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STICKSTOFF-STOFFWECHSEL

BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN

HARNSTOFFZYKLUS

Beim Abbau von Aminosäuren und anderen stickstoffhaltigen Verbindungen entsteht

Ammoniak. Ammoniak in höheren Konzentrationen (>50 µmol/l) ist eine äußerst toxische

Substanz. Soweit das entstehende Ammoniak nicht für die Biosynthese anderer

stickstoffhaltiger Verbindungen gebraucht wird, erfolgt Einbau von Ammoniak in Harnstoff.

Auf diese Weise wird Ammoniak in eine nichttoxische Verbindung überführt. Nur die Leber

besitzt eine enzymatische Ausstattung für eine vollständige und bedeutsame Bildung von

Harnstoff. Ammoniak kann auch unverändert über die Niere ausgeschieden werden.

Bei der Bildung von Harnstoff handelt es sich um eine zyklische Reaktionsfolge, die als

Harnstoffzyklus bezeichnet wird. Im Verlauf des Harnstoffzyklus wird Harnstoff aus einem

Molekül Ammoniak und Bicarbonat sowie aus dem -Aminostickstoff von Aspartat

zusammengesetzt. Eine der Reaktionen, bei welcher in der Leber ein erheblicher Anteil an

Ammoniak entsteht, ist die NAD+-abhängige oxydative Desaminierung von Glutamat. Das

Enzym Carbamylphosphat-Synthetase (in Gegenwart von N-Acetylglutamat als

allosterischem Aktivator) katalysiert die Bildung von Carbamylphosphat aus Ammoniak und

Bicarbonat unter Verbrauch von zwei Molekülen ATP (Abb. 1). Diese Reaktion läuft in den

Mitochondrien der Hepatozyten ab. Vom Carbamylphosphat wird die Carbamyl-Gruppe auf

Ornithin unter Bildung von Citrullin und Freisetzung von Phosphat übertragen. Diese

Reaktion wird durch das Enzym Ornithin-Transcarbamylase katalysiert. Citrullin wird aus den

Mitochondrien in das Zytosol transportiert. Eine zweite Aminogruppe wird durch Aspartat in

den Zyklus eingeschleust. Die Aminogruppe von Aspartat kondensiert mit der Car-

bonylgruppe des Citrullins, wobei Argininosuccinat entsteht. Diese Reaktion erfordert ein

Molekül ATP und als Enzym Argininosuccinat-Synthetase. Argininosuccinat wird durch

Argininosuccinatlyase in Fumarsäure und Arginin gespalten. Harnstoffausscheidende

Organismen besitzen eine hohe Aktivität des Enzyms Arginase, durch dessen Wirkung

Arginin hydrolytisch in Harnstoff und Ornithin gespalten wird; das Gleichgewicht liegt weit auf

der Seite von Harnstoff und Ornithin. Der Harnstoff wird ausgeschieden, während das

Ornithin wieder in die Mitochondrien transportiert wird.

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Die Biosynthese eines Moleküls Harnstoff nach der Gleichung

2 NH3 + HCO3- + 3 ATP CO(NH2)2 + 2 ADP + AMP + 4 Pi

erfordert 3 Moleküle ATP bzw. die Spaltung von vier energiereichen Bindungen. Dabei sind

die Energetik der Biosynthese des Aspartats aus Fumarat und die Transportvorgänge durch

die Mitochondrienmembran noch nicht berücksichtigt.

In folgenden Versuchen wird die Harnstoffsynthese in Leberextrakten untersucht. Ausgehend

von verschiedenen Zwischen- und Vorprodukten des Kreisprozesses wird die Bildung von

Harnstoff nachgewiesen. Dieser wird quantitativ bestimmt. Daraus wird die spezifische

enzymatische Aktivität errechnet.

Abb. 1: Harnstoffbiosynthese

Enzyme:

1 = Carbamylphosphat-Synthetase I

2 = Ornithin-Carbamyl-Transferase

3 = Argininosuccinat-Synthetase

4 = Argininosuccinat-Lyase

5 = Arginase

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AMINOTRANSFERASEN (TRANSAMINASEN)

Für die Einschleusung von Aminogruppen in den Harnstoffzyklus müssen diese entweder in

Form von Aspartat zugeführt werden oder aber als Ammoniak aus Aminosäuren abgespalten

werden (z.B. durch die Glutamatdehydrogenase-Reaktion aus Glutamat). Damit haben

Aminotransferasen, die zur Bildung von Glutamat führen, eine besondere Bedeutung im

Stoffwechsel (Abb. 2). (Transaminasen ist eine ältere aber immer noch verwendete

Bezeichnung für Aminotransferasen).

Aminotransferasen übertragen mit Hilfe von Pyridoxalphosphat als Coenzym reversibel die

Aminogruppe einer Aminosäure 1 auf eine -Ketosäure 2 unter Bildung der -Ketosäure 1

und der Aminosäure 2 (Mechanismus siehe Lehrbücher).

Aminosäure 1 + -Ketosäure 2 -Ketosäure 1 + Aminosäure 2

Eines dieser Enzyme ist die Alanin-Aminotransferase ALT (frühere Bezeichnung Glutamat-

Pyruvat-Transaminase GPT). Sie übernimmt den Aminogruppentransfer von Alanin auf -

Ketoglutarat unter Bildung von Pyruvat und Glutamat.

Eine zweite wichtige Aminotransferase ist die Aspartat-Aminotransferase AST (früher

Glutamat-Oxalacetat-Transaminase GOT). Sie benutzt Glutamat und Oxalacetat als

Substrate und führt zur Bereitstellung von -Ketoglutarat und Aspartat. Dieses kann dann zur

Harnstoffsynthese verwendet werden.

Bestimmung von ALT und AST (GPT und GOT) hat im klinisch-chemischen Labor eine

praktische Bedeutung. Erhöhte Aktivitäten dieser Enzyme im Serum deuten auf

Organschädigungen, wie Herzinfarkt oder Erkrankungen der Leber (Leberzirrhose, Hepatitis)

hin. Aus dem Verhältnis der enzymatischen Aktivitäten von AST (GOT) und ALT (GPT) im

Serum kann auf das geschädigte Organ geschlossen werden: In der Leber findet sich

hauptsächlich ALT, während im Herzmuskel und Skelettmuskel AST und ALT in annähernd

gleich hohen Aktivitäten vorkommen.

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Abb. 2 Aminotransferasen im Stoffwechsel

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ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN

Welche energiereichen (Ver)bindungen kommen im Harnstoffzyklus vor?

Um welchen chemischen Bindungstyp handelt es sich dabei?

Für welche Biosynthese wird sonst noch Carbamylphosphat benötigt?

Durch welche Reaktionen werden Aminogruppen aus Aminosäuren als Ammoniak

abgespalten?

Durch welche Reaktionen im Stoffwechsel wird Ammoniak gebunden?

Kommen die Aminosäuren Ornithin, Citrullin und Arginin in Proteinen vor?

Worin besteht eine Wechselbeziehung zwischen Harnstoffzyklus und Citratzyklus?

Welche klinischen Symptome beobachtet man bei Enzymdefekten des Harnstoffzyklus

(genetisch bedingt oder erworben)?

Wie lassen sich diese Erkrankungen behandeln?

Aus welchen Gründen ist die Harnstoffbestimmung im Serum von klinischer Bedeutung?

Welches Coenzym wird von Aminotransferasen benötigt?

Von welchen Enzymen wird dieses Coenzym ebenfalls benötigt?

Welche Stoffwechselstörungen beim Abbau der Aminosäuren kennen Sie?

Welche Bedeutung hat die Bestimmung von Aminosäuren?

In welchen Körperflüssigkeiten sind diese Bestimmungen sinnvoll?

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ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE

HARNSTOFFZYKLUS:

Bestimmung von Harnstoff

Im Leberrohextrakt soll die Entstehung von Harnstoff unter unterschiedlichen Bedingungen

verfolgt werden, und anschließend soll die entstandene Menge an Harnstoff pro Stunde und

per mg Protein im Leberextrakt berechnet werden.

Harnstoff bildet mit -Isonitrosopropiophenon einen Farbstoff, dessen Extinktion im

Photometer bestimmt werden kann.

PROTEINBESTIMMUNG (BIURETREAKTION)

Proteine bilden mit Kupfer-II-Ionen in alkalischer Lösung violette Komplexverbindungen, die

sich vom blauen Kupfer-Tartrat-Komplex, wie er im Biuretreagenz enthalten ist, eindeutig

unterscheiden. Diese auf der Bildung von Protein-Kupfer-Komplexen beruhende Protein-

bestimmungsmethode wird als Biuretreaktion bezeichnet, da die Verbindung Biuret

H2N-CO-NH-CO-NH2 (Säureamidbindung!)

mit Biuretreagenz (alkalische Kupfer-Tartrat-Lösung) eine Färbung ergibt, die der Farbe der

Protein-Kupfer-Komplexe ähnelt. Die Absorptionsspektren der meisten Protein-Kupfer-

Komplexe sind sehr ähnlich, so dass man eine Serumalbuminlösung als Proteinstandard

verwenden und auf Korrekturfaktoren in der Regel verzichten kann.

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AMINOTRANSFERASEN

Qualitativer Nachweis der Alaninaminotransferase

Die Übertragung der Aminogruppe von Glutamat auf Pyruvat unter Bildung von Alanin und

-Ketoglutarat sowie die Umkehrung dieser Reaktion sollen nachgewiesen werden. Dazu

werden Substrate und Produkte der Reaktion durch Dünnschichtchromatografie voneinander

getrennt. Auf den Chromatogrammen werden die Aminosäuren Alanin und Glutamat durch

Reaktion mit Ninhydrin nachgewiesen. Ninhydrin bildet beim Erhitzen mit Aminosäuren einen

blauvioletten Farbstoff.

VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL

HARNSTOFFZYKLUS

Mitbringliste: Kittel, Lineal, Taschenrechner

ENZYMATISCHE REAKTION

Nach dem Pipettierplan 1 werden die Lösungen in die Eppendorf Cups 1-10 gegeben. Als

letztes wird Leberextrakt zupipettiert, wodurch die Reaktion gestartet wird. Nach der Zugabe

von Leberextrakt werden die Ansätze gemischt und die Reaktionsgefäße dann 30 min bei

37°C inkubiert.

Puffer und Salze enthalten:

0,1 mol/l, Kaliumphosphatpuffer (pH 7.8), 0,02 mol/l L-Aspartat, 0,0075 mol/l MgSO4

und 0,003 mol/l ATP zusammen mit den Enzymen Glycerat-3-phosphat-Mutase,

Enolase und Pyruvatkinase, die ebenfalls im Enzymextrakt enthalten sind, als ATP-

Quelle.)

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Pipettierplan 1 (Angaben in Mikrolitern µl)

Eppendorfcup Nr

Reagenzien 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

µl Puffer und Salze 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350

µl L-Citrullin (0,1 mol/l) 25

µl L-Arginin (0,1 mol/l) 25 25

µl L-Ornithin (0,1 mol/l) 25 25 25 25

µl Carbamylphosphat

(0,06 mol/l) 25 25 25

µl NH4HCO3 (0,2 mol/l) 25 25

µl N-Acetylglutamat

(0,05 mol/l) 25

µl H2O dest. 525 525 75 75 50 75 75 25 50 100

µl Leberextrakt 450 450 450 450 450 450 450 450

Am Ende der Inkubationszeit werden die Reaktionen durch Zugabe von je 100 µl 50 %iger Phosphorsäure zu allen

Ansätzen gestoppt. Die Proben werden gut durchgemischt (Eppendorf Cups verschließen, mehrfach umdrehen, nicht heftig

schütteln!) und 5 min zentrifugiert. Der Überstand wird zur Harnstoffbestimmung verwendet. Schutzbrille tragen!

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PHOTOMETRISCHE HARNSTOFFBESTIMMUNG

Während der Inkubation der Enzymansätze werden die Reagenzgläser für die Bestimmung

des in der Enzymreaktion gebildeten Harnstoffs vorbereitet.

Die Reagenzgläser werden mit wasserfestem Stift beschriftet. Gemäß Pipettierplan 2 werden

in jedes Reagenzglas 0,2 ml -Isonitrosopropiophenon pipettiert. Anschließend werden die

Überstände zugegeben. Zuletzt wird die Säuremischung aus einem Dispenser zugemischt.

Die Säuremischung sollte zum Schluss zugegeben werden, weil dadurch eine bessere

Durchmischung der Lösungen erreicht wird. Schutzbrille tragen!

Pipettierplan 2 (Angaben in Mikrolitern µl, bzw. Millilitern ml)

Reagenzien Reagenzglas Nr.

Lw 1 - 10

Isonitrosopropiophenon*) 200 µl je 200 µl

H2O dest. 400 µl -

Überstand - je 400 µl

Säuremischung**) 5 ml je 5 ml

Lw = Leerwert

*) 4%ige ethanolische Lösung

**) Die Säuremischung enthält konz. H2SO4, konz. H3PO4 und H2O im

Verhältnis 1 : 3 : 6. Sie wird mit einem Dispenser (automatische Pipette)

zugegeben.

Die Reagenzgläser werden 45 min im Thermoblock bei 100°C inkubiert. Nach 45 min werden

die Gläser aus dem Thermoblock genommen. Man lässt sie kurz abkühlen. (Bei längerem

Abkühlen entsteht ein Niederschlag, der die Messungen stört). Anschließend werden die

Extinktionen der Proben bei 540 nm im Photometer gegen den Leerwert gemessen.

Schutzbrille tragen!

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QUANTITATIVE PROTEINBESTIMMUNG MIT DER BIURETREAKTION

Schutzbrille tragen!

Pipettierplan 3 (Angaben in Millilitern ml)

Reagenzglas Nr.

Lw 1 2 3

ml NaCl (0,9%) 5 4,9 4,9 4,8

ml Standardserumalbumin

(50 mg/ml)

0,1

ml Leberextrakt - - 0,1 0,2

ml Biuretreagenz* 5 5 5 5

* 1 Liter Biuretreagenz enthält: 45 g Kalium-Natrium-Tartrat,

5 g Kupfersulfat und

5 g Kaliumjodid

gelöst in Natronlauge (0,2 mol/l)

Die Ansätze werden sorgfältig gemischt und dann mindestens 30 min bei Zimmertemperatur

stehen gelassen. Danach wird die Extinktion bei 540 nm gegen den Leerwert gemessen.

Probennummer gemessene Extinktion

1

2

3

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AMINOTRANSFERASEN

a) Lösungen

10 mmol/l Natriumphosphatpuffer pH 7,6

100 mmol/l Glutamat

100 mmol/l Pyruvat

100 mmol/l Alanin

100 mmol/l -Ketoglutarat

Alanin-Aminotransferase aus Schweineherz

b) Pipettierplan

Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4

Phosphatpuffer 150 µl 150 µl 150 µl 150 µl

Glutamat 50 µl 50 µl - -

Pyruvat 50 µl 50 µl - -

Alanin - - 50 µl 50 µl

-Ketoglutarat - - 50 µl 50 µl

Die angegebenen Lösungen in Eppendorf Gefäße pipettieren und gut mischen.

Dann die Reaktion durch Zugabe von

Alanin-

Aminotransferase

- 50 µl - 50 µl

H2O 50 µl - 50 µl -

starten (gut mischen) und die Proben in einem 37oC Wasserbad mindestens 45 min.

inkubieren. Anschließend werden die Proben auf Cellulosefolie aufgetragen.

c) Dünnschichtchromatographie der Aminosäuren

Für die Trennung und den Nachweis der Aminosäuren werden folgende Lösungen einzeln

auf eine Cellulosefolie aufgetragen:

1) Glutamatstandard

2) Alaninstandard

3) Probe 1

4) Probe 2

5) Probe 3

6) Probe 4

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Dafür wird die Cellulosefolie mit der breiten Seite in die Auftragschablone gelegt. Mit Kapillaren

werden die Lösungen in den Kerben der Schablone solange aufgetragen, bis circa 3 mm

große Flecken entstanden sind (Abb. 3). Die rechte untere Ecke der Folie wird mit einem

weichen Bleistift markiert, damit später klar ist, an welcher Kante die Proben aufgetragen

worden sind (Abb. 4). Die Folie wird unter dem Fön getrocknet und anschließend so in die

große Kammer der Chromatografiekammer gelegt, dass die Kante mit den Proben die poröse

Platte berührt (Abb. 4). In die kleine Kammer werden 1,5 ml Laufmittel (1-Propanol / 34%

Ammoniaklösung 7 : 3) gefüllt. Die Chromatografiekammer wird sofort mit der Glasplatte

verschlossen.

Abb.3: Auftragschablone mit 6 Kerben

Abb.4: Chromatografiekammer

← Große Kammer

mit Cellulosefolie

← Markierung

← Poröse Platte

← Kleine Kammer

(1,5 ml Laufmittel einfüllen)

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Sobald die Laufmittelfront ca. 0,5 cm vom oberen Rand der Folie entfernt ist, wird die Folie

herausgenommen. Dann wird die Folie unter dem Fön getrocknet und mit Ninhydrinreagenz

(0,2% Ninhydrin in Aceton) besprüht. Nach erneutem Trocknen an der Luft wird das

Chromatogramm vorsichtig auf der Heizplatte bis zum Erscheinen der violetten Flecken

erhitzt.

AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION

Jeder Praktikumsteilnehmer erstellt ein schriftliches Protokoll in Form der Tabelle auf der

übernächsten Seite.

Berechnung der spezifischen enzymatischen Aktivität:

Spezifische Enzymatische Aktivität: Die Menge an Substrat (µmol Harnstoff) die innerhalb einer

bestimmten Zeit (Stunde) durch eine definierte Menge Protein (mg Protein) umgesetzt wird.

Demnach benötigt man:

a. Die Menge an Protein, die in 1ml Ansatz vorlag (1)

b. Die Menge an Harnstoff, die in 1ml Ansatz entstanden ist

Menge an Protein:

1) Hierfür benötigt man die Extinktion der Proteinbestimmung mit der Biuret-Reaktion

Reaktionsansätze nach Pipettierplan 3

2) Es gilt: Die Extinktion (Ext) steigt proportional zur Proteinkonzentration (c). Durch den

Vergleich der Probe unbekannter Konzentration mit einer bekannten standardisierten

Probe kann die Proteinkonzentration errechnet werden. Die Konzentration an

Standardserumalbumin (als Referenzprotein) ist im Skript nachzulesen.

CProbe / ExtProbe = C Standard / ExtStandard CProbe = ExtProbe x CStandard / ExtStandard

3) Es wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt, wobei bei der einen Probe die

doppelte Menge Leberextrakt eingesetzt wurde. Das muss bei der Berechnung eines

Mittelwerts beachtet werden.

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Die Menge an Protein in 1ml Ansatz beträgt: 0.45 ml x CProbe = ___________ mg Protein

Harnstoffmenge:

Aus den Extinktionen der photometrischen Harnstoffbestimmung (Pipettierplan 2) wird mittels

der hier gegebenen Eichkurve die Menge an Harnstoff, bezogen auf 1 ml Ansatz, bestimmt.

Beachten Sie, dass die Eichkurve im Bereich der Extinktionen, die in diesem Versuch

gemessen werden, nahezu linear verläuft.

Deshalb gilt: mg Harnstoff = Extinktion x 0.125

Ansatz

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Tabelle zur Berechnung der spezifischen enzymatischen Aktivität

Reaktionsgefäß- Nummer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

zugesetzte Substrate L-Arginin/

- Leberextrakt

Carbamyl- phosphat/

- Leberextrakt

L-Arginin/ +

Leberextrakt L-Citrullin/

+ Leberextrakt

L-Ornithin/ Carbamyl- phosphat/

+ Leberextrakt L-Ornithin/

+ Leberextrakt

Carbamyl- phosphat/

+ Leberextrakt

L-Ornithin/ Ammonium- hydrogen- carbonat/

N-Acetylglutamat/ + Leberextrakt

L-Ornithin/ Ammonium+

hydrogen- carbonat/

+ Leberextrakt

+ Leber-extrakt

gemessene Extinktion nach Pipettierplan 2 = X1

Harnstoff (mg) bezogen auf 1 ml Ansatz X1 x 0,125= X2

Harnstoff in µmol: 1mol Harnstoff wiegt 60 g X2 x 1000/60 = X3

Harnstoff produziert pro Stunde: X3/0.5 hr = X4

Harnstoff pro Stunde pro mg Protein: X4/Menge an Protein in 1ml Ansatz

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AMINOTRANSFERASEN

Liegen in Proben 2 und 4 die Aminosäuren Glutamat und Alanin in Gleichgewichts-

konzentrationen vor?

Welche Aussagen kann man über das Gleichgewicht der Reaktion machen?

Welche Bedeutung hat dies für den Stoffwechsel?

SCHLUSSFOLGERUNGEN