R. K ~ und K. HOF~T~: Sehwefelha]tige Verbindungen des Fleisehes. IV 7

15. MILLER, ~. z~., U. ~NT. E. WILLIAMS: Analyst 76, 226 (1951), 16. M~LLER, ]3. : Chemiker-Ztg. 44, 573 (1920). 17. EAST~IV£, A. M., u. G. A. LATRE~OUILLE: Canad. J. Res. 28 B, 264 (1950). 18. JA\vo~s~, M., A. ZI]~LASKO u. K. GASIO~: Chem. analit. (Warszaw~) 6, 1005 (1961). 19. HILTO~T, F. : Trans. Inst. Rubber :[ndus~r. 17, 313 (1941). 20. Ross, W. C. J. : J. chem. Soc. 1950, 2257. 21. Swx~, J. D.: Analytic. Chem. 26, 878 (1954). 22. GvDzr~owIcz, B. J.: Analytic. Chem. 32, 1520 (1960). 23. ST~AC~E, F. : Niitt.-]3l. GDCh., Lebensmittelchem. 2, 21 (1966). 24. BEgCK, ]3. : J. agrie. Food Chem. 13, 373 (1965).

Schwefelhaltige Verbindungen des Fleisches 1 V. Mitteilun~

Bestimmung yon Sulfhydrylgr~ppen in Myofibrillen mit 7Natrium-p-chlorquecksilber(II)benzoat (PCMB)

I:~EINER HAMM und ]J~LAUS ~tOFMANN*

Mitteilung aus dem Institut [i~r Chemic und Physik der Bunde~anstalt /i~r Fleisch/orschung, Kulm- bach, und dem Institut ]i~r Ern~'hrungswissenscha]t I der Universitiit Gieflen

Eingegangen am30. Mai1967

PCMB z/~hlt zu den meistangewandten Reagentien zur Bcstimmung yon SH- Gruppcn in Proteinen (vgl. 1-12). Die Reaktion mit SH-Gruppen verl/~uft in folgen- der Weise:

N~OOC--~ - -Hg-CI + HS-R -+ N a O O C ~ H g - S - R + HC1

Zur Bestimmung yon Protein-SH-Gruppen benutzt man vielfach eine yon Borz~ (12) eingeffihrte Methode, die auf der optischen Messung des .Reaktionsproduktes (Extinktionszunahme der Reaktionsl6sung bei 250-255 nm) beruht. Das Verfahren l~Bt sich jedoch nur auf gelSste Proteine anwenden. Bei ungelSsten EiweiBstoffen (z. B. MuskeleiweiB) kann man die Menge des unverbrauchten Reagenses aufgrund seiner Absorption bei 232 nm (Absorptionsmaximum) ermitteln. Dieses Prinzip wurde in der vorliegenden Arbeit angewendet. Zun~chst war es erforderlieh, den EinfluB ver- schiedener Reaktionsbedingungen auf die Zahl der bestimmbaren SH-Gruppen in Myofibrfllen zu untersuchen.

1. Reaktion yon PCMB mit Myofibrillen in AbhKngigkeit yon der PCMB-Konzentration

Durch/i~hrung der Untersuchungen: ~[yofibrillen warden in 0,5 × 10 -~ bis 2 × 10 -4 m-PCMB- L6sungen 7 Std bei pH 7,0 (Phosphatpuffer) gesehiittelt. Der ReagensfibersehuJ~ wurde spektral- photometriseh bei 232 nm ermittelt (experimenteHe Einzelheiten vgl. Absehrdtt 5).

Die Ergebnisse sind in Abb. 1 dargestellt. Die K u r v e n p u n k t e stellen Mittelwerte aus je 6 Bes t immungen dar (das gleiche gilt ffir Abb. 2).

* Tefl der Dissertation yon K. HoF~_w~: Untersuchung des Einflusses der thermischen Behandlung yon Fleiseh auf die funktionellen Gruppen der strukture]len NIuskelproteine. Justus Liebig-Universit~Lt GieBen 1964.

8 1~. ttA~Z~ und K. I - I o F ~ :

Trotz der extrem langen Re~ktionsdauer, und obwohl in s~mtlichen Ans~tzen in bezug auf die maximal zu erwar~ende SH-~Kenge (mit AgNOs ermittelt (13)) ein genfigender ReagensfibersehuB vorlag, steigt die Zahl der reagierenden SH-Gruppen mit zunehmender PCMB-Konzentration - vermutlieh auch fiber 2 × 10 -~ tool hin- aus - an. I-IShere Konzentra~ionen an PCMB konnten wegen der verhifltnismiiBig geringen LSslichkeit dieses Reagenses bei pH 7,0 nicht angewendet werden. Die Ursaehe ffir den starken Anstieg der SI-I-Werte mit grSBer werdendem PCMB: Myofibrillen-Verhifltnis liegt m5glieherweise in einer sukzessiven Denaturierung durch das Reagens, als deren Folge SH-Gruppen (vgl. 14) freigesetzt werden, die zu- vor in maskierter Form vor]agen. Eine solche denaturierende Wirkung dureh PCMB ist bereits an gelSsten Proteinen festgestellt worden (15). Weiterhin besteht die MSgliehkei~, dal~ PCMB aueh mit Disulfidgruppen reagieren kann (16, 17). Denkbar w~re ferner eine unspezifisehe Reaktion yon PCMB mit anderen funktionellen Gruppen (18). Bisher sind jedoeh noch keine schlfissigen Beweise daffir erbracht worden.

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7

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0 0,5 7,0 Z~0.70 -~ too! i?eajeiTdeonzenlralion an P6"H8

Abb. 1. Abhiingig~eit der ReaCtion zwischen P C M B und Myofibrillen yon der PCMB-Kon- zentratTon bei 2 verschiedenen Substratmengeu ; a: 25 rag, b: 100 nag Myofibri l len pro Ansatz

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Abb. 2. Abhiingiglceit der Reaktion yon P C M B mit Myofibrillen yon der Realctionszeit.

a: 2 × I0-~moI PCMB, 25 m g h~[yofibrillen; b: 1 × 10 -4 mol PCMB, 100 m g ~Iyofibril len

2. Reaktion yon PCMB mit Myofibrillen in Abhiingigkeit yon der Zeit Myofibri l lenproben ein und desse lben h 0 m o g e n e n Pr~parates lie• man bei unterschiedl icher

Reakt ionsdauer (maximal 15 Std) mi t P C M B reagieren. Das Mengenverhi~ltnis y o n Reagens zu Myofibri l len war zu Beg inn tier Reakt ion im Versuch a aehtmal grSl~er als im Versuch b (Abb. 2).

Wie Abb. 2 zeigt, wird die Zeitabhi~ngigkeit der Reaktion yon PCMB mit Myo- fibrillen von der HShe des Reagensfiberschusses stark beeinfluBt. Bei einem relativ geringen UberschuB (Kurve b) ist das Reaktionsgleichgewieht bereits naeh 3 Std erreieht, bei einer wesentlich hSheren PCMB-Anfangskonzen~ration dagegen erst naeh 7 Std (Kurve a). Aus den Ergebnissen in Abb. 1 und 2 geht hervor, dab das AusmaB der Reaktion mit steigender PCMB-Konzentration zunimmt, wobei naeh sp~testens 7s~findiger Reaktion jeweils Reaktionsgleichgewieh~ erreieht ist.

3. Sonstige Untersuehtmgen Bei der B e s t i m m u n g y o n SH-Gruppen bes teht s te ts die MSglichkeit e ines s t6renden Ein-

f lusses y o n Lu~tsauerstoff. Diese Frage wurde im Hinbl i ck au~ die V e r w e n d u n g y o n P C ~ B untersucht :

Schwefelhaltige Verbindungen des Fleisches. IV 9

Je 100 nag Myofibrillen behandelte man a) in Gegenwart yon Luit und b) unter Stickstoff- atmosphire 20 Std unter Schiitteln mit PCMB bei pI~I 7,0 (Phosphatpuffer).

Neun Bes t immungen in Gegenwart yon Luf t ergaben einen Mittelwert yon 1,58 ± 0,037, 8 Bes t immungen unter Stickstoff 1,55 ± 0,073. Luf t sauers tof fha t dem- n~ch keinen erkennbaren EinfluB auf die SH-Best immung mit PCMB.

4. Weitere Diskussion und Schlul3folgerungen

Mit PCMB erfaBt m a n - ebenso wie mR N-~thylmale in imid (NEM) (19) -- nur einen Tefl s~mtlicher [z. B. durch l~eaktion mit AgNOs erfaBbaren (13)] S t I -Gruppen in Myofibrfllen. Ebenso wie NEI~ eignet sich PCMB daher zur Bes t immung der leicht zugingl ichen SH-Gruppen und dami t zur Verfolgung von Denatur ierungsvorgingen, bei denen SH-Gruppen freigesetzt werden. PCMB besitzt gegenfiber N E M den Vor- teil grSBerer Stabflit~t. Als Nachteile sind zu erw/ihnen: 1. Die Fehler der St{-Be- s t immung mit PCMB nuch der yon uns angewendeten Methode (Abschn. 5) sind relativ hoch. 2. Die Ergebnisse sind in s tarkem MaBe yon der I~eagenskonzentration abh/ingig. 3. Die Methode 1/~Bt sich nur auf Myofibrfllen anwenden, da Gesamtgewebe zu hohe Blindwerte verursacht .

5. Methode zur Best immung yon SH-Gruppen in ~Iyofibrillen mit PCMB a) Unter~achungsmaterial Myofibrinen wurden aus dem 5--6Tage nach dem Schlachten entnommenen Musculus

longissimus dorsi 3-Sj~hriger Kiihe wie in (13) beschrieben hergestellt.

b) L6sungen 0,0758 g (2 × 10 -4 tool) Natrium-p.chlorquecksilber(1-I)benzoat (PCMB) werden in 2 ml 0,I n-

Natronlauge und 10 ml Wasser gelSst und mit Phosphatpuffer yon pI-I 7,0 (612 ml 0,05 m- Na~HP04 9- 388 ml 0,05 m-KH~P04) auf 1 1 aufgefiillt. Die Eichkurven werden mit einer 10 -am- PCMB-LSsung (5, 10, 15, 20m 1/100 ml) bei 232 nm aufgenommen (1 cm-Quarzkfivetten).

c) Durch/iihrung der Bestimmung 25 mg Myofibrillen werden mit 10 ml 2 X 10 -4 m-PCMB-LSsung (pit 7,0) versetzt und bei

Zimmertemperatur in Pulverflachen yon 25--30 ml Inhalt geschiittelt. Es werden fiir jede Bestimmung 6 Proben angesetzt. Nach der Reaktion wird 30 rain bel etwa 25 000 g zentrifugiert. 5 ml Zentrifugat werden auf 50 ml aufgefiillt. Die Extinktion dieser LSsung wird bei 232 nm in einer 1 cm- Quarzkiivette gemessen.

Zur Ermittlung der Leerwerte ersetzt man die Reagensl6sung durch den oben beschriebenen Phosphatpuffer. Jeweits 4 Proben sind hierbei ausreichend.

d) Berechnung Oer Reagensverbrauch ist gleich der Differenz aus dem insgesamt zugesetzten PCMB

(2 × 10-'~mol)und demReagensfiberschu~ ( ~zmol PCM_B × 10 ) ml ---- a, aus Eichkurve abzulesen .

In 1 g Protein sind somit enthalten: SH = (2 -- a) × 33,7 x 100

Proteingehalt (%) × Einwaage (rag) mg

e) Pehlergrenze der Methode Der mittlere Fehler des lV[itte]wertes betrug 5,1°/o, der mittlere Fehler des ]~inzelwertes 12,6°/o.

Zusammen/assung

Eine Methode zur Bes t immung yon Sulfhydrylgruppen in ~¢[yofibrillen mit Natr ium-p-chlorquecksi lber(I I )benzoat in Phosphatpuffer p H 7,0 wird beschrieben"

10 B. I~. F. R. LINDEMANN:

Das Reagens erfaBt hierbei nu r einen Teil der SH-Gruppen (die sog. leichtzug/~ng- lichen). Das AusmaB der Reakt ion in Abh~ngigkei t v o n d e r l~eagenskonzentrat ion und der Reakt ionszei t wurde untersucht .

Li teratur

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Zur Aherung von Weindestillaten

BURGHARD R. F. R. LINDEMANN*

Eingegangen am 27. Januar 1967

A. LReratur

1. Grundlagen der Beurteilung F/ir die Beurteilung eines Weindesti]la~s ben5tigt man sowohl anaiytisehe als auch organo-

leptische Priifungen. Zus~tzlieh kann auch die Untersuchung des Brennweines nach Vorschriften herangezogen werden (1). Die Meinung, dab auf die organoleptische Untersuchung nicht verziehtet werden kann, hat sieh heute allgemein durchgesetzt [HAESV, LER (2), A~ERr~E (3)]. L/~ngere Zeit war dies ]edoch strittig. WiiSTE~-FEL]) und LUCKOW schrieben 1929 auf der HShe dieser Auseinandersetzungen (4), dab f/ir die Gfite und Echtheit eines Brennereierzeugnisses die ge- schmaekliche und geruchliehe Priifung dutch einen Saehverst/indigen ausschlaggebend sei. Under den Vertretern der gegenteiligen Meinung, dab allein die analytischen Zahlen Sicherheit bei der Beurteilmlg gaben, befinden sieh u. a. BOTTLER und MIERMEISTV.R (5). Aueh in jiingster Zei~ ist immer wieder versucht worden, yon den Ergebnissen organoleptischer Priifungen nach und nach unabh~ngig zu werden. D~bei ist bekannt (6, daselbst S. 80--84), dab man diese Unter- suehungen so gestalten kann, dab ihre Ergebnisse den analytischen Zahlen an Genauigkeit gleieh- kommen. PA¥~AVD und L ~ o ~ (7) haben ans ihren Arbeiten gefolger~, dab der versehiedene Gehalt an Butandion-2,3 (Diacetyl), Butanol-2-on-3 (Acetoin) und Butandiol-2,3 (Dimethyl- glykol) ausreiche, um die versehiedenen Weinbrandarten zu charakterisieren. Analytische nnd organoleptische Ergebnisse siehern sich gegenseitig. GewiB mag Vervollkommnung und Neu- entwickeln analytiseher Me~hoden in der Zukunf~ einmal erm5glichen, yon der Organoleptik im Prinzip unabh/~ngig zu sein.Vorl/iufig ist es noch nicht so welt. Diese hypothetischen Zukunfts- methoden k6nnten aber derart aufwendig sein, dab sie aus wirbschaftlichen Grfinden vielleich~ nur in Sonderfgllen angewandt werden. Mit anderen WorSen: Der gesehulte Pr/ifer wird bflliger

* Anschrift des Verfassers: 5320 Bad Godesberg, Riingsdorferstr. 31.