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Skript zum Vortrag über
Konfokale Mikroskopie
Seminar „Laserphysik“
SoSe 2007
03.Juli.2007
Christine Derks
Universität Osnabrück
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Lichtmikroskop
2 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop
2.1 Laser-Scanning-Mikroskop
2.2.1 Lichtquelle
2.2.2 Die konfokale Blende
2.2.3 Optik
2.2.4 Signalverarbeitung
2.3 Optische Schnitte
2.4 Reflexionsmodus
2.4.1 Reflexionsmodus Beispiele
2.5 Fluoreszenzmodus
2.5.1 Fluoreszenzmodus Beispiele
3 Auflösungsvermögen
3.1 Point-Scattering-Funktion
3.2 Geometrisch optische Konfokalität
3.3 Wellenoptische Konfokalität
4 Konfokale Mikropskope
4.1 Konfokales Weißlichtmikroskop
4.2 Nipkow-Mikroskop
5 Zusammenfassung
6 Quellen
7 Abbildungsverzeichnis
3
1 Einleitung
Das konfokale Prinzip wurde 1955 von Marvin Minsky entwickelt.
Marvin Minsky wurde am 9.August.1927 in New York geboren, er machte
1950 seinen Bachelor in Mathematik an der Universität in Harvard und vier
Jahre später seinen Doktor in Mathematik in Princeton. Seit 1958 ist er
Mitglied im MIT (Massachusetts Institute of Technology). Dort forscht und
lehrt er heute noch auf dem Gebiet der künstlichen Intelligenz.
1.1 Lichtmikroskop
Um die Besonderheiten der konfokalen Mikroskopie herauszuarbeiten,
werden vorher die Funktionsweise und Schwäche eines handelsüblichen
Lichtmikroskops beschrieben.
Abbildung 01: Strahlengang eines Lichtmikroskops
Das Objekt wird durch das Objektiv und das Okular optisch abgebildet,
indem das Objektiv zuerst ein echtes Zwischenbild vom Objekt erzeugt,
das dann durch das Okular betrachtet werden kann.
Die Fokusebene wird dabei scharf abgebildet, leider wird diese Ebene von
anderen Ebenen überlagert. Diese werden zwar unscharf abgebildet,
verschlechtern aber die Tiefenschärfe der fokussierten Ebene. Aus diesem
Grund darf die Dicke der Probe die Tiefenschärfe des Mikroskops nicht
übersteigen.
Eine Lösung für dieses Problem liefert das konfokale Prinzip, durch das
Einführen einer konfokalen Blende. Die Funktionsweise dieses Prinzips
wird im Folgenden am Beispiel des konfokalen Laser-Scanning-
Mikroskops (CLSM) erklärt werden.
4
2 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop
Es gibt drei Mikroskoparten in denen das konfokale Prinzip hauptsächlich
verwendet wird, dazu gehören, das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop,
das konfokale Weißlichtmikroskop und das Nipkow-Mikroskop. Sie
unterscheiden sich nur in Details. Aus diesem Grund wird das CLSM im
Weiteren ausführlich beschrieben. Im Anschluss daran wird auf die
Unterschiede zu den anderen Mikroskopen eingegangen.
2.1 Laser-Scanning-Mikroskop
Abbildung 02: Schematischer Aufbau eines Laser-Scanning-Mikroskops
Aufbau
Ein Laser-Scanning-Mikroskop besteht aus einem Laser, einer konfokalen
Anregungslochblende, einem Farbteiler, Scan-Spiegeln, einem Objektiv,
einer konfokalen Detektionslochblende, einem Detektor und einem
Kontrollsystem. Diese Bestandteile werden so wie in Abbildung 02
angeordnet.
5
Funktionsweise/Überblick
Der entscheidende Unterschied zwischen einem Lichtmikroskop und
einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop besteht darin, dass
zusätzlich zwei konfokale Blenden in den Strahlengang gebracht werden.
Sie verhindert, dass Licht, das außerhalb der Brennebene des
Laserstrahls liegt den Detektor erreicht. In Abbildung 03 liegt die
Brennebene in der roten Schicht, das Licht das aus der blauen oder
grünen Schicht kommt, kann die Blende nicht passieren, da der Fokus
nicht exakt auf Höhe der Blende liegt.
Abbildung 03: Strahlengang eines Konfokalen-Laser-Scanning-Mikroskops
Ein Laser wird als Anregungslichtquelle verwendet und auf die
Anregungslochblende fokussiert. Ein geeigneter Farbteiler (in Abbildung
02 Dichroischer Spiegel) reflektiert einen großen Teil der Intensität dieses
Strahls. Er trifft auf zwei bewegliche Spiegel, die ihn durch das Objektiv
auf das Objekt abbilden.
Die Lochblende ist so klein gewählt, dass ihr Bild in der Objektebene
beugungsbegrenzt ist. Das vom Objekt emittierte Fluoreszenz- oder
Reflexionslicht wird wieder durch das Objektiv gesammelt und über den
Scannspiegel zurück auf den Farbteiler abgebildet und auf eine
Detektionslochblende abgebildet. Dahinter befindet sich ein Lichtdetektor,
6
der das vom Objekt emittierte Licht farbselektiv misst. Dieser Lichtdetektor
wird durch einen Photomultiplier realisiert. In dieser Anordnung wird das
Bild Punktweise abgebildet.
Um ein Bild des gesamten Objektes zu erzeugen müssen die
übereinander liegenden Bilder der Anregungs- und Detektionslochblende
über das Objekt geführt werden. Das wird durch eine entsprechende
Ansteuerung der Scannspiegel erreicht. Dafür wird ein Laserstrahl in
Zeilen und Spalten über das Objekt geführt. Nur die Signale, die sich
genau in der Bildebene des Lasers befinden werden detektiert, denn sie
haben ihren Brennpunkt an der Lochblende. Alle anderen Strahlen, die in
tieferen oder höheren Schichten liegen, werden ausgeblendet. So können
verschiedene Schichten aufgenommen werden. Aus der dabei
entstehenden sequentiellen Folge von Signalen am Detektor kann dann
das Bild des Objekts digital rekonstruiert werden.
Das Laser-Scanning-Mikroskop kann mit zwei verschiedenen Moden
betrieben werden - von dem gewählten Modus hängt die geeignete Wahl
des Farbteilers ab.
2.2.1 Lichtquelle
Als Lichtquelle werden Laser verwendet, sie haben eine hohe Intensität
und lassen sich stark fokussieren. Deswegen sind sie für das CLSM
besonders gut geeignet. Verwendet werden Argon-Ionen-Laser mit
Wellenlängen von 488nmλ = und von 514,5nmλ = , ND YAG-Laser mit
532nmλ = , HeNe Gaslaser mit 543nmλ = oder Diodenlaser mit einer
Wellenlänge von 635nmλ = .
2.2.2 Die konfokale Blende
Der Laser wird auf die Probe fokussiert, trotzdem finden Reflexion und
Anregung auch in anderen Teilen der Probe statt. Das Objektiv bildet auch
diese unerwünschten Bildanteile ab, durch das Einfügen einer konfokalen
Blende in einer zum Objekt konjugierten Ebene, erreichen nur die
Informationen den Detektor, die ihren Fokus direkt in der Lochblende
haben. Alle anderen Bildanteile werden so ausgeblendet. Das ermöglicht
7
auch das betrachten dicker Präparate. Im Gegensatz zum Lichtmikroskop,
wo andere Ebenen das Bild überlagern. Vgl. Abbildung 4.
Abbildung 4: Vergleich des Strahlengangs eines Lichtmikroskops mit einem
CLSM.
Die Größe des Pinholes wird in Airy-Einheiten angegeben.
1,22
1AE
NA
λ⋅
= mit 2 2
2em exc
em exc
λ λ
λ
λ λ
⋅
=
+
emλ : Emissionswellenlänge
excλ : Anregungswellenlänge
Die Größe des Pinholes hat einen entscheidenden Einfluss auf das
Auflösungsvermögen. Er wird in Abschnitt 3 ausführlich erläutert.
2.2.3 Optik
Der Farbteiler oder Strahlteiler sorgt durch seine Transmissions- und
Reflexionseigenschaften dafür, dass das vom Objektiv abgebildete Signal
aus dem Verlauf des Laserstrahls ausgekoppelt wird. Für unterschiedliche
Betriebsmoden müssen dabei unterschiedliche Kriterien erfüllt werden.
Beispiele dafür werden bei der Erklärung dieser unterschiedlichen Moden
gegeben.
8
Die Scannspiegel werden benötigt um den fokussierten Laserstrahl in der
x-y-Ebene über die Probe zu führen, damit nacheinander die
Informationen einer ganzen Ebene der Probe detektiert werden. Sie
können dann mit einer geeigneten Software zu einem Bild der
Probenebene zusammengesetzt werden.
Ein Linsensystem fokussiert den Laserstrahl auf der Probe und den
reflektierten bzw. emittierten Strahl auf der konfokalen Blende.
2.2.4 Signalverarbeitung
Das Signal, dass vom Fokus kommt und das Pinhole passieren kann, wird
Wellenlängen abhängig detektiert, indem Wellenlängenfilter verwendet
werden. Dafür gibt es verschiedene Verfahren. Eine Möglichkeit besteht
darin, das Licht mit Hilfe eines Prismas zu spalten so trifft jede
Wellenlänge an einer anderen Stelle des Photomultipliers auf. Meist ist es
möglich den Bereich, der gemessen werden soll, vorher einzugrenzen um
die Empfindlichkeit zu erhöhen oder es werden verschiedene Kanäle für
unterschiedliche Wellenlängenbereiche angelegt.
2.3 Optische Schnitte
Das CLSM ermöglicht das Erstellen optischer Schnitte. Darunter versteht
man, dass zusätzlich zur x-y-Ebene noch die z-Richtung beobachtet wird.
Das ist beim Laser-Scanning-Mikroskop möglich indem der Objekttisch
computergesteuert in z-Richtung bewegt wird, dabei wird der Fokus des
Lasers in tiefere Ebene der Probe projiziert. Im Gegensatz zum
Lichtmikroskop werden dabei die Bildteile der darüber liegenden Ebenen
durch die konfokale Blende ausgeblendet. Bei einer transparenten Probe
ermöglicht das einen sogenannten optischen Schnitt durch die Probe.
Eine geeignete Software kann die erhaltenen Daten, dann entweder in
einen zweidimensionalen Schnitt oder eine dreidimensionale Darstellung
bringen.
9
Abbildung 5: Serie optischer Schnitte
2.4 Reflexionsmodus
Im Reflexionsmodus wird der Laserstrahl von der Probe reflektiert, es
erfolgt also keine Änderung der Wellenlänge. In diesem Fall wird ein
Farbteiler gewählt, der beispielsweise 30% reflektiert und 70%
transmittiert. Die Verluste beim Einfallendenstrahl werden durch eine
Erhöhung der Laserleistung kompensiert. Das zurückkommende Signal
wird lediglich auf 70% reduziert, bevor es auf den Detektor trifft.
2.4.1 Reflexionsmodus Beispiele
Der Reflektionsmodus wird an einer 2 Cent Münze demonstriert, die Bilder
dazu wurden zusammen mit Frau Baensch während des F-Praktikums im
WS 2006/07 aufgenommen.
Abbildung 6: 2 Cent Münze
10
Ein Stern der 2 Cent Münze wurde mit dem Reflexionsmodus
mikroskopiert, die Farbe entspricht dabei einer Skala des
Computerprogramms und erlaubt keine Rückschlüsse auf die Wellenlänge
des verwendeten Lasers.
In Abbildung 07 ist deutlich zu erkennen, dass die fokussierte Ebene hell
dargestellt ist alles darüber und darunter sehr viel dunkler. Es ist an dieser
Abbildung nicht erkennbar ob es sich bei dem Stern um eine Erhebung
oder eine Senke handelt.
Abbildung 07: Bild im Reflexionsmodus
Im Gegensatz dazu ermöglicht ein zusammensetzen optischer Schnitte
mit einer Software das Drehen des Objekts, so ist es möglich die Struktur
eindeutig zu bestimmen. Abbildung 08 zeigt solche zusammengesetzte z-
Scans.
11
Abbildung 08: 3D Abbildung aus optischen Schnitten
2.5 Fluoreszenzmodus
Im Fluoreszenzmodus regt der einstrahlende Laserstrahl Elektronen der
Probenatome an. Beim Übergang zurück in den Grundzustand senden
diese Licht mit einer vom Laser verschiedenen Wellenlänge aus.
In wie weit das möglich ist, hängt natürlich von der Probe ab. Fluoresziert
die Probe, so hat das vom Objekt kommende Signal eine längere
Wellenlänge als der anregende Laserstrahl. Der Farbteiler kann dann so
gewählt werde, dass er das anregende Laserlicht möglichst optimal
reflektiert und das zu erwartende Fluoreszenzlicht optimal transmittiert.
2.5.1 Fluoreszenzmodus Beispiele
Abbildung 09 zeigt eine untersuchte Alge, die Aufnahme wurde mit dem
Lichtmikroskopteil eines CLSM und einer USB-Kamera aufgenommen.
12
Abbildung 09: Alge unter einem Lichtmikroskop
Abbildung 10 zeigt eine x-y-Ebene einer Zelle. Dabei werden die
Chloroplasten der Alge angeregt, welche deutlich zu erkennendes
Fluoreszenzlicht aussenden. Wieder hat die Farbe des Bildes keine
Aussagekraft über die Wellenlänge des emittierten oder eingestrahlten
Lichtes, da die Farbskalen beliebig gewählt werden können.
Abbildung 10: Bild im Fluoreszenzmodus
Abbildung 11 zeigt ein dreidimensionales Bild, dass aus optischen
Schnitten durch die Probe zusammengesetzt wurde. Hieran sind deutlich
die Chloroplasten in der Zelle erkennbar.
13
Abbildung 11: 3D Abbildung aus optischen Schnitten
3. Auflösungsvermögen
Um eine Aussage über das Auflösungsvermögen zu machen, muss man
sich zuerst darüber bewusst werden, dass ein Punkt selbst unter
optimalen Bedingungen nicht wieder auf einen Punkt abgebildet werden
kann. Es kommt immer zu Verwaschungen. Man erhält einen
Rotationselipsoiden im Kern mit schwächeren Strukturen darum herum.
Diese Struktur wird durch die Point Scattering Funktion beschrieben und
ist in Abbildung 12 dargestellt.
Abbildung 12: Darstellung der Point-Scatterin-Funktion
14
3.1 Point-Scattering-Funktion
Das Auflösungsvermögen wird durch die Halbwertsfläche (FWHM) der
Point Scattering Funktion berechnet. Die Ungenauigkeit bei der Abbildung
spielt sowohl beim Abbilden des Lasers auf die Probe (Bel
PSF ) als auch
bei der Abbildung des Objektpunktes (Nachw
PSF ) eine Rolle. Sie werden zu
einer Ungenauigkeit Ges
PSF zusammengefasst. Ges
PSF ist das Produkt aus
BelPSF und
NachwPSF . Sie hängt besonders von der Numerischen Apparatur
(NA) des Objektivs und der Laserwellenlänge ab, wird jedoch auch von
Beugungserscheinungen an der Objektpupille und der Aberration der
verwendeten optischen Bauteile ab.
GesPSF ist immer größer als
BelPSF . Wie nah man die beiden Werte
annähern kann, hängt von der Größe des Pinholes ab.
Je nach Größe des Pinholes muss zwischen geometrisch optischer
Konfokalität und wellenoptischer Konfokalität unterschieden werden.
3.2 Geometrisch optische Konfokalität
Man spricht von geometrisch optischer Konfokalität, wenn das Pinhole
einen Durchmesser hat, der größer als 1AE ist. Dabei ist die Bedingung
dafür, dass zwei Punkte noch als getrennt wahrgenommen werden, dass
sie eine Abstand haben, der größer als Bel
PSF ist. Aufgrund der
Ellipsenform gelten dabei unterschiedliche Werte für die axiale und
laterale Auflösbarkeit.
Für axiale Auflösbarkeit gilt:
,2 2
0,88exc
Bel axialFWHM
n n NA
λ⋅
=
− −
Für die laterale Auflösbarkeit gilt:
,
0,51em
Bel lateralFWHM
NA
λ⋅
=
Wie man den Formeln entnehmen kann ist dabei nur die
Anregungswellenlänge relevant.
Für die Schichtdicke gilt:
15
22
,2 2
0,88 2em
Nachw axial
n PH
FWHM
NAn n NA
λ ⋅ ⋅ ⋅
= +
− −
mit PH: Größe des Pinholes in µm
und n: Brechungsindex des Immersionsmediums
Der erste Summand unter der Wurzel ist ein wellenoptischer Term, der bei
gegebenem Objektiv und Wellenlänge konstant ist. Der zweite Summand
ist geometrisch optisch und bei gegebenem Objektiv nur von der Größe
der Lochblende abhängig. Das heißt die Auflösbarkeit ist proportional zum
Durchmesser des Pinholes.
3.3 Wellenoptische Konfokalität
Man spricht von wellenoptischer Konfokalität, wenn das Pinhole einen
Durchmesser hat, der kleiner als 1AE ist. Dabei verändert sich der
Abbildungscharakter. DieNachw
PSF nähert sich der Größe von Bel
PSF an
und es müssen Beugungserscheinungen berücksichtigt werden. (Vgl.
Abbildung 13)
Für den nicht realisierbaren Grenzfall PH=0, lassen sich die folgenden
Gleichungen herleiten, die jedoch auch für den Bereich bis PH=1 gelten,
wenn man die numerischen Vorfaktoren anpasst.
,2 2
0,64
ges axialFWHM
n n NA
λ⋅
=
− −
,
0,37
Ges lateralFWHM
NA
λ⋅
=
Im Falle der wellenoptischen Konfokalität ist die axiale Auflösbarkeit von
Punkten, auf Grund der Beugungserscheinungen nicht mehr von den
aufgenommenen Schichtdicken zu unterschieden. Deswegen gilt für sie
dieselbe Gleichung.
16
Abbildung 13: Der Durchmesser der Blende nimmt von a) nach c) ab
Geometrisch optische
Konfokalität
Wellenoptische
Konfokalität
Laterales
Auflösungs-
vermögen
0,51em
NA
λ⋅ 0,37
NA
λ⋅
Axiales
Auflösungs-
vermögen
2 2
0,88exc
n n NA
λ⋅
− −2 2
0,64
n n NA
λ⋅
− −
Optische
Schnittdicke
22
2 2
0,88 2em
n PH
NAn n NA
λ ⋅ ⋅ ⋅
+
− −
2 2
0,64
n n NA
λ⋅
− −
Tabelle 01: Auflösungsvermögen eines CLSM
Als Werte zur Orientierung kann mit einer Auflösung von 170 nm in x-y-
Ebene und von 500 nm in z-Richtung.
4 Konfokale Mikroskope
Wie bereits erwähnt gibt es noch weitere Anwendungen des konfokalen
Prinzips in anderen Mikroskopen. An dieser Stelle sollen jetzt noch kurz
das konfokale Weißlichtmikroskop und das Nipkow-Mikroskop vorgestellt
werden.
17
4.1 Konfokales Weißlichtmikroskop
In einem konfokalen Wisslichtmikroskop verwendet man weißes Licht,
anstelle eines Lasers, so werden auch Farbabbildungen mit einem
konfokalen Mikroskop möglich.
Ein Nachteil ist dabei, dass weißes Licht sich nicht mit einer so hohen
Intensität auf die Probe fokussieren lässt, das führt zu einer Verlängerung
der Beobachtungszeit. Darum verfügen konfokale Weißlichtmikroskope
meist über mehrere parallele Strahlengänge, die eine gleichzeitige
Beobachtung mehrerer Stellen auf dem Objekt ermöglichen.
4.2 Nipkow-Mikroskop
„Das Nipkow-Mikroskop enthält statt der konfokalen Blenden eine
sogenannte Nipkow-Scheibe, sie ermöglicht das gleichzeitige Beobachten
mehrer Punkte auf der Probe, sodass ein Bild in Echtzeit betrachtet
werden kann. Nipkow-Scheiben haben bis zu 20.000 Löcher mit je ca
20µm Durchmesser. Diese Löcher sind bogenförmig angeordnet.
In der Abbildung 14 ist die untere Scheibe die eigentliche Nipkow-Scheibe,
die darüber liegende Scheibe hat ein identisches Lochmuster. Mikrolinsen
in jedem Loch der oberen Scheibe fokussieren Laserlicht auf das darunter
liegende Loch in der Nipkow-Scheibe. In der Abbildung sind nur einige
wenige Löcher dargestellt, um die bogenförmige, radiale Anordnung zu
erklären.
Die beiden Scheiben rotieren mit einigen hundert Umdrehungen pro
Minute. Licht, das durch ein Loch der Nipkow-Scheibe auf das Objekt fällt,
beschreibt deshalb eine kreisbogenförmige Bahn über das Objekt
(schwarzer Pfeil auf dem Objekt). Diese Bahn ergibt sozusagen eine Zeile
des Bildes. Das benachbarte Loch auf der Scheibe erzeugt die nächste
Zeile, und jedes weitere Loch des Bogens fügt eine Zeile hinzu. Die
Löcher eines Bogens erzeugen also bei ihrer Passage über das Objekt ein
vollständiges Bild, allerdings nur für den Bruchteil einer Sekunde. Der
nächste Satz Löcher erzeugt ein neues Bild, und wegen der schnellen
Rotation der Scheibe entstehen Bilder in so schneller Folge (über 300 pro
Sekunde), dass die Einzelbilder im Auge zu einem stehenden Bild des
Objekts verschmelzen.
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In der Abbildung ist der Strahlengang nur für ein Loch dargestellt -
tatsächlich aber werden mehrere Löcher eines Bogens gleichzeitig
beleuchtet. Anregungslicht (grün) und Fluoreszenzlicht (rot) werden durch
dieselbe Lochblende geführt. Da die Lochblende konfokal mit der
Brennebene der Objektivlinse ist, gelangt nur Licht aus der Brennebene
auf den Strahlenteiler zwischen den beiden Scheiben und damit ins
Okular.“1
Abbildung 14: CLSM mit Nipkow-Scheibe
5 Zusammenfassung
Konfokale Mikroskopie ist die Verbesserung der Lichtmikroskopie durch den
Einsatz einer konfokalen Blende.
Abbildung 15: Vergleich Wide-Field und konfokal
1
http://www.sinnesphysiologie.de/methoden/fluo/nipkowl.htm, 23.06.2007
19
6 Quellen
http://www.lme.ei.tum.de/paper/VorlesungMikroskop.pdf
http://www.thch.uni-
bonn.de/wandelt/pcf_praktikum/versuchsanleitungen/LSM.pdf
http://web.media.mit.edu/~minsky/papers/ConfocalMemoir.htmlhttp://www.
uni-stuttgart.de/ito/Forschung/3d1/KonfokaleMikroskopie/
http://www.sinnesphysiologie.de/methoden/fluo/nipkowl.htm
http://www.palaeontologische-
gesellschaft.de/palges/schule/posterimgs_seiten/CLMS/CLSM_A0.pdf
www.wikipedia.de
Gerthsen Physik (Springer Lehrbuch) von Dieter Meschede und Christian
Gerthsen
http://www.sinnesphysiologie.de/methoden/fluo/confocl.htm
http://www.pc.tu-clausthal.de/dienstleistungen/clsm/
7 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 01: Gerthsen Physik (Springer Lehrbuch) von Dieter Meschede
und Christian Gerthsen
Abbildung 02: http://www.lme.ei.tum.de/paper/VorlesungMikroskop.pdf
Abbildung 03: http://www.lme.ei.tum.de/paper/VorlesungMikroskop.pdf
Abbildung 04: http://www.sinnesphysiologie.de/methoden/fluo/confocl.htm
Abbildung 05: http://www.palaeontologische-gesellschaft.de/
palges/schule/posterimgs_seiten/CLMS/CLSM_A0.pdf
Abbildung 06: Bilder entstanden beim F-Praktikum WS2006/07 von Frau
Baensch und Frau Derks
Abbildung 07: Bilder entstanden beim F-Praktikum WS2006/07 von Frau
Baensch und Frau Derks
Abbildung 08: Bilder entstanden beim F-Praktikum WS2006/07 von Frau
Baensch und Frau Derks
Abbildung 09: Bilder entstanden beim F-Praktikum WS2006/07 von Frau
Baensch und Frau Derks
Abbildung 10: Bilder entstanden beim F-Praktikum WS2006/07 von Frau
Baensch und Frau Derks
20
Abbildung 11: Bilder entstanden beim F-Praktikum WS2006/07 von Frau
Baensch und Frau Derks
Abbildung 12: Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie von Stefan
Abbildung 13: Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie von Stefan
Abbildung 14: http://www.sinnesphysiologie.de/methoden/fluo/nipkowl.htm
Abbildung 15: http://www.lme.ei.tum.de/paper/VorlesungMikroskop.pdf
