammenhang mit

einer Deletion auf Chromosom 1 (1p36.3) und eventuellem Verlust von

Tumorsuppressorgenen in diesem Bereich auf (Fong, 1989). Hier befindet sich

auch das Protein von CHD5, einem Mitglied der CHD-Familie, das u.a. an

posttranlationellen Chromatinmodifikationen beteiligt ist. Es konnte gezeigt werden,

dass in 137 Neuroblastomen die CHD5-Expression deutlich erniedrigt oder nicht

messbar war. Darüber hinaus ergab sich eine deutlich Korrelation mit einer 1p-

Deletion und fortgeschrittenem Krankheitsstadium (White, 2005; Thompson, 2003).

Dieser Verlust an genetischer Information (LOH = loss of heterozygosity) korreliert

entsprechend mit einer schlechten Prognose der Patienten (Christiansen, 1994;

Brodeur, 1997b).

Neben einer vermuteten familiären Veranlagung durch autosomal-dominante

Vererbung (Maris, 1997; Knudson, 1972) ist außerdem der DNA-Gehalt der

Tumorzellen von klinischer Bedeutung, wobei hyperploide Neuroblastome meist in

niedrigeren Stadien vorkommen und besser auf die Chemotherapie ansprechen

(Christiansen, 1998; Brodeur, 1997a).

Bei etwa 25% aller Neuroblastome kann eine Amplifikation des Protoonkogens

MYCN beobachtet werden, was regelhaft mit einem fortgeschrittenen Stadium und

einer schlechten Prognose für die Patienten einhergeht (Brodeur, 1984). Bei N-

Myc handelt sich um ein Mitglied der Myc-Familie, die als bedeutende

Transkriptionsfaktoren in die Onkogenese involviert sind (Hurlin, 2005). Im Stadium

12 1 Einleitung

IV-S bedeutet eine MYCN-Amplifikation ein hohes Risiko für eine baldige

Progression zum Stadium IV und damit eine Verringerung der 5-Jahres-

Überlebensrate (5-JÜR).

Einen weiteren Einfluss auf den Verlauf der Neuroblastom-Erkrankung hat die

Expression des Neurotrophin-Rezeptor-Gens TRKA. An diesen Rezeptor bindet

der Nervenwachstumsfaktor NGF, der in Zusammenhang mit der Induktion der

Zelldifferenzierung zu stehen scheint. Eine hohe Amplifikation von TRKA wirkt sich

positiv auf den Verlauf aus, zumal die Expression mit anderen Prognose-

verbessernden Parametern wie niedrigem Erkrankungsalter, fehlender MYCN-

Amplifikation und begrenzter Tumorausdehnung einhergeht (Castleberry, 1997).

1.1.6 Therapie

Bis auf das Stadium IV, wo Risikofaktoren nur die Prognose, nicht aber die

Therapie bestimmen, erfolgt die Behandlung der Neuroblastom-Patienten in den

Stadien I-III und IV-S nach Einteilung in definierte Risikogruppen nach den

Richtlinien der Neuroblastomstudie NB 97 (Laufzeit: 30.09.1998 - 30.09.2004). Für

die Stadien I-III gelten MYCN-Amplifikation und ein Patientenalter von >1 Jahr bei

Diagnosestellung als Risikofaktoren, wohingegen beim Stadium IV-S eine

Thrombozytenzahl von <150/nl und ein schwerstkranker Allgemeinzustand die 5-

JÜR am stärksten beeinflussen. Abhängig von der Anzahl der Risikofaktoren wird

eine Einteilung der Patienten in die Gruppen (Standard-, mittleres und Hochrisiko)

vorgenommen, um ihnen dann die entsprechende Therapie zuteil werden zu

lassen (Brodeur, 1997c). Die Behandlung reicht von Null- bzw. Minimaltherapie bei

Fehlen einer MYCN-Amplifikation im Stadium I bis hin zu operativen Eingriffen,

Hochdosischemotherapie und Megatherapie mit autologer Stammzellrekonstitution

und monoklonalen Anti-GD-2-Antikörpern als Konsolidierungsbehandlung im

Stadium IV. Auch eine Megavolttherapie von 15-30 Gy auf das Tumorbett

abhängig von Patientenalter, Tumormasse und -lokalisation ist möglich

(Bachmann, 1990). Laut Neuroblastomstudie NB 97 wurden 98% aller Patienten in

1.2 Die E2F-Transkriptionsfaktoren 13

der Bundesrepublik nach diesen einheitlichen Richtlinien kooperativ multizentrisch

behandelt (Brodeur, 1997a; Wargalla-Plate, 1995; Berthold, 2003).

1.1.7 Prognose

Durch moderne, stadiengerechte und nach international vereinbarten Protokollen

durchgeführte Behandlungsstrategien konnten in den letzten 10 Jahren Fortschritte

bei der Therapie des Neuroblastoms insbesondere im Stadium IV erzielt werden.

Dennoch liegt die Überlebenswahrscheinlichkeit für dieses Stadium immer noch

bei ca. 20%, während sie in den niedrigeren Stadien bis zu 90% beträgt

(Castleberry, 1997). Neben genetischen Parametern spielt vor allem das Alter der

Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine große Rolle bei der Prognose.

So überleben insgesamt 72% aller Patienten mit einem Erkrankungsalter unter 12

Monaten, 28% aller Patienten mit einem Erkrankungsalter zwischen 12 und 24

Monaten und nur 12% der Patienten, die über 24 Monate alt sind (Breslow, 1971).

1.2 Die E2F-Transkriptionsfaktoren

Seit ihrer Identifizierung als Bindungspartner und Aktivator des adenoviralen E2-

Genpromotors im Jahre 1986 wurden fortwährend neue Mitglieder der E2-

Faktor(E2F)-Familie mit teils synergistischen, teils antagonistischen

transkriptionellen Eigenschaften entdeckt (Dyson, 1998; Kovesdi, 1986). Sie sind

Effektoren im Retinoblastoma-Tumorsuppressor-Signalweg (pRb), spielen eine

bedeutende Rolle in der Zellteilung und sind bislang als positive Regulatoren von

Genen angesehen worden, die für die DNA-Synthese benötigt werden. Darüber

hinaus üben sie jedoch auch großen Einfluss auf die Proliferation und

Differenzierung von Zellen aus und besitzen neben ihrer Fähigkeit, den

programmierten Zelltod auszulösen, sowohl onkogenes als auch

tumorsuppressives Potential (Helin, 1998; Nevins, 1998; DeGregori, 2002;

Trimarchi, 2002).

14 1 Einleitung

1.2.1 Die E2F-Familie

Nach derzeitigem Wissensstand besteht die E2F-Familie bei Säugetieren aus 8

verschiedenen Transkriptionsfaktoren, E2F-1 bis E2F-8, die mit Ausnahme von

E2F-7 und E2F-8 in einem heterodimeren Komplex mit einem Mitglied der DP-

Familie, DP1 bis DP4 (DP2Mensch entspricht DP3Maus), die Aktivität von Promotoren

regeln, die über eine entsprechende E2F-Bindedomäne verfügen (Milton, 2006;

Dyson, 1998; Di Stefano, 2003). E2F-1 bis E2F-5 können gemäß ihrer

zellzyklischen Eigenschaften und der Interaktion mit ihren negativen Regulatoren,

den sog. Pocketproteinen (pRB, p107 und p130) in 2 Untergruppen eingeteilt

werden. E2F-1 bis E2F-3a sind starke transkriptionelle Aktivatoren, die

ausschließlich mit pRB interagieren und Zellzyklus-ahängig exprimiert werden. Sie

sind in der Lage, Zellen in die Apoptose zu treiben, wobei diese Fähigkeit

offensichtlich auf der E2F-1-Aktivität beruht (Denchi, 2005). Im Gegensatz dazu

besitzen E2F-4 und E2F-5 vorwiegend reprimierende Eigenschaften, zumal sie in

G0/G1-Zellen hauptsächlich im Nukleus lokalisiert und dort an Pocketproteine

gebunden sind. Während E2F-4 alle 3 Pocketproteine an sich binden kann,

interagiert E2F-5 lediglich mit p130 (Nevins, 1998; Müller, 1997; Sardet 1995;

Verona, 1997). Allgemein spielen E2F-1 bis E2F-3a eine große Rolle im Fortlauf

des Zellzyklus, E2F-4 und E2F-5 dagegen sind für die Differenzierung von Zellen

von Bedeutung. Der Transkriptionsfaktor E2F-3b entstammt dem gleichen

Genlokus wie E2F-3a, unterscheidet sich von diesem jedoch in seinem N-

Terminus, so dass er wie E2F-4 und E2F-5 die Aufgabe eines transkriptionellen

Repressors übernimmt (He, 2000; Leone, 2000).

Die Transkriptionsfaktoren E2F-6 bis E2F-8 treten ebenfalls durch reprimierende

Eigenschaften in Erscheinung, wobei sie aber weder über eine entsprechende

Transaktivierungsdomäne noch eine Bindestelle für die Pocketproteine an ihrem

Carboxy-Terminus verfügen. Sie unterdrücken die Transkription in Verbindung mit

der Grupppe der Polycombproteine und verhindern bzw. verzögern den Fortlauf

des Zellzyklus, wobei E2F-7 und E2F-8 eine auffallende Ähnlichkeit aufweisen

(Logan, 2005; Trimarchi, 2002). Wie auch die anderen E2F bildet E2F-6 ein


Heterodimer mit DP1 bis DP4 (Gaubatz, 1998; Morkel, 1997; Trimarchi, 1998),

während E2F-7 und E2F-8 über keine DP-Bindestellen verfügen und über ihre

beiden DNA-Bindedomänen DP-unabhängig an die DNA binden (de Bruin, 2003;

Logan, 2004; Di Stefano 2003).

Die Aktivität von E2F kann über verschiedene Mechanismen gesteuert werden

(Muller, 2000). Die bislang am detailliertesten untersuchte Möglichkeit ist jedoch

die direkte Bindung von E2F-1 bis E2F-5 durch die Pocketproteine pRB, p107 und

p130, was zur Unterdrückung von Transaktivierung (Dynlacht, 1994) und Apoptose

(Qin, 1994; Hsieh, 1997) sowie zum Schutz vor Degradierung (Hateboer, 1996;

Hofmann, 1996) führt. Heterodimere aus Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinasen

(CDK) lösen während der G1-Phase durch Phosphorylierung die Pocketproteine

von den E2F, die dann ihre Zielgene aktivieren können, wobei hier CDK4 und

CDK6 eine herausragende Rolle in der Phosphorylierung von pRB spielen. Der

ebenfalls durch CDK katalysierte Übergang von einer Phase des Zellzyklus zur

nächsten wird bei Säugetieren zudem durch die Aktivität zweier verschiedener

Familien von CDK-Inhibitoren (CDKI) kontrolliert. Die Mitglieder der ersten Familie

(p21, p27 und p57) binden an verschiedene Cyclin/CDK-Komplexe, während sich

die Mitglieder der zweiten CDKI-Familie (p15, p16Ink4a, p18 und p19ArfMaus bzw.

p14ArfMensch) nur CDK4 und CDK6 anlagern (Sherr, 1995). Die Deregulierung einer

der genannten und miteinander verketteten Komponenten führt häufig zur

Deregulierung der nächsten. Die Störung dieser Abfolge des pRB-Signalwegs und

Mutationen finden sich sehr häufig in menschlichen Tumorzellen und werden

mittlerweile als eine der Vorbedingungen für die Tumorentstehung angesehen

(Sherr, 1996).

Die derzeit am besten verstandene Aufgabe der E2F ist die Regulierung des G1/S-

Übergangs während des Zellzyklus. Dies ist möglich durch die transkriptionelle

Aktivierung von Genen, die für den Eintritt in die S-Phase notwendig sind.

Komplexe aus reprimierenden E2F und Pocketproteinen herrschen in der G0- und

der frühen G1-Phase vor, während in der späten G1-Phase aktivierende E2F die

Transkription von Cyclin-abhängigen Kinasen steuern, die zur Phosphorylierung

16 1 Einleitung

der Pocketproteine und damit zur Auflösung der o.g. Komplexe führen (DeGregori,

2002; Stevaux, 2002; Trimarchi, 2002).

1.2.2 p16/pRb als Tumorsuppressoren

p16Ink4a ist Mitglied der CDKI-Familie, die ausschließlich die Cyclin-abhängigen

Kinasen 4 und 6 inhibieren, die ihrerseits als Dimere mit Cyclinen durch

Phosphorylierung und damit Lösung von pRb die Aktivierung der E2F und ihrer

Zielgene zur Folge haben. Somit ist p16Ink4a durch die Inhibierung in der Lage,

Zellen am Eintritt in die S-Phase zu hindern und damit auch ihre Proliferation zu

unterdrücken. Die häufige Störung des p16Ink4a-Cyclin D1/CDK4-pRb-Pfads als

Ursache menschlicher Tumoren kommt entweder durch den Funktionsverlust von

p16Ink4a oder pRb oder die Überexpression einer der beiden Proto-Onkogene

Cyclin D1 oder CDK4 zustande (Weinberg, 1995; Sherr, 1996; Ruas, 1998).

CDK4 Cyclin D1

pRb

p16Ink4a

E2F1-4 DP1-4E2F-Zielgene

Abbildung 1.3: E2F als integraler Bestandteil des p16/Rb-Signalwegs. p16 inhibiert das CDK4-Cyclin D1-Dimer und damit die Phosphorylierung von pRb. Unphosphoryliert kann das Pocketprotein pRb an die heterodimeren Komplexe aus E2F1-4 und DP1-4 binden und die Transkription der E2F-Zielgene unterdrücken.


Ein weiterer wesentlicher Grund für die Entstehung von Tumoren ist die

Ausschaltung des Tumorsuppressorgens p53, beispielsweise durch die fehlende

Abbau- oder Inaktivierungshemmung aufgrund einer gestörten Expression von

p19Arf (Jacobs, 1999a; Weber, 1999; Pomerantz, 1998), da p53 in seiner

Eigenschaft als Transkriptionsfaktor den regulären Ablauf des Zellzyklus

verhindern oder als Antwort auf eine DNA-Schädigung Apoptose induzieren kann

(Ko, 1996; Levine, 1997; Giaccia, 1998). Das enge Ineinandergreifen von pRb- und

p53-Effekten wird bei der Beobachtung deutlich, dass ein Funktionsverlust von

pRb zwar den p53-vermittelten Arrest von Zellen in der G1-Phase umgehen kann

(Demers, 1994; Slebos, 1994), jedoch derselbe Verlust auch zur E2F- und p53-

induzierten Apoptose führt (Wu, 1994).

1.2.3 E2F-1 als Onkogen und Tumorsuppressor

E2F-1 als Mitglied der aktivierenden E2F verhält sich, wie in Transformations-

Assays gezeigt werden konnte, wie ein übliches Onkogen (Bell, 2004). Die

Überexpression von E2F-1 führt in transgenen Mäusen zu Tumorwachstum

(Pierce, 1998), während andererseits E2F-1-Knockout-Mäuse eine große

Bandbreite an Tumoren wie Lymphome und Adenokarzinome der Lunge

entwickeln (Yamasaki, 1996). Gemäß der Rolle, die E2F-1 im Fortlauf des

Zellzyklus spielt, lässt sich seine Onkogenität nachvollziehen; wie E2F-1 jedoch

gleichzeitig eine tumorsuppressive Wirkung haben kann, ist weniger leicht zu

verstehen. Zwei Modelle versuchen, dieses Paradoxon zu erklären: 1. Die E2F-

Bindedomänen können sowohl die Aktivierung als auch die Repression von E2F-1-

Zielgenen vermitteln. Hierbei führt E2F-1 das gebundene pRB an die DNA heran

und erlaubt so pRB, die Expression von bestimmten, kritischen Zielgenen zu

unterdrücken. 2. Dereguliertes E2F-1 induziert Apoptose in Zellen in

Tumorvorstadien. Die Inaktivierung von E2F-1 könnte somit im Umkehrschluss

eine Tumorentstehung fördern, indem es das Überleben von unnatürlich

proliferierenden Zellen zulässt (Yamasaki, 1998; Dyson 1998).

18 1 Einleitung

1.2.4 Funktionen von E2F in Neuroblastomen

Etwa 25% aller Neuroblastome weisen eine Amplifikation von MYCN auf, was zu

einer deutlich verschlechterten Prognose dieser Patienten führt (Savelyeva, 2001;

Brodeur, 1984). Die MYC-Gene in ihrer Gesamtheit kodieren für eine Gruppe von

Transkriptionsfaktoren, die Teil eines Netzwerkes sind, welches einen

bedeutsamen Einfluss auf die Tumorentstehung hat. Hierzu zählen die

Zellzykluskontrolle, Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren und Apoptose, so dass

die Überexpression der Myc-Gene eine zentrale Rolle in der Entstehung vieler

verschiedener Tumoren spielt (Lutz, 2002; Eisenman, 2001). Die

Transkriptionsfaktoren E2F-1 bis E2F-3 aktivieren in Neuroblastomzellen über

E2F-Bindedomänen und in Kooperation mit Sp1/Sp3 den proximalen MYCN-

Promoter in vivo. Die Überexpression von p16Ink4a und damit die Inhibition der E2F-

Aktivität führen zu einer verminderten Expression von endogenem MYCN

(Strieder, 2003; Kramps, 2004). Darüber hinaus liegen Hinweise vor, dass trotz nur

seltener Defekte im p16Ink4a/pRb-Pfad bei Neuroblastomen es zu einem

Kontrollverlust der normalen E2F-Aktivität kommt (Takita, 1998). Neben der

Tatsache, dass mehrere Produkte von E2F-Zielgenen wie z.B. Skp2 in vielen

menschlichen Tumoren überexprimiert werden und dort mit der Malignität

korrelieren (Latres, 2001; Bloom, 2003; Oliveira, 2003), verschlechtert ein weiteres

direktes Zielgen von E2F, das mitotische Kontrollpunkt-Gen MAD2, direkt die

Prognose von Neuroblastom-Patienten, so dass die Aktivität der E2F-

Transkriptionsfaktoren und der von ihnen kontrollierten Gene für den klinischen

Verlauf von Krebserkrankungen von entscheidender Bedeutung sein könnten

(Hernando, 2004).

1.3 Das Onkogen BMI1

Das Onkogen BMI1 (B cell-specific Moloney murine leukaemia virus integration

site 1) kodiert für einen Transkriptionsfaktor aus der Gruppe der Polycomb-

Proteine und spielt eine Rolle in der Embryonalentwicklung sowie der

1.3 Das Onkogen BMI1 19

Selbsterneuerung von Stammzellen. Über die Faktoren, welche die Bmi-1-

Expression beeinflussen, ist jedoch bislang nur wenig bekannt.

1.3.1 Die Gruppe der Polycombproteine

Als transkriptionelle Repressoren regulieren die Proteine aus der Polycomb-

Gruppe (PcG) die Aktivität von Zielgenen, von denen die bislang bekanntesten die

Homeobox(=HOX)-Gene sind, die für die Entwicklung während der

Embryonalphase von Bedeutung sind (Alkema, 1997). Sie binden an spezielle

chromosomale Bindestellen, die sog. PRE (polycomb response elements) und

führen dort zu einer Umgestaltung des Chromatins. Mindestens zwei Komplexe der

PcG-Proteine mit ungleichen Aufgaben und Zielgenen können sowohl in

Drosophila-Fliegen als auch in Säugetieren voneinander unterschieden werden

(Sewalt, 1998). Einer dieser Komplexe (PRC2) enthält die PcG-Proteine Eed,

EzH2 und EzH1, wohingegen der andere Komplex (PRC1) die PcG-Proteine Bmi-

1, Mel18, Mph1, Ring1 und Hpc2 enthält (Shao, 1999; Francis, 2001; Jacobs,

2002). Die Proteine beider Komplexe spielen auch eine Rolle in der menschlichen

Hämatopoese und werden dort streng reguliert exprimiert. Während Eed in allen

Stadien von Knochenmarkszellen in etwa gleichen Konzentrationen zu messen ist,

steigert sich die Expression der meisten PcG-Proteine im Laufe der

Differenzierung. Lediglich die Höhe der Bmi-1-Expression nimmt, ausgehend von

primitiven Knochenmarkszellen, kontinuierlich ab (Lessard, 1998; Lessard, 1999).

1.3.2 Funktionen von Bmi-1 und Beziehung zum Zellzyklus

Das Protein des Onkogens BMI1 konnte als erstes Mitglied eines PcG-

Proteinkomplexes (PRC1) identifiziert werden und wird in vielen Geweben wie

embryonalen Stammzellen, Plazenta, Thymus, Herz, Hoden und Gehirn exprimiert

(van Lohuizen, 1991). Bmi-1 verhindert die Zellalterung, immortalisiert embryonale

Maus-Fibroblasten und führt in Kombination mit aktiviertem H-ras zu

neoplastischer Transformation. Bmi-1-/--Mäuse erfahren schwere

Proliferationsdefekte im Bereich des hämatopoetischen Systems,

20 1 Einleitung

Skelettmissbildungen sowie Schäden im Bereich des zentralen Nervensystems,

die sich in sporadischen Krampfanfällen und einer ataktischen Fortbewegung

abzeichnen (Jacobs, 1999a; van der Lugt, 1994). Als negativer Regulator des

Ink4a-Arf-Lokus führt Bmi-1 dosisabhängig zu einer Inhibition der

Tumorsuppressorgene pRb und p53 (Alkema, 1997) und nimmt daher eine

mögliche Rolle in der Tumorentstehung ein. Beim Menschen wird eine Bmi-1-

Überexpression bislang bei schlecht-differenzierten Non-Hodgkin-Lymphomen

(Bea, 2001), Mammakarzinomen (Dimri, 2002), nicht-kleinzelligen

Bronchialkarzinomen (Vonlanthen, 2001), kolorektalen Karzinomen (Kim, 2004)

und in Medulloblastomen (Leung, 2004) gefunden. Dabei haben mehrere Studien

eine mögliche Abhängigkeit der genetischen Deregulation und damit auch eine

eventuelle Onkogenese von der Zusammensetzung der verschiedenen PcG-

Komplexe aufgezeigt. Demnach führt die unkontrollierte Expression von PcG-

Untereinheiten zu einem Ungleichgewicht zugunsten eines PcG-Proteins und

nachfolgend zu verändertem Zellverhalten (van Kemenade, 2001).

Wie nachfolgend dargelegt wird, ist BMI1 ein Zielgen von E2F-1, das seinerseits

bestimmte genetische Programme, darunter den Eintritt von Zellen in die S-Phase

des Zellzyklus, induzieren kann. BMI1 wird jedoch anders als viele andere E2F-1-

Zielgene Zellzyklus-unabhängig exprimiert, was im experimentellen Teil noch

einmal belegt werden wird. Auch wird die BMI1-Expression nicht durch eine

Blockierung Zellzyklus-regulierter E2F-Zielgene durch Überexpression des CDKI

p16Ink4a beeinflusst (Nowak, 2006).

1.3.3 BMI1 als Zielgen von E2F-1

BMI1 ist ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors E2F-1. Dies konnte durch

cDNA-Microarrays und Induktion von BMI1 mittels E2F-1 unter gleichzeitiger

Proteinbiosynthesehemmung gezeigt werden. Der Promoter des humanen BMI1

enthält eine mutmaßliche E2F-Bindedomäne, an die sowohl E2F-1, -2 und -3

binden können. Für E2F-4 und -5 konnte im Reporterassay keine Aktivierung

gezeigt werden (Nowak, 2006). Während im PRC2 die Gene mehrerer

1.3 Das Onkogen BMI1 21

Untereinheiten durch E2F-1 induziert werden können (Muller, 2001; Bracken

2003), ist eine Induktion im PRC1 bislang nur für BMI1 nachgewiesen worden.

1.3.4 Kooperation zwischen Bmi-1 und Myc

Bmi-1 kooperiert mit c-Myc, ein Mitglied der für viele zelluläre Prozesse

entscheidenden Myc-Familie, in der Genese von Lymphomen in doppeltransgenen

Mäusen (Haupt, 1991; van Lohuizen, 1991). Dieser Synergismus von Bmi-1 und c-

Myc in der Tumorentstehung wird bestätigt durch BMI1/MYC-doppeltransgene

Mäuse, die bereits als Neugeborene an Leukämie versterben. Als wahrscheinliche

Ursache hierfür liegt die Inhibition der c-Myc-induzierten Apoptose durch Bmi-1

zugrunde (Haupt, 1993; Alkema, 1997). Die Überexpression von Myc in

Mausembryofibroblasten führt zu einem deutlichen Anstieg von p19Arf, der die

Ursache des programmierten und durch p53 vermittelten Zelltods ist. Dieser

Anstieg wird jedoch von überexprimiertem Bmi-1 unterbunden, so dass die

Kollaboration zwischen den beiden E2F-Zielgenen MYC und BMI1 hauptsächlich

auf ihre gegenteiligen Effekte auf den Ink4a-Arf-Lokus zurückzuführen ist (Jacobs,

1999b). In Neuroblastomen macht das c-Myc-homologe N-Myc die Zellen

empfindlicher für verschiedene apoptotische Stimuli (Lutz, 1998; Fulda, 1999), und

Myc kann seinerseits die E2F-Aktivität stimulieren (Leone, 2001; Beier, 2000). Dies

führt zu dem bedeutsamen Effekt, dass die E2F-Zielgene MYC und BMI1 entweder

direkt (MYC) oder durch Unterdrückung des Ink4a-Gens und damit Unterstützung

der pRb-Phosphorylierung (BMI1) ihren eigenen Stimulus verstärken und somit

unter Umständen zur Entstehung von Neuroblastomen beitragen (Nowak, 2006;

Abb. 1.4).

22 1 Einleitung

Abbildung 1.4: E2F-1 als Schaltstelle der Kooperation zwischen Bmi-1 und Myc. Überexprimiertes Bmi-1 verhindert die durch Myc initiierte und durch p19 vermittelte Apoptose. Myc und Bmi-1 können ihren eigenen Stimulus (E2F-1) auf direkte bzw. über p16 und pRb auf indirekte Weise verstärken und fördern unter Umständen so ein Tumorwachstum.

1.3.5 BMI1-Expression in Neuroblastomen

Nachdem mittlerweile mehrere E2F-Zielgene (MYCN, MAD2) identifiziert werden

konnten, die mit einer sehr schlechten Prognose von Neuroblastom-Patienten

einhergehen (Hernando, 2004; Strieder, 2003), konnte für das ebenfalls durch E2F

induzierte BMI1 in über 90% von 68 untersuchten primären Neuroblastomen

unterschiedlicher Tumorstadien eine starke Expression nachgewiesen werden

(Nowak, 2006). Diese stellte sich sowohl vom Stadium als auch von der MYCN-

Amplifikation unabhängig dar, was sich trotz jeweiliger Induktion durch E2F-1

dadurch erklären lässt, dass für die MYCN-Expression eine E2F-Aktivität zwar

Voraussetzung, diese aber allein nicht ausreichend ist (Kramps, 2004).

E2F-1 Bmi-1

p16

p19Myc Apoptose

pRb

2 Zielsetzung der Arbeit Das Onkogen BMI1 ist ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors E2F-1, der

selbst eine ambivalente Rolle als Onkogen und Tumorsuppressor spielt. Im

Mittelpunkt meiner Dissertation stand die Frage, ob und welche der bekannten

E2F-1-Funktionen von der Expression des Proteins Bmi-1 abhängen, und ob diese

Funktionen durch die Überexpression von BMI1 rekapituliert werden können.

Ein weiterer Aspekt war, eine mögliche Abhängigkeit der BMI1-Expression vom

Zellzyklus zu überprüfen, wie dies bereits für andere E2F-Zielgene gezeigt wurde.

Darüber hinaus sollte untersucht werden, welche Auswirkungen durch eine

verstärkte Bmi-1-Anreicherung in humanen Neuroblastomzellen in Bezug auf das

Zellverhalten zu beobachten sind, zumal eine Überexpression von BMI1

mittlerweile in einer Vielzahl von Tumoren beim Menschen, darunter auch

Neuroblastomen, nachgewiesen werden konnte.

Als Grundlage für die durchgeführten Experimente dienten von mir hergestellte

Neuroblastomzellen, in denen die Expression von BMI1 reversibel induziert werden

kann.

3 Material und Methoden

3.1 Material

Allgemeine Chemikalien in Analysequalität oder Qualität für die Molekularbiologie

wurden, wo nicht anders vermerkt, über die Firmen Sigma-Aldrich (München),

Merck (Darmstadt) und Applichem (Heidelberg) bezogen. Feinchemikalien mit

höchstem Reinheitsgrad wurden entweder von Sigma oder Gibco-Life

Technologies geliefert. Zellkulturmedien und andere Chemikalien für die Zellkultur

wurden ebenfalls von Gibco-Life Technologies bezogen. Andere Lieferanten

werden in Klammern mit dem jeweiligen Material genannt.

3.1.1 Zelllinien

Sämtliche verwendete Zelllinien entstammen der humanen Neuroblastom-Zelllinie

SK-N-SH-EP.

Um eine Regulierbarkeit des Transkriptionsfaktors E2F-1 zu erreichen, wurde der

SK-N-SH-EP-Klon 1A3 eingesetzt, der ein Fusionsprotein aus E2F-1 und einem

Teil des Östrogenrezeptors überexprimiert, welches durch das Östrogenderivat 4-

Hydroxytamoxifen (4-OHT) aktiviert werden kann (Verena Strieder, persönliche

Mitteilung).

Die für die Experimente herangezogenen TOR-Klone entsprachen stabil

transfizierten 1A3-Zellen, die einen Tetrazyklin-abhängigen Repressor, die Tet21-

Zellen (SK-N-SH-EP-Klon) dagegen einen Tetrazyklin-abhängigen Aktivator

exprimieren. Die Selektion erfolgte bei den 1A3- und den Tet21-Zellen mit G418,

bei den TOR-Zellen mit Puromycin.

3.1 Material 25

3.1.2 Materialien für die Zellkultur

Vollmedium für Säugerzellen 500 mL RPMI (mit Phenolrot)

50 mL FCS wärmeinaktiviert (30 min bei 56°C)

5 mL Penicillin (10.000 U/mL) / Streptomycin

(10 mg/mL)

Einfriermedium 6 mL RPMI (s.o.)

3 mL FCS (s.o.)

1 mL DMSO

Transfektionsmedium 500 mL DMEM

50 mL FCS (s.o.)

Penicillin / Streptomycin (s.o.)

10% L-Glutamin (200 mM)

Trypsin-EDTA 1 x Trypsin-EDTA, gebrauchsfertige Lösung

PBS pH 7,4 130 mM NaCl

3 mM KCl

6,4 mM Na2HPO4

1,5 mM NaH2PO4

ad pH 7,4 mit HCl justiert

DMSO Merck, Dimethylsulfoxid (100%)

4-Hydroxytamoxifen 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) (Sigma)

Stammlösung 1 mM in Ethanol

Endkonzentration für Induktion: 200 nM

Hygromycin B Calbiochem, Stocklösung 397 mg/mL

Selektion bei 90 µg/mL

Puromycin Sigma, Stocklösung 20 mg/mL

Selektion bei 0,8 µg/mL

Zeocin Calbiochem, 100 µg/mL

Tetrazyklin 10 µg/mL

G418 (Neomycin) Calbiochem, 200 µg/mL

26 3 Material und Methoden

3.1.3 Fertige Lösungen und Chemikalien

LB-Medium 10 g Trypton

5 g Hefeextrakt

5 g Glucose

ad 1000 mL H2O, pH 7,0

LB-Agar LB Medium

1,5% (w/v) Bacto-Agar

TRIzol Reagenz Invitrogen

DEPC-H2O 0,1% (v/v) Diethylpyrocarbonat in H2O

DTT 1M

Desoxynukleosid- Sigma (100 mM je dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

Triphosphat (dNTP)

Ethidiumbromid Roth (Stammlösung 10 mg/mL in H2O)

Luciferase-Substratmix 0,2 mM D-Luciferin (Applichem)

25 mM Gly-Gly pH 7,8

Propidiumjodid Lösung Sigma (Stammlösung 1 mg/mL)

(FACS-Analyse)

Bradford Reagenz 0,01% (w/v) Coomassie Brillant Blue G-250

(Sigma)

4,75% (v/v) Ethanol

10% (v/v) Ortho-Phosphorsäure in H2O; filtrieren;

lichtgeschützt lagern

3.1.4 Kits

QIAquick PCR Purification Kit Qiagen

QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen

Rapid DNA Ligation Kit Roche

Qiagen-tip 500 Maxi-Präparation, Qiagen

3.1 Material 27

3.1.5 Puffer

TE-Puffer 10 mM Tris/HCl

1 mM EDTA

pH 8,0

2 x HBS-Puffer 280 mM NaCl

1,5 mM Na2HPO4

50 mM Hepes-KOH

pH 7,05

TAE-Puffer 40 mM Tris-Acetat

1 mM EDTA

pH 8,0

STET-Puffer 8% (w/v) Saccharose

0,5% (v/v) Triton X-100

50 mM EDTA

50 mM Tris-HCl

pH 8,0

Kaliumphosphatpuffer 100 mM KHPO4

1 mM DTT

pH 7,8

First-Strand-Puffer 5x Gibco

Dilution-Puffer 5x MobiTec GmbH

Elution-Puffer 1% SDS

0,1 m NaHCO3

E1A-Puffer 50 mM HEPES pH 7,0

250 mM NaCl

0,1% NP-40

5 mM EDTA

1 mM DTT

+ Leupeptin

+ Aprotinin


3.1.6 PCR und quantitative Realtime-PCR

dNTP je 2,5 mM, Stratagene

H2O autoklaviert

Hot GoldStar Enzym Eurogentec

MgCl2 2,5 mM

MgSO4 20 mM

Pfu-Puffer 10x Stratagene

Pfu-Turbo-Polymerase Stratagene, 2,5 U/µL

Reaktionspuffer 10x Eurogentec

SYBR® Green Eurogentec

3.1.7 Bakterienstämme

Kompetente E.coli (IMT Marburg)

Ultrakompetente E.coli (IMT Marburg)

3.1.8 Plasmide

pcDNA 4/TO, 5078 Nukleotide (Invitrogen)

pBI, 4358 Nukleotide (BD Biosciences)

3.1.9 Oligonukleotide

Die verwendeten Oligonukleotide wurden, soweit nicht anders angegeben, von

MWG erstellt. Die eingesetzte Konzentration betrug jeweils 100 pmol/µL.

PCR: BMIfw 5’-CTT CAT CTG CAA CCT CTC CTC TAT-3’

BMIrev 5’-AAT TAG TTC CAG GGC TTT TCA A-3’

bmiwtRF3 5’-CCG GAT CCC GAG TCT CAG GTA TCA ACC-3’

deltaRFBMI5new 5’-CCG GAT CCA GAA ATG CAT TTC TTT GAC CAG

AAC AGA TTG G-3’

3.1 Material 29

Quantitative Realtime-PCR:

BMIfw 5’-CTT CAT CTG CAA CCT CTC CTC TAT-3’

BMIrev 5’-AAT TAG TTC CAG GGC TTT TCA A-3’

S14 5'-GGC AGA CCG AGA TGA ATC CTC-3'

5'-CAG GTC CAG GGG TCT TGG TCC-3'

Cyclin E 5‘-ACG TTC TAC TTG GCA CAG GAC-3‘

5‘-TGA GAC CTT CTG CAT CAA CTC-3‘

HPC2 5’-TCG CGG TGG AGA GCA TCG AGA AGA-3’

5’-AGC TGC TCC TGC CGT TCC CTG TTC-3’

Ring1a 5’-GGG GGT GCC GGA GGA GGT G-3’

5’-CCA GGG TCA GCG AGC CAT TCA AC-3’

Random Primer

Sequenzierung: CMVforward 5’-CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-3’

BGHreverse 5’-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3’

3.1.10 Enzyme

Alkalische Phosphatase (Shrimp) Roche

BstX I Stratagene

EcoR I Stratagene

EcoR V Stratagene

Hind III Stratagene

Reverse Transkriptase SuperScript, Gibco

RNAse A Boehringer (10 mg/mL)

RNAsin Promega

Xba I Stratagene


3.1.11 Western Blot

4x Sammelgelpuffer 0,5 M Tris/HCl

0,4% (w/v) SDS

pH 6,8

4x Trenngelpuffer 1,5 M Tris/HCl

0,4% (w/v) SDS

8 mM EDTA

pH 8,8

Laufpuffer 25 mM Tris/HCl

0,2 M Glycin

0,1% (w/v) SDS

pH 8,3

Acrylamid Stammlösung 30% (w/v) Acrylamid (Applichem)

(SDS-PAGE) 0,8% (w/v) N, N´-Methylen-Bisacrylamid (Sigma)

in H2O; Lagerung: 4°C, lichtgeschützt

3x SDS-Probenpuffer 4,8 mL 4x Trenngelpuffer

600 mg SDS

426 mg Dithiothreithol

1 Spatelspitze Bromphenolblau

3,5 mL Glycerin

ad 10 mL mit H2O

Ammoniumperoxodisulfat 10% (w/v) APS in H2O

TEMED Tetramethylethyldiimin (Gibco)

Transferpuffer 10-20% (v/v) Methanol

192 mM Glycin

25 mM Tris-Base

0,03% SDS

TBS 50 mM Tris/HCl

150 mM NaCl

pH 7,4

3.2 Zellbiologische Methoden 31

Blocklösung 5% (w/v) Magermilchpulver (Merck) in TBS-T

TBS-T TBS

0,2% (v/v) Tween-20

Methanol 100%, zur Behandlung der PVDF Membran

Blotting Membran Immobilon-P, PVDF Membran (Millipore)

Film ECL Hyperfilm (Amersham)

Gel-Blotting Papier Schleicher und Schuell

ECL+-Lösung 1 und 2 Amersham

anti-Bmi-1, monoklonaler Mausantikörper Upstate Biotechnology, F6

anti-CDK2, polyklonaler Kaninchenantikörper M2 St. Cruz, sc-163

Sekundärantikörper anti-Maus Amersham

Sekundärantikörper anti-Kaninchen Amersham

3.1.12 Verbrauchsmaterial

Plastikwaren Kulturschalen sowie andere Einwegartikel für die

Zellkultur wurden entweder über die Firmen

Greiner oder Nunc bezogen.

3.2 Zellbiologische Methoden

3.2.1 Zellkultur

Die Arbeiten mit eukaryontischen Zellkulturen entsprachen im Wesentlichen den

Standardmethoden, wie sie z.B. bei Spector (Cold Spring Harbour Laboratory

Press, 1998) beschrieben sind. Alle verwendeten Neuroblastomzelllinien wurden in

Adhäsionskultur auf Polystyrol-Zellkulturschalen mit den Durchmessern 6 cm, 10

cm oder 15 cm gehalten und in HEPES-gepuffertem Vollmedium in Heräus BBD

6220 Begasungsbrutschränken bei 37°C, 96% relativer Feuchte und 5% CO2

kultiviert. Alle Zellexperimente und Kulturarbeiten wurden unter sterilen

Bedingungen an einer Steril-Arbeitsbank (Heräus HeraSafe) durchgeführt.

Je nach Wachstumsrate der Zellen wurden die verwendeten Zelllinien alle 3-5

Tage verdünnt und erneut auf frischen Zellkulturschalen plattiert. Die Verdünnung


lag je nach Zelldichte zwischen 1:5 und 1:20. Zum Ablösen der Zellen von den

Kulturschalen wurden sie mit einer Trypsin/EDTA Lösung behandelt. Dazu wurde

das Kulturmedium abgesaugt und der Zellrasen einmal mit PBS pH 7,4

gewaschen, um die im Serum enthaltenen Proteaseinhibitoren zu entfernen.

Danach wurden die Zellen mit 1-2 mL Trypsin/EDTA-Lösung 5 min bei 37°C

inkubiert, bis sie sich völlig von der Kulturschale gelöst hatten. Anschließend

wurden die Zellen in Medium verdünnt und in Zellkulturschalen überführt, die mit

frischem Medium vorbereitet waren.

3.2.2 Einfrieren von Zellen

Zunächst wurde das Medium der Zellschale abgesaugt, und die Zellen wurden

unter Einwirkung von Trypsin abgelöst und in ein Falcon-Röhrchen überführt.

Anschließend wurde das Röhrchen in einer Heraeus Fresco Biofuge-Zentrifuge bei

4°C und 1200 U/min für 5 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das

Zellpellet wurde in 1 mL Einfriermedium resuspendiert und in einem Cryoröhrchen

für 20 min auf Eis gelagert. Nach weiteren Abkühlungsschritten (45 min bei -20°C,

72 h bei -80°C) wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff konserviert.

3.2.3 Auftauen von Zellen

Zum Auftauen von in flüssigem Stickstoff gelagerten Zellen wurde ein Falcon-

Röhrchen mit Vollmedium befüllt und eisgekühlt. Das Cryoröhrchen mit den darin

befindlichen Zellen wurde in einem 37°C-Wasserbad rasch erwärmt und als

Suspension in das gekühlte Medium überführt. Anschließend wurde das Falcon-

Röhrchen bei 4°C und 1200 U/min für 5 min zentrifugiert und der Überstand

verworfen. Das Zellpellet wurde in 10 mL normalen Mediums resuspendiert und

auf einer Zellschale ausplatiert.

3.3 Molekularbiologische Methoden 33

3.3 Molekularbiologische Methoden

3.3.1 RNA-Extraktion

Zunächst wurde das Vollmedium der jeweiligen Zellschalen entfernt und nach

Waschen mit PBS nochmals sorgfältig abgesaugt. Nach Hinzufügen von 1 mL PBS

wurde der Zellrasen mit Hilfe eines Zellschabers vorsichtig vom Boden der Schale

gelöst und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Suspension wurde für 2

min bei 4°C und 2200 U/min zentrifugiert, und anschließend der Überstand

vollständig abgesaugt. Das Zellpellet wurde in 1 mL TRIzol-Reagenz gelöst, und

die Probe für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 200 µL

Chloroform wurden die Eppendorf-Reaktionsgefäße 15 s lang kräftig geschüttelt und

weitere 3 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zentrifugation bei 10000 U/min

für 15 min bei 4°C führte zu einer Phasenschichtung, wobei die obere, wässerige

Phase die extrahierte RNA enthielt und in ein weiteres Eppendorf-Reaktionsgefäß

transferiert wurde. Um RNA-Präzipitate zu erhalten, wurden 500 µL

Isopropylalkohol zugefügt und die Proben für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert

und anschließend für 10 min bei 10000 U/min und 4°C zentrifugiert. Der Überstand

wurde entfernt und das RNA-Präzipitat mit 1 mL 75%igem Ethanol gewaschen.

Nach weiterer Zentrifugation für 5 min bei 6000 U/min und 4°C und Verwerfen des

Überstands wurde das RNA-Pellet vorsichtig getrocknet und in 30 µL Elution Puffer

für 10 min bei 55°C auf dem Heizblock gelöst. Anschließend wurden die Proben

bei -80°C eingelagert.

3.3.2 cDNA-Synthese

Für die Erststrangsynthese wurden die als Matritze verwendeten RNA-Proben

zunächst auf die Konzentration 1 µg/µL gebracht und anschließend 2 µg jeder

RNA-Probe mit 8 µL DEPC-H2O im PCR-Gerät für 10 min bei 65°C inkubiert.


Nach kurzer Abkühlung auf Eis wurden jeder Probe dann 40 µL des

Reaktionsgemisches hinzugefügt, bestehend aus:

• 10 µL First Strand Puffer 5x

• 5 µL 0,1 M DTT

• 1,25 µL 10 mM dNTP

• 2 µL Random Primer

• 1 µL Reverse Transkriptase

• 0,2 µL RNAsin

• 20,55 µL DEPC-H2O

Die Programmierung des PCR-Geräts erlaubte nach 15 min Inkubation bei

Raumtemperatur eine kontrollierte Erwärmung der Proben für 50 min auf 37°C

und abschließend für 5 min auf 65°C. Die entstandenen cDNA-Proben wurden bei

-20°C eingelagert.

3.3.3 PCR

Zur Vervielfältigung der cDNA wurde folgender Ansatz für die PCR in geeignete

und beschriftete Röhrchen pipettiert und mit einem Deckel luftdicht verschlossen:

• 1 µL (=100 ng) cDNA

• 5 µL Pfu Puffer

• 1 µL MgSO4

• 1,5 µL dNTP

• 2 µL Pfu Polymerase

• 1 µL Primer

• 38,5 µL H20


Nach Aufheizen des Primus Thermocyclers (MWG) auf 95°C zur Denaturierung

der DNA fand über 28 Zyklen die Primeranlagerung jeweils für 60 s bei 56°C und

die Vervielfältigung des komplettierten DNA-Strangs bei 72°C für 90 s statt.

3.3.4 Quantitative Realtime-PCR Die quantitative Realtime-PCR (qRT-PCR) beschreibt die Ermittlung der benötigten

PCR-Zyklusanzahl, bei der die Fluoreszenz einer amplifizierten und markierten

DNA-Menge einen festgelegten Schwellenwert (treshold cycle; CT) überschreitet.

Der Schwellenwert wird manuell so festgelegt, dass die ermittelten CT-Werte der

exponentiellen Phase der einzelnen PCR-Reaktionen entsprechen. Die Detektion

erfolgt mittels SYBR® Green, das durch einen nicht vollständig geklärten

Mechanismus mit der doppelsträngigen DNA interagiert, und dessen

Fluoreszenzeigenschaft durch das ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System

gemessen wird. Je höher hierbei die eingesetzte DNA-Menge ist, desto früher

kommt es zu einem Anstieg der Fluoreszenz über den Schwellenwert, und umso

kleiner ist der sich ergebende CT-Wert. Unter optimalen Bedingungen verdoppelt

sich bei jedem PCR-Zyklus die Menge der genomischen DNA, so dass durch die

exponentielle Funktion ein ∆∆CT-Wert von -1 in etwa der doppelten, ein ∆∆CT-Wert

von -2 in etwa der vierfachen, eingesetzten DNA-Menge entspricht (Erläuterungen

zur Berechnung finden sich unter 3.6).

Zur Durchführung wurden je 2 µL der zu analysierenden cDNA bzw. des Leerwerts

in Form einer gleichen Menge an Elution Puffer in spezielle, für die

Fluoreszenzmessung geeignete und beschriftete Röhrchen pipettiert.

Anschließend wurde der abgedunkelte Reaktionsansatz hinzugegeben und die

Röhrchen mit Deckeln verschlossen.


Der Reaktionsansatz für 10 Proben bestand aus:

• 180 µL Elution Puffer

• 25 µL Reaction Puffer

• 17,5 µL MgCl2

• 10 µL dNTP

• 10 µL Primer

• 7,5 µL SYBR® Green

• 1,25 µL Hot Gold Star Enzym

Das ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System erlaubte anschließend die

automatische Abfolge der 40 PCR-Zyklen sowie die Analyse der Fluoreszenzen für

die parallel gemessenen Proben, wobei für den Leerwert ein CT-Wert von 40

erwartet wurde.

3.3.5 Agarose-Gelelektrophorese

Die analytische und präparative Agarosegelelektrophorese wurde nach den in

Standardwerken veröffentlichten Protokollen durchgeführt (Sambrook, 1989).

Hierzu wurden in einem Erlenmeyerkolben 2,25 g Agarose in Pulverform in 150 mL

TAE-Puffer durch Erhitzen in einem Mikrowellengerät gelöst und anschließend 4,5

µL Ethidiumbromid hinzugefügt. Das noch flüssige Gel ließ man in einer

vorbereiteten Form erkalten, wobei ein Kammeinsatz als Platzhalter für die

Probentaschen diente. Um das verfestigte Gel für die Probenbefüllung

vorzubereiten, wurde es mitsamt der Form in die mit TAE-Puffer angefüllte

Gelelektrophorese-Apparatur eingesetzt, so dass das Gel vollständig mit TAE-

Puffer bedeckt war. Nach der Entnahme des Kammes wurden abhängig von der

Probenanzahl einseitig oder an beiden Seiten des Gels je eine Probentasche mit 4

µL eines Größenmarkers befüllt, der als Referenz für die Größenabschätzung der

Probenfragmente eingesetzt wurde. Anschließend wurden die verbliebenen freien

Probentaschen mit je 10 µL der Proben, die zuvor im Verhältnis 1:6 mit einem


Farbmarker versetzt worden waren, beladen. Für den Probenlauf wurde an das

Agarosegel für 60 min eine Spannung von 120 V angelegt und das Gel

abschließend unter ultraviolettem Licht dem analytischen bzw. präparativen Zweck

zugeführt.

3.3.6 Restriktionsendonukleasen-Verdau

Der Verdau von Plasmid-DNA durch Endonukleasen hatte zum Ziel, die

ringförmige DNA innerhalb des Bakteriums an einer vorher definierten Stelle zu

spalten, um anschließend einen weiteren DNA-Abschnitt einfügen zu können.

Hierzu wurde bei beiden verwendeten Plasmiden (pBI und pcDNA 4/TO) folgender

Ansatz verwendet:

• 5 µg Plasmid-DNA

• 1 µL EcoR V Endonuklease

• 2 µL SHRIMP (Alkalische Phosphatase)

• 1 µL Puffer React 2 10x

• H2O zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 10 µL

Die Ansätze wurden anschließend für 2 h bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Die

Endonuklease EcoR V spaltet beide DNA-Stränge auf gleicher Höhe, so dass ein

gerader Abschluss ohne einseitige Überhänge von Nukleotiden entsteht.

Gleichzeitig wurde bei diesem Reaktionsschritt eine Dephosphorylierung der

Plasmid-DNA vorgenommen.

3.3.7 Aufreinigung von PCR-Produkten

Die Aufreinigung von PCR-Produkten erfolgte zum einen direkt durch das QIAquick

PCR Purification Kit, wobei hier das reine PCR-Produkt als Ausgangsmaterial

eingesetzt wurde. Zum anderen wurde im Rahmen der präparativen

Gelelektrophorese, d.h. unter ultraviolettem Licht kontrolliert ausgeschnittene


Gelfragmente, mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kits auch eine indirekte

Aufreinigung der PCR-Produkte vorgenommen.

3.3.8 Ligation

Die Ligation bakterieller Plasmid-DNA mit einem externen DNA-Abschnitt in Form

eines PCR-Produktes wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kits (Roche)

durchgeführt. Um diesen Schritt zu ermöglichen, musste jedoch das PCR-Produkt

ebenso wie die zuvor mit Endonukleasen aufgetrennte Plasmid-DNA einen

geraden Abschluss beider DNA-Stränge ohne einseitige Überhänge aufweisen.

Hierfür wurde für 30 min bei RT zunächst folgende Auffüllreaktion durchgeführt:

• 42 µL PCR-Produkt

• 5 µL Klenow-Puffer 10x

• 2 µL dNTP’s (2,5 mM)

• 1 µl Klenow Polymerase

Nach Aufreinigung mit dem QIAquick PCR Purification Kit wurde das PCR-Produkt

durch folgenden Reaktionsschritt für 1 h bei 37°C im Wasserbad phosphoryliert:

• 50 µL PCR-Produkt

• 6 µL Polynukleotidkinase Puffer 10x

• 1 µL ATP (1 mM)

• 1 µl T4 Polynukleotidkinase

Für die Ligation wurde folgender Ansatz erstellt:

• 25 ng Plasmid-DNA

• 25 ng PCR-Produkt

• 2 µL Dilution Puffer 5x

• 10 µL DNA Ligation Puffer


Dem Ansatz wurde nach gründlichem Mischen 1 µL DNA Ligase hinzugefügt, und

die Reaktion für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden nach

Ende der Ligation bei -20°C eingefroren.

3.3.9 Transformation von ultrakompetenten E.coli-Bakterien

Die Transformation von Bakterien bezeichnet das Einschleusen von Plasmid-DNA

in die Bakterienzelle. Hierzu wurden bei -80°C gelagerte, ultrakompetente E.coli-

Bakterien aufgetaut und ebenso wie die ligierte Plasmid-DNA auf Eis gelagert.

Nach dem Vermischen von 200 µL E.coli-Bakterien mit 2 µL Plasmid-DNA wurde

die Suspension weitere 15 min auf Eis belassen, um sie dann für 90 s einem

Hitzeschock von 42°C im Wasserbad auszusetzen. Nach 1-minütiger Abkühlung

auf Eis wurde der Suspension 800 µL LB-Medium beigefügt und diese

anschließend für 45 min bei 37°C auf dem Schüttler mit 700 U/min in

Rotationsbewegung versetzt. Nach Zentrifugation für 30 s bei 3000 U/min wurde

der Überstand verworfen, das Restvolumen resuspendiert und mit dem über der

offenen Flamme sterilisierten Glasspatel auf LB-Agarplatten ausgesät. Die

Inkubation fand für 24 h bei 37°C in Brutschränken statt, wobei die Agarplatten

nach 30 min mit der Oberseite nach unten gedreht wurden, um

Kondensationstropfen zu vermeiden.

3.3.10 Mini-Präparation von Plasmid-DNA

Erfolgreich gewachsene Klone wurden mit Hilfe von autoklavierten Pipettenspitzen

von der Oberfläche der Agarplatten entfernt und einzeln in Reagenzgläser

überführt, die mit jeweils 2 mL LB-Medium befüllt waren. Mit Metalldeckeln

verschlossen wurden die Reagenzgläser für 24 h bei 37°C in Brutschränken

gelagert, um anschließend mit jeweils 2 mL der enthaltenen Kultur Eppendorf-

Reaktionsgefäße zu befüllen. Nach Zentrifugation bei 12000 U/min für 3 min wurde

der Überstand abgesaugt, das Zellpellet in 110 µL STET-L-Puffer resuspendiert

und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Eppendorf-Reaktionsgefäße

wurden für 45 s in einem Heizblock bei 95°C erhitzt und dann bei 4°C für 15 min


bei 12000 U/min zentrifugiert. Das weiche Sediment wurde mit autoklavierten

Zahnstochern aus dem Eppendorf-Reaktionsgefäß entfernt und dem Inhalt 110 µL

Isopropanol zugesetzt. Nach vorsichtiger Resuspension und Zentrifugation für 15

min bei 4°C und 12000 U/min wurde der Überstand entfernt und das Pellet mit 300

µL 70%igen Ethanol gewaschen. Nach weiterer Zentrifugation für 2 min wurde der

Überstand sorgfältig entfernt und das Pellet in 25 µL TE-Puffer und 1 µL RNAse A

gelöst.

3.3.11 Maxi-Präparation von Plasmid-DNA

Die Maxi-Präparation wurde zur Herstellung größerer Mengen an Plasmid-DNA

verwendet. Hierzu wurden 2 µL des Ausgangsplasmids in 200 µL kompetente

E.coli-Bakterien pipettiert und nach Vermischen für 15 min auf Eis belassen. Durch

kurzzeitige Erwärmung für 90 s auf 42°C im Wasserbad nahmen die Bakterien die

Plasmide auf. Nach einer Abkühlungsphase von 1 min auf Eis wurden die

Bakterien in 1 mL LB-Medium überführt und anschließend für 45 min bei 37°C auf

einem Schüttelinkubator bei 700 U/min belassen. Dem Transformationsansatz

wurde 300 mL LB-Medium beigefügt, das 0,1% Ampicillin enthielt, bevor er für

weitere 16 h bei 37 °C auf einem Schüttelinkubator mit 200 U/min in gleichmäßige

Rotationsbewegungen versetzt wurde. Nach Abzentrifugation des Ansatzes wurde

gemäß des vorgegeben Protokolls für das Maxi-Präparation-Kit Qiagen-tip 500 von

Qiagen in mehreren Schritten die vervielfältigte Plasmid-DNA freigesetzt und

filtriert.

3.3.12 Sequenzierung

Die Sequenzierungen zur Kontrolle der ligierten DNA-Abschnitte auf Vollständigkeit

und korrekte Orientierung wurden sämtlich von SeqLab, Sequence Laboratories

Göttingen GmbH durchgeführt.


3.3.13 Transfektion

Die Transfektion bezeichnet den Vorgang des Einschleusens fremder DNA in

eukaryontische Zellen. Um den bei der verwendeten Kalziumphosphat-

Transfektion in RPMI-Medium andernfalls entstehenden Kalziumpräzipitaten

vorzubeugen, wurden die zu transfizierenden Zellen zuvor auf DMEM-Medium

umgesetzt. Für jede 10 cm-Schale wurde folgender Ansatz erstellt:

• 50 µL CaCl2 (2,5 M)

• 30 µg ligierte Plasmid-DNA

• 5 µg Resistenz-Marker (Zeocin / Hygromycin)

• H2O auf ein Gesamtvolumen von 500 µL

Dieser Ansatz wurde langsam unter Luftblasenentwicklung mittels Pipettierhilfe in

ein Falconröhrchen überführt, das bereits 500 µL 2x HBS enthielt. Nach Zugabe

des gesamten Ansatzes zu den Zellschalen wurden diese für 12 h im Brutschrank

inkubiert und anschließend das DMEM-Medium durch RPMI-Medium ersetzt. Nach

weiteren 24 h wurde mit der Selektion der erfolgreich transfizierten Zellen

entsprechend ihrer plasmideigenen bzw. kotransfizierten Resistenzmarker

begonnen.

3.3.14 Herstellung und Expansion von Zellklonen

Nach erfolgreicher Selektion, die zwischen 10 und 20 Tagen andauerte, wurde

jeder einzelne Zellklon aus der ursprünglichen Zellschale in eine kleinere, mit

Medium gefüllte Zellschale überführt. Hierzu wurde das Medium zunächst

abgesaugt und die Zellklone mit Hilfe sterilisierter Metallringe und ebenfalls

sterilisierter Vaseline gegenüber der Umgebung abgedichtet. Durch Zugabe von 50

µL Trypsin wurden nach einer Inkubation von 1 min die von der Zellschale gelösten

Zellen des jeweiligen Klons mit einer sterilen Pipette abgesaugt und in eine, mit je

1 mL RPMI-Medium pro Well befüllten 24-Well-Platte überführt. Nach Wachstum

bis zu einer ausreichenden Dichte wurden die Zellklone in eine, mit je 2 mL


Medium pro Well befüllten 12-Well-Platte und anschließend in eine, mit je 4 mL

Medium pro Well befüllten 6-Well-Platte transferiert, von wo aus die weitere

Expansion der Klone mit Hilfe von 6 cm- und 10 cm-Zellschalen durchgeführt

wurde. Ab diesem Zeitpunkt wurde auch die abwechselnde Selektion je nach

Zelltyp und plasmideigenen bzw. kotransfizierten Resistenzmarkern

wiederaufgenommen.

Folgender Zeitplan wurde eingehalten, um die Zellklone nicht einem gleichzeitigen

Selektionsdruck durch verschiedene Antibiotika auszusetzen:

Hygromycin / Zeocin 7 Tage

G418 7 Tage

Puromycin 3 Tage

3.3.15 FACS-Analyse zur Bestimmung des DNA-Gehalts von Zellen

Zur Analyse der Zellzyklusverteilung wurde der DNA-Gehalt einer Zellpopulation

mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Zellen wurden dazu zunächst einmal in

PBS gewaschen und dann nach Absaugen und nochmaliger Zugabe von 1 mL

PBS mittels Zellschaber in Falcon-Röhrchen überführt. Daraufhin wurden die

Zellen in einer Heraeus-Megafuge bei 1500 U/min und 4°C für 5 min abzentrifugiert

und einmal in 8 mL PBS gewaschen. Das Pellet wurde nach erneutem

Zentrifugieren in 0,5 mL PBS aufgenommen, mit 4,5 mL eiskaltem 70%igen

Ethanol zur Fixierung versetzt und mindestens 30 min auf Eis stehend fixiert.

Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert, in 0,5 mL PBS aufgenommen und

nach Zugabe von 5 µL RNAse A für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden

in die speziell dafür vorgesehenen FACS-Röhrchen überführt und unter

Lichtausschluss mit 15 µL Propidiumiodid versetzt. Mit einem Becton-Dickinson

FACScalibur-Gerät wurde der DNA-Gehalt pro Zelle bestimmt. Dazu wurden pro

Ansatz 50.000 Zellen analysiert. Die erhaltenen Daten wurden unter Verwendung

des Programms „Modifit“ (Verity Software House) ausgewertet.

3.4 Methoden zur Analyse von Proteinen 43

3.4 Methoden zur Analyse von Proteinen

3.4.1 Bradford-Assay

Die Bestimmung der Proteinkonzentration in den Zelllysaten wurde nach der von

Bradford beschriebenen Methode durchgeführt (Harlow und Lane, 1988). Hierzu

wurden in Küvetten zur photometrischen Messung jeweils 7 µL des Zellextrakts

und im Fall des Leerwerts 7 µL des 100 mM Kaliumphosphatpuffers vorgelegt.

Daraufhin wurden je 100 µL 150 mM NaCl und 1 mL der Bradford-Lösung

hinzugefügt und die Proteinmenge bei einer Wellenlänge von 595 nm relativ zum

Leerwert gemessen. Die Bestimmung der absoluten Menge an Protein erfolgte

anhand einer Standardreihe, die für die benutzte Bradford-Lösung ermittelt worden

war.

3.4.2 Luciferase-Assay

Mit Hilfe eines Luciferase-Assays kann die Proteinproduktion von Zellen, die durch

eine Transfektion das Luciferase-Reportergen erhalten haben, quantifiziert werden.

Hierbei macht man sich die in der Natur als Biolumineszenz bekannte Eigenschaft

der Luciferase zunutze, Luciferin in Verbindung mit Sauerstoff zu modifizieren, so

dass es zu einer Lichtemission kommt. Die Zellen wurden 36 h nach der

Transfektion mit kaltem PBS gewaschen. 1 mL kaltes PBS wurde zu den Zellen

gegeben, die mit einem Plastikschaber geerntet und in der Kühlzentrifuge bei 2200

U/min und 4°C für 2 min pelletiert wurden. Das Zellpellet wurde in 120 µL 0,1 M

Kaliumphosphatpuffer pH 7,8 / 0,2% Triton aufgenommen und durch dreimaliges

Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen bei 37°C aufgeschlossen. Das Lysat

wurde durch Zentrifugation bei 14.000 U/min für 10 min bei 4°C von den

unlöslichen Bestandteilen befreit und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß

überführt. 50 µL des Überstands wurden mit 350 µL Reaktionspuffer versetzt und

die Lichtemission im Luminometer nach Zugabe von 150 µL Substratmix

gemessen.


3.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von

Proteinen Die Auftrennung von Proteinen durch diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese

erfolgte nach Laemmli (1970) unter denaturierenden Bedingungen. Grundlage

hierfür bildeten Acrylamidgele, die aus einem oberen Sammelgel und einem

unteren Trenngel bestanden, und sich wie folgt zusammensetzten.

Sammelgel: 650 µL Acrylamidlösung

• 1,2 mL Sammelgelpuffer

• 50 µL SDS (10%), auf 5 mL mit Aqua dest. aufgefüllt

• 5 µL TEMED

• 150 µL APS (10%) zur Initialisierung der

Gelpolymerisation

Trenngel: 3,83 - 5,1 mL Acrylamidlösung

• 3,75 mL Trenngelpuffer

• 150 µL SDS (10%), auf 15 mL mit Aqua dest. aufgefüllt

• 12 µL TEMED

• 50 µL APS (10%) zur Initialisierung der

Gelpolymerisation

Das Trenngel wurde in den Zwischenraum zweier Glasscheiben, die in eine

Apparatur eingespannt waren, gegossen und anschließend mit Isopropanol

überschichtet. Nach erfolgter Polymerisation wurde das Isopropanol abgegossen

und verbliebene Reste mittels Whatman-Papier enfernt. Unmittelbar nach der

Überschichtung des Trenngels durch ein Sammelgel wurde ein geeigneter Kamm

eingesetzt, um die entsprechenden Aussparungen für die Geltaschen zu schaffen.

Vor dem Beladen der Gele wurden die Proben mit 3x SDS-Probenpuffer versetzt

und für 5 min bei 95°C denaturiert. Die Proteine wurden auf das im SDS-Laufpuffer

stehende Gel aufgetragen und durch das Anlegen einer gleichmäßigen Spannung

3.4 Methoden zur Analyse von Proteinen 45

(80 V im Sammelgel, 120 V im Trenngel) aufgetrennt. Der Transfer auf eine

Nylonmembran und die Analyse der Proteine erfolgte im anschließenden Western

Blot.

3.4.4 Western Blot

Der Western Blot bezeichnet den Transfer von mittels SDS-PAGE getrennten

Proteinen auf eine Membran und den dortigen Nachweis durch markierte

Antikörper. Hierzu lässt man die Proteine durch ein transversal zur Oberfläche des

Gels angelegtes elektrisches Feld auf der anodischen Seite aus dem Gel austreten

und transferiert sie auf eine Nylonmembran. Dort nehmen die Proteine dieselbe

Position ein, die sie schon im Gel belegten. Die auf der Oberfläche der PVDF-

Membran immobilisierten Proteine sind nun immunologischen Reaktionen

zugänglich. Dazu wird die Membran in einer Lösung, die gegen das

nachzuweisende Protein gerichtete Antikörper enthält, inkubiert. Nach Abwaschen

des nicht gebundenen Antikörperüberschusses wird ein Zweitantikörper, der gegen

die konstanten Domänen der schweren Kette des Erstantikörpers gerichtet ist,

hinzugegeben. Dieser Zweitantikörper ist mit einer Markierung gekoppelt, hier mit

einer Horseradish-Peroxidase. Deren Enzymreaktionen erlauben den

hochspezifischen Nachweis des erwünschten Proteins.

Zunächst wurde die PVDF-Membran jeweils unter Vermeidung von

Verunreinigungen auf die Größe des Acrylamid-Gels zurechtgeschnitten.

Anschließend wurde die Membran für 1 min in 100% Methanol, für 2 min in H2O

und für 5 min in Blot-Puffer inkubiert. Der elektrophoretische Transfer der Proteine

wurde in einer “semi-dry“-Blot-Apparatur vorgenommen. Drei Whatman-3M

Papiere, in ihrer Größe der PVDF-Membran entsprechend, wurden in Blot-Puffer

getränkt und luftblasenfrei übereinander auf die Anode der Blot-Apparatur gelegt.

Darauf wurde dann die vorbehandelte PVDF-Membran, das Polyacrylamidgel und

schließlich nochmals drei Blot-Puffer getränkte Whatman-3M Papiere gelegt. Der

Proteintransfer auf die Membran erfolgte dann für 90 min bei konstanten 200 mA.

Zur Vermeidung von unspezifischer Bindung der Antikörper an die Membran wurde


diese anschließend in Blocklösung überführt und über Nacht bei 4°C auf einem

Schüttler inkubiert. Dadurch wurde die Membran abgesättigt. Danach wurde die

Blocklösung durch frische ersetzt und dieser der primäre Bmi-1-Antikörper in einer

Verdünnung von 1:1000 zugesetzt. In dieser Lösung wurde die Membran 2 h bei

RT inkubiert. Anschließend wurde 2 x 5 min und 3 x 15 min mit TBS-T gewaschen.

Der sekundäre Antikörper wurde 1:3000 in Blocklösung verdünnt. Hierin erfolgte

die Inkubation der Membran für 1 h bei RT. Danach wurde erneut 2 x 5 min und 3 x

10 min mit TBS-T gewaschen. Anschließend wurde die Membran mit ECL-

Reagenzien entwickelt. ECL+ Lösung A und B wurden im Verhältnis 40:1 gemischt

und die Membran hiermit für 5 min bei RT inkubiert. Die ECL-Reagenzien

erzeugen zusammen mit der Horseradish-Peroxidase eine Chemolumineszenz, die

sich mit geeigneten Filmen nachweisen lässt. Die Membran wurde zur Exposition

in Klarsichtfolie verpackt. Die Expositionszeit auf einen ECL Hyperfilm erfolgte je

nach erwarteter Signalstärke zwischen 10 s und 10 min. Die Schwärzung des

Films ist in gewissen Grenzen der Menge an gebundenem Antikörper und damit

der Menge an nachzuweisendem Protein proportional. Aufgrund der

Schwärzungsintensität der jeweils resultierenden Banden wurde die Expression

von Bmi-1 als nicht oder kaum nachweisbar, deutlich nachweisbar und erhöht

klassifiziert. Die Höhe der Signale wurde dabei in Relation zu der Signalstärke des

jeweilig als Ladekontrolle parallel bestimmten CDK2-Signals beurteilt.

3.5 Geräte

ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems

Begasungsbrutschränke, BBD 6220, Heraeus

FACScalibur, Becton-Dickinson

Kamera, CF 1/8 FMC CCD, Kappa

Kühlzentrifuge, Centrifuge 5417R, Eppendorf

Lumat LB 9507, Berthold

Megafuge 1.OR, Heraeus

Mikroskop DMIRB, Leica


Primus Thermocycler, MWG

Schüttelinkubatoren Model G25, New Brunswick Scientifik Co. INC

Spektrophotometer, Pharmacia

Steril-Arbeitsbank, Heraeus HeraSafe

Tankblotapparatur, Trans-blot, Biorad

Tischzentrifuge, Biofuge pico, Heraeus

Zentrifuge, Sorvall RC-5B, DuPont

3.6 Statistische Auswertungen

Die Berechnung der relativen Expression in der quantitativen Realtime-PCR

basiert auf der arithmetischen Grundlage der vergleichenden CT-Methode und wird

wie folgt abgeleitet.

Die Gleichung, die die exponentielle Amplifikation der PCR beschreibt, lautet:

!

Xn

= X0" (1+E

X)n (3.1)

wobei: Xn = Anzahl der Probenmoleküle bei Zyklus n

X0 = anfängliche Anzahl der Probenmoleküle

EX = Effizienz der Probenamplifikation

n = Anzahl der Zyklen

Der CT-Wert (treshold cycle) markiert den Bruchwert der Zyklenanzahl, bei dem die

amplifizierte Probenmenge einen festgesetzten Schwellenwert überschreitet:

!

XT

= X0" (1+E

X)CT ,X = K

X (3.2)

wobei: XT = Schwellenwertanzahl der Probenmoleküle

CT,X = Schwellenwertzyklus für die Probenamplifikation

KX = konstant


Für die Berechnung der eingesetzten Referenzreaktion wird eine ähnliche

Gleichung verwendet:

!

RT

= R0" (1+E

R)CT ,R = K

R (3.3)

wobei: RT = Schwellenwertanzahl der Referenzmoleküle

R0 = anfängliche Anzahl der Referenzmoleküle

ER = Effizienz der Referenzamplifikation

CT,R = Schwellenwertzyklus für die Referenzamplifikation

KR = konstant

Die Division von XT durch RT ergibt folgenden Ausdruck:

!

XT

RT

=X0" (1+E

X)CT ,X

R0" (1+E

R)CT ,R

=K

X

KR

= K (3.4)

Die Effizienzen sind verschiedenen Einflüssen unterworfen und müssen nicht

gleich 1 sein. Wenn man jedoch gleiche Effizienz für Probe und Referenz als

gegeben ansehen kann, dann ist EX = ER = E:

!

X0

R0

" (1+E)CT ,X #CT ,R = K (3.5)

oder:

!

XN" (1+E)

#CT = K (3.6)

wobei: XN = X0/R0, die normalisierte Probenmenge

ΔCT = CT,X-CT,R, die Differenz der Schwellenwertzyklen


Durch Umstellen ergibt sich:

!

XN

= K " (1+E)#$C

T (3.7)

Im letzten Schritt dividiert man die XN für jede Probe q durch die XN des Kalibrators

cb:

!

XN ,q

XN ,cb

=K " (1+E)

#$CT ,q

K " (1+E)#$CT ,cb

= (1+E)#$$CT (3.8)

wobei: ΔΔCT = ΔCT,q-ΔCT,cb

Unter Beachtung der vorgegebenen Richtlinien für die Durchführung einer qRT-

PCR liegt die Effizienz nahe 1. Somit errechnet sich die anhand eines eingesetzten

Referenzwertes normalisierte und in Relation zu einem Kalibrator gesetzte

Probenmenge (relative Expression) wie folgt:

!

XN ,q

XN ,cb

= 2"##CT (3.9)

4 Ergebnisse

4.1 Funktionsprinzip der verwendeten Neuroblastom-Zelllinien

Die für die Experimente verwendeten Zelllinien sind Derivate der humanen

Neuroblastom-Zelllinie SK-N-SH-EP, deren durch stabile Transfektion modifizierte

Funktionen im Folgenden beschrieben werden.

4.1.1 SK-N-SH-EP-Zelllinie 1A3

Der SK-N-SH-EP-Klon 1A3 exprimiert konstitutiv ein Fusionsprotein aus dem

Transkriptionsfaktor E2F-1 und einem Teil des Östrogenrezeptors (E2F-1-ER),

dessen Bindung an einen Komplex aus Hitzeschockproteinen unter dem Einfluss

des Östrogenderivats 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) aufgehoben werden kann. Dies

ermöglicht es dem Fusionsprotein, in den Zellkern einzudringen und seine

regulatorische Funktion auf die E2F-1-Zielgene wie z.B. BMI1 auszuüben, den

Eintritt der Zellen in die S-Phase zu stimulieren sowie den programmierten Zelltod

(Apoptose) zu induzieren (Kramps, 2004).

4.1.2 SK-N-SH-EP-Zelllinie TOR

Der 1A3-Klon TOR (Kornelius Kerl, persönliche Mitteilung) exprimiert dauerhaft

einen Repressor, der unter dem Einfluss von Tetrazyklin seine Bindung an eine

Tetrazyklin-spezifische Operatorgensequenz aufgibt und somit die Ablesung des

nachfolgenden Genabschnitts ermöglicht (T-REx-System; Yao, 1998). Es wurden

zwei verschiedene, funktionstüchtige TOR-Klone (TOR7 und TOR27) eingesetzt,

um im Verlauf der Transfektion den Klon mit der besseren Effizienz zu ermitteln.

4.1.3 SK-N-SH-EP-Zelllinie Tet21

Der SK-N-SH-EP-Klon Tet21 dagegen exprimiert einen Aktivator, der an eine

Tetrazyklin-spezifische Operatorgensequenz bindet und somit in Abwesenheit von

Tetrazyklin die Ablesung des nachfolgenden Genabschnitts erlaubt (Lutz, 1996).

4.2 Neuroblastomzellen mit induzierbarer Expression von Bmi-1 51

Unter dem Einfluss von Tetrazyklin löst der Aktivator jedoch seine Bindung und

verhindert somit eine Ablesung (Tet-Off-System).

4.2 Neuroblastomzellen mit induzierbarer Expression von Bmi-1

Um die Auswirkungen einer erhöhten Bmi-1-Produktion in Neuroblastomzellen zu

messen, wurden zum einen Zellen benötigt, bei denen die Herstellung der

entsprechenden mRNA reversibel gesteuert werden konnte. Zum anderen war die

mengenmäßig ausreichende Synthese an Protein bzw. mRNA Voraussetzung für

eine zuverlässige Beurteilung der ermittelten Daten. Darüber hinaus wollte ich

überprüfen, ob die erhöhte BMI1-Expression geeignet ist, bestimmte Teilaspekte

der bekannten E2F-Effekte nachzuahmen. Um diese Ziele zu erreichen, wurden

die 1A3-Klone TOR, bei dem die Regulation des Transkriptionsfaktors E2F-1

bereits möglich war, und Tet21 als Ausgangszellen verwendet, um sie durch ein

Tetrazyklin-abhängiges System mit der Fähigkeit zur solitären Bmi-1-Produktion zu

erweitern. Ich entwickelte zwei voneinander unabhängige Systeme, um ihren

Wirkungsgrad miteinander zu vergleichen und das erfolgreichere System für die

Messung und Auswertung zu verwenden.

4.2.1 Klonierung von BMI1 in Tetrazyklin-regulierbare Vektoren

Voraussetzung für die exogene Produktion des Bmi-1-Proteins in

Neuroblastomzellen war die Amplifikation des entsprechenden, vollständigen

Genabschnitts aus nativer Neuroblastom-cDNA. Für die Herstellung der TOR-

Zellen wurde der Vektor pcDNA 4/TO, für die Klonierung der Tet21-Zellen der

Vektor pBI ausgewählt. Der Vektor pcDNA 4/TO besitzt neben Resistenzmarkern

für Ampicillin und Zeocin eine Schnittstelle, die einem viralen Promotor (CMV) und

einer doppelten Tetrazyklin-Operatorgensequenz nachgeschaltet war. Der Vektor

pBI besitzt lediglich einen Ampicillin-Resistenzmarker und zwei Schnittstellen, die

von einer gemeinsamen, zentralen Tetrazyklin-Operatorgensequenz und einem

viralen, bidirektionalen Minimalpromotor (CMV) getrennt werden, wobei sowohl die

Schnittstelle des Vektors pcDNA 4/TO als auch eine der Schnittstellen des Vektors

52 4 Ergebnisse

pBI je eine Bindesequenz für die Restriktionsendonuklease EcoR V aufweist, die

für die verwendete „blunt-end“-Klonierstrategie geeignet war. Nach erfolgter

Ligation, also dem Einfügen der isolierten BMI1-Gensequenz in die Vektoren, und

Transformation in ultrakompetente E.coli-Bakterien wurden jeweils etwa 25 Klone

ausgewählt, bei denen mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen zum einen die

berechnete Fragmentgröße kontrolliert und zum anderen, soweit dies möglich war,

auch die Richtung der in den Vektor klonierten BMI1-Gensequenz bestimmt wurde.

Abbildung 4.1: Vektorkarten von pBI und pcDNA 4/TO. Die Multiple Cloning Site (MCS) I von pBI weist ebenso wie der Klonierbereich von pcDNA 4/TO eine Schnittstelle für EcoR V auf, an der die beiden DNA-Stränge des Vektors auf gleicher Höhe gespalten werden.


Abbildung 4.2: Kontrollverdau der klonierten Plasmide. Nur die markierte Probe (Pfeil) zeigt die, bei richtiger Orientierung des in den pBI-Vektor klonierten BMI1-Wildtyp- Genabschnitts (980 bp) zu erwartenden Fragmentgrößen bei 0,6 kb, 1 kb und 3,8 kb nach Verdau mit den Restriktionsendnukleasen Xba I und Hind III.

Die Plasmide, die das richtige Bandenmuster zeigten, wurden zur endgültigen

Überprüfung der Vollständigkeit sowie der Orientierung der BMI1-Gensequenz

sequenziert. Die Bezeichnungen der erfolgreichen Klonierungen lauteten gemäß

ihrer Nummerierungen für die ausgewählten Mini-Präparationen:

BMI1-WT → pcDNA 4/TO: BMI1-WT21/pcDNA

BMI1-WT → pBI: BMI1-WT6/pBI

BMI1-ΔRF → pcDNA 4/TO: BMI1-ΔRF13/pcDNA

BMI1-ΔRF → pBI: BMI1-ΔRF2/pBI

4.2.2 Das dominant negative BMI1-Allel

Das Bmi-1-Protein besitzt an seinem Amino-Terminus eine Zn-Bindedomäne, den

sog. RING-finger (RF), der für die onkogenen Funktionen von Bmi-1 notwendig ist

(Alkema, 1997). Eine Deletionsmutante von Bmi-1, der die RF-Domäne fehlt (Bmi-

4072 bp 3054 bp

2036 bp 1636 bp 1018 bp 506 bp

3800 bp 1000 bp

600 bp

Größen- standard

pBI-BMI1-WT + Xba I, Hind III

54 4 Ergebnisse

1-ΔRF), geht vorzeitig in die Seneszenz (Itahana, 2003). Demnach wirkt Bmi-1-

ΔRF dominant negativ.

Die Vektoren, die dieses Allel enthielten, wurden für weitere Versuche innerhalb

der Arbeitsgruppe verwendet. Hierbei sollte untersucht werden, welche

Auswirkungen das Fehlen von funktionellem Bmi-1 für die E2F-1-Funktionen hat.

Diese Vektoren finden im Folgenden keine Erwähnung mehr.

4.2.3 Untersuchung der Neuroblastom-Zelllinie Tet21 auf Induzierbarkeit durch Tetrazyklin

Um die Zelllinie Tet21 auf ihre Funktionstüchtigkeit zu überprüfen, führte ich einen

Luciferase-Assay durch.

Hierzu wurden je zwei semikonfluente Tet21-Zellschallen entweder mit dem Vektor

puHC 13-6 oder dem Vektor puHD 13-3, die sich in ihrem Minimalpromotor

unterschieden aber beide ein tetrazyklinabhängiges Luciferase-Reportergen

besaßen, transfiziert. Bei der durchgeführten Kalziumphosphat-Transfektion wurde

neben der Vektor-DNA auch GFP eingesetzt, um eine optische Einschätzung des

Transfektionserfolgs vornehmen zu können. Nach Durchführung des Bradford- und

Luciferase-Assays zeigte sich, dass beide Vektoren bei fehlender Reprimierung

durch Tetrazyklin mit einer deutlichen Steigerung der relativen Luciferase-Aktivität

reagierten, wobei der Vektor puHD 13-3 die stärkere Antwort lieferte (Abb. 4.3).


Abbildung 4.3: Luciferase-Assay für die Vektoren puHC 13-6 und puHD 13-3 nach Entzug von Tetrazyklin. Beide Vektoren zeigen eine deutliche Antwort des Tetrazyklin- abhängigen Luciferase-Reporters bei Wegfall der reprimierenden Tetrazyklinwirkung.

4.2.4 Transfektion und Selektion der Zelllinien TOR und Tet21 mit BMI1-tragenden Vektoren

Nachdem die Funktionsfähigkeit beider verwendeter Zelllinien sichergestellt war,

und die BMI1-Gensequenzen der zur Transfektion eingesetzten Plasmide auf

Vollständigkeit und Orientierung überprüft sowie Mutationen ausgeschlossen

waren, wurden je vier semikonfluente Zellschalen der TOR7- und TOR27-Zellen

und zwei semikonfluente Zellschalen der Tet21-Zellen für die Transfektion

vorbereitet. Nachdem bei vorangegangenen Selektionsversuchen Probleme bei

der Verwendung von Zeocin aufgetaucht waren, wurden jeweils zwei Zellschalen

der TOR-Zellen zusätzlich zu dem, auf dem Vektor pcDNA 4/TO befindlichen

Resistenzmarker für Zeocin mit dem Resistenzmarker für Hygromycin

kotransfiziert. Die beiden Zellschalen der mit dem Vektor pBI zu transfizierenden

Tet21-Zellen wurden aufgrund fehlender andersweitiger Resistenzen mit dem

Resistenzmarker für Zeocin in Form des pcDNA 4/TO-Leervektors kotransfiziert.

56 4 Ergebnisse

Jeweils eine Schale eines gleichen Transfektionsansatzes wurde anschließend

unverdünnt auf RPMI-Medium umgesetzt, die andere im Verhältnis 1:3 gesplittet

und deren Nährlösungen ebenfalls durch RPMI-Medium ersetzt. Hierdurch sollte

das evtl. bessere Ansprechen der Selektion auf die unverdünnten bzw. die 1:3

verdünnten Zellen getestet werden. Nach weiteren 48 h wurde mit der Selektion

der Zellen mit Hygromycin bzw. Zeocin begonnen, die zwischen 10 und 20 Tagen

andauerte und lichtmikroskopisch kontrolliert wurde. Nach erfolgreicher Selektion

wurden die 30 bis 40 verbliebenen Klone jeder Zellschale in 24-Well-Platten

überführt und von dort aus bei ausreichender Zelldichte in größere Platten bzw.

Schalen umgesetzt. Die Bezeichnung der Zellklone beinhaltete den Zelltyp, den

eingesetzten Resistenzmarker und die fortlaufender Nummer (z.B. TOR7 Zeo2).

4.2.5 Nachweis der Tetrazyklin-abhängigen Expression von Bmi-1

Jeder expandierte Zellklon wurde abschließend auf je drei 6 cm-Zellschalen

ausplattiert, wobei eine Zellschale als Mutterschale weiterverwendet wurde und die

beiden anderen Schalen einem Western Blot zugeführt wurden, wobei auch hier

auf semikonfluentes Wachstum zu achten war. Den Zellschalen mit zu

induzierender Bmi-1-Expression wurden im Falle der TOR-Zellen (T-REx-System)

10 µg/mL Tetrazyklin zugesetzt, im Falle der Tet21-Zellen (Tet-Off-System)

entsprechend den Zellschalen, bei denen eine Unterdrückung der Bmi-1-

Expression hervorgerufen werden sollte. Da sich bei den Tet21-Zellen eine

Expansion unter Selektionsdruck als äußerst schwierig erwies, und die TOR-Zellen

sehr stabile Ergebnisse lieferten, wurde auf eine weitergehende Untersuchung

einzelner Zellklone verzichtet und stattdessen eine globale Einschätzung der

Tet21-Zellen mittels Western Blot der gepoolten Zellklone der Mutterschale

vorgenommen (Mischklon).

Die drei TOR-Klone Hygro1, Zeo1 und Zeo2 zeigten eine deutliche Antwort auf die

Induktion mit Tetrazyklin im Sinne einer erhöhten Expression von Bmi-1 (Abb. 4.4).

Auch der Tet-21-Mischklon reagierte unter der Induktion mit Tetrazyklin wie

erwartet mit einer verminderten Expression von Bmi-1, wobei aufgrund der

4.3 Induktion von Bmi-1 in induzierbaren Neuroblastomzellen 57

besseren Selektionsfähigkeit für die nachfolgenden Experimente ausschließlich die

o.g. TOR-Klone verwendet wurden.

Abbildung 4.4: Tetrazyklin-abhängige Expression von Bmi-1. Verschiedene Klone wurden für 30 Stunden in Medium mit bzw. ohne Tetrazyklin kultiviert. Anschließend wurden Zelllysate hergestellt, und mit einem Bmi-1-spezifischen Antikörper wurde das Protein Bmi-1 nachgewiesen.

4.3 Induktion von Bmi-1 in induzierbaren Neuroblastomzellen

Diejenigen Zellklone, die im ersten Western Blot positive Ergebnisse lieferten,

wurden in weiteren Western Blots kontrolliert und für die Untersuchung der Bmi-1-

Überexpression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene expandiert. Neben

der Frage nach den Auswirkungen einer direkten und indirekten Induktion der Bmi-

1-Expression durch Tetrazyklin bzw. 4-OHT untersuchte ich, ob es bei

gleichzeitigem Einsatz der beiden Induktionssysteme zu Behinderungen des

jeweils anderen Systems kam.

4.3.1 Tetrazyklin-abhängige Induktion von BMI1 auf mRNA-Ebene

Die Mutterschale jedes zu untersuchenden Zellklons (TOR7 Zeo1, TOR7 Zeo2,

TOR7 Hygro1) wurde im Verhältnis 1:9 in 10 cm-Zellschalen gesplittet, wobei

neben einer neuen Mutterschale zwei Ansätze zu je 4 Zellschalen für die mRNA-

Ernte und den Western Blot entstanden. Diese wurden jeweils auf semikonfluentes

Wachstum gebracht und die Zellschalen dann zeitgleich für die Dauer von 30

CDK2-Ktr.

Bmi-1

TOR7 Hygro1 TOR7 Zeo1 TOR7 Zeo2 Tet21 (Mischklon)

- Tet - Tet - Tet - Tet

58 4 Ergebnisse

Stunden (Tetrazyklin) bzw. 18 Stunden (4-OHT) den angegebenen Bedingungen

ausgesetzt. Nach gleichzeitiger Ernte der Zellschalen jedes Zellklons wurde eine

quantitative Realtime-PCR bzw. ein Western Blot durchgeführt. Nach erfolgter

Erststrangsynthese wurde bei der quantitativen RT-PCR neben einer Leerkontrolle

die cDNA sämtlicher Zellschalen in Doppelansätzen sowohl mit den geeigneten

Primern für BMI1 als auch für S14 eingesetzt.

Abb. 4.5 zeigt die, anhand von S14-mRNA normalisierten, durchschnittlichen

Ergebnisse für BMI1 der einzelnen Zellklone sowie die relative Expression. Die

starke, plasmidgesteuerte Expression von BMI1 durch Tetrazyklin übertraf dabei

jeweils deutlich die durch 4-OHT induzierte Expression des endogenen BMI1. Bei

kombinierter Induktion wurden allerdings keine höheren, teilweise auch nur etwas

geringere Werte erreicht als bei alleiniger Induktion mit Tetrazyklin, was besonders

bei den Zellklonen TOR7 Zeo1 und Zeo2 auffiel. Eine Erklärung hierfür könnte eine

vermehrte Bildung des Tet-Repressors durch freigesetztes E2F-1 oder eines

seiner Zielgene bzw. die Förderung der Bindung an die Operatorsequenz sein.

Somit könnte der durch Tetrazyklin bedingte Effekt bei gleichzeitigem Einsatz von

4-OHT abgemildert worden sein.


Abbildung 4.5: Gesteigerte Expression von BMI1 nach unterschiedlicher Induktion in relativer Darstellung. Aus Zellen, die zuvor für 30 Stunden mit Tetrazyklin bzw. für 18 Stunden mit 4-OHT induziert worden waren, wurde die mRNA extrahiert und die relative BMI1-Menge in der qRT-PCR bestimmt.

4.3.2 Tetrazyklin-abhängige Induktion von Bmi-1 auf Proteinebene

Der Proteingehalt an Bmi-1 der einzelnen Zellklone nach 30 h (Tetrazyklin) bzw. 18

h (4-OHT) unter den oben beschriebenen Bedingungen wurde mittels Western Blot

gemessen. Auch hier zeigte sich die stärkere Expression von Bmi-1 unter dem

Einfluss von Tetrazyklin im Vergleich zur indirekten Induktion durch 4-OHT, wobei

nach optischer Einschätzung die Bmi-1-Expression bei den Klonen TOR7 Hygro1

und Zeo1 nach 4-OHT nicht die entsprechenden Werte aus der qRT-PCR erreichte

(Abb. 4.6). Ebenfalls auf Proteinebene bestätigt wurde die gemessene gleiche

bzw. etwas geringere mRNA-Menge in der qRT-PCR bei gleichzeitiger Induktion

durch Tetrazyklin und 4-OHT, was wiederum Folge einer möglichen, verstärkten

60 4 Ergebnisse

Bindung des Tet-Repressors an die Operatorsequenz gewesen sein könnte. Diese

zellulären Werkzeuge, deren Grundlage eine getrennte Kontrolle von reiner Bmi-1-

Expression und E2F-1-Aktivität mit nachfolgender Bmi-1-Steigerung ist, wurden als

Grundlage der folgenden Experimente verwendet.

Abbildung 4.6: Nachweis der gesteigerten Bmi-1-Menge im Western Blot nach unterschiedlicher Induktion. Der Proteingehalt von Zellen, die zuvor entweder keine Induktion, eine Induktion über 30 Stunden mit Tetrazyklin bzw. über 18 Stunden mit 4-OHT oder eine kombinierte Induktion durchlaufen hatten, wurde mit Hilfe eines Antikörpers gegen das Bmi-1-Protein bestimmt.

4.3.3 Einfluss der erhöhten Bmi-1-Aktivität auf Zellzyklus und Apoptose

Die Aktivierung von E2F-1 induziert in SK-N-SH-EP Neuroblastomzellen Apoptose.

Um zu überprüfen, ob auch nur die erhöhte Expression des E2F-1-Zielgens BMI1

ausreicht, den programmierten Zelltod auszulösen, wurde der Zellklon TOR7 Zeo2

ausgewählt und für die FACS-Analyse vorbereitet, wobei die Induktionsdauer wie

bei den vorherigen Experimenten bei 30 Stunden für Tetrazyklin und bei 18

Stunden für 4-OHT lag. Es wurde der DNA-Gehalt von jeweils mindestens 50.000,

nach der Ernte in 70%igem Ethanol fixierten Zellen durch ein Becton-Dickinson

FACScalibur-Gerät ermittelt und somit eine Zuordnung der Zellen in ihre Phase im

Zellzyklus vorgenommen.

TOR7 Hygro1 TOR7 Zeo1 TOR7 Zeo2

Bmi-1

CDK2-Ktr.

- Tet 4-OHT Tet - Tet 4-OHT Tet - Tet 4-OHT Tet 4-OHT 4-OHT 4-OHT


Wie Abb. 4.7 zeigt, befanden sich in den unbehandelten Populationen 68,2% der

Zellen in der G0- bzw. der G1-Phase des Zellzyklus. Der Anteil apoptotischer Zellen

mit sub-diploidem DNA-Gehalt lag bei lediglich 1,4%. Die Aktivierung des E2F-1-

ER-Fusionsproteins führte zu einem Anstieg der Zellen in den Phasen S, G2 und

M des Zellzyklus auf Kosten diploider Zellen. Zudem war der Anteil apoptotischer

Zellen mit 8,1% deutlich erhöht. Im Gegensatz dazu bewirkte die Behandlung mit

Tetrazyklin alleine keine Veränderungen im Vergleich zu unbehandelten Zellen.

Weder zeigte sich ein Anstieg an apoptotischen Zellen noch ergab sich eine

Änderung der relativen Verteilung auf die Zellzyklusphasen. Somit waren die

Zellpopulationen, in denen gleichzeitig E2F-1 aktiviert und Bmi-1 überexprimiert

wurde, in ihrer Zellzyklusverteilung nicht von Zellpopulationen zu unterscheiden,

bei denen nur E2F-1 aktiviert worden war. Diese Daten erlauben den Schluss,

dass die Überexpression von Bmi-1 nicht ausreicht, um den Einfluss von E2F-1 auf

Neuroblastomzellen nachzuahmen.

A)

Tetrazyklin + 4-OHT

4-OHT

keine Induktion Tetrazyklin

62 4 Ergebnisse

B)

Abbildung 4.7: Die Überexpression von Bmi-1 beeinflusst weder die Zellzyklusverteilung noch die Apoptose. In der FACS-Analyse wurde nach 30-stündiger Induktion mit Tetrazyklin bzw. 18-stündiger Induktion mit 4-OHT der Anteil der Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen ermittelt. A) FACS-Diagramm. B) Prozentuale Verteilung der Zellen auf die einzelnen Zellzyklusphasen bzw. apoptotische Zellen.

4.3.4 Expression von Bmi-1 im Verlauf des Zellzyklus

Nach den Experimenten zur Ermittlung, ob eine erhöhte Bmi-1-Expression

Auswirkungen auf den Zellzyklus hat, wurde zur Beantwortung der Frage, ob die

Bmi-1-Expression abhängig vom Zellzyklus ist, der Arrest von TOR7-Zellen in der

G0-Phase nach Kontaktinhibition zeitgleich aufgehoben und die Zellen

anschließend zu unterschiedlichen Stundenwerten geerntet, um deren Bmi-1-

Gehalt zu bestimmen.

Voraussetzung für die Ermittlung der Bmi-1-Expression während der

unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus war eine Zellpopulation, die sich zum

Zeitpunkt der Messung nahezu vollständig in derselben Zyklusphase befinden

musste. Hierfür wurde das Verfahren der Synchronisation durch Kontaktinhibition


gewählt, für das TOR7-Zellen gleichmäßig in 10 cm-Zellschalen ausgesät und

kultiviert wurden, bis ein dichter, lückenloser Zellrasen entstand. Durch den

gegenseitigen Kontakt der Zellen wurde die Bildung zelleigener

Wachstumsfaktoren unterdrückt und somit der Austritt der Zellen aus der Phase G0

bzw. der Eintritt von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus verhindert. 48 h nach

Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen gepoolt, verdünnt ausplattiert und somit

die Kontaktinhibition aufgehoben, wobei die ersten Zellen bereits als 0 h-Wert für

die quantitative Realtime-PCR und die FACS-Analyse geerntet wurden. Die

anderen Zellen wurden entsprechend 4 h, 8 h, 12 h, 16 h und 20 h nach

Wiedereintritt in den Zellzyklus geerntet und ebenfalls für die quantitative Realtime-

PCR und die FACS-Analyse vorbereitet.

Abbildung 4.8: Zellzyklusverteilung von TOR7-Zellen 4 bzw. 20 Stunden nach Wiedereintritt in den Zellzyklus (FACS-Analyse). Die Zellen waren zuvor durch konfluentes Wachstum arrettiert worden und konnten anschließend durch verdünntes Ausplattieren in den Zellzyklus zurückkehren.

64 4 Ergebnisse

Zum Zeitpunkt der Ausplattierung der Zellen befanden sich fast 90% der Zellen im

diploiden DNA-Zustand, während in den Zellzyklusphasen S, G2 und M lediglich

9% der Zellen nachgewiesen werden konnten. Im Laufe der folgenden Stunden

verschob sich der Anteil der Zellen in der G0/G1-Phase zugunsten der anderen

Zellzyklusphasen. Allerdings war der Anteil an Zellen, die nach 20 Stunden in den

Zellzyklus zurückgekehrt waren, mit ca. 25% verhältnismäßig niedrig. Dies könnte

auf Schwierigkeiten bei der Rückführung der Zellen in den Zyklus durch evtl.

mangelnde Verdünnung bei der erneuten Ausplattierung hindeuten. Auch zeigt die

erhöhte Apoptoserate die erschwerten Kultivierungsbedingungen während der

Kontaktinhibition an, wobei sich im Zusammenhang mit den TOR-Zellen auch ein

Synchronisierungsversuch mit wachstumsfaktorfreiem Serum als problematisch

herausstellte. Hier kam es nach Entzug des wachstumsfaktorhaltigen Serums zu

einem raschen Absterben der Zellen, was auf den bestehenden Selektionsdruck

durch wechselnde Antibiotika zurückzuführen sein dürfte.

Die mRNA der zu den Stundenwerten 0 h, 4 h, 8 h, 12 h, 16 h und 20 h nach

Aufhebung der Kontaktinhibition geernteten Zellen wurde der Erststrangsynthese

und anschließend der quantitativen Realtime-PCR zugeführt. Auch hier wurde

neben einer Leerkontrolle jede cDNA in einem Doppelansatz mit jeweils den

entsprechenden Primern für BMI1, S14 und für CYCLIN E als Positivkontrolle

angesetzt. Cyclin E ist eine regulatorische Untereinheit von cyclinabhängigen

Proteinkinasen und wird Zellzyklus-spezifisch während der G1- und S-Phase

exprimiert. Darüber hinaus ist CYCLIN E ein direktes Zielgen von E2F (Duronio,

1995).

Wie zu erwarten war, stieg die relative Expression von CYCLIN E mit einem

Maximum von 8,8 nach 12 Stunden stark an. Diese deutlichen Unterschiede

zeigten sich bei den Werten für BMI1 mit einer relativen Expression von 0,4 bis 1,6

nicht. Schlussfolgernd darf man davon ausgehen, dass sich die Expression von

Bmi-1 nicht im Verlauf der Progression einer Zelle aus G0 in die S-Phase ändert.

4.4 Induktion der Polycombproteine Hpc2 und Ring1 durch E2F-1 65

Abbildung 4.9: Bmi-1 wird während der G1- bzw. G0-Phase und der S-Phase des Zellzyklus gleichmäßig exprimiert. In Zellen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Kontaktinhibition und Wiedereintritt in den Zellzyklus geerntet worden waren, wurde mittels qRT-PCR der Gehalt an BMI1 und an CYCLIN E als Positiv- kontrolle bestimmt.

4.4 Induktion der Polycombproteine Hpc2 und Ring1 durch E2F-1

E2F-1 induziert mehrere Gene wie EZH2 und EED, die Untereinheiten des zweiten

Polycombprotein-Komplex PRC2 kodieren (Bracken, 2003). Dagegen ist BMI1 das

bislang einzige Gen für ein Protein aus dem PRC1 (Christoph Kramps, persönliche

Mitteilung). Es stellte sich daher die Frage, ob die Expression auch weiterer

Proteine aus dem PRC1 durch E2F-1 induziert wird, da die einzelnen Proteine des

PRC1 jeweils unterschiedliche Auswirkungen auf Zellproliferation bzw.

Zellzyklusarrest haben.

66 4 Ergebnisse

Um diese Frage zu beantworten, wurde der Einfluss von E2F-1 auf zwei

ausgewählte Gene, HPC2 und RING1, untersucht. Es wurde von 1A3-Zellen, die

mit 4-OHT induziert worden waren, in Doppelansätzen eine quantitative Realtime-

PCR erstellt, wobei neben den Primern für HPC2 und RING1 auch die Primer für

das Protein S14 eingesetzt wurden, um eine Normalisierung der Werte vornehmen

zu können. Die Zellen wurden zu unterschiedlicen Zeitpunkten nach Induktion

geerntet, um Informationen über den Expressionsverlauf zu erhalten.

Während für das Protein Ring1 keine Induktion zu erkennen war, kam es beim

Protein Hpc2 zu einer transient schwachen Induktion, die jedoch innerhalb von 12

h wieder nahezu den Ausgangswert erreichte (Abb. 4.10).

Abbildung 4.10: Transient gesteigerte bzw. unwesentlich veränderte Expression von HPC2 bzw. RING1 nach Induktion von E2F-1. Zellen, in denen zuvor das E2F-1-ER- Fusionsprotein durch 4-OHT aktiviert worden war, wurden anschließend zu unterschiedlichen Zeitpunkten geerntet und mittels qRT-PCR ihr Gehalt an HPC2- bzw. RING1-RNA überprüft, um deren mögliche Rolle als Zielgene von E2F-1 zu klären.

5 Diskussion

5.1 Etablierung eines Zellsystems mit induzierbarer Bmi-1-

Expression

BMI1 wird durch E2F-1 induziert (Nowak, 2006), wobei jedoch unklar war, ob für

die bekannten Effekte von E2F-1 wie Initiation von Apoptose und S-Phaseneintritt

von Zellen BMI1 als essentieller Mediator fungiert. Um einen Teil dieser Effekte

rekapitulieren oder andere Auswirkungen einer erhöhten Bmi-1-Akkumulation in

humanen Neuroblastomzellen (SK-N-SH-EP) beschreiben zu können, wurde zu

Beginn der vorliegenden Dissertation ein Zellsystem etabliert, das als Reaktion auf

ein externes Signal (Tetrazyklin) die Expression von Bmi-1 steigerte.

Das T-REx-System des 1A3-Klons TOR (Kornelius Kerl, persönliche Mitteilung)

erlaubte eine stärkere Induktion von BMI1 und fand daher in den

Folgeexperimenten Anwendung.

Bei solitärer Induktion der endogenen Bmi-1-Expression durch 4-OHT auf das im

Mittel 4,3-fache und solitärer Induktion der exogenen Bmi-1-Expression durch

Tetrazyklin auf das im Mittel 9,8-fache wäre bei gemeinsamer Induktion ein

Summationseffekt zu erwarten gewesen, der jedoch nicht beobachtet werden

konnte. Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass durch 4-OHT freigesetztes E2F-1

oder eines seiner Zielgene unter Umständen die Bildung des Tet-Repressors oder

seine Bindung an die Operatorsequenz fördert und damit die Ablesung des

nachfolgenden Genabschnitts verhindert. Man könnte daher in weiteren

Experimenten versuchen, diesen Effekt durch eine höhere Konzentration von

Tetrazyklin und somit verstärkter Hemmung des Tet-Repressors zu umgehen.

Es erscheint zunächst naheliegend, dass keine anderen Gründe für den

reprimierenden Effekt bei simultaner Induktion vorliegen, da sich das Prinzip der

Bmi-1-Anreicherung lediglich durch die vorgeschaltete E2F-1-Induktion

unterscheidet. Außerdem übertraf die Bmi-1-Menge nach simultaner Induktion die

Menge nach solitärer Induktion durch 4-OHT, erreichte jedoch nicht die Bmi-1-

68 5 Diskussion

Akkumulation nach solitärer Induktion durch Tetrazyklin. Allerdings wäre eine

Rückkopplungsschleife denkbar, mit Hilfe derer Bmi-1 seine eigene Synthese

kontrolliert. In diesem Fall würde die exogene Bmi-1-Anreicherung einen

Schwellenwert überschreiten und in Folge die Synthese des endogenen Bmi-1

reprimieren.

Eine weitere Möglichkeit, den Effekt der unerwünschten Einflussnahme zu

umgehen, wäre die Verwendung eines anderen Zellsystems wie z.B. die o.g. Tet-

21-Zellen. Für zukünftige Experimente mit erhöhter Bmi-1-Menge in

Neuroblastomzellen sollte somit vorerst auf das rein Tetrazyklin-gesteuerte System

zurückgegriffen werden, da dieses die stärksten Ergebnisse sowohl auf mRNA- als

auch auf Proteinebene lieferte.

weitere

Zielgene

E2F-14-OHT Tet-RepressorBmi-1 Tetrazyklin

?

? ?

Abbildung 5.1: Vereinfachte Darstellung der simultanen Induktion der E2F-Aktivität und Bmi-1- Expression mit 4-OHT und Tetrazyklin in den verwendeten Neuroblastomzelllinien. Aufgezeigt werden hier mögliche Fakoren, die bei gleichzeitigem Einsatz von 4-OHT und Tetrazyklin die Bmi-1-Expression hemmen könnten.

5.2 Bmi-1-Überexpression ohne Auswirkung auf S-Phase und Apoptose 69

5.2 Bmi-1-Überexpression ohne Auswirkung auf S-Phase und

Apoptose

Die Messung der auf gleiche Weise vorbehandelten Zellen in der FACS-Analyse

ergab erwartungsgemäß jeweils einen erhöhten Anteil an Zellen in der S-Phase

sowie an apoptotischen Zellen nach Induktion mit 4-OHT und damit gesteigerter

E2F-1-Aktivität (Denchi, 2005; DeGregori, 2002; Stevaux, 2002; Trimarchi, 2002;

Kramps, 2004). Trotz bekannter Repression des Ink4a-Arf-Lokus hatte weder die

erhöhte Expression von Bmi-1 durch Induktion von E2F-1 noch die Überexpression

von Bmi-1 durch Induktion mit Tetrazyklin einen Einfluss auf die Stimulation des S-

Phaseneintritts bzw. die Apoptose-Rate der Neuroblastomzellen. Zum einen

könnte der Einfluss von E2F-1 auf S-Phase und Apoptose völlig unabhängig von

Bmi-1 ablaufen. Zum anderen ist die Bmi-1-Menge unbekannt, die für die

Ausübung aller Funktionen benötigt wird. Die natürlicherweise in den

Neuroblastomzellen vorkommende Bmi-1-Konzentration könnte also bereits

ausreichend sein, so dass das zusätzlich induzierte Protein keinen detektierbaren

Effekt zeigt. Um diese Überlegungen zu verifizieren, wäre zunächst die Etablierung

eines zellulären Systems erforderlich, in dem funktionstüchtiges Bmi-1 entweder

durch den Einsatz der Deletionsmutante Bmi-1-ΔRF oder durch RNA-Interferenz

unterdrückt wird. Letzteres wurde zwischenzeitlich bei Neuroblastomzellen

angewendet, wobei im Vergleich zur Kontrolle ein verlangsamtes Zellwachstum

und eine erhöhte Apoptoserate nach 3 Tagen beobachtet werden konnte (Liu,

2006), was die These eines relativ niedrigen Schwellenwertes für die Ausübung

der Bmi-1-Effekte unterstützen würde. Ob auch die Fähigkeit von E2F-1, in Zellen

den Übertritt in die S-Phase des Zellzyklus zu initiieren, von der Abwesenheit des

Bmi-1-Proteins beeinflusst wird, könnte in Folgeexperimente untersucht werden.

Zudem wären im Vergleich mit Zellen, in denen die Bmi-1-Expression vollständig

unterdrückt wurde, die Auswirkungen unterschiedlich hoher Bmi-1-Konzentrationen

ermittelbar. Festzustellen ist jedoch zum jetzigen Zeitpunkt, dass eine über das

70 5 Diskussion

natürliche Maß hinaus gesteigerte Bmi-1-Akkumulation in Neuroblastomzellen

nicht zu verändertem Zellzyklusverhalten führt.

E2F-1

S-Phase

Apoptose

Bmi-1

?

Abbildung 5.2: Mögliche Einflussnahme von Bmi-1 auf E2F-1-gesteuerte Funktionen.

5.3 Bmi-1-Expression verläuft unabhängig von Zellzyklus-

Progression

Bmi-1 wird unabhängig von der Progression einer Zelle aus der G0- in die S-Phase

des Zellzyklus exprimiert. Bei der durch Kontaktinhibition synchronisierten

Zellpopulation von TOR-Neuroblastomzellen wurde der Zellarrest in der G0-/G1-

Phase zeitgleich aufgehoben, wobei das synchrone Verhalten der Zellpopulation

mit Hilfe von Cyclin-E-Primern dokumentiert wurde. Die entsprechenden

Stundenwerte der relativen mRNA-Menge von BMI1 schwankten zwischen 0,4 und

1,4, so dass eine Abhängigkeit der Bmi-1-Expression von den untersuchten

Zellzyklusphasen ausgeschlossen werden kann. Dies überrascht insofern, als eine

Reihe von E2F-1-regulierten Genen eine Zellzyklus-abhängige Expression zeigen

(Dimova, 2005; DeGregori, 2002). Zudem sind auch die direkten Effekte von Bmi-1

auf den Zellzyklus durch seinen reprimierenden Einfluss auf die CDKI p16Ink4a und

p19Arf bekannt. Die Inhibition von p16Ink4a führt u.a. zur vermehrten

Phosphorylierung von pRB und damit zur Aktivierung der E2F-Zielgene, sowie der

Induktion von S-Phaseneintritt und Apoptose. Die Inhibition von p19Arf fördert

Mdm2 und hemmt damit p53, sowie die durch p53 vermittelten Effekte wie

Apoptose und Zellzyklusarrest (Pomerantz, 1998).

5.3 Bmi-1-Expression verläuft unabhängig von Zellzyklus-Progression 71

Diese Effekte könnten jedoch auch durch posttranskriptionelle

Proteinmodifikationen hervorgerufen werden. Von Bmi-1 ist bekannt, dass es

Zellzyklus-abhängig phosphoryliert wird. Hypophosphoryliertes Bmi-1 in der G1-/S-

Phase ist chromatingebunden, während hyperphosphoryliertes Bmi-1 in der G2-/M-

Phase vom Chromatin dissoziiert (Voncken, 1999). Ob weitere Modifikationen

insbesondere zwischen der G0- und der G1-/S-Phase stattfinden, und ob

fehlerhafte Modifikationen zu verändertem Zellzyklusverhalten führen, ist bislang

unbekannt und sollte in weitergehenden Experimenten untersucht werden.

Darüber hinaus findet man in der Literatur Hinweise darauf, dass sowohl bei

kontaktinhibierten als auch bei Zellen, die durch Entzug von Wachstumsfaktoren

oder Überexpression von p16Ink4a arretiert wurden, der Transkriptionsfaktor E2F-4

und das Pocketprotein p130 mit dem BMI1-Promoter interagieren und somit

möglicherweise die BMI1-Expression behindern (Cam, 2004). Dieser Effekt konnte

jedoch zumindest für die Überexpression von p16Ink4a in humanen

Neuroblastomzellen (IMR-32) nicht bestätigt werden (Nowak, 2006).

Abbildung 5.3: Vereinfachtes Schema eines möglichen Netzwerkes von onkogenen Transkriptionsfaktoren im Neuroblastom und ihre Funktionen im Zellzyklus.

E2F-1 pRbBmi-1 p16

p53p19Myc

Proliferation / Transformation

Zielgene ?

Apoptose

CyclinCDK

72 5 Diskussion

5.4 Hpc2 und Ring1 werden nicht stabil durch E2F-1 induziert

Mehrere Mitglieder des Polycomb-Proteinkomplexes 2 (PRC2) werden von E2F-1-

Zielgenen kodiert, wohingegen aus dem PRC1 bislang nur für Bmi-1 eine Induktion

durch E2F-1 nachgewiesen werden konnte (Muller, 2001; Bracken, 2003). 1A3-

Neuroblastomzellen, die zu unterschiedlichen Stundenwerten nach Induktion mit 4-

OHT und in Folge dessen gesteigerter E2F-1-Aktivität geerntet worden waren,

wurden auf erhöhte Amplifikation der beiden PRC1-Proteine Ring1 und Hpc2

untersucht.

Ring1, Hpc2 und Bmi-1 interagieren miteinander und bestimmen so die

Zusammensetzung des PRC1 (Satijn, 1999a), wobei hier besonders Ring1 (A und

B) und Bmi-1 die Funktion des PRC als Ubiquitin-E3-Ligase festlegen, die Histon

H2A am Lysin 119 monoubiquitiniert (Wang, 2004). Hpc2 interagiert mit dem Rb-

Protein und induziert einen HDAC-unabhängigen Zellzyklusarrest (Dahiya, 2001).

Es enthält zwei konservierte Domänen, bei der die N-ständige Chromodomäne für

die Bindung des Proteins an Chromatin verantwortlich ist (Muller, 1995). Die C-

ständige Domäne ist vermutlich für die Interaktion mit Ring1 mitverantwortlich und

sorgt somit für die Repression der Genaktivität (Bunker, 1994). Hpc2 und Ring1

üben darüber hinaus unterschiedliche Effekte aus. Die Überexpression von Hpc2

führte zu einer Unterdrückung von c-Myc, die Überexpression von Ring1 dagegen

resultierte in Zelltransformation und der Induktion von Tumoren in Nacktmäusen.

Diese Entwicklungen waren zudem von einer starken Erhöhung der Onkoproteine

c-Jun und c-Fos begleitet, was den Verdacht bestärkt, HPC2 als

Tumorsuppressorgen, RING1 dagegen als klassisches Onkogen anzusehen

(Satijn, 1999b).

Die relative mRNA-Menge betrug für RING1 zwischen 0,7 und 0,9, womit

ausgeschlossen werden kann, dass es ein Zielgen von E2F-1 ist. Ring1 verstärkt

also nicht das onkogene Potential von E2F-1 auf direkte Weise. Ob andere

Verbindungen zwischen ihnen existieren, oder ob kritische, regulatorische

Proteinfunktionen durch die Monoubiquitinierung durch das Zusammenspiel von

Bmi-1 und Ring1 ausgelöst werden, werden Folgeexperimente ergeben.

5.5 Ausblick 73

Die relative Expression erreichte für HPC2 auf mRNA-Ebene nach 4 h mit 5,3 ihren

Höhepunkt und kehrte nach 12 h mit 1,8 nahe zum Ausgangswert zurück. Diese

relativ schwache und lediglich transiente Steigerung der Expression lässt nicht auf

eine direkte Induktion durch E2F-1 schließen. Eher wahrscheinlich erscheint eine

Rückkopplungsschleife, bei der die kurzfristige Steigerung an HPC2-mRNA durch

andere Faktoren ausgelöst wurde und Hpc2 sich im Sinne eines negativen

Regulationsprozesses anschließend selbst hemmt. Ob diese transiente Steigerung

an Hpc2 einen Einfluss auf das Zellverhalten hat, könnte in Überexpressions- und

Funktionsverlustansätzen überprüft werden. Auch die Faktoren, die eine

Steigerung der messbaren Hpc2-Menge hervorrufen, sollten hierbei genauer

untersucht werden. Ein möglicher Erklärungsansatz wäre die verstärkte Bindung

von pRb durch das nach Induktion freigesetzte E2F-1 und damit behinderte

Komplexbildung von Hpc2 und dem Rb-Protein (Dahiya, 2001). Untersuchungen

durch den Einsatz von Microarrays könnten die Frage klären, welche Zielgene

Hpc2 induziert, und ob sich hier ein Zusammenspiel mit E2F oder Bmi-1 findet.

5.5 Ausblick

Um das bislang nur lückenhafte Verständnis des Onkogens BMI1 und seines

Proteins als Ziel und Ausgangspunkt genetischer Prozesse zu erweitern, erscheint

es sinnvoll, ein zelluläres System zu etablieren, in dem die Bmi-1-Expression durch

den Einsatz der ΔRF-Deletionsmutante oder siRNA unterdrückt wird. Hierdurch

könnten die Effekte eines fehlenden oder erniedrigten Bmi-1-Spiegels in

Neuroblastomzellen erfasst werden und in Kontext zur erhöhten Expression

gesetzt werden. Darüber hinaus könnte eine Untersuchung mit Microarrays

Hinweise auf weitere, bislang unentdeckte Zielgene von Bmi-1 geben, die

wiederum in Zusammenschau mit dem bisher bekannten Bmi-1-Netzwerk zu

betrachten wären. Dabei ist aber auch die Bmi-1-Interaktion mit anderen PcG-

Proteinen und die daraus resultierende Zusammensetzung der PRCs zu

bedenken, da nur vor dem Hintergrund dieser Komposition die Funktionsweise von

Bmi-1 nachvollziehbar sein wird. Ob diese Zusammenhänge dann jedoch auch auf

74 5 Diskussion

andere Zell- und Tumorzellsysteme als die untersuchten humanen

Neuroblastomzellen zu übertragen wären, bliebe abzuwarten. Letztendlich werden

aber nur in-vivo-Experimente klären können, ob und in wieweit die Überexpression

des Proteins Bmi-1 Auswirkungen auf die Entstehung und Malignität von

Neuroblastomen sowie weiterer Tumoren in Gesamtorganismen hat.

.

6 Zusammenfassung Der Transkriptionsfaktor Bmi-1 ist Bestandteil des Polycomb-Proteinkomplexes

PRC1 und wird beim Menschen in verschiedenen Karzinomen überexprimiert. Das

kodierende Onkogen BMI1 ist ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors E2F-

1, der eine zentrale Rolle in der Regulation von Zellzyklus und programmiertem

Zelltod spielt. Um die Frage zu beantworten, ob und inwieweit Bmi-1 an einzelnen

Teilfunktionen von E2F-1 beteiligt ist, wurde auf der Basis einer humanen

Neuroblastom-Zelllinie ein Zellsystem etabliert, in dem die Expression von BMI1

reversibel induziert werden konnte. Die Prognose des Neuroblastoms, eines

häufigen Tumors des kindlichen Nervensystems, korreliert u.a. mit der

Überexpression mehrerer E2F-Zielgene wie z.B. MYCN und MAD2.

Die Neuroblastom-Zellen zeigten nach Induktion eine bis zu 10-fache Erhöhung

der Bmi-1-Expression. Im Gegensatz zu isogenen Zellen, in denen E2F-1 aktiviert

wurde, ergab sich jedoch keine Änderung im Zellzyklusverhalten oder bei der

Apoptoserate. Dies spricht dagegen, dass die Überexpression von Bmi-1 in

Neuroblastomzellen ausreicht, um E2F-1-regulierte, genetische Programme zu

aktivieren. Andererseits könnte in diesen Zellen die Menge an endogenem Bmi-1

bereits ausreichend gewesen sein, um seine Aufgaben zu erfüllen. In zukünftigen

Experimenten sollen daher auch Ansätze verwendet werden, die die Funktion des

endogenen Bmi-1-Proteins hemmen.

Bmi-1 wirkt durch die Inhibition von p16Ink4a und p19Arf fördernd auf

Zellzyklusprozesse ein. Im Gegensatz zu vielen anderen E2F-regulierten Genen

wird BMI1 allerdings während der G1- bzw. G0-Phase und der S-Phase des

Zellzyklus gleichmäßig exprimiert, was in einer synchronisierten Population von

Neuroblastomzellen nachgewiesen werden konnte.

Die Polycombproteine Bmi-1, Ring1 und Hpc2 interagieren miteinander, üben

jedoch unterschiedliche, teilweise sogar gegensätzliche Effekte aus. Bei den von

mir untersuchten PRC1-Proteinen Ring1 und Hpc2 fand sich keine bzw. lediglich

eine transiente Steigerung nach Induktion von E2F-1. BMI1 ist demnach das

76 6 Zusammenfassung

einzige Gen für eine Komponente des Polycomb-Proteinkomplexes PRC1, das

durch E2F-1 reguliert wird. Nach vorherrschender Meinung wird die molekular-

biologische Funktion eines Polycomb-Proteinkomplexes durch seine

Zusammensetzung bestimmt. Weil E2F-1 nicht die Gesamtmenge des Komplexes,

sondern die relative Menge verschiedener Proteine im Komplex festlegt, könnte

auf diese Weise die Begünstigung von Zellproliferation durch E2F-1 erklärt werden.

Dieses Ergebnis festigt die Position von E2F-1 als herausragender Regulator

zellulärer Prozesse, dessen Einfluss sich über viele genetische Programmabläufe

erstreckt.

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8 Abkürzungen Sofern nicht hier aufgeführt, wurden Abkürzungen entsprechend den Maßangaben der IUPAC (International union of pure and applied chemistry) und denen des SI-Systems (System Internationale de l´Unité) verwendet.

Spezielle Abkürzungen für Fachtermini, die nicht in dieser Liste enthalten sind, werden jeweils im Text erläutert.

AK Antikörper

APS Ammoniumperoxodisulfat

ARF alternative reading frame

ATP Adenosintriphosphat

bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin

C Cytosin

°C Grad Celsius

Cdc cell division cycle

CDKI cyclin dependent kinase inhibitor

Cdk cyclin dependent kinase

cDNA complementary DNA

CMV Cytomegalovirus

Cys Cystein

Da Dalton

dATP 2'-Desoxyadenosintriphosphat

dCTP 2'-Desoxycytidintriphosphat

dGTP 2'-Desoxyguanosintriphosphat

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

dTTP 2'-Desoxythymidintriphosphat

DMEM Dulbecco´s modification of Eagle´s minimal essential

medium

8 Abkürzungen 91

DMSO Dimethylsulfoxid

dn dominant negativ

DNA deoxyribonucleic acid

DTT Dithiothreitol

ECL™ enhanced chemoluminescence

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ER estrogen receptor

FACS fluoresence activated cell sorting

FCS fetal calf serum

G Guanosin

GFP green fluorescent protein

G1-Phase Gap1-Phase

G2-Phase Gap2-Phase

GTP Guanosintriphosphat

Gy Gray

HBS Hepes-gepufferte Salzlösung

HEPES N2-Hydroxyethylpiperazin-N2-Ethansulfonsäure

Ink4 inhibitor of kinase 4

5-JÜR 5-Jahres-Überlebensrate

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

Ktr. Kontrolle

L Liter

LB Luria-Bertani-Medium

m milli

M molar

min Minute

Myc Myelocytomatose Protein

mRNA messenger RNA

µ mikro

92 8 Abkürzungen

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS phosphate buffered saline

PCR polymerase chain reaction

PVDF Polyvinylidendifluorid

qRT-PCR quantitative Realtime-PCR

Rb Retinoblastom

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

U/min Umdrehungen pro Minute

RT Raumtemperatur

RT reverse Transkription

SDS sodium dodecyl sulfate

S-Phase Synthese-Phase

STET Sucrose Triton EDTA

TAE Tris-Acetat/EDTA-Puffer

TBS Tris-gepufferte Salzlösung

TBS-T Tris-gepufferte Salzlösung mit Tween-20

TE Tris/EDTA (Puffer)

TEMED Tetramethylethyldiamin

Tet Tetracyclin

Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan

U/min Umdrehungen pro Minute

v/v volume to volume

w/o without

WT Wildtyp

w/v weight per volume

9 Verzeichnis der akademischen Lehrer Meine akademischen Lehrer waren die Damen und Herren in Marburg:

Aumüller, Austermann, Basler, Baum, Beato, Behr, Bertalanffy, Bien, Daut, Eilers,

Engenhart-Cabillic, Fruhstorfer, Fuchs-Winkelmann, Geus, Gotzen, Gress,

Grzeschik, Gudermann, Happle, Hasilik, Herrmann-Lingen, Hertl, Hofmann, Hoyer,

Jones, Kern, Kill, Klenk, Klose, Koolmann, Kretschmer, Krieg, Kroll, Lenz, Lill,

Lorenz, Maier, Maisch, Moll, Moosdorf, Mueller, Müller, Neubauer, Oertel,

Pagenstecher, Remschmidt, Renz, Rothmund, Schäfer, Schmidt, Schnabel,

Schüffel, Schulz, Seitz, Seyberth, Vogelmeier, Wagner, Weihe, Werner, v. Wichert,

Wulf

sowie in Aachen:

Borggrefe, Gatzen, Kusche, Möllhoff, Nagel, Paes

10 Danksagung Mein Dank geht an PD Dr. Werner Lutz für die Überlassung des Themas, seine

jederzeit bereitwillige Hilfe und die unermüdlichen Erläuterungen

molekularbiologischer Zusammenhänge. Seiner Unterstützung und Geduld

verdanke ich die Fertigstellung meiner Arbeit.

Ebenfalls bedanken möchte ich mich bei Prof. Dr. Martin Eilers für die vorbildliche,

wissenschaftliche Leitung der Abteilung.

Für die herzliche Aufnahme in das Team und die Einführung in die Laborarbeit

danke ich der Arbeitsgruppe des Labors Nr. 117. Durch Kornelius Kerl, Sven

Gallinat, Andreas Hock, Jens-Peter Reese und Sovana Adhikary werden mir die

vielen lehrreichen, aber auch die manchmal nicht allzu ernsthaften Momente am

IMT in sehr guter Erinnerung bleiben. Auch bei den anderen Mitarbeitern der

Abteilung bedanke ich mich für die stets angenehme Atmosphäre.

Ein Dank besonderer Art geht an meine Familie, meine Freunde und nicht zuletzt

meine Freundin Silke für die Unterstützung in jeder Situation und die Motivation,

diese Arbeit zu einem erfolgreichen Ende zu führen.

Documents

Rolle des Onkoproteins Bmi-1 im Neuroblastomarchiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2007/0553/pdf/ddf.pdf · Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG 7 1.1 Das Neuroblastom 7 1.1.1 Histologie 7 1.1.2