Spurenanalytische Erfassung zytostatisch wirksamer Stickstoff … · Trotz der Unterschiede in der histologischen Struktur scheinen die Tumore nahezu alle durch recht ähnliche grundlegende

Spurenanalytische Erfassungzytostatisch wirksamer Stickstoff-Lost-Derivate

in aquatischen Umweltkompartimentenmittels gaschromatographischer Verfahren

Entwicklung, Optimierung, ValidierungRealprobenmessungen

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Chemie

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Rüdiger Kohl

aus Essen

Bochum 2002

Johann Sebastian Bach (1685-1750)

BWV 245

Diese Arbeit wurde in der Zeit von Mai 1998 bis April 2002 am Lehrstuhl für Analytische

Chemie an der Ruhr-Universität Bochum angefertigt.

Ich bedanke mich bei Herrn Prof. Dr. H.-J. Götze für die interessante Themenstellung sowie für

seine ständige Diskussionsbereitschaft, engagierte Unterstützung und den mir gewährten

Freiraum bei der Anfertigung dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. W.S. Sheldrick danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes.

Ich danke ebenso Herrn AOR Dr. P. Zinn für die technische Unterstützung sowie die ständige

Diskussionbereitschaft bei der Anfertigung dieser Arbeit.

Allen Mitgliedern des Lehrstuhls für Analytische Chemie und insbesondere der Arbeitsgruppe

möchte ich für die äußerst gute Zusammenarbeit und das ausgezeichnete Arbeitsklima danken.

I Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung............................................................................................................................................. 1

2 Problemstellung .................................................................................................................................. 3

3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit .................................................................................. 4

3.1 Onkologische Grundlagen............................................................................................................ 4

3.1.1 Behandlung von Krebserkrankungen ................................................................................ 5

3.1.2 Chemotherapie ...................................................................................................................... 6

3.1.3 Toxizität, Mutagenität und Kanzerogenität von Chemotherapeutika......................... 15

3.2 In der Bundesrepublik Deutschland eingesetzte Zytostatika ................................................ 18

3.3 Umweltrelevanz von Zytostatika ............................................................................................... 23

3.3.1 Eintragspfade der Zytostatika in die Umwelt ................................................................. 23

3.3.2 Belastung der aquatischen Umwelt .................................................................................. 26

3.3.3 Belastung der Luft............................................................................................................... 28

3.3.4 Belastung des Bodens......................................................................................................... 30

3.4 Analytik von Zytostatika ............................................................................................................. 31

4 Auswahl der untersuchten Zytostatika .......................................................................................... 33

4.1 Auswahlkriterien........................................................................................................................... 33

4.2 Ökotoxikologische Bewertung................................................................................................... 34

4.3 Ausgewählte Zytostatika ............................................................................................................. 38

5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten ........................................................................ 39

5.1 Der Gaschromatograph .............................................................................................................. 39

5.2 Das Massenspektrometer............................................................................................................ 40

5.2.1 Sektorfeld-Massenspektrometer ....................................................................................... 40

5.2.2 Quadrupol-Massenspektrometer ...................................................................................... 41

5.2.3 Ion Trap-Massenspektrometer.......................................................................................... 42

5.2.4 Vor- und Nachteile von GC-MS-Gerätenbezogen auf den analytischen Sachverhalt ...................................................................... 44

6 Probenvorbereitung.......................................................................................................................... 46

6.1 Verwendete Apparaturen............................................................................................................ 46

6.2 Anreicherung mittels Flüssig/Flüssig-Extraktion ................................................................... 47

6.2.1 Prinzip der Flüssig/Flüssig-Extraktion............................................................................ 47

6.2.2 Optimierung der Extraktionsparameter .......................................................................... 48

6.2.3 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................... 51

I Inhaltsverzeichnis II

6.3 Anreicherung mittels Festphasen-Extraktion ................................................................. 55

6.3.1 Prinzip der Festphasen-Extraktion................................................................................... 55

6.3.2 Optimierung der Extraktionsparameter .......................................................................... 58


6.4 Derivatisierung ............................................................................................................................. 72

6.3.1 Optimierung der Derivatisierungsreaktion...................................................................... 74


6.5 Einteilung der Verbindungen in Gruppen für die Probenvorbereitung .............................. 80

7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren.................................................................................. 82

7.1 Verwendete Geräte und Gase .................................................................................................... 82

7.2 Entwicklung der chromatographischen Methode................................................................... 82

7.2.1 Optimierung der gaschromatographischen Systemparameter...................................... 83


7.3 Entwicklung der massenspektrometrischen Detektionsmethode......................................... 92

7.3.1 Optimierung der massenspektrometrischen Systemparameter.................................... 92


7.3.3 Interpretation der Massenspektren................................................................................. 106

8 Validierung der entwickelten Methoden ..................................................................................... 122

8.1 Interne Qualitätssicherung........................................................................................................ 122

8.1.1 Kalibrierung ....................................................................................................................... 123

8.1.2 Wiederfindungsrate........................................................................................................... 124

8.1.3 Standardabweichung......................................................................................................... 125

8.1.4 Bestimmungsgrenze.......................................................................................................... 126

8.1.5 Ergebnisse .......................................................................................................................... 127

8.2 Externe Qualitätssicherung....................................................................................................... 135

8.2.1 Ringversuch – Urin........................................................................................................... 135

8.2.2 Ringversuch – Abwasser.................................................................................................. 137

8.3 Diskussion................................................................................................................................... 140

9 Untersuchung von Realproben..................................................................................................... 142

9.1 Herkunft des Probenmaterials ................................................................................................. 142

9.2 Beschaffenheit der Probenmatrix Abwasser .......................................................................... 143

9.3 Messung der Zytostatika-Konzentrationen in realen Klinkabwässern .............................. 143

9.3.1 Beschreibung des verwendeten Verfahrens .................................................................. 143

9.3.2 Ergebnisse der Messungen und Diskussion.................................................................. 145

I Inhaltsverzeichnis III

10 Zusammenfassung.......................................................................................................................... 151

11 Anhang ............................................................................................................................................. 155

11.1 Eigenschaften der untersuchten Substanzen..................................................................... 155

11.1.1 Cyclophosphamid (CP)................................................................................................... 155

11.1.2 Keto-Cyclophosphamid (KCP) ..................................................................................... 157

11.1.3 Carboxycyclophosphamid (CCP).................................................................................. 158

11.1.4 Cyclophosphamid Mustard (CPM) ............................................................................... 159

11.1.5 Ifosfamid (IF)................................................................................................................... 160

11.1.6 4-Keto-Ifosfamid (KIF).................................................................................................. 162

11.1.7 Carboxyifosfamid (CIF).................................................................................................. 163

11.1.8 Ifosfamid Mustard (IPM) ............................................................................................... 164

11.1.9 1,3-Oxazolidin-2-on (OXAZ)........................................................................................ 165

11.1.10 2-Chlorethylamin (CEA) ................................................................................................ 166

11.2 Arbeitsanweisung für die Anreicherung der Substanzen................................................. 167

11.2.1 Gruppe 1 ............................................................................................................................ 167

11.2.2 Gruppe 2 ............................................................................................................................ 169

12 Literatur............................................................................................................................................ 171

II Verwendete Abkürzungen IV

Verwendete Abkürzungen

a Jahr

ACN Acetonitril

AQS Analytische Qualitätssicherung

BLAC Bund-Länder-Arbeitsgemeinschaft Chemikaliensicherheit

CCP Carboxyphosphamid

CEA 2-Chlorethylamin

CID Kollisionsinduzierter Zerfall

CIF Carboxyifosfamid

CP Cyclophosphamid

CPM Cyclophosphamid Mustard

DIN Detusches Institut für Normung

DNA Desoxyribonukleinsäure

ECD Elektroneneinfang-Detektor

ED50, EC50 Mittlere Effektdosis, Effektkonzentration

EI Elektronenstoß-Ionisierung

EMEA The European Agency for the Evaluation of Medical Products

EtOAc Ethylacetat

EU Europäische Union

GC Gaschromatograph(ie)

GLP Gute Labor Praxis

HFBA Heptafluorbuttersäureanhydid

HFBI Heptafluorbutyrylimidazol

HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie

IARC International Agency for Research on Cancer

IF Ifosfamid

IPM Ifosfamid Mustard

KCP 4-Keto-Cyclophosphamid

KIF 4-Keto-Ifosfamid

LD50, LC50 Mittlere Letaldosis, Letalkonzentration

II Verwendete Abkürzungen V

LLE Flüssig/Flüssig-Extraktion

log Pow Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient

M Mol pro Liter

m/z Masse-zu-Ladungs-Verhältnis

MeOH Methanol

MP Mischprobe

MS, MS/MS Massenspektrometrie/-meter, Tandem-Massenspektrometrie

MURL Minsterium für Umwelt, Raumplanung und Landwirtschaft des LandesNordrhein-Westfalen

NB Nicht bestimmt

NCI Negative Chemische Ionisierung

NNM Nor Nitrogen Mustard

NOEC No Effect Concentration

OECD Organisation for Economic Co-operation and Development

OXAZ 1,3-Oxazolidin-2-on

PA Protonenaffinität

PCI Postive Chemische Ionisierung

PEC Predicted Environmental Concentration

PFPA Pentafluorpropansäureanhdrid

PNEC Predicted No Effect Concentration

QP Qualifizierte Stichprobe

RT Raumtemperatur

SIM Single Ion Monitoring

SP Schöpf- oder Stichprobe

SPE Festphasen-Extraktion

TFAA Trifluoressigsäureanhydrid

THF Tetrahydrofuran

TIC Total Ion Currency

TMSH Trimethylsulfoniumhydroxid

tR Retentionszeit

Umin-1 Umdrehungen pro Minute

1 Einleitung 1

1 Einleitung

Arzneimittel werden in Mitteleuropa aufgrund des ausgedehnten Gesundheitswesens in

beträchtlichen Mengen verabreicht. Bedingt durch Menge und Art ihrer Verwendung sind die im

Jahre 2000 in Deutschland produzierten ca. 29.000t Humanarzneimittelwirkstoffe als

umweltrelevante Verbindungen einzustufen. Die Multiplikation der Anzahl der in einem Jahr

verordneten Tagesdosen [3] mit der Menge einer Tagesdosis [1] ergibt die jährlichen

Verordnungsmengen, die in einzelnen Fällen sogar Spitzenwerte von über 100 t/a erreichen.

Durch ihre gewollte mehr oder minder starke Wirkung auf den menschlichen Organismus ist das

Auftreten von Pharmazeutika in den unterschiedlichen Umweltkompartimenten per se

unerwünscht. Einige der etwa 9700 human- und 2700 veterinärmedizinischen Produkte, die sich

in Deutschland derzeit auf dem pharmazeutischen Markt befinden, zeigen einen weiten

Wirkungsradius und können akute und chronische ökotoxikolische Auswirkungen bei im Boden

oder Wasser existierenden Lebensgemeinschaften hervorrufen. Bis zum jetzigen Zeitpunkt sind

Rückstände von 91 Arzneimitteln in verschiedenen aquatischen Umweltkompartimenten

detektiert worden [2]. In der Regel gelangen die verordneten Humanpharmaka über die

menschlichen Ausscheidungen wie Urin, Faeces oder Erbrochenes in das Abwassersystem, wo

sie je nach ihren chemischen und physikalischen Eigenschaften, insbesondere ihrer Polarität,

häufig die Kläranlagen unverändert passieren und in die Bereiche der Grund- und

Oberflächengewässer vordringen. Eine Kontamination des Trinkwassers ist somit möglich. Das

Aufbringen von durch Adsorption mit pharmazeutischen Substanzen belasteten Klärschlämmen

auf landwirtschaftliche Nutzflächen ermöglicht das Eindringen dieser Verbindungen in den

Boden respektive in die Nahrungskette des Menschen. Unfälle bei der Produktion, beim

Transport und der Applikation sowie unsachgemäße Entsorgung der Arzneimittel stellen weitere

mögliche Expositionspfade dar.

Die Zulassung von Humanpharmaka ist nicht mit einer Umweltverträglichkeitsprüfung

verbunden. Obwohl das Vorkommen und die erzeugten Effekte dieser Verbindungen in der

Umwelt trotz verstärkt auftretender Untersuchungsvorhaben immer noch weitgehend unbekannt

sind, unterliegen sie nicht den im Chemikaliengesetz vorgeschriebenen ökotoxikologischen

Prüfungen. Während die EU-Richtlinie 92/39/EWG für Tierarzneimittel ein Prüfschema und

und die Art der zu leistenden Prüfungen detailliert vorschreibt, existiert eine entsprechende

Regelung für Humanarzneimittel bislang nicht.

1 Einleitung 2

2001 stellte die Europäische Arzneimittel-Agentur EMEA (The European Agency for the

Evaluation of Medical Products) ein Diskussionspapier zur Umweltbewertung von

Humanpharmaka vor. Der Entwurf sieht eine Bewertung in zwei Phasen vor. Im ersten

Abschnitt der Prüfung sollen die physiko-chemischen Parameter und die Expositionsbestimmung

des Eintrags in Gewässer und Böden bestimmt werden. Übersteigt die Konzentration einen

festgelegten Triggerwert, so erfolgt in einer zweiten Phase eine vertiefte Risikobewertung anhand

des möglichen Bioakkumulationspotentials sowie der akuten und chronischen Toxizität für

aquatische und terretrische Organismen [3,4].

Die in der Chemotherapie von Tumoren eingesetzten Zytostatika stellen aufgrund ihrer Toxizität,

Mutagenität, Teratogenität und der teilweise in Tierversuchen nachgewiesenen Kanzerogenität

ein hohes Gefährdungspotential für beteiligte und unbeteiligte Personen dar. Die auftretenden

akut-toxischen Nebenwirkungen bei Chemotherapiepatienten wie Haarausfall, Erbrechen und

Kopfschmerzen, aber auch das Auftreten sekundärer Neoplasien, die nicht durch

Metastatisierung des Primärtumors entstanden sind, belegen die völlig unspezifische

Wirkungsweise dieser pharmazeutischen Verbindungen [11-29]. Chemotherapeutika wirken auf

alle in der Teilungsphase befindlichen menschlichen Zellen meist sehr ähnlich wie einige

Antibiotika auf Bakterien: Sie hindern die Zellen an der Vermehrung, indem sie die Verdopplung

ihrer DNA vor der Zellteilung stören und dadurch bei den Zellen die Apoptose, ihren eigenen

programmierten Tod, auslösen. Dieser Eingriff in den Prozeß der Zellteilung birgt stets die

Gefahr genetischer Veränderung und kann damit die Bildung weiterer Geschwulste auslösen.

Verglichen mit anderen Pharmakagruppen wie Analgetika, Herzmittel oder Hormone ist der

jährliche Produktionsumfang in Deutschland mit geschätzten 5 Tonnen gering [30], jedoch muß

das gesundheitsschädliche und umweltgefährdende Potential dieser Verbindungen verglichen mit

den oben genannten als weitaus größer eingeschätzt werden. Die Eintragspfade der Zytostatika in

die Umwelt sind an vielen Stellen in der Literatur beschrieben worden. Nachdem in den letzten

Jahren bei Krankenhauspersonal und Angestellten von Krankenhaus-Apotheken, die mit der

Zubereitung von applikablen Zytostatika-Lösungen oder der Anwendung von Chemotherapien

zu tun hatten, hohe Konzentrationen in Urin- und Blutproben gefunden wurden, sind die

arbeitsmedizinischen Sicherheitsvorkehrungen verschärft worden. Der Hauptexpositionsweg von

Zytostatika in die aquatische Umwelt sind jedoch die in erheblichem Ausmaße mit den

unmetabolisierten Muttersubstanzen und deren aktiven Stoffwechselprodukten kontamierten

Ausscheidungen der Patienten, die mit antineoplastischen Arzneimitteln behandelt wurden. Eine

geregelte Entsorgung der Patientenausscheidungen ist gesetzlich nicht vorgeschrieben und wird

nur an wenigen Krankenhäusern in Deutschland praktiziert, was zu einer starken Belastung der

Klinikabwässer mit Chemotherapeutika führt.

2 Problemstellung 3

2 Problemstellung

Der medizinische und gesellschaftliche Wert von Arzneimitteln wie Chemotherapeutika ist

unumstritten, dennoch müssen die enormen Informationsdefizite systematisch aufgearbeitet

werden. Für die Beurteilung möglicher nachteiliger Wirkungen der Zytostatika und vor allem

deren aktiver Metaboliten in der Umwelt und für die Festlegung künftiger

Risikominderungsmaßnahmen fehlen derzeit die wissenschaftlichen Grundlagen. Für eine

Expositionsanalyse bezüglich der Zytostatika-Rückstände in den betroffenen

Umweltkompartimenten Grund- und Oberflächenwasser und mögliche Umwelteintragspfade

über Kläranlagen ist eine nachweisstarke Spurenanalytik für die Ermittlung von Konzentrationen

im Spuren- und Ultraspurenbereich der ausgesuchten Verbindungen in Oberflächengewässern

und im Klinikabwasser erforderlich.

Die Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit läßt sich in folgende Punkte gliedern:

→ Auswahl von Zytostatika aufgrund ihrer hohen Verbrauchsmengen, Ausscheidungsraten

und nachgewiesenen Kanzerogenität

→ Auswahl möglicher in aquatischen Umweltkompartimenten vorkommenden Metaboliten

zytostatischer Natur

→ Entwicklung neuer oder Adaption vorhandener Verfahren sowie deren Optimierung zur

Anreicherung der ausgewählten Zytostatika aus den interessierenden Matrices mit Hilfe

verschiedener Extraktionsmethoden

→ Entwicklung neuer oder Adaption und Optimierung vorhandener gaschromatogra-

phischen Bestimmungsverfahren für die Trennung und Bestimmung der ausgewählten

Zytostatika und Metabolite in Oberflächen- und Klinikabwasserproben mittels

massenspektrometrischer Detektion

→ Validierung der entwickelten spurenanalytischen Methoden durch interne und externe

Qualitätssicherung

→ Untersuchung des Vorkommens der ausgesuchten Verbindungen in realen Oberflächen-

und Klinikabwasserproben unter Einsatz der entwickelten Analyseverfahren

3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 4

3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit

3.1 Onkologische Grundlagen

Krebs ist keine einheitliche Krankheit, sondern ein Sammelbegriff für eine Vielzahl verschiedener

Formen maligner Erkrankungen. Nahezu jedes Gewebe des Körpers kann bösartige Entartungen

hervorbringen. Trotz der Unterschiede in der histologischen Struktur scheinen die Tumore

nahezu alle durch recht ähnliche grundlegende Prozesse hervorgerufen zu werden.

Die rund 30 Billionen gesunden Zellen in einem erwachsenen menschlichen Körper leben in

einer Gemeinschaft wechselseitiger Abhängigkeiten und geteilter Herrschaft. Die Proliferation

der Zellen respektive deren Unterbleiben unterliegt im allgemeinen dem Einfluß der

benachbarten Zellen, die die Aufforderung aussenden, sich zu teilen, so daß Gewebe, Organ und

Körper die gewünschte Funktion und Form erhalten. Dieser gegenseitigen Kontrolle entziehen

sich die Krebszellen, indem sie nur ihrem eigenen Vermehrungsprogramm folgen. Die Fähigkeit

zur Metastatisierung, also die Möglichkeit der Krebszellen, ihren Zellverband zu verlassen und

gegebenenfalls nach Transport in der Blut- oder Lymphbahn an anderer Stelle im Körper eine

weitere Geschwulst zu bilden, läßt den Verlauf der Krankheit zumeist schlimmer und deren

Behandlung schwieriger werden. Werden lebenswichtiges Gewebe oder Organe befallen, können

sie zum Tod führen.

Alle bösartigen Geschwülste sind des weiteren durch die Begriffe Anaplasie und Hyperplasie zu

charakterisieren. Während Anaplasie bedeutet, daß die Zellen einer Geschwulst nicht vollständig

ausreifen und somit ihre Funktion nicht in vollem Umfang wahrnehmen können, beschreibt der

Begriff Hyperplasie die Eigenschaft der unkontrollierten Zellteilung. Diese wiederum ist nicht in

jedem Fall schneller als die der normalen Zellen. Jedoch befinden sich die meisten Zellen der

chemotherapiesensiblen Tumore in der Teilungsphase. Derzeit stirbt in den Industrieländern

zwischen 20 und 25 Prozent der Bevölkerung an solchen malignen Tumorbildungen, und somit

ist sie die zweithäufigste Todesursache nach den Krankheiten des Kreislaufsystems. In

Deutschland erliegt jeder Dritte einer Kreislauferkrankung, und jeder Vierte stirbt an einer

bösartigen Neubildung. Wenn sich auf dem Gebiet der Krebsprävention keine ähnlich

durchschlagenden Erfolge zeigen wie bei den Kreislauferkrankungen, dann wird der Krebs in den

nächsten 15-20 Jahren die Todesursache Nummer Eins in Deutschland sein [31-35].


3.1.1 Behandlung von Krebserkrankungen

Um Krebserkrankungen behandeln zu können, bestehen prinzipiell zwei Möglichkeiten: Zum

einen kann das Geschwulstgewebe vernichtet oder aber in seinem Wachstum gehemmt werden.

Die älteste und am häufigsten angewendete Behandlungsmethode ist die operative Entfernung

des Tumors. Mit einer Operation werden die meisten Heilungen verbucht, und sie ist zudem die

einzige Therapieform, bei der sich überprüfen läßt, ob der Tumorherd vollständig beseitigt

worden ist. Hat das entfernte maligne Gewebe einen geschlossenen Kranz von normalen Zellen,

so ist von einer vollständigen Beseitigung dieses Tumors auszugehen. Jedoch garantiert dies

nicht, daß mikroskopische Ausläufer, die sogenannten invasiven Tumorzellen, mit erfaßt worden

sind.

Oft wird die Bestrahlung der Operation vorgezogen. Hierbei wird der Bereich der

Krebserkrankung einer intensiven Röntgen- oder γ-Strahlung ausgesetzt. Dies kann von außen in

Form von Bestrahlungsgeräten sowie auch durch Verabreichung winziger radioaktiver

Strahlungsquellen in den Körper erreicht werden. In beiden Fällen wird der Zelle ein so großer

genetischer Schaden zugefügt, daß die Zelle entweder abstirbt oder dazu gebracht wird, gleichsam

„Selbstmord“ zu begehen (Apoptose). Da sich gesundes Gewebe schneller von den Folgen der

Bestrahlung erholen kann als Krebszellen, kann eine solche Therapie die Gewebestruktur um den

Tumor erhalten und somit denselbigen ohne Funktionseinbußen des umgebenden Gewebes

heilen. Einige Arten von Krebs lassen sich mit Bestrahlung gut behandeln, wie zum Beispiel

Gebärmutterhals-Krebs, Frühstadien von Prostata-Krebs sowie Hodgkin-Lymphom. Ein

weiterer Vorteil dieser Behandlungsmethode ist die Tatsache, daß auch mikroskopisch kleine

Auswüchse des Tumors zerstört würden, die bei einer Operation nur schwer vollständig mit dem

Skalpell erfaßt werden können.

Aber auch die Bestrahlung erweist sich trotz aller Vorteile manchmal als unzureichend. Sie kann

teilweise nicht alle Krebszellen eines Tumors bzw. schon invasive Zellen beseitigen, die vielerorts

nach einiger Zeit zu Tumoren auswachsen. Diese beiden Behandlungsmethoden eignen sich also

zur Beseitigung lokalisierter Geschwülste, die noch nicht metastatisiert sind. Derzeit heilen sie

rund 35% aller Tumorerkrankungen.

Die dritte Möglichkeit, um Hyperplasie behandeln zu können, ist die systemische Chemotherapie

mit zytotoxisch wirkenden Medikamenten, die im Gegensatz zu den obigen Methoden ungezielt

in den Organismus eingreift.


Sie ist bei fortgeschrittenen, inoperablen oder generalisierten Tumorerkrankungen (Leukämien)

sowie zur Metastasenprophylaxe und –bekämpfung die einzige Therapieform. Auf die

Wirkungsweise der sogenannten Zytostatika wird im folgenden näher eingegangen.

3.1.1 Chemotherapie

Von den weltweit über 200.000 Substanzen, die jährlich auf ihre Zytotoxizität getestet werden,

gelangt nur etwa 1% in die klinische Phase I, in der die therapeutische Wirksamkeit eines

Arzneimittels an wenigen, wenn möglich gesunden, ausgesuchten Personen getestet wird, bevor

es in den nächsten beiden Phasen bei einer größeren Anzahl von Menschen Anwendung findet

und anschließend als neues Medikament zugelassen wird.

Aufgrund der Tatsache, daß die Erkenntnisse, wie es zur Entstehung und Vermehrung bösartiger

Tumore kommt und wie Zytostatika im einzelnen genau wirken, recht rudimentär sind, ist es bis

heute noch nicht möglich, auf den Patienten und seinen Karzinom maßgeschneiderte

Chemotherapeutika zu synthetisieren.

Während bei einem chirurgischen Eingriff oder bei radiotherapeutischem Vorgehen alle drei

Zellfraktionen eines Tumors geschädigt werden können, ist bei der Behandlung einer

systemischen Erkrankung mittels einer Chemotherapie die Proliferationsfraktion das Ziel. Dies

bedeutet, daß die Zytostatika nur Zellen angreifen, die sich in einer Phase des Zellzyklus

befinden, nicht jedoch in der sogenannten G0-Phase (Ruhephase). Daraus resultiert die besondere

Empfindlichkeit der proliferierenden Zellen chemotherapiesensibler Tumoren auf Zytostatika.

Die Chemotherapie erfolgt entweder mit einzelnen Substanzen oder in der sogenannten

Polychemotherapie. Hierbei wird eine Kombination von in der Regel 3-4 Zytostatika

angewendet, um in unterschiedliche Phasen des Zellzyklus eingreifen und Resistenzbildung

vermeiden zu können, während die toxischen Nebenwirkungen minimiert werden[37-39].

Soll eine Unterteilung der als Zytostatika verwendeten Substanzen aufgrund ihrer nicht bei allen

Substanzen en detail geklärten Wirkungsmechanismen und deren chemischer Strukturen

vorgenommen werden, so kommt es meist zu der in Tabelle 3.1 gezeigten Einteilung. Hierbei

werden die in manchen Publikationen separat geführten platinhaltigen Verbindungen und die

Interferone zu den sonstigen Zytostatika gezählt.


Tab. 3.1: Einteilung der verwendeten Zytostatika [1]

Substanzgruppe Zytostatika (Wirkstoffe)

AlkylantienBendamustin, Busulfan, Carmustin, Chlorambucil, Cyclophosphamid,Ifosfamid, Lomustin, Melphalan, Nimustin, Prednison, Thiotepa,Treosulfan, Trofosfamid

Antimetaboliten Cladribin, Cytarabin, Fludarabin, Fluorouracil, Gemcitabin,Mercaptopurin, Methotrexat, Tioguanin

Alkaloide Vinblastin, Vinchristin, Vindesin, Vinorelbin

Antibiotika Aclarubicin, Bleomycin, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin,Farmorubicin, Idarubicin, Mitomycin

HormoneAminoglutethimid, Buserelin, Ethinylestradiol, Flutamid, Formestan,Fosfestrol, Goserelin, Leuprorelin, Medroxyprogesteron, Tamoxifen,Triptorelin

Sonstige

Amsacrin, Dacarbazin, Docetaxel, Estramustin, Etoposid,Hydroxycarbamid, Miltefosin, Mitoxantron, Paclitaxel, Pentostatin,Porfimer, Procarbazin, Teniposid, Topotecan, Tretinoin, Interferonalpha-2a, Interferon alpha-2b, Carboplatin, Cisplatin

3.1.1.1 Alkylierende Verbindungen

Dieser Begriff vereinigt Substanzen relativ einfacher Struktur, die durch Einbau von

Alkylgruppen in Nukleinsäuren und somit durch Blockierung der DNA-Synthese eine hemmende

Wirkung auf die Zellteilungsprozesse haben. Im allgemeinen besitzen diese Moleküle zwei

reaktive Zentren, die über die Bildung eines Carbokations mit Proteinen und u.a. mit dem

Guanin der Desoxyribonukleinsäure reagieren, wobei es zu einer multiplen Veränderung des

DNA-Strangs kommt („cross-linking“, anormale Basenpaare, DNA-Spaltung, etc., Abb.3.1).

Diese Verbindungsklasse der alkylierenden, zytotoxischen Verbindungen enthält u.a.

Halogenalkylamine, N-Alkyl-N-Nitroso-Verbindungen, Phosphamidester, Aziridin-

Verbindungen und Sulfonsäureester mehrwertiger Alkohole. Für die meisten Autoren fallen die

Platinverbindungen ebenfalls unter diese Gruppe, da auch sie eine Bindung mit den DNA-

Strängen eingehen, jedoch handelt es sich hierbei nicht um Alkylierungen.


Abb. 3.1: Hemmung der DNA-Replizierung durch Alkylantien und zytostatische Antibiotika [40]

Eine der ältesten Substanzgruppen ist die der Stickstoff-Lost-Derivate. Diese Stoffe entstanden

in Analogie zu den Schwefellost-Verbindungen oder Senfgasen, die als Hautkampfstoffe im I.

Weltkrieg eingesetzt wurden [41]. Soldaten, die an einer Intoxikation mit diesen Kampfstoffen

(Yperit, Gelbkreuz, N-Lost) gestorben waren, wiesen bei der Autopsie regelmäßig eine Aplasie

des Knochenmarks (fehlende Entwicklung des vorhandenen Gewebes), eine Auflösung des

lymphatischen Gewebes und Geschwürbildung im Magen-Darmtrakt auf [41].

Die besondere Toxizität dieser Stoffe für lymphatisches Gewebe ließ frühzeitig an die

Entwicklung besser steuerbarer Substanzen von ähnlicher Struktur denken, die bei malignen

Erkrankungen des lymphatischen Systems zum Einsatz kommen könnten. Solche Substanzen

wurden in Verbindungen mit der allgemeinen nachstehenden Formel gefunden (Abb. 3.2 ).

O N

P

O

N

R2R3

R1

Abb. 3.2: Allgemeine Struktur der Oxazaphosphinan-Derivate


Tab. 3-2: Chemische Strukturen der untersuchten Oxazaphosphinan-Derivate

Oxazaphosphinan-Derivat R1 R2 R3

Cyclophosphamid -H -CH2CH2Cl -CH2CH2Cl

Ifosfamid -CH2CH2Cl -CH2CH2Cl -H

Trofosfamid -CH2CH2Cl -CH2CH2Cl -CH2CH2Cl

Es handelt sich hierbei um 1,3,2-Oxazaphosphinan-2-amin-2-oxide ähnlicher Struktur mit

unterschiedlicher Anordnung und Anzahl der 2-Chloroethyl-Seitengruppen, die ein breites

Anwendungsspektrum besitzen (siehe Anhang). Die Verabreichung erfolgt oral oder intravenös

in Dosen von bis zu 5000mg/m2 Körperoberfläche je nach Tumorerkrankung und Ansprechen

des Patienten auf die Therapie [43]. Die Dosierung von Ifosfamid erfolgt bedeutend höher, da

das Alkylierungsverhältnis von IF zu CP etwa 1:5 beträgt [44]. Die Muttersubstanzen sind inaktiv

und nicht zytotoxisch. Eine Metabolisierung im Körper ist also notwendig, um ein reaktives

alkylierendes Intermediat zu bilden. Da die Metabolismen der beiden in dieser Arbeit

untersuchten alkylierend wirkenden Muttersubstanzen sehr ähnlich sind, werden im folgenden

nur die biochemischen Prozesse des am besten untersuchten Cyclophosphamid nähergehend

erläutert. Die beiden schematischen Darstellungen der Stoffwechsel von Cyclophosphamid und

Ifosfamid können den Abbildungen 3.3 und 3.4 entnommen werden. In einem ersten Schritt

wird die Muttersubstanz in der Leber mit Hilfe eines Enzyms („Gemischte-Funktion-Oxidase“),

das in den endoplasmatischen Reticuli dieses Organs vorkommt, unter Verbrauch von NADPH

und Sauerstoff zu 4-Hydroxycyclophosphamid oxidiert. In Gegenwart von Wasser bzw. H3O+-

Ionen kommt es zu einer säurekatalysierten Ringöffnung dieses Primärmetaboliten. Mit dem

entstehenden Aldehyd-Tautomer Aldophosphamid steht das 4-Hydroxycyclophosphamid im

Gleichgewicht. Beide Substanzen sind atoxisch und werden zu Transportzwecken im Körper

benötigt. In dieser Form gerät das Zytostatikum in die Zelle. Der Aldehyd ist ein chemisch sehr

labiles Produkt. Es kommt, wenn keine oxidativen Enzyme, wie sie in der Leber existieren,

vorhanden sind, die ihn zur ebenfalls untoxischen Carbonsäure weiteroxidieren, durch eine

basen- oder albuminkatalysierte β -Eliminierung zur Abspaltung des toxischen Acroleins und

dadurch zur Bildung des eigentlich zytotoxischen Phosphamidmustard. Die meisten Tumoren

sind zu dem oxidativen Abbau des Aldehyds nicht fähig: Die Substanz zerfällt also am Ort der

gewünschten Wirkung und setzt dabei das alkylierende Produkt frei.


O NHP

O

N

Cl

Cyclophosphamid

Cl

O NHP

O

NH

Cl

+HC

H2C ClO

N-Dechloro-Cyclophosphamid Chloracetaldehyd4-Hydroxy-CyclophosphamidAldo-Cyclophosphamid

O NHP

O

N

ClCl

OH

O P

O

NH2

N

O

Cl Cl

H

O NP

O

NH

Cl

Cl

O

4-Keto-CyclophosphamidHO O P

O

NH2

N

O

OHC

HC CH2

ON

O

Cyclophosphamid Mustard Acrolein Carboxyphosphamid

3-(2-Chloroethyl)-1,3-Oxazolidin-2-on

Cl Cl

HO P

O

NH2

N

Cl Cl

HN

Cl Cl

Nor Nitrogen Mustard

Cl+

CH2C

H2C

O

HO

3-Hydroxypropionsäure

OH

NCl

N-2-Chloroethylaziridin

+

Abb. 3.3: Metabolismus von Cyclophosphamid [45]


O NP

O

NH

Cl

Cl

Ifosfamid

O NP

O

NH

Cl

Cl

OH

O NP

O

NH

Cl

Cl

OH

HO O P

O

NH

HN

Cl

Cl

Alco-Ifosfamid

O NP

O

NH2

ClO NH

P

O

NH

Cl

OHC CH2Cl

+

OHC CH2Cl

+

O NP

O

NH

Cl

Cl

OH

HC

O P

O

NH

HN

Cl

Cl

O

4-Hydroxy-IfosfamidAldo-Ifosfamid

O NP

O

NH

Cl

Cl

O

4-Keto-Ifosfamid

HO O P

O

NH

HN

Cl

Cl

O

Carboxy-Ifosfamid

HO P

O

NH

HN

Cl

Cl

OHC

HC CH2

IfosfamidMustard

Acrolein

+

NClH

H

Chloroethylamin

ON

O

H

1,3-Oxazolidin-2-on

2-Dechloroethyl-Ifosfamid 3-Dechloroethyl-Ifosfamid

Chloroacetaldehyd Chloroacetaldehyd

Abb. 3.4: Metabolismus von Ifosfamid [46]


Im nächsten Schritt wird das Chloratom einer der 2-Chlor-Ethylgruppen abgespalten, und es

entsteht ein extrem reaktives Imonium-Ion, das durch Umwandlung in ein Carbonium-Ion nun

leicht durch in Makromolekülen vorhandenen, nucleophilen Gruppen angegriffen wird. Dadurch

wird das Stickstoff-Lost-Molekül kovalent an das Makromolekül gebunden. Die Abspaltung des

zweiten Chloratoms führt nun zur Vernetzung der beiden DNA-Stränge („cross-linking“). In

Abbildung 3-5 ist dies am Beispiel der chemisch nachgewiesenen Alkylierung des Guanin in N-7-

Position gezeigt. Diese Alkylierung hat für die DNA schwerwiegende Konsequenzen: Durch den

Übergang der normalerweise bevorzugten Ketokonfiguration von Guanin in die

Enolkonfiguration ändert sich die Spezifität der Basenpaarung. Guanin kann als Enol auch mit

Thymin ein Basenpaar bilden, wodurch der Informationsgehalt der DNA verfälscht wird.

Beheben die zelleigenen Reparaturmechanismen dies nicht, so kommt es zur Apoptose.

Abb. 3.5: DNA-Alkylierung („cross-linking“) durch Phosphamidmustard [44]


3.1.1.2 Antimetaboliten

Bei dieser Substanzklasse handelt es sich um Komponenten, die aufgrund ihrer strukturellen

Ähnlichkeit mit physiologischen Stoffwechselbausteinen (Metaboliten) im Organismus eine

höhere Affinität zu den jeweiligen Enzymen haben und daher den Einbau der eigentlichen

Bausteine verhindern oder aber bevorzugt statt derer in Stoffwechselprodukte eingebaut werden.

Auch die Antimetaboliten sind zytotoxische Verbindungen, die wegen ihres völlig unspezifischen

Verhaltens alle Zellen gleichermaßen betreffen. Die Folgen des Einbaus sind Störungen des

Stoffwechsels und des Zellwachstums.

Abb. 3.6: Hemmung der DNA-Bildung durch Antimetabolite [40]

Beispiele für typische Antimetaboliten-Klassen sind Folsäureantagonisten (z.B. Methotrexat),

Purinantagonisten (z.B. Mercaptopurin), Pyrimidinantagonisten (5-Fluorouracil) und 4-

Aminobenzoesäureantagonisten, die Verwendung als Chemotherapeutika, Zytostatika,

Immunsuppresiva, Virostatika und Gichtmittel finden.


3.1.1.3 Pflanzenalkaloide

Eine weitere Möglichkeit der Zellzyklus-Hemmung ist die Blockade der Mitose durch

Pflanzenalkaloide, die aus dem Madagaskar-Immergrün Vinca rosea gewonnen werden. Diese

beeinträchtigen den Spindelapparat z.B. in der Weise, daß die Chromosomen in der Metaphase

nicht getrennt werden, weshalb Zellen mit nicht nur verdoppeltem, sondern 4-, 8-, 16-fachem

Chromosomensatz entstehen können (Polyploidisierung z.B. durch Colchicin, Nocodazol,

Podophyllotoxin, etc.).

Abb. 3.7: Wirkung der Mitosespindelgifte [40]

Als Zytostatika finden Vinblastin, Vincristin und Vindesin Verwendung.

3.1.1.4 Antibiotika

Anders als die Alkylantien, die mit den Nukleinsäuren der Erbsubstanz kovalente Bindungen

eingehen (siehe Kapitel 3.1.2.1), liegen diese Bindungen bei der Behandlung mit Antibiotika teils

ionisch, teils als Wasserstoffbrücken- oder van-der-Waals-Bindungen vor. Aufgrund dieser

Verknüpfung mit der Doppelhelix kommt es zu Fehlern - etwa Brüche oder unpassende

Verbindungen zwischen oder in den Strängen.


Diese kann sich nicht mehr richtig replizieren. Versagen nun die Reparaturmechanismen der

Zelle, kommt es zum programmierten Zelltod, der Apoptose.

Wichtige Vertreter dieser Wirkklasse sind Anthracycline wie Doxorubicin und Adriarubicin sowie

Actinomycine und die synthetischen Antibiotika Mitoxantron und Amsacrin [47].

3.1.1.5 Hormone

Auch Östrogene, Antiöstrogene, Androgene, Antiandrogene und Gestagene werden seit

geraumer Zeit dazu eingesetzt, bösartige Tumoren in einer Chemotherapie zu behandeln. Im

Unterschied zu den bisher aufgeführten Substanzen haben Hormone keine direkte zytotoxische

Wirkweise, sondern sie verändern vielmehr die hormonellen Bedingungen des den Tumor

umgebenden Gewebes. So wirken die Hormone vermutlich indirekt über die Hormonrezeptoren

an der Oberfläche der Tumorzellen.

3.1.1.6 Sonstige

Substanzen, die aufgrund ihrer Struktur und zytostatischen Wirkungsweise keiner der oben

genannten Gruppen zugeordnet werden können, faßt man in dieser Gruppe zusammen. Dazu

gehören neben dem Pflanzenwirkstoff Podophyllotoxin und dessen Derivaten Etoposid und

Teniposid die häufig verwendeten Platinverbindungen, Cisplatin und Carboplatin. Deren

zytostatische Wirkung ähnelt der der Alkylierungssubstanzen, weshalb sie auch von einigen

Autoren zu dieser Gruppe gezählt werden. Auch sie wirken bifunktionell und interkalieren die

DNA-Stränge („cross-linking“), jedoch übertragen sie keine Alkylreste auf dieselbigen [39,48,49].

3.1.2 Toxizität, Mutagenität und Kanzerogenität von Chemotherapeutika

Der einzige Unterschied zwischen gesunden und krebsartigen Zellverbänden liegt in der Regel in

der weitaus höheren Teilungsrate der Tumorzellen. Aufgrund der meist völlig unspezifischen

Wirkungsweise der Zytostatika kommt es gerade auch bei gesunden Zellen mit kurzen

Teilungszyklen (Wechselgewebe) zu teils schweren Schädigungen. Als primäre toxische

Auswirkungen sind Haarausfall, die Zerstörung der Schleimhäute, des Knochenmarks und der

Keimzellen zu nennen.


Im Verlaufe einer Chemotherapie kommt es häufig zu Übelkeit und Erbrechen sowie teils

schwersten Durchfällen. Eine starke Reduzierung der Leukozyten hat eine erhöhte

Infektionsgefahr zur Folge. Im Hinblick auf die teilweise starke Verschlechterung des physischen

und psychischen Wohlbefindens des Patienten müssen stets sorgfältig diese Nebenwirkungen

gegen die zu erwartende Verbesserung der Lebensqualität und die Verlängerung der Lebensdauer

abgewogen werden.

Aus dem unspezifischen Wirkmechanismus und wegen des Eingreifens in den

Nukleinsäurestoffwechsel können Zytostatika mutagen und teratogen wirken, woraus auch ein

nicht unerhebliches kanzerogenes Potential resultiert, das Gegenstand zahlreicher

Untersuchungen ist [1,14,32,48,50-52]. In der neueren toxikologischen und medizinischen

Literatur werden Zytostatika durchweg als mutagen eingestuft, und man geht heute davon aus,

daß mehr als 90% aller mutagenen Verbindungen auch kanzerogene Eigenschaften haben [48,53-

58]. Während die genannten allgemein toxischen Nebenwirkungen erst ab einer bestimmten

Mindestmenge an aufgenommener Substanz auftreten, sind mutagene und karzinogene

Wirkungen prinzipiell an keine Mindestkonzentration gebunden, und der Zusammenhang

zwischen aufgenommener Menge und kanzerogener Wirkung ist nicht unbedingt linear [53-58].

In den sechziger Jahren des letzten Jahrhunderts wurde erstmals das Auftreten sogenannter

Sekundärtumoren erwähnt [13-29]. Dabei handelt es sich um Tumoren, die im Gegensatz zu den

Metastasen völlig unabhängig vom eigentlichen primären Tumor sind. Zumeist sind dies

chemotherapieresistente Leukämien. Die hierzu durchgeführten wenigen Langzeitstudien [23-

29,59-62] beziffern das absolute Risiko eines Chemotherapiepatienten, an einem solchen

Sekundärtumor zu erkranken, auf 2-10%. Werden diese Personen mit einer Kontrollgruppe mit

gesunden Probanden verglichen, so entspricht das einem relativen Krebsrisiko, das um das 9- bis

100-fache erhöht ist.

Von der International Agency for Research on Cancer (IARC) sind bislang 26 Zytostatika

untersucht und, wie im folgenden aufgeführt, eingestuft worden [5-11]:


Gruppe 1: Kanzerogen für den Menschen

Chlorambucil [305-03-3] IARC26

Cyclophosphamid [50-18-0] [6055-19-2] IARC26

Semustin [13909-09-6] IARCS7

Melphalan [148-82-3] IARC9, IARCS7

Myleran [55-98-1] IARCS7

Tamoxifen [10540-29-1] IARC66

Thiotepa [52-24-4] IARC50

Treosulfan [299-75-2] IARC26, IARCS7

MOPP und andere kombinierte Chemotherapien IARCS7einschließlich der Alkylantien

Gruppe 2A: Wahrscheinlich kanzerogen für den Menschen

Adriamycin [23214-92-8] IARC10, IARCS7

BCNU [154-93-8] IARC26, IARCS7

CCNU [13010-47-4] IARC26, IARCS7

Cisplatin [15663-27-1] IARC26, IARCS7

Procarbazine Hydrochloride [366-70-1] IARC26, IARCS7

Gruppe 2B: Möglicherweise kanzerogen für den Menschen

Bleomycins [11056-06-7] IARC26, IARCS7

Dacarbazine [4342-03-4] IARC26, IARCS7

Daunomycin [20830-81-3] IARC10, IARCS7

Mitomycin C [50-07-7] IARC10, IARCS7


Gruppe 3: Nicht klassifizierbare Kanzerogenität gegenüber dem Menschen

Actinomycin D [50-76-0] IARC10, IARCS7

5-Fluorouracil [51-21-8] IARC26, IARCS7

Ifosfamid [3778-73-2] IARC26, IARCS7

6-Mercaptopurin [50-44-2] IARC26, IARCS7

Methotrexat [59-05-2] IARC26, IARCS7

Prednimustin [29069-24-7] IARC50

Prednison [53-03-2] IARC26, IARCS7

Vinblastin sulfat [143-67-9] IARC26, IARCS7

Vincristin sulfat [2068-78-2] IARC26, IARCS7

Kein Zytostatikum wurde in die Gruppe 4 – Das Agens ist wahrscheinlich nicht kanzerogen für

den Menschen – eingestuft.

3.2 In der Bundesrepublik Deutschland eingesetzte Zytostatika undderen Verbrauchsdaten

Von den in der Welt vertriebenen mehreren hundert zytostatisch wirkenden Substanzen finden

sich rund einhundert in der vom Bundesverband der pharmazeutischen Industrie jährlich

herausgegebenen Roten Liste® [1], in dem sich 98% aller in der Bundesrepublik erhältlichen

Fertigarzneimittel mit ihren Zusammensetzungen, Anwendungsgebieten, Dosierungen und

Nebenwirkungen laut Herstellerangaben befinden. Die 71 als Zytostatika und Metastasehemmer

Verwendung findenden Substanzen werden hier zusätzlich zu den schon in Tab. 2.1 aufgeführten

in zwei weitere Gruppen eingeteilt; die Platinverbindungen und die Interferone werden als

gesonderte Gruppe angesehen. Über diese Anzahl hinaus befindet sich noch eine Reihe weiterer

zytostatisch wirkender Verbindungen in den klinischen Phasen respektive im

Zulassungsverfahren, die nicht in dieser Auflistung zu finden sind. Wieder andere sind

zugelassen, werden aber in Deutschland nicht vertrieben.


Die Gesamtjahresproduktion aller Zytostatika in der Bundesrepublik Deutschland wird auf

ungefähr 5 Tonnen geschätzt [30]. Wegen der an den behandelnden Kliniken weit verbreiteten

Tendenz zur Hochdosis-Therapie ist mit einer weiterhin steigenden Nachfrage und somit auch

Produktion dieser Substanzen zu rechnen. An genaue Verbrauchszahlen einzelner Verbindungen

zu gelangen, hat sich immer wieder als äußerst schwer herausgestellt. Die bis dato umfangreichste

Untersuchung dieser Art wurde im Jahre 1992 von der Arbeitsgruppe Götze et al. der Ruhr-

Universität Bochum durchgeführt [63], auf deren Ergebnisse im folgenden eingegangen wird. Die

Befragung umfaßt den Jahresverbrauch von Zytostatika von 19 Krankenhausapotheken in

Deutschland. Der Übersicht halber sind die Ergebnisse in vier verschiedenen Säulendiagrammen

dargestellt. Den ersten beiden Abbildungen (Abb. 3.8 und 3.9) ist der Verbrauch aller Apotheken

zu entnehmen. Jedoch sind die Verbrauchsdaten teilweise höchst unterschiedlich, so daß die y-

Achse bei einem Jahresverbrauch von 1000g/a abgeschnitten wurde. Während Zytostatika mit

einem Verbrauch von weniger als 100g/a gar nicht erst in dieser Graphik erscheinen, werden die

sieben Krankenhäuser mit dem höchsten Verbrauch noch einmal in den beiden Abbildungen

3.10 und 3.11 exakt gezeigt.

Abb. 3.8: Verbrauchsdaten von Zytostatika nach einer Befragung von 19 Krankenhausapotheken [63]

13

57

911

1315

1719

Cisplatin

Methotrexat

EstramustinCytarabin

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0

200

400

600

800

1000Verbrauch

[g/Jahr]

Krankenhäuser


Abb. 3.9: Verbrauchsdaten von Zytostatika nach einer Befragung von 19 Krankenhausapotheken [63]

Abb. 3.10: Daten der sieben Krankenhäuser mit dem höchsten Verbrauch nach einer Befragung von

19 Krankenhausapotheken 1992 [63]

13

57

911

1315

1719

Etoposid

5-Fluorouracil

Ifosphamid

Cyclophosphamid

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0

200

400

600

800

1000

Verbrauch [g/Jahr]

Krankenhäuser

2 3 9 12 13 18 19

Etoposid

5-Fluorouracil

Cyclophosphamid

Ifosfamid

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0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

Verbrauch [g/Jahr]

Krankenhaus


Abb. 3.11: Daten der sieben Krankenhäuser mit dem höchsten Verbrauch nach einer Befragung von

19 Krankenhausapotheken 1992 [63]

Die Daten dieser Untersuchung zeigen ganz deutlich, daß es erhebliche Unterschiede in der Art

und im Verbrauch der Zytostatika existieren. Lediglich acht dieser Verbindungen werden in

Mengen von mehr als 100g/Jahr eingesetzt. Wird berücksichtigt, daß es immer mehr zu

Kombinationen bestimmter Substanzen in der Chemotherapie kommt, um in alle Phasen des

Zellzyklus eingreifen zu können, kann dieses Ergebnis erklärt werden. Die beiden Verbindungen

mit dem höchsten Umsatz sind Ifosfamid und Cyclophosphamid aus der Klasse der Alkylantien.

Auch die restlichen Verbindungen zeigen alkylierende Eigenschaften auf: Während das dem

Estradiol strukturverwandte Estramustin und das Pflanzenalkaloid Etoposid, das als

Topoisomerase-II-Hemmer fungiert, ebenfalls u.a. kovalente Bindungen mit der DNA eingehen,

basieren die zytostatischen Eigenschaften des Cisplatin auf vergleichbaren [32,33,48,64-66].

Die Angaben in medizinisch-pharmazeutischen Lehrbüchern bestätigen die Aussage dieser

Umfrage. Die obigen Zytostatika werden im Vergleich zu den Antibiotika und Hormonen in

großen Mengen pro Tag und Patient und bevorzugt in der Kombinationstherapie eingesetzt [32-

36,48]

2 3 9 12 13 18 19

Cisplatin

Methotrexat

Estramustin

Cytarabin

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0

500

1000

1500

2000

2500

Verbrauch [g/Jahr]

Krankenhaus


Tab. 3.3: Zytostatika-Verbrauchsdaten in Krankenhäusern nach einer Befragung von 19

Krankenhausapotheken 1992 [63]

Klinik Verbrauchsmengen [ g/a]

Cisplatin Cyclo-phos-

phamid

Cytarabin Etoposid Estra-mustin

5-Fluoro-uracil

Ifos-famid

Metho-trexat

1 3,4 ---- ---- ---- ---- 1000 ---- 433

2 31,2 962 ---- 1000 1000 77 ---- 8,8

3 6 40 ---- ---- 540 125 50 5,8

4 32,8 319,5 111 ---- ---- 437 250 50,7

5 3,7 205 ---- ---- 27 337,5 280 30

6 13,9 361 24 ---- ---- 175 120 21,6

7 267 356,4 ---- 70,8 ---- 493,5 170 55,4

8 223,2 536,6 117,2 ---- 680 360 ---- 534,4

9 400,2 1000 1000 662,2 ---- 891,5 1000 762

10 2,7 325,5 792,8 36,1 ---- 1,3 26,4 47,3

11 45,7 366,9 706,4 91,5 ---- 224 306,5 108,2

12 43,4 481,4 ---- 577,5 ---- 341 1000 20

13 109 1000 472 7 ---- 1000 940 150

14 16,3 139,7 ---- 13,6 ---- 599,5 6 11,1

15 5,9 444 10,5 60 ---- 640 550,8 3,5

16 49 251,4 226,4 38 481,6 217,5 331,5 32,5

17 1 67,7 18,8 4,5 ---- 42,5 ---- 0,4

18 73,7 1000 491,1 157 ---- 1000 1000 147,5

19 124,9 1000 1000 297,5 173,5 686 1000 547,5

Summe 1453 6077 4970 1945 2902 5643 6161 2970


3.3 Umweltrelevanz von Zytostatika

Erst in den letzten Jahren tritt das Gefährdungspotential von Zytostatika für die Umwelt aus dem

Schatten der zahlreichen Untersuchungen bezüglich des Patientenmonitorings. Auch

arbeitsmedizinische Untersuchungen, die sich mit der Gefahr für Personen, die beruflich

während der Produktion, Zubereitung und Applikation dieser Substanzen exponiert sind, wurden

durchgeführt [59-61,67-77]. Dieses Problems hat man sich in den letzten Jahren verstärkt

angenommen, da für kanzerogene Stoffe keine unbedenkliche Geringstkonzentration angeben

werden kann und der oben genannten Personenkreis stets einer geringen Menge am Arbeitsplatz

ausgesetzt ist.

3.3.1 Eintragspfade der Zytostatika in die Umwelt

Wird der mögliche Eintragspfad der Zytostatika genauer betrachtet, so offenbaren sich viele

mögliche Gefahren, denen verschiedenen Menschen, die mit diesen Stoffen in Berührung

kommen können, drohen (Abb. 3.12): Gerade während der Produktion kann es schon, vor allem

wegen der immer weiter steigenden Tendenz zur Hochdosis-Therapie und somit der hohen

Produktionsrate, zur Bildung von Stäuben, kontaminierten Abfällen und Abwässern kommen.

Über das Ausmaß kann wegen des Betriebsgeheimnisses nur spekuliert werden [59,60]. Ein hohes

Risiko der Kontamination beteiligter wie unbeteiligter Personen besteht vor allem beim

Transport. Werden die Zytostatika vom Produzenten zur Apotheke oder Klinik auf dem Postweg

verschickt, so müssen sie nur als Medikamente, nicht aber als Gefahrgut gekenntzeichnet werden,

was zur Folge hat, daß keinerlei weitere Schutzmaßnahmen, wie z.B. Hinweise zur Verhalten bei

Transportschäden, getroffen werden müssen. Ist bei der Abfüllung der Arzneimittel nicht

sorgfältig gearbeitet worden oder ist es zu einem nicht bemerkten Bruch während des Transports

gekommen, birgt dies neue Gefahrenquellen durch den Hautkontakt über kontaminierte

Außenverpackungen [61].

Eine weiterer Gefahrenbereich ist die Zubereitung der Applikationen. Auch hierbei kommt es zu

Belastungen der beiteiligten Personen und der Umwelt über die Luft, den entstehenden Abfall

und über direkten Hautkontakt. Auch die Verwendung von Sicherheitswerkbänken (laminar

flow) bietet nicht immer ausreichenden Schutz. Da nach neuen Untersuchungen manche

Zytostatika einen meßbaren und vergleichsweise hohen Dampfdruck besitzen und die

Sicherheitswerkbänke häufig noch mit Umluft und entsprechenden Filtermatten betrieben

werden, kann von einer Belastung der umgebenden Raumluft ausgegangen werden [59,60,78].


Abb. 3.12: Eintragspfade der Zytostatika in die Umwelt [79]

Produktion

Transport (Post)

Zubereitung Sicherheits-werkbänke

Transport (Haus)

Applikation Abfall

Abwasser

KläranlageKlärschlamm Ablauf

Gewässer

Abfall

AbluftAbfall

Abwasser Hautkontakt

Filtermatten

AbfallVerpackungsbruch

Ausscheidungen Hautkontakt

Hautkontakt

Hautkontakt

Luftkontakt

VerpackungsbruchAußenkontamination

Dünger

Abluft

Nahrungskette


Ebenso haben Untersuchungen kürzlich ergeben, daß es trotz sorgfältigen Arbeitens bei der

Herstellung applikabler Lösungen von Cyclophosphamid in Werkbänken, die mit einem

Fortluftsystem ausgestattet sind, zu einer erheblichen Belastung der umgebenden Raumluft

kommt, die hauptsächlich in der Gasphase und nicht Partikelform vorliegt [78].

Beim Transport innerhalb des Krankenhauses oder bei einer ambulanten Behandlung im Hause

des Patienten besteht erneut die Gefahr des Bruches der Verpackung und der enthaltenen

Behältnisse. Weiterhin ist zu beachten, daß die Kontaminationsgefahr durch Zytostatika nach der

Verabreichung weiterhin besteht, da viele Zytostatika über Urin, Faeces, Erbrochenes, Atem oder

Schweiß teilweise unverändert respektive zu einem nicht unbedeutenden Teil auch in Form von

ebenfalls hochtoxischen und kanzerogenen Metaboliten wieder ausgeschieden werden. Gerade

bei den in dieser Arbeit untersuchten beiden Alkylantien Cyclophosphamid und Ifosfamid liegen

die Ausscheidungsraten der unmetabolisierten Muttersubstanz je nach Autor bei 10-20% [80,81].

Auf diesem Weg gelangt ein beträchtlicher Teil in das Abwasser der behandelnden

Krankenhäuser oder bei ambulanter Applikation umgehend in kommunale Abwässer.

Untersuchungen von Kümmerer et al. und Kiffmeyer haben gezeigt, daß ein biologischer Abbau

der Zytostatika in einem closed-bottle-Test bzw. einer Modellkläranlage häufig nur teilweise oder

gar nicht stattfindet [82-85,172]. Dadurch ist eine Belastung der Kläranlagenabläufe und des

entstehenden Klärschlamms zu befürchten.

Zusammenfassend ist festzuhalten, daß im Laufe der Herstellung, des Transports und der

Applikation von Zytostatika sowie durch Patientenausscheidungen erhebliche Risiken für die an

diesem Verlauf beteiligten wie unbeteiligten Personen besteht. Daher bedarf es einer

leistungsfähigen Analytik, die in der Lage ist, auch geringste Zytostatikabelastungen in den

verschiedenen Matrices zu bestimmen und somit ein Belastungsmonitoring von

Krankenhauspersonal, Luftmonitoring in Krankenhausapotheken sowie die Überwachung von

Krankenhausabwässern ermöglicht.


3.3.2 Belastung der aquatischen Umwelt

Das mögliche und teilweise auch nachgewiesene Vorkommen von Zytostatika in der aquatischen

Umwelt hat mehrere Ursachen. Sowohl Unfälle als auch unsachgemäße Entsorgung jedweder Art

führen zu einer erheblichen Belastung der Abwässer. Jedoch erfolgen in Deutschland die

Zytostatika-Applikationen in der Regel durch Infusionen oder orale Gaben stationär im Bereich

der Krankenhäuser und Klinken. Hier gelangen die Ausgangssubstanzen durch die

Ausscheidungen der Patienten zu einem großen Teil unmetabolisiert oder in Form der

zytostatisch wirkenden Metaboliten in die Klinikabwässer [32,51,58,86,87], wodurch sie zum

Gesamteintrag von Pharmaka ins Abwasser [88-97] und zu dessen mittlerweile nachgewiesener

Mutagenität beitragen [98,99].

In der Literatur sind nur wenige Stellen über den tatsächlichen Nachweis von Zytostatika in

aquatischen Umweltkompartimenten zu finden. Erstmals wurde 1985 im Ablauf einer

onkologischen Klink in Großbritannien Methotrexat nachgewiesen. Die daran angeschlossenen

Oberflächengewässer wiesen allerdings keine Belastungen auf [90]. Ebenfalls in England wurde

fünf Jahre später das zytostatisch wirksame Antbiotikum Bleomycin sowohl in einem

Kläranlagenabfluß als auch in Fluß- und Trinkwasser gefunden [99]. Die Arbeitsgruppe um

Kümmerer in Freiburg hat im Jahre 1996 den Abwasserstrom einer Freiburger Klinik und die

Teilströme der daran angeschlossenen kommunalen Kläranlage untersucht [85]. Es konnten

sowohl in den Kläranlagenzu- und -abläufen als auch im Klinikabwasser die beiden Stickstoff-

Lost-Derivate Cyclophosphamid und Ifosfamid detektiert werden. Tabelle 3.4 sind die genaue

Ergebnisse dieser Untersuchungen zu entnehmen.

Bezüglich der Verteilung, der Stabilität und des biologischen Abbaus von Zytostatika in

Abwässern sind einige Untersuchungen der Arbeitsgruppen von Kümmerer in Freiburg und

Götze in Bochum unternommen worden. Während die in dieser Arbeit untersuchten

Cyclophosphamid und Ifosfamid sowohl in dem in Freiburg durchgeführten closed bottle test als

auch in dem Abbauversuch in einer Modellkläranlage an der Ruhr-Universität Bochum keinen

biologischen Abbau zeigten, wurden die Verbindungen Treosulfan, Cytarabin, Methotrexat und

5-Fluorouracil teilweise oder vollständig abgebaut. Die entsprechenden Literaturstellen sind in

Tabelle 3.5 aufgeführt.


Tab. 3.4: Literaturstellen zum Nachweis von Zytostatika in verschiedenen Umweltkompartimenten

Zytostatikum Probennahmeort Konzentration Jahr Zitat

Methotrexat Abfluß Onkologische Klinik 1 µg/L 1985 [90]

Bleomycin

Kläranlagenabfluß

Flußwasser

Trinkwasser

11-19 ng/mL

5-17 ng/mL

5-13 ng/mL

1990 [99]

Cyclophos-phamid

Zu/Ablauf der Kläranlage

Klinikabwasser

bis 60 ng/L

4,5 µg/L1996 [85]

IfosfamidZu/Ablauf der Kläranlage

Klinikabwasser

bis 60 ng/L

1,9 µg/L1996 [85]

Tab. 3.5: Literaturstellen zum biologischen Abauverhalten von Zytostatika

Zytostatikum Testverfahren Abbaurate Jahr Zitat

Cyclophosphamid

Ifosfamid

Closed Bottle Test (OECD 301 D)


0 %

0 %

1996

1996

[84]

[84]

Mitoxantron

Treosulfan



0 %

30%

1997

1997

[100]

[100]

MethotrexatManometric Respirometry Test

(OECD 301 F)< 60% 1997 [101]

Cisplatin

Cyclophosphamid

Cytarabin

5-Fluorouracil

Methotrexat

OECD Sreening Test (TensV)

OECD Confirmatory Test (TensV)




0 %

0 %

60 %

100 %

98 %

1998

1998

1998

1998

1998

[102]

[102]

[102]

[102]

[102]


Abbau bedeutet hier, daß eine Konzentrationsabnahme der Ausgangssubstanz stattfand. Es

werden keine Aussagen darüber getroffen, ob der Abbau vollständig verläuft bis hin zu Wasser

und Kohlendioxid oder ob es sich hierbei um eine Umwandlung in Metaboliten handelt, die wie

im Falle des Methotrexat in einem Primärabbau in eine strukturverwandte Struktur umgeformt

wird, die aber ebenfalls zytotoxisch wirksam ist (Hier: 7-Hydroxy-Methotrexat). Über das

Vorkommen, Verhalten und den biologischen Abbau von Zytostatika-Metaboliten existieren nur

wenige Veröffentlichungen.

3.3.3 Belastung der Luft

Bisher waren noch keine Daten über die Emissionen von Zytostatika aus Produktionsbetrieben

oder aus zentralen Krankenhausapotheken bekannt. Einige Untersuchungen befassen sich mit

Arbeitsplatzmessungen zur Bestimmung der Massenkonzentration von partikelgebundenen

Zytostatika in der Raumluft [103-109]. Im Zuge des Arbeitsschutzes wurden Wisch- und

Luftproben genommen, der Urin von pharmazeutischen und pflegedienstlichen Angestellten

analysiert sowie die Permeabilität für Zytostatika von Handschuhe untersucht. Die erhaltenen

Meßergebnisse der Luftproben ergaben für die partikelgebundenen Zytostatika aufgrund

unterschiedlicher Probenahmetechniken und weiterer Schritte stark voneinander abweichende

Ergebnisse.

Neueste Forschungsergebnisse haben gezeigt, daß sowohl eine partikuläre als auch eine

gasförmige Bildung von Cyclophosphamid möglich ist [78]. Bei diesem Forschungsvorhaben

wurden die Apotheke eine Universitätsklinik und die eines städtischen Krankenhauses während

unterschiedlicher Arbeitsphasen beprobt. Bemerkenswert ist, daß die in der Gasphase

gefundenen Konzentrationen von Cyclophosphamid stets signifikant höher waren als die des

partikelgebundenen (Tabellen 3.5 und 3.6).


Tab. 3.5: Massenkonzentrationen von Cyclophosphamid in den Emissionen aus Zubereitungsräumen

für Zytostatika [78]

Massenkonzentration[µg/m3]

Universitätsklinik

Partikelphase Gasphase

Ohne Zubereitung mitlaufender Sicherheitswerkbank < 0,003 13

Zubereitung nurCyclophosphamid

(30 x 400 bis 700 mg)< 0,003 < 0,012

Routinezubereitung(Anteil Cyclophosphamid 2 g) < 0,003 0,027

Tab. 3.6: Massenkonzentrationen von Cyclophosphamid in der Raumluft von Zubereitungsräumen

für Zytostatika [78]

Massenkonzentration[µg/m3]

Universitätsklinik Städtische Klinik

Partikelphase Gasphase Partikelphase Gasphase

Ohne Zubereitung mit laufenderSicherheitswerkbank < 0,003 0,6 0,006 - 0,0065 0,045 - 0,145

Zubereitung nur Cyclophosphamid(30 x 400 bis 700 mg) < 0,003 3,9 Nicht

bestimmtNicht

bestimmt

Zubereitung nur Cyclophosphamid(100 x 1000 mg)

Nichtbestimmt

Nichtbestimmt < 0,003 0,11

Routinezubereitung(Anteil Cyclophosphamid 2 g) 0,017 - 0,223 0,017 Nicht

bestimmtNicht

bestimmt


3.3.4 Belastung des Bodens

Untersuchungen haben ergeben, daß es zu Belastungen der Böden durch Antibiotika durch das

Aufbringen kontaminierter Klärschlämme kommt. Hierbei handelt es sich aber nur um

entsprechende Substanzen für den Veterinärbereich. Es liegen jedoch noch kaum Daten zur

Bodenbelastung bzw. zum Verhalten von Zytostatika in Böden vor. Eine Forschungprojekt hatte

das Adsorptionsverhalten von Etoposid, Methotrexat und 5-Fluorouracil zum Inhalt [78]. Dabei

zeigte sich in einem Modellversuch, daß bei den jeweiligen Substanzen keine Adsorption

festzustellen war. Jedoch konnte bei der Extraktion eindeutig 7-Hydroxy-Methorexat

nachgewiesen werden. Dies bestätigt die Vermutung, daß es sich bei der Elimination von

Methotrexat um eine Hydrolyse in 7-Hydroxy-Methotrexat handelt, der damit prinzipiell in der

Lage ist, an der Oberfläche von Klärschlämmen zu adsorbieren, weshalb ein Ausbringen

kontaminierter Schlämme zu einer Belastung der Boden führen kann. Jedoch konnten keine

positiven Befunde bezüglich dieser Komponente bei der Untersuchung realer Proben festgestellt

werden.


3.4 Analytik von Zytostatika

Die analytischen Bestimmungsverfahren für Zytostatika bezogen sich seit Beginn dieser

Untersuchungen vor 40 Jahren zumeist auf das in Krankenhäusern für die Einstellung der

Chemotherapie-Patienten benötigte Monitoring. Hierbei müssen die Konzentrationen der

Verbindungen in physiologischen Matrices von medizinisch-diagnostischer Bedeutung wie Urin

und Blut gemessen werden, um sie mit der dem Patienten verabreichten Menge an Substanz in

Relation setzen zu können. Dieses Verhältnis läßt Rückschlüsse auf den Umsetzungsgrad der

Verbindungen im Körper und somit auf einen möglichen Behandlungserfolg zu [32,33,110-116].

In der medizinisch-pharmazeutischen Literatur sind für die Untersuchung der Verteilung der in

der vorliegenden Arbeit untersuchten Muttersubstanzen und ihrer Metaboliten im Körper einige

Methoden zu finden [45,46,117-133]. Diese pharmakokinetischen Untersuchungen beschäftigen

sich mit den Voraussetzungen für die Resorption der Pharmaka im Organismus, also um deren

Bioverfügbarkeit.

In den letzten 15 Jahren wurden diese Bestimmungsmethoden für Zytostatika auch zur

Überprüfung der Belastung beruflich exponierter Berufgruppen wie Ärzte, Krankenpfleger und

ambulante Pflegekräfte angewendet [59-62,67,71,134-136].

Während im Blut und Urin von Chemotherapie-Patienten zum Teil äußerst hohe

Konzentrationen dieser Verbindungen auftreten, so sind in physiologischen Flüssigkeiten des

Krankenhauspersonal weitaus geringere Mengen zu erwarten, da dieser Personenkreis einer

niedrigeren, aber chronischen Zytostatika-Belastung ausgesetzt sind. Naturgemäß ist eine

Verbesserung der Nachweisstärke der Analysemethoden für diese Arbeitsschutzmaßnahmen

notwendig. Eine weitere arbeitsmedizinische Fragestellung waren und sind in den letzten Jahren

die Untersuchungen der Belastung durch Stäube und Aerosole in Krankenhaus-Apotheken,

onkologischen Stationen und Produktionsstätten. Vereinzelt wurden diese durch Wisch- und

Luftprobenahmen untersucht [137,138].

Die Untersuchung des Umweltmediums Wasser und hier im speziellen Fall das Oberflächen-

sowie das Abwasser stellt die Analytik der Zytostatika und ihrer Metaboliten vor weitere

Schwierigkeiten. So treten zum einen die Verbindungen in noch weitaus geringeren

Konzentrationen auf als bei den oben genannten Fällen, und zum anderen handelt sich hierbei

um eine sehr inhomogene und teilweise extrem stark belastete Matrix. Es ist also ein

nachweisstarkes und selektives Bestimmungsverfahren der Verbindungen verbunden mit einer

effektiven Spurenanreicherung aus einer komplexer Matrix notwendig.


Hier liegen verglichen mit der Anzahl der Methoden zum Patienten- und Belastungsmonitoring

nur wenige Literaturstellen vor (Tab. 3.4). Zur analytischen Bestimmung der hier untersuchten

Stickstoff-Lost-Derivate Cyclophosphamid und Ifosfamid sowie deren Metabolite wurden bisher

vor allem gas- und flüssigchromatographische Methoden mit verschiedenen Detektoren

verwendet. Die gaschromatographische Trennung der Komponenten von den

Matrixbestandteilen hat sich im Laufe der Zeit gegenüber den flüssigchromatographischen

Methoden aufgrund der höheren und schnelleren Trennleistung sowie der empfindlicheren und

nachweisstärkeren Detektionssysteme (z.B. MS) durchgesetzt. Obwohl die aufwendige und mit

Verlusten behaftete Probenaufbereitung bei der HPLC entfällt, sind mit der GC weitaus

niedrigere Nachweisgrenzen zu erreichen. Jedoch ist es in neuesten Untersuchungen möglich

gewesen, bei der Verwendung einer HPLC-MS/MS-Kopplung eine ähnlich gute

Nachweisempfindlichkeit zu erreichen [139]. Erstmals konnten 1997 Cyclophosphamid und das

Strukturisomer Ifosfamid mittels GC-MS-Kopplung in Konzentrationen von bis zu 60ng/L in

verschiedenen Strömen einer Kläranlage nachgewiesen werden [85,86]. In verschiedenen

Veröffentlichungen konnten die interessierenden Metaboliten im Blut mit einer speziellen

Ionisierungstechnik (Negative Chemische Ionisierung) im Massenspektrometer analysiert werden

[133].

4 Auswahl der untersuchten Zytostatika 33

4 Auswahl der untersuchten Zytostatika

4.1 Auswahlkriterien

Das sicherlich ausschlaggebende Auswahlkriterium zur Untersuchung des Verhaltens von

Humanarzneimitteln ist deren Umweltgefährdungspotential. In der Europäischen Union erfolgen

Untersuchungen zum Umweltgefährdungspotential von Chemikalien und Pflanzenschutzmitteln

nach vereinheitlichten Grundprinzipien, für Humanpharmaka hingegen liegen bisher keine

standardisierten Bewertungsverfahren vor. Lediglich für neue Tierarzneimittel wurde 1996 eine

Richtlinie zur Durchführung eines sogenannten Environmental Risk Assessments verabschiedet

[140]. Die Schätzung dieses Potentials basiert stets auf der Betrachtung substanzbezogener Daten

und anderen gesetzlich verlangten und umweltrelevanten Informationen. Des weiteren geschieht

sie in der Regel durch den Vergleich ihrer in der Umwelt gefundenen bzw. prognostizierten

Konzentration mit denjenigen, die für repräsentative Arten oder Ökosysteme toxisch sind. In

Kapitel 4.2 wird näher auf diese Problematik eingegangen.

Ein weiteres Auswahlkriterium ist die Tatsache, daß es sich bei den beiden Muttersubstanzen um

zwei der am häufigsten verschriebenen Pharmazeutika zytostatischer Wirkung handelt, die auch

hohe Wiederauscheidungsraten von bis zu 65% - je nach medikamentöser Einstellung und

physischer Verfassung des Patienten - besitzen. Auch von den jeweiligen Metaboliten wird

vermutet, daß sie teilweise starke mutagene und kanzerogene Eigenschaften besitzen [F40,41,44

G18,19,21]. Weiter erscheint es sinnvoll, das Vorkommen einiger der im Körper zu einem großen

Teil gebildeten und ausgeschiedenen Stoffwechselprodukte zu überprüfen, da über deren

Vorkommen und Verhalten im Umweltkopartiment Wasser keinerlei Daten vorliegen.

Als Einschränkung soll hier die analytische Bestimmung mit der zur Verfügung stehenden GC-

MS-Kopplung genannt werden. Die Substanzen mußten sich, wenn nötig auch mittels zur Hilfe

genommener Derivatisierungsreaktionen, mit dieser chromatographischen Methode bestimmen

lassen.


4.2 Ökotoxikologische Bewertung

Das Bewertungsverfahren für Chemikalien basiert auf einem Vergleich der Exposition mit der

Wirkung. Dies wird durch den Quotienten der erwarteten Konzentration in der Umwelt –

„Predicted Environmental Concentration“, PEC – und der Konzentration, bei der keine Effekte

zu erkennen sind – „Predicted No Effect Concentration“, PNEC ausgedrückt.

1≥PNEC

PEC

Ist dieser Wert größer als 1, ist mit einem Auftreten wirkungsauslösender Konzentrationen in der

Umwelt zu rechnen, ist er kleiner, so sind keine weiteren Untersuchungen erforderlich. Dies gilt

jedoch nicht für Verbindungen mit kanzerogenen Eigenschaften wie z.B. Zytostatika.

Wichtig für eine Risikoabschätzung von Pharmaka sind im einzelnen [78]:

� Eintrag und Verbleib in der Umwelt

Wichtig ist vor allem zu klären, wieviel von einer Substanz auf welchem Wege in die aquatische

Umwelt gelangt. Dabei spielen die applizierte Menge der jeweiligen Substanz und deren

Ausscheidungsraten eine wichtige Rolle. Bei Humanpharmaka erfolgt ein wesentlicher Eintrag

der Wirkstoffe und ihrer Metaboliten über den Urin, Faeces oder das Erbrochene der

behandelten Patienten. Besonderes Augenmerk ist dabei auf den Eintrag in die Klinkabwässer

und die kommunalen Kläranlagen zu richten. Handelt es sich bei den Verbindungen um

hydrophile Substanzen, so kann davon ausgegangen werden, daß diese in den verschiedenen

aquatischen Umweltkompartimenten wie Oberflächengewässern und im Grundwasser äußerst

mobil sind und es nicht zu Adsorptionen an Sedimenten, Schlämmen oder Schwebstoffen

kommt. Bei lipophilen Substanzen hingegen kann es zu Bioakkumulation in Organismen

kommen. Bei der Betrachtung der Bioverfügbarkeit ist ebenfalls der mögliche biologische und

abiotische Abbau der Verbindung und ihrer Metabolite zu berücksichtigen.


� Wirkung

Die Wirkabschätzung zielt darauf ab, ein Maß für die toxischen Effekte auf die Organismen des

Ökosystems zu finden. Dazu werden entsprechende Wirkkonzentrationen in standardisierten

Labortests ermittelt. In der Regel werden akute Tests mit Fischen, Daphnien, Algen und

Mikroorganismen durchgeführt, um durch diese Kombination von Testspezies und

Testmethoden die reale Situation zu simulieren, die durch einzelne Tests nur mangelhaft zu

beschreiben wäre.

Auch dieses Vorgehen birgt wie alle Labortests noch eine Variabilität der Daten, vor allem wegen

des Übergang von akuten auf chronische Toxizitätsdaten und synergistischer Effekte. Auf der

Basis von Labordaten werden diese Umstände durch einen Unsicherheitsfaktor von 10

berücksichtigt.

Als Basisdaten sind folgende Angaben bei Vermarktungsmengen von weniger als 100t im Jahr

erforderlich:

- Akute Fischtoxizität LC50 (96h)

- Akute Daphnientoxizität EC50 (48h)

- Akute Algentoxizität EC50 (72h)

- Wachstumshemmung bei Mikroorganismen EC50

- Biologischer Abbau

- Abiotischer Abbau (Ad- und Desorption für nicht leichtabbaubare Substanzen)

Bislang sind kaum Daten über die ökotoxikologischen Wirkungen von Pharmaka bekannt. Hinzu

kommt, daß vielfach die chemische Analytik nicht in der Lage ist, die Substanzen und deren

Metabolite in den umweltrelevanten Konzentrationen nachweisen zu können, was einer

Risikoabschätzung für die meisten Zytostatika seiner wesentlichen Elemente beraubt.

Für die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Muttersubstanzen sind die notwendigen

Angaben vorhanden und den nachfolgenden Tabellen 4.1 und 4.2 zu entnehmen. Bezüglich der

Bewertung der Stoffwechselprodukte fehlen viele Daten, um auch nur annähernd eine Aussage

über das ökotoxikologische Gefährdungspotential dieser Metaboliten machen zu können. Um

jedoch das Verhalten der beiden Alkylantien Cyclophosphamid und Ifosfamid in der aquatischen

Umwelt umfassender beschreiben zu können, ist es wichtig, ebenfalls mögliche Folgeprodukte in

den entsprechenden Kompartimenten nachweisen zu können.


Tab. 4.1: Physikalisch-chemische Eigenschaften, Abbaubarkeit in aquatischen Umweltkompartimenten

und Konzentrationen in Realproben von Cyclophosphamid und Ifosfamid.

Cyclophosphamid Ifosfamid Literaturstelle

Physikalisch-chemischeEigenschaften

Wasserlöslichkeit 40.000 mg/L 100.000 mg/L [43, 141]

Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient(log Pow)

-0,49 -0,9 [84]

Adsorptionskoeffizientfür Boden undSediment

12,85 7,76 [84]

Biokonzentrations-faktor 11,81 7,41 [84]

Abbaubarkeit

Abbau (28 d)OECD 301 E

< 1% < 1% [82]

Closed bottle-Test 0 % 5-7 % [84]

Zahn-Wellens-Test Keine Elimination Keine Elimination [84]

Kläranlagen-Simulationstest

< 5 %keine Toxizität

< 5%keine Toxizität

[82]

Nachweis inaquatischenUmwelt-kompartimenten

Kläranlagenzu- und-ablauf

bis 60 ng/L bis 60 ng/L [84]

Klinikabwasser 4,5 µg/L 1,9 µg/L [84]


Tab. 4.2: Ökotoxikologische Daten von Cyclophosphamid und Ifosfamid

Cyclophosphamid Ifosfamid Literaturstelle

Ökotoxizität

Akute Fischtoxizität

Salmo gairdneriNOEC (96 h)LC50 (96 h)(OECD 203)

> 984 mg/L > 555 mg/L> 1.000 mg/L

[141,142]

AkuteDaphnientoxizität

Daphnia magnaNOEC (48 h)EC 50 (48 h)(OECD 202)

> 987 mg/L 100 mg/L162 mg/L

[141,142]

Bakterientoxizität

PseudomonasputidaEC 10 (16 h)DEV/DIN 38412 T 8

> 10.000 mg/L > 10.000 mg/L

[141,142]

Keine antimikrobielleAktivität gegenüberanaeroben gram-negativen oder –positiven Bakteriensowie Hefen

[143]

KeineWachstumshemmungbei Staphylococcus a ureus,Entorococcus faeces,Pseudomonas aeroginosa,Candida alba

bei 9 mg/L

KeineWachstumshemmungbei Staphylococcus a ureus,Entorococcus faeces,Pseudomonas aeroginosa,Candida alba

bei 9 mg/L

[114,145]

Bakteriostatisch bei2 g/L, bakterizid ab3 g/L für Salmonellatyphimurium

[146]


4.3 Ausgewählte Zytostatika

Ziel dieser Arbeit war es, durch die Entwicklung neuer respektive die Optimierung vorhandener

Analysenverfahren, eine Möglichkeit zu schaffen, in Zukunft die durch die in großen Mengen

verabreichten Muttersubstanzen Cyclophosphamid und Ifosfamid und die ebenfalls entstehenden

und teilweise hochtoxischen Metaboliten hervorgerufene Gefährdung der Umwelt und damit

auch des Menschen besser einschätzen zu können. Hier wurden diejenigen Stoffwechselprodukte

untersucht, die zum einen entweder käuflich zu beziehen waren oder aber vom Hersteller der

Ausgangssubstanzen zur Verfügung gestellt werden konnten. Ein weiterer Beweggrund war das

bekannte oder nicht einschätzbare Umweltgefährdungspotential dieser Verbindungen. Es

handelte sich hierbei neben Cyclophosphamid und Ifosfamid um 4-Keto-Cyclophosphamid,

Carboxyphosphamid, Cyclophosphamid Mustard, 4-Keto-Ifosfamid, Carboxyifosfamid,

Ifosfamid Mustard, 1,3-Oxazolidin-2-on und 2-Chlorethylamin.

5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten 39

5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten

5.1 Der Gaschromatograph

Die GC ist wie alle anderen chromatographischen Verfahren eine Trennmethode, die sowohl zur

Gewinnung reiner Stoffe als auch zur Durchführung qualitativer und quantitativer Analysen von

Mischungen eingesetzt werden kann.

Die beiden prinzipiell wichtigsten Bestandteile gaschromatographischer Trennsysteme sind die

Trennsäule und der Detektor. In den unter Trägergasdruck stehenden Probenaufgabeteil, den

Injektor, wird mittels einer Mikroliter-Spritze ein bestimmtes Volumen eines Stoffgemisches (1

bis 250µL) über ein selbstdichtendes Septum eingebracht. Flüssige Proben werden in einem

ersten Schritt durch schnelles Erwärmen des sich im Injektor befindlichen Glasröhrchens (Liner)

verdampft und mit Hilfe des inerten Trägergases (Stickstoff, Helium, Wasserstoff) auf die mit

dem Injektor verbundene Trennsäule überführt. Die vom Trägergas durchströmte Gepackt- oder

Kapillarsäule ist in einem Ofen angebracht, so daß die in ihr ablaufende Trennung des

Substanzgemisches durch Anlegen eines Temperaturgradienten bzw. durch temperaturkonstante

Perioden optimiert werden kann. Chromatographische Säulen unterscheiden sich im allgemeinen

durch die Effizienz der mit ihnen erreichbaren Trennungen durch die Selektivität der in ihr

enthaltenen stationären Phasen und durch ihre Belastbarkeit mit der Probe. Spezielle

Unterschiede ergeben sich durch die Arten von Trägeroberflächen, auf denen sich die stationäre

Phase befindet (Kapillarsäule, gepackte Säulen) und durch die Geometrie der Säule

(Durchmesser, Länge). Die in der Säule getrennten Komponenten des Gemisches gelangen im

optimalen Fall mit dem charakteristischen Konzentrationsprofil einer Gaußschen Kurve im

Trägergas in den Detektor, der je nach dem zu erreichenden Analysenziel alle (z.B.

Massenspektrometer) oder einzelne Vertreter bestimmter Substanzklassen (z.B. stickstoff-

/phosphorselektiver Detektor) spezifisch, unter Erzeugung eines Signals, anzeigt. Das

Registriersystem liefert dann ein Chromtogramm, also eine Aufzeichnung der Höhe des

Detektorsignals in Relation zur Zeit, die seit der Injektion vergangen ist [147]. Im weiteren

Verlauf dieses Kapitels wird näher auf die Detektorklasse der Massenspektrometer eingegangen,

die in dieser Arbeit verwendet worden ist. Details zu anderen in der Gaschromatographie

benutzten Detektoren sind in der einschlägigen Literatur nachzuschlagen [147,148].


5.2 Das Massenspektrometer

Die Kopplung eines Gaschromatographen mit einer leistungsfähigen Identifizierungsmethode

wie einem massenselektiven Detektor ermöglicht die Bestimmung der Identität der von der

Trennsäule eluierenden Komponenten des Stoffgemisches. Will man diese Informationen nur

über die Retentionsdaten erhalten, so ist dies nur schwer möglich, da schon Verbindungen

bekannter Struktur bei Verwendung von Säulen mit unterschiedlichen Trennphasen nicht

einwandfrei bestimmt werden können. Der Informationsgehalt von Massenspektren, die während

des GC-Laufs im Bereich von 1 bis 10 pro Sekunde aufgenommen werden, ist äußerst hoch, da

von ihnen häufig über den Zerfall der entstandenen Ionen auf die Struktur geschlossen und

gegenbenfalls auch mit Spektren aus einer Bibliothek verglichen werden kann.

In einem ersten Schritt werden die in dem GC-Eluat befindlichen Substanzen über ein Interface

in die unter Hochvakuum stehende Ionenquelle geleitet, wo sie mittels beschleunigter Elektronen

oder über ein Reaktandgas ionisiert werden (Siehe Kapitel 7.3.1.1). Die erzeugten Ionen und die

daraus durch Umlagerungen und Zerfall gebildeten Fragmente werden über elektronische Linsen

beschleunigt und zu einem schmalen Strahl fokussiert. Anschließend gelangen sie in den

Massenfilter, dessen unterschiedliche Ausführungen in den nächsten Kapiteln genauer

beschrieben werden.

5.2.1 Sektorfeld-Massenspektrometer

In diesem Gerät werden die entstandenen Ionen durch eine hohe Spannung von 1 bis 10 kV, die

an den Beschleunigungselektroden angelegt ist, auf hohe Geschwindigkeiten gebracht. Eine mit

geringerer Spannung versehene Ausgangsblende fungiert als Eintrittsspalt des Massenfilters. Er

fokussiert die divergenten Ströme von Ionen mit demselben Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z),

die in den Analysator eintreten, auf den Austrittsspalt am Ende des Analysators. Ein auf dieser

Strecke angelegtes Magnetfeld hat die Funktion eines Filters, der die Massen auftrennt. Das m/z-

Verhältnis der Ionen, die am Ende des Analysators durch den Austrittsspalt treten, hängt gemäß

der unten stehenden Gleichung, die Beynon et al. 1960 zur Beschreibung des Massenfilters dieser

Prägung formulierten, vom Radius r der Kreisbahn, die die Ionen im Magnetfeld beschreiben, der

Magnetflußdichte B und der angelegten Beschleunigungsspannung V ab (Formel 5.1).

m/z = 4,82 x 10-5 B2 r2 / V (Formel 5.1)


Bei einem bestimmten Wert der Magnetfelddichte oder der Beschleunigungsspannung entspricht

die Flugbahn des Ions der vorgegebenen Krümmung des Analysatorrohrs. Die Ionen, die durch

den Austrittsspalt gelangen, erzeugen am Ionenkollektor ein Signal, das mit Hilfe eines

Sekundärelektronenvervielfachers oder ähnlichem verstärkt wird. Da für diese Flugbahn jedem

bestimmten m/z-Verhältnis ein Wert von B bzw. V entspricht, kann durch Änderung eines

dieser beiden Werte der interessierende Bereich an m/z-Verhältnissen innerhalb geringer

Zeitspannen gescannt werden. In der Praxis gelingt es aber trotz Eintrittsspalt nicht, einen

Ionenstrahl nur in einer einzigen Richtung in das Magnetfeld einzuschießen. Daher spielt neben

der massendispergierenden Eigenschaft auch die richtungsfokussierende Wirkung des

Magnetfeldes eine wichtige Rolle. Ionen gleicher Masse, die mit unterschiedlicher Richtung in das

Magnetfeld gelangen, werden nach der Ablenkung wieder in einem Punkt vereinigt [149].

Wird zwischen der Beschleunigungsstrecke und dem magnetischen Sektor noch ein homogenes

elektrostatisches Feld angebracht, so ensteht ein sogenanntes doppelfokussierendes

Massenspektrometer, bei dem sowohl eine Richtungsfokussierung von Ionen gleichen m/z-

Verhältnissen als auch eine Energie-Fokussierung erfolgt.

5.2.2 Quadrupol-Massenspektrometer

Sie enthalten vier konzentrische oder elliptische, parallel zueinander angeordnete runde

Stabelektroden. An jedes Paar gegenüberliegender Elektroden legt man eine Gleichspannung mit

entgegengesetzter Polarität an den gegenüberliegenden Stabpaaren, die von einer hochfrequenten

Wechselspannung überlagert wird. Ein Ionenstrahl im Inneren des Stabsystems wird durch das

Hochfrequenzfeld zu Schwingungen angeregt, die massenabhängig sind. Die Ionen bewegen sich

auf spiralförmigen Bahnen. Nur für Ionen einer bestimmten Masse bleibt die

Schwingungsamplitude so klein, daß sie das System passieren und in den Auffänger gelangen

kann. Ionen, die leichter sind als das eingestellte m/z-Verhältnis stoßen mit den positiven Polen

und die, die schwerer sind, mit den negativen Polen zusammen und werden auf diese Weise

eliminiert. Durch Ändern der Werte für Gleich- und Wechselspannung kann ein m/z-Scan

durchfahren werden.


Abb. 5.1: Schematische Darstellung eines Quadrupol-Massenspektrometers [150]

5.2.3 Ion Trap-Massenspektrometer

Aufgrund der Tatsache, daß die vorliegende Arbeit zu einem großen Teil mit einem Ionenfallen-

Gerät gemacht wurde, wird in diesem Abschnitt genauer auf diese Art des massenselektiven

Detektors eingegangen.

Die in der Ionenquelle auf dem beschriebenen Wege erzeugten Kationen gelangen über drei

elektronische Linsen unterschiedlicher Spannung in den Massenanalysator, die sogenannte Ionen-

Falle („ion trap“). Sollen negative Ionen detektiert werden, so werden entsprechende positive

Spannungen angelegt.


Der Ion-Trap-Massenanalysator an sich besteht aus drei Elektroden aus Stahl, der

Eingangselektrode („entrance endcap electrode“), der Ringelektrode („ring electrode“) und der

Ausgangselektrode („exit endcap electrode“), die durch Siliziumnitrid-Spacer voneinander

getrennt und isoliert werden. Die Anordnung ist der Abbildung 5.3 zu entnehmen. Die

„endcap“-Elektroden besitzen in der Mitte jeweils ein kleines Loch, um den Ionen den Eintritt in

und den Austritt aus dem Ionen-Käfig zu ermöglichen.

An die Ringelektrode wird eine Wechselspannung mit konstanter Frequenz (ca. 1 MHz) und

variabler Amplitude (ca. 0 bis 8500 V) angelegt, welche ein dreidimensionales Quadrupolfeld

innerhalb der Ion Trap erzeugt. Dieses sich zeitlich ändernde Feld versetzt die Ionen in axiale

(entlang der „endcap“-Elektroden) und in radiale (entlang der Ringelektrode) Bewegung auf

stabilen, kreisähnlichen Bahnen.

Soll nun eine Massenanalyse vorgenommen werden, so wird das System durch Variation der

Ringspannungsamplitude in der Weise verändert, daß es zu einer Instabilität, die vom m/z-

Verhältnis abhängig ist, und dadurch zu einer Beschleunigung der Ionen durch das Loch in der

Ausgangselektrode auf die Konversionsdynode des Multipliers kommt. Die Spannung, bei der die

Kreisbahn eines Ion instabil wird und das geladene Teilchen aus der Kreisbahn und somit aus

dem Ionen-Käfig gerät, wird Resonanzspannung genannt.

Vom Prinzip her ist das Ion-Trap-Massenspektrometer ein Speicher-Massenspektrometer. Das ist

der grundlegende Unterschied zu Quadrupol-Massenspektrometern, die als Strahlgeräte

anzusehen sind und die vier Quadrupolstäbe als Massenfilter verwenden. Der große analytische

Vorteil liegt darin, daß Ionen innerhalb eines kurzen Entstehungszeitraums (wenige

Millisekunden) gesammelt werden können. Auf diese Weise kann ein Ionenstrom aus einer

Ionenquelle über die Sammlungszeit integriert und als „gebündeltes Paket“ auf den Multiplier

geschickt werden, was sich in höherer Empfindlichkeit und besserer Nachweisstärke

niederschlägt. Wie alle Speicher kann die Ion-Trap nur mit einer begrenzten Anzahl von Ionen,

die von der sich an die Speicherung anschließende Scanphase bestimmt wird, beladen werden.

Extreme Beladungssituationen führen zu „Raumladungseffekten“, die durch Abstoßung

gleichgeladener Ionen untereinander zustande kommen und Qualitätseinschränkungen bei der

Detektion bewirken. Für das verwendete Finnigan MAT GCQ liegt die maximal zu speichernde

Ionenzahl bei 108 Teilchen.


Effektives Arbeiten mit einem Ion-Trap-Massenspektrometer ist am besten möglich, wenn der

Ionen-Speicher maximal befüllt ist. Die korrekte Steuerung der Speicherphase wird über die

Öffnungszeiten der mittleren der Eingangslinsen („gate“, bis zu 25 ms) gesteuert. Für die

Zeitregelung, also die Bestimmung des Totalionenstroms TIC bzw. der Ionentransferzeit, ist ein

spezieller Scan-Abschnitt, der Pre-Scan, zuständig. Daran schließt sich der eigentliche Speicher-

bzw. Scanzyklus, der sogenannte analytische Scan an, bei dem das eigentliche Massenspektrum

aufgenommen wird. Die Einheit von Pre-Scan und analytischem Scan wird als Mikro-Scan

bezeichnet und bildet damit die kleinste zeitliche Funktionseinheit des Analysators.

Abb. 5.3: Querschnitt durch einen Ion-Trap-Analysator (Finnigan MAT) [150]

5.2.4 Vor- und Nachteile der GC-MS-Geräte bezogen auf den analytischenSachverhalt

Welches der oben genannten Ausführungen von Massenspektrometern das geeignetste ist, hängt

letztendlich immer vom eigentlichen analytischen Problem, das mit diesem gelöst werden soll, ab.

Um bei der Identifizierung einer Verbindung neben dem eigentlichen Full Scan-Spektrum noch

weitere Informationen zu erhalten, existieren verschiedene Möglichkeiten.

Zum einen können mit Hilfe eines hochauflösenden Massenspektrometers außerordentlich

genaue Aussagen über Substanzen gemacht werden.


Als Auflösungsvermögen A wird in der Massenspektrometrie die Fähigkeit eines Analysators

verstanden, eng benachbarte Massensignale (Ionen) nach ihrem m/z-Verhältnis zu trennen, also

als Quotient aus der Massenzahl m und der Differenz zu der gerade noch aufgelösten Massenzahl

Δm. Es gilt: A = m/Δm. Als aufgelöst werden zwei Signale bezeichnet, die sich in 10% oder

weniger ihrer Höhe überlappen. Für die meisten Geräte liegt die Auflösung bei 1.000 bis 2.000,

mit hochauflösenden doppelfokussierenden Sektorfeld-Analysatoren werden Werte von bis

150.000 erreicht. Bei letzteren ist es dadurch möglich, über ein entsprechendes

Massenchromatogramm eine sehr hohe Selektivität und damit Nachweisstärke auch bei hoher

Matrixbelastung zu erhalten. Jedoch sind die Anschaffungskosten für ein hochauflösendes

Massenspektrometer verglichen mit einem Benchtop-Gerät, wie es Quadrupol- und Ion Trap-

Analysatoren darstellen, ernom hoch. Ein weiterer Nachteil sind die geringen Scanraten bei

Verwendung dieser Massenfilter. Enthalten Chromatogramme sehr schmale Peaks, wie sie z.B.

bei der Verwendung von Wasserstoff als Trägergas respektive bei der Fast Chromatographie

auftreten, so müssen hohe Scanraten gewährleistet sein, da sonst möglicherweise keine korrekte

Bestimmung dieser Komponenten erreicht wird.

Eine weitere Möglichkeit, niedrige Konzentrationen auch mit hoher Matrixbelastung detektieren

und quantifizieren zu können, birgt die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS). Hierbei wird in

einem ersten Schritt ein bestimmtes Ion mit möglichst hoher Intensität und Masse entweder in

der Ion Trap als einziges gesammelt oder in einem ersten Quadrupol herausgefiltert. In dem

zweiten Schritt wird dieses Ion nun zu weiterem Zerfall angeregt und liefert dadurch wieder

spektrale Information, sprich über den strukturellen Aufbau dieses Fragmentes.

Während ein Ion Trap-Massenspektrometer aufgrund seiner Geometrie dies ohne weiteres kann,

muß bei einem Quadrupol-Gerät ein weiterer Filter hinzugefügt werden, was diese Konstellation

wieder teurer macht.

Als Nachteil gegenüber dem Quadrupol ist bei der Betrachtung der Ionenfalle zu erwähnen, daß

es im Bereich der jeweiligen Nachweisgrenze wegen gerätebaulicher Grenzen zu einer höheren

Standardabweichung kommt, was dazu führt, daß mit einer Ionenfalle nicht die Nachweisgrenzen

eines MS/MS-fähigen Quadrupol-Massenspektrometers erreicht werden kann.

Somit erfüllt das Ion Trap-Massenspektrometer die Kriterien, um die zu untersuchenden

Pharmazeutika und deren Metabolite in der hochbelasteten Matrix (Klinik-)Abwässer in

geringsten Konzentrationen detektieren, indentifizieren und quantifizieren zu können.

6 Probenvorbereitung 46

6 Probenvorbereitung

6.1 Verwendete Apparaturen

Die Schritte der Probenaufbereitung können durch Verwendung verschiedener Apparaturen

erheblich erleichert und reproduzierbarer gemacht werden:

Für die Flüssig/Flüssig-Extraktion der Blut- und Urinproben wurde ein Vortex Genie 2-Mixer

der Firma Bender & Hobein als Schüttelapparatur verwendet. Es handelt sich hierbei um eine

Apparatur zum Schütteln von bis zu 60 2mL-Safe-Lock-Vials mit stufenloser

Schüttelfrequenzregulierung. Hierdurch ist eine stets gleichmäßige, gut reproduzierbare

Extraktion der Proben möglich, was beim Vergleich der Kalibriergeraden mit und ohne

Verwendung dieser Apparatur deutlich wird.

Zur besseren Trennung der Phasen wurde die Microzentrifuge MC-13 der Firma Millipore

eingesetzt. Hierbei werden die maximal 24 Probenfläschchen á 2mL auf bis zu 13.000

Umdrehungen pro Minute beschleunigt.

Um nach der Extraktion und nach der Derivatisierung das Lösungsmittel bei mehr als einer

Probe entfernen zu können, wird mittels einer selbstgebauten Gasbrücke als

Evaporisiervorrichtung (Abb. 6-1) ein Inertgasstrom über bis zu zehn Fläschchen geleitet.


I n e r t g a s

P r o b e

Abb. 6.1: Evaporisiervorrichtung (Eigenbau)

6.2 Anreicherung mittels Flüssig/Flüssig-Extraktion

6.2.1 Prinzip der Flüssig/Flüssig-Extraktion

Unter dieser Bezeichnung wird ein Verfahren der Extraktion verstanden, bei dem eine gelöste

Substanz aus ihrem Lösungsmittel durch ein anderes, mit dem ersten nur geringfügig mischbares

flüssiges Extraktionsmittel (kalt oder heiß) extrahiert wird, wobei die Verteilung zwischen den

Phasen dem Nernstschen Verteilungssatz entspricht. Der vom Extraktionsmittel zu isolierende

Stoff wird Extrakt, die nach Extraktion verbleibende Phase Raffinat genannt. Flüssig/Flüssig-

Übergänge zwischen Analyten und den störenden Begleitsubstanzen liegen den klassischen

Flüssig/Flüssig-Verteilungen zugrunde. Sie lassen sich sowohl im Schütteltrichter oder

Probenfläschchen als auch in Säulen an verschiedenen Sorbentien (beispielsweise Florisil®), die

mit Wasser beladen werden, durchführen.


Eine weitere, sehr schonende und effiziente Möglichkeit, um Verbindungen auf diesem

prinzipiellen Wege zu extrahieren, bilden die sogenannten Perforatoren. Hierbei wird bei

ständiger Extraktionsmittelrückführung in einem Kolben durch einen Rückflußkühler das

Lösungsmittel in Form feinster Tröpfchen in der wäßrigen Phase verteilt, wobei sich die

extrahierbaren organischen Bestandteile darin lösen. In der Chemie versteht man unter

Verteilung die Einstellung eines chemischen Gleichgewichts (Verteilungsgleichgewicht)

unterschiedlicher Konzentrationen eines Stoffes in zwei aneinander grenzenden Phasen. Im Fallle

der Flüssig/Flüssig-Extraktion handelt es sich hierbei um zwei nicht miteinander mischbare

Flüssigkeiten mit möglichst stark voneinander unterschiedlichen Löslichkeiten für diese

Verbindung. Es stellt sich das Verhältnis der Stoffaktivitäten in den beiden Phasen nach dem

Nernstschen Verteilungssatz ein, dieses Verhältnis wird durch den Verteilungskoeffizienten

beschrieben. Durch einige Tricks kann dieses Verhältnis zum einen durch Einsatz sogenannter

Phasen-Transfer-Salze, die bewirken, daß die Substanz in die für sie unnatürliche Phase zu

wandert, oder zum anderen durch geeignete Auswahl des Extraktionslösungsmittels beeinflußt

werden.

Die Charakterisierung eines Lösungsmittels bezüglich der Extraktionseigenschaften kann mittels

der Polarität und der Selektivität beschrieben werden. Während der Polaritätsparameter P‘ ein

Maß für die Stärke des Lösungsmittel ist, sagt die Selektivität etwas darüber aus, wie sich die

polaren Wechselwirkungseingeschaften aus den Protonenakzeptor-, Protonendonator- und

Dipolparametern zusammensetzen. [151] ist die Eluotrope Reihe der gängigsten Lösungsmittel

mit diesbezüglichen Eigenschaften zu entnehmen.

6.2.2 Optimierung der Extraktionsparameter

6.2.2.1 Verwendete Extraktionsmittel

Um die Extraktionseigenschaften der Lösungsmittel untersuchen zu können, wurden folgende

organische Lösungsmittel oder Gemische organischer Lösungsmittel verwendet:


Tab. 6.1: Eluotrope Reihe der verwendeten Lösungsmittel [151]

mit P‘: Polaritätsparameter, Xe: Protonenakzeptorparameter,

Xd: Protonendonatorparameter, Xn: Dipolparameter

Lösungsmittel P‘ xe xd xn

Hexan 0,1 / / /

Tetrachlor-kohlenstoff

1,6 / / /

Toluol 2,4 0,25 0,28 0,47

Diethylether 2,8 0,53 0,13 0,34

Dichlormethan 3,1 0,29 0,18 0,53

Chloroform 4,1 0,25 0,41 0,33

Ethylacetat 4,4 0,34 0,23 0,43

2-Butanon(MEK)

4,7 0,35 0,22 0,43

4:1-GemischDiethylether/iso-Propanol

2,83,9

0,530,55

0,130,19

0,340,27

Die jeweiligen Parameter geben an, zu welchem Teil die polaren Wechselwirkungen aus den

entsprechenden Eigenschaften bestehen. Die Summe ergibt stets 1.

6.2.2.2 pH-Wert

Ob ein Analyt-Molekül neutral oder geladen als Kation oder Anion in der Probenlösung vorliegt,

ist von grundlegender Bedeutung. Deswegen erschien es ratsam, den Einfluß des pH-Wertes auf

die Flüssig/Flüssig-Extraktion zu untersuchen. So wurden die Probenlösungen bei den

Anreicherungsversuchen in diesem Bereich auf ganzzahlige pH-Werte eingestellt. Als

Puffersystem wurden Kaliumdihydrogenphosphat respektive di-Kaliumhydrogenphosphat und

Phosphorsäure oder Kalilauge benutzt. Die Probenlösungen wurden je nach pH-Wert mit einem

der beiden Kaliumsalze bis zu einer Konzentration von 0,01M versetzt und schließlich mit den

Lösungen auf den entsprechenden Wert eingestellt.


→ pH 2,0: 0,01M KH2PO4

Einstellung mit 0,3 M Phosphorsäure auf pH 2,0 ± 0,1

→ pH 3,0: 0,01M KH2PO4


→ pH 4,0: 0,01M KH2PO4


→ pH 5,0: 0,01M KH2PO4

Einstellung mit 0,3 M KOH-Lösung auf pH 5,0 ± 0,1

→ pH 6,0: 0,01M KH2PO4


→ pH 7,0: 0,01M K2HPO4


→ pH 8,0: 0,01M KH2PO4


6.2.2.3 Sonstige Parameter

Weitere Möglichkeiten, um die Extraktion der Verbindungen zu verbessern, können zum einen

darin bestehen, die wäßrige Phase durch Zusatz von Salzen polarer zu machen und dadurch das

Verteilungsgleichgewicht der größtenteils unpolareren Substanzen auf die Seite des organischen

Lösungsmittels zu verschieben. Zum anderen dem Verlust an Substanz bei leichter flüchtigen

Metaboliten zu verhindern, indem die vereinigten organischen Phasen nur bis auf einen geringen

Flüssigkeitsrückstand reduziert werden.


6.2.3 Ergebnisse und Diskussion

6.2.3.1 Getestete Lösungsmittel

Als Extraktionsmittel wurden die aufgeführten organischen Lösungsmittel unterschiedlicher

Polarität auf ihre Fähigkeit hin untersucht, der wäßrigen Phase die in dieser Arbeit untersuchten

Verbindungen zu entziehen. Für die Untersuchungen wurden 500µL wäßrige Probe

(Oberflächenwasser, pH-Wert 5,5) in einem 2mL-Vial vorgelegt und die dreimalige Extraktion

mit derselben Menge an organischem Lösungsmittel durchgeführt. Die Dauer des Schüttelns

mittels eines Vortex-Mixers wurde nach einer früheren Arbeit des Autors mit 60 Sekunden für

die beiden Ausgangsverbindungen ausreichend gewählt [152]. Wie sich zeigte, war diese Zeit auch

für die Stoffwechselprodukte ausreichend.

Um die Ergebnisse miteinander vergleichbar zu machen, wurde im Anschluß an die Extraktion

das vierfach deuterierte d4-Cyclophosphamid in Ethylacetat in gleichen Mengen hinzugegeben.

Zur Auswertung wurden die Flächen der Verbindungen mit denen des Standards in Relation

gesetzt und als Maß für die Extraktionsfähigkeit der Lösungsmittel verwendet. Für

Cyclophosphamid und Ifosfamid wurden diese Extraktionsversuche schon in einer früheren

Arbeit des Autors gemacht [152]. Die Ergebnisse für die Metaboliten sind der Tabelle 6.2 zu

entnehmen (NB = Nicht bestimmbar).

Für den Metaboliten Cyclophosphamid Mustard (CPM) mußten separate Untersuchungen

gemacht werden, da sich diese Verbindung je nach Extraktionsbedingungen teilweise oder

vollständig weiter in das eigentlich zytotoxische Bis(2-Chloroethyl)amin oder in der Literatur Nor

Nitrogen Mustard (NNM) genannte Stoffwechselendprodukt abbaut. Dies stellt ein Problem dar,

weil sich andere Verbindungen dieses Metabolismus wie auch der verwendete Standard d4-

Cyclophosphamid teilweise in diese Substanz umsetzt[45, 126]. Dies erforderte eine getrennte

Betrachtung. Deswegen werden im weiteren Verlauf dieser Arbeit CP, KCP, CCP, IF, KIF, CIF

und IPM als Gruppe 1, CPM separat als Gruppe 2 bezeichnet und untersucht. Die

Vorgehensweise der Flüssig/Flüssig-Extraktion bei CPM war die gleiche wie bei Gruppe 1 bis

auf die Tatsache, daß der Standard durch das dem CPM strukturverwandte IPM ersetzt wurde.

Tabelle 6.3 stellt die Ergebnisse dar. Zur weiteren Optimierung mußte die pH-Wert-Abhängigkeit

der Extraktion experimentell bestimmt werden.


Tab. 6.2: Ergebnisse der Untersuchung der Extraktionsfähigkeit verschiedener Lösungsmittel und

Lösungmittelgemische bezüglich KCP, CCP, KIF, CIF, IPM,OXAZ und CEA bei pH 5,5

Extraktions-mittel

Hexan CCl4 Toluol Et2O CH2Cl2 EtOAc MEK Et2O/iso-Pr

Substanz

KCP NB 2 3 8 47 91 123 35

CCP NB NB NB NB NB 1 2 1

KIF NB 5 28 30 51 85 108 95

CIF NB NB NB NB NB NB NB NB

IPM NB 1 NB NB NB 2 6 4

OXAZ NB NB NB NB NB NB NB NB

CEA NB NB NB NB NB NB NB NB

Bei dem gewählten pH-Wert von 5,5 konnte CPM oder NNM nur bei der Verwendung von

Ethylacetat als Lösungsmittel nachgewiesen werden.

Tab. 6.3: Ergebnisse der Untersuchung der Extraktionsfähigkeit verschiedener Lösungsmittel und

Lösungmittelgemische bezüglich CPM bei pH 5,5

Extraktions-mittel

Hexan CCl4 Toluol Et2O CH2Cl2 EtOAc MEK Et2O/iso-Pr

Substanz

CPM NB NB NB NB NB 20 NB NB

6.2.3.2 pH-Wert

Während die anderen Metaboliten bei der Flüssig/Flüssig-Extraktion abgesehen von pH-Werten

unter 3 und über 7 nur wenig Veränderung in der Wiederfindungsrate, die über die Fläche im

Chromatogramm abgeschätzt wurde, zeigten, erwies sich diese Untersuchung beim CPM als

äußerst wichtig.


Nur bei pH-Werten ≤ 4 konnte das Abbauprodukt NNM nachgewiesen werden,

unmetabolisertes CPM hingegen bei keiner der gemachten Versuche, was sich mit den

Ergebnissen in der Literatur bezüglich der Bestimmung in physiologischen Matrices deckt [45]

Die geringe eingesetzte Menge an Probenvorlage und Extraktionsmittelvolumen ermöglichte nur

relativ geringe Anreicherungsfaktoren und somit auch eine hohe Nachweisgrenze für die

entsprechenden Verbindungen. Zur Bestimmung der Nachweisgrenze wurden jeweils 500µL

Probe dreimal mit der gleichen Menge an Ethylacetat versehen und eine Minute lang mit einem

Vortex-Mixer geschüttelt. Die Injektionslösung hatte abschließend ein Volumen von 150µL. In

Tabelle 6.4 sind die Nachweisgrenzen, wenn es möglich war, sie zu bestimmen, aufgeführt.

Tab. 6.4: Mit Flüssig/Flüssig-Extraktion erreichbare Nachweisgrenzen (in µg/L) aus Oberflächenwasser

Substanz CP KCP CCP CPM IF KIF CIF IPM OXAZ CEA

BG(S/N 10)

1 100 200 NB 10 50 NB 500 NB NB

NWG(S/N 3)

0,5 50 100 NB 1 10 NB 100 NB NB

6.2.2.4 Sonstige Parameter

Ein weiterer Parameter ist von außerordentlicher Bedeutung für das Erreichen einer möglichst

hohen Wiederfindungsrate. Nach der Extraktion werden die vereinigten Extraktionsmittelphasen

mit Hilfe eines Inertgasstroms eingeengt. Bei Gruppe 1 ist für das Erreichen einer hohen

Wiederfindungsrate, einer geringen Standardabweichung und verläßlichen Kalibrierung

unabdingbar, daß das Lösungsmittel nach der Extraktion vollständig bis zur Trockne entfernt

wird, während es auf der anderen Seite bei CPM bei gleicher Vorgehensweise zu einem starken

Verlust an Nachweisempfindlichkeit kommt. Um dies zu verhindern, ist es zwingend notwendig,

den Extrakt nur bis zu einem Rückstand von ungefähr 20µL zu reduzieren. Ein Vergleich der

beiden Vorgehensweisen zeigte, daß sich die Nachweisempfindlichkeit bei Gruppe 2 um nahezu

eine Zehnerpotenz verbessert (Tab. 6.5).

Eine weitere, aber geringere Verbesserung für Gruppe 2 brachte das zusätzliche Versetzen der

wäßrigen Phase mit einem wasserlöslichen Salz, um die Probe noch polarer zu machen und somit

die hydrophoben Analyten auszusalzen (Tab. 6.5).


Für diesen beiden Optimierungen wurde KIF als Standard dem Extrakt hingefügt.

Tab. 6.5: Ergebnisse der sonstigen CPM-Optimierungen verdeutlicht am Flächenverhältnis

Analyt/Standard (KIF)

Optimierung

MessungAussalzen derKomponenten

Zurückbehalten einesRückstandes

1 1,08 16,88

2 1,25 14,81

3 1,95 18,26

Standardabweichung 32,2 10,4

Zur Erreichung höherer Anreicherungsfaktoren müßten bei Beibehaltung des

Phasenverhältnisses enorme Mengen an teilweise giftigen und umweltschädigenden

Lösungsmitteln eingesetzt werden, was einer der Zielsetzungen dieser Arbeit, nämlich eine

möglichst wenig umweltbelastende Methode zur Bestimmung dieser Substanzen zu entwickeln,

widerspräche.

Bei einer erwarteten Konzentration von Cyclophosphamid im Oberflächenwasser von 1ng/L

wäre es notwendig, mit einer Probenvorlage und einem Extraktionsmittelvolumen von einem

halben Liter zu arbeiten. Die vereinigten organischen Phasen hätten dann einen Umfang von 1,5

Liter, die bis zur Trockne eingedampft werden müßten.

Auch die Tatsache, daß die Metaboliten mit vergleichsweise geringem Molekulargewicht –

CPM/NNM, OXAZ und CEA – mit dieser Extraktionsmethode nicht in bestimmbaren Mengen

der Matrix entzogen werden konnten, spricht gegen die Verwendung der Flüssig/Flüssig-

Extraktion.


6.3 Anreicherung mittels Festphasen-Extraktion

6.3.1 Prinzip der Festphasen-Extraktion

In den letzten Jahren haben die Adsorptionsverfahren für die Isolierung und Reinigung

verschiedenster Verbindungen in der Analytik stark an Bedeutung gewonnen. So werden

zunehmend die Flüssig/Flüssig- von den Flüssig/Fest-Verteilungen in Form der Festphasen-

Extraktion abgelöst.

Die Festphasen-Extraktion ist ein physikalischer Extraktionprozeß, der zwischen einer flüssigen

und einer festen Phase stattfindet. Bei der Aufgabe des wäßrigen Probevolumens haben die

Komponenten im zu erreichenden Idealfall eine höhere Affinität zur festen Phase, bei der im

Abschluß erfolgenden Elution mit einem organischen Lösungsmittel eine höhere Affinität zu

eben diesem.

Die Schritte der Probenvorbereitung sind der Abbildung 6.2 zu entnehmen.

Durch Modifizierung der stationären Phase kann eine äußerst selektive Extraktion der Analyten

aus der Matrix ermöglicht werden. Ihre Basis besteht zumeist aus einem speziellen Polymer oder

aus einem Silicagerüst, dessen endständige funktionelle Gruppen durch die Reaktion von

Organosilanen mit dem aktivierten Silica gebildet werden und somit eine stationäre Phase mit

anderen Eigenschaften erzeugt wird. Häufig verwendete Phasen werden im folgenden aufgeführt:

→ Normal- und Umkehr-Phasen unpolar: Methyl, Octyl, Octadecyl und Phenyl

polar: Diol, Cyanopropyl, Silicagel, u.a.

→ Ionenaustausch-Phasen Kationisch: Diethylaminopropyl, Trimethylaminopropyl

Anionisch: Propylsulfonsäure, Carboxymethyl, u.a.

→ Gelpermeationssorbentien

→ Wide-Bore-Sorbentien


Abb. 6.2: Schritte der Probenvorbereitung mittels Festphasen-Extraktion [82]

Die Trennung der Analyten von der Matrix erfolgt nach flüssigchromatographischen Prinzipien:

Es findet der Einsatz eines Lösungsmittelgradienten und der gleichen festen Phasen statt.

In der neueren Literatur erfolgt die Probenvorbereitung in der Zytostatikaanalytik aus

biologischen und Umweltproben zunehmend mittels Festphasenextraktion [153-159].

I II III IV V

Fritten

Sorbens

Konditio-nierungs-mittel

Proben-lösung

Inertgas Elutionsmittel

Wasch-lösung

Inter-ferenzen

Inter-ferenzen

Analyten


Die wichtigsten Vorteile gegenüber der Flüssig/Flüssig Extraktion sind:

→ Erzielung höherer Wiederfindungsraten durch vielfache Verteilung

→ Erzielung von höheren Anreichungsfaktoren, somit niedrigerer Nachweisgrenzen

→ Verringerung der Matrixbelastung durch Einsatz spezifischer stationärer Phasen

→ Einfache und schnelle Handhabung

→ Geringere Lösungsmittelmenge und dadurch Umweltbelastung

→ Möglichkeit der Automatisierung

Die für die Festphasen-Extraktion verwendeten Materialien liegen in Säulen unterschiedlichen

Volumens oder in sogenannten Disks vor. Für die Bestimmung von Substanzen aus stark

matrixbelasteten Umweltproben eignen sich diese scheibenartigen Kartuschen der Möglichkeit

hoher möglicher Durchflußraten bei großen, stark partikelbelasteten Volumina und sind deshalb

für die Untersuchung der Oberflächen- und Abwasserproben in dieser Arbeit verwendet worden.

Weitergehende Erläuterungen zu dieser Art der Extraktion sind in der Literatur zu finden

[149,160].

Die Durchführung der Anreicherung wurde mit Hilfe eines kommerziellen Gerätes (Separex 47,

spe-12G, Baker) durchgeführt. Hierbei handelt es sich um eine Vorrichtung, mit der bis zu 12

Proben gleichzeitig angereichert werden können. Der zum Durchsaugen des Probenvolumens

notwendige Unterdruck wird mittels einer Wasserstrahl- oder Membranpumpe erzeugt und von

einem Manometer kontrolliert. Um das wiederholte Auffüllen der Extraktionsscheiben mit der

Hand und ein Trockenlaufen der Festphase zu verhindern, wurden käuflich erhältliche

Adaptoren der Fa. Baker verwendet. Der Aufbau der verwendeten Apparatur ist in der

Abbildung 6.6 zu sehen.


Proben-reservoir

Wasser-strahl-pumpe

AdaptorenExtraktions-scheibe

Manometer

Abb. 6.6: Für die Festphasen-Extraktion verwendete Apparatur der Fa. J.T. Baker (Separex 47, spe-12G)

6.3.2 Optimierung der Extraktionsparameter

6.3.2.1 Getestete Festphasenmaterialien

Für eine der beiden Ausgangssubstanzen – Cyclophosphamid – sind in der Dissertationsschrift

von Kiffmeyer, deren Arbeiten hier teilweise aufgegriffen werden, sowie in der Literatur optimale

Materialien für eine möglichst effektive Festphasen-Extraktion bestimmt worden [82,133].

Hierbei handelt es sich in beiden Fällen um ein Material auf Polysiloxan-Basis, deren endständige

Gruppen mit C18-Ketten inaktiviert sind.


Tab. 6.6: Eigenschaften der getesteten Festphasensäulen

Sorbens EndständigeGruppen

Wechsel-wirkung

Sorbens-menge[mg]

Durch-messer[mm]

Volu-men[mL]

Handels-name

Anbieter

Modifiz.Silicagel C18

endcappedunpolar 500 12 3 BakerBond Baker

C18 unpolar 500 47 25 C18Speedisk

Baker

C18Restsilanol-gruppen

unpolar/polar 500 47 25 C18 Polar Plus

SpeediskBaker

Co-polymer

Divinylbenzol unpolar 500 47 25 DVB Speedisk Baker

500 47 25 PAH aquaSpeedisk

Baker

6.3.2.2 Konditionierung und Equilibrierung

Für eine Wechselwirkung zwischen Analyt und den funktionellen Gruppen der Festphase vor

allem auf Silica-Basis und somit eine vollständige Anreicherung der Analyten ist es unabdingbar,

die Ankergruppen zu benetzen und aufzurichten. Dies erfolgt durch Gabe eines entsprechenden

organischen Lösungsmittels. In der Regel wurde das mit Methanol, Acetonitril und Ethylacetat

sowie Hexan getestet.

6.3.2.3 Probenaufgabe

Wegen der teilweise äußerst starken Partikelbelastung der beprobten Oberflächengewässer,

Kläranlagenzu- und -abläufe sowie der Klinikabwässer dient eine vor der eigentlichen

Probenaufgabe vorgenommene Filtration einer ersten Abtrennung störender Matrixbestandteile.

Ein weiterer Optimierungsparameter ist die Durchflußgeschwindigkeit. Laut Herstellerangaben

ist es möglich, diese SPE-Disks mit einer Geschwindigkeit von 80mL/min zu betreiben. Zwei

Punkte sind dabei zu beachten.


Sie sollte möglichst hoch sein, um eine kurze Gesamtanalysenzeit zu gewährleisten, jedoch sollte

sie auch nicht zu schnell gewählt werden, da eine mangelhafte Gleichgewichtseinstellung zu einer

starken Verschlechterung der Wiederfindungsrate führt.

Die wichtigste Variable bei der Probenaufgabe ist der pH-Wert der Pobenlösung. Nicht nur bei

der Verwendung von Ionenaustauschern als Festphasen hat er großen Einfluß auf die Effizienz

der Extraktion. Bei den letztgenannten ist es notwendig, daß die Analyten in kationischer oder

anionischer Form vorliegen, damit ein entsprechender Austausch stattfinden kann. Aber auch bei

den hier verwendeten Festphasen auf Silica-Basis beeinflußt der pH-Wert die Anreicherung sehr

stark. So sollten die zu extrahierenden Verbindungen als Neutralteilchen vorliegen. Als Ionen

hätten sie bei diesen eine um ein Vielfaches erhöhte Affinität zur wäßrigen Phase und könnten so

nur schlecht bis gar nicht extrahiert werden. Der Hersteller der SPE-Materialien gibt die pH-

Stabilität mit 2 bis 8 an. Die Lösungen wurden mit Hilfe der unter 6.1.3.2 aufgeführten

Puffersysteme auf die jeweiligen pH-Werte eingestellt.

6.3.2.4 Waschschritt

Zwischen der Aufgabe der Probe auf das Material und dessen Trocknung wird in der Literatur

häufig ein weiterer Schritt eingeführt. Hierbei können durch geeignete Wahl eines weiteren

Lösungsmittels störende Matrixbestandteile von der Festphase eluiert werden ohne Koelution der

Analyten. Des weiteren können in den Rückständen, die sich nach Beendigung der Aufgabe auf

der oberen Fritte angesammelt haben, Reste von Analyten eingeschlossen sein, die durch einen

Waschschritt herausgelöst werden können. Es wurden jeweils 25mL von einigen organischen

Lösungsmitteln und wäßrigen Lösungen verschiedener pH-Werte getestet.

6.3.2.5 Trocknung der Extraktionsscheiben

Das Trocknen der Festphasenmaterialien mittels eines Inertgasstromes dient in erster Linie dem

Entfernen der Proben- bzw. Waschlösung aus dem Sorbensbett. Da es im folgenden Schritt – der

Elution – erneut zu einem Wechsel des das Sorbens umgebenden Lösungsmittel kommt, ist es

wichtig, möglichst quantitativ die wäßrigen Reste aus der Festphase zu entfernen. Die in ihnen

enthaltenen Matrixbestandteile können die weitere Analytik stören. Eine Verschlechterung der

Bestimmungsgrenzen wäre die Folge.


Da im Anschluß an die Extraktion eine Derivatisierung unter anderem mit einem Säureanhydrid

erfolgt, kommt es durch das Auftreten von Wasserspuren zu einem Verlust an

Derivatisierungsmittel. Auf der anderen Seite kann eine zu lang gewählte Trocknungszeit oder ein

zu starker Gasstrom zu geringeren Wiederfindungsraten führen. Besonders bei leichtflüchtigen

Verbindungen ist dies der Fall. Es wurden Dauer und Intensität des Gasstromes variiert.

6.3.2.6 Elution der Analyten

Durch geeignete Wahl des Elutionslösungsmittels oder eines Lösungsmittelgemisches kann

wiederum eine hohe Selektivität erreicht werden. Ziel ist es, vollständig und ausschließlich die

Analyten vom Sorbensbett zu lösen, während Interferenzen dort verbleiben, was in der Praxis

nur schwer zu erreichen ist. Das am häufigsten verwendete Elutionsmittel ist Methanol, aber

auch weitere organische Lösungsmittel wurden in unterschiedlichen Mengen auf ihre

Elutionseigenschaften hin untersucht.

Von weiterem Interesse war die Frage, ob die Art der Elution eine Rolle spielt. Hierfür wurde die

Elution vergleichsweise einmal mit einer einmaligen Gabe einer bestimmten Menge an

Lösungsmittel und dann mit der gleichen Menge in Portionen mit zwischenzeitlichem

Trockenziehen des Sorbensbettes durchgeführt. Des weiteren wurde das Gesamtvolumen des

Elutionsmittels und dessen Einwirkzeit untersucht.

6.3.2.7 Einengen des Eluats

Zur weiteren Erhöhung der Anreicherungsfaktoren sowie zum endgültigen Entfernen der

Wasserspuren kann mit Hilfe eines Inertgasstroms das Eluat weiter eingeengt werden. Für die

Ermittlung der optimalen Bedingungen wurden die Art des Gases, die Temperatur des Eluats

und die Menge des verbleibenden Rückstandes variiert.



6.3.3.1 Geeignete Festphasensorbentien

Um die prinzipielle Eignung einer Festphase bezogen auf das analytische Problem zu testen,

wurden 500mL Oberflächenwasser mit jeweils 100µg/L einer jeden Verbindung dotiert und aus

dieser Matrix extrahiert. Da es sich um relative Messungen handelte, wird in der folgenden

Tabelle 6.7 die Festphase mit der jeweilig höchsten Wiederfindungsrate, also dem höchsten

Verhältnis der Fläche des Analyten zu der des internen Standards im Chromatogramm, mit einem

„++“ versehen. Ist die Festphase bedingt geeignet, die Verbindung kann also extrahiert werden,

jedoch mit einer schlechteren Wiederfindungsrate, so steht in der Tabelle ein „+“. Für

Festphasen mit einer Wiederfindungsrate von ≤ 30% ist ein „–“ zu finden. Daraus resultiert, daß

sich die Scheiben mit den DVB- und den PAH aqua-Materialien aufgrund mangelnder

Wiederfindung nicht für die Extraktion der Verbindungen eignen. Weiter ist festzuhalten, daß die

beiden Ifosfamid-Metaboliten 1,3-Oxazolidin-2-on und 2-Chlorethylamin auch mit diesen

Festphasen nicht in ausreichendem Maße bestimmt werden konnten. Die beiden Phasen mit C18-

modifiziertem Silicagel hingegen sind für alle restlichen Substanzen in einem ausreichenden Maße

in der Lage, sie aus der wäßrigen Probe zu extrahieren. Bei der Extraktion von Cyclophosphamid

Mustard ist eine leichte Verbesserung bei der Bestimmung mit der Polar Plus-Phase, die neben

den C18-Ketten noch Restsilanolgruppen besitzt, festzustellen.

Tab. 6.7: Ergebnisse der Eignungsprüfung einiger Festphasenmaterialien

Substanz CP KCP CCP CPM IF KIF CIF IPM OXAZ CEA

Festphase

C18Speedisk

++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ - -

C18 PolarPlusSpeedisk

+ + + ++ + + + + - -

DVBSpeedisk + + - - + + - - - -

PAH aquaSpeedisk + + - - + + - - - -


6.3.3.2 Konditionierung und Equilibrierung

Beim Vergleich verschiedener organischer Lösungsmittel zeigten sich keinerlei Unterschiede

bezüglich ihrer Fähigkeit, das Sorbensbett auf die anschließende Probeaufgabe vorzubereiten.

Im weiteren Verlauf der Analysen wurde Methanol verwendet. Die Menge an organischem

Lösungsmittel belief sich stets auf 25mL, die ohne Anlegen eines Vakuums mit einer

Geschwindigkeit von ungefähr 5mL/min durch die Festphase lief. Um eine vollständige

Gleichgewichtseinstellung wirklich gewährleisten zu können, wurde der Fluß bei einem noch

gerade sichtbaren Flüssigkeitsspiegel oberhalb der Fritte gestoppt und das Methanol weitere 2

Minuten auf das Sorbensbett einwirken gelassen. Für die Phasen auf (Co-)Polymer-Basis ist dies

nicht notwendig, da sie nicht über Gruppen verfügen, die konditioniert werden müssen.Nach

dieser Equilibrierung wurden zur Umstellung auf die eigentliche wäßrige Matrix 25mL

bidestilliertes Wasser gegeben und bei Normaldruck durch das Material fließen gelassen. Auch

hier wurde das Wasser abschließend 2 Minuten in der Phase stehen gelassen.

Ziel war es, daß keine möglicherweise noch vorhandenen Reste der organischen Lösungsmittel

Teile der zu untersuchenden Substanzen mit herauslösen bzw. die Wechselwirkung derer mit

dem Sorbensmaterial verhindern. Da eine Probenaufgabe von nicht mehr als 1 Liter Volumen

vorgesehen und keine Verschlechterung der Wiederfindungsrate zu bemerken war, schien es

nicht angezeigt, durch Zusatz von organischen Lösungsmitteln eine in-situ-Equilibrierung

während der Extraktion vorzunehmen.

6.3.3.3 Probenaufgabe

Bei den Abwasser-Proben zeigte sich, daß die normalen säulenartigen Festphasen-Kartuschen

trotz einer vorgeschalteten Filtration sehr schnell verstopfen, was zu langen Verzögerungen

durch einen stark erhöhten Strömungswiderstand führt. Bei den im weiteren Verlauf

verwendeten Disks war eine Filtration trotz vergleichbaren Adsorptionsvermögens aufgrund der

größeren Oberfläche nicht notwendig. Dies ermöglicht eine Verringerung des

Strömungswiderstandes und somit einer wesentlichen Erhöhung der Flußgeschwindigkeit.

Zudem wurde die Probe, sofern es möglich war, erst aufgegeben, nachdem sich die

Schwebeteilchen in der Probe abgesetzt hatten, so daß diese festen Bestandteile erst zum

Abschluß auf die obere Fritte der scheibenförmigen Kartusche gelangten und somit die

Geschwindgkeit der Aufgabe erst zum Ende verringert wurde.


Die Ermittlung der optimalen pH-Werte der Probenlösungen war von außerordentlicher

Wichtigkeit. Es zeigten sich starke Unterschiede in der Wiederfindungsrate und im

Mitextrahieren störender Interferenzen. Um die unterschiedlichen Werte miteinander

vergleichbar zu machen, wurde dem Eluat jeweils nach der Extraktion einen Standard

hinzugegeben und das Flächenverhältnis im Chromatogramm bestimmt. Die Abbildungen 6.7 bis

6.15 zeigen im einzelnen und Tabelle 6.8 in einer Zusammenstellung der Abhängigkeit der

Wiederfindungsraten von den pH-Werten der Probenvorlagen. Anhand dieser Aufstellung ist

ersichtlich, daß es eine große Gruppe gibt, die bei einem pH-Wert von 4 ein Maximum an

Extraktionseffizienz duchläuft. Die beiden Mustard-Verbindungen bilden jedoch Ausnahmen. So

werden für das Cyclophosphamid Mustard bei pH 7, für das Ifosfamid-Analogon bei pH 2 die

besten Wiederfindungsraten gefunden. Da es sich bei diesen Verbindungen um Strukturisomere

und Phosphorsäure-Derivate handelt, werfen diese Ergebnisse zunächst Fragen auf. Für die

Extraktion mit C18-Material müssen die Komponenten als neutrale Moleküle vorliegen. Hierfür

müssen bei der Extraktion einer Säure hohe Hydronium-Ionen-Konzentrationen herrschen, was

den niedrigen pH-Wert für IPM erklärt. Jedoch konnte durch Wägen der Kartuschen vor und

nach der Extraktion festgestellt werden, daß die Materialien bei einem solchen pH-Wert zerstört

werden [82]. Diese Erkenntnis wurde zum Anlaß genommen, auch das Ifosfamid Mustard bei

einem pH-Wert von 4 zu bestimmen.

Wie schon weiter oben erläutert, ist es nicht möglich, das Cyclophosphamid Mustard als solches

zu extrahieren, zu derivatisieren und zu detektieren. Es zerfällt während der Lagerung in wäßriger

Lösung, der Extraktion und Derivatisierung vollständig in das ebenfalls während des

Metabolismus entstehenden zytotoxischen Stoffwechselprodukt Bis(2-chloroethyl)amin, welches

schließlich bestimmt werden kann. Dieses Amin besitzt aller Voraussicht nach einen weitaus

geringeren pKa-Wert, liegt also schon bei geringeren H3O+-Ionen-Konzentrationen als

Neutralteilchen vor. Ein weiterer Parameter, der während der Probenaufgabe von Wichtigkeit ist,

ist die Durchlaufgeschwindigkeit des Probevolumens durch das Sorbensbett. Hierbei mußte ein

Kompromiß zwischen einer möglichst kurzen Analysendauer und der möglichst vollständigen

Gleichgewichtseinstellung zwischen den Analyten und der Festphase gefunden werden. Bei der

vom Hersteller angegebenen Durchflußrate von 80mL/min traten keine Substanzverluste auf,

jedoch um schlechtere Wiederfindungsraten durch Unwägbarkeiten in der Extraktion wie

unterschiedlich hohe Matrixbelastungen der Proben zu vermeiden, wurde mit einer Rate von

20mL/min gearbeitet.


Abb. 6.7:

pH-Wert-Abhängigkeit der

SPE von CP

Abb. 6.8:


SPE von IF

Abb. 6.9:


SPE von d4-CP

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0 2 4 6 8 10

pH-Wert

F(C

P)/

F(I

S)

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

0 2 4 6 8 10

pH-Wert

F(I

F)/

F(I

S)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0 2 4 6 8 10

pH-Wert

F(d

4-C

P)/

F(I

S)


Abb. 6.10:


SPE von KCP

Abb. 6.11:


SPE von KIF

Abb. 6.12:


SPE von CCP

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 2 4 6 8 10 12

pH-Wert

F(K

IF)/

F(I

S)

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

0 2 4 6 8 10 12

pH-Wert

F(K

CP

)/F

(IS

)

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 2 4 6 8 10 12

pH-Wert

F(C

CP

)/F

(IS

)


Abb. 6.13:


SPE von CIF

Abb. 6.14:


SPE von CPM/NNM

Abb. 6.15:


SPE von IPM

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10 12

pH-Wert

F(C

IF)/

F(I

S)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

0 2 4 6 8 10 12

pH-Wert

F(N

NM

)/F

(IS

)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 2 4 6 8 10 12

pH-Wert

F(I

PM

)/F

(IS

)


Tab. 6.7: Ergebnisse der pH-Wert-Optimierung bezüglich der Festphasen-Extraktion

Substanz CP KCP CCP CPM IF KIF CIF IPM d4-CP

OptimalerpH-Wert

4 4 4 7 4 4 4 2 4

Da am Anfang der Aufgabe ein nur geringer, am Ende jedoch durch das Zurückhalten

unlöslicher Schwebstoffen auf der Kartuschenfritte ein erheblich höherer Gegendruck herrscht,

mußte der Druck manuell nachgeregelt werden, um somit eine reproduzierbare Extraktion zu

gewährleisten.

6.3.3.4 Waschschritt

Auf diesen Schritt der Probenextraktion wurde verzichtet, da es gerade bei den kleineren und

polareren Komponenten sowohl bei rein wäßrigen als auch bei mit organischem Modifier

versetzten Waschlösungen zu starken Substanzverlusten kam.

6.3.3.5 Trocknung der Extrakionsscheiben

Ein Trocknen der Festphasen ist für diese analytische Fragestellung von großer Bedeutung. Es

wurde Stickstoff, Argon und die umgebende Luft durch die Säulen gesogen. Da kein Unterschied

zwischen den verschiedenen Gasen festzustellen war, also kein Inertgas benötigt wurde, um

eventuelle Oxidationsprozesse zu unterbinden, wurde ausschließlich Luft zum Trocken der

Festphasen verwendet. Wichtig war die Dauer dieses Arbeitsschrittes. Da zumindest die

Augangsverbindungen erwiesenermaßen einen meßbaren Dampfdruck besitzen (3,3∙10-5 hPa für

CP, 1,4∙10-5 hPa für IF), erschien es ratsam, die Sorbentien nicht zu intensiv zu trocknen. Auf der

anderen Seite mußten die wäßrigen Überreste entfernt werden, damit diese die anschließende

Derivatisierung nicht störten. So wurden die Festphasen 10 Minuten im leichten Luftstrom

getrocknet.


6.3.3.6 Elution

Weniger die Art des organischen Elutionsmittels als vielmehr deren Aufgabe auf die Festphase

konnte die Elution der Komponenten beeinflussen. Die getesteten Lösungsmittel zeigten keine

signifikanten Unterschiede in der Elutionskraft von Methanol, Acetonitril, Ethylacetat und Hexan

bezüglich der interessierenden Verbindungen. Jedoch spielten die Aufteilung des

Gesamtvolumens und die Einwirkzeit im Sorbensbett eine erhebliche Rolle. Die

Wiederfindungsrate konnte durch dieses wiederholte Einstellen des Gleichgewichtes erhöht

werden, was anhand der beiden Hauptkomponenten Cyclophosphamid und Ifosfamid in den

folgenden Diagrammen (Abb. 6.16 bis 6.19) gezeigt werden soll.

Bei dieser Untersuchung wurden jeweils 1L mit 100ng CP und IF dotiertes Oberflächenwasser

mit Hilfe der beiden C18-Phasen extrahiert. Die Konditionierung und Trocknung der Phase

erfolgte wie oben beschrieben. Als Kompromiß aus Elutionskraft und Flüchtigkeit wurde

Acetonitril als Elutionslösungsmittel gefunden. Die Desorption erfolgte mit 10 x 5mL dieses

Lösungsmittels. Außerdem wurde die Einwirkzeit auf jeweils 2 Minuten festgesetzt. Die

einzelnen Fraktionen wurden separat aufgefangen und weiterverarbeitet. Die Analyse ergab, daß

erst nach der dritten Gabe von Elutionsmittel über 95% der Verbindungen eluiert werden

konnten. Auch ein Wechsel auf andere Festphasen oder Lösungsmittel brachte keine Änderung.

Das hatte zur Folge, daß die Elution im weiteren Verlauf jeweils mit 3 x 5mL Acetonitril erfolgte.

Die Stabilitäten der Verbindungen im Eluat sind verschieden. Während die Muttersubstanzen

und die Ketoverbindungen bei einer Tiefkühlung von –18°C über Monate hinweg keine

Substanzverluste zeigen, zerfallen die anderen Metabolite, vor allem die Carboxy-Komponenten

innerhalb weniger Tage auf nicht bekanntem Wege. Insofern ist eine sofortige weitere

Verarbeitung der Eluate indiziert.


Abb. 6.16: Fraktionssammlung nach Cyclophosphamid-SPE mit C18-Speedisk

Abb. 6.17: Fraktionssammlung nach Ifosfamid-SPE mit C18-Speedisk

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Fraktionsnummer

Re

l. F

läc

he

nza

hl

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Fraktionsnummer

Re

l. F

läc

he

nza

hl


Abb. 6.18: Fraktionssammlung nach Cyclophosphamid-SPE mit C18 Polar Plus-Speedisk

Abb. 6.19: Fraktionssammlung nach Ifosfamid-SPE mit C18 Polar Plus-Speedisk

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

0 2 4 6 8 10 12

Fraktionsnummer

Re

l. F

läc

he

nza

hl

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

0 2 4 6 8 10 12

Fraktionsnummer

Re

l. F

läc

he

nza

hl


6.3.3.7 Einengen des Eluats

Durch den Einsatz unterschiedlicher Inertgase (Stickstoff, Argon) konnte gezeigt werden, daß die

Verwendung keines der Gase zu einer Verringerung der Wiederfindungsrate führte. Wurde

jedoch Luft zu Verdrängen des überflüssigen Elutionsmittels gebraucht, so konnten geringe

Substanzverluste bei den Mustard-Metaboliten festgestellt werden.

Wie schon in Kapitel 6.3.2.7 erläutert, existiert bei diesem Punkt ein Unterschied zwischen dem

Cyclophosphamid Mustard und den restlichen Verbindungen, die unter den entwickelten

Bedingungen zu extrahieren waren. Das vollständige Entfernen des Elutionsmittels und der in

ihm enthaltenen Wasserspuren aus der Extraktion ist bei den Komponenten der Gruppe 1 zum

Erreichen maximaler Wiederfindungsraten obligat. Der Dampfdruck des CPM oder des

mittlerweile während des Extraktionsprozesses entstandenen NNM scheint so groß zu sein, daß

es unter den gewählten Bedingungen verdampft oder sich weiter zersetzt, sollte kein Rückstand

von wenigen Mikrolitern in der Probenvorlage zurückbleiben.

Um die Abkühlung durch die Kälte des verdampfenden Lösungsmittel und somit eine damit

verbundene Erniedrigung des Damfdruckes zu kompensieren, wurde auf einer Temperatur

knapp unterhalb des Lösungsmittelsiedepunktes (hier bei ACN: 80°C) temperiert.

6.4 Derivatisierung

Verbindungen, die mehrere stark polare funktionelle Gruppen wie z.B. –OH, –COOH oder

–NH2 sowie zusätzlich noch weitere Heteroatome enthalten, verursachen Schwierigkeiten bei der

gaschromatographischen Trennung wegen ihrer stark verminderten Flüchtigkeit und ihrer

Adsorption an Teilen des Systems wie Injektor, Säule und Detektor. Verbindungen dieser Art

(Dicarbonsäuren, Phenole, Polyalkohole, -saccharide, u.a.) lasssen sich unzersetzt und ohne

Tailing nur nach vorheriger Derivatisierung, d.h. durch Entfernung der polaren Gruppen durch

Reaktion mit bestimmten Reagenzien, die selbst nicht zu polar sind, chromatographieren. Für

jede dieser funktionellen Gruppen steht eine Reihe von Derivatisierungsmitteln zur Verfügung.

Häufig werden diese Reaktionen auch dafür eingesetzt, um die Detektion der derivatisierten

Verbindungen viel empfindlicher zu machen, indem funktionelle Gruppen in das Molekül

eingebaut werden, die einen sehr hohen Response in einem spezifischen Detektor (z.B.: ECD

oder GC-MS) zeigen, so daß Spurenkomponenten sicherer nachgewiesen werden können.


Bei der Verwendung eines Massenspektrometers als Detektor kann die Derivatisierung auch als

chemischer Test für spezifische Struktureigenschaften des unbekannten Moleküls oder eines

Fragments eingesetzt werden. Des weiteren kann durch Einfügen einer solchen Gruppe mit

möglichst hohem Molekulargewicht das Gesamtgewicht des zur Quantifizierung genutzten Ions

stark erhöht werden, was eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses im

Massenchromatogramm mit sich bringt. Je größer das zum Auswerten verwendete m/z-

Verhältnis ist, desto geringer ist das chemische Rauschen im Chromatogramm. Das resultiert aus

der Tatsache, daß Matrixbestandteile und Säulenbluten, die zu einen großen Teil zum Rauschen

beitragen, nur unterhalb des m/z-Wertes von 300 Fragmente bilden.

Eine weiterer Vorteil liegt in der Tatsache, daß durch Derivatisierungen mit Reagenzien

geeigneter Polarität und Struktur der in das Analytmolekül einzubauenden Gruppe auch die

Selektivität der chromatographischen Trennung verbessert wird.

Ein Nachteil der strukturellen Veränderung eines Analytmoleküls durch eine Derivatisierung

besteht häufig darin, daß diese Reaktionen oft nicht vollständig ablaufen und einen höheren

Arbeitsaufwand erfordern.

Bei den zu derivatisierenden Verbindungen handelt es sich um Komponenten, die Hydroxy- und

Aminogruppen als funktionelle Gruppen haben. Die OH-Gruppen sind Teil einer Carbonsäure-

(IPM) oder einer Phosphorsäure-Funktion (CCP, CIF). Die Aminofunktionen liegen sowohl als

endozyklische Sekundäraminogruppen (CP, KCP) als auch als exozyklische Primär- (CCP, ggf.

CPM) und Sekundäraminogruppen (IF, KIF, CIF, IPM, NNM) vor. Es gilt, diese Gruppen

insoweit chemisch zu verändern, daß die Verbindungen chromatographisch analysierbar werden.

Also muß ihre Polarität wie auch ihre Tendenz zur Adsorption innerhalb des Systems reduziert

werden. Des weiteren ist auch ein Abbau, wie er im folgenden anhand des Beispiel von

Cyclophosphamid gezeigt ist (Abb. 6.20), zu verhindern. Hierbei kommt es während des GC-

Laufs zu einem im Umfang nicht reproduzierbaren intramolekularen Ringschluß.

O NH

P

O

N

ClCl

O N

P

O

N

Cl

Wärme

- HCl

Abb. 6.20: Intramolekularer Ringschluß von Cyclophosphamid bei Wärmezufuhr


6.3.1 Optimierung der Derivatisierungsreaktion

6.3.1.1 Alkylierung, Veresterung, Veretherung

Die Verwendung von alkylierenden Reagenzien für die Derivatisierung ist nur für Analyten mit

reaktiven Wasserstoffatomen wie Carbonsäuren, Alkoholen, Aminen, Amiden oder Thiolen

geeignet. Das Ersetzen eines solchen Wasserstoffs durch eine Alkylgruppe ist wichtig für die

chromatographische Analyse wegen des Verlustes an Polarität und der intermolekularen

Wechselwirkung des Moleküls verglichen mit der Ausgangssubstanz.

In dem vorliegenden Fall wurde der Schwerpunkt auf die Einführung einer Methylgruppe in die

Molekülstruktur gelegt. Mit den folgenden Reagenzien bzw. Reagenzsystemen wurde versucht,

die Hydroxy-Gruppen zu alkylieren:

→ Methanol/HCl

→ Trimethylsulfoniumhydroxid

→ Diazomethan

→ Methyliodid/Triethylamin

→ 3,5-Bis(trifluoromethyl)benzylbromid/Triethylamin

→ Pentafluorobenzylbromid/K2CO3

Diese Reaktionen wurden in verschiedenen Lösungsmitteln durchgeführt. Ebenfalls Gegenstand

der Untersuchungen war der Einfluß der eingesetzten Reagenzmenge sowie die Dauer und

Temperatur der Reaktionszeit auf die Effizienz.


6.4.1.2 Silylierung

Auch diese Derivatisierungsmethode wird angewandt, um die Flüchtigkeit der Verbindung

heraufzusetzen und die Dipol/Dipol-Wechselwirkungen zwischen den Molekülen zu reduzieren.

Die Einführung einer Silylgruppe in eine Struktur kann für die massenspektrometrische

Detektion von großem Vorteil sein, weil sie entweder ein für Strukturuntersuchungen günstiges

Zerfallsschema zeigt oder charakteristische Ionen für die Bestimmung der Komponenten im

Spurenbereich erzeugt. Aufgrund der bekannten Empfindlichkeit dieser Art der Derivatisierung

gegenüber Wasserspuren in der Reaktions- und Injektionslösung wurde nur der Versuch mit N-

Methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamid unternommen.

6.4.1.3 Acylierung

Das Ersetzen azider Protonen durch eine Acylgruppe kann prinzipiell auf drei Arten erfolgen:

mit Säureanhydriden, Säurehalogeniden oder anderen reaktive Acylderivaten wie acylierten

Imidazolen, Amiden oder Phenolen. Bei der Optimierung wurden folgende Reagenzien auf ihre

Fähigkeit, Gruppen wie Hydroxy-, Amino- oder Carbonsäurefunktionen zu acylieren, geprüft:

→ Trifluoressigsäureanhydrid, TFAA

→ Pentafluorpropansäureanhydrid, PFPA

→ Heptafluoressigsäureanhydrid, HFBA

→ Heptafluorbutyrylimidazol, HFBI

Hierbei wurden im besonderen Derivatisierungsmittel untersucht, die im Hinblick auf eine

möglichst spezifische und selektive Detektion mit dem Massenspektrometer gute Ergebnisse

liefern könnten. Die Derivatisierung mit diesen Reagenzien erhöhen die m/z-Verhältnisse der

detektierten Ionen und reduzieren damit das chemische Rauschen im entsprechenden

Chromatogramm. Auf der anderen Seite beinhalten die Verbindungen 3 bis 7 Fluoratome pro

eingefügtem Seitenarm. Dies erhöht die Fähigkeit der Moleküle, in der Ionenquelle des

Massenspektrometers mit emittierten Elektronen zu wechselwirken und somit zu ionisieren. Bei

der Anwendung der Negativen Chemischen Ionisierung sind solche Atome unabdingbar

notwendig.



6.4.2.1 Cyclophosphamid/Ifosfamid/4-Keto-Ifosfamid

Die zu derivatisierenden sekundären Aminofunktionen können mit Hilfe von TFAA hinreichend,

weil schnell und quantitativ zu Mono-TFA-Derivaten umgesetzt werden, was an einigen Stellen

in der Literatur [u.a. Dipl, Sessink, Kümmerer, de Bruijn] nachzulesen ist. Ebenso wurden zur

Steigerung der Meßempfindlichkeit und zur Strukturaufklärung eines Fragmentes von CP und IF,

welches während der Detektion im Massenspektrometer entsteht (siehe Kapitel 7.3), die übrigen

perfluorierten Säureanhydride mit den beiden Ausgangsverbindungen und dem Ifosfamid-

Metaboliten jeweils in einem großen Überschuß an Reagenz in die Vorlage gegeben und in einem

Ethylacetat-Medium 1 Stunde bei 70°C zur Reaktion gebracht.

Hierbei zeigte sich, daß die Reaktion mit allen Derivatisierungsmitteln vonstatten geht, jedoch

nahmen die Umsatzraten mit steigender Molekülmasse der Derivate ab. Daraus resultierte die

weitere Verwendung von Trifluoressigsäureanhydrid als Derivatisierungsreagenz für

Cyclophosphamid, Ifosfamid und 4-Keto-Ifosfamid.

6.4.2.2 4-Keto-Cyclophosphamid

Diese Verbindung wurde auf verschiedenste Art mit methylierenden und acylierenden

Verbindungen zur Reaktion gebracht. So wurden Versuche gemacht, 4-Keto-Cyclophosphamid

in Lösungsmitteln unterschiedlicher Polaritäten (Hexan, ACN, MeOH, THF, EtOAc, Toluol,

DMF, CH2Cl2, Diethylether, CCl4) mit Trimethylsulfoniumhydroxid zu methylieren oder mittels

TFAA (nicht in MeOH) zu trifluoracetylieren. Während das TFA-Derivat in keiner

Reaktionslösung zu detektieren war, konnte das methylierte KCP nach der Reaktion von TMSH

in CCl4 in geringen Mengen nachgewiesen werden.

Im Hinblick auf mögliche Ionisierungsmethoden wurde des weiteren das Reaktionsverhalten

verschiedener perfluorierter Verbindungen ermittelt. Sowohl die Alkylierungen mit

Pentafluorobenzylbromid/K2CO3 und 3,5-Bis(trifluoromethyl)benzylbromid/Triethylamin als

auch die Acylierungsversuche mit HFBA verliefen erfolglos. Die Reaktion mit dem

fluoroacylierten Imidazol ergab als einzige akzeptable Ausbeuten.


Eine äußerst schnelle und effektive Reaktion (15 Minuten bei Raumtemperatur) wurde mit der

Methylierung durch Diazomethan in einer Ether-Lösung gefunden. Die Wiederfindungsrate, die

mit dieser Methode erzielt werden konnte, war die mit Abstand beste, so daß diese Methode im

weiteren Verlauf zur Derivatisierung von KCP benutzt wurde.

6.4.2.3 Carboxyphosphamid/Carboxyifosfamid

Die beiden Carboxy-Metaboliten zeigen ein sehr ähnliches Reaktionsverhalten. Die

Methylierungsversuche mit methanolischer TMSH-Lösung in DMF und Methyliodid (K2CO3 als

Fällungsreagenz) in Aceton zeigten nur wenig Erfolg, während erneut die Derivatisierung mit

Diazomethan eine äußerst schnelle und praktikable Lösung für die Reaktion mit der

Cabonsäurefunktion darstellte. Die primäre bzw. sekundäre Aminogruppe konnte erneut gut mit

Trifluoressigsäureanhydrid in die entsprechenden TFA-Derivate überführt werden, was mit

PFPA und HFBA mißlang. Erwähnenswert ist, daß bei CIF wahrscheinlich aufgrund sterischer

Hinderung nur eine der beiden identischen Phosphorsäureamid-Funktionen derivatisiert werden

konnte, während es beim CP-Analogon während der Probenaufbereitung zu einem

reproduzierbaren intramolekularen Ringschluß kommt (Abb. 6.21).

O NH

P

O

N

ClCl

O

O

O N

P

O

N

Cl

O

O

CF3

O

O

F3C

- HCl

Abb. 6.21: Struktur des Carboxy-Derivats von Cyclophosphamid


Wichtig zu erwähnen ist, daß es nur möglich war, zuerst die Methylierung und dann erst die

Trifluoracetylierung vorzunehmen. Brachte dies gute Wiederfindungsraten, so konnte bei der

umgekehrten Vorgehensweise keine entsprechenden Verbindungen nachgewiesen werden.

Von Wichtigkeit ist auch, daß es sich hierbei um nur mäßig stabile Derivate handelt, die nach der

Reaktion umgehend mit der GC-MS vermessen werden mußten. Eine Alternativreaktion, die zu

stabileren Verbindungen führte, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht gefunden werden.

Die Untersuchung der Reaktionsdauer und –temperatur erbrachte, daß die Methylierung schon

bei Raumtemperatur und nach 15 Minuten vollständig erfolgt war, während die

Trifluoracetylierung wie auch schon bei den oben erwähnten Verbindungen 1 Stunde bei 70°C

benötigt.

6.4.2.4 Cyclophosphamid Mustard

Wird von der Struktur dieses Metaboliten ausgegangen, so sind wiederum ein –OH- und eine

primäre Aminogruppe chemisch so zu verändern, daß sie nicht die oben erwähnten Effekte im

Chromatographen zeigt.

Das Verhalten von CPM unterscheidet sich maßgeblich von dem der anderen Metaboliten von

Cyclophosphamid und Ifosfamid. Während des Auftauens einer gefrorenen Probe, der

Aufbewahrung in Lösung, der Flüssig/Flüssig- wie Festphasen-Extraktion und der

Derivatisierung mit den obigen Reagenzien baut sich CPM unter Bruch der P-N-Bindung zu Nor

Nitrogen Mustard ab.

Die reine Methylierung mit etherischer Diazomethan-Lösung ergibt ein Gemisch aus drei

verschiedenen Methylderivaten, die durch die Reaktionen mit beiden möglichen Stellen im

Molekül entstanden sind, entweder am Stickstoff der Amino-, am Sauerstoff der Phosphorsäure-

Gruppe oder an beiden Funktionen. Da diese unterschiedlichen Reaktionswege völlig

unreproduzierbar beschritten werden, kann auch nicht nur eine Komponente zur Quantifizierung

herangezogen werden.

Soll das acide Proton der Aminogruppe durch Trifluoracetylierung ersetzt werden, so findet der

endgültige und vollständige Abbau zum Bis(2-chloroethyl)amin unter P-N-Bindungsbruch beim

CPM statt. Hierbei scheint die Anwesenheit des Reagenz den Abbau zu forcieren.


Die Menge des Reagenzes (10, 20, 50, 100µL), die Dauer (sofort, 30, 60, 120, 300 Minuten) und

die Temperatur der Reaktion (RT, 70°C) wurden variiert. Bis auf die Tatsache, daß bei der

Verwendung von nur 10µL TFAA nur eine geringe Ausbeute zu verzeichnen ist, haben diese

Faktoren alle keinen Einfluß auf die entstehende Menge an NNM. Es ist also davon auszugehen,

daß die Trifluoracetylierung von CPM/NNM schnell und quantitativ verläuft.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Konzentration von Cyclophosphamid Mustard

in einer Oberflächen- oder Abwasserprobe nur über die Trifluoracetylierung als NNM-TFA-

Derivat bestimmt werden kann. Da sich jedoch, wie in einigen Literaturstellen zu lesen ist [F48,

F49] und was auch im Laufe dieser Arbeit mehrfach gezeigt werden konnte, auch andere

Verbindungen des Cyclophosphamid-Metabolismus in das Abbauprodukt Nor Nitrogen Mustard

umsetzen, kann bei einer Bestimmung dieser Substanz stets nur über diese Summe, nicht jedoch

über die Konzentration des frei vorliegenden NNM eine Aussage getroffen werden.

6.4.2.5 Ifosfamid Mustard

Beim Ifosfamid-Analogon ist kein ähnliches Verhalten wie beim Cyclophosphamid Mustard zu

beobachten. Bei allen Versuchen, die Phosphorsäure-Funktion mit verschiedenen

Methylierungsreagenzien zu verestern bzw. die sekundäre Aminogruppe zu acetylieren, kommt es

nicht zu dem entsprechenden Abbau zum 2-Chlorethylamin.

Die säurekatalysierte Veresterung mit Methanol und einigen Mikrolitern konzentrierter Salzsäure

und die Methylierung mit Iodmethan und Triethylamin als Fällungsreagenz konnten keine

zufriedenstellenden Ergebnisse liefern. Auch die Veränderungen der eingesetzten Menge an

Reagenz sowie die Dauer (60, 120, 180, 240, 300 Minuten) und Temperatur (RT, 50°C) der

ablaufenden Reaktion erbrachten keine Verbesserungen. Ein Vergleich einer

Diazomethanreaktion in Ether mit der unternommenen Iodmethan-Derivatisierung ergab ein um

das Sechsfache verbesserte Flächenverhältnis von Analyt zu internem Standard, der bei beiden

Reaktionen in gleichen Mengen hinzugegeben worden war. Somit war es wiederum diese

Reaktion, die am besten geeignet war, um die OH-Funktion des IPM zu verestern. Um das azide

Aminproton zu ersetzen, wurden auch hier Versuche unternommen, mit TFAA, PFPA und

HFBA zu acetylieren. Jedoch erbrachte auch beim IPM nur TFAA die höchste

Wiederfindungsraten.


6.4.2.6 1,3-Oxazolidin-2-on/2-Chlorethylamin

Die Aminogruppen dieser beiden kleinsten Metaboliten des Ifosfamid konnten ohne

Schwierigkeiten mit Trifluoressigsäureanhydrid zu den jeweiligen TFA-Derivaten umgesetzt

werden. Hierbei wurden die gleichen Reaktionsparameter verwendet wie bei allen anderen

Verbindungen.

Die Substanzen wurden 1 Stunde lang in 70°C heißem Ethylacetat mit 100µL TFAA zur

Reaktion gebracht, danach das überschüssige Reagenz und Lösungsmittel mittels eines

Inertgasstroms entfernt und schließlich der Rückstand wieder in Ethylacetat aufgenommen.

6.5 Einteilung der Verbindungen in Gruppen für die Probenvorbereitung

Ein Ziel dieser Arbeit war, eine schnelle und effiziente Analytik zu entwickeln, die es ermöglicht,

mit geringem Zeit- und Materialaufwand viele der in den Metabolismen von Cyclophosphamid

und Ifosfamid vorkommenden, stabilen Verbindungen anreichern und detektieren zu können.

Um diese Vorgabe zu erfüllen, ist es notwendig, möglichst viele der untersuchten Komponenten

in Gruppen für die Probenvorbereitung einzuteilen. Dabei sind der Zeitgewinn und mögliche

Einbußen in der Nachweisstärke gegeneinander abzuwiegen.

Die beiden Metaboliten 1,3-Oxazolidin-2-on und 2-Chlorethylamin konnten zwar derivatisiert

und mittels einer GC-MS analysiert werden, jedoch entzogen sie sich jeglicher Versuche, sie aus

der wäßrigen Matrix zu extrahieren. Insofern wurden diese Substanzen im weiteren Verlauf dieser

Arbeit nicht weiter untersucht.

Da es sich bei den restlichen untersuchten Verbindungen naturgemäß um eine relativ homogene

Gruppe handelt, war es möglich, sie alle mit Festphasen auf Silicagel-Basis und endständigen C18-

Gruppen anzureichern. Allein das Cyclophosphamid Mustard verhielt sich aufgrund seines

Abbaus zu Nor Nitrogen Mustard im Laufe der Probenvorbereitung in drei Punkten different.

Zum einen ließ sich CPM auf einer C18-Polar Plus-Phase und bei einem pH-Wert von 7 weitaus

besser extrahieren als mit den Konditionen der restlichen Komponenten. Des weiteren war beim

Entfernen des überschüssigen Lösungs- und Derivatisierungsmittels die Reduktion bis auf einen

Rückstand von wenigen Mikrolitern durchführbar, um eine gute Wiederfindungsrate und

Reproduzierbarkeit zu erreichen.


Der Tabelle 6.8 ist die Einteilung der Analyten in die Gruppen für die Probenvorbereitung mit

den entsprechenden optimierten Parametern zu entnehmen.

Tab. 6.8: Einteilung der Zytostatika und deren Metabolite in Gruppen für die Probenvorbereitung

Gruppe 1

Cyclophosphamid, 4-Keto-Cyclophosphamid, Carboxyphosphamid,

Ifosfamid, 4-Keto-Ifosfamid,Carboxyifosfamid, Ifosfamid Mustard

Gruppe2

Cyclophosphamid Mustard

Sorbens C18 C18 Polar Plus

Konditionierung 25mL Methanol 25mL bidestilliertes Wasser

25mL Methanol 25mL bidestilliertes Wasser

pH-Wert Probe 4 7

Waschschritt / /

Elution 3 x 5mL Acetonitril 3 x 5mL Acetonitril

Einengen Mit Inertgas bis zur Trockne Mit Inertgas bis zu einemRückstand von ca. 20µL

Derivatisierung 1. Methylierung mit Diazomethan2. Trifluoracetylierung mit TFAA

1. Methylierung mit Diazomethan2. Trifluoracetylierung mit TFAA

Es war im weiteren darauf zu achten, daß während der Probenvorbereitung die Verbindungen

den Derivatisierungen in der angegebenen Reihenfolge zugeführt wurden. Das jeweilige Abblasen

des organischen Überschusses während der Derivatisierung ist in der gleichen Form

durchzuführen wie beim Einengen des SPE-Eluats.

7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 82

7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren

7.1 Verwendete Geräte und Gase

Für die gaschromatographische Trennung wurde der GCQ-Gaschromatograph der Firma

Thermo Quest, der mit einer elektronischen Druck- und Flußkontrolle des Trägergases und mit

einem split/splitless-Injektor versehen ist, verwendet. Als Detektor kam ein entsprechendes

GCQ Ion Trap-Massenspektrometer mit der Option, Messungen mittels positiver und negativer

chemischer Ionisierung sowie im Full Scan-, SIM- und MS/MS-Modus durchzuführen, zum

Einsatz. Um die Vergleichsmessungen an einem Quadrupol-Massenspektrometer vornehmen zu

können, wurde von der Firma Axel Semrau GmbH & Co. (Sprockhövel, Deutschland) ein

solches, ebenfalls von Thermo Finnigan hergestelltes Strahlgerät (Automass) zur Verfügung

gestellt. Beide Gaschromatographen waren zusätzlich zu ihren split/splitless-Injektoren mit einer

speziellen Optic 200-Injektionseinheit der Firma Atas (Veldhoven, Niederlande) versehen, der es

ermöglichte, temperaturprogrammierte sowie großvolumige Probenaufgabe auf eine analytische

Säule vorzunehmen. Die rechnergestützte Datenaufnahme wie die Steuerung der beiden

Gerätekonfigurationen erfolgte mit der Software des Geräteherstellers (Xcalibur, Version 1.2).

Durch die Verwendung des Autosamplers Combi PAL der Firma CTC (Schweiz), der mit einer

10µL-Spritze (SGE, Hamilton) ausgestattet war, konnte die Probenaufgabe automatisiert und

dadurch reproduzierbarer durchgeführt werden.

Die verwendeten Gase sollten möglichst hohe Reinheiten aufweisen. Als Trägergas kam in allen

untersuchten Fällen Helium der Reinheit 5.0 zum Einsatz. Bei den Gasen, die bei der chemischen

Ionisierung als Reaktandgas in der Ionenquelle des Massenspektrometers benötigt wurden, lagen

die Reinheitsgrade zwischen 2.8 und 4.5. Alle für Injektions- und Spüllösungen benutzten

organischen Lösungsmittel wiesen p.A.-Qualität auf, konnten also für die organische

Spurenanalyse verwendet werden.

7.2 Entwicklung der chromatographischen Methode

Das Ziel einer gaschromatographischen Trennung ist zumeist eine möglichst gute Auflösung der

untersuchten Komponenten und die Separierung derselbigen von den störenden

Matrixbestandteilen.


Jedoch ist oft nicht die maximale, sondern nur eine auf die spezielle analytische Fragestellung

bezogene Effizienz erforderlich. So ist bei einer komplexen Stoffmischung eine äußerst hohe

Trennleistung notwendig, um die jeweiligen Komponenten qualitativ bestimmen zu können,

während für eine quantitative Analyse einer weniger komplexen und in ihrer Zusammensetzung

bekannten Stoffmischung eine gerade ausreichende und häufig damit zeitsparende Trennung

ausreichend ist. Zu beachten ist weiter, daß die chromatographischen Peaks möglichst eine

symmetrische Form haben und keine Deformationen durch Fronting (langsam ansteigende

Vorderflanke und steil abfallende Hinterflanke des Peaks) oder Tailing (steil ansteigende

Vorderflanke und langsam abfallende Hinterflanke) aufweisen. Sollte dies auftreten, so kann es zu

einer Verfälschung der Retentionsdaten kommen. Bei der Spurenanalyse zum Nachweis

geringster Mengen in Umweltkompartimenten ist es dabei wichtig, vorab die Verbindungen in

ausreichenden Mengen zu analysieren, um die Parameter der Trennung und der Detektion

optimieren zu können. In der Spurenanalytik werden hohe Anforderungen an die Belastbarkeit

des gesamten chromatographischen Systems gestellt; die Retentionsdaten müssen reproduzierbar

sein, was bedeutet, daß die Polarität und alle anderen Parameter der Säulen eines Herstellers von

einer speziellen Säule zur anderen völlig gleich sein müssen. Außerdem müssen beim

Gaschromatographen die Temperaturprogramme reproduzierbar eingestellt sowie bei isothermen

Messungen konstant gehalten werden können. Des weiteren hängen die Retentionsdaten stark

vom Druck des Trägergases ab, was bedeutet, daß die Steuerung der Trägergasstromes korrekt

und wiederholbar sein muß.

7.2.1 Optimierung der gaschromatographischen Systemparameter

7.2.1.1 Trennsäulen

Die beiden verschiedenen Arten von gaschromatographischen Säulen werden in gepackte Säulen

und Kapillartrennsäulen unterschieden. Wurden noch bis in die achziger Jahre die gepackten

Säulen zum Lösen analytischer Probleme herangezogen, so haben sich mittlerweile die

Kapillartrennsäulen in der praktischen Anwendung durchgesetzt. Bei den für diese Arbeit

verwendeten Kapillarsäulen ist die stationäre Phase in Form eines Films an die Innenwandungen

der Säule aufgebracht.


Folgende zwei Punkte waren für die Beurteilung der Leistungsfähigkeit einer Säule bezogen auf

das analytische Problem besonders von Gewicht. Zum einen wurden Säulen unterschiedlicher

Polaritäten getestet, um den möglicherweise verschiedenen intermolekularen Wechselwirkungen

zwischen Analyten und stationärer Phase Rechnung zu tragen. Auf der anderen Seite schien es

indiziert, die Beständigkeit der Säule oder besser die der stationären Phasen zu untersuchen.

Denn das Rauschen des Detektors, also das Störsignal, das den Untergrund im Chromatogramm

erzeugt, wird zu einem großen Teil vom sogenannten Säulenbluten hervorgerufen. Dieser Begriff

beschreibt das Auftreten von im Trägergas befindlichen flüchtigen Bestandteilen der stationären

Phase, die durch thermische oder katalytische Zersetzung entstehen.

7.2.1.2 Injektionstechnik

Durch das Aufkommen der Kapillar-Trennsäulen in der Gaschromatographie ist die

Probenaufgabe zu einem limitierenden Faktor für die Qualität der chromatographischen

Trennung geworden und ist somit von elementarer Bedeutung. Ziel ist es, eine möglichst schmale

Substanzzone am Kopf der Trennsäule zu schaffen. Eine bei der Entwicklung der vorliegenden

Methode benutzte Technik fällt in die Gruppe der heißen Aufgabetechniken. Hierunter versteht

man die klassische Aufgabetechnik, bei der die Dosierung der Probelösung in konstant beheizte

Injektoren erfolgt. In dem eigens dafür vorgesehenen Verdampfungsrohr (Insert) verdampft

sowohl das Lösungsmittel als auch die darin gelöste Probe und vermischt sich mit dem

eingespeisten Trägergas. Die Temperaturen der Injektionsapparatur belaufen sich auf 200 bis

300°C. Es besteht die Möglichkeit, den Transfer der Lösungsmittel-/Probe-Anteile in die Säule

mittels einer Splitvorrichtung zu steuern. Die beiden Betriebsweisen der Split-Injektion und der

Totalinjektion sind möglich.

Bei der Split-Injektion wird der Proben-/Trägergas-Strom nach dem Verdampfen im Insert

durch die Split-Technik aufgeteilt. Der größere Teil verläßt den Injektor durch den Splitausgang,

der kleinere gelangt auf die Trennsäule. Das Splitverhältnis ist variabel und kann je nach

Analytkonzentration, Detektorempfindlichkeit und Kapazität der Säule angepaßt werden. Übliche

Werte liegen zwischen 1/10 und 1/100. Das kleinste einstellbare Verhältnis ist vom

Innenvolumen des Inserts abhängig. Bei konzentrierten Proben ist diese Technik optimal, um die

Substanzmenge der Säulen- und Detektorkapazität anzupassen, während sich in der

Spurenanalytik durch einen höheren Splitstrom die Trägergasgeschwindigkeit erhöht.


Somit wird ein stark beschleunigter Transport der Probenwolke am Säulenanfang vorbei und die

Aufgabe einer sehr schmalen Probezone auf die Trennsäule ermöglicht. Nachteilig wirkt sich bei

dieser Technik die unkontrollierbare Diskriminierung bei Probenzusammensetzungen mit

großem Siedepunktsbereich aus. Von Quantifizierungen mit externem Standard ist daher unter

diesen Umständen abzusehen.

Erfolgt die Probenaufgabe mit geschlossenem Splitventil, so wird diese Technik Totalaufgabe

oder splitlose Injektion genannt. Besonders zum Tragen kommt hierbei das Volumen des Inserts,

das die Probe-/Lösemittel-Dampfwolke zunächst vollständig aufnehmen muß, weshalb bei

Totalaufgabe benutzte Inserts ein größeres Volumenhaben sollten als die bei Split-Injektion

verwendeten. Dies widerspricht dem in der Literatur angegebenen Vorgehen. Ist das

Verdampfungsrohr aber zu klein, so kommt es bei der explosionsartigen Verdampfung des

Lösungsmittels zu einer Ausdehnung der Dampfwolke in den Septumsbereich hinein und somit

zu einer Kontamination des Septums oder der Septumsleitung. Zu weite Inserts bewirken eine zu

starke Verdünnung der Probenwolke und damit verlängerte Transferzeiten und Verluste durch

Diffusion. Gängige Insert-Volumina belaufen sich ungefähr auf 1mL bei einem

Injektionsvolumen von 1-2µL. Durch das Trägergas wird die Probewolke aus dem Injektor stetig

in die Trennsäule gespült. Dieser Vorgang nimmt in der Regel etwa 30 bis 90 Sekunden bis zum

vollständigen Transfer in Anspruch. Es wird ein drei- bis fünfmaliger Transfer des

Insertvolumens ermöglicht. Längere Transferzeiten begünstigen die Verbreiterung der jeweiligen

Peaks und den weiteren Eintrag von (Stör-) Komponenten in die Säule. Um dies zu unterbinden,

wird das Splitventil nach abgeschlossenem Probentransfer wieder geöffnet.

Durch die Verwendung des Optic-Injektor war es möglich, nicht nur die bei Benutzung des

eingebauten split/splitless-Injektors vorhanden Optionen zu nutzen, sondern auch spezielle

Techniken wie die Großvolumenaufgabe (large volume injection) zu testen. Hierbei werden für

die Gaschromatographie verhältnismäßig große Volumina von bis zu 250µL bei geschlossenem

Splitventil auf einen speziell gepackten Liner gegeben, der in der Lage ist, diese

Lösungsmittelmengen in seinem Bett zu speichern. Da der Injektor temperaturprogrammiert

arbeitet, startet die Injektion mit einer Temperatur, die gut 5-10°C unterhalb des

Lösungsmittelsiedepunktes liegen sollte. Dann öffnet sich ein zusätzliches Ventil (solvent vent),

über das mit Hilfe eines hohen Trägergasstromes das überschüssige Lösungsmittel aus dem

System entfernt wird. Die aufkonzentrierten Analyten verbleiben im Idealfall komplett auf dem

Packungsmaterial und werden durch Aufheizen des Liners in Form von schmalen Banden auf die

analytische Säule transferiert. Diese drei vorgestellten Injektionstechniken wurden auf ihre

Verwendbarkeit getestet.


7.2.1.3 Temperaturprogrammierung

Die Säulentemperatur hat direkten Einfluß auf die absoluten und relativen chromatographischen

Flüchtigkeiten und somit auf die Retentionsdaten der Komponenten auf einer vorgegebenen

Säule. Somit hängen auch die Gesamtanalysenzeit und die erreichbare Auflösung stark von der

Säulentemperatur ab. Die Einstellung einer optimalen Temperatur für die Trennung mehrerer

Stoffpaare in verschiedenen Bereichen des Chromatogramms ist zumeist nicht möglich, was eine

Temperaturprogrammierung notwendig macht.

7.2.1.4 Trägergasströmung

Der Stofftransport und damit auch die Einstellung des Verteilungsgleichgewichtes zwischen

Analyt und stationärer Phase wird durch die Strömung des Trägergases in der Säule beeinflußt.

Hierbei stehen sich Gesamtanalysenzeit und Auflösungsvermögen gegenüber, denn große Flüsse

bewirken zwar einen schnellen Transport der Komponenten durch die Säule, aber auch eine

Verbreiterung der Peaks durch den langsamen Stoffaustausch zwischen stationärer und mobiler

Phase. Ziel der Strömungsoptimierung ist es, bei gegebenen Systemeigenschaften denjenigen

Trägergasfluß zu finden, bei dem in einem Minimum an zeitlichem Aufwand ein Maximum an

Effizienz erreicht werden kann. Je nach analytischer Problemstellung muß der Schwerpunkt

gelegt werden. Einen entsprechenden Zusammenhang zwischen der Trennleistung und der

Strömungsgeschwindigkeit sowie den verschiedenen auftretenden Diffussionsarten stellt die

Golay-Gleichung (Formel 7.1) [161,162] dar:

2

22

)1(24

)1161(2

kD

ukkr

u

DH

g

g

++++=

(Formel 7.1)

Abb. 7.1: Golay-Gleichung mit H: Trennstufenhöhe, Dg: Diffusionskoeffizient Analyt im

Trägergas, u: Durchschnittliche Trägergasgeschwindigkeit, r: Radius der Kapillartrennsäule,

k: Kapazitätsfaktor des Analyten



7.2.2.1 Trennsäulen

Es wurden einige Kapillartrennsäulen unterschiedlicher Polarität auf ihre Trenneffizienz

bezüglich des vorliegenden analytischen Problems untersucht. Jedoch nach dem Prinzip, daß sich

gleiches in gleichem am besten löst und es sich durchweg um relativ unpolare Verbindungen

handelt, wurden hauptsächlich folgende unpolare bis schwach polare Säulen verschiedener

Hersteller getestet:

Tab. 7.1: Getestete Säulen verschiedener Hersteller

Säule Hersteller Belegung Dimensionen Polarität

DB-XLB J & W Sientific88% Dimethyl-12% Diphenyl-

Polysiloxan

30m0,25mm0,25µm

schwach polar

DB-5-MS J & W Sientific95% Dimethyl-5% Diphenyl-

Polysiloxan

30m0,25mm0,25µm

unpolar

HT-8 SGE92% Dimethyl-8% Diphenyl-

Polysiloxan

25m0,25mm0,1µm

unpolar

HT-5 SGE95% Dimethyl-5% Diphenyl-

Polysiloxan

25m0,22mm0,1µm

unpolar

RTX-5 Restek95% Dimethyl-5% Diphenyl-

Polysiloxan

30m0,25mm0,25µm

unpolar

XTI-5 Restek95% Dimethyl-5% Diphenyl-

Polysiloxan

30m0,32mm0,25µm

unpolar

RTX-624 Restek94% Dimethyl-

6% Cyanopropyl-Polysiloxan

30m0,32mm1,8µm

polar


Bei den vergleichenden Untersuchungen konnten folgende Punkte festgestellt werden. Bezogen

auf die Polarität erfolgt die Trennung auf apolaren Säulen erheblich effizienter als auf der

polaren, während das Fassungsvermögen der stationären Phase proportional mit ihrer

Schichtdicke steigt. Die polare RTX-624 hatte neben der vergleichsweise schlechten

Trennleistung auch den weiteren Nachteil eines erheblich dickeren Films gegenüber den anderen,

was zur Folge hatte, daß diese Kapillartrennsäule ein hohes Rauschen im Massenspektrometer

erzeugte. Somit wurde das Erreichen einer möglichst niedrigen Bestimmungsgrenze verhindert.

Dieses konstante Bluten der stationären Phase hat üblicherweise auch eine schnelle und starke

Verunreinigung der Ionenquelle des Detektors, was die besonders blutungsarmen Säulen HT-5

und HT-8 mit ihrem sehr dünnen 0,1µm-Film für die Verwendung in einer GC-MS-Kopplung

auszeichnet. Zudem ist festzuhalten, daß eine Veränderung der anderen Säulendimensionen keine

bedeutende Rolle spielt. Einer geringere Säulenlänge oder des Innendurchmessers folgt aufgrund

kleinerer Trennstufenzahlen eine Beschleunigung der Analysenzeit, was aber nicht von

gravierender Bedeutung war. Die Grenze des Trägergas-Flusses bezüglich der maximalen

Belastbarkeit des Massenspektrometers liegt bei einem Ion-Trap-Tischgerät bei bis zu 3 mL/min,

was den einsetzbaren Säulendurchmesser bei linearer Flußgeschwindigkeit ungefähr 40cm/s auf

maximal 0,32mm limitiert.

Die besten Peakformen und Trennleistungen auch bei starker Matrixbelastung konnten mit der

schwach polaren, extrem blutungsarmen DB-XLB-Säule der Firma J & W Scientific erreicht

werden, welche bei allen weiteren Untersuchungen daraufhin verwendet wurde.

7.2.2.2 Injektionstechnik

In der Spurenanalyse werden im Hinblick auf möglichst niedrige Nachweisgrenzen größere

Volumina der Probenlösungen aufgegeben, um auch im Spurenbereich ausreichend große

Peakflächen zu erhalten. Dem entgegen stand im vorliegenden Fall die Auflösung der Peaks mit

kleinen Retentionszeiten (NNM, IPM); denn es kam bei diesen Mengen schnell zu Überladungen,

die meist mit schlechten Peakformen einhergingen. Also wurden bei der Bestimmung der

genauen Retentionszeiten der Komponenten für die Festlegung der jeweiligen

chromatographischen Fenster eine Lösung verwendet, in der größere Absolutmengen der

derivatisierten Komponenten vorlagen und 1µL dieser Lösung in einer split-Injektion

aufgegeben. Nur ein geringer Teil der Probenmenge kam durch ein entsprechend einzustellendes

split-Verhältnis auf die Säule, und somit konnten Überladungseffekte verhindert werden.


Die splitlose Injektion kann hingegen vorteilhaft auf verdünnte Proben angewendet werden,

wenn mit Temperaturprogrammierung gearbeitet wird. Durch das zeitlich befristete Verschließen

des Split-Ausgangs gelangt das größte Teil des Volumens auf die Säule, was eine starke

Vergrößerung der Peakflächen zur Folge hat. Bei Verschlußzeiten (splitless time), die größer als 1

Minute waren, konnte keine weitere Vergrößerung der Peakflächen festgestellt werden. Somit

wurde dieser Parameter auf 60 Sekunden festgesetzt. Um eine möglichst vollständige

Transferierung der Analyten in schmalen Banden zu erreichen, war es ebenso notwendig, die

Temperatur des Injektors zu Beginn der Analyse auf einer Temperatur unterhalb des

Lösungsmittelsiedepunktes (70°C) zu halten und dann in einer Rate von bis zu maximal 16°C/s

auf einen Endwert von 300°C aufzuheizen. Hierbei kam es dann zu einer zeitlich verzögerten

Verdampfung des Lösungsmittels auf der einen Seite und den Analyten auf der anderen Seite.

Unter diesen Bedingungen wurden die schwerer verdampfbaren Verbindungen von dem leicht

flüchtigen Lösungsmittel (EtOAc) abgetrennt. Des weiteren bestand hierbei der Vorteil,

möglicherweise thermisch labile Substanzen ohne Zersetzung auf die Säule zu transferieren.

Die dritte Möglichkeit, ein bestimmtes Probenvolumen aufgeben zu können, lag im Nutzen der

large volume-Option des Optic 200. Da es aber bei dieser Matrix zu erheblichen Störungen durch

Interferenzen kam, wurde von der Verwendung dieser Option Abstand genommen. Erste

Versuche mit nur 50µL Injektionsvolumen zeigten eine umgehende Verschmutzung der

gepackten Liner, was eine starke und in ihrem Umfang nicht zu reproduzierende Veränderung

der Retentionsdaten und Adsorptionseffekte der Analyten im Liner zur Folge hatte. Ein starkes

Ausheizen des Liners bis 350°C noch während der Analyse erbrachte keine Verbesserung. Die

vom Injektor erreichbaren höheren Temperaturen von bis 600°C konnten nicht in Anspruch

genommen werden, da sich das Packungsmaterial oberhalb von 350°C zersetzte.

7.2.2.3 Temperaturprogrammierung

Da bei der Entwicklung der einzelnen Methodenbestandteile jede Verbindung einzeln behandelt

wurde, war es in diesen Fällen nicht notwendig, einen Temperaturgradienten zu verwenden, der

es ermöglichte, alle untersuchten Analyten in einem Lauf basisliniengetrennt detektieren zu

können. In diesem Fall standen kurze Laufzeiten des Gaschromatographen im Vordergrund.

Hier wurde die Säulenanfangstemperatur so gewählt, daß sie für die Zeit, während der das

Splitventil geschlossen war, tiefer als der Lösungsmittelsiedepunkt lag. Da die Injektionslösungen

ausschließlich in EtOAc vorlagen, wurde diese Temperatur auf 70°C festgesetzt.


Das bewirkte den sogenannten „Lösungsmitteleffekt“, der durch das erneute Kondensieren des

Lösungsmittels dazu beiträgt, daß leichtflüchtige Komponenten der Probe noch besser fokussiert

werden. Das rekondensierte Lösungsmittel wirkt hierbei wie eine stationäre Phase und

vermindert durch Verdünnung derselbigen den Partialdruck der Spurenkomponenten.

Gleichzeitig kompensiert dieser Effekt die durch längere weil umfangreichere Transferierung

hervorgerufene Bandenverbreiterung in einem nicht geringen Maße. Nach den 60 Sekunden, in

denen das Splitventil geschlossen war, wurde nun ein Temperaturgradient von 30°C/min auf

300°C Endtemperatur gefahren, der die Abtrennung der untersuchten Komponenten von

interferierenden Bestandteilen möglich wurde. Unter diesen Umständen eluierten alle

Verbindungen im Bereich von 5-10 Minuten, wobei sich in einem kleineren

chromatographischen Fenster von 6-7,5 Minuten die Retentionszeiten von CP, IF, KIF, CIF und

CCP mit teilweise sich überlagernden Peaks befanden. Um diesem Problem zu begegnen, standen

zwei Möglichkeiten zur Verfügung. Auf der einen Seite wurde das Ofentemperaturprofil insoweit

verändert, daß bei einer Heizrate von nur noch 15°C/min eine weitere Trennung der Peaks

ermöglichte. Jedoch konnte es auch dann nicht verhindert werden, daß IF und sein Keto-

Metabolit koeluierten. Darüber hinaus ist es bei Verwendung der MS/MS-Technik durch

entsprechende Software-Steuerung (Xcalibur Version 1.2) möglich, ebendiese trotzdem bei

geschickter Wahl der Vorläuferionen und Einteilung in bestimmte Scanereignisse zu analysieren,

auch wenn sie gleichzeitig von der Säule eluieren.

Zusammenfassend können die verschiedenen verwendeten Temperaturprogramme wie folgt

angegeben werden:

Injektor: 70°C → ° sekC /16 300°C (Restlaufzeit)

Ofen (Methodenentwicklung): 70°C (60s) → ° min/30 C 300°C (5min)

Ofen (Realproben): 70°C (60s) → ° min/15 C 300°C (10min)

Unter den Bedigungen für das Vermessen der Realproben wird ein Chromatogramm, wie in

Abbildung 7.1 abgebildet, erhalten.


Abb. 7.1: Massenchromatogramme einer Standardlösung mit allen untersuchten Verbindungen und dem

internen Standard d4-Cyclophosphamid

7.2.2.4 Druckprogrammierung

Mit Helium 5.0 als Trägergas wurde das Minimum in der graphischen Auftragung der

Golay-Gleichung bei einer Trägergasgeschwindigkeit von 40cm/s gefunden. Bei der Verwendung

einer 30 Meter langen DB-XLB-Säule mit den oben angebenen Dimensionen konnte bei diesem

Wert ein Maximum an Trenneffizienz erreicht werden, wie bei [152] nachzulesen ist.

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time (min)

0

1000

1000

1000

1000

100%

0

1000

1000

100 Nor Nitrogen Mustard6,13

Ifosfamid Mustard9,68

Ifosfamid Cyclophosphamid12,19

12,94

4-Keto-Ifosfamid12,23

Carboxyifosfamid12,63

d4-Cyclophosphamid12,94

Carboxyphosphamid13,34

4-Keto-Cyclophosphamid13,80


7.3 Entwicklung der massenspektrometrischen Detektionsmethode

Die großen analytischen Vorteile der Ion-Trap-Technik entstehen durch die Möglichkeit, Ionen

über einen kurzen Entstehungszeitraum [ms] anzusammeln. Auf diese Weise kann ein

Ionenstrom aus einer Ionenquelle über die Sammlungszeit integriert werden und als „gebündeltes

Paket“ auf den Multiplier geschickt werden. Während der Speicherphase kann die Art der Ionen

(Full Scan, Single Ion Monitoring, positive/negative Ionen) oder Reaktionen mit den Ionen

(CID, MS/MS) kontrolliert werden. Folglich waren Optimierungen bezüglich der verschiedenen

Ionisierungsmethoden und massenspektrometrischen Ereignisse wie Speicher-, Dissoziations-

und Scanparameter erforderlich, um ein äußerst selektives Detektionsvermögen und somit eine

hohe Nachweisempfindlichkeit zu erreichen.

7.3.1 Optimierung der massenspektrometrischen Systemparameter

7.3.1.1 Ionisierung

Bei der in der Routine-Analytik am häufigsten eingesetzten Elektronenstoß-Ionisierung (EI)

kollidieren in der Ionenquelle des Massenspektrometers, der in den beiden verwendeten

Modellen (Thermo Quest „GCQ“, Thermo Finnigan „Automass“) über eine direkte Kopplung

mit dem Gaschromatographen verbunden ist, Elektronen mit relativ hoher Energie (meist 70eV)

mit den Analytmolekülen und bilden unter anderem positive Ionen. Die von den Elektronen

übertragene Energie übersteigt die Energie zur Entfernung des ersten Elektrons aus den meisten

organischen Verbindungen (10-15eV) um ein Vielfaches, womit das ionisierte Molekül zu

Schwingungen angeregt wird und nach bekannten Regeln stark zerfällt [163]. Das meist gut

erklärbare Fragmentierungsmuster, das sogenannte Massenspektrum, dient der

Substanzidentifizierung des Analyten.

Während die EI-Reaktion als ein direkter Energietransfer von den Elektronen zum

Analytmolekül verstanden wird, kann die Chemische Ionisierung (CI) als chemische Reaktion

gesehen werden. In einer in diesem Fall fast vollständig abgeschlossenen Reaktionskammer (ion

volume) liegt hierbei ein Reaktandgas in einem Überschuß vor und wird durch die mit bis zu

200eV beschleunigten Elektronen ionisiert, oder ein Moderatorgas dient als Medium zur Bildung

energieschwacher Elektronen.


Die Analytmoleküle reagieren mit den Reaktandgasionen oder den energieschwachen Elektronen

und zerfallen ebenfalls, jedoch je nach Wahl des Gases mehr oder weniger stark. Entsprechend

der Resultate der Reaktionsmöglichkeiten wird zwischen Positiver (PCI) und Negativer

Chemischer Ionsierung (NCI) unterschieden. Im allgemeinen ist der Energiebetrag, der bei der

CI auf das Analytmolekül übertragen wird, erheblich kleiner als bei der EI, was zu einer weitaus

geringeren Fragmentierung führt.

Die PCI wird bevorzugt dann eingesetzt, wenn das EI-Massenspektrum keine oder nur

unzureichende Information über die Molmasse des Analyten liefert. Das Meßergebnis, also der

Umfang der Fragmentierung, ist primär von der Wahl des Reaktandgases abhängig. Die Prozesse

der PCI werden mit dem Begriff der Protonenaffinität (PA) beschrieben. Die PA des ionisierten

Reaktandgases muß größer sein als die des Probemoleküls. Die auf den Analyten übertragene

Energiemenge ist somit abhängig von der Art des Gases. Methan ist als sehr „hartes“ PCI-Gas

weniger selektiv, während iso-Butan und Ammoniak typische „weiche“ PCI-Gase sind, die wenig

Energie zur Fragmentierung des Analytmoleküls beitragen.

Die gezielte Erzeugung negativer Ionen kann durch Anlagerung thermischer Ionen äußerst

geringer Energie (0-2eV), durch Ladungsaustausch oder durch Abstraktion azider Protonen

erfolgen. Die Bedeutung der NCI liegt in der Möglichkeit, die für diese Reaktion geeigneten

organischen Verbindungen im Ultraspurenbereich (je nach Substanz bis ppt-Bereich) selektiv

nachzuweisen. Die für die NCI geeigneten Analyten weisen hohe Elektronenaffinitäten (EA) auf,

wodurch es zum Beispiel bei Komponenten mit großer EA und der Verwendung von Methan als

CI-Gas zur oben erwähnten Anlagerung thermischer Elektronen kommt. Elektronen höherer

Energie (bis zu 15eV) bedingen eine dissoziative Reaktion, aus der Massenspektren resultieren,

die je nach Wahl des Gases eine mehr oder minder starke Fragmentierung des Molekülions

zeigen. Die Ionisierungseffizienz der Analyten kann verbessert werden, indem durch

Derivatisierung Gruppen mit elektronenziehenden Eigenschaften in das Molekül eingebaut

werden. Geeignet sind hierfür mehrfach halogenierte Verbindungen, solche mit Nitrogruppen,

Doppelbindungen und die allgemein Heteroatome in der Molekülstruktur aufweisen. Weitere

Betrachtungen der Chemischen Ionisierung und deren Reaktionsmechnismen sind einer großen

Anzahl von Literaturstellen zu entnehmen [164]

Für die Optimierung der Ionisierung wurden im allgemeinen Elektronenstoß-Ionisierung und

beide Formen der Chemischen Ioniserung gegenübergestellt. Hierfür wurde die Derivatisierung

der Verbindungen im Hinblick auf die Bestimmung ihrer Molmassen und die möglichst hohe

Empfindlichkeit bei der Ionisierung und Detektion durchgeführt.


Als Reaktandgase wurden Methan, Ammoniak, Helium, Stickstoff, Argon, Wasserstoff, Methanol

und Wasser auf ihre Fähigkeit getestet, die Analyten möglichst selektiv zu ionisieren und das

Untergrund-Rasuschen weitestgehend zu unterdrücken. Um die bei Normaldruck flüssigen

Reaktanden Wasser und Methanol verwenden zu können, wurde im Eigenbau ein gasdichtes

Behältnis, in das die Flüssigkeiten gegeben werden konnten, vor das CI-Gas-Ventil des

Massenspektrometers geschaltet. Wurde nun das Ventil geöffnet, so reichte der Dampfdruck aus,

um den notwendigen Druck in der Reaktionskammer zu erzeugen. Schließlich wurden der

Gasdruck in der Reaktionskammer, die Temperatur der Ionenquelle sowie die

Beschleunigungsenergie der Elektronen variiert.

7.3.1.2 Meßtechniken

Bei der Datenaufnahme des Massenspektrometers wird zwischen der Detektion der kompletten

Spektren (Full Scan), der Einzelmassen-Registrierung (Single Ion Monitorung, SIM) und der

Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) bei mehrstufigen oder Ion Trap-Geräten unterschieden.

Die kontinuierliche Aufnahme von Spektren im Full Scan-Modus ermöglicht bei gleichzeitiger

Erfassung der Retentionszeit eine Identifizierung der Analyten durch Interpretation der

entstandenen Spektren und Vergleich mit entsprechenden Bibliotheken. Bei Ionenstrahlgeräten

ist zu beachten, daß die Empfindlichkeit zur Erfassung des Spektrums von der Effizienz der

Ionenquelle, der Transmission durch den Analysator und ganz wesentlich von der Meßzeit der

Ionen abhängt. Die Meßzeit pro Masse ergibt sich aus dem untersuchten Massenbereich (z.B. 80-

400 amu) und der Abtastrate des Chromatogramms (z.B. 0,5s pro Scan). Hierdurch wurde ein

Abwägen zwischen spektrometrischem Inhalt und Länge des einzelnen Scans sowie ein Festlegen

des minimalen Massenbereichs für das Erfassen der Full Scan-Spektren der einzelnen

Verbindungen notwendig. Dies hat für die Strahlgeräte einen weitaus größeren Stellenwert als für

die Ion Trap-Geräte, da es bei letzteren zu einer parallelen statt zu einer nacheinanderfolgenden

Detektion der einzelnen Massen kommt.

Die Aufteilung der vorhandenen Scanzeit auf wenige Massen während einer Einzelmassen-

Registrierung ermöglicht eine durch höhere Abtastraten erreichbare präzisere Darstellung des

chromatographischen Peaks und einen Gewinn an Nachweisstärke. Jedoch geht jegliche

Information über die Struktur des Analyten verloren. Es mußte eine geeignete Wahl eines oder

mehrerer SIM-Ionen zum Erreichen einer empfindlichen und mit wenig Rauschen behafteten

Analyse getroffen werden.


Die Weiterentwicklung der Gerätetechnik hat im Laufe der letzten 15 Jahre die MS/MS-Analytik

zur Methode der Wahl zur Spurenbestimmung von Komponenten in einer komplexen Matrix

werden lassen. Als analytischer Hintergrund zur Nutzung der GC-MS/MS-Technik in der

Rückstandsanalytik ist der bekannte Zusammenhang zu sehen, daß das Signal/Rausch-Verhältnis

mit der Anzahl der analytischen Stufen zunimmt. Aufreinigungen verringern dabei aber auch die

potentielle Signalintensität. Die Aneinanderreihung von naßchemischen oder instrumentellen

Probenvorbereitungs-Schritten kann leicht dazu führen, daß in Folge von Aufarbeitungsverlusten

ein Substanzsignal unter die Detektierbarkeitsgrenze fällt. Aus dieser Überlegung heraus kann in

der GC-MS/MS bei der Anwendung von stark matrixbelasteten Extrakten die erste Trennstufe

als massenspezifischer „Clean up“ gewertet werden.

Im Ion Trap-Analysator wird in einem Elektronenstrahl-Puls zunächst das Probenspektrum

erzeugt. Die Selektion des Vorläufer-Ions, der stoßinduzierte Zerfall und die Analyse der

Tochter-Ionen werden durch eine zeitgesteuerte Sequenz erreicht. Durch eine "Scanfunktion"

wird der Analysator vom Rechner kontrolliert. Zusätzlich zur Wechselspannung (RF, radio

frequency) werden die Ringelektrode mit einem Gleichspannungsimpuls (DC, direct current) und die

Endkappen mit einem durchstimmbaren Frequenzgenerator (AC, alternating current) angesteuert.

Die Umlauffrequenz (Säkular-Frequenz) des Parent-Ions fehlt in diesem Spektrum und beläßt so

eine einzelne Massensorte in der Ion-Trap. Der stoßinduzierte Zerfall wird durch die gleiche

zusätzliche Wechselspannung an den Endkappen ausgelöst. Wenn die Frequenz der angelegten

Wechselspannung mit der Umlauf-Frequenz der ausgewählten Ionen identisch ist, können diese

durch Resonanz Energie aufnehmen. Die Bestimmung des Analyten erfolgt über das

charakteristische Massenspektrum von Tochterionen oder dessen Quantifizierung über

substanzspezifische Signale. Der Zeitaufwand dieser Vorgänge liegt im unteren ms-Bereich und

ist somit gut auch bei hohen Abtastraten für das GC einsetzbar. Neben der Abtrennung der

Matrix bleibt verglichen mit der SIM-Technik die spektroskopische Information

(Tochterspektrum) erhalten, so daß falsch-positive Befunde ausgeschlossen werden können.

Wie in der Abbildung 7.1 verbildlicht, kann diese Meßtechnik von mehrfachen Sektorfeld- und

Triplequadrupol-Geräten auch mit dem verwendeten Ionfallen-Massenspektrometer angewendet

werden. Hierbei war die Optimierung einer Vielzahl von Parametern erfoderlich.


Abb. 7.1: GC-MS/MS-Realisierungen [164]

Tandem-in-Space: Triple-Quadrupol-Technik

Tandem-in-Time: Ion Trap-Technik

Zu Anfang mußten Vorläufer-Ionen bestimmter m/z-Werte bestimmt werden, die in einem

möglichst großem Unfang im Totalionenaufkommen vorlagen, um aus dem im GC-Eluat

enthaltenen Ionengemisch von Analyten, Koelutionen, Matrix und Säulenbluten

Spurenkonzetrationen der Komponenten ermitteln zu können. Aufgrund der entstehenden

geringen Fragmentierung ist hierfür speziell die Verwendung weicher Ionsierungsmethoden

untersucht worden. Für eine optimale Speicherung und Dissoziation mit Hilfe in die Ion Trap

eingeleiteten Helium mußten weitere Parameter variiert werden. Die Ermittlung des Optimums

bezüglich der Ionen-Speicherzeit, der Dauer und Intensität der Anregungsspannung, die an den

Endkappen angelegt einen stoßinduzierten Zerfall der Vorläuferionen hervorruft, sowie des

Stabilitätsfaktors q wurde durch Veränderung der jeweiligen Werte für jede Substanz ermittelt.

Bei dem q-Wert handelt es sich um einen Ion Trap-spezifischen Faktor, der Einfluß auf die

Stabilitäten der Speicherung der zu untersuchenden Ionen hat. Mit der Veränderung der drei

Werte für q – 0.225, 0.300, 0.450 – besteht die Möglichkeit, Einfluß auf das Meßergebnis zu

nehmen. Je größer dieser Wert, desto instabiler darf das Vorläuferion sein. Jedoch wird dadurch

die Breite der m/z-Verhältnisse des Tochterspektrums kleiner. Alle Optimierungen zielen auf

eine maximale CID-Effizienz ab, worunter das Verhältnis des Totalionenaufkommen des

Tochterspektrums und der Vorläuferionenanzahl verstanden wird. Letztendlich war noch jeweils

ein Tochterion auszuwählen, das sich zum Quantifizieren eignete.



7.3.2.1 Ionisierung

Bei der Erzeugung positiver Ionen mittels Elektronenstoß-Ionisierung wurden bei allen

Verbindungen Full Scan-Spektren erzeugt, die eine geringe bis mäßig starke Fragmentierung

erzeugten, mit denen sie sich identifizieren ließen. Eine Erniedrigung der Elektronenenergie

erzeugte nur eine Verringerung des Totalionenaufkommens und nicht der Fragmentierung,

weswegen davon bei EI-Messungen abgesehen wurde. Generell kann bei allen CI-Gasen

festgestellt werden, daß die Temperatur der Ionenquelle einen Einfluß auf das Ionenaufkommen

hat. Temperaturen über 200°C gehen mit einer Zerstörung der wichtigen Cluster aus

Reaktandgasmolekülen bzw. der enstandenen Ionen einher, während unterhalb von 150°C die

Ionenquelle sehr schnell verschmutzt.

Für alle Verbindungen, die aus der wäßrigen Matrix extrahiert werden konnten, wurden ausgiebig

die Möglichkeiten der Chemischen Ionisierung untersucht. Ob die jeweiligen CI-Gase prinzipiell

für die Ionisierung der Substanzen anwendbar waren, zeigen die Ergebnistabellen 7.2 und 7.3:

Tab. 7.2: Ergebnistabelle der Eignungsuntersuchung für die Postive Chemische Ionisierung

PCI-Gas CH4 NH3 H2O

Substanz

CP + + +

IF + + +

KCP + + -

CCP + + NB

KIF + + +

CIF + + NB

NNM NB NB NB

IPM + + -


Tab. 7.3: Ergebnistabelle der Eignungsuntersuchung für die Negative Chemische Ionisierung

mit +: Generell möglich -: Nicht möglich NB: Nicht bestimmt

NCI-Gas CH4 NH3 H2O Ar He N2 H2 CH3OH

Substanz

CP + + + + + + + -

IF + + + + + + + -

KCP + + - - - - - NB

CCP + + NB NB NB NB NB NB

KIF + + + + + + + NB

CIF + - NB NB NB NB NB NB

NNM NB NB NB NB NB NB NB NB

IPM + + - NB - - NB NB

Die Untersuchungen haben gezeigt, daß sich die Verbindungen je nach Größe der Protonen-

respektive Elektronenaffinität der Moleküle sehr unterschiedlich stark durch die CI-Gase

ionisieren lassen.

Die bei der Positiven Chemischen Ionisierung verwendeten Gase Methan und Ammoniak waren

größtenteils in der Lage, die acht trifluoracetylierten bzw. methylierten Komponenten zu

ionisieren und eine Fragmentierung zu initiieren, die es ermöglichte, weitere Informationen über

den strukturellen Aufbau der Analyten und damit deren Identifizierung zu erhalten. Die

Ionisierung mittels Wasser erzeugte saubere Spektren mit einem aufgrund der hohen

Protonenaffinität erstaunlich hohen Fragmentierungsgrad; bei den beiden Metaboliten KCP und

IPM zeigte dies wiederum keinen Erfolg. Der Wasserdampf belastete aber in hohem Maße die

Filamente des Massenspektrometers, was auf Dauer einen Einbruch in der Stabilität des Gerätes

zur Folge hatte. Dies machte von vornherein eine dauerhafte Verwendung dieser Methode in der

Routine nicht praktikabel.

Eine optimale Vordruck-Einstellung des CI-Gases liegt je nach Gas zwischen 50 und 70 mTorr.

Ein zu niedriger Gasdruck reicht zur Ionenbildung nicht aus, während sich die Anwesenheit von

zuviel Reaktandgas in der Reaktionskammer in einem starken Anstieg der Basislinie zeigt.


Es war jedoch möglich, unter Verwendung der PCI Chromatogramme zu erhalten, die im Bezug

auf das Signal/Rausch-Verhältnis eine Alternative zur Elektronenstoßionisierung darstellten.

Diese Möglichkeit der Ionisierung wurde aber wegen mangelnder Stabilität der

Gerätekonfiguration im PCI-Modus nur dann angewendet, wenn bei der Bestimmung der

Verbindungen in Matrix Zweifel an der Identität der Komponenten bestanden.

Neben den bei der PCI benutzten Gasen kamen bei der Negativen Chemischen Ionisierung noch

des weiteren Stickstoff, Helium, Argon, Wasserstoff und Methanol zum Einsatz. Die Gründe für

die notwendige Erniedrigung der Temperatur der Ionenquelle entsprechen denen der Positiven

Chemischen Ionisierung. Auch hier sollte sie zwischen 150 und 200°C liegen. Der Gasvordruck

hingegen sollte bei der NCI mit 70-90 mTorr etwas höher liegen als bei den PCI-Messungen.

Bei der Untersuchung der unterschiedlichen Derivate (TFA, PFP, HFB) zeigte sich sehr schnell,

daß sich zwar bei der Derivatisierung mit steigender Fluoranzahl im Molekül durch das größere

Quantifizierungsion eine Verbesserung des S/N-Verhältnisses einstellte, jedoch konnte dies nicht

die anscheinend fehlende quantitative Umsetzung bei der Reaktion gegenüber den TFA-

Derivaten kompensieren, so daß sich die folgenden Ergebnisse auf ebendiese beziehen. Die

beiden Muttersubstanzen CP und IF ließen sich mit Ausnahme von Methanol von allen CI

negativ ionisieren. Jedoch kam es bei den CI-Gasen Ammoniak, Stickstoff und Argon zu teils

extrem starken Clusterbildungen, was sich in einer starken Reduzierung der Empfindlichkeit

zeigte, da eine scharfe Massentrennung in der Ion Trap nicht mehr möglich war. Bei CP mit

Wasser und bei IF mit Helium konnten hingegen sehr gute S/N-Verhältnisse bei geringer

Fragmentierung festgestellt werden. Aufgrund fehlender zusätzlicher Halogenatome im Molekül

ließ sich das lediglich methylierte KCP mit keinem der getesteten Gase negativ ionisieren. Das

Ifosfamid Analogon hingegen zeigte ein ähnliches Verhalten wie CP und IF. Mit allen

angewendeten CI-Gasen gelang die Ionisiserung, die auch hier bei Argon starke Clusterbildung

hervorrief. Das KIF-Spektrum zeigte bei Wasser-NCI fast ausschließlich das Isotopenpaar

307/309, wodurch ein hoher Responsegewinn einherging. Während beim Carboxyphosphamid

sowohl mit Methan als auch mit Ammoniak NCI-Spektren mit schwacher Fragmentierung

erzeugbar waren, konnten beim Carboxyifosfamid nur mittels Methan saubere Spektren

detektiert werden. Bei der Verwendung von Ammoniak zeigte sich eine sehr starke

Fragmentierung, die es verhinderte, daraus spektrale Informationen zu ziehen bzw. sie zur

Spurenanalytik einzusetzen. Auch das Ifosfamid Mustard ließ sich sowohl mit Methan als auch

mit Ammoniak, nicht jedoch mit den Inertgasen Stickstoff und Helium sowie mit Wasser

ionisieren. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß sich die Chemische Ionisierung in dem

vorliegenden Fall dazu eignet, weitere spektrale Informationen (vor allem die Molmassen) der

Verbindungen zu erhalten.


Jedoch konnte bis auf die Ionisierung von 4-Keto-Ifosfamid mit Wasser kein Responsegewinn

aus dem Einsatz der Negativen Chemischen Ionisierung im Vergleich mit den entsprechenden

EI-Messungen gezogen werden, wovon aufgrund starker Systembelastung durch das Wasser und

wegen der Vereinheitlichung der Methoden für alle untersuchten Verbindungen Abstand

genommen wurde.

7.3.2.2 Meßtechniken

Schon bei den ersten, für die MS/MS-Technik noch mit unoptimierten Parametern

unternommenen Versuchen zeigte sich die Überlegenheit der MS/MS-Technik gegenüber der

Full Scan- bzw. SIM-Methodik deutlich, wie hier in Abb. 7.10 am Beispiel einer Messung von

Cyclophosphamid und Ifosfamid in einer EtOAc-Standardlösung dargestellt ist. Während hier

das S/N-Verhältnis der Meßsignale im SIM-Lauf etwa doppelt so groß ist wie bei dem

Massenchromatogramm der entsprechenden Full Scan-Messung, verzehnfacht sich dieses

Verhältnis beim MS/MS-Chromatogramm.

Abb. 7.10: Vergleichende Massenchromatogramme eines Full Scan-, SIM- und MS/MS-Laufes (von

oben) für IF (tR: 7,02 min) und CP (tR: 7,51 min)

5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0Time (min)

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100RT: 7,02 RT: 7,50

RT: 7,02 RT: 7,51

RT: 7,02RT: 7,51

Full ScanS/N 3

SIMS/N 10

MS/MSS/N 50


Um eine möglichst selektive und sensitive Methodik zu erreichen, war es notwendig, für jede

Komponente verschiedene Vorläufer-Ionen der EI-Massenspektren auszuwählen und mit diesen

dann die Parameter Isolationszeit T, Dissoziationsspannung U, Dissozaitionszeit t und den Ion

Trap-spezifischen q-Wert sowie ein möglichst selektives Tochter-Ion zur Quantifizierung zu

ermitteln. Zur Bestimmung der geeignetsten Vorläufer-Ionen wurden Full Scan-Massenspektren

aufgenommen.

Die jeweiligen S/N-Verhältnisse wurden in den Massenchromatogrammen der einzelnen m/z-

Werten der Verbindungen ausgerechnet und miteinander verglichen. Hierbei wurden die

folgenden Ionen als Vorläufer für die Muttersubstanzen und deren Metaboliten ausgewählt:

Tab. 7.4: Ausgewählte Vorläufer-Ionen zur Entwicklung der MS/MS-Methoden

Substanz CP IF KCP KIF CCP CIF IPM NNM d4-CP

Vorläufer-Ion 307 307 239 335 317 324 187 188 311

Bei den Massenchromatogrammen zeigten sich hier bei Messungen aus Standardlösungen und

Realproben die geringsten Einflüsse des Untergrundes auf die Meßempfindlichkeit der

Methoden.

Im nächsten Schritt mußten geeignete Ionen aus dem Tochterspektrum ausgewählt werden, die

zur Auswertung der Meßergebnisse herangezogen werden konnten. Hierfür wurde analog zur

Auswahl der Vorläufer-Ionen verfahren, indem Standardlösungen mit den MS/MS-

Voreinstellungen im Massenspektrometer (T=8ms, t=15ms, U=1V, q=0,450) vermessen und die

S/N-Verhältnisse der entsprechenden Tochtermassen-Chromatogramme verglichen wurden. Die

folgenden sogenannten Qualifier-Ionen wurden ausgewählt:

Tab 7.5: Ausgewählte Qualifier-Ionen zur Entwicklung der MS/MS-Methoden


Qualifier-Ion 212 212 209 281 231 158 110 63 216


Bei CP, IF, KIF, IPM und NNM kam es fast aussschließlich zur Bildung der genannten Ionen,

während für die restlichen drei Verbindungen eine stärkere Fragmentierung der Vorläufer-Ionen

nicht zu verhindern war.

Den stärksten Einfluß auf die Ionenausbeute im Tochterionenspektrum hat die

Dissoziationsspannung U. Wird das Qualifier-Ion in Abhängigkeit von ebendieser

Potentialdifferenz betrachtet, so ist zu erkennen, daß die Vorläufer-Ionen für den erneuten

Zerfall Energie aufnehmen müssen, was sich in einem Anstieg des Ionenaufkommens des

Qualifiers zeigt. Nachdem ein Maximum durchlaufen worden ist, geht dieser Wert wieder zurück,

da auch das untersuchte Ion durch die Aufnahme weiterer Energie fragmentiert und somit für die

Auswertung verlorengeht.

Um auch den den Stabilitätsfaktor q in diese Untersuchungen mit einzubeziehen, wurde das

Aufkommen der jeweiligen Qualifier-Ionen in Abhängigkeit von der Dissoziationsspannung bei

den drei Werten für q bestimmt. Hierbei wurde ein interner Standard mit stets denselben

Parametern parallel vermessen, um durch die Verhältnisbildung der Peakflächen des Analyten

und des internen Standards mögliche Abweichungen durch die Injektion in den

Gaschromatographen zu kompensieren. Die Verläufe der Graphen sind in den Abbildungen 7.11

bis 7.13 dargestellt.

Abb. 7.11: Abhängigkeit des Qualifier-Ionen-Aufkommens von der Dissoziationsspannung bei q = 0,225

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

U in V

F(A

naly

t)/F(

IS)

CPIFKCPKIFCCPCIFIPMNNM




0,0010,0020,0030,0040,0050,0060,0070,0080,0090,00

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

U in V

F(A

naly

t)/F(

IS)

CPIFKCPKIFCCPCIFIPMNNM

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

U in V

F(A

naly

t)/F(

IS) CP

IFKCPKIFCCPIPM


Bei der Verwendung des q-Wertes 0,450 ist die obige Untersuchung von Carboxyifosfamid und

Nor Nitrogen Mustard nicht möglich, da die zu beobachtenden Tochterionen m/z-Verhältnisse

von 158 respektive 63 haben. Das kleinste unter diesen Bedingungen in der Ionenfalle

speicherbare Tochter-Ion hat den halben Wert des Vorläufer-Ions, der in diesem Fall 162 bzw.

94 betrüge. Um die Wirkung einer Änderung des Zeitraums, in dem die Vorläufer-Ionen angeregt

werden und zerfallen, und des Stabilitätsfaktors q zu veranschaulichen, ist in den Abbildungen

7.14 und 7.15 die Beeinflussung des Ionenaufkommens durch ebendiese Parameter dargestellt.

Die jeweils anderen Parameter haben die optimierten Werte.

Abb. 7.14: Abhängigkeit des Qualifier-Ionen-Aufkommens von der Dissoziationszeit t

Abb. 7.15: Abhängigkeit des Qualifier-Ionen-Aufkommens vom Stabilitätsfaktor q

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 5 10 15 20 25 30 35

t in ms

F(A

naly

t)/F(

IS)

CP

IF

KCP

KIF

CCP

CIF

IPM

NNM

0,4500,225 0,3000,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

q

F(A

nalyt

)/F(

IS)

CPIFKCPKIFCCPCIFNNMIPM


Aus den Verläufen dieser Kurven ist ersichtlich, daß die Anzahl der Ionen zumeist mit einem

Anstieg der Dissoziationszeit und mit geringeren q-Werten einhergeht. Daraus wird ersichtlich,

daß die entstehenden Vorläuferionen vergleichsweise stabil sind und eine längere Zerfalls- und

Speicherzeit nicht gleichbedeutend ist mit stärkerer Fragmentierung. Ausnahmen bilden hierbei

4-Keto-Ifosfamid mit einem maximalen Ionenvorkommen bei q=0,300/t=20ms und

Carboxyphosphamid bei q=0,225/t=20ms. Eine Zusammenfassung der Optimierungsversuche

wird in der Tabelle 7.6 dargestellt.

Tab. 7.6: Darstellung der optimierten Parameter


U/V 0,7 0,7 0,7 0,8 0,6 0,6 0,5 0,5 0,7

T/ms 30 30 30 20 20 30 30 30 30

q 0,225 0,225 0,225 0,300 0,225 0,225 0,225 0,225 0,225


7.3.3 Interpretation der Massenspektren

7.3.3.1 Cyclophosphamid

O NP

O

N

ClCl

CF3

O

356

212

307

- CH2Cl

O NP

O

N

Cl

CF3

O

O NP

O

N

Cl

CF3

O

O NP

O

N

Cl

CF3

O

N C CF3P

O

N

Cl

O

O

Abb. 7.16: Mögliches Zerfallsschema von Cyclophosphamid

Tab. 7.7: Weitere mögliche Fragmentierungen

m/z Spezifisches Ion Spektrum m/z Spezifisches Ion Spektrum

357 [M + H]+ PCI/NH3 271 [320 - CH2Cl]+ EI Full Scan

320 [M - HCl]+ EI Full Scan 176 [212 - HCl]+ EI MS3

285 [320 - Cl]+ EI Full Scan 150 [212 – H2C=CCl] EI MS3


10

01

502

002

503

003

50

m/z

0

20406080

10

0

EI F

ull

Sca

n

307

212

309

214

150

156

285

120

110

242

271

310

172

217

94

199

322

34

7

100

15

020

02

503

003

50

m/z

0

20

40

60

80

100

Wa

sser

PC

I F

ull

Sca

n

307

30

9

357

212

321

359

262

264

214

242

323

154

15

03

0617

21

863

553

6111

096

10

015

020

02

503

00

m/z

0

20406080

10

0

EI

MS

MS

30

7

212

199

156

176

307

213

308

266

300

245

151

273

100

15

020

02

503

003

50

m/z

0

20

40

60

80

100

Wa

sse

r N

CI F

ull S

can

28

4

320

28

3

28

53

223

5629

32

571

9217

42

822

562

993

573

2323

11

511

37

10

69

6

10

01

201

40

160

180

200

220

240

260

280

30

0

m/z

0

20406080

10

0

EI M

SM

SM

S 3

07

212

156

120

15

0

132

17

61

58 172

138

110

212

289

184

30

228

319

425

024

226

421

3

100

15

020

02

503

003

50

m/z

0

20

40

60

80

100

M

e

th

a

n

P

C

I F

u

ll S

ca

n

2

6

2

3

0

7

3

2

1

2

6

4

3

5

73

5

9

1

5

4

2

2

6

3

2

3

2

4

2

2

1

2

2

6

6

2

9

0

3

2

6

1

3

6

3

6

0

11

6

2

5

9

1

7

2

9

4

1

8

6

2

0

0

Abb. 7.17: Massenspektren von Cyclophosphamid


7.3.3.2 Ifosfamid

O NP

O

N

Cl

356

212

307

- CH2Cl

O NP

O

N

Cl

O

O NP

O

N

Cl

CF3

O

N C CF3P

O

N

Cl

O

O

Cl

CF3

O

O NP

O

N

ClCF3

O

CF3

Abb. 7.18: Mögliches Zerfallsschema von Ifosfamid



357 [M + H]+ PCI/H2O 284 [320 - HCl]- NCI/CH4

320 [M - HCl]- NCI/CH4NCI/He 184 [212 - H2C=CH2]+ EI MS3

293 [M - CH2CH2Cl]- NCI/CH4 150 [212 - H2C=CCl] EI MS3


100

150

20

025

030

0

m/z

0

20

40

60

80

100

EI

Fu

ll S

can

21

2

150

307

21

430

91

54

132

22

61

8224

21

84

321

106

122

15

68

227

9

100

15

020

025

030

0

m/z

0

20

40

60

80

100

Me

than

NC

I F

ull

Sca

n

293

284

320

295

32

23

072

43

257

283

18

71

61

198

24

2

100

150

200

250

300

m/z

0

20

40

60

80

100

EI

MS

MS

307

21

2

279

100

150

200

25

030

0

m/z

0

20

40

60

80

100

Hel

ium

NC

I F

ull S

can

294

320

295

285

322

283

19

42

962

43

100

15

02

00

250

300

m/z

0

20

40

60

80

100

EI

MS

MS

MS

30

7 21

2

15

0

134

18

41

56

106

100

150

20

02

503

003

50

m/z

0

20

40

60

80

100

��

��

��

��

��

��

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��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

Abb. 7.19: Massenspektren von Ifosfamid



O NP

O

N

ClCl

CH3

288

239

- CH2Cl

O NP

O

N

CH2Cl

CH3

O

O

209- 2*CH3

Abb. 7.20: Mögliches Zerfallsschema von 4-Keto-Cyclophosphamid



307 [M + H + H2O] PCI/NH3 253 [M + H - HCl]+ PCI/CH4

289 [M + H]+ PCI/CH4 240 [M + H - H2CCl]+ PCI/NH3

257 [239 + NH4]+ PCI/NH3 216 [M - HCl - HCl]- NCI/NH3


809

010

011

01

20

130

140

150

16

017

018

019

02

00

210

220

230

240

250

m/z

0

20406080

10

0

EI

Fu

ll S

can

239 2

41

209

15

68

41

481

82

211

18

515

817

424

29

212

81

202

081

491

88

94

203

115

106

16

213

82

371

68

132

248

220

142

90

197

98

10

923

22

182

29

801

001

20

140

160

180

200

220

240

m/z

0

20406080

10

0

EI

MS

MS

23

9

209

156

185

174

186

159

146

12

01

8284

208

128

200

169

138

92

148

10

611

62

192

3922

8

15

02

0025

030

0

m/z

0

20

40

60

80

100

Am

mon

iak

PC

I Ful

l Sca

n

307 30

9

290

292

240

25

431

12

57

274

242

318

168

106

195

138

176

239

204

12

315

3

10

01

50

20

02

50

300

m/z

0

20406080

10

0

Met

han

PC

I Fu

ll S

can

289

291

253

239

255

29

330

63

19

174

25

611

686

199

106

235

222

287

140

160

10

015

020

025

030

0

m/z

0

20

40

60

80

100

Am

mo

nia

k N

CI F

ull

Sca

n

215 21

6

21

31

9418

828

625

824

81

36

160

305

238

117

326

268

113

187

98

Abb. 7.21: Massenspektren von 4-Keto-Cyclophosphamid


7.3.3.4 4-Keto-Ifosfamid

O NP

O

N

Cl

370

335

- Cl

Cl

CF3

O

O NP

O

N

ClCF3

O

O

O NP

O

N

ClCF3

O

321

N

ClCF3

O

175

O NP

O-

- CH2Cl

Abb. 7.22: Mögliches Zerfallsschema von 4-Keto-Ifosfamid



371 [M + H]+ PCI/H2O 307 [M - CH2CH2Cl]+ NCI/CH4

335 [M - Cl]+ EI Full Scan 240 [M - Cl - NCCF3]+ EI MSMS

321 [M - CH2Cl]+ EI Full Scan 175 [N(CH2CH2Cl)COCF3]+ EI MSMS


10

015

020

025

030

035

0

m/z

0

20406080

10

0

EI

Fu

ll S

can

33

5

24

02

81

187

321

337

122

18

418

92

422

83

152

96

299

255

158

148

201

239

98

33

8

100

15

020

025

03

0035

0

m/z

0

20406080

100

Me

tha

n N

CI

Fu

ll S

can

30

7 309

212

212

100

150

200

250

300

m/z

0

20406080

10

0

EI

MS

MS

335

281

24

017

525

529

13

091

6118

42

63

160

23

72

01

116

22

9

100

150

20

02

503

003

50

m/z

0

20406080

100

Was

ser

PC

I Ful

l Sca

n

335

240

321

337

17

83

71

214

242

28

13

7315

814

818

72

3929

912

23

70

244

201

273

237

99

100

150

200

250

300

m/z

0

20406080

10

0

EI M

SM

SM

S 3

35

281

237

20

1

175

127

139

18

92

55

100

15

020

025

03

0035

0

m/z

0

2

0

4

0

6

0

8

0

1

0

0

W

a

sse

r N

C

I F

u

ll S

ca

n

3

0

73

0

9

2

1

2

2

7

1

Abb. 7.23: Massenspektren von 4-Keto-Ifosfamid


7.3.3.5 Carboxyphosphamid

O OP

O

NHN

CF3

O

O OP

O

N

CF3

O

N

Cl

O OP

O

N

CF3

O

N

- HCl

- CH2Cl

317

366

402

H2CO

P

O

N

CF3

O

N

259

OP

O

N

CF3

O

N

231

OP

O

N

CF3

O

N

245

- HCl

O OP

O

N

CF3

O

N

330

O

O- CH

O

O

CH-

O

O-

Cl

Cl

O

O

O

O

Abb. 7.24: Mögliches Zerfallsschema von Carboxyphosphamid



384 [M - H2O]+ PCI/NH3 367 [M + H - HCl]+ PCI/CH4


8010

01

201

40

16

018

020

02

202

4026

028

030

03

20

m/z

0

20406080

10

0

EI F

ull

Sca

n

15

1

231

317

25

92

45

285

263

218

202

24

41

52

10

82

991

39

169

160

87

183

100

150

20

02

5030

0

m/z

0

20406080

10

0

EI

MS

MS

31

7

151

231

24

5

263

285

169

10

01

502

00

250

300

350

400

m/z

0

20406080

100

Me

than

PC

I F

ull

Sca

n

281

298

352

367

335

300

201

369

245

259

87

151

18

62

31

384

100

150

20

02

5030

0

m/z

0

20406080

10

0

EI

MS

MS

MS

317

231

20

2

139

151

169

183

129

21

91

0898

10

01

502

00

250

300

350

400

m/z

0

20406080

100

A

m

m

o

n

ia

k P

C

I F

u

ll S

ca

n

3

8

4

2

9

8

3

8

6

3

5

2

3

5

1

3

0

0

3

5

4

1

5

1

2

7

6

2

6

2

2

4

8

Abb. 7.25: Massenspektren von Carboxyphosphamid


7.3.3.6 Carboxyifosfamid

O OP

O

NNH

402

Cl

Cl

CF3

O

O

324

-

238

O OP

O

N

ClCF3

O

O

OCH

HOP

O

N

Cl

CF3

O

O

- 176

P

N

CF3

O

HO OH

- H2O

P

N

CF3

O

O

158

HN

Cl

-

Cl

Abb. 7.26: Mögliches Zerfallsschema von Carboxyifosfamid


m/z Spezifisches Ion Spektrum

404 [M – CH3Cl +(NH3)2*NH4]+ PCI/NH3


100

15

020

02

5030

03

504

00

45

050

05

5060

06

5070

0

m/z

0

20406080

10

0

EI F

ull

Sca

n

169

174 178

324

8719

11

60

112

92

326

228

283

192

140

126

230

273

309

284

37

22

2434

93

83

459

42

64

91

41

84

4056

053

64

695

785

956

70

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

m/z

0

20406080

10

0

EI

MS

MS

32

4

176

238

325

326

22

61

611

3927

92

8229

52

02

24

62

702

621

06

300

318

218

188

306

25

211

612

911

715

22

29

20

01

381

741

77

801

00

120

14

016

018

020

02

202

402

602

803

00

32

03

40

360

380

400

420

440

460

480

500

m/z

0

20406080

10

0

Am

mo

niak

PC

I F

ull

Sca

n

40

4 40

6

862

77

318

9240

737

233

93

00

352

265

18

320

33

8422

924

59

42

90

402

219

140

420

127

165

112

443

157

485

45

04

684

98

Abb. 7.27: Massenspektren von Carboxyifosfamid



OP

O

NNH

Cl

Cl

CF3

O

330

OP

O

NNH

ClCF3

O

281

- CH2Cl - HCl

OP

O

N

CF3

O

N

Cl

293

Abb. 7.28: Mögliches Zerfallsschema von Ifosfamid Mustard



331 [M + H]+ PCI/CH4 295 [M + H - HCl]+ PCI/CH4


100

150

200

250

300

m/z

020406080100

EI F

ull

Sca

n

187 18

92

81

120

293

200

156

94

124

186

201

295

110

165

96

216

151

5060

708

090

100

110

m/z

020406080

100

EI

MS

MS

MS

187

110

110

69

60

8010

01

2014

016

018

0

m/z

020406080100

EI

MS

MS

187

110

158

100

150

20

025

030

035

0

m/z

020406080

100

Met

han

PC

I F

ull S

can

331

156

295

174

176

333

158

201

330

811

872

3717

314

01

2211

133

531

228

02

32

243

214

922

52

Abb. 7.29: Massenspektren von Ifosfamid Mustard


7.3.3.8 Nor Nitrogen Mustard

N

Cl

Cl

F3C

O

237

N

Cl

CH2

F3C

O

188

- CH2Cl - Cl

N

Cl

CH2

F3C

O

202

N

CH2

F3C

HO

126

Cl-

NH

Cl

F3C

O

63

-

Abb. 7.30: Mögliches Zerfallsschema von Cyclophosphamid


6080

10

01

20

14

01

60

18

02

00

22

02

40

m/z

020406080100

EI F

ull S

can

18

8

63

190

69

20

21

26

20

17

820

45

65

11

66

70

237

127

170

909

620

51

06

111

14

28

41

83

14

81

33

15

82

17

118

229

199

60

801

00

120

14

01

601

80

200

220

24

0

m/z

020406080100

EI

MS

MS

18

8

63

12

65

618

87

811

015

21

236

91

44

17

71

06

88

96

51

127

Abb. 7.31: Massenspektren von Nor Nitrogen Mustard

8 Validierung der entwickelten Methoden 122

8 Validierung der entwickelten Methoden

Im Zuge von GLP (Gute Labor Praxis) und Qualitätssicherung beschäftigt sich dieses Kapitel

mit der Validierung der Methoden und der erhaltenen Analysenergebnisse. Nach Bosshardt und

Schorderet wird unter der Validierung die Gesamtheit aller sich über Planung, Ausführung und

Dokumentation erstreckenden Maßnahmen, die die Gültigkeit einer analytischen Methode

beweisen, verstanden [165].

Das System der Analytischen Qualitätssicherung (AQS) schreibt neben einer Vorbereitungsphase,

die sich unter anderem mit der Auswahl geeigneter Untersuchungsverfahren und der

Bestimmung interner Verfahrenskenndaten beschäftigt, eine interne und externe

Qualitätssicherung vor. Abschließend ist eine Auswertung und Dokumentation des

Untersuchungsvorhabens vorzunehmen. Im folgenden werden die im speziellen auf die GC-MS-

Untersuchungen bezogenen Ergebnisse vorgestellt.

8.1 Interne Qualitätssicherung

Zur internen Qualitätssicherung gehören im Bezug auf Untersuchungsvorhaben mit GC-MS-

Komponenten in erster Linie gerätespezifische Kontrollen. Um reproduzierbare

Analysenergebnisse zu erhalten, war es notwendig, mindestens einmal pro Woche oder bei

Veränderungen am System (Reinigung mit damit verbundenem vollständigen Verlust von

Vakuum, Trennsäulen-, Ion volume-Wechsel u.a.) das Massenspektrometer zu tunen, also die

zum optimalen Speichern und Detektieren der Ionen notwendigen Spannungen der Elektronen-

Linsen und der Ionenfalle einzustellen, den sogenannten Tune-Report auszudrucken und in

einem Journal für Qualitätssicherung abzuheften. Eine darauffolgende Überprüfung der

Retentionszeiten bedingte das wiederholte Injizieren entsprechender Standardlösungen.

Um die Nachweisstärke des Massenspektrometers und damit auch die Ergebnisse der Analysen

vergleichbar zu machen, wurde in regelmäßigen Abständen eine Spezifikationslösung mit 100pg

Decafluorbenzophenon vermessen und das entsprechende Signal/Rausch-Verhältnis mit einem

in der Gerätesoftware vorhandenen Algorithmus berechnet. Laut Gerätehersteller muß dieser

Parameter mindestens einen Wert von 250 haben. Es wurden in der Praxis jedoch auch noch

Verhältnisse von 100 akzeptiert.


Eine weitergehende und in den Richtlinien für eine interne Qualitätssicherung vorgeschlagene

Überprüfung durch das Vermessen methanolischer Lösungen der Analyten konnte mangels

ensprechender zertifizierter Standards nicht durchgeführt werden.

In den folgenden Abschnitten werden nun die weiteren substanzbezogenen Punkte der internen

Qualitätssicherung wie Kalibrierung der Methoden, Wiederfindungsraten sowie

Standardabweichungen dargestellt. Hierfür wurde Oberflächenwasser, das in Stichproben aus vier

verschiedenen Teichen auf dem Gelände der Ruhr-Universität Bochum, aus dem Kemnader

Staussee sowie der Ruhr gezogen wurde, verwendet. Die aus dem Freiland stammenden Proben

unterlagen naturgemäß jahreszeitlichen und witterungsbedingten Schwankungen im Aufkommen

von Matrixbelastungen.

8.1.1 Kalibrierung

Aus Meßsignalen werden analytische Informationen, in der Regel Massen- bzw.

Konzentrationsdaten erhalten. Die Abhängigkeit eines Meßsignals von der Konzentration eines

Analyten wird als Analysenfunktion bezeichnet und experimentell auf dem Wege der

Kalibrierung bestimmt. Im Falle linearer Abhängigkeit der Signale vom Analysenwert stellt die

Steigung der Kalibriergeraden die Empfindlichkeit des Verfahrens dar.

Bei der Präparation der Lösungen zur Kalibrierung wurden jeweils 500mL Oberflächenwasser in

einem Vorratsbehältnis vorgelegt, mit Pufferlösung auf die entsprechenden pH-Werte eingestellt

und mit internem Standard im zu erwartenden Konzentrationsbereich des Analyten versetzt. Bis

auf die Bestimmung der Validierungsdaten von Nor Nitrogen Mustard, bei dem Ifosfamid

Mustard zum Einsatz kam, wurden alle Untersuchungen bezüglich der Validierungsdaten mit

dem isotopenmarkierten Cyclophosphamid (d4-Cyclophosphamid, d4-CP) durchgeführt. Um die

oben erwähnten Inhomogenitäten in Material und Proben sowie Abweichungen im Gerätesystem

zu kompensieren, wurden diese Untersuchungen mit einem internen Standard vorgenommen.

Diese auch Surrogat-Standard genannte Substanz wurde schon der Originalprobe hinzugegeben,

um die Effektivität einzelner Aufarbeitungsschritte überprüfen zu können. Diese Verbindung

darf naturgemäß nicht im Untersuchungsmaterial enthalten sein und sollte sich grundsätzlich

chromatographisch und chemisch ähnlich wie die zu untersuchenden Komponenten verhalten.


Von der Verwendung eines externen Standards wurde deshalb abgesehen, weil hierbei schon

geringe Veränderungen bei der Injektion und im Massenspektrometer erhebliche Auswirkungen

auf das Ergebnis haben.

Generell wurden bei allen quantitativen Untersuchungen nach dem Vermessen der Lösungen die

Konzentrationen der Analyten mit dem Peakflächenverhältnis F(Analyt) zu F(IS) in Relation

gesetzt. Das Höhenverhältnis der Peaks kann nur bei Peaks mit nahezu Gaußschen Konturen

[166] zum Einsatz kommen, da diese dann annähernd gleiche Halbwertsbreiten haben. Kommt

es bei einem der Peaks zu Tailing bzw. Fronting oder eluieren die Peaks mit stark

unterschiedlichen Retentionszeiten, so ist es notwendig, die Kalibrierung über die Flächen

unterhalb der jeweiligen Peaks vorzunehmen.

8.1.2 Wiederfindungsrate

Zur quantitativen Charakterisierung eines Anreicherungsverfahrens soll im Rahmen der internen

Qualitätssicherung stets eine sogenannte Wiederfindungsrate angegeben werden, worunter das

Verhältnis der Konzentrationen nach und vor der Anreicherung verstanden wird, das über einen

möglichst großen Bereich konzentrationsunabhängig sein sollte.

Die wäßrigen und gepufferten Proben wurden vor der Anreicherung mit dem gewünschten

Volumen eines oder mehrerer Zytostatika versetzt und die Analyten mit den optimierten

Parametern der Probenvorbereitung aus der Vorlage extrahiert und anschließend analysiert. Zur

Bestimmung der Wiederfindungsrate wurde parallel die gleiche Absolutmenge an Analyt in einer

EtOAc-Lösung geringen Volumens ohne Anreicherung derivatisiert und mit der GC-MS

vermessen.

Um auch hier Fehler durch das System auszuschließen, aber auch um die Verluste durch die

Anreicherung bestimmen zu können, wurden nach der Extraktion entsprechende Mengen an

dem in der Probenmatrix nicht vorhandenen Standard d4-Cyclophosphamid respektive Ifosfamid

Mustard zur organischen Phase gegeben. Zur Auswertung wurden nach der Messung die

Verhätnisse der jeweiligen Chromatogramm-Flächen der Zytostatika und des Standards gebildet

(Formel 8.1). Die Quantifizierung der Wiederfindungsrate erfolgte anschließend über den

Vergleich ebendieser Verhältnisse von Probe und Standard.


Es gilt:

%100)()(

)()(

Prtan

tanPr ∗∗

∗=ISFAnalytF

ISFAnalytFWFR

obedardS

dardSobe (Formel 8.1)

mit FProbe(Analyt, IS): Chromatogrammfläche der Probenlösung

FProbe(Analyt, IS): Chromatogrammfläche der Standardlösung

8.1.3 Standardabweichung

Die Standardabweichung S ist ein Maß für die Größe des Zufallsfehlers in einer Meßreihe [167]

und kann somit als Anhaltspunkt für die erreichte Präzision dienen. Für das Gesamtverfahren

wurde sie stets mit sechs verschiedenen Proben gleicher Konzentration bestimmt.

Es gilt nach [168]:

S nx xi m

i

n

=−

−−∑1

12

1

( ) (Formel 8.2)

mit S: Standardabweichung

xi - xm: Absolute Abweichung der Einzelwerte vom Mittelwert

n: Anzahl der Meßwerte

Für die Ermittlung der Standardabweichungen der Zytostatika und ihrer Metabolite wurden

wiederum 500mL Oberflächenwasser vorgelegt, gepuffert, mit internem Standard (Surrogat-

Standard) versetzt und anschließend mit dem in den Kapiteln 7 und 8 beschriebenen optimierten

Verfahren analysiert. Die Berechnung der Zahlenwerte der Standardabweichung erfolgte durch

Bildung des Verhältnisses der Chromatogramm-Flächen der Analyten und des internen Standards

und dem abschließenden Einsetzen der ermittelten Daten in die obige Gleichung.


8.1.4 Bestimmungsgrenze

Der kleinste, mit ausreichend statistischer Sicherheit erfaßbare Meßwert hängt von der

Empfindlichkeit des Verfahrens, das heißt von der Steigung der Kalibriergeraden, vom Blindwert

und von dessen Streuung ab. Es wird festgelegt, daß die Entscheidungsgrenze so zu ziehen ist,

daß das kleinste von der Substanz detektierbare Signal deutlich von einem Blindwert

unterschieden werden kann. Um falsch-positive Aussagen der Analysen zu vermeiden, wurden

bei jeder Kalibrierung und Quantifizierung diese substanzfreien Proben mit verarbeitet. Vor

allem im Bereich der Bestimmungs- oder Nachweisgrenzen erschien dies indiziert, da schon eine

geringe Verschleppung aus vorangegangenen Analysen einen falschen Befund erbringen kann.

Eine Substanz gilt als detektiert, wenn das Substanzsignal ein bestimmtes Vielfaches der

Rauschbreite übersteigt. Dieser Wert für die Nachweisgrenze wurde hier willkürlich auf 3

angesetzt und wird stets in der Substanzdomäne (ng/L oder µg/L) angegeben.

Bei der Bestimmungsgrenze handelt es sich ebenfalls um eine Substanzmenge oder

Konzentration in der Substanzdomäne. Sie ist im Gegensatz zur Nachweisgrenze statistisch

abgesichert und gibt die untere Grenzkonzentration an, die eindeutig quantitativ erfaßt werden

kann und sich signifikant vom Blindwert unterscheidet. Übertragen auf das Signal/Rausch-

Verhältnis wurde dies mit einem Wert von 10 festgelegt.

8.1.5 Ergebnisse

Im folgenden werden die Ergebnisse der einzelnen Bestandteile der internen Qualitätssicherung

jeweils für eine Substanz zusammenfassend tabellarisch aufgeführt. Die Vertrauensbereiche der

Kalibrierfunktion sind mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit α von 0,05 - also 5% - bestimmt

worden.


8.1.5.1 Cyclophosphamid

Abb. 8.1: Kalibrierfunktion von Cyclophosphamid in Oberflächenwasser

Kalibrierpunkte: 1, 25, 50, 100ng/L

y-Achsenabschnitt a: 0,025

Konfidenzbereich für a: 0,308

Steigung b: 0,039

Konfidenzbereich für b: 0,005

Korrelationskoeffizient r: 0,999

Wiederfindungsrate (100 ng/L): 94,7 % (d4-CP: 93,0 %)

Standardabweichung (100 ng/L): 10,7 % (d4-CP: 6,7 %)

Bestimmungsgrenze: 1 ng/L

Nachweisgrenze: 500 pg/L


8.1.5.2 Ifosfamid

Abb. 8.2: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Ifosfamid in Oberflächenwasser

Kalibrierpunkte: 1, 25, 50, 100ng/L



Steigung b: 0,008



Wiederfindungsrate (100 ng/L): 111,3 %

Standardabweichung (100 ng/L): 17,1 %


Nachweisgrenze: 1 ng/L



Abb. 8.3: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von 4-Keto-Cyclophosphamid in Oberflächenwasser

Kalibrierpunkte: 1, 25, 50, 100 µg/L



Steigung b: 0,751



Wiederfindungsrate (10 µg/L): 77,6 %

Standardabweichung (10 µg/L): 12,5 %

Bestimmungsgrenze: 5 µg/L

Nachweisgrenze: 1 µg/L


8.1.5.4 4-Keto-Ifosfamid

Abb. 8.4: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von 4-Keto-Ifosfamid in Oberflächenwasser


y-Achsenabschnitt a: -1,480


Steigung b: 0,342








8.1.5.5 Carboxyphosphamid

Abb. 8.5: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Carboxyphosphamid in Oberflächenwasser




Steigung b: 0,018








8.1.5.6 Carboxyifosfamid

Abb. 8.6: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Carboxyifosfamid in Oberflächenwasser




Steigung b: 0,129









Abb. 8.7: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Ifosfamid Mustard in Oberflächenwasser




Steigung b: 0,002








8.1.5.8 Nor Nitrogen Mustard

Abb. 8.8: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Nor Nitrogen Mustard in Oberflächenwasser

Kalibrierpunkte: 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100 µg/L



Steigung b: 0,056








8.2 Externe Qualitätssicherung

Eine Möglichkeit zur Überprüfung und Absicherung der entwickelten Anreicherungs- und

Bestimmungsverfahren sowie der Vergleichbarkeit der Analysenergebnisse bietet die

Durchführung von Ringversuchen. Es handelt sich hierbei um ein Experiment, bei dem mehrere

Laboratorien ein identisches Material auf die gleiche Meßgröße hin untersuchen und die Resultate

vergleichend beurteilen. Ringversuche dienen dazu, die Qualität von Analysenmethoden oder

Laboratorien zu beurteilen und sind somit ein wichtiger Bestandteil der externen

Qualitätssicherung. Sie unterscheiden sich im Hinblick auf die Zielsetzung sowie die Art und

Weise der Teilnahme und der Teilnehmer. So können Ringversuche zum Ziel haben, Verfahren

zu standardisieren oder der Laborüberwachung zu dienen. Der Kreis der Laboratorien kann

national begrenzt sein, oder aber der Ringversuch kann auf internaltionaler Ebene stattfinden

[169-171]

In den beiden vorliegenden Fällen, an denen der Autor zwecks Überprüfung der

Leistungsfähigkeit der entwickelten Methoden teilgenommen hat, handelte es sich um

Ringversuche, die durchgeführt wurden, um sowohl eine geeignete Gerätekonfiguration für die

Bestimmung von Cyclophosphamid und Ifosfamid in physiologischen und Umweltmatrices zu

eruieren als auch eine Auswahl der teilnehmenden Laboratorien für entsprechende Monitoring-

Untersuchungsvorhaben zu treffen.

8.2.1 Ringversuch – Urin

Dieser vom Institut und der Poliklinik für Arbeits- und Umweltmedizin der Ludwig-Maximilians-

Universität München durchgeführte Ringversuch fand im Rahmen eines dortigen

Untersuchungsvorhabens mit dem Titel „Untersuchung einer möglichen Gesundheitsgefährdung

durch berufliche Exposition gegenüber Zytostatika“, das u.a. vom Bundesministerium für

Bildung, Wissenschaft, Forschung und Technologie gefördert wurde, statt. Ziel dieser Studie war

die quantitative Erfassung einer Gesundheitsgefährdung von Mitarbeitern in der zentralen

Zytostatikazubereitung von Apotheken und vom Pflegepersonal auf onkologischen Stationen.

Zur Quantifizierung der Exposition wurde bei 100 Probanden mehrfach ein Biomonitoring

durch fraktionierte Sammlung der jeweiligen 24-Stunden-Urine durchgeführt.


Im Zuge der Validierung der Methoden wurde ein Ringversuch mit fünf Teilnehmern aus drei

europäischen Ländern (Frankreich, Niederlande, Deutschland) durchgeführt. Die Extraktion

einer Cyclophosphamid-Konzentration von 1µg/L Urin mittels Flüssig/Flüssig-Extraktion und

die analytische Bestimmung durch eine GC-MS-Kopplung wurde vorgeschrieben. Die

zugesandten zwei Urin-Proben und eine entsprechende Kalibrierung (Abb.8.8, r=0,993) mit

dotiertem, vorher auf den Blindwert getesteten Eigenurin im angegebenen

Konzentrationsbereich wurden wie folgt analysiert:

Es wurden 500µL der Urinprobe in einem 2,0mL-Safe-Lock-Präparateglas vorgelegt, mit

ebenfalls 0,5mL einer auf pH 4 eingestellten Pufferlösung (0,01M KH2PO4/P4O10) versetzt und

eine Minute mit dem Vortex-Mixer geschüttelt. Die sich daran anschließende dreimalige

Extraktion erfolgte mit jeweils 0,5mL Ethylacetat. Nach fünf Minuten Schütteln und

zehnminütiger Zentrifugation bei 13.000 Umin-1 wurde die obere organische Phase mit einer

Pipette abgetrennt. Diese Extraktion wurde zweimal wiederholt. Die vereinigten EtOAc-Phasen

wurden mit Hilfe der Gasbrücke in einem Inertgasstrom (Argon oder Stickstoff) bis zur Trockne

eingeengt. Der Rückstand wurde mit 100µL EtOAc aufgenommen und mit der gleichen Menge

an Trifluoressigsäureanhydrid versetzt. Die einstündige Derivatisierung erfolgte bei 70°C im

Thermoschüttler. Nach dem erneuten Abblasen der überschüssigen Lösungsmittel wurde 1µL

dieser Lösung injiziert und in einem SIM-Lauf mit dem GCQ-Massenspektrometer analysiert.

Abb. 8.8: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Cyclophosphamid in Urin


Die Proben wurden dreimal auf die gleiche Weise im Abstand einiger Tage aufgearbeitet, und die

Ermitllung durch Einsetzen in die Kalibrierfunktion ergab folgende Ergebnisse:

Tab. 8.1: Ergebnisse des Ringversuchs „Cyclophosphamid in Urin“ (1999) in ng/L

Probe 1 Probe 2

Messung 1 4,0 0,9

Messung 2 4,1 1,0

Messung 3 3,9 0,9

Labor-Mittelwert 4,0 0,9

Standardabweichung 2 % 13 %

Referenzwert 4,1 0,9

Sollwert 4,9 1,1

8.2.2 Ringversuch – Abwasser

Die Validierung einiger Nachweisverfahren für die Analyse von Umweltrealproben erfolgte durch

die Teilnahme am Ringversuch „Arzneimittel-Wirkstoffe in der aquatischen Umwelt“, der von

der Bund-Länder-Arbeitsgemeinschaft Chemikaliensicherheit (BLAC) durchgeführt wurde. Im

Rahmen des Untersuchungsvorhabens „Verhalten von Zytostatika in der Umwelt, insbersondere

in Abwässern, Gewässern und Kläranlagen“, an dem auch der Autor teilnahm, wurde zur

externen Qualitätssicherung vom Bayrischen Landesamt für Wasserwirtschaft dieser aufwendige

Ringversuch zur Bestimmung von Cyclophosphamid und Ifosfamid in Oberflächengewässern

und verschiedenen kommunalen Abwässern als Teil eines Vorhabens, das noch weitere

Pharmazeutika größerer Anzahl umfaßt, initiiert. Es nahmen sieben Laboratorien aus dem

gesamten Bundesgebiet teil.

Neben der Vorgabe, daß die Anreicherung der Analyten durch eine Festphasen-Extraktion und

das analytische Bestimmungsverfahren mit einer GC-MS erfolgen sollte, waren die wäßrigen,

teilweise stark matrixbelasteten Proben vor der Extraktion mit einem Glasfilter Nr. 8

aufzureinigen, während der Rückstand nicht erneut mit einem Lösungsmittel eluiert werden

sollte. Des weiteren mußten für die unterschiedlichen Matrices folgende Bestimmungsgrenzen

erreicht werden:


Tab. 8.2: Zu erreichende Bestimmungsgrenzen

Probe Zu erreichende Bestimmungsgrenzen

Standardprobe gelöst in Methanol/1-15% ACN 1 µg/L

Oberflächenwasser (aufgestockt) 25 ng/L

Kommunales Abwasser 50 ng/L

Kommunales Abwasser (aufgestockt) 50 ng/L

Die Aufarbeitung der wäßrigen Proben erfolgte mit dem optimierten Verfahren, das im Anhang

(Kapitel 11) in Form einer Arbeitsanweisung zusammengefaßt ist.

Zur Quantifizierung wurde bei den verschiedenen Matrices differenziert vorgegangen. Während

beim Oberflächenwasser eine Vier-Punkt-Kalibrierung für die beiden Analyten vorgenommen

wurde, war dies bei den Abwasserproben aufgrund erheblicher Unterschiede in der Belastung

und mangels undotierter Matrix nicht möglich. Der zu geringe Umfang der Probe verhinderte

eine Konzentrationsermittlung mit dem Standardadditionsverfahren.

In diesem Fall kam der sogenannte Responsefaktor zum Einsatz, der es ermöglicht, mit geringem

Aufwand akzeptable Ergebnisse zu liefern. Es handelt sich hierbei um einen

Proportionalitätsfaktor für die Umwandlung von Peakflächen in Mengenwerte einzelner

Komponenten. Es wird davon ausgegangen, daß sich das Verhältnis der Fläche des Analyten und

der eingesetzten Menge an Substanz in einem kleinen Konzentrationsbereich proportional zum

entsprechenden Verhältnis eines Standards verhält (Formel 8.3). Somit gilt:

AnalytdardS

dardSAnalyt

MF

MFf

∗∗

=tan

tan

(Formel 8.3)

Ist dieser Faktor für den erwarteten Konzentrationsbereich des Analyten bestimmt und die

Realprobe mit der gleichen Menge an Standard vermessen worden, so ist es möglich, durch

Verwendung des Responsefaktors und der obigen Gleichung die Menge an vorliegendem

Analyten zu beziffern. Die Ergebnisse der Untersuchungen im Rahmen dieses Ringversuches

sind den Tabellen 8.3 und 8.4 zu entnehmen.


Tab. 8.3: Ergebnisse des Ringversuchs „Arzneimittel-Wirkstoffe in der aquatischen Umwelt“ (2000) für

Cyclophosphamid

Oberflächenwasser

KommunalesAbwasser

KommunalesAbwasser

(aufgestockt)Standardlösung

Bestimmung überKalibriergerade 56 ng/L / / /

Bestimmung überResponsefaktor 58 ng/L < 10ng/L 284 ng/L 154 µg/L

Referenzwert 55 ng/L 0 ng/L 160 ng/L 150 µg/L

Sollwert 82 ng/L 139 ng/L 253 ng/L 188 µg/L

Tab. 8.4: Ergebnisse des Ringversuchs „Arzneimittel-Wirkstoffe in der aquatischen Umwelt“ (2000) für

Ifosfamid

Oberflächenwasser

KommunalesAbwasser

KommunalesAbwasser

(aufgestockt)Standardlösung

Bestimmung überKalibriergerade 113 ng/L / / /

Bestimmung überResponsefaktor 126 ng/L < 10ng/L 93 ng/L 113 µg/L

Referenzwert 95 ng/L 0 ng/L 80 ng/L 100 µg/L

Sollwert 101 ng/L 0 ng/L 103 ng/L 122 µg/L

Der Referenzwert gibt die vom Veranstalter des Ringversuches hinzugesetzte Dotierung der

jeweiligen Komponenten an, während es sich bei dem Sollwert um einen empirischen Wert

handelt, genauer um den Mittelwert der von sieben teilnehmenden Laboratorien abgegebenen

positiven Befunde.


8.3 Diskussion

Die Durchführung einer umfassenden internen und externen Qualitätssicherung bezüglich der

Bestimmung pharmazeutischer Substanzen und deren Stoffwechselprodukte in aquatischen

Umweltkompartimenten ist notwendig, um zu zeigen, daß es sich bei den entwickelten

Analysemethoden um genaue und robuste Verfahren handelt. Hierzu wurden für die Validierung

der entwickelten Verfahren eine Reihe von Untersuchungen in den beiden oben stehenden

Kapiteln durchgeführt.

Der fortlaufende Einsatz der verwendeten Methoden für die Aufbereitung und Bestimmung zur

Analyse einer großen Zahl Proben verschiedenster Art stellt die Robustheit der Verfahren unter

Beweis. Die für die Entwicklung und Validierung der Methoden verwendeten Probenmatrices

wurden zu verschiedenen Zeiten im Jahr und an verschiedenen Orten gezogen, was eine teils

starke jahreszeitlich und umweltbedingte Varietät dieser Matrix erzeugt.

Zur Quantifizierung der Zytostatika-Gehalte wurden mittels internem Standard 4- bis 6-Punkt-

Kalibriergeraden erstellt, deren Funktionen zur Bestimmung verwendet werden konnten. Hierbei

handelt es sich um Kalibrierungen, die die gesamte Aufbereitung und die chromatographische

Auswertung beinhalten. Es ist nicht möglich, bezüglich zu derivatisierender Verbindungen nur

die Linearität der gaschromatographischen Analyse zu betrachten, da auf jeden Fall auch die

Verluste der Derivatisierung mit einfließen. Hier sei festgehalten, daß im allgemeinen die durch

die Anreicherung und Derivatisierung verursachten Fehleranteile wesentlich größer sind als die

der gaschromatographischen Analyse, da die Probenvorbereitung aus einer Vielzahl einzelner

Schritte besteht. Es zeigte sich eine durchweg gute Linearität der Zusammenhänge zwischen

Verbindungskonzentration und erzeugtem Signal, was den jeweiligen Linearitätskoeffizienten in

Tabelle 8.5 zu entnehmen ist. Der lineare Bereich erstreckt sich je nach Verbindung über zwei

oder drei Größenordnungen, zumeist noch weiter, jedoch ist eine Ermittlung der Linearität in

Bereichen von über 100µg/L nicht notwendig, da derart hohe Zytostatika-Konzentrationen in

Realproben nicht zu erwarten sind.

Die Wiederfindungsraten liegen bei der Anwendung der optimierten Verfahren bei dotierten

Oberflächenwasserproben im Bereich von 61 bis 111%, wodurch belegt wird, daß sie sich gut

dazu eignen, die Verbindungen aus ebendieser Matrix zu bestimmen. Es zeigten sich nur geringe

Einflüsse der Matrixbelastung der Proben und der damit verbundenen Verluste.


Die Schwankungen in den Werten für die Wiederfindungsraten gehen auf das unterschiedliche

Verhalten der Verbindungen vor allem bei der Probenvorbereitung zurück.

Vor allem die Carboxy-Komponenten verändern sich im Laufe der Extraktion und

Derivatisierung, daß heißt, sie werden hydrolysiert oder bauen sich weiter zu den entsprechenden

Mustard-Verbindungen ab. Des weiteren sind auch eine unvollständige Festphasen-Extraktion

oder nicht umfassende Derivatisierungsreaktionen mögliche Gründe. Die Ursachen für eine

Wiederfindungsrate von über 100% liegen eher in der chromatographischen Analyse; so können

z.B. koeluierende Matrixbestandteile zu größeren Werten führen.

Die gleichen Gründe gelten auch für die teils merklichen Differenzen in den ermittelten

Standardabweichungen. Auch hier kommt es zu einer Abweichung bei Carboxyphosphamid.

Während bei den Muttersubstanzen, den Keto- wie den Mustardverbindungen die bei einer

solchen Matrixbelastung zu erwartenden Abweichungen von 10-20% erreicht wurden, liegt dieser

Wert mit 32% erheblich darüber, was auf den möglicherweise nicht reproduzierbaren Ringschluß

während des chromatographischen Prozesses zurückzuführen ist, denn das strukturisomere

Ifosfamid-Analogon zeigt weder ein derartiges chemisches Verhalten noch werden solch

abweichende Werte für die Wiederfindungsrate gefunden.

Die Resultate der beiden Ringversuche als Bestandteil der externen Qualitätssicherung zeigen

ganz deutlich die Möglichkeit zur Anwendung dieser Methoden für die Ermittlung von

Spurenkonzentrationen der Muttersubstanzen Cyclophosphamid und Ifosfamid im Harn eines

Menschen und in den beiden aquatischen Kompartimenten Oberflächenwasser und Abwasser.

Die Untersuchung des aufgestockten Abwassers bildet eine Ausnahme, zeigt sich doch hierbei

eine starke Abweichung vom Referenzwert. Der Grund für diese Differenz liegt vermutlich in

einem Fehler bei der Dotierung oder in einem erheblichen Blindwert der Abwasserprobe, denn

der Sollwert von 253 ng/L zeigt, daß viele der an dem Ringversuch teilnehmenden Laboratorien

ebenfalls einen Betrag in dieser Größenordnung ermittelt haben.

Durch diese Verfahren zur Qualitätssicherung konnte gezeigt werden, daß eine genaue und

robuste Bestimmung von Cyclophosphamid und Ifosfamid sowie deren Metaboliten im Spuren-

und Ultraspurenbereich in den entsprechenden Umweltmatrices sehr gut möglich ist.

9 Untersuchung von Realproben 142

9 Untersuchung von Realproben

9.1 Herkunft des Probenmaterials

Die erste Probennahme der Klinikabwässer erfolgte im Rahmen des Untersuchungsvorhabens

„Verhalten von Zytostatika in der Umwelt, insbesondere in Abwässern, Gewässern und

Kläranlagen“, das vom Ministerium für Umwelt, Raumplanung und Landwirtschaft gefördert und

in dessen Rahmen ein Teil dieser Arbeit erstellt wurde. Es wurden Krankenhäuser mit

ausgewiesenen onkologischen Stationen, also mit einem potentiellen Aufkommen der

untersuchten Verbindungen, ausgewählt. Es handelte sich hierbei um zwei Universitätskliniken

mit jeweils 1600 Betten und ein städtisches Krankenhaus mit ca. 400 Betten. Bei jeder der drei

Kliniken wurden die Proben durch Personal der jeweils zuständigen staatlichen Umweltämter an

den Hauptsammlern der Krankenhausabwässer, den Zu- und Abläufen der angeschlossenen

kommunalen Kläranlagen sowie den zugehörigen Vorflutern in Form von Schöpf- oder

Stichproben gezogen.

Eine weitere Probenahmekampagne wurde bei 15 Krankenhäusern in Nordrhein-Westfalen

durch Mitarbeiter der Stadtentwässerungsbetriebe Düsseldorf vorgenommen. Die Kliniken

wurden an bis zu acht verschiedenen Zuläufen der Klinikabwässer in die kommunalen

Abwässerkanäle ein- bzw. zweimal beprobt. Es kamen mehrere Probenahme-Techniken zum

Einsatz. Mittels qualifizierter Stichproben – einer Methode, bei der innerhalb von 10 Minuten bis

2 Stunden alle 2 Minuten ein Aliquot gezogen und anschließend gemischt wird – wurden 24, mit

einer einfachen Schöpfprobe 1 und mit der zeitproprtionalen 24-Stunden-Mischprobenahme 8

Proben gezogen.

Nach Abschluß der Probenahme wurden alle Proben, die jeweils im Schnitt ein Volumen von 2

Litern hatten, ohne weitere Behandlung umgehend in Kunststoffflaschen bei –38°C tiefgefroren

und erst kurz vor der Aufarbeitung bei Raumtemperatur aufgetaut.


9.2 Beschaffenheit der Probenmatrix Abwasser

Unter dem aquatischen Kompartiment Abwasser wird nach DIN 4045 ein „durch Gebrauch

verändertes abfließendes Wasser und jedes in die Kanalisation gelangendes Wasser“ verstanden.

Diese allgemeine Formulierung der Begriffsbestimmung weist auf starke quantitative und vor

allem qualitative Unterschiede hin. Die Verschmutzung von Abwasser kann auf anorganische

Stoffe wie Salze, Schleifstoffe u.a. oder auf organische Komponenten (Erde, Kohlenhydrate,

Fette, Eiweiße und deren Abbauprodukte) zurückgeführt werden. Je nach Herkunft, Tages- und

Jahreszeit, Wetter und anderen Faktoren ist das Abwasser sehr unterschiedlich beschaffen. So

beinhaltet normales häusliches Abwasser andere Ingredienzien und Konzentrationen als die

gezogenen und für diese Arbeit untersuchten Proben klinischer Abwässer.

Die analysierten Proben zeigten ein weites Spektrum an Verunreinigungen. Während manche

noch Papierreste und andere Schwebstoffe in starkem Ausmaß enthielten, hatten andere Proben

die Qualität eines Oberflächengewässers. Das war naturgemäß auch stark vom Probenahmeort

abhängig. So waren Wasserproben, die aus dem Effluenten einer kommunalen Kläranlage

genommen wurden, zumeist sensorisch ohne Befund und zeigten erheblich weniger Störungen

im Chromatogramm der Analyse als Aliquote, die zu einem früheren Zeitpunkt im

Abwasserreinigung-Prozeß gezogen wurden wie zum Beispiel in den Zuläufen oder den

Hauptsammlern der Anlagen.

9.3 Messung der Zytostatika-Konzentrationen in realen Klinkabwässern

9.3.1 Beschreibung des verwendeten Verfahrens

Die tiefgefrorenen Proben wurden langsam in einem Wasserbad bei Raumtemperatur aufgetaut

und zwei Aliquote von je 500mL nach vorherigem Absetzen der Schwebstoffe im

Vorratsbehältnis entnommen. Eine getrennte Betrachtung von Nor Nitrogen Mustard ist wegen

des Abbaus des bei allen anderen Analyten verwendeten internen Standards d4-Cyclophosphamid

zu ebendiesem und der unterschiedlichen, optimierten Parameter für die Probenvorbereitung

notwendig.


Die Probevorlage für die Bestimmung der Zytostatika der Gruppe 1 wurde mit der

entsprechenden Pufferlösung auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und mit d4-Cyclophosphamid

versetzt, so daß sich eine Gesamtkonzentration dieses internen Standards von 1 µg/L ergibt,

während die Probelösung für die Ermittlung der Substanzkonzentration von NNM auf pH 7

eingestellt und mit 1-Chlor-Naphthalin als Surrogat- und Extraktionsstandard versehen wurde.

Eine vorhergehende Filtration blieb aus, da die noch in der Lösung vorhandenen Schwebstoffe

auf der Fritte der Festphasen-Scheibe zurückgehalten und gesammelt wurden. Des weiteren

konnten dadurch an dem Feststoff adsorbierte Substanzspuren mit Hilfe der eingesetzten

organischen Lösungsmittel zusätzlich eluiert werden.

Die sich daran anschließende Extraktion lief bis auf unterschiedliche Festphasen-Materialien (C18

für Gruppe 1, C18 Polar Plus für NNM) gleich. Nach Konditionierung der Phasen erfolgte die

Probenaufgabe per Hand oder über Adaptoren. Hierbei zeigte sich ein großer Einfluß einer

gegebenen starken Matrixbelastung. Trotz der Möglichkeit hoher Durchflußraten stark

partikelbelasteter Volumina bei Verwendung scheibenartiger Festphasen-Kartuschen verringerte

sich im Laufe einer Extraktion häufig die Durchlaufgeschwindigkeit, so daß der von der

Membranpumpe erzeugte Unterdruck erhöht werden mußte, um vergleichbare

Extraktionsbedingungen für alle untersuchten Proben zu schaffen und somit mögliche

Abweichungen in der Wiederfindungsrate zu verhindern.

Aufgrund der auf der Fritte verbliebenen Rückstände war es notwendig, die Trocknung der

Fasern zu verlängern, um weitere Wasserreste zu entfernen, die in diesen Resten eingeschlossen

waren. Die Elution verlief, wie im Kapitel 6 dargestellt, in drei Gaben von jeweils 5mL

Acetonitril. Die anschließend bis zur Trockne eingeengten Eluate (bis auf die Bestimmung von

NNM aus den in Kapitel 6 erwähnten Gründen) zeigten starke Verunreinigungen, die sich in

unterschiedlichster Färbung und Konsistenz der Lösungen äußerte. Wegen dieses erhöhten

Aufkommens an störenden Bestandteilen wurden die Mengen der Derivatisierungsmittel

Trifluoressigsäureanhydrid und Diazomethan in einer Etherlösung verdoppelt, um gerade bei der

Methylierung Verluste durch quantitative Reaktion mit den Matrixbestandteilen zu verhindern.

Es wurde jeweils 1 µL der Injektionslösungen auf den Gaschromatgraphen gegeben, wo die

Trennung der Komponenten auf einer DB-XLB-Kapillartrennsäule stattfand. Der Gehalt an

Zytostatika wurde mittels der in Kapitel 8.3 aufgeführten MS/MS-Methode bestimmt.


9.3.2 Ergebnisse der Messungen und Diskussion

Bis auf Schwierigkeiten, die im Hinblick auf das Konstanthalten der Durchflußraten bei der

Festphasen-Extraktion auftraten, konnten die entwickelten Methoden zur Probenaufbereitung

und spurenanalytischen Bestimmung der Stickstofflost-Derivate ohne weitere Komplikationen

auf die Analyse der Klinikabwässer angewendet werden. Die zur Überprüfung der Extraktion

sowie der Wiederfindung des zudotierten internen Surrogatstandards konnten in allen Fällen in

guter Reproduzierbarkeit wiedergefunden werden, so daß von einer korrekten

Probenaufbereitung ausgegangen werden kann. Die bei jedem Probenzyklus vorhandenen nicht

belasteten Abwässer fungierten als Blindwerte, womit verhindert werden konnte, daß falsch-

positive Aussagen bezüglich der Substanzkonzentrationen gemacht wurden. Es zeigt sich in

diesen Chromatogrammen, daß es trotz des erheblichen Aufkommens an Matrix bei der Analyse

von Abwasserproben bei Zuhilfenahme der Tandem-Massenspektrometrie nur zu geringen

beeinflussenden Interferenzen durch Bestandteile aus dem Abwasser kommt.

Von den untersuchten 45 Proben waren 5 teilweise stark mit einem oder zwei verschiedenen

Substanzen kontaminiert. Vor allem die beiden Muttersubstanzen wurden in erheblichen

Konzentrationen von teilweise über 1µg/L Abwasser gefunden. Aber auch der kanzerogene

Metabolit Nor Nitrogen Mustard konnte mit 200 respektive 1600 ng/L weit oberhalb der

Nachweisgrenze bestimmt werden. Zur Bestätigung der Ergebnisse wurden die Proben, die ein

Substanzaufkommen oberhalb der Nachweisgrenzen zeigten, noch zwei weitere Mal analysiert,

um zu einer verstärkten Absicherung der Resultate zu gelangen. Zwei weitere Kontaminationen

durch KIF und NNM konnten festgestellt, aber durch erneute Messungen nicht bestätigt werden,

was auf eine mögliche Verschleppung der Substanzen oder eine eventuelle Abbaureaktion in

dieser sehr aktiven Matrix schließen läßt.

Die Tabelle 9.1 stellt die Ergebnisse der Realproben-Messungen zusammenfassend dar. Hierbei

sind die Krankenhäuser, deren Abläufe beprobt worden sind, mit Buchstaben und die

dazugehörigen verschiedenen Probenahmestellen mit der ersten fortlaufenden Nummer

versehen.Wie häufig innerhalb des Probenahmezeitraums ein Aliquot gezogen wurde, ist mit der

zweiten Zahl kenntlich gemacht. Dieser Auflistung ist zu entnehmen, daß es bei den Messungen

der Realproben zu einer hohen Anzahl an positiven Befunden für die Bestimmung der

Zytostatika kommt.


Tab. 9.1: Ergebnisse der Messungen von realen Klinikabwasserproben (Angaben in ng/L) mit

QS: Qualifizierte Stichprobe, SP: Schöpf- oder Stichprobe, MP: Mischprobe

/: Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze

Krankenhaus Probe Art derProbenahme

ProbenpH-Wert CP IF KCP KIF CCP CIF IPM NNM

A 1.1 QS 7,1 2000 / / / / / / 1600*

1.2 QS 8,5 / / / / / / / /

2.1 QS 7,5 / / / / / / / /

2.2 MP 8,0 / / / / / / / /

3.1 QS 8,1 / / / / / / / /

3.2 MP 8,1 / / / / / / / /

4.1 QS 8,4 / / / / / / / /

5.1 QS 8,3 / / / / / / / /

5.2 QS 7,0 / / / / / / / /

6.1 QS 9,3 / / / / / / / /

6.2 QS 7,9 / / / / / / / /

7.1 QS 6,4 / / / / / / / /

8.1 MP 7,8 / / / / / / / 200

B 1.1 QS 8,1 / / / / / / / /

C 1.1 QS 9,0 / / / / / / / /

D 1.1 SP 8,7 / / / / / / / /

E 1.1 QS 8,5 / / / / / / / /

2.1 MP 7,7 / / / / / / / /

F 1.1 QS 9,5 / / / / / / / /

G 1.1 MP 7,9 / / / / / / / /

H 1.1 QS 8,1 / / / / / / / /

2.1 QS 8,1 / / / / / / / /

I 1.1 QS 8,3 / / / / / / / /


Tab. 9.2: Ergebnisse der Messungen von realen Klinikabwasserproben (Angaben in ng/L) mit

QS: Qualifizierte Stichprobe, SP: Schöpf- oder Stichprobe, MP: Mischprobe

/: Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze

Krankenhaus Probe Art derProbenahme

ProbenpH-Wert CP IF KCP KIF CCP CIF IPM NNM

J 1.1 QS 8,5 / / / / / / / /

2.1 QS 8,2 / / / / / / / /

K 1.1 QS 8,7 / / / / / / / /

2.1 MP 7,8 / / / / / / / /

3.1 QS 8,5 / / / / / / / /

L 1.1 QS 7,9 / / / / / / / /

M 1.1 MP 8,4 / / / / / / / /

N 1.1 QS 8,2 160 / / / / / / /

2.1 QS 8,3 / / / / / / / /

O 1.1 MP 8,3 / / / / / / / /

P 1.1 SP 6,4 / / / / / / / /

2.1 SP 6,4 / / / / / / / /

3.1 SP 6,1 30 1200 / / / / / /

4.1 SP 6,0 / / / / / / / /

Q 1.1 SP 6,8 / / / / / / / /

2.1 SP 6,6 / / / / / / / /

3.1 SP 6,7 / / / / / / / /

4.1 SP 6,9 / / / / / / / /

R 1.1 SP 7,6 / / / / / / / /

2.1 SP 7,2 / / / / / / / /

3.1 SP 7,2 / 2300 / / / / / /

4.1 SP 7,3 / / / / / / / /


Als Beispiele seien im folgenden einige Chromatogramme hoch belasteter Proben aufgeführt.

Abb. 9.1: Chromatogramm und die entsprechenden Massenspektren der Probe A 1.1

Diese Probe wurde an einer von acht Stellen auf dem Gelände einer großen Klinik gezogen, die

vermutlich in erheblichen Mengen Zytostatika zur Chemotherapie und Immunsuppresion

einsetzt. Sowohl Cyclophosphamid (Retentionszeit tR=13,13 min) als auch der Metabolit Nor

Nitrogen Mustard (tR=6,66 min) wurden in Konzentrationen von 2 respektive 1,6 µg/L in einem

der Zuläufe des Krankenhauses in die kommunalen Abwasserkanäle detektiert und anhand ihrer

Massenspektren identifiziert.

Da diese Probe insgesamt dreimal aufgearbeitet und vermessen worden ist, konnte festgestellt

werden, daß die vom eluierten Cyclophosphamid erzeugte Fläche im Chromatogramm und damit

die absolute Menge sukzessiv abnahm. Die erste Bestätigungsmessung wurde umgehend am

folgenden Tag durchgeführt, die zweite hingegen erst zwei Wochen später. Während bei der

ersten Bestimmung nur eine geringe Veränderung gegenüber der vorangegangenen ermittelt

werden konnte, wurde bei der zweiten Analyse ein klarer Abbau der Muttersubstanz und eine

Erhöhung der NNM-Konzentration ersichtlich. Eine Umwandlung von Cyclophosphamid in

seinen aktiven Metaboliten scheint in diesem Fall möglich.

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Time (min)

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

1006,66

13,13

m/z= 62,5-63,5 F: + c SRM ms2 188,00@0,50 [ 60,00-188,00] MS

m/z= 211,5-212,5 F: + c SRM ms2 307,00@0,70 [ 200,00-307,00] MS

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

m/z

100

0

50

8

0

5

63

188

126 168

212

20020116-01#242 RT: 6,64 AV: 1 NL: 3,71E4 F: + c SRM ms2 188,00@0,50 [ 60,00-188,00]

20011219-01#1257 RT: 13,13 AV: 1 NL: 4,39E5 F: + c SRM ms2 307,00@0,70 [ 200,00-307,00]


Abb. 9.2: Chromatogramm und die entsprechenden Massenspektren der Probe P 3.1.1

Abb. 9.3: Chromatogramm und die entsprechenden Massenspektren der Probe R 3.1.1

5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8 9,0

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1007,40

m/z= 211,5-212,5 F: + c SRM ms2 307,00@0,70 [ 145,00-310,00]

150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310

m/z

0

20

40

60

80

100212

269248158 254170

5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8 9,0

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1007,30

7,63

m/z= 211,5-212,5 F: + c SRM ms2 307,00@0,70 [ 200,00-310,00]

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310

m/z

0

20

40

60

80

100212

307


Die Abbildungen 9.2 und 9.3 zeigen zwei Massenchromatogramme der Proben P 3.1 und R 3.1,

die in zwei Hauptsammelbecken kommunaler Kläranlagen genommen wurden, welche u.a. die

Abwässer zweier Krankenhäuser mit ausgewiesenenen onkologischen Stationen behandeln. Diese

Proben zeigen ebenfalls eine starke Belastung durch die beiden Ausgangssubstanzen, vor allem

durch Ifosfamid (tR=7,30 bzw. 7,40 min) mit Konzentrationen bis zu 2,3 µg/L. Bei diesen

Proben zeigte sich kein mit dem oben erwähnten Abbau vergleichbarer Prozeß, was eine

Interpretation desselbigen erschwert.

Die Quantifizierung der detektierten Substanzmengen erfolgte durch externe Kalibrierungen.

Jedoch kann hier nur von einer Abschätzung der Konzentrationen gesprochen werden, da die

jeweiligen Kalibrierfunktionen stets aus einer Ethylacetat-Standardlösung bestimmt wurden und

die Bestimmung in einer weitaus komplizierteren Matrix erfolgte. Es kann also davon

ausgegangen werden, daß die real vorliegenden Konzentrationen weitaus höher liegen als die

durch die erfolgte Kalibrierung errechneten.

10 Zusammenfassung 151

10 Zusammenfassung

Die als antineoplastische Humanpharmaka in der Chemotherapie krebskranker Patienten

eingesetzten Stickstoff-Lost-Derivate Cyclophosphamid und Ifosfamid sowie deren aktive

Stoffwechselprodukte stellen wegen ihrer toxischen, mutagenen und teilweise nachgewiesenen

kanzerogenen Eigenschaften ein hohes Gefährdungspotential für unterschiedliche

Umweltmedien dar. In der vorliegenden Arbeit wurden neben diesen beiden Leitsubstanzen

zusätzlich die Metaboliten 4-Keto-Cyclophosphamid, Carboxyphosphamid, Cyclophosphamid

Mustard, 4-Keto-Ifosfamid, Carboxyifosfamid und Ifosfamid Mustard in das

Untersuchungsvorhaben mit einbezogen, um auch das Vorkommen der im Laufe des

Stoffwechsel im Körper des Patienten entstehenden Metaboliten in wäßrigen Matrices erfassen

zu können. Aufgrund des Verbrauchs der Muttersubstanzen, deren Ausscheidungsraten, der

Toxizität aller Verbindungen sowie der jeweilig möglichen Umweltgefährdungspotentiale schien

es indiziert, das Vorkommen dieser Komponenten in der Umwelt zu untersuchen.

Im Zuge dessen wurden in der vorliegenden Arbeit für diese acht Zytostatika leistungsfähige

spurenanalytische Bestimmungsmethoden für die Konzentrationsermittlung in wäßrigen Medien

entwickelt oder von Methoden für die Zytostatika-Bestimmung in anderen Matrices adaptiert und

optimiert. Um die zu erwartenden Substanzkonzentrationen im Spuren- und Ultraspurenbereich

detektieren zu können, waren hohe Anreicherungsfaktoren und somit die Verwendung der

Festphasen-Extraktion notwendig. Die sich im Analysenverfahren daran anschließende

Derivatisierung der Moleküle wurde im Hinblick auf die Detektion mittels eines

Massenspektrometers auf eine möglichst hohe Selektivität und Sensitivität hin optimiert. Die

Trennung der Verbindungen erfolgte mit Hilfe eines temperaturprogrammierten

gaschromatographischen Verfahrens auf einer schwach polaren Kapillartrennsäule (DB-XLB,

J&W Scientific, 30m x 0,25mm x 0,25µm).

Zur Identifizierung der Zytostatika wurden Full Scan- und MS/MS- Massenspektren verwendet,

während die Quantifizierung dieser Verbindungen in den teils stark matrixbelasteten

Kompartimenten ausschließlich mit der Technik der Tandem-Massenspektrometrie erfolgten.

Hierdurch konnte ein hohes Maß an Selektivität und Sensitivität erreicht werden. Durch die

Verwendung sogenannter Scanevents war es möglich, auch koeluierende Verbindungen wie

Ifosfamid und sein Keto-Metabolit ohne Schwierigkeiten zu quantifizieren, wodurch eine weitere

Optimierung des Temperaturgradienten entfiel.


Somit gelang die Analyse der zwei Muttersubstanzen sowie der sechs Metaboliten in Matrix mit

den optimierten Parametern der gaschromatographischen Separierung und der

massenspektrometrischen Detektion in weniger als 15 Minuten (Abb. 10.1).

Abb. 10.1: Massenchromatogramme der acht untersuchten Zytostatika und des internen Standards

Um die Ergebnisse der analytischen Messungen bewerten zu können, wurde eine große Anzahl

von Maßnahmen ergriffen, die der internen wie externen Qualitätssicherung dienten. Die im

Zuge dieser Validierung ermittelten statistischen Parameter wie Standardabweichung,

Wiederfindungsrate oder Regression zeigten, daß es sich bei den entwickelten Methoden um

nachweistarke, selektive und ausreichend präzise Verfahren zur Konzentrationsermittlung dieser

Zytostatika in den behandelten wäßrigen Matrices handelt. Der Konzentrationsbereich ist für die

jeweiligen Komponenten mit Korrelationskoeffizienten von stets größer als 0,99 ausreichend

linear. Die bestimmten Wiederfindungsraten liegen mit Werten von 60 bis 110% im Bereich der

in der Literatur angegebenen Zahlen für die Bestimmung in physiologisch-diagnostischen

Flüssigkeiten. Auch die Standardabweichungen, die sich mit einer Ausnahme alle im Bereich von

10 bis 20% bewegen, zeigen, daß es sich bei diesen Verfahren um ausreichend robuste und

präzise Methoden handelt.

Die Ergebnisse der Ringversuche, an denen für die beiden Muttersubstanzen als Mittel der

externen Qualitätskontrolle teilgenommen wurde, belegen die Leistungsfähigkeit (Genauigkeit)

der entwickelten Verfahren für die Konzentrationsbestimmung dieser Verbindungen.

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time (min)

0

1000

1000

1000

1000

100%

0

1000

1000

100 Nor Nitrogen Mustard6,13

Ifosfamid Mustard9,68

Ifosfamid Cyclophosphamid12,19

12,94

4-Keto-Ifosfamid12,23

Carboxyifosfamid12,63

d4-Cyclophosphamid12,94

Carboxyphosphamid13,34

4-Keto-Cyclophosphamid13,80


Bei allen Ringversuch-Proben konnten die realen Substanzmengen mit sehr geringen

Abweichungen in den vorgegebenen Matrices (Standardlösungen, Oberflächen- und Abwasser,

Urin), also auch mit problemorientierten und den realen Untersuchungsfällen angepaßten Proben

bestimmt werden.

Tab. 10.1: Bedingungen, Bestimmungs- und Nachweisgrenzen der entwickelten Bestimmungsverfahren

Substanz VerwendeteSorbentien

Detektion(Vorläufer-/Tochterion)

Nachweis-/Bestimmungsgrenze

Oberflächenwasser[µg/L]

Nachweis-/Bestimmungsgrenze

Abwasser[µg/L]

Cyclo-phosphamid

Baker BondC18

307 / 212 0,0005 / 0,001 0,005 / 0,01

4-Keto-Cyclophosphamid

Baker BondC18

239 / 209 1 / 5 5 / 10

Carboxy-phosphamid

Baker BondC18

317 / 231 10 / 50 30 / 100

Nor NitrogenMustard

Baker BondC18

Polar Plus188 / 63 0,1 / 0,5 0,2 / 1

Ifosfamid Baker BondC18

307 / 212 0,001 / 0,005 0,01 / 0,03

4-Keto-Ifosfamid Baker BondC18

335 / 281 0,5 / 1 2 / 5

Carboxy-ifosfamid

Baker BondC18

324 / 158 1 / 5 5 / 20

IfosfamidMustard

Baker BondC18

187 / 110 1 / 5 5 / 20

Die vorgestellten Analyseverfahren eignen sich hiernach für die Anreicherung, Trennung und

Bestimmung der untersuchten Verbindungen aus Matrices wie den unterschiedlichsten

Oberflächen- und Abwässern. Die Bestimmungs- und Nachweisgrenzen für ebendiese

Kompartimente konnten für die Substanzen gegenüber früheren Arbeiten, falls vorhanden, teils

stark verbessert werden (Tab. 10.1). Der Vergleich dieser Werte mit den potentiell in

Klinkabwasser- und Oberflächenwasserproben auftretenden Substanzkonzentrationen zeigt, daß

die Erfassung der Belastungen in diesen Medien bei Verwendung der hier diskutierten Methoden

für alle untersuchten Komponenten außer Carboxyphosphamid möglich ist.


Des weiteren wurden die entwickelten Analyseverfahren zur Untersuchung des Vorkommens der

ausgewählten Zytostatika in realen Klinikabwasser- und verschiedenen Oberflächenwasserproben

eingesetzt. Um möglichst aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, wurden Proben von insgesamt

18 Universitätsklinken und städtischen Krankenhäusern an verschiedenen Stellen im

Abwasserstrom (Zuleitung ins öffentliche Abwassernetz, Zu- und Abläufe sowie Vorfluter

kommunaler Kläranlagen) teilweise mehrfach genommen. Diese Realproben-Untersuchung zeigte

deutlich, daß die Abwasserströme teils stark mit den Stickstoff-Lost-Derivaten belastet sind.

Mehr als 11% aller untersuchten Proben waren zumeist hoch mit einem oder zwei dieser

Zytostatika kontaminiert. Hierbei handelte es sich um die beiden auch schon an anderen Stellen

im Klinikabwasser gefundenen Cyclophosphamid (0,03 bis 2µg/L) und Ifosfamid (1,2 und

2,3µg/L). Erstmals konnte auch ein Metabolit des Cyclophosphamids – das Nor Nitrogen

Mustard (NNM) (0,2 und 1,6µg/L) – in zwei Abwasserproben eines Unversitätsklinikums und

eines städtischen Krankenhauses in Konzentrationen weit oberhalb der Bestimmungsgrenzen

nachgewiesen werden. Falsch-positive Aussagen können ausgeschlossen werden, da bei jedem

Analysengang Blindwerte mit vermessen wurden und ein positiver Befund stets durch zwei

weitere Messungen bestätigt wurde. Das Auftreten des zytotoxischen NNM zeigt, daß auch

Metaboliten zur Mutagenität klinischer Abwässer beitragen und möglicherweise wegen ihrer

Polarität und damit verbundenen Mobilität in der wäßrigen Phase auch die Kläranlagen ohne

Abbau passieren und die Oberflächengewässer belasten. Eine weitere Untersuchung des

Abbauverhaltens der Metaboliten von Cyclophosphamid und Ifosfamid sowie im speziellen von

Nor Nitrogen Mustard erscheint sinnvoll und angebracht.

In den beprobten Oberflächengewässern wurden weder die Muttersubstanzen noch die

Metaboliten in Konzentrationen oberhalb der jeweiligen Bestimmungsgrenzen gefunden.

Aufgrund der Menge an belasteten Proben, der Kontaminationshöhe sowie des bekannten

mutagenen und kanzerogenen Potentials der gefundenen Substanzen ist von einer starken

umweltgefährdenden Belastung der untersuchten Medien auszugehen. Eine Untersuchung von

Klinikabwässern im Allgemeinen in Form eines Umweltmonitorings ist somit notwendig und

kann mit Hilfe der durch die vorliegende Arbeit nun vorhandenen Möglichkeiten durchgeführt

werden. Ebenso können die hier vorgestellten Analyseverfahren im Hinblick auf den

Arbeitsschutz im Bereich der klinischen Analytik Verwendung finden, wie durch die externe

Qualitätssicherung mittels des Urin-Ringversuchs gezeigt werden konnte.

11 Anhang 155

11 Anhang

11.1 Eigenschaften der untersuchten Substanzen

11.1.1 Cyclophosphamid (CP)

Allg. Bemerkung: Liegt als Cyclophosphamid Monohydrat vor.

Summenformel: C7H15Cl2N2O2P ∙ H2O

Molekulargewicht: 279,1 g/mol

CAS-Nr.: [50-18-0]

Strukturformel:

O NH

P

O

N

ClCl

Zytostatika-Typ: Alkylans, Stickstofflost-Derivat, Muttersubstanz

Namen: N,N'-bis(2-chloroethyl)tetrahydro-2H-1,2,3-oxazaphosphorin-2-amin-2-

oxid, 2-[Bis(2-chloroethyl)amin]-2H-1,2,3-oxazaphosphinan-2-oxid

Handelsnamen: Cyclo-cell (cell pharm), Cyclophosphamid-biosyn (biosyn), Cyclostin

(Pharmacia & Upjohn), Endoxan (Asta Medica)

Indikationen: Akute und chronische lymphatische und myeloische Leukämien, maligne

Lymphome, Paraproteinämien (z.B. Plasmozytom, Morbus Waldenström),

maligne und metastatisierende solide Tumore (Ovarial-, Mamma-,

Bronchialkarzinom), postoperative Zusatzbehandlung bei chemosensiblen

Tumoren, Autoimmunkrankheiten, Organ- und Knochenmarktransplanta-

tionen

Nebenwirkungen: Kopfschmerzen, Brechreiz, Übelkeit, Haarausfall, Absinken der Leukozyten

und Thrombozyten, Unterdrückung der Immunreaktion, Störung der

Keimdrüsenfunktion, Blasenentzündung, Störungen der Leber-, Nieren-

Lungenfunktion, Veränderungen des Blutbildes und der Spermatogenese,

kardiotoxisch, teratogen, kanzerogen, mutagen, embryo- und fetotoxisch

11 Anhang 156

Dosierung: - Täglich:

3 bis 6 mg/kg Körpergewicht

- Intervalltherapie:

10 bis 15 mg/kg Körpergewicht in Abständen von 2 bis 5 Tagen

- Hochdosierte Intervalltherapie:

20 bis 50 mg/kg Körpergewicht in Abständen von 10 bis 20 Tagen

Pharmakokinetik: - Mittlere Halbwertszeit im Serum t1/2 4 bis 10 Stunden

- Nachweisbare Konzentrationen von Cyclophosphamid und Metaboliten

noch nach 72 Stunden

- Ausscheidung: 6-65% im Urin, 3,5% über Galle

Wirkmechanismus: Bifunktional alkylierend, zellphasenunspezifisch

IARC-Einstufung: Gruppe 1, erwiesenermaßen kanzerogen beim Menschen

R-/S-Sätze: R 45-46-61-41-48/23/24/25

S 53-15-26-45

Phys. Eigenschaften: - Weißes, kristallines Pulver

- Schmelzbereich: 49-53°C

- Siedepunkt: Exotherme Zersetzung bei 90°C

- Dampfdruck: 3,3∙10-5 hPa (bei 20°C, bestimmt mit Dampfdruckwaage)

- Löslichkeit: 40g/L Wasser, leicht löslich in Ethanol, schwer löslich in

Diethylether

- In Wasser stabil

Toxizität: - LD50 (Ratten) = 160mg/kg in einer einzelnen intravenösen Injektion

- Chronische Gabe toxischer Dosen führt zu Leberverfettung mit

anschließender Nekrose

- Mutagenität nachgewiesen (Ames-Test, S. typhimurium/E. coli positiv,

Mikrokerntest, Maus, positiv)

- Kanzerogenität und Reproduktionstoxizität aufgrund epidemiologischer

Studien und von Einzelberichten sowie tierexperimenteller Befunde sehr

wahrscheinlich

11 Anhang 157

11.1.2 Keto-Cyclophosphamid (KCP)

Summenformel: C7H13Cl2N2O3P


CAS-Nr.: [27046-19-1]

Strukturformel:

O NH

P

O

N

ClCl

O

Zytostatika-Typ: Metabolit von Cyclophosphamid

Namen: 2-[Bis(2-chloroethyl)amin]tetrahydro-2-oxid-4H-1,2,3-oxazaphosphorin-4-

on, 4-Oxo-Cyclophosphamid, Oxo-Endoxan


- Schmelzpunkt: Zersetzung

- Löslichkeit: 1g/L Wasser, sehr gut löslich in Ethylacetat, >1% in

DMSO

- Stabil bei Temperaturen unter –20°C

Toxizität: LD50 (Ratten) >800mg/kg in einer einzelnen intraperitonealen Injektion

Abbauprodukt des Zytostatikums Cyclophosphamid

11 Anhang 158

11.1.3 Carboxycyclophosphamid (CCP)



CAS-Nr.: [22788-18-7]

Strukturformel:

O NH2

P

O

N

ClCl

O

OH


Namen: 3-((Amino-[bis(2-chloroethyl)amino]phoshpinyl)oxy)-propanoic acid,

Carboxyphosphamid


- Schmelzpunkt : 116-117°C

- Löslichkeit: 1g/L Wasser, sehr gut löslich in Ethylacetat, 100g/L in

Ethanol




11 Anhang 159

11.1.4 Cyclophosphamid Mustard (CPM)



CAS-Nr.: [10159-53-2]

Strukturformel:

HO NH2

P

O

N

ClCl


Namen: N,N-bis(2-chloroethyl)-phosphorodiamidic acid, Phosphamid Mustard


- Schmelzpunkt : Zersetzung

- Löslichkeit: <100mg/L Wasser und Ethylacetat, >100mg/L pH7-

Phosphatpuffer

- Temperaturen unter –20°C sind unabdingbar

Toxizität: LD50 (Ratten) 70mg/kg in einer einzelnen intraperitonealen respektive

61mg/kg in einer einzelnen intravenösen Injektion, zytostatisch,

alkylierendes Agens, möglicherweise teratogen und kanzerogen wirkend,

zytotoxische Aktivität in vitro: 20μg/mL (2h-Inkubation)


11 Anhang 160

11.1.5 Ifosfamid (IF)



CAS-Nr.: [3778-73-2]

Strukturformel:

O N

P

O

NH

Cl

Cl

Zytostatika-Typ: Alkylans, Stickstofflost-Derivat, Muttersubstanz

Name: 3-(2-Chlorethyl)-2-[(2-chlorethyl)amino-2H-1,3,2-oxazaphosphinan-2-oxid

Handelsnamen: Holoxan (Asta Medica)

Indikationen: Inoperable maligne, Ifosfamid-empfindliche Tumore: Bronchial- und

Ovarialkarzinome, Hodentumore, Mammakarzinome, Weichteilsarkome,

Pankreaskarzinome, Hypernephrome, Endometriumkarzinome, maligne

Lympome

Nebenwirkungen: Übelkeit, Erbrechen, Haarausfall, Diarrhöe, Knochenmarkschädigungen mit

Absinken der Leukozyten und Thrombozyten, Unterdrücken der

Immunreaktion, Blasenentzündung, Störung der Keimdrüsenfunktionen,

Störungen der Nierenfunktion (Erhöhung des Blutharnstoffs und der

Serum-Creatininwerte, vermehrte Ausscheidung von Eiweiß, Zucker,

Phosphat im Urin, Fanconi-Syndrom bei Kindern), Störung der

Leber- und Herzfunktion, Desorientierung, Verwirrungszustände,

kardiotoxisch, teratogen, kanzerogen, mutagen, embryo- und fetotoxisch

11 Anhang 161

Dosierung: - Regelfall:

Intravenöse Gabe von 50-60 mg/kg Körpergewicht an fünf aufeinander

folgenden Tagen oder 80 mg/kg Körpergewicht an 2 bis 3 aufeinander

folgenden Tagen

- Hochdosis-Therapie:

5g/m2 Körperoberfläche in einer 24-Stunden-Infusion

Pharmakokinetik: - In vitro inaktiv, in vivo hochwirksam

- Aktivierung in der Leber durch mikrosomale mischfunktionelle

Oxidasen

- Mittlere Halbwertszeit im Serum t1/2 4 bis 7 Stunden

- Elimination der Muttersubstanz und der Metabolite über Urin

Wirkmechanismus: Bifunktional alkylierend an nukleophilen Zentren in der Zelle, zytotoxische

Aktivität in der späten S- und frühen G2-Phase

IARC-Einstufung: Gruppe 2

R-/S-Sätze: R 45-46-61-36-48/23/24/25

S 53-15-26-45

Phys. Eigenschaften: - Weißes, kristallines, geruchloses Pulver

- Flammpunkt: Exotherme Zersetzung bei 152°C


- Dampfdruck: 1,4∙10-5 hPa (bei 20°C, bestimmt mit Dampfdruckwaage)

- Löslichkeit: 100g/L Wasser, leicht löslich in Ethylacetat

- In Wasser stabil

Toxizität: - LD50 (Ratten) = 568 mg/kg in einer einzelnen Injektion

- Mutagenität nachgewiesen (Ames-Test, S. typhimurium/E. coli positiv,

Mikrokerntest, Maus, positiv)

- Kanzerogenität und Reproduktionstoxizität aufgrund epidemiologischer

Studien und von Einzelberichten sowie tierexperimenteller Befunde sehr

wahrscheinlich

11 Anhang 162

11.1.6 4-Keto-Ifosfamid (KIF)



CAS-Nr.: [42436-20-4]

Strukturformel:

O N

P

O

NH

Cl

O

Cl

Zytostatika-Typ: Metabolit von Ifosfamid

Namen: 3-(2-Chlorethyl)-2-[(2-chlorethyl)amino]tetrahydro-2-oxid-4H-1,2,3-

oxazaphosphorin-4-on, 4-Oxo-Ifosfamid, 4-Keto-Isophosphamid,

Oxo-Holoxan



- Löslichkeit: 10g/L Wasser, sehr gut löslich in Ethylacetat, >5% in

Methanol und Ethanol



Abbauprodukt des Zytostatikums Ifosfamid

11 Anhang 163

11.1.7 Carboxyifosfamid (CIF)

Allg. Bemerkung: Liegt als Cyclohexylamin-Salz vor.

Summenformel: C7H15Cl2N2O4P + C6H14N

Molekulargewicht: 392,3 (292,1 + 100,2) g/mol

CAS-Nr.: [53459-52-2]

Strukturformel:

O NH

P

O

NH

Cl

O

OH

Cl


Namen: 3-((Bis(2-chloroethylamino)phoshinyl)oxy)-propanoic acid cyclohexylamin

Salt, Carboxyisophosphamid



- Löslichkeit: 100g/L Wasser, sehr gut löslich in Ethylacetat


Toxizität: LD50 (Ratten) = 200mg/kg in einer einzelnen intravenösen Injektion

Abbauprodukt des Zytostatikums Ifosfamid

11 Anhang 164

11.1.8 Ifosfamid Mustard (IPM)



CAS-Nr.: [31645-39-3]

Strukturformel:

HO NH

P

O

NH

Cl

Cl

Zytostatika-Typ: Metabolit von Ifosfamid, Wirkform

Namen: N,N'-bis(2-chloroethyl)-phosphorodiamidic acid, Isophosphamid Mustard


- Schmelzpunkt: 112-114°C

- Löslichkeit: <100mg/L Wasser und Ethylacetat, >100mg/L pH7-

Phosphatpuffer

- Temperaturen unter –20°C sind unabdingbar, in Lösung ist IPM nicht

stabil und zerfällt in 2-Chloroethylamin

Toxizität: LD50 (Ratten) 113mg/kg in einer einzelnen in einer einzelnen intravenösen

Injektion, zytostatisch, alkylierendes Agens, möglicherweise teratogen und

kanzerogen wirkend, zytotoxische Aktivität in vitro: 10μg/mL (2h-

Inkubation), Abbauprodukt der Zytostatika Ifosfamid und Glufosfamid

11 Anhang 165

11.1.9 1,3-Oxazolidin-2-on (OXAZ)

Summenformel: C3H5NO2


CAS-Nr.: [497-25-6]

Strukturformel:

OHN

O


Name: 2-Aminoethylchlorid-hydrochlorid

Phys. Eigenschaften: - Farblose Kristalle


- Löslichkeit: >1g/L Wasser und Ethylacetat

Toxizität: Es liegen keine Daten zur Toxizität vor.

11 Anhang 166

11.1.10 2-Chlorethylamin (CEA)

Allg. Bemerkung: Es liegt als Hydrochlorid-Salz vor.

Summenformel: C2H6ClN ∙ HCl

Molekulargewicht: 116,0 (79,5+36,5) g/mol

CAS-Nr.: [870-24-6]

Strukturformel:

H2N

Cl


R-/S-Sätze: R 36/37/38 Xi - Reizend

S 26-36

Phys. Eigenschaften: - Farblose Kristalle


- Siedepunkt: 220°C (64mbar)

- Löslichkeit: >1g/L Wasser und Ethylacetat

Toxizität: Es liegen keine Daten zur Toxizität vor.

11 Anhang 167

11.2 Arbeitsanweisung für die Anreicherung der Substanzen

11.2.1 Gruppe 1: Cyclophosphamid, 4-Keto-Cyclophosphamid, Carboxyphosphamid,Ifosfamid, 4-Keto-Ifosfamid, Carboxyifosfamid, Ifosfamid Mustard

Vorlage: 500mL dotiertes Oberflächenwasser oder 500mL mit internem Standard

versehene Abwasserproben aus den Abläufen der untersuchten Kliniken

Probenvorbereitung: → Einstellung des pH-Wertes auf 4 mittels Gabe von Kaliumdihy-

drogenphosphat (KH2PO4) und Diphosphorpentoxid (P4O10),

→ Dotierung mit dem internen Standard d4–Cyclophosphamid

(d4-CP) entsprechend der zu erwartenden Substanzmengen

Sorbens: Extraktionsdisk: C18, 47mm (Bakerbond®, Speedisk®, J.T. Baker)

Konditionierung: → Zum Aufrichten der C18-Gruppen im Sorbens einmalige Gabe von

25mL Methanol, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!

→ Versetzen der Phase mit auf pH-Wert 4 eingestelltem Phosphat-

puffer, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!

→ Wenn notwendig, beim Durchlaufen leichtes Vakuum anlegen

Probenaufgabe: → Extraktionsdisk mit Probe befüllen

→ Entweder Adapter anschließen oder stets per Hand Probe

nachfüllen, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!

→ Probe durchsaugen, dabei Flußgeschwindigkeit durch allmähliche

Erhöhung des Unterdruckes soweit möglich konstant halten

→ Nach vollständiger Aufgabe der Probe Adapter entfernen

Waschschritt: -----

Trocknen: 15 Minuten Luft durch die Kartusche saugen

Elution: → Entsprechende Fläschchen zur Aufnahme des Elutionsmittels

einsetzen

→ Dreimal jeweils 3mL Acetonitril auf die Phase geben, 2 Minuten

einwirken lassen, dann langsam durchsaugen

11 Anhang 168

Einengen: → Eluat nach und nach in ein 2mL-Vial überführen und bei 80°C in

einem leichten Inertgasstrom (Argon oder Stickstoff) bis zur

Trockne einengen

Derivatisierung: → Aufnahme in 200µL etherischer Diazomethan-Lösung

→ Kurz schütteln und 15 Minuten bei Raumtemperatur reagieren

lassen

→ Anschließend im Inertgasstrom bis zur Trockne einengen

→ Aufnahme in 100µL Ethylacetat

→ Hinzugabe von 100µL Trifluoressigsäureanhydrid

→ Kurz schütteln und dann 1 Stunde bei 70°C reagieren lassen

→ Erneut bis zur Trockne einengen und mit 100µL Ethylacetat

aufnehmen

Analytik: 1µL der Lösung mit GC analysieren

Säule: DB-XLB (Macherey-Nagel, Polysiloxan-Gerüst mit 88% Methyl- und

12% Phenylbelegung, 30m x 0,25mm x 0,25µm)

Injektorgradient: 70°C → ° sC /16 300°C

Ofengradient: 70°C → ° min/20 C 300°C

MS-Detektion:

Substanz Vorläufer-Ion Tochter-/SIM-Ion

Cyclophosphamid 307 212

4-Keto-Cyclophosphamid 239 209

Carboxyphosphamid 317 231

Ifosfamid 307 212

4-Keto-Ifosfamid 335 281

Carboxyifosfamid 324 158

Ifosfamid Mustard 187 110

11 Anhang 169

11.2.2 Gruppe 2: Cyclophosphamid Mustard

Vorlage: 500mL dotiertes Oberflächenwasser oder Abwasserproben ohne

internen Standard aus den Abläufen der untersuchten Kliniken

Probenvorbereitung: → Einstellung des pH-Wertes auf 7 mittels Gabe von di-Kaliumhy-

drogenphosphat (K2HPO4) und Diphosphorpentoxid (P4O10)

Sorbens: Extraktionsdisk: C18 Polar Plus, 47mm

(Bakerbond®, Speedisk®, J.T. Baker)

Konditionierung: → Zum Aufrichten der C18-Gruppen im Sorbens einmalige Gabe von

25mL Methanol, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!

→ Versetzen der Phase mit auf pH-Wert 7 eingestelltem Phosphat-

puffer, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!

→ Wenn notwendig, beim Durchlaufen leichtes Vakuum anlegen

Probenaufgabe: → Extraktionsdisk mit Probe befüllen

→ Entweder Adapter anschließen oder stets per Hand Probe

nachfüllen, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!

→ Probe durchsaugen, dabei Flußgeschwindigkeit durch allmähliche

Erhöhung des Unterdruckes soweit möglich konstant halten

→ Nach vollständiger Aufgabe der Probe Adapter entfernen

Waschschritt: -----

Trocknen: 15 Minuten Luft durch die Kartusche saugen

Elution: → Entsprechende Fläschchen zur Aufnahme des Elutionsmittels

einsetzen

→ Dreimal jeweils 3mL Acetonitril auf die Phase geben, 2 Minuten

einwirken lassen, dann langsam durchsaugen

Einengen: → Eluat nach und nach in ein 2mL-Vial überführen und bei 80°C in

einem leichten Inertgasstrom (Argon oder Stickstoff) einengen bis

auf einen Rückstand von etwa 10µL

11 Anhang 170

Derivatisierung: → Aufnahme in 200µL etherischer Diazomethan-Lösung

→ Kurz schütteln und 15 Minuten bei Raumtemperatur reagieren

lassen

→ Anschließend im Inertgasstrom einengen bis auf einen Rückstand

von etwa 10µL

→ Aufnahme in 100µL Ethylacetat

→ Hinzugabe von 100µL Trifluoressigsäureanhydrid

→ Kurz schütteln und dann 1 Stunde bei 70°C reagieren lassen

→ Erneut bis auf einen Rückstand von etwa 10µL einengen und mit

100µL Ethylacetat aufnehmen

Analytik: 1µL der Lösung mit GC analysieren

Säule: DB-XLB (Macherey-Nagel, Polysiloxan-Gerüst mit 88% Methyl- und

12% Phenylbelegung, 30m x 0,25mm x 0,25µm)

Injektorgradient: 70°C → ° sC /16 300°C

Ofengradient: 70°C → ° min/20 C 300°C

MS-Detektion:

Substanz Vorläufer-Ion Tochter-/SIM-Ion

Cyclophosphamid Mustard 188 63

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Lebenslauf

Name: Rüdiger Wolfgang Kohl

Geburtsdatum/-ort: 17. September 1972 in Essen

Nationalität: deutsch

Schulbildung

Grundschule: 1979 – 1983 Bardelebenschule, Essen

Gymnasium: 1983 – 1992 Don-Bosco Gymnasium, Essen

Abitur: Juni 1992

Wehrdienst

10/92 – 12/92: 7. Gebirgssanitätsbataillon, Kempten/Allgäu

01/93 – 09/93: Untersuchungsinstitut des Sanitätsdienstes der Bundeswehr III,

Düsseldorf

Studium der Chemie

Vordiplom: Oktober 1995

Diplomhauptprüfung: Oktober 1997

Diplomarbeit: Oktober 1997 – April 1998

„Gaschromatographische Bestimmung von Cyclophosphamid und

Ifosfamid in biologischen Matrices mit massenspektrometrischer

Detektion“, Betreuung Prof. Dr. H.-J. Götze

Promotion: Mai 1998 – April 2002

„Spurenanalytische Erfassung zytostatisch wirksamer Stickstoff-Lost-

Derivate in aquatischen Umweltkompartimenten mittels

gaschromatographischer Verfahren – Entwicklung, Optimierung,

Validierung, Realprobenmessungen“, Betreuung Prof. Dr. H.-J.

Götze

Danksagung

Eine solche Arbeit völlig ohne jegliche Unterstützung anzufertigen, erscheint im Rückblick

unmöglich und somit Dank unerläßlich. Dies jedoch birgt die Gefahr, jemandem ungewollt die

Erwähnung zu verweigern oder eine bestimmte Reihenfolge nicht einzuhalten. Anyway...

Der erste und ganz große Dank gilt meiner Mutter und meiner Schwester. Ohne ihre Liebe und

Unterstützung moralischer, finanzieller und nahrungstechnischer Natur ;-) wäre mein gesamtes

Studium und diese Arbeit schlichtweg nicht möglich gewesen. Sie litten stets und zweifelten nie.

Meiner Arbeitsgruppe – Patrick Kursawe, Oliver Lerch und Thorsten Teutenberg – sowie

Thekla Kiffmeyer und MJ Dolny danke ich zutiefst für vier unglaublich tolle Jahre in unseren

heiligen Hallen und anderswo, für den wissenschaftlichen sowie vor allem für den

unwissenschaftlichen Austausch – schlichtweg für die Freundschaft, die sie mir geschenkt haben.

Ich danke auch all meinen anderen Freunden und Bekannten, die mich im Laufe der Jahre des

Studiums und der Promotion durch so viele Freuden und Schwierigkeiten begleitet haben.

Wieviel Kraft man aus einem Anruf zur rechten Zeit oder aus der Gewißheit, willkommen zu

sein, schöpfen kann... glücklich, wer solche Freunde sein „Eigen“ nennen kann.

Der Firma Axel Semrau GmbH & Co. und hier im speziellen Herrn Dr. Andreas Bruchmann gilt

mein Dank für den stets prompten technischen Support, für die offene und freundliche

Aufnahme meinerseits als neuen Mitarbeiter in der Firma sowie für die mir gewährten Freiheiten

während meiner Promotionszeit.

Spezielle Erwähnung finden soll an dieser Stelle noch der heldenhafte Einsatz von Thorsten

Teutenberg, Oliver Lerch und meiner Mutter, die die Rohfassung dieser Dissertation lesen und

korrigieren mußten.

Documents

Spurenanalytische Erfassung zytostatisch wirksamer Stickstoff … · Trotz der Unterschiede in der histologischen Struktur scheinen die Tumore nahezu alle durch recht ähnliche grundlegende