Ruhr-Universität Bochum PD Dr. med. A. M. Müller Dienstort ... · PECAM-1 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule PFA Paraformaldehyd PMN Polymorphonuclear Leukocytes (= Granulozyten)

Ruhr-Universität Bochum PD Dr. med. A. M. Müller

Dienstort: Klinikum der Johann-Gutenberg-Universität Mainz Abteilung für Kinderpathologie

VE-Cadherin in humanen Lungen mit septisch bedingtem ARDS und endothelialen Zellkulturen

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer

Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Martina Christina Herwig

aus Dortmund 2006

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Priv. Doz. Dr. med. A. M. Müller Koreferent: Prof. Dr. med. J. Guzman y Rotaeche Tag der mündlichen Prüfung: 28.11.2006

Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung

1.1 Das Blutgefäßsystem der Lunge ....................................................................................1 1.1.1 Vasa publica 1.1.2 Vasa privata 1.2 Endothel .........................................................................................................................3 1.2.1 Endotheliale Zelladhäsionsmoleküle 1.2.2 Metabolische Aktivität des Endothels 1.2.3 Endothelzellaktivierung 1.2.3.1 Endothelzellaktivierung bei Sepsis 1.2.3.2 Leukozytenadhäsion 1.2.4 Heterogenität der Endothelzellen 1.3 Zelladhäsion...................................................................................................................9 1.4 Zytoskelett ...................................................................................................................10 1.5 VE-Cadherin ................................................................................................................11 1.5.1 Charakterisierung 1.5.2 Aufbau 1.5.3 Verknüpfung mit dem Zytoskelett 1.5.4 Regulation 1.5.5 Funktionen 1.5.6 VE-Cadherin-vermittelte Zelladhäsion im Rahmen einer Entzündungsreaktion 1.6 Sepsis ...........................................................................................................................25 1.6.1 Definition und klinisches Bild 1.6.2 Pathophysiologie 1.7 ARDS...........................................................................................................................28 1.7.1 Ätiologie 1.7.2 Pathogenese unter Berücksichtigung der Pathophysiologie 1.7.3 Klinisches Bild 1.7.4 Prognose 1.7.5 IRDS 1.8 Endothelzellkulturen....................................................................................................34 1.9 LPS...............................................................................................................................35 1.9.1 Charakterisierung 1.9.2 Struktur 1.9.3 Pathophysiologie 1.9.4 Funktion 1.9.5 Bedeutung im Hinblick auf die Sepsis 1.10 TNFα ..........................................................................................................................40 1.10.1 Charakterisierung 1.10.2 Expression 1.10.3 Rezeptoren 1.10.4 Funktionen 1.10.5 Bedeutung im Hinblick auf ARDS und Sepsis 1.10.6 Klinische Bedeutung 1.11 IFNγ (Interferon-gamma) ..........................................................................................44 1.11.1 Interferone 1.11.2 Aufbau 1.11.3 Funktion

1.11.4 Regulation 1.11.5 Bedeutung im Hinblick auf die Sepsis 1.12 Fragestellung..............................................................................................................47 2 Material und Methoden

2.1 Material ........................................................................................................................50 2.1.1 Lungengewebe 2.1.2 Zellkulturen 2.2 Methoden .....................................................................................................................53 2.2.1 Immunhistochemische Aufarbeitung 2.2.1.1 Vorbehandlung 2.2.1.2 VE-Cadherin-Färbung 2.2.1.3 Isotypkontrolle 2.2.1.4 CD31-Färbung 2.2.1.5 Farbentwicklung 2.2.1.6 Gegenfärbung 2.2.2 Zellkultur

2.2.2.1 Kultivierung humaner pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen (HPMEC)

2.2.2.2 Kultivierung humaner Umbilicalvenen-Endothelzellen (HUVEC) 2.2.2.3 Stimulation 2.2.2.4 Immunzytochemische Fluoreszenzfärbung 2.2.3 Antikörper 2.3 Auswertung..................................................................................................................61 2.3.1 Auswertung der Lungengewebsproben 2.3.1.1 Färbungsintensität der Endothelzellen 2.3.1.2 Einteilung der Patienten 2.3.2 Auswertung der Zellkulturen 3 Ergebnisse

3.1 In-situ Befunde ............................................................................................................65 3.1.1 VE-Cadherin-Antigenexpression in den verschiedenen Gefäßtypen 3.1.1.1 Alle Proben 3.1.1.2 Kontrollgruppe "Frauen" und "Männer" 3.1.1.3 Kindergruppe 3.1.1.4 Patienten mit Sepsis 3.1.1.5 Patienten mit IRDS 3.1.1.6 Unterschiede zwischen den einzelnen Gefäßtypen

3.1.2 VE-Cadherin-Expression der Sepsisgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe 3.1.2.1 Lungengewebe von Patienten mit Sepsis 3.1.2.2 Vergleich der Gruppe "gesund" und "krank"

3.1.2.3 Vergleich der VE-Cadherin-Werte Erwachsener mit regelrechtem Lungengewebe und Erwachsener mit Zeichen eines septisch bedingten ARDS nach dem Kriterium "gesund – krank"

3.1.3 Einfluss des Geschlechts auf die VE-Cadherin-Expression 3.1.3.1 Gesamtkollektiv

3.1.3.2 Kontrollgruppe 3.1.3.3 Gruppe der an septischem Multiorganversagen verstorbenen Patienten

3.1.4 Einfluss des Alters auf die VE-Cadherin-Expression 3.1.4.1 Untersuchung aller 78 Patienten, verteilt auf vier Altersgruppen 3.1.4.2 Vergleich der Lungengewebsproben gesunder Erwachsener mit denen

gesunder Kinder

3.1.5 VE-Cadherin-Antigenexpression in Abhängigkeit vom Obduktionszeitpunkt 3.1.6 Zusammenfassung der in situ-Ergebnisse 3.2 Zellkulturen..................................................................................................................87 3.2.1 Expression von VE-Cadherin in HPMEC 3.2.1.1 Unstimulierte HPMEC 3.2.1.2 Vierstündige Stimulation 3.2.1.3 24-stündige Stimulation 3.2.1.4 Zusammenfassung 3.2.2 Expression von VE-Cadherin in HUVEC 3.2.2.1 Unstimulierte HUVEC 3.2.2.2 Vierstündige Stimulation 3.2.2.3 24-stündige Stimulation 3.2.2.4 Zusammenfassung 3.2.3 Vergleich der VE-Cadherin-Antigenexpression bei HPMEC und HUVEC 4 Diskussion

4.1 Charakterisierung der VE-Cadherin-Antigenexpression entlang der Lungenstrombahn .....................................................................................................................................97

4.1.1 Heterogenität der Endothelzellen bezüglich Morphologie und Expression funktionsbestimmender Moleküle

4.1.2 Heterogenität des Endothels in Abhängigkeit von der endothelialen Barrierefunktion

4.1.3 Einfluss eines Lungentumors auf die VE-Cadherin-Expression 4.2 VE-Cadherin-Antigenexpression in regelrechtem Lungengewebe und Lungengewebe

bei septisch bedingtem ARDS ...................................................................................102 4.2.1 Zusammenhang zwischen verminderter VE-Cadherin-Expression und

Endothelpermeabilität 4.2.2 Einfluss weiterer Faktoren auf die VE-Cadherin-Expression 4.2.3 Reaktivität des septischen Lungengewebes 4.3 VE-Cadherin-Antigenexpression bezogen auf Geschlecht und Alter .......................104 4.4 VE-Cadherin-Antigenexpression bezogen auf den Zeitraum zwischen Todeseintritt und Obduktionszeitpunkt...........................................................................................105 4.5 IRDS ..........................................................................................................................106 4.6 Kritische Anmerkungen zur VE-Cadherin-Untersuchung in situ..............................107 4.7 VE-Cadherin-Antigenexpression in Zellkulturen (HPMEC und HUVEC)...............108 4.8 VE-Cadherin-Antigenexpression in unstimulierten Zellkulturen im Vergleich zu stimulierten Zellkulturen............................................................................................110 4.8.1 Analyse der Stimulationsfaktoren 4.8.1.1 Stimulation mit TNFα 4.8.1.2 Stimulation mit IFNγ 4.8.1.3 Stimulation mit IFNγ plus TNFα 4.8.1.4 Stimulation mit LPS 4.8.2 Verbesserung der Zellkulturversuche 4.9 Zellkulturen (HPMEC und HUVEC) als Modell für die VE-Cadherin-Expression in humanem Lungengewebe ..........................................................................................115 4.10 Zusammenfassung ...................................................................................................117 4.11 Regulation von VE-Cadherin...................................................................................118 4.11.1 Pathomechanismus der Reduktion der VE-Cadherin-Antigenexpression 4.11.2 Phosphorylierung und Dephosphorylierung 4.11.3 Internalisation / Endozytose 4.11.4 Proteolyse 4.11.5 Diffusion

4.11.6 Spaltung der Zell-Zell-Verbindungen 4.11.7 Gegenüberstellung der verschiedenen Theorien 4.12 Leukozytentransmigration ......................................................................................124 4.12.1 Transmigration 4.12.2 "real time"-Transmigration 4.12.3 Einfluss auf das Lungengewebe 4.13 Vergleich systemischer Kreislauf zu Lungenkreislauf ............................................127 4.14 Ausblick ...................................................................................................................128 5 Zusammenfassung .........................................................................................................129 6 Literaturverzeichnis ......................................................................................................131

7 Danksagung ....................................................................................................................144

8 Lebenslauf.......................................................................................................................145

Abkürzungsverzeichnis ABC-Methode Avidin-Biotin-Komplex-Methode ACCP/SCCM Consensus Conference des American College of Chest Physicians /

der Society of Critical Care Medicine ACE Angiotensin Converting Enzyme ALI Acute Lung Injury Aqua dest. destilliertes Wasser ARDS Acute Respiratory Distress Syndrome BAL bronchioloalveoläre Lavage BSA Bovine Serum Albumin = Rinderserumalbumin Ca2+ Kalzium CAL Calmodulin CAM Zelladhäsionsmoleküle CAR Cell Adhesion Recognition CHO Chinese Hamster Ovary Cells CO2 Kohlenstoffdioxid CSA Colony-Stimulating Activity CSF Colony-Stimulating Factor DAB 3,3-Diaminobenzidin Dsh Dishevelled E-Cadherin Epithelial Cadherin ECGS Endothelial Cell Growth Supplement EDTA Ethylen-Diamin-Tetracetat ELISA Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Essay ET-1 Endothelin 1 EvG-Färbung Elastica van Giesson-Färbung FCS Fetal Calf Serum GDP Guanosyldiphosphat GTP Guanosyltriphosphat H2O2 Wasserstoffperoxid HCL Salzsäure HDL High Density Lipoprotein HE-Färbung Hämalaun-Eosin Färbung HMEC Human Dermal Microvessel Endothelial Cells HPMEC Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1 IQGAP1 Calmodulin-Binding Domain GAP 1 IFNγ Interferon gamma IL Interleukin IRDS Infant Respiratory Distress Syndrome KCl Kaliumchlorid KDa Kilodalton kg Kilogramm LBP Lipopolysaccharid Binding Protein LDL Low Density Lipoprotein LPS Lipopolysaccharid M Mol M-Cadherin Muscle Cadherin MHC Major Histocompatibility Complex

MVEC Pulmonary Microvascular Endothelial Cells NaCl Natriumchlorid N-Cadherin Neuronal Cadherin NO Nitric Oxide (Stickstoffmonoxid) O2 Sauerstoff p0071 Plakophilin-4 p120ctn p120-Catenin PAF Platelet-Activating-Factor PaO2 Sauerstoffpartialdruck PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung PC + 15% FKS bFGF/Hep

PC (= Endothelial Cell Growth Medium (ECGM-MV) von PromoCell (PC, BestellNr. C-90320)) mit 15% FCS, dem Wachstumsfaktor bFGF (basic FGF), Heparin in der Konzentration von 2,5ng bFGF und 10µg Heparin

P-Cadherin Placental Cadherin PDGF Platelet Derived Growth Factor PECAM-1 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule PFA Paraformaldehyd PMN Polymorphonuclear Leukocytes (= Granulozyten) POX Peroxidase PTK Protein Tyrosine Kinase PTP Protein Tyrosine Phosphatase RHS Retikulo-Histiozytäres System SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome TBS Tris-Buffer-Saline TH-Zellen T-Helfer-Zellen TLR Toll-Like Receptor TNFα Tumor Necrosis Factor alpha Tris-Puffer (THAM) Tris-(Hydroximethyl-)Aminomethan Trp Tryptophan VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule 1 VEcadGFP VE-Cadherin / Green Fluorescent Fusion Protein Construct VE-Cadherin Vascular Endothelial Cadherin VE-PTP Vascular Endothelial Protein Tyrosine Phosphatase vWf von Willebrand-Faktor Wnt Wingless int-1 7TM-cadherine Seven Transmembrane Cadherins

Kapitel 1 – Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Das Blutgefäßsytem der Lunge

Die Hauptaufgabe der Lunge besteht in der Vermittlung des Gasaustausches zwischen Blut

und Atemluft im Bereich der alveolokapillären Membran. Um diese Funktion zu erfüllen,

besitzt die Lunge ein außerordentlich dichtes Gefäßnetz – die Vasa publica. Diese sind von

den Vasa privata zu unterscheiden, die zur Blutversorgung der Lunge dienen.

1.1.1 Vasa publica

Die Vasa publica bilden den funktionellen Blutkreislauf der Lunge, in dem das

sauerstoffarme Blut des Körpers oxygeniert und CO2 – zwecks anschließender Abatmung

über die Lunge – aus dem Blut abgegeben wird.

Zu den Vasa publica gehören die Aa. pulmonales, die alveolären Kapillarnetze und die Vv.

pulmonales, die gemeinsam den Lungenkreislauf bilden.

Die Aa. pumonales folgen dem Bronchialbaum und gehen an den Bronchioli respiratorii

und Ductus alveolares in Arteriolen über. Die Arterien sind in das lockere peribronchiale

Bindegewebe eingebettet. Sie geben zahlreiche kleinere Äste zu den ihnen naheliegenden

Alveolen ab und ihre Endäste ziehen als Arteriolen zu den in den Interalveolarsepten

verlaufenden alveolären Kapillarnetzen. Die Pulmonalarterien bilden mit ihren einzelnen

Ästen jeweils Endarterien.

Die A. pulmonalis hat im Vergleich zu gleichkalibrigen Körperarterien eine geringe

Wandstärke mit einem niedrigen elastischen Faseranteil. Dies ist darauf zurückzuführen,

dass die Vasa publica ein Niederdrucksystem darstellen. Hier herrschen systolische Drücke

von 22 mmHg und diastolische Drücke von 8 mmHg.

Der Gasaustausch spielt sich größtenteils in den Kapillaren ab, die flächige und

engmaschige Kapillarnetze in den Interalveolarsepten bilden. Man unterscheidet die

ständig durchbluteten Ruhekapillaren von Arbeitskapillaren, die nur bei erhöhter

Beanspruchung durchströmt werden. Ein wesentlicher Bestandteil des Gasaustausches ist

das Kapillarendothel. Die Endothelzellen sind nicht nur durchlässig für Gase wie

Sauerstoff und CO2, sondern auch für diverse Plasmabestandteile.

Die Kapillaren gehen im weiteren Verlauf in die Venolen über. Sie liegen im interlobulären

Bindegewebe und fließen zur nächstgelegenen Segmentoberfläche ab. Dort münden sie in

Kapitel 1 – Einleitung 2 größere Venen, die zwischen den Segmenten oder unterhalb der Pleura zum Lungenhilus

verlaufen. Die Vv. pumonales besitzen keine Venenklappen.

1.1.2 Vasa privata

Die Vasa privata versorgen als nutritiver (ernährender) Kreislauf die Bronchien bis zu den

Bronchioli terminales sowie die Pulmonalarterien mit Sauerstoff und Nährstoffen. Die

Vasa privata der Lunge werden von den Rami bronchiales und den Vv. bronchiales

gebildet und sind jeweils kleiner als die Aa. und Vv. pulmonales.

Die Rami bronchiales entspringen entweder direkt aus der Aorta oder aus den 3. oder 4.

Interkostalarterien. Sie laufen wie die Aa. pumonales im peribronchialen Gewebe bis zu

den Bronchioli terminales. Aus ihren Kapillarnetzen sammeln sich feine Vv. bronchiales,

die letztendlich in die V. azygos bzw. V. hemiazygos münden. Peripher gelegene Vv.

bronchiales fließen auch in die Vv. pumonales ab.

Zwischen den Vasa publica und den Vasa privata bestehen Anastomosen, die insbesondere

bei Verlegungen (z. B. durch Emboli) große Bedeutung erlangen.


1.2 Endothel

Endothelzellen sind flache Zellen, die die Lumina von Blutgefäßen einschichtig

auskleiden. Sie sind in Längsrichtung der Gefäße orientiert. Auf Grund ihrer besonderen

Lage bilden Endothelzellen eine physikalische Barriere, die das Blut vom Gewebe trennt

(Stevens et al., 2000). Die Endothelzellen liegen auf der dem Lumen abgewandten Seite

auf einer – von wenigen Ausnahmen abgesehen – durchgehenden Basallamina. Die

Basallamina formt eine sekundäre Barriere für die Passage von flüssigen und geformten

Elementen in das extravaskuläre Kompartiment (Jaffe, 1987). Sie hat also nicht nur

mechanische Aufgaben, sondern dient auch als Permeabilitätsschranke.

Bei einem 70 kg schweren Erwachsenen bedecken die Endothelzellen eine Oberfläche von

mehr als 1000 m² (Jaffe, 1987).

1.2.1 Endotheliale Zelladhäsionsmoleküle

Untereinander sind die Endothelzellen über Zelladhäsionsmoleküle miteinander

verbunden. Eines von ihnen ist das "Vascular Endothelial Cadherin" (VE-Cadherin), das

zur Familie der Cadherine gehört. Haftstrukturen wie "Tight Junctions" (Zonula

occludens), Desmosomen und "Adherens Junctions" (Zonula adhaerens,

Adhärensjunktionen) vermitteln die Zell-Zell-Adhäsion zwischen Endothel- oder

Epithelzellen (Hordijk et al., 1999). Mittels Auf- und Abbau von Zelladhäsionsmolekülen

wird die endotheliale Gefäßpermeabilität reguliert. Entzündungsmediatoren induzieren

eine Reduktion der Zelladhäsionsmoleküle. Die Zellen haften nicht mehr so fest

aneinander, es entstehen Lücken und den Leukozyten wird der Übertritt aus der Blutbahn

in das Gewebe ermöglicht.

Das Endothel stellt somit eine semipermeable Barriere dar (Stevens et al., 2000), die den

Fluss in den Alveolarraum beschränkt.

1.2.2 Metabolische Aktivität des Endothels

Aufgrund ihrer Lokalisation mit Kontakt zum Blutstrom sind Endothelzellen perfekt

positioniert, um in zahlreiche biologische Systeme im Blut einzugreifen (Jaffe, 1987). Sie

synthetisieren physiologisch wichtige Moleküle und sezernieren diese ins Blut und/oder in

die subendotheliale extrazelluläre Matrix (Jaffe, 1987).

Zu den vom Endothel sezernierten bzw. exprimierten Molekülen gehören

1. die Zelladhäsionsmoleküle Vascular Endothelial (VE-) Cadherin und Neuronal (N-)

Cadherin (Hordijk et al., 1999; Orfanos et al., 2004). Über die Expression der Cadherine

Kapitel 1 – Einleitung 4 (und über die Synthese von Rezeptoren für Entzündungsmediatoren) wird die

Gefäßpermeabilität und die Barrierefunktion reguliert (Aird, 2003; Orfanos et al., 2004).

2. Substanzen zum Aufbau des subendothelialen Bindegewebes, z. B. Kollagen Typ IV,

Elastin und Laminin. Endothelzellen können daher die Basalmembran umbilden (Jaffe,

1987).

3. Rezeptoren für die Anhaftung von Leukozyten an der Endothelzelloberfläche (z. B.

ICAM-1, E-Selektin, P-Selektin, VCAM (Engelhardt und Wolburg, 2004; Grau et al.,

1996)).

4. Rezeptoren für β-LDL, HDL, Chylomikronen und den Scavenger Rezeptor, die

Lipoproteine binden (Baker et al., 1984; Brinton et al., 1985; Fielding et al., 1978), sowie

Hormonrezeptoren (z. B. für Insulin (Bar et al., 1978)).

5. Proteine und Rezeptoren, die eine Rolle bei der Regulation des Gefäßtonus, der

Koagulation und Fibrinolyse, des Zellwachstums, der Zelldifferenzierung, der

Immunantwort und der Entzündungsreaktion spielen (Aird, 2003; Cines et al., 1998; Faure

et al., 2001; Fishman et al., 1998; Mantovani et al., 1992; Orfanos et al., 2004; Vuong und

Berry, 2002). Dazu zählt die Synthese von gefäßerweiternden Faktoren wie

Stickstoffmonoxid (NO) (Cines et al., 1998; Noris et al., 1995; Orfanos et al., 2004),

Prostazyklinen (Cines et al., 1998; Jaffe, 1987; Orfanos et al., 2004) und Angiotensin II

(Orfanos et al., 2004), aber auch die Synthese von gefäßverengenden Faktoren wie ET-1

(Cines et al., 1998; Noris et al., 1995; Orfanos et al., 2004; Yanagisawa et al., 1988) und

ACE (Angiotensin Converting Enzyme) (Jaffe, 1987; Orfanos et al., 2004). Die Balance

zwischen vom Endothel freigesetzten Vasodilatatoren und -konstriktoren hat großen

Einfluss auf die Aufrechterhaltung des regelrechten Gefäßtonus (Thorin und Atkinson,

1994).

Über die Synthese des "von Willebrand-Faktor" (vWf), "Platelet-Activating Factor" (PAF)

(Cines et al., 1998) und "Tissue Factor" greifen Endothelzellen in das

Blutgerinnungssystem ein (Jaffe, 1987). Außerdem binden diverse Gerinnungsfaktoren

(z. B. IX und X) an Endothelzellen (Jaffe, 1987). Endothelzellen synthetisieren auch

antithrombotisch wirksame Substanzen, wie z. B. Prostazykline, Thrombomodulin und

Heparansulfat (Cines et al., 1998; Jaffe, 1987). Des Weiteren werden auch Plasminogen-

Aktivatoren und -Inhibitoren vom Endothel freigesetzt (Jaffe, 1987).

Durch Sekretion von Faktoren, die das Wachstum anderer Zellen (z. B. das glatter

Muskelzellen) regulieren (Jaffe, 1987; Orfanos et al., 2004), beeinflussen Endothelzellen

das Wachstum neuer Blutgefäße (Aird, 2003).

Kapitel 1 – Einleitung 5 Daneben spielen Endothelzellen eine Rolle bei der Differenzierung anderer Zellen.

Beispielsweise sezernieren sie "Colony-Stimulating Factor" (CSF), der auf Makrophagen-

Granulozyten-Kolonien einwirkt (Mantovani et al., 1997; Mantovani et al., 1992).

Menschliche Endothelzellen enthalten die ABO-Blutgruppen und die HLA-A,B-Antigene

und können somit auch als antigenpräsentierende Zellen agieren (Gibofsky et al., 1975;

Jaffe et al., 1973). Nicht nur deshalb ist das Gefäßendothel ein wesentlicher Bestandteil der

angeborenen Immunantwort. Über die Bindung von Immunkomplexen registrieren

Endothelzellen u. a. die Anwesenheit von bakteriellen Zellwandkomponenten und sind

durch entsprechende Antworten in die frühesten Stadien der Immunantwort involviert

(Faure et al., 2001; Orfanos et al., 2004).

Endothelzellen nehmen an Entzündungsreaktionen teil. Im Zusammenhang mit der

Endothelzellaktivierung sind sie Zielpunkte für Lipopolysaccharid (LPS) und andere

Zytokine (Mantovani et al., 1992). Endothelzellen sezernieren auch Zytokine und

Chemokine (Mantovani et al., 1992; Orfanos et al., 2004), sie interagieren mit Bakterien

und Blutkomponenten wie Leukozyten und Thrombozyten (Orfanos et al., 2004) und

beeinflussen somit die Entzündung.

1.2.3 Endothelzellaktivierung

Die metabolische Funktion der Endothelzellen ist Bestandteil der Endothelzellaktivierung.

Eine Definition der Endothelzellaktivierung (Zimmerman et al., 1999) beschreibt diese als

einen "Wechsel des Phänotyps oder der Funktion als Reaktion auf äußere Stimuli".

Diese Stimuli induzieren aktivierungsabhänginge funktionelle Veränderungen in

menschlichen Endothelzellen. Es sind verschiedenste Faktoren bekannt, die Endothelzellen

aktivieren: Zytokine und Chemokine, welche mit den Zelloberflächenrezeptoren

interagieren, Thrombin und Fibrin-Spaltprodukte, bakterielle Endotoxine wie das LPS,

aktivierte Leukozyten, proteolytische Enzyme, Immunkomplexe, Bakterien und

mikrobielle Produkte, hämodynamische Störungen, Oxidantien, Ischämie und Hyperoxie,

Hyperlipidämie, mechanische Belastung, Strahlung und Medikamente (Cines et al., 1998;

Fishman et al., 1998; Orfanos et al., 2004).

Die Endothelzellaktivierung kann ein regulierter Bestandteil einer physiologischen

Gefäßreaktion sein, unter pathologischen Bedingungen aber auch fehl- oder unreguliert

ablaufen. In diesen Fällen ist die Endothelzellaktivierung nicht reversibel oder limitiert

(Zimmerman et al., 1999).

Die Reaktion auf die endotheliale Aktivierung hängt vom Stimulus, dem Zeitraum nach

Stimulusapplikation sowie der Stärke und Potenz des Stimulus ab. Auch die gleichzeitige

Kapitel 1 – Einleitung 6 Applikation verschiedener Stimuli, eine zusätzliche Stimulation nach einer

vorangegangenen submaximalen Stimulation, vorangegangene Verletzungen und andere

Faktoren haben Einfluss auf die Endothelzellaktivierung (Zimmerman et al., 1999).

1.2.3.1 Endothelzellaktivierung bei Sepsis

Die Endothelzellaktivierung gilt als ein grundlegender Mechanismus der komplexen

pathologischen Ereignisse, die in einem ARDS resultieren (Zimmerman et al., 1999). Die

Endothelzellaktivierung ist in diesem speziellen Fall eine Antwort auf Faktoren wie

Bakterientoxine im Rahmen einer Sepsis, Trauma, oxidativer Stress oder chemische

Alteration. Die Endothelzellaktivierung oder -verletzung durch mikrobielle

Zellwandkomponenten wie LPS spielt eine Rolle bei der Entwicklung einer Sepsis und

dem septischem Schock (Faure et al., 2001). Die Aktivierung von Endothelzellen durch

LPS und andere Faktoren resultiert zum einen in der endothelialen Produktion

verschiedenster proinflammatorischer Moleküle sowie löslicher Zytokine und Chemokine

(Carlos und Harlan, 1994; Cohen, 2002; Morrison und Ryan, 1987) und zum anderen in

einer stimulus- und organspezifischen Induktion verschiedenster Adhäsionsmoleküle

(Bauer et al., 2000; Eppihimer et al., 1996; Henninger et al., 1997).

Lösliche Adhäsionsmoleküle, die als Marker für Endothelzellaktivierung angesehen

werden, sind vermehrt im Plasma von Patienten mit ARDS, lokalisiertem akutem

Lungenschaden und hypoxischer akuter Bergkrankheit (= Höhenkrankheit) nachweisbar

(Grissom et al., 1997; Moss et al., 1996). Dies unterstützt aus klinisch-chemischer Sicht die

These, dass Endothelzellen unter diesen Bedingungen aktiviert werden bzw. auf einen

pathologischen Stimulus mit ansteigender Synthese und/oder Freisetzung von

zirkulierenden Proteinen antworten (Zimmerman et al., 1999).

1.2.3.2 Leukozytenadhäsion

Die Endothelzellaktivierung kann in einem gewissen Maße mit der Expression von

Molekülen, die die Zelladhäsion und die Leukozytenmigration vermitteln, gleichgesetzt

werden. Jedoch nimmt nur das aktivierte Endothel an der inflammatorischen Antwort teil.

So exprimiert im Gegensatz zum nicht-aktivierten Endothel das aktivierte Endothel

Leukozytenadhäsionmoleküle und ermöglicht so die Transmigration der Neutrophilen

(Ward und Hunninghake, 1998). Wenngleich die Endothelaktivierung für die

Akkumulation von inflammatorischen Zellen erforderlich ist, so ist sie nicht stereotyp

(Zimmerman et al., 1999). Für die Interaktion mit Leukozyten werden die verschiedensten

endothelialen Moleküle benötigt. Menschliche Endothelzellen exprimieren

Kapitel 1 – Einleitung 7 unterschiedliche Adhäsions- und Signalmoleküle, die von verschiedenen Klassen von

Leukozyten erkannt werden; dieser Vorgang erfolgt Agonist- und Zeit-abhängig (Cines et

al., 1998; Luscinskas und Gimbrone, 1996; Orfanos et al., 2004). Des Weiteren können

aktivierte menschliche Endothelzellen auch verschiedene Kombinationen von Adhäsions-

und Signalmolekülen für eine bestimmte Leukozytenklasse, die Granulozyten

(polymorphonukleären Leukozyten = PMNs), die von besonderer Bedeutung für die

Initiation und Amplifikation eines ARDS-bedingten Lungenversagens sind, exprimieren

(Zimmerman et al., 1999). Die Granulozyten sind die ersten Zellen, die bei einer akuten

Entzündungsreaktion schon nach wenigen Minuten aus dem Blut rekrutiert werden (Harris

et al., 2000; Del Maschio et al., 1996).

1.2.4 Heterogenität der Endothelzellen

Die Endothelzellen und ihre Antworten auf die Aktivierung an verschiedenen Stellen des

Gefäßsystems sind sehr heterogen (Rajotte et al., 1998). Eine Heterogenität besteht

zwischen den verschiedenen Gefäßtypen innerhalb der Lunge und des Systemkreislaufs,

aber auch zwischen Lungenendothel und nicht-pulmonalem Endothel (Aird, 2003).

Endothelzellen unterscheiden sich durch die Lokalisation des Gefäßes in der Strombahn.

So unterscheiden sich Endothelzellen in kleinen Gefäßen von Endothelzellen in großen

Gefäßen (Stevens et al., 2000; Swerlick et al., 1992; Thorin et al., 1997). Beispielsweise

besteht in menschlichen mikro- und makrovaskulären Endothelzellen eine funktionelle

Heterogenität für die Verteilung von Bradykinin und die Aktivität von Plasminogen-

Aktivator-Inhibitor-1 (Gräfe et al., 1994; Shatos et al., 1995).

In der Lunge bildet die Mikrovaskulatur eine sehr große Oberfläche, pro Fläche findet aber

ein geringerer Blutdurchstrom statt als in den Arterien oder Venen (Parker und Yoshikawa,

2002). Dementsprechend ist die Endothelbarriere in den mikrovaskulären Gefäßen weniger

durchlässig als in den makrovaskulären. Auch bezüglich der Art der

Endothelzelljunktionen im übrigen Körperkreislauf bestehen Unterschiede. Während

Arteriolen mit einem sehr dichten Netzwerk von verschiedenen Junktionen ausgestattet

sind, sind Arterien vergleichsweise schlecht mit Junktionen ausgestattet. In den Kapillaren

fehlen bestimmte Junktionstypen sogar vollständig. Die Venolen weisen nur gering

organisierte Junktionen und demzufolge ein diskontinuierliches Endothel auf (Simionescu

et al., 1976; Simionescu et al., 1975).

In struktureller Hinsicht unterscheiden sich Endothelzellen verschiedener Lokalisationen

des Gefäßbaumes in Größe, Form und Dicke. Beispielsweise sind bei einer Ratte

Endothelzellen, die die Pulmonalarterie auskleiden, größer und rechteckiger als die die

Kapitel 1 – Einleitung 8 Aorta auskleidenden Endothelzellen. Hingegen sind diese Endothelzellen dicker als ihre

Gegenstücke in den Kapillaren oder Venen (Aird, 2003).

Aus diesen strukturellen Unterschieden ergeben sich funktionelle Unterschiede, die sich in

streng lokalisierten Prozessen widerspiegeln. Im Gegensatz zum systemischen Kreislauf

findet die Neutrophilenmigration in der Lunge in den Kapillaren statt. Die Kapillaren sind

mit einem Durchmesser von 6 - 9 µm sehr eng. Für die verformbaren Erythrozyten stellt

die Kapillarpassage kein Problem dar. Dies gilt nicht für die weniger verformbaren

Leukozyten. Die Leukozyten adhärieren an den Oberflächen der Endothelzellen in vivo

und können den extravaskulären Raum durch Überwindung der Endothelzellbarriere

erreichen. Die Leukozyten-Endothelzell-Interaktion findet über Adhäsionsmoleküle der

Leukozyten und der Endothelzellen statt (Burns et al., 2002).

Zusammenfassend ist zu sagen, dass Endothelzellen, obwohl sie grundlegende strukturelle

und funktionelle Charakteristika teilen, ausgeprägte Unterschiede in ihrer Morphologie und

ihren Wachstumscharakteristika, bei der Freisetzung von Molekülen und der Antwort auf

eine Vielzahl von Mediatoren aufweisen (Thorin et al., 1997). Wichtige Faktoren, von

denen die Endothelzellvariationen abhängen, sind die embryonale Herkunft, die

Lokalisation des Gefäßes in der Strombahn, Geschlecht, Alter und der Gesundheitszustand

(McCarron et al., 1994; Marín und Rodríguez-Martínez, 1999; Risau, 1995).


1.3 Zelladhäsion

Zwischen fast allen Zellen des Körpers werden vorübergehende oder dauerhafte Kontakte

(Junktionen) gebildet. Kontakte zwischen Zellen desselben Zelltyps bezeichnet man als

homotypische Kontakte, Kontakte zu anderen Zelltypen als heterotypische Kontakte.

Die Kontakte werden nach Funktion, Morphologie und molekularem Aufbau in drei

Hauptgruppen eingeteilt: Adhäsionskontakte (Kontakte mit überwiegend mechanischer

Funktion, hierzu gehören die Cadherine), Kommunikationskontakte (Kontakte mit

metabolischer und elektrisch-koppelnder Funktion) und Barrierenkontakte (Kontakte, die

den Interzellularraum verschließen, wie z. B. die Zonula occludens bzw. Tight Junction).

Zu den Adhäsionskontakten gehören die Zelladhäsionsmoleküle (CAMs). Sie beinhalten

eine sehr heterogene Gruppe von Proteinen, die für die Zell-Zell-Haftung zwischen

benachbarten Zellen verantwortlich sind. Die vier wichtigsten Klassen sind: die Cadherine,

die Zelladhäsionsmoleküle der Immunglobulinsuperfamilie, die Selektine und die

Integrine.

Cadherine sind die am häufigsten auftretenden Haftproteine, insbesondere in

Desmosomen. Als kalziumabhängige Proteine können sie nur in Anwesenheit von

Kalziumionen homophile Zellkontakte eingehen.

Die Familie der Cadherine besteht aus verschiedenen Subgruppen: den klassischen

Cadherinen, den desmosomalen Cadherinen, den Protocadherinen, den 7TM (Seven

Transmembrane Cadherins, auch Flamingo Cadherine genannt), den FAT-family

Cadherinen und den T-Cadherinen (Angst et al., 2001).

Zu den klassischen Cadherinen gehören das in den frühen 80er Jahren des letzten

Jahrhunderts erstbeschriebene E-Cadherin (Epithelial Cadherin, Uvomorulin), das N-

Cadherin (Neuronal Cadherin), das P-cadherin (Placental Cadherin), M-Cadherin (Muscle

Cadherin) und das VE-Cadherin (Vascular Endothelial Cadherin). Ihnen allen gemeinsam

ist eine charakteristische Grundstruktur. Jedes Cadherin hat aber ein eigenes

Verteilungsmuster im Gewebe. Auf den Endothelzellen werden N-Cadherin, VE-Cadherin

und auch – in geringerem Maße – P-Cadherin exprimiert. Nur VE-Cadherin wird

ausschließlich auf Endothelzellen exprimiert (Angst et al., 2001).

Es ist hier anzumerken, dass die Einteilung der Cadherine in Gruppen nicht einheitlich ist.

Es existieren verschiedene Ansichten, auch über die Einordnung von VE-Cadherin (Nollet

et al., 2000).


1.4 Zytoskelett

Das VE-Cadherin ist eng mit dem Zytoskelett verbunden. In der Zelle übernimmt das

Zytoskelett die Aufgabe eines internen Stütz- und Bewegungsapparates und erfüllt damit

statische und dynamische Zellfunktionen.

Zum Zytoskelett gehören Mikrotubuli (Zentriol, Zentrosom, Kinetosom; Kinozilien,

Flagellen), Intermediärfilamente, Aktinfilamentsystem, Spektrinsystem,

Membranzytoskelett, Dystrophin und das Laminsystem.

VE-Cadherin ist sowohl mit dem Intermediärfilament (über Plakoglobin und Desmoplakin)

als auch mit dem Aktinfilamentsystem (über β-Catenin, α-Catenin und Vinculin)

verbunden.

Das Intermediärfilament ist bevorzugt in Bündeln angeordnet. Die genaue Funktion ist

unbekannt. Man geht derzeit von einer passiven Funktion im Sinne eines zellulären

Stützgerüstes aus, das Zellorganellen und den Zellkern in ihrer Position hält.

Das Aktinfilament ist hauptsächlich aus Aktin aufgebaut. Aktin ist an aktiven

Formveränderungen von Zellen bis hin zur Kontraktion beteiligt. Es reguliert die

Viskosität des Zytoplasmas und dient der mechanischen Stabilisierung verschiedener

Zellfortsätze und Zellkontakte, v. a. der Adhäsionskontakte.


1.5 VE-Cadherin

1.5.1 Charakterisierung

Das "Vascular Endothelial Cadherin" (VE-Cadherin) ist ein calciumabhängiges

Glykoprotein und gehört zur großen Familie (Superfamilie) der Cadherine. Es ist in einem

Cluster von insgesamt sechs Cadherinen auf dem langen Arm des Chromosoms 16

(16q22.1) lokalisiert. Sein Gewicht beträgt 135 Kda (Abb. 1).

Der Name "Vascular Endothelial Cadherin" basiert auf den strukturellen Ähnlichkeiten mit

der Familie der Cadherine und auf der alleinigen Expression auf Endothelzellen. Weitere

Bezeichnungen für das "VE-Cadherin" sind "cadherin-5", "7B4", "cd144" und

"Endothelial-Specific Cadherin".

1990 beschrieben Heimark, Degner und Schwartz (Heimark et al., 1990) in Zellkulturen

aus Endothelzellen der Aorta ein calciumabhängiges Zell-Zell-Adhäsionsmolekül. Damals

waren das Uvomorulin (E-Cadherin) und andere im Epithel vorkommende

calciumabhängige Zelladhäsionsmoleküle bekannt.

1991 wurde VE-Cadherin von Suzuki, Sano und Tanihara (Suzuki et al., 1991) entdeckt.

Sie propagierten die Existenz acht neuer Cadherine (Cadherin-4 bis Cadherin-11) aufgrund

von Untersuchungen der menschlichen cDNA in Gehirn und Retina.

1992 produzierten Lampugnani und Mitarbeiter (Lampugnani et al., 1992) einen

monoklonalen Antikörper (7B4), der mit dem von Suzuki et al. gefundenen Protein

immunopräzipitierte (Vincent et al., 2004). Dieser Maus-Antikörper band sich an die

interzellulären Junktionen von HUVEC-Monolayern. Die Inkubation der HUVEC mit dem

Antikörper führte außerdem zu einer gesteigerten Permeation von Makromolekülen durch

die Monolayer ohne offensichtliche Veränderung der Zellmorphologie. Bei der durch u. a.

TNFα/IFNγ gesteigerten Endothelpermeabilität zeigte sich eine veränderte Verteilung des

Antikörpers. Damit stellte sich schon 1992 heraus, dass das 7B4-Antigen ein

endothelspezifisches Cadherin ist, das eine Rolle bei der Organisation der lateralen

endothelialen Junktionen und bei der Kontrolle der Permeabilitätseigenschaften des

Gefäßendothels spielt (Lampugnani et al., 1992).

Abb. 1: Genomorganisation von VE-Cadherin auf dem Chromosom 16, bestehend aus Signal- und Prosequenz, fünf Cadherin-Einheiten (Repeats), der transmembranären Domäne und der zytoplasmatischen Domäne (Angst et al., 2001)

Kapitel 1 – Einleitung 12 1.5.2 Aufbau

Klassische Cadherine bestehen aus einer extrazellulären Domäne mit fünf Cadherin-

Repeats (= fünf gleichartige kettenartig aneinandergeknüpfte Einheiten), einer

transmembranären/juxtamembranären Region und einem zytoplasmatischen/intrazellulären

Teil (Abb. 2).

Abb. 2: Schema des Aufbaus des VE-Cadherin-Moleküls (Vincent et al., 2004) mit der extrazellulären (bestehend aus fünf Einheiten) und der intrazellulären Domäne (bestehend aus juxtamembranärer und Catenin-bindender Domäne, Catenin Binding Domain)

Die extrazelluläre Region knüpft calciumabhängig über den interzellulären Spalt hinweg

homophile Zelladhäsionskontakte zu benachbarten Endothelzellen. Die fünf extrazellulären

Cadherin-Repeats sind an der EC1-Domäne mit einem aminoterminalen Tryptophan (Trp-

2) verknüpft. Innerhalb der EC1-Domäne findet sich auch die "Cell Adhesion Recognition"

(CAR). Zwischen jedem Cadherin-Repeat finden sich drei Ca2+-Moleküle (Abb. 2).

VE-Cadherin bildet ausschließlich homophile Zellkontakte. Gebildet werden cis-Dimere

(Verbindungen von zwei benachbarten Cadherinen an einer einzigen Zelle) und trans-

Dimere (Zell-Zell-Verbindungen zwischen aneinander angrenzenden Zellen). Durch die

Verbindung von cis- und trans-Dimeren entstehen Reisverschluss-ähnliche Strukturen

(Shapiro et al., 1995). Die homophilen Bindungen werden vor allem über die EC1-

Domäne, aber auch über die EC4- oder EC5-Domänen geschlossen.

Die extrazelluläre Domäne ist damit ein wichtiger Bestandteil der Zelladhäsion (Navarro et

al., 1995), scheint aber keine Schlüsselrolle bei der Regulation der Gefäßpermeabilität inne

zu haben (Guo et al., 2004).

Die intrazelluläre Domäne beinhaltet die Transmembranregion, die p120-Catenin (p120ctn)

bindet, und die "Catenin Binding Domain" (Vincent et al., 2004). VE-Cadherin bildet über

Kapitel 1 – Einleitung 13 die "Catenin Binding Domain" Komplexe mit anderen zytoplasmatischen Komponenten

wie β-Catenin, α-Catenin, Plakoglobin und Vinculin, über die eine Verbindung mit dem

intrazellulären Aktin hergestellt wird (Angst et al., 2001). Untypischerweise für die

klassischen Cadherine interagiert das VE-Cadherin (vergleichbar mit dem desmosomalen

Cadherin) auch mit Plakoglobin und Plakophilin, zwei Mitgliedern der Armadillo Familie

(Angst et al., 2001a). Sie bilden einen Komplex, der über Desmoplakin mit dem

intermediären Filamentnetzwerk interagiert (Kowalczyk et al., 1998). VE-Cadherin knüpft

also sowohl mit Aktin und als auch dem Intermediärfilament Verbindungen (Abb. 3). Die

Regulation der Cadherinfunktion – und damit der parazellulären Permeabilität – erfolgt

über die Interaktion des zytoplasmatischen Anteils des VE-Cadherins mit den

zytoplasmatischen Proteinen, den Cateninen (Iyer et al., 2004; Navarro et al., 1995). Die

intrazelluläre Domäne ist Ziel inflammatorischer Signale, da die meisten

Entzündungsmediatoren durch die Bindung an ihre Rezeptoren konsekutiv eine Kaskade

intrazellulärer Signale triggern und darüber die zelluläre Funktion affektieren (Guo et al.,

2004).

Vinc (Vinculin), α-CAT (α-Catenin), β-CAT (β-Catenin), PG (Plakoglobin), DP (Desmoplakin), IF

(Intermediäres Filament), Cadherin repeat, Catenin-binding domain

Abb. 3: Homophile Zell-Zell-Verbindung zweier Zellen (rechts und links) durch VE-Cadherin mit je fünf extrazellulären Cadherin-Repeats, der transmembranären Region und dem zytoplasmatischen Teil, der mit dem Zytoskelett verbunden ist (Angst et al., 2001a)

Die juxtamembranäre Domäne des zytoplasmatischen Anteils des VE-Cadherins ist eine

funktionell aktive Region, die über die Interaktion mit dem p120ctn an der endothelialen

Zell-Zell-Adhäsion mitwirkt (Iyer et al., 2004; Yap et al., 1998). Die Bindung von p120ctn

an das VE-Cadherin (bzw. deren juxtamembranäre Domäne) steigert die Stärke der Zell-

Zell-Adhäsion, verhindert die Endozytose von VE-Cadherin und führt zu einer

Kontaktinhibition. Ein Verlust von p120ctn ist mit einem Abfall des VE-Cadherin-Level in

den Endothelzellen assoziiert, da die juxtamembranäre Domäne ohne p120ctn eine

Neuordnung des Zytoskeletts, einen Anstieg von VE-Cadherin-Phosphorylierung und -

Endozytose und eine Neuverteilung der Adhäsionsmoleküle auf der Endothelzelloberfläche

Kapitel 1 – Einleitung 14 bedingt (Anastasiadis und Reynolds, 2000; Ferber et al., 2002; Iyer et al., 2004; Thoreson

et al., 2000; Xiao et al., 2003; Yap et al., 1998).

Die juxtamembranäre Region ist prinzipiell für die Zusammenlagerung der VE-Cadherin-

Moleküle verantwortlich, wohingegen die Catenin-bindende Region den Hauptlink an das

Aktinzytoskelett darstellt (Yap et al., 1998).

Nach Lambert et al. (2005) erfolgt als erster Schritt der Bildung einer Zelladhäsion die

Verknüpfung der extrazellulären Domänen untereinander, gefolgt von der Verknüpfung

der intrazellulären Domäne mit dem Zytoskelett.

1.5.3 Verknüpfung mit dem Zytoskelett

Es gibt drei Typen von VE-Cadherin: 1. Membran-assoziiertes VE-Cadherin, 2.

Zytoskelett-assoziiertes (Aktin-abhängig) VE-Cadherin und 3. Zytoskelett-assoziiertes

(Aktin-unabhängig) VE-Cadherin (Lim et al., 2001). VE-Cadherin ist sowohl an das Aktin

(Aktin-abhängig) als auch an das Intermediäre Filament-Zytoskelett (Aktin-unabhängig)

gebunden (Kowalczyk et al., 1998). Über bestimmte Proteine, die Catenine, ist das VE-

Cadherin mit dem Aktinzytoskelett verknüpft. Die Catenine sind für die Regulation der

Cadherin-vermittelten Adhäsion wichtig. Von Bedeutung sind α-, β- und γ-Catenin, sowie

p120ctn.

α-Catenin ist mit Vinculin verknüpft und nimmt eine Schlüsselrolle bei der Verknüpfung

des Schwanzteiles von VE-Cadherin mit dem Aktinzytoskelett ein.

β-Catenin verbindet den Cadherin-Schwanz mit dem α-Catenin.

γ-Catenin hingegen ist identisch mit dem desmosomalen Protein Plakoglobin und

übernimmt teilweise die gleichen Funktionen wie β-Catenin. β-Catenin und Plakoglobin

gehören beide zur Familie der Armadillo Proteine (Vincent et al., 2004).

Plakoglobin kommt nicht nur in Desmosomen, sondern auch – weil es an klassische

Cadherine bindet – in Adhärensjunktionen vor. Es bindet an Aktin und an das intermediäre

Filament. Damit ist Plakoglobin für eine Verbindung zwischen Adhärensjunktionen und

Desmosomen verantwortlich.

β-Catenin und Plakoglobin verbinden beide den Cadherin-Schwanz mit α-Catenin, welches

den Cadherin-Catenin-Komplex mit dem Aktin-Zytoskelett verknüpft. Die beiden

Armadillo-Proteine binden dabei an der "Catenin Binding Domain" des VE-Cadherins. In

Abwesenheit von β-Catenin ist der Cadherin-Schwanz unstrukturiert und anfällig für

Proteolyse. Bindet jedoch das β-Catenin an den Cadherin-Schwanz, verknüpft sich die

aminoterminale Region des β-Catenin mit dem α-Catenin. Plakoglobin agiert ähnlich. Es

bindet auch an α-Catenin (was an E- und N-Cadherin untersucht wurde), kommt aber nie

Kapitel 1 – Einleitung 15 gleichzeitig mit β-Catenin im Cadherin-Catenin-Komplex vor. Im Gegensatz zu β-Catenin

ist es mit Desmoglein und Desmocollin assoziiert (Alberle et al., 1994; Sacco et al., 1995).

β-Catenin und Plakoglobin nehmen also Schlüsselrollen in der Vernetzung des VE-

Cadherin mit dem Aktinzytoskelett ein (Abb. 4).

Abb. 4: Interaktion von VE-Cadherin mit dem Zytoskelett: Zum einen Bindung über α- und β-Catenin bzw. Plakoglobin p120-vermittelt an Aktin, zum anderen über Desmoplakin und Plakoglobin p0071-vermittelt an Vimentin (Vincent et al., 2004)

Das Protein p120ctn (p120-Catenin) spielt bei der Regulation der Cadherinfunktion

ebenfalls eine wichtige Rolle (Iyer et al., 2004). p120ctn interagiert mit der

juxtamembranären Domäne des VE-Cadherin. Es verbindet das VE-Cadherin nicht direkt

mit dem Zytoskelett, reguliert jedoch die Funktion von VE-Cadherin. Außerdem ist es

zusammen mit der juxtamembranären Region für die Organisation von Aktin im Rahmen

VE-Cadherin-vermittelter Zellkontakte zuständig und reguliert die Zusammenballung von

VE-Cadherin (Thoreson et al., 2000; Yap et al., 1998). p0071 (= Plakophilin-4) übernimmt

wohl eine ähnliche Funktion wie p120ctn (Vincent et al., 2004).

1.5.4 Regulation

Die strukturelle und funktionelle Regulation des Cadherin-Catenin-Komplexes ist noch

nicht endgültig geklärt. Ein wichtiger Bestandteil der Regulation ist das Zusammenspiel

von Wnt (Wingless int-1) und β-Catenin. Wnts sind einflussreiche Regulatoren der

Zellproliferation und Differenzierung (Venkiteswaran et al., 2002). Ihr Signalweg

Kapitel 1 – Einleitung 16 involviert Proteine, die direkt an der Gentranskription und der Zelladhäsion teilnehmen.

Das zentrale Protein des Signalwegs ist β-Catenin (Nelson und Nusse, 2004).

β-Catenin existiert in mehreren Formen (Abb. 5):

- in einer Cadherin-gebundenen Form zur Regulation der Zelladhäsion,

- in einer phosphorylierten Form in einem Komplex aus mehreren Komponenten,

- im Nucleus.

Über die Wnt-Signalkette wird β-Catenin freigesetzt und kann in den Zellkern eintreten,

wo es mit den Transkriptionsfaktoren interagiert und durch Beeinflussung der

Genexpression in die Zelladhäsion und die Expression von Cadherinen eingreift (Bienz

und Clevers, 2000; Nelson und Nusse, 2004).

Abb. 5: Zentrale Rolle von β-Catenin im Wnt-Signalweg (Wingless int-1): β-Catenin existiert in einer Cadherin-gebundenen Form zur Regulation der Zelladhäsion, in einer phosphorylierten Form und im Nucleus zur Beeinflussung der Transkription (Nelson und Nusse, 2004)

Der Grundmechanismus der Regulation des Cadherin-Catenin-Komplexes ist die

Phosphorylierung. Die strukturelle und funktionelle Regulation erfolgt durch das

Gleichgewicht der Tyrosinkinase- und der Phosphataseaktivität. Cadherin bindet β-

Catenin, das seinerseits wieder α-Catenin bindet, und p120. Die Integrität dieses

Komplexes ist negativ durch die Phosphorylierung von β-Catenin reguliert (Angst et al.,

2001). Die Phosphorylierung erfolgt durch Tyrosinrezeptorkinasen (RTKs) und

zytoplasmatische Tyrosinkinasen (Fer, Fyn, Yes und Src), die besondere Tyrosinreste

(Y654, Y142) im β-Catenin phosphorylieren (Abb. 6). Das führt zur Dissoziation des

Cadherin-Catenin-Komplexes (Ukropec et al., 2000). Die Integrität ist somit positiv über

die Phosphorylierung von β-Catenin durch die Kasein Kinase II und die

Kapitel 1 – Einleitung 17 Dephosphorylierung durch die Protein-Tyrosin-Phosphatase reguliert. Letztere bindet p120

und β-Catenin (Abb. 6). Veränderungen in der Phosphorylierung von β-Catenin haben

Auswirkungen auf die Zell-Zell-Adhäsion, die Zellmigration, die Menge an

signalwirksamem β-Catenin und über die Barriereintegrität den parazellulären

Transportweg (Nelson und Nusse, 2004; Sui et al., 2005; Tinsley et al., 2005; Ukropec et

al., 2000).

Die Aktivierung der Tyrosinkinase führt demnach zu einem Verlust an Cadherin-

vermittelten Zell-Zell-Kontakten und lässt das zytoplasmatische β-Catenin ansteigen. Im

Gegensatz dazu, stabilisiert die Aktivierung der Protein Tyrosine Phosphatase (PTP) den

Cadherin-Catenin-Komplex und es resultiert eine Vermehrung der Cadherin-vermittelten

Zell-Zell-Kontakte. Daraus ergibt sich, dass der Regulationsmechanismus auf dem

Gleichgewicht der Tyrosinkinase und der Tyrosinphosphatase beruht (Nelson und Nusse,

2004).

Abb. 6: Regulation des Cadherin-Catenin-Komplexes über De-/Phoshorylierung von β-Catenin; rote Pfeile: Phosphorylierung, grüne Pfeile: Dephosphorylierung (Nelson und Nusse, 2004)

Die Tyrosinphosphorylation von VE-Cadherin kann durch TNFα, einem u. a. bei Sepsis

freigesetzten Entzündungsmediator, und PAF (Platelet Activating Factor) induziert

werden. TNFα ruft eine verstärkte interzelluläre Lückenbildung hervor und steigert

Kapitel 1 – Einleitung 18 dadurch die Endothelzellpermeabilität zwischen den Zellen (Hudry-Clergeon et al., 2005;

Nwariaku et al., 2002).

Daneben existieren noch weitere Signalwege. Einer davon wird durch IQGAP1

(Calmodulin-Binding Domain GAP 1) vermittelt, das bei niedriger intrazellulärer Ca2+-

Konzentration mit einem GTP-gebundenen, aktivierten in der Zellmembran verankerten

Komplex (CDC42/RAC1) und Aktin interagiert. Daraus resultieren ein stabiler Cadherin-

Catenin-Komplex und eine feste interzelluläre Adhäsion. Steigt der intrazelluläre Ca2+-

Spiegel an, bindet Ca2+ direkt an IQGAP1 und Calmodulin (CAL) (Abb. 7). IQGAP1

dissoziiert vom membrangebundenen Komplex und vom Aktin, es bindet sich an den

Cadherin-Catenin-Komplex, wobei α-Catenin abgespalten wird. Die Cadherin-vermittelte

Zell-Zell-Adhäsion ist reduziert (Angst et al., 2001).

GRD = GAPrelated domain; IQ = calmodulin-binding domain; C = calponin-homology domain; V= vinculin

Abb. 7: Regulation des Cadherin-Catenin-Komplexes in Abhängigkeit von der Ca2+-Konzentration in der Zelle (Angst et al., 2001)

Für die Regulation der VE-Cadherin-Expression und die Präsentation von Cadherinen an

der Plasmamembran ist die Endoztyose, also die Aufnahme von Substanzen in die Zelle

über Ausstülpungen der Zellmembran, ein wichtiger zellulärer Mechanismus. Sie findet

während der Entwicklung als Reaktion auf die Zellmigration triggernde

Wachstumsfaktoren statt. Beispielsweise führt H2O2 in Endothelzellen zur Internalisation

von VE-Cadherin. Daraus resultiert eine Dysfunktion der Endothelbarriere mit Bildung

von "Lücken" (Vincent et al., 2004).

Kapitel 1 – Einleitung 19 Für die biochemische Erklärung des Prozesses spielt die Bindung von VE-Cadherin zu β-

Catenin und p120ctn eine Rolle. Die Menge von freiem p120ctn hat Einfluss auf die Menge

an freiem VE-Cadherin. Wird p120ctn von VE-Cadherin getrennt, wird VE-Cadherin

internalisiert und zudem von β-Catenin getrennt (Abb. 8). Der Verlust der Bindung mit

p120ctn setzt eine Abbaukaskade des VE-Cadherins in Gang, in die Lysosomen und

Proteosomen involviert sind. Ob ein "Recycling" stattfindet, evtl. unter dem Einfluss von

p120ctn-Kinesin, ist bis dato nicht bekannt (Vincent et al., 2004).

Abb. 8: Endozytose von VE-Cadherin: nach Dissoziation von p120ctn und VE-Cadherin, konsekutive Ablösung des β-Catenin von VE-Cadherin mit nachfolgender Internalisation/Endozytose von VE-Cadherin (Vincent et al., 2004)

1.5.5 Funktionen

Während VE-Cadherin spezifisch von Endothelzellen der Blut- und Lymphgefäße

exprimiert wird, ist es auf zirkulierenden Blutzellen wie Monozyten, PMNs und Plättchen

– im Gegensatz zu anderen Adhäsionsmolekülen – nicht vorhanden (Lampugnani et al.,

1992; Vincent et al., 2004). Am Endothel bildet VE-Cadherin kalziumabhängig homophile

Bindungen an den interzellulären Junktionen aus und bedingt so eine endotheliale Zell-

Zell-Adhäsion (Breviario et al., 1995; Navarro et al., 1995). An den Zell-Zell-Adhäsionen

(Adhärensjunktionen), an denen VE-Cadherin die Hauptkomponente darstellt, bestimmt es

die Stärke der Zelladhäsion und die Monolayereigenschaften des Endothels (Dejana et al.,

1996; Hordijk et al., 1999; Venkiteswaran et al., 2002). Eine verminderte Expression bzw.

der Verlust von VE-Cadherin bedingt eine Endothelzellverbandlockerung und eine

Kapitel 1 – Einleitung 20 Steigerung der Endothelpermeabilität mit Ausbildung von "Lücken" (Breviario et al.,

1995; Hordijk et al., 1999) (Abb. 9).

VE-Cadherin ist somit nicht nur ein wichtiger Regulator der Gefäßpermeabilität, sondern

auch wichtig für die Aufrechterhaltung der Endothelbarrierenfunktion (Angst et al., 2001;

Breviario et al., 1995; Corada et al., 2001; Corada et al., 1999; Dejana et al., 1999;

Haselton und Heimark, 1997; Hordijk et al., 1999; Kevil et al., 1998; Lum und Malik,

1996; Navarro et al., 1995; Stevens et al., 2000). Über die Regulierung der

Endothelpermeabilität wird auch die Transmigration hochmolekularer Moleküle reguliert,

da die Expression von VE-Cadherin deren Durchtritt durch das Endothel erschweren und

damit senken kann (Breviario et al., 1995). Ebenso kann die VE-Cadherin-Expression die

Transmigration von Zellen (Breviario et al., 1995; Hordijk et al., 1999; Navarro et al.,

1995), insbesondere die der Leukozyten und Neutrophilen (Shaw et al., 2001),

beeinflussen. Des Weiteren führt die gesteigerte Endothelpermeabilität zur Ausbildung

eines Ödems (Grau et al., 1996; Lehr et al., 2000; Petrache et al., 2003; Wong et al., 1999).

VE-Cadherin ist für die Organisation gefäßähnlicher Strukturen in Embryos verantwortlich

(Vittet et al., 1997). Hier spielt es durch Ausbildung einer homotypischen Zellaggregation

eine Rolle bei der Embryogenese und der Entwicklung definierter Gewebe und Organe

(Breviario et al., 1995), sowie bei der Gefäßmorphogenese, der Gefäßneu- und -umbildung

(Angst et al., 2001; Corada et al., 2001; Gory-Fauré et al., 1999). Im Rahmen der

Neovaskularisation ist VE-Cadherin für die Ausbildung von Adhärensjunktionen zwischen

den Endothelzellen wichtig (Liao et al., 2002). Endothelzellen, die eine Nullmutation für

das VE-Cadherin Gen in sich tragen, zeigen erhebliche Veränderungen in ihrem

funktionellen Verhalten und können keine gefäßähnlichen Strukturen organisieren (Vittet

et al., 1997). Daneben ist VE-Cadherin nicht nur bei der Gefäßbildung (Vittet et al., 1997),

sondern auch bei der Aufrechterhaltung der Funktion der Blutgefäße von Bedeutung

(Breviario et al., 1995). VE-Cadherin fördert das Zellwachstum (Caveda et al., 1996) und

beeinflusst die Apoptose (Corada et al., 2001; Herren et al., 1998) – letztere wird durch

eine Hemmung von VE-Cadherin ausgelöst.

Auf der einen Seite fördert VE-Cadherin die Tumorvaskularisation (Liao et al., 2002)

durch die Eigenschaft der Angiogenese, führt aber auf der anderen Seite auch zur

Zellkontakt-induzierten Wachstumsinhibition der Zellen. Aus Letzterem ergibt sich die

Rolle der Cadherine als Tumorsuppressorgene mit bei verschiedenen Tumoren

auftretenden Veränderungen auf dem Chromosom 16 (Kremmidiotis et al., 1998).


Abb. 9: Interendotheliale Lückenbildung durch VE-Cadherin-Affektion (Lim et al., 2001): (1) membranäres, nicht mit dem Zytoskelett verknüpftes VE-Cadherin als "Schwachstelle" für eine Lückenbildung; (2) Dissoziation der extrazellulären VE-Cadherin-Moleküle; (3) Bildung interzellulärer Lücken an "VE-Cadherin-freien" Zellwandabschnitten

1.5.6 VE-Cadherin-vermittelte Zelladhäsion im Rahmen einer Entzündungsreaktion

Bei einer Entzündungsreaktion führt das Auseinanderweichen der VE-Cadherin-

vermittelten Zell-Zell-Adhäsion zur Ausbildung von interendothelialen Lücken (Corada et

al., 1999). Die Akkumulation von Entzündungszellen im perivasalen Gewebe infolge des

Durchtretens von Entzündungszellen durch die entstandenen Lücken erfolgt im Detail

folgendermaßen: Der Austritt von Neutrophilen aus dem Blutstrom wird von einer

Kaskade von Zelladhäsionsmolekülen und Leukozyten-aktivierenden Mediatoren, die das

Andocken von Neutrophilen an der Endothelzelloberfläche kontrollieren, initiiert.

Selektine sorgen für das Anhängen der Leukozyten am Endothel und das Entlangrollen am

selben (Hasleton und Roberts, 1999). Integrine und Adhäsionsmoleküle vermitteln die

feste Anheftung am Endothel. So spielt z. B. PECAM-1 bei der Adhäsion und

Transmigration eine Rolle (Bogen et al., 1994; Muller et al., 1993).

Neutrophile verändern dabei die endotheliale junktionale Integrität durch die Elastase-

vermittelte Proteolyse junktionaler Proteine wie VE-Cadherin (Carden et al., 1998) und

induzieren durch diesen Mechanismus ihre eigene Transmigration.

Auch im menschlichen Knochenmark führt der Verlust von VE-Cadherin-vermittelter Zell-

Zell-Adhäsion zu einer Permeabilitätssteigerung des Endothels (van Buul et al., 2002). Die

Kapitel 1 – Einleitung 22 reduzierte Zelladhäsion und der lokal begrenzte Verlust von VE-Cadherin führt zur

transendothelialen Migration von CD34+-Zellen. Der Verlust von VE-Cadherin ist

allerdings reversibel (van Buul et al., 2002).

Die große Bedeutung von VE-Cadherin für die Transmigration von Neutrophilen durch die

Endothelzellschicht wurde mittels eines VE-Cadherin-Antikörpers untermauert (Gotsch et

al., 1997). Dieser Antikörper beschleunigte in vivo durch eine gesteigerte

Gefäßpermeabilität die Rekrutierung von Neutrophilen aus dem Blut ins Gewebe.

Bei einer real-time-Darstellung (Shaw et al., 2001) mit markiertem VE-Cadherin konnte

der Vorgang der Diapedese beobachtet werden. Die Transmigration erfolgte dabei auf zwei

verschiedene Arten: 1. Transmigration durch neu entstandene Lücken im

Endothelzellverband und 2. Transmigration durch vorbestehende Endothellücken.

Bei der Migration näherten sich die Leukozyten dem kontinuierlichen Endothelverband, es

entstand eine Lücke – bzw. es bestand schon eine Lücke – und durch diese Lücke

wanderten die Leukozyten hindurch. Es konnten auch zwei Leukozyten hintereinander,

noch bevor diese wieder verschlossen wird, durch dieselbe Lücke gelangen. Sowohl die

neu entstandenen als auch die vorhandenen Lücken wurden nach einigen Minuten wieder

geschlossen (Shaw et al., 2001).

Unter inflammatorischen Bedingungen "öffnen" Endothelzellen ihre interzellulären

Junktionen und erlauben Makromolekülen und Leukozyten die Passage in das umgebende

Gewebe und damit den Angriff auf invasive Pathogene im Interstitium. Die Trennung und

Wiederherstellung des VE-Cadherin-Komplexes im Rahmen der inflammatorischen

Lückenbildung und der Transmigration von Leukozyten verlangt eine Regulation der

extrazellulären Bindungen (Baumgartner et al., 2000).

Die Cadherin-vermittelte Adhäsion zwischen Endothelzellen hat zwei Hauptfunktionen zu

erfüllen: Zum einen soll sie mechanische Stabilität gegen externe Kräfte wie Shearstress,

die auf die Junktionen einwirken, verleihen, zum anderen soll sie ein dynamisches

Zellverhalten (Veränderung der Zellgestalt und der Barriereeigenschaften) erlauben. Die

anscheinend recht niedrige Affinität zwischen den Cadherinen führte Baumgartner et al.

(2000) zu der Theorie, dass die Anzahl der Adhäsionen zwischen den Zellen durch einen

einfachen thermodynamischen Mechanismus im Organismus reguliert werden könnte.

Wie andere Membranproteine unterliegen auch Cadherine einer zufälligen seitlichen

Diffusion in der Plasmamembran, so dass die Bildung von Adhäsionen diffusionslimitiert

ist. Auf Grund der Diffusionskinetik, der kurzen Lebenszeit der Adhäsionen und der hohen

Kapitel 1 – Einleitung 23 Dissoziationskonstante dissoziieren die Adhäsionsmoleküle schnell und werden durch

laterale Diffusion getrennt. Es kommt nicht zu einer Readhäsion derselben Moleküle. Eine

große Fraktion ungebundener frei diffundierender Cadherin-Moleküle verbleibt in einem

ungebundenen Status in der Plasmamembran (Baumgartner et al., 2000).

Wird die Diffusion der Cadherine durch eine zytoplasmatische Bindung über Catenine an

das Aktin-Filament-Zytoskelett zurückgehalten, so steigt die Wahrscheinlichkeit eines

Adhäsionsmoleküls, nach der Dissoziation wieder eine Bindung einzugehen. Eine

Dissoziation der Cadherine vom Zytoskelett führt zu einer Reduktion der interzellulären

Junktionen, bedingt durch die seitliche Diffusion der Moleküle. Die Stärke der Adhäsion

zwischen den Zellen wird über den Grad der Anbindung der Cadherine an das Zytoplasma

bestimmt. Jeder Signalmechanismus, der die Anbindung der Cadherine an das Zytoskelett

ändert (z. B. durch Phosphorylierung der Catenin-Adapter-Moleküle oder durch

Modulation des Status der Aktinpolymerisation) wirkt auf die laterale Mobilität der

Cadherine und somit auf die Anzahl der Adhäsionen ein. Die transmembranäre Adhäsion

ist streng abhängig von der Affinität der extrazelluären Bindungen, d. h. der Bindung der

extrazellulären Domänen der Cadherine aneinander, und der intrazelluären Bindungen, d.h.

der Bindung von VE-Cadherin an das Zytoskelett. Die sehr niedrigen Bindungsaffinitäten

zwischen den interagierenden Cadherinen machen die Cadherine zu idealen Kandidaten für

die adhäsive Regulation durch zytoskelettale Anbindung, weil mit wenig Energie

Bindungen geknüpft und gelöst werden können (Baumgartner et al., 2000).

An der Erhaltung der Barrierefunktion sind viele Proteine beteiligt und dementsprechend

an den Zell-Zell-Junktionen konzentriert (z. B. Okkludine, Desmoplakine, Connexine,

Integrine, Cadherine, PECAM-1). VE-Cadherin, eine der Hauptkomponenten, bestimmt

maßgeblich die Stärke der Zell-Zell-Adhäsion und die Monolayer-Eigenschaften (Hordijk

et al., 1999). Das beruht vor allem darauf, dass VE-Cadherin – im Gegensatz zu PECAM-1

– an den Zell-Zell-Verbindungen mit "Actin Stress Fibers" kolokalisiert ist, ebenso wie β-

Catenin und Plakoglobin, die jeweils mit den Endpunkten der Stressfasern verknüpft sind.

In Verbindung mit den Stressfasern imponiert VE-Cadherin in einer unregelmäßigen

Verteilung an den Zell-Zell-Adhäsionen. Die Abwesenheit von Stressfasern führt zu einer

linearen Verteilung von VE-Cadherin (Hordijk et al., 1999).

Aus dieser Kolokalisation des Cadherin-Catenin-Komplexes mit den Endpunkten der

Aktin-Stressfasern ist eine funktionelle Verbindung zwischen VE-Cadherin und dem

Aktinzytoskelett abzuleiten. Inhibition von intaktem funktionierendem VE-Cadherin führt

zu einer Neubildung des Aktinzytoskeletts. Das zieht einen Verlust der junctionalen VE-

Kapitel 1 – Einleitung 24 Cadherin-Lokalisation mit reduzierter Zell-Zell-Adhäsion, steigender Permeabiliät und

wachsender Neutrophilentransmigration nach sich; Retraktionsfasern können beobachtet

werden und Lücken im Monolayer werden sichtbar (Hordijk et al., 1999).

Die Zellverbindungen aus VE-Cadherin werden von der Dynamik des Aktin-Zytoskeletts,

der Aktinpolymerisation, Organisation des Aktinzytoskeletts und Anwesenheit von

Aktinstressfasern kontrolliert. Der Verlust von VE-Cadherin führt zu einer Neu- und

Umbildung des Aktinzytoskeletts (Hordijk et al., 1999). Die Untersuchungen von Hordijk

et al. wurden an HUVEC durchgeführt.


1.6 Sepsis

1.6.1 Definition und klinisches Bild

Der Begriff Sepsis (griech. Fäulnis) bezeichnet eine lebensbedrohliche "systemische"

Infektion, bei der – von einem lokalen Infektionsherd ausgehend – kontinuierlich oder in

Schüben Erreger und deren Toxine in die Blutbahn eingeschwemmt werden, auf Grund

dessen es zu schweren Allgemeinsymptomen und im Rahmen der hämatogenen Streuung

zu metastatischer Absiedlung in andere Organe kommt.

Dementsprechend werden das Krankheitsbild und die Folgen der Sepsis durch drei

Faktoren bestimmt: 1. den in den Körper eingedrungenen Erreger, 2. die gebildeten

Produkte (Toxine) und 3. die Abwehrreaktion des Organismus. Vor allem die Freisetzung

körpereigener Mediatoren (Zytokine wie TNFα und Interleukine) wird für zahlreiche

Symptome verantwortlich gemacht.

Der Begriff Sepsis gilt nicht für Viren, Rickettsien oder für zellgebundene Bakteriämien,

bei denen die Erreger innerhalb der Blutmonozyten auftreten, ohne eine

Sepsissymptomatik hervorzurufen.

Von der Sepsis ist die Bakteriämie abzugrenzen, bei der lediglich Bakterien im Blut

nachgewiesen werden können und (noch) keine Krankheitssymptome vorliegen. Bei Sepsis

besteht hingegen eine Septikämie, d. h. eine Systemkrankheit, verursacht durch Bakterien

und deren Toxine im Blut, bei der mindestens zwei der folgenden Symptome auftreten

(1991 definiert durch die ACCP/SCCM, die Consensus Conference des American College

of Chest Physicians und der Society of Critical Care Medicine):

Temperatur > 38 °C oder < 36 °C, Tachykardie > 90/min (oder Bradykardie) bei

Ausschluss einer Herzkrankheit, Tachypnoe > 20/min als wesentliches Leitsymptom bei

Ausschluss einer Lungenkrankheit, pCO2 < 32 mmHg, Leukozyten > 12000/µl bzw.

< 3800/µl; erhöhte Anzahl von Stabkernigen, starke Reduktion der Thrombozyten.

Die Sepsis tritt bei zwei von 100 Einlieferungen ins Krankenhaus auf und betrifft folgende

Organsysteme: Niere (Infektion des oberen Harntraktes), Leber und Gallenblase, Darm im

Rahmen einer Peritonitis, Haut (Pusteln, Nekrosen, Blasen, petechiale Blutungen), Lungen

(bakterielle Pneumonie), Meningen, bei Kindern auch das Knochenmark (Osteomyelitis).

Neben der charakteristischen Hyperventilation ist die schwere Sepsis mit

Organdysfunktion und Perfusionsstörungen wie Hypoperfusion oder Hypotension

Kapitel 1 – Einleitung 26 assoziiert. Weitere Symptome sind Schüttelfrost, Oligurie, Benommenheit und

Verwirrtheit. Im Rahmen eines Diabetes mellitus kann es auch zu einer metabolischen

Entgleisung (Laktatazidose) kommen.

Die häufigsten Erreger der Sepsis sind: E. coli (Eintrittspforte über die Harnwege und den

Gastrointestinaltrakt), Staphylokokkus aureus (bei Hautinfektionen und intravasalen

Fremdkörpern), koagulase-negative Staphylokokken (bei intravasalen Fremdkörpern),

Klebsiella species (Eintrittspforte über die Harnwege), Pseudomonas aeruginosa (bei

beatmeten Patienten und Verbrennungswunden), Pseudomonas mirabilis (Eintrittspforte

über die Harnwege).

Besonders gefährdet sind stationäre Patienten hohen Alters und solche mit schweren

Allgemeinerkrankungen (Diabetes, Tumoren). Auch nach Verbrennungen, großen

Operationen, invasiver Diagnostik und unter immunsuppressiver Therapie bzw. bei

Immunschwäche ist das Risiko an einer Sepsis zu erkranken erhöht. Venenverweilkatheter,

chirurgische Drainagen und Dekubitus stellen bei hospitalisierten Patienten Risikofaktoren

für eine Sepsis dar.

Fulminante Verlaufsformen der Sepsis sind das Waterhouse-Friederichsen-Syndrom

(ausgelöst durch Meningokokken, einhergehend mit Nebennierenblutungen, petechialen

Hautblutungen und Verbrauchskoagulopathie), eine Sepsis nach Splenektomie und das

"Toxic Shock Syndrom" (ausgelöst durch Stayphylokokken oder Strepktokokken).

Eine schwere Form der Sepsis kann zum septischen Schock mit

Multiorganfunktionsstörung und schließlich zum Exitus letalis führen.

Die Therapie besteht aus Herdsanierung und Antibiotikagabe.

1.6.2 Pathophysiologie

Entscheidend für die Pathophysiologie der Sepsis ist die Freisetzung von Endotoxinen ins

Blut (= Endotoxinämie) (Faure et al., 2001). Das Endotoxin schädigt die Elemente des

RHS (= retikulohistiozytäres System) und blockiert dadurch die phagozytäre

Abwehrkomponente, vor allem schädigt es aber die Gefäßendothelien. Im Mittelpunkt der

Pathogenese der Sepsis steht die ebenfalls zytokin-induzierte mikrozirkuläre Dysfunktion

(Lehr et al., 2000; Mutunga et al., 2001; Wong et al., 1999). Die Konsequenzen der

mikrozirkulären Dysfunktion sind der Zusammenbruch der endothelialen und epithelialen

Barrierefunktion, die zu Gewebeödem und unkontrollierter inflammatorischer

Kapitel 1 – Einleitung 27 Zellinfiltration führt, die Vasodysregulation, die zur Bildung arteriovenöser Shunts

und/oder dem Verlust des peripheren Widerstandes mit erheblichen

makrohämodynamischen Konsequenzen wie z. B. Tachypnoe/Tachykardie und

Kreislaufzentralisation führt und die Störung des Sauerstofftransports und -verbrauchs der

Gewebezellen (Lehr et al., 2000). Das Endotoxin führt des Weiteren zu einer Aktivierung

und Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen und Leukozyten. Dies trägt ebenfalls

zum Gewebeschaden bei (Lehr et al., 2000).

Auf Grund dieser Mechanismen führt der weitreichende Endothelschaden zu

Organdysfunktion und -schaden (Mutunga et al., 2001).


1.7 ARDS

1967 wurde das akute Atemnotsyndrom des Erwachsenen ("Acute Respiratory Distress

Syndrome") erstmals von Ashbaugh et al. in Zusammenhang mit einem akuten

Lungenversagen beschrieben. Es handelt sich dabei um eine akute respiratorische

Insuffizienz bei vorher lungengesunden Patienten durch pulmonale Schädigungen

unterschiedlicher Genese, die mit einem nicht-kardiogenen Lungenödem einhergeht.

1994 definierte die "American-European Consensus Conference on ARDS" das

Atemnotsyndrom folgendermaßen: (a) akuter Beginn, (b) bilaterale Infiltrate auf dem

frontalen Röntgen-Thorax-Bild, (c) pulmonaler arterieller Verschlussdruck bei pulmonaler

arterieller Kathetermessung ≤ 18 mmHg oder keine klinischen Anzeichen einer Links-

Herz-Hypertonie, (d) verringerte Oxygenierung mit PaO2/FIO2 ≤ 200 Torr, unabhängig

von der Höhe des endexpiratorischen Druckes.

1.7.1 Ätiologie

Ausgelöst wird das ARDS durch direkte oder indirekte Schädigung der Lunge. Die direkte

pulmonale Schädigung wird z. B. durch Magensaftaspiration, Beinahe-Ertrinken,

Rauchvergiftung, Vergiftung mit verschiedenen Toxinen sowie Drogenabusus, O2-

Vergiftung, primäre bakterielle und virale Pneumonien verursacht.

Indirekte pulmonale Schädigung kann z. B. durch Sepsis, Fettembolie, Verbrennungen,

Thoraxtrauma, kardiopulmonalen Bypass, prolongierten Schock, massive Bluttransfusion

und akute hämorrhagische Pankreatitis entstehen.

ARDS entwickelt sich in 20 - 50 % bei Patienten nach schweren Störungen wie multiplem

Trauma, Sepsis oder Schock. Des Weiteren wird geschätzt, dass in mehr als 30 % der Fälle

eine Sepsis die auslösende Ursache für ein ARDS ist.

1.7.2 Pathogenese unter Berücksichtigung der Pathophysiologie

Das ARDS ist eine akute Funktionsstörung der Gasaustauschstrecke der Lunge im Bereich

von Kapillaren, Interstitium und Alveolen.

Die Blut-Luft-Schranke ist für den Gasaustausch zwischen Alveolarluft und Blut

verantwortlich. Wird die Schranke geschädigt – wie dies beim ARDS der Fall ist – können

Bestandteile aus dem Blut in die Alveolen übertreten und ein Ödem ausbilden.

Die Blut-Luft-Schranke besteht aus:

Kapitel 1 – Einleitung 29 1. Zytoplasma der dünn ausgezogenen (kapillären) Endothelzellen, 2. miteinander

verschmolzenen Basalmembranen der Kapillarwand und des Alveolarepithels (= alveoläres

Interstitium, normalerweise ein virtueller Spalt), 3. Zytoplasma der Alveolarepithelzellen,

Alveolarepithelzellen Typ I (Deckzellen) und Alveolarepithelzellen Typ II

(Surfactantproduktion), und die 4. Schicht aus Surfactant.

Unabhängig von der Ätiologie des ARDS verläuft die Schockreaktion in der Lunge in drei

Phasen:

1. Exsudative Phase mit gesteigerter Kapillarpermeabilität und interstitiellem Lungenödem

2. Alveoläres Lungenödem, Untergang der Pneumozyten Typ II mit verminderter Synthese

des Surfactant-Factors, Bildung hyaliner Membranen und Ausbildung intrapulmonaler

Shunts mit Folge einer Hypoxie sowie Mikroatelektasen

3. Proliferative Phase mit Ausbildung einer Lungenfibrose und einer Endothelproliferation

der Alveolarkapillaren (irreversibles Stadium)

Charakteristisch für das ARDS ist der exzessive Entzündungsprozess in den Lungen, der

im weiteren Verlauf bis zur Fibrose fortschreiten kann (Hasleton und Roberts, 1999):

Innerhalb von 24 - 48 Stunden nach dem ursprünglichem Auslöser entwickeln sich

zunächst sog. Frühveränderungen bestehend aus einem – wohl nur funktionellen – Schaden

der Gefäßwand, der einen Flüssigkeitsübertritt aus den Blutgefäßen in das Interstitium der

Alveolarwandungen ermöglicht (Müller und Grundmann, 1980). Für den akuten

Lungenschaden ist ein komplexes Zusammenspiel zwischen pro- und anti-

inflammatorischen Mediatoren verantwortlich (Hasleton und Roberts, 1999). Unabhängig

von der Ätiologie des Schockgeschehens werden die klassischen Mediatorsysteme der

Entzündung (Kinin-, Gerinnungs-, Histamin-, Komplementsystem und

Arachidonsäurekaskade) in Gang gesetzt, die sich gegenseitig verstärken. Dies führt zu

einer Aktivierung der pulmonalen Makrophagen und Granulozyten. Der kapilläre

Endothelzellverband wird über die Alteration von VE-Cadherin für diese Zellen permeabel

(= erhöhte Kapillarpermeabilität). Die Entzündungszellen und Erythrozyten gelangen in

den sonst nicht existenten Alveolarspalt und bilden damit das hämorrhagische interstitielle

Ödem (erst serös, dann serofibrinös) aus. Das Ödem bewirkt eine Reduzierung der

Lungencompliance, so dass die Atemarbeit erschwert wird. Dies äußert sich in einer

Hypoxämie und einer Hyperventilation mit respiratorischer Alkalose. Im Röntgenbild sind

die hilusnahen Gefäße spindelförmig aufgetrieben, die bilateralen Infiltrate repräsentieren

das proteinreiche Ödem (Hasleton und Roberts, 1999).

Kapitel 1 – Einleitung 30 Die Zellschädigung greift nachfolgend auch auf das alveoläre Epithel über. Da die

Alveolarepithelzellen Typ II kein Surfactant mehr produzieren, entstehen Atelektasen. Der

Zellverband zwischen Alveolarepithelzellen Typ I und II wird aufgelockert mit der Folge

eines alveolären Ödems.

Infolge dieser Endothel- und die Epithelzellschichtschädigung erreicht das fibrinreiche

Exsudat die Oberfläche der Alveolen. Dort bildet es zusammen mit den Zelltrümmern

bereits nach 24 Stunden hyaline Membranen (breite, PAS-positive Niederschläge)

(Hasleton und Roberts, 1999). Durch die die Alveolen tapetenartig auskleidenden hyalinen

Membranen wird der Gasaustausch weiter behindert, es kommt zur Hypoxie. Die Atemnot

nimmt zu und im Röntgenbild erscheinen beidseitige schleierartige Verschattungen der

Lungenfelder infolge Ausdehnung des Ödems in das alveoläre Interstitium.

Die Lungen sind makroskopisch dunkel, rötlich-blau und schwer (Abb. 10) – mit einem

Gewicht von 1000g und mehr. Die Schnittfäche zeigt ein hämorrhagisches Ödem

(Hasleton und Roberts, 1999).

Abb. 10: Links: makroskopisches Bild einer blutreichen Lunge bei ARDS; Mitte und rechts: histologisches Bild bei ARDS mit Ausbildung hyaliner Membranen, eines intravasalen Ödems und blutgefüllter Kapillaren

Nach ca. einer Woche beginnt die irreversible Phase des ARDS, die durch eine

sklerosierende Alveolitis bedingt ist. Die alveolokapilläre Membran wird reepithelialisiert

bzw. reendothelialisiert. Dadurch verbreitert sich die Alveolenwand und steht – in

Abhängigkeit von ihrer Breite – für den Gasaustausch nicht mehr zur Verfügung.

Zusätzlich zur Diffusionsstörung liegt eine Perfusionsstörung vor, da die Gefäße teilweise

durch Mikrothromben verstopft oder zerstört sind. Hieraus resultiert eine respiratorische

Globalinsuffizienz (Hypoxämie und Hyperkapnie) und eine respiratorische Azidose. Die

Proliferation interstitieller Myofibroblasten trägt einen weiteren Teil zur Fibrosierung bei.

Die Fibrosierung im Bereich der Alveolarwandungen ist im Röntgenbild anhand einer

kontinuierlichen Zunahme einer streifig-netzförmigen und reiserartigen Eintrübung und

Verdichtung der Lungen abzulesen (Müller und Grundmann, 1980).

Kapitel 1 – Einleitung 31 Die Lungen sind in diesem Stadium solide, fleischig und rötlich-grau (Hasleton und

Roberts, 1999).

Aus den beschriebenen Veränderungen ergeben sich verschiedene Befunde auf zellulärer

und subzellulärer Ebene (Abb. 11):

Das ARDS resultiert letztendlich aus der endothelialen Dysfunktion, die sich in

pulmonalen Mikrogefäßen entwickelt und in die vor allem Endothel-Leukozyten-

Interaktionen – insbesondere die Rekrutierung der zirkulierenden Leukozyten vom

Gefäßlumen in die Lungenalveolen – involviert sind (Carden et al., 1993; Grau et al., 1996;

Moss et al., 1996; Orfanos et al., 2004; Xiao et al., 1997).

Das Lungenendothel und dessen Permeabilität haben großen Anteil an der Entwicklung des

ARDS (Donnelly et al., 1994). Die Endothelzellauskleidung der Lungengefäße bildet

zwischen Blut und Interstitium eine semipermeable Barriere, welche beim ARDS zu

Schaden kommt, was wiederum zu einer gesteigerten Permeabilität mit Bildung eines

Ödems führt (Lewis und Martin, 2004; Matthay et al., 2003; Orfanos et al., 2004).

Die Schädigung der Endothelbarriere führt vor allem zu einer veränderten Zell-Zell-

Adhäsion. Diese ist der initiale Schritt für die Leukozytenmigration, die ihrerseits die

Permeabilität weiter verstärkt, sowie für den Durchtritt proteinreicher Flüssigkeit ins

Interstitium (Hasleton und Roberts, 1999). Dieser Prozess geschieht z. B. durch die

Hochregulation der endothelialen, aber auch leukozytären, Adhäsionsmoleküle (Adams

und Shaw, 1994). So aktiviert beispielsweise LPS Endothelzellen mit konsekutiver

Expression von Adhäsions- und Signal-Molekülen und lokaler PMN-Akkumulation (Hogg

und Doerschuk, 1995). Auch E-selectin, vWf und ICAM-1 sind bei ARDS-Patienten

erhöht (Moss et al., 1996). Adhäsionsmoleküle nehmen somit in der Pathogenese des

ARDS eine zentrale Stellung ein (Agouridakis et al., 2002).

Der Leukozyten-vermittelte Gewebeschaden ist eine Hauptkomponente des ARDS

(Bevilacqua, 1993; Bhatia et al., 2000; Weinacker und Vaszar, 2001). Die Aktivierung

zirkulierender Neutrophiler, die Adhäsion an und die Migration der Neutrophilen durch die

Oberfläche der Endothelzellschicht repräsentieren wichtige Schritte der Zellaktivierung, in

den Veränderungen der Endothelpermeabilität sowie in der Ausbildung eines pulmonalen

Ödem (Carden et al., 1998; Carden et al., 1993; Grau et al., 1996; Xiao et al., 1997).

Neutrophile reduzieren die endotheliale junktionale Integrität durch die Elastase-

vermittelte Proteolyse junktionaler Proteine wie VE-Cadherin. Im Einklang dazu steht,

dass bei ARDS-Patienten lösliches VE-Cadherin zu finden ist – untersucht an HUVEC von

Carden et al. (1998).

Kapitel 1 – Einleitung 32 Neben Neutrophilen, die eine Schlüsselrolle beim ARDS spielen, sind auch Eosinophile

und Makrophagen mit in die Pathogenese einbezogen (Albelda et al., 1994). Letztere sind

verantwortlich für ALI bei neutropenischen Patienten (Albelda et al., 1994). Die

Aktivierung dieser Zellen beim ARDS führt zu einer massiven Freisetzung von Zytokinen

(Grau et al., 1996), die beim ARDS als Signalmoleküle fungieren und die

inflammatorische Antwort auf lokaler und systemischer Basis initiieren und verstärken

(Bhatia und Moochhala, 2004; Park et al., 2001).

Der zytokininduzierte Zusammenbruch der mikrovaskulären Barrierenfunktion resultiert in

einem Lungenödem, assoziiert mit dem Syndrom des akuten Lungenversagen (Petrache et

al., 2003; Wong et al., 1999). In der Frühphase des ARDS sind verschiedene

inflammatorische Mediatoren in der bronchioloalveolären Lavage erhöht wie z. B.

Endotoxin-bindende Proteine, TNFa, IL-1, IL-6, Chemokine und adhäsive Moleküle

(Agouridakis et al., 2002). Die steigende endotheliale Lungenpermeabilität wird durch die

freigesetzten Zytokine induziert, aber auch andere Agenzien, Thrombin und mechanische

Reizung aktivieren das Endothel ähnlich den Zytokinen (Dudek und Garcia, 2001).

Somit koordinieren Zytokine, v. a. IL-1 und TNFa, sowie Endothelzellen, Leukozyten und

Adhäsionsmoleküle eine Kaskade von Interaktionen zwischen Leukozyten und

Endothelzellen, die in einem Gewebeschaden resultieren.

Abb. 11: Pathogenese des ARDS: Auslösendes Krankheitsereignis – Einwanderung von Zellen und Freisetzung von Zytokinen – Leukozytenaktivierung mit Durchwanderung derselben durch das instabile Endothel –> ARDS (Bhatia und Moochhala, 2004)

Kapitel 1 – Einleitung 33 1.7.3 Klinisches Bild

Charakteristisch für ein ARDS ist der Anstieg der Atemfrequenz gefolgt von in nur

wenigen Stunden auftretender Dyspnoe. Infolge intrapulmonaler Rechts-Links-Shunts

kommt es zu einer schweren (teils therapierefraktären) Hypoxämie mit deutlich reduzierter

Compliance. Auf Grund der peripheren Vasodilatation kommt es zu einem Blutdruckabfall

und evtl. einem Entgleiten in den Schockzustand – verbunden mit Organschäden.

1.7.4 Prognose

Die Letalität beträgt beim ARDS 20 - 30 %. Allerdings variiert die Letalität stark von der

Ätiologie. Alkoholanamnese und vorbestehende Lungenerkrankung sowie Rauchen

verschlechtern die Prognose. Die höchste Letalität (> 80 %) besteht bei einem ARDS durch

septisches Multiorganversagen.

1.7.5 IRDS

Das Atemnotsyndom des Neugeborenen (IRDS; Infant Respiratory Distress Syndrome) ist

eine restriktive Lungenerkrankung, die sich bei unreifen Neugeborenen infolge eines

absoluten oder relativen Surfactantmangels bildet. Das Surfactant (Surface Active Agent)

wird von den Pneumozyten Typ II gebildet und besteht überwiegend aus verschiedenen

Phospholipiden. Es trägt zur Stabilität des Alveolarsystems bei, indem es die

Oberflächenspannung der Alveolen reduziert, sodass sie nicht kollabieren. Beim IRDS

kommt es daher infolge des Surfactantmangels zum Alveolarkollaps in der Expiration, eine

reguläre Atmung des Kindes ist nicht möglich. Durch die versuchte Belüftung entsteht eine

Überdehnung der terminalen Bronchiolen, während die Kapillaren kollabiert bleiben und

Atelektasen ausgebildet werden. Gegebenenfalls treten sekundäre Schäden, z. B. durch

Sauerstofftoxizität, hinzu. Beim IRDS ist – wie auch beim ARDS – das führende

histologische Zeichen die Ausbildung sog. hyaliner Membranen.

Die Behandlung besteht in der Substitution mit natürlichem Surfactant und der

symptomatischen Therapie (Sauerstoffgabe) sowie der Prävention.

Risikofaktoren für die Ausbildung eines IRDS sind Frühgeburt, Diabetes mellitus der

Mutter und Stress während der Entbindung, der zur Azidose des Neugeborenen führt.

Das IRDS hat somit eine vollkommen andere Ätiopathogenese als das ARDS und darf

daher keinesfalls als "ARDS des Neugeborenen" bezeichnet werden.


1.8 Endothelzellkulturen

Zellkulturen sind Kulturen lebender Zellen, die aus einem beliebigen Organ isoliert wurden

und sich unter sterilen Bedingungen in geeigneten Nährmedien in vitro durch Mitose

vermehren. Die Zellen werden in speziellen Kulturgefäßen ausgesät, in regelmäßigen

Abständen "geerntet" und in neue Kulturgefäße aufgeteilt. Die Vermehrung der Zellen

erfolgt in hinsichtlich Temperatur, Feuchtigkeit und pH-Wert körpersimulierenden

Inkubatoren, da nur eine "körperähnliche" Umgebung Wachstum und Differenzierung der

Zellen ermöglicht.

Die Verwendung von Gewebe-/Zellkulturen ist seit Beginn des 20. Jahrhunderts

dokumentiert: Harrison glückte 1907 die In-vitro-Kultivierung von Gewebe aus einer

Kaulquappen-Nervenfaser in Froschlymphe. In den frühen 70ern des letzten Jahrhunderts

wurden Methoden zur Kultivierung von Endothelzellen entwickelt.

Zellkulturen, entwickelt als Ersatz für Tierversuche, erlauben die Untersuchung zellulärer

Regulationsmechanismen unter standardisierten Bedingungen. Heute spielen Zellkulturen

u. a. in der Entwicklung und Erforschung von Arzneimitteln eine Rolle: So können anhand

von Zellkulturmodellen molekularpharmakologische Prüfungen durchgeführt werden, die

zum Verständnis der Wirkung von Arzneistoffen und Xenobiotika (= Substanzen wie

Antigene oder Toxine, die den Körper zu Abwehrreaktionen veranlassen) beitragen.

Darüber hinaus kann der Metabolismus und die Biotransformation bestimmter Substanzen

auf der In-vitro-Ebene ermittelt werden, was eine gezielte Planung toxikologischer

Prüfungen ermöglicht. Zellkulturen sind außerdem geeignet, den Wirkungsmechanismus

von Xenobiotica auf molekularer Ebene zu untersuchen (z. B. Enzyminduktion,

Protoonkogenexpression). Durch das Einschleusen von Genen in Zellen kann deren

Funktion analysiert werden. Viren und intrazelluläre Bakterien können ebenfalls mit Hilfe

der Zellkultur untersucht werden. Aus Gewebe isolierte Zellen haben inzwischen klinische

Relevanz in der Zell- und Stammzelltherapie sowie im "Tissue Engineering".

Die Zellkultur stößt allerdings an ihre Grenzen, wenn es darum geht, übergeordnete

systemische Prozesse in Organsystemen oder im Gesamtorganismus zu untersuchen.


1.9 LPS


Das LPS (Lipopolysaccharid) – auch Endotoxin genannt – ist ein Bestandteil der Zellwand

gramnegativer Bakterien. Chemisch handelt es sich um ein Molekül, das aus Zuckern und

Fettsäuren besteht (Lipopolysaccharid). Es ist in höheren Konzentrationen sehr toxisch und

kann daher als wichtiger Virulenzfaktor aller gramnegativen Bakterien angesehen werden.

Als eine Hauptkomponente in der Pathogenese gramnegativer bakterieller Infektionen

(Morrison und Ryan, 1987) löst es im Menschen eine Vielzahl von Effekten aus wie

Fieber, Entzündung, septischer Schock, Blutdruckabfall oder die Freisetzung zytotoxischer

Botenstoffe. Im Extremfall kann es letal wirken. Im Menschen führt es zur Bildung von

Antikörpern, welche die schädlichen Wirkungen neutralisieren können.

1.9.2 Struktur

Das LPS weist drei Teilkomponenten auf (Abb. 12):

1. Das Lipid A, ein Phosphoglykolipid.

2. Eine relativ konstante Polysaccharid-Kernregion (Core): Die innere Kernregion, die mit

dem Lipid A in Verbindung steht, enthält "ausgefallene" Zucker, sowie drei teils

phosphorylierte Heptosen. Die daran anschließende äußere Kernregion besteht aus fünf

Hexosen.

3. Eine äußere Polysaccharidkette bestehend aus bis zu 25 sich wiederholenden Einheiten

von drei bis fünf verschiedenen Zuckerbausteinen, die von Keim zu Keim sehr variieren.

Diese nach außen ragenden Strukturen des LPS stellen die für die serologische Typisierung

wichtigen Antigene dar (sog. O-Antigene). Korrekt wird nur das Lipid A als Endotoxin

bezeichnet.


Abb. 12: Schematische Struktur des LPS bestehend (von innen nach außen) aus Lipid A, Kernregion (mit dem inneren und äußeren Kern) und O-Antigen (Knierim, 2000)

1.9.3 Pathophysiologie

Wenn Gram-negative Bakterien sich vermehren oder sterben wird LPS – und somit Lipid

A – aus der Zellwand freigesetzt. Das Lipid A führt nun mit Hilfe von LBP

(Lipopolysaccharid bindendes Protein) zur Ausschüttung von proinflammatorischen

Zytokinen und Mediatoren aus Granulozyten, Endothelzellen, Lymphozyten, Monozyten

und Makrophagen. Dadurch werden die typischen Endotoxineffekte wie Akut-Phase-

Reaktion, Blutdruckabfall sowie Verbrauchskoagulopathie und Schock induziert. Diese

durch das LPS ausgelöste Kaskade ist entscheidend an der Entstehung der Sepsis beteiligt

(Pugin et al., 1993).

Das Lipopolysaccharid bindende Protein (LBP) ist ein Akut-Phase-Protein, das von

Hepatozyten synthetisiert und ins Blut abgegeben wird (Tobias et al., 1986). Die

Serumkonzentration steigt im septischen Schock an. LBP besitzt eine starke

Bindungsaffinität zu LPS. Niedrig konzentriertes LBP transportiert LPS an den zellulären

LBP-Rezeptor von z. B. Monozyten und Makrophagen und verstärkt so die Wirkung von

Kapitel 1 – Einleitung 37 LPS (Bannerman und Goldblum, 1999; Lamping et al., 1998). Beispielsweise wird

dadurch die Zytokinausschüttung von Monozyten um den Faktor 100 bis 1000 verstärkt.

Eine protektive Funktion von LBP im Bezug auf die Auslösung einer Sepsis wird durch die

Applikation hoher Konzentrationen von LBP erzielt (Lamping et al., 1998). Auch

Lipoproteine hoher Dichte (HDL) können LPS binden und inaktivieren. Bei der Interaktion

zwischen Lipoproteinen und LPS handelt es sich um eine physiologische Reaktion des

Organismus auf bakterielle Endotoxine bei Sepsis (Knierim, 2000).

1.9.4 Funktion

Das Lipopolysaccharid ist eine wichtige Komponente der äußeren Oberfläche von

gramnegativen Bakterien und zugleich ein potenter Aktivator von Zellen des

Immunsystems und des inflammatorischen Systems wie Makrophagen, Monozyten und

Endothelzellen (Heumann et al., 1998). Vor allem die Gefäßendothelzellen und

Makrophagen sind Ziele des LPS und verschiedener Zytokine (Mantovani et al., 1992;

Morrison und Ryan, 1987).

LPS induziert direkt am Endothel verschiedene Reaktionen (Bannerman und Goldblum,

1999): Die Aktivierung des Gefäßendothels durch LPS resultiert in einer endothelialen

Produktion und Sekretion von verschiedenen proinflammatorischen Molekülen

(Leukozytenadhäsionsmolekülen) sowie löslichen Zytokinen und Chemokinen (Morrison

und Ryan, 1987). Dazu gehört die gesteigerte Expression von u. a. Plasminogen Aktivator

Inhibitor Typ 1, IL-1, IL-6, IL-8, Tissue Factor, Zelladhäsionsmolekülen und NO

(Bannerman und Goldblum, 1999; Bauer et al., 2000). Endotoxine können auch die

Produktion und Freisetzung einer Reihe von Mediatoren wie Anaphylatoxine,

Prokoagulanzien, Interleukine, Leukotriene, Prostaglandine, Platelet Activating Factor,

TNF und Interferon induzieren (Morrison und Ryan, 1987). LPS aktiviert somit multiple

Mediatorsysteme, die zusammen mit ihren Nebenprodukten die Endothelzellfunktion

beeinflussen können (Bannerman und Goldblum, 1999).

LPS kann direkt und indirekt die Oberflächenexpression der Adhäsionsmoleküle – und

damit auch die Leukozytenadhärenz an der Endothelzelloberfläche – steigern (Bannerman

und Goldblum, 1999). Es interagiert direkt mit den Endothelzellen und führt über den

Verlust der endothelialen Barrierefunktion (in vivo und in vitro) und die Disruption der

Monolayerintegrität zu einer endothelialen parazellulären Transmigration (Bannerman und

Goldblum, 1999; Bannerman et al., 1998; Goldblum et al., 1994; Goldblum et al., 1993;

Szabo et al., 1998). Dies wurde in mikro- und makrovaskulären Endothelzellen für

Kapitel 1 – Einleitung 38 verschiedene Tierspezies sowie den Menschen nachgewiesen (Bannerman und Goldblum,

1999).

1.9.5 Bedeutung im Hinblick auf die Sepsis

Pathogenetisch von großer Bedeutung für die Entwicklung eines ARDS ist die

Endotoxämie (Meyrick et al., 1995). Die gramnegative Komponente, die für die

Endothelzellschädigung bei gramnegativer Sepsis verantwortlich ist, ist das LPS

(Bannerman und Goldblum, 1999; Bannerman et al., 1999). Dessen systemische

Freisetzung kann Lungenzellen schädigen und zu den pathomorphologischen Zeichen

eines ARDS mit steigender Kapillarpermeabilität, Leukozyteninfiltration, mikrozirkulärer

Stase und disseminierter intravasaler Gerinnung führen (Lehr und Arfors, 1994; Ulevitch et

al., 1975).

Das klinische Syndrom des septischen Schocks resultiert allerdings aus den kombinierten

Effekten der Mediatoren, die LPS-induziert u. a. vom Endothel und Makrophagen

freigesetzt werden (Morrison und Ryan, 1987).

Die Verabreichung von LPS an Tiere zeigt Endothelzellveränderungen wie bei Gram-

negativer Sepsis (Ulevitch et al., 1975). In Übereinstimmung mit klinischen

Beobachtungen an Sepsispatienten wurde in zahlreichen Tiermodellen beschrieben, dass

die Injektion von Endotoxin in einer Aktivierung und Adhäsion von Leukozyten an

Endothelzellen mit konsekutiver Transmigration und Gewebeschädigung resultiert (Lehr et

al., 2000).

Die Freisetzung von LPS bedingt also systemische Veränderungen, die in schweren Fällen

zum septischen Schock führen können (Haimovitz-Friedman et al., 1997; Heumann et al.,

1998; Morrison und Ryan, 1987; Opal und Cohen, 1999).

Eine zentrale Rolle beim septischen Schock spielt die Endothelzelldysfunktion

(Bannerman et al., 1998). LPS induziert über PTKs und Caspasen eine gesteigerte

Tyrosinphosphorylierung mit darausfolgendem Zerreißen von Zonulae Adhärentes-

Proteinen und damit eine Barrieredysfunktion sowie das Auseinanderweichen von

Endothelzellen (Abb. 13) (Bannerman et al., 1998). Bei LPS-exponierten Endothelzellen

kommt es dosis- und zeitabhängig zur Spaltung der Komponenten des Cadherin-Catenin-

Komplexes β- und γ-Catenin. Die anderen Komponenten des Komplexes, Cadherin, α-

Catenin und p120, bleiben intakt (Bannerman et al., 1998). Die Endothelzellen adhärieren

an der betroffenen Stelle nicht mehr aneinander und auch die Verbindung zum Zytoskelett

ist nicht mehr länger gegeben.

Kapitel 1 – Einleitung 39 Der resultierende Endothelschaden steuert zur Entwicklung eines Multiorganschadens –

einschließlich ARDS – bei (Bannerman und Goldblum, 1999; Faure et al., 2001).

LPS induziert auch eine disseminierte endotheliale Apoptose, die zum endotoxischen

Schock führt (Bannerman et al., 1998; Haimovitz-Friedman et al., 1997).

Des Weiteren besteht eine Synergie zwischen LPS und IFNγ bei der Induktion von mit

gramnegativer Sepsis assoziiertem Schock (Faure et al., 2001).

Abb. 13: Schema der LPS-induzierten Spaltung des Endothelmonolayers: LPS induziert über PTKs und Caspasen eine gesteigerte Tyrosinphosphorylierung –> Spaltung von Cadherin-Adhäsionen mit Barrieredysfunktion durch Auseinanderweichen von Endothelzellen (Bannerman et al., 1998)


1.10 TNFα (TNF-alpha)


TNFα ist ein Mitglied der Familie der Zytokine, die die Expression von Akute Phase

Proteinen in der Leber induzieren. Ursprünglich wurde TNFα auf Grund seiner starken

Toxizität gegen Tumorzellen identifiziert und danach benannt (Carswell et al., 1975). Es

gibt verschiedene Synonyme für TNFα (Cachectin, Nekrosin, Haemorragic Factor,

Endogenous Pyrogen), die die zahlreichen Funktionen von TNFα widerspiegeln.

Das menschliche TNFα Gen liegt auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6. Das komplette

Genprodukt ist ein nicht-glykosyliertes Protein, das aus 157 Aminosäuren besteht. TNFα

formt Dimere und Trimere.

1.10.2 Expression

TNFα wird von verschiedenen Zelltypen produziert. Die wichtigsten Zellen sind

Monozyten, Fibroblasten und Endothelzellen. Auch Makrophagen, T- und B-

Lymphozyten, neutrophile Granulozyten, glatte Muskelzellen, Chondrozyten,

Osteoblasten, Mastzellen, Gliazellen und Keratinozyten produzieren in stimuliertem

Zustand TNFα. Menschliche Milch enthält ebenfalls TNFα. Physiologische Stimuli für die

Synthese von TNFα sind IL-1, IL-2, Interferone, GM-CSF, Substanz P, Bradykinin,

Immunkomplexe, bakterielle Endotoxine (LPS), virale Infektionen, PDGF,

Cyclooxygenaseinhibitoren, PAF (Platelet Activating Factor), Histogranin und Oncostatin

M. In Endothelzellen und Fibroblasten kann auch durch IL-17 die TNFα -Synthese

induziert werden. TNFα kann abhängig vom Zelltyp seine eigene Synthese fördern oder

inhibieren. Die Produktion von TNFα wird durch IL-6, Vitamin D3, Prostaglandin E2,

Dexamethasone, Cyclosporin A und Antagonisten des PAF gehemmt.

1.10.3 Rezeptoren

Es existieren zwei verschiedene Rezeptoren (R): Der 55 kDa TNF-R1 (p55) und der 75

kDa TNF-R2 (p75). Sie werden auf allen somatischen Zelltypen mit Ausnahme von

Erythrozyten exprimiert. p55 wird auf Zellen exprimiert, die für die zytotoxische

Komponente von TNFα empfänglich sind. Daher spielt er eine nennenswerte Rolle in der

Abwehr von Mikroorganismen und ihren pathogenen Faktoren. p75 ist vor allem auf

Zellen myeloischen Ursprungs nachzuweisen, z. B. stimulierten T- und B-Lymphozyten.

Daraus ergeben sich die verschiedenen Funktionen von TNFα auf unterschiedlichen

Zelltypen. Interferon-α, -β und -γ induzieren die Expression der TNFα Rezeptoren.

Kapitel 1 – Einleitung 41 1.10.4 Funktionen

TNFα führt bei Tumoren zur Zytolyse und Zytostase von Tumorzellen (u. a. durch

Apoptose). Es steigert die Phagozytose und Zytotoxizität der Neutrophilen. Durch eine

Interaktion mit dem p55-Rezeptor kann TNFα Gefäßschäden an Endothelzellen induzieren

und so Tumorgefäße zerstören (Ferrero et al., 2004).

In vielen Zellen wie z. B. Fibroblasten, Makrophagen, Leukozyten oder Fettzellen führt

TNFα zur Induktion verschiedenster Prozesse.

Am Endothel wirkt TNFα oft zusammen mit IL-1. Hier hat es Einfluss auf die

Antikoagulation und Thrombose (Mantovani et al., 1997; Morrison und Ryan, 1987). Es

hemmt des Weiteren das Endothelzellwachstum in vitro und fördert die Angiogenese in

vivo. TNFα und IL-1 induzieren die Produktion von Prostaglandinen, Platelet-Activating-

Factor (PAF) und NO in Endothelzellen (Mantovani et al., 1997).

TNFα ist der bedeutendste Mediator der Wirtsabwehr gegen gramnegative Bakterien und

Parasiten. Es ist verantwortlich für verschiedene Reaktionen des Organismus bei

gramnegativer Sepsis:

1. TNFα induziert die Synthese neuer Oberflächenrezeptoren auf Endothelzellen.

Über den Rezeptor p55 führt es zu einer gesteigerten Expression der Zelladhäsions-

moleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 in HUVEC (Bevilacqua, 1993; Bevilacqua et

al., 1987; Rival et al., 1996). Die durch TNFα gesteigerte Expression von

Adhäsionsmolekülen (Jersmann et al., 2001) mit konsekutiver Zunahme der

Leukozytenadhäsion geht mit einer gesteigerten Permeabilität einher (Shaw et al., 2001a).

2. TNFα aktiviert Leukozyten, die nun Mikroorganismen leichter zerstören können.

3. TNFα stimuliert das Endothel, die mononukleären Phagozyten und andere Zelltypen zur

Produktion von Zytokinen (Hasleton und Roberts, 1999) und Chemokinen (Mantovani et

al., 1997). Zytokine sind essentielle Komponenten der eigenen Abwehr während

Verletzung, Entzündung und Immunantwort (Shaw et al., 2001a). Sie führen durch

Veränderungen in der Mikrovaskulatur über NO und Prostaglandine und durch eine

Induktion von Adhäsionsmolekülen und chemotaktischen zell- und gewebsspezifischen

Zytokinen zu einer Einwanderung der Leukozyten in die Lungen – bedingt durch

Chemotaxis, nachfolgende Endotheladhärenz und schließlich Transmigration (Hasleton

und Roberts, 1999; Mantovani et al., 1992).

TNFα ist eines der Zytokine, die NF κ-B (Nuclear Factor Kappa-B) aktivieren. NF κ-B ist

ein wichtiger Transkriptionsfaktor für die maximale Expression vieler Zytokine, die in die

Pathogenese von Entzündungskrankheiten involviert sind. NF κ-B ist auch an der

Kapitel 1 – Einleitung 42 Pathogenese des ARDS beteiligt und eine wichtige Teilkomponente bei der neutrophilen

Entzündungsreaktion (Hasleton und Roberts, 1999).

4. TNFα schützt die Zellen – ähnlich den Interferonen – gegen Viren.

5. TNFα induziert Fieber durch Freisetzung von IL-1 aus Makrophagen und wirkt auch

selbst pyrogen (Morrison und Ryan, 1987).

6. TNFα hemmt die Lipoproteinlipase in Adipozyten (klinisches Bild: Kachexie).

7. TNFα bildet bei einer akuten bakteriellen Infektion Akute Phase Proteine in der Leber.

8. TNFα hat Fibroblasten, Monozyten und Osteoklasten als Zielzellen bei Rheumatoider

Arthritis.

9. TNFα steuert die komplizierten Interaktionen zwischen verschiedenen Zellpopulationen.

So koordinieren beispielsweise Zytokine, vor allem IL-1 und TNFα, sowie Endothelzellen,

Leukozyten und Adhäsionsmoleküle, eine Kaskade von Interaktionen zwischen

Leukozyten und Endothelzellen. Dies resultiert schlussendlich in einem Gewebeschaden

(Agouridakis et al., 2002).

1.10.5 Bedeutung im Hinblick auf ARDS und Sepsis

TNFα wird als einer der Hauptmediatoren des septischen Schocks angesehen (Cohen,

2002; Putensen und Wrigge, 2000). Im Einklang damit steht, dass die zirkulierenden

TNFα-Level beim septischen Schock und dessen Vorstufen erhöht sind.

TNFα trägt wesentlich zur Endothelzellaktivierung und Barrierendysfunktion beim ARDS

bei, die von großer Bedeutung bei diesem Krankheitsbild sind:

In kultiviertem Endothel wurde gezeigt, dass inflammatorische Zytokine wie z. B. TNFα

und andere Gram-negative bakterielle Endotoxine das Endothel aktivieren (Bevilacqua et

al., 1985; Gamble et al., 1985; Petrache et al., 2003; Rival et al., 1996; Romer et al., 1995;

Schleimer und Rutledge, 1986). Die Endothelzellaktivierung führt über die Expression von

Adhäsionsmolekülen zur Anhaftung von Blutleukozyten an das Endothel (Bevilacqua et

al., 1985; Gamble et al., 1985; Rival et al., 1996; Schleimer und Rutledge, 1986) und über

den Verlust der Barrierenfunktion (Barrierendysfunktion) mit der Folge einer gesteigerten

Endothelzellpermeabilität zur Rekrutierung der Leukozyten in das umgebende Gewebe

und Bildung eines Lungenödems (Bevilacqua, 1993; Bevilacqua et al., 1987; Cohen, 2002;

Petrache et al., 2003; Rival et al., 1996; Schleimer und Rutledge, 1986; Shaw et al.,

2001a).

TNFα hat insbesondere einen großen Einfluss auf die VE-Cadherin-Expression und damit

die Endothelpermeabilität: Über die Tyrosinphosphorylierung von VE-Cadherin induziert

es die Verminderung von VE-Cadherin an den interzellulären Junktionen und führt damit

Kapitel 1 – Einleitung 43 zu interzellulären Lückenformationen (Petrache et al., 2003). Zu einer Reduktion von VE-

Cadherin an den interzellulären Zelljunktionen führen auch das Zusammenspiel von IFNγ

und TNFα (Rival et al., 1996), sowie die Adhäsion von polymorphkernigen Leukozyten

(PMN) an TNFα -stimulierte Endothelzellen (Allport et al., 1997; Del Maschio et al.,

1996). In Abwesenheit von Neutrophilen bleibt der VE-Cadherin/Catenin-Komplex an

TNFα-aktivierten Endothelzellen hingegen intakt (Allport et al., 1997). Die alleinige

Stimulation der Endothelzellen mit TNFα verändert nach Allport et al. (1997) die VE-

Cadherin- und die Cateninverteilung somit nicht.

Diese These wurde in anderen Experimenten widerlegt: In HUVEC induziert TNFα einen

Verlust von VE-Cadherin von den interzellulären Junktionen, verbunden mit

Veränderungen am Aktin-Zytoskelett (Wojciak-Stothard et al., 1998). TNFα löst die mit

einer Spaltung von VE-Cadherin assoziierte Leukozytenadhäsion entweder direkt oder

indirekt über eine Kaskade, einhergehend mit der aktinomyosin-vermittelten Kontraktion

von Stressfasern, aus (Wojciak-Stothard et al., 1998).

Durch diese Vorgänge wird die VE-Cadherin vermittelte Zell-Zell-Adhäsion gestört und

die Passage von Blutmakromolekülen und Zellen ins Interstitium gefördert (Wong et al.,

1999). Diese Veränderungen, die mit einer ansteigenden Endothelzell-Monolayer-

Permeabilität bzw. einer steigenden alveolar-kapillären Membranpermeabilität assoziiert

sind, werden durch TNFα wie auch durch Leukozytenaktivierung, Proteasen, freie

Radikale und Zytokine wie IFNγ induziert (Friedl et al., 2002; Hofmann et al., 2002;

Lampugnani et al., 1992; Minagar et al., 2003; Nwariaku et al., 2002; Petrache et al., 2003;

Rival et al., 1996; Shaw et al., 2001a; Wojciak-Stothard et al., 1998; Wong et al., 1999).

TNFα ist somit ein wichtiger Mediator des akuten Lungenschadens (Hasleton und Roberts,

1999). Für einen Zusammenhang zwischen TNFα und der Pathophysiologie der Sepsis

spricht auch, dass erhöhte Konzentrationen der proinflammatorischen Zytokine wie TNFα

und IL-1 in der BAL (bronchioloalveolären Lavage) und im Plasma von ARDS-Patienten

gefunden wurden (Agouridakis et al., 2002; Meduri et al., 1999). Dementsprechend

wurden auch erhöhte TNFα-Serumkonzentrationen bei Patienten mit Sepsis bzw.

Meningokokkenmeningitis und nach Infusion von E. coli-Endotoxin nachgewiesen.

1.10.6 Klinische Bedeutung

TNFα kommt bei Tumorpatienten (TNFα attackiert maligne Zellen), bei

therapieresistentem M. Crohn (TNFα-Antikörper) und rheumatischen Erkrankungen zum

Einsatz.

Kapitel 1 – Einleitung 44 1.11 IFNγ (Interferon-gamma)

1.11.1 Interferone

Interferone sind Proteine, die von den Zellen des Immunsystems als Antwort auf Viren,

Bakterien, Parasiten und Tumorzellen gebildet werden. Beim Menschen sind drei große

Interferon-Klassen bekannt: 1. Typ I Interferon (= Interferon α, β, ω, ε, κ, τ und δ), 2. Typ

II Interferon (= Interferon γ), 3. Typ III Inferferon (= Interferon λ).

1.11.2 Aufbau

Das IFNγ-Gen liegt auf Chromosom 12. Das Molekül ist ein Homodimer mit kompliziert

miteinander verlinkten Untereinheiten (Abb. 14). Jede Untereinheit besteht aus sechs α-

Helices sowie wenigen β-Faltstrukturen.

Der IFNγ-Rezeptor ist wie IFNγ ein Homodimer. Er ist auf der Zelloberfläche von T- und

B-Lymphozyten, Makrophagen, NK-Zellen und Fibroblasten lokalisiert. Durch

verschiedene Phosporylisierungsvorgänge kommt es zu einer erhöhten IFNγ-

Transkription.

Abb. 14: IFNγ-Homodimer Glykoprotein Struktur (zylinderförmige α-Helices mit farblicher Darstellung der beiden Untereinheiten)

Kapitel 1 – Einleitung 45 1.11.3 Funktion

IFNγ ist in die zell-vermittelte Regulation der Immun- und Entzündungsantwort – vor

allem auf Viren und Mykobakterien – involviert. Es wird von NK-Zellen, dendritischen

Zellen, zytotoxischen Zellen, TH0-Zellen und TH1-Zellen produziert (Morrison und Ryan,

1987).

Durch die vermehrte IFNγ-Synthese als Antwort auf Infektionen mit Mykobakterien und

Viren kommt es zu einer Verstärkung der Zytokinfunktion. In Konjugation mit Zytokinen

wie CD40 bindet IFNγ an Makrophagen und aktiviert diese (Morrison und Ryan, 1987),

die daraufhin in der Lage sind, Viren zu phagozytieren und damit zu eliminieren. IFNγ

erhöht die Produktion von MHCI und MHCII in Makrophagen (Mantovani et al., 1997;

Mantovani et al., 1992). Außerdem stimuliert es die Makrophagen zur Abtötung von

Bakterien.

Des Weiteren werden durch die unspezifische antivirale Aktivität die Ausbreitung von

Viren und die Virusreplikation gehemmt. Dadurch werden die Zellen – ohne zerstört zu

werden – vom Virus "befreit".

IFNγ fördert die Zelldifferenzierung von der Progenitor Zelle TH0 zu TH1-Zellen und

hemmt die Differenzierung in TH2-Zellen. Auch der Isotypenwechsel ("Switch") bei den

B-Zellen hin zu IgG wird vorangetrieben.

Zusätzlich spielt IFNγ eine Rolle bei der Vermittlung der Hypersensitivität.

IFNγ aktiviert des Weiteren vaskuläre Endothelzellen, fördert die Lymphozytenadhäsion

und weitere morphologische Veränderungen, die die Extravasation der Lymphozyten

ermöglichen. IFNγ rekrutiert zudem Leukozyten im Entzündungsgebiet und fördert damit

die Entzündungsreaktion.

1.11.4 Regulation

Für den Abbau von IFNγ und die Beendigung der Synthese gibt es zwei sich selbst

regulierende Wege: 1. Reduktion der Halbwertszeit der mRNA von IFNγ (bei Vorkommen

bestimmter Sequenzen auf der mRNA), 2. Transkription von IFNγ und eines weiteren

Proteins, dass die mRNA abbaut, durch aktivierte T-Zellen.

Durch das negative Feedback führt das aktivierende Signal für eine gesteigerte IFNγ-

Produktion gleichzeitig zur Senkung des IFNγ auf die Normalkonzentration.

Störungen in diesem System führen somit u. a. zu einem erhöhten Risiko viraler und

bakterieller Infektionen.

Kapitel 1 – Einleitung 46 1.11.5 Bedeutung im Hinblick auf die Sepsis

Während einer inflammatorischen Immunantwort nimmt das Endothel der postkapillären

Venolen des Systemkreislaufs – in der Lunge das Endothel der Kapillaren – an der

Rekrutierung zirkulierender Leukozyten durch Expression von Adhäsionsmolekülen sowie

der Sekretion von Chemokinen und Zytokinen teil (Wong et al., 1999).

IFNγ ist wie TNFα ein Zytokin, das an der körpereigenen Abwehrreaktion auf

Verletzungen und Entzündungsreize sowie der Immunantwort mitbeteiligt ist (Shaw et al.,

2001a). Die Behandlung kultivierter Endothelzellen mit inflammatorischen Zytokinen wie

IFNγ aktiviert das Endothel (Rival et al., 1996; Romer et al., 1995). Das führt u. a. zur

gesteigerten Expression von Zelladhäsionsmolekülen wie ICAM-1 (Dustin et al., 1986;

Mantovani et al., 1992) und E-Selectin (zusammen mit TNFα) (Bevilacqua, 1993). Die

Expression von Adhäsionsmolekülen und anderen Zytokinen (Morrison und Ryan, 1987)

erleichtert und unterstützt die Chemotaxis, Endotheladhärenz (Rival et al., 1996) und

Transmigration der Leukozyten in das Lungengewebe.

Gerade im Hinblick auf die Sepsis nehmen IFNγ und TNFα ähnliche Funktionen wahr

bzw. ergänzen sich: Die proinflammatorischen Zytokine IFNγ und TNFα aktivieren lokal

das Endothel, induzieren eine Leukozytenakkumulation durch eine erhöhte Expression und

Neuverteilung von Zelladhäsionsmolekülen und steigern die Endothelzellpermeabilität

(Bevilacqua, 1993; Rival et al., 1996; Shaw et al., 2001a).

TNFα und IFNγ vermindern die Intensität von VE-Cadherin und Cateninen an den

interzellulären Endotheljunktionen (Rival et al., 1996; Wong et al., 1999). Dies führt zu

einer Permeabilitätssteigerung (Wong et al., 1999). Da VE-Cadherin die Barrierenfunktion

des Endothels durch die Bildung interzellulärer Junktionen aufrecht erhält, kann der

Verlust von VE-Cadherin den Durchtritt von Blutbestandteilen, Zellen und Flüssigkeit

durch das Endothel nicht hemmen (Wong et al., 1999). IFNγ und TNFα – sowie

Leukozytenaktivierung, Proteasen, freie Radikale und weitere Zytokine – führen zu einer

höheren alveolar-kapillären Membranpermeabilität (Rival et al., 1996; Nwariaku et al.,

2002).

IFNγ steigert sowohl alleine als auch zusammen mit TNFα die Durchlässigkeit der Gefäße

für Zellen und Flüssigkeiten (Shaw et al., 2001a). Es hat somit großen Einfluss auf die

Expression von VE-Cadherin und die Gefäßpermeabilität. Dies ist für die Ausbildung eines

septischen Prozesses von Bedeutung.


1.12 Fragestellung

In der vorliegenden Arbeit wurden die endotheliale Expression des Zelladhäsionsmoleküls

VE-Cadherin in formalin-fixiertem humanem Lungengewebe und die Expression von VE-

Cadherin in Zellkulturen untersucht.

VE-Cadherin ist ein kalziumabhängiges Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, das an den lateralen

Zelljunktionen lokalisiert ist (Burns et al., 2003; Gao et al., 2000; Sandoval et al., 2001;

Schnittler et al., 1997; Stevens et al., 2000; Tiruppathi et al., 2002). Die auf die

endothelialen Zellgrenzen beschränkte Lokalisation von VE-Cadherin unterscheidet es von

den anderen Cadherinen (Lampugnani et al., 1992). Auf Grund dieser Lokalisation ergeben

sich für das Molekül Funktionen wie die Aufrechterhaltung der Integrität des endothelialen

Zellverbandes (Allport et al., 1997; Breviario et al., 1995; Burns et al., 2003; Dejana et al.,

1995; Gotsch et al., 1997; Gulino et al., 1998; Lampugnani et al., 1992; Del Maschio et al.,

1996; van Wetering et al., 2002) und die Regulation der Gefäßpermeabilität (Angst et al.,

2001; Breviario et al., 1995; Burns et al., 2003; Corada et al., 2001; Corada et al., 1999;

Dejana et al., 1999; Gao et al., 2000; Haselton und Heimark, 1997; Hordijk et al., 1999;

Iyer et al., 2004; Kevil et al., 1998; Lampugnani et al., 1995; Lampugnani et al., 1992;

Lum und Malik, 1996; Navarro et al., 1995; Stevens et al., 2000). Ein Verlust von VE-

Cadherin an den Endothelzelljunktionen führt dementsprechend zu einer Lockerung des

Zellverbandes mit Bildung von Lücken und einer gesteigerten Gefäßpermeabilität (van

Buul et al., 2002; Corada et al., 1999; Ferrero et al., 2004; Gotsch et al., 1997; Gulino et

al., 1998; Hordijk et al., 1999; Liao et al., 2002; Lim et al., 2001; Del Maschio et al., 1996;

Nwariaku et al., 2002; Pellegrino et al., 2004; Sandoval et al., 2001; Tinsley et al., 1999;

Wong et al., 1999). Die gesteigerte Gefäßpermeabilität ermöglicht flüssigen und festen

Blutbestandteilen sowie Leukozyten aus dem Blut ins umliegende Gewebe überzutreten

und führt damit zu einem Ödem (Corada et al., 1999; Gotsch et al., 1997; Hordijk et al.,

1999; Del Maschio et al., 1996; Nwariaku et al., 2002; van Wetering et al., 2002).

Die Bedeutung von VE-Cadherin bezüglich der Endothelintegrität und der

Gefäßpermeabilität wurde durch Inhibitionsversuche bewiesen: Die Blockierung von VE-

Cadherin mit dem Antikörper c175 bzw. dem Antikörper BV13 führte zu einer

gesteigerten endothelialen Endothelpermeabilität, begleitet von einer diffusen Verteilung

von VE-Cadherin an den Zellgrenzen (Corada et al., 2002; Corada et al., 1999; Hordijk et

al., 1999; Liao et al., 2002). In weiteren Studien mit Antikörpern gegen VE-Cadherin

wurde die Neutrophilenmigration beschleunigt und die Gefäßpermeabilität gesteigert

Kapitel 1 – Einleitung 48 (sowohl in vivo als auch in vitro), begleitet von einer verminderten Expression von VE-

Cadherin an den Zellgrenzen (Albuquerque und Flozak, 2002; Corada et al., 1999; Gotsch

et al., 1997; Gulino et al., 1998; Hordijk et al., 1999; Liao et al., 2002). Diese

Untersuchungen wurden an Zellen und Geweben unterschiedlicher Spezies, einschließlich

des Menschen, vorgenommen.

Aus den Untersuchungen kann man schließen, dass der Verlust der Zell-Zell-Kontakte

einhergehend mit Lückenbildung und ansteigender Permeabilität durch eine Veränderung

der Verteilung des Adhäsionsmoleküles VE-Cadherin bedingt ist (Pellegrino et al., 2003).

Die Kontrolle der VE-Cadherin vermittelten endothelialen Zell-Zell-Adhäsion ist bei

pathophysiologischen Prozessen wie Entzündung, Ödem und Tumorangiogenese wichtig.

Bei diesen Vorgängen ist die endotheliale Integrität, die stark von der Funktion des VE-

Cadherins abhängt, geschwächt (Nwariaku et al., 2002; van Wetering et al., 2002). Zu den

entzündlichen Vorgängen gehört auch das ARDS (Acute Respiratory Distress Syndrome),

bei dem Ödembildung und Leukozytenextravasation im Vordergrund stehen – vermittelt

über die gesteigerte Endothelpermeabilität.

Bisher liegen keine veröffentlichten Untersuchungen zur VE-Cadherin-Antigenexpression

entlang der humanen Lungenstrombahn vor. Da bisher auch noch keine Studien zum

Zusammenhang zwischen der Pathogenese des ARDS und der Expression von VE-

Cadherin im menschlichen Lungengewebe publiziert sind, ergeben sich folgende

Fragestellungen:

Liegt für das VE-Cadherin eine homogene oder heterogene Antigenexpression entlang der

humanen Lungenstrombahn vor, wie sie für andere Endothelmarker wie z. B. für vWf, E-

Selectin, VCAM oder ACE beschrieben ist (Müller et al., 2004; Müller et al., 2002)?

Wird diese Expression durch physiologische Faktoren wie "Alter" oder "Geschlecht"

beeinflusst bzw. verändert?

Lässt sich eine veränderte pulmonale VE-Cadherin-Antigenexpression bei septisch

bedingtem ARDS nachweisen?

In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression des VE-Cadherin-Antigens in

regelrechtem Lungengewebe (gewonnen im Rahmen von Tumorlobektomien und

Probeexzisionen) und in Lungengewebe von Patienten, verstorben an einem durch

gramnegative Sepsis verursachten ARDS, immunhistochemisch untersucht,

mit den Zielen


1. Charakterisierung der Antigenverteilung von VE-Cadherin in der humanen

Lungenstrombahn im Hinblick auf eventuelle Unterschiede zwischen den einzelnen

Gefäßtypen.

2. Vergleich der endothelialen VE-Cadherin-Antigenexpression zwischen Proben von

lungengesunden Patienten und Patienten mit septisch bedingtem ARDS.

3. Vergleich der endothelialen VE-Cadherin-Antigenexpession in humanem

Lungengewebe unter den Gesichtspunkten Geschlecht, Alter und Zeitspanne

zwischen Todeseintritt und Obduktionszeitpunkt.

Gleichzeitig wurde überprüft, ob – und wenn ja in wie weit – endotheliale Zellkulturen ein

geeignetes Modell darstellen, die in situ gefundenen Beobachtungen unter standardisierten

Bedingungen zu überprüfen. Dazu wurden Zellkulturen von HPMEC (Human Pulmonary

Microvascular Endothelial Cells, Modell für mikrovaskuläre pulmonale Endothelzellen)

und HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Modell für makrovaskuläre

Endothelzellen) bezüglich der VE-Cadherin-Antigenexpression untersucht. Um den

Einfluss von LPS bei gramnegativer Sepsis bzw. von im Rahmen einer Sepsis freigesetzten

Zytokine zu untersuchen, wurden die Zellkulturen 4 bzw. 24 Stunden mit LPS, TNFα (in

verschiedenen Konzentrationen), IFNγ und einer Kombination aus TNFα plus IFNγ

stimuliert und die Expression des VE-Cadherin-Antigens immunhistochemisch

nachgewiesen.

Die Untersuchung dazu diente

1. dem semiquantitativen Nachweis der VE-Cadherin-Antigenexpression in

unstimulierten sowie mit LPS-, TNFα- und IFNγ-stimulierten Zellkulturen

(HPMEC und HUVEC).

2. der Überprüfung, in wieweit diese Zellkulturen als geeignetes Modell für die

Expression von VE-Cadherin in humanem endothelialen Lungengewebe gelten

können.

Kapitel 2 – Material und Methoden 50

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Lungengewebe

Untersucht wurden Lungengewebsproben von 78 Patienten. Dabei handelte es sich um

Lungengewebe von 20 an septischem Multiorganversagen verstorbenen Patienten sowie

von 58 Patienten, deren Lungengewebe morphologisch regelrecht war. Es wurde des

Weiteren Lungengewebe von drei Patienten mit IRDS untersucht; diese Proben wurden

aber auf Grund der vom ARDS divergierenden Ätiologie des IRDS nicht in die statistische

Auswertung miteinbezogen.

Die 58 morphologisch regelrechten Proben stammten von 41 Erwachsenen (Alter: 33 - 75

Jahre) und 17 Kindern (Alter: 1 Monat - 12 Jahre). Bei den Proben der Erwachsenen

handelte es sich um tumorfreie Abschnitte von bei Tumorlobektomien entnommenem

Gewebe. Diese Gruppe setzte sich aus 20 Männern (Alter: 34 - 75 Jahre) und 21 Frauen

(Alter: 33 - 74 Jahre) zusammen (Abb. 15 und Abb. 16). Die Proben aus den Kinderlungen

stammten von aus diagnostischen Gründen entnommenen Probeexzisionen. Es handelte

sich um Gewebe von acht Jungen (Alter: 1 Monat - 12 Jahre) und neun Mädchen (Alter: 2

Monate - 9 Jahre) (Abb. 17).

Die Proben der 20 Sepsis-Patienten stammten alle aus Obduktionsgut, davon elf Präparate

aus Obduktionsfällen des Institutes für Pathologie der Ruhr-Universität am Bergmannsheil

und neun weitere aus dem Sektionsgut der Rechtsmedizin Hamburg. Die Gruppe bestand

aus 13 männlichen Patienten (Alter: 3 Monate - 83 Jahre) und sieben weiblichen (Alter: 27

- 74 Jahre) (Abb. 18). In allen Fällen lag ein laborchemisch nachgewiesenes septisches

Multiorganversagen bei mikrobiologisch gesicherter gram-negativer Sepsis vor. Die

Obduktion erfolgte innerhalb von vier Tagen nach Todeseintritt (Abb. 19).

2.1.2 Zellkulturen

Für die Zellkulturen wurden Endothelzellen aus Tumorlobektomiepräparaten und

Nabelschnurgefäßen im Zellkulturlabor der Johannes Gutenberg Universität Mainz

kultiviert.


Kontrollgruppe Männer

0

20

40

60

80

0 5 10 15 20 25

20 Patienten

Alt

er

[Jah

re]

Abb. 15: Altersverteilung der Männer (Kontrollgruppe)

Kontrollgruppe Frauen

0

20

40

60

80

0 5 10 15 20 25

21 Patientinnen

Alt

er

[Jah

re]

Abb. 16: Altersverteilung der Frauen (Kontrollgruppe)

Kontrollgruppe Kinder

0

5

10

15

0 5 10 15 20

17 Patienten

Alt

er

[Jah

re]

Abb. 17: Altersverteilung der Kinder (Kontrollgruppe)


Patienten mit ARDS

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25

20 Patienten

Alt

er

[Jah

re]

Abb. 18: Altersverteilung der Patienten mit septisch bedingtem ARDS

4

11

5

< 24 h

24 - 48 h

> 48 h

Abb. 19: Zeitspanne zwischen Todeseintritt und Obduktionszeitpunkt: Obduktion innerhalb von 24 Stunden (4 Patienten), innerhalb von 24 bis 48 Std. (11 Patienten), innerhalb von 48 bis 72 Std. (4 Patienten) und innerhalb von 72 bis 96 Std. (1 Patient)


2.2 Methoden

2.2.1 Immunhistochemische Aufarbeitung

2.2.1.1 Vorbehandlung

Von den formalinfixierten, paraffineingebetteten Lungen wurden 3 - 4 µm dicke Schnitte

angefertigt und auf einen speziellen Kapillarspaltobjektträger der Firma DAKO,

Dänemark, aufgezogen. Anschließend wurden die Präparate über Nacht bei 60 °C im

Brutschrank gelagert, damit sie für die anschließende Mikrowellenbehandlung besonders

fest auf dem Objektträger haften und keine Wasserrückstände, die zur Zerstörung des

Präparates während der Hitzedemaskierung führen könnten, verbleiben. Danach erfolgte

die Entparaffinierung in Xylol (drei Mal für fünf Minuten) und die Rehydrierung in einer

absteigenden Alkoholreihe. Die Schnitte wurden anschließend für fünf Minuten in

destilliertes Wasser gestellt.

Da durch Formalinfixierung eine Proteinvernetzung im Gewebe stattfindet, musste eine

hitzeinduzierte Antigendemaskierung vorgenommen werden, damit der Antikörper gegen

VE-Cadherin auch solche Epitope erkennen konnte, die zuvor durch Vernetzungen

maskiert waren.

Für die dafür notwendige Mikrowellenbehandlung wurden die Objektträger in geeignete

Plastikküvetten mit EDTA (pH 8,0) gestellt. Bei 600 Watt erfolgte über fünf mal fünf

Minuten die Erwärmung, wobei darauf zu achten war, dass nach jedem Schritt genügend

EDTA-Puffer in die Küvetten nachgefüllt wurde, damit die Objektträger immer mit Puffer

bedeckt waren. Anschließend kühlten die Schnitte mindestens fünf Minuten aus, wurden

dann noch mal fünf Minuten in TbS-Puffer (pH 7,4) gespült und dann in PBS eingestellt.

Die endogene Peroxidase findet sich hauptsächlich in Granulozyten, Mastzellen,

Makrophagen und Erythrozyten, aber auch in Dünndarmgewebe und Nervenzellen. Das

Enzym bildet zusammen mit dem Substratpuffer, H2O2 als Katalysator und dem

Chromogen ein farbiges Endprodukt, das nicht vom Endprodukt der Reaktion mit dem

verwendeten ABC-System mit Peroxidase unterschieden werden kann. Durch Inkubation

der Präparate mit Wasserstoffperoxid vor der eigentlichen Färbung kann die endogene

Peroxidase eliminiert werden.

Das Blockieren der endogenen Peroxidase erfolgte durch eine 30minütige Behandlung in

1,5 ml 30%igem Wasserstoffperoxid auf 50 ml PBS. Nach einem Spülgang mit

Leitungswasser und destilliertem Wasser wurden die Schnitte erneut in PBS gestellt.

Kapitel 2 – Material und Methoden 54 Da die ABC-Methode (POX) angewandt wurde, mussten auch das endogene Avidin und

das endogene Biotin geblockt werden. Für die Blockade des endogenen Avidins und

Biotins wurde das Blocking-Kit benutzt, bestehend aus Lösung A (A für Avidin) und

Lösung B (B für Biotin) in der Verdünnung mit PBS/BSA 1%. Es wurden 100 µl Lösung

auf jeden Objektträger gegeben. Bei Raumtemperatur wurde für 15 Minuten mit Lösung A

und für 15 Minuten mit Lösung B in einer feuchten Kammer inkubiert. Zwischen den

beiden Schritten wurde stets mit PBS gespült.

2.2.1.2 VE-Cadherin-Färbung

Die Färbung zum Nachweis von VE-Cadherin erfolgte mittels der Avidin-Biotin-

Komplex-Methode mit Peroxidase (ABC-Methode (POX)). Diese Methode machte sich

die Affinität von Avidin zu Biotin zu Nutze.

Nach Zugabe von Normalserum, dem Primär-Antikörper und dem Sekundär-Antikörper

wurde der ABC-Komplex hinzugegeben. Letzterer bestand aus einem mit Biotin

markierten (biotinylierten) Brückenantikörper, der an den Sekundär-Antikörper band. An

den Brückenantikörper wiederum band sich der ABC-Komplex, bestehend aus drei

biotinylierten Enzymen, einem Avidin und zusätzlich einem Enzym, in diesem Fall

Peroxidase (Abb. 20). Die Peroxidase gewährleistete schließlich die Substrat-Chromogen-

Reaktion mit DAB.

Abb. 20: Schema der ABC-Methode: Darstellung des Primärantikörpers, des biotinylierten Brückenantikörpers und des ABC-Komplexes (Noll und Schaub-Kuhnen, 2000)

Es wurden jeweils 100 µl Antikörperlösung auf jeden Objektträger gegeben und dieser bei

Raumtemperatur in einer feuchten Kammer für die angegebene Zeit inkubiert. Zwischen

den Inkubationsvorgängen wurde ausgiebig mit PBS gespült, damit nicht bzw.

unspezifisch gebundene Antikörper vom Schnitt heruntergewaschen wurden und eine

nachfolgende spezifische Antikörperbindung gewährleistet werden konnte.

Zuerst wurde für 20 Minuten mit dem Normalserum vom Pferd inkubiert (Verdünnung

1 ml PBS/BSA 1% + 15 µl Normalserum). Das Normalserum wird auch als Non- oder

Kapitel 2 – Material und Methoden 55 Nicht-Immunserum bezeichnet. Es wurde so ausgewählt, dass es keine spezifischen

Antikörper gegen die gesuchten Antigene besaß. Deshalb richtete es sich nach der Spezies,

in der der Sekundär-Antikörper hergestellt wurde, weil "normale" (gesunde) Tiere keine

Autoantikörper bilden. Das Normalserum diente zur Absättigung von elektrostatischen

Ladungen der Proteine im Untersuchungsgut und verhinderte damit unspezifische

Anfärbungen. Auch das BSA (Rinderserumalbumin) erfüllte diese Funktion der

Abdeckung unspezifischer Bindungen. Anschließend wurde nicht mit PBS gespült, denn

sonst wäre der Ausgangszustand des Präparates wieder hergestellt worden und die

unspezifischen Ladungen hätten wieder von Immunglobulinen gebunden werden können.

Es folgte eine einstündige Inkubation mit dem Primärantikörper, in diesem Fall einem

monoklonalen gegen das VE-Cadherin gerichteter Antikörper von der Maus (Verdünnung

1:100 mit PBS/BSA 1%).

Nach dreimaliger Spülung mit PBS für ca. 5 Minuten schloss sich eine Inkubation für 30

Minuten mit dem Sekundär-Antikörper (anti-Maus aus dem Pferd) an.

Nach erneuter fünfminütiger Spülung mit PBS kam die POX-konjugierte ABC-Methode

(Avidin-Biotin-Complex mit Peroxidase konjugiert). Der ABC-Komplex wurde 30

Minuten vor Gebrauch angesetzt, anschließend wurden die Präparate für weitere 30

Minuten inkubiert.

2.2.1.3 Isotypkontrolle

An einem weiteren Präparat erfolgte eine Isotypkontrolle, mit Hilfe derer man

unspezifische Bindungen des Primärantikörpers detektieren kann. Das Präparat wurde wie

oben beschrieben behandelt. Statt des Primärantikörpers wurde aber ein Antikörper

derselben, jedoch nicht-immunisierten Tierart eingesetzt.

2.2.1.4 CD31-Färbung

Die Präparate der Sepsispatienten wurden zusätzlich mit einem Antikörper gegen CD31

gefärbt. Da CD31 spezifisch an Endothelzellen bindet, konnte auf diese Art und Weise die

Reaktivität des Gewebes überprüft werden.

Dieser Umstand kann darauf zurückgeführt werden, dass in normalen und in septischen

Lungen die Arterien, Venen und die prä- und post-Kapillaren mit Endothelzellen

ausgekleidet sind, die mit dem Antikörper gegen PECAM (= CD31) reagieren. Es gibt

keine Expressionsunterschiede für CD31 zwischen den Endothelzellen größerer Gefäße

und der Mikrovaskulatur oder zwischen normalen und septischen Lungen (Müller et al.,

2002).

Kapitel 2 – Material und Methoden 56 2.2.1.5 Farbentwicklung

Zur Farbentwicklung wurde DAB eingesetzt. In 15 ml Tris HCL Puffer (pH 7,4), einer

Tablette DAB und 12 µl Wasserstoffperoxid wurden die Präparate sieben Minuten

entwickelt. Es bildete sich ein brauner unlöslicher Farbkomplex, der durch das Wässern

unter fließendem Leitungswasser und anschließendes Einstellen in Aqua dest. noch in der

Färbung intensiviert wurde.

2.2.1.6 Gegenfärbung

Die Gegenfärbung der Präparate erfolgte in Hämalaun. Gebläut wurde mit Leitungswasser,

anschließend mit Aqua dest. Dann wurden die Schnittpräparate in einer aufsteigenden

Alkoholreihe dehydriert und über Xylol mit Eukitt eingedeckt.

Zusätzlich wurde von allen 78 (und den drei IRDS-) Präparaten eine HE- und ein EvG-

Färbung angefertigt.

2.2.2 Zellkultur

2.2.2.1 Kultivierung humaner pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen (HPMEC)

Die Kultivierung der HPMEC (Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells)

erfolgte nach der von M. I. Hermanns entwickelten Methode (Hermanns, 1997): Zur

Isolierung des mikrovaskulären Endothels wurde Gewebe aus dem peripheren subpleuralen

Lungenparenchym entnommen und die Pleura abpräpariert. Für ca. zwei Stunden wurde

das Gewebe in einer Transportpufferlösung (Hepes-Puffer 25 mM, Penicillin/Streptomycin

(10U/10 µl/ml)) bei 4 °C gelagert.

Anschließend erfolgte die mechanische Zerkleinerung des Gewebes mit einer Schere.

Danach wurde das Gemisch mit PBS gewaschen, Erythrozyten und Debris wurden mit

einem Netz entfernt.

Es folgten nun mehrere Schritte, in denen das Gewebe mit Dispase (18 U/ml), Elastase

(40 U) und Trypsin (0,05 %) enzymatisch aufgespalten wurde. Die Dispase wirkt

unspezifisch und führt zu einer schonenden Dissoziation des Gewebes. Trypsin und

Elastase wirken sehr viel spezifischer, wobei letztere besonders die elastischen Fasern in

der Extrazellularmatrix der Alveolen verdaut. Es entstand eine Zellsuspension aus

sämtlichen Zellen des peripheren Lungengewebes. Mit Nylonnetzchen wurden

Gewebeklümpchen und größere Zellen herausgefiltert, die Endothelzellen blieben im

Filtrat erhalten. Um eine reine Kultur aus Endothelzellen zu erhalten, reichte dieser Schritt

nicht aus. Zur Herstellung einer Einzelzellsuspension wurden sogenannte

Kapitel 2 – Material und Methoden 57 immunomagnetische Partikel (Beads) eingesetzt. Bei diesen Beads handelt es sich um

kleine Polystyren-Kügelchen mit einem Eisenoxidkern, die mit einem spezifischen

Antikörper konjugiert sind. Der Antikörper und somit das ganze Kügelchen bindet an der

Zielzelle, die das entsprechende Antigen besitzt. Diese Methode funktioniert nur, wenn das

Antigen spezifisch auf den Zellen vorkommt, die isoliert werden sollen. Für die Isolation

der HPMEC wurden CD31 (PECAM-1)-Beads verwendet. Nach Bindung der Beads

erfolgte die positive Separation der Zellen mit Hilfe eines Magneten. Anschließend wurden

die Zellen auf einem mit Gelatine-beschichteten 6er Well ausgesät.

Die HPMEC wurden nun für fünf bis sieben Tage in dem Kulturmedium für HPMEC mit

PC + 15% FKS bFGF/Hep kultiviert, bis zu drei Mal weiter passagiert und maximal in

vierter Passage (P4) für den Versuch eingesetzt.

2.2.2.2 Kultivierung humaner Umbilicalvenen-Endothelzellen (HUVEC)

VE-Cadherin wird nicht nur an den Zellkontakten von Endothelzellen der Lunge

exprimiert, sondern auch von Hirngewebe, Nabelschnurvenen und anderen Gewebetypen.

Nabelschnurvenen sind vergleichsweise einfach zu beschaffen und zahlreich vorhanden.

Die Kulturen aus den isolierten Endothelzellen können als Modell für makrovaskuläre

Endothelzellen verwendet werden.

Die Isolation und Kultivierung der HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells)

erfolgte nach den Methoden von Jaffe et al. (1973). Die nach der Geburt entnommenen

Nabelschnüre wurden in einer Pufferlösung (0.14 M NaCl, 0.004 M KCl, 0.001 M

Phosphatpuffer, pH 7.4, 0.011 M Glucose) bei 4 °C bis zu ihrer weiteren Verwendung

aufbewahrt. Die gesäuberte Vene wurde kanüliert und ebenfalls mit Puffer (s. o.) gespült.

Nach mehreren Spül- und Waschgängen wurde die Vene bei 37 °C für 15 Minuten mit 10

ml einer 0,2 %igen Collagenase-enthaltenden Lösung gefüllt (Jaffe et al., 1973). Die

Kollagenase-Lösung bewirkte das Ablösen der Endothelzellen von der darunter liegenden

Basalmembran (Bill, 2003). Nach diesem Vorgang wurden die Collagenase-Lösung und

die abgelösten Endothelzellen mit dem Puffer aus der Vene herausgespült und in fetales

Kälberserum (Fetal Calf Serum, FCS) und Medium 199 (TC 199) gegeben. Anschließend

wurde das Gemisch zentrifugiert und sedimentiert. Die Endothelzellen wurden in Medium

199 (TC199), bestehend aus 20 % FCS, Penicillin (200 U/ml), Streptomycin (200 µg/ml)

und L-Glutamin (2 mM) bei 37 °C und unter 5 % CO2 kultiviert (Jaffe et al., 1973).

Zusätzlich wurden die Zellen mit einem Wachstumsmedium ECGS (Endothelial Cell

Growth Supplement) versetzt. Eine Passage vor dem Versuch wurden die Zellen in PC +

15 % FKS bGFG/Hep gezogen.

Kapitel 2 – Material und Methoden 58 Der sich nach ungefähr fünf Tagen ausgebildete gleichmäßige Zellrasen wurde bis zu drei

Mal in Hepes-Puffer mit 0,01% EDTA und 0,1% Collagenase passagiert. Eine konfluente

P3 (dritte Passage) wurde mit 0,01 % EDTA und 0,1 % Collagenase abgelöst und auf 8-

Kammerglasobjektträgern (Lab-Teks), die mit humanem Fibronektin (1 µg/cm2)

beschichtet waren, in einer Zellzahl von 4 x 104 Zellen pro Well ausgesät. Die Zellen

wurden für 24 h bei 37 °C inkubiert. Der Mediumüberstand aus den Lab-Teks wurde

entfernt und durch frisches Medium (Kontrolle) oder Medium mit Stimulanzien ersetzt.

2.2.2.3 Stimulation

Die isolierten HPMEC und HUVEC wurden auf neun Lab-Teks mit je acht Wells pro Lab-

Tek ausgesät. Auf einem Lab-Tek wurden je vier Wells mit HPMEC und vier Wells mit

HUVEC bestückt. Die Zellen des ersten Wells blieben im Gegensatz zu den drei anderen

Wells unstimuliert. Die Stimulation erfolgte mit LPS, TNFα bzw. IFNγ. Die Fixierung

erfolgte nach vier Stunden und nach 24 Stunden (Abb. 21).

Die Stimulation der Zellkulturen erfolgte mit TNFα, LPS und IFNγ in folgenden

Konzentrationen:

TNFα 30, 150, 300 U/ml

LPS 1 µg/ml

IFNγ 10 ng/ml

IFNγ + TNFα 10 ng/ml IFNγ + 300 U/ml TNFα

Die folgenden Stimulanzien und die entsprechenden Vorverdünnungen wurden in

PC + 15 % FKS bFGF/Hep angesetzt:

TNFα 30, 150, 300 U/ml; IFNγ 10 ng/ml; IFNγ 10 ng/ml + TNFα 300 U/ml

Es wurde mit 500 µl pro Well stimuliert. Nach 4 h bzw. nach 24h wurde der Zellrasen mit

3,7 % PFA (Paraformaldehyd) in PBS-Puffer für 15 min. fixiert. Um den aktivierten

Zellrasen nicht zu verletzen, durfte vor der Fixierung nicht gespült werden. Nach 15 min.

wurden die fixierten Zellen drei Mal mit PBS gespült.


1

HPMEC

PFA

VE-Cad 1:100

2

HPMEC

PFA

TNF-α 30 U/ml

VE-Cad 1:100

3

HPMEC

PFA

TNF-α 150 U/ml

VE-Cad 1:100

4

HPMEC

PFA

TNF-α 300 U/ml

VE-Cad 1:100

5

HUVEC

PFA

VE-Cad 1:100

6

HUVEC

PFA

TNF-α 30 U/ml

VE-Cad 1:100

7

HUVEC

PFA

TNF-α 150 U/ml

VE-Cad 1:100

8

HUVEC

PFA

TNF-α 300 U/ml

VE-Cad 1:100

1

HPMEC

PFA

VE-Cad 1:100

2

HPMEC

PFA

LPS

VE-Cad 1:100

3

HPMEC

PFA

IFN-γ

VE-Cad 1:100

4

HPMEC

PFA

IFN-γ / TNF-α

VE-Cad 1:100

5

HUVEC

PFA

VE-Cad 1:100

6

HUVEC

PFA

LPS

VE-Cad 1:100

7

HUVEC

PFA

IFN-γ

VE-Cad 1:100

8

HUVEC

PFA

IFN-γ / TNF-α

VE-Cad 1:100

Abb. 21: Belegungungsplan der Lab-Teks mit HPMEC und HUVEC: Stimulation mit TNFα, IFNγ und LPS bei einer Stimulationsdauer von 4 bzw. 24 h

2.2.2.4 Immunzytochemische Fluoreszenzfärbung

Zuerst erfolgte die Permeabilisierung mit 0,5 % Triton-x 100 für 10 min. Die

Permeabilisierung verringert die Quervernetzung der durch die Fixierung denaturierten

Proteine und macht die Zellmembran durchlässiger. Sie erleichtert somit die Erkennung

der für die Antikörper spezifischen Epitope. Anschließend wurde vier Mal mit PBS

gespült.

Über Nacht wurden die Wells bei 4 °C mit dem ersten Antikörper inkubiert. Der

Antikörper, anti-VE-Cadherin (Cadherin-5) mouse IgG (BD) wurde in der Verdünnung

1:100 aufgetragen. Es wurde nun einmal mit PBS gespült, einmal mit PBS/Triton-x 100

0,5% und noch vier Mal mit PBS. Es erfolgte dann die Inkubation mit dem zweiten

Kapitel 2 – Material und Methoden 60 Antikörper (Goat Anti Mouse IgG) mit Phalloidin TRITC in einer Verdünnung von

1:1000.

Die Lab-Teks wurden fünf Mal mit PBS gespült, in destilliertes Wasser eingestellt und

schließlich in Gel Mount (Eindeckmedium) eingedeckt. Sie wurden bei

4 °C im Dunkeln aufbewahrt.

Die Aussaat und die Färbung erfolgten im Juni 2004.

2.2.3 Antikörper

VE-Cadherin (Cadherin-5)

150 µg Catalog Number C26120-150 (old), 610252 (new); Mouse IgG1; Clone 75; Mol.

Weight 130; Pos. Control Human Endothelial; Firma BD Biosciences; Verdünnung 1:100

Sekundär-Ak

Biotinylated Anti-Mouse, IgG (H+L); Vector/Alexis BA-2000

Isotypkontrolle

Isotype control IgG1 (1B9); Prod. no. 2010; unconj.; 0,2 mg/200 µL; Fa. Dianova


2.3 Auswertung

2.3.1 Auswertung der Lungengewebsproben

2.3.1.1 Färbungsintensität der Endothelzellen

Die endotheliale Expression des VE-Cadherin-Antikörpers in den immunhistochemisch

gefärbten Präparaten wurde lichtmikroskopisch semiquantitativ ausgewertet. Dazu wurde

in allen Präparaten die endotheliale Farbintensität pro mikrovaskulärem Gefäßtyp

(Arteriole, Kapillare, Venole) in jeweils 20 Gesichtsfeldern in zwei getrennten

Durchgängen bewertet. Bei den großen Gefäßen (Arterien und Venen) wurden jeweils alle

Gefäße pro Präparat bewertet. Aus den zwei Bewertungen wurde ein Durchschnittswert für

die Anfärbungsintensität der Endothelzellen gebildet.

Basierend auf den graduellen Unterschieden wurde jeweils pro Präparat und Gefäßtyp die

Färbeintensität und der Prozentsatz positiv gefärbter Endothelzellen mit einem Score

(angelehnt an den Immunoreaktivitätsscore nach Remmele et al. (1986)), bewertet. Für

jeden Patienten einer jeweiligen Gruppe (Gruppe der Sepsispatienten, Kontrollgruppen)

wurde aus den Anfärbungsscores für jeden Gefäßtyp ein Mittelwert durch Addition der

ermittelten Werte nach dem Score und Division durch die Anzahl der beurteilten Gefäße

errechnet. Die Mittelwerte und die Mediane der unterschiedlichen Gefäßtypen und

unterschiedlichen Gruppen wurden miteinander verglichen. Die statistische Auswertung

wurde unter Zuhilfenahme des Statistikprogramms SPSS vorgenommen.

Die Intensität der VE-Cadherin-Antigenexpression wurde anhand der Färbeintensität der

Endothelzellgrenzen pro Gesichtsfeld nach folgendem Schema bewertet (Tab. 1):

Tab. 1: Immunhistochemischer Score zur Auswertung der Lungenproben

0 negativ; keine Färbereaktion der Endothelzellen (Abb. 22)

1 schwach positiv; schwache Färbereaktion der Endothelzellen (Abb. 23)

2 mittelgradig positiv; mäßige Färbereaktion der Endothelzellen (Abb. 24)

3 stark positiv; starke Färbereaktion der Endothelzellen (Abb. 25)


Abb. 22: Keine bzw. minimale Abb. 23: Schwache Expression des Expression des VE-Cadherin-Antigens VE-Cadherin-Antigens in humanem in humanem Lungengewebe (Score 0) Lungengewebe (Score 1)

Abb. 24: Deutliche Expression des Abb. 25: Sehr starke Expression VE-Cadherin-Antigens in humanem des VE-Cadherin-Antigens in humanem Lungengewebe (Score 2) Lungengewebe (Score 3)

Untersucht wurden auf diese Weise die Anfärbungsintensitäten des Antikörpers gegen VE-

Cadherin bei den 78 Lungenproben im Hinblick auf Unterschiede zwischen den einzelnen

pulmonalen Gefäßtypen. Die sich hieraus ergebenden Daten wurden unter folgenden

Gesichtspunkten analysiert: Unterschiede der Kontrollgruppe gegenüber Sepsisgruppe,

Unterschiede bezüglich Geschlecht, Alter und Obduktionszeitpunkt.

2.3.1.2 Einteilung der Patienten

Bei der Untersuchung nach geschlechtlichen Unterschieden wurden die 78 Patienten in

männlich (41 Patienten) und weiblich (37 Patienten) unterteilt. Zusätzlich wurden die

Kontrollgruppen der weiblichen (n = 21) und männlichen Patienten (n = 20) miteinander

verglichen.

Für die Untersuchung der Färbeintensität nach dem Alter wurden die 78 Patienten in vier

Gruppen eingeteilt, gestaffelt nach dem Alter zum Zeitpunkt der Probenentnahme bzw.

Kapitel 2 – Material und Methoden 63 zum Todeszeitpunkt (Tab. 2). Für die Untersuchung bezüglich der Zeitdauer zwischen Tod

und Obduktion wurden die 20 an ARDS verstorbenen Patienten in drei Gruppen

zusammengefasst (Tab. 3):

Tab. 2: Einteilung der 78 Patienten in vier Altersgruppen

Gruppe 1 0 bis 20 Jahre 18 Patienten




Tab. 3: Einteilung der 20 Sepsispatienten nach dem Obduktionszeitpunkt in drei Gruppen

Gruppe 1 < 24 Stunden zwischen Tod und Obduktion 4 Patienten

Gruppe 2 24 bis 48 Stunden zwischen Tod und Obduktion 11 Patienten

Gruppe 3 > 48 Stunden zwischen Tod und Obduktion 5 Patienten

2.3.2 Auswertung der Zellkulturen

Bei den Zellkulturen mit den HUVEC und den HPMEC wurde jedes "Well" fotografisch

mit der 20er Vergrößerung der Immunofluoreszenz-Mikroskop-Kamera

(Absorptionsspektrum: 495 nm, Emissionsspektrum: 528 nm) digital dokumentiert und

ausgewertet. Pro Well wurden 20 Bilder erstellt, wobei jedes zweite Gesichtsfeld

dokumentiert wurde. Bei der Auswertung wurde jedes Foto virtuell in vier Felder unterteilt

und jedes Feld nach dem Score bewertet (Tab. 4). Die sich aus dem Score ergebenden

Bewertungen wurden addiert und anschließend durch die Anzahl der Felder (in diesem Fall

konstant vier Felder) geteilt, was zu einer "Gesamtnote" zwischen "0,0" und "3,0" führte.

Um eine Beeinflussung bei der Bewertung weitestgehend auszuschalten, erfolgte die

Auswertung in zwei getrennten Durchgängen anhand einer blinden und zufälligen

Reihenfolge der Bilder.

Tab. 4: Immunhistochemischer Score zur Auswertung der Zellkulturen

0 kein vorhandener Endothelverband (EV), nur Fragmente sichtbar (Abb. 26)

1 unterbrochener EV, schwach angefärbt (Abb. 27)

2 gering geschädigter EV, mäßig angefärbt (Abb. 28)

3 geschlossener EV, stark angefärbt (Abb. 29)


Abb. 26: Kein Endothelverband Abb. 27: Endothelzellverband mit ausgebildet, teilweise noch deutlicher Lückenbildung (Score 1) Zellgrenzenfragmente sichtbar (Score 0)

Abb. 28: Endothelverband mit Abb. 29: Dichter Zellrasen mit geringer Lückenbildung (Score 2) intensiver und lückenloser Expression von VE-Cadherin (Score 3)

Kapitel 3 – Ergebnisse 65

3 Ergebnisse

3.1 In situ-Befunde

3.1.1 VE-Cadherin-Antigenexpression in den verschiedenen Gefäßtypen

3.1.1.1 Alle Proben

Bei der Untersuchung der Proben aller 78 Patienten stellte sich mit einer Signifikanz p =

0,0 für die einzelnen Gefäßtypen folgendes Bild dar:

Die Arterien, Arteriolen und Kapillaren zeigten eine kräftige endotheliale VE-Cadherin-

Expression, während die Venolen und Venen eine vergleichsweise schwache Expression

aufwiesen.

Der Median der Färbeintensität lag bei den Arterien, Arteriolen und Kapillaren in einem

Bereich zwischen 1,53 und 1,81. Bei den Venen und Venolen betrug der Median 0,27 bzw.

0,45 (Tab. 5). Die Werte zwischen dem 25%- und dem 75%-Quantil veranschaulichen,

dass die Werte für die Färbeintensität in den Arterien, Arteriolen und Kapillaren weiter um

den Mittelwert und Median streuten als bei den Venolen und Venen. Gleichzeitig

dokumentieren sie aber auch die intensivere Anfärbung der Endothelien in den arteriellen

Gefäßen und Kapillaren im Gegensatz zu den venösen Gefäßen (Abb. 30 und 31).

Dementsprechend zeigten die im Boxplot dargestellten Minimal- und Maximalwerte eine

breite Streuung der Färbeintensitäten bei den Arterien, Arteriolen und Kapillaren. In den

Venen und Venolen wurden sehr viel geringere Maximalwerte erreicht, der Minimalwert

lag hier bei 0,0.

Kapitel 3 – E

rgebnisse 66

Arterie Arteriole Kapillare Venole Vene Abb. 30: Endotheliale VE-Cadherin-Antigenexpression in den verschiedenen Gefäßtypen entlang der pulmonalen Lungenstrombahn (Arterien / Kapillaren > Arteriolen >> Venen / Venolen) in regelrechtem Lungengewebe.


ARTERIEN ARTERIOLEN KAPILLAREN VENOLEN VENEN

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Abb. 31: Endotheliale VE-Cadherin-Antigenexpression in den 78 untersuchten Proben mit intensiver Expression in den Arterien, Arteriolen und Kapillaren und vergleichsweise schwacher Expression in den Venolen und Venen

Dasselbe Verteilungsmuster bezüglich der VE-Cadherin-Expression in den Gefäßen zeigte

sich bei isolierter Betrachtung der Befunde unter dem Aspekt "Frauen" (Abb. 32),

"Männer" (Abb. 33), "Kinder" (Abb. 34) und "Patienten mit Sepsis" (Abb. 36). Diese

Ergebnisse für die einzelnen Gefäßtypen waren auch hier mit einer Signifikanz von p <

0,05 (pFrauen = 0,0; pMänner = 0,0; pKinder = 0,0 und pSepsispatienten ≤ 0,04) hochsignifikant.



0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Abb. 32: VE-Cadherin-Antigenexpression der verschiedenen Gefäßtypen in der "Kontrollgruppe Frauen": sehr intensive Antigenexpression in den arteriellen Gefäßen und Kapillaren sowie deutlich geringere Expression in den Venolen und Venen


0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Abb. 33: VE-Cadherin-Antigenexpression in der "Kontrollgruppe Männer", analysiert nach Gefäßtypen: gleiches Verteilungsmuster wie bei der "Kontrollgruppe Frauen" (Abb. 32)



0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Abb. 34: VE-Cadherin-Antigenexpression in der "Kontrollgruppe Kinder", analysiert nach Gefäßtypen: gleiches Verteilungsmuster wie bei den "Kontrollgruppen Frauen" und "Männer" (Abb. 32 und 33) Betrachtet man die Expression des VE-Cadherin-Antigens, so fällt nicht nur die Stärke der

Expression auf, sondern auch eine charakteristische Anfärbung der die Gefäße

auskleidenden Zellen (Abb. 35). Die endothelialen Zellmembranen waren dort besonders

intensiv angefärbt, wo zwei Endothelzellen aneinander grenzen, d. h. an den

Endothelzelljunktionen.

Abb. 35: Endotheliale Expression von VE-Cadherin in arteriellen Gefäßen und Kapillaren: Anhand der arteriellen Endothelzellen wird die VE-Cadherin-Expression an den Endothelzelljunktionen besonders gut erkennbar

Kapitel 3 – Ergebnisse 70 3.1.1.2 Kontrollgruppe "Frauen" und "Männer"

Das gefäßtypische Verteilungsmuster trat bei den beiden Kontrollgruppen der Frauen (n =

21) und Männer (n = 20) (Abb. 32 und 33) besonders deutlich hervor: Die Endothelien der

arteriellen Gefäße und Kapillaren zeigten eine starke Anfärbung, die Endothelien der

Venen und Venolen hingegen eine wesentlich schwächere. Der Median lag bei den

arteriellen, arteriolären und kapillären Endothelien bei gesunden Frauen und Männern

zwischen 1,72 und 2,09. Bei den venolären und venösen Endothelien lag der Median

zwischen 0,30 und 0,58. Bei diesen beiden "gesunden" Patientengruppen streuten die

Werte im Vergleich zu allen 78 Patienten (Abb. 31) nur gering. Dementsprechend stellten

sich in der Boxplotdarstellung sowohl die 25%- und 75%-Quantile als auch die 5%- und

95%-Quantile sehr schmal dar (Abb. 32 und 33).

3.1.1.3 Kindergruppe

Bei den Proben morphologisch regelrechter Kinderlungen (n = 17) lag der Median für die

angefärbten Endothelzellmembranen der Arterien, Arteriolen und Kapillaren zwischen

1,55 und 2,00. Der Median der Venolen und Venen lag bei 0,35 bzw. 0,63. Bei den

Boxplots fand sich eine etwas größere Streuung innerhalb der 25%- und 75%-Quantile und

der 5%- und 95%-Quantile (Abb. 34).

Sowohl zahlenmäßig als auch graphisch stellte sich der für die Erwachsenen bereits

beschriebene Unterschied in der Färbeintensität zwischen den arteriellen Gefäßen und

Kapillaren (als Gefäßtypen mit hoher VE-Cadherin-Antigenexpression) und den venösen

Gefäßen (als Gefäßtypen mit niedriger VE-Cadherin-Antigenexpression) dar.

Betrachtet man die Mittelwerte (Tab. 6) der Färbeintensitäten, so unterstreichen die sich

dabei ergebenden Werte das gefäßtypische Verteilungsmuster mit starker Expression im

arteriellen Schenkel und den Kapillaren sowie schwacher VE-Cadherin-Expression im

venösen Schenkel der Strombahn. Die Mittelwerte aller 78 Proben in den arteriellen

Gefäßen und den Kapillaren lagen zwischen 1,34 und 1,58. In den venösen Gefäßen lag

der Mittelwert mit 0,32 bzw. 0,44 deutlich niedriger. Diese anhand des Mittelwertes

ermittelte Verteilung der Expressionsintensität zeigte sich auch bei einer isolierten

Betrachtung der Kontrollgruppe "Männer", der Kontrollgruppe "Frauen", der Gruppe

"Kinder" und der Gruppe der Patienten mit Sepsis.

Kapitel 3 – Ergebnisse 71 3.1.1.4 Patienten mit Sepsis

Bei der Gruppe der Patienten mit Sepsis war das bereits beschriebene endotheliale

Expressionsmuster von VE-Cadherin für alle Gefäßtypen ebenfalls erkennbar (Abb. 36 und

37). Dementsprechend waren auch der Median und der Mittelwert (Tab. 5 und 6) in den

Arterien, Arteriolen und Kapillaren größer als in den Venolen und Venen. Jedoch fiel die

Anfärbung aller Endothelzellen signifikant schwächer aus (p ≤ 0,04) als im gesunden

Lungengewebe.


0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Abb. 36: endotheliale VE-Cadherin-Antigenexpression in den verschiedenen Gefäßtypen der Sepsispatienten: im Vergleich zu einer sehr schwachen Expression in Venen und Venolen deutlich kräftigere Antigenexpression in Arterien, Arteriolen und Kapillaren

Kapitel 3 – E

rgebnisse 72

Arterie Arteriole Kapillare Venole Vene Abb. 37: Darstellung der endothelialen VE-Cadherin-Antigenexpression in Lungengewebe mit Ausbildung eines septischen ARDS für die verschiedenen Gefäßtypen entlang des pulmonalen Gefäßbaumes (Arterien / Kapillaren > Arteriolen >> Venen / Venolen). Im Vergleich zu Abb. 14 zeigte sich eine schwächere Expression.

Kapitel 3 – Ergebnisse 73 Tab. 5: Mediane der verschiedenen Gruppen für jeden Gefäßtyp

alle

Patienten

Kontrollgruppe

Frauen

Kontrollgruppe

Männer

Gruppe der

Kinder

Sepsisfälle

Arterien 1,81 1,92 2,03 2,00 0,30

Arteriolen 1,55 1,72 1,84 1,55 0,12

Kapillaren 1,53 2,09 2,05 1,81 0,16

Venolen 0,27 0,30 0,47 0,35 0,00

Venen 0,45 0,45 0,58 0,63 0,01

Tab. 6: Mittelwerte der verschiedenen Gruppen für jeden Gefäßtyp

alle

Patienten

Kontrollgruppe

Frauen

Kontrollgruppe

Männer

Gruppe der

Kinder

Sepsisfälle

Arterien 1,58 1,90 2,02 1,89 0,55

Arteriolen 1,34 1,70 1,78 1,53 0,37

Kapillaren 1,49 1,91 1,98 1,68 0,44

Venolen 0,32 0,42 0,42 0,43 0,04

Venen 0,44 0,45 0,59 0,72 0,04

3.1.1.5 Patienten mit IRDS

Zusätzlich wurde Lungengewebe von drei IRDS-Patienten untersucht. Diese Ergebnisse

wurden auf Grund der kleinen Fallzahl dieser Gruppe nicht bei der Analyse der übrigen

"Kinderwerte" bzw. der Sepsispatienten berücksichtigt.

Es zeigten sich sehr unterschiedliche Färbungsintensitäten für die VE-Cadherin-

Antigenexpression bei den drei Patienten. Jedoch war auch hier das bereits mehrfach

beschriebene gefäßtypspezifische Expressionsmuster nachweisbar (Tab. 7).

Tab. 7: Medianwerte der VE-Cadherin-Expression in den drei IRDS-Lungenproben

Arterien Arteriolen Kapillaren Venolen Venen

Patient 1: 1.74 1.25 2.21 0.29 0.51

Patient 2: 0.68 0.39 0.64 0.10 0.20

Patient 3: 2.20 1.99 0.84 0.11 0.77

Kapitel 3 – Ergebnisse 74 3.1.1.6 Unterschiede zwischen den einzelnen Gefäßtypen

Zwischen den Arterien, Arteriolen und Kapillaren als Gefäßtypen mit hoher endothelialer

Expression von VE-Cadherin stellte sich kein signifikanter Unterschied dar (Abb. 30 - 34,

36 und 37; Tab. 5 und 6). Bei isolierter Betrachtung der Boxplots – und hier insbesondere

der Mediane der Gruppen der Frauen, Männer, Kinder und Sepsispatienten – fiel auf, dass

die Arterien und Kapillaren leichtgradig stärker angefärbt waren als die Arteriolen. Diese

Unterschiede in der VE-Cadherin-Expression zwischen Arterien, Arteriolen und Kapillaren

waren allerdings statistisch nicht signifikant (= Interpretation).

Bei den Venolen und Venen als Gefäßtypen mit niedriger endothelialer Expression von

VE-Cadherin konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen diesen beiden

Gefäßtypen gefunden werden, obwohl sich eine stärkere Anfärbung der Venen im

Gegensatz zu den Venolen (bei Betrachtung der Boxplots und Mediane, s. o.) darstellte.

Auch diese Unterschiede sind somit lediglich eine nicht signifikante Beobachtung.

3.1.2 VE-Cadherin-Expression der Sepsisgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe

3.1.2.1 Lungengewebe von Patienten mit Sepsis

Im Gegensatz zu den gesunden Proben (Abb. 32 bis 34) waren die Gefäßendothelien in den

Proben der Sepsispatienten (n = 20) mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin sehr viel

schwächer angefärbt. Trotzdem fand sich auch hier eine statistisch signifikant stärkere VE-

Cadherin-Expression der Endothelzellen in den arteriellen Gefäßen und Kapillaren

gegenüber einer schwächeren Expression in den venösen Gefäßen (Signifikanz p ≤ 0,04).

Dieses Ergebnis verdeutlichten auch der Median, die Boxplots und der Mittelwert: Die

Werte des Medians bewegten sich für die Arterien, Arteriolen und Kapillaren zwischen

0,12 und 0,30. In den Venolen und Venen lag der Median annähernd bei 0,0. Für die

arteriellen Gefäße ließen die Boxplots eine geringe Streuung der Werte erkennen. Die

Maximalwerte waren vereinzelt recht hoch, während die Minimalwerte dagegen bei Null

lagen. Die bei Gesunden bereits schwach VE-Cadherin-exprimierenden venösen Gefäße

zeigten bei sehr niedrigen Maximalwerten fast gar keine Streuung (Abb. 36 und 37; Tab. 5

und 6).

Bei den Proben der Sepsispatienten lagen auch die Mittelwerte generell unter denen der

Kontrollgruppen der Männer, Frauen und Kinder: Bei den Arterien, Arteriolen und

Kapillaren lag der Mittelwert zwischen 0,37 und 0,55 – bei den Venolen und Venen bei

0,04.

Kapitel 3 – Ergebnisse 75 3.1.2.2 Vergleich der Gruppe "gesund" und "krank"

Bei der Gegenüberstellung der Gruppen nach dem Kriterium gesund – krank (= Sepsis)

(gesund: n = 58 Patienten; krank: n = 20 Patienten) zeigte sich für alle Gefäßtypen eine

deutlich schwächere endotheliale Expression von VE-Cadherin in den Proben mit Zeichen

eines akuten Lungenversagens (Abb. 38, 39 und 40). Dieser Unterschied war statistisch

hochsignifikant (p = 0,0). So differierten die Werte der Mediane erheblich (Abb. 18 und

Tab. 8): Bei den Sepsisfällen fanden sich in den arteriellen Gefäßen und den Kapillaren

Werte zwischen 0,12 und 0,3, bei der Kontrollgruppe lagen die Medianwerte zwischen

1,77 und 2,03. Die Mediane der venösen Endothelzellen lagen bei den Sepsispatienten um

0,0, bei der Kontrollgruppe zwischen 0,36 und 0,53 (Tab. 8)

Die 25%- und 75%-Quantile verdeutlichten für alle Endothelzellen, unabhängig vom

Gefäßtyp, eine sehr niedrige VE-Cadherin-Antigenexpression bei den Sepsisfällen und

eine im Vergleich dazu hohe VE-Cadherin-Antigenexpression bei der Kontrollgruppe

(Abb. 38). Sowohl bei den Proben mit Zeichen des septischen ARDS als auch bei den

Proben gesunder Patienten zeigten sich breite Boxplots (Ausnahme: venöse Gefäße der

Sepsisgruppe).

Die Mittelwerte (Tab. 8) der Färbeintensität zeigten dieselbe Verteilung, die auch schon

bei den Medianen deutlich geworden war. Bei den Sepsisfällen lagen in den Arterien,

Arteriolen und Kapillaren die Mittelwerte der endothelialen Färbeintensität zwischen 0,37

und 0,55, bei der Kontrollgruppe zwischen 1,68 und 1,94. Bei den Venolen und Venen

lagen die Mittelwerte bei den Sepsisfällen bei 0,04, bei der Kontrollgruppe zwischen 0,42

und 0,58.

Sowohl die Proben regelrechten Lungengewebes als auch die Proben der septisch

geschädigten Lungen wiesen das bereits für die Kontrollgruppen beschriebene Gefäßtyp-

spezifische Expressionsmuster auf.


gesund krank

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00ARTERIEN

ARTERIOLEN

KAPILLAREN

VENOLEN

VENEN

Abb. 38: Gegenüberstellung der VE-Cadherin-Antigenexpression in den Lungengefäßen gesunder Patienten ("gesund") und an gramnegativer Sepsis verstorbener Patienten ("krank"): deutliche Reduktion der VE-Cadherin-Expression in der Gruppe "krank"

Abb. 39: intensive endotheliale VE- Abb. 40: minimale endotheliale VE- Cadherin-Expression einer Arteriole bei Cadherin-Expression einer Arteriole bei einem lungengesunden Patienten einem Sepsispatienten

Kapitel 3 – Ergebnisse 77 3.1.2.3 Vergleich der VE-Cadherin-Werte Erwachsener mit regelrechtem Lungengewebe

und Erwachsener mit Zeichen eines septisch bedingten ARDS nach dem Kriterium

"gesund – krank"

Verglich man die VE-Cadherin-Antigenexpression in den Proben der Erwachsenen nach

dem Kriterium "gesund" und "krank" (41 gesunde Erwachsene und 19 Erwachsene mit

Sepsis), fanden sich hochsignifikante Unterschiede bezüglich der endothelialen

Expressionsintensität zwischen den beiden Gruppen (p = 0,0). So zeigte sich eine mehr als

vierfach höhere endotheliale VE-Cadherin-Expression in den Arterien, Arteriolen und

Kapillaren der Gesunden im Vergleich zu den Patienten mit einem ARDS. Auch die

Färbung der Venolen und Venen der gesunden Kontrollgruppe war deutlich intensiver als

die der Sepsisgruppe. Es zeigte sich bezüglich der verschiedenen Gefäßtypen wiederum

das bereits beschriebene Verteilungsmuster der VE-Cadherin-Expression.

Ein Vergleich der VE-Cadherin-Werte in Proben regelrechter Kinderlungen und

Kinderlungen mit ARDS wurde auf Grund der kleinen Fallzahlen nicht durchgeführt: Da

nur ein Präparat mit ARDS zur Verfügung stand, konnte keine (statistisch) relevante

Aussage getroffen werden.

Tab. 8: Median und Mittelwert der Sepsispatienten und der Kontrollpatienten

Median Mittelwert

Sepsisfälle Kontrollgruppe Sepsisfälle Kontrollgruppe

Arterien 0,30 2,00 0,55 1,94

Arteriolen 0,12 1,77 0,37 1,68

Kapillaren 0,16 2,03 0,44 1,87

Venolen 0,00 0,36 0,04 0,42

Venen 0,01 0,53 0,04 0,58

Kapitel 3 – Ergebnisse 78 3.1.3 Einfluss des Geschlechts auf die VE-Cadherin-Expression

Bei Vergleich der Proben nach dem Kriterium Geschlecht (Abb. 41 bis 45) fanden sich

keine statistisch signifikanten Unterschiede (p = 0,8) bezüglich der endothelialen

Expressionsintensität von VE-Cadherin zwischen "Frauen" und "Männern".

3.1.3.1 Gesamtkollektiv

Die 41 Proben männlicher und 37 Proben weiblicher Patienten zeigten keine Differenzen

bezogen auf die endotheliale Expressionsintensität in den verschiedenen Gefäßtypen bzw.

auf die Färbeintensität (Abb. 41). Die Boxplots wiesen eine große Streuung der Werte

innerhalb des 25%- und 75%-Quantils sowie innerhalb des 5%- und 95%-Quantils auf.

Sowohl in der Gruppe der Frauen als auch in der Gruppe der Männer waren die

Endothelzellen der Arterien, Arteriolen und Kapillaren wesentlich stärker angefärbt als die

der Venolen und Venen. Es bestand kein Unterschied in der Gesamtexpression von VE-

Cadherin (Abb. 42 und 43).

m w

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00ARTERIEN

ARTERIOLEN

KAPILLAREN

VENOLEN

VENEN

Abb. 41: VE-Cadherin-Antigenexpression in den Gefäßen aller untersuchten Proben (n = 78) unter dem Gesichtspunkt "Geschlecht" (w = weiblich, m = männlich): kein Expressionsunterschied zwischen den Lungenproben von Männern und Frauen


Abb. 42: arterioläreVE-Cadherin- Abb. 43: arterioläreVE-Cadherin- Antigenexpression in einer Probe der Antigenexpression in einer Probe der Kontrollgruppe "Männer" Kontrollgruppe "Frauen"

3.1.3.2 Kontrollgruppe

Bei Vergleich der Kontrollgruppe der Männer (n = 20) und der Kontrollgruppe der Frauen

(n = 21) war ebenfalls kein statistisch signifikanter Unterschied erkennbar (Abb. 44). Die

Boxplots zeigten – verglichen mit Abb. 41 – keine große Streuung innerhalb des 25%- und

75%-Quantils. Der Unterschied der VE-Cadherin-Expression zwischen Arterien,

Arteriolen und Kapillaren zu den Venolen und Venen war noch deutlicher ausgeprägt als

bei Mitberücksichtigung der Kinder und der Sepsispatienten (Abb. 41). Das

Verteilungsmuster der Expressionsintensität in den Gefäßen war bei Frauen und Männern

identisch, auch die Gesamtintensität der Färbungen war nahezu gleich.

Ebenfalls kein Unterschied in der Gesamtexpression des VE-Cadherin-Antigens zeigte sich

in der Gruppe der Kinder und bei den Proben aller gesunden Patienten im Bezug auf das

Merkmal "Geschlecht".


m w

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00ARTERIEN

ARTERIOLEN

KAPILLAREN

VENOLEN

VENEN

Abb. 44: VE-Cadherin-Expression in den Gefäßtypen der Kontrollgruppen "Männer" und "Frauen", untersucht nach dem Kriterium Geschlecht: keine Expressionsunterschiede zwischen den Geschlechtern, Beibehaltung des gefäßtypspezifischen Expressionsmusters

3.1.3.3 Gruppe der an septischem Multiorganversagen verstorbenen Patienten

Bei der Gegenüberstellung der Lungengewebsproben der an Sepsis verstorbenen Patienten

(13 Männer, 7 Frauen) bezüglich des Kriteriums Geschlecht war kein signifikanter

Unterschied nachweisbar. Die Boxplots und die Minimal- und Maximalwerte zeigten

allerdings bei der Gruppe der männlichen Patienten eine etwas breitere Streuung als bei der

Gruppe der weiblichen Patienten (Abb. 45). Auch hier war aber das zu Beginn

beschriebene Muster mit stärkerer Expression von VE-Cadherin in den arteriellen Gefäßen

sowie den Kapillaren und schwächerer Expression in den Venolen und Venen erkennbar.

Die Anfärbungsintensität war bei beiden Geschlechtern gleich ausgeprägt. Es ergab sich

somit kein Hinweis auf eine höhere Anfälligkeit oder eine schlechtere Prognose bezüglich

eines ARDS für eines der beiden Geschlechter.


m w

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50ARTERIEN

ARTERIOLEN

KAPILLAREN

VENOLEN

VENEN

Abb. 45: endotheliale VE-Cadherin-Antigenexpression in den verschiedenen Gefäßtypen der Sepsispatienten untersucht nach dem Kriterium Geschlecht: keine Expressionsunterschiede zwischen den Geschlechtern

3.1.4 Einfluss des Alters auf die VE-Cadherin-Expression

Der Vergleich der endothelialen Expression im Bezug auf das Kriterium Alter ließ keine

signifikanten Unterschiede (Signifikanz p = 0,4) der endothelialen Expressionsintensität

der Gefäßtypen oder der Gesamtexpression (d. h. der Stärke der Anfärbung des Gewebes

im Präparat) erkennen (Abb. 46 bis 51).

3.1.4.1 Untersuchung aller 78 Patienten, verteilt auf vier Altersgruppen

Bei Einteilung des Patientenkollektivs der 78 Patienten in vier Altersgruppen stellte sich

für jede Altersgruppe das oben beschriebene Expressionsmuster mit stärkerer Expression

von VE-Cadherin in den arteriellen Gefäßen sowie den Kapillaren und schwächerer

Expression in den Venolen und Venen dar (Abb. 46). Die 25%- und 75%-Quantile sowie

die 5%- und 95%-Quantile der Boxplots streuten sehr stark. Ein Einfluss des Alters auf die

Expression von VE-Cadherin stellte sich dementsprechend nicht dar (Abb. 47 bis 50).


1 2 3 4

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00ARTERIEN

ARTERIOLEN

KAPILLAREN

VENOLEN

VENEN

Abb. 46: VE-Cadherin-Antigenexpression in den in vier Altersklassen (1: bis 20 Jahre; 2: 21 bis 40 Jahre; 3: 41 bis 60 Jahre; 4: 61 bis 83 Jahre): kein signifikanter Expressionsunterschied zwischen den verschiedenen Altersgruppen

Abb. 47: kapillarendotheliale VE- Abb. 48: kapillarendotheliale VE- Cadherin-Antigenexpression in Cadherin-Antigenexpression in Lungenproben von Patienten der Gruppe 1 Lungenproben von Patienten der Gruppe 2


Abb. 49: kapillarendotheliale VE- Abb. 50: kapillarendotheliale VE- Cadherin-Antigenexpression in Cadherin-Antigenexpression in Lungenproben von Patienten der Gruppe 3 Lungenproben von Patienten der Gruppe 4

3.1.4.2 Vergleich der Lungengewebsproben gesunder Erwachsener mit denen gesunder

Kinder

Bei der Gegenüberstellung der Proben der Erwachsenen (n = 41) und der Kinder (n = 17)

bezogen auf das Kriterium Alter fand sich kein signifikanter Unterschied (p = 0,5) der VE-

Cadherin-Expressionsintensität (Abb. 51). Auch hier zeigten die Boxplots sowie die

Minimal- und Maximalwerte eine große Streuung. Das Expressionsmuster bezüglich der

Gefäße war konstant.

Adulte Kinder

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00ARTERIEN

ARTERIOLEN

KAPILLAREN

VENOLEN

VENEN

Abb. 51: VE-Cadherin-Antigenexpression lungengesunder Kinder und Erwachsener: keine signifikanten Expressionsunterschiede bezüglich des Merkmals Alter

Kapitel 3 – Ergebnisse 84 3.1.5 VE-Cadherin-Antigenexpression in Abhängigkeit vom Obduktionszeitpunkt

Bei Untersuchung der 20 Proben der an Sepsis verstorbenen Patienten auf einen

Zusammenhang zwischen der Zeitspanne Todeseintritt – Obduktionszeitpunkt und der

Expressionsstärke von VE-Cadherin zeigten alle Patienten das oben bereits beschriebene

Expressionsmuster mit stärkerer Expression des VE-Cadherin-Antigens in den arteriellen

Gefäßen sowie Kapillaren und schwächerer Expression in den Venolen und Venen (Abb.

52).

Es konnten keine signifikanten Unterschiede (p = 0,6) der VE-Cadherin-Antigenexpression

in Abhängigkeit der Zeitspanne zwischen Todeseintritt und Obduktionszeitpunkt gefunden

werden (Abb. 53 bis 55).

Die Gruppe 1 (weniger als 24 Stunden zwischen Todeseintritt und Obduktion, vier

Patienten) zeigte im Gegensatz zu Gruppe 2 (24 bis 48 Stunden zwischen Todeseintritt und

Obduktion, elf Patienten) zwar für die Arterien und Arteriolen eine etwas stärkere, aber

statistisch nicht signifikante, Expression von VE-Cadherin mit einer größeren Streuung

bezüglich Boxplots und Minimal- bzw. Maximalwerten. In Gruppe 3 (mehr als 48 Stunden

zwischen Todeseintritt und Obduktion, fünf Patienten) imponierte eine extrem breite

Streuung der Boxplots und Maximalwerte in den arteriellen Gefäßen und den Kapillaren.

Der Median lag in Gruppe 3 deutlich niedriger als in Gruppe 1 und 2.

Die Expressionsintensität von VE-Cadherin in Venolen und Venen lag in allen drei

Gruppen nahezu bei 0, eine nennenswerte Streuung der Werte konnte nicht beobachtet

werden.

Anhand der Boxplots lässt sich ablesen, dass nach einem Zeitraum zwischen Todeseintritt

und Obduktion von mehr als 48 Stunden die VE-Cadherin-Antigenexpression äußerst

variabel ist – wenngleich auch im Mittel die Expression abnimmt – und somit keine

forensischen Rückschlüsse auf den Zeitpunkt des Todeseintritts erlaubt.


1 2 3

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50ARTERIEN

ARTERIOLEN

KAPILLAREN

VENOLEN

VENEN

Abb. 52: Vergleich der VE-Cadherin-Expression in Lungenproben von Sepsispatienten (Obduktion < 24 h (1), 24 - 48 h (2), > 48 h (3) post mortem): keine statistisch signifikanten Unterschiede der VE-Cadherin-Expression in Abh. vom Obduktionszeitpunkt

Abb. 53: VE-Cadherin-Expression in Abb. 54: VE-Cadherin-Expression in Gewebe von Sepsispatienten Gewebe von Sepsispatienten (Obduktion < 24 h post mortem) (Obduktion 24 - 48 h post mortem)


Abb. 55: VE-Cadherin-Expression in Gewebe von Sepsispatienten (Obduktion > 48 h post mortem)

3.1.6 Zusammenfassung der in situ-Ergebnisse

Bei allen 78 Patienten zeigte sich ein statistisch signifikantes Expressionsmuster mit

stärkerer Expression von VE-Cadherin in den arteriellen Gefäßen sowie den Kapillaren

und schwächerer Expression in den Venolen und Venen.

Die 20 Patienten mit einem septisch bedingten akuten Lungenversagen wiesen im

Gesamten eine sehr viel schwächere, ebenfalls statistisch signifikante, Expression von VE-

Cadherin auf als die 58 gesunden Patienten. Der Unterschied in der Expression der

verschiedenen Gefäßtypen änderte sich nicht.

Bezüglich des Geschlechts, des Alters und des Zeitraumes zwischen Tod und Obduktion

ließ sich kein signifikanter Unterschied der endothelialen Expressionsintensität von VE-

Cadherin feststellen.


3.2 Zellkulturen

Untersucht wurde die Expression des VE-Cadherin-Antigens in Immunofluoreszenz-

gefärbten Zellkulturen (HPMEC und HUVEC).

3.2.1 Expression von VE-Cadherin in HPMEC

Die nicht stimulierten HPMEC exprimierten entlang der Zell-Zell-Grenzen deutlich mehr

VE-Cadherin als die stimulierten Endothelzellen. Dies korrelierte mit einer bei stimulierten

Endothelzellen reduzierten VE-Cadherin-Antigenexpression im Bereich der

Junktionszonen.

3.2.1.1 Unstimulierte HPMEC

Die unstimulierten HPMEC (Kontrolle) bildeten einen gleichmäßigen Zellrasen aus

mittelgroßen Zellen mit generalisierter Immunofluoreszenzfärbung (= Expression des VE-

Cadherin-Antigens) entlang der Zellgrenzen entsprechend einem dichtem

Endothelzellverband (Abb. 56). Die unstimulierten Endothelzellen waren durch die

Anfärbung des VE-Cadherin-Antigens an den Interzellularjunktionen mit indirekter

Darstellung der Zellgrenzen und Zellfortsätze deutlich voneinander abgrenzbar. Des

Weiteren präsentierte sich die Antigenexpression linear. Die unstimulierten HPMEC

wiesen Werte zwischen 2,23 und 2,71 (Tab. 9 und 10) auf, wobei "0" keine Anfärbung

bzw. nur noch Fragmente des Endothelzellverbandes vorhanden und "3" eine sehr starke

endotheliale Antigenexpression bei intaktem Endothelzellverband bedeutete.

Zusammenfassend imponierte bei den unstimulierten HPMEC ein lückenloser

Endothelverband.

3.2.1.2 Vierstündige Stimulation

Nach vierstündiger Inkubation mit LPS zeigten sich deutliche, teilweise innerhalb eines

Wells sich unterscheidende, Veränderungen.

An einigen Stellen waren die Zelljunktionen noch mit dem VE-Cadherin-Antikörper

angefärbt, an anderen Stellen konnte keine VE-Cadherin-Antigenexpression mehr

festgestellt werden (Abb. 57). Dementsprechend waren Lücken im

Endothelmonolayerverband erkennbar. In einigen Bereichen des Wells war die VE-

Cadherin-Expression nach Stimulation mit LPS noch stärker reduziert (Abb. 58). VE-

Cadherin war an den Zellgrenzen nur noch streifig oder, wenn überhaupt vorhanden,

punktförmig nachweisbar (im Gegensatz zur linearen Verteilung an den Zellgrenzen der

Kapitel 3 – Ergebnisse 88 unstimulierten HPMEC, Abb. 56). Dementsprechend waren zahlreiche Lücken im

Endothelmonolayer sichtbar, passend zu einer starken Reduktion der VE-Cadherin-

Antigenexpression. Die VE-Cadherin-Antigenexpression wurde im Mittel mit 1,4 bewertet

und lag damit deutlich niedriger als bei den unstimulierten Zellen (Tab. 9).

Insgesamt war die Anfärbung des VE-Cadherin-Antigens in stimulierten HPMEC weniger

intensiv als in der unstimulierten HPMEC-Zellkultur.

Abb. 56: Unstimulierte HPMEC: lückenlose membranäre Immunofluoreszenzanfärbung aller Endothelzellen mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin

Abb. 57: HPMEC, nach vierstündiger LPS-Stimulation: streifige, lückenhafte Anfärbung der Endothelzellmembranen mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin


Abb. 58: HPMEC nach vierstündiger LPS-Stimulation: im Vergleich zu Abb. 57 noch stärkere Lückenbildung in der Immunofluoreszenzfärbung, entsprechend einer starken Reduktion des VE-Cadherin-Antigens an den Zellgrenzen

Nach vierstündiger Stimulation mit IFNγ konnte ebenfalls keine durchgehende bzw.

lineare Antigenexpression von VE-Cadherin mehr gefunden werden. An einigen Stellen

war sogar gar keine Expression mehr nachweisbar, einhergehend mit massiver

Lückenbildung im Zell-Zell-Verband. Die VE-Cadherin-Antigenexpression wurde im

Mittel mit 1,56 bewertet (Tab. 9).

Nach vierstündiger Stimulation mit IFNγ plus TNFα zeigte sich neben einer streifigen

Antigenexpression von VE-Cadherin eine teilweise auch vollkommen fehlende Expression

des VE-Cadherin-Antigens. Auffallend war, dass sich trotz Stimulation einige Zellgrenzen

erstaunlich intakt darstellten. Insgesamt ergab sich eine Bewertung der Antigenexpression

von 1,27 (Tab. 9).

Nach vierstündiger Stimulation mit TNFα (30 U/ml) zeigten sich im Vergleich zu den

unstimulierten Endothelzellen vermehrt Unterbrechungen der linearen VE-Cadherin-

Verteilung mit Bildung großer Lücken, vor allem an den trizellulären Ecken. Auch hier

imponierte die VE-Cadherin-Antigenexpression nicht linear, sondern gestreift.

Nach vierstündiger Stimulation mit TNFα (150 U/ml) war im Vergleich zu den

unstimulierten Zellkulturen nur noch wenig VE-Cadherin-Antigen an den Zell-Zell-

Grenzen nachweisbar. Dies entsprach einem deutlichen Auseinanderweichen der Zellen

und einem Zerreißen des Zellverbandes.

Kapitel 3 – Ergebnisse 90 Nach vierstündiger Stimulation mit TNFα (300 U/ml) zeigten sich – wie in den anderen mit

TNFα stimulierten Zellkulturen – eine streifige Anfärbung der Endothelzelljunktionen mit

dem Antikörper gegen VE-Cadherin und zahlreiche Unterbrechungen des Zellverbandes,

entsprechend einem "löchrigen" (durchlässigen) Endothelzellverband.

Die Bewertungen entsprechend des Scores lagen für die vierstündige Stimulation mit

TNFα in verschiedenen Konzentrationen zwischen 1,59 und 1,7 (Tab. 10).

Insgesamt zeigten sich keine bedeutsamen Unterschiede in der Schädigung des

Endothelzellverbandes in Abhängigkeit des Stimulans oder der Konzentration von TNFα

(Tab. 9 und 10).

3.2.1.3 24-stündige Stimulation

Während der unstimulierte Endothelzellmonolayer (Kontrolle) stark angefärbte und

lückenlose Zellgrenzen präsentierte, zeigten sich in den (unterschiedlich) stimulierten

Zellkulturen Veränderungen vergleichbar mit denen nach vierstündiger Stimulation (Tab.

IV und V). Die stimulierten Zellkulturen zeigten mittlere Werte zwischen 1,58 und 1,99.

Demgegenüber wiesen die unstimulierten Zellkulturen Werte von 2,63 und 2,71 auf. Die

Immunofluoreszenz-Färbung sowie die quantitativen Auswertungen belegten eine

interendotheliale Lückenbildung und eine insgesamt verminderte Anfärbungsintensität.

3.2.1.4 Zusammenfassung

Bei den unstimulierten Endothelzellen lag die VE-Cadherin-Antigenexpression im

Durchschnitt zwischen "2" (gering unterbrochener Endothelverband) und "3"

(geschlossener Endothelverband). Die stimulierten Zellen zeigten einen geschädigten

Endothelzellverband mit durchschnittlichen Werten zwischen "1" (unterbrochener

Endothelverband) und "2" (Tab. 9 und 10, Abb. 59 und 60).

Zwischen den unterschiedlichen Stimulanzien TNFα, LPS bzw. IFNγ zeichnete sich kein

Unterschied in der Stärke der Schädigung des Endothelzellzusammenhaltes ab (Tab. 9 und

10, Abb. 59 und 60). Bei Stimulation mit LPS ergaben sich für die Schädigung des

Endothelverbands Werte von 1,4 (4 h) und 1,58 (24 h) und bei Stimulation mit IFNγ Werte

von 1,56 (4 h) und 1,71 (24 h). Bei der Kombinationsstimulation mit IFNγ und TNFα

ergaben sich Werte von 1,27 (4 h) und 1,69 (24 h). Es zeigte sich tendenziell eine etwas

stärkere Schädigung des Endothels durch die Kombinationsstimulation als durch die

jeweilige Einzelstimulation mit TNFα oder IFNγ.

Auch die unterschiedlichen Konzentrationen von TNFα waren in ihrer Wirkung

vergleichbar (Tab. 10). Die Bewertungen anhand des Scores lagen zwischen 1,59 und 1,99

Kapitel 3 – Ergebnisse 91 und damit in einem sehr eingegrenzten Bereich. Eine Stimulation mit TNFα (30 U/ml)

führte bei einem mittleren Wert von 1,61 für 4 bzw. 24 Stunden teilweise sogar zu einer

größeren Endothelschädigung als die Stimulation mit TNFα (150 U/ml bzw. 300 U/ml),

bei der Werte zwischen 1,59 und 1,99 ermittelt wurden. Die Dauer der Stimulation (4 bzw.

24 Stunden) hatte ebenfalls keinen Einfluss auf den Grad der Minderung der VE-Cadherin-

Antigenexpression.

HPMEC (4h)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

unstim

uliert

LPS

IFN

IFN +

TNF

TNF (3

0 U/m

l)

TNF (1

50 U

/ml)

TNF (3

00 U

/ml)

Abb. 59: VE-Cadherin-Antigenexpression in HPMEC nach vierstündiger Stimulation mit verschiedenen Stimulanzien: im Vergleich zur Kontrolle (unstimuliert) reduzierte Antigenexpression

Abb. 60: VE-Cadherin-Antigenexpression in HPMEC nach 24-stündiger Stimulation mit verschiedenen Stimulanzien: im Vergleich zur Kontrolle (unstimuliert) reduzierte Antigenexpression

HPMEC (24h)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

unst

imul

iert

LPS

IFN

IFN +

TNF

TNF

(30

U/m

l)

TNF

(150

U/m

l)

TNF

(300

U/m

l)

Kapitel 3 – Ergebnisse 92 3.2.2 Expression von VE-Cadherin in HUVEC

Bei den HUVEC zeigte sich ein ähnliches Bild wie bei den HPMEC. Die unstimulierten

HUVEC zeigten eine deutlich stärkere VE-Cadherin-Antigenexpression an den

Endothelzellgrenzen als die stimulierten Zellen.

3.2.2.1 Unstimulierte HUVEC

Die unstimulierten HUVEC präsentierten sich als deutlich angefärbte Zellen mit intensiver,

lückenloser VE-Cadherin-Antigenexpression an den Zellgrenzen (Abb. 61). Durch die

Anfärbung des VE-Cadherin-Antikörpers an den interzellulären Junktionen wurden die

einzelnen Zellgrenzen deutlich und die Zellen präsentierten sich insgesamt als

geschlossener Endothelzellverband. Es zeigte sich eine lineare Anfärbung der Zellgrenzen.

Eine signifikante Lückenbildung war nicht vorhanden. Die unstimulierten Zellkulturen

wurden gemäß dem Score mit Werten zwischen 2,18 und 2,58 bewertet (Tab. 9 und 10).

3.2.2.2 Vierstündige Stimulation

Nach vierstündiger Stimulation mit LPS zeigte sich nur eine sehr schwache VE-Cadherin-

Immunofluoreszenz-Färbung. Die Zellgrenzen waren weder intensiv noch deutlich

angefärbt (Abb. 62). Bei hoher Vergrößerung zeigte sich meist keine lineare Verteilung der

VE-Cadherin-Expression, viel mehr waren kleine Lücken erkennbar. Die endotheliale VE-

Cadherin-Antigenexpression wurde im Mittel mit 1,62 bewertet (Tab. 9).

Nach vierstündiger Stimulation mit INFγ zeigte sich im ganzen Monolayer eine schwache

Anfärbung mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin. Neben einer teils streifigen VE-

Cadherin-Antigenexpression waren zahlreiche Lücken erkennbar, manchmal waren auch

mehrere benachbarte Zellen gar nicht angefärbt (mittlerer Score-Wert: 1,28) (Tab. 9).

Die kombinierte Stimulation mit TNFα und IFNγ schädigte den Endothelverband stärker

als die alleinige Inkubation mit TNFα, jedoch etwas schwächer als die alleinige

Stimulation mit IFNγ. Entlang der Endothelzellmembranen zeigte sich eine punktförmige

oder streife Verteilung von VE-Cadherin (mittlerer Score-Wert 1,33) (Tab. 9).

Nach vierstündiger Stimulation mit TNFα (30 U/ml) bildeten sich ebenfalls zahlreiche

Lücken. Die Zellgrenzen waren infolge dessen punktförmig und insgesamt schwach mit

dem Antikörper gegen VE-Cadherin angefärbt. Nach Stimulation mit TNFα (150 U/ml)

war der Zellverband zwar noch erhalten, unterschied sich aber vom unstimulierten

Verband. Es zeigten sich mehr Lücken als in der unstimulierten Kultur. Nach Stimulation

mit TNFα (300 U/ml) zeigte sich eine deutliche Reduktion der VE-Cadherin-Expression an

den Zellgrenzen mit punktförmiger Verteilung des VE-Cadherin-Antigens. Bei den mit

Kapitel 3 – Ergebnisse 93 TNFα in verschiedenen Konzentrationen stimulierten HUVEC ergaben sich Bewertungen

zwischen 1,52 und 1,6 (Tab. 10). Ein deutlicher Expressionsunterschied abhängig von der

TNFα-Konzentration kann somit nicht beschrieben werden

Wie bei den HPMEC zeigten sich keine bedeutsamen Unterschiede in der Schädigung des

Endothelzellverbandes in Abhängigkeit des Stimulans oder der Konzentration von TNFα.

Abb. 61: Unstimulierte HUVEC: lückenloser Endothelverband mit intakter membranöser Anfärbung der Zellgrenzen mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin

Abb. 62: HUVEC nach vierstündiger Stimulation mit LPS: nur noch schwache, lückenreiche Anfärbung der Zellmembran mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin

Kapitel 3 – Ergebnisse 94 3.2.2.3 24-stündige Stimulation

Nach 24-stündiger Stimulation zeigten die HUVEC eine reduzierte VE-Cadherin-

Antigenexpression, die nahezu identisch war mit dem Expressionsmuster nach

vierstündiger Expression. Auch hier ergab sich keine Abhängigkeit der Expression des VE-

Cadherin-Antigens vom Stimulans oder der Konzentration von TNFα (Tab. 9 und 10).

3.2.2.4 Zusammenfassung

Bei den HUVEC zeigte sich zusammenfassend ein den HPMEC ähnliches Bild. In den

unstimulierten Zellen lag die VE-Cadherin-Antigenexpression zwischen "2" und "3". In

den stimulierten HUVEC zeigte sich eine Schädigung des Endothelzellverbandes (Score

zwischen "1" und "2") (Tab. 9 und 10, Abb. 63 und 64).

Die Stimulation mit LPS ergab Werte von 1,62 (4 h) und 1,93 (24 h) und die Stimulation

mit IFNγ Werte von 1,28 (4 h) und 1,22 (24 h). Die Kombinationsstimulation mit TNFα

und IFNγ ergab Werte von 1,33 (4 h) und 0,81 (24 h). Die jeweiligen Einzelstimulationen

ergaben tendenziell eine geringere Schädigung des Endothelzellverbandes.

Bezüglich der unterschiedlichen Konzentrationen von TNFα ergaben sich Werte, die sehr

nahe beieinander lagen, für die vierstündige Stimulation zwischen 1,52 und 1,6 und für die

Stimulation über 24 Stunden zwischen 1,44 und 1,49.

Die verschiedenen Stimulanzien, die Stimulationszeit und auch die unterschiedlichen

Konzentrationen von TNFα zeigten keine Unterschiede in der Stärke der Schädigung des

Endothelzellverbandes.

Abb. 63: VE-Cadherin-Antigenexpression in HUVEC nach vierstündiger Stimulation mit verschiedenen Stimulanzien: im Vergleich zur Kontrolle (unstimuliert) reduzierte Antigenexpression

HUVEC (4h)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

unstim

uliert

LPS

IFN

IFN +

TNF

TNF (3

0 U/m

l)

TNF (1

50 U/m

l)

TNF (3

00 U/m

l)


Abb. 64: VE-Cadherin-Antigenexpression in HUVEC nach 24-stündiger Stimulation mit verschiedenen Stimulanzien: im Vergleich zur Kontrolle (unstimuliert) reduzierte Antigenexpression Tab. 9: Ergebnisse der Immunofluoreszenz-Färbung für LPS, IFNγ und IFNγ/TNFα

PFA LPS IFNγ IFNγ / TNFα

HPMEC, 4h 2.23 1.4 1.56 1.27

HPMEC, 24 h 2.63 1.58 1.71 1.69

HUVEC, 4h 2.36 1.62 1.28 1.33

HUVEC, 24h 2.49 1.93 1.22 0.81

Tab. 10: Ergebnisse der Immunofluoreszenz-Färbung in Abhängigkeit von den unterschiedlichen Konzentrationen von TNFα PFA 30 U/ml TNFα 150 U/ml TNFα 300 U/ml TNFα

HPMEC, 4h 2.46 1.61 1.59 1.7

HPMEC, 24 h 2.71 1.61 1.89 1.99

HUVEC, 4h 2.18 1.6 1.52 1.56

HUVEC, 24h 2.58 1.46 1.44 1.49

3.2.3 Vergleich der VE-Cadherin-Antigenexpression bei HPMEC und HUVEC

Sowohl bei HUVEC als auch bei HPMEC war die VE-Cadherin-Antigenexpression an den

Zellgrenzen der unstimulierten Zellen deutlich stärker entwickelt als bei den stimulierten

Zellkulturen.

HUVEC (24h)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

unstim

uliert

LPS

IFN

IFN +

TNF

TNF (3

0 U/m

l)

(150

U/m

l)

TNF (3

00 U/m

l)

Kapitel 3 – Ergebnisse 96 Eine Erhöhung der Stimulationszeit und der Konzentration von TNFα führten zu keiner

weiteren Reduktion der VE-Cadherin-Antigenexpression. Tendenziell führte die

Kombinationsstimulation von TNFα und IFNγ bei beiden Zelltypen zu einer etwas

erhöhten Endothelschädigung. Des Weiteren waren keine relevanten Unterschiede in der

Intensität der Stimulation zwischen den einzelnen Substanzen (TNFα, LPS bzw. IFN γ)

erkennbar.

Zwischen den HPMEC und den HUVEC konnten keine relevanten Unterschiede bezüglich

der Expressionsintensität des VE-Cadherin-Antigens festgestellt werden.

Anhand der Bilder zeigte sich aber eine unterschiedliche Verminderung der VE-Cadherin-

Expression. In den HPMEC entsprach die Verminderung im Wesentlichen der Bildung von

Zell-Zell-Lücken und Unterbrechung der VE-Cadherin-Antigenexpression entlang der

Zellgrenzen. Die geringe Anfärbungsintenstität der HPMEC nach Stimulation trat

demgegenüber eher in den Hintergrund.

In den HUVEC entsprach die reduzierte Expression einer extrem schwachen

Immunfluoreszenzreaktion der Endothelien. Eine Lückenbildung mit Unterbrechung der

VE-Cadherin-Antigenexpression war nicht so eindrücklich ausgebildet.

Kapitel 4 - Diskussion 97

4 Diskussion

4.1 Charakterisierung der VE-Cadherin-Antigenexpression entlang der

Lungenstrombahn

Alle 78 untersuchten Patienten zeigten eine kräftige endotheliale VE-Cadherin-

Antigenexpression in den arteriellen Gefäßen (Arterien und Arteriolen) sowie den

Kapillaren und eine im Vergleich dazu deutlich schwächere Expression in den Venolen

und Venen. Tendenziell – nicht signifikant – war die Expression in den Arterien und

Kapillaren stärker ausgeprägt als in den Arteriolen.

Dieses gefäßtypspezifische Expressionsmuster fiel auch bei der getrennten Untersuchung

der Lungengewebsproben der Gruppen der Frauen, Männer, Kinder und Sepsispatienten

auf. Die nicht-signifikante Beobachtung einer besonders starken Anfärbung der Arterien

und Kapillaren fand sich ebenfalls in allen vier Einzelgruppen.

Vergleichbare Untersuchungen zur VE-Cadherin-Expression in pulmonalen Endothelzellen

in situ sind bis dato nicht publiziert. Die hier für Lungengefäße erhobenen Befunde

korrelieren jedoch mit Untersuchungen von Endothelzellen muskulärer Arterien,

Arteriolen, Kapillaren, Venolen und Venen in verschiedenen Organen, darunter der Lunge,

für die die Expression von VE-Cadherin an den Zellgrenzen nachgewiesen wurde

(Lampugnani et al., 1992). Allerdings beschrieben Lampugnani et al. keine Unterschiede

zwischen den Endothelien verschiedener Gefäßtypen. Des Weiteren wurde von der

Forschergruppe eine VE-Cadherin-Expression in Makrophagen nachgewiesen

(Lampugnani et al., 1992). Diese wurde in der vorliegenden Untersuchung nicht

beobachtet. Allerdings wurde hier bei der Färbung des Gewebes die endogene Peroxidase

blockiert und so eine unspezifische Anfärbung der Makrophagen ausgeschlossen.

4.1.1 Heterogenität der Endothelzellen bezüglich Morphologie und Expression

funktionsbestimmender Moleküle

Die in der vorliegenden Arbeit sich darstellende Heterogenität der VE-Cadherin-

Expression in den Endothelzellen der verschiedenen pulmonalen Gefäßtypen korreliert mit

der für verschiedene Gefäßbahnabschnitte in der Literatur beschriebenen Heterogenität.

So wurde eine endotheliale Heterogenität der mikro- und makrovaskulären sowie

arteriellen und venösen Endothelzellen in verschiedenen Organen und Spezies, aber auch

in verschiedenen Kompartimenten im selben Organ beschrieben (Cines et al., 1998;

Kapitel 4 - Diskussion 98 Mantovani et al., 1997; Mantovani et al., 1992; Rajotte et al., 1998; Springer et al., 1995;

Thorin et al., 1997; Volk und Kox, 2000). Diese phänotypische Variation zwischen

Endothelzellen wird durch embryonale Differenzierungsunterschiede, Geschlecht, Alter

und Krankheiten erklärt (McCarron et al., 1994; Marín und Rodríguez-Martínez, 1999;

Risau, 1995).

Im Einzelnen unterscheiden sich Endothelzellen u. a. in ihrer Morphologie (Aird, 2003;

Cines et al., 1998; Murphy et al., 1999; Risau, 1995), Funktion, Expression von

Adhäsionsmolekülen (z. B. VE-Cadherin, ICAM-1, Leukozytenadhäsionsmoleküle) und

Syntheseprodukten, Zytokinen, Peptidsequenzen (molekulare Heterogenität) und

Proteinen, der Wachstumsrate und der Antwort auf endogene Faktoren (Cines et al., 1998;

Gräfe et al., 1994; Grau et al., 1996; Stevens et al., 2000). Daraus ergeben sich

unterschiedliche Antworten auf inflammatorische Signale (Stevens et al., 2000), so dass

abhängig von den endothelialen Eigenschaften bestimmte pathologische Vorgänge auf

einzelne Regionen beschränkt sein können und sich daraus charakteristische

Krankheitsbilder ergeben. Beispiele sind die arterielle und venöse Thrombose, die

Atherosklerose, die verschiedenen Vaskulitiden und die Tumormetastasierung (Cines et al.,

1998).

Analog zur heterogenen VE-Cadherin-Expression in den pulmonalen Gefäßen

unterscheidet sich die Expression anderer endothelialer Moleküle ebenfalls in ihrer

Intensität zwischen den verschiedenen Gefäßtypen: ACE wird sehr stark in pulmonalen

Kapillaren, gefolgt von Arterien und Arteriolen exprimiert, bei nur geringer Expression in

Venen und Venolen (Müller et al., 2004). Im Gegensatz dazu wird der vWf in den

Kapillaren nur sehr schwach exprimiert – mit zunehmendem Gefäßkaliber steigt seine

Expression an (Müller et al., 2002b). In postkapillären Venolen des Systemkreislaufs

finden sich vor allem P-Selectin, E-Selectin und VCAM-1. CD34 wird bevorzugt in

Kapillaren, CD36 in der Mikrovaskulatur exprimiert (Müller et al., 2002a; Springer et al.,

1995). Viele endothelfunktionsbestimmende Moleküle, unter ihnen vWf, Tissue Type

Plasminogen Activator, u-PA, Lu-ECAM-1 (Lung-Specific Endothelial Cell Adhesion

Molecule), Mad-CAM-1 (Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1), Granulocyte

Colony-Stimulating Factor, PECAM-1 und IL-6, werden nicht in allen Organen bzw.

Gefäßtypen endothelial exprimiert (Cines et al., 1998).

Analog zu der unterschiedlichen Expression endothelialer Moleküle treten auch bei der

Expression von Rezeptoren Unterschiede auf, die auf die unterschiedlichen Zelltypen und

Differenzierungsstadien zurückzuführen und für die Heterogenität der Endothelzellen

ursächlich sind (Faure et al., 2001).

Kapitel 4 - Diskussion 99 Die gefäßtyp- und organspezifische Expression endothelialer Moleküle und Rezeptoren

erklärt, dass grundlegende Funktionen des Endothels wie die Kontrolle der Hämostase, der

Gefäßtonus, die Zellbewegung, der Nährstoffaustausch, die Barrierenfunktion und

Angiogenese in verschiedenen Abschnitten des Gefäßbaumes unterschiedlich reguliert

werden können (Aird, 2003). Innerhalb kürzester Zeit können Endothelzellen auf äußere

oder innere Einflüsse segmentabhängig und damit sehr selektiv reagieren (Aird, 2003;

Khimenko und Taylor, 1999; Lamm et al., 1988; Parker und Yoshikawa, 2002).

4.1.2 Heterogenität des Endothels in Abhängigkeit von der endothelialen Barrierefunktion

Die Heterogenität des Endothels spiegelt sich auch in der gefäßtypspezifischen Regulation

der Blut-Gewebe-Schranke, die eine zentrale physiologische Funktion des Endothels

darstellt, wider.

Die hier nachgewiesene starke VE-Cadherin-Antigenexpression in den Arterien deutet auf

einen stabilen Endothelverband mit geringer Permeabilität hin, während die schwache

Antigenexpression in den venösen Lungengefäßen auf eine vergleichsweise höhere

Gefäßwandpermeabilität im venösen Schenkel des Lungenkreislaufs hinweist.

Vergleichbares haben Kevil et al. (1998) für den systemischen Kreislauf beschrieben: Das

arterielle Gefäßsystem befördert mit hohem Druck Blut und Plasmabestandteile – ein

Stoffaustausch ist hier nicht erwünscht. Um dies zu gewährleisten, ist eine geringe

Gefäßpermeabilität nötig. In den Venen des systemischen Kreislaufs existiert im

Gegensatz dazu eine höhere Permeabilität, der einen größeren Austausch löslicher Stoffe

erlaubt.

In vitro-Studien zeigten eine stärkere Expression und junktionale Organisation von

Cadherinen, vor allem von VE-Cadherin, in venösen im Gegensatz zu arteriellen

Endothelzellen (Kevil et al., 1998). Hingegen exprimierten beide Endothelzelltypen in vivo

VE-Cadherin in gleicher Weise. Diese Studie weist zum einen auf den Unterschied

zwischen in vitro- und in vivo-Experimenten hin. Der scheinbare Widerspruch zu den hier

präsentierten Ergebnissen, bei denen im menschlichen Lungengewebe die Arterien

eindeutig mehr VE-Cadherin exprimierten als die Venen, kann mit dem Unterschied

zwischen dem systemischen und dem pulmonalen Kreislauf erklärt werden. So

verwendeten Kevil et al. (1998) sowohl für die in vitro- als auch für die in vivo-Studien (en

face preparations) arterielle und venöse Nabelschnurgefäße, während in der vorliegenden

Arbeit Lungengewebe und HPMEC/ HUVEC untersucht wurden.

Dass Kevil et al. (1998) in vivo in venösen Endothelzellen eine schwächere, diffusere und

weniger organisierte Okkludin-Expression und in arteriellen Endothelzellen eine starke

Kapitel 4 - Diskussion 100 kontinuierliche interzelluläre Okkludin-Expression fanden, erklärten sie damit, dass die

Endothelbarriere in den Arterien mehr von Okkludin als von VE-Cadherin und die venöse

Barriere mehr von VE-Cadherin als von Okkludin abhängig ist. Daraus ergab sich im

Versuch eine unterschiedliche Ansprechbarkeit der beiden Gefäßtypen auf eine niedrige

extrazelluläre Calziumkonzentration sowie auf Cytochalasin D.

Ähnliche Ergebnisse erarbeiteten Corada et al. (1999), die in Gefäßendothelien von Herz

und Lunge nach Inkubation mit dem VE-Cadherin-Antikörper BV13 eine diffuse VE-

Cadherin-Neuverteilung in den Mikrogefäßen nachwiesen, mit Ausnahme der Arteriolen,

in denen sich das Verteilungsmuster infolge des Nebeneinanderbestehens von Tight- und

Adhärensjunktionen nicht änderte.

Weitere Untersuchungen ergaben eine Variation der Art der Endothelzelljunktionen

zwischen verschiedenen Segmenten des Gefäßbaumes (Aird, 2003). In Gefäßen mit einem

Durchmesser < 30 µm bildete das Lungenendothel eine eingeschränktere Barriere als das

arterielle oder venöse Endothel (Stevens et al., 2000). Dementsprechend unterschieden sich

in Ratten- und Kaninchenlungen Arterien und Venen bezüglich der pulmonalen

Endothelpermeabilität von den alveolären Kapillargefäßsegmenten (Albert et al., 1985;

Chetham et al., 1999; Kelly et al., 1998; Parker et al., 2002). Auch in verschiedenen

Organen existieren Unterschiede in der Ausprägung der Endothelzelljunktionen mit einem

durch Zonulae occludentes vernetzten kontinuierlichen Endothel im Gehirn und der

Netzhaut, einem diskontinuierlichen Endothel in der Leber, der Milz und den

Knochenmarksinusoiden sowie einem gefensterten Endothel in den Nieren, dem

Intestinaltrakt und den endokrinen Drüsen (Cines et al., 1998). In mesenterialen Venolen

wurde eine lockere, diskontinuierlich organisierte Verteilung von Zonulae occludentes

(Tight-Junktionen), in Arterien, Arteriolen und Kapillaren hingegen eine komplexe

Kombination von Zonulae occludentes mit Ausbildung einer weniger permeablen Barriere

gefunden (Adamson et al., 1998; Simionescu et al., 1975).

Obgleich die Variationen der Oberflächenbeschaffenheit der Endothelien, die von Region

zu Region unterschiedlich sind, sowie die stimulansbedingten Veränderungen der

Endothelzellen wichtig für die Funktion des Endothelmonolayers sind (Davies et al.,

2003), ist die Rolle der Heterogenität im Bezug auf die verschienen Gefäßbetten relativ

wenig untersucht (Cines et al., 1998; Lehr et al., 2000; Thorin et al., 1997).

Kapitel 4 - Diskussion 101 Die Literatur bestätigt somit die Heterogenität des Endothels bezüglich der Expression von

VE-Cadherin an den Interzellularjunktionen.

4.1.3 Einfluss eines Lungentumors auf die VE-Cadherin-Expression

41 Lungengewebeproben wurden im Rahmen von Tumorlobektomien gewonnen. Trotz der

mikroskopischen Begutachtung, dass es sich bei dem für die immunhistochemischen

Untersuchungen verwendeten Material um tumorfreies Gewebe handelt, ist zu diskutieren,

ob eine systemische Wirkung des Tumors die VE-Cadherin-Antigenexpression beeinflusst

hat. Vergleichende Studien über eine mögliche Beeinflussung der Expression der

Adhäsionsmoleküle in tumornahem, jedoch mikroskopisch tumorfreiem Gewebe sind bis

dato nicht veröffentlich worden. Vielmehr gelten Endothelzellkulturen, gewonnen aus im

Rahmen von Tumorlobektomien entnommenem Lungengewebe, als ideales

Untersuchungsgut. So nutzten z. B. Grau et al. (1996) für ihre Arbeit über die

Eigenschaften mikrovaskulärer Endothelzellen bei Patienten mit ARDS als Kontrollgruppe

eine Kultur MVEC (Pulmonary Microvascular Endothelial Cells) aus (makroskopisch

normalem) Lungengewebe, das im Rahmen einer Tumorlobektomie entnommen worden

war.

Corada et al. (2002) untersuchten die VE-Cadherin-Expression in Tumorgefäßen und

fanden in Tumorgefäßen schlecht organisierte Junktionen sowie eine hohe Permeabilität im

Vergleich zu den gesunden Gefäßen. Auch Tumorzellen sind (während der

Metastasierung) fähig, eine lokale Dissoziation mit Bildung von interzellulären Lücken

zwischen Endothelzellen herbeizuführen. Dies ermöglicht den Tumorzellen, in die

Blutzirkulation zu gelangen (Baumgartner et al., 2000). In den hier untersuchten

Lungengewebsproben konnte eine hierzu passende schwache Expression von VE-Cadherin

nicht gefunden werden.


4.2 VE-Cadherin-Antigenexpression in regelrechtem Lungengewebe und

Lungengewebe bei septisch bedingtem ARDS

Die Lungenproben mit Zeichen eines ARDS zeigten bei Vergleich mit regelrechten

Lungen eine statistisch signifikante Reduktion der endothelialen VE-Cadherin-

Antigenexpression, wobei diese Reduktion in allen Gefäßtypen nachweisbar war. Dennoch

waren die Arterien, Arteriolen und Kapillaren – entsprechend dem im Gesunden

nachweisbaren gefäßtypspezifischen Verteilungsmuster von VE-Cadherin – nicht ganz so

schwach angefärbt wie die Venen und Venolen.

Die reduzierte VE-Cadherin-Antigenexpression bei Patienten mit septisch bedingtem

ARDS deutet auf eine Verminderung von VE-Cadherin an den endothelialen

Zelljunktionen hin. Dies entspricht der Hypothese, dass Zelladhäsionsmoleküle wie VE-

Cadherin bei ARDS vermindert exprimiert werden, dadurch die Endothelpermeabilität

gesteigert wird und eine Leukozytenextravasation und eine Ödembildung ermöglicht wird.

4.2.1 Zusammenhang zwischen verminderter VE-Cadherin-Expression und

Endothelpermeabilität

Vergleichbare Untersuchungen zur VE-Cadherin-Expression in Gefäßendothelien humaner

Lungen mit septisch bedingtem ARDS liegen derzeit nicht vor.

Zahlreiche Untersuchungen an Zellkulturen zeigten jedoch, dass die Adhäsion von

Leukozyten an Endothelzellen einen Verlust der VE-Cadherin vermittelten Zell-Zell-

Kontakte und einen Anstieg der Endothelpermeabilität induziert (Allport et al., 1997;

Carden et al., 1998; Hermant et al., 2003; Del Maschio et al., 1996; Rosengren et al., 1991;

Tinsley et al., 1999). Aus der gestörten Permeabilität resultiert die fast ungehinderte

Passage hochmolekularer Moleküle und Zellen, die im Weiteren zu einer Ödembildung

führt (Del Maschio et al., 1996; Lampugnani et al., 1992; Petrache et al., 2003).

Eine Exposition von Endothelzellen gegenüber Zytokinen wie TNFα, IFNγ und LPS (die

im Rahmen von Sepsis und ARDS eine Rolle spielen) führte ebenfalls zu einer Zerstörung

der VE-Cadherin-Immunolokalisation mit Bildung von Lücken und einer gestörten

Barrierefunktion (Bannerman et al., 1998; Nwariaku et al., 2002; Petrache et al., 2003;

Shaw et al., 2001a; Wong et al., 1999).

Carden et al. (1998) wiesen per ELISA einen signifikanten Anstieg des löslichem VE-

Cadherins im Plasma von ARDS-Patienten im Vergleich zu Gesunden nach, bedingt durch

die proteolytische Abspaltung des VE-Cadherin bei ARDS.

Kapitel 4 - Diskussion 103 Wong et al. (1999) fanden bei der Untersuchung der VE-Cadherin-Expression in

Mesenterialgefäßen der Ratte nach Zytokinexposition in den Arteriolen und Kapillaren nur

sehr wenige Lücken im Endothel, ganz im Gegensatz zu einer häufigen Lückenbildung in

den Venolen. Das zeigt, dass das endotheliale VE-Cadherin der Venolen zwar stärker von

den Zytokinen affektiert wird, die VE-Cadherin-Expression der Endothelzellen der

Arteriolen und Kapillaren aber ebenfalls betroffen ist. In den vorliegenden Untersuchungen

zeigte sich ein vergleichbares Ergebnis – bei septisch bedingtem ARDS reagierten alle

Gefäße mit einer VE-Cadherin-Reduktion.

Die Literatur bestätigt somit eine verminderte VE-Cadherin-Expression bei Patienten mit

einem ARDS.

4.2.2 Einfluss weiterer Faktoren auf die VE-Cadherin-Expression

Abgesehen von den bei ARDS vermehrt messbaren Zytokinen und Chemokinen, haben

auch weitere Faktoren Einfluss auf die VE-Cadherin-Expression: Externe Stimuli wie

Apo(a) (Pellegrino et al., 2003), Cadmium (Pearson et al., 2003), Thrombin

(Konstantoulaki et al., 2003; Lampugnani et al., 1992; Lim et al., 2001), Elastase (Carden

et al., 1998; Hermant et al., 2003; Lampugnani et al., 1992), oxidativer Stress (Kevil et al.,

1998a; Zhao et al., 2001), EGTA-Behandlung (Liao et al., 2002), erniedrigte

Kalziumkonzentration (Gao et al., 2000; Schnittler et al., 1997), Wasserstoffperoxid und

Diamid (Zhao et al., 2001) führen zu einer verminderten Expression von VE-Cadherin mit

Lückenbildung und verminderter junktionaler Integrität.

4.2.3 Reaktivität des septischen Lungengewebes

Die Reaktivität des Lungengewebes von an septischem ARDS verstorbenen Patienten

wurde durch die Anfärbung mit CD31 nachgewiesen. CD31 (= PECAM), ein pan-

endothelialer Marker für die morphologische Endothelintegrität (Müller et al., 2002), wird

sowohl in regelrechtem Lungengewebe als auch in Proben von Sepsispatienten in allen

Gefäßen gleichmäßig stark exprimiert (Müller et al., 2002). Die gleichmäßige Expression

von CD31 in den Gefäßtypen der untersuchten Lungengewebsproben belegt, dass die

reduzierte VE-Cadherin-Antigenexpression nicht Folge eines schlechten

Erhaltungszustands des Gewebes ist, sondern charakteristisch für die VE-Cadherin-

Expression bei ARDS ist. Die verminderte VE-Cadherin-Expression beruht daher nicht auf

einem defekten Endothel, sondern auf einer Reduktion der endothelialen Zelljunktionen in

Zusammenhang mit dem ARDS.


4.3 VE-Cadherin-Antigenexpression bezogen auf Geschlecht und Alter

Der Vergleich der VE-Cadherin-Antigenexpression in den Lungenproben bezüglich des

Kriteriums Geschlecht wies keinerlei Unterschiede in der endothelialen Expression

zwischen Männern und Frauen auf. Es wurden ebenfalls keine Unterschiede der VE-

Cadherin-Antigenexpression zwischen den nach Alter gruppierten Patienten gefunden.

Zum Einfluss dieser beiden Kriterien auf den endothelialen Phänotyp gibt es nur sehr

wenige Untersuchungen. Das mag zum einen damit zusammenhängen, dass man bei der

Expression von Zelladhäsionsmolekülen keinen Unterschied zwischen den Geschlechtern

erwartet. Es hängt aber wohl auch damit zusammen, dass viele Studien an Zellkulturen

durchgeführt werden, bei denen eine Unterscheidung nach Alter und Geschlecht nicht

möglich ist.

In situ-Studien über einen Zusammenhang zwischen der VE-Cadherin-Expression und

Alter bzw. Geschlecht sind bisher nicht publiziert.

In der Literatur beziehen sich die Untersuchungen zu altersabhängigen Veränderungen der

Gefäße überwiegend auf Erkrankungen wie Atherosklerose, Hyalinose u. a.

Jedoch sind Variationen für die Expressionsintensität bestimmter Proteine in pulmonalen

Endothelzellen beschrieben, die sowohl durch das Geschlecht als auch durch das Alter

bedingt sind (Marín und Rodríguez-Martínez, 1999; Müller et al., 2004; Müller et al.,

2002a; Müller et al., 2002b; Müller et al., 2002c; Risau, 1995; Vuong und Berry, 2002). So

fanden Müller et al. (2002a und 2002c) bezüglich CD34 eine mit dem Alter zunehmende

endotheliale Expressionsintensität in Venen und Arterien sowie eine mit dem Alter

abnehmende Expressionsintensität in der pulmonalen Mikrovaskulatur, d. h. den Venolen,

Arteriolen und Kapillaren. Die Expression des vWf in humanen Lungenendothelzellen

nahm mit dem Alter zu (Müller et al., 2002b; Müller et al., 2002c). Des Weiteren wird

zwischen embryonalem und adultem ausdifferenziertem Endothel unterschieden (Risau,

1995). Zu diskutieren wäre hier, dass VE-Cadherin in Mausembryos bei der

Vaskulogenese von Bedeutung ist (Breviario et al., 1995; Vittet et al., 1997).

Die VE-Cadherin-Expression wurde ebenso wie die von ACE, CD34 und vWf durch das

Geschlecht nicht signifikant beeinflusst (Müller et al., 2004; Müller et al., 2002a; Müller et

al., 2002b).


4.4 VE-Cadherin-Antigenexpression bezogen auf den Zeitraum zwischen

Todeseintritt und Obduktionszeitpunkt

Bei den Proben der Sepsispatienten – die alle obduziert wurden – wurde überprüft, ob die

Expression von VE-Cadherin mit zunehmendem Zeitraum zwischen Todeseintritt und

Obduktionszeitpunkt abnahm. Interessanterweise konnten keine signifikanten Unterschiede

in Abhängigkeit vom Obduktionszeitpunkt gefunden werden. Als signifikante

Beobachtung zu werten war, dass ein stark erniedrigter Median bei Patienten, deren

Lungenproben mehr als 48 Stunden nach dem Tod gewonnen wurden, zu beobachten war.

Bemerkenswert war auch, dass die Spannbreite der Werte nach diesem Zeitpunkt (> 48

Stunden) auffällig hoch war. Bei der Interpretation der Befunde muss berücksichtigt

werden, dass nur Proben von 20 Patienten zur Verfügung standen. Nach Einteilung in drei

Gruppen (je nach Zeitraum zusammengestellt in "Kleingruppen" von 4, 11 bzw. 5

Patienten) waren statistisch signifikante Aussagen schwierig. Insgesamt deuten die

Befunde darauf hin, dass die VE-Cadherin-Expression nach diesem Zeitraum individuell

unterschiedlich stark nachweisbar war. In jedem Fall zeigen die Befunde, dass VE-

Cadherin noch bis zu drei Tagen postmortal in formalinfixiertem Gewebe nachgewiesen

werden kann.

Tsokos et al. zeigten in Studien, dass endotheliale Adhäsionsmoleküle wie E-Selektin und

ICAM-1, ebenso wie zahlreiche andere Parameter, als immunhistochemische Marker für

die postmortale Diagnose der Sepsis geeignet sind (Tsokos et al., 2000; Tsokos und

Fehlauer, 2001; Tsokos, 2003). Der Aspekt einer evtl. rechtsmedizinisch relevanten

Veränderung der Expression von E-Selektin und ICAM-1 in Abhängigkeit des Zeitraumes

zwischen Tod und Obduktion wurde allerdings nicht diskutiert.

In der vorliegenden Arbeit wurde VE-Cadherin bei septischem ARDS im Vergleich zu

gesundem Lungengewebe vermindert nachgewiesen. Da aber keine Beziehung zwischen

der Zeitspanne zwischen Tod und Obduktionszeitpunkt und der Intensität der VE-

Cadherin-Antigenexpression nachweisbar war, liefern die vorliegenden Befunde keinen

Hinweis dafür, dass VE-Cadherin zur Bestimmung des Todeszeitpunkts innerhalb einer

Spanne von drei Tagen verwendet werden kann.


4.5 IRDS

Bei den drei IRDS-Fällen zeigten zwei der Kinderlungen eine vergleichsweise intensive

Anfärbung der Endothelzellen mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin, während die dritte

Lunge eine schwache immunhistochemische Reaktion aufwies (analog den Patienten mit

gramnegativer Sepsis). Die Zahl der hier untersuchten Proben ist für eine tendenzielle

Aussage zu klein. Dennoch sollte diskutiert werden, ob VE-Cadherin in den beiden Lungen

mit IRDS nicht vermindert exprimiert wurde, weil IRDS in erster Linie auf eine

Lungenunreife infolge ungenügender Bildung reifen Surfactants zurückzuführen ist. Eine

Ödembildung, die auf eine Störung der Permeabilität und damit auf eine evtl.

Verminderung von VE-Cadherin an den Zellgrenzen hinweist, tritt nicht auf. Bei der

IRDS-Lunge mit einer niedrigen VE-Cadherin-Expression wurde hingegen zusätzlich die

Diagnose einer bronchopulmonalen Dysplasie gestellt, die sich aus einem IRDS

entwickeln kann und bei der es auch zu einer (meist wieder abklingenden)

Entzündungsreaktion kommt. Da eine Entzündung mit einer verminderten Expression von

VE-Cadherin einhergeht, kann dies die verminderte VE-Cadherin-Antigenexpression bei

dieser IRDS-Lunge erklären.


4.6 Kritische Anmerkungen zur VE-Cadherin-Untersuchung in situ

Die Bewertung der Lungenpräparate erfolgte semiquantitativ. Eine quantitative – und

damit objektivere – Untersuchung kann mittels DNA- oder RNA-Extraktion des VE-

Cadherin aus dem Gewebe erfolgen. Dass eine DNA- bzw. RNA-Extraktion aus

paraffiniertem Lungengewebe möglich ist, zeigten Shi et al. und Masuda et al. (Shi et al.,

2002; Masuda et al., 1999). Allerdings ergibt sich daraus der Nachteil, dass

morphologische Veränderungen nicht mehr sichtbar werden. Des Weiteren erlauben diese

quantitativen Methoden keinen Nachweis gefäßtypspezifischer Unterschiede der VE-

Cadherin-Expression.

Daher sollten für quantitative Untersuchungen der VE-Cadherin-Antigenexpression in

einer Folgestudie die hier verwendeten Methoden mit einer DNA- bzw. RNA-Bestimmung

nach Lasermikrodissektion kombiniert werden.

Vergleicht man in mehreren Lungenproben ein oder mehrere Merkmale, so sind

Unterschiede im Rahmen der natürlichen Schwankung von "echten", d. h. durch bestimmte

Einflussfaktoren hervorgerufene Veränderungen zu unterscheiden. "Natürliche"

Schwankungen der Probenwerte stechen bei einer kleinen Probenzahl stärker hervor. Je

größer die Anzahl der Proben, desto geringer ist der Einfluss der natürlichen

Schwankungen. Nicht signifikante Unterschiede kommen aber auch dadurch zu Stande,

dass es keine Unterschiede gibt.

Der Unterschied zwischen diesen beiden Fällen lässt sich an den Graphiken verdeutlichen.

Sind die Boxplots der Vergleichgruppen ähnlich hoch, so liegt kein Unterschied vor.

Streuen die Werte sehr stark und ist die Spannweite sehr groß, so ist – vor allem bei einer

geringen Probenzahl – der evtl. erkennbare Unterschied eher zufällig entstanden.


4.7 VE-Cadherin-Antigenexpression in Zellkulturen (HPMEC und HUVEC)

In den Zellkulturen ergab sich eine kontinuierliche Antigenexpression von VE-Cadherin an

den Grenzen der unstimulierten Endothelzellen sowohl bei den HPMEC (= Modell für

mikrovaskuläre Endothelzellen) als auch bei den HUVEC (= Modell für makrovaskuläre

Endothelzellen).

Der Nachweis einer kontinuierlichen interendothelialen Expression von VE-Cadherin in

Endothelzellkulturen ist mehrfach beschrieben worden (Davies et al., 2003; Hordijk et al.,

1999; Lampugnani et al., 1992; Lim et al., 2001) und wurde bei zahlreichen

Zellkulturuntersuchungen zur VE-Cadherin-Expression unter externer Stimulation als

gegeben vorausgesetzt.

In der Literatur finden sich zudem Aussagen über Unterschiede zwischen mikro- und

makrovaskulären Endothelzellen: Mantovani et al. (1992) beschreiben bezüglich einer

Aktivierung durch Zytokine, dass die Ergebnisse in makrovaskulären Endothelzellen auf

mikrovaskuläre Endothelzellen übertragen werden können. Sie betonen jedoch, dass es

Unterschiede zwischen Endothelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen oder

von verschiedenen Kompartimenten desselben Organs in Bezug auf die Antwort auf

Zytokine gibt.

Mehrheitlich ist man jedoch der Meinung, dass zwischen HUVEC und HPMEC bzw.

makro- und mikrovaskulären Endothelzellen in vielen Aspekten Unterschiede bestehen

(Burns et al., 2003; Cines et al., 1998; Gräfe et al., 1994; Grau et al., 1996; Mantovani et

al., 1997; Mantovani et al., 1992; Risau, 1995; Springer et al., 1995; Stevens et al., 2000).

Das betrifft zum einen phänotypische/morphologische Unterschiede (Burns et al., 2003),

unterschiedliche biochemische Eigenschaften (Gräfe et al., 1994) und Unterschiede in der

Antigenexpression. So wird ICAM-1 in der Lunge in der Mikro- gegenüber der

Makrovaskulatur vermehrt exprimiert (Grau et al., 1996). Im Herzen zeigte sich u. a. eine

Heterogenität bezüglich der Expression von Bradykinin und Plasminogen Aktivator

Inhibitor-1 in mikro- und makrovaskulären Zellen (Gräfe et al., 1994). Unterschiede

zwischen HUVEC und Aortenzellen von Rindern (Friedl et al., 2003) und zwischen

PMECs (Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells) und PAECs (Rat Pulmonary

Arterial Endothelial Cells) (Wang et al., 2002) wurden insbesondere bezüglich der

Endothelpermeabilität und der Neutrophilenadhäsion nach Stimulation mit TNFα

beschrieben.

Kapitel 4 - Diskussion 109 Im Gesamten besteht zwar eine Heterogenität zwischen makro- und mikrovaskulären

Endothelzellen, endotheliale Marker – so auch das hier untersuchte VE-Cadherin – werden

aber mehrheitlich von beiden Zellformen exprimiert (Imaizumi et al., 1997; Zimmerman et

al., 1999). Dies erfordert somit in jedem Einzelfall eine Prüfung bezüglich der

Vergleichbarkeit von mikro- und makrovaskulären Endothelzellen.


4.8 VE-Cadherin-Antigenexpression in unstimulierten Zellkulturen im Vergleich zu

stimulierten Zellkulturen

Wie auf Grund der in situ-Befunde erwartet, wiesen die stimulierten Zellkulturen

gegenüber den unstimulierten kultivierten Zellen eine verminderte Expression von VE-

Cadherin auf, einhergehend mit einer deutlichen Lückenbildung im Zellverband. Das VE-

Cadherin war an den Endothelzellgrenzen lediglich in Form eines unterbrochenen und

gestreift bzw. punktförmigen Musters nachweisbar.

In der Literatur finden sich vergleichbare in vitro-Ergebnisse: Hordijk et al. (1999)

beschrieben, dass das VE-Cadherin nach Stimulation "gestreift" oder "gezackt" exprimiert

wurde, während es vorher linear verteilt war. Sie sahen diese veränderte VE-Cadherin-

Expression durch einen Verlust der Aktinstressfasern bedingt. Auch Lampugnani et al.

(1992) berichteten, dass VE-Cadherin nach Stimulation mit TNFα und IFNγ nur noch

punktförmig an den Zell-Zell-Kontakten vorhanden war. Davies et al. (2003) zeigten eine

Veränderung der ehemals kontinuierlichen Struktur von VE-Cadherin entlang den

Zellrändern hin zu punktförmiger VE-Cadherin-Expression als Reaktion auf Shear Stress

(Davies et al., 2003). Ebenso beschrieben Lim et al. (2001) eine kontinuierliche Expression

von VE-Cadherin entlang der Zellgrenzen intakter Zellen, im Gegensatz zu einer

fleckförmigen Verteilung mit Bildung von Lücken zwischen Zellen, die mit Thrombin,

EGTA oder H2O2 stimuliert wurden. Viele Agenzien führen zu einer diffusen

Umverteilung von VE-Cadherin mit Bildung von Lücken ("gaps") einhergehend mit einer

reduzierten Expression von VE-Cadherin (Davies et al., 2003, Gulino et al., 1998; Hordijk

et al., 1999; Lampugnani et al., 1992; Lim et al., 2001; Navarro et al., 1995).

4.8.1 Analyse der Stimulationsfaktoren

Zwischen den mit LPS, TNFα und IFNγ stimulierten Kulturen war kein

Unterschied in der VE-Cadherin-Expression zu beobachten. Strieter et al. (1999)

begründen dies mit ähnlichen pathophysiologischen Effekten von TNFα und LPS.

4.8.1.1 Stimulation mit TNFα

Nach Stimulation der Zellkulturen (HPMEC und HUVEC) mit TNFα in verschiedenen

Konzentrationen (30, 150, 300 U/ml) und Stimulationszeiten von 4 bzw. 24 Stunden zeigte

sich, unabhängig von den Faktoren Konzentration und Zeit, im Vergleich zu den

Kapitel 4 - Diskussion 111 unstimulierten Zellkulturen eine verminderte Expression von VE-Cadherin an den

Endothelzellgrenzen, sowie die Ausbildung interendothelialer Lücken.

Zur Stimulation von Zellkulturen mit TNFα existieren zahlreiche Studien, die zu

unterschiedlichen Ergebnissen kommen: Dass das bei Sepsis und ARDS freigesetzte

Zytokin TNFα zu einer gesteigerten Permeabilität des Endothelzellmonolayer,

interzellulärer Lückenformation und Neuverteilung/Verlust von membranständigem VE-

Cadherin führt, wurde vielfach beschrieben (Friedl et al., 2002; Hofmann et al., 2002;

Nwariaku et al., 2002; Petrache et al., 2003; Wojciak-Stothard et al., 1998). Auch in der

vorliegenden Arbeit zeigte sich ein Zusammenhang zwischen TNFα-Stimulation und

verminderter VE-Cadherin-Expression.

Andere Studienergebnisse kommen zu dem Schluss, dass die Stimulation der

Endothelzellen mit TNFα die VE-Cadherin- und Cateninverteilung und die

Endothelpermeabilität nur in Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten verändert, bei

alleiniger TNFα-Stimulation diese Veränderungen am Endothel jedoch nicht auftreten

(Allport et al., 1997; Friedl et al., 2003; Del Maschio et al., 1996). In einigen Experimenten

konnte eine Permeabilitätssteigerung nur im Zusammenspiel mit IFNγ nachgewiesen

werden (s. u.).

Bezüglich der Abhängigkeit der VE-Cadherin-Expression von der Dauer der Stimulation

fanden Del Maschio et al. (1996) keinen Unterschied zwischen einer Stimulation für 4, 6

oder 20 Stunden mit TNFα. Auch in der vorliegenden Arbeit ließ sich kein Unterschied

zwischen einer 4- bzw. 24-stündigen Stimulation belegen. Hieraus ist aber nicht ohne

weiteres abzuleiten, dass keine zeitabhängigen Unterschiede für die VE-Cadherin-

Expression bestehen. Wojciak-Stothard et al. (1998) beschrieben, dass eine Lückenbildung

frühestens 15 Minuten nach TNFα-Addition zu beobachten war, teilweise auch erst nach 1

- 1,5 Stunden. Es ist daher zu diskutieren, dass die Zeiträume, die von Del Maschio et al.

(1996) und in der vorliegenden Arbeit (mit 4 Stunden als kürzester Inkubationszeit)

gewählt wurden, keine direkte Aussage über eine variierende VE-Cadherin-Expression

infolge zeitabhängiger TNFα-Stimulation in den ersten vier Stunden zulassen. Jedoch kann

man ableiten, dass nach vierstündiger Stimulation im weiteren Verlauf der Zeitfaktor bei

der Stimulation mit TNFα keine Rolle mehr spielt.

4.8.1.2 Stimulation mit IFNγ

Wie bei TNFα führte auch die Stimulation mit IFNγ zu einer reduzierten VE-Cadherin-

Expression an den Endothelzellgrenzen der HPMEC und HUVEC. Wie bei TNFα konnte

Kapitel 4 - Diskussion 112 zeitunabhängig nach 4 bzw. 24 Stunden die Bildung von Lücken im Endothelzellverband

nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis stimmt mit Befunden in der Literatur überein,

wobei Studien zu IFNγ und VE-Cadherin im Vergleich zur Literatur über TNFα und TNFα

plus IFNγ rar sind.

Vorbeschrieben ist, dass IFNγ allein signifikant die Expression von VE-Cadherin senkt mit

konsekutiver Bildung von Lücken im endothelialen Monolayer und zu einer gesteigerten

Permeabilität führt (Minagar et al., 2003; Shaw et al., 2001a). Die Bedeutung von IFNγ bei

der Migration von Neutrophilen zeigten Versuche mit IFNγ-defizienten Mäusen, die einen

Defekt der Neutrophilen-Migration aufwiesen (Doerschuk et al., 2000). Bezüglich des

Expressionsprofils bei Stimulation mit IFNγ sind keine Aussagen über die VE-Cadherin-

Expression in den ersten vier Stunden bekannt. Auch die vorliegende Arbeit erlaubt

hierüber keine Aussagen. Daher sollte in einer Folgestudie die Antigenexpression von VE-

Cadherin während der ersten vier Stimulationsstunden untersucht werden.

4.8.1.3 Stimulation IFNγ plus TNFα

Die Stimulation der Zellkulturen (HPMEC und HUVEC) mit TNFα plus IFNγ zeigte

unabhängig von einer Stimulation über 4 bzw. 24 Stunden ebenfalls eine verminderte VE-

Cadherin-Expression im Vergleich zu den unstimulierten Zellen. Dies äußerte sich auch in

der Bildung von Lücken ("gaps"). In der Literatur findet man eine Bestätigung dieser

Ergebnisse (Lampugnani et al., 1992; Mark und Miller, 1999; Rival et al., 1996; Shaw et

al., 2001a; Wong et al., 1999). Demnach aktivieren TNFα und IFNγ lokal das Endothel,

induzieren Leukozytenakkumulation, steigern die Endothelzellpermeabilität und führen

durch die Neuverteilung u. a. von VE-Cadherin zu dessen Abwesenheit an den lateralen

Junktionen der HUVEC-Monolayer. INFg alleine oder TNFα plus IFNγ steigern

signifikant die Permeabilität (Shaw et al., 2001a). TNFα alleine oder TNFα plus IFNγ

führen zu einem Anstieg der Neutrophilen- und Monozyten-Adhäsion und der

Transmigration (Mark und Miller, 1999; Wong et al., 1999).

Ebenso wirken TNFα und LPS an Endothelzellen synergistisch und potenzieren die

adhäsiven Eigenschaften dieser Zellen (Jersmann et al., 2001). Dabei ist zu

berücksichtigen, dass Endotoxine ihrerseits die Produktion von Zytokinen wie TNFα und

IFNγ induzieren (Carlos und Harlan, 1994; Cohen, 2002; Morrison und Ryan, 1987).

Im Gegensatz zu den hier präsentierten Ergebnissen fanden Wong et al. (1999) in ihren

Untersuchungen eine statistisch nicht-signifikante Dosis-abhängige Endothelantwort. So

stieg die Anzahl der affektierten Zellen in Abhängigkeit von der steigenden

Zytokinkonzentration von TNFα und IFNγ. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch eine

Kapitel 4 - Diskussion 113 tendenziell etwas stärkere Schädigung des Endothelzellverbandes durch die

Kombinationsstimulation (TNFα und IFNγ) im Vergleich zu den jeweiligen

Einzelstimulationen beobachtet werden.

4.8.1.4 Stimulation mit LPS

LPS führte ebenfalls zu einer von der Stimulationszeit von 4 bzw. 24 Stunden

unabhängigen Verminderung der VE-Cadherin-Lokalisation an den Zellgrenzen der

HPMEC und HUVEC sowie einer Lückenbildung im Zellmonolayer. Diese Ergebnisse

stehen im Einklang mit der Literatur: LPS (Lipopolysaccharid), das Endotoxin

gramnegativer Bakterien, induziert eine gesteigerte Endothelpermeabilität bereits nach

zweistündiger LPS-Exposition, die mit längerer Einwirkzeit zunimmt (Bannerman et al.,

1998; Goldblum et al., 1994). Die gesteigerte Permeabilität infolge des reduzierten

Endothelzellzusammenhaltes beruht dabei auf einer Dissoziation des Cadherin-Catenin-

Komplexes durch LPS, der Dosis- und Zeit-abhängig erfolgt (Bannerman und Goldblum,

1999; Bannerman et al., 1998). Die Dissoziation des Komplexes bedingt auch die

verminderte VE-Cadherin-Expression an den Zellgrenzen. Das VE-Cadherin ist nun nicht

mehr mit dem Zytoskelett verknüpft und kann zur Seite dissoziieren oder wird

internalisiert. Da schon nach zweistündiger LPS-Stimulation die Endothelpermeabilität

gesteigert wird und in der vorliegenden Arbeit nur die Stimulation über 4 bzw. 24 Stunden

untersucht wurde, kann hier nicht entschieden werden, wie das Expressionsprofil nach

Stimulation mit LPS in den ersten vier Stunden aussieht. Es kann jedoch festgestellt

werden, dass nach mehr als vier Stunden der Zeitfaktor keinen Einfluss auf die VE-

Cadherin-Antigenexpression hat.

4.8.2 Verbesserung der Zellkulturversuche

Die Ergebnisse der Zellkulturen stellen lediglich eine semiquantitative Beobachtung dar.

Eine quantitative Analyse der VE-Cadherin-Moleküle mittels ELISA (Enzyme-Linked

Immuno Sorbent Assay) bietet eine objektivere Quantifizierung, allerdings kann mit dieser

Methode das morphologische Bild der Endothelzellen – z. B. die Ausbildung von

Endothelzelllücken nicht beobachtet werden. Auch andere Methoden wie eine RNA-

(Northern Blot), DNA-Extraktion (Southern Blot) oder ein Proteinnachweis (Western Blot)

sind quantitativ verlässlicher. Western und Northern Blotting-Untersuchungen wurden von

Kevil et al. (1998) für VE-Cadherin durchgeführt. In einer Folgestudie sollten solche

quantitativen Untersuchungen der VE-Cadherin-Antigenexpression mit den hier

verwendeten (morphologischen) Methoden kombiniert werden.

Kapitel 4 - Diskussion 114 Um eine bessere Annäherung der Zellkulturen an die in situ-Verhältnisse zu erreichen,

züchteten Grau et al. (1996) Kulturen aus mikrovaskulären pulmonalen Zellen von an

ARDS verstorbenen Patienten. Eine weitere Verbesserung wäre die Kultivierung

pulmonaler Endothelzellen von an septischem ARDS erkrankten Patienten, gewonnen im

Rahmen einer bronchioloalveolären Lavage (BAL). Bei Entnahme der Zellen zu

verschiedenen Zeitpunkten und Stadien der Erkrankung könnten eine Verlaufskontrolle

erfolgen und evtl. weitere Pathomechanismen aufgedeckt werden. Dies ist allerdings aus

ethischen Gründen nicht zu empfehlen, da die BAL bei diesen schwerkranken Patienten

aus rein diagnostischen oder wissenschaftlichen Gründen in der Regel nicht durchgeführt

wird. Hingegen dürfte die vergleichende Untersuchung der VE-Cadherin-Expression

pulmonaler Endothelzellen von an ARDS verstorbenen Patienten im Gegensatz zu extern

stimulierten kultivierten Endothelzellen keinerlei ethische Probleme darstellen.


4.9 Zellkulturen (HPMEC und HUVEC) als Modell für die VE-Cadherin-Expression

in humanem Lungengewebe

Die Ergebnisse der Untersuchungen an humanem Lungengewebe ergaben eine

abgeschwächte endotheliale VE-Cadherin-Expression bei Lungen mit septisch bedingtem

ARDS. Auch in den Zellkulturen fand sich nach Stimulation der Zellen mit LPS, TNFα

und IFNγ eine verminderte Expression von VE-Cadherin an den Zellgrenzen. Die

Zellkulturen erscheinen somit als geeignetes Modell der in vivo-Situation. Jedoch zeigte

sich bei Betrachtung der VE-Cadherin-Expression der gesunden und septischen Lungen

eine starke Expression in den Arterien, Arteriolen und Kapillaren und eine deutlich

schwächere Expression von VE-Cadherin in den Venolen und Venen.

In den Zellkulturen kann diese gefäßtypspezifisch unterschiedliche Expression nicht

nachgewiesen werden, da HPMEC (Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells)

eine Mischung verschiedener mikrovaskulärer Endothlzellen, d. h. Arteriolen, Kapillaren

und Venolen, darstellen. Der Unterschied der VE-Cadherin-Expression in situ zwischen

Arteriolen und Kapillaren auf der einen und den Venolen auf der anderen Seite war

hingegen beträchtlich. Die HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) sind

venöse Endothelzellen (der Nabelschnur), die 1. arterielles Blut führen und 2. als Modell

für Makrogefäße (Arterien und Venen) dienen, welche in situ ebenfalls einen deutlichen

Unterschied in der VE-Cadherin-Antigenexpression zeigten. Des Weiteren können

Kriterien wie Alter und Geschlecht an Zellkulturen, wenn überhaupt, dann nur

eingeschränkt untersucht werden. Das schränkt die Bedeutung der Zellkulturen bei

gewissen Fragestellungen ein.

Kevil et al. (1998) zeigten eine gleichmäßige interzelluläre Verteilung von VE-Cadherin in

venösen und arteriellen Endothelzellen des Menschen in vivo (= en face-Präparationen

menschlicher Nabelschnurvenen und -arterien), im Vergleich zu einer ausschließlich in den

Venen zu findenden interzellulären VE-Cadherin-Expression in vitro (= Zellkulturen aus

menschlichen Nabelschnurvenen und -arterien). Auch Lehr et al. (2000) fanden

Unterschiede in der Expression zwischen HUVEC und in situ-Endothelzellen für einige

Parameter, obgleich sie generell eine gute Übereinstimmung zwischen HUVEC und in

situ-Endothelzellen sahen.

Grau et al. (1996) züchteten MVEC (Pulmonary Microvascular Endothelial Cells) aus

ARDS-Lungen von frisch verstorbenen Patienten und Kontroll-MVEC mit dem Gedanken,

dass die Zellkulturen den Endothelzellen eines ARDS in situ entsprechen. Die

Kapitel 4 - Diskussion 116 Beobachtungen wurden jedoch ausschließlich an Zellkulturen erhoben und ermöglichen

daher keinen Vergleich mit in situ-Befunden.

Aufschlussreich wäre ein Vergleich von extern stimulierten primären endothelialen

Zellkulturen und Zellkulturen, gewonnen aus erkranktem Lungengewebe, sowie ein

Vergleich von Endothelzellkulturen und in situ-Lungenproben, welche beide aus derselben

Patientengruppe entnommen wurden. Aus den sich daraus ergebenden Ergebnissen

könnten Unterschiede und Übereinstimmungen zwischen den Zellkulturen und in situ-

Proben besser analysiert und Differenzen bezüglich VE-Cadherin-Expression aufgedeckt

werden.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass kein isoliertes Zellmodell den in situ-Zustand

identisch wiedergeben kann. Die zurzeit vorhandenen in vitro-Modelle sind daher als

Annäherungen an die intakten in vivo-Endothelzellverbände zu verstehen (Albelda et al.,

1988). Jedoch bieten diese Zellkulturen den großen Vorteil, dass an ihnen in situ-

Beobachtungen unter standardisierten Bedingungen überprüft werden können. Man muss

sich dabei jedoch der Grenzen der Kultursysteme bewusst sein und ein geeignetes in vivo-

System zum Vergleich heranziehen (Friedl et al., 2003; Risau, 1995; Zimmerman et al.,

1999).


4.10 Zusammenfassung

Die in situ-Ergebnisse mit einer verminderten Expression von VE-Cadherin in Lungen mit

durch gramnegative Sepsis bedingtem ARDS werden durch die Zellkulturversuche

bestätigt und stehen in Einklang mit der Literatur. Die reduzierte VE-Cadherin-Expression

und die daraus sich ergebende reduzierte endotheliale Zelladhäsion ist daher neben anderen

Kausalfaktoren als eine Teilursache der erhöhten Gefäßpermeabilität und der gesteigerten

Leukozytenextravasation bei dem Krankheitsbild des ARDS anzusehen.

Dies wirft die Frage nach der Regulation von VE-Cadherin und seinem Einfluss auf die

Transmigration von Leukozyten durch das Endothel sowie auf Unterschiede zwischen dem

Lungen- und Systemkreislauf auf.


4.11 Regulation von VE-Cadherin

Das Zytoskelett ist an der Aufrechterhaltung des Cadherin-Catenin-Komplexes und an der

strukturellen Integrität der Monolayer beteiligt (Davies et al., 2003; Lim et al., 2001;

Petrache et al., 2003).

4.11.1 Pathomechanismus der Reduktion der VE-Cadherin-Antigenexpression

Für die veränderte Verteilung des VE-Cadherin werden folgende Strukturen und

Mechanismen diskutiert: An den Zonula Adhaerentes, der Region der Plasmamembran, die

die homotypische Zell-Zell-Adhäsion vermittelt, ist das transmembranäre Cadherin mit

dem darunterliegenden Aktinzytoskelett durch einen intrazellulären Komplex aus

zahlreichen Proteinen verknüpft (Alexander und Elrod, 2002; Dejana et al., 1995).

Während der ersten Stunden nach Auftreten eines "Störfaktors" (z. B. Zytokine,

Leukozyten, oxidativer Stress) dissoziieren periphere Aktin-Bänder und die Verteilung von

VE-Cadherin, Plakoglobin, α- und β-Catenin ändert sich von der kontinuierlichen Struktur

entlang den Zellrändern hin zu punktierten Komplexen, die nur in Gebieten des Kontaktes

zwischen angrenzenden Zellen ausgebildet werden (Davies et al., 2003; Lim et al., 2001).

Dieser Vorgang der interendothelialen Lückenbildung erfolgt nicht gleichmäßig an allen

Zell-Zell-Kontakten, sondern diskontinuierlich, wobei zahlreiche Kontaktzonen intakt

bleiben. Die "Auflösung" der Junktionen ist demnach nicht ein "Alles-oder-nichts-

Phänomen", sondern ein lokalisierter Prozess. Dieses Phänomen könnte durch die Existenz

von wenigstens zwei Typen von Adhärensjunktionen erklärt werden, die in verschiedenen

Zonen entlang der Zellgrenzen verteilt sind, wobei nur ein Typ für die Zerreißung anfällig

ist.

An Mesenterialvenen konnte gezeigt werden, dass die Veränderungen der VE-Cadherin-

Organisation mit Bildung von interzellulären Lücken dort stattfindet, wo auch

Plasmaproteine und das Zytoskelett verändert sind. Des Weiteren zeigte das

Aktinmikrofilament eine dem VE-Cadherin-Molekül sehr ähnlich lokalisierte Verteilung

(Wong et al., 1999). Dem widerspricht nicht, dass in den 90er Jahren des letzten

Jahrhunderts ein "neuer" Typ der Endothelzell-Junktion beschrieben wurde und zwar die

"Complexus Adhaerentes", bei der VE-Cadherin über γ-Catenin mit dem intermediären

Filamentzytoskelett verknüpft ist (Kowalczyk et al., 1998; Valiron et al., 1996). Telo' et al.

(1998) beschrieben ein Cadherin (VE-Cadherin 2), welches an den interzellulären

Junktionen vorhanden ist und adhäsive Eigenschaften besitzt. Es ist aber nicht an Catenine

Kapitel 4 - Diskussion 119 gebunden und zeigt nur eine schwache Assoziation mit dem Zytoskelett. Außerdem

beeinflusst das VE-Cadherin 2 nicht die parazelluläre Permeabilität, die Zellmigration und

das Zellwachstum. Die von Telo' et al. beschriebene schwache Assoziation des VE-

Cadherin 2 mit dem Zytoskelett, lässt keinen Rückschluss darüber zu, ob es sich dabei um

Aktin-abhängiges oder Aktin-unabhängiges VE-Cadherin handelt. Eine schwache bzw.

keine Verbindung mit dem Aktin-abhängigen Zytoskelett charakterisiert das über

Desmoplakin (Desmoplakin: kein Catenin) mit dem intermediären Filament verknüpfte

VE-Cadherin, das dementsprechend mit dem VE-Cadherin 2 übereinstimmen könnte.

Derzeit ist allgemein anerkannt, dass das VE-Cadherin sowohl an das Aktin als auch an

das intermediäre Filament-Zytoskelett (v. a. Vimentin) gebunden ist, an letzteres aber laut

Vincent et al. (2004) und Angst et al. (2001 und 2001a) über das Desmoplakin und nicht

über γ-Catenin (Kowalczyk et al., 1998; Lim et al., 2001).

Für eine unterschiedliche Empfindlichkeit zwischen dem Aktin-verknüpften und dem

Desmoplakin-verknüpften VE-Cadherin spricht auch die Studie von Lim et al. (2001). Sie

konnten zeigen, dass das membranäre, nicht mit dem Zytoskelett verankerte, VE-Cadherin

ein Ziel für die potenzielle Bildung interzellulärer Lücken ist. Verschwindet das

membranäre VE-Cadherin entzündungsbedingt von der Zellmembran, so wird es an den

verbleibenden Stellen des Zell-Zell-Kontakts zurückgezogen und Aktin-unabhängig, d. h.

über γ-Catenin oder Desmoplakin, mit dem Zytoskelett verknüpft.

Ob das an das intermediäre Filament gebundene VE-Cadherin tatsächlich anders auf eine

Stimulation mit Zerreißung des VE-Cadherin-Catenin-Komplexes reagiert, bleibt jedoch

weiter unklar.

4.11.2 Phosphorylierung und Dephosphorylierung

Hinter dem Phänomen des "Verschwindens" von VE-Cadherin von den endothelialen

Zelljunktionen stehen biochemische Veränderungen in Form äußerst komplizierter und

noch nicht endgültig erforschter Regulationsmechanismen. Einer davon ist die

Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung von VE-Cadherin, deren dynamisches

Gleichgewicht eine entscheidende Rolle für die Aufrechterhaltung und Regulation des VE-

Cadherin-Catenin-Komplexes und somit der VE-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion

spielt (Alexander und Elrod, 2002; Dudek und Garcia, 2001; Gulino et al., 1998; Tinsley et

al., 1999).

Phosphorylierung des Cadherin-Catenin-Komplexes über die Tyrosinkinase führt zu einer

diffusen Verteilung von VE-Cadherin, einhergehend mit einer reduzierten Zell-Zell-

Adhäsion und einer gesteigerten Endothelpermeabilität (Guo et al., 2004; Konstantoulaki

Kapitel 4 - Diskussion 120 et al., 2003; Sandoval et al., 2001; Tinsley et al., 1999; Ukropec et al., 2000). Die

zytoplasmatischen Catenine dissoziieren vom VE-Cadherin in dünne Membranvorsprünge

in den interendothelialen Lücken. Daraus ergeben sich weitere Veränderungen am

Zytoskelett wie Aktinneuorganisation und Veränderungen der Zellgestalt der

Endothelzellen (Bannerman und Goldblum, 1999; Konstantoulaki et al., 2003).

Viele andere Eigenschaften, unter anderem aber die Auswirkung der Phosporylierung /

Dephosphorylierung auf das VE-Cadherin, wurden an CHO-Zellen (Chinese Hamster

Ovary Cells) erforscht, die erst nach Genimplantation VE-Cadherin exprimierten (VE-

Cadherin-Transfected Clones) (Breviario et al., 1995). Das hat den Vorteil, dass das

Modell sehr gut kontrolliert und eine Beeinflussung der Ergebnisse durch vorbestehendes

VE-Cadherin ausgeschlossen werden kann. Bei Experimenten an diesen Zellen konnte

gezeigt werden, dass die Expression von VE-PTP (Vascular Endothelial Protein Tyrosine

Phosphatase) über die Dephosphorylierung die VE-Cadherin-vermittelte

Barrierenintegrität des zellulären Monolayer steigert (Nawroth et al., 2002).

Was passiert mit dem VE-Cadherin, wenn es von den Zelljunktionen "verschwindet"?

Dazu wurden mehrere Theorien entwickelt wie die Internalisation/Endozytose, die

Proteolyse und die Diffusion von VE-Cadherin innerhalb der Plasmamembran mit

Spaltung des VE-Cadherin-Catenin-Komplexes.

4.11.3 Internalisation / Endozytose

Zahlreiche Autoren diskutieren in erster Linie eine Endozytose bzw. Internalisation des

VE-Cadherin-Moleküls (Gao et al., 2000; Gulino et al., 1998; Del Maschio et al., 1996;

Vincent et al., 2004). Nach Gulino et al. (1998) wird VE-Cadherin innerhalb des

Zytoplasmas verteilt und im endoplasmatischen Retikulum gespeichert. Die

Wiederherstellung von Zell-Zell-Kontakten erfolgt dementsprechend durch Rekrutierung

bestehender Moleküle oder ihrer Neusynthese. Gao et al. (2000) sind der Ansicht, dass

ungebundenes VE-Cadherin, das während der Entzündungsreaktion aus den Junktionen

freigesetzt worden ist, ins Zellinnere verlagert wird. Das intrazelluläre VE-Cadherin kann

während der Wiederausbildung der Adhärensjunktionen aber sehr schnell wieder zur

Verfügung gestellt werden. Die Reversibilität der Verlagerung von VE-Cadherin in die

Zelle spricht für Gao et al. (2000) gegen eine Entkopplung des Cadherins von den

Cateninen und damit gegen eine Internalisation der einzelnen Komplexkomponenten. Ihrer

Meinung nach wird der VE-Cadherin-Catenin-Komplex komplett ins Zellinnere verlagert.

Kapitel 4 - Diskussion 121 Bei Betrachtung der Lungenpräparate und der Zellkulturen fällt auf, dass in ARDS-Lungen

und in stimulierten Zellkulturen vergleichsweise weniger VE-Cadherin nachweisbar war.

Diese deutliche Reduktion von VE-Cadherin an den Zellgrenzen widerspricht der These,

dass das VE-Cadherin internalisiert wird, nicht.

4.11.4 Proteolyse

Von anderen Autoren wird eine Spaltung/Proteolyse des VE-Cadherin durch die

neutrophile Elastase berichtet (Carden et al., 1998; Hermant et al., 2003). Werden HUVEC

menschlicher neutrophiler Elastase ausgesetzt, kommt es zu einer Proteolyse von 141 kDa

VE-Cadherin, mit Bildung von 92- und 50-kDa-Fragmenten. Die Menge an intaktem VE-

Cadherin in HUVEC wurde durch die Exposition mit aktivierten Neutrophilen signifikant

reduziert (Carden et al., 1998). Gulino et al. (1998) hingegen sprechen nur von einer

Internalisation mit Speicherung des VE-Cadherin im endoplasmatischen Retikulum,

schließen aber eine endozytäre Degradation des VE-Cadherin-Komplexes aus. Unklar

bleibt, ob das VE-Cadherin dennoch an anderer Stelle gespalten wird. Da die Gruppe um

Gulino aber von einer anschließenden Neusynthese des Moleküls spricht, ist dies wohl so

zu verstehen.

Sowohl bei der Proteolyse als auch bei der Internalisation kommt es zu einer Reduktion

von VE-Cadherin an den Endothelzellgrenzen. Dementsprechend kann anhand den in der

vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen keiner der beiden Mechanismen

ausgeschlossen werden.

4.11.5 Diffusion

Eine weitere Möglichkeit bestünde in der lateralen Diffusion der VE-Cadherin-Moleküle

innerhalb der Endothelzellmembran (Burns et al., 2003; Hermant et al., 2003; Hordijk et

al., 1999; Miao et al., 2005; Navarro et al., 1995; Shaw et al., 2001; Wong et al., 1999).

In der Real-Time Betrachtung der Transmigration von Leukozyten durch einen

Endothelmonolayer wurde keine Proteolyse von VE-Cadherin beobachtet, sondern eine

Zusammenballung von VE-Cadherin an den Zelljunktionen neben den gebildeten Lücken

beschrieben, gefolgt von einer posttransmigralen Rediffusion. Für diesen Prozess muss

sich VE-Cadherin allerdings vom Zytoskelett abkoppeln. Ansonsten wäre eine Diffusion

zur Seite nicht möglich. Dieser Prozess erfolgt entweder durch Signale der

transmigrierenden Leukozyten oder durch Neuordnung des Zytoskeletts (Shaw et al.,

2001). Diese Beobachtung stimmt mit der von Allport et al. (2000) überein, die von einem

Falltür-Mechanismus sprechen. Der Falltür-Mechanismus meint Folgendes: Der VE-

Kapitel 4 - Diskussion 122 Cadherin-Catenin-Komplex wird durch die migrierenden Leukozyten mechanisch zur Seite

gedrängt, so dass sie durch die interzellulären Lücken transmigrieren können. Nach der

Transmigration diffundieren die deplatzierten Moleküle zurück, um die Junktionen neu zu

konstituieren (Allport et al., 2000; Allport et al., 1997; Burns et al., 2003; Gao et al., 2000;

Hermant et al., 2003; Shaw et al., 2001).

Für diese Hypothese spricht, dass adhärente Neutrophile sehr schnell (< 2 Minuten)

migrieren und sich die endothelialen Junktionen deshalb während des Migrationsprozesses

sehr schnell öffnen und schließen müssen (Burns et al. 2003) – die Diffusion erlaubt diesen

Vorgang. Eine weitere Begründung liegt in der Beobachtung, dass eine Zytokin-induzierte

Zerreißung der interzellulären Junktionen zu einem diffusen, teils punktförmigen

Verteilungsmuster von VE-Cadherin führt (Davies et al., 2003; Wong et al., 1999). Daraus

kann geschlossen werden, dass VE-Cadherin nicht länger in interzellulären Junktionen

verankert ist, sondern in der Plasmamembran frei diffundiert und dort nachweisbar ist

(Wong et al., 1999). Dabei wird VE-Cadherin aber nicht proteolysiert, sondern bleibt als

komplettes Molekül erhalten.

Den Mechanismus erklären Wong et al. (1999) mit Zytokin-induzierten Veränderungen der

Affinität oder Konformation des Cadherin-Catenin-Komplexes (evtl. mit Zerreißung des

Komplexes (Allport et al., 2000; Carden et al., 1998; Lim et al., 2001), die zu einer

Entkopplung vom Zytoskelett führen, so dass VE-Cadherin innerhalb der Plasmamembran

oder dem Zytoplasma (falls es doch internalisiert wird) neu verteilt werden kann.

Der Nachweis einer verminderten VE-Cadherin-Expression in ARDS-Lungen und

stimulierten Zellkulturen steht im Widerspruch zur Hypothese der Diffusion des VE-

Cadherin in der Plasmamembran. Bei einer Umverteilung des VE-Cadherin und einer

Diffusion des Moleküls in der Plasmamembran müsste das Molekül auf Grund der weiter

bestehenden Membranlokalisation trotzdem anfärbbar sein.

4.11.6 Spaltung der Zell-Zell-Verbindungen

Diskutiert wird auch die Spaltung der Verknüpfung der extrazellulären Domänen zweier

bzw. mehrerer Cadherin-Moleküle. Dadurch kommt es zur Permeabilitätssteigerung, ohne

dass das VE-Cadherin seine Lokalisation ändert (Corada et al., 1999).

Diese Theorie ist allerdings nach den hier vorgelegten Befunden in Frage zu stellen, da

VE-Cadherin von den Zellgrenzen verschwindet und es auch optisch zu einer

Lückenbildung kommt. Nach der oben genannten Theorie ergäben sich optisch keine

Veränderungen der Membranfärbung.

Kapitel 4 - Diskussion 123 4.11.7 Gegenüberstellung der verschiedenen Theorien

Man ist sich derzeit uneinig darüber, ob eine Internalisation oder eine Neuverteilung von

VE-Cadherin auf der Zelloberfläche für die Beobachtung verantwortlich ist, dass nach

Stimulation VE-Cadherin-Aggregate an einigen Stellen vorhanden sind, an anderen Stellen

jedoch nicht (Gulino et al., 1998; Konstantoulaki et al., 2003).

Sowohl bei der Diffusion als auch bei der Internalisation von VE-Cadherin muss eine

Trennung des VE-Cadherin-Catenin-Komplexes vom Zytoskelett erfolgen. Bei der

Diffusion von VE-Cadherin in der Plasmamembran führt eine Rediffusion zur Schließung

der Lücken, bei der Internalisation muss das Molekül bzw. der Molekül-Komplex

exozytiert oder sogar neu synthetisiert werden.

Die Beobachtungen der Leukozytentransmigration mittels Falltürmechanismus stützen die

These der Diffusion (Allport et al., 2000; Allport et al., 1997; Burns et al., 2003; Gao et al.,

2000; Hermant et al., 2003; Shaw et al., 2001). Des Weiteren ist die Sequestration

(Rückzug) von VE-Cadherin an die verbleibenden Zell-Zell-Kontakte energetisch sehr

günstig, da für diesen Vorgang nur eine einfache Diffusion in der flüssigen Membran

vonnöten ist. Das Zurückziehen des VE-Cadherins zu den verbleibenden Zell-Zell-

Kontakten spielt außerdem eine Rolle bei der strukturellen Verstärkung und der

Aufrechterhaltung der Kapillarintegrität. Der verstärkende Effekt ist notwendig, um der

allumfassenden Reduktion der Zell-Zell-Kontakte während der Lückenbildung

vorzubeugen (Lim et al., 2001).

Andere Strategien für die Lückenbildung, wie die Proteolyse oder Internalisation sind

weniger effizient und die Neubildung der Barrierenfunktion würde die Proteinsynthese

oder aktive Externalisation des Proteins erfordern. Gegen eine Proteolyse spricht auch,

dass eine TNFα-induzierte Neuverteilung von VE-Cadherin in HUVEC-

Endothelzellmonolayern ohne Änderung des gesamten zellulären VE-Cadherin-

Vorkommens erfolgt (Nwariaku et al., 2002).


4.12 Leukozytentransmigration

1875 demonstrierte Julius Arnold mit Zinnober-Injizierung die Endothelzellgrenzen. Mehr

als 100 Jahre später wurde bestätigt, dass Neutrophile vor allem an den interendothelialen

Junktionen vom Blut ins Gewebe gelangen (Albelda et al., 1994; Burns et al., 2003; Dudek

und Garcia, 2001).

4.12.1 Transmigration

Die Leukozyten migrieren vorzugsweise an Stellen, wo drei Endothelzellen aneinander

stoßen (trizelluläre Ecken), denn sowohl Zonulae occludentes (Tight Junctions) als auch

Adhäerensjunktionen sind an diesen Stellen im Kultursystem diskontinuierlich und stellen

damit eine mögliche Durchtrittspforte für Leukozyten dar (Allport et al., 2000; Burns et al.,

2003; Gopalan et al., 2000; Shaw et al., 2001; Zhao et al., 2001). In vivo existieren im

Endothel teilweise vorbestehende interendotheliale Lücken, durch die die Neutrophilen in

den interstitiellen Raum transmigrieren (Behzad et al., 1996; Shaw et al., 2001). Die

Neutrophilen inserieren dabei einen Pseudopod in den interendothelialen Spalt. Das

Endothelzytoskelett bildet sich um und die interendotheliale Junktion separiert (Burns et

al., 2003). Andere Autoren beschreiben den Vorgang zur Induktion der Lücken im

Endothel folgendermaßen: Die Leukozytenadhäsion triggert intrazelluläre Signale, die zu

einer Destabilisierung von VE-Cadherin-Komplexen führt und den Leukozyten eine

Migration durch die entstandenen Lücken erlaubt (Shaw et al., 2001). VE-Cadherin und

die Catenine verschwinden von den Zell-Zell-Kontakten als Antwort auf die Adhäsion von

Neutrophilen am Endothelzellmonolayer (Allport et al., 2000; Allport et al., 1997; Gotsch

et al., 1997; Del Maschio et al., 1996). Das bestätigen Untersuchungen an Endothelzellen:

Die Mengen an nativem β-Catenin, VE-Cadherin, Plakoglobin und p120 waren in TNFα-

aktivierten Endothelzellen, die mit Neutrophilen für 3 Minuten – dann hat nur eine

Adhäsion, keine Transmigration stattgefunden – inkubiert wurden, dramatisch vermindert.

α-Catenin war nicht betroffen. Nach 10 Minuten Neutrophileninkubation fanden Adhäsion

und Transmigration statt, die Menge jeder Komponente, ausgenommen α-Catenin, sanken

dramatisch oder waren nicht mehr nachweisbar (Allport et al., 1997; Del Maschio et al.,

1996).

4.12.2 "real time"-Transmigration

Die Transmigration wurde von Shaw et al. (2001) mittels Neutrophiler und Monozyten an

HUVEC untersucht: Die HUVEC wurden mit VEcadGFP (VE-Cadherin/Green

Kapitel 4 - Diskussion 125 Fluorescent Fusion Protein Construct) inkubiert, anschließend wurden die

Neutrophilen/Monozyten hinzugegeben, so dass auf diese Weise das VE-Cadherin und

Veränderungen in der Struktur der Endotheljunktionen unter dem Mikroskop beobachtet

werden konnten. Es fand sich eine Transmigrationen vor allem an den Zellgrenzen, also

parazellulär. Konnte ein Granulozyt an eine kontinuierliche Junktion mit VEcadGFP

andocken, dann wurde in der Junktion eine Lücke geformt, durch die der PMN

transmigrierte. Teilweise migirierte der PMN auch durch vorbestehende Lücken.

Monozyten verhielten sich ähnlich. Nach der Leukozytentransmigration durch eine Lücke

füllte VEcadGFP die Lücke wieder aus und verschloss diese. Im Durchschnitt fand dieser

Vorgang innerhalb von fünf Minuten nach einer Transmigration statt. Interessanterweise

wurden auf die Weise auch schon vorher existierende Lücken verschlossen. Es konnte

auch beobachtet werden, dass neben neugebildeten Lücken eine Ansammlung von VE-

Cadherin zu finden war, die nach der Transmigration zurück diffundierte. Aus diesen

Vorgängen kann man schließen kann, dass endotheliale Junktionsproteine wie das VE-

Cadherin nicht fixiert, sondern dynamisch sind (Shaw et al., 2001).

4.12.3 Einfluss auf das Lungengewebe

Dementsprechend führen nicht nur vom Organismus systemisch freigesetzte Zytokine oder

von Bakterien freigesetztes LPS zu einer verminderten VE-Cadherin-Expression,

verbunden mit gesteigerter endothelialer Permeabilität und Leukozyteninvasion in den

Entzündungsherd. Auch die Leukozyten selber induzieren solche Vorgänge – vor allem die

PMNs (polymorphonukleären Leukozyten = Granulozyten). Es konnte gezeigt werden,

dass im gesunden Lungengewebe PMNs zu einer Disruption der Endothelzellbarriere und

des VE-Cadherin-Moleküls führen (Allport et al., 1997; Carden et al., 1998; Hermant et

al., 2003; Lucchesi, 1990; Del Maschio et al., 1996; Rosengren et al., 1991; Tinsley et al.,

1999). Granulozyten können proteolytische Enzyme freisetzen, die zur Zerstörung des VE-

Cadherin-Catenin-Komplexes führen. Sie setzen aber auch Zytokine frei. Dies könnte die

Schädigung des Endothelmonolayers erklären.

Zum Einfluss von adhärenten Neutrophilen auf VE-Cadherin gibt es unterschiedliche

Hypothesen: Einerseits wird diskutiert, dass die VE-Cadherin-Moleküle trotz Stimulation

mit TNFα bei Fehlen von adhärenten Neutrophilen intakt bleiben (Allport et al., 2000;

Allport et al., 1997; Del Maschio et al., 1996). Das würde bedeuten, dass die Neutrophilen

die Hauptursache für die Bildung der Endothellücken sind. Andererseits ist zu überlegen,

ob die Zerstörung der endothelialen Barriere auch in Abwesenheit von Leukozyten durch

Zytokin-Stimulation von statten geht und nicht mit der Anwesenheit von Mastzellen und

Kapitel 4 - Diskussion 126 Leukozyten im Interstitium korreliert (Albelda et al., 1994; Wong et al., 1999). Dies wurde

in der vorliegenden Arbeit gezeigt. Im humanen Organismus spielen generell beide

Faktoren, d. h. Neutrophile und Zytokine, eine Rolle. Welches Element den Hauptanteil

stellt, kann man auf diese Art und Weise nicht beantworten.

Bei den in der hier vorgestellten Arbeit eingesetzten Zellkulturen wurde der Einfluss der

Leukozyten und speziell der PMNs nicht untersucht. Die Zellkulturen wurden vielmehr

isoliert mit Zytokinen und LPS stimuliert. In einer weiteren Untersuchung wäre mittels

Kokultur der Einfluss von Leukozyten auf die Zellkulturen zu untersuchen.


4.13 Vergleich systemischer Kreislauf zu Lungenkreislauf

Bei der Wichtung der Literatur zur hier beobachteten reduzierten VE-Cadherin-Expression

und der daraus resultierenden Leukozytenextravasation (Engelhardt und Wolburg, 2004)

muss der Unterschied zwischen systemischem Kreislauf und Lungenkreislauf

berücksichtigt werden. Daher dürfen Studien an Endothelzellen des systemischen

Kreislaufs nicht ohne weiteres mit Studien an pulmonalen Endothelien verglichen werden

(Burns et al., 2003).

Der Hauptgrund dafür ist die Tatsache, dass die Neutrophilenmigration in der Lunge in den

Kapillaren stattfindet, während dieser Vorgang im systemischen Kreislauf in den

postkapillären Venolen von statten geht (Burns et al., 2003; Hogg und Doerschuk, 1995).

Die Mechanismen in den großen Gefäßen, um Neutrophile über Adhäsionsmoleküle aus

dem Blut abzufangen, sind im alveolären Kapillarbett nicht notwendig. Da die

Durchmesser der Neutrophilen (6 - 8 µm) gleich wie oder größer als die Durchmesser

vieler Kapillarsegmente (2 - 15 µm) sind und ungefähr 50 % der Kapillarsegmente

während der Passage eine Deformierung der Neutrophilen erfordern (Doerschuk et al.,

1993; Doerschuk et al., 1990; Downey et al., 1990; Downey und Worthen, 1988; Gebb et

al., 1995), wird ein enger Kontakt der intrazellulären Leukozyten mit dem Lungenendothel

sicher gestellt (Kuebler et al., 1997). Des Weiteren werden die Zellen während einer

Entzündungsreaktion durch bestimmte Faktoren an einer Deformation und damit einer

Passage des Blutgefäßes gehindert (Buttrum et al., 1994; Doerschuk et al., 1999; Downey

et al., 1990; Erzurum et al., 1992; Inano et al., 1992). Als Folge bleiben die Neutrophilen

im Kapillarbett stecken. Dieser Vorgang wird durch Adhäsionsmoleküle auf den

Leukozyten und endothelialen Adhäsionsmolekülen unterstützt – doch handelt es sich

vorwiegend um andere Moleküle als im Systemkreislauf (Albelda et al.,1994; Burns et al.,

2003; Carlos und Harlan, 1994; Doerschuk et al., 2000; Gimbrone et al., 1997; Kuebler et

al., 1997; DeLisser und Albelda, 1998; Springer, 1995). Hinzu kommt, dass verglichen mit

dem Blut in den großen Gefäßen der meisten Gefäßbetten, das Blut im komplexen

pulmonalen Kapillarnetzwerk 50mal mehr Neutrophile enthält, sowie weit mehr

Lymphozyten und Monozyten als im systemischen Kreislauf (Doerschuk et al., 1990).

Diese Unterschiede der beiden Kreisläufe müssen auch im Bezug auf die Zellkulturen

berücksichtigt werden, da HPMEC aus humanen mikrovaskulären Lungenendothelien,

HUVEC hingegen aus humanen Nabelschnurvenen gewonnen werden.


4.14 Ausblick

Auf Grund der Bedeutung des VE-Cadherins für die Aufrechterhaltung des Zellverbandes

– der Verlust wird beim ARDS deutlich – ist ein therapeutischer Eingriff in VE-Cadherin-

vermittelte Prozesse zu diskutieren. Beispielsweise könnte in die bei ARDS auftretende

Destabilisierung des Cadherin-Catenin-Komplexes, der schließlich zerfällt und damit zu

einer Lückenbildung im Endothelverband führt, eingegriffen werden. Eine Verhinderung

dieser Prozesse erhielte gegebenenfalls die Endothelintegrität.

Sowohl die Mikrozirkulation als auch die Leukozytentransmigration sind eng an die

Endothelintegrität und den Cadherin-Catenin-Komplex geknüpft, so dass ein Eingriff in

diese Vorgänge von therapeutischem Nutzen sein könnte (Burns et al., 2003; Lee und

Downey, 2001; Lehr et al., 2000).

Ein weiterer Ansatzpunkt könnte die Verknüpfung von VE-Cadherin mit dem Zytoskelett

darstellen. Die Zelladhäsion wird durch die Bindung der VE-Cadherin-Moleküle an das

Zytoskelett bestimmt (Baumgartner et al., 2000). Jeder Mechanismus, der die Anbindung

der Cadherine an das Zytoskelett verändert (z. B. durch Phosphorylierungsvorgänge oder

Aktinpolymerisation), könnte Einfluss auf die Mobilität der Cadherine in der

Plasmamembran und damit auch auf die Anzahl der geknüpften Adhäsionen nehmen.

Aus der Kenntnis des bidirektionalen Signalweges zwischen dem Cadherin-Catenin-

Komplex und dem Aktin-Zytoskelett ergeben sich folgende Überlegungen: In die

endotheliale Zell-Zell-Adhäsion kann zum einen durch Rezeptor-Aktivierung und zum

anderen mit Hilfe von Aktin-modifizierenden Agenzien eingegriffen werden, woraus sich

dann veränderte endotheliale Eigenschaften in der Permeabilität und der

Leukozytentransmission ergeben (Hordijk et al., 1999).

Nwariaku et al. (2002) sehen eine Therapiemöglichkeit in der Modulation der

Phosphorylierung der Adhärensjunktion. Diese Überlegungen basieren auf einer Studie, in

der die Substitution eines Tyrosinkinaseinhibitors in Ratten der Dysfunktion von Leber

und Herz vorbeugt (Jarrar et al., 2000). Dieser Ansatz wird durch Angst et al. (2001)

bestätigt, die vor allem den VE-Cadherin-β-Catenin-Komplex als Ziel

permeabilitätssteigernder Agenzien sehen; bekannterweise führt die Phosphorylierung von

β-Catenin zu einer Dissoziation des Komplexes.

Die Herunterregulation der Expression induzierbarer endothelialer Genprodukte ist ein

weiterer Therapieansatz (Luscinskas und Gimbone, 1996).

Kapitel 5 – Zusammenfassung 129

5 Zusammenfassung

VE-Cadherin in humanen Lungen mit septisch bedingtem ARDS und endothelialen

Zellkulturen

In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Charakterisierung des VE-Cadherins – eines

ausschließlich auf Endothelzellen exprimierten Zelladhäsionsmoleküls – in der

menschlichen Lungenstrombahn sowie in Endothelzellkulturen. Untersucht wurde die VE-

Cadherin-Expression in Lungen mit septisch bedingtem ARDS im Vergleich zu

regelrechtem, entzündungsfreiem Lungengewebe sowie in unstimulierten und mit LPS,

TNFα und IFNγ stimulierten Zellkulturen.

Immunhistochemisch wurden 78 humane Lungenpräparate (58 regelrechte

Lungengewebsproben, 20 Proben mit septischem ARDS) und Zellkulturen (HPMEC und

HUVEC) mit einem monoklonalen Antikörper gegen VE-Cadherin gefärbt.

Es ergaben sich folgende Ergebnisse:

1. Es bestand eine statistisch signifikante gefäßtypspezifische Heterogenität der

endothelialen VE-Cadherin-Expression in der menschlichen Lunge mit einer

starken VE-Cadherin-Antigenexpression in Arterien, Arteriolen und Kapillaren und

einer vergleichsweise schwachen Expression in Venolen und Venen.

2. In Lungenproben mit septisch bedingtem ARDS lag eine im Vergleich zum

regelrechten Lungengewebe statistisch signifikant schwächere VE-Cadherin-

Antigenexpression vor, bei Erhalt des im regelrechten Lungengewebe

nachgewiesenen gefäßtypspezifischen Expressionsmusters. Das

gefäßtypspezifische VE-Cadherin-Expressionsmuster in der menschlichen Lunge

wurde somit durch pathophysiologische Bedingungen eines septischen ARDS nicht

beeinflusst.

3. Die Faktoren Geschlecht, Alter und Zeitraum zwischen Todeseintritt und

Obduktionszeitpunkt hatten keinen signifikanten Einfluss auf die VE-Cadherin-

Expression.

4. In den mit LPS-, TNFα- und IFNγ-stimulierten Zellkulturen zeigte sich –

korrespondierend zu den in situ-Befunden – sowohl für HPMEC als auch HUVEC

Kapitel 5 – Zusammenfassung 130

eine reduzierte VE-Cadherin-Antigenexpression mit, im Gegensatz zu den

unstimulierten Zellkulturen, Bildung von "Gaps" (Lücken) im Endothelzellverband.

Die verminderte VE-Cadherin-Expression in Lungen mit septisch bedingtem ARDS ist als

Ursache einer gesteigerten Endothelpermeabilität und daraus resultierenden

Transmigration von Leukozyten sowie weiterer Blutbestandteile aus dem Gefäß in das

entzündete Gewebe einzustufen. Damit erlangt VE-Cadherin bzw. seine verminderte VE-

Cadherin-Expression die Bedeutung eines wichtigen Pathogenesefaktors in der

Entwicklung des septisch bedingten ARDS. Die Ergebnisse der Untersuchung der VE-

Cadherin-Expression in Zellkulturen bestätigen diese in situ-Ergebnisse.

Die Zellkulturen (HPMEC und HUVEC) sind somit als ein geeignetes Modell für

Untersuchungen der VE-Cadherin-Expression in der menschlichen Lunge bei septischem

ARDS unter standardisierten Bedingungen anzusehen.

Auf Grund der ubiquitären Verteilung des VE-Cadherins ist bei derzeitigem Wissenstand

zur VE-Cadherin-Expression in situ (diese Arbeit ist einer der ersten Arbeiten zu VE-

Cadherin in menschlichem Lungengewebe) eine Beeinflussung der VE-Cadherin-

Expression im Sinne eines therapeutischen Eingreifens in die Pathogenese des ARDS noch

nicht in greifbarer Nähe.

Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 131

6 Literaturverzeichnis

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Kapitel 7 – Danksagung 144

7 Danksagung

Frau PD Dr. med. Müller danke ich herzlich für die Überlassung des Themas. Mein

besonderer Dank gilt ihrer hervorragenden Betreuung, ihrer Geduld und ihrem Verständnis

für mein Studium und meine privaten Interessen.

Herrn Prof. Dr. med. Müller danke ich für die Bereitstellung der Institutseinrichtungen.

Meinen Eltern danke ich für die finanzielle Unterstützung meines Studiums und meiner

Doktorarbeit.

Herrn Prof. Dr. med. Kirkpatrick, Direktor des Instituts für Pathologie der Johann-

Gutenberg-Universität Mainz, danke ich für die Bereitstellung der Einrichtungen des

Zellkulturlabors. Vielen Dank für die Unterstützung durch das ganze Team.

Herrn PD Dr. med. Tsokos danke ich für die Überlassung der Lungengewebsproben von

an septischem ARDS verstorbenen Patienten.

Frau Dipl.-Biolog. Stockmann danke ich für die Einarbeitung in die Immunofluoreszenz-

Fotographie.

Herrn PD Dr. med. Lange und Herrn Dipl.-Stat. Holland-Letz danke ich für die

hervorragende statistische Beratung.

Frau Cornelia Troske danke ich für ihre Unterstützung bei fototechnischen Problemen.

Meinen Freunden danke ich für das Verständnis, die Unterstützung und die schöne Zeit

während des Studiums.

Kapitel 8 – Lebenslauf 145

8 Lebenslauf

Name: Herwig

Vorname: Martina Christina

Geburtsdatum: 01.02.1981

Geburtsort: Dortmund

Familienstand: ledig

Konfession: römisch-katholisch

Eltern: Dr. med. Burckhardt Herwig, Arzt für Innere Medizin

Liselotte Herwig (geb. Kaufmann), Hausfrau

Schullaufbahn: 1987 - 1991 Aplerbecker-Mark-Grundschule in Dortmund

1991 - 2000 Stadtgymnasium Dortmund (Abiturnote 1,3)

Fremdsprachen: 1. Fremdsprache: Latein (1991); Abschluss: Latinum

2. Fremdsprache: Englisch (1993)

3. Fremdsprache: Alt-Griechisch (1995); Abschluss: Graecum

Studium: 2000 bis jetzt Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum

2002 Physikum

2003 1. Staatsexamen (2,0)

2005 2. Staatsexamen (1,66)

Famulaturen: Institut für Pathologie (BG-Kliniken Bergmannsheil, Bochum)

Knappschaftskrankenhaus Bochum-Langendreer, Augenklinik

Wiener Gebietskrankenkasse, Augenambulanz

Wiener Gebietskrankenkasse, Gastroenterologische Ambulanz

Unfallkrankenhaus Wien-Meidling

Krankenhaus Bethanien (Dortmund), Innere Medizin

Praxis für Allgemeinmedizin in Schwerte

Praxis für Unfallchirurgie in Dortmund

Praktisches Jahr: 1. Tertial: Chirurgie, Knappschaftskrankenhaus Bochum

2. Tertial: Augenheilkunde, Universitätsspital Basel

3. Tertial: Innere Medizin, Knappschaftskrankenhaus Bochum

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Ruhr-Universität Bochum PD Dr. med. A. M. Müller Dienstort ... · PECAM-1 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule PFA Paraformaldehyd PMN Polymorphonuclear Leukocytes (= Granulozyten)