Schwermetalle und Pflanzen - eine komplizierte Beziehung (II)

S h ll kk l i i ildSchwermetall-Hyperakkumulation im Wilden Westenmodified from:

Die Dosis macht das Gift - auch bei Schwermetallen!

Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität

Ein scheinbar intakter natürlicherEin scheinbar intakter, natürlicher Bachlauf - die Elodea canadensisdarin war jedoch an Zn-Vergiftung eingegangen, die ihr Chlorophyll ineingegangen, die ihr Chlorophyll in Zn-Chlorophyll umgewandelt hatte.

Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295), 259-66

Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität (II)

Wo? Wodurch? Für Wen?

• Natürlicherweise auf schwermetallhaltigen BödenNatürlicherweise auf schwermetallhaltigen Böden (Cu: z.B. in Zaire, Afrika; Zn/Cd: rel. häufig, auch in Mitteleuropa; Nickel: rel. häufig, Serpentinböden z.B. in Afrika Australien Nord und Mittelamerika): Schwermetallkonzentrationen hochin Afrika, Australien, Nord- und Mittelamerika): Schwermetallkonzentrationen hoch genug für Toxizität gegen die meisten Organismen.

• Natürlicherweise in kupferhaltigen Bereichen der Ozeane (z.B. Sargasso-See):Natürlicherweise in kupferhaltigen Bereichen der Ozeane (z.B. Sargasso See): Kupferkonzentrationen im nanomolaren Bereich hemmen bereits empfindliche Cyanobakterien.

• Anthropogen wegen Einsatzes von Schwermetallsalzen (z.B. CuSO4, z.B. Zn-Phosphid, Zn-Borat, Zn-Fluosilikat): Konzentrationen im mikromolaren Bereich sind toxisch für viele Pflanzen, v.a. Wasserpflanzen in , pangrenzenden Gewässern

• Anthropogen durch Erz-Abbau und -Verhüttung, Konzentrationen in der Umgebung von Minen, Hütten und Abraumhalden können extrem hoch und für alle Organismen toxisch sein.

Anthropogen in geringerem Umfang auch durch andere Industrien Der Rhein enthielt• Anthropogen in geringerem Umfang auch durch andere Industrien. Der Rhein enthielt in den 70er Jahren bis zu 0.5 µM Kupfer, was für empfindliche Wasserpflanzen wie Stratiotes, Ceratophyllum oder Elodea bei längerer Einwirkung letal ist.

Wirkungsmechanismen von Schwermetall-Toxizitätund Resistenz-Mechanismen, die diese gezielt verhindern, g

--> Hemmung der Wurzelfunktion

--> direkte Hemmung der Photosynthese direkte Hemmung der Photosynthese

--> oxidativer Stress, entweder direkt durch die Schwermetall hervorgerufen oder durch dieSchwermetall hervorgerufen oder durch die Fehlfunktion der Photosynthese induziert.

--> Substitution von aktiven Zentren in Enzymen

--> Hemmung der Atmung und anderer weniger g g gsensitiver Prozesse

1. Hemmung der Wurzelfunktion

Warum Wurzeln?

• Bei terrestrischen Pflanzen ist die Wurzel generell das erste Organ der Pflanze, das mit den Schwermetallen in Berührung kommtmit den Schwermetallen in Berührung kommt.

• Bei Schwermetallen mit relativ geringer Mobilität, z.B. Cu+, werden auch die höchsten Konzentrationen in der Wurzel erreichtKonzentrationen in der Wurzel erreicht

MechanismenMechanismen

• Kompetition in der Aufnahme mit weniger verfügbaren essentiellen Spurenelementen, da z.T. von denselben Proteinen transportiert: umstritten da widersprüchliche Datenp p

• Vermutlich Hemmung von Transportproteinen

• Diverse relativ unspezifische Inhibierungen von cytoplasmatischen Enzymen• Diverse relativ unspezifische Inhibierungen von cytoplasmatischen Enzymen

• Hemmung der Zellteilung (Wirkmechanismus unbekannt)

Also Folge der Wurzeltoxizität sterben zunächst die Wurzelhaare und Wurzelspitzen ab• Also Folge der Wurzeltoxizität sterben zunächst die Wurzelhaare und Wurzelspitzen ab

1. Hemmung der Wurzelfunktion:Resistenzmechanismen

Strategien

• Verringerung der unspezifischen Durchlässigkeit der Wurzel für unerwünschte Schwermetalle: Expression von Peroxidasen verstärkt Lignifizierung

Akti (ATP bhä i ) A hl d h Effl P W d fü C i Sil• Aktive (ATP-abhängige) Ausschleusung durch Efflux-Pumpen: Wurde für Cu in Silene vulgaris und für diverse Metalle in Bakterien gefunden.

2. Direkte Hemmung der Photosynthese2.1. Angriffspunkte in den photosynthetischen

Lichtreaktionen

P700*

heavy metals

P700* A0 A1Antenna Chl-protein

P680* PheoQA QB ChlPQ

Chl-protein complexes,

main protein:LHCII

EChlChlPQ FeS/

Rieskeelectron transport

LHCII4 h·ν

P700PC

p

excitationChl

ChlChl

P680

excitation energy transfer

2 H2O O2 + 4 H+WSC 4 e

-

2.1. Der Mechanismus der Hemmung der photosynthetischen Lichtreaktionen ist in Chlorophyta lichtabhängig

“Schatten-Reaktion”Bei geringer Lichtintensität mit einer

p y g g

Bei geringer Lichtintensität mit einer Nachtphase ist der größte Teil der Antennenchlorophylle (v.a. LHCII) der Mg-Substitution zugänglich. Werden dabeiSubstitution zugänglich. Werden dabei stabile Schwermetallchlorophylle wie z.B. Kupferchlorophyll gebildet, bleiben die Pflanzen auch nach ihrem Absterben

“S R kti ”

grün.

“Sonnen-Reaktion”In hoher Lichtintensität ist dagegen nur ein kleiner Anteil der Chlorophylle der Mg-Substitution zugänglich statt dessenSubstitution zugänglich, statt dessen findet die Hemmung direkt im PSIIRC statt. Der größte Anteil der Chlorophylle bleicht im Zusammenhang mit derbleicht im Zusammenhang mit der Zerstörung des Photosyntheseapparates aus.

Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58, 125-33

Warum sind Schwermetallchlorophylle untauglich zur Photosynthese?y

• Instabiler S1-Zustand

• Blauverschobene Absorptionsbande des S1-Zustandes• Blauverschobene Absorptionsbande des S1-Zustandes

• Wegen der vorgenannten Gründe wirken Schwermetallchlorophylle in einem Mg-Chl-basierten System als „schwarze Löcher“ für Anregungsenergiey „ g g g nur wenige (3-10) Prozent des Gesamtchlorophylls müssen in Schwermetallchlorophyll umgewandelt werden, um komplette Hemmung der Photosynthese zu erreichenPhotosynthese zu erreichen.

• Schwermetall-Chlorophylle haben eine geringere Tendenz als Mg-Chl, eine Ladungstrennung durchzuführen.g g

• Schwermetall-Chlorophylle binden, im Gegensatz zu Mg-Chl, axiale Liganden nur schwach (z.B. Zn-Chl) oder gar nicht (Cu-Chl)

Hemmung des PSIIRC

Diskutierte Mechanismen

Hemmung des wasserspaltenden• Hemmung des wasserspaltenden Komplexes

• Hemmung der primärenHemmung der primären Ladungstrennung:- durch Bindung ans D1-Protein

durch Insertion ins Pheophytin- durch Insertion ins Pheophytin

• Hemmung des Elektronentransports- durch Bindung an Qa-Domänedurch Bindung an Qa Domänedes D1-Proteins- durch Bindung an nicht-Häm-Fe-Dömäne des D1 ProteinsDömäne des D1-Proteins

2.2. Hemmung der Dunkelreaktionen der Photosynthese(Calvin-Cyclus)( y )

• Indizien aus Messungen der Chlorophyll-Fluoreszenz-Kinetik

• Mechanismus und Bedeutung unklar

3. Oxidativer Stress

Bedeutung

• Umstritten: Studien mit geringen aber noch toxischen Schwermetall Konzentrationen• Umstritten: Studien mit geringen aber noch toxischen Schwermetall-Konzentrationen zeigen oft keinen oxidativen Stress

Mechanismen

• Direkt: Katalysiert von redox-aktiven Metallionen (Fe2+ Cu+) werden ausDirekt: Katalysiert von redox aktiven Metallionen (Fe , Cu ) werden aus Wasserstoffperoxid durch die Fenton-Reaktion reaktive Sauerstoff-Radikale:

populärer aber in vivo höchstwahrscheinlich irrelevanter Mechanismus.

• Indirekt: Durch Fehlfunktion der Photosynthese und Atmungskette können reaktive Sauerstoff-Spezies entstehen. Deswegen kann auch bei in vivo redox-inerten Metallionen wie Zn2+ und Cd2+ oxidativer Stress auftreten Vermutlich der NormalfallMetallionen wie Zn2+ und Cd2+ oxidativer Stress auftreten. Vermutlich der Normalfall.

• Oxidativer Stress kann zur Oxidation von Lipiden in Membranen und somit zu deren Undichtigkeit führen. Populärer aber in seiner Bedeutung in vivo umstrittenerUndichtigkeit führen. Populärer aber in seiner Bedeutung in vivo umstrittener Mechanismus.

3. Resistenzmechanismen gegen oxidativen Stress

• Verstärkte Expression von Enzymen, die reaktive Sauerstoffspezies entgiften (S id Di K l P bl H d Z A f h (SOD) b i(Superoxid-Dismutase+Katalase. Problem: Hemmung der Zn-Aufnahme (SOD) bei Cd-Stress.

• Synthese von nicht Enzym Antioxidantien z B Ascorbat und Glutathion• Synthese von nicht-Enzym-Antioxidantien, z.B. Ascorbat und Glutathion

• Umbau der Zellmembranen, um sie resistenter gegen den Angriff von reaktiven Sauerstoff-Spezies zu machen: - Lipide mit weniger ungesättigten Bindungen- Lipide mit weniger ungesättigten Bindungen- Austausch von Phosphatidylcholin durch Phosphytidyl-Ethanolamin als Lipid-“Kopf“- Verringerter Anteil von Lipiden und erhöhter Anteil von stabilisierenden Proteinen in der MembranMembran

4. GenotoxizitätRelevanzRelevanz

Hängt STARK vom Metall ab:

NICHT l t fü K f d Zi k• NICHT relevant für Kupfer und Zink-Toxizität, weil andere Mechanismen (v.a. Photosynthese-Hemmung) VIEL

ant

effizienter sind

• SEHR relevant für Arsen, da effizient -d M h i hi i o

ts p

er p

la

andere Mechanismen hier wenig erforscht.

• Relevant für Cadmium da ähnlich atio

ns: s

po

• Relevant für Cadmium, da ähnlich effizient wie Photosynthese-Inhibition

• Nicht sehr effizient für Blei, aber andere Poin

t mut

a

,Mechanismen der Toxizität sind hier bei Pflanzen noch weniger effizient Pb-Toxizität für Pflanzen ist generell NICHT

P

Toxizität für Pflanzen ist generell NICHT umweltrelevant!

Hängt auch von der Pflanzenart ab!gFrom: Kovalchuk O, Titov V, Hohn B, Kovalchuk I, 2001, Nature

Biotechnol. 19, 568-72

5. Allgemeine Resistenz-Mechanismen5 1 S h t ll E t ift it t k Li d5.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden

PhytochelatinePhytochelatine

• Binden mit sehr hoher Affinität Cd2+, andere Metallionen aber wenig

S C 2 S• Speziell zur Cd2+-Bindung synthetisiert von Phytochelatin-Synthase

• Sind der wichtigste Cd-Resistenzmechanismus in den meisten Pflanzen (außerHyperakkumulatoren) und vielen TierenHyperakkumulatoren) und vielen Tieren

• Phytochelatin-Synthase wird von (z.B. durch Cd-Bindung) blockierten Thiolen von Glutathion und ähnlichen Peptiden aktiviertGlutathion und ähnlichen Peptiden aktiviert

• Phytochelatine binden Cd2+ im Cytoplasma, dann Tranport des Komplexes in die Vakuole.

• In der Vakuole bilden sich große Phytochelatin-Cd-Aggregate

5. Allgemeine Resistenz-Mechanismen

5.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden

Freie Aminosäuren

• Wie beim Metalltransport unter normalen physiologischen Bedingungen, scheinen freieWie beim Metalltransport unter normalen physiologischen Bedingungen, scheinen freie Aminosäuren (v.a. Histidin+Nicotianamin) eine Rolle bei der Entgiftung von Schwermetallen zu spielen.

Metallothionine

• MTs vom Typ I und II binden mit sehr hoher• MTs vom Typ I und II binden mit sehr hoher Affinität Cu2+ und scheinen an dessen Entgiftung beteiligt zu sein.

• Aber: Hauptrolle der MTs in Pflanzen vermutllich Metall-Verteilung während des normalen (nicht-gestressten) Stoffwechselsgestressten) Stoffwechsels

5.2. Schwermetall-Entgiftung durch Kompartimentierung

Mechanismen

• Generell: aktive Transportprozesse gegen den Konzentrationsgradienten Transportproteine beteiligt.

• Ausschluss aus der Zellen:in Algen: bei Braunalgen beobachtet- in Algen: bei Braunalgen beobachtet

- in Wurzeln: siehe Wurzeln

• Einlagerung in die Vakuole:Einlagerung in die Vakuole: - Pflanzen-spezifischer Mechanismus (Tiere haben keine Vakuolen...)- sehr wirksam, da die Vakuole keine zu hemmenden Enzyme enthält

spart den Aufwand der Synthese von starken Liganden wie Phytochelatinen- spart den Aufwand der Synthese von starken Liganden wie Phytochelatinen - wichtigster Mechanismus in Hyperakkumulatoren

• Einlagerung in wenig sensitive Gewebe, z.B. Epidermis ohne statt Mesophyll mitEinlagerung in wenig sensitive Gewebe, z.B. Epidermis ohne statt Mesophyll mit Photosynthese

Cadmium zu allen Mahlzeiten: Pflanzen mit einem ungewöhnlichen Appetit

Schwermetall-Hyperakkumulation

--> Biologische Funktion der Hyperakkumulation

--> Mechanismen der Hyperakkumulation Mechanismen der Hyperakkumulation

--> Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung und zur Erzgewinnung

Schwermetall-Aufnahme-Charakteristika verschiedener Pflanzentypen

Effekte von Ni2+ auf das Wachstum und Ni2+ -Konzentrationen im Sproßp

(a)14 Thlaspi goesingense

Alyssum bertolonii

(b)30000

Thlaspi goesingense

ight

(g)

8

10

12 Alyssum bertoloniiAlyssum lesbiacum

on (µ

g g-

1 )

20000

25000Thlaspi goesingenseAlyssum bertoloniiAlyssum lesbiacum

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dry

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4

6

8

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tio

10000

15000

Sh

0

2

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0

5000

Ni added to the substrate (mg kg-1)

0 1000 2000 3000 4000

Ni added to the substrate (mg kg-1)

0 1000 2000 3000 4000

Alyssum lesbiacum

Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365), 2291-2300

Komplexierung von Cadmium&Zink vs. Kupferim Cd/Zn-Hyperakkumulator Thlaspi caerulescens (Ganges)yp p ( g )

hyperaccumulated non-accumulated

Hyperakkumulierte Metalle durch SCHWACHE Liganden (Wasser, org. Säuren), nicht-akkumulierte Schwermetalle durch STARKE Liganden (PC, MT, NA) gebunden

Cd: Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2003) Plant Physiology 134 (2), 748-757Cu: Mijovilovich A, Leitenmaier B, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH, Götz B, Küpper H (2009)

Plant Physiology 151, 715-731

Kompartimentierung der Metalle in BlätternZn/Cd/Ni -Akkumulation in Epidermis- Vakuolen p

von Thlaspi und Alyssum -ArtenCompartmentation in leaves of Thlaspi caerulescens Alyssum bertoloniiCompartmentation in leaves of Thlaspi caerulescens Alyssum bertolonii

6

8 young leaves

mM

Ca

2

4

mM

/ m

8mature leaves

Zn Mg P S Cl K0

4

6

8

M /

mM

Ca

Zn Mg P S Cl K0

2mM

gupper epidermis upper mesophylllower mesophyll lower epidermis

Concentrations of elements Zn K α line scan and dot map Ni K α line scan and dot map in leaf tissues of a T. caerulescens leaf of a A. bertolonii leaf

Zn: Küpper H, Zhao F, McGrath SP (1999) Plant Physiol 119, 305-11Ni: Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365), 2291-2300

Cd-transport in Protoplasten isoliert aus dem Cd/Zn Hyperakkumulator Thlaspi caerulescensyp p

In fast allen gemessenen Zellen wurde zugegebenes Cd während

Erst nach längerer Zeit (>1h) reicherte sich das Cd vorwiegend in d V k lder ersten 15-60 min im

Cytoplasma angereichertder Vakuole an.

Der Transport in die Vakuole ist der geschwindigkeitslimitierende Schritt derDer Transport in die Vakuole ist der geschwindigkeitslimitierende Schritt der Metallaufnahme!

Leitenmaier B, Küpper H (2010) Plant Cell & Environment DOI: 10.1111/j.1365-3040.2010.02236.x

Cd-Stress im Zn-/Cd-hyperakkumulator T. caerulescens: Verteilung von Photosystem II-Aktivitätg y

30

T. caerulescens

C 20

T. fendleri

A

0

10

20

Con

trol

0

10

Con

trol

0

10

20 D

esse

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0

10

20 B

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d

Cellular Fv/Fm distribution in a control plant 0

Stre20 E

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Str

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0

10

Accl

imat

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10

20 F

clim

ated

Distribution of Fv/Fm in a Cd-stressed plant

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

Fv / Fm

Acc

p

Küpper H, Aravind P, Leitenmaier B, Trtilek M, Šetlík I (2007) New Phytologist 175, 655-674

Regulation der ZNT1-Transkription analysiert durch quantitative mRNA in situ-Hybridisierung (QISH)q y g ( )

in einer nicht-hyperakkumulierenden und einer hyperakkumulierenden Art 10 µM Zn2+ Thlaspi caerulescens10 µM Zn2+ Thlaspi arvense

0.5

10 µM Zn Thlaspi arvense 1 µM Zn2+ Thlaspi arvense

0 3

0.4

(18s

rRN

A)

0.2

0.3

mR

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) / c

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0.1c(ZN

T1

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epide

rmal

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Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187

epide

rmep

id

Quantitative cellular pattern of ZNT5 transcript abundance in young leaves of Thlaspi carulescens (Ganges ecotype)

Das Expressionsmuster in der Epidermis deutet auf eine zentrale Rolle voneine zentrale Rolle von ZNT5 bei der Hyperakkumulation von Zn hin.

Küpper H, Kochian LV (2010) New Phytologist 185, 114-129

Reinigung und Characterisierung einer Zn/Cd transportierenden P1B-typ ATPase aus natürlicher

Scheme from:

p 1B ypÜberexpression in Thlaspi caerulescens

Solioz M, Vulpe C (1996) TIBS21,

237-41

T [°C]

Parameswaran A, Leitenmaier B, Yang M, Welte W, Kroneck PMH, Lutz G, Papoyan A, Kochian LV, Küpper H (2007) BBRC 364, 51-Leitenmaier B, Witt A, Witzke A, Stemke A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH, Küpper H (2010) submitted to Biochemistry

Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung:Phytoremediationy

Aufnahme des Metalls in Hyperakkumulatoren. Nach diesem Prozess ist das Metall durch den hohen Bioakkumulations-Koeffizienten der Hyperakkus in einem viel kleineren Volumen konzentriert. Die geerntetenVolumen konzentriert. Die geernteten Pflanzen werden verbrannt; die Asche wird entweder deponiert oder erneut zur Metallgewinnung eingesetzt.

Pflanzenart Max. Cd Biomasse Cd-Entfernungmg/kg DW t DM/ha g/(ha*Jahr)

Arabidopsis halleri 100 2 200Thlaspi caerulescens (Prayon) 250 5 1250Thlaspi caerulescens (S. France) 2500 5 12500Thlaspi caerulescens (S. France) 2500 5 12500Dichapetalum gelonoides 2.1 5 10Athyrium yokosense 165 2 330Arenaria patula 238 2 476S d lf dii 180 5 900Sedum alfredii 180 5 900Weide/Pappel 2.5 20 50Upland Rice 40. 10 400

Daten aus Feldexperimenten von Rufus Chaney (USA) präsentiert auf Konferenz in Hangzhou 2005Daten aus Feldexperimenten von Rufus Chaney (USA), präsentiert auf Konferenz in Hangzhou 2005

Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Metallgewinnung:Phytomining

Vegetation auf natürlich nickelreichem Boden (Serpentin). Solcher Boden ist weder für die Landwirtschaft (Ni-Konz.

y g

viel zu hoch) noch für die konventionelle Erzgewinnung tauglich (Ni-Konz zu niedrig).

Werden Nickel-Hyperakkumulatoren auf solchen Böden angebaut, reichern sie mehrere Prozent ihrer Trockenmasse an Nickel an NachTrockenmasse an Nickel an. Nach Verbrennung enthält die Asche 10 bis 50% Nickel, so dass sie als “Bio-Erz” genutzt werden kann.

So eine “Pflanzenmine” kann, Phytomining pictures from R. ChaneyFeldstudien unter kommerziell anwendbaren Bedingungen zufolge, etwas 170 kg Nickel pro Hektar und Jahr produzieren Beim derzeitigen (10 12 09)produzieren. Beim derzeitigen (10.12.09) Nickelpreis von ca 11 € pro Kilo Rohnickel sind das fast 2000 €.ha-1.

Alle Folien meiner Vorlesungen, ebenso wie Informationen über die Arbeitsgruppe im Internet unterüber die Arbeitsgruppe, im Internet unter

http://www.uni-konstanz.dehttp://www.uni konstanz.de/FuF/Bio/kuepper/Homepage/AG Kuepper education.html/ G_ ueppe _educa o

(auch zu finden über Homepage der Biologie Arbeitsgruppen ( p g g g ppKüpper)

weiterführende Literatur als pdf auf Anfrage

Interesse an Biochemie&Biophysik der Pflanzen im allgemeinen, und/oder Metallstoffwechsel bekommen?

Bei uns gibt’s 2 Bachelorplätze (zeitlich flexibel) und

5 Plät i V ti f k “Bi h i & Bi h ik d Pfl ”5 Plätze im Vertiefungskurs “Biochemie & Biophysik der Pflanzen” (1. Hälfte Sommersemester)