REI)IEI~ HA~I~ und KL~vs H o ] ~ A ~ : Schwefe]haltige Verbindungen des Fleisches. I 143

unter Esterbildung neutralisiert werden. Wenn dieses Vermutung richtig ist, dann spielen Enzyme wie Carboxylase und Esterase die Hauptrolle fiir die Aromabildung. Nach langer Lagerzeit und beim Zusammenbruch wird dieser Mechanismus stark auf die Alkoholbildung konzentriert.

Zusammen]assung l. Lagernde J~pfel nehmen aus einer mit 14C0s angereicherten Atmosphiire kein

14C auf, dagegen nehmen lagernde Xpfe114C aus einer in das Kerngehause injizierten NaHi4CO3-LSsung auf. Es scheint nur ein CO~-Austausch yon innen nach aui3en m6glich zu sein.

2. Als mSgliche Aufnahmemechanismen kommen Carboxylase-Reaktionen in Frage.

3. Die sti~rkste 14C-Aufnahme zeigt die ~ttherische Fraktion des Apfels, so dal~ in ihr die spezifische Aktivit~t je mg hSher ist ~ls in der unverdampfbaren Fraktion.

4. Die hSchsten laC-Aktivithten liegen in der nicht mit Ather extrahierbaren Fraktion, die bisher als ,,freie Siiuren" ch~rakterisiert wird, und in den Estern vor. Das bedeutet, d~13 w~hrend der Lagerzeit die Huuptre~ktionen in Richtung Siiure- b[[dung-Esterbildung verlaufen.

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Schwefelhaltige Verbindungen des Fleisches I. Mitteilung

(~ber die Problematik der Best immung yon Sulfhydrylgruppen im Fleischeiwei•

Von

REINER HAM~I und KL~us HOFMANN*

Mitteilung aua dem ln,titut ]i~r Chemie uncl Physik der Bundesanstalt /iir Fleisch]orschung, Kulmbach, und dem Institut ]i~r ErnShrungswissenscha/t der Justus Liebiff-Universitiit, Giefien

(Eingegangen am 23. Mgrz 1965)

Unter den schwefelhaltigen Verbindungen des Fleisches verdienen die Muskel- proteine besonderes Interesse. Die Sulfhydrylgruppen des in die Polypeptidketten der EiweiBmolekiile eingebauten Cysteins und die Disulildgruppen des Cystins diirften bei den wi~hrend der Lagerung (1) und Verarbeitung eintretenden Ver~nde- rungen des Fleisches, insbesondere bei der Fleischreifung (2, 3), beim Gefrieren (4, 5),

* Teil der Dissertation yon K. I - I o ] r ~ : Untersuchung des Einflusses der thermischen Be- handlung yon Fleisch auf die funktionellen Gruppen der strukturellen Muskelproteine. Justus Liebig-Universitgt Giel~en 1964.

1~4 REI~ER H x ~ und KLAVS HOF~A~:

P6keln (6 -8 ) und Rauchern (9) eine Rolle spielen, fiber die allerdings noch wenig bekannt ist. Auch die Qualit/it des Fleisches, vor Mlem Zartheit (1, 10,11) undWasser- bindungsverm6gen, werden wahrseheinlich durch das Sulfhydryl-Disulfid-Sys~em der Muskelproteine und dessen Reaktionen beeinflugt. Gewisse naehteilige Ver/~nderun- gen beim Erhitzen yon FMsch, wie etwa die zu Dosenkorrosionen (12) ffihrende Bildung yon Schwefelwasserstoff bei der Hitzekonservierung (13-16), vielleieht aber aueh das bei schonender thermischer Behandlung auftretende angenehme Aroma, sind auf l~eaktionen der Sulfhydrylgruppen des Muskeleiweiites zuriickzuffihren.

I)er Bestimmung yon Sulfhydrylgruppen in Fleiseh kommt daher grunds/£tzliche Bedeutung zu. Die Bestimmung von SIt-Gruppen erm6glieht es auch, Aufsehlug fiber die Denaturierung des lVfuskeMweiBes dureh Erhitzen, Gefrieren oder Trocknen zu erhMten, da die Denaturierung yon Proteinen in der Regel mit einer ~nderung der Zug/inglichkeit der SH-Gruppen ffir bestimmte, SH-spezifische t~eagentien verbunden ist (17).

Aus diesen Grfinden erwies es sieh als notwendig, geeignete Methoden zur Be- st immung yon SH-Gruppen auszuw£hlen und auf ihre Anwendbarkeit in der Fleiseh- forsehung zu prfifen. I m Itinblick auf die oben erw~hnten Anwendungsm6glichkeiten ist es wfinschenswert, solehe Verfahren zur Verffigung zu haben, mit welehen man SIt-Gruppen nieht nur in isolierten Muskelproteinen, sondern aueh in intakten Myo- fibrillen und im Gewebe ermitteln kann; es darf n~mlieh nicht yon vornherein er- wartet werden, dab die bei der Lagerung und Verarbeitung yon FMseh eintretenden Ver/~nderungen bei den isolierten Muskelproteinen die gleiehen sind wie bei den in der Muskelfibrille in best immter Anordung fixierten Proteinen. Zudem eoagulieren Muskelproteine beim Erhitzen aul Temperaturen fiber 60 ° C. Sie sind dann selbst in Pufferl6sungen yon hoher Ionenst~rke nieht mehr 16slieh (18); es so]lte aber atmh in diesem Fall die M6gliehkeit bestehen, SI{-Gruppen ira ungel6sten Material zu bestimmen, um Einfl/isse der Hitzedenaturierung studieren zu k6nnen.

I m folgenden sei zun/~chst er6rtert, welche Methoden zur Bestimmung yon SH- Gruppen in Proteinen unter diesen Gesichtspunkten in Betraeht kommen. Die ex- perimentelle Prfifung und Ausarbeitung solcher Verfahren f/Jr die Untersuehung yon Fleiseh, Myofibrillen und Muskelproteinen wird Gegenstand weiterer Mittei]ungen dieser Reihe sein.

1. Methoden zur Bestimmung yon SH-Gruppen in l'roteinen Zur Bestimmung yon Sulfhydrylgruppen in Proteinen sind zahlreiehe Methoden

entwiekelt worden, die auf der Anwendung versehiedener SH-Reagentien beruhen (l~bersiehten: 19-21)*. Diese VielfMt ist ein Ausdruck ffir die mannigfachen Reak- tionsmSgliehkeiten der SH-Gruppen, aber auch ffir die Sehwierigkeiten ihrer quanti- tat iven Bestimmung.

Die l~eagentien zur Bestimmung yon SH-Gruppen in Proteinen sind ira wesent- lichen dieselben, die anch zur Bestimmung niedermolekularer Stt-Verbindungen - wie z. B. Cystein und Glutathion - benutzt werden. Sie ]assen sich in vier Gruppen zusammenfassen :

a) Oxydationsmittel In glteren Arbeiten sind fast ausschlieglieh Oxydationsmittel, wie z. B.

K3[Fe(CN)6], verwendet worden. Sie ergeben mitunter zu hohe Werte, da sie den Sehwefel der SI{-Gruppen nieht nur entspreehend der geakt ion

2 R--SH - - 2e > R--S--S--]~ + 2 H + * In diesem Abschnitt sind nur solche Arbeiten zitiert, die in den ~bersichtsrefer~ten (19--21)

nicht er6rtert sind.

SchwefelhMtige Verbindungen des Fleisches. I 145

bis zum Disulfid, sondern darfiber hinaus aueh zu hSheren Wertigkeitsstufen oxy- dieren kSnnen. Andererseits werden aber mit Ka[Fe(CN)6 ] bisweilen aueh zu niedrige Werte gefunden (3, 22). Angerdem sind Oxydationsmittel wenig spezifiseh. Eine Aus- nahme bilden die geaktionen mit Disulfiden (,,Disulfidaustanseh") (23-25)

R--SH + R1--S--S--R2 > R--S--S--R2 + RI--SH,

mit denen sich aber ira Fall des Muskeleiweil3es nieht alle SH-Gruppen erfassen lassen (25).

b) Mercaptidbildende Reagentien SehwermetallsMze bflden mit SH-Verbindungen weitgehend undissoziierte Mer-

captide. In der Regel sind die iibersehiissigen Schwermetallionen polarographisch wirksam, so dab man zu ihrer ]3estimmung elektrometrische Titrationsverfahren an- wenden kann, die den Vorteil hoher Empfindlichkeit besitzen. Diese Methoden werden hente bevorzugt angewendet. Es besteht jedoeh hier eine gewisse Gefahr der Komplex- bildung mit anderen funktione]len Gruppen der Proteine (vgl. 26), insbesondere bei den zweiwertigen Metallionen. Man bedient sieh daher bestimmter Verbindungen des Ty]?s g~eXIX (1% = Alkyl- oder Arylrest, X - Anion) (1, 27-38), die sich wie ein- wertige Metallsalze verhalten. Sie reagieren mit der Sg-Gruppe in folgender Weise:

R1SK ~- R--MeuX ~- R--Me H S--R~ ~- ttX.

Tr~gt der Rest R eine ehromophore Gruppe, so kann die Reaktion durch optische Messungen im Siehtbaren verfolgt werden (36, 39, 40).

Bei diesen Verfahren bestimmt man jeweils die Menge an nieht verbrauehtem Reagens. Die Anwendung yon p-Chlormercuribenzoat auf die Bestimmung yon SH- Grnppen in gel6sten Proteinen ermSglieht auch die unmittelbare Messung des Reak- tionsproduktes, da es im UV eine charakteristisehe Absorption anfweist (41). Diese Methode wurde in letzter Zei~ h/iufig benutzt (33, 37, 42-45).

c) Allcylierungsmittel Verbindungen mit additions/ighigen Doppelbindungen. Von diesen wurden bisher

fast nur Derivate des Maleinimids zur Bestimmung yon SH-Gruppen in Proteinen herangezogen. Aber auch Vinylsulfone kSnnen mit SIt-Gruppen nmgesetzt wcrden, wie Untersuchungen yon ScItS]3ERL (46) in jfingster Zeit gezeigt haben. In allen F/illen erfo]gt eine Addition der SH-Gruppen an die Doppelbindung, z. B.

R--SH ~- tlC=CK R--S--CH--CtI 2

I rCO > OC O~ ~0 \/ \/ N N

I I g g

N-J~thylmaleinimid (NEM) ist neuerdings Mufig zur Bestimmung yon Protein-SH- Gruppen herangezogen worden (11, 47--50). NEM galt bishcr Ms sehr spezifisches Reagens fiir SH-Gruppen. Naeh neueren Untersuchungen (51) kann NEM u. U. aueh mit Aminogrnppen reagieren, offenbar aber nur in Konzentrationen, die wesentlieh gr6f3er sind, a]s sie normalerweise bei der Analyse yon Proteinen verwendet werden. Bci l%eaktionszeitcn bis zu 6 Std reagiert NEM spezifiseh mit StI-Gruppen. Erst bei 1/~ngerer Einwirkung reagiert es langsam mit NH~- und NH-Gruppen.

146 I~E~]~ HAM~ und KLAvs I~OFMAXX:

Halogenalkylverbindungen. Jodessigsi~m'e (bzw. Jodaeetat) und Jodacetamid (vgl. z. B. 52) sine[ gebri~uehliche SH-lgeagentien. Sie reagieren mit der Stt-Gruppe unter Abspaltung yon Jodwasserstoff, z. B.

I~--SI~ q- JCI-12CONH ~ ) R--S--CH2CONH2 q- HJ.

Es hat sich aber gezeigt, dab beide Reagentien ffir SH-Gruppen in Proteinen nicht immer spezifiseh sind (53).

d) Sonstige SH-Reagentien Das am 1/~ngsten bekannte SH-Reagens ist Nitroprussidnatrinm, das mit Stt-

Verbindungen in basiseher L6sung eine eharaktcristische rotviolette Farbe ergibt. Wegen der geringen Best/~ndigkeit dieser Farbe wird es aber meist nur zum qualita- riven Naehweis der SI-LGruppen in Proteinen angewendet (bei unl5shchen Strukturen als ,,Tfipfeltest"). Bei der Titration yon Protein-SH-Gruppen ist Nitroprussidnatrium aueh als Indicator benutzt worden (1, 4, 11, 29, 54).

Ein bekannter SH-Blocker ist m-Amino-p-hydroxyphenyl-arsen(III)oxyd (Oxar- san). Infolge der Bloekierung yon SH-Gruppen hemmt es z. B. die Kontraktion yon Actomyosin (55) :

HO HS HO

+ Protein

/ ~ / \ /s",erot~i ~ tt~N As=O HS / H~ \ s /

Darfiber hinaus gibt es noeh eine groBe Zahl verschiedener Verbindungen, die mit SH-Gruppen reagieren. Sic seien hier aber nicht erw/~hnt, da sic bisher noeh keine verbreitete Anwendung zur Bestimmung yon SK-Gruppen in Proteinen gefunden haben.

2. Allgemeine Sehwierigkeiten bei der Bestimmung yon Protein-SH-Gruppen Die Erfassung s/~mtlicher SI-I-Gruppen eines Proteins bereitet vielfach Schwierig-

keiten, da die Zahl tier bestimmbaren Sg-Gruppen yon einer l~eihe versehiedener Faktoren abMngig sein kann, wie z. B. yon der jeweiligen Struktur eines Proteins, yon Art und Konzentration der SH-Reagentien, yon Eeaktionszei~, Temperatur und anderen Faktoren.

Auf Grund der bisherigen Erfahrungen unterseheidet man - je naeh der Zug/~ng- lichkeit der SI~-Gruppen im Protein - zwisehen 1) freien, rasch reagierenden, 2) tr/~ge reagierenden and 3) maskierten SH-Gruppen (56, 57).

Unter den zuletztgenannten SK-Gruppen versteht man solche, die erst nach Dena- turierung dureh Harnstoff, Guanidin oder Hitzebehandlung naehweisbar werden.

Diese Unterschiede in der Reaktionsf/~higkeit yon Protein-SH-Gruppen liegen in der spezifischen Struktur der Proteine und in den Weehselbeziehungen zwisehen den Proteinmolekfilen begriindet. ~ber die ~mderung der Zug/~nglichkeit der SK-Gruppen durch Denaturierung existieren verschiedene Theorien (17), die hier nicht diskutiert seien.

Am Beispiel des besonders h/~ufig untersuchten Eialbumins kann man zeigen, welch bedeutenden EinfluB die Art des Reagens auf die Zahl der bestimmbaren SR- Gruppen haben kann (Tabelle).

Schwefelhaltige Verbindungen des Fleisches. I 147

Tabelle. SH-Gehalt in Harnsto~-dena~riertem Eia~umin molSH

l~,eagens

Kaliumcyanoferrat (III) Jodacetat Porphyridin Silbernitrat p-Chlormercuribenzoat

Art der l~eaktion

Oxydation Alkylierung Oxydation Mercaptidbildung Mercaptidbildung

molProtein

2,3 3,3 3,8 4,3 5,5

Li~era~ur

(22) (59) (60) (61) (22)

Auch bei anderen Proteinen sind voneinander abweichende t~esultate erzielt worden.

Eine einfaehe MSgliehkeit, den maximalen SH-Gehal~ eines Proteins zu ermitteln, seheint darin zu bestehen, den Cysteingehalt eines Proteins naeh der Hydrolyse fest- zustellen. Dieser Weg fiihrt abet nieht zum giel, da Cystein dureh die tIydrolyse be- trgehtliehe Verluste erleidet (35, 62, 63, 76). Die Befunde yon Mmsx~r (65), nach denen die Zahl tier Stt-Gruppen im denaturierten Protein dem naeh Hydrolyse ermittelten Cysteingehalt/iquivalent war, sind daher yon 0LCOT$ und F~AE~EL-Co~AT (66) auf einander ausgleiehende Fehler der Analysenmethoden zur/iekgef/ihrt worden.

3. [Tber die Bestimmung yon SIt-Gruppen in ltluskelproteinen 7Clber die Bestimmung yon SIt-Gruppen in gelS~ten Muskelproteinen ist in der

Literatur - vor allem im HinbHck auf die Bedeutung yon SH-Gruppen flit die Bin- dung yon ATP an Myosin, die Aktivitgt yon ATPase, die Polymerisation yon Actin und die Muskelkontraktion - h/iufig berichtet worden (vgl. 8, 23, 24, 29, 52, 65, 67-75). Dagegen ist fiber die Bestimmung yon SH-Gruppen in ungeldsten Muskel- proteinen (77), Myofibrfllen und Gewebe (3) nur sehr wenig bekannt.

M c C ~ Y und KInG (1) ffihrten eine jodometrische Bestimmung von Stt-Grup- pen in I~indermuskelgewebe dutch. Die Verwendung yon Jod ist abet wegen seiner geringen Spezifi~/it ffir Protein-SII-Gruppen unbefriedigend. WATts u. Mitarb. (8) verwendeten den Ttipfeltest mit Nitroprussidnatrium, der abet nur eine sehr grobe Abschi~tzung gestattet. Schlieglieh bestimmte CON~rELL (4, 11) SIt-Gruppen in Fisch- muskelgewebe durch Titration mit N-Xthylmaleinimid unter Verwendung yon Nitro- prussidnatrium als Indicator. Wit versuchten, auf diese Weise Rindermuskelhomo- genate zu ti~rieren. Die Ergebnisse waren jedoch v611ig unbefriedigend, da am End- punkt der Titration nur ein sehr undeutlicher Farbwechsel eintrat.

4. Auswahl der Reagentien fiir die Bestimmung yon Sit-Gruppen im Muskelgewebe Fiir die Bestimmung yon SH~Gruppen in nicht gel6sten Muskelproteinen, Myo-

fibrillen und Gewebe kamen nut wenige SH-Reagentien in Betraeht. Es waren solche Best:hnmungsmethoden auszuw/ihlen, yon denen man erwarten konnte, dag sie nieht schon yon sich aus zu einer Proteindenaturierung ffihren. Daher waren folgende Gesichtspunkte maggebend:

a) Die l~eagentien sollen in Wasser lSslich sein. Organisehe LSsungsmittel sind zu vermeiden, da sie unter Umstgnden denaturierend wirken (17, 58, 64).

b) Die Bestimmungen mfissen bei pH-Werten um 7 durchgeffihrt werden, da es andernfalls zu Basen- oder S/~ure-Oenaturierung kommen karm.

e) Das l~eagens muB sieh mit den SH-Gruppen im nngelSsten Protein (Muskel- gewebs- oder Myofibrfllenhomogenat, Actomyosingel) in relativ kurzer Zeit quanti- tativ umsetzen; nach der Reaktion muB man den Reagensiiberschug bes~immen k6nnen.

148 I~nlNER HAN~ und KLAVS Ho~&~N: SehwefelhMtige Verbindungen des Fleisches. I

d) Die l~eakt ion soll in A n b e t r a e h t des verh/ t l tnism/tNg niedrigen SH-Gehal tes yon Muskeleiweig h inre iehend empfindl ich und un te r den anzuwendenden Bedin- gungen ftir S I t - G r u p p e n spezifiseh sein.

Eine kr i t i sehe Durehs ich t der berei ts bekann ten , oben angeff ihr ten Methoden er- gab, dab Si lbern i t ra t , N - ~ t h y l m a l e i n i m i d u n d p-Chlormercur ibenzoa t voranss ieht - l ieh a m ehesten den geste l l ten Bedingungen entspreehen. Diese Reagen t i en wurden daher auf ihre B rauehba rke i t gepri if t . F i i r den qua l i t a t iven Nachweis wurden auBer- dem Ni t rop rus s idna t r i um und K a l i u m h e x a e y a n o f e r r a t ( I I I ) herangezogen. Ube r die Ergebnisse dieser Un te r suehungen soll in den fo lgenden Mit te i lungen dieser Reihe ber ich te t werden.

Zusammen/assung Wie eine Diskuss ion der in der L i t e r a t u r ~ngegebenen Verfahren zur E r m i t t l u n g

yon Su l fhydry lg ruppen in Pro te inen ergibt , k o m m e n ffir die Bes t immungen yon Su l fhydry lg ruppen in Muskelgewebe, Myofibri l len und n icht gel6sten Muskelpro te inen in ers ter Linie die l~eakt ionen mi t S i lbern i t ra t , N-fi~thy]maleinimid und p-Chlormer- cur ibenzoat in Be t rach t .

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Diinnschichtchromatographie der Pesticide Von

TAPIO SALo u n d KARl SALMINEN

Mitteilung aus den Zentrallaboratorien der Grofleinkau/sgenossenscha/t finnlscher Handels- genossenscha/ten (SOK) Helsinki

(Eingegangen am 8. Februar 1965)

Die ]3e s t immu n g y o n Pes t i c id r f i cks t~nden wurde d a n k c h r o m a t o g r a p h i s c h e r M e t h o d e n au l ]e ro rden t l i ch er le ichter t . Die b e d e u t e n d e Schnel l igke i t u n d vo r a h e m die E m p f i n d l i c h k e i t dieser Methoden , i n sbesondere die df innschich t - u n d gaschro- m a t o g r a p h i s c h e n , s i nd ffir die l%fickstandanalyse y o n u n s c h i i t z b a r e m Wer t .

z. ]Sebensmitt.-Untersuch., Band 129 11