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CAROLINE BLUMER TOTI, VOLKER NÖLLE

MILTENYI BIOTEC GMBH, BERGISCH GLADBACH

The demand for high grade recombinant proteins is growing. Especially inthe field of cell-based therapies, all materials used, including cytokinesand growth factors must comply to the highly demanding GMP specifica-tions. We show how essential protein parameters are monitored toensure consistent high product quality using the cytokine interleukin-4 asan example.

DOI: 10.1007/s12268-014-0409-2© Springer-Verlag 2014

ó Die Qualität rekombinanter Proteine wirddurch viele Faktoren während der Herstel-lung beeinflusst. Um eine konstant gleich-bleibende Qualität zu gewährleisten, ist esunerlässlich, verschiedene analytische undfunktionelle Parameter zu erfassen. Diesekönnen zum Monitoring während der Pro-zessentwicklung sowie als Prüfmethoden zurProduktfreigabe verwendet werden. Zuneh-mend werden komplexe analytische Metho-den auch zur Qualitätsprüfung bei rekombi-nanten Zytokinen und Wachstumsfaktoreneingesetzt, welche als Zusätze in Zellkultu-ren verwendet werden, um beispielsweise pri-märe Immunzellen zu stimulieren und expan-dieren oder Stammzellen zu differenzieren.Für solche Anwendungen ist in den letztenJahren der Bedarf nach hochwertigen Prote -inen gestiegen. Diese werden nicht nur für

Forschungsarbeiten, sondern auch im klini-schen Umfeld zur Produktion von Zellthera-peutika als sogenannte ancillary materials [1]eingesetzt. Im letzteren Fall müssen die Pro-teine gewissen regulatorischen Anforderun-gen genügen, was eine entsprechende analy-tische Kontrolle erfordert.

Wichtige Parameter zur Charakterisierungder Proteine umfassen u. a. die Identität, dieReinheit, der Gehalt an Wirtszellverunreini-gungen und nicht zuletzt die biologische Akti-vität. Zur Bestimmung dieser Parameter ste-hen meist mehrere Methoden zur Auswahl.Am Beispiel des humanen Interleukin-4 (IL-4) aus der Serie der MACS®-GMP-Zytokine(Miltenyi, Abb. 1) soll gezeigt werden, wel-che Verfahren geeignet sind, die Produkt-qualität mit hoher Genauigkeit zu überprü-fen und eine möglichst geringe Lot-zu-Lot-Varianz zu erreichen.

IL-4 wird in vivo vor allem durch eine Sub-population aktivierter T-Zellen (Th2) sezer-niert und führt u. a. zur Proliferation akti-vierter B- und T-Zellen. In vitro wird IL-4 ver-wendet, um aus Monozyten in Kombinationmit GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor) dendritische Zellen zugenerieren sowie naive CD4+-T-Helferzellenin Richtung Th2 zu differenzieren. Das hierbeschriebene IL-4 ist ein in Escherichia colifermentiertes und in einem mehrstufigenRückfaltungs- und Reinigungsprozess herge-stelltes Protein, welches abschließend in einer

speziellen Formulierung in Glasfläschchengefriergetrocknet wird, um eine hohe Lang-zeitstabilität zu gewährleisten.

IdentitätZur eindeutigen Bestimmung der Identität isteine Methode wie Western Blot nicht ausrei-chend, da eine mögliche Kreuzreaktivität desAntikörpers im Einzelfall keine sichere Zuord-nung ermöglicht. Stattdessen wird eine mas-senspektrometrische Analyse der Intaktmas-se durchgeführt, mit der sich auf wenige Dal-ton genau die molare Masse bestimmen lässt.Zusätzlich lässt sich die Existenz von Disul-fidbrücken recht genau ermitteln. Im Fall vonIL-4 sind im aktiven Protein drei Disulfid-brücken zu erwarten, wodurch sich die vor-hergesagte molekulare Masse des reduzier-ten Proteins um sechs Dalton auf 15.088,4Dalton verringert. Wie in Abbildung 2Aersichtlich, liegt die ermittelte Masse bei15.090 (+/–2) Dalton, was die Identität vonIL-4 bestätigt und den Hinweis liefert, dassdie Disulfidbrücken korrekt ausgebildet sind.Neben dem Produktpeak können weiterePeaks auftreten, wobei zwischen echten Pro-teinmodifikationen (z. B. Oxidation) unddurch die Methode/Reagenzien verursachtenArtefakten unterschieden werden muss: BeiIL-4 finden sich zusätzlich zwei um jeweils97 bis 98 Dalton schwerere Peaks, die einfa-che bzw. zweifache Addukte von Phosphat(H3PO4) an IL-4 darstellen und als gemeinsa-me Ionenpaare detektiert werden. Die Phos-phate stammen aus der Pufferformulierung.

ReinheitZur Bestimmung der Reinheit wird im Labor-maßstab gerne eine SDS-PAGE durchgeführt.Diese Methode erlaubt allerdings keine vali-de Quantifizierung von Produkt zu Verunrei-nigungen. Daher erfolgt die Reinheitsbe-stimmung von IL-4 mittels einer Chip-basier-ten Gelelektrophorese, die sowohl eine hoheGenauigkeit aufweist als auch eine digitaleQuantifizierung ermöglicht. Bei dieser Metho-de wird die Probe in Gegenwart von SDS miteinem fluoreszenten Farbstoff versetzt und

Zytokine

Sicherung der Produktqualität rekombinanter Wachstumsfaktoren

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˚ Abb. 1: MACS®-GMP-Zytokine in lyophili-sierter Formulierung

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in Mikrokanälen der Größe nach aufgetrennt,wobei die Detektion über das Fluoreszenz-signal erfolgt. Die chromatografische Dar-stellung in Form eines Elektropherogrammserlaubt eine Quantifizierung einzelner Peaks(Abb. 2B). Bei IL-4 erscheint neben einemsystembedingten Peak bei fünf Kilodalton derProduktpeak bei einem apparenten Moleku-largewicht von ca. 13 bis 14 Kilodalton (Mono-mer) sowie ca. 25 Kilodalton (Dimer). Aus derIntegration der Peaks wird die prozentualeReinheit (Produktpeakfläche im Verhältniszur totalen Peakfläche) errechnet. In diesemFall liegt die Reinheit bei 98,6 Prozent undsomit über der Mindestanforderung, die fürIL-4 mit 97 Prozent spezifiziert ist.

KontaminationenBedingt durch den Herstellprozess könnenVerunreinigungen aus den Wirtszellen in dasProdukt gelangen. Besonders kritisch sindEndotoxine und Wirtszell-DNA, da diese dieFunktion des zellulären Produktes beein-flussen können. Während der Endotoxinge-halt in einem anerkannten und standardi-sierten Verfahren der European Pharmaco-poeia (Ph. Eur.) mittels Limulus-Amöbozyten-Lysat(LAL)-Test bestimmt werden kann, istbei der Auswahl der Methode zur Wirtszell-DNA-Bestimmung Vorsicht geboten, da sichdie möglichen Prüfverfahren hinsichtlichZuverlässigkeit und regulatorischer Akzep-tanz unterscheiden. Im industriellen undregulatorischen Umfeld haben sich der Threshold™-Assay (Molecular Devices) unddie quantitative PCR (qPCR) als akzeptierteStandards etabliert. Für IL-4 wurde dement-sprechend eine qPCR-Methode entwickelt, dieden Gehalt an E. coli-DNA quantifiziert. InAbbildung 3A ist exemplarisch das Ergebniseines qPCR-Laufs gezeigt, bei dem DNA-Stan-dards im Bereich von 30 pg/ml bis 3 μg/mlsowie die eigentliche Probe amplifiziert wur-den. Unter Berücksichtigung von Verdün-nungsfaktoren ergibt sich für IL-4 ein DNA-Gehalt von < 1 ng DNA/Fläschchen, was beieinem Proteingehalt von 250 μg IL-4 einemGehalt von < 4 pg DNA/μg IL-4 entspricht.

Biologische AktivitätFür den Anwender entscheidend ist die bio-logische Aktivität des Zytokins. Diese wirdin einem zellbasierten Assay bestimmt undüblicherweise in Form der spezifischen Akti-vität (Units pro mg Protein) angegeben. Aller-dings gilt diese Angabe nur genau für diesenAssay und die Bedingungen, unter der dieserdurchgeführt wurde, sodass ermittelte Akti-

vitäten zunächst nicht vergleichbar sind.Daher wird der Assay mittels eines Refe-renzstandards kalibriert, um eine Lot-zu-Lot-Vergleichbarkeit zu schaffen. Für IL-4 wurdeein Proliferationsassay mithilfe von IL-4-abhängigen TF-1-Zellen entwickelt [2]. Beider Bestimmung der lotspezifischen Aktivitätwird der Assay gegen den WHO InternationalStandard NIBSC 88/656 (1st standard for Inter-leukin-4) [3] kalibriert. Um zu verdeutlichen,dass eine Kalibrierung durchgeführt wurde,wird das Messergebnis in InternationalenUnits (IU) angegeben. Das Ergebnis einer sol-chen Aktivitätsbestimmung ist in Abbildung

3B dargestellt, wobei der Mittelwert aus vierEinzelmessungen dargestellt ist. Aus der ge -mittelten Kurve wurde die IL-4-Konzentrationder halbmaximalen Aktivierung (ED50, ng/ml)bestimmt und in U/ml umgerechnet. Parallelwurde der IL-4-Referenzstandard NIBSC88/656 vermessen und mittels der dafürerhaltenen Aktivität der Assay kalibriert.Zudem wurde der Proteingehalt (mg) nachBradford bestimmt. Aus diesen Werten ergabsich für IL-4 eine kalibrierte spezifische Akti-vität von 1,2 E + 07 IU/mg.

Für die Verwendbarkeit des finalen Pro-duktes als ancillary material (z. B. MACS-

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˚ Abb. 2: Identitäts- und Reinheitsprüfung der MACS®-GMP-Zytokine. A, Massenspektrometri-sche Analyse mittels ESI-MS (Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie). Die rechnerischemolekulare Masse von IL-4 beträgt 15.088,4 Dalton. Neben dem reinen Produktpeak bei15.090 Dalton sind Phosphataddukte bei 15.187 und 15.285 Dalton zu erkennen. B, Reinheits -analyse mittels chipbasierter Gelelektrophorese (Agilent Bioanalyzer). Die unverdünnte IL-4-Probeweist unter diesen Bedingungen ein apparentes Molekulargewicht von ca. 13 bis 14 Kilodalton(Monomer) sowie ca. 25 Kilodalton (Dimer) auf. Das Signal bei fünf Kilodalton ist ein systembe-dingter Peak.

A

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GMP-Zytokine) werden weitere Prüfungen aufbeispielsweise Sterilität nach der EuropeanPharmacopoeia sowie Langzeitstabilitätsstu-dien durchgeführt. Die entsprechende Doku-mentation zum Produkt wird dem Anwenderin Form eines produkt- und lotspezifischenAnalysenzertifikats (Certificate of Analysis)zur Verfügung gestellt.

FazitDie Sicherung der Produktqualität ist auf-wendig, bietet dem Anwender aber dieGewissheit, immer ein gleichbleibend gutesProdukt zu erhalten, und ist für die Herstel-lung von zellulären Produkten im klinischenUmfeld unerlässlich. Nicht zuletzt wird eineanalytische Qualitätssicherung auch bei Zyto-kinen für Forschungszwecke angewendet. Fürden Anwender ist so sichergestellt, dass einsolches wie auch das entsprechende MACS-GMP-Zytokin möglichst ähnliche Produktei-genschaften aufweisen und sich in der zellu-lären Anwendung geringstmöglich unter-scheiden. ó

Literatur[1] U.S. Pharmapopeial Convention (2006) AncillaryMaterials for Cell, Gene, und Tissue-Engineered Products. In:U.S. Pharmacopedia 29, Kapitel 1043:2814–2821. www.usp.org[2] Kitamura T, Takaku F, Miyajima A (1991) IL-1 up-regula-tes the expression of cytokine receptors on a factor-dependenthuman hemopoetic cell line, TF-1. Int Immunol 3:571–577[3] National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC), Potters Bar, Hertfordshire, EN6, 3QG, UK

Caroline Blumer Toti und Volker Nölle

Korrespondenzadresse:Dr. Caroline Blumer TotiMiltenyi Biotec GmbHFriedrich-Ebert-Straße 68D-51429 Bergisch GladbachTel.: 02204-8306-2200Fax: 02204-8306-85197carolineb@miltenyibiotec.dewww.miltenyibiotec.com

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˚ Abb. 3: Wirtszell-DNA-Nachweis und Bestimmung der biologischen Aktivität der MACS®-GMP-Zytokine. A, Amplifikationskurven residualer Escherichia coli-DNA mittels qPCR. Gezeigt sind dieFluoreszenzsignale der Sonden gegen die Zyklenzahl. Die DNA-Standards (3 μg/ml bis 30 pg/ml)weisen Zyklus-Schwellenwerte (Ct-Werte) im Bereich von 12 bis 32 auf, während die IL-4-ProbenCt-Werte größer als 35 ergaben. B, Biologische Aktivitätskurve. TF-1-Zellen wurden in einem vier-fachen Ansatz mit unterschiedlichen Konzentrationen an IL-4 inkubiert und die Proliferationsratekolorimetrisch mithilfe eines Reagens zur Bestimmung viabler Zellen ermittelt, dargestellt sindMittelwerte. Die Abhängigkeit der Zellproliferation wurde optisch bei 490 nm erfasst und gegenden Logarithmus der eingesetzten Konzentration des Zytokins aufgetragem. Zusätzlich wurde derIL-4-Referenzstandard NIBSC 88/656 vermessen und mittels der dafür erhaltenen Aktivität derAssay kalibriert.

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