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Synthese von Arylamin-modifizierten 2’-dG-Phosphoramiditen und deren Einbau in
Oligonucleotide
Dissertation Zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades
von
Nicolas Böge
aus
Hamburg
vorgelegt dem Department Chemie der Universität Hamburg
Hamburg, im Januar 2008
1. Gutachter: Prof. Dr. C. Meier
2. Gutachter: Prof. Dr. J. Thiem
Datum der Disputation: 14.3.2008
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde im Arbeitskreis von Prof. Dr. Chris Meier am Institut für
Organische Chemie der Universität Hamburg in der Zeit von April 2005 bis Januar
2008 angefertigt.
Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. C. Meier für die Überlassung des interessanten
Themas, sowie für die Freiheiten bei der Bearbeitung. Ferner danke ich ihm für die
gute Betreuung während der Arbeit, für zahlreiche Diskussionen, Anregungen und
Hilfestellungen.
Allen ehemaligen und aktiven Mitgliedern des Arbeitskreises gilt mein Dank für ihre
Hilfsbereitschaft. Einen ganz besonderen Dank möchte ich Herrn Dipl.-Chem.
Nicolas Gisch für die gemeinsamen Jahre im Labor 518, die hervorragende
Zusammenarbeit, das exzellente Arbeitsklima und die stete Hilfsbereitschaft in allen
Lagen aussprechen. Für die thematische Zusammenarbeit danke ich weiterhin Frau
Dipl.-Chem. Maike Jacobsen, Frau Dipl.-Chem. Zita Szombati und Frau Sarah
Krüger.
Einen besonderen Dank gilt den zahlreichen Praktikantinnen und Praktikanten,
welche im Rahmen ihres Studiums experimentelle Arbeiten für mich durchführten.
Hervorzuheben sind dabei meine ehemaligen Schwerpunktpraktikanten, Frau Dipl.-
Chem. Zita Szombati, Frau Sarah Krüger, Frau Saskia Wolf, Frau Nathalie Lunau
und Herr Marcus Schröder.
Herrn Dr. V. Sinnwell, Herrn Dr. E.T.K. Haupt und ihren Mitarbeitern möchte ich für
die Messung zahlreicher NMR-Spektren danken.
Frau A. Meiners, Frau C. Christ und Herrn M. Preuße spreche ich meinen Dank für
die zahlreichen Messungen der FAB-, ESI- und EI-Massenspektren aus.
Herrn Prof. Andreas Marx und Frau Dipl.-Chem. Francesca di Pasquale, Universität
Konstanz danke ich für die Durchführung der Primer-Verlängerungs-Tests, sowie für
die Aufnahme von ESI-Massenspektren.
Einen weiteren Dank gilt meinen Kooperationspartnern am DESY, Hamburg. Allen
voran Herrn Dr. Markus Perbandt für die Unterstützung bei den
Kristallisationsversuchen der Oligonucleotide.
Herrn Dipl.-Chem. Nicolas Gisch und Herrn Dipl.-Chem. Bastian Reichardt danke ich
weiterhin für die kritische Durchsicht dieser Arbeit.
Meiner Mutter möchte ich für die finanzielle Unterstützung während meines Studiums
danken. Ebenso möchte ich ihr wie auch meinen Freunden, besonders Jenny
Matthiesen, für die moralische Unterstützung während der gesamten Zeit danken.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1. Einleitung 1 2. Kenntnisstand 5 2.1 Metabolismus der aromatischen Amine 5
2.1.1 Phase I 5
2.1.2 Phase II (Bildung der ultimalen Carcinogene) 6
2.2 Reaktion ultimaler Carcinogene mit der DNA 8
2.3 Mechanismus der Adduktbildung in vivo 10
2.4 Nachweis der Carcinogenität 11
2.4.1 Ames-Test 11
2.4.2 32P-Postlabeling-Methode 12
2.5 Darstellung von Arylamin-Addukten am 2‘-Desoxyguanosin 13
2.5.1 Darstellung von C8-Arylamin-Addukten 13
2.5.2 Darstellung von N2-Arylamin-Addukten 17
2.5.3 Darstellung von O6-Arylamin-Addukten 19
2.5.4 Darstellung von C8-N-Acetyl-Arylamin-Addukten 20
2.6 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide und
deren Eigenschaften 21
2.7 Reparatur und Struktur C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 22
3. Aufgabenstellung 24 4. Resultate und Diskussion 26
4.1 Synthese C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotid-
Bausteine 26
4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Oligonucleotid-
Bausteine 41
4.2.1 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels
Azokupplung 42
4.2.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Substitution 45
4.2.3 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels
Palladium-katalysierter Kreuzkupplung 50
Inhaltsverzeichnis
4.3 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotid-
Bausteine 72
4.3.1 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotid-
Bausteine mittels Mitsunobu-Reaktion 73
4.3.2 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotid-
Bausteine mittels einer Substitutions-Reaktion 78
4.4 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 94
4.4.1 Synthese C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 100
4.4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 104
4.5 Messung der Schmelztemperaturen (Tm-Werte) 109
4.6 Messung des circularen Dichroismus 116
4.7 Restriktionsabbau mittels EcoRI 121
4.8 Primer-Verlängerungs-Untersuchungen 127
4.9 Erste Versuche zur Kristallisation von Oligonucleotiden 136
5. Zusammenfassung 141 6. Summary 146
7. Ausblick 149
8. Experimentalteil 152 8.1 Allgemeines 152
8.1.1 Lösungsmittel und Reagenzien 152
8.1.2 Chromatographie und Geräte 154
8.1.2.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 154
8.1.2.2 Präparative Säulenchromatographie 154
8.1.2.3 Zirkulare präparative Dünnschichtchromatographie 155
8.1.2.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) 155
8.1.2.5 Kernresonanzspektroskopie (NMR) 156
8.1.2.6 Massenspektrometrie (MS) 156
8.1.2.7 Schmelzpunktbestimmung 157
8.1.2.8 Infrarot-Spektrometer 157
8.1.2.9 Polarimeter 157
8.1.2.10 Zentrifuge 157
8.1.2.11 UV-Spektrometer 157
8.1.2.12 Thermomixer 157
8.1.2.13 Speed-Vac-Probenkonzentrator 157
Inhaltsverzeichnis
8.1.2.14 DNA-Synthesizer 158
8.1.2.15 CD-Spektrometer 158
8.2 Oligonucleotide 158
8.2.1 Synthese von Oligonucleotiden 158
8.2.2 Entschützung und Trägerabspaltung 158
8.2.3 Reinigung der Oligonucleotide 159
8.3 Analytik der Oligonucleotide 159
8.3.1 Bestimmung der Optischen Dichte (OD260) 159
8.3.2 Präparation der Oligonucleotide für das ESI-MS 160
8.3.3 Bestimmung der Schmelztemperatur (Tm-Wert) 160
8.3.4 Messung des circularen Dichroismus 160
8.3.5 Enzymatischer Abbau der Oligonucleotide mittels des
EcoRI Restriktionsenzym 160
8.4. Allgemeine Arbeitsvorschriften 161
8.5 Synthesen 167
8.6 Oligonucleotide 273
9. Gefahrstoffe 281 10. Literatur 286
11. Anhang 301
12. Persönliches 312
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungen und Symbole
AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift
Abb. Abbildung
Ac Acetyl
AG Abgangsgruppe
Äq. Äquivalente
ber. berechnet
BINAP 2,2´-Bis(diphenylphosphino)-1,1´-binaphthyl
Bn Benzyl
BOP Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-
hexafluorophosphat
Bz Benzoyl
CD circularer Dichroismus
cod cyclooctadienyl
CPE Cyanophenylethyl
CPG controlled pore glass
δ chemische Verschiebung
d Dublett
dA 2’-Desoxyadenosin
dba dibenzylidenaceton
DBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en
DC Dünnschichtchromatographie
DCM Dichlormethan
dC 2’-Desoxycytosin
DCI 4,5-Dicyanoimidazol
dG 2’-Desoxyguanosin
DIAD Diisopropylazodicarboxylat
DIPEA Diisopropylethylamin (Hünigs Base)
DLS Dynamische Lichtstreuung
DMAP 4-(Dimethylamino)-pyridin
1,2-DME 1,2-Dimethoxyethan
DMF N,N-Dimethylformamid
DMSO-d6 Dimethylsulfoxid (sechsfach deuteriert)
Abkürzungsverzeichnis
DMTr 4,4’-Dimethoxytriphenylmethyl
DNA Desoxyribonucleinsäure
dT 2’-Desoxythymidin
DTE Dithioerithrol
DTT Dithiothreithol
ε molarer Extinktionskoeffizient
EcoRI Escherichia Coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EI Elektronenionisation
ESI Elektronensprayionisation
FAB fast atom bombardment
FG funktionelle Grupppe
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Form Formamidin
gef. gefunden
h Stunde
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HPLC High Performance Liquid Chromatographie
iBu iso-Butyryl
IQ 2-Amino-3-methyl-imidazo[4,5-f]quinolin
IR Infrarot
J skalare Kern-Kern-Kopplungskonstante
λ Wellenlänge
K Kelvin
Kap. Kapitel
LM Lösungsmittel
m Multiplett
M Molar
MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
MHz Megahertz
MPD 2-Methyl-2,4-pentanediol
MS Massenspektrometrie
NBS N-Bromsuccinimid
NER nucleotide excision repair
Abkürzungsverzeichnis
nm Nanometer
NMR Nuclear Magnetic Resonance
NOE Nuclear Overhauser Effect
NOESY Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy
p page
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PPh3 Triphenylphosphin
ppm parts per million
PhthNOH N-Hydroxyphthalimid
rac racemisch
Rf Retentionsfaktor
RP reversed phase
Rt Raumtemperatur
s Singulett
S. Seite
s. siehe
Sdp Siedepunkt
sec Sekunden
sept Septett
SG Schutzgruppe
Smp Schmelzpunkt
t Triplett
TBAF Tetrabutylammoniumfluorid
TBDMS tert-Butyldimethylsilyl
TEAA Triethylammoniumacetat
Tf Triflat
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran
Tm Schmelzpunkt eines DNA-Duplexes
TMSN3 Trimethylsilylazid
tR Retentionszeit
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
UV Ultraviolett
XANTPHOS 9,9-Dimethyl-4,5-bis(diphenylphosphino)xanthene
Abkürzungsverzeichnis
z.B. zum Beispiel
Einleitung
1. Einleitung
Der menschliche Körper besteht aus vielen verschiedenen Zelltypen. Normalerweise
wachsen bzw. teilen sich die Zellen, wenn dies für den Körper notwendig ist. Diese
Regeneration der Zellen läuft geregelt ab und dient der Gesunderhaltung des
Körpers.
Erfolgen Zellteilungen, obwohl keine neuen Zellen benötigt werden, kommt es zu
einer übermäßigen Gewebeneubildung. Der Überschuss an Gewebe bildet eine
Geschwulst, welche man Tumor nennt. Dieser kann gutartig oder bösartig sein.
Bösartiges (malignes) Gewebe bezeichnet man als Krebsgewebe. Bei Krebszellen
ist das Gleichgewicht von Wachstum, Teilung und Zerstörung (Apoptose) im
Zellverband außer Kraft gesetzt. Regulierende Signale werden nicht erkannt oder
nicht ausgeführt, da meistens der dafür benötigte genetische Code einer Mutation
unterliegt und damit defekt ist. Die Krebszellen teilen sich im Vergleich zu gesunden
Zellen unkontrolliert. Sie können in das benachbarte gesunde Gewebe eindringen
(infiltrierendes Wachstum) oder es zerstören (destruierendes Wachstum). Als
krebserregend werden daher vor allem Einflüsse bezeichnet, die das Erbgut
verändern.
Die Nomenklatur der malignen Tumore unterscheidet zum Einen nach dem
Ursprungsgewebe und zum Anderen nach dem Tumortyp. Hier werden epitheliale
Tumore, die sich aus Ektoderm- und Entodermgewebe gebildet haben, als
Karzinome bezeichnet, während mesenchymale Tumore, die aus dem Mesoderm
entstehen, als Sarkome bezeichnet werden.[1]
Prinzipiell kann jedes Gewebe einen Tumor entwickeln. Die drei häufigsten Tumor-
erkrankungen sind jedoch das Prostata-Karzinom, das Mamma-Karzinom, sowie das
Bronchial-Karzinom. Das Bronchial-Karzinom weist zudem die höchste Todesrate
aller Tumorerkrankungen auf. Dies begründet sich vor allem in der Tatsache, dass
das Karzinom relativ spät diagnostiziert wird, so dass ein Großteil des umgebenden
Gewebes schon geschädigt ist und sich meist schon Metastasen gebildet haben.[2]
Metastasen entstehen, wenn sich Tumorzellen aus dem Tumor lösen und sich über
das Lymphsystem und den Blutstrom verbreiten. Binden sie schließlich an
Endothelzellen, so kann die Zelle von dort in das umliegende Gewebe eindringen
und einen Tochtertumor bilden (s. Abb. 1, S. 2).
1
Einleitung
Abb. 1 Skizze des Mechanismus der Metastasierung[3]
Die direkte Folgeerscheinung des Tumorwachstums ist der Verlust von spezifischen
Zell- und Gewebefunktionen, die daraus resultiert, dass der Tumor in das gesunde
Gewebe hineinwächst und so die ihn umgebenden Zellstrukturen schädigt. Zudem
gibt es eine weitere Folgeerscheinung, die sogenannte Tumoranämie, bei der unter
anderem die Anzahl und die Lebensdauer der Erythrozyten herabgesenkt sind.
Zusätzlich kommt es zu Schädigungen der Blutgefäße und damit verbunden zu
Blutungen, wodurch die Erythrozytenkonzentration weiter sinkt. Eine direkte
Konsequenz der Anämie ist somit eine Schwächung des Patienten, wodurch die
Überlebenschance weiter abnimmt.[1, 4-6]
In den meisten Ländern der Welt ist Krebs heute nach Herz- und
Kreislauferkrankungen die zweithäufigste Todesursache. [7] So stieg die Anzahl der
durch Krebs ausgelösten Todesfälle in den letzten Jahren auf ein Viertel. Nach
Schätzungen der American Cancer Society lag die Zahl der Krebs-Neuerkrankungen
beispielsweise innerhalb der USA im Jahre 2007 bei 1.44 Millionen Patienten. Im
gleichen Jahr sind schätzungsweise 560.000 Personen an den Folgen von Krebs
gestorben. Dabei handelt es sich um 23.1% der in den USA registrierten
Todesfälle.[2] Diese Daten lassen sich auf nahezu jedes andere westliche
Industrieland übertragen.
Neben der Neigung an Krebs zu erkranken, welche bekanntermaßen u.a. bei Brust-
und Darmkrebs vererbt werden kann, können Neuerkrankungen von ionisierender
Strahlung (so starb Marie Curie 1934 an durch radioaktiver Strahlung verursachter
Leukämie), infektiösem biologischem Material und genetischen Determinanten
herrühren. Als Hauptursache bei der Induktion von Krebs scheinen jedoch
Chemikalien zu fungieren.[8]
2
Einleitung
Die ersten Befunde über den Zusammenhang zwischen bestimmten Chemikalien
und Krebs stammen aus dem Jahr 1761.[9] So berichtete J. Hill von einem erhöhten
Auftreten von Krebs in Nasenschleimhäuten nach langjährigem Gebrauch von
Schnupftabak. Berichte über aromatische Amine, die Gegenstand dieser Arbeit sind,
als krebsauslösende Substanzen, wurden von L. Rehn im Jahr 1895 veröffentlicht.[10]
Er beobachtete eine Zunahme von Harnblasenkarzinomen bei Arbeitern, die in der
Produktion von Magenta (Fuchsin) beschäftigt waren. Rehn prägte daraufhin den
Begriff „Anilin-Krebs“, da Anilin 1 (s. Abb. 2) die Ausgangsverbindung der Synthese
darstellt. Diese Bezeichnung stellte sich jedoch später als falsch heraus. Vielmehr
waren es die Nebenprodukte der Anilinherstellung, wie z. B. 4-Aminobiphenyl 2, die
krebserzeugend waren (s. Abb. 3, S. 4).
NH2 NH2 NH2 NH2
O
1 5 6 7
NH2
NH2NH2
2 3 4 Abb. 2 carcinogene aromatische Amine
Außer polycyclischen Aminen wie z.B. 2-Aminofluoren 3 oder 2-Naphthylamin 4 sind
für die Carcinogenese auch die monocyclischen Amine von Bedeutung, wenngleich
sie im Allgemeinen eine geringere Carcinogenität aufweisen. Verbindungen dieser
Art, wie z. B. Anilin 1, 4-Toluidin 5, 4-Anisidin 6 oder 4-Ethylanilin 7, werden daher als
Grenzcarcinogene bezeichnet. Bei Substanzen dieser Klasse kommt die Fähigkeit
der Tumorindikation nur dann zum Ausdruck, wenn eine hohe Dosierung vorliegt, die
Substanz über einen langen Zeitraum verabreicht oder aber ein Comutagen
zugegeben wird.
3
Einleitung
Aromatische Amine sind in den Industrieländern ubiquitäre Umweltgifte. Sie werden
seit Beginn des 19. Jahrhunderts vor allem zur Synthese von Azo-Farbstoffen,
Pharmaka, Pestiziden oder auch Polyurethanen benötigt. Auch waren aromatische
Amine bis ins 20. Jahrhundert aufgrund mangelndem Risikobewusstseins im
Straßenteer enthalten.
Monocyclische, aromatische Amine wurden unter anderem im Tabakrauch
nachgewiesen, vor allem das 4-Aminobiphenyl 2 und zahlreiche Methyl-, Dimethyl-,
und Ethylderivate des Anilin 1.
Weiterhin können sie jedoch auch als Abbauprodukte, z. B. durch Reduktion von
polycyclischen Nitroaromaten aus Dieselgasen und synthetischen Treibstoffen
entstehen. Ebenso konnten verschiedene heterocyclische, aromatische Amine, wie
z.B. 2-Amino-3-methyl-imidazo[4,5-f]quinolin (IQ) 33 (s. S. 15), in gekochtem Fisch
oder Fleisch nachgewiesen werden, wo sie durch Pyrolyse von Aminosäuren wie
Tryptophan entstehen können. [11,12]
4
Kenntnisstand
2. Kenntnisstand
2.1 Metabolismus der aromatischen Amine
Obwohl das carcinogene Potential bei den genannten Verbindungen bisweilen sehr
unterschiedlich ist, bleibt deren Wirkungsweise immer gleich.
Gelangen aromatische Amine in den Körper, so setzt ein Detoxifizierungsprozess
ein, der die Wasserlöslichkeit körperfremder Stoffe zum Ziel hat, um diese
ausscheiden zu können. Allerdings können die aromatischen Amine auch durch
enzymatische Reaktionen zu elektrophilen Aminierungsreagenzien (sogenannte
ultimale Carcinogene) umgewandelt werden (s. Abb. 4, S. 7).
Bei diesen Prozessen unterscheidet man zwei Phasen. In Phase I findet eine
Oxidation statt, während es sich bei der Reaktion in Phase II meistens um eine
Veresterung handelt.
2.1.1 Phase I
Aus Arbeiten von J. W. Cramer, J. A. Miller und E. C. Miller wurde bekannt, dass
diesem ersten Schritt, der Oxidation aromatischer Amine, eine Schlüsselrolle für
deren Carcinogenität zukommt.[13]
Das aromatische Amin 8 (bzw. die N-acetylierte Form) kann relativ unspezifisch
durch verschiedene Enzymsysteme am Ring oder am Stickstoff oxidiert werden. So
kann es einerseits durch eine Cytochrom-P450-vermittelte Aktivierung in der Leber
zum Hydroxylamin 9 oxidiert werden. Quantenmechanische Rechnungen legen dabei
einen Ein-Elektronen-Mechanismus für diesen initialisierenden Schritt des
Metabolismus aromatischer Amine nahe. Dabei kann der Mechanismus sowohl über
das Aminium-Kation 10 als auch über das Aminyl-Radikal 11 laufen (s. Abb. 3, S.
6).[14]
5
Kenntnisstand
HN
8
NH
10
N
11
NH
N
- e
- H
- H
Enz-OHN
9
R
R R
R R R
OH
R = H, Ac
Abb. 3 Postulierter Ein-Elektronen-Mechanismus der N-Oxidation aromatischer Amine
Andererseits kann das Arylamin 8 durch die cytosolische N-Acetyltransferase in das
ausscheidbare Acetanilid 12 überführt werden.[15] Nach neueren Erkenntnissen wird
auch die N-Glucuronidierung als Entgiftungsreaktion genutzt, wobei der
Glucuronsäureester 13 gebildet wird, der aufgrund seiner Stabilität als Transportform
gilt und ausgeschieden werden kann.
Das Hydroxylamin 9 kann über das Blut in die Nieren transportiert und über den Urin
ausgeschieden werden. Im Blut allerdings kann das Hydroxylamin 9 teilweise durch
Hämoglobin, unter Methämoglobinbildung, zum Nitrosoderivat 14 oxidiert werden und
spontan mit Glutathion (GSH) oder SH-Gruppen des Hämoglobins abreagieren.[9]
2.1.2 Phase II (Bildung der ultimalen Carcinogene)
In der Harnblase kann es allerdings zu weiteren Reaktionen kommen. Das
Hydroxylamin 9 kann hier wegen des geringen pH-Wertes protoniert werden und
liefert unter Wasserabspaltung das hochreaktive Nitreniumion 15, welches kovalent
an DNA oder andere Biomoleküle binden kann.
Neben diesem nicht-enzymatischen Aktivierungsschritt gibt es je nach Spezies und
Organ eine Reihe von enzymatisch katalysierten Wegen. So kann das Hydroxylamin
9 beispielsweise durch die Sulfotransferase in den Sulfatester 16 (ein ultimales
Carcinogen) überführt werden, welcher dann durch Abspaltung der Sulfatgruppe
ebenfalls das Nitreniumion 15 bildet.[16,17]
Ein weiterer Weg, der das Nitreniumion 15 liefert, erfolgt durch Acetylierung des
Hydroxylamins 9 durch die N-Acetyltransferase in der Harnblase. Hierbei entsteht
6
Kenntnisstand
zunächst das N-Acyloxyarylamin 17 (ultimales Carcinogen), das dann ebenfalls nicht-
enzymatisch unter Acetatabspaltung zerfällt und das Nitreniumion 15 bildet.[18,19]
N-AcetyltransferaseNH
O
P450
NOH
RN
Gluc
HbFe
N OGSHHämoglobin
NOH
RN
GlucAusscheidung
Leber
Blut
Harn-blase
Sulfo-transferase
nicht-enzymatisch
N-Acetyl-transferase
NR
OSO3N
RN
R
OAc
DNA-Addukt
NH
8
9
12
13
14
1516 17
11 R
R
R = H, Ac
Abb. 4 Metabolismus aromatischer Amine in der Entstehung von Harnblasenkrebs (Giftungsreaktionen sind rot,
Entgiftungsreaktionen schwarz dargestellt)
7
Kenntnisstand
2.2 Reaktion ultimaler Carcinogene mit der DNA
Das durch Metabolisierung erhaltene elektrophile Nitreniumion 15 ist in der Lage sich
an die nucleophilen Stellen der DNA anzulagern und sogenannte DNA-Addukte zu
bilden.
Chemisch betrachtet ist der Begriff des „DNA-Addukts“ missverständlich, da es sich
bei der Reaktion zwischen Carcinogen und Nucleobase nicht um eine
Additionsreaktion, sondern um eine Substitutionsreaktion handelt. Da der Begriff in
der biochemischen Terminologie jedoch gebräuchlich ist und auch in der Literatur
Verwendung findet, soll er auch hier angewandt werden.
Viele Untersuchungen in den letzten Jahren haben sich mit der Identifizierung dieser
„Addukte“ beschäftigt. Dabei hat sich gezeigt, dass sowohl in vitro, als auch in vivo
die Anzahl, als auch die Menge der mit den DNA-Basen gebildeten Produkte je nach
Carcinogen verschieden sein können.
Neben der Bildung von Addukten an der N4-Position des 2’-Desoxycytosin, an der
C8- sowie N6-Position des 2’-Desoxyadenosin wurden eine Reihe von Addukten am
2’-Desoxyguanosin gefunden, welche Thema dieser Arbeit sind (s. Abb. 5, S. 9).[20]
Neben den Addukten in C8-Position 18 (ca. 80% aller gefundenen Addukte) wurden
von Hatcher und Swaminathan, sowie von Kadlubar die in geringerem Maße
vorkommenden Addukte in N2- und in O6-Position nachgewiesen und identifiziert.
Diese Nachweise wurden dabei mit Hilfe der 32P-Postlabeling-Methode, sowie
massenspektrometrischen und NMR-spektroskopischen Untersuchungen mit
4-Aminobiphenyl 2 bzw. 2-Naphthylamin 4 durchgeführt.[21-26]
Eine Quantifizierung gelang dabei für das C8-Addukt des 4-Aminobiphenyl in
humanen Pankreaszellen durch Vouros im Jahre 2005. Er konnte dabei die
durchschnittliche Anzahl an gebildeten Addukten (60 pro 108 Nucleobasen) bei
starken Rauchern mittels Kapillar-Flüssigchromatographie-Mikroelektronenspray
Massenspektrometrie bestimmen.[27] Aussagen über die Quantifizierung in anderen
Organen oder Zelltypen sind bislang nicht bekannt.
8
Kenntnisstand
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
NH
Aryl NH
N
N
O
NHN
O
OH
HNAryl
NH
N
N
O
NN
O
OH
NAryl
C8-dG ~ 80 % 18
N2-dG ~ 5 % 19
N2-dG < 5 % 20
HO HO HO
HO
N
N
N
O
NH2N
O
OH
HNAryl
O6-dG ~1 % 21
NH
N
N
O
NH
N
O
OH
N2-dG < 1 % 22
HONH2
HO
N
N
N
O
NH2N
O
OH
O6-dG < 0.1 % 23
NH2
Abb. 5 Addukte des 2’-Desoxyguanosin und deren relative Häufigkeit
Durch diese Addukte kann die Struktur der DNA soweit verändert werden, dass es
bei der Transkription zu Mutationen und in Folge dessen zu Zellen kommt. Dies kann
zum Absterben der Zelle (Apoptose) oder im ungünstigsten Fall zur Entwicklung
einer Tumorzelle führen.[9] Allerdings führen diese DNA-Modifikationen nur dann zu
Replikationsfehlern, sollten die zelleigenen Reparaturmechanismen die Veränderung
nicht rechtzeitig erkennen und beheben, sowie die Zelle nicht mehr in der Lage sein
ein Signal zu ihrer eigenen Zerstörung abzugeben.
In Tierversuchen konnte unter Zuhilfenahme von 32P-Postlabeling-Experimenten
gezeigt werden, dass die unterschiedlichen DNA-Addukte der verschiedenen
aromatischen Amine unterschiedlich schnell repariert werden.[28] So sind zum
Beispiel N2-Addukte in vivo persistenter verglichen mit den
entsprechenden C8-Addukten. Grund hierfür ist die unterschiedliche Konformation
der DNA, die durch die verschiedenen Addukte entstehen kann. Welche
Konformation vorliegt und damit maßgeblich die Struktur beeinflusst, hängt vom
aromatischen System des Addukts ab. Während einige Aromaten sich in die Helix
der DNA einfügen und keine merkliche konformative Änderung hervorrufen,
begünstigen andere in unterschiedlichem Maße die Umwandlung von der
9
Kenntnisstand
B-Konformation zur „stacked“ S-Konformation (z. B. C8-modifizierte Oligonucleotide
des 2-Aminofluoren 6), welches eine Denaturierung der DNA zur Folge hat.[29]
2.3 Mechanismus der Adduktbildung in vivo
Der Mechanismus der am häufigsten auftretenden DNA-Addukt-Gruppe, dem dG-C8-
Addukten, ist bislang noch nicht vollständig geklärt. Allerdings gilt es als erwiesen,
dass intermediär ein Arylnitreniumion 15 gebildet wird. Die Beobachtung, dass die
Reaktion vorwiegend am Guanin stattfindet, kann mit Hilfe des Redoxpotentials der
Base erklärt werden, da dieses deutlich kleiner als das der anderen DNA-
Heterocyclen ist und somit die notwendige Elektronenabgabe erst möglich macht.
Aufgrund der Tatsache, dass die C8-Position nicht die nukleophilste Stelle der Base
ist und mit Alkylierungsreagenzien (z.B. Methyliodid) eine bevorzugte Reaktion an
der N7-Position nachgewiesen werden konnte, schlugen F. P. Guengerich et al.
einen Mechanismus vor, der diesen Umstand mit einbezieht.[30,31]
Zu ähnlichen Ergebnissen kamen drei Jahre später auch M. Novak und S. A.
Kennedy.[32] Die durch den elektrophilen Angriff des Arylnitreniumion 15 erzeugte
positive Ladung ist demnach über die N7-, C8- und N9-Positionen delokalisiert. Nach
Deprotonierung an der C8-Position liegt dann ein Ylid vor, welches in einer der
Stevens-Umlagerung ähnlichen Reaktion das in vivo beobachtete C8-Addukt liefert,
wobei seine Aromatizität zurückgebildet wird (s. Abb. 6).
HN
N N
N
O
H2NR
H
Aryl NH
15
N
N
R
H
NAryl
H
H N
N
R
NAryl
H
N
N
R
HN Aryl
R=OH
OHO
Abb. 6 Postulierter Mechanismus der C8-Adduktbildung
10
Kenntnisstand
2.4 Nachweis der Carcinogenität
Der Nachweis, ob eine Substanz carcinogen oder mutagen ist, lässt sich am
zuverlässigsten in Tierversuchen an Säugetieren klären. Da diese jedoch nicht nur
sehr umstritten, sondern auch teuer sind, existieren auch mehrere alternative
Methoden, von denen zwei an dieser Stelle kurz erläutert werden sollen.
2.4.1 Ames-Test
Der gegenwärtig wichtigste Test zur Untersuchung von Mutagenität einer Verbindung
ist der nach seinem Entwickler B. N. Ames benannte Ames-Test.[33,34] Als
Testobjekte werden hier mutierte Bakterienstämme von Salmonella typhimurium
verwendet. Diese Stämme besitzen das Merkmal der Histidinauxotrophie; eine
Mutation in den Genen für die Enzyme der Histidinbiosynthese, welche dafür sorgt,
dass diese Bakterien, im Gegensatz zum Wildtyp, nicht zur Synthese des Histidin
befähigt sind und deshalb in histidinfreien Kulturen nicht wachsen können. Diese
Mutation kann allerdings durch eine weitere Mutation (z. B. durch chemische
Substanzen) rückgängig gemacht werden. Durch diese Reversion entsteht eine
Zelle, die nun wiederum eine funktionelle Basensequenz besitzt und in der Lage ist,
Histidin zu synthetisieren.
Es ist möglich, eine Selektion dieser Revertanten vorzunehmen, ihre quantitative
Häufigkeit zu bestimmen und mit der Mutagenität der chemischen Substanz in
Korrelation zu setzen. In Tabelle 1, S. 12 sind die ermittelten Werte für die in dieser
Arbeit verwendeten Arylamine dargestellt. Hierbei scheint in den verwendeten
Zellsystemen (TA 100; aus Salmonella typhimurium) ein Zusammenhang zwischen
der Mutagenität (log Rev; je größer der Wert, desto mutagener die Substanz) und der
Polarität der aromatischen Amine (log P; je größer der Wert, desto lipophiler bzw.
unpolarer die Substanz) zu bestehen.[35]
11
Kenntnisstand
Arylamin log Rev/nmol log P
Anilin 1 - 2.61 0.90 4-Methoxyanilin 6 - 1.95 0.95 4-Methylanilin 5 - 1.77 1.39
3,5-Dimethylanilin 24 - 1.31 1.91 4-Aminobiphenyl 2 0.29 2.86 2-Aminofluoren 3 0.91 3.14
Tabelle 1 Korrelation von Polarität und Mutagenität der verwendeten Arylamine[35]
Routinemäßig werden heute fünf verschiedene Bakterienstämme eingesetzt. Da
diese Stämme zum Teil verschiedene Arten von Mutationen (z. B. Leseraster- oder
Basenpaarmutationen) besitzen, kann mit ihrer Hilfe nicht nur das mutagene
Potential einer Substanz, sondern auch Anhaltspunkte für eine Klassifizierung des
Wirkmechanismus erfolgen. So gibt es erste Anzeichen für eine Basendeletion
welche durch die Modifikationen aromatischer Amine ausgelöst werden könnten. Da
die meisten genotoxischen Stoffe (wie z. B. die aromatischen Amine) allerdings nicht
direkt, sondern erst nach Aktivierung zu reaktiven Metaboliten mit der DNA
reagieren, muss diese im Säugetierorganismus stattfindende Metabolisierung im
Ames-Test simuliert werden. Hierzu kann ein aus Säugetierleber gewonnenes
Aktivierungssystem (S9-Mix) verwendet werden.[36]
2.4.2 32P-Postlabeling-Methode
Eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von DNA-Addukten ist das 32P-
Postlabeling. Bei dem von K. Randerath et al.[37] eingeführten Verfahren wird
zunächst DNA mit der zu testenden Substanz inkubiert, wobei ebenfalls ein
Aktivierungssystem hinzugegeben werden kann. Nach Aufarbeitung wird die DNA
enzymatisch zu 3’-Nucleosidmonophosphaten abgebaut. Diese werden dann durch
Reaktion mit γ-[32P]-Adenosintriphosphaten am C5’ phosphoryliert. Durch
mehrdimensionale Dünnschichtchromatographie können die Addukte von den
unveränderten 3’,5’-Nucleosiddiphosphaten abgetrennt und radiographisch
untersucht werden. Voraussetzung ist jedoch das die Addukte bekannt und
strukturell charakterisiert sind, um eine eindeutige Zuordnung vornehmen zu können.
12
Kenntnisstand
2.5 Darstellung von Arylamin-Addukten am 2’-Desoxyguanosin
2.5.1 Darstellung von C8-Arylamin-Addukten
Bei der Synthese der modifizierten C8-Addukte können grundsätzlich drei Methoden
angewendet werden.
Bei der 1989 von der Arbeitsgruppe Boche erstmals durchgeführten elektrophilen Arylaminierung werden zunächst Hydroxylamine gebildet, welche dann in das
elektrophile Nitreniumion umgewandelt werden können. Der Nachteil dieser Methode
sind jedoch die sehr geringen Ausbeuten, wie z.B. bei der Reaktion des
Arylhydroxylaminesters 25 mit 2’-Desoxyguanosin zum entsprechenden C8-Addukt
26 mit 2.5% (Abb. 7).[38]
HN
O
O
R
25
CHCl3/EtOH/H2O (3 : 7 : 4)dG, Et3N, 24 h, 37 °C
2.5%
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
NH
26 Abb. 7 Beispielreaktion zur elektrophilen Arylaminierung nach Boche et al 38]
Durch die von E. Kriek und E. Müller bereits 1967 durchgeführte Synthese eines
C8-Adduktes mittels nukleophiler Arylaminierung des geschützten Ribosederivates
27 wurde jedoch mit 23% eine bessere Ausbeute erzielt, als es über die elektrophile
Arylaminierung bisher möglich war (Abb. 8).[39]
NH
N
N
O
NH2N
O
OAcOAc
AcO
Br
NH2
NH
N
N
O
NH2N
O
OAcOAc
AcO
NH
iPrOH
20 h, 150 °C
27 3 28
23%
Abb. 8 Beispielreaktion zur nukleophilen Arylaminierung nach Kriek und Müller
13
Kenntnisstand
Diese Methode ist jedoch nur auf Ribosen anwendbar, da die harschen
Reaktionsbedingungen (150 °C) eine Depurinierung des 2’-Desoxynucleotids zur
Folge hatten.
Die Strategie der Palladium-katalysierten C-N-Bindungskupplung wurde erstmals
von T. Migita et al. im Jahre 1983 veröffentlicht.[40] Diese Reaktion wurde von S. L.
Buchwald et al. und J. F. Hartwig et al. weiterentwickelt und beide veröffentlichten
schließlich 1995 die nach ihnen benannte Buchwald-Hartwig-Kupplung (s. Abb.
9).[41,42]
BrR
NR1R2RPdCl2[P(o-Tol)3]
tBuONa, Toluol,100 °C
29 30
HNR1R2
Abb. 9 Buchwald-Hartwig-Kupplung
Die ersten Reaktionen dieser Art mit Nucleosiden wurden von M. K. Lakshman et al.
durchgeführt. Ihm gelang es u. a. die N6-Aryl-Addukte des 2’-Desoxyadenosin zu
synthetisieren.[43]
Eine Anwendung der Buchwald-Hartwig-Kupplung zur Darstellung C8-Arylamin
modifizierter 2’-Desoxyguanosin-Derivate und deren anschließende Überführung in
die entsprechenden Phosphoramidite gelang S. Gräsl in ihrer Dissertation im
Arbeitskreis von C. Meier.[44] Ihr gelang es unter Verwendung von Silylethern als
Schutzgruppe der beiden Hydroxyfunktionen, sowie der Verwendung der Isobutyryl-
Schutzgruppe, einer Standardschutzgruppe für die Oligonucleotidsynthese für die
exocyclische Aminofunktion, mehrere dG-C8-Addukte (mit Ausbeuten von 65-75%)
darzustellen und diese dann in die entsprechenden Phosphoramidite zu überführen.
Bei der angewandten Buchwald-Hartwig-Kupplung war eine Schützung der O6–
Funktion der Base elementar für eine erfolgreiche Einführung der Arylamin-
Modifikation. Als Schutzgruppe etablierte S. Gräsl die Benzylschutzgruppe, da sie
nach der Kupplungsreaktion unter milden Bedingungen wieder abgespalten werden
konnte (s. Abb. 10, S. 15).
14
Kenntnisstand
N
N
N
O
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
Br O
K3PO4, rac-BINAP, Pd2(dba)3,1,2-Dimethoxyethan
50 h, 80 °C
N
N
N
O
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
NH
O
NH2
31
5
32 75%
Abb. 10 Synthese des dG-C8-Adduktes des 4-Toluidin 5
Nachteil der verwendeten iso-Butyryl-Schutzgruppe ist jedoch die langwierige,
vollständige Abspaltung, die in konzentrierter Ammoniaklösung bei 55 °C erst nach
mindestens 8 Stunden zu beobachten war. Des Weiteren war die Synthesesequenz
nicht universell anwendbar, so scheiterte z.B. die Überführung des C8-2-
Aminofluorenyl-modifizierten 2’-Desoxyguanosin-Derivates in das entsprechende
Phosphoramidit. Dennoch konnte S. Gräsl den Einbau der modifizierten
Phosphoramidite in Oligonucleotide in ihrer Dissertation zeigen.
Während der Durchführung der vorliegenden Arbeit veröffentlichten Rizzo et al. eine
Modifizierung der Syntheseroute zur Herstellung der C8-Addukte von
heteroaromatischen Aminen, wie 2-Amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinolin (IQ) 33.[45]
Hierbei gelang es ihnen nach kompletter Entschützung des Adduktes mit Formamidin
als Schutzgruppe für die exocyclische Aminofunktion eine sehr labile Gruppe
einzuführen (s. Abb. 11).
N
N
N
OBn
NH2N
O
O
O
Br
Si
SiO
34
N
N
N
OBn
NN
O
O
DMTrO
HN
35
NN
N
PO N(iPr)2NC
1.) Pd2(dba)3, BINAP2.) H2, Pd/C3.) TBAF4.) Me2NCH(OMe)2
5.) DMTr-Cl6.) NC(CH2)2OP[N(iPr)2]2
NMe2
N NN NH2
33
Abb. 11 Synthesesequenz zur Herstellung des C8-modifizierten
Phosphoramidits 35 des IQ 33 nach Rizzo[45]
15
Kenntnisstand
Probleme traten jedoch im Weiteren auf, da die entsprechenden Phosphoramidite,
welche als Grundbaustein zur Oligonucleotidsynthese dienen, in den standardmäßig
verwendeten Lösungsmitteln nicht löslich waren und deshalb eine präparativ
schwierige Oligonucleotidsynthese zur Folge hatten. Ebenfalls konnte nicht gezeigt
werden, ob diese Syntheseroute auch auf einfache aromatische Amine anwendbar
ist.
Einen anderen Weg zur Darstellung C8-Arylamin-modifizierter 2’-Desoxyguanosin-
Derivate mittels der Buchwald-Hartwig-Kupplung beschritt Takamura-Enya. Nach der
Überführung von geschütztem 2’-Desoxyguanosin 36 in das entsprechende C8-
Amino-Derivat 37 folgte eine Buchwald-Hartwig-Reaktion mit polycyclischen
Arylbromiden (s. Abb. 12).[46,47]
N
N
N
OBn
NH
N
O
OAc
AcODMTr
BrN
N
N
OBn
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSODMTr
H2N
1) TMSN3, TBAF, CH3CN2) NaBH4, MeOH/THF
3) NaOMe4) TBDMSCl, Imidazol, DMF
N
N
N
OBn
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSODMTr
HN
36 37
39
Pd2(dba)3,XANTPHOS,KO-t-Bu
Br
38
Ausbeute: 75%
Abb.12 Synthesesequenz nach Takamura-Enya[46,47]
Zwar gelang bei diesem Syntheseweg auch die Kupplung mit polycyclischen
Arylaminen, jedoch konnte keine Verkürzung der Syntheseschritte oder eine
deutliche Steigerung der Syntheseausbeuten erreicht werden.
16
Kenntnisstand
2.5.2 Darstellung von N2-Arylamin-Addukten
F. De Riccardis, R. R. Bonala und F. Johnson widmeten sich der Synthese von N2-
Alkyl-substituierten-2’-dG-Derivaten. Der Schlüssel für diese erfolgreiche Synthese
war auch hier die Palladium-katalysierte Buchwald-Hartwig-Kupplung zwischen
einem TBDMS-geschützten 2´-dG 40 und einem o-Nitroaryltriflat oder –bromid 41 in
Anwesenheit von racemischem BINAP und einer stöchiometrischen Menge einer
milden Base, z.B. Cäsiumcarbonat (s. Abb. 13).[48]
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
+R
O2N
R= OTf, Br
N
N
N
O
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
O2N
N
N
N
O
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
H2NN
N
N
O
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
HNAc
40
41
42
43 44
Abb. 13 Synthese der N2-Aryl-2´-dG-Derivate[48]
Bei der Umsetzung mit dem geschützten 2´-dG-Derivat 40 konnte unabhängig von
den verwendeten aromatischen Donoren stets eine Ausbeute von > 86% beobachtet
werden. Die Produkte 42 konnten jeweils durch Flash-Chromatographie leicht
gereinigt werden. Eine anschließende Reduktion der Nitro-Funktion lieferte die
N2-Alkyl-substituierten-2’-dG-Addukte 43, welche auch in die entsprechenden
N-acetylierten Formen 44 überführt werden konnten. Die anschließende Entfernung
der TBDMS-Schutzgruppen erfolgte mit TBAF in THF, jedoch wurde von keiner
17
Kenntnisstand
Überführung in die entsprechenden Phosphoramidite und deren Einbau in
Oligonucleotide berichtet.
Neuere Versuche von G. Boche et al. zeigten die Darstellung von N-2´-dG-4-
aminobiphenyl-3´-phosphaten, welche synthetisiert und vollständig durch 1H-NMR
und Massenspektrometrie charakterisiert wurden, um als Standard für die 32P-Postlabeling-Methode zu dienen. Allerdings erfolgte auch hier keine Synthese
der entsprechenden Phosphoramidite (s. Abb. 14).[49]
NH
N
N
O
NH2N
O
O
TBDMSO
PO OO
45
1. DEAD, PPh3, Allylalkohol, THF, Rt, 1 h2. tBuONO, Rt, 5 min3. Tf2O, Et3N, DMAP, Rt, 0.5 h
N
N
N
O
ON
O
O
TBDMSO
PO OO
46
SCF3
O
O
1. DMF, Rt, 3 h2. (Et2NH2)2CO3, Pd(PPh3)4, CHCl3, Rt, 0.5 h3. TBAF, THF, Rt, 1 h4. Pd/C, H2, MeOH, Rt, 1 h
NH
N
N
O
NH
N
O
O
HO
PO OO 48
HN
10%
9%
HN NH2
47
Abb. 14 Synthese von N-2´-dG-4-aminobiphenyl-3´-phosphat 47 nach der Vorschrift von G. Boche [49]
Ausgehend von einem bereits 5´-TBDMS-geschützten 2´-dG-phosphat 45 erfolgte
zuerst mit Hilfe einer Mitsunobu-artigen Reaktion die Allylschützung in O6-Position
und die anschließende Umsetzung zum Triflat-Derivat 46. An dieser Stelle erfolgte
die Umsetzung mit 4-Hydrazinobiphenyl.
Nach Entschützung der Phosphatgruppe, Entfernung der TBDMS-Gruppen mit Hilfe
von TBAF und der Entschützung der O6-Position mittels Hydrogenolyse konnte das
N-2´-dG-4-aminobiphenyl-3´-phosphat 48 erhalten werden. Auch hier wurde
wiederum nicht über die Überführung in die entsprechenden Phosphoramidite
18
Kenntnisstand
berichtet, so dass bislang keine Methode zur Darstellung von N2-Addukten und deren
Phosphoramidite bekannt ist.
2.5.3 Darstellung von O6-Arylamin-Addukten
Im Jahr 1978 gelangen F. F. Kadlubar, J. A. Miller und E. C. Miller neben dem
Nachweis auch erste Erfolge in der Synthese von O6-Arylamin-Addukten.[22]
Damals fanden sie heraus, dass N-Hydroxy-1-naphthylamin 49 mit Nucleinsäuren bei
einem pH-Wert von 5 unter Bildung von kovalent gebundenen Derivaten reagierte.
Es konnten dabei jedoch keine Aussagen über die Art der Bindung noch die
Ausbeute gemacht werden. Erst die nach Zugabe des Hydroxylamin 49
durchgeführte enzymatische Hydrolyse der DNA führte unter sauren Bedingungen zu
zwei O6-Arylamin-Addukten (neben den bereist zuvor identifizierten C8 und N2-
Addukten), dem N-dG-O6-1-naphthylamin 50 als Hauptprodukt (s. Abb. 15) und dem
2-dG-O6-1-naphthylamin 51. Beide Produkte konnten mittels HPLC getrennt und
mittels NMR-Spektroskopie eindeutig charakterisiert werden.[22]
HNOH
1) DNA
pH 5, 37 °C, 6 h
2) DNase, Phosphatase, Phosphodiesterase
N
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
NH
49 50
N
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
51
NH2
Abb. 15 Reaktion von N-Hydroxyl-1-naphtylamin mit DNA[22]
In Anbetracht der Selektivität des Hydroxylamins gegenüber Makromolekülen und
der Tatsache, dass die Geschwindigkeit dieser Reaktion von der Konzentration der
DNA und des N-Hydoxylarylamins abhängig ist, konnte ein Reaktionsmechanismus
postuliert werden, welcher die Bildung eines 1-Naphthyl-Nitrenium-Ions als
Schlüsselschritt der Reaktion beinhaltet und welcher durch Solvolyse-Reaktionen mit
H218O bestätigt werden konnte. Diese Erkenntnisse wurden in der Folgezeit
19
Kenntnisstand
allerdings nicht weiter verfolgt, um zu einer geeigneten Syntheseroute zur
Darstellung O6-Arylamin-modifizierten 2’dG-Phosphoramiditen zu gelangen.
2.5.4 Darstellung von C8-N-Acetyl-Arylamin-Addukten
Neben den Arylaminen haben auch die entsprechenden N-Acetyl-Derivate eine
große Bedeutung für die chemische Carcinogenese. Die ersten erfolgreichen
Synthesen dieser Addukte wurden von Zhou und Romano beschrieben. Mittels
elektrophiler Arylaminierung konnten sie das C8-Addukt des N-Acetyl-2-
aminofluorens darstellen. Problematisch war jedoch die geringe Ausbeute der
Kupplung (ca. 2.5 %). [50,51] Die bislang einzige effektive Synthese solcher Addukte
wurde 2002 von Schärer beschrieben (s. Abb. 16).[52,53]
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
N
N
N
OBn
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSODMTr
Br4 Stufen
N
N
N
OBn
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSODMTr
HNArylKreuz-
kupplungNH
N
N
O
NHiPr-PAcN
O
O
DMTrO
NAryl
O
PO N
NC
7 Stufen
52 53
54 55Gesamtausbeute: 6%
Abb. 16 Darstellung C8-N-Acetyl-Arylamin-modifizierter 2’-dG-Phosphoramidite nach Schärer[52,53]
Ausgehend vom 2’-Desoxyguanosin 52 wurde zunächst in vier Stufen ein
geschützter, bromierter Baustein 53 synthetisiert, welcher anschließend mit dem
Arylamin mittels der schon beschriebenen Buchwald-Hartwig-Reaktion zum
20
Kenntnisstand
entsprechenden Addukt 54 gekuppelt werden konnte. Nach anschließender
Acetylierung und Abspaltung der Schutzgruppen (O6-Benzyl, NH2-DMTr und OH-
TBDMS) konnte das geschützte Phosphoramidit 55 über insgesamt 12 Stufen mit
einer Gesamtausbeute von 6% hergestellt werden.
Die Synthese solcher N-acetylierten C8-Addukte ohne die Verwendung einer
Kreuzkupplungsreaktion und der damit verbundenen aufwändigen
Schutzgruppenstrategie bzw. die direkte Kupplung von Acetaniliden sind bislang
nicht bekannt.
2.6 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide und deren Eigenschaften
Die ersten synthetisierten C8-modifizierten Oligonucleotidbausteine und deren
Einbau wurden von Zhou und Romano beschrieben. Ihnen gelang es, mittels
elektrophiler Arylaminierung die Phosphoramidite der dG-C8-Addukte des
2-Aminofluorens 3 und des N-Acetyl-2-aminofluorens darzustellen und
einzubauen.[50,51] Probleme waren neben der geringen Ausbeute der Kupplung, die
Verwendung der Fmoc-Funktion (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) als Schutzgruppe für
die exocyclische Aminofunktion, da die entsprechenden unmodifizierten
Phosphoramidite nicht kommerziell erhältlich sind.
Nach der erfolgreichen Synthese C8-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite konnte
S. Gräsl in ihren Arbeiten auch deren Einbau in verschiedene Oligonucleotide
zeigen. Ihr gelang es, neben drei Grenzcarcinogen-C8-modifizierten 2’-dG-
Phosphoramiditen, auch das C8-Biphenyl-modifizierte 2’-dG-Phosphoramidit
einzubauen. Nach anschließender Reinigung mittels HPLC konnte sie erste
Untersuchungen hinsichtlich der Eigenschaften solcher modifizierten Oligonucleotide
durchführen. Es konnte beobachtet werden, dass die Modifikation eine Verringerung
des Schmelzpunktes (Tm-Wert) zur Folge hatte, jedoch keinerlei Einfluss auf die
Konformation des Doppelstranges zu haben schien. Auch in ersten biologischen
Untersuchen, Primer-Verlängerungs-Untersuchungen, konnte kein Unterschied in
den Eigenschaften zwischen den Grenzcarcinogen- und dem Biphenyl-modifizierten
Oligonucleotiden festgestellt werden.[44]
Während der Durchführung dieser Arbeit gelang Rizzo der Einbau des C8-IQ-
modifizierten 2’-dG-Phosphoramidits. Er untersuchte die Eigenschaften eines
21
Kenntnisstand
solchen modifizierten Oligonucleotids im Vergleich zu einem 2’-dG-C8-N-Acetyl-2-
aminofluorenyl-modifizierten Oligonucleotids (Sequenz: 5'-d(CTCGGCGCCATC) 56)
und konnte zeigen, dass der Einfluss auf den Tm-Wert im Fall des 2’-dG-C8-IQ-
modifizierten Doppelstranges geringer ist. Jedoch konnte er keine konformativen
Unterschiede beider modifizierter Oligonucleotide feststellen.[45] In Folgearbeiten
berichtet Rizzo von dem Einbau eines N2-IQ-2’-dG-modifizierten Phosphoramidites
des Typs 22 (s. Abb. 6, S. 9). Vergleichende Polymerase-Experimente zu dem 2’-dG-
C8-IQ-modifizierten Oligonucleotiden wurden beschrieben und legten nahe, dass der
Effekt bei der Replikation IQ-modifizierter Oligonucleotide (abhängig von der
Sequenz) sowie von der Art (C8 oder N2) der Modifikation sei.[54,55] Hierbei scheinen
die C8-Addukte zu einer Basendeletion zu führen, während die N2-Addukte zu einem
Abbruch der Replikation führen. Ähnliche Untersuchungen, allerdings nur mit 2’-dG-
C8-N-Acetyl-2-aminofluorenyl-modifizierten Oligonucleotiden, wurden 2005 von
Romano durchgeführt.[56] Auch hier war eine Zwei-Basen-Deletion zu beobachten.
Da weitere Untersuchungen, insbesondere im Hinblick auf die Ursachen der
unterschiedlichen Carcinogenität mono- und polycyclischer aromatischen Amine
nicht bekannt sind, ist es das Bestreben dieser Arbeit, zu weiteren Erkenntnissen auf
diesem Gebiet zu gelangen.
2.7 Reparatur und Struktur C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide
Die bisherigen Untersuchungen zur Reparatur der DNA-Schäden, welche durch
aromatische Amine verursacht werden, legen nahe, dass die Struktur eine
entscheidende Rolle spielt. So scheinen Addukte aromatischer Amine schlechte
Substrate für die NER (nucleotide excision repair) zu sein, die eine Struktur
aufweisen, in der der aromatische Ring in der major oder minor groove liegt (z.B. bei
2-Aminofluoren 6). Andererseits sind Addukte, bei denen das aromatische System
innerhalb der DNA liegt, gute Substrate.[57] Detaillierte Versuche zur Reparatur von
Benzo[α]pyren- und Benzo[α]phenanthren-Addukten ließen erkennen, dass bei der
Reparatur verschiedene Parameter wie z.B. die Störung der Basenpaarung, die
Entwindung, die Krümmung und die Flexibilität der DNA eine Rolle zu spielen
scheinen.[58-60] Experimentelle Untersuchungen zur Reparatur von Addukten, welche
durch aromatische Amine gebildet werden, sind bislang nur für polycyclische
22
Kenntnisstand
Arylamine wie 4-Aminobiphenyl 5 und 2-Aminofluoren 6, sowie deren N-acetylierte
Formen bekannt. Diese legen nahe, dass eine mögliche syn-Konformation der
modifizierten Guanin-Base (Drehung der glycosidischen Bindung um 180°) die
Fähigkeit der DNA-Polymerase über das Addukt hinweg zu transkribieren verringern
oder gar ganz verhindern könnte. Weiterhin sei die Art (die Struktur) des
aromatischen Systems verantwortlich für die Stabilität der Addukte gegenüber
Reparaturmechanismen. So scheint eine planare aromatische Struktur (wie beim 2-
Aminofluoren 6) persistenter in den untersuchten Zelllinien zu sein.[61-63]
Um genauere Aussagen über den räumlichen Einfluss der Modifikation machen zu
können wurden bislang jedoch nur wenige Strukturuntersuchungen vorgenommen.
1998 veröffentlichten Broyde et al. computergestützte Rechnungen (minimized
potential energy calculations), in denen sie zeigen konnten, dass für ein C8-Anilin
modifiziertes Oligonucleotid die B-Konformation mit dem Amin in der major groove
begünstigt zu sein scheint. Im Gegensatz dazu seien beim C8-2-Aminofluoren
modifizierten Oligonucleotid auch anderen Konformationen (z.B. die syn-
Konformation) möglich.[64]
Ein Beweis für die Existenz einer solchen syn-Konformation bei C8-2-Aminofluoren-
modifizierten Oligonucleotiden lieferte Beland et al. Sie konnten mittels NMR-
Spektroskopie zwei Konformationen nachweisen. Zum Einen eine Konformation, in
der der 2-Aminofluorenyl-Rest in der major groove (anti-Konformation des
Nucleosids) und zum Anderen in den DNA-Dublex interkalierend.[65] Im Falle des
4-Aminobiphenyl konnten sie zeigen, dass eine solche zweite Konformation immerhin
zu 5-10% vorhanden ist.[66]
Weitere Strukturaufklärungen, auch mit monocyclischen Arylamin-Addukten, sowie
kristallographische Untersuchungen sind bislang nicht bekannt. Da hierüber jedoch
möglicherweise eine Differenzierung von poly- und monocyclischen Arylaminen im
Hinblick auf ihren Einfluss auf die Struktur von Oligonucleotid-Duplexen erfolgen
könnte, ist dieses ein Fernziel, für welches im Rahmen dieser Arbeit erste
Grundlagen geschaffen werden sollen.
23
Aufgabenstellung
3. Aufgabenstellung
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Unterschied in der Mutagenität/Carcinogenität
von mono- bzw. polycyclischen aromatischen Aminen untersucht werden.
Die Bearbeitung dieses Gebietes gestaltete sich dabei in drei Themenkomplexen:
Zum Einen sollte zunächst die von S. Gräsl entwickelte Syntheseroute für die C8-
Arylamin-modifizierten-2’-dG Phosphoramidite optimiert werden. Hauptaugenmerk
lag dabei auf der Einführung einer labilen Schutzgruppe für die exocyclische
Aminofunktion, um eine Abspaltung nach der Oligonucleotidsynthese unter
basischen Bedingungen zu verkürzen und damit die Ausbeute an modifiziertem
Oligonucleotid zu steigern. Außerdem sollte die Syntheseroute eine
Allgemeingültigkeit besitzen und auch auf aromatische Amine wie 2-Aminofluoren 3
anwendbar sein. Dies war bislang nicht möglich.
Ein zweites Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von geeigneten Syntheserouten
zur Darstellung weiterer in vivo gefundener Adduktformen am 2’-Desoxyguanosin.
Dabei sollte neben der Synthese der O6-Addukte des Typs 21 (s. S. 9) vor allem die
Synthese der beiden bislang noch nicht chemisch dargestellten N2-Addukte 19 und
20 (s. S. 9) im Vordergrund stehen. Nach erfolgreicher Darstellung der Addukte
sollten diese mit einer geeigneten Schutzgruppenstrategie in die entsprechenden
modifizierten Phosphoramidite überführt werden und neben den C8-Arylamin-
modifizierten-2’-dG Phosphoramiditen als Bausteine für die Oligonucleotidsynthese
zur Verfügung stehen.
Die Phosphoramidite sollten dann in Oligonucleotide gezielt eingebaut werden.
Hierbei sollten drei verschiedene Sequenzen einen Einblick in die Eigenschaften
solcher modifizierten Oligonucleotide geben (s. Abb. 17).
5'-d(CTCGGCGCCATC) 5'-d(GTAGAATTCTAC)
5'-d(AAATGAACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
56 57
58 Abb. 17 Im Rahmen dieser Arbeit synthetisierte Oligonucleotid-Sequenzen
Für alle Sequenzen sollten Untersuchungen hinsichtlich der thermischen Stabilität
(Tm-Wert) und der Konformation des Doppelstranges (Circular Dichroismus) 24
Aufgabenstellung
vorgenommen werden. Außerdem sollte für die selbstkomplementäre Sequenz 57
ein Restriktionsverdau mittels EcoRI etabliert werden und den Einfluss der
Modifikation auf die Halbwertszeit untersucht werden.
Um eine mögliche Erklärung der unterschiedlichen Mutagenität/Cancerogenität von
mono- bzw. polycyclischen aromatischen Aminen geben zu können sollten weitere
biochemische Untersuchungen mit der Sequenz 58 durchgeführt werden. So sollte
der Einfluss der verschiedenen Arylamin-Modifikationen bei der Replikation mittels
Primer-Verlängerungs-Experimenten in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von
Prof. A. Marx, Universität Konstanz untersucht werden. Abschließend sollten, um
Aussagen über den Einfluss der Modifikation auf die Struktur des DNA-
Doppelstranges machen zu können, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof.
C. Betzel, Universität Hamburg und dem in Hamburg ansässigen DESY erste
Versuche zur Kristallisation solcher modifizierten Oligonucleotide durchgeführt
werden.
25
Resultate und Diskussion
26
4. Resultate und Diskussion 4.1 Synthese C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine
Die Darstellung der C8-Arylamin-modifizierten Oligonucleotidbausteine sollte
ausgehend vom 2’-Desoxyguanosin 52 erfolgen.
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
Br
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HNAryl NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
HNAryl
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HNAryl
N(Me)2
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
HNAryl
N(Me)2
PO N(iPr)2
NC
52
59 60
6162
63
Abb. 18 Retrosynthese der Darstellung C8-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite 59
Resultate und Diskussion
27
Der entscheidende Schritt bei der gewählten Syntheseroute ist dabei die Einführung
der Modifikation in die C8-Position des Guanosins 63 (s. Abb. 18, S. 26).
Diese C-N-Bindungsknüpfung sollte mittels einer Buchwald-Hartwig-Kupplung
erfolgen. Die für diese Kupplung notwendigen Schutzgruppen sollten dafür zunächst
eingeführt werden. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass eine
Schützung der exocyclischen Aminofunktion bei der Kreuzkupplung nicht notwendig
ist.[67] Nach der C8-Modifizierung sollten dann die Schutzgruppen abgespalten, die
Einführung der basenlabilen NH2-Schutzgruppe (Formamidin), sowie die für die
Oligonucleotid-Festphasensynthese notwendige 5‘-OH-Schutzgruppe (DMTr),
erfolgen und abschließend die Phosphoramiditfunktion 59 generiert werden.
Zur Anwendung der Buchwald-Hartwig-Reaktion war die Synthese eines allgemeinen
Bausteins 63 notwendig. Hierbei war besonders wichtig, dass die verwendeten
Schutzgruppen nicht nur den Bedingungen der Kupplungsreaktion standhalten
(80 °C und schwach basische Reaktionsbedingungen), sondern auch unter möglichst
milden Bedingungen nach der Kupplung abzuspalten waren. Aufgrund dieser
Voraussetzungen und bereits von S. Gräsl in vergangenen Arbeiten durchgeführten
Synthesen kamen für die beiden Hydroxylgruppen eine Schützung mit tert-
Butyldimethylsilylchlorid als entsprechende Silylether in Frage.[44]
Für die zwingend notwendige Schützung des Amids des Guanosins als Azaenolether
sollte die Benzylgruppe dienen, da diese sich mittels Hydrogenolyse mild abspalten
lässt.
Zunächst musste 2’-Desoxyguanosin 52 an der C8-Position bromiert werden. Die
Reaktion wurde nach P. M. Gannet und T. P. Sura durchgeführt (s. Abb. 19).[68]
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
Br
52 64
NBS, H2O
Rt, 15 min.
79%
Abb. 19 Synthese von 8-Brom-2’-desoxyguanosin (8-Br-dG) 64
Resultate und Diskussion
28
Hierbei wurden feingepulvertes 2’-Desoxyguanosin 52 und N-Bromsuccinimid
vorgelegt, mit Wasser versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das
Produkt konnte nach anschließender Filtration ohne Reinigung in einer Ausbeute von
79% isoliert werden. Allerdings war diese Reaktion nicht auf Mengen über 500 mg
2’-Desoxyguanosin 52 übertragbar, da es dabei zu einer Spaltung der glycosidischen
Bindung kam. Größere Mengen 8-Br-dG 64 waren nur durch Parallelansätze
zugänglich, die dann vereinigt werden konnten.
Der nächste Syntheseschritt bestand darin, die tert-Butyldimethylsilylgruppen an der
3‘- und 5‘-Hydroxylfunktion einzuführen (s. Abb. 20).
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
Br
64
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
Br
65
TBDMSCl,Imidazol,Pyridin
Rt, 1 h
74% Abb. 20 Synthese von 8-Brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 65
Die Synthese wurde analog zu P. B. Hopkins et al. durchgeführt.[69] Zunächst wurden
Imidazol und tert-Butyldimethylsilylchlorid in Pyridin gelöst vorgelegt und
anschließend mit 8-Br-dG 64 versetzt. Nach Aufarbeitung und Reinigung wurde das
Produkt in 74% Ausbeute erhalten.
Anschließend erfolgte die Überführung der Amidfunktion in einen Azaenolether
ebenfalls analog zu Hopkins et al., wobei die Benzylgruppe mittels einer Mitsunobu-
artigen Reaktion mit Benzylalkohol eingeführt werden konnte (s. Abb. 21).[70]
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
Br
65
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
Br
63
Benzylalkohol,PPh3, DIAD,1,4-Dioxan
0 °C -> Rt, 1 h
57% Abb. 21 Synthese von O6-Benzyl-8-brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63
Resultate und Diskussion
29
Bei der Reaktion wurden 8-Brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin
65 und Triphenylphosphin in 1,4-Dioxan mit Benzylalkohol und
Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) versetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur und
abschließender Aufarbeitung konnte das Produkt und damit der Ausgangsstoff für die
Buchwald-Hartwig-Kupplung mit einer Ausbeute von 57% isoliert werden.
Mit dieser Ausgangsverbindung 63 konnte nun die Buchwald-Hartwig-Reaktion
durchgeführt werden (s. Abb. 22).
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
Br
63
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
66-72
Aryl
Pd2(dba)3, rac-BINAP,K3PO4, Aryl-NH2,1,2-DME
80 °C, 55-84 h
55-91% Abb. 22 Einführung der C8-Arylamin-Modifikationen zu den Produkten 66-72
Der Palladium-Katalysator, rac-BINAP und Kaliumphosphat wurden unter Stickstoff
eingewogen und anschließend mit O6-Benzyl-8-brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-
2’-desoxyguanosin 63, absolutem 1,2-Dimethoxyethan (1,2-DME) und dem
entsprechenden Arylamin versetzt. Die Reaktionsmischungen wurden für 55-84 h bei
80 °C gerührt. Die Produkte 66-72 konnten nach Aufarbeitung und
säulenchromatographischer Reinigung in einer Ausbeute von 55-91% isoliert werden
(s. Tab. 2).
Produkt Aryl Reaktionszeit Ausbeute
66 Phenyl 70 h 64%
67 4-Methoxyphenyl 70 h 62%
68 4-Methylphenyl 70 h 75%
69 4-Cyanophenyl 84 h 55%
70 3,5-Dimethylphenyl 72 h 66%
71 4-Biphenyl 55 h 65%
72 2-Fluorenyl 78 h 91% Tab. 2 Zusammenfassung aller Adduktsynthesen zu den Produkten 66-72
Resultate und Diskussion
30
Eine Ausbeutesteigerung durch eine Vorreaktion des Katalysators mit dem Liganden
konnte nicht beobachtet werden.
Der Mechanismus dieser Kupplungsreaktion ist noch nicht vollständig geklärt, wurde
aber von S. L. Buchwald et al. postuliert und konnte auf die hier durchgeführte
Arylaminierung der C8-Position übertragen werden (s. Abb. 23).[71]
Pd2(dba)3 + BINAP
(BINAP)Pd(dba)
(BINAP)Pd(0)
NN
NOBn
NH2O
OTBDMS
NTBDMSOBr
NN
NOBn
NH2
O
OTBDMS
N
TBDMSO
PdPP
Br(+II)
NN
NOBn
NH2
O
OTBDMS
N
TBDMSO
PdBr
NH2
Ar
P
P
+-
NN
NOBn
NH2
O
OTBDMS
N
TBDMSO
PdPP
NH(+II)
Ar
Ar-NH2
K3PO4
K2HPO4 + KBr
NN
NOBn
NH2O
OTBDMS
NTBDMSOHN
Ar
I
II
III
IV
V
Abb. 23 Postulierter Mechanismus der Buchwald-Hartwig-Reaktion
Die Pd-katalysierte Arylaminierung verläuft wahrscheinlich über die oxidative Addition
des Arylbromids I an die Pd0-Spezies (BINAP)Pd0, welches sich aus Pd2(dba)3 (Tris-
Dibenzylidenacetondipalladium) und rac-BINAP bildet. Das entstehende Pd2+-
Intermediat II bildet durch die Koordination des verwendeten Arylamin die trigonal-
bipyramidale Verbindung III. Durch Deprotonierung mit der zugesetzten Base
Resultate und Diskussion
31
entsteht die Verbindung IV, die durch reduktive Eliminierung neben dem
gewünschten Arylaminaddukt V den Pd0-Katalysator zurückbildet.
Um nun, ausgehend von den vollgeschützten Addukten 66-72, die Synthese der
Oligonucleotidbausteine vorzunehmen, mussten zunächst die Benzylgruppe sowie
die Hydroxylschutzgruppen abgespalten, die exocyclische Aminofunktion mit einer
basenlabilen Schutzgruppe, sowie die 5’-O-Position mit der Dimethoxytritylfunktion
(DMTr) geschützt und abschließend die Reaktion zu den entsprechenden
Phosphoramiditen durchgeführt werden.
Die zunächst durchgeführte Debenzylierung wurde durch Lösen des entsprechenden
C8-Adduktes in Methanol und Zugabe von Palladium auf Aktivkohle bei
anschließendem Rühren unter einer Wasserstoff-Atmosphäre erreicht (s. Abb. 24).
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
66-72
Aryl NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
73-79
ArylPd/C, H2, MeOH
Rt, 4-48 h
78-96% Abb. 24 Debenzylierung der C8-Arylamin-Addukte 66-72
Die entsprechenden Produkte 73-79 konnten dabei nach Reaktionszeiten von 4-48 h
in zufriedenstellenden Ausbeuten von 78-96% durch mehrmaliges Zentrifugieren und
Waschen des Katalysators mit Methanol ohne weitere Aufarbeitung in reiner Form
erhalten werden (s. Tab. 3).
Produkt Aryl Reaktionszeit Ausbeute
73 Phenyl 24 h 90%
74 4-Methoxyphenyl 4 h 96%
75 4-Methylphenyl 4 h 85%
76 4-Cyanophenyl 16 h 95%
77 3,5-Dimethylphenyl 12 h 78%
78 4-Biphenyl 16 h 93%
79 2-Fluorenyl 48 h 84% Tab. 3 Zusammenfassung aller durchgeführten Debenzylierungen
Resultate und Diskussion
32
Der nächste Syntheseschritt bestand in der Deblockierung der beiden
Hydroxylgruppen. Hierbei konnte ich in vorangegangenen Arbeiten während meiner
Diplomarbeit zeigen, dass die Verwendung von Tetrabutylammoniumfluorid zu einer
Dearylierung führt. Eine milde Abspaltung konnte jedoch durch die Verwendung von
Triethylamin-Trihydrofluorid in Gegenwart von Triethylamin erreicht werden (s. Abb.
25).[67]
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
73-79
Aryl NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
HN
80-86
ArylEt3N*3HF,Et3N, DCM,THF
Rt, 2-12 h
61-96% Abb. 25 Desilylierung der C8-Addukte 73-79
Hierzu wurden die entsprechenden Addukte 73-79 in THF/DCM (1:1 v/v) gelöst, bei
Raumtemperatur mit 10 Äquivalenten Triethylamin und 12.5 Äquivalenten
Triethylamin-Trihydrofluorid versetzt und für 2-12 Stunden gerührt. Die
entsprechenden Produkte 80-86 konnten nach chromatographischer Reinigung (zur
Abtrennung gebildeter Triethylammonium-Salze waren bis zu 3 Trennungen
erforderlich) mit Ausbeuten von 61-96% erhalten werden (s. Tab. 4).
Produkt Aryl Reaktionszeit Ausbeute
80 Phenyl 3 h 78%
81 4-Methoxyphenyl 2 h 96%
82 4-Methylphenyl 4 h 89%
83 4-Cyanophenyl 3 h 88%
84 3,5-Dimethylphenyl 12 h 79%
85 4-Biphenyl 3 h 94%
86 2-Fluorenyl 5 h 61% Tab. 4 Zusammenfassung aller durchgeführten Desilylierungen zu den entschützten Addukten 80-86
Resultate und Diskussion
33
Die geringere Ausbeute bei der Darstellung der komplett entschützten Addukte 80,
84 und 86 ist möglicherweise auf die niedrige Stabilität dieser Verbindungen
gegenüber den anderen Addukten zurückzuführen. So konnte eine deutliche
Verfärbung der erhaltenen Feststoffe innerhalb von wenigen Minuten an der Luft
beobachtet werden. Die mehrmalige säulenchromatographische Reinigung kann
somit mögliche Ausbeuteverluste erklären. Eine direkte Umsetzung (ohne
säulenchromatographische Abtrennung der Salze) der entschützten Addukte 80-86,
in der folgenden Schützung der exocyclischen Aminofunktion mit Formamidin, könnte
diese Verluste verhindern. Für die Schützung der NH2-Gruppe wurden in
vorangegangenen Arbeiten Versuche unternommen die Phenoxyacetyl-Funktion
einzuführen.[67] Da diese Versuche nicht erfolgreich verliefen, wurde auf die bereits
von Rizzo verwendete Formamidin-Gruppe zurückgegriffen.[45] Diese ist unter
basischen Bedingungen (konz. Ammoniak) innerhalb von 2 h bei 45 °C abspaltbar
und sollte eine schnellere Entschützung nach der Oligonucleotid-Synthese und damit
eine Steigerung der Ausbeute der modifizierten Oligonucleotide im Vergleich zu der
bislang verwendeten isoButyryl-Strategie ermöglichen.
Die selektive Schützung der exocyclischen Aminofunktion der entschützten Addukte
80-86 konnte durch die Reaktion mit Dimethylformamiddiethylacetal in Pyridin bei
Raumtemperatur innerhalb von 24-72 h erreicht werden (s. Abb. 26).
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
HN
80-86
Aryl NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
87-93
ArylDimethylformamid-diethylacetal,Pyridin
Rt, 24-72 h
47-94%
N(Me)2
Abb. 26 Formamidin-Schützung der C8-Addukte 80-86
Die entsprechenden geschützten Addukte 87-93 konnten dabei in Ausbeuten von 47-
94% isoliert werden (s. Tab. 5, S. 34).
Resultate und Diskussion
34
Produkt Aryl Reaktionszeit Ausbeute
87 Phenyl 24 h 67%
88 4-Methoxyphenyl 24 h 81%
89 4-Methylphenyl 24 h 68%
90 4-Cyanophenyl 24 h 91%
91 3,5-Dimethylphenyl 72 h 47%
92 4-Biphenyl 24 h 94%
93 2-Fluorenyl 24 h 60% Tab. 5 Zusammenfassung aller durchgeführten Formamidin-Schützungen
Auch hier ist die vermeintliche Instabilität der Edukte eine Erklärung für die teilweise
nicht zufriedenstellenden Ausbeuten. Eine alternative, schnellere Umsetzung der
Addukte zu den geschützten Produkten 87-93 in Methanol unter Refluxbedingungen
für eine Stunde führte nicht zum Erfolg, vielmehr war eine Zersetzung der Edukte 80-
86 zu beobachten.
Um erste Informationen über den Einfluss der Modifikation auf die Struktur zu
erhalten, konnte mit den stabilen Produkten 87-93 eine Konformationsanalyse mittels
NOESY-Spektroskopie durchgeführt werden. Mit Hilfe der beobachteten NOE-Effekte
ist es möglich die Stellung der modifizierten Guanosin-Basen zu bestimmen. Sollte
die anti-Stellung auch bei den Addukten vorliegen, so würde man einen NOE-Effekt
zwischen der 5‘-Hydroxygruppe und dem NH-Proton des jeweiligen Arylamin
erwarten. Dieses lässt sich anhand der aufgenommenen Spektren bestätigen. In
Abbildung 27, S. 35 sind exemplarisch die relevanten Kopplungen der NOESY-
Spektren des Anilin-modifizierten Adduktes 87 und des 4-Aminobiphenyl-
modifizierten Adduktes 92 dargestellt. Diese bestätigen das Vorliegen einer anti-
Stellung. Bei einer durch die Modifikation verursachte syn-Stellung würde ein solcher
NOE-Effekt zwischen dem NH-Proton und der 5‘-OH-Gruppe nicht zu beobachten
sein, vielmehr müsste eine Kopplung des α-Protons der Formamidin-Schutzgruppe
zu eben dieser 5‘-OH-Gruppe gemessen werden können, was jedoch in keinem Fall
zu beobachten war.
Resultate und Diskussion
35
ppm (t2)8.508.608.708.808.90
5.850
5.900
5.950
6.000
6.050
ppm (t1
ppm (t2)8.5008.5508.6008.6508.7008.750
5.800
5.850
5.900
5.950
ppm (t1
5'-OH 5'-OH
NH-Anilin H-α NH-4-Amino- biphenyl
H-α
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
87
N(Me)2
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
92
N(Me)2
α α
Abb. 26 relevante Kopplungen der NOESY-Spektren des Anilin-modifizierten Addukt 87 und des 4-
Aminobiphenyl-modifizierten Addukt 92
Da aus den gemessenen Spektren, wie zu erwarten war, eine räumliche Nähe des
Arylamin-NH der modifizierten Nucleobase zu der 5‘-Hydroxyfunktion zu erkennen
ist, sollte im Folgenden der Einfluss einer Phosphatgruppe an der 5‘-Position auf die
Stellung der Base untersucht werden. Die hierüber erhaltenen Daten könnten dabei
Aufschluss geben, ob bei den dargestellten Addukten eine Umwandlung in eine syn-
Konformation innerhalb eines Oligonucleotidstranges vorliegen könnte.
Die Synthese der C8-Arylamin-modifizierten 5‘-Monophosphate sollte zunächst
analog zu der von Moffat etablierten Methode erfolgen (s. Abb. 27).[72]
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
87
N(Me)2
NH
N
N
O
NN
O
OH
O
HN
94
N(Me)2POO
OPOCl3, Pyridin,H2O, MeCN
0 °C -> Rt, 4- 24 h
Abb. 27 Versuch der C8-Anilin-modifizierten 5‘-Monophosphat-Synthese nach Moffat
Resultate und Diskussion
36
Nach der Herstellung des Phosphatylierungsreagenz aus Phosphorylchlorid, Wasser
und Pyridin bei 0 °C wurde das entschützte Anilin-modifizierte C8-Addukt 87 in situ
zu der Reaktionslösung gegeben und die Lösung bei Raumtemperatur gerührt. Nach
der für solche Umsetzungen typischen Reaktionszeit von 4 Stunden konnte jedoch
keine Umsetzung beobachtet werden und das Edukt nach Aufarbeitung und
Reinigung wieder reisoliert werden. Bei einem analog durchgeführten Versuch mit
einer Reaktionszeit von 24 Stunden konnte dünnschichtchromatographisch kein
Edukt mehr detektiert werden. Nach anschließender hydrolytischer Aufarbeitung,
Neutralisation mit Ammoniumhydrogencarbonat und RP-Säulenchromatographie
konnten jedoch nur nicht identifizierbare Zersetzungsprodukte isoliert werden.
Eine weitere Möglichkeit, Zugang zu modifizierten 5‘-Monophosphaten zu erlangen,
ist die selektive Hydrolyse von cycloSal-Phosphattriestern. Zur Darstellung dieser
Verbindungen sind zwei Synthesewege denkbar. Zum Einen die Kupplung eines
cycloSaligenylchlorphosphits mit dem modifizierten Nucleosid und anschließender
Oxidation zum entsprechenden cycloSal-Phosphattriester. Zum Anderen ist die
Darstellung eines cycloSaligenylchlorophosphidates möglich, welches analog zu der
von O. Ludek entwickelten Methode ohne einen folgenden Oxidationsschritt direkt
zum entsprechenden cycloSal-Phosphattriester mit dem Nucleosid gekuppelt werden
kann.[73]
Bereits 1990 publizierten Johnson et al. die starke Oxidationsempfindlichkeit solcher
C8-Arylamin-modifizierten 2‘-dG Addukte.[74,75] Aus diesem Grund wurde hier die
gewünschte Darstellung C8-Arylamin-modifizierter cycloSal-Phosphattriester mittels
der zweiten Route versucht, um den Oxidationsschritt mit tert-Butylhydroperoxid oder
Oxon und die mögliche oxidative Spaltung zu vermeiden.
Die Kupplungsreaktion sollte ausgehend vom Addukt 88 durch langsame Zugabe bei
-40 °C eines von S. Warnecke im Rahmen ihrer Dissertation synthetisierten
cycloSaligenylchlorophosphidates 95 erfolgen (s. Abb. 28, S. 37).[76]
Resultate und Diskussion
37
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
88
N(Me)2
O
ClO
OP
O
Cl
95
NH
N
N
O
NN
O
OH
O
HN
96
N(Me)2
O
PO
O
ClO
Pyridin,Toluol
- 40 °C, 5 h
Abb. 28 Versuch der Darstellung des C8-4-Methoxyanilin-modifizierten cycloSal-Phosphattriesters 96
Nach einer Reaktionszeit von 5 Stunden bei -40 °C konnte jedoch dünnschicht-
chromatographisch kein Umsatz beobachtet werden. Ein anschließendes Erwärmen
auf Raumtemperatur führte zu einer Zersetzung des Eduktes 95.
Da es auf den durchgeführten Wegen nicht möglich war, die 5‘-Phosphatfunktion
nach der Einführung der C8-Arylaminmodifikation zu generieren, scheint der einzige
Zugang zu solchen Monophosphaten eine Kreuzkupplungsreaktion mit einem
geschützten, an 5‘-Position bereits phosphoryliertem, Nucleosid zu sein. Allerdings
müsste eine geeignete Schutzgruppenstrategie für die Phosphatgruppe für eine
durchzuführende Kreuzkupplung etabliert werden. Diese Versuche wurden nicht
mehr im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt.
Die erhaltenen entschützten Addukte 87-93 wurden im Folgenden zu den
geschützten Bausteinen für die Oligonucleotidsynthese umgesetzt.
Zunächst musste die 4,4’-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe (DMTr) an der primären
Hydroxylgruppe eingeführt werden (s. Abb. 29, S. 38).
Resultate und Diskussion
38
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
87-93
Aryl
N(Me)2
NH
N
N
O
NN
O
OH
DMTrO
HN
97-103
Aryl
N(Me)2
DMTrCl,Pyridin
Rt, 3.5-12 h
45-84%
Abb. 29 DMTr-Schützung der C8-Addukte 87-93
Die Edukte 87-93 wurden jeweils in absolutem Pyridin gelöst und mit zwei
Äquivalenten 4,4’-Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) versetzt und bei Raumtemperatur
gerührt. Nach Aufarbeitung sowie chromatographischer Reinigung konnten die
entsprechenden Produkte 97-103 in Ausbeuten von 45-84% isoliert werden
(s. Tab. 6).
Produkt Aryl Reaktionszeit Ausbeute
97 Phenyl 3.5 h 79%
98 4-Methoxyphenyl 3.5 h 79%
99 4-Methylphenyl 5 h 81%
100 4-Cyanophenyl 3.5 h 45%
101 3,5-Dimethylphenyl 12 h 82%
102 4-Biphenyl 3.5 h 84%
103 2-Fluorenyl 3.5 h 78% Tab. 6 Zusammenfassung aller durchgeführten DMTr-Schützungen
An die Dimethoxytritylierung schloss sich die Überführung in das entsprechende
Phosphoramidit an.
Das benötigte Phosphitylierungsreagenz, Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-
phosphit 107, wurde zunächst in zwei Schritten aus Phosphortrichlorid 104, 3-
Hydroxypropionsäurenitril 105 und N,N’-Diisopropylamin dargestellt (s. Abb. 30, S.
39).[77]
Resultate und Diskussion
39
PCl3 HOCN P
Cl
ClO
CNPyridin,Diethylether
- 78 °C -> Rt, 12 h
Diisopropylamin,Diethylether
- 10 °C -> Rt, 12 h
PN
NO
CN
104 105 106 107
41%
Abb. 30 Synthese von Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107
Phosphortrichlorid 104 wurde hierbei zunächst in einem Lösungsmittelgemisch aus
absolutem Pyridin und absolutem Diethylether gelöst, bei – 78 °C tropfenweise mit
3-Hydroxypropionsäurenitril 105 versetzt und für 14 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Das nach Filtration erhaltene Rohprodukt 106 wurde direkt in absolutem
Diethylether aufgenommen und bei – 10 °C mit N,N’-Diisopropylamin versetzt. Nach
Aufarbeitung und anschließender Destillation konnte das Produkt 107 in einer
Ausbeute von 41% über beide Stufen erhalten werden.
Das so erhaltene Phosphitylierungsreagenz 107 konnte nun zur Umsetzung mit den
DMTr-geschützten Addukten 97-103 eingesetzt werden (s. Abb. 31).
NH
N
N
O
NN
O
OH
DMTrO
HN
97-103
Aryl
N(Me)2
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
HN
108-114
Aryl
N(Me)2
PO N(iPr)2
NC
107, DCI,DCM, MeCN
Rt, 1 h
47-100%
Abb. 31 Synthese der Arylamin-modifizierten Phosphoramidite 108-114
Die DMTr-geschützten Addukte 97-103 wurden jeweils mit Dichlormethan
coevaporiert, in Dichlormethan/Acetonitril gelöst und zunächst mit 4,5-
Dicyanoimidazol (DCI) und anschließend tropfenweise mit 1.5 Äq. Bis-N,N’-
Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 versetzt. Nach wässriger Aufarbeitung
mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung und chromatographischer Reinigung mit
Dichlormethan/Methanol (0-2%) über Aluminiumoxid (Neutral, Aktivitätsstufe 3)
Resultate und Diskussion
40
wurden die entsprechenden Phosphoramidite von den ebenfalls entstehenden H-
Phosphonaten mit Ausbeuten von 47-100% abgetrennt (s. Tab. 7, S. 40).
Produkt Aryl Ausbeute
108 Phenyl 61%
109 4-Methoxyphenyl 61%
110 4-Methylphenyl 68%
111 4-Cyanophenyl 47%
112 3,5-Dimethylphenyl 97%
113 4-Biphenyl 60%
114 2-Fluorenyl 100% Tab. 7 Zusammenfassung aller durchgeführten C8-Arylamin-modifizierten Phosphoramiditsynthesen
Die Phosphoramidite wurden anschließend jeweils nach Abkondensierung aus
Benzol als farblose Schäume erhalten.
14
8.
93
00
14
8.
86
90
( p p m)- 1 4 0- 1 0 0- 6 0- 2 02 06 01 0 01 4 01 8 02 2 0
Abb. 32 exemplarisch abgebildetes 31P-NMR des C8-Arylamin-modifizierten Phosphoramidites 110
Aus dem 31P-NMR des Phosphoramidites 110 (s. Abb. 32) ist die Reinheit zu
erkennen, da außer den beiden Diastereomeren weder das
Resultate und Diskussion
41
Phosphitylierungsreagenz 107 (bei einer chemischen Verschiebung von 123.34 ppm)
noch die entsprechenden H-Phosphonate (bei -5 – 20 ppm) zu erkennen sind. Die
Phosphoramidite sind an der Luft einige Tage stabil und können unter Stickstoff im
Tiefkühlschrank mehrere Monate gelagert werden. Diese, im Gegensatz zu den von
Rizzo et al. synthetisierten C8-IQ-modifizierten Phosphoramiditen in Acetonitril
ausgezeichnet löslichen modifizierten Phosphoramidite, lagen nun als Bausteine für
die Festphasensynthese modifizierter Oligonucleotide vor.
Neben den hier synthetisierten Arylamin-modifizierten C8-Addukten des 2‘-
Desoxyguanosins kommen weiteren Addukten eine Bedeutung in der chemischen
Carcinogenese zu (s. Abb. 5, S. 9). Diese an der N2- sowie O6-Position gebildeten
Addukte und deren Phosphoramidite sind bislang chemisch noch nicht zugänglich
gewesen, so dass ein gezielter Einbau in Oligonucleotide und damit eine gezielte
Untersuchung der Auswirkungen solcher Modifikationen auf die Eigenschaften des
DNA-Duplex noch nicht möglich waren. Im Folgenden sollen die Syntheseversuche
zur Darstellung dieser Adduktformen und die Überführung in die entsprechenden
Phosphoramidite beschrieben werden.
4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine
Die Darstellung der N2-Arylamin-modifizierten Phosphoramidite 115 sollte ausgehend
vom 2‘-Desoxyguanosin 52 erfolgen. Es sollte zunächst eine Überführung wiederum
in einen an der O6-Position sowie den beiden Hydroxyfunktionen geschützten
Baustein 117 erfolgen. Dieser sollte an der 2-Position eine funktionelle Gruppierung
besitzen, die es ermöglichen sollte, die gewünschte Modifikation einzuführen und das
Addukt 116 darzustellen (s. Abb. 33, S. 42). Die im Einzelnen gewählten
funktionellen Gruppen und die damit verbundenen Synthesewege sollen im
Folgenden diskutiert werden.
Resultate und Diskussion
42
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
52
N
N
N
OBn
FGN
O
OTBDMS
TBDMSO
117FG: NH2, OTf, Br
N
N
N
OBn
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
116
HN
ArylNH
N
N
O
NH
N
O
O
DMTrO
115
HN
Aryl
PO
NCN(iPr)2
Abb. 33 allgemeines Retrosynthesschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite
4.2.1 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Azokupplung
Bei dem zunächst gewählten Syntheseweg sollte das N2-Arylamin-modifizierte
Addukt 118 ausgehend vom Bis-TBDMS-geschützten 2‘-Desoxyguanosin 121
dargestellt werden (s. Abb. 34, S. 43). Nach erfolgreicher Schützung sollte die
Modifikation durch eine Kupplung mit der entsprechend hergestellten Nitrosoaryl-
Verbindung 120 eingeführt werden. Das entstehende Addukt 119, mit einer N-N-
Doppelbindung, könnte anschließend selektiv zum Produkt 118 reduziert (analog zu
einer an Azobenzen bekannten Reduktion) werden. Vorteil dieser Synthese wäre die
einfache Zugänglichkeit des Nucleosidbausteins 121, die kurze Synthesesequenz
und das Vorliegen eines zweiten, in der Carcinogenese eine Rolle spielenden, N2-
Adduktes 119. Dieses könnte ebenfalls in das entsprechende Phosphoramidit
überführt und als Baustein für die Oligonucleotidsynthese verwendet werden.
Resultate und Diskussion
43
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
NO
120
NH
N
N
O
NN
O
OTBDMS
TBDMSO
119
NNH
N
N
O
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
118
HN
Abb. 34 Retrosynthesschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Azokupplung
Die für die Azokupplung benötigten beiden Edukte 120 und 121 mussten zunächst
hergestellt werden. Die Darstellung von Nitrosobenzol 120 sollte dabei ausgehend
vom Anilin 1 durch selektive Oxidation erfolgen (s. Abb. 35).
NH2 NO
1 1
H2O2, H2OMoO3, KOH
Rt, 24 h
13% 20
Abb. 35 Darstellung von Nitrosobenzol 120
Die Reaktion wurde analog zu der von Defoin beschriebenen Methode
durchgeführt.[78] Hierfür wurde die Ausgangssubstanz Anilin 1 mit 30%igem H2O2 und
H2O, anschließend mit MoO3 in einer KOH-Lösung versetzt und 24 h bei
Raumtemperatur gerührt. Nach erfolgter Aufarbeitung wurden braune Kristalle mit
einer Ausbeute von 13% erhalten. Die Ausbeute liegt im Vergleich zu den von Defoin
beschriebenen (53-80%) deutlich niedriger, da als Hauptprodukt die Entstehung von
Nitrobenzol beobachtet werden konnte.
Resultate und Diskussion
44
Neben dem Nitrosobenzol 120 sollte als zweites Edukt das 3´,5´-Bis(tert-
butyldimethylsilyl)-2´-desoxyguanosin 121 dargestellt werden (s. Abb. 36).
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
52
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
TBDMSCl,Imidazol, Pyridin
Rt, 14 h
98%
Abb. 36 Darstellung von 3´,5´-Bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxyguanosin 121
Dabei wurde 2´-Desoxyguanosin-Monohydrat als Ausgangssubstanz verwendet, mit
Imidazol in Pyridin suspendiert und anschließend mit TBDMS-Cl versetzt. Die
Reaktion lief innerhalb von 14 h bei Raumtemperatur ab. Nach chromatographischer
Reinigung konnte das Produkt in 98% Ausbeute erhalten werden.
Nach der erfolgreichen Synthese der beiden Kupplungsedukte sollte anschließend
die Umsetzung zu dem gewünschten Produkt 119 erfolgen (s. Abb. 37).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
NO
120
NH
N
N
O
NN
O
OTBDMS
TBDMSO
119
N
Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute
EtOH, Essigsäure Rt 26 h Kein Umsatz
EtOH, Essigsäure 40 °C 26 h Zersetzung
Chloroform Rt 24 h Kein Umsatz Abb. 37 Versuche zur Darstellung des N2-Adduktes 119
Die Syntheseversuche erfolgten dabei analog zu denen in der Literatur
beschriebenen Kupplungen zu verschieden substituierten Azobenzenen.[79-82]
Resultate und Diskussion
45
Bei den durchgeführten Reaktionen konnte jedoch in keinem der Fälle das
gewünschte Produkt isoliert werden. Bei der Umsetzung der Edukte 120 und 121 in
Ethanol unter Zugabe von Essigsäure bei Raumtemperatur konnte
dünnschichtchromatographisch keine Umsetzung detektiert werden. Bei einer
Durchführung der Reaktion bei 40 °C wurde eine Spaltung der glycosidischen
Bindung beobachtet und es konnten lediglich Zersetzungsprodukte isoliert werden.
Ebenfalls keine Umsetzung konnte bei der analog zu der von Yunes et al.
durchgeführten Azokupplung in Chloroform bei Raumtemperatur beobachtet
werden.[82]
Da durch die beschriebenen Versuche gezeigt werden konnte, dass die
gewünschten N2-Addukte mittels Azokupplung nicht zugänglich sind, wurde im
Folgenden ein alternativer Syntheseweg durchgeführt, bei dem die Einführung der
Arylaminmodifikation mittels Substitution erfolgen sollte.
4.2.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Substitution
Bei diesem Syntheseweg sollte die Einführung der Arylaminmodifikation an der N2-
Position analog zu der von Boche für modifizierte 3‘-Monophosphate durchgeführten
Substitution eines Triflat-Intermediats 123 mit einem Arylhydrazin erfolgen (s. Abb.
38, S. 46).[49] Das Intermediat 123 musste dafür zunächst aus dem geschützten
Xanthosin-Derivat 124 hergestellt werden, welches aus dem entsprechenden
geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40 generiert werden sollte. Als
Schutzgruppen sollten dabei die schon bei den C8-Addukten erfolgreich etablierten
TBDMS-Gruppen (für die Hydroxyfunktionen) und die Benzylgruppe für die O6-
Position dienen, welche zunächst ausgehend vom 2‘-Desoxyguanosin eingeführt
werden sollten.
Resultate und Diskussion
46
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
40
N
NH
N
OBn
N
O
OTBDMS
TBDMSO
124
O
N
N
N
OBn
N
O
OTBDMS
TBDMSO
123
OTf
N
N
N
OBn
N
O
OTBDMS
TBDMSO
122
NH
HN
Abb. 38 Retrosyntheseschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Substitution
Die Darstellung des 3´,5´-Bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxyguanosin 121 erfolgte
wie in Abb. 36, S. 44 gezeigt. Anschließend erfolgte die Schützung der O6-Position
mittels der Benzylschutzgruppe zum Produkt 40 (s. Abb. 39).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
40
Benzylalkohol,PPh3, DIAD,1,4-Dioxan
Rt, 1 h
68%
Abb. 39 Darstellung des geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivates 40
Die Reaktion wurde analog zu der Benzylschützung des C8-bromierten 2‘-
Desoxyguanosin-Derivates 65 durchgeführt. Dabei konnte nach einer Reaktionszeit
von einer Stunde bei Raumtemperatur und anschließender
Resultate und Diskussion
47
säulenchromatographischer Reinigung das Produkt 40 mit einer Ausbeute von 68%
(10% höher als bei der bromierten Verbindung 63) erhalten werden.
Anschließend sollte die Überführung in das entsprechende Xanthosin-Derivat 124
erfolgen. Für diesen Syntheseschritt erfolgten drei alternative Umsetzungen, um eine
möglichst effektive Methode zur Darstellung der gewünschten Verbindung zu
erhalten (s. Abb. 40).
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
40
N
NH
N
OBn
N
O
OTBDMS
TBDMSO
124
O
Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute
tertButylnitrit 0 °C 5 min. 9%
Na2Fe(CN)5NO*2H2O, NaOH 70 °C 4 h ---
Aceton, H2O, HClO4, NaNO2, DCM 10 °C 1 h 6% Abb. 40 Zusammenfassung der Darstellungen des Xanthosin-Derivates 124
Die Synthese wurde zunächst analog zu der von Boche für das geschützte
Monophosphat 45 beschriebenen Methode durchgeführt. Hierbei wurde das Produkt
124 durch Reaktion der Ausgangssubstanz 40 mit tertButylnitrit innerhalb von 5
Minuten bei 0 °C erhalten.[49] Das Produkt konnte nach Aufarbeitung und Reinigung
jedoch nur, im Gegensatz zu den 25% von Boche, mit einer Ausbeute von 9% isoliert
werden.
Eine alternative Umwandlung aus dem geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40 in
das Produkt 124 unter der Verwendung von Dinatriumpentacyanonitrosoferrat(II)-
dihydrat unter alkalischen Bedingungen bei 70 °C, wie von Keefer et al. für 2’-dG 52
beschrieben, führte zu keiner Umsetzung des Eduktes.[83]
Eine weitere Möglichkeit zur Darstellung des gewünschten Produktes 124 schien die
Umsetzung nach Pfleiderer et al..[84] Hierzu wurde das Edukt O6-Benzyl-3´,5´-bis-
(TBDMS)-2´-dG 40 in Aceton und Wasser gelöst und mit 70%iger HClO4 und NaNO2
Resultate und Diskussion
48
bei 10 °C versetzt und 1 h gerührt. Nach anschließender Aufarbeitung wurde das
Produkt mit einer Ausbeute von 6% erhalten.
Insgesamt ließ sich in keiner der durchgeführten Synthesemethoden eine
zufriedenstellende Ausbeute erreichen, was somit eine Schwierigkeit zur Darstellung
größerer Mengen des Produktes 124 darstellt.
Die aus den verschiedenen Synthesen vereinigten Produktmengen des geschützten
Xanthosin-Derivates 124 wurden anschließend zum Triflat-Intermediat 123
umgesetzt (s. Abb. 41). Dabei wurde ebenfalls auf die von Boche beschriebene
Methode zurückgegriffen.[49]
N
NH
N
OBn
N
O
OTBDMS
TBDMSO
124
O
N
N
N
OBn
N
O
OTBDMS
TBDMSO
123
OTfEt3N, DMAP, DCM, Tf2O
0 °C, 30 min.
37%
Abb. 41 Darstellung des Triflat-Intermediats 123
Es wurde dabei das Edukt 124 mit Triethylamin und einer katalytischen Menge 4-
(Dimethylamino)-pyridin (DMAP) in Dichlormethan versetzt und auf 0 °C gekühlt.
Anschließend erfolgten die Zugabe von Trifluormethansulfonsäureanhydrid und das
Rühren für 0.5 h bei dieser Temperatur. Nach der folgenden Reinigung wurde das
Produkt in 37% Ausbeute erhalten und stand somit für die Umsetzung mit
entsprechenden Arylhydrazinen zur Verfügung.
Die für eine solche Substitution benötigten monocyclischen Arylhydrazine sind als
entsprechende Hydrochloride kommerziell erhältlich. Da die Darstellung
polycyclischer Arylaminmodifikationen an der N2-Position ebenfalls ein Ziel war,
mussten die entsprechenden Arylhydrazine zunächst dargestellt werden (s. Abb. 42).
NH2
2
HN
125
NH2
1) NaNO2, HCl,H2O, SnCl22) konz. NH3
-10 °C, 4 h
80% Abb. 42 Darstellung von 4-Hydrazinobiphenyl 125
Resultate und Diskussion
49
Die Synthese von 4-Hydrazinobiphenyl erfolgte analog zu der von Müller
beschriebenen Methode.[85] Dabei wurde 4-Aminobiphenyl 2 zunächst in Wasser und
konz. Salzsäure suspendiert und bei –10 °C mit Natriumnitrit versetzt. Nach
anschließender Reduktion des entstehenden Diazoniumsalzes mittels Zinn(II)chlorid
konnte das Produkt als Hydrochlorid isoliert werden. Zur Darstellung des instabilen
freien Hydrazins 125 wurde das Hydrochlorid basisch mit Diethylether extrahiert und
nach dem Einengen in reiner Form mit einer Ausbeute von 80% erhalten. Mittels
dieser Methode konnte ebenfalls das entsprechende Fluorenyl-Derivat dargestellt
werden (s. S. 223).
Für die Umsetzung zu dem gewünschten N2-Addukt, ausgehend vom Triflat-
Intermediat 123, wurde zunächst das kommerziell erworbene Phenylhydrazin nach
der von Boche beschriebenen Methode verwendet (s. Abb. 43).[49]
N
N
N
OBn
N
O
OTBDMS
TBDMSO
123
OTf
N
N
N
OBn
N
O
OTBDMS
TBDMSO
122
NH
HNPhenylhydrazin,
DMF
Rt, 10 d
(53%)
Abb. 43 Erste Darstellung des N2-Arylhydrazino-Adduktes 122
Hierbei wurde das Triflat-Intermediat 123 mit Phenylhydrazin in DMF versetzt und 10
Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach der entsprechenden Aufarbeitung konnte
mit einer Ausbeute von 53% ein Produktgemisch erhalten werden. Zwar zeigten die
NMR-Messungen das gewünschte Produkt, jedoch lag dieses in einer nicht
trennbaren Mischung verschiedener nicht identifizierbarer Produkte nur zu ca. 10%
vor, weshalb eine genaue Ausbeutebestimmung für die durchgeführte
Substitutionsreaktion nicht möglich ist.
Mittels dieser Substitution ist es möglich, die gewünschte N2-Modifikation am
2‘-Desoxyguanosin einzuführen, jedoch ist es aufgrund der geringen Ausbeuten nicht
durchführbar größere Mengen der Addukte herzustellen, welche für eine weitere
Umsetzung zu den entsprechenden Phosphoramiditen nötig wäre.
Eine alternative Darstellung zur Einführung der Arylaminmodifikation sollte analog zu
den synthetisierten C8-Addukten mittels einer Palladium-katalysierten
Resultate und Diskussion
50
Kreuzkupplungsreaktion erfolgen. Die entsprechenden Ergebnisse sollen im
Folgenden aufgezeigt und diskutiert werden.
4.2.3 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Palladium-katalysierter
Kreuzkupplung
Bei diesem Syntheseweg sollte die Einführung der Arylaminmodifikation an der N2-
Position analog zu den C8-Addukten mittels einer Palladium-katalysierten
Kreuzkupplung an einem an der 2-Position bromierten, geschützten
2‘-Desoxyguansoin-Derivat 126 mit einem Arylhydrazin erfolgen (s. Abb. 44).
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
40
N
N
N
OBn
BrN
O
OTBDMS
TBDMSO
126
N
N
N
OBn
N
O
OTBDMS
TBDMSO
122
NH
HN
Abb. 44 Retrosynthesschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Kreuzkupplung
Der Baustein 126 sollte dabei direkt aus dem entsprechenden geschützten
2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40, welches aus den vorangegangenen Versuchen
bereits vorlag, generiert werden. Anschließend sollte eine Buchwald-Hartwig-
Resultate und Diskussion
51
ähnliche Kreuzkupplungsreaktion mit den Arylhydrazinen die Einführung der N2-
Arylamin-Modifikation ermöglichen und das gewünschte Produkt 122 liefern.
Nach der bereits beschriebenen Schützung der beiden Hydroxylgruppen mit TBDMS
sowie der Blockierung der O6-Position mit der Benzylgruppe, sollte eine Methode zur
selektiven Bromierung der 2-Position gefunden werden.
Hierfür wurden drei unterschiedliche Methoden angewendet, um eine möglichst
effiziente Synthese zu entwickeln (s. Abb. 45).
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
40
N
N
N
OBn
BrN
O
OTBDMS
TBDMSO
126
Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute
tert-Butylnitrit, CHBr3 90 °C 30 min. ---
NaNO2, TMSBr, BnBu3NCl, CCl4 0 °C 1.5 h ---
tert-Butylnitrit, CH2Br2, Sb(III)Br3 - 10 °C 1 h 40% Abb. 45 Zusammenfassung der Bromierungsversuche zur Darstellung des Produktes 126
Die Synthese wurde zunächst analog zu der von Nair beschriebenen Methode
durchgeführt.[86] Hierbei sollte das Edukt 40 durch Reaktion mit tertButylnitrit
innerhalb von 30 Minuten bei 90 °C in die Diazonium-Verbindung überführt werden
und anschließend mit einem Bromid des Lösungsmittels Bromoform zum Produkt
126 reagieren. Nach Reinigung des Reaktionsgemisches konnte das Produkt jedoch
nicht isoliert werden. Vielmehr trat hierbei eine Vielzahl nicht identifizierbarer
Produkte auf.
Auch die Umwandlung aus dem geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40 in das
Produkt 126 unter der Verwendung von Trimethylsilylbromid als Bromid-Donor in
Gegenwart von Benzyltributylammoniumchlorid bei einer Temperatur von 0 °C, wie
von Lee et al. beschrieben, führte zu keiner Umsetzung des Eduktes.[87]
Resultate und Diskussion
52
Die Synthese des gewünschten Produktes 126 gelang schließlich durch die
Umsetzung nach Harwood et al..[88] Hierzu wurde das Edukt O6-Benzyl-3´,5´-bis-
(TBDMS)-2´-dG 40 in Dibrommethan bei -10 °C gelöst, mit Antimon(III)-bromid und
tertButylnitrit versetzt und eine Stunde gerührt. Nach anschließender Aufarbeitung
und säulenchromatographischer Reinigung wurde das Produkt mit einer Ausbeute
von 40% erhalten.
Ausgehend von dem dargestellten Baustein 126 sollte nun die Einführung der
Arylaminmodifikation erfolgen. Für die notwendige Kreuzkupplungsreaktion wurde
auf die Bedingungen der C8-Kreuzkupplung zurückgegriffen. Um für diese
Anwendung die optimalen Reaktionsbedingungen zu finden, wurden die
Komponenten Lösungsmittel, Base und Salzzusatz variiert (s. Abb. 46).
N
N
N
OBn
BrN
O
OTBDMS
TBDMSO
126
N
N
N
OBn
N
O
OTBDMS
TBDMSO
122
NH
HN
Pd2(dba)3, rac-BINAP,Phenylhydrazin,Base, LM
Lösungsmittel Base Zusatz (0.2 Äq.) Zeit Ausbeute
Toluol KtOBu --- 24 h ---
1,2-DME K3PO4 --- 48 h (14)
1,2-DME K3PO4 Et3NHCl 24 h (100)
1,2-DME K3PO4 LiCl 24 h (52)
1,2-DME K3PO4 Bu4NCl 24 h (45)
1,2-DME Cs2CO3 Et3NHCl 24 h (56) Abb. 46 Zusammenfassung der Kreuzkupplungen zum Produkt 122
Zunächst wurde die Reaktion in Toluol mit Kaliumtertbutanolat als Base durchgeführt.
Der Palladiumkatalysator wurde dabei mit rac-BINAP und dem Kupplungsedukt 126 in abs. Toluol gelöst. Anschließend erfolgte die Zugabe von Phenylhydrazin und der
Base. Die Reaktionsmischung wurde 24 h bei 80 °C gerührt, wobei eine Zersetzung
des Eduktes dünnschichtchromatographisch beobachtet werden konnte. Da diese
Resultate und Diskussion
53
Beobachtung bereits bei der Verwendung von Kaliumtertbutanolat als Base bei der
durchgeführten C8-Addukt-Synthese gemacht wurde, wurden für die folgenden
Synthesen schwächere Basen, wie Kaliumphosphat und Cäsiumcarbonat gewählt.
Bei der Verwendung von Kaliumphosphat als Base (analoge Bedingungen der C8-
Kreuzkupplung) konnte die Bildung des Produktes dünnschichtchromatographisch
detektiert werden. Nach erfolgter Aufarbeitung und Reinigung konnten allerdings nur
14% eines Produktgemisches erhalten werden. Bei diesem nicht trennbaren
Gemisch handelt es sich um das Produkt 122 und einem Nebenprodukt, welches aus
dem Liganden rac-BINAP entstanden sein könnte, im Verhältnis 2:1. Das
Nebenprodukt wurde jedoch nicht weiter charakterisiert.
Im Jahr 2005 publizierten Cacchi et al. eine Kreuzkupplungsreaktion von Hydrazinen
mit Arylbromiden. Ihnen gelang es durch Addition von Lithiumchlorid als Chlorid-
Donor eine deutliche Steigerung der Ausbeute zu erzielen.[89]
Auch für die hier durchgeführte Kreuzkupplung ließ sich durch Addition von 0.2
Äquivalenten Lithiumchlorid eine Ausbeutesteigerung auf 52% erzielen, wobei
ebenfalls das zuvor beobachtete Produktgemisch im gleichen Verhältnis vorlag.
Neben Lithiumchlorid wurden unter gleichen Bedingungen weitere Zusätze getestet,
welche ebenfalls als Chlorid-Donatoren dienen sollten. Bei der Verwendung von
Tetrabutylammoniumchlorid konnte dabei eine Ausbeute von 45% erzielt werden.
Eine deutliche Steigerung konnte bei der Verwendung von Triethylammoniumchlorid
als Salzzusatz erreicht werden.[90] Nach erfolgter Reinigung konnten 100% des
Produktgemisches erhalten werden. Auch in diesem Fall lag das Produkt 122 und
das Nebenprodukt im zuvor beschriebenen Verhältnis vor.
Die deutliche Ausbeutesteigerung durch die Addition von Chlorid-Ionen kann durch
einen von Amatore postulierten Mechanismus erklärt werden (s. Abb. 46, S. 54).[90]
Beim diesem postulierten Mechanismus geht man von dem bereits in Abb. 23, S. 29
beschriebenen Mechanismus aus. Hier wird zusätzlich ein zweifach negativ
geladener Komplex, welcher durch den Zusatz von Chlorid-Ionen hervorgerufen wird,
angenommen. Durch die Koordination der Chlor-Atome an den 0-wertigen Pd-
Katalysator werden ein Zwei-Zentren-Drei-Elektronen-Übergangszustand und eine
Stabilisierung im jeweiligen Lösungsmittel erreicht. Dieser wird erst durch die
Reaktion mit dem Edukt I aufgelöst. Durch diese Stabilisierung wird möglicherweise
Resultate und Diskussion
54
ein anderer Reaktionsweg eingeschlagen, wodurch die Ausbeute des Produktes
gesteigert werden kann.
Pd2(dba)3 + BINAP
(BINAP)Pd(dba)
(BINAP)Pd(0)
NN
NOBn
BrO
OTBDMS
NTBDMSO
NN
NOBn
Pd
O
OTBDMS
N
TBDMSO(+II)N
N
NOBn
Pd
O
OTBDMS
N
TBDMSO
+-
NN
NOBn
O
OTBDMS
N
TBDMSO
Ar-NH-NH2
K3PO4
K2HPO4 + KBr
NN
NOBn
NH-NH-ArO
OTBDMS
NTBDMSO
I
II
III
IV
V
PBr
PNH2-NH-Ar
Br
PP
Pd(+II)
PNH-NH-Ar
P
(Et)3N Cl
PdP
P
0
Cl
Cl
PdP
P
0
-2
Abb. 46 Postulierter Mechanismus der Buchwald-Hartwig-Reaktion mit Zusatz von (Et)3N+Cl- nach C. Amatore
Resultate und Diskussion
55
Eine weitere Optimierung der Salzzusatzkonzentration (0.1, 0.5, 1, 2 Äquivalente)
brachte keine Steigerung der Ausbeute bzw. eine Verschiebung des Verhältnisses im
Produktgemisch.
Auch die unter optimierten Bedingungen durchgeführte Verwendung von
Cäsiumcarbonat als Base führte zu keiner weiteren Verbesserung (56% Ausbeute
des beschriebenen Produktgemisches).
Nach erfolgter Kupplung, sollte nun die Umsetzung des Produktgemisches zum
entsprechenden Phosphoramidit erfolgen. Diese Umsetzung sollte analog zu den
bereits durchgeführten Synthesen zu den C8-Arylamin-modifizierten
Phosphoramiditen 108-114 erfolgen.
Zunächst erfolgte die Debenzylierung in O6-Position mit Hilfe von Pd/C unter einer
H2-Atmosphäre (s. Abb. 47).
N
N
N
OBn
N
O
OTBDMS
TBDMSO
122
NH
HN
NH
N
N
O
N
O
OTBDMS
TBDMSO
118
NH
HNPd/C, H2, MeOH
Rt, 5 h
40%(über 2 Stufen)
Abb. 47 Debenzylierung zum Produkt 118
Hierfür wurde O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 122 mit einer
katalytischen Menge Pd/C in Methanol versetzt und unter H2-Atmosphäre 5 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt. Nach der entsprechenden Aufarbeitung konnte das
Produkt 118 über beide Syntheseschritte, Kupplung und Debenzylierung, mit einer
Ausbeute von 40% in reiner Form erhalten werden.
Der nächste Syntheseschritt bestand in der Entfernung der TBDMS-Schutzgruppen.
Nach einer Vorschrift von De Riccardis wurde die Entschützung mit
Tetrabutylammoniumfluorid in THF vorgenommen (s. Abb. 48, S. 56).[48] Die Reaktion
führte nicht zu dem gewünschten Produkt 127, vielmehr konnte eine Dearylierung
beobachtet werden.
Resultate und Diskussion
56
NH
N
N
O
N
O
OTBDMS
TBDMSO
118
NH
HN
TBAF, THF
Rt, 3 h
NH
N
N
O
N
O
OH
HO
127
NH
HN
Abb. 48 Versuch der Desilylierung mittels Tetrabutylammoniumfluorid zum Produkt 127
Als Alternative erfolgte die Entschützung mit Triethylamin-Trihydrofluorid unter
Zusatz von Triethylamin in Dichlormethan/THF (s. Abb. 49).
NH
N
N
O
N
O
OTBDMS
TBDMSO
118
NH
HN
Et3N*3HF,Et3N, DCM,THF
Rt, 24 h
68%
NH
N
N
O
N
O
OH
HO
127
NH
HN
Abb. 49 Desilylierung zum Produkt 127
Das Produkt 127 konnte dabei nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden und
entsprechender Reinigung mit einer Ausbeute von 68% erhalten werden. Mittels
dieser schonenden Methode war es erstmals möglich, das vollständig entschützte
N2-Phenylhydrazino-2‘-desoxyguanosin 127 darzustellen. Verbindungen dieser Art
könnten in zukünftigen Untersuchungen als Referenz zur weiteren Identifizierung
solcher Addukte dienen und damit eine Quantifizierung solcher Addukte auch für
weitere aromatische Amine möglich machen.
Das erhaltene entschützte N2-Addukt 127 sollte im Folgenden zum geschützten
Baustein für die Oligonucleotidsynthese umgesetzt werden.
Zunächst musste die 4,4’-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe (DMTr) an der primären
Hydroxylgruppe eingeführt werden (s. Abb. 50, S. 57).
Resultate und Diskussion
57
NH
N
N
O
N
O
OH
HO
127
NH
HN
DMTrCl,Pyridin
Rt, 20 h
10%
NH
N
N
O
N
O
OH
DMTrO
128
NH
HN
Abb. 50 DMTr-Schützung des N2-Addukt 127
Das Edukt 127 wurden in absolutem Pyridin gelöst und mit zwei Äquivalenten 4,4’-
Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach
Aufarbeitung, sowie chromatographischer Reinigung konnte das entsprechende
Produkt 128 in einer Ausbeute von 10% isoliert werden. Diese für eine solche
Reaktion unbefriedigende Ausbeute ließ sich aber auch durch eine Wiederholung der
Synthese nicht steigern.
Im Anschluss an die Dimethoxytritylierung sollte sich die Überführung in das
entsprechende Phosphoramidit 129 anschließen (s. Abb. 51).
NH
N
N
O
N
O
OH
DMTrO
128
NH
HN
107, DCI,DCM, MeCN
Rt, 1 h
NH
N
N
O
N
O
O
DMTrO
129
NH
HN
PO
NCN(iPr)2
Abb. 51 Versuch der Synthese des Phosphoramidit 129
Das DMTr-geschützte Addukt 128 wurde mit Dichlormethan coevaporiert, in
Dichlormethan/Acetonitril gelöst und zunächst mit 4,5-Dicyanoimidazol (DCI) und
anschließend tropfenweise mit Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit
107 versetzt. Nach wässriger Aufarbeitung mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung
und chromatographischer Reinigung mit Dichlormethan/Methanol (0-2%) über
Aluminiumoxid (Neutral, Aktivitätsstufe 3) konnte jedoch kein Produkt 129 isoliert.
Vielmehr war bereits während der Reaktion eine, auf eine Zersetzung hindeutende,
starke Verfärbung der Reaktionslösung zu beobachten, welche während der
Resultate und Diskussion
58
Aufarbeitung und Reinigung noch deutlich stärker wurde. Zwar konnte die
Entstehung des Produktes massenspektrometrisch aus der Reaktionslösung
nachgewiesen werden, jedoch machten es auch eine kürzere Reaktionszeit sowie
eine Aufarbeitung und Reinigung unter Schlenk-Bedingungen nicht möglich, das
gewünschte Produkt 129 zu isolieren. Bei Produkten der Art 129 scheint es sich also
um an Luft instabile Verbindungen zu handeln, welche es nicht ermöglichen, eine
Darstellung, Isolierung oder gar Lagerung durchzuführen. Diese Instabilität könnte
bereits die Ursache für die niedrige Ausbeute bei der DMTr-Schützung gewesen sein
und deshalb auch die Darstellung einer solchen Verbindung erschweren.
Die Isolierung der angestrebten N2-Arylamin-modifizierten Phosphoramidite kann aus
den erhaltenen Ergebnissen nur durch eine Stabilisierung des Systems geschehen.
Diese Stabilisierung müsste durch eine funktionelle Gruppe geschehen, welche erst
nach dem erfolgreichen Einbau in Oligonucleotide abgespalten werden kann. Über
solche Schutzgruppen berichteten Pfleiderer et al. im Jahre 1981.[91] Die für die
Blockierung der O6-Position eingesetzten p-subsituierten (p-Nitro bzw. p-Cyano)
2-Phenylethyl-Gruppen erfüllen diese Anforderungen. Da bereits aus vorangegangen
Arbeiten hervorging, dass eine Schützung mit einer p-Nitro-2-phenylethyl-Gruppe an
der O6-Position des 2‘-Desoxyguanosin eine Kreuzkupplungsreaktion nicht möglich
macht, sollte für die Stabilisierung die p-Cyano-2-phenylethyl-Gruppe (CPE-Gruppe)
angewendet werden (s. Abb. 52, S. 59).
Die Synthese eines CPE-geschützten bromierten Bausteins 132 sollte ausgehend
vom bereits 3‘,5‘-BisTBDMS-2´-desoxyguanosin 121 geschehen. Anschließend sollte
die CPE-Schutzgruppe in die O6-Position eingeführt werden und die Bromierung der
N2-Position erfolgen. Ausgehend von diesem bromierten Baustein 132 sollte die
Einführung der Modifikation in die N2-Position des Guanins wiederum durch die
entwickelte Buchwald-Hartwig-Kupplung vorgenommen werden.
Nach erfolgter Kupplung sollten die 3´- und 5´-Position wieder entschützt und nach
der Einführung der 5‘-DMTr-Schutzgruppe das Phosphoramidit 130 generiert werden.
Resultate und Diskussion
59
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
N
N
N
OCPE
BrN
O
OTBDMS
TBDMSO
132
N
N
N
OCPE
N
O
OTBDMS
TBDMSO
131
NH
HN
Aryl
N
N
N
OCPE
N
O
O
DMTrO
130
NH
HN
Aryl
PO
NCN(iPr)2
Abb. 52 Retrosyntheseschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte unter Verwendung der O6-
CPE-Schutzgruppe
Für die angedachte Einführung der CPE-Schutzgruppe musste zunächst der
entsprechende Alkohol, 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134, analog zu Pfleiderer
hergestellt werden (s. Abb. 53).[91]
OH
NH2
133OH
CN
134
1) NaNO2, HCl, H2O2) CuCN,Toluol, Benzol
0 °C -> 50 °C,3.5 h
44%
Abb. 53 Darstellung von 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134
In dieser Sandmeyer-Reaktion wurde zunächst der 2-(p-Aminophenyl)ethanol 133 in
einem Wasser/Salzsäure-Gemisch suspendiert und bei einer Temperatur von 0 °C
Resultate und Diskussion
60
mit Natriumnitrit diazotiert. Anschließend konnte die Reaktion mit frisch hergestelltem
Kupfer(I)cyanid erfolgen. Das Produkt 134 konnte nach Aufarbeitung und Reinigung
mit einer Ausbeute von 44% erhalten werden.
Die Einführung der CPE-Schutzgruppe geschah analog zu der Einführung der
Benzylschutzgruppe mittels einer Mitsunobu-Reaktion (s. Abb. 54).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
N
N
N
OCPE
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
135
134, PPh3, DIAD,1,4-Dioxan
0 °C -> Rt, 14 h
92%
Abb. 54 Darstellung der O6-CPE-geschützten Verbindung 135
Bei der Reaktion wurden zunächst 3’,5’-Bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin 121 und
Triphenylphosphin in 1,4-Dioxan mit 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134 vorgelegt und mit
Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) versetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur und
abschließender Aufarbeitung konnte das Produkt mit einer Ausbeute von 92% isoliert
werden.
Die anschließende Bromierung in 2-Position erfolgte ebenfalls analog zu der bereits
durchgeführten Synthese des Benzyl-geschützten Derivates 126 (s. Abb. 55).
N
N
N
OCPE
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
135
N
N
N
OCPE
BrN
O
OTBDMS
TBDMSO
132
tert-Butylnitrit,Sb(III)Br3, CH2Br2
- 10 °C, 1 h
50%
Abb. 55 Darstellung von O6-CPE-3´,5´-bis-(TBDMS)-2-brom-2´-desoxyguanosin 132
Das Produkt 132, und damit der Ausgangsbaustein für die Buchwald-Hartwig-
Kupplung, konnte nach analoger Durchführung und Reinigung mit einer Ausbeute
von 50% isoliert werden. Bereits bei den ersten Schritten scheint der Einfluss der
Resultate und Diskussion
61
CPE-Schutzgruppe erkennbar zu sein, denn sowohl die Einführung der O6-
Schutzgruppe, als auch die anschließende Bromierung gelangen mit höheren
Ausbeuten, als dieses bei den entsprechenden Benzyl-geschützten Derivaten 40 und
126 möglich war.
Anschließend konnte die Kupplungsreaktion mit den entsprechenden Arylhydrazinen
zu den Kupplungsprodukten 136-139 durchgeführt werden (s. Abb. 56).
N
N
N
OCPE
BrN
O
OTBDMS
TBDMSO
132
Pd2(dba)3, rac-BINAP,K3PO4, Et3NHCl,Arylhydrazin1,2-DME
80 °C, 24 h
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
136-139
HN
Aryl
Abb. 56 Einführung der N2-Arylamin-Modifikationen zu den Produkten 136-139
Die Reaktionen wurden dabei unter den für die Darstellung des Benzyl-geschützten
Produktes 122 optimierten Bedingungen durchgeführt. Die Produkte 136-139
konnten nach Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung in einer
Ausbeute von 52-80% in reiner Form isoliert werden (s. Tab. 8).
Produkt Aryl Ausbeute
136 Phenyl 80%
137 4-Biphenyl 50%
138 4-Methylphenyl 75%
139 3,5-Dimethylphenyl 52% Tab. 8 Zusammenfassung aller Adduktsynthesen zu den Produkten 136-139
Eine Ausbeutesteigerung durch eine Vorreaktion des Katalysators mit dem Liganden
konnte wiederum nicht beobachtet werden.
Anschließend sollten unter den ebenfalls erprobten Bedingungen die TBDMS-
Gruppen exemplarisch für die Verbindungen 136-137 abgespalten werden (s. Abb.
57, S. 62).
Resultate und Diskussion
62
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
136-137
HN
Aryl
Et3N*3HF,Et3N, DCM,THF
Rt, 2-12 h
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OH
HO
140-141
HN
Aryl
N
N
N
OCPE
NN
O
OH
HO
142-143
NAryl
Abb. 57 TBDMS-Entschützung der N2-Arylamin-Addukte 136-137
Hierzu wurden die entsprechenden Addukte 136-137 in THF/DCM (1:1 v/v) gelöst,
bei Raumtemperatur mit 10 Äquivalenten Triethylamin und 12.5 Äquivalenten
Triethylamin-Trihydrofluorid versetzt und bei Raumtemperatur für 2-12 Stunden
gerührt. Nach anschließender chromatographischer Reinigung konnten jedoch nur
jeweils Produktgemische aus den gewünschten entschützten N2-Addukten 140-141 (im Folgenden als Hydrazinoaryl-Addukt bezeichnet), sowie deren
Oxidationsprodukten 142-143 (im Folgenden als Azoaryl-Addukt bezeichnet) erhalten
werden. Die unerwartete Entstehung der Oxidationsprodukte 142-143 konnte bisher
nicht mit Sicherheit aufgeklärt werden. Eine dünnschichtchromatographische
Reaktionsverfolgung sowie eine NMR-spektroskopische Analyse des
Reaktionsgemisches zeigen, dass die Bildung dieser Produkte nicht während der
Reaktion zu beobachten ist. Ebenfalls kann eine Oxidation während der wässrigen
Aufarbeitung ausgeschlossen werden. Somit müsste die Oxidation während der
Säulenchromatographie über Silica-Gel stattfinden. In Abbildung 58, S. 63 sind
exemplarisch die NMR-Spektren vor und nach säulenchromatographischer
Reinigung über Silica-Kieselgel abgebildet. Es ist deutlich zu erkennen, dass
ausgehend von einem nucleosidischen Produkt nach der Trennung eine
Verdopplung der Signale vorliegt. Dieses weist auf das Entstehen der oxidierten
Form während der Säulenchromatographie hin.
Resultate und Diskussion
63
( p p m)2 . 02 . 53 . 03 . 54 . 04 . 55 . 05 . 56 . 06 . 57 . 07 . 58 . 08 . 5
( p p m)2 . 42 . 83 . 23 . 64 . 04 . 44 . 85 . 25 . 66 . 06 . 46 . 87 . 27 . 68 . 0
H-82 x H-8
Abb. 58 1H-NMR-Spektren vor (links) und nach (rechts) einer durchgeführten Kieselgeltrennung bei der
Entschützung des N2-Adduktes 136
Durch die Verwendung von Aluminiumoxid könnte eine solche Reaktion unterbunden
werden. Da beide Adduktformen jedoch in der chemischen Carcinogenese eine Rolle
spielen, sollte sich diese partielle Oxidation zu Nutze gemacht und eine Möglichkeit
gefunden werden, die jeweiligen Addukte quantitativ darzustellen und separat in die
entsprechenden Phosphoramidite zu überführen. Da eine säulenchromatographische
Trennung ausgeschlossen werden konnte, wurde zunächst einmal untersucht, ob
eine chemische, quantitative Überführung des Reaktionsgemisches 140/142 in die
reduzierte Form 140 möglich ist (s. Abb. 59, S. 64).
Zunächst wurde das Produktgemisch 140/142 in Methanol gelöst und mit Magnesium
und Ammoniumchlorid versetzt und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.[92]
Nach dieser Zeit konnte mittels 1H-NMR-Spektroskopie der Reaktionslösung keine
merkliche Verschiebung des Produktverhältnisses 140/142 beobachtet werden.
Eine weitere Möglichkeit zur Reduktion von Azoverbindungen zu den
entsprechenden Hydrazinoverbindungen besteht durch die Reaktion mit
Natriumhydrogencarbonat, Hydrazin-Hydrat und Zirkoniumdioxid als Katalysator in
Ethanol.[93] Auch bei dieser durchgeführten Reaktion konnte jedoch keine quantitative
Reduktion erreicht werden. Gleiches gilt für den Reduktionsversuch mit
Natriumborhydrid und Iod, welches in Tetrahydrofuran gelöst wurde.[94]
Diese Reaktionen fanden alle bei Raumtemperatur für 24 Stunden statt, lieferten
allerdings ebenso keine quantitative Umsetzung wie die Reaktion mit Iod,
Magnesiumiodid und Magnesium. Als Lösungsmittel wurde bei dieser Reaktion ein
Resultate und Diskussion
64
Ether/Benzol-Gemisch verwendet. Die Reaktion fand bei Raumtemperatur für 72
Stunden statt.[95]
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OH
HO
140
HN
N
N
N
OCPE
NN
O
OH
HON
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OH
HO
140
HN
142
Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute*
MeOH, Mg, Ammoniumchlorid Rt 24 h ---
NaHCO3, EtOH, Hydrazinhydrat, ZrO2 Rt 24 h ---
Iod, Magnesiumiodid, Diethylether, Benzol, Mg Rt 72 h ---
NaBH4, Iod, THF Rt 24 h ---
Hydrazinhydrat, Pd/C, MeOH Rt 14 h ---
Hydrazinhydrat, Pd/C, MeOH (Ultraschall-Bad) Rt 14 h ---
Hydrazinhydrat, Pd/C, MeOH 60 °C 14 h ---
Hydrazinhydrat, Pd/C, EtOH 60 °C 14 h ---
*Ausbeute bezieht sich auf eine quantitative Reduktion zum Produkt 140
Abb. 59 Zusammenfassung aller Versuche zur quantitativen Darstellung von 140
In weiteren Versuchen wurden die Reaktionsbedingungen für die Reaktion mit
Hydrazin-Hydrat und Palladium auf Aktivkohle als Katalysator in Methanol variiert.[96]
Im Allgemeinen wurde Methanol als Lösungsmittel verwendet und die Zeit des
Ultraschallbades zum Aktivieren des Katalysators variiert. Dieses lieferte allerdings
keine quantitative Umsetzung zum Hydrazino-Produkt 140, ebenso wie bei einem
Erhitzen der Reaktionslösung auf 50 °C. Es wurde zwar eine Verschiebung der
Resultate und Diskussion
65
Verhältnisse beobachtet, aber es erfolgte keine quantitative Umsetzung. Letztlich
wurde versucht, die Reaktion ohne Katalysator stattfinden zu lassen. Auch hierbei
konnte sowohl in Methanol, als auch in Ethanol kein reines Hydrazino-Produkt 140
erhalten werden.
Es scheint somit nicht möglich zu sein eine quantitative Reduktion des
Produktgemisch 140/142 zur reinen Hydrazinoform 140 chemisch zu erreichen.
Neben der reduzierten Form 140 spielt die oxidierte Form 142 eine wichtige Rolle in
der chemischen Carcinogenese, weshalb im Folgenden versucht wurde, das
Produktgemisch 140/142 zur reinen Azoform 142 zu oxidieren (s. Abb. 60).
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OH
HO
140
HN
N
N
N
OCPE
NN
O
OH
HON
N
N
N
OCPE
NN
O
OH
HO
142
N
142
Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute*
KO2, Toluol Rt 48 h ---
NBS, Pyridin, DCM Rt 1.5 h ---
*Ausbeute bezieht sich auf eine quantitative Oxidation zum Produkt 142
Abb. 60 Zusammenfassung aller Versuche zur quantitativen Darstellung von 142
Resultate und Diskussion
66
Die Oxidation zum Azo-Produkt 142 sollte zum Einen mit Hilfe von Kaliumsuperoxid
in Toluol bei Raumtemperatur erfolgen.[97] Hierbei verschoben sich laut NMR zwar
nach einer Reaktionszeit von 48 Stunden die Verhältnisse zu Gunsten der Azo-
Komponente, jedoch war keine quantitative Reaktion zu beobachten.
Zum Anderen wurde das Produktgemisch 140/142 in Dichlormethan gelöst, mit
Pyridin und NBS versetzt und anschließend bei Raumtemperatur gerührt.[98] Auch
hier erfolgte allerdings keine reproduzierbare quantitative Umsetzung zum Azo-
Produkt 142. Mit dem bei der DNA-Synthese verwendeten Oxidationsreagenz (THF,
Pyridin, Iod) konnte ebenfalls keine Verschiebung des Hydrazino / Azo –
Gleichgewichtes gefunden werden.
Da auch in diesem Fall keine quantitative Überführung des Produktgemisches
möglich war, wurde nach einer geeigneten Trennmethode der beiden Komponenten
140/142 gesucht. Eine Trennung über Aluminiumoxid verlief dabei allerdings
aufgrund des geringen Polaritätsunterschiedes der beiden Verbindungen erfolglos.
Letztendlich konnte eine Trennung des Produktgemisches 140/142 mittels Reversed
Phase-Säulenchromatographie erreicht werden. Für die Trennung des
Produktgemisches mittels RP-Säule wurde Wasser mit einem Acetonitril-Gradienten
(20-40%) als Laufmittel verwendet. Hiermit gelang es die Produkte 140 und 142
getrennt in reiner Form zu isolieren. Die 1H-NMR-Spektren der isolierten Produkte
sind in Abb. 61, S. 66 dargestellt. Die erfolgreiche Trennung wurde durch die
Ergebnisse der MS-Spektren bestätigt. Auch ließ sich die Trennung des
Produktgemisches 141/143 mit dieser Methode durchführen. In Tab. 9 sind die
isolierten Ausbeuten der Produkte 140-143 aus der TBDMS-Entschützung
zusammengefasst.
Produkt Aryl Ausbeute
140 Phenyl 48%
141 4-Biphenyl 31%
142 Phenyl 27%
143 4-Biphenyl 25% Tab. 9 Zusammenfassung der Ausbeuten aus den TBDMS-Entschützungen der Addukte 136-137
Resultate und Diskussion
67
1.
02
41
2.
30
89
2.
29
82
2.
18
62
2.
10
94
1.
10
08
1.
00
00
1.
96
82
1.
06
60
2.
18
53
1.
07
79
1.
08
80
2.
22
38
2.
05
96
1.
15
22
1.
03
18
In
te
gr
al
7.
64
75
7.
64
49
7.
63
98
7.
62
59
7.
62
33
7.
42
31
7.
40
21
7.
33
73
7.
31
89
7.
30
24
7.
29
73
7.
10
53
7.
08
69
7.
06
85
6.
32
36
6.
30
77
6.
30
45
6.
28
86
5.
31
43
5.
29
27
4.
89
16
4.
63
74
4.
62
03
4.
60
31
4.
37
37
4.
36
67
3.
84
80
3.
83
60
3.
82
90
3.
82
39
3.
81
69
3.
54
17
3.
14
13
3.
12
41
3.
10
70
2.
77
08
2.
75
61
2.
75
17
2.
73
77
2.
72
31
2.
71
86
2.
70
40
2.
26
61
2.
25
85
2.
25
09
2.
24
32
2.
23
31
2.
22
54
2.
21
78
2.
21
02
( p p m)0 . 01 . 02 . 03 . 04 . 05 . 06 . 07 . 08 . 09 . 0
1.
05
35
1.
54
63
2.
20
65
1.
83
18
2.
42
04
0.
96
68
1.
00
00
2.
21
35
1.
29
23
1.
18
91
1.
02
46
1.
30
65
1.
19
30
1.
17
23
In
te
gr
al
7.
99
89
7.
99
51
7.
98
75
7.
80
00
7.
77
97
7.
75
93
7.
68
05
7.
67
61
7.
67
10
7.
66
78
7.
66
21
7.
60
74
7.
58
65
6.
48
06
4.
90
69
4.
89
04
4.
87
39
4.
44
99
4.
44
17
4.
43
47
3.
90
14
3.
89
38
3.
66
05
3.
64
91
3.
63
07
3.
61
92
3.
56
58
3.
55
44
3.
53
60
2.
77
65
2.
76
12
2.
74
34
2.
38
94
2.
38
11
2.
37
48
2.
36
53
2.
33
16
2.
32
65
( p p m)2 . 53 . 03 . 54 . 04 . 55 . 05 . 56 . 06 . 57 . 07 . 58 . 08 . 59 . 0
Abb. 61 1H-NMR-Spektren des entschützten N2-Phenylhydrazino-modifizierten Adduktes 140 (oben) und des N2-
Azophenyl-modifizierten Adduktes 142 (unten)
Resultate und Diskussion
68
Die erhaltenen entschützten N2-Hydrazinoaryl-Addukte 140,141, sowie die
entschützten N2-Azoaryl-Addukte 142,143 sollte im Folgenden zu geschützten
Bausteinen für die Oligonucleotidsynthese umgesetzt werden.
Zunächst musste die 4,4’-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe (DMTr) an der primären
Hydroxylgruppe der N2-Hydrazino-Addukte 140,141 eingeführt werden (s. Abb. 62).
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OH
HO
140,141
HN
Aryl
DMTrCl,Pyridin
Rt, 12 h
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OH
DMTrO
144,145
HN
Aryl
Produkt Aryl Ausbeute
144 Phenyl 69%
145 4-Biphenyl 62% Abb. 62 DMTr-Schützung der N2-Addukte 140,141
Die Edukte 140,141 wurden in absolutem Pyridin gelöst und mit zwei Äquivalenten
4,4’-Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach
Aufarbeitung sowie chromatographischer Reinigung über Aluminiumoxid (zur
Vermeidung einer weiteren Oxidation) konnten die entsprechenden Produkte
144,145 in einer Ausbeute von 62-69% isoliert werden.
Analog konnte die Schützung der entschützten N2-Azoaryl-Addukte 142,143 erfolgen
(s. Abb. 63, S. 69). Hierbei konnte auf die Verwendung von Aluminiumoxid verzichtet
werden und die Trennung mittels Silica-Kieselgel erfolgen. Die Produkte konnten mit
Ausbeuten von 68-76% isoliert werden.
Resultate und Diskussion
69
N
N
N
OCPE
NN
O
OH
HO
142,143
NAryl
DMTrCl,Pyridin
Rt, 12 h
N
N
N
OCPE
NN
O
OH
DMTrO
146,147
NAryl
Produkt Aryl Ausbeute
146 Phenyl 68%
147 4-Biphenyl 76% Abb. 63 DMTr-Schützung der N2-Addukte 142,143
An die Dimethoxytritylierung sollte sich die Überführung in die entsprechenden
Phosphoramidite anschließen. Zunächst wurden wiederum die N2-Hydrazinoaryl-
Addukte 144,145 umgesetzt (s. Abb. 64).
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OH
DMTrO
144,145
HN
Aryl
107, DCI,DCM, MeCN
Rt, 12 h
N
N
N
OCPE
N
O
O
DMTrO
148,149
NH
HN
Aryl
PO
NCN(iPr)2
Produkt Aryl Ausbeute
148 Phenyl 75%
149 4-Biphenyl 90% Abb. 64 Synthese des Phosphoramidite 148,149
Die DMTr-geschützten Addukte 144,145 wurde mit Dichlormethan coevaporiert, in
Dichlormethan/Acetonitril gelöst und zunächst mit 4,5-Dicyanoimidazol (DCI) und
anschließend tropfenweise mit Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit
107 versetzt. Nach wässriger Aufarbeitung mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung
und chromatographischer Reinigung über Aluminiumoxid (Neutral, Aktivitätsstufe 3)
Resultate und Diskussion
70
konnten die Produkte 148,149 in reiner Form mit Ausbeuten von 75-90% isoliert
werden. Abbildung 65 zeigt exemplarisch die NMR-Spektren der Verbindung 149.
0.
69
39
1.
34
46
12
.4
45
0.
95
61
5.
28
33
4.
32
15
2.
61
46
2.
06
83
1.
00
00
0.
98
47
1.
98
87
4.
22
97
8.
69
56
0.
67
96
2.
53
83
0.
22
42
2.
05
88
18
.4
45
In
te
gr
al
6.
85
53
6.
85
22
6.
84
33
6.
82
32
6.
77
71
6.
77
15
6.
75
95
6.
75
38
6.
68
45
6.
67
38
6.
66
87
6.
65
80
6.
36
68
6.
35
35
4.
53
43
4.
52
80
4.
51
98
4.
50
97
4.
21
60
4.
20
90
4.
20
27
4.
18
95
3.
66
25
3.
64
86
3.
63
54
3.
62
85
3.
62
22
3.
61
52
3.
60
14
3.
57
93
3.
57
11
3.
55
35
3.
54
97
3.
54
46
3.
53
90
3.
53
45
3.
53
01
3.
51
82
3.
51
50
3.
51
19
3.
51
00
3.
50
43
3.
50
18
3.
49
86
3.
49
04
3.
48
85
3.
48
35
3.
47
84
3.
47
21
3.
46
71
3.
46
52
3.
45
89
3.
45
26
3.
43
87
3.
39
78
( p p m)0 . 51 . 01 . 52 . 02 . 53 . 03 . 54 . 04 . 55 . 05 . 56 . 06 . 57 . 07 . 58 . 08 . 59 . 0
14
9.
13
09
14
8.
35
32
( p p m)- 7 0- 5 0- 3 0- 1 01 03 05 07 09 01 1 01 3 01 5 01 7 01 9 02 1 0
Abb. 65 1H-NMR- (oben) und 31P-NMR- (unten)
Spektren des N2-Biphenylhydrazino-modifizierten Phosphoramidites 149
Die Phosphoramidite wurden abschließend jeweils als farblose Schäume nach
Abkondensierung aus Benzol erhalten. Analog konnte die Überführung der N2-Azoaryl-Addukte 146,147 erfolgen (s. Abb. 66,
S. 71).
Resultate und Diskussion
71
N
N
N
OCPE
NN
O
OH
DMTrO
146,147
NAryl
107, DCI,DCM, MeCN
Rt, 12 h
N
N
N
OCPE
N
O
O
DMTrO
150,151
NN
Aryl
PO
NCN(iPr)2
Produkt Aryl Ausbeute
150 Phenyl 51%
151 4-Biphenyl 35% Abb. 66 Synthese des Phosphoramidite 150,151
Hierbei konnte erneut auf die Verwendung von Aluminiumoxid verzichtet werden und
die Trennung mittels Silica-Kieselgel erfolgen. Auch hier war es möglich die Produkte
150,151 in reiner Form mit Ausbeuten von 35-51% zu isolieren. Die Phosphoramidite
wurden abschließend jeweils als orangefarbene Schäume nach Abkondensierung
aus Benzol erhalten und konnten ebenfalls mittels ESI-MS eindeutig charakterisiert
werden.
Mittels der hier beschriebenen Methode ist es somit erstmals möglich N2-Arylamin-
modifizierte 2‘-Desoxyguanosinaddukte herzustellen und diese in die
entsprechenden Phosphoramidite zu überführen. Diese entwickelte Syntheseroute
liefert neben den N2-Hydrazinoaryl-Addukten zusätzlich noch die ebenfalls in der
chemischen Carcinogenese eine Rolle spielenden N2-Azoaryl-Addukte. Diese
konnten in sehr guten Ausbeuten isoliert und ebenfalls in die entsprechenden
Phosphoramidite überführt werden, wodurch auch diese als Bausteine für die
Oligonucleotidsynthese zum gezielten Einbau in DNA und damit zur gezielten
Untersuchung solcher Modifikationen auf die Eigenschaften eines DNA-Dublex zur
Verfügung stehen.
Die für die Synthese eines weiteren Typs von aromatischen Aminen gebildeten
Addukten, den O6-2‘-dG-Addukten, unternommenen Versuche sollen im Folgenden
diskutiert werden.
Resultate und Diskussion
72
4.3 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine
Die Darstellung der Arylamin-modifizierten Oligonucleotidbausteine sollte ausgehend
vom 2’-Desoxyguanosin 52 erfolgen. Bei der gewählten Syntheseroute stellt die
Einführung der Modifikation in die O6-Position des Guanins den bedeutendsten
Schritt dar. Dabei sollte die C-O-N-Bindung des Adduktes 153 generiert und dieses
anschließend in das Phosphoramidit 152 überführt werden (s. Abb. 67).
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
52
N
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
153
HNAryl
N
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
152
HN
N(Me)2
PO
NCN(iPr)2
Aryl
Abb. 67 Retrosynthese der Darstellung O6-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite
Die Einführung einer solchen Modifikation ist prinzipiell auf mehreren Wegen
denkbar. In den durchgeführten Fällen wurde von einer bereits bestehenden C-O-N-
Bindung an einem Hydroxylamin ausgegangen und versucht, diese zunächst mittels
Mitsunobu-Reaktion oder durch Substitution einzuführen. Die Versuche hierzu sollen
im Folgenden aufgezeigt werden.
Resultate und Diskussion
73
4.3.1 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine
mittels Mitsunobu-Reaktion
Bei diesem Syntheseweg sollte die Einführung der Arylaminmodifikation an der O6-
Position mittels einer Mitsunobu-artigen Reaktion am bereits synthetisierten TBDMS-
geschützten 2‘-dG 121 mit einem Arylhydroxylamin 155 erfolgen (s. Abb. 68).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
NHHO
NO2
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
154
HN
155 156 Abb. 68 Retrosyntheseschema zur Darstellung O6-modifizierter Addukte mittels Mitsunobu-Reaktion
Das für die Mitsunobu-Reaktion benötigte Hydroxylamin 155 sollte dabei aus der
entsprechenden Nitroarylverbindung 156 zugänglich sein.
Die Synthese hierfür wurde analog zu Brink et al. durchgeführt (s. Abb. 69, S. 74).[99]
Resultate und Diskussion
74
NO2
156
NH4Cl, Zn,H2O
60 °C, 20 min.
NHHO
15543%
Abb. 69 Darstellung des N-Phenylhydroxylamin 155
Bei dieser Reaktion wurde zunächst eine Lösung aus Nitrobenzol und einer
wässrigen Ammoniumchlorid-Lösung auf 60 °C erhitzt und dann in einem Zeitraum
von ca. 20 Minuten mit der entsprechenden Menge Zink versetzt. Nach
anschließender Aufarbeitung konnte das Produkt mit einer Ausbeute von 43%
erhalten werden.
Die Einführung der O6-Arylamin-Modifikation sollte nun an dem bereits
synthetisierten 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG 121 mittels einer Mitsunobu-Reaktion erfolgen
(s. Abb. 70).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
NHHO
155
PPh3, DIAD,1,4-Dioxan
0 °C -> Rt, 14 h
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
154
HN
Abb. 70 Versuch der Darstellung des O6-Adduktes 154
Hierzu wurden die bereits für die Benzylierung der C8-Addukte und für die CPE-
Schützung der N2-Addukte etablierten Synthesebedingungen angewandt. Die Edukte
121 und 155 wurden dabei mit Triphenylphosphin vorgelegt, in 1,4-Dioxan gelöst und
bei 0 °C mit DIAD versetzt. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur und einer
Reaktionszeit von 14 Stunden konnte jedoch kein Umsatz des geschützten 2‘-dG
121 beobachtet werden. Vielmehr war eine unerwünschte Reaktion an der NH-
Resultate und Diskussion
75
Gruppierung des Hydroxylamins 155 zu beobachten, welches die Bildung des
gewünschten Produktes unmöglich machte.
Um das Problem der höheren Reaktivität der NH-Funktion des Hydroxylamin 155 im
Vergleich zu der Hydroxyl-Gruppe zu umgehen, sollte eine selektive Schützung der
NH-Funktion erfolgen. Als Schutzgruppen sollten dabei basenlabile Gruppen (um
eine Abspaltung nach der Oligonucleotidsynthese mit Ammoniak zu garantieren) wie
Acetyl und Benzoyl eingesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit sollte die
hydrogenolytisch abspaltbare Benzylgruppe sein.
Zunächst erfolgte die Acetyl-Schützung zur N-Acetyl-N-phenylhydroxamsäure 157
analog zu Trager et al. (s. Abb. 71).[100]
NHHO
155
Et2O, NaHCO3,AcCl
Rt, 16 h
49%
NAcHO
157 Abb. 71 Acetyl-Schützung des Hydroxylamins 155
Die Umsetzung des Hydroxylamin 155, welches in Diethylether gelöst wurde, erfolgte
mit Natriumhydrogencarbonat und Acetylchlorid bei einer Temperatur von 0 °C und
anschließendem 16-stündigen Rühren und Aufarbeitung mit einer Ausbeute von
49%.
Eine Benzyl-NH-Schützung konnte analog zu Utzinger erreicht werden (s. Abb.
72).[101]
NHHO
155
Pyridin, H2OBnCl
Rt, 16 h
46%
NBnHO
158 Abb. 72 Benzyl-Schützung des Hydroxylamins 155
Die Einführung der Benzyl-Gruppe an das Hydroxylamin 155 erfolgte durch Reaktion
unter Lichtausschluss mit Benzylchlorid in Pyridin und einigen Tropfen Wasser. Nach
Resultate und Diskussion
76
16-stündigen Rühren und Aufarbeitung wurde das Produkt mit einer Ausbeute von
46% erhalten.
Als drittes konnte die Schützung mit der Benzoyl-Gruppe analog zu Nikrad erreicht
werden (s. Abb. 73).[102]
NHHO
155
Et2O, NaHCO3,BzCl
0 °C , 3 h
68%
NBzHO
159 Abb. 73 Benzoyl-Schützung des Hydroxylamins 155
Die Reaktion erfolgte durch Zugabe von Benzoylchlorid zu bereits gelöstem
Hydroxylamin 155 in Diethylether in Gegenwart von Natriumhydrogencarbonat bei
einer Temperatur von 0 °C. Nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden konnte das
Produkt in reiner Form durch Filtration mit einer Ausbeute von 68% erhalten werden.
Die folgenden Reaktionen, die Umsetzung des 3´,5´-Bis-(TBDMS)-2´-dG-Derivates
121 mit der N-Acetyl-N-phenylhydroxamsäure 157 bzw. dem N-Benzyl-N-
phenylhydroxylamin 158 erfolgten unter unterschiedlichen Synthesebedingungen (s.
Abb. 74, S. 77). Dabei erfolgte stets zunächst die Zugabe von Triphenylphosphin und
DIAD, welche zur Bildung eines Betains führen, das wiederum durch das geschützte
Hydroxylamin protoniert werden sollte. Das auf diese Weise aktivierte
Triphenylphosphin sollte unter Addition mit dem O6-Atom des 2´-dG reagieren.
Triphenylphosphinoxid stellt eine gute Abgangsgruppe dar und könnte durch die
geschützten Hydroxylamine in einer SN2-Reaktion angegriffen werden.[103-104]
Bei den Durchführungen der in der Abbildung 74, S. 76 aufgeführten Reaktionen
fanden vor allem Variationen in Bezug auf die Lösungsmittel statt. Hier wurden
Acetonitril, 1,4-Dioxan, Dichlormethan sowie THF verwendet. Außerdem wurden die
Reaktionen unter Zugabe von Imidazol durchgeführt, welches als
Deprotonierungsreagenz für das jeweils eingesetzte N-geschütze Hydroxylamin
dienen sollte.[105]
Resultate und Diskussion
77
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
154
SGN
SG: Ac, Bn, Bz
PPh3, DIAD,LM, Zusatz
geschütztes Hydroxylamin
Lösungsmittel Base Temp. Zeit Ausbeute
157 THF --- Rt 16 h ---
157 THF Imidazol Rt 16 h ---
157 MeCN --- -40 °C -> Rt 20 h ---
157 DCM Imidazol Rt 20 h ---
157 Dioxan --- Rt 16 h ---
158 THF Imidazol Rt 16 h --- Abb. 74 Versuche zur Darstellung von O6-Addukten unter Mitsunobu-Bedingungen
Sämtliche Variationen führten jedoch leider nicht zu einer Umsetzung und zu dem
gewünschten Produkt 154, wodurch eine Reaktion unter Mitsunobu-Bedingungen als
Syntheseweg zum O6-Addukt ausgeschlossen werden kann.
Als eine weitere Möglichkeit der Darstellung der O6-Addukte kommt eine Einführung
der Modifikation durch eine Substitutionsreaktion mit den bereits dargestellten
geschützten Hydroxylaminen 157-159 in Frage. Die entsprechenden Versuche sollen
im Folgenden aufgezeigt und diskutiert werden.
Resultate und Diskussion
78
4.3.2 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine
mittels einer Substitutions-Reaktion
Eine einfache Methode zur Einführung einer Propiohydroxamsäure in die O6-Position
von Guanosin unter Abspaltung von Wasser wurde von Shibaeva beschrieben.[106]
Diese Methode sollte auf das ungeschützte 2‘-Desoxyguanosin 52 und das
geschützte Arylhydroxylamin 159 angewendet werden (s. Abb. 75).
NBzHO
159
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
52
N
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
161
BzNAryl
LM, H2O
Lösungsmittel pH Temp. Zeit Ausbeute
MeCN 9 Rt 7 d ---
MeCN 10 Rt 7 d ---
Pyridin 10 Rt 7 d ---
MeOH 10 Rt 7 d --- Abb. 75 Versuche zur direkten Einführung der O6-Arylamin-Modifikatinon nach Shibaeva
Für die Reaktionen wurde 2‘-dG 52 in einer Mischung aus dem verwendeten
Lösungsmittel und einer wässrigen pH-definierten Lösung (pH 9 und 10) gegeben
und mit der Benzoyl-geschützten Hydroxamsäure 159 versetzt. Nach einer
Reaktionszeit von 7 Tagen konnte jedoch dünnschichtchromatographisch kein
Umsatz detektiert werden. Eine Erhöhung der Temperatur führte ebenfalls nicht zu
einer Umsetzung und das Edukt konnte reisoliert werden. Es ist davon auszugehen,
dass der Grund für das Misslingen dieser Reaktionen die Eigenschaft des O6-
Sauerstoffs als schlechte Austrittsgruppe zu fungieren ist. Diese Art von Substitution
mit einer Propiohydroxamsäure konnte jedoch von Shibaeva bei Ribonucleosiden
beobachtet werden konnte.
Resultate und Diskussion
79
Um eine Substitutionsreaktion möglich zu machen, sollten im Folgenden
verschiedene Austrittsgruppen an der 6-Position eingeführt werden (s. Abb. 76).
NH
N
N
O
NH2N
O
OSG
SGO
164SG: Ac, TBDMS
N
N
N
AG
NH2N
O
OSG
SGO
163AG: Cl, N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl, benzotriazoyl
N
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
162
HNAryl
Abb. 76 Retrosyntheseschema der O6-Arylamin-Addukt Darstellung mittels Substitution
Ausgehend von an den Hydroxyfunktionen geschützten 2‘-dG-Derivaten 164 sollte im
Folgenden eine Austrittsgruppe in der 6-Position eingeführt werden, welche nach
Substitution und anschließender Schutzgruppenabspaltung das gewünschte O6-
Addukt 162 liefern sollte. Als Abgangsgruppen sollte dabei zunächst Chlorid
Verwendung finden. Als alternative Gruppen kämen N-Phenyl-2,2,2-
trifluoracetimidoyl und Benzotriazoyl in Frage. Die durchgeführten Versuche sollen im
Folgenden aufgezeigt werden.
Für die Einführung der Chlorid-Funktion in 6-Position mussten zunächst die
Hydroxylgruppen des 2‘-Desoxyguanosin 52 durch Acetylgruppen geschützt werden.
Die Synthese geschah analog zu Matsuda (s. Abb. 77, S. 80).[107]
Resultate und Diskussion
80
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
52
Et3N, DMAP,Ac2O, Pyridin,MeCN
Rt, 20 h
NH
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
16598%
Abb. 77 Acetylierung von 2‘-Desoxyguanosin 52
Die Darstellung von 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin 165 erfolgte ausgehend von
2’-Desoxyguanosin-Monohydrat 52, welches in Pyridin und Acetonitril suspendiert
wurde. Nachdem DMAP, Triethylamin und Essigsäureanhydrid zugegeben wurde,
wurde die Lösung für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und nach
anschließender Filtration konnte das Produkt in einer sehr guten Ausbeute von 98%
erhalten werden.
Anschließend erfolgte die Umsetzung zum 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-
desoxyribosylpurin 166 (s. Abb. 78).[108]
NH
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
165
Et4NCl, POCl3N,N-Dimethyl-anilin, MeCN
reflux, 10 min.
70%
N
N
N
Cl
NH2N
O
OAc
AcO
166 Abb. 78 Chlorierung des 2‘-Desoxyguanosinderivates 165
Dazu wurde das zuvor dargestellte 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin 165 zusammen
mit Tetraethylammoniumchlorid in Acetonitril gelöst und mit N,N-Dimethylanilin und
Phosphorylchlorid versetzt. Nach kurzem Erhitzen auf 80 °C und Aufarbeitung mit
chromatographischer Reinigung wurde das Produkt in einer Ausbeute von 70%
erhalten.
Bereits 2003 gelang es Zemlicka et al., an solchen Derivaten eine nucleophile
Substitution an der 6-Position, u. a. mit Alkoholen oder Aminen, durchzuführen.[109]
Diese Durchführungen sollten sich auf die Substitution mit den geschützten
Resultate und Diskussion
81
Hydroxylaminen 157-158 übertragen lassen und eine Darstellung der gewünschten
O6-Addukte ermöglichen. Die durchgeführten Synthesen sind in Abb. 79
zusammengefasst.
N
N
N
Cl
NH2N
O
OAc
AcO
166
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
167
SGN
SG: Ac, Bn
geschütztes Hydroxylamin
Lösungsmittel/Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute
158 EtOH, Et3N, DMAP 80 °C 20 h ---
158 THF, NaH Rt 20 h ---
158 THF, NaH 80 °C 20 h ---
158 EtOH Rt 70 h ---
158 EtOH 80 °C 70 h ---
158 Pyridin Rt 70 h ---
158 Pyridin 80 °C 70 h ---
158 Formamid 100 °C 40 h ---
158 1,2-DME, K2CO3 80 °C 40 h ---
157 EtOH Rt 72 h ---
157 EtOH, Pyridin 80 °C 72 h ---
157 EtOH, DIPEA 80 °C 72 h ---
157 EtOH 80 °C 72 h --- Abb. 79 Zusammenfassung der Versuche zur Substitution am 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-
desoxyribosylpurin 166
Bei den durchgeführten Testreaktionen wurden dabei jeweils 50-100 mg des 2-
Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-desoxyribosylpurins 166 mit 2 Äquivalenten des
geschützten Hydroxylamins 157, 158 in dem verwendeten Lösungsmittel gelöst und
Resultate und Diskussion
82
bei der angegebenen Temperatur (ggf. unter Zugabe der aufgeführten Basen zur
Deprotonierung der Hydroxylamine) für 20 – 72 Stunden gerührt.
Hierbei wurden Variationen in Bezug auf das Lösungsmittel, die Reaktionstemperatur
und die Deprotonierungsreagenzien durchgeführt, wobei SN2-begünstigende protisch
polare wie Ethanol und Formamid, aber auch als Deprotonierungsreagenzien
wirkende Lösungsmittel wie Pyridin zum Einsatz kamen.
Für die mit dem N-Benzyl-N-phenylhydroxylamin 158 durchgeführten Reaktionen
führte weder eine Erhöhung der Temperatur noch ein Zusatz von
Deprotonierungsreagenzien wie Kaliumcarbonat oder Triethylamin in dieser Reihe zu
dem gewünschten O6-Addukt. Dabei konnte durch dünnschichtchromatographische
Überprüfung keine Umsetzung der Edukte bei Raumtemperatur beobachtet werden.
Bei den bei 80 °C durchgeführten Reaktionen fand eine Zersetzung (Abspaltung der
Acetylgruppe) des Zucker-Derivates statt.
Bei den Reaktionen mit N-Acetyl-N-phenylhydroxamsäure 157 konnten die zuvor
beschriebenen Beobachtungen bestätigt werden und außerdem eine Zersetzung des
Eduktes 166 dünnschichtchromatographisch detektiert werden. Auch in dieser
Versuchsreihe konnte das gewünschte O6-Addukt nicht isoliert werden.
Eine Ausnahme bildet die bei Raumtemperatur in Ethanol durchgeführte Reaktion
des 2‘-dG-Derivates 166 mit der Hydroxamsäure 157. Bei dieser Reaktion erfolgte
wahrscheinlich die Abspaltung der Acetyl-Schutzgruppe der Hydroxamsäure 157,
wodurch die reaktivere NH-Funktion mit dem Desoxyribosylpurin-Derivat unter
Wasserabspaltung zu einem Produkt führte, in dem sich das Stickstoff-Atom direkt
am C6 befindet.
Da bei den durchgeführten Reaktionen mit Hilfe der aufgenommenen NMR-Spektren
zum Teil Abspaltungen der Acetyl-Schutzgruppen beobachtet wurden, sollten im
Folgenden Versuchsreihen mit TBDMS-Schutzgruppen in 3´- und 5´-Position des
Desoxyribosylpurin-Derivates durchgeführt wurden.
Da eine analog durchgeführte Chlorierung mit dem bereits Bis-TBDMS-geschützten
2‘-dG-Derivat 121 zu einer Abspaltung der TBDMS-Gruppen und zu unerwünschten
Nebenprodukten führte, sollte die Darstellung ausgehend vom 2-Amino-6-chlor-3´,5´-
O-acetyl-2´-desoxyribosylpurin 166 durch Entschützung und anschließende TBDMS-
Schützung erfolgen.
Resultate und Diskussion
83
Zunächst wurden die Acetyl-Schutzgruppen durch Zugabe eines Gemisches aus
Triethylamin, Wasser und Methanol und anschließendem 3-stündigen Rühren bei
Raumtemperatur abgespalten. Nach Aufarbeitung konnte das gewünschte Produkt in
einer Ausbeute von 99% erhalten werden (s. Abb. 80).
N
N
N
Cl
NH2N
O
OAc
AcO
166
N
N
N
Cl
NH2N
O
OH
HO
168
Et3N, H2O,MeOH
Rt, 3 h
99%
Abb. 80 Entschützung von 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-desoxyribosylpurin 166
Es folgte die TBDMS-Schützung analog zu den bereits durchgeführten Reaktionen,
wodurch das 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxyribosyl-
purin 169 mit einer Ausbeute von 90% erhalten wurde (s. Abb. 81).
N
N
N
Cl
NH2N
O
OH
HO
168
TBDMSCl,Imidazol, Pyridin
Rt, 16 h
90%
N
N
N
Cl
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
169 Abb. 81 TBDMS-Schützung von 2-Amino-6-chlor-2´-desoxyribosylpurin 168
Im Folgenden wurden Versuche unternommen die O6-Modifikation durch eine
Umsetzung des 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2´-
desoxyribosylpurins 169 mit einem geschützten Hydroxylamin zu erreichen. Bei den
durchgeführten Testreaktionen wurden dabei jeweils 50-100 mg des 2-Amino-6-
chlor-3´,5´-O-TBDMS-2´-desoxyribosylpurins 169 mit 2 Äquivalenten des
geschützten Hydroxylamins 157, 158 in dem verwendeten Lösungsmittel gelöst und
bei 80 °C unter Zugabe der beschriebenen Base gerührt. Abbildung 82, S. 84 fasst
die Ergebnisse dieser Versuche zusammen.
Resultate und Diskussion
84
N
N
N
Cl
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
169
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
170
SGN
SG: Ac, Bn
geschütztes Hydroxylamin
Lösungsmittel/Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute
158 EtOH 80 °C 16 h ---
158 EtOH, K2CO3 80 °C 16 h ---
158 EtOH, DIPEA 80 °C 16 h ---
158 DMSO, DIPEA 80 °C 16 h ---
157 EtOH 80 °C 16 h ---
157 EtOH, K2CO3 80 °C 16 h ---
157 DMSO, DIPEA 80 °C 16 h ---
157 EtOH 80 °C 16 h --- Abb. 82 Zusammenfassung der Versuche zur Substitution am 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-TBDMS-2´-
desoxyribosylpurin 169
Auch bei diesen durchgeführten Reaktionen konnte kein Umsatz des Eduktes 169
beobachtet werden. Einzige Ausnahmen bilden die in Ethanol unter Zugabe von
Kaliumcarbonat durchgeführten Reaktionen. In diesen Fällen konnte eine Umsetzung
beobachtet werden. Nach anschließender Aufarbeitung und Reinigung gelang es
nicht, das entstandene Produkt in reiner Form zu isolieren. Aus den NMR-Daten ließ
sich jedoch erkennen, dass nicht das gewünschte Produkt 170 entstanden war,
vielmehr scheint eine Reaktion am C8-Atom der Nucleobase stattgefunden zu haben.
Eine genaue Identifizierung dieses in geringen Mengen gebildeten Produktes war
jedoch nicht möglich.
Die beschriebenen Versuche zeigen, dass im vorliegenden Fall Chlorid als
Abgangsgruppe ungeeignet ist und eine Substitutionsreaktion zu dem gewünschten
O6-Addukt auf diesem Wege nicht möglich ist.
Resultate und Diskussion
85
Eine Alternative als Abgangsgruppe stellt die von Papot et al. verwendete N-Phenyl-
2,2,2-trifluoracetimidoyl-Gruppe dar.[110] Ihnen gelang es, an einer glycosidischen
Hydroxylgruppe diese Funktion einzuführen und mit einer Hydroxamsäure zu
substituieren. Das für die Einführung dieser Abgangsgruppe benötigte Chlorid sollte
zunächst aus Anilin und Trifluoressigsäure hergestellt werden (s. Abb. 83).
N
CF3
Cl
172
NH2
OH
1 171
PPh3, Et3N,CCl4
reflux, 20 h
22%
F3C
O
Abb. 83 Darstellung von N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoylchlorid 172
Dabei wurden Triphenylphosphin, Anilin 1, Triethylamin zunächst in
Tetrachlorkohlenstoff suspendiert und unter Reflux mit Trifluoressigsäure versetzt
und für 20 Stunden gerührt. Das Produkt konnte nach Aufarbeitung und
abschließender Destillation mit 22% Ausbeute erhalten werden.
Die Einführung dieser Schutzgruppe geschah anschließend unter den von Papot
beschriebenen Bedingungen (s. Abb. 84).[110]
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
N
CF3
ClN
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
173172
Et3N, DMAP,DCM
Rt, 14 h
40%
N CF3
Abb. 84 N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl-Schützung
Dabei wurden die beiden Edukte 121 und 172 zunächst in Dichlormethan gelöst und
anschließend mit Triethylamin und DMAP versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 14
Resultate und Diskussion
86
Stunden bei Raumtemperatur und anschließender chromatographischer Reinigung
konnte das Produkt 173 in 40% Ausbeute erhalten werden.
Die abschließende Substitutionsreaktion unter Verwendung von TMSO-Triflat wurde
ebenfalls analog zu den von Papot beschriebenen Versuchen durchgeführt (s. Abb.
85).[110]
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
173
N CF3
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
170
AcN
157, TMSOTf,DCM
- 20 °C -> Rt, 4 h
Abb. 85 Versuch der TMSOTf-katalysierten Substitutionsreaktion nach Papot
Hierbei wurde das geschützte 2‘-dG-Derivat 173 in Dichlormethan unter Zugabe von
aktiviertem Molekularsieb gelöst und nach der Zugabe von TMSO-Triflat mit dem
geschützten Hydroxylamin 157 bei einer Temperatur von – 20 °C versetzt. Nach
anschließendem Erwärmen und einer Reaktionszeit von vier Stunden konnte kein
Umsatz des Nucleosid 173 dünnschichtchromatographisch detektiert werden.
Allerdings konnte eine Zersetzung des geschützten Hydroxylamins 157 beobachtet
werden. Auch diese Methode eignet sich damit nicht, um mittels einer
Substitutionsreaktion die gewünschten O6-Addukte zu synthetisieren.
Als eine letzte Abgangsgruppe sollte die von Lakshman zur Synthese C6-
modifizierter Inosin-Derivate etablierte Benzotriazoyl-Funktion untersucht werden.[111]
Ihm gelang es, nach Addition von Benzotriazol an die O6-Position des Inosins
nucleophile Substitutionsreaktionen mit Alkoholen, Aminen, Phenolen und Thiolen
durchzuführen.
Das hierfür benötigte, geschützte 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 174 musste zunächst
hergestellt werden (s. Abb. 86, S. 87).
Resultate und Diskussion
87
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
174
N
NN
BOP, DIPEA,DMF
Rt, 72 h
65%
Abb. 86 Benzotriazol-Schützung von 3’,5’-BisTBDMS-2‘-dG 121
Das geschützte Nucleosid 121 wurde dafür in DMF gelöst und anschließend mit BOP
(Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorophosphat) und
Diisopropylethylamin (Hünigs Base) versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 72
Stunden konnte das Produkt nach Aufarbeitung und säulenchromatographischer
Reinigung in einer Ausbeute von 65% isoliert werden.
Die Substitutionsreaktion sollte zunächst aufgrund möglicher Selektivitäten
metallkatalysiert durchgeführt werden. Ähnliche Versuche zur Verwendung von
Hydroxylaminen als Sauerstoff-Nucleophile wurden von Takemoto 2005
beschrieben.[112] Die analog durchgeführten Versuche sind in Abb. 87, S. 88
zusammengefasst.
Bei den Reaktionen wurde das Benzotriazol-geschützte 2‘-dG-Derivat 174 in dem
verwendeten Lösungsmittel vorgelegt und anschließend mit dem Katalysator sowie
dem geschützten Hydroxylamin 159 versetzt. Als Katalysator wurden dabei die von
Takemoto verwendeten Tetrakis(triphenylphosphino)palladium und das dimere
Iridiumcyclooctadienchlorid eingesetzt. Nach Reaktionszeiten von 24 Stunden bei
Raumtemperatur konnte jedoch erneut in beiden Fällen kein Umsatz des Eduktes
174 dünnschichtchromatographisch detektiert werden.
Resultate und Diskussion
88
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
174
N
NN
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
170
BzN
geschütztes Hydroxylamin
Lösungsmittel/Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute
159 DCM, [IrCl(cod)]2 Rt 24 h ---
159 MeCN, Pd(PPh3)4 Rt 24 h --- Abb. 87 Versuche zur metallkatalysierten Substitution an 174
Als letzte Variante sollte eine basen-katalysierte Substitution mit dem Benzotriazol-
geschützten 2‘-dG-Derivat 174 durchgeführt werden. Nach der durch die Base
erfolgten Deprotonierung sollte die Hydroxamsäure 157 an der C6-Position selektiv
angreifen und unter Abspaltung von Hydroxybenzotriazol das gewünschte
geschützte O6-Addukt liefern. Als Base sollte neben Cäsiumcarbonat (mit 1,2-DME
als Lösungsmittel) auch Pyridin Verwendung finden, welches sowohl als Base als
auch als Lösungsmittel dienen sollte. Für die Versuche wurden 174 und 1.5
Äquivalente Hydroxamsäure 157 in dem jeweiligen Lösungsmittel gelöst, ggf. mit der
Base versetzt, und bei Raumtemperatur gerührt. Bei den durchgeführten Reaktionen
konnte bereits nach kurzer Zeit eine dünnschichtchromatographische Umsetzung zu
zwei Produkten beobachtet werden. Diese konnten nach kompletter Umsetzung und
anschließender säulenchromatographischer Reinigung sauber erhalten werden.
Neben dem erhaltenen 3’,5’-BisTBDMS-2‘-dG 121 konnte auch das zweite Produkt
charakterisiert werden. Zwar handelt es sich auch bei diesem nicht um das
gewünschte O6-Addukt, vielmehr konnte das unerwartet entstandene C8-N-Ac-
geschützte Addukt 175 isoliert werden (s. Abb. 88, S. 89).
Resultate und Diskussion
89
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
174
N
NN
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
175
AcN
Lösungsmittel/Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute
157, Cs2CO3, 1,2-DME Rt 2 h 52%
157, Pyridin Rt 16 h 75% Abb. 88 Zusammenfassung der Versuche zur basenkatalysierten Substitution an 174
Die Umsetzung zum Produkt 175 gelang dabei in 1,2-DME unter Zugabe von
Cäsiumcarbonat mit einer Ausbeute von 52% nach zwei Stunden, während die
Verwendung von Pyridin als Base und Lösungsmittel nach 16 Stunden gar eine
Ausbeute des sauberen Produktes von 75% lieferte.
Mittels dieser Methode sind offensichtlich die O6-Addukte nicht zugänglich, jedoch ist
hiermit eine neue und erste Methode gefunden worden, die einen schnellen und
einfachen Zugang zu den C8-N-Ac-Addukten liefert, welche ebenfalls eine Rolle in
der chemischen Carcinogenese spielen. Im Gegensatz zu der bislang einzigen
veröffentlichten Syntheseroute solcher Addukte von Schärer et al. (s. Abb. 16, S. 20)
ist hier keine komplexe Schutzgruppenstrategie sowie keine metallkatalysierte
Kreuzkupplungsreaktion nötig. Allerdings scheint hier eine zunächst durchgeführte
Aktivierung der O6-Position mit Benzotriazol elementar. In einer durchgeführten
Testsynthese zur direkten Umsetzung von 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG 121 unter Zugabe
der Hydroxamsäure 157, BOP und DIPEA in DMF konnte auch nach 96 Stunden
keine Umsetzung detektiert werden (s. Abb. 89, S. 90). Auch eine zu erwartende
erneute Aktivierung der O6-Position mit Benzotriazol konnte nicht beobachtet werden.
Resultate und Diskussion
90
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
175
AcN157, BOP, DIPEA, DMF
Rt, 96 h
Abb. 89 Versuch zur direkten Umsetzung von 121 zu dem C8-N-Ac-Addukt 175
Diese Beobachtungen geben einen ersten Aufschluss über den Mechanismus,
welcher zu dem unerwarteten Produkt 175 führen könnte. Da ebenfalls kein an der
O6-Position Benzotriazol-geschütztes C8-N-Ac-Addukt erhalten werden konnte,
scheint zunächst eine Reaktion der Hydroxamsäure mit der Benzotriazol-Gruppe
stattzufinden (s. Abb. 90).
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
174
N
NN
NOH
O
157
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
N
NN
ON
O
NN
N
O
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSON
ONH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
175
AcN
Abb. 90 Postulierter Mechanismus zur Darstellung der C8-N-Ac-Addukte aus 174
Resultate und Diskussion
91
Nach einer Addition der Hydroxamsäure 157 an die Benzotriazol-Gruppe könnte sich
unter Abspaltung von Hydroxybenzotriazol neben 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG ein
hochreaktives Nitreniumion bilden, welches analog zu dem in vivo gefundenen
Mechanismus (s. Abb. 6, S. 10) zu dem C8-N-Ac-Addukt 175 reagiert. Durch diesen
Mechanismus würde ebenfalls die Entstehung des 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG 121 als
Nebenprodukt erklärt werden, da möglicherweise keine quantitative Umsetzung mit
dem intermediär gebildeten Nitreniumion erfolgt. Ein solcher Mechanismus wäre
insofern bemerkenswert, da hier ein Beispiel für eine elektrophile Arylaminierung
vorliegen würde. Diese Methode wurde in vorangegangenen Arbeiten zur Darstellung
von C8-Arylamin-Addukten angewendet, lieferte aber mit 2.5% sehr schlechte
Ausbeuten (s. Abb. 7, S. 13). Zukünftige Arbeiten sollen Aufschluss über den
Mechanismus dieser Reaktion geben. Hierbei könnte ein intermediär entstehendes
Nitreniumion abgefangen werden oder eine Reaktionsverfolgung isotopen-markierter
Edukte mittels NMR-Spektroskopie erfolgen.
Die NMR-Spektren des hier dargestellten C8-N-Ac-Adduktes 175 weisen eine starke
Verbreiterung der Signale auf. Diese Beobachtung wurde bereits von Beland et al.
gemacht.[113] Diese beschrieben, dass eine solche Verbreiterung möglicherweise
durch vorliegende Rotationsisomere verursacht wird. Diese These sollte anhand von
NMR-spektroskopischen, temperaturabhängigen Messungen gestützt werden. Diese
wurden exemplarisch mit dem Addukt 175 durchgeführt. Dazu wurde die Substanz in
DMSO-d6 gelöst und bei verschiedenen Temperaturen spektroskopisch untersucht.
Abbildung 91, S. 92 enthält exemplarisch einen Ausschnitt (H1‘, NH2-Funktion, sowie
aromatischer Bereich) aus den jeweils durchgeführten Messung aus denen eine für
diese Verbindung charakteristische Koaleszenztemperatur (Temperatur, bei der sich
beide Signale komplett zu einem überlagern) ermittelt werden kann. Diese liegt über
einem Wert von 353 K.
Resultate und Diskussion
92
4 . 85 . 25 . 66 . 06 . 46 . 87 . 27 . 68 . 08 . 48 . 8( p p m)
300 K
323 K
333 K
353 K
Abb. 91 Koaleszenz im Bereich von 5-8 ppm der Verbindung 175
Um die Zugänglichkeit solcher Addukte für die Oligonucleotidsynthese zu zeigen,
sollte das dargestellte Addukt 175 in das entsprechende Phosphoramidit überführt
werden. Hierzu wurden bei allen weiteren durchgeführten Reaktionen jeweils die für
die C8-Addukte etablierten Bedingungen mit einer Ausgangsmenge von 150 mg
angewendet.
Zunächst erfolgte die Abspaltung der TBDMS-Gruppen mittels Triethylamin-
Trihydrofluorid (s. Abb. 92).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
175
AcNEt3N*3HF,Et3N, DCM,THF
Rt, 3 h
96%
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
176
AcN
Abb. 92 TBDMS-Entschützung des C8-N-Ac-Adduktes 175
Das komplett entschützte Addukt 176 konnte dabei mit einer sehr gute Ausbeute von
96% isoliert werden. Anschließend erfolgte die Einführung der basenlabilen
Schutzgruppe Formamidin an der exocyclischen Aminofunktion (s. Abb. 93, S. 93).
Resultate und Diskussion
93
Dimethylformamid-diethylacetal,Pyridin
Rt, 24 h
61%
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
176
AcNNH
N
N
O
NN
O
OH
HO
177
AcNN(Me)2
Abb. 93 Formamidin-Schützung des C8-N-Ac-Adduktes 176
Nach säulenchromatographischer Reinigung konnte dabei das entsprechende
Produkt 177 mit einer Ausbeute von 61% isoliert werden.
Als weitere Schutzgruppe wurde die DMTr-Funktion an der 5‘-OH-Gruppe eingeführt
(s. Abb. 94).
DMTrCl,Pyridin
Rt, 3.5 h
56%
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
177
AcNN(Me)2
NH
N
N
O
NN
O
OH
DMTrO
178
AcNN(Me)2
Abb. 94 DMTr-Schützung des C8-N-Ac-Adduktes 176
Das entsprechend geschützte Produkt konnte dabei nach Aufarbeitung und
Reinigung mit einer Ausbeute von 56% erhalten werden.
Abschließend sollte die Überführung in das Phosphoramidit 179 erfolgen (s. Abb. 95,
S. 94).
Resultate und Diskussion
94
107, DCI,DCM, MeCN
Rt, 1 h
68%
NH
N
N
O
NN
O
OH
DMTrO
178
AcNN(Me)2
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
AcN
179
N(Me)2
PO N(iPr)2
NC
Abb. 95 Überführung des C8-N-Ac-Addukt 178 in das entsprechende Phosphoramidit 179
Auch diese Überführung gelang unter den für die C8-Addukte etablierten
Reaktionsbedingungen und das Produkt 179 konnte mit einer zufriedenstellenden
Ausbeute von 68% erhalten werden.
Somit ist es gelungen das C8-N-Ac-Arylamin-modifizierte Addukt darzustellen und in
insgesamt sieben Syntheseschritten, ausgehend vom 2‘-dG, in das entsprechende
Phosphoramidit 179 mit einer Gesamtausbeute von 20% zu überführen und damit
eine höchst effiziente Syntheseroute für die Zugänglichkeit solcher Addukt und deren
Einbau in Oligonucleotide zu entwickeln. Die Untersuchungen dieser Addukte und
deren gezielter Einbau in Oligonucleotide sind Gegenstand gegenwärtiger Arbeiten in
unserem Arbeitskreis und werden von Frau Sarah Krüger durchgeführt.
4.4 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide
Die im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten C8- und N2-Arylamin-modifizierten
Phosphoramidite sollten nun gezielt in verschiedene Oligonucleotide eingebaut und
deren Einfluss auf die Eigenschaften untersucht werden.
Oligonucleotide sind Polymere, die durch Polykondensation von
Nucleosidphosphaten entstehen. Im Gegensatz zu der auf 5’-Triphosphaten
basierenden natürlichen DNA-Synthese verläuft die Oligonucleotidsynthese am DNA-
Synthesizer aufgrund der höheren Reaktivität der 5’-Hydroxygruppe in 3’→5’-
Richtung. Die Methoden zur chemischen Synthese von Oligonucleotiden
unterscheiden sich im Wesentlichen durch die Art wie die
Phosphorsäureesterbindung erhalten wird. Man unterscheidet die Triester-,
Resultate und Diskussion
95
Phosphit-, Phosphoramidit-, bzw. H-Phosphonatmethode (s. Abb. 96). Als
Ausgangsverbindung der Synthese fungiert das entsprechend geschützte
Nucleosidderivat 180.
ODMTrO
O
180
P
B
OHO
OR1
B+
1) Katalyse
ODMTrO
OP
OO
B
O
OR1
B2) Oxidation
X OR2
181
R2O
182X = Cl, N
B = N
NN
NNH
O
N
N
N
O
HO
NH
NN
NO
N
NH
N
O
OO
O
DMTr =
ABz CBz Gform T
ODMTrO
O
180P
O OR2O
B
OHO
OR1
B+
Kondensation
ODMTrO
OP
OO
B
O
OR1
BR2O
ODMTrO
O
180P
O HO
B
OHO
OR1
B+
1) Kondensation
ODMTrO
OP
OO
B
O
OR1
BO2) Oxidation
Phosphit- (X=Cl) bzw. Phosphoramiditmethode (X=N(i-Pr)2):
H-Phosphonatmethode:
Triestermethode:
N(Me)2
Abb. 96 Methoden der Oligonucleotidsynthese
Resultate und Diskussion
96
Obgleich viele Schutzgruppen bekannt sind, haben sich aufgrund der
Automatisierung der DNA-Synthese einige wenige Schutzgruppen durchgesetzt. Dies
sind im Wesentlichen die von Khorana[114] eingeführten Acylgruppen für die
exocyclischen Aminofunktionen an Adenin und Cytosin, die Formamidin-Gruppe am
Guanin sowie die 4,4’-Dimethoxytriphenylmethylgruppe (DMTr) an der 5’-
Hydroxylgruppe der Desoxyribose.
Das Startmolekül wird bei der automatisierten Festphasensynthese über die
3’-Hydroxylgruppe und einem Linker an einen sogenannten „controlled pore glass“-
Träger (CPG-Träger) gebunden. Der Linker zwischen dem festen Trägermaterial und
dem Startnucleosid ist im allgemeinen eine Dicarbonsäure (meist Bernsteinsäure),
die wiederum an ein langkettiges Alkylamin (Long Chain Amino Alkyl) gebunden ist.
Die wegen ihrer sehr guten Ausbeuten standardmäßig angewandte Methode ist die
Phosphoramiditmethode. Hier wird ein geschütztes Nucleosidphosphoramidit 181 in
Gegenwart eines Aktivators wie Tetrazol oder Dicyanoimidazol mit einem 5’-OH-
freien Nucleosid 180 zu einem Phosphittriester umgesetzt. Eine nachfolgende
Oxidation führt zum entsprechenden Phosphattriester 182.
Durch die höhere Reaktivität der P(III)-Verbindungen im Gegensatz zu den P(V)-
Verbindungen sind die Phosphoramidite attraktive Edukte, wobei zunächst ihre
schlechte Zugänglichkeit und Lagerfähigkeit der monomeren Bausteine im Wege
stand. Mit der Einführung der durch milde Säuren aktivierbaren Phosphoramidite
durch H. Köster et al.[115] und deren Optimierung durch M. H. Caruthers et al.[116]
gelang der Durchbruch, wobei heute die Diisopropylaminoverbindungen in
Verbindung mit der 2-Cyanoethylschutzgruppe den besten Kompromiss darstellen.
Der Synthesezyklus (s. Abb. 97, S. 97) beginnt mit der Abspaltung der DMTr-
Schutzgruppe durch Trifluoressigsäure (TFA, 1% in Acetonitril) (Schritt 1). Darauf
folgt die Addition des Nucleosidphosphoramidits, das zuvor durch DCI aktiviert wurde
(Schritt 2). Man erhält zunächst ein 3’→5’-verknüpftes Dinucleosidphosphit mit einer
Ausbeute von über 99% (Schritt 3). Zur Vermeidung von Fehlsequenzen werden
daraufhin nicht abreagierte 5’-Hydroxygruppen mit Essigsäureanhydrid und N-
Methylimidazol als 5’-Acetate blockiert (Schritt 4). Der anschließenden Oxidation des
dreiwertigen Phosphits zum fünfwertigen Phosphat mit einer Iodlösung (Schritt 5)
Resultate und Diskussion
97
folgen erneut die saure Abspaltung der nächsten DMTr-Gruppe und der Eintritt in den
sich wiederholenden Synthesezyklus.
PN O CN
OTrMDO
O
B
OTrMDO
OP O
O
B
O
O
BNC
CPG
O
OHO
O
B
CPG
OP O
B
O
O
BONC
CPG
OTrMDO
TrMDO
O
BO
CPG
OAcO
O
B
CPG
Kettenabbruch
B = ABz, GForm, CAc oder T
F3CCOOH
HN
N CN
CN
NH4OH
4. Capping
< 1%
I2/H2O
5. Oxidation
3. Addition
Oligonucleotid6. Schutzgruppen abspaltung
2. Aktivierung
1. Detritylierung
Abb. 97 Synthesezyklus der Phosphoramiditmethode
Nach Abschluss der Synthese wird unter Standardbedingungen das Oligonucleotid
mit konzentrierter, wässriger Ammoniaklösung von der festen Phase abgespalten
und die Schutzgruppen der Nucleobasen sowie der Phosphatgruppen im gleichen
Medium bei erhöhter Temperatur (45 °C) entfernt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Herstellung verschiedener modifizierter und
unmodifizierter Oligonucleotide dreier Sequenzen erfolgen.
Resultate und Diskussion
98
Zunächst sollte die bereits von Rizzo für das heterocyclische Amin IQ verwendete
NarI-Sequenz 56 verwendet werden. Das als Hotspot für aromatische Amine
bekannte 12mer sollte an verschiedenen Positionen C8-modifiziert und der Einfluss
der Modifikation auf den Tm-Wert und die Konformation untersucht werden (s. Tab.
10).
Oligonucleotid Sequenz
56 5'-d(CTCGGCGCCATC)
183 5'-d(GATGGCGCCGAG)
184 5'-d(CTC[G(Anil)]GCGCCATC)
185 5'-d(CTC[G(4-ABP)]GCGCCATC)
186 5'-d(CTCGGC[G(Anil)]CCATC)
187 5'-d(CTCGGC[G(4-ABP)]CCATC)
188 5'-d(CTCGGCG[(4-Anis)]CCATC) Tab. 10 Zusammenfassung aller synthetisierten Oligonucleotide der NarI-Sequenz
Als weitere Sequenz wurde ein selbstkomplementäres 12mer gewählt, welches eine
Schnittstelle für das Restriktionsenzym EcoRI besitzt (Sequenz wird im Folgenden
als EcoRI-Sequenz bezeichnet).
Hier sollten neben den C8-Addukten, welche an verschiedenen Stellen der Sequenz
eingebaut wurden, auch die synthetisierten N2-Addukte eingebaut werden (s. Tab.
11, S. 99). Anschließend sollten erneut Untersuchungen bezüglich des Einflusses
der Modifikation auf den Tm-Wert und die Konformation, sowie den Restriktionsabbau
durch das EcoRI-Enzym durchgeführt werden.
Um den Einfluss solcher Modifikationen auf längere Oligonucleotide zu untersuchen,
wurden als Weiteres die synthetisierten Phosphoramidite in ein nicht-palindromisches
30mer eingebaut (s. Tab. 12, S. 99). Nach den Standarduntersuchungen bezüglich
des Einflusses der Modifikation auf den Tm-Wert und die Konformation, sollten in
Kooperation mit Prof. Andreas Marx, Universität Konstanz, Primer-
Verlängerungsuntersuchungen mit den dargestellten C8-Arylamin-modifizierten
Oligonucleotiden 203-208 erfolgen.
Resultate und Diskussion
99
Oligonucleotid Sequenz
57 5'-d(GTAGAATTCTAC)
189 5'-d(GTA[G(Anil)]AATTCTAC)
190 5'-d(GTA[G(4-Anis)]AATTCTAC)
191 5'-d(GTA[G(4-Tol)]AATTCTAC)
192 5'-d(GTA[G(4-Cyano)]AATTCTAC)
193 5'-d(GTA[G(3,5-DMA)]AATTCTAC)
194 5'-d(GTA[G(4-ABP)]AATTCTAC)
195 5'-d(GTA[G(2-AF)]AATTCTAC)
196 5'-d([G(Anil)]TAGAATTCTAC)
197 5'-d([G(4-ABP)]TAGAATTCTAC)
198 5'-d(GTA[G(N2-Hydr. Anil)]AATTCTAC)
199 5'-d(GTA[G(N2-Hydr. 4-ABP)]AATTCTAC)
200 5'-d(GTA[G(N2-Azo Anil)]AATTCTAC)
201 5'-d(GTA[G(N2-Azo 4-ABP)]AATTCTAC) Tab. 11 Zusammenfassung aller synthetisierten Oligonucleotide der EcoRI-Sequenz
Oligonucleotid Sequenz
58 5'-d(AAATGAACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
202 5‘-d(CGTTGGTCCTGAAGGAGGATAGGTTCATTT)
203 5'-d(AAAT[G(Anil)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
204 5'-d(AAAT[G(4-Anis)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
205 5'-d(AAAT[G(4-Tol)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
206 5'-d(AAAT[G(3,5-DMA)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
207 5'-d(AAAT[G(4-ABP)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
208 5'-d(AAAT[G(2-AF)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
209 5'-d(AAAT[G(N2-Hydr. Anil)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
210 5'-d(AAAT[G(N2-Hydr. 4-ABP)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
211 5'-d(AAAT[G(N2-Azo Anil)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
212 5'-d(AAAT[G(N2-Azo 4-ABP)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) Tab. 12 Zusammenfassung aller synthetisierten 30mer-Oligonucleotide
Resultate und Diskussion
100
Die Synthesen der unmodifizierten Oligonucleotide wurden mittels Festphasen-
synthese nach der Phosphoramiditmethode auf einem DNA-Synthesizer der Firma
Applied Biosystems (Modell 392/394) durchgeführt. Zur Synthese der unmodifizierten
Oligonucleotide wurden sowohl die Standard-Chemikalien als auch die
Syntheseprotokolle des Herstellers (s. Anhang) verwendet. Als Trägermaterial
wurden kommerziell erhältliche Succinyl-CPG-Träger eingesetzt. Die
Kupplungsausbeuten lagen bei jedem Schritt bei ca. 98% (ermittelt über einen Trityl-
Assay).
Zur Synthese der modifizierten Oligonucleotide wurden die zuvor synthetisierten
Oligonucleotidbausteine in ein spezielles (spitz zulaufendes) Synthesizerfläschchen
überführt und in absolutem Acetonitril gelöst. Die Konzentration der eingesetzten
Phosphoramidite betrug stets 0.1 M. Es wurden die Standard-Chemikalien der
Hersteller eingesetzt. Beim Einbau des modifizierten Amidits wurde das
Kupplungsprotokoll leicht verändert (s. Anhang). Es wurde ein dritter
Kupplungsschritt eingefügt und die Kupplungszeit bei jedem der drei Schritte von 15
auf 500 sec verlängert. Dies konnte die Kupplungsausbeute jedoch nicht über 60%
bei den C8-Addukten (NH und N-Ac) bzw. 80% bei den N2-Addukten steigern und
liegt damit deutlich unter den Ausbeuten der Standardkupplungen, die auch in
diesem Fall ca. 98% betrugen. Alle Synthesen wurden im 1 μM-Maßstab
durchgeführt. Nach den Synthesen wurden die Oligonucleotide unter den im
Folgenden beschriebenen identischen Bedingungen gereinigt, isoliert und
charakterisiert.
4.4.1 Synthese C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide
Die letzte DMTr-Schutzgruppe wurde noch am Synthesizer entfernt. Anschließend
wurden die Oligonucleotide manuell mit konzentriertem Ammoniak und
β-Mercaptoethanol vom CPG-Träger abgespalten. Zur Abspaltung der
Schutzgruppen der einzelnen Basen wurde diese Lösung anschließend für 4 h im
Thermomixer bei 45 °C inkubiert und abschließend im Vakuum (Speed-Vac)
aufkonzentriert.[117,118]
Resultate und Diskussion
101
Die erhaltenen Rohprodukte wurden in Reinstwasser aufgenommen und auf eine
RP-18-Säule gegeben und mit einem Triethylammoniumacetat-Puffer (TEAA-Puffer,
pH 6.9) und einem Acetonitrilgradienten eluiert. Der Gradient wurde für die
Oligonucleotide so gewählt, dass der (n-1) – Peak des um eine Base kürzeren
Oligonucleotids eindeutig vom Produktpeak zu unterscheiden war. Die
Säulentemperatur betrug 25 °C.
Anschließend wurde das Roh-Oligonucleotid mit dem optimierten Gradienten
gereinigt. Die Absorption wurde bei 260 nm gemessen. Abbildung 98 zeigt
exemplarisch das Roh-Chromatogramm des C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids
189. Der gewünschte Peak wurde in einzelnen Fraktionen gesammelt und
anschließend von jeder Fraktion eine Probe chromatographisch über die HPLC
analysiert. Abbildung 99, S. 102 zeigt exemplarisch das Chromatogramm des
gereinigten C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids 189. Gleiche Fraktionen wurden
dabei vereinigt und in einem Speed-Vac-Probenkonzentrator bis zur Trockene
eingeengt.
0 10 20 30 40 50 60
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
t [min]
Abb. 98 Rohgemisch des Anilin-modifizierten Oligonucleotids d(GTA[G(Anil)]AATTCTAC) 189
Resultate und Diskussion
102
0 10 20 30 40 50 6
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0
t [min]
Abb. 99 Isoliertes gereinigtes Anilin-modifiziertes Oligonucleotid d(GTAG(Anil)AATTCTAC) 189
Analoge Trennungen wurden für alle synthetisierten Oligonucleotide durchgeführt.
Die gereinigten und getrockneten Oligonucleotide wurden erneut in je 200 μL
Reinstwasser aufgenommen. Von 20 μL dieser Oligonucleotidlösung wurde nun die
Absorption bei 260 nm (A260) gemessen. Aus dem A260-Wert ließ sich durch
Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor die optische Dichte der Gesamtlösung
(OD260) und daraus die Menge des in den Fraktionen erhaltenen Oligonucleotids
berechnen (s. Abschnitt 8.3.1 S. 159). Die erhaltenen Mengen der modifizierten
Oligonucleotide lagen dabei 4-5fach höher als dieses über die isoButyryl-Strategie
bislang möglich war.
Zur Identifizierung der erhaltenen, sauberen Fraktionen der Oligonucleotide mittels
ESI-MS wurde eine Lösung aus 20% Isopropanol und 1% Triethylamin in Wasser
hergestellt. Die ESI-MS Messungen wurden von Frau Christine Christ, unter der
Anleitung von Dr. Stefan Franke, mit einer Oligonucleotidkonzentration von 5 pM/ μL
durchgeführt. Mittels dieses Lösungsmittelgemisches gelang eine erfolgreiche
Vermessung und Charakterisierung aller synthetisierten 12mere 56,57 und 183-197.
Resultate und Diskussion
103
Abbildung 100 zeigt exemplarisch das aufgenommene ESI-MS-Spektrum des
modifizierten Oligonucleotids 189.
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700m /z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
465 532
535
468 621
471 538624
500 544492485414 473 563 628571554424 476 590 632494 584503 514 636519441 573 668416 527425 609459452408406 606 671598 642 664617440 696690
- 8 - 7
- 6
Abb. 100 Spektrum des modifizierten Oligonucleotids 189
Oligonucleotide sind Polyanionen und liegen in größeren Ladungen als -1 vor.
Maximale Ladung des Dodecamers ist -11. Bei den ESI-MS-Spektren muss somit
die m/z mit der dort vorliegenden Ladung multipliziert werden, um die Masse des
Oligonucleotids zu erhalten.
Für die synthetisierten 30mere 58 und 202-208 war eine Vermessung in Hamburg
und die damit verbundene Charakterisierung nicht möglich. Die Charakterisierung
erfolgte mittels ESI-MS-Spektrometrie durch die Arbeitsgruppe von Prof. A. Marx an
der Universität Konstanz.
Resultate und Diskussion
104
4.4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide
Bei den N2-Arylamin-modifizierten Oligonucleotiden war die Entschützung in konz.
Ammoniak nicht ausreichend, da die modifizierten Nucleotide an der O6-Position
CPE geschützt waren und die Schutzgruppe, obwohl auch sie basenlabil ist, nicht mit
Ammoniak abgespalten werden konnte.
Stengele et al. berichteten über die erfolgreiche Verwendung von
2-(4-Nitrophenyl)ethyl- (NPE) und 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl- (NPEOC)
Schutzgruppen. NPEOC wurde anstelle der Benzoyl- bzw. der iBu-Gruppe zur
Blockierung des N6 am dA und des N2 am dG benutzt und die NPE-Schutzgruppe
wurde zur Schützung der Amidfunktion des dG verwendet.[119] Die Abspaltung (β-
Eliminierung) wurde mit 0.5 M DBU in Acetonitril innerhalb von 6 h bei Rt erfolgreich
durchgeführt. DBU in abs. Pyridin wurde von Uhlmann et al. für die Abspaltung der
NPE-Schutzgruppe an Phosphorsäuretriestern verwendet, wobei sie dort als
Schutzgruppe am Phosphorzentrum diente.[120] 1995 berichteten Pfister et al.
außerdem über die Verwendung von der 2-(4-Nitrophenyl)ethylsulfonyl- (NPES)
Schutzgruppe für Schützungen der 2’-Hydroxygruppe an Ribonucleotiden und deren
erfolgreiche Abspaltung mit DBU in Acetonitril.[121]
Da die CPE-Schutzgruppe eine ähnliche Reaktivität wie die NPE-Schutzgruppe
besitzt, sollte sie sich unter gleichen Bedingungen abspalten lassen. Die
Verwendung von DBU als sterisch anspruchsvolle, nicht nucleophile, aber trotzdem
starke Base bietet noch den weiteren Vorteil, dass das Oligonucleotid nicht von der
festen Phase abgespalten wird und somit die DBU-Salze durch Filtration entfernbar
sind.
Zu Testzwecken wurde das Oligonucleotid 200 hergestellt, um dann die idealen
Bedingungen zur CPE-Abspaltung bestimmen zu können. Zuerst wurde Acetonitril
als Lösungsmittel benutzt und die DBU Konzentration sowie die Temperatur variiert.
Wie in Tab. 13, S. 104 zu erkennen ist, fand nach 24 h Reaktionszeit weder bei 0.1 M
noch bei 0.5 M DBU eine Abspaltung der CPE-Gruppe statt. Auch eine Erhöhung der
Temperatur von RT auf 45 °C brachte in beiden Fällen keinen Erfolg. Die
Verwendung von Pyridin als Alternative zu Acetonitril führte bei 0.1 M DBU ebenfalls
Resultate und Diskussion
105
zu keinem erfolgreichen Ergebnis. Jedoch konnte mit 0.5 M DBU in Pyridin bei Rt die
CPE-Schutzgruppe ohne störende Nebenreaktionen quantitativ abgespalten werden.
Lösungsmittel Temp. Zeit c (DBU) Abspaltung
Acetonitril Rt 24 h 0.1M Nein
Acetonitril 45 24 h 0.1M Nein
Acetonitril Rt 24 h 0.5M Nein
Acetonitril 45 24 h 0.5M Nein
Pyridin Rt 24 h 0.1M Nein
Pyridin 45 24 h 0.1M Nein
Pyridin Rt 24 h 0.5M JA
Tab. 13 Abspaltungsmethoden der CPE-Gruppe nach der Oligonucleotidsynthese
Nach der CPE-Abspaltung fand die vollständige Entschützung und Abspaltung von
der festen Phase unter den bekannten Bedingungen mit konz. Ammoniak und β-
Mercaptoethanol (4 h bei 45 °C) statt. Anschließend konnten die Reinigungen mittels
HPLC und die anschließende Charakterisierung mittels ESI-MS analog zu den
dargestellten C8-Arylamin-modifizierten Oligonucleotiden erfolgen.
Mittels dieser Methoden gelang die Darstellung N2-Azoaryl-modifizierter
Oligonucleotide.
In den ESI-Spektren der N2-Hydrazinoaryl-modifizierten Oligonucleotide trat bei der
Charakterisierung das Problem auf, dass nur die Masse des gewünschten
Oligonucleotides plus 40 gefunden wurde. Da eine zusätzliche Acetylgruppe die
Gesamtmasse exakt um 40 erhöhen würde, liegt die Vermutung nahe, dass eine
Acetylierung des Oligonucleotides durch das verwendete Essigsäureanhydrid im
Capping-Schritt bei der chemischen DNA-Synthese stattgefunden hat (vgl. Abb. 97,
S. 97). Da außer der Hydrazinofunktion alle anderen funktionellen Gruppen
geschützt sind, kann die Acetylierung somit nur dort stattgefunden haben. Um diese
Vermutung zu bestätigen, wurde die geschützte N2-Hydrazinophenyl-modifizierte
Resultate und Diskussion
106
Verbindung 136 mit Essigsäureanhydrid unter den am Synthesizer verwendeten
Bedingungen umgesetzt (s. Abb. 101). Nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden
konnte dabei das doppelt acetylierte Produkt 213 erhalten werden.
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
136
HN Ac2O, THF
Rt, 3 h
N
N
N
OCPE
NAc
N
O
OTBDMS
TBDMSO
213
AcN
Abb. 101 Acetylierungsreaktion am N2-Addukt 136
Eine anschließende Abspaltung mit Ammoniak unter den Standardbedingungen (4 h,
45 °C) lieferte das erwartete monoacetylierte Produkt 214 (s. Abb. 102).
N
N
N
OCPE
NAc
N
O
OTBDMS
TBDMSO
213
AcN konz. NH3
45 °C, 4 h
N
N
N
OCPE
NAc
N
O
OTBDMS
TBDMSO
214
HN
Abb. 102 Entschützung des diacetylierten N2-Addukt 213
Die Position der Acetylgruppe konnte dabei mit Hilfe der 2D-NMR-Spektren bestimmt
werden.
Um die Acetylgruppe wieder abzuspalten wurde zuerst die Dauer der normalen
Entschützung mit Ammoniak von 4 auf 24 h verlängert, was jedoch keine Abspaltung
bewirkte. Reddy et al. berichteten über die Verwendung von Methylamin/Ammoniak
1:1 zur Entschützung von Oligonucleotiden, wodurch sich die Reaktionszeit von 4 h
auf 10 min bei 55 °C verkürzen ließ, was auf die größere Nucleophilie des
Methylamins zurückgeführt wurde.[122] Außerdem wurde berichtet, dass mit dieser
Methode die Ausbeute bei der Synthese von Oligoribonucleotiden deutlich gesteigert
Resultate und Diskussion
107
werden konnte. Bei der testweise durchgeführten Entschützung der N2-
Hydrazinoaryl-modifizierten Dodecamere führte die Anwendung von
Methylamin/Ammoniak 1:1 jedoch wiederum nur zu dem monoacetylierten Produkt
und dies in schlechteren Ausbeuten.
Bei der Verwendung von stärkeren Basen wie 1 N Natriumhydroxidlösung konnte
eine Zersetzung des modifizierten Oligonucleotids beobachtet werden.
Somit scheint eine nachträgliche Abspaltung dieser Acetylgruppe nicht durchführbar.
Zur Darstellung der gewünschten N2-Hydrazinoaryl-modifizierten Oligonucleotide
muss deshalb diese Acetylierung vermieden werden.
Im Jahre 2001 berichtete Greenberg von der Verwendung anderen Reagenzien zum
„cappen“ der Abbruchstränge wie Trimethylessigsäureanhydrid zur Vermeidung
unerwünschter Acetylierungen.[123] Durch dieses Ersetzen des Capping-Reagenzes
gelang es nach analogem Entfernen der Schutzgruppen die N2-Hydrazinoaryl-
modifizierten Oligonucleotide 198, 199 und 209, 210 erfolgreich darzustellen. Eine
Reaktion mit dem Trimethylessigsäureanhydrid konnte auch in geringem Maße nicht
beobachtet werden. Für die synthetisierten N2-Arylamin-modifizierten Oligonucleotide
erfolgte die Charakterisierung mittels ESI-MS-Spektrometrie durch die Arbeitsgruppe
von Prof. A. Marx an der Universität Konstanz. Abbildung 103, S. 108 zeigt
exemplarisch das aufgenommen ESI-MS-Spektrum des modifizierten Oligonucleotids
209.
Eine Alternative zur Verwendung des Trimethylessigsäureanhydrids zur Vermeidung
der Acetylierung wäre das Auslassen des Capping-Schrittes bei allen Schritten nach
dem erfolgten Einbau der N2-Hydrazinoaryl-Modifikation. Dieses hätte jedoch eine
erschwerte Abtrennung der Abbruchstränge zur Folge, weswegen auf die
Anwendung diese Methode verzichtet wurde.
Resultate und Diskussion
108
416.9 465.9 489.9
547.5
581.8
620.7 665.2 716.5
776.3
847.0
931.8
1035.5
1165.2 1194.5 1313.4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 5 x10 Intens.
400 600 800 1000 1200 1400 m/z
- 8
- 9
- 10
- 11
- 12
- 13 - 14 - 15
- 16
Abb. 103 ESI-MS-Spektrum des N2-Hydrazinobiphenyl-modifizierten Oligonucleotids 209
Für die Untersuchungen hinsichtlich des Einflusses einer Arylamin-Modifikation lagen
nun, neben den synthetisierten C8-Arylamin-modifizierten Oligonucleotiden, auch die
entsprechenden N2-Azo- und N2-Hydrazino-modifizierten Oligonucleotide in reiner
Form vor.
Zunächst sollte dabei die Messung der Schmelztemperaturen (Tm-Werte) erfolgen,
um Aussagen über die thermische Stabilität der modifizierten Oligonucleotide im
Vergleich zu den unmodifizierten machen zu können. Ebenfalls sollten hierüber
Aussagen über den Einfluss unterschiedlicher Arylamin-Modifikationen und
unterschiedlicher Modifikationsarten (C8 und N2) gemacht werden können.
Resultate und Diskussion
109
4.5 Messung der Schmelztemperaturen (Tm-Werte)
Bei Oligonucleotiden kann durch Messung der UV-Absorption als Funktion der
Temperatur der thermisch induzierte Übergang von einer geordneten, helikalen
Struktur in einen ungeordneten Zustand mit statistischer Verteilung der Konformation
verfolgt werden. Die elektronische Wechselwirkung der π-Systeme der Basen, die in
der helikalen Form in Stapeln senkrecht zur Helixachse angeordnet sind, führt zu
einer deutlichen Reduktion der UV-Absorption, dem hypochromen Effekt
(Hypochromizität).[124]
Beim Erwärmen der Probe sollte der Absorptionswert zunächst langsam, dann
sprunghaft und später wieder langsam steigen. Dieser sigmoide Verlauf resultiert aus
dem Phänomen, dass von einem Startpunkt aus, meistens den Strangenden, die
Denaturierung sehr schnell den Duplex entlang verläuft, da der Zustand eines
Nucleotids die Konformation der benachbarten Nucleotide beeinflusst.
Der Grad der Hypochromizität ist ein Maß für die Basenpaarung und –stapelung der
Sekundärstruktur. Der Wendepunkt der sigmoiden Kurve, bzw. das Maximum der
1. Ableitung, das man durch Auftragung der UV-Absorption gegen die Temperatur
erhält, entspricht dem Schmelzpunkt (Tm-Wert) des Duplexes.
Die in dieser Arbeit synthetisierten und untersuchten Oligonucleotide wurden in
einem 2 μM-Maßstab (2 nmol der komplementären Stränge), in einem 10 mM
Phosphat-Puffer mit 140 mM NaCl und 1 mM EDTA, pH 6.8 vermessen. Die
Messungen wurden in einem Temperaturbereich von 5 °C bis 80 °C durchgeführt,
wobei jeweils dreimal von 5 °C auf 80 °C erhitzt und dreimal von 80 °C auf 5 °C
abgekühlt wurde. Die Heiz- bzw. Kühlrate betrug hierbei 0.5 °C/min, wobei alle 0.5 °C
ein Datenpunkt aufgenommen wurde. Vor der eigentlichen Messung wurde die
Probelösung zweimal schnell von 5 °C auf 80 °C erhitzt und wieder auf 5 °C
abgekühlt. Die Heiz- bzw. Kühlrate hierbei lag bei 10 °C/min. Mit dieser „Rampe“
wurde die DNA-Struktur zunächst in Einzelstränge auseinander geschmolzen, damit
sie bei der folgenden Abkühlung eine wohldefinierte Struktur ausbilden konnte. Die
Absorption der Probelösung wurde bei einer Wellenlänge von 260 nm verfolgt. Von
der resultierenden sigmoiden Kurve kann das Maximum der 1. Ableitung zur
Bestimmung des Schmelzpunktes berechnet und die einzelnen Werte gemittelt
Resultate und Diskussion
110
werden. Der so erhaltene Mittelwert wird als Tm-Wert des Duplexes angegeben. Der
Fehler bei dieser Methode beträgt ±1 °C. Eine weitere Möglichkeit den Tm-Wert zu
bestimmen, ist die van’t Hoff’sche Kurvenanalyse. Sie lieferte mit einem Fehler von
±0.5 °C die genaueren Ergebnisse und wurde für die hier angegebenen Werte
verwendet. Zusätzlich dazu lassen sich mittels dieser Methode thermodynamische
Daten (ΔH und ΔS) der Oligonucleotid-Stränge bestimmen.
In Tabelle 14 und Tabelle 15, S. 111 sind die ermittelten Werte für die NarI-Sequenz
aufgelistet.
Oligonucleotid Tm [°C] ΔH [kcal/mol] ΔS [cal/mol/K]
56 (unmod.) 58.2/65[125] -79.1 -267.7
184 (Anil) 50.3 -88.5 -303.0
185 (4-ABP) 40.4 -72.9 -254.8
IQ 58[125] keine Angabe keine Angabe
Tab. 14 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 56 und den an G1-modifizierten NarI-
Oligonucleotiden 184, 185 mit 183 als Gegenstrang
Die dargestellten Tm-Werte wurden für den unmodifizierten Strang 56
5'-d(CTCGGCGCCATC), sowie die modifizierten Stränge 184, 185
5'-d(CTCG*GCGCCATC) mit dem komplementären Strang 183
5'-d(GATGGCGCCGAG) gemessen.
Es ist ein deutlicher Einfluss der beiden Arylamin-Modifikationen auf die thermische
Stabilität zu erkennen. So liegt der Wert für das C8-Anilin-modifizierte Oligonucleotid
184 mit 50 °C bereits 8 °C tiefer als der für das unmodifizierte Oligonucleotid 56.
Einen noch stärkeren Effekt lässt sich bei dem 4-Aminobiphenyl-modifizierten
Oligonucleotid 185 beobachten. Hier reicht eine einzelne Modifikation in dem
vorliegenden 12mer aus, um den Tm-Wert um 18 °C auf 40 °C zu senken. Der Grund
für diesen signifikanten Unterschied muss das polycyclische aromatische System des
4-Aminobiphenyl-modifizierten Oligonucleotids 185 zu sein, welches eine merkliche
Verkrümmung des DNA-Duplexes zur Folge haben könnte. Dieser Einfluss scheint
jedoch nicht in dem Maße für polycyclische, heterocyclische Amine zu gelten. Bereits
Resultate und Diskussion
111
2007 publizierten Rizzo et al. für die verwendete Sequenz den Einbau des C8-IQ-
modifizierten 2‘-Desoxyguanosin.[125] In Tabelle 14, S. 109 ist vergleichend der von
gemessene Wert mit aufgenommen. Dieser liegt mit 58 °C höher, als die hier
vermessenen modifizierten Oligonucleotide 184, 185. Im Vergleich zu dem hier
vermessenen unmodifizierten Strang 56 scheint also kein Effekt beobachtet werden
zu können. Bei den von Rizzo durchgeführten Messungen betrug dieser Tm-Wert
allerdings 65 °C, so dass also auch dort eine Erniedrigung von 7 °C vorliegt, die dem
Einfluss der Anilin-Modifikation entsprechen würde. Der Unterschied in den
gemessenen Tm-Werten für den unmodifizierten Strang 56 liegt an der Verwendung
eineinhalbfach höherer Salzkonzentrationen von Rizzo et al., welche zu einer
zusätzlichen Stabilisierung des Duplexes führen.
Um eine eventuelle Abhängigkeit des Tm-Wertes von der Lage der Modifikation
innerhalb einer bestimmten Sequenz zu ermitteln, wurden neben der G1-Position
ebenfalls analoge Messungen mit den in G3-Position modifizierten Oligonucleotiden
186-188 durchgeführt. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 15, wiederum
vergleichend zu dem an dieser Stelle IQ-modifizierten Oligonucleotid,
zusammengefasst.
Oligonucleotid Tm [°C] ΔH [kcal/mol] ΔS [cal/mol/K]
56 (unmod.) 58.2/65[125] -79.1 -267.7
186 (Anil) 50.3 -47.5 -122.4
187 (4-ABP) 39.2 -47.9 -182.5
188 (4-Anis) 51.4 -65.5 -169.9
IQ 61[125] --- ---
Tab. 15 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 56 und den an G3-modifizierten NarI-
Oligonucleotiden 186-188 mit 183 als Gegenstrang
Auch aus diesen gemessenen Werten ist der unterschiedliche Einfluss der mono-
bzw. polycyclischen aromatischen Modifikation auf die thermische Stabilität zu
erkennen. In diesem Fall haben die monocyclischen Modifikationen der
Oligonucleotide 186 (Anilin) und 188 (4-Anisidin) eine Erniedrigung des Tm-Wertes
Resultate und Diskussion
112
um 7-8 °C auf 50.3 bzw. 51.4 °C zur Folge. Einen erneut stärkeren Einfluss weist die
polycyclische Modifikation 4-Aminobiphenyl im Oligonucleotid 187 auf. Hier ist, wie
schon bei der analogen G1-Modifikation 185, eine starke Senkung auf 39 °C zu
beobachten.
Insgesamt lässt sich allerdings keine Abhängigkeit des Tm-Wertes durch die Position
(G1 oder G3) einer Arylamin-Modifikation feststellen. Anders ist die Beobachtung von
Rizzo für das an G3 IQ-modifizierte Oligonucleotid. Hier ist, anders als an der G1-
Position, nur eine halb so große Senkung des Tm-Wertes (-4 °C) zu beobachten, was
auf eine Abhängigkeit in der Lage einer solchen Modifikation innerhalb eines
Oligonucleotidstranges hindeutet.[125]
Um weitere Informationen über den Einfluss der Arylamin-Modifikationen zu erhalten,
wurden analoge Messungen auch für die selbstkomplementäre Sequenz 57
5'-d(GTAGAATTCTAC) und den an der G2-Position modifizierten Strängen 189-195
und 198-201 5'-d(GTAG*AATTCTAC) gemacht. Die Ergebnisse dieser Messungen
sind in Tabelle 16 dargestellt.
Oligonucleotid Tm [°C] ΔH [kcal/mol] ΔS [cal/mol/K]
57 (unmod.) 42.1 -74.4 -269.5
189 (Anil) 29.5 -88.9 -323.1
190 (4-Anis) 25.5 -90.7 -276.1
191 (4-Tol) 23.2 -50.2 -142.0
192 (4-Cyano) 23.7 -70.5 -212.4
193 (3,5-DMA) 24.0 -80.7 -243.4
194 (4-ABP) 23.9 -87.5 -267.5
195 (2-AF) 23.3 -56.5 -164
198 (N2-Hydr. Anil) --- --- ---
199 (N2-Hydr. 4-ABP) --- --- ---
200 (N2-Azo Anil) --- --- ---
201 (N2-Azo 4-ABP) --- --- ---
Tab. 16 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 57 und den an G2-modifizierten
Oligonucleotiden 189-195 und 198-201
Resultate und Diskussion
113
Wie schon erwartet, sind auch hier die Tm-Werte für die modifizierten Oligonucleotide
niedriger als für den unmodifizierten Referenzstrang 57, der einen Tm-Wert von 42.1
°C aufweist. Dabei lässt sich generell erkennen, dass eine zweite Modifikation
nahezu eine Verdopplung des Effektes bewirkt, wie er bei den Strängen mit einer
monocyclischen Modifikation zu beobachten war. Der geringste Einfluss ist dabei für
das C8-Anilin-modifizierte Oligonucleotid 189 zu erkennen. Hier konnte eine
Senkung, verursacht durch die beiden Modifikationen, des Tm-Wertes um 13 °C auf
29.5 °C beobachtet werden. Für alle weiteren C8-Arylamin-modifizierten
Oligonucleotide 190-195 ist diese Senkung in stärkerem Maße zu beobachten. Die
hierfür gemessenen Tm-Werte liegen im Bereich von 23.2 - 25.5 °C und lassen in
diesem Fall keinen Unterschied im Einfluss poly- bzw. monocyclischer Modifikationen
erkennen.
Einen großen Unterschied machen die N2-modifizierten Oligonucleotide 198-201. In
der vorliegenden selbstkomplementären Sequenz konnte in keinem Fall eine
Paarung des DNA-Stranges beobachtet werden, was auf eine deutlich größere
Destabilisierung dieser Modifikationen gegenüber der analogen Modifikation an der
C8-Position hindeutet. Dabei scheint die Art der Modifikation (N2-Hydrazinoaryl oder
N2-Azoaryl) keine Rolle zu spielen. Ebenso lässt sich zunächst keine Aussage über
einen möglichen unterschiedlichen Einfluss poly- bzw. monocyclischer Modifikationen
machen.
Neben den Modifikationen an der G2-Position sollte exemplarisch eine poly- bzw.
monocyclische Modifikation an der G1-Position eingeführt werden. Die Ergebnisse
der Tm-Wert-Messungen sind in Tabelle 17 zusammengefasst.
Oligonucleotid Tm [°C] ΔH [kcal/mol] ΔS [cal/mol/K]
57 (unmod.) 42.1 -74.4 -269.5
196 (Anil) 35.0 -81.2 -237.1
197 (4-ABP) 30.9 -88.1 -263.1
Tab. 17 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 57 und den an G1-modifizierten
Oligonucleotiden 196-197
Resultate und Diskussion
114
Auch bei diesen Messungen ist augenscheinlich eine Senkung des Tm-Wertes zu
erkennen. Diese ist jedoch im Vergleich zu den Modifikationen in der G2-Position
deutlich geringer, was auf die ohnehin schwächere Basenpaarung an den Enden des
DNA-Doppelstranges zurückzuführen ist. Für das C8-Anilin-modifizierte
Oligonucleotid 196 liegt der gemessene Tm-Wert mit 35 °C lediglich 7.1 °C niedriger
als für den unmodifizierten Strang 57. Ein Unterschied im Einfluss auf die thermische
Stabilität ist hier für die polycyclische Modifikation zu erkennen. So erfolgt eine
deutliche größere Destabilisierung durch die C8-4-Aminobiphenyl-Modifikation auf
30.9 °C. Diese Beobachtung stimmt also mit den für die NarI-Sequenz erhaltenen
Ergebnissen überein.
Um diese Ergebnisse weiter zu bestätigen und den Einfluss der N2-Modifikation auf
die thermische Stabilität zu untersuchen, wurden diese Modifikationen ebenfalls in
ein nicht selbstkomplementäres 30mer-Oligonucleotid eingebaut. Die Ergebnisse der
Tm-Wert-Messungen sind in Tabelle 18 dargestellt.
Oligonucleotid Tm [°C] ΔH [kcal/mol] ΔS [cal/mol/K]
58 (unmod.) 62.3 -67.5 -232.9
203 (Anil) 62.2 -131.7 -361.1
204 (4-Anis) 62.3 -120.6 -389.3
205 (4-Tol) 62.6 -72.7 -246.2
206 (3,5-DMA) 59.0 -89.4 -238.5
207 (4-ABP) 58.7 -72.3 -299.6
208 (2-AF) 59.2 -55.3 -197.7
209 (N2-Hydr. Anil) 60.8 -67.5 -173
210 (N2-Hydr. 4-ABP) 59.8 -53.1 -188.1
211 (N2-Azo Anil) 60.5 -71.5 -214
212 (N2-Azo 4-ABP) 59.2 -62.9 -218.2
Tab. 18 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 58 und den modifizierten
Oligonucleotiden 203-212 mit 202 als Gegenstrang
Aus den Werten lässt sich klar der Unterschied in dem Einfluss der verschiedenen
Modifikationen auf die thermische Stabilität erkennen. So liegen die Tm-Werte der
Resultate und Diskussion
115
monocyclischen C8-Modifikationen 203-205 exakt in dem Bereich des
unmodifizierten Stranges 58, welcher einen Tm-Wert von 62.3 °C aufweist. Ein
Einfluss ist lediglich für die Modifikationen mit den starken Carcinogenen, dem 3,5-
Dimethylanilin und den polycyclischen Arylaminen, erkennbar. Diese Modifikation
führen wie erwartet zu einer Senkung des Tm-Wertes, in diesen Fällen um ca. 3 °C
auf 58.7 - 59.2 °C.
Für beide N2-Anilin-Modifikationen kann eine Reduktion des Tm-Wertes um 2 °C auf
60.5 bzw. 60.8 °C beobachtet werden. Es ist zu erkennen, dass die N2-
Modifikationen in diesen Fällen einen höheren Effekt haben, als die entsprechende
C8-Modifikation (hier war keine Änderung des Tm-Wertes zu erkennen). Dabei
scheint es keine Rolle zu spielen, ob eine N2-Hydrazinoaryl- oder N2-Azoaryl-
Modifikation vorliegt.
Auch für die N2-Modifikation lässt sich beobachten, dass die polycyclische
Modifikation, in diesem Fall 4-Aminobiphenyl, einen höheren Einfluss und damit ein
stärkeres Absenken des Tm-Wertes im Vergleich zur monocyclischen Modifikation,
hier Anilin, ausübt. So ist für beide N2-4-Aminobiphenyl-modifizierten Oligonucleotide
210 und 212 eine Senkung des Tm-Wertes um ca. 3.5 °C zu beobachten. Auch hier
ist kein signifikanter Unterschied zwischen der N2-Hydrazino- oder N2-Azo-
Modifikation zu erkennen.
Alle durchgeführten Messungen geben erste Hinweise darauf, dass der Einfluss auf
die thermische Stabilität durch polycyclische Arylamin-Modifikationen höher ist, als
durch monocyclische Modifikationen. Auch scheint der Einfluss abhängig von der Art
der Modifikation zu sein, so haben die N2-Modifikationen einen höheren Einfluss als
die korrespondierenden C8-Modifikationen.
Um Aussagen über den Einfluss der Modifikationen auf die Konformation des DNA-
Duplexes machen zu können, wurden Untersuchungen mittels circularer Dichroismus
durchgeführt. Die Ergebnisse sollen im Folgenden gezeigt und diskutiert werden.
Resultate und Diskussion
116
4.6 Messung des circularen Dichroismus
Links und rechts zirkular-polarisiertes Licht wird beim Durchtritt durch ein optisch
aktives Medium unterschiedlich stark absorbiert - dieser Effekt wird als Zirkularer
Dichroismus bezeichnet (CD). Beim CD-Experiment bestimmt man also nicht nur die
spezifische Drehung, sondern man misst auch die Intensitätsunterschiede von links-
und rechts-linear polarisiertem Licht.
Zum CD-Effekt kommt es durch Wechselwirkungen der helikalen Struktur des
zirkular-polarisierten Lichtes mit den Gruppen um ein asymmetrisches C-Atom. Ein
Maximum im CD-Spektrum ist für das eine Enantiomer positiv, für das andere
negativ. Durch die CD-Spektroskopie ist somit eine Bestimmung der absoluten
Konfiguration möglich. Außerdem gehört sie zu den wichtigsten Methoden zur
Konformationsanalyse von Peptiden und Oligonucleotiden. In
Oligonucleotiddoppelsträngen sind die Nucleobasen als Chromophore konformativ
fixiert, während in Einzelsträngen eine statistische Verteilung der Basenorientierung
vorliegt. Dadurch entsteht eine chirale Doppelhelix. Diese bewirkt im DNA-
Doppelstrang eine Vorzugsrichtung der Nucleobasen gegenüber dem Rückgrat einen
Cotton-Effekt.[126] Abb. 104 zeigt die CD-Spektren der verschiedenen DNA-
Konformationen.
Abb. 104 CD-Spektren der verschiedenen DNA-Konformationen
Resultate und Diskussion
117
Diese können anhand der charakteristischen Lage der Maxima und Minima
zugeordnet werden. Dabei handelt es sich bei der B-DNA um die natürlich
vorkommende DNA-Konformation, während die A-DNA-Konformation nur in
dehydratisierter DNA und die Z-DNA-Konformation nur in stark salzhaltigen
Lösungen und Sequenzen mit alternierenden Pyrimidin- und Purinbasen vorliegen.
Die CD-Messungen wurden mit der gleichen Lösung durchgeführt wie die Tm-Wert-
Bestimmung. Die Absorption wurde dabei in einem Bereich von 220-350 nm bei einer
Temperatur von 10 °C gemessen. Mit Hilfe dieser Spektren kann analysiert werden,
welche Konformation der DNA bei allen modifizierten Oligonucleotiden im Vergleich
zu dem unmodifizierten Doppelstrang vorliegt.
Die gemessenen CD-Spektren der Oligonucleotide der NarI-Sequenz 56 und 184-
188 mit 183 als Gegenstrang sind in Abb. 105 dargestellt.
220 240 260 280 300 320 340-2
0
2
4 unmod. 56 Anil G1 184 4-ABP G1 185 Anil G3 186 4-ABP G3 187 4-Anis G3 188
mol
are
Elli
ptiz
ität
Wellenlänge [nm]
Abb. 105 CD-Spektren der NarI-Sequenz 56 und 184-188 mit 183 als Gegenstrang
Die CD-Spektren der modifizierten Sequenzen 184-188 zeigen, wie auch das
unmodifizierte Oligonucleotid 56, im Duplex das typische CD-Spektrum einer B-DNA.
Charakteristisch für diese Konformation ist dabei das Maximum bei einer
Wellenlänge von ca. 265 nm sowie das Minimum bei einer Wellenlänge von 250 nm.
Unterschiede zwischen den verschiedenen Modifikationen, sowohl was die Arylamin-
Modifikation als auch die Position betrifft, sind nicht erkennbar. Die Untersuchungen
Resultate und Diskussion
118
(exemplarisch für das C8-Anilin, das C8-4-Aminobiphenyl und das C8-2-
Aminofluoren-modifizierte Oligonucleotid) für die an der G2-Position modifizierten
selbstkomplementären Oligonucleotide sind im Folgenden dargestellt.
220 240 260 280 300 320 340-4
-2
0
2
4
6 unmod. 57 2-AF 195 4-ABP 194 Anil 189
mol
are
Ellip
tizitä
t
Wellenlänge [nm]
Abb. 106 CD-Spektren der selbstkomplementären Sequenz 57 und der modifizierten
Oligonucleotide 189, 194 und 195
Auch diese CD-Spektren der modifizierten und des unmodifizierten Oligonucleotids
zeigen das eindeutige Vorhandensein einer B-DNA-Konformation. Die Verschiebung
der lokalen Maxima und Minima für die polycyclisch-modifizierten Oligonucleotide
194 und 195 zu höheren Wellenlängen (bathochromer Effekt) lässt sich durch die
Vergrößerung des π-Systems und der damit verbundenen stärkeren Delokalisation
erklären. Analoge Beobachtungen können auch bei den CD-Spektren für die an G1-
Position modifizierten Oligonucleotide der selbstkomplementären Sequenz 57
gemacht werden. Die gemessenen Spektren sind in Abb. 107, S. 119 dargestellt.
Resultate und Diskussion
119
220 240 260 280 300 320 340
-2
0
2
4
6
8 unmod. 57 Anil 196 4-ABP 197
mol
are
Elli
ptiz
ität
Wellenlänge [nm]
Abb. 107 CD-Spektren der selbstkomplementären Sequenz 57 und der modifizierten
Oligonucleotide 196, 197
Abschließend sollten diese konformativen Untersuchungen ebenfalls für das
synthetisierte 30mer 58 und die entsprechend modifizierten Oligonucleotide 203-212 durchgeführt werden. Abb. 108, S. 120 zeigt die erhaltenen CD-Spektren für die C8-
modifizierten Oligonucleotide 203-208. In Abb. 109, S. 120 sind die Ergebnisse der
CD-Spektren der N2-modifizierten Oligonucleotide 209-212 zusammengefasst. Auch
diese CD-Spektren des unmodifizierten und der modifizierten Oligonucleotide zeigen
das Vorliegen einer B-DNA-Konformation. Auch in diesen Fällen ist kein Unterschied
in der Lage der Maxima bzw. Minima zwischen den Spektren des unmodifizierten
und der modifizierten Dublices erkennbar.
Resultate und Diskussion
120
220 240 260 280 300 320 340-10
-5
0
5
10 unmod. 58 Anil 203 4-Anis 204 4-Tol 205 3,5-DMA 206 4-ABP 207 2-AF 208
mol
are
Elli
ptiz
ität
Wellenlänge [nm]
Abb. 108 CD-Spektren der 30mer-Sequenz 58 und der C8-modifizierten
Oligonucleotide 203-208 mit 202 als Gegenstrang
220 240 260 280 300 320 340
-5
0
5
unmod. 58 N2 Hydr. Anil 209 N2 Hydr. 4-ABP 210 N2 Azo Anil 211 N2 Azo 4-ABP 212
mol
are
Ellip
tizitä
t
Wellenlänge [nm]
Abb. 109 CD-Spektren der 30mer-Sequenz 58 und der N2-modifizierten
Oligonucleotide 209-212 mit 202 als Gegenstrang
Zusammenfassend kann aus den aufgenommenen CD-Spektren geschlossen
werden, dass die hier angewandte CD-Spektroskopie keinen Hinweis auf strukturelle
Resultate und Diskussion
121
oder auf die unterschiedliche Interaktion mit Enzymen
esultierenden Ergebnisse sollen im Folgenden aufgezeigt und diskutiert
erden.
.7 Restriktionsabbau mittels EcoRI
den
ntsprechenden Tetra- bzw. Octameren abgebaut werden können (s. Abb. 110).
C T A C-3'
3'-C A T C T T A A G A T G-5'
Veränderungen der DNA durch Modifikation eines 2‘-Desoxyguanosin liefert. So kann
kein konformativer Einfluss einer C8- oder einer N2-Modifikation erkannt werden. Die
Unterschiede in der Carcinogenität sind demnach auf lokale strukturelle
Veränderungen
zurückzuführen.
Um diese Vermutung zu stützen, sollten erste Informationen über die Interaktion mit
Enzymen, am Beispiel des Restriktionsenzyms EcoRI sowie verschiedener
Polymerasen, durch verschiedene Assays erhalten werden. Abschließend sollten
erste Experimente zur Kristallisation und damit zur Strukturuntersuchung solcher
modifizierten Oligonucleotide erfolgen. Die durchgeführten Experimente und die
daraus r
w
4
Um den Einfluss der Modifikation auf die Restriktion durch das EcoRI-Enzym
untersuchen zu können, wurde die von Seela et al. beschriebene Sequenz 57
verwendet.[127] Diese selbstkomplementäre Sequenz beinhaltet die Erkennungs-
sequenz für EcoRI und sollte somit mittels diesem durch Restriktion zu
e
5'-G T A G A A T T 5'-
3'-C A T C T T A A-5'
5'-A A T T C T A C-3'
3'-G A T G-5'
EcoRI G T A G-3'
Rt
ATCTTAA-5'5'-GTAG-3' 3'-C Abb. 110 Restriktionsabbau des Oligonucleotids 57 mittels EcoRI
Zunächst sollten die experimentellen Bedingungen für diesen Test am Beispiel des
unmodifizierten Oligonucleotids 57 etabliert werden. Dabei sollte die Temperatur
20 °C betragen, um auch diesen Test mit den modifizierten Oligonucleotiden 189-197
Resultate und Diskussion
122
litative Versuche durchgeführt.
ab. 19 fasst die erhaltenen Ergebnisse zusammen.
Puffer (pH 7.5) Units EcoRI Restriktion
durchführen zu können. Da diese teilweise einen Tm-Wert von 23 °C besitzen war es
wichtig eine geringere Temperatur während des Restiktionsassays einzuhalten, um
das Vorliegen der DNA-Doppelstränge zu gewährleisten. Optimiert werden sollten
dabei das verwendete Puffersystem, sowie die für den Abbau benötigte Menge
(Units) des EcoRI-Enzym. Um festzustellen, ob eine Restriktion unter den gewählten
Bedingungen erfolgt, wurden zunächst lediglich qua
T
Tris/HCl 100 nein
Tris/HCl 270 nein
DTE 100 nein
DTE 270 nein
DTT 100 nein
DTT 270 ja Tab. 19 Zusam riktionsassay
am unmodifizierten Oligonucleotid 57 bei 20 °C
on 270 Units Enzym gelang der gewünschte Abbau des
menfassung der Reaktionsoptimierung des Rest
Zunächst wurden die von Seela für einen solchen Abbau beschriebenen
Bedingungen angewendet.[127] Hierbei konnte auch durch die Verwendung von 270
Units EcoRI Enzym keine Restriktion erreicht werden.[128] Ursache hierfür könnte die
Temperatur von 20 °C sein, da Seela seine Experimente bei einer Temperatur von
37 °C durchgeführt hat. Dieses könnte eine Verringerung der Enzymaktivität, bis hin
zur vollkommenen Inaktivität zur Folge haben. Da die Enzymaktivität ebenfalls durch
die Verwendung anderer Puffersysteme beeinflusst werden kann, wurden ebenfalls
DTE- und DTT-Puffersysteme verwendet.[129,130] Auch bei der Verwendung des DTE-
Puffers konnte weder unter der Zugabe von 100 bzw. 270 Units des EcoRI-Enzyms
eine Restriktion beobachtet werden. Erst durch die Verwendung eines DTT-Puffers
und der Zugabe v
Oligonucleotids 57.
Für den Abbau wurden zunächst je 0.4 OD des Oligonucleotids in 100 μL eines DTT-
Puffers (pH 7.5) gelöst und für 2 Minuten auf 70 °C erhitzt. Nach Abkühlen auf 20 °C
Resultate und Diskussion
123
matogramme zu verschiedenen Zeitpunkten bei dem Abbau des Oligonucleotids
57.
Abb. 111 Restriktionsabbau des unmodifizierten Oligonucleotids 57
, die Halbwertszeit für
nschließend graphisch die Halbwertszeit ermittelt werden(s. Abb.
112, S. 124):[131]
μ [Fläche d(GTAG)][ C AATTCTAC)orig.]
Olig leo=
folgte die Inkubation mit 270 Units EcoRI. Nach gewählten Reaktionsdauern wurden
Aliquote entnommen und mittels der HPLC vermessen. Abb. 111 zeigt die erhaltenen
Chro
10 20 -0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10 t=0h t=1h t=2h t=3h t=5h
t [min]
Aus den dargestellten Chromatogrammen ist deutlich die Abnahme des 12mer-
Peaks zu erkennen, welcher bei andauernder Inkubation mit dem Enzym immer mehr
abnimmt, während im Gegensatz dazu die Fläche des 4-mers und des 8-mers größer
werden. Mittels der erhaltenen Chromatogramme ist es möglich
den Restriktionsabbau des Oligonucleotids 57 zu berechnen.
Mittels der anhängenden Formeln konnte die Menge an abgebautem Oligonucleotid
berechnet und a
M gespaltenes ε260[GTAGAATTCTA ]][μM d(GTAG
onuc tid [(Gesamtfläche) * [ε260[d(GTAG)]]]
Resultate und Diskussion
124
μM Ausgangsm Oligonucleotid
X =
μM Ausgangsmenge Oligonucleotid
enge Oligonucleotid - μM gespaltenes
Abb. 112 Graph zur Berechnung der H lbwertszeit τ ½ des Oligonucleotids 57
tion handelt, ist k die negative
exemplarisch
ie Chromatogramme des C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids 189.
y = 2.4572e
2.5
2
a
Da es sich hierbei um eine Reak erster Ordnung
Hochzahl und es folgt daraus: τ ½ = ln 2 / k
= 2.45 h
Somit erhält man eine Halbwertszeit von 2.45 h.
Analoge Versuche wurden für die an der G2-Position modifizierten Oligonucleotide
189-195 durchgeführt. Diese direkt an der Schnittstelle modifizierten Oligonucleotide
werden im Gegensatz zu dem unmodifizierten Oligonucleotid auch nach einer
Inkubationszeit von 76 Stunden nicht gespalten. Abb. 113, S. 125 zeigt
d
-0.2825x 1.5ln [x]
1
0.5
00 1 2 3 4 5 6
t [h]
Resultate und Diskussion
125
10 20 -0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25 t=0h t=1h t=5ht=24ht=76h
t [min]
Abb. 113 Restriktionsabbau des G2-C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids 189
Hier wird ein erster immenser Einfluss einer C8-Arylamin modifizierten 2‘-
Desoxyguanosinbase deutlich. Durch diese Modifikation scheint es dem
Restriktionsenzym EcoRI nicht mehr möglich zu sein an den Oligonucleotid-
Doppelstrang zu binden und die enzymatische Spaltung durchzuführen. Diese
Beobachtung ist dabei unabhängig von der aromatischen Modifikation.
Neben der Modifikation der Guanosinbase an der Schnittstelle des EcoRI-Enzyms
sollte untersucht werden, ob auch eine C8-Arylamin-Modifikation außerhalb dieser
Schnittstelle einen Einfluss auf die Aktivität des Enzyms hat. Dazu wurden
exemplarisch die an G1-modifizierten Oligonucleotide 196 (C8-Anilin-modifiziert) und
197 (C8-4-Aminobiphenyl-modifiziert) untersucht. Bei diesen analog durchgeführten
Experimenten konnte auch für diese modifizierten Oligonucleotide eine Spaltung
beobachtet werden. Die Chromatogramme des Verdaus des Oligonucleotid 197 sind
exemplarisch in Abb. 114, S. 126 dargestellt.
Resultate und Diskussion
126
10 20-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h
t [min]
Abb. 114 Restriktionsabbau des G1-C8-4-Aminobiphenyl modifizierten Oligonucleotids 197
Aus diesen Chromatogrammen ist der Abbau des Oligonucleotids 197 klar zu
erkennen. Die Abnahme des durch das 12mer hervorgerufenen Peaks führt in
diesem Fall nur zu Entstehung eines weiteren Peaks (nach kompletten Verdau ist nur
dieser zu erkennen). Dieser wird nicht nur durch das entstehende Octamer, sondern
auch durch das Tetramer welches die Modifikation beinhaltet, verursacht. Analoge
Beobachtungen konnten auch bei dem Abbau des Oligonucleotids 196 gemacht
werden.
In beiden Fällen war eine Berechnung der Halbwertszeit möglich. Tabelle 20 fasst die
Ergebnisse im Vergleich zum unmodifizierten Oligonucleotid 57 zusammen.
Oligonucleotid t1/2 [h]
57 (unmod.) 2.5
196 (Anil) 6.5
197 (4-ABP) 3.4
Tab. 20 Zusammenfassung der berechneten Halbwertszeiten
des EcoRI-Restriktionsverdaus
Resultate und Diskussion
127
Aus den erhaltenen Werten ist deutlich der Einfluss der Modifikationen auf die
Enzymaktivität zu erkennen. Auch außerhalb der Erkennungssequenz des EcoRI-
Enzyms ist eine Verminderung der Enzymaktivität zu beobachten. So beträgt die
Halbwertszeit für das C8-4-Aminobiphenyl-modifizierte Oligonucleotid 197 mit 3.4 h
nahezu das 1.5-fache wie für das unmodifizierte Oligonucleotid 57. Deutlicher ist der
hemmende Einfluss für die monocyclische Modifikation des Oligonucleotids 196. Für
dieses C8-Anilin-modifzierte Oligonucleotid ist mehr als eine Verdopplung der
Halbwertszeit auf 6.5 Stunden zu beobachten. Somit scheint der Effekt einer
Grenzcarcinogen-modifizierten Guanosinnucleobase größer zu sein, als das einer in
C8-Position mit einem starken Carcinogen modifizierte Guanosinbase.
Dieses unerwartete Ergebnis lässt sich bislang nicht erklären, gibt jedoch einen
ersten Hinweis darauf, dass der Unterschied in der Carcinogenität mono- und
polycyclischer aromatischer Amine durch unterschiedliche Interaktionen mit Enzymen
verursacht werden könnte.
Um einen weiteren Einblick und eine mögliche Bestätigung dieser Überlegung zu
erhalten, wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Andreas Marx,
Universität Konstanz, erste Primer-Verlängerungs-Experimente durchgeführt. Die
ersten Ergebnisse hierzu sollen im Folgenden aufgezeigt werden.
4.8 Primer-Verlängerungs-Untersuchungen
Mit Primer-Verlängerungs-Untersuchungen sollte der Einfluss von C8-Arylamin-
Modifikationen am 2’-Desoxyguanosin in Oligonucleotiden auf die Selektivität
verschiedener DNA-Polymerasen untersucht werden.
DNA-Polymerasen lassen sich nach Strukturhomologien in mindestens sechs
Familien einteilen, darunter Familie B (z.B. Pfu), Familie X (z.B. Pol β) und Familie Y
(z.B. Dpo4). Die DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus (Pfu) arbeitet mit einer
extrem hohen Genauigkeit. Da sie zusätzlich noch thermostabil ist, wird sie häufig für
die PCR verwendet.[132]
Resultate und Diskussion
128
Pol β ist eine Polymerase, die durch Basen-Excisions-Reparatur entstandene
„Löcher“ in der DNA wieder auffüllt. In vitro macht Pol β jedoch vergleichsweise sehr
viele Deletionen und Einbaufehler (ein Fehler pro103 bp).[133] Es wird weiter
angenommen, dass Pol β in der Neurogenese eine entscheidende Rolle spielt und
auch bei der Meiose beteiligt ist.[134]
Dpo4 (Y-Familie) aus Sulfolobus solfataricus wird häufig als strukturelles und
funktionelles Modell für eine DNA-Polymerase der Y-Familie verwendet. Sie ist
ebenfalls eine thermostabile Polymerase, welche eine Fehlerrate von 8 × 10–3 bis 3 ×
10–4 besitzt.[135]
Die in dieser Arbeit synthetisierten, modifizierten Oligonucleotide (58 und 203-208)
sollten nun mit den DNA-Polymerasen aus den drei verschiedenen Familien (Pfu
exo-, Polβ, Dpo4) untersucht werden.
Es wurde untersucht, welche Auswirkungen der Einbau einer C8-Arylamin-
Modifikation in den Templatstrang auf die Genauigkeit beim komplementären
Nucleotideinbau bzw. beim Einbau des darauffolgenden Nucleotids hat.
Für die Versuche zur Einbaugenauigkeit gegenüber dem C8-modifizierten
Desoxyguanosin wurden „standing-start“-Reaktionen durchgeführt. Das heißt, die
DNA-Polymerase ist noch nicht in Bewegung, wenn sie an die zu untersuchende
Stelle kommt. Sie muss dort zuerst an die DNA binden und dann mit der Synthese
beginnen. Dafür wurde ein Primer verwendet, der direkt vor dem
Desoxyguanosinanalogon endet.
Um ein Nucleotid verlängert ist der Primer für die Einbauversuche des
darauffolgenden Nucleotids. Diese Experimente werden im weiteren Verlauf der
Arbeit als „standing-start +1“-Versuche bezeichnet. Hierbei sollte das Nucleotid des
verwendeten Primers, welches sich gegenüber der Modifikation befindet, dem bei
den „standing-start“-Reaktionen bevorzugt eingebauten entsprechen.
Die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-Bilder (PAGE) wurden folgendermaßen
beschriftet:
Die Abkürzungen über jeder Bande geben die Art der C8-Modifikation an.
Die Buchstaben unter jeder Bande zeigen, mit welchem dNTP das Reaktionsgemisch
versetzt wurde: C: dCTP, A: dATP, G: dGTP, T: dTTP, N: alle dNTP
Resultate und Diskussion
129
Zunächst wurden die „standing-start“-Reaktionen exemplarisch mit dem
4-Aminobiphenyl-modifizierten Oligonucleotid 207 und dem 4-Anisidin-modifizierten
Oligonucleotid 204 im Vergleich zum unmodifizierten Referenzstrang 58 mit den
verschiedenen Polymerasen durchgeführt. Zu der Lösung mit dem Reaktionspuffer,
Primer und dem jeweiligen Templat wurden die DNA-Polymerase und das
entsprechende dNTP gegeben. Abb. 115 zeigt die Polyacrylamid-Gele.
Abb. 115 Polyacrylamid-Gele der ersten „standing-start“-Reaktionen
Bei den Reaktionen des unmodifizierten Templat 58 ist für alle drei verwendeten
Enzyme der kanonische Einbau von dCTP zu erkennen. Neben diesem sind lediglich
für die Pfu DNA-Polymerase geringe Fehleinbauten aller drei übrigen Nucleotide zu
Resultate und Diskussion
130
sehen. Bei der Zugabe aller vier dNTPs ist für das Templat 58 jeweils unabhängig
vom verwendeten Enzym eine vollständige Elongation des Stranges zu beobachten.
Bei den Versuchen der modifizierten Template 207 und 204 mit der Pfu DNA-
Polymerase ergeben sich erste Unterschiede. So ist bei dem 4-Aminobiphenyl-
modifizierten Templat 207 neben dem kanonischen Einbau von dCTP ebenfalls,
wenn auch in geringerer Häufigkeit, der Einbau von dATP zu beobachten. Auffällig ist
der Abbruch bei der Zugabe aller dNTPs nach dem Einbau eines Nucleotids. Es
erfolgt hier keine vollständige Elongation zum 30mer. Diese Beobachtung tritt
ebenfalls beim 4-Anisidin-modifizierten Templat 204 auf. Auch hier erfolgt der
Kettenabbruch nach dem Einbau eines Nucleotids. Unterschiedlich, im Vergleich zum
Templat 207, ist jedoch die Häufigkeit eines nicht-kanonischen Einbaus. Das 4-
Ansidin-Addukt bewirkt einen Fehleinbau von dATP und dTTP. Diese haben jeweils
die gleiche Häufigkeit wie der Einbau des dCTP. Die monocyclische Modifikation hat
also einen größeren Einfluss auf die Genauigkeit der Pfu DNA-Polymerase und führt
zu einer höheren Fehlerrate als die verwendete polycyclische Modifikation im
Templat 207.
Analoge Beobachtungen können auch bei der Verwendung der Dpo4 DNA-
Polymerase gemacht werden. Auch hier erfolgt keine vollständige Elongation der
Template 204 und 207. Erneut kommt es zu dem bereits für die Pfu DNA-Polymerase
beobachteten Kettenabbruch. Ebenfalls ist die Häufigkeit eines Fehleinbaus bei dem
4-Anisidin-modifizierten Templat 204 höher als bei dem entsprechend
4-Aminobiphenyl-modifizierten Templat 207. Insgesamt ist jedoch ein geringerer
Fehleinbau bei der Dpo4 DNA-Polymerase als bei der Pfu DNA-Polymerase zu
erkennen.
In gleicher Häufigkeit wie bei der Dpo4 DNA-Polymerase erfolgt auch der fehlerhafte
Einbau bei der Verwendung der humanen pol β DNA-Polymerase. Auch hier ist der
Anteil des nicht-kanonischen Einbaus von dATP und dTTP bei dem 4-Anisidin-
modifizierten Templat 204 größer als beim 4-Aminobiphenyl-modifizierten Templat
207. Einen Unterschied zu den anderen verwendeten Enzymen besteht bei der
Zugabe aller vier dNTPs. Hier ist in beiden Fällen neben einer vollständigen
Elongation auch das Auftreten eines um ein bzw. zwei Nucleotide verkürzten
Stranges zu beobachten. Die Modifikationen könnten also in diesen Fällen zu einer
Resultate und Diskussion
131
ein- bzw. zwei-Basendeletion führen, wie sie für heterocyclische Modifikationen
bereits von Rizzo beschrieben worden sind.[136]
Um genauere Aussagen über die Häufigkeit eines nicht-kanonischen Einbaus
machen zu können, wurden weitere „standing-start“-Reaktionen mit den modifizierten
Oligonucleotiden 204-208 durchgeführt. In diesen Fällen wurde neben der humanen
pol β DNA-Polymerase die Dpo4 DNA-Polymerase verwendet. Abbildung 116 zeigt
die erhaltenen PAGE-Gele.
Abb. 116 PAGE-Gele der durchgeführten „standing-start“-Reaktion mit den Oligonucleotiden 58 und 204-208
unter der Verwendung der humanen pol β und der Dpo4 DNA-Polymerase
Bei diesen durchgeführten Versuchen lassen sich die zuvor erhaltenen Ergebnisse
bestätigen. Bei der humanen pol β DNA-Polymerase erfolgt bei dem unmodifizierten
Resultate und Diskussion
132
Templat 58 einzig der kanonische Einbau von dCTP. Für alle modifizierten Template
204-208 ist eine deutlich geringere Einbaurate zu erkennen. Dabei kommt es bei den
polycyclisch modifizierten Templaten 207 und 208 nur zu einem Einbau von dCTP,
während bei den monocyclischen Templaten 204-206 auch der Einbau von dATP
und, im Falle des 4-Anisidin Adukktes 204, von dTTP zu beobachten ist. Der höhere
Einfluss der monocyclischen Modifikation auf einen nicht-kanonischen Einbau
bestätigt sich auch hier und lässt auf eine Allgemeingültigkeit schließen. Auch scheint
dieser Trend nicht vom Enzym abhängig zu sein. Bei der Verwendung der Dpo4
DNA-Polymerase bestätigen sich wiederum die Unterschiede in der Häufigkeit der
Fehleinbauten. Bei den monocyclischen Modifikationen 204-206 überwiegt erneut
der nicht-kanonische Einbau im Unterschied zu den entsprechend polycyclisch
modifizierten Templaten 207 und 208, wo ein solcher nur mit geringerer Häufigkeit zu
beobachten ist. Allgemein lässt sich erkennen, dass die Dpo4 DNA-Polymerase im
Vergleich zur humanen pol β DNA-Polymerase eine deutlich höhere Häufigkeit von
nicht-kanonischen Einbauten aufweist, was bereits am unmodifizierten Templat 58 deutlich wird. Auch hier kommt es zum Einbau von dATP, dGTP und dTTP.
Um Informationen zu erhalten, welche Effekte solche Modifikationen auf eine weitere
Elongation haben, wurden im Folgenden „standing-start +1“-Versuche durchgeführt.
Hierzu wurde der in den vorigen Versuchen eingesetzte Primer um ein Nucleotid
verlängert. Zum Einen, dem kanonischen Einbau entsprechend, mit dC (F26C) und
zum Anderen, einem nicht-kanonischen Einbau entsprechend, mit dA (F26A).
Anschließend wurden den „standing-start“-Experimenten analoge Reaktionen mit
dem Reaktionspuffer, den beiden Primern, dem jeweiligen Templat und der DNA-
Polymerase sowie dem entsprechenden dNTP durchgeführt. Für diese
Untersuchungen wurden neben der humanen pol β DNA-Polymerase die Dpo4 DNA-
Polymerase verwendet.
In Abb. 117, S. 133 sind die PAGE-Gele der „standing-start +1“-Versuche unter
Verwendung der humanen pol β DNA-Polymerase dargestellt.
Resultate und Diskussion
133
Abb. 117 „standing-start +1“-Versuche der Template 58 und 203-208 unter Verwendung
der humanen pol β DNA-Polymerase
Bei der Verwendung des F26A-Primers (exemplarisch für einen nicht-kanonischen
Einbau) kann man lediglich bei den polycyclisch modifizierten Templaten 207 und
208 einen weiteren Einbau erkennen. Dieser ist mit dTTP ebenfalls nicht-kanonisch
und führt daher erneut zu einer Mutation, möglicherweise durch das Überspringen (1-
Basendeletion) des im Templat befindlichen T. Für die monocyclisch modifizierten
Template 203-206, sowie für den unmodifizierten DNA-Strang 58 erfolgt ein
Kettenabbruch. Hier kommt es zu keinem weiteren (fehlerhaften) Einbau. Grund
hierfür könnte eine Erkennung des nicht-kanonische Einbaus an der vorherigen
Position durch die Polymerase sein. Die polycyclische Modifikation könnte also einen
Einfluss auf die Exonuclease-Aktivität der humanen pol β DNA-Polymerase haben.
Bei der Verwendung des F26C-Primers (kanonischer Einbau) hingegen kommt es in
allen Fällen zu einer weiteren Elongation. Es wird dabei jeweils mit dATP ein
korrekter Einbau vorgenommen und kein weiterer Einfluss der Modifikation auf die
Polymerase-Aktivität beobachtet.
Resultate und Diskussion
134
Für die Dpo4 DNA-Polymerase wurden analoge Experimente durchgeführt. Die
Ergebnisse sind in Abb. 118 zusammengefasst.
Abb. 118 „standing-start +1“-Versuche der Template 58 und 203-208 unter Verwendung
der Dpo4 DNA-Polymerase
Bei der Verwendung des F26A-Primers (exemplarisch für einen nicht-kanonischen
Einbau) kommt es bei der weiteren Elongation durch die Dpo4 DNA-Polymerase zu
einem massiven Fehleinbau. So kann in allen Fällen neben dem kanonischen Einbau
von dATP auch der Einbau von dTTP beobachtet werden. Es kommt weiterhin zu
keinem Kettenabbruch, sondern zum weiteren Einbau von dTTP. Dieses weist auf
eine Ein-Basendeletion hin, welche durch den nicht-kanonischen Einbau des dATP
gegenüber der Modifikation hervorgerufen sein könnte. Auch bei der weiteren
Elongation des F26C-Primers (kanonischen Einbau) durch die Dpo4 DNA-
Polymerase ist eine solche Basendeletion zu vermuten, da es hier ebenfalls nicht nur
zu dem kanonischen Einbau von dATP kommt. Vielmehr ist hier auch eine weitere
Elongation mit dATP zu erkennen. Die höchste Fehlerrate beim Einbau weist dabei
das unmodifizierte Templat 58 auf, was ein Hinweis auf die hohe Ungenauigkeit der
Resultate und Diskussion
135
verwendeten Dpo4 DNA-Polymerase ist. Die mit der Dpo4 DNA-Polymerase
durchgeführten „standing-start +1“-Versuche lassen keinen Unterschied in dem
Einfluss mono- bzw. polycyclischer Modifikationen erkennen und geben somit keinen
Anhaltspunkt für eine mögliche Erklärung der unterschiedlichen Carcinogenität
solcher Verbindungen.
Allgemein können jedoch aus den durchgeführten Experimenten erste Schlüsse
hinsichtlich der durch die C8-Arylamin-modifizierten dGs verursachten Einflüsse auf
die Replikation gezogen werden. Zum Einen sind diese Einflüsse abhängig von der
verwendeten Polymerase und zum Anderen vom aromatischen System der
Modifikation. So führen Schäden durch monocyclische Arylamine, verglichen mit den
polycyclischen, vermehrt zu einem Fehleinbau. Diese Ergebnisse widersprechen
somit zunächst den im Ames-Test gefundenen Daten. Allerdings ist auch durch
diesen höheren Einfluss die Möglichkeit gegeben, dass diese Art von Modifikationen
in vivo schneller durch Enzyme erkannt und repariert werden. Versuche hierzu sind
Gegenstand zukünftiger Projekte der Arbeitsgruppe von Prof. C. Meier. Ebenso
werden gegenwärtig Versuche mit den N2-modifizierten Oligonucleotiden 209-212
sowie kinetische Messungen der „standing-start“-Versuche durchgeführt, wodurch
weitere Information hinsichtlich des Einflusses solcher Modifikationen auf
verschiedene Polymerasen erhalten werden können.
Sollten sich die hier erhaltenen Ergebnisse bestätigen, so würde der Unterschied in
der Carcinogenität durch die verschieden starke Interaktion der Modifikationen mit
den Enzymen herrühren. Als Ursache dafür kämen strukturelle Unterschiede in
Frage. Da durch die durchgeführten Messungen des Circular Dichroismus keine
konformative Veränderung der modifizierten Oligonucleotide gefunden werden
konnte, sollte eine Methode zur strukturellen Analyse modifizierter Oligonucleotide
etabliert werden, um diese in Zukunft untersuchen zu können.
Für solche strukturellen Untersuchungen kommen hauptsächlich drei Methoden in
Frage:
1) Molecular Modelling
2) NMR-Strukturanalyse
3) Kristallisation
Resultate und Diskussion
136
Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Grundlagen zur Kristallisation und damit zur
strukturellen Analyse modifizierter Oligonucleotide geschaffen werden. Diese
Methode erscheint für die gewünschten strukturellen Untersuchungen am besten
geeignet, da zum Einen vergleichsweise wenig Substanz benötigt wird (im
Gegensatz zur NMR-Strukturanalyse), jedoch eine Struktur aufgrund von
gemessenen Datenpunkten berechnet werden kann (im Gegensatz zur
computergestützten Berechnung mittels molecular modelling). Die ersten Versuche
hierzu sollen im Folgenden beschrieben werden.
4.9 Erste Versuche zur Kristallisation von Oligonucleotiden
Die Versuche wurden in Kooperation mit Dr. Markus Perbandt, Universität Hamburg
und dem in Hamburg ansässigen DESY durchgeführt.
Im Gegensatz zu kleinen Molekülen wie Zucker oder Salze, die häufig problemlos
auskristallisieren und sehr regelmäßige Kristalle bilden, kristallisieren die oft sehr
großen DNA-Moleküle mit ihrer unregelmäßigen dreidimensionalen Struktur nur unter
ganz bestimmten Bedingungen, die in Versuchsreihen ermittelt werden müssen.
Für diese Versuche wird eine Oligonucleotid-Lösung mit einer Konzentration von 2.5
mg/mL verwendet. Da zunächst optimale Kristallisationsbedingungen gefunden
werden sollten, wurde zunächst das selbstkomplementäre unmodifizierte
Oligonucleotid 57 für diese Zwecke verwendet. Der erste Schritt ist die Wahl des
richtigen Puffersystems. Das gewählte System sollte die DNA-Moleküle mit dem
negativ geladenen Phosphatrückgrat stabilisieren, jedoch nicht mit dem Duplex in
Wechselwirkung treten oder gar reagieren.
Ziel ist es durch die Wahl eines geeigneten Puffers eine monodisperse Lösung zu
erhalten. D.h., dass sich in der Lösung nur Teilchen einer Größe befinden, in diesem
Fall des DNA-Duplex. Unerwünscht sind Einzelstränge, sowie die Bildung höhere
Aggregate, wie z.B. eine Triplehelix oder das Annealing mehrerer DNA-Duplices
aneinander. Zur Bestimmung der Monodispersität wird die dynamische Lichtstreuung
der Probe vermessen.
Resultate und Diskussion
137
Bei der dynamischen Lichtstreuung (DLS) handelt es sich um eine Methode, bei der
das Streulicht eines Lasers an einer gelösten Probe analysiert wird. Sie wird am
häufigsten bei Polymeren und Biopolymeren wie zum Beispiel Proteinen angewandt,
um den hydrodynamischen Radius der Moleküle zu bestimmen.
Strahlt man mit einem Laser auf eine gelöste Probe, so wird ca. 1 % des Lichts an
den gelösten Molekülen gestreut. Analysiert man die Intensität des Streulichts unter
einem bestimmten Winkel, so erhält man eine Messgröße, die eine Aussage über die
Molekülmasse der Moleküle erlaubt. Man spricht hierbei zur klaren Unterscheidung
von der dynamischen Lichtstreuung auch von 'statischer Lichtstreuung'.
Da die Moleküle sich in Lösung aber auch bewegen (Brown‘sche
Molekularbewegung), wird die Wellenlänge des gestreuten Lichtes minimal
verändert. Dies hat zur Folge, dass die Intensität des Streulichtes kleine
Schwankungen aufweist. Misst man nun diese Schwankungen im Millisekunden-
Bereich, so spricht man von 'dynamischer Lichtstreuung'. Aus den Schwankungen
kann man die Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle in Lösung bestimmen. Und
kann den hydrodynamischen Radius der Moleküle in Lösung bestimmen.[137]
Mittels solcher Messungen konnte ein Puffersystem gefunden werden, welches alle
genannten Bedingungen erfüllt. Abb.119 zeigt die Ergebnisse der DLS-Messungen
unter der Verwendung eines Natriumcacodylat-Puffers.[138]
Abb. 119 Ergebnisse der DLS-Messung des Oligonucleotids 57 unter Verwendung des Natriumcacodylat-Puffers;
links: zeitabhängige Messung, rechts: berechneter hydrodynamischer Radius
Resultate und Diskussion
138
Aus den erhaltenen Daten ist die einheitliche Teilchengröße in der verwendeten
Lösung zu erkennen. Der berechnete hydrodynamische Radius beträgt in diesem
Fall 2.90 nm.
Anschließend erfolgt ein erstes Screening, bei dem eine Reihe von Bedingungen
austestet. Hierzu wurden die Bedingungen käuflich erworbener Kristallisations-Kits
ausgetestet. Zum Einen wurde der Natrix-Screen (s. Anhang) angewendet. Zum
Anderen kam der MPD-Screen (s. Anhang) zum Einsatz. Beide Kits wurden von der
Firma Hampton Research erworben.
Die in diesem Screening ermittelten Bedingungen (0.01M Magnesiumchlorid, 0.5M
HEPES-Puffer pH 7.0, 25% Polyethylenglycolmonomethylether 550), bei denen
Kristallisationskeime gebildet werden, wurden anschließend systematisch durch
Konzentrationsvariationen mittels der hanging drop-Methode optimiert.
Es gibt grundsätzlich zwei verschiedene Methoden zur Kristallisation, die sitting drop-
und die hanging drop-Methode. Bei der hier angewendeten hanging drop-Methode
werden ein paar Mikroliter der Oligonucleotid-Lösung mit einem gleichen Volumen
einer Reservoir-Lösung gemischt, die das Präzipitationsmittel enthält. Ein Tropfen
dieser Mischung wird auf einen Glasträger gegeben, der das Reservoir bedeckt (s.
Abb. 120, S. 139).
Da die Lösung im Reservoir eine höhere Konzentration des Präzipitationsmittels
enthält als der Tropfen (der ja ein Gemisch mit Oligonucleotid ist), tritt im Laufe der
Zeit Wasser von dem Tropfen in das Reservoir über und sowohl die DNA-
Konzentration als auch die Konzentration des Präzipitationsmittels im Tropfen erhöht
sich sukzessive. Dieser Vorgang wird mikroskopisch verfolgt, immer in der Hoffnung,
dass sich Kristallisationskeime bilden.
Für die Vermessung von Kristallen mittels Synchrotronstrahlung[139] (besondere Form
der Bremsstrahlung durch elektromagnetischen Wellen, die tangential zur
Bewegungsrichtung von Elektronen austreten, wenn sie durch ein Magnetfeld
abgelenkt werden) müssen diese neben einer homogenen, möglichst kubischen
Form auch eine Größe von 1 mm pro Seite aufweisen. Abb. 121, S. 140 zeigt einige
für das Oligonucleotid 57 erhaltenen Kristalle.
Resultate und Diskussion
139
Abb. 120 hanging drop-Methode zur Kristallisation von Oligonucleotiden
Zwar wurde mit allen erhaltenen Kristallen eine Vermessung durchgeführt, jedoch
konnte in keinem Fall ein verwertbarer Datensatz erhalten werden. Als mögliche
Gründe hierfür ist neben der Inhomogenität der Kristalle auch die geringe Größe zu
nennen. Zwar konnte anhand der Reflexmuster gezeigt werden, dass es sich um
DNA-Kristalle, und nicht um auskristallisierte Salze des verwendeten Puffers,
handelt, jedoch konnte keine Kristallstruktur des unmodifizierten
selbstkomplementären Oligonucleotids 57 (EcoRI-Sequenz) erhalten werden.
Resultate und Diskussion
140
Abb. 121 erhaltene Kristalle des Oligonucleotides 57
Um eine Inhomogenität durch die vorliegende Selbstkomplimentarität der
Oligonucleotids 57 auszuschließen, wurde ein entsprechendes Screening mit dem
unmodifizierten DNA-Doppelstrang 58/202 durchgeführt.
Auch hier konnte das Wachstum von ersten Kristallen beobachtet werden.
Gegenwärtig werden die ersten Ansätze zur Optimierung der
Kristallisationsbedingungen für diesen unmodifizierten DNA-Duplex 58/202
durchgeführt. Diese vielversprechenden Kristallisationsansätze werden in
zukünftigen Arbeiten von Frau Sarah Krüger aus der Arbeitsgruppe von Prof. Meier
weiter verfolgt werden.
Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Das Ziel dieser Arbeit war der Unterschied in der Mutagenität/Carcinogenität von
mono- bzw. polycyclischen aromatischen Aminen zu untersuchen. Diese nach
Metabolisierung unter Bildung von hochreaktiven Nitreniumionen umgewandelten
Verbindungen reagieren mit den Nucleobasen der DNA und führen in
unterschiedlichem Maße zur Bildung von Mutationen. Die Bearbeitung dieses
Themas unterteilte sich dabei in mehrere Punkte.
Um die Auswirkungen solcher Modifikationen in DNA-Doppelsträngen untersuchen
zu können, mussten in einem ersten Teil zunächst die Nucleosid-Addukte hergestellt
und in die entsprechenden Phosphoramidite überführt werden. Als zweiter
wesentlicher Teil dieser Arbeit sollten nach dem erfolgten Einbau in ausgewählte
DNA-Sequenzen die Eigenschaften der modifizierten DNA-Duplices bestimmt und
möglicherweise erste Informationen für den Carcinogenitätsunterschied mono- bzw.
polycyclischen aromatischer Amine erhalten werden.
Zunächst wurde eine Optimierung der Synthese von C8-Arylamin-modifizierten
2‘-Desoxyguanosinaddukten und deren anschließende Überführung in die
modifizierten Phosphoramidite mit einer möglichst basenlabilen Schutzgruppe der
exocyclischen Aminofunktion (zur Verkürzung der Schutzgruppenabspaltung nach
der Oligonucleotidsynthese) vorgenommen. Nach der dreistufigen Darstellung des
geschützten, bromierten Bausteins 63 gelang die Einführung der C8-Arylamin-
Modifikation mittels einer Palladium-katalysierten Kreuzkupplungsreaktion
(Buchwald-Hartwig-Reaktion) in Ausbeuten von 55-91% (s. S. 29). Diese
geschützten Addukte 66-72 konnten in zwei Stufen jeweils komplett entschützt und
anschließend die exocyclische Aminofunktion mit der Formamidin-Schutzgruppe
blockiert werden.
Dabei führten diese Addukte 87-93 zu keiner Konformationsänderung und so lag bei
allen eine anti-Stellung der Nucleobase vor (s. S. 35). Abschließend gelang es diese
Addukte in weiteren zwei Syntheseschritten in die entsprechenden Phosphoramidite
108-114 zu überführen, die Bausteine zur Oligonucleotidsynthese zu generieren und
damit die Allgemeingültigkeit dieser Syntheseroute klar zu belegen unter der
Verwendung der labilen Schutzgruppe der exocyclischen Aminofunktion.
Neben den synthetisierten Arylamin-modifizierten C8-Addukten des 2‘-Desoxy-
guanosin kommen weiteren Addukten eine Bedeutung in der chemischen
141
Zusammenfassung
Carcinogenese zu (s. Abb. 5, S. 9). Die Darstellung der N2-Arylamin-modifizierten
Addukte wurde dabei auf drei verschiedenen Syntheserouten untersucht (s. Kap. 4.2,
S. 41). Eine zunächst durchgeführte Azokupplung eines Nitrosoaryl mit dem
2‘-Desoxyguanosin-Derivat 121 zur Darstellung der N2-Addukte scheiterte.
Ebenfalls erfolglos verlief die Umsetzung des Triflat-Intermediats 123 mit
Phenylhydrazin. Zwar konnte hier das gewünschte Addukt 122 in geringer Ausbeute
hergestellt werden, jedoch bleiben als Ergebnis dieser Syntheseroute mehrere
Probleme bestehen. Zum Einen erwies sich die Zugänglichkeit des Triflat-
Intermediats 123 als sehr schwierig und gelang nur in einer Gesamtausbeute von
2%, was eine Darstellung größerer Mengen nicht möglich macht. Zum Anderen ließ
sich das N2-Addukt 122 nicht in reiner Form isolieren und lag in einem nicht
trennbaren Produktgemisch vor.
Erfolgreich, und damit die erstmalige Darstellung in guten Ausbeuten, verlief der
Syntheseweg mittels einer Buchwald-Hartwig-Reaktion-ähnlichen Synthese unter der
Verwendung des entsprechenden Arylhydrazins und einem an 2-Position bromierten
Baustein 126.
Die dreistufige Darstellung dieses Bausteins gelang dabei mit einer Gesamtausbeute
von 30% und lässt somit auch die Darstellung größerer Mengen zu (s. S. 51). Nach
der Optimierung dieser Kreuzkupplungsreaktion und der erfolgreichen Darstellung
des N2-Adduktes 122 erfolgte die Umwandlung in die entschützte Form 127. Eine
anschließende Schützung mit DMTr verlief in schlechten Ausbeuten und eine
Überführung in das entsprechende Phosphoramidit 129 scheiterte an einer
vermeintlichen Instabilität dieser Verbindung (s. S. 57).
Es gelang im Folgenden eine Stabilisierung des Systems durch die Verwendung
einer O6-Schutzgruppe, welche nach der Oligonucleotidsynthese abgespalten
werden kann. Hierfür wurde die von Pfleiderer etablierte CPE-Gruppe verwendet (s.
S. 59 ff.). Auch hier gelang es den bromierten Baustein 132 in einer guten
Gesamtausbeute von 47% herzustellen. Die Arylmodifikationen konnten dann mittels
der in dieser Arbeit etablierten Kreuzkupplungsreaktion eingeführt werden und die
entsprechenden N2-Addukte 136-139 erstmalig in sehr guten Ausbeuten synthetisiert
werden (s. S. 61). Bei der anschließend für die Addukte 136 und 137 durchgeführten
TBDMS-Entschützung kam es neben der Bildung der gewünschten Produkte 140,
141 auch zur Entstehung der Azoprodukte 142, 143. Diese spielen ebenfalls eine
Rolle in der chemischen Carcinogenese. Das Produktgemisch 140/142 sollten
142
Zusammenfassung
zunächst chemisch quantitativ in die jeweiligen reinen Komponenten 140 bzw. 142
überführt werden, welches jedoch in keinem Fall gelang. Eine Trennung und damit
die saubere Isolierung beider Adduktformen gelang mittels RP-
Säulenchromatographie in guten Ausbeuten (s. S. 66). Anschließend gelang es die
jeweiligen N2-Addukte nach einer durchgeführten DMTr-Schützung in die
Phosphoramidite 148-151 zu überführen und somit erstmalig die Darstellung solch
modifizierter Bausteine für die Oligonucleotidsynthese mittels einer höchst effizienten
Syntheseroute zu ermöglichen. Diese neu etablierte Syntheseroute bietet dabei den
Vorteil, dass neben den N2-Hydrazinoaryl- auch die N2-Azoaryl-Addukte erstmalig
zugänglich sind und die Darstellung der entsprechenden Phosphoramidite auch in
größeren Mengen problemlos zu erzielen ist.
Zur Darstellung der O6-Arylamin-modifizierten Addukte wurden zwei Synthesewege
beschritten. Zunächst sollte die Arylamin-Modifikation mittels einer Mitsunobu-artigen
Reaktion unter Verwendung eines geschützten Hydroxylamin eingeführt werden. Da
jedoch unter keinen gewählten Bedingungen eine Reaktion zu beobachten war (s.
Kap. 4.3.1) wurden Versuche zur Einführung der Modifikation mittels Substitution
unternommen (s. Kap. 4.3.2). Die Darstellung von 2‘-Desoxyguanosinderivaten,
welche eine gute Abgangsgruppe an der 6-Position besitzen, gelang dabei für die
Chloride 166 und 169 sowie das N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl-Derivat 173 in
guten Ausbeuten. Jedoch konnte auch hier unter keiner Reaktionsbedingung die
Bildung des gewünschten Produktes beobachtet werden. Eine weitere Einführung
einer Abgangsgruppe bestand in der Schützung der O6-Position mit Benzotriazol. Die
Darstellung des analogen Benzotriazol-geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivates
174 gelang in einer guten Ausbeute von 63%. Bei den durchgeführten Reaktionen
konnte eine rasche Umsetzung beobachtet werden. Zwar handelt es sich auch bei
diesem Produkt nicht um das gewünschte O6-Addukt, vielmehr konnte das
unerwartete C8-N-Ac-geschützte Addukt 175 isoliert werden (s. S. 90). Durch eine
Optimierung der Reaktionsbedingungen war es möglich, die Ausbeute auf 75% zu
steigern und somit eine neue, einfache und höchst effektive Darstellungsmethode für
C8-N-Ac-geschützte Addukte zu entwickeln. In weiteren vier Syntheseschritten war
die Überführung in das entsprechende Phosphoramidit 179 mit einer
Gesamtausbeute von 45% möglich (s. S. 93). Diese entwickelte Syntheseroute
macht es möglich auch diese Adduktform in zukünftigen Arbeiten weiter auf ihren
Einfluss auf die Eigenschaften der DNA durch gezielte Synthese und Einbau in
143
Zusammenfassung
Oligonucleotide zu untersuchen, was bislang aufgrund einer einfachen fehlenden
Syntheseroute nicht möglich war.
Mit den C8- und N2-modifizierten Phosphoramiditen 108-114 und 148-151 wurden
unter Verwendung eines abgewandelten Standard-Syntheseprotokolls (s. Anhang)
verschiedene, modifizierte Oligonucleotide synthetisiert (s. Kap. 4.4, S. 94 ff.). Für die
C8-modifizierten Oligonucleotide konnten nach einer durch die verwendete labilere
Schutzgruppe verkürzten Abspaltungszeit mit Ammoniak und anschließender
Reinigung mittels HPLC die gewünschten Oligonucleotide mit einer 4-5fach höheren
Ausbeute erhalten werden, als dieses mit der bislang verwendeten isoButyryl-
Strategie möglich war (s. Kap. 4.4.1). Für die N2-modifizierten Oligonucleotide wurde
zunächst eine geeignete Methode zur Abspaltung der CPE-Schutzgruppe unter
Verwendung von DBU etabliert. Nach analog zu den C8-modifizierten
Oligonucleotiden erfolgter Abspaltung mit Ammoniak und abschließender Reinigung
konnten alle modifizierten Oligonucleotide in reiner Form erhalten werden (s. Kap.
4.4.2).
Bei den gewählten Sequenzen handelt es sich zum Einem um die NarI-Sequenz
5'-d(CTCGGCGCCATC), einem Hot Spot für Arylamin-Modifikationen. Hier konnten
C8-Arylamin-Modifikationen erfolgreich in Position 4 und 7 eingebaut werden und
anhand von Schmelzpunktexperimenten und CD-spektroskopischen Untersuchungen
dieser modifizierten Oligonucleotide mit den entsprechenden Antisense-Strängen der
Einfluss der Modifikation auf das Hybridisierungsverhalten oder die Konformation der
entstehenden DNA-Helix festgestellt werden. Dabei bleibt als Ergebnis festzuhalten,
dass die polycyclische C8-Modifikation einen massiven Einfluss auf den Tm-Wert hat
und zu einer deutlicheren Senkung dieses führen. Ein Einfluss eines Schadens auf
die Konformation konnte in keinem Fall beobachtet werden.
Als weitere Sequenz wurde das selbstkomplementäre 12mer
5'-d(GTAGAATTCTAC) gewählt welche eine Erkennungssequenz für das Enzym
EcoRI besitzt. Neben den C8-Addukten wurden erstmals die N2-Addukte eingebaut.
Es konnte hier außer dem Einfluss auf den Tm-Wert und die Konformation auch die
Auswirkungen auf die Aktivität des Restriktionsenzym EcoRI durch einen in dieser
Arbeit etablierten Abbau untersucht werden (s. Kap. 4.7). Aus den Untersuchungen
ging hervor, dass eine N2-Modifikation im Allgemeinen einen größeren Einfluss auf
die Schmelztemperatur hat als die entsprechenden C8-Modifikationen. So war in
keinem Fall eine Duplex-Bildung oberhalb von 5 °C zu beobachten (s. S. 112). Ein
144
Zusammenfassung
Einfluss auf die Konformation war jedoch erneut nicht zu beobachten. Bei den in
Position 1 und 4 C8-modifizierten Oligonucleotiden ergaben sich einige
Rückschlüsse auf den Einfluss solcher Modifikationen auf Enzyme durch den
durchgeführten Restriktionsabbau. Eine Modifikation direkt an der Schnittstelle führt
zu einer kompletten Inaktivität des EcoRI-Enzyms, während eine Modifikation
außerhalb der Schnittstelle immerhin noch eine Erniedrigung der Aktivität zur Folge
hat. Hierbei ist der Einfluss der polycyclischen Modifikation geringer als der eines
monocyclischen Arylamin-Schadens (s. S. 126).
Zur Klärung der Auswirkungen von C8-Arylamin-Addukten auf die Wirkungsweise
verschiedener DNA-Polymerasen wurden modifizierte 30mer-Oligonucleotide mit der
Sequenz 5'-d(AAATG*AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) synthetisiert und als
Templat in Primer-Verlängerungs-Untersuchungen mit drei verschiedenen DNA-
Polymerasen (Pfu, Pol β, Dpo4) eingesetzt (s. Kap. 4.8, S. 127). Als Ergebnis dieser
Untersuchungen lässt sich festhalten, dass die C8-DNA-Addukte starker
Carcinogene bei Versuchen eine geringere Rate an Fehleinbauten besitzen, als die
monocyclischen DNA-Schäden. So findet hier für die monocyclischen Modifikationen
neben dem kanonischen Einbau eines dCTPs mit derselben Häufigkeit auch der
nicht-kanonischer Einbau eines dTTPs und dATPs statt (s. S. 129). Somit scheinen
auch in diesen Fällen die monocyclischen Modifikationen einen höheren Einfluss auf
die Enzyme zu haben.
Abschließend wurden erste Versuche unternommen strukturelle Informationen mittels
Kristallisation zu erhalten. Zwar gelang es das selbstkomplementäre Oligonucleotid
57 zu kristallisieren, jedoch waren diese Kristalle zu inhomogen oder wiesen eine zu
kleine Oberfläch auf, um verwertbare Messungen zur Strukturanalyse mittels
Synchrotronstrahlung durchführen zu können (s. Kap. 4.9, S. 136 ff.). Weitere
vielversprechende Ansätze zur Kristallisation des 30mer-Oligonucleotide laufen
zurzeit und waren bei der Beendigung der Arbeit nicht abgeschlossen und werden an
einer anderen Stelle publiziert.
Insgesamt scheinen im Rahmen dieser Arbeit erste Anhaltspunkte für die Ursache
der unterschiedlichen Mutagenität mono- bzw. polycyclischer aromatischer Amine
gefunden worden zu sein. So haben die monocyclischen Modifikationen einen
stärkeren Einfluss auf enzymatische Aktivitäten, was eventuell zu einer schnelleren
Erkennung eines solchen Schadens und damit zu einer schnelleren Reparatur führen
könnte, als dieses für die polycyclischen Modifikationen der Fall ist.
145
Summary
6. Summary
Polycyclic aromatic amines belong to the class of strong chemical carcinogens,
whereas monocyclic aromatic amines are only borderline carcinogens, which act as
carcinogens after a longer exposition or at high concentrations. Until now no reason
for their different carcinogenic potential was found. Both types form covalently
bonded adducts with DNA after metabolic activation. If these damages are not
repaired, they can compromise the fidelity of DNA replication and cause mutations
and possibly cancer. To properly study the mutagenic effects, structure and repair of
these adducts, it was the aim of this thesis, to develop strategies for the site-specific
incorporation of these dG-carcinogen-adducts into oligonucleotides.
The first section of this thesis deals with the synthesis of the arylamine-modified
phosphoramidites. Primary goal was to achieve an optimization of the synthesis of
C8-arylamine-adducts using a base labile protecting group for the exocyclic amino
function of 2’-dG to shorten the period of time for the alkaline cleavage after
oligonucleotide synthesis. The key step for this synthesis was the Pd-catalyzed
Buchwald-Hartwig reaction (see p. 29). After the complete deprotection of these
adducts 66-72 the formamidine group was introduced to block the exocyclic amino
function. After that the compounds 87-93 were converted into the corresponding
oligonucleotide building blocks 108-114 by dimethoxytritylation and phosphitylation.
In the second part of this thesis a synthetic route to the N2-arylamine-adducts was
found. A direct azo-coupling as well as a substitution using a triflated 2’-dG-derivative
123 failed. Again a Pd-catalyzed cross-coupling reaction with the bromide 132 and
the corresponding arylhydrazines was used to introduce the N2-modification (see p.
61). During the subsequently performed deprotection a partial oxidation to the
corresponding azo-products 142, 143 could be observed. The mixture of the two N2-
adduct forms (N2-hydrazino and N2-azo) could be separated using RP column
chromatography (see p. 66). Afterwards a dimethoxytritylation and phosphitylation led
to the desired N2-arylamine modified phosphoramidites 148-151. Therefore a
blocking of the O6-position using a protecting group which could be cleaved after
oligonucleotide synthesis (Pfleiderers CPE-group) was found to be essential to
stabilize the system and for the isolation of these oligonucleotide building blocks.
As a third class of adducts the O6-arylamine modified 2’-dG-derivatives were target
molecules. Unfortunately, the modifications could be introduced neither by a
146
Summary
Mitsunobu-reaction nor by a substitution using different protected hydroxylamines
(see chapter 4.3). When using the O6-benzotriazol protected 2’-dG-derivative 174 a
quick and highly efficient conversion to the unexpected product 175, the C8-N-Ac-
adduct, was observed. In four additional synthetic steps a conversion into the
corresponding phosphoramidite 179 with an overall yield of 20% was achieved and
therewith a new and short synthesis for this type of adduct been developed.
The C8- and N2-modified phosphoramidites 108-114 and 148-151 were incorporated
into three different oligonucleotide sequences.
First the NarI-sequence with a modification in position 4 or 7
5'-d(CTCGGCGCCATC), and a self complementary sequence with a recognition site
for then EcoRI enzyme 5'-d(GTAGAATTCTAC) were used to investigate the effects
of the modification on hybridisation and structure of the resulting DNA-helices. The
result of these CD- and Tm-value studies were that no difference in structure was
observed, but a higher decrease of the polycyclic modifications of the Tm-value. Also
the influence of the N2-modifications compared to the corresponding C8-adducts was
bigger and for these modified oligonucleotides a lower Tm-value was measured.
Using the oligonucleotides of the EcoRI-sequence a restriction assay was performed.
As a result, a total prevention was achieved by modifying the dG-nucleotide at the
cleavage site. When the modification was outside the recognition sequence a higher
influence, leading to a higher half-live, for the C8-monocyclic-adducted
oligonucleotides than for the polycyclic-modified one was observed (see p. 126).
To study the influence of C8-arylamine adducts on the effectiveness of DNA-
polymerases, oligonucleotides of the following sequence were synthesized
5'-d(AAATG*AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) and used as templates in
primer-extension experiments. Three different polymerases were used, Pfu, Pol β
and Dpo4 (see chapter 4.8, p. 127).
The primer-extension experiments with the modified oligonucleotides revealed
differences between the three polymerases and between the modifications. The most
outstanding result is that there is a much more significant introduction of a wrong
base for the monocyclic modifications (dGTP and dATP instead of dCTP) opposite
the modified base. This effect was also observed for the strong-carcinogen adducts,
but was in comparison only very small (see p. 129).
To gain information about the structure of the modified oligonucleotides first
experiments for the crystallization of the oligonucleotide 57 were performed. The first
147
Summary
obtained crystals were too small or too inhomogeneous. Promising experiments for
the crystallization of the 30mer sequence are currently underway in our laboratories
and were not terminated when this thesis was finished.
148
Ausblick
7. Ausblick
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Reihe modifizierter Oligonucleotide mit
verschiedenen Addukten unterschiedlich starker Carcinogene synthetisiert und
sowohl strukturell als auch molekularbiologisch untersucht. Die dabei erhaltenen
Ergebnisse geben erste Hinweise auf die mögliche Ursache der unterschiedlichen
Carcinogenitäten mono- bzw. polycyclischer Arylamine durch deren unterschiedliche
Interaktion mit verschiedenen Enzymen. Dabei scheinen diese Wechselwirkungen
nicht nur abhängig von der Art des aromatischen Systems, sondern auch von der Art
der Modifikation zu sein. Um weitere Informationen hierüber zu erhalten ist es nötig,
neben zusätzlichen Modifikationen in der N2-Position (z.B. 2-Aminofluoren) auch
einen geeigneten Syntheseweg zur Darstellung der O6-Addukte zu finden. Eine
Alternative zu den in dieser Arbeit nicht erfolgreichen Syntheserouten wäre die
Darstellung dieser Addukte mittels einer Buchwald-Hartwig-Reaktion. In diesem Fall
konnte eine Reaktion eines Arylbromids mit einem entsprechenden
2‘-Desoxyguanosin-Derivat 215 zu dem gewünschten Produkt 216 führen (s. Abb.
122).
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
215
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
216
Pd2(dba)3, rac-BINAP,K3PO4, Aryl-Br,1,2-DME
80 °C
NH2 HNAryl
Abb. 122 mögliche Synthesestrategie zur Darstellung der O6-Arylamin-Addukte
Für die Darstellung eines solchen Kupplungsbausteins 215 bieten sich mehrere
Wege an (s. Abb. 123, S.150).
Zum Einen wäre eine Darstellung ausgehend vom TBDMS-geschützten 2‘-dG 121
denkbar. Durch eine Mitsunobu-Reaktion mit N-Hydroxyphthalimid und
anschließender Reaktion mit Hydrazinhydrat oder Methylhydrazin könnte das
gewünschte Produkt 215 liefern.[140,141]
149
Ausblick
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
215
NH2
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
N
N
N
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
169
Cl
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
121
N
N
N
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
169
Cl
N
N
N
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
169
Cl
1) PhthNOH, PPh3,DIAD (rt)2) CH3NHNH2, CH2Cl2
1) PhthNOH, PPh3,DIAD (reflux)2) H2NNH2
. H2O, EtOH
1) PhthNOH, Et3N, MeCN2) H2NNH2
. H2O, EtOH
1) tBu N-hydroxycarbamat2) CF3COOH
1) NH2OH . HCl, Na2CO3, H2O2) KOH, nBu4NBr3) HCl
Abb. 123 mögliche Synthesen zur Darstellung des Hydroxylamin 215
Zum Anderen wäre eine Darstellung ausgehend vom in dieser Arbeit bereits
synthetisierten Chlorid 169 auf unterschiedlichen Wegen denkbar.[142-144]
Neben der Darstellung der O6-Addukte am 2‘-Desoxyguanosin und den bereits in der
Arbeitsgruppe synthetisierten dA-Addukten könnten auch die Synthesen der an den
Pyrimidin-Basen gefundenen Addukte von Interesse sein. Hier wurden in Versuchen
neben C5-dC-, N4-dC- auch C5-dT-Addukte aromatischer Amine in geringen Mengen
nachgewiesen und identifiziert.[145-147]
Auch die weitere Darstellung und der gezielte Einbau in Oligonucleotide der N-
acetylierten Addukte sollte in zukünftigen Arbeiten eine wichtige Rolle spielen. Dabei
könnte mit Paracetamol (4-Hydroxyacetanilin) auch eine in der Medizin wichtige
Verbindung verwendet werden und die Darstellung der entsprechenden Addukte
wichtige Informationen über die möglichen Nebenwirkungen bei anhaltender
Verabreichung geben.
150
Ausblick
Außer der Synthese modifizierter Phosphoramidite sollte in Zukunft das
Hauptaugenmerk auf den Einbau in Oligonucleotide und die Untersuchungen deren
Eigenschaften gelegt werden. Hierbei sollte neben den bereits in dieser Arbeit
angewandten Methoden (Tm-Wert, CD, Restriktionsabbau, Polymerase-Experimente)
auch die Untersuchung in Repair-Assays möglich gemacht werden, um Aussagen
über die Resistenz der unterschiedlichen Modifikationen gegenüber den
Reparaturmechanismen der Zelle machen zu können.[148] Die beschriebenen
Untersuchungen könnten dabei vergleichend zu einem heterocyclischen DNA-
Schaden, z.B. durch IQ 33, untersucht werden
Eine weitere Möglichkeit, Informationen bezüglich des Verhaltens von dG-Addukten
in biologischen Systemen zu erhalten, könnte beispielsweise die Einführung von
diesen an der Schnittstelle der Topoisomerase 1 (top1) sein (Abb. 124).
5'-AAAAAGACTT-GGAAAAATTTTT TTTTTCTGAA-CCTTTTTAAAAA-3’
Abb. 124 Topoisomerase 1 Schnittstelle
Topoisomerasen sind zusammen mit Helikasen dafür verantwortlich, dass die DNA
nach der Verdoppelung wieder funktionsfähig gemacht wird. Wird beispielsweise die
Topoisomerase 1 blockiert, so ist eine geordnete Weitergabe genetischer Information
für die betroffenen Zellen nicht mehr möglich. Topoisomerase-Hemmer wie z.B.
Camptothecin werden in der Krebstherapie verwendet und können DNA-Brüche, und
damit verbunden, den programmierten Zelltod (Apoptose) auslösen.[149]
Auch die in dieser Arbeit begonnenen Versuche zur Kristallisation und damit zur
strukturellen Analyse modifizierter Oligonucleotide sollte in folgenden Arbeiten
weitergeführt werden.
Als weiteres zukünftiges Projekt wäre eine Anwendung der Synthesen und der
durchgeführten Untersuchungen auf RNA-Ebene vorstellbar. Dieses könnte dann im
Zusammenhang mit einer möglichen Untersuchung der Einflüsse solcher
Modifikationen im Hinblick auf die Translation stehen.
151
Experimentalteil
8. Experimentalteil
8.1 Allgemeines 8.1.1 Lösungsmittel und Reagenzien
Acetonitril: C2H3N [41.05]; Sdp.: 81-82 °C; d = 0.78
a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 0.001%; Fluka Nr.0069
b) zur Synthese; Merck Nr. 800015.
c) technische Qualität; über Calciumhydrid getrocknet und bei
Normaldruck abdestilliert.
Dichlormethan: CH2Cl2 [84.93]; Sdp.: 39-40 °C; d = 1.325
a) technische Qualität; über Calciumchlorid getrocknet und bei
Normaldruck abdestilliert.
b) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 50 ppm; Fluka Nr. 66749
Diethylether: C4H10O [74.12]; Sdp.: 34.5 °C; d = 0.70
a) technische Qualität; über Kalium getrocknet und bei Normal-
druck abdestilliert.
1,2-Dimethoxyethan: C4H10O2 [90.12]; Sdp.: 84-86 °C; d = 0.867
a) technische Qualität; über Kalium getrocknet und bei Normal-
druck abdestilliert.
N,N’-Dimethylformamide: C3H7N1O1 [73.09]; Sdp.: 153 °C; d = 0.94
a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 0.001%; Fluka Nr.40248
1,4-Dioxan: C4H8O2 [88.10]; Sdp.: 101.5 °C; d = 1.03
a) technische Qualität; über Kalium getrocknet und bei Normal-
druck abdestilliert.
Essigsäureethylester: C4H8O2 [88.11]; Sdp.: 77 °C; d = 0.902
a) technische Qualität; über Calciumchlorid getrocknet und bei
Normaldruck abdestilliert.
n-Hexan: C6H14 [86.17]; Sdp.: 68.7 °C; d = 0.65
a) technische Qualität; über Normaldruck abdestilliert.
Methanol: CH4O [32.04]; Sdp.: 64 °C; d = 0.791
a) technische Qualität; über Normaldruck abdestilliert.
b) puriss. Absolut, über Molsieb, Fluka Nr. 65542
152
Experimentalteil
Petrolether 50-70: ---; Sdp.: 50-70 °C; ---
a) technische Qualität; über Normaldruck abdestilliert.
Pyridin: C5H5N [79.10]; Sdp.: 115 °C; d = 0.980
a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 50 ppm; Fluka Nr. 82704
b) technische Qualität; über Calciumhydriddispersion getrocknet
und bei Normaldruck abdestilliert.
Tetrahydrofuran: C4H8O [72.11]; Sdp.: 65-66 °C; d = 0.890
a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 50 ppm; Fluka Nr. 87371
b) technische Qualität; über Kalium getrocknet und bei Normal-
druck abdestilliert.
Triethylamin C6H15N [101.19]; Sdp.: 89 °C; d = 0.72
a) technische Qualität; über Natrium getrocknet und bei Normal-
druck abdestilliert.
racemisches 2,2´-Bis(diphenylphosphino)-1,1´-binaphthyl:
C44H32P2 [633.70] luftdicht verpackt unter Argon, STREM Nr.
98327-87-8 I
Tris(dibenzylidenaceton)-dipalladium(0):
C51H42O3Pd2 [915.70] luftdicht verpackt unter Argon, STREM Nr.
52409-22-0
EcoRI Enzym: aus Escherichia Coli BS5; fermentas ER 0271; 5000 units
DTT-Puffer (pH = 7.5) für den EcoRI-Restriktionsabbau
Es wurden 190.4 mg Magnesiumchlorid, 1.17 g Natriumchlorid
und 1.21 g Tris in ca. 180 mL Reinstwasser gelöst, mit konz.
Salzsäure auf einen pH-Wert von 7.5 eingestellt und auf 200 mL
aufgefüllt. Anschließend wurden zu 200 mL Puffer noch 15.4 mg
DTT hinzugefügt.
153
Experimentalteil
Triethylammoniumacetat-Puffer (TEAA-Puffer) pH = 8.0 für die HPLC (EcoRI Abbau)
Es wurden 3.00 mL Eisessig und 5.00 mL Triethylamin sowie
50 mL Acetonitril in ca. 900 mL Reinstwasser gelöst und auf einen
pH-Wert von 8.0 eingestellt und mit Reinstwasser auf 1000 mL
aufgefüllt.
Triethylammoniumacetat-Puffer (TEAA-Puffer) pH = 6.9 für die HPLC (Trennung der
Oligonucleotide)
Es wurden 5.88 mL Eisessig und 10.12 mL Triethylamin in ca.
900 mL Reinstwasser gelöst und auf einen pH-Wert von 6.9
eingestellt und mit Reinstwasser auf 1000 mL aufgefüllt.
Natriumcacodylat-Puffer (10 mM; pH = 7.0)
Es wurden 214.03 mg Natriumcacodylat in 80 mL Reinstwasser
gelöst und auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt. Danach wurden
noch 952.18 mg Magnesiumchlorid hinzugefügt und auf 100 mL
aufgefüllt.
8.1.2 Chromatographie und Geräte
8.1.2.1 Dünnschichtchromatographie (DC)
Es wurden mit Kieselgel beschichtete Aluminiumfolien mit Fluoreszenzindikator
(Merck Nr. 5554; Schichtdicke 0.2 mm) verwendet. Die Platten wurden auf eine Größe
von 1-8 x 10 cm zugeschnitten; die Laufstrecke betrug 5-10 cm. Alle Rf-Werte wurden
bei Kammersättigung ermittelt. Die Detektion der UV-aktiven Substanzen erfolgte mit
einer UV-Lampe bei einer Wellenlänge von 254 nm.
8.1.2.2 Präparative Säulenchromatographie
Substanzgemische mit mehr als 4 g Rohausbeute wurden über eine Säule mit
leichtem Überdruck aufgereinigt. Als Trennmaterial wurde Kieselgel mit einer
Korngröße von 63-200 µm (Baker Nr. 0253) verwendet.
154
Experimentalteil
8.1.2.3 Zirkulare präparative Dünnschichtchromatographie (Chromatotron)
Substanzgemische mit weniger als 4 g Rohausbeute wurden über eine Platte mit einer
Schichtdicke von 1-4 mm aufgereinigt. Als Trennmaterial wurde Kieselgel Merck Typ
7749 mit Gipszusatz und Fluoreszenzindikator verwendet.
8.1.2.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
Die Hochleistungflüssigkeitschromatographie wurde an einer Merck-Hitachi-Anlage
durchgeführt.
Software: Chromatography Data Station Software
HPLC System Manager Version 3.1.1.
Interface: Model L-7000
Pumpe: Model L-7100
Automatischer Probenwechsler: Model L-7200
Dioden Array Detektor: Model L-7455
Säule: RP-18 endcapped 5 μm Li Chrosphor 100,
EcoCART 125-3
HPLC-Methoden:
Methode A: Reinigung (12mere)
Acetonitril-Gradient von 0-23% in TEAA-Puffer (pH 6.9) bis 50 Minuten, dann 100%
Acetonitril für 5 Minuten und abschließend 100% TEAA-Puffer für 10 Minuten.
Methode B: Reinigung (30mere)
Acetonitril-Gradient von 0-26% in TEAA-Puffer (pH 6.9) bis 50 Minuten, dann 100%
Acetonitril für 5 Minuten und abschließend 100% TEAA-Puffer für 10 Minuten.
Methode C: Enzymatischer Abbau durch EcoRI
Acetonitril-Gradient von 0-25% in Triethylammoniumacetat-Puffer (pH 8.0) bis
20 Minuten, dann für 5 Minuten 100% Acetonitril und abschließend 100%
Triethylammoniumacetat-Puffer für 10 Minuten.
155
Experimentalteil
8.1.2.5 Kernresonanzspektroskopie (NMR)
Die NMR-Spektren wurden in der spektroskopischen Abteilung der Universität
Hamburg aufgenommen. Es standen folgende Geräte zur Verfügung:
1H-NMR:
Bruker AMX 400 (400 MHz), Bruker DMX 500 (500 MHz), Bruker AV 400 (400MHz)
Die Standardisierung erfolgte gegen DMSO-d6 (δ= 2.50 ppm) und C6D6 (δ= 7.26 ppm). Die
Aufnahmen erfolgten bei 400 MHz in 5-mm-Röhrchen über einen Messbereich von 0
bis 14 ppm.
13C-NMR:
Bruker AMX 400 (101 MHz), Bruker AV 400
Die Standardisierung erfolgte gegen DMSO-d6 (δ= 39.52 ppm) und C6D6 (δ= 128.0 ppm).
Die Aufnahmen erfolgten bei 100.6 MHz in einen Messbereich von 0 bis 220 ppm.
31P-NMR:
Bruker DMX 500 (202 MHz).
Die Standardisierung erfolgte gegen einen externen Standard (85% Phosphorsäure).
Zur Wiedergabe der Multiplizitäten in den 1H-, 13C- und 31P-NMR-Spektren finden
folgende Abkürzungen Verwendung:
s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quadruplett, quin = Quintett, sept = Septett,
m = Multiplett.
Die Zuordnung der Signale erfolgte durch die Aufnahme zweidimensionaler Spektren
(H,H-COSY; HSQC; HMBC; NOESY; TOCSY).
8.1.2.6 Massenspektrometrie (MS)
Die FAB-Massenspektren wurden an der Universität Hamburg mit einem
doppelfokussierenden Spektrometer VG/70-250 F der Firma VG Analytical gemessen.
Als Stoßgas wurde Xenon, als Matrix wurde m-Nitrobenzylalkohol verwendet.
Die EI-Massensprektren wurden an der Universität Hamburg mit einem
doppelfokussierenden VG Analytical VG/70-250S-Spektrometer aufgenommen.
Die ESI-Massenspektren wurden an der Universität Hamburg mit einem ThermoQuest
Spektrometer der Marke Finnigan, Modell MAT 95 XL gemessen.
156
Experimentalteil
8.1.2.7 Schmelzpunktbestimmung
Die Schmelzpunkte wurden mit einem Schmelzpunkt-Bestimmer apotec der Firma
Otto Stein ermittelt.
8.1.2.8 Infrarot-Spektrometer
Die IR-Spektren wurden an einem IR-Spektrometer AVATAR 370 FT-IR bei
Raumtemperatur in einem Messbereich von 400 - 4000 cm-1 aufgenommen. Die
Substanzen wurden als KBr - Presslinge und teils mit Hilfe von NaCl-Platten
gemessen.
8.1.2.9 Polarimeter
Der Drehwert der chiralen Verbindungen wurde an einem Perkin Elmer Polarimeter
341 mit einer Hg-Lampe (546 nm) bei 20 °C aufgenommen.
8.1.2.10 Zentrifuge
Die Entfernung des Palladium-Katalysators erfolgte mit Hilfe einer Biofuge der Firma
Heraeus, Modell Pico.
8.1.2.11 UV-Spektrometer
Die UV-Spektren wurden an einem UV-Spektralphotometer (CARY 1E) der Firma
Varian aufgenommen.
8.1.2.12 Thermomixer
Die Abspaltung vom Träger wurde in einem Eppendorf Thermomixer, Modell 5436, bei
45 °C durchgeführt.
8.1.2.13 Speed-Vac-Probenkonzentrator
Die Oligonucleotide wurden in einem Speed-Vac-Probenkonzentrator, einer Zentrifuge
mit integrierter Membranpumpe, der Firma Eppendorf getrocknet.
8.1.2.14 DNA/RNA-Synthesizer
Die modifizierten und unmodifizierten Oligonucleotide wurden in einem DNA-
Synthesizer der Firma Applied Biosystems, Modell 394 DNA/RNA Synthesizer,
157
Experimentalteil
synthetisiert. Die Synthesen wurden dabei nach der Phosphoramidit-Methode
durchgeführt.
8.1.2.15 circularer Dichroismus
Die Messungen des Circular Dichroismus wurden an einem CD Instrument Model 215
der Firma AVIV durchgeführt.
8.2 Synthese von Oligonucleotiden
8.2.1 Synthese
Die Synthese der DNA-Oligonucleotide wurde im Maßstab 1.00 μM mit Hilfe der
Phosphoramidit-Methode durchgeführt. Für unmodifizierte DNA-Stränge wurde das
Standardprotokoll der DNA-Synthese verwendet (s. Anhang).
Für die Synthese der modifizierten DNA-Oligonucleotide wurde dieses Protokoll
abgewandelt und ein weiterer Kupplungsschritt eingeführt, sowie die Kupplungszeit
erhöht (s. Anhang). Für den Einbau der N2-Hydrazinoaryl-modifizierten
Phosphoramidite wurde als Capping-Reagenz eine Mischung aus THF/2,6-
Lutidin/Trimethylessigsäureanhydrid (8:1:1 v/v) verwendet.
8.2.2 Entschützung und Trägerabspaltung
Am Ende der DNA-Synthese wurde von allen Oligonucleotiden die letzte DMTr-
Schutzgruppe mit dem Synthesemodus „Trityl-off“ entfernt. Die weitere Entschützung
und die Abspaltung vom Träger wurden manuell durchgeführt.
Für die N2-modifizierten Oligonucleotide wurde zunächst die Abspaltung der CPE-
Schutzgruppe vorgenommen. Dazu wurden die noch festphasengebundenen
Oligonucleotide mit 1 mL absolutem Pyridin und 100 μL DBU versetzt und für 24 h bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die DBU-Lösung durch Filtration
entfernt und die weitere Abspaltung analog zu den C8-modifizierten Oligonucleotiden
vorgenommen.
Für die Abspaltung von der festen Phase, sowie der Schutzgruppen der Nucleobasen
wurden die noch festphasengebundenen Oligonucleotide mit 1 mL konzentriertem
Ammoniak und 17.5 μL ß-Mercaptoethanol versetzt und für mindestens 4 Stunden im
Thermomixer bei 45 °C geschüttelt. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen,
158
Experimentalteil
der Rückstand noch zweimal mit Reinstwasser gewaschen und in einem Speed-Vac-
Probenkonzentrator getrocknet.
8.2.3 Reinigung der Oligonucleotide
Das getrocknete Roh-Oligonucleotid wurde in 100 μL Reinstwasser aufgenommen und
in zwei Portionen über die Säule an der HPLC gereinigt. Hierbei wurden manuell
jeweils 0.5-1.0 mL-Fraktionen in Eppendorf-Caps aufgefangen und anschließend
mittels analytischen Läufen die Reinheit der Fraktionen untersucht. Gleiche Fraktionen
wurden vereinigt, an einem Speed-Vac-Probenkonzentrator bis zur Trockne
eingeengt, und bei Bedarf noch einmal getrennt.
8.3 Analytik der Oligonucleotide
8.3.1 Bestimmung der Optischen Dichte (OD260)
Eine OD260-Einheit ist die Menge, die in 1.0 mL Wasser gelöst, im Spektralphotometer
(1 cm Küvettendicke) bei 260 nm einen Absorptionswert von 1.0 erzeugt. Um die
OD260-Menge zu bestimmen, wurde das gereinigte Oligonucleotid in 200 μL
Reinstwasser gelöst und 20 μL davon mit 980 μL Reinstwasser auf 1000 μL
Gesamtlösung verdünnt. Diese Lösung wurde in einer Quarzküvette in einem UV/VIS-
Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm vermessen. Der
Absorptionswert (A260) wurde mit dem Faktor 10 (für zehnfache Verdünnung)
multipliziert und ergibt den OD260-Wert.
Mittels des Oligo Calculator 3.1 der Firma Northwestern
(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalc.html) wurden die Stoffmengen,
sowie die Mengen der Oligonucleotide ausgehend vom gemessenen OD260-Wert
berechnet. Bei modifizierten Basen wurde dabei der Extinktionskoeffizient der
unmodifizierten Base als Näherungswert verwendet.
8.3.2 Präparation der Oligonucleotide für das ESI – MS Verdünnung der Oligonucleotide mit einer Lösung aus 20% Isopropanol in Wasser
und 1% Triethylamin, auf eine Konzentration von 5 pmol/ μL.
159
Experimentalteil
8.3.3 Bestimmung der Schmelztemperatur (Tm-Wert) Die Tm-Werte wurden im 1 μM-Maßstab (1 nmol je Strang gelöst in 1 mL Puffer), in
einem 10 mM Phosphat-Puffer mit 140 nM NaCl und 1 mM EDTA, pH 6.8 vermessen.
Die Messungen wurden in einem Temperaturbereich von 5 °C bis 80 °C durchgeführt.
Die Probe wurde jeweils dreimal von 5 °C auf 80 °C erhitzt und dreimal von 80 °C auf
5 °C abgekühlt. Die Heiz- bzw. Kühlrate betrug hierbei 0.5 °C/min., wobei alle 0.5 °C
ein Datenpunkt aufgenommen wurde. Die Absorption der Probelösung wurde bei einer
Wellenlänge von 260 nm verfolgt. Von der resultierenden sigmoiden Kurve wurde das
Maximum der 1. Ableitung zur Bestimmung des Schmelzpunktes berechnet und die
einzelnen Werte gemittelt.
8.3.4 Messung des circularen Dichroismus
Für die Messung des Circular Dichroismus wurden die verwendeten Lösungen der
Schmelzpunktbestimmung auf 3 mL mittels des Phosphatpuffers (pH=6.8) verdünnt
und die molare Elliptizität von 350-200 nm gemessen.
8.3.5 Enzymatischer Abbau der Oligonucleotide mittels des EcoRI
Restriktionsenzym Es wurden jeweils so viele μL wässrige Oligonucleotid-Lösung eingesetzt, dass mit
einem OD von 0.4 gearbeitet werden konnte. Nach der Aufkonzentration wurde das
Oligonucleotid in 100 μL DTT-Puffer aufgenommen, für ca. 2 Minuten auf 70 °C erhitzt
und durch Eiskühlung wieder abgekühlt. Es folgte die Inkubation mit 27 μL EcoRI
(270 Units) bei ca. 20 °C im Thermomixer. Je Probe wurden 20 μL Reaktionslösung
und 40 μL Reinstwasser verwendet und sofort an der HPLC vermessen.
Für die Bestimmung der Halbwertszeit wurden die Integrale des Oligonucleotids und
der beiden Restriktionsprodukte bestimmt und die Menge des geschnittenen
Oligonucleotides zu den jeweiligen Zeitpunkten mittels der folgenden Formel
bestimmt:[131]
μM geschnittenes [Integral d(GTAG)][ε260[GTAGAATTCTAC]][μM d(GTAGAATTCTAC)orig.]
Oligonucleotid =
[(Summe aller Integrale) * [ε260[d(GTAG)]]]
160
Experimentalteil
Nach Auftragung des natürlichen Logarithmus der berechneten Menge gegen die Zeit
konnte, unter der Annahme einer Reaktion 1. Ordnung, die Halbwertszeit nach
folgender Formel berechnet werden:
τ ½ = ln 2 / k
(k: ergibt sich aus der Gleichung des Graphen)
8.4 Allgemeine Arbeitsvorschriften
Darstellung der C8-Arylamin-Addukte mittels der Buchwald-Hartwig-Reaktion
(AAV 1)
In einem ausgeheizten Kolben wurden, unter Stickstoffatmosphäre, das Bromid,
1.5 Äquivalente der Base (K3PO4), 10 mol% Tris(dibenzylidenaceton)-dipalladium(0)
(Pd2(dba)3), 30 mol% racemisches 2,2’-Bis(diphenylphosphino)-1,1’-binaphthyl
(rac-BINAP) und 2 Äquivalente Amin eingewogen und in absolutem 1,2-
Dimethoxyethan (1,2-DME) (15 mL pro mmol des Bromid) gelöst. Anschließend wurde
die Reaktionsmischung bei 80 °C solange gerührt bis dünnschichtchromatographisch
kein Edukt mehr detektiert werden konnte.
Nach Abkühlen der Reaktion auf Raumtemperatur wurden 5 mL gesättigte
Natriumhydrogencarbonat-Lösung zugegeben und die Mischung kurz gerührt. Nach
Zugabe von 10 mL gesättigter Natriumchloridlösung wurden die Phasen getrennt. Die
wässrige Phase wurde dreimal mit je 30 mL Essigsäureethylester extrahiert, und die
vereinigten organischen Phasen anschließend zweimal mit je 10 mL gesättigter
Natriumchloridlösung und einmal mit einer Mischung aus 10 mL gesättigter
Natriumchloridlösung und 2 mL Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde
über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck
abdestilliert. Durch säulenchromatographische Reinigung mit Essigsäureethylester in
Petrolether (10-33%) konnten die Arylamin-Addukte erhalten werden.
Debenzylierung der 8-N-Arylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-
Derivate (AAV 2)
161
Experimentalteil
In einem ausgeheizten Kolben wurden, unter Stickstoffatmosphäre, das 8-N-
Arylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-Derivat in absolutem
Methanol (20 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit einer Spatelspitze Pd/C versetzt.
Nach kurzem Halten ins Ultraschall-Bad wurde das Reaktionsgemisch bei
Raumtemperatur unter einer Wasserstoffatmosphäre für 1-48 h gerührt und
anschließend durch mehrmalige Zentrifugation vom Katalysator befreit. Die
Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck lieferte das saubere
Produkt.
Desilylierung der 8-N-Arylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-
Derivate (AAV 3)
In einem ausgeheizten Kolben wurde, unter Stickstoffatmosphäre, das 8-N-Arylamino-
3’,5’-bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-Derivat in absolutem
Tetrahydrofuran (THF) und absolutem Dichlormethan (DCM) im Verhältnis 1:1 v/v
(20 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 10 Äquivalenten Triethylamin und 12.5
Äquivalenten Triethylamintrihydrofluorid versetzt und bis zur vollständigen Umsetzung
des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ende der Reaktion wurde das
Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand
säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradient (10-40%).
Formamidin-Schützung der 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 4)
In einem ausgeheizten Kolben wurden unter Stickstoffatmosphäre 1 Äquivalent des 2’-
Desoxyguanosin-Derivats in absolutem Pyridin (25 mL je mmol Edukt) gelöst und mit
2 Äquivalenten N,N-Dimethylformamiddiethylacetal versetzt und bis zur vollständigen
Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ende der Reaktion wurde
das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand
säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradient (5-25%).
162
Experimentalteil
Dimethoxytritylierung der 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 5)
Das 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosine-Derivat wurde zweimal mit Pyridin
coevaporiert, in absolutem Pyridin (25 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 2 Äquivalenten
Dimethoxytritylchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre versetzt und bis zur
vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von
gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Dichlormethan wurden die Phasen
getrennt, und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter
vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde
säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradient und 0.1% Triethylamin.
Phosphitylierung der 8-N-Arylamino-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin-Derivate
(AAV 6)
Das 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosin-Derivat wurde zweimal mit absolutem
Acetonitril coevaporiert, unter einer Stickstoffatmosphäre in absolutem Dichlormethan:
absolutem Acetonitril (1:1 v/v) (30 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit 1 Äquivalent
einer 0.25 M DCI-Aktivator-Lösung in THF versetzt. Unter Rühren wurden dann 1.5
Äquivalente Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 zugetropft und die
Reaktionsmischung bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei
Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-
Lösung wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über
Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit.
Der Rückstand wurde säulenchromatographisch über Aluminiumoxid (neutral,
Aktivitätsstufe III) gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit 0-2% Methanol.
Eine anschließende Gefriertrocknung mit Benzol lieferte das gewünschte Produkt als
Feststoff.
163
Experimentalteil
Darstellung der N2-Arylamin-Addukte mittels der Buchwald-Hartwig-Reaktion (AAV 7)
In einer Stickstoffatmosphäre wurden 1 Äquivalent O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-3’,5’-
bis(TBDMS)-2-brom-2’-dG mit 30mol% rac-BINAP, 10mol% Pd2(dba)3, 2 Äquivalenten
Kaliumphosphat, 0.2 Äquivalenten Triethylammoniumchlorid und 2 Äquivalenten des
Arylhydrazin versetzt. Die Reaktanden wurden in abs. 1,2-DME (20 mL pro mmol
Edukt) gelöst und 24 h bei 80 °C gerührt. Nach Abkühlen der Reaktionslösung wurden
1 mL gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung und anschließend 10 mL ges.
Natriumchloridlösung dazugeben. Nach Trennung der Phasen wurde die wässrige
dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden
zweimal mit gesättigter Natriumchloridlösung und anschließend mit Wasser
gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel entfernt.
Die Reinigung erfolgte säulenchromatographisch (PE/EE: 10% -35 %).
Desilylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-arylamino-3’,5’-bis(tert-
butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 8)
In einem ausgeheizten Kolben wurde, unter Stickstoffatmosphäre, das O6-2-(p-
Cyanophenyl)-ethyl-N2-arylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-
Derivat in absolutem Tetrahydrofuran (THF) und absolutem Dichlormethan (DCM) im
Verhältnis 1:1 v/v (20 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 10 Äquivalenten Triethylamin
und 12.5 Äquivalenten Triethylamintrihydrofluorid versetzt und bis zur vollständigen
Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ende der Reaktion wurde
Natriumhydrogencarbonat-Lösung hinzugegeben und die wässrige Phase dreimal mit
Dichlormethan extrahiert. Nach anschließendem Trocknen über Natriumsulfat wurde
das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand
säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradient (10-40%).
Die Trennung der Azo- und Hydrazinoform erfolgte mittels RP-18-Chromatographie.
Als Eluent diente dabei Wasser:Acetonitril (10-40%).
164
Experimentalteil
Dimethoxytritylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-2’-desoxyguanosin-
Derivate (AAV 9)
Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-2’-desoxyguanosin-Derivat wurde zweimal
mit Pyridin coevaporiert, in absolutem Pyridin (25 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 2
Äquivalenten Dimethoxytritylchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre versetzt und bis
zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe
von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Dichlormethan wurden die
Phasen getrennt, und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter
vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde
säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradient (0-20%).
Dimethoxytritylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-2’-
desoxyguanosin-Derivate (AAV 10)
Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-2’-desoxyguanosin-Derivat wurde
zweimal mit Pyridin coevaporiert, in absolutem Pyridin (25 mL pro mmol Edukt) gelöst,
mit 2 Äquivalenten Dimethoxytritylchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre versetzt
und bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach
Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Dichlormethan wurden
die Phasen getrennt, und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet
und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde
säulenchromatographisch über Aluminiumoxid (Neutral; Aktivitätsstufe III) gereinigt.
Als Eluent diente Dichlormethan.
165
Experimentalteil
Phosphitylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-O-5’-dimethoxytrityl-2’-
desoxyguanosin-Derivate (AAV 11)
Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin-
Derivat wurde zweimal mit absolutem Acetonitril coevaporiert, unter einer
Stickstoffatmosphäre in absolutem Dichlormethan: absolutem Acetonitril (1:1 v/v)
(30 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit 1 Äquivalent einer 0.25 M DCI-Aktivator-
Lösung in THF versetzt. Unter Rühren wurden dann 1.5 Äquivalente Bis-N,N’-
Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 zugetropft und die Reaktionsmischung
bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach
Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurden die Phasen
getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter
vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde
säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit 0-2%
Methanol.
Eine anschließende Gefriertrocknung mit Benzol lieferte das gewünschte Produkt als
Feststoff.
Phosphitylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-O-5’-
dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 12)
Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxy-
guanosin-Derivat wurde zweimal mit absolutem Acetonitril coevaporiert, unter einer
Stickstoffatmosphäre in absolutem Dichlormethan: absolutem Acetonitril (1:1 v/v)
(30 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit 1 Äquivalent einer 0.25 M DCI-Aktivator-
Lösung in THF versetzt. Unter Rühren wurden dann 1.5 Äquivalente Bis-N,N’-
Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 zugetropft und die Reaktionsmischung
bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach
Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurden die Phasen
getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter
vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde
166
Experimentalteil
säulenchromatographisch über Aluminiumoxid (Neutral; Aktivitätsstufe 3) gereinigt. Als
Eluent diente Dichlormethan:Ethylacetat 1:2.
Eine anschließende Gefriertrocknung mit Benzol lieferte das gewünschte Produkt als
Feststoff.
8.5 Synthesen Synthese von 8-Brom-2’-desoxyguanosin (Br-dG) 64
571 mg (2.00 mmol) feingepulvertes 2’-Desoxyguanosin 52 wurden in 20 mL dest. Wasser suspendiert, mit 534 mg
(3.00 mmol) N-Bromsuccinimid versetzt, kurz im
Ultraschallbad suspendiert und für genau 15 Minuten bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließendes Filtrieren vom
Lösungsmittel mit Unterdruck liefert das Produkt
8-Brom-2’-desoxyguanosin 64.
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
Br
1
2
34
5 67
8
9
1'
2'3'4'
5'
64
Ausbeute: 545 mg (1.58 mmol, 79%) eines orangenen Feststoffs. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.03. - Smp.: Zersetzung bei 217 °C. - [α]20546:
- 15.4 ° (c = 0.5, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.83 (s,
1H, NH), 6.50 (s, 2H, NH2), 6.14 (dd, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’), 4.39
(ddd, 3JHH = 3.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 2.7 Hz, 1H, H3’), 3.79 (ddd, 3JHH = 5.3 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H4’), 3.61 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 5.3 Hz, 1H,
H5a’), 3.48 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H5b’), 3.13 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.10 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH
= 2.7 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 166.8 (C6), 163.3 (C2),
145.7 (C8), 139.5 (C4), 135.4 (C5), 88.1 (C4’), 81.8 (C1’), 65.3 (C3’), 63.2 (C5’), 36.8
(C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3168, 1650, 1460, 1290, 1064, 789, 626. - MS
(FAB, m/z): ber.: 345.00, gef.: 346.01 (M+H+).
167
Experimentalteil
Synthese von 8-Brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 65
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 8.00 g
(23.1 mmol) 8-Brom-2’-desoxyguanosin 64, 14.9 g
(99.2 mmol) tert-Butyldimethylsilylchlorid und 10.4 g
(152 mmol) Imidazol in 60 mL absolutem Pyridin
suspendiert und für eine Stunde bei Raumtemperatur
gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dabei klar.
Nach langsamer Zugabe von 4 mL Methanol und
anschließendem fünfminütigem Rühren, wurde das Lösungsmittel im
Ölpumpenvakuum in eine Kühlfalle abkondensiert. Der Rückstand wurde zweimal mit
je 40 mL Toluol coevaporiert und säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent
diente Dichlormethan mit 5% Methanol.
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
Br
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
65
Ausbeute: 9.77 g (17.0 mmol, 74%) eines gelben Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Dichlor-
methan/Methanol 9:1 v/v): 0.21. - Smp.: 66 °C. - [α]20546: + 29.5 ° (c = 0.8, CHCl3). -
1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.81 (s, 1H, NH), 6.41 (s, 2H, NH2), 6.14 (dd, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’), 4.58 (ddd, 3JHH = 3.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH =
3.1 Hz, 1H, H3’), 3.74 (ddd, 3JHH = 7.6 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H4’), 3.63
(dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H5a’), 3.42 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 6.0 Hz,
1H, H5b’), 3.16 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.14
(ddd,2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H2b’), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3
an C3’), 0.82 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C5’), 0.10 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), - 0.01 (s, 3H,
Si-(CH3)2 an C5’), - 0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 155.6 (C6), 153.5 (C2), 152.3 (C8), 120.8 (C4), 117.6 (C5), 87.3 (C4’),
84.9 (C3’), 83.0 (C1’), 72.6 (C5’), 36.2 (C2’), 25.9 (SiC(CH3)3), 25.8 (SiC(CH3)3), 18.1
(SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5 (Si(CH3)2), -4.7 (Si(CH3)2), -5.2 (Si(CH3)2), -5.3
(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 2928, 1693, 1471, 1082, 836, 777. - MS
(FAB, m/z): ber.: 573.18, gef.: 574.18 (M+H+).
168
Experimentalteil
Synthese von O6-Benzyl-8-brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63
Ein Kolben mit 5.50 g (9.57 mmol) 8-Br-3’,5’-
TBDMS-dG 65 und 5.02 g (19.1 mmol)
Triphenylphosphin (PPh3) wurde 10 min. im
Ölpumpenvakuum evakuiert. Dann wurden, unter
Stickstoffatmosphäre, 50 mL absolutes 1,4-Dioxan
und 2 ml Benzylalkohol über eine Spritze
zugegeben. Nach zehnminütigem Rühren wurde die
Reaktionsmischung auf 0 °C abgekühlt und 3.7 mL
Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) zugetropft. Die Reaktion wurde auf
Raumtemperatur erwärmt und eine Stunde gerührt. Anschließend wurde das
Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand am
Chromatotron gereinigt. Als Eluent diente Petrolether mit 10% Essigsäureethylester.
α β
γ δ
ε
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
Br
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
63
Ausbeute: 4.36 g (5.45 mmol, 57%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan):
0.22. - [α]20546: + 12.2 ° (c = 2.80, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):
7.49-7.46 (m, 2H, Hγ), 7.41-7.36 (m, 2H, Hδ), 7.30-7.28 (m, 1H, Hε), 6.46 (s, 2H, NH2),
6.18 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 3JHH = 6.8 Hz, 1H, H1’), 5.47 (d, 2JHH = 7.2 Hz, 2H, Hα), 4.66
(ddd, 3JHH = 3.0 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H3’), 3.77 (ddd, 3JHH = 7.6 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H4’), 3.63 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H,
H5a’), 3.42 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H5b’), 3.21 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 6.9 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 1H, H2a’), 2.18 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 6.8 Hz, 3JHH
= 3.0 Hz, 1H, H2b’), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C3’), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C5’),
0.12 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.06 (s, 3H, Si-(CH3)2
an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.4 (C6), 159.2 (C2), 154.8 (C8),
136.5 (Cβ), 128.6 (Cγ + Cδ), 128.3 (Cε), 125.9 (C4), 114.6 (C5), 87.4 (C4’), 85.2 (C3’),
82.8 (C1’), 72.4 (Cα), 67.1 (C5’), 35.9 (C2’), 26.5 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.1
(SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5 (Si(CH3)2), -4.7 (Si(CH3)2), -5.3 (Si(CH3)2), -5.3
(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 2954, 2929, 1614, 1585, 1251, 1077, 836,
777. - MS (FAB, m/z): ber.: 665.78, gef.: 666.80 (M+H+).
169
Experimentalteil
Synthese von O6-Benzyl-8-N-(phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethyl-silyl)-2’-
desoxyguanosin 66
Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt.
170
Es wurden 3.00 g (4.51 mmol) O6-Benzyl-8-brom-
3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63 eingesetzt.
Reaktionszeit: 70 h. - Ausbeute: 1.97 g (2.90 mmol,
64%) eines gelben Feststoffs. - DC: Rf-Wert
(Petrolether/Essigsäureethylester 2:1 v/v): 0.48. -
Smp.: 161.1 °C. - [α]20546: +13.8 (c= 1.64, CHCl3). -
1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.69 (s, 1H, H10), 7.59 (dd, 3JHH= 7.6 Hz, 2H,
Hg), 7.49 (dd, 3JHH= 6.7 Hz, 2H, Hd), 7.47 (d, 3JHH = 7.2 Hz, 2H, Hγ), 7.40-7.38 (m, 4H,
He, Hδ + Hε), 7.37-7.33 (m, 2H, Hc), 7.26 (ddd, 3JHH= 7.5 Hz, 3JHH= 7.5 Hz, 2H, Hh),
6.91 (ddd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, Hi), 6.31 (dd, 3JHH= 6.9 Hz, 3JHH= 6.9 Hz,
1H, H1´), 6.05 (s, 2H, H11), 5.48 (s, 2H, Hα), 4.64 (ddd, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 6.2 Hz, 1H, H3´), 3.88-3.80 (m, 2H, H5´a, H4´), 3.68 (dd, 3JHH= 4.4 Hz, 2JHH=
10.0 Hz, 1H, H5´b), 3.47-3.40 (m, 1H, H2´a), 2.15-2.10 (m, 1H, H2´b), 0.90 (s, 9H, Si-
C(CH3)3 an H3´), 0.81 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.12 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.02, -0.03
(2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.6 (C2), 157.4
(C6), 147.2 (C8), 137.3 (C(A)), 133.9 (Cβ), 128.6 (Cγ + C(C)), 128.5 (Cδ), 128.1 (Cε +
C(B)), 127.1 (C(D)), 86.6 (C4´), 82.4 (C3´), 72.1 (C1´), 65.8 (Cα), 62.4 (C5´), 35.8
(C2´), 25.2 (Si(CH3)2), 17.4 (SiC(CH3)3), 17.2 (SiC(CH3)3), -5.2 (SiC(CH3)3), -5.4
(Si(CH3)3), -6.0 (SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3227, 3034,
1180, 1005, 917, 895, 725, 669, 560, 505. - MS (FAB, m/z): ber.: 678.3745, gef.:
677.3616 [M-H]+
α β
γ δ
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
Dε
66
Experimentalteil
Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-methoxyphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethyl-
silyl)-2’-desoxyguanosin 67
Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt.
171
Es wurden 3.02 g (4.54 mmol) O6-Benzyl-8-brom-
3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63 eingesetzt.
Reaktionszeit: 70 h. - Ausbeute: 2.00 g (2.81 mmol,
62%) eines gelben Feststoff. -DC: Rf-Wert
(Petrolether/Essigsäureethylester 2:1 v/v): 0.38. -
Smp.: 117-121 °C. - [α]20546: + 15 ° (c = 0.1, CHCl3).
- 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.47 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.51 (d, 3JHH =
9.0 Hz, 2H, H(C)), 7.47 (d, 3JHH = 7.2 Hz, 2H, Hγ), 7.38 (dd, 3JHH = 7.2 Hz, 3H, Hδ +
Hε), 6.88 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)), 6.29 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 1H, H1’), 5.97 (s, 2H,
NH2), 5.46 (s, 2H, Hα), 4.63 (ddd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H3’),
3.84-3.81 (m, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 9.6 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.70 (s, 3H,
OMe), 3.68 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H5b’), 3.43 (ddd, 2JHH = 13.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.10 (ddd, 2JHH = 13.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 3.2 Hz, 1H,
H2b’), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.81 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.12 (s, 6H, Si-
(CH3)2 an C3’), -0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-
NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.6 (C2), 157.4 (C6), 147.2 (C8), 139.1 (C(D)),
137.3 (C(A)), 133.9 (Cβ), 128.6 (Cγ + C(C)), 128.5 (Cδ), 128.1 (Cε + C(B)), 120.0 (C4),
114.0 (C5), 87.3 (C1’), 83.0 (C4’), 72.9 (C3’), 66.6 (Cα), 63.2 (C5’), 55.3 (O-CH3), 36.6
(C2’), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.0 (SiC(CH3)3), -5.2 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):
3332, 2952, 2929, 1633, 1605, 1565, 1414, 1256, 835. - MS (FAB, m/z): ber.:
706.3718, gef.: 707.3622 (M+H+).
α β
γ δ
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
Dε
67
O
Experimentalteil
Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-methylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-
2’-desoxyguanosin 68
Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt.
172
Es wurden 2.50 g (3.76 mmol) O6-Benzyl-8-brom-
3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63 eingesetzt.
Reaktionszeit: 70 h. - Ausbeute: 1.96 g
(2.83 mmol, 75%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-
Wert (Petrolether/Essigsäureethylester 2:1 v/v):
0.4. - Smp.: 86 °C. - [α]20546: + 16.9 ° (c = 0.9,
CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.56 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 7.47-
7.49 (m, 2H, Hδ), 7.30-7.40 (m, 3H, H(B) + Hε), 7.07 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, Hγ), 6.80
(d, 3JHH = 8.0 Hz, 2H, H(C)), 6.30 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 1H, H1’), 6.01 (s, 2H, NH2), 5.47
(s, 2H, Hα), 4.62 (ddd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H3’), 3.82-3.79
(m, 2H, H5a’, H4’), 3.68 (dd, 2JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 4.5 Hz, 1H, H5b’), 3.42-3.38 (m,
1H, H2a’), 2.22 (s, 3H, CH3), 2.11 (m, 1H, H2b’), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.80
(s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.11 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an
C5’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.6
(C2), 157.4 (C6), 146.4 (C8), 138.1 (C(D)), 137.0 (C(A)), 129.9 (Cβ), 129.2 (Cγ), 128.4
(Cδ), 128.3 (C(B)), 127.9 (Cε), 123.9 (C4), 117.4 (C(C)), 111.0 (C5), 87.1 (C1’), 83.0
(C4’), 72.7 (C3’), 66.4 (Cα), 63.0 (C5’), 36.5 (C2’), 25.7 (SiC(CH3)3), 20.3 (CH3-
Toluidin), 18.0 (SiC(CH3)3), -4.6, -5.2 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3465,
3348, 2953, 1600, 1409, 1257, 1105, 1060, 835, 698. - MS (FAB, m/z): ber.:
690.3745, gef.: 691.3809 (M+H+).
α β
γ δ
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
Dε
68
Experimentalteil
Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 69
Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt.
173
Es wurden 2.50 g (3.76 mmol) O6-Benzyl-8-brom-
3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63 eingesetzt.
Reaktionszeit: 84 h. - Ausbeute: 1.27 g (1.81
mmol, 55%) eines gelben Feststoffs. - DC: Rf-Wert
(Petrolether/Essigsäureethylester 4:1 v/v): 0.36. -
Smp.: 70 °C. - [α]20546: + 19 ° (c = 0.28,
CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 9.39 (s, 1H, NH-p-
Cyanophenylamin), 7.71-7.67 (m, 4H, H(C) + Hγ), 7.50-7.48 (m, 2H, H(B)), 7.28-7.41
(m, 3H, Hδ + Hε), 6.30 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 1H, H1´), 6.12 (s, 2 H, NH2), 5.50 (s, 2 H,
Hα), 4.64-4.60 (m, 1H, H3´), 3.81-3.78 (m, 2H, H4´+ H5a´), 3.65 (dd, 3JHH = 8.2 Hz,
1H, H5b´), 3.52 (dd, 2JHH = 13.2 Hz , 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a´), 2.13 (ddd, 2JHH = 13.2
Hz , 3JHH = 6.7 Hz , 3JHH = 3.2, 1H, H2b´), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3´), 0.80 (s, 9H,
Si-C(CH)3 an C5´), 0.12 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3´), -0.34 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5´), -
0.43 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5´). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.0 (C2),
156.6 (C6), 144.6 (C8), 139.9 (C(D)), 136.8 (C(A)), 133.1 (Cβ), 128.4 (C(C) + Cγ),
128.3 (Cδ), 127.9 (C(B) + Cε), 124.3 (C4), 117.2 (C5), 111.1 (CN), 87.3 (C4´), 83.0
(C1´), 72.6 (Cα), 66.4 (C3´), 62.9 (C5´), 36.1 (C2´), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3),
-4.9, -5.6 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3215, 2953, 2929, 1622, 1595,
1540, 1304, 1176, 950, 697. - MS (FAB, m/z): ber.: 701.3541, gef.: 702.3641 (M+H+).
α β
γ δ
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
Dε
69
NC
Experimentalteil
Synthese von O6-Benzyl-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-
butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 70
Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt.
174
Es wurden 2.50 g (3.47 mmol) O6-Benzyl-8-brom-
3´,5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxy-
guanosin 63 eingesetzt.
Reaktionszeit: 72 h. - Ausbeute: 1.74 g (2.29
mmol, 66%) eines orangen schmierigen Feststoff.
- DC: Rf-Wert (Petrolether/Essigsäureethylester
2:1 v/v): 0.58. – Smp.: 135 °C. - [α]20546: + 15 ° (c = 1.64, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm]
(400 MHz, DMSO-d6): 8.38 (s, 1H, NH-3,5-Dimethylanilin), 7.46 (d, 3JHH= 7.2 Hz, 2H,
H(B)), 7.36 (t, 3JHH= 7.5 Hz, 2H, Hδ), 7.32-7.29 (dd, 3JHH= 7.2 Hz, 3JHH= 8.2 Hz, 2H,
Hγ), 7.25 (d, 3JHH= 7.1 Hz, 1H, Hε), 6.55 (s, 1H, H(D)), 6.26 (t, 3JHH= 6.9 Hz, 1H, H1’),
6.02 (s, 2H, NH2), 5.49 (s, 2H, Hα), 4.59 (s, 1H, H3´), 3.85-3.79 (m, 2H, H5´a, H4´),
3.67 (dd, 3JHH= 4.6 Hz, 3JHH= 5.8 Hz, 1H, H5´b ), 2.20 (s, 6H, Me-aromat.), 2.08 (s, 2H,
H2´), 0.88 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C3´), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C5´)), 0.10 (d, 3JHH=
2.1 Hz, 6H, Si(CH3)2), 0.00 (d, 3JHH= 3.3 Hz, 6H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101
MHz, DMSO-d6): 157.8 (Cβ), 154.9 (C6), 154.1 (C2), 149.3 (C8), 141.0 (C4), 137.7
(C5), 128.7 (C(D)), 128.5 (C(B)), 128.4 (Cε), 128.3 (Cδ), 128.0 (Cγ), 120.8 (C(C)),
117.9 (C(A)), 87.2 (C4´), 84.0 (C3´), 72.8 (C1´), 66.6 (Cα), 63.2 (C5´), 36.7 (C2´), 25.9
(Si(CH3)2), 21.4 (Me-aromat.), 17.4 (SiC(CH3)3), 16.7 (SiC(CH3)3), -5.2 (SiC(CH3)3), -
5.4 (Si(CH3)3), -6.0 (SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3377, 3333, 2950, 2857,
1616, 1565, 1464, 1413, 1253, 1108, 833, 783. - MS (FAB, m/z): ber.: 704.902, gef.:
705.3993 (M+H+).
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
NH
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
AB
CD
70
B
C
α β
χδ
ε
Experimentalteil
Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 71
Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt.
175
Es wurden 1.40 g (1.56 mmol) O6-Benzyl-8-brom-
3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63 eingesetzt.
Reaktionszeit: 55 h. - Ausbeute: 1.03 g (1.37
mmol, 65%) eines gelben Feststoff. -DC: Rf-Wert
(Petrolether/Essigsäureethylester 2:1 v/v): 0.42. -
Smp.: 146 °C. - [α]20546: + 16.3° (c = 0.32, CHCl3).
- 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.05 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 7.52-7.20
(m, 14H, Hγ + Hδ + Hε + H(B) + H(C) + H(F) + H(G) + H(H)), 6.50 (s, 2H, NH2), 6.20
(dd, 3JHH = 6.8 Hz, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H1’), 5.48 (s, 2H, Hα), 4.51 (ddd, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 1H, H3’), 3.81 (dd, 2JHH = 10.6 Hz, 3JHH = 5.0 Hz, 1H,
H5a’), 3.73 (ddd, 3JHH = 5.0 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H4’), 3.69 (dd, 2JHH =
10.6 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H5b’), 3.63 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 6.8
Hz, 1H, H2a’), 2.26 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H2b’), 0.89
(s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.85 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.10 (s, 3H, Si-(CH3)2 an
C3’), 0.09 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.04 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.05 (s, 3H, Si-
(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.2 (C2), 159.9 (C6),
154.3 (C(A)), 148.5 (C8), 140.9 (C(D)), 137.8 (C(E)), 136.8 (Cβ), 128.9 (Cγ), 128.6
(Cδ), 128.4 (C(B)), 128.2 (Cε), 127.5 (C4), 127.4 (C(C)), 127.2 (C5), 125.8 (C(F)),
125.5 (C(G)), 114.4 (C(H)), 82.5 (C1’), 72.4 (C4’), 72.3 (C3’), 67.0 (Cα), 62.9 (C5’),
37.2 (C2’), 26.0 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.1 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5
(Si(CH3)2), -4.7 (Si(CH3)2), -5.2 (Si(CH3)2), -5.3 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1]
(KBr): 2940, 2908, 2877, 1607, 1559, 1423, 1159, 1005, 938, 785. - MS (FAB, m/z):
ber.: 752.3902, gef.: 753.3992 (M+H+).
α β
γ δ
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BCD
EF
G
H
ε
71
Experimentalteil
Synthese von O6-Benzyl-8-N-(2-aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 72
176
Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt.
Es wurden 1.95 g (2.91 mmol) O6-Benzyl-8-
brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 63 eingesetzt.
Reaktionszeit: 78 h. - Ausbeute: 2.05 g (2.68
mmol, 91%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-
Wert (Petrolether/Essigsäureethylester 2:1
v/v): 0.44. - Smp.: 85 °C. - [α]20546: - 5.2 ° (c =
0.5, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.77 (s, 1H, NH-2-
Aminofluoren), 7.88 (m, 1H, H(E)), 7.76 (dt, 3JHH = 7.8 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H(B)),
7.59 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4JHH = 1.9 Hz, 1H, H(L)), 7.46-7.52 (m, 3H, H(F) + Hγ), 7.20-
7.42 (m, 5H, H(J) + H(I) + Hδ + Hε), 7.07-7.00 (m, 1H, H(K)), 6.34 (dd, 3JHH = 6.9 Hz,
1H, H1’), 6.07 (s, 2H, NH2), 5.50 (s, 2H, Hα), 4.63 (ddd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 3.1 Hz,
1H, H3’), 3.92 (s, 2H, CH2-AF), 3.86-3.81 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.69-3.65 (m, 1H, H5b’),
3.43 (ddd, 2JHH = 10.1 Hz, 3JHH = 6.5 Hz, 1H, H2a’), 2.13 (ddd, 2JHH = 10.1 Hz, 3JHH =
7.2 Hz, 3JHH = 3.5 Hz, 1H, H2b’), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.81 (s, 9H, Si-C(CH)3
an C5’), 0.12 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.00 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.01 (s, 3H, Si-
(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.8 (C(A)), 157.6 (C2),
153.9 (C6), 146.1 (C8), 143.8 (C(D)), 142.5 (C(M)), 141.3 (C(H)), 140.1 (C(C)), 137.0
(C(A)), 134.5 (Cβ), 128.4 (Cγ), 128.4 (Cδ), 127.9 (Cε), 126.7 (C(F)), 124.9 (C(B)),
124.3 (C4), 120.1 (C(K)), 119.0 (C(I) + C(J)), 116.8 (C(L)), 114.4 (C(E)), 111.3 (C5),
87.2 (C4’), 83.0 (C1’), 72.7 (Cα), 66.5 (C3’), 63.0 (C5’), 57.9 (C(G)), 36.5 (C2’), 25.7
(SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.7, -5.4 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3495,
3357, 2952, 2927, 1597, 1560, 1456, 1416, 1254, 835, 778. - MS (FAB, m/z): ber.:
764.3902, gef.: 765.3974 (M+H+).
α β
γ δ
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
ε
72
AB
C
D
EF
GH
IJ
K
L M
Experimentalteil
Synthese von 8-N-(Phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin
73
Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt.
177
Es wurden 1.90 g (2.80 mmol) O6-Benzyl-8-N-
(phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 66 eingesetzt.
Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 1.48 g (2.52 mmol,
90%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.9. - Smp.:
155°C. - [α]20546: - 10.8 ° (c = 0.8, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):
10.52 (s, 1H, NH), 8.35 (s, 1H, NH-Anilin), 7.45 (dd, 3JHH= 7.6 Hz, 2H, H(B)), 7.23 (dd, 3JHH= 8.5 Hz, 2H, H(C)), 6.87 (dd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, H(D)), 6.22 (dd, 3JHH= 7.1 Hz, 1H, H1´), 6.19 (s, 2H, NH2), 4.53 (ddd, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH=
6.2 Hz, 1H, H3´), 3.84-3.78 (m, 2H, H5´a, H4´), 3.71 (ddd, 3JHH= 8.2 Hz, 3JHH= 8.2 Hz, 3JHH= 8.1 Hz, 1H, H5´b), 3.23-3.16 (m, 1H, H2´a), 2.18-2.14 (m, 1H, H2´b), 0.88 (s,
9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.83 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.10 (s, 6H, (Si(CH3)2)2), 0.00
(s, 6H, (Si(CH3)2)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.3 (C6), 152.0 (C2),
149.5 (C8), 143.2 (C4), 141.3 (C5), 128.2 (C(D)), 120.0 (C(C)), 116.5 (C(B)), 113.0
(C(A)), 86.8 (C4´), 82.5 (C3´), 72.3 (C1´), 62.7 (C5´), 36.5 (C2´), 25.4 (Si(CH3)2), 25.3
(Si(CH3)2), 17.7 (SiC(CH3)3), 17.4 (SiC(CH3)3), -5.1 (SiC(CH3)3), -5.3 (SiC(CH3)3). - IR:
Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3353, 1179, 1006, 953, 692, 667, 576, 501. - MS (FAB, m/z):
ber.: 586.8736, gef.: 587.8705 (M+H+).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BCD
73
Experimentalteil
Synthese von 8-N-(4-Methoxyphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 74
Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt.
178
Es wurden 1.92 g (2.69 mmol) O6-Benzyl-8-N-(4-
methoxyphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-
2’-desoxyguanosin 67 eingesetzt.
Reaktionszeit: 4 h. - Ausbeute: 1.58 g (2.55 mmol,
96%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.36. - Smp.:
112°C. - [α]20546: - 9.9 ° (c = 0.8, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):
10.53 (s, 1H, NH), 8.14 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.42 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(C)), 6.84
(d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)), 6.20 (dd, 3JHH = 7.1 Hz, 1H, H1’), 6.15 (s, 2H, NH2), 4.52
(ddd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H3’), 3.83-3.79 (m, 2JHH = 13.2
Hz, 3JHH = 9.6 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.70 (s, 3H, OMe), 3.68 (dd, 2JHH =
13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H5b’), 3.20 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H2a’),
2.10 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 3.2 Hz, 1H, H2b’), 0.88 (s, 9H, Si-
C(CH)3 an C3’), 0.83 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.10 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), 0.00 (s,
3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 155.8 (C2), 153.9 (C6), 152.2 (C8), 150.0 (C(D)), 144.7 (C(A)), 134.8
(C(C)), 128.4 (C(B)), 119.3 (C4), 114.0 (C5), 87.3 (C1’), 83.0 (C4’), 72.9 (C3’), 63.3
(C5’), 55.3 (O-CH3), 37.0 (C2’), 26.0 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.0 (SiC(CH3)3),
17.9 (SiC(CH3)3), -4.6 (Si(CH3)2), - 5.2 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):
2929, 2856, 1698, 1613, 1513, 1248, 1108, 834, 777. - MS (FAB, m/z): ber.:
616.3222, gef.: 617.3312 (M+H+).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
O
A
BCD
74
Experimentalteil
Synthese von 8-N-(4-Methylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 75
179
Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt.
Es wurden 1.90 g (2.74 mmol) O6-Benzyl-8-N-(4-
methylphenylamino)- 3’,5’- bis(tert-butyldimethylsilyl)-
2’-desoxyguanosin 68 eingesetzt.
Reaktionszeit: 4 h. - Ausbeute: 1.69 g (2.38 mmol,
85%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.34. - Smp.:
119 °C. - [α]20546: - 7.9 ° (c = 0.47, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):
10.55 (s, 1H, NH), 8.22 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 7.37 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(B)), 7.04
(d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(C)), 6.20 (dd, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’), 6.17 (s, 2H, NH2), 4.52
(m, 1H, H3’), 3.81-3.76 (m, 3JHH = 8.3 Hz, 3JHH = 9.3 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.70-3.66 (m,
1H, H5b’), 3.18 (ddd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.23 (s,
3H, CH3), 2.06 (ddd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H2b’), 0.88 (s,
9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.83 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.09 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’),
0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), 0.00 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101
MHz, DMSO-d6): 155.7 (C2), 152.3 (C6), 146.0 (C8), 143.9 (C(D)), 139.0 (C(A)), 128.3
(C(B)), 123.9 (C4), 114.5 (C(C)), 111.0 (C5), 87.1 (C1’), 82.9 (C4’), 72.7 (C3’), 63.1
(C5’), 36.9 (C2’), 25.7 (SiC(CH3)3), 20.1 (CH3-Toluidin), 18.1 (SiC(CH3)3), -4.6, -5.3
(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3312, 2918, 1693, 1603, 1517, 1369, 1252,
1083, 837, 776. - MS (FAB, m/z): ber.: 600.3276, gef.: 601.3344 (M+H+).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
75
Experimentalteil
Synthese von 8-N-(4-Cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxy-
guanosin 76
Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt.
180
Es wurden 1.40 g (1.99 mmol) O6-Benzyl-8-N-(4-
cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 69 eingesetzt.
Reaktionszeit: 16 h. - Ausbeute: 1.16 g (1.89 mmol,
95%) eines farblosen Feststoff. -DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.49. - Smp.: 148
°C. -[α]20546: - 8.6 ° (c = 0.5, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.65
(s, 1H, NH), 9.14 (s, 1H, NH-p-Cyanophenylamin), 7.67 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 2H, H(C)),
7.53 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, H(B)), 6.24 (s, 2H, NH2), 6.29 (dd, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’),
4.51 (ddd, 3JHH = 5.8 Hz, 3JHH = 2.7 Hz, 1H, H3’), 3.81-3.78 (m, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH =
8.0 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.64 (dd, 2JHH = 9.7 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, H5b’),
3.43 (ddd, 2JHH = 13.1 Hz, 3JHH = 6.5 Hz, 1H, H2a’), 2.09 (ddd, 2JHH = 13.1 Hz, 3JHH =
6.8 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H2b’), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.82 (s, 9H, Si-C(CH)3
an C5’), 0.09 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.01 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ
[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.8 (C2), 152.6 (C6), 150.0 (C8), 146.4 (C(D)), 141.8
(C(A)), 133.2 (C(C)), 116.4 (C(B)), 114.3 (C4), 113.7 (C5), 101.6 (CN), 87.3 (C4’), 82.9
(C1’), 66.6 (C3’), 63.2 (C5’), 36.6 (C2’), 25.7 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.7, -5.4
(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3499, 3211, 2218, 1634, 1471, 1175, 1031,
777, 544. - MS (FAB, m/z): ber.: 611.3072, gef.: 612.3144 (M+H+).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
76
NC
Experimentalteil
Synthese von 8-N-(3,5-Dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxy-guanosin 77
Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt.
181
Es wurden 1.71 g (1.54 mmol) O6-Benzyl-8-N-(3,5-
dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-
2’-desoxyguanosin 70 eingesetzt.
Reaktionszeit: 12 h. - Ausbeute: 1.17 g (1.35 mmol,
78%) eines bräunlichen Feststoff. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.46. - Smp.:
185°C. - [α]20546: - 43 ° (c = 0.8, CHCl3). - 1H-NMR: δ
[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.57 (s, 1H, NH), 8.04 (s, 1H, NH-3,5-Dimethylanilin),
7.28-7.21 (m, 2H, H(B)), 6.97 (s, 1H, H(D)), 6.51 (s, 2H, NH2), 6.20-6.11 (m, 1H, H1´),
4.49 (t, 3JHH= 2.8 Hz, 1H, H3´), 4.02 (q, 3JHH= 7.1 Hz, 1H, H4´), 3.82-3.75 (m, 2H, H5´),
3.08 (q, 3JHH= 6.8 Hz, 1H, H2´a), 2.19 (s, 1H, H2´b), 0.86 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´),
0.83 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.7 (s, 6H, (Si(CH3)2)2), 0.00 (s, 6H, (Si(CH3)2)2). – 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.9 (C6), 152.7 (C2), 150.2 (C8), 143.6
(C4), 142.0 (C5), 137.7 (C(C), 119.7 (C(D), 117.8 (C(B)), 112.2 (C(A)), 93.7 (C4´),
87.2 (C3´), 73.0 (C1´), 63.2 (C5´), 37.2 (C2´), 30.5 (Si(CH3)2), 26.0 (Si(CH3)2), 26.0
(Me-aromat.), 21.4 (Me-aromat.), 18.3 (SiC(CH3)3), 17.3 (SiC(CH3)3), -4.7 (SiC(CH3)3),
-6.1 (SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3489, 2928, 2857, 1696, 1596, 1497,
1406, 1285, 1091, 836, 775. - MS (FAB, m/z): ber.: 614.3439, gef.: 615.3510 (M+H+).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
77
Synthese von 8-N-(4-Aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxy-
guanosin 78
Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt.
Es wurden 1.00 g (1.32 mmol) O6-Benzyl-8-N-(4-
aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-des-
oxyguanosin 71 eingesetzt.
Reaktionszeit: 16 h. - Ausbeute: 820 mg (1.23 mmol,
93%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.56. - Smp.:
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BCD
EF
G
H
78
Experimentalteil
Zersetzung bei 200 °C. - [α]20546: - 8 ° (c = 0.3, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,
DMSO-d6): 10.59 (s, 1H, NH), 7.87 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 7.83 (d, 3JHH = 8.3
Hz, 2H, H(B)), 7.60 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4H, H(C) + H(F)), 7.42 (dd,3JHH = 7.6 Hz, 2H,
H(G)), 7.29 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 1H, H(H)), 6.47 (s, 2H, NH2), 6.10 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 7.6 Hz, 1H, H1’), 4.48 (ddd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 5.3 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 1H,
H3’), 3.81 (dd, 2JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, H5a’), 3.73 (ddd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH
= 4.7 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 1H, H4’), 3.69 (dd, 2JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H5b’),
3.63 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.8 Hz, 1H, H2a’), 2.22 (ddd, 2JHH =
13.0 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 3JHH = 7.6 Hz, 1H, H2b’), 0.88 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.86
(s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.09 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C3’), 0.08 (s, 3H, Si-(CH3)2 an
C3’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.04 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ
[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.4 (C2), 159.9 (C6), 154.5 (C(A)), 148.6 (C8), 140.9
(C(D)), 139.8 (C(E)), 128.9 (C(B)), 127.6 (C4), 127.3 (C(C)), 127.2 (C5), 125.8 (C(F)),
125.5 (C(G)), 114.4 (C(H)), 82.3 (C1’), 72.4 (C4’), 72.3 (C3’), 62.9 (C5’), 37.2 (C2’),
26.0 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.1 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5 (Si(CH3)2),
-4.7 (Si(CH3)2), -5.2 (Si(CH3)2), -5.3 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3346,
3173, 2954, 2928, 1647, 1603, 1537, 1486, 1383, 1169, 1075, 776. - MS (FAB, m/z):
ber.: 662.3432, gef.: 663.3496 (M+H+).
Synthese von 8-N-(2-Aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxy-
guanosin 79
Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt.
182
Es wurden 1.95 g (2.55 mmol) O6-Benzyl-8-N-(2-
aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)- 2’ -
desoxyguanosin 72 eingesetzt.
Reaktionszeit: 48 h. - Ausbeute: 1.45 g (2.14 mmol,
84%) eines beigen Feststoff. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.56. - Smp.:
169 °C. - [α]20546: - 21 ° (c = 0.34, CHCl3). - 1H-NMR:
δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.61 (s, 1H, NH),
8.50 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 7.80-7.75 (m, 1H, H(E)), 7.75 (dt, 3JHH = 7.9 Hz, 3JHH
= 6.0 Hz, 1H, H(B)), 7.63 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4JHH = 1.9 Hz, 1H, H(L)), 7.50-7.46 (m,
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
79
AB
C
D
EF
GH
IJ
K
L M
Experimentalteil
1H, H(F)), 7.41 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4JHH = 2.0 Hz, 1H, H(I)), 7.32 (dt, 3JHH = 7.6 Hz, 1H,
H(J)), 7.06-7.01 (m, 1H, H(K)), 6.55 (dd, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H1’), 6.21 (s, 2H, NH2),
4.53-4.49 (m, 1H, H3’), 3.99 (s, 2H, CH2-AF), 3.65-3.92 (m, 3H, H5a’, H5b’, H4’), 3.21
(dd, 3JHH = 6.8 Hz, 1H, H2a’), 2.09-2.01 (m, 1H, H2b’), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’),
0.84 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.09 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), 0.08 (s, 3H, Si-(CH3)2
an C5’), 0.01 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6):
158.3 (C(A)), 157.3 (C2), 152.3 (C6), 149.8 (C8), 143.9 (C(D)), 143.5 (C(M)), 140.9
(C(H)), 140.1 (C(C)), 137.0 (C(A)), 126.9 (C(F)), 125.4 (C(B)), 124.8 (C4), 120.1
(C(K)), 118.9 (C(I) + C(J)), 115.9 (C(L)), 113.4 (C(E)), 110.3 (C5), 87.2 (C4’), 83.0
(C1’), 72.6 (C3’), 63.1 (C5’), 57.9 (C(G)), 36.9 (C2’), 25.8 (SiC(CH3)3), 17.9
(SiC(CH3)3), -4.7, -5.4 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3357, 2952, 2928,
1684, 1591, 1562, 1456, 1359, 1256, 836. - MS (FAB, m/z): ber.: 674.3432, gef.:
675.3483 (M+H+).
Synthese von 8-N-(Phenylamino)-2’-desoxyguanosin 80
183
Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt.
Es wurden 1.41 g (2.40 mmol) 8-N-(Phenylamino)-3’,5’-
bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 73 einge-
setzt.
Reaktionszeit: 3 h. - Ausbeute: 820 mg (2.05 mmol, 78%)
eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.02. - Smp.: 103 °C. - [α]20546: - 3.4 ° (c = 1.0,
CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.52 (s, 1H, NH), 8.62 (s,
1H, NH-Anilin), 7.72 (dd, 3JHH= 7.7 Hz, 2H, H(B)), 7.25 (ddd, 3JHH= 7.4 Hz, 3JHH= 7.4
Hz, 2H, H(C)), 6.89 (dd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, H(D)), 6.38 (s, 2H, NH2), 6.32
(dd, 3JHH= 5.6 Hz, 3JHH= 9.7 Hz, 1H, H1´), 5.92 (dd, 3JHH= 4.7 Hz, 3JHH= 4.7 Hz, 1H,
5´-OH), 5.34 (d, 3JHH= 3.5 Hz, 1H, 3´-OH), 4.42-4.41 (m, 1H, H3´), 3.92-3.88 (m, 2H,
H5´a, H4´), 3.75-3.74 (m, 1H, H5´b), 3.35 (dd, 1H, H2´a), 2.03-2.00 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.1 (C6), 152.3 (C2), 148.9 (C8), 142.7
(C4), 140.3 (C5), 128.0 (C(D)), 120.0 (C(C)), 116.8 (C(B)), 112.7 (C(A)), 86.6 (C4´),
82.3 (C3´), 70.7 (C1´), 60.7 (C5´), 45.1 (C2´). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3423,
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BCD
80
Experimentalteil
2982, 1638, 1476, 1037. - UV: λMax [nm] MeCN: 285. - MS (FAB,m/z): ber.: 358.1390,
gef.: 359.1402 (M+H+).
Synthese von 8-N-(4-Methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 81
Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt.
Es wurden 1.80 g (2.92 mmol) 8-N-(4-Methoxy-
phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxy-
guanosin 74 eingesetzt.
Reaktionszeit: 2 h. - Ausbeute: 780 mg (2.89 mmol, 96%)
eines farblosen Öls. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.48. - [α]20546: - 0.9 ° (c
= 1.0, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,
DMSO-d6): 10.73 (s, 1H, NH), 8.47 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.64 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H,
H(C)), 6.83 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)), 6.62 (s, 2H, NH2), 6.31 (dd, 3JHH = 9.7 Hz, 3JHH
= 5.7 Hz, 1H, H1’), 5.90 (s, 1H, 5’-OH), 5.34 (s, 1H, 3’-OH), 4.42 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz,
1H, H3’), 3.91 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 2H, H5a’, H4), 3.74 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5
Hz, 1H, H5b’), 3.71 (s, 3H, OMe), 3.40 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H2a’),
1.99 (ddd, 2JHH = 12.6 Hz, 3JHH = 5.7 Hz, 3JHH = 3.2 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm]
(101 MHz, DMSO-d6): 156.1 (C2), 153.8 (C6), 153.3 (C8), 149.9 (C(D)), 144.1 (C(A)),
134.5 (C(C)), 128.4 (C(B)), 119.3 (C4), 112.0 (C5), 87.5 (C1’), 83.0 (C4’), 71.7 (C3’),
61.7 (C5’), 55.5 (O-CH3), 38.5 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 3423, 2982, 1638,
1476, 1037. - UV: λMax [nm] MeCN: 294, 255. - MS (FAB,m/z): ber.: 388.1495, gef.:
389.1501 (M+H+).
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
O
A
BCD
81
184
Experimentalteil
Synthese von 8-N-(4-Methylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 82
Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt.
185
Es wurden 1.30 g (2.16 mmol) 8-N-(4-Methylphenylamino)-
3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 75 ein-
gesetzt.
Reaktionszeit: 4 h. - Ausbeute: 720 mg (1.93 mmol, 89%)
eines weißen klebrigen hochviskosen Öls. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.65. - [α]20546: - 1.8 °
(c = 0.94, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.92 (s, 1H, NH),
8.53 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 7.62 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, H(B)), 7.04 (d, 3JHH = 8.5 Hz,
2H, H(C)), 6.56 (s, 2H, NH2), 6.31 (dd, 3JHH = 9.7 Hz, 3JHH = 5.6 Hz, 1H, H1’), 5.75 (s,
1H, 5’-OH), 5.32 (s, 1H, 3’-OH), 4.42-4.38 (m, 1H, H3’), 3.91-3.88 (m, 2H, H5a’, H4’),
3.74-3.69 (m, 1H, H5b’), 3.16-3.10 (m, 1H, H2a’), 2.23 (s, 3H, CH3), 1.99 (dd, 2JHH =
12.9 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.7
(C2), 153.0 (C6), 149.5 (C8), 143.4 (C(D)), 138.4 (C(A)), 129.2 (C4), 128.6 (C(B)),
117.4 (C(C)), 111.8 (C5), 87.1 (C1’), 82.7 (C4’), 71.3 (C3’), 61.3 (C5’), 38.3 (C2’), 20.3
(CH3-Toluidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 3468, 3095, 2938, 1676, 1647, 1561,
1474, 1361, 736. - UV: λMax [nm] MeCN: 312, 255, 213. - MS (FAB, m/z): ber.:
372.1546, gef.: 373.1611 (M+H+).
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
82
Synthese von 8-N-(4-Cyanophenylamino)-2’-desoxyguanosin 83
Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt.
Es wurden 900 mg (1.47 mmol) 8-N-(4-
Cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl) - 2’ -
desoxyguanosin 76 eingesetzt.
Reaktionszeit: 3 h. - Ausbeute: 500 mg (1.30 mmol,
88%) eines farblosen Öl. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.06. - [α]20546: + 14 ° (c
= 1.3, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.33 (s, 1H, NH),
9.25 (s, 1H, NH-p-Cyanophenylamin), 7.91 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 2H, H(C)), 7.68 (d, 3JHH =
8.9 Hz, 2H, H(B)), 6.98 (s, 2H, NH2), 6.33 (dd, 3JHH = 9.5 Hz, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H1’),
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
83
NC
Experimentalteil
5.75 (s, 1H, 5’-OH), 4.82 (s, 1H, 3’-OH), 4.42 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H3’), 3.92-3.88
(m, 2H, H5a’, H4’), 3.74-3.66 (m, 1H, H5b’), 3.16-3.09 (m, 1H, H2a’), 2.06 (ddd, 2JHH =
12.6 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 154.1
(C2), 153.3 (C6), 149.6 (C8), 144.9 (C(D)), 141.7 (C(A)), 133.1 (C(C)), 119.7 (C4),
117.1 (C(B)), 113.7 (C5), 101.6 (CN), 87.3 (C4’), 83.0 (C1’), 71.3 (C3’), 61.3 (C5’),
38.6 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3422, 2974, 2937, 2676, 1685, 1647, 1170,
1027, 736, 418. - UV: λMax [nm] MeCN: 335, 212. - MS (FAB, m/z): ber.: 383,1342,
gef.: 384.2351 (M+H+).
Synthese von 8-N-(3,5-Dimethylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 84
Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt.
186
Es wurden 1.17 g (1.75 mmol) 8-N-(3,5-
dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 77 eingesetzt.
Reaktionszeit: 12 h. - Ausbeute: 520 mg (1.35 mmol,
79%) eines braunen Öls. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.85. - [α]20546: - 17 ° (c
= 1.0, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.53 (s, 1H, NH),
8.41 (s, 1H, NH-3,5-Dimethylanilin), 7.30 (s, 2H, H(B)), 6.52 (s, 1H, H(D)), 6.45 (s, 2H,
NH2), 6.29 (dd, , 3JHH= 5.7 Hz, , 3JHH= 3.9 Hz, 1H, H´1), 5.86 (s, 1H, 5´-OH), 5.03 (s,
1H, 3´-OH), 4.40 (d, 3JHH= 5.2 Hz, 1H, H3´), 3.89 (d, 3JHH= 1.9 Hz, 1H, H4´), 3.70-3.65
(m, 2H, H5´), 2.21 (s, 6H, Me-aromat.), 1.98-1.91 (m, 2H, H2´). - 13C-NMR: δ [ppm]
(101 MHz, DMSO-d6): 155.6 (C6), 154.4 (C2), 150.7 (C8), 147.9 (C4), 137.5 (C5),
133.6 (C(D)), 130.9 (C(B)), 130.8 (C(B)), 127.5 (C(C)), 127.0 (C(C)), 115.2 (C(A)),
95.4 (C4´), 90.4 (C3´), 71.3 (C1´), 58.7 (C5´), 45.8 (C2´), 21.4 (Me-aromt.). - IR:
Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3438, 2941, 2677, 1684, 1476, 1397, 1069, 736, 519. - UV:
λMax [nm] MeCN: 335, 212. - MS (FAB, m/z): ber.: 386.1703, gef.: 387.1751 (M+H+).
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
84
Experimentalteil
Synthese von 8-N-(4-Aminobiphenyl)-2’-desoxyguanosin 85
Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt.
Es wurden 600 mg (0.90 mmol)
8-N-(4-Aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethyl-
silyl)-2’-desoxyguanosin 78 eingesetzt.
187
Reaktionszeit: 3 h. - Ausbeute: 370 mg (0.85 mmol,
94%) eines farblosen Feststoff. -DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.83. - Smp.:
197 °C. - [α]20546: + 3.8 ° (c = 0.5, CH2Cl2/MeOH). -
1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.92 (s,
1H, NH), 8.77 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 7.83 (d, 3JHH = 8.3 Hz, 2H, H(B)), 7.60
(dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4H, H(C) + H(F)), 7.42 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 2H, H(G)), 7.29 (dd, 3JHH
= 7.6 Hz, 1H, H(H)), 6.65 (s, 2H, NH2), 6.34 (dd, 3JHH = 9.5 Hz, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H1’),
6.02 (s, 1H, 5’-OH), 5.39 (s, 1H, 3’-OH), 4.44 (ddd, 3JHH = 5.6 Hz, 1H, H3’), 3.93 (dd, 2JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, H5a’), 3.77-3.64 (m, 3H, H4’ + H5b’ + H2a’), 2.22
(ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 5.6 Hz, 3JHH = 12.6 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm]
(101 MHz, DMSO-d6): 158.9 (C2), 156.0 (C6), 153.3 (C(A)), 149.7 (C8), 140.5 (C(D)),
140.3 (C(E)), 132.4 (C5 + C4), 126.7 (C(F) + C(B) + C(C)), 126.2 (C(G)), 117.8 (C(H)),
87.3 (C1’), 83.0 (C4’), 71.4 (C3’), 61.5 (C5’), 38.6 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):
3427, 2979, 1559, 1475, 1400, 1035, 720. - UV: λMax [nm] MeCN: 327, 233, 213. - MS
(FAB, m/z): ber.: 434.1703, gef.: 435.1805 (M+H+).
Synthese von 8-N-(2-Aminofluorenyl)-2’-desoxyguanosin 86
Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt.
Es wurden 1.35 g (2.00 mmol) 8-N-(2-
Aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)- 2’
-desoxyguanosin 79 eingesetzt.
Reaktionszeit: 5 h. - Ausbeute: 548 mg (1.22
mmol, 61%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-
Wert (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.81. -
Smp.: Zersetzung bei 240 °C. - [α]20546: - 18 ° (c =
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
86
AB
C
D
EF
GH
IJ
K
L M
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BCD
EF
H
85
G
Experimentalteil
0.16, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.55 (s, 1H, NH),
8.73 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 8.09 (d, 4JHH = 1.3 Hz, 1H, H(E)), 7.76 (dt, 3JHH = 7.4
Hz, 3JHH = 9.8 Hz, 2H, H(B) + H(L)), 7.67 (dd, 3JHH = 9.4 Hz, 4JHH = 1.9 Hz, 1H, H(F)),
7.52 (d, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(I)), 7.33 (t, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(J)), 7.21 (dt, 3JHH = 7.4
Hz, 3JHH = 7.4 Hz, 4JHH = 1.0 Hz, 1H, H(K)), 6.36 (s, 2H, NH2), 6.34-6.29 (m, 1H, H1’),
5.98 (t, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, 5’-OH), 5.34 (d, 3JHH = 3.6 Hz, 1H, 3’-OH), 4.43-4.37 (m,
1H, H3’), 3.93-3.88 (m, 1H, H5a’), 3.89 (s, 2H, CH2-AF), 3.78-3.70 (m, 2H, H5b’, H4’),
2.56-2.52 (m, 1H, H2a’), 2.09-2.00 (m, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 157.3 (C(A)), 155.7 (C2), 152.8 (C6), 149.5 (C8), 143.8 (C(D)), 143.3
(C(M)), 142.4 (C(H)), 141.4 (C(C)), 140.0 (C(A)), 134.0 (C(F)), 126.6 (C(B)), 124.9
(C4), 120.0 (C(K)), 119.0 (C(I) + C(J)), 116.3 (C(L)), 113.9 (C(E)), 112.2 (C5), 87.2
(C4’), 82.8 (C1’), 71.3 (C3’), 61.3 (C(G) + C5’), 36.5 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1]
(KBr): 3330, 1676, 1593, 1561, 1432, 1415, 1356, 1325, 1095, 767, 731. - UV: λMax
[nm] MeCN: 317, 260, 206. - MS (FAB, m/z): ber.: 446.1703, gef.: 447.1790 (M+H+).
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin 87
Die Reaktion wurde nach AAV 4 durchgeführt.
188
Es wurden 800 mg (1.95 mmol) 8-N-
(Phenylamino)-2’-desoxyguanosin 80 eingesetzt.
Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 563 mg (1.36
mmol, 67%) eines hellgelben Feststoff. - DC: Rf-
Wert (Dichlormethan/Methanol 6:1 v/v): 0.31. -
Smp.: 161 °C. - [α]20546: + 18.8 ° (c = 1.2,
CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.26 (s, 1H, NH), 8.72 (s,
1H, NH-Anilin), 8.53 (s, 1H, Hα), 7.74 (dd, 3JHH= 7.7 Hz, 2H, H(B)), 7.26 (ddd, 3JHH=
7.4 Hz, 3JHH= 7.4 Hz, 2H, H(C)), 6.92 (dd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, H(D)), 6.44
(dd, 3JHH= 5.6 Hz, 3JHH= 9.3 Hz, 1H, H1´), 5.87 (dd, 3JHH= 4.8 Hz, 3JHH= 4.8 Hz, 1H, 5´-
OH), 5.39 (d, 3JHH= 3.9 Hz, 1H, 3´-OH), 4.46-4.44 (m, 1H, H3´), 3.92 (d, 3JHH= 2.2 Hz,
2H, H5´a, H4´), 3.76 (dd, 3JHH= 2.0 Hz, 3JHH= 4.6 Hz, 1H, H5´b), 3.17 (d, 3JHH= 5.6 Hz,
1H, H2´a), 3.15 (s, 3H, Me-Formamidin), 3.02 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.09-2.04 (m,
1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.1 (Cα), 156.2 (C6), 155.5
(C2), 147.7 (C8), 143.9 (C4), 140.3 (C5), 128.1 (C(D)), 120.4 (C(C)), 117.1 (C(B)),
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'4'
5'
2'
A
BCD
N(Me)2
α
87
Experimentalteil
115.2 (C(A)), 86.8 (C4´), 82.3 (C3´), 70.7 (C1´), 60.8 (C5´), 38.0 (C2´), 34.2 (Me-
Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3265, 1115, 991, 960, 915, 859, 504. - MS
(FAB,m/z): ber.: 414.1812, gef.: 415.2543 (M+H+).
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 88
Die Reaktion wurde nach AAV 4 durchgeführt.
189
Es wurden 840 mg (1.75 mmol) 8-N-(4-
Methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 81 einge-
setzt.
Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 680 mg (1.42
mmol, 81%) eines farblosen Feststoff. – DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.36. - Smp.: 124
°C. - [α]20546: + 8.4 ° (c = 0.8, CH2Cl2/MeOH). - 1H-
NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.21 (s, 1H, NH), 8.57 (s, 1H, Hα), 8.51 (s, 1H,
NH-p-Anisidin), 7.64 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(C)), 6.85 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)),
6.42 (dd, 3JHH = 9.4 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H1’), 5.86 (dd, 3JHH = 4.8 Hz, 1H, 5’-OH),
5.37 (d, 3JHH = 3.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.44 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H3’), 3.91 (ddd, 3JHH =
5.7 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.73 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H5b’), 3.71 (s, 3H,
OMe), 3.40 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H2a’), 3.14, 3.01 (2x s, 2x 3H,
Me-Formamidin), 2.04 (ddd, 2JHH = 12.6 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ
[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.3 (Cα), 156.1 (C2), 153.8 (C6), 153.3 (C8), 149.9
(C(D)), 144.1 (C(A)), 120.8 (C4), 119. 3 (C(C)), 113.9 (C(B)), 112.0 (C5), 87.5 (C1’),
83.0 (C4’), 71.7 (C3’), 61.7 (C5’), 55.4 (O-CH3), 38.5 (C2’), 34.7 (Me-Formamidin). -
IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3338, 3161, 2944, 2910, 1651, 1599, 1531, 1475, 1361,
1139, 1038, 776. - MS (FAB,m/z): ber.: 443.4699, gef.: 444.4802 (M+H+).
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'4'
5'
2'
O
A
BCD
N(Me)2
α
88
Experimentalteil
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 89
Die Reaktion wurde nach AAV 4 durchgeführt.
190
Es wurden 700 mg (1.87 mmol) 8-N-(4-
Methylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 82 einge-
setzt.
Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 530 mg (1.23
mmol, 68%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.78. - Smp.: 182
°C. - [α]20546: + 28.5 ° (c = 0.33, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-
d6): 11.24 (s, 1H, NH), 8.64 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 8.52 (s, 1H, Hα), 7.63 (d, 3JHH = 8.5
Hz, 2H, H(B)), 7.06 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(C)), 6.42 (dd, 3JHH = 9.4 Hz, 3JHH = 5.9 Hz,
1H, H1’), 5.87 (dd, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, 5’-OH), 5.39 (d, 3JHH = 3.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.45-
4.39 (m, 1H, H3’), 3.91-3.85 (m, 1H, H5a’), 3.75-3.67 (m, 2H, H4’, H5b’), 3.01, 3.14
(2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.57 (ddd, 3JHH = 13.1 Hz, 3JHH = 9.5 Hz, 3JHH = 6.4 Hz,
1H, H2a’), 2.24 (s, 3H, CH3), 2.05-1.99 (m, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 157.5 (Cα), 156.5 (C2), 155.8 (C6), 148.1 (C8), 144.5 (C(D)), 138.2 (C(A)),
129.5 (C4), 128.9 (C(B)), 117.6 (C(C)), 115.6 (C5), 87.2 (C1’), 82.7 (C4’), 71.1 (C3’),
61.2 (C5’), 38.3 (C2’), 34.6 (Me-Formamidin), 20.3 (CH3-Toluidin). - IR: Wellenzahl
[cm-1] (KBr): 3307, 1667, 1632, 1533, 1344, 1114, 1061, 960, 819. - MS (FAB, m/z):
ber.: 427.1968, gef.: 428.2046 (M+H+).
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
89
N(Me)2
α
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-2’-desoxyguanosin 90
Die Reaktion wurde nach AAV 4 durchgeführt.
Es wurden 500 mg (1.30 mmol) 8-N-(4-
Cyanophenylamino)-2’-desoxyguanosin 83 einge-
setzt.
Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 520 mg (1.18
mmol, 91%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.14. - Smp.:
154 °C. - [α]20546: + 3.6 ° (c = 0.43, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,
DMSO-d6): 11.34 (s, 1H, NH), 9.40 (s, 1H, Hα), 9.29 (s, 1H, NH-p-Cyanophenylamin),
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
90
NC
N(Me)2
α
Experimentalteil
7.70 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 2H, H(C)), 7.38 (d, 3JHH = 7.5 Hz, 2H, H(B)), 6.45 (dd, 3JHH = 9.2
Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H1’), 5.75 (s, 1H, 5’-OH), 4.78 (s, 1H, 3’-OH), 4.46 (ddd, 3JHH =
5.7 Hz, 1H, H3’), 3.93 (dd, 1H, H5b’), 3.75-3.70 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.16-3.09 (m, 1H,
H2a’), 2.88, 2.72 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.12 (ddd, 2JHH = 12.2 Hz, 3JHH = 5.2
Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.5 (Cα), 155.7 (C2),
155.4 (C6), 147.3 (C8), 143.8 (C(D)), 141.8 (C(A)), 132.0 (C(C)), 118.6 (C4), 116.3
(C(B)), 114.6 (C5), 100.8 (CN), 86.4 (C4’), 81.9 (C1’), 70.1 (C3’), 60.3 (C5’), 38.2
(C2’), 34.7 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3446, 2738, 2676, 1598,
1392, 1176, 1061, 916, 844, 643, 579. - MS (FAB, m/z): ber.: 438.1764, gef.:
439.1797 (M+H+).
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 91
Die Reaktion wurde nach AAV 4 durchgeführt.
191
Es wurden 520 mg (1.35 mmol) 8-N-(3,5-
dimethylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 84
eingesetzt.
Reaktionszeit: 72 h. - Ausbeute: 280 mg (0.63
mmol, 47%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.89. - Smp.:
151 °C. - [α]20546: - 10 ° (c = 1.0, CHCl3). - 1H-
NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.23 (s, 1H, NH), 8.50 (s, 1 H, NH-3,5-
Dimethylanilin), 8.49 (s, 1H, Hα), 7.30 (s, 2H, H(B)), 6.53 (s, 1H, H(D)), 6.39 (dd, 3JHH=
5.9 Hz, 3JHH= 6.7 Hz, 1H, H1´), 5.81 (dd, 3JHH= 4.6 Hz, 3JHH= 9.2 Hz, 1H, 5´-OH), 5.34
(d, 3JHH= 3.9 Hz, 1H, 3´-OH), 4.42 (s, 1H, H3´), 3.88 (d, 3JHH= 2.3 Hz, 1H, H5´a), 3.73-
3.68 (m, 2H, H5´b, H4´), 3.12 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.99 (s, 3H, Me-Formamidin),
2.52-2.39 (m, 1H, H2´a), 2.20 (s, 6H, Me-aromat.), 2.04-1.99 (m, 1H, H2´b). – 13C-
NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.6 (Cα), 157.8 (C6), 156.8 (C2), 156.03 (C8),
148.5 (C4), 144.5 (C5), 140.8 (C(A)), 137.6 (C(D)), 122.3 (C(C)), 115.6 (C(B)), 87.3
(C4´), 82.1 (C3´), 71.2 (C1´), 61.3 (C5´), 38.5 (C2´), 34.8 (Me-Formamidin), 21.5
(Mearomat.). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3302, 2921, 1675, 1630, 1560, 1345, 1113. -
MS (FAB, m/z): ber.: 438.1764, gef.: 439.1797 (M+H+).
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
91
N(Me)2
α
Experimentalteil
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-2’-desoxyguanosin 92
Die Reaktion wurde nach AAV 4
durchgeführt.
192
Es wurden 160 mg (0.36 mmol) 8-N-(4-
Aminobiphenyl)-2’-desoxyguanosin 85 einge-
setzt.
Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 167 mg
(0.34 mmol, 94%) eines farblosen Feststoff. -
DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1
v/v): 0.13. - Smp.: 245 °C. - [α]20546: + 28.9 °
(c = 0.5, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.28 (s, 1H, NH),
8.68 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 8.57 (s, 1H, Hα), 7.85 (d, 3JHH = 8.3 Hz, 2H, H(B)),
7.63 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4H, H(C) + H(F)), 7.42 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 2H, H(G)), 7.29 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 1H, H(H)), 6.46 (dd, 3JHH = 9.3 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H1’), 5.93 (s, 1H,
5’-OH), 5.40 (s, 1H, 3’-OH), 4.47 (ddd, 1H, H3’), 3.94 (dd, 3JHH = 2.1 Hz, 1H, H5a’),
3.77-3.72 (m, 3H, H4’ + H5b’ + H2a’), 3.07, 3.06 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.08
(ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-
d6): 157.7 (Cα), 156.7 (C2), 156.0 (C6), 149.7 (C(A)), 148.3 (C8), 140.4 (C(D)), 140.1
(C(E)), 132.7 (C5 + C4), 129.0 (C(F)), 126.9 (C(B)), 126.8 (C(C), 126.2 (C(G)), 115.8
(C(H)), 87.4 (C1’), 83.0 (C4’), 71.3 (C3’), 61.4 (C5’), 38.6 (C2’), 34.8 (Me-
Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3346, 3173, 2954, 2928, 1647, 1603, 1537,
1486, 1383, 1169, 1075, 776. - MS (FAB m/z): ber.: 489.2125, gef.: 490.2229 (M+H+).
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BCD
EF
G
H
α
N(Me)2
92
Experimentalteil
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)-2’-desoxyguanosin 93
Die Reaktion wurde nach AAV 4
durchgeführt.
Es wurden 350 mg (0.78 mmol) 8-N-(2-
Aminofluorenyl)-2’-desoxyguanosin 86 eingesetzt.
Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 237 mg
(0.47 mmol, 60%) eines roten Feststoff. -
DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 6:1
v/v): 0.4. - Smp.: 209 °C. - [α]20546: + 5 °
(c = 0.1, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.30 (s, 1H, NH),
8.83 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 8.53 (s, 1H, Hα), 8.11 (d, 4JHH = 1.3 Hz, 1H, H(E)),
7.77-7.73 (m, 2H, H(B) + H(L)), 7.68 (dd, 3JHH = 8.4 Hz, 4JHH = 1.8 Hz, 1H, H(F)), 7.53
(d, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(I)), 7.33 (t, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(J)), 7.22 (dt, 3JHH = 7.4 Hz, 3JHH = 7.4 Hz, 4JHH = 1.0 Hz, 1H, H(K)), 6.34 (dd, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 9.3 Hz, 1H,
H1’), 5.96 (t, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, 5’-OH), 5.41 (d, 3JHH = 3.7 Hz, 1H, 3’-OH), 4.48-4.44
(m, 1H, H3’), 3.94-3.89 (m, 1H, H5a’), 3.90 (s, 2H, CH2-AF), 3.79-3.71 (m, 2H, H5b’,
H4’), 3.15, 3.02 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.61-2.55 (m, 1H, H2a’), 2.08-2.01 (m,
1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.5 (Cα), 156.6 (C(A)), 155.9
(C2), 152.8 (C6), 148.1 (C8), 144.2 (C(D)), 143.8 (C(M)), 142.4 (C(H)), 141.4 (C(C)),
139.9 (C(E)), 134.1 (C4), 126.7 (C(F)), 125.4 (C(B)), 124.9 (C(K)), 120.0 (C(I)), 119.0
(C(J)), 116.5 (C(L)), 115.6 (C5), 114.0 (C(F)), 87.2 (C4’), 82.8 (C1’), 71.1 (C3’), 61.3
(C(G)), 48.6 (C5’), 36.5 (C2’), 34.6 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):
3283, 2923, 1673, 1630, 1343, 1113, 1058, 946, 731. - MS (FAB, m/z): ber.:
501.2203, gef.: 502.2237 (M+H+).
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
93
AB
C
D
EF
GH
IJ
K
L M
N(Me)2
α
193
Experimentalteil
Versuch der Darstellung von N2-Formamidin-8-N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin-5‘-
monophosphat 94
Die Reaktion wurde unter einer
Stickstoffatmosphäre durchgeführt, um
Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen.
194
Es wurden 44 µL (0.47 mmol)
Phosphorylchlorid, 4.2 µL (0.23 mmol) Wasser
und 38 µL (0.47 mmol) Pyridin in 2 mL abs.
Acetonitril bei 0 °C gelöst. Anschließend wurde 40 mg (0.10 mmol) N2-Formamidin-8-
N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin 87, gelöst in 1 mL abs. Acetonitril hinzugetropft
und die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und 4 Stunden gerührt. Nach erfolgter
Hydrolyse mit Eis bei 4 °C für eine Stunde erfolgte die Neutralisation mit
Ammoniumhydrogencarbonat und Lyophillisation der Reaktionslösung. Nach
abschließender RP-säulenchromatographischer Reinigung mit Wasser konnten jedoch
nur Zersetzungsprodukte isoliert werden.
NH
N
N
O
NN
O
OH
O
HN
94
N(Me)2P
Versuch der Darstellung von 5-Chlor-cycloSal-N2-formamidin-8-N-(4-
methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosinmonophosphat 96
Die Reaktion wurde unter einer
Stickstoffatmosphäre durchgeführt,
um Sauerstoff und Feuchtigkeit
auszuschließen.
Es wurden 25 mg (0.06 mmol) N2-
Formamidin-8-N-(4-methoxyphenyl-
amino)-2’-desoxyguanosin 88 in 500
µL abs. Pyridin gelöst und bei – 40 °C mit einer 0.1 M Lösung des Chlorophosphidates
95 (0.1 mL) über einen Zeitraum von einer Stunde versetzt. Nach weiteren 5 h Rühren
konnte jedoch keine Umsetzung des Eduktes beobachtet werden.
OO
O
1
2
34
5 67
8
9
1'4'
5'
2'
A
BCD
α
NH
N
N
O
NN
O
OH
O
HN
96
N(Me)2
O
PO
O
ClO
1
2
34
5 67
8
9
1'4'
5'
2'
A
BCD
αA'
B'C'
D'
E'F'
Experimentalteil
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(Phenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-
desoxyguanosin 97
Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt.
195
Es wurden 542 mg (1.31 mmol) N2-Formamidin-8-
N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin 87 einge-
setzt.
Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbeute: 737 mg (1.03
mmol, 79%) eines hellgelben Feststoff. - DC: Rf-
Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.23. -
Smp.: 168 °C. - [α]20546: - 2.9 ° (c = 1.0, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-
d6): 11.30 (s, 1H, NH), 8.69 (s, 1H, NH-Anilin), 8.23 (s, 1H, Hα), 7.66 (dd, 3JHH= 7.7
Hz, 2H, H(B)), 7.60 (dd, 3JHH= 7.7 Hz, 1H, H(D)), 7.33-7.30 (m, 2H, H(C)), 7.20-7.13
(m, 13H, DMTr), 6.37 (dd, 3JHH= 5.0 Hz, 3JHH= 7.7 Hz, 1H, H1´), 5.36-5.35 (m, 1H, 3´-
OH), 4.59 (ddd, 3JHH= 5.5 Hz, 1H, H3´), 3.90 (ddd, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 6.8 Hz, 3JHH=
6.9 Hz, 2H, H5´a, H4´), 3.70-3.68 (m, 7H, DMTr-CH3; H5´b), 3.17 (d, 3JHH= 4.6 Hz, 1H,
H2´a), 2.99 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.97 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.24-2.20 (m, 1H,
H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.2 (Cα), 156.7, 156.5, 156.4 (C6),
155.6, 155.2 (C2), 155.0, 154.7, 153.7, 153.4, 146.7 (C8), 146.3 (C4), 143.6 (C5),
128.4, 128.3, 128.2, 128.1 (C(D)), 128.0, 127.8, 127.1, 126.5, 126.4, 126.2, 126.1,
125.1, 119.1 (C(C)), 115.7 (C(B)), 115.4 (C(A)), 111.8 (DMTr-CH3), 111.5 (DMTr-CH3),
84.0 (C4´), 83.9 (C3´), 81.0 (C1´), 62.6 (C5´), 36.1 (C2´), 33.1 (Me-Formamidin). - IR:
Wellenzahl [cm-1] (KBr): 2931, 2835, 914, 790, 777, 727, 583, 555, 503. - MS
(FAB,m/z): ber.: 715.3118, gef.: 716.3202 (M+H+).
NH
N
N
O
NN
O
OH
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'4'
5'
2'
A
BCD
N(Me)2
α
97
Experimentalteil
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methoxyphenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-
desoxyguanosin 98
196
Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt.
Es wurden 650 mg (1.46 mmol) N2-Formamidin-
8-N-(4-methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 88 eingesetzt.
Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbeute: 850 mg (1.15
mmol, 79%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-
Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.38. -
Smp.: 131 °C. - [α]20546: - 10.6 ° (c = 0.76, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,
DMSO-d6): 11.24 (s, 1H, NH), 8.47 (s, 1H, Hα), 8.22 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.60 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(C)), 7.13-7.26 (m, 10 H, DMTr-H), 6.86 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H,
H(B)), 6.70-6.75 (m, 5H, DMTr-H), 6.42 (dd, 3JHH = 7.5 Hz, 3JHH = 5.1 Hz, 1H, H1’),
5.34 (d, 3JHH = 5.4 Hz, 1H, 3’-OH), 4.58 (ddd, 3JHH = 5.4 Hz, 1H, H3’), 4.09 (ddd, 3JHH
= 5.2 Hz, 3JHH = 5.4 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.73 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H,
H5b’), 3.71 (s, 3H, OMe), 3.68 (s, 6H, DMTr-CH3), 3.40 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH =
6.6 Hz, 1H, H2a’), 3.17, 3.16 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.32 (ddd, 2JHH = 12.6 Hz, 3JHH = 5.4 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.3 (Cα), 156.1
(C2), 153.8 (C6), 153.3 (C8), 149.9 (C(D)), 144.1 (C(A)), 140.6, 139.9, 135.8, 135.7,
132.6, 129.7, 129.6, 128.9, 127.8, 127.4, 126.8, 126.6, 126.4, 126.0, 120.8 (C4),
119.2 (C(C)), 113.9 (C(B)), 113.1 (C5), 87.5 (C1’), 83.0 (C4’), 71.7 (C3’), 61.7 (C5’),
55.4 (O-CH3), 38.5 (C2’), 34.7 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3423,
3041, 2982, 1638, 1476, 1037. - MS (FAB,m/z): ber.: 745.3224, gef.: 746.3215 (M+H+)
NH
N
N
O
NN
O
OH
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'4'
5'
2'
O
A
BCD
N(Me)2
α
98
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-
desoxyguanosin 99
NH
N
N
O
NN
O
OH
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
99
N(Me)2
α
Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt.
Es wurden 500 mg (1.16 mmol) N2-
Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-2’-
desoxyguanosin 89 eingesetzt.
Experimentalteil
Reaktionszeit: 5 h. - Ausbeute: 675 mg (0.92 mmol, 81%) eines farblosen Feststoff. -
DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.35. - Smp.: 165 °C. - [α]20546: - 9.7 °
(c = 0.69, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.27 (s, 1H, NH), 8.56 (s,
1H, NH-p-Toluidin), 8.23 (s, 1H, Hα), 7.56 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, H(B)), 7.13-7.28 (m,
8H, DMTr-H), 7.06 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(C)), 6.68-6.77 (m, 5H, DMTr-H), 6.42 (dd, 3JHH = 7.7 Hz, 3JHH = 5.1 Hz, 1H, H1’), 5.34 (d, 3JHH = 3.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.48-4.41 (m,
1H, H3’), 3.90-3.81 (m, 1H, H5a’), 3.72-3.66 (m, 2H, H4’, H5b’), 3.67 (s, 6H, DMTr-
CH3), 3.21-3.15 (m, 1H, H2a’), 2.99, 2.96 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.24 (s, 3H,
CH3), 2.19 (ddd, 3JHH = 12.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101
MHz, DMSO-d6): 157.9, 157.8, 157.0 (Cα), 156.6 (C2), 155.1 (C6), 148.1 (C8), 144.9
(C(D)), 138.7 (C(A)), 135.5, 129.6, 129.5, 129.3 (C4), 128.9 (C(B)), 127.6, 126.5,
117.4 (C(C)), 116.8 (C5), 112.9, 85.4 (C1’), 82.3 (C4’), 70.6 (C3’), 64.0 (C5’), 54.9 (O-
CH3), 37.5 (C2’), 34.5 (Me-Formamidin), 20.3 (CH3-Toluidin). - IR: Wellenzahl [cm-1]
(KBr): 3361, 2927, 1674, 1628, 1527, 1342, 1247, 827. - MS (FAB, m/z): ber.:
729.3275, gef.: 730.3353 (M+H+).
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-
desoxyguanosin 100
197
300 mg (0.68 mmol) N2-
ute: 225 mg
Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt.
Es wurden
Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-2’-
desoxyguanosin 90 eingesetzt.
Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbe
(0.30 mmol, 45%) eines gelben Feststoff. -
DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1
v/v): 0.4. - Smp.: 133 °C. - [α]20546: + 10.6 ° (c = 1.68, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400
MHz, DMSO-d6): 11.36 (s, 1H, NH), 9.61 (s, 1H, Hα), 9.40 (s, 1H, NH-p-
Cyanophenylamin), 6.71-7.80 (m, 17H, H(C) + H(B) + DMTr-H), 6.35 (dd, 3JHH = 7.7
Hz, 3JHH = 5.0 Hz, 1H, H1’), 5.35 (s, 1H, 3’-OH), 4.58-4.51 (m, 1H, H3’), 3.90-3.86 (m,
1H, H5b’), 3.75-3.72 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.68 (s, 6H, DMTr-CH3), 3.15-3.10 (m, 1H,
H2a’), 2.88, 2.72 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.12-2.04 (m, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ
[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.5 (Cα), 157.2, 156.7 (C2), 155.6 (C6), 149.6, 148.2
NH
N
N
O
NN
O
OH
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
100
NC
α
N(Me)2
Experimentalteil
(C8), 145.7, 144.9 (C(D)), 143.1 (C(A)), 133.1 (C(C)), 129.7, 129.6, 129.4, 128.9,
127.7, 127.5, 126.5, 119.7 (C4), 117.2 (C(B)), 116.8 (C5), 101.4 (CN), 85.6 (C4’), 82.5
(C1’), 70.6 (C3’), 64.0 (C5’), 54.9 (CH3-DMTr), 37.5 (C2’), 34.6 (Me-Formamidin). - IR:
Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3338, 2219, 1675, 1605, 1421, 1250, 1114, 1031, 754, 583,
546. - MS (FAB, m/z): ber.: 740.3071, gef.: 741.6171 (M+H+).
198
ynthese von N2-Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-
ie Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt.
-
: 383 mg (0.51
(s, 1H, NH), 8.41 (s, 1H, NH-3,5-
S
desoxyguanosin 101
D
Es wurden 280 mg (0.63 mmol) N2-Formamidin
8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-2’-
desoxyguanosin 91 eingesetzt.
Reaktionszeit: 12 h. - Ausbeute
mmol, 82%) eines rosafarbenen Feststoff. - DC:
Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.36. -
Smp.: 164 °C. - [α]20546: + 10 ° (c = 1.0, CHCl3). -
1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.25
Dimethylanilin), 8.20 (s, 1H, Hα), 8.05 (s, 1H, H(D)), 7.24-7.10 (m, 11H, DMTr-H), 6.68
(dd, 3JHH= 8.9 Hz, 3JHH= 4.6 Hz, 4H, H(B), DMTr-H), 6.29 (dd, 3JHH= 5.1 Hz, 3JHH= 2.6
Hz, 1H, H1’), 5.28 (d, 3JHH= 4.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.52 (dd, 3JHH= 5.7 Hz, 3JHH= 6.2 Hz,
1H, H3’), 3.86-3.82 (m, 2H, H5’a, H4´), 3.64 (d, 3JHH= 1.1 Hz, 6H, DMTr-CH3), 3.12 (d, 3JHH= 5.2 Hz, 1H, H5´b), 2.94 (d, 3JHH= 8.9 Hz, 6H, Me-Formamidin), 2.18 (s, 7H, Me-
aromat., H2’a), 1.99-1.86 (m, 1H, H2’b) – 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6):
159.3 (Cα), 159.2, 159.1 (C6), 158.6, 158.4 (C2), 156.3, 152.3, 149.5, 148.0, 146.6,
(C8), 146.3 (C4), 136.1 (C5), 130.6 (C(D)), 128.8 (C(B)), 118.9 (C(C)), 117.8 (C(A)),
113.7 (DMTr-CH3), 113.6 (DMTr-CH3), 85.9 (C4´), 85.3 (C3´), 80.0 (C1´), 64.4 (C5´),
54.9 (Me-Formamidin), 34.9 (C2´). 24.7, 20.0 (Me-aromat.) - IR: Wellenzahl [cm-1]
(KBr): 3366, 2921, 1675, 1629, 1560, 1342, 1249, 1113, 1032, 830.
NH
N
N
O
NN
O
OH
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BD
101
C
N(Me)2
α
Experimentalteil
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxy-
guanosin 102
Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt.
199
NH
N
Es wurden 182 mg (0.37 mmol) N2-
Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-2’-desoxy-
guanosin 92 eingesetzt.
Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbeute: 247 mg (0.31
mmol, 84%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-
Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.4. -
Smp.: 120 °C. - [α]20546: - 15.4 ° (c= 0.5,
CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.29 (s, 1H, NH), 8.81 (s, 1H, NH-
4-Aminobiphenyl), 8.24 (s, 1H, Hα), 6.70-7.65 (m, 22H, DMTr-H, H(B) + H(C) + H(F) +
H(G) + H(H)), 6.39 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 3JHH = 5.1 Hz, 1H, H1’), 5.34 (s, 1H, 3’-OH), 4.60
(ddd, 1H, H3’), 3.91 (dd, 3JHH = 2.1 Hz, 1H, H5a’), 3.71-3.65 (m, 3H, H4’ + H5b’ +
H2a’), 3.67 (s, 6H, DMTr-CH3), 3.00, 2.98 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.22 (ddd, 3JHH = 5.1 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.7 (Cα), 156.7
(C2), 156.0 (C6), 149.7 (C(A)), 148.3 (C8), 140.4 (C(D)), 140.1 (C(E)), 139.9, 135.8,
135.7, 132.7 (C5 + C4), 132.6, 129.7, 129.6, 129.0 (C(F)), 128.9, 127.8, 127.4, 126.9
(C(B)), 126.8 (C(C), 126.2 (C(G)), 115.8 (C(H)), 87.4 (C1’), 83.0 (C4’), 71.3 (C3’),
61.4 (C5’), 55.4 (O-CH3), 38.6 (C2’), 34.8 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1]
(KBr): 3380, 2931, 1672, 1628, 1527, 1343, 1249. - MS (FAB, m/z): ber.: 791,3431,
gef.: 792.3535 (M+H+).
NH
N
N
O
NN
O
OH
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BCD
EF
G
H
102
N(Me)2
α
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxy-
guanosin 103
Die Reaktion wurde nach AAV 5
durchgeführt.
Es wurden 200 mg (0.39 mmol)
N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)- 2’ -
desoxyguanosin 93 eingesetzt.
N
O
NN
O
OH
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
103
AB
C
D
EF
GH
IJ
K
L M
α
N(Me)2
Experimentalteil
Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbeute: 247 mg (0.30 mmol, 78%) eines lachsfarbenen
Feststoff. - DC: Rf-Wert (Dichlor-methan/Methanol 9:1 v/v): 0.31. - Smp.: 180 °C. -
[α]20546: - 11 ° (c = 0.3, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.32 (s, 1H,
NH), 8.79 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 8.25 (s, 1H, Hα), 8.03 (d, 4JHH = 1.3 Hz, 1H,
H(E)), 7.76-7.70 (m, 2H, H(B) + H(L)), 7.56 (dd, 3JHH = 8.4 Hz, 4JHH = 2.0 Hz, 1H,
H(F)), 6.65-7.53 (m, 16H, H(I) + H(J) + H(K) + DMTr-H), 6.40 (dd, 3JHH = 5.1 Hz, 3JHH =
7.7 Hz, 1H, H1’), 5.35 (d, 3JHH = 3.6 Hz, 1H, 3’-OH), 4.59-4.51 (m, 1H, H3’), 3.91-3.84
(m, 1H, H5a’), 3.88 (s, 2H, CH2-AF), 3.67-3.62 (m, 8H, H5b’, H4’ + DMTr-CH3), 3.18-
3.09 (m, 1H, H2a’), 3.00, 2.98 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.22-2.18 (m, 1H, H2b’).
- 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.9, 157.8 (Cα), 157.0, 156.7 (C(A)),
155.9 (C2), 152.8 (C6), 148.2 (C8), 145.0 (C(D)), 143.8 (C(M)), 142.4 (C(H)), 141.4
(C(C)), 140.0 (C(E)), 135.6, 134.9 (C4), 133.9, 129.6, 129.5, 126.7 (C(F)), 126.5,
125.5 (C(B)), 124.9 (C(K)), 120.1 (C(I)), 119.0 (C(J)), 116.9 (C5), 116.2 (C(L)), 113.6
(C(F)), 112.9, 85.5 (C4’), 82.5 (C1’), 70.6 (C3’), 64.1 (C(G) + C5’), 54.9 (O-CH3), 36.5
(C2’), 34.5 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3354, 2928, 1674, 1628,
1455, 1424, 1342, 1175, 1031, 827, 765, 701. - MS (FAB, m/z): ber.: 803.3431, gef.:
804.3483 (M+H+).
Synthese des Phosphitylierungsreagenz Bis-N,N´-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-
phosphit 107
Unter Schlenkbedingungen wurden 12.9 mL (147 mmol)
Phosphortrichlorid 104 mit 12.2 mL abs. Pyridin und 30 mL
Diethylether versetzt. Nach Kühlung mit einem Stickstoff/Aceton-
Kältebad auf -78 °C wurden 10.4 mL (153 mmol)
3-Hydroxypropionsäurenitril 105 innerhalb von 1.5 h dazugetropft. Nach langsamem
Aufwärmen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung für 16 h gerührt. Das
entstandene Pyridiniumhydrochlorid unter Schlenkbedingungen filtriert und mit abs.
Diethylether gewaschen. Zum Filtrat wurde nach Aufnahme in 150 mL abs.
Diethylether bei -10 °C innerhalb von einer Stunde 130 mL (925 mmol)
Diisopropylamin hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde erneut für 16 h bei
Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Diisopropylammoniumhydrochorid wurde
über eine Schlenkfritte filtriert und wiederum mit Diethylether gewaschen.
αPN
N OCN
107
β
200
Experimentalteil
Anschließend wurde das Filtrat im Ölpumpenvakuum eingeengt. Das erhaltende
Rohprodukt wurde unter Zugabe von 297 mg (7.06 mmol) Calciumhydrid im Vakuum
destilliert. Die Übergangstemperatur des Produkts betrug 190 – 200 °C.
Ausbeute: 18.4 g (61.0 mmol, 41%) einer farblosen Flüssigkeit. 1H-NMR: δ [ppm] (400
MHz, Benzol-d6): 3.51-3.42 (m, 4 H, iPr-H), 3.41-3.35 (m, 2H, H-α), 1.85-1.81 (m, 2H,
H-β), 1.20-1.25 (m, 24 H, iPr-CH3). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 118.0
(CN), 60.2 (C-α), 45.3 (iPr-CH), 27.1 (iPr-CH3), 23.9 (iPrCH3), 19.8 (C-β). - 31P-NMR: δ
[ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 122.15. – IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 3332, 2952, 2929,
1633, 1605, 1565, 1414, 1256, 835. MS (FAB, m/z): ber.: 301.283, gef.: 301 [M].
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(phenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’-
diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 108
201
Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt.
Es wurden 20.0 mg (0.02 mmol) N2-Formamidin-8-
N-(phenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-
desoxyguanosin 97 eingesetzt.
Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 14 mg (0.01 mmol,
61%) eines farblosen Feststoffs als Gemisch
zweier Diastereomere (I + II) im Verhältnis 1:1. -
DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.49. - Smp.: 136 °C. -[α]20546: + 7 ° (c
= 0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 11.29 (s, 2H, NH (I+II)), 8.36
(s, 1H, Hα (I)), 8.23 (s, 1H, Hα (II)), 7.62-6.62 (m, 38H, DMTr-H (I+II) + Anilin-H (I+II),
NH-Anilin (I+II)), 6.41 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.31 (dd, 3JHH =
6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.88-4.86 (m, 1H, H3’ (I)), 4.85-4.82 (m, 1H, H3’
(II)), 4.37-4.33 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.56-3.30 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) +
H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II) + Formamidin-CH3 (I+II)), 2.77-2.66 (m, 1H,
H2b’ (II)), 2.58-2.50 (m, 2H, H2b’ (I) + β’Ha (I)), 2.23 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 1.85 (dd, 3JHH
= 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 1.15-0.96 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 178.7, 159.3, 159.2, 158.2, 147.6, 147.5,
145.3, 145.3, 136.3, 133.2, 130.9, 130.8, 130.7, 130.6, 130.5, 129.3, 128.8, 128.7,
128.6, 128.4, 118.4, 118.2, 114.6, 113.7, 113.6, 87.1, 86.6, 85.6, 75.0, 74.8, 74.0,
73.8, 64.1, 64.0, 58.7, 58.6, 58.5, 58.5, 55.1, 54.9, 54.8, 43.6, 43.6, 43.5, 43.5, 38.6,
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'4'
5'
2'
A
BCD
N(Me)2
α
108PO N
NCα'
β'
Experimentalteil
38.4, 37.7, 30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 20.6, 20.5, 20.3. - 31P-NMR: δ [ppm] (161 MHz,
Benzol-d6): 148.03, 148.21. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3385, 2964, 2930, 1628,
1527, 1509, 1344, 1250, 1032, 978. - UV: λMax [nm] MeCN: 345, 256. - MS (ESI, m/z):
ber.: 915.4197, gef.: 938.4091 (M+Na+).
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methoxyphenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-
(N,N’-diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 109
Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt.
202
Es wurden 20.0 mg (0.02 mmol) N2-Formamidin-
8-N-(4-methoxyphenylamino)-O-5’-
dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 98 eingesetzt.
Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 14.0 mg (0.01
mmol, 61%) eines farblosen Feststoffs als
Gemisch zweier Diastereomere (I + II) im
Verhältnis 1:2. - DC: Rf-Wert (Dichlor-
methan/Methanol 9:1 v/v): 0.52. - Smp.: 122 °C. - [α]20546: + 15 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1H-
NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 10.99 (s, 2H, NH (I+II)), 8.35 (s, 1H, Hα (I)), 8.31
(s, 1H, Hα (II)), 7.68 (s, 1H, NH-p-Anisidin (I)), 7.66 (s, 1H, NH-p-Anisidin (II)), 7.59-
6.71 (m, 34H, DMTr-H (I+II) + ANIS-H (I+II)), 6.44 (dd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz,
1H, H1’ (I)), 6.37 (dd, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.92-4.89 (m, 1H, H3’
(I)), 4.85-4.81 (m, 1H, H3’ (II)), 4.36-4.28 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.64-3.16 (m, 44H, DMTr-
CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II) + Anis-CH3 (I+II) +
Formamidin-CH3 (I+II)), 2.80-2.76 (m, 1H, H2b’ (II)), 2.54-2.50 (m, 2H, H2b’ (I) + β’Ha
(I)), 2.20 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 1.89 (dd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 1H, β’Ha (II)), 1.83-
1.80 (m, 1H, β’Hb (II)), 1.24-1.10 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101
MHz, Benzol-d6): 178.7, 159.3, 159.2, 158.3, 155.5, 155.4, 147.6, 147.5, 145.3, 145.3,
136.1, 136.0, 136.0, 135.9, 133.9, 133.8, 130.7, 130.6, 130.6, 130.5, 128.8, 128.7,
128.6, 128.3, 128.2, 128.0, 127.2, 127.2, 120.4, 120.3, 118.9, 118.8, 118.2, 114.6,
113.6, 113.6, 87.1, 86.6, 86.5, 86.4, 86.3, 86.2, 85.6, 75.0, 74.8, 74.0, 73.8, 64.1,
64.0, 58.8, 58.6, 58.6, 58.5, 55.2, 54.9, 54.9, 43.6, 43.6, 43.5, 43.5, 38.6, 38.4, 37.7,
30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 20.6, 20.5, 20.3. - 31P-NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6):
147.34, 148.63. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3411, 2965, 2360, 1628, 1527, 1510,
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'4'
5'
2'
O
A
BCD
N(Me)2
α
109PO N
NCα'
β'
Experimentalteil
1344, 1247, 1114. - UV: λMax [nm] MeCN: 331, 258, 224. - MS (ESI, m/z): ber.:
945.4302, gef.: 968.4191 (M+Na+).
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-
(N,N’-diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 110
Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt.
203
Es wurden 50.3 mg (0.05 mmol) N2-Formamidin-
8-N-(4-methylphenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-
2’-desoxyguanosin 99 eingesetzt.
Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 43.1 mg (0.03
mmol, 68%) eines farblosen Feststoffs als
Gemisch zweier Diastereomere (I + II) im
Verhältnis 1:1. - DC: Rf-Wert (Dichlor-
methan/Methanol 9:1 v/v): 0.50. - Smp.: 111 °C. - [α]20546: - 21 ° (c = 0.07, CHCl3). -
1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 12.04 (s, 2H, NH (I+II)), 8.47 (s, 1H, Hα (I)),
8.42 (s, 1H, Hα (II)), 6.66-8.00 (m, 36H, DMTr-H (I+II) + Tol-H (I+II)), 6.43 (dd, 3JHH =
6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.39 (dd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)),
5.00-4.96 (m, 1H, H3’ (I)), 4.94-4.90 (m, 1H, H3’ (II)), 4.33-4.28 (m, 2H, H4’ (I+II)),
3.32-3.51 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b
(I+II) + Formamidin-CH3 (I+II)), 2.85-2.79 (m, 1H, H2b’ (II)), 2.54-2.48 (m, 8H, H2b’ (I)
+ β’Ha (I) + Tol-CH3), 2.05 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 1.81 (dd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 6.2 Hz,
1H, β’Ha (II)), 1.72-1.68 (m, 1H, β’Hb (II)), 1.15-1.10 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). - 13C-
NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.2, 158.3, 155.5, 155.4, 148.1, 147.1, 145.3,
145.3, 136.1,135.9, 133.9, 133.8, 130.6, 130.5, 129.7, 128.8, 127.2, 127.2, 120.4,
120.3, 118.9, 118.8, 117.3, 116.1, 114.6, 113.6, 113.6, 87.1, 86.9, 85.6, 75.0, 74.8,
74.0, 73.8, 64.1, 64.0, 54.9, 43.6, 43.6, 43.5, 43.5, 40.7, 38.6, 38.4, 36.3, 30.2, 24.6,
20.8, 19.6. - 31P-NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 148.93, 148.87. - IR: Wellenzahl
[cm-1] (KBr): 3853, 3744, 3675, 2927, 2219, 1669, 1628, 1528, 1249, 1115. - UV: λMax
[nm] MeCN: 330, 297. - MS (ESI, m/z): ber.: 929.4353, gef.: 952.4256 (M+Na+).
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'4'
5'
2'
A
BCD
N(Me)2
α
110PO N
NCα'
β'
Experimentalteil
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’-
diisopropyl-amino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 111
Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt.
204
Es wurden 300 mg (0.40 mmol) N2-
Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)- O - 5’-
di-methoxytrityl-2’-desoxyguanosin 100 eingesetzt.
Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 175 mg (0.19
mmol, 47%) eines gelben Feststoff als
Gemisch zweier Diastereomere (I + II) im
Verhältnis 2:1. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 19:1 v/v): 0.2. - Smp.: 104 °C. -
[α]20546: + 10 ° (c = 0.12, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 10.59 (s,
2H, NH (I+II)), 8.68 (s, 1H, Hα (I)), 8.51 (s, 1H, Hα (II)), 7.87 (s, 2H, NH-p-
Cyanophenylamin (I+II)), 6.70-7.60 (m, 34H, H(C) + H(B) + DMTr-H), 6.51-6.49 (m,
1H, H1’ (II)), 6.44-6.40 (m, 1H, H1’ (I)), 5.01-4.98 (m, 1H, H3’ (II)), 4.59-4.54 (m, 1H,
H3’ (I)), 4.26-4.22 (m, 1H, H4’ (II)), 4.20-18 (m, 1H, H4’ (I)), 3.67-3.29 (m, 24H, DMTr-
CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II)), 3.06-3.01 (m, 1H, H2a’ (II)),
2.87-2.84 (m, 1H, H2a’ (I)), 2.72, 2.48 (2x s, 2x 6H, Me-Formamidin), 2.04-1.99 (m,
2H, H2b’ (I+II)), 1.81-1.89 (m, 4H, β’Ha (I+II) + β’Hb (I+II)), 0.99-1.01 (m, 24H, iPr-CH3
(I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.5, 159.3, 158.8, 155.2, 155.1,
147.8, 147.7, 145.4, 145.4, 136.2, 136.1, 136.0, 135.9, 134.3, 134.1, 131.0, 130.9,
130.9, 130.5, 129.4, 129.3, 128.6, 128.5, 128.4, 128.1, 127.5, 127.4, 120.4, 120.3,
119.1, 119.0, 118.2, 116.4, 114.8, 114.7, 101.3, 101.1, 87.0, 86.8, 86.7, 86.3, 86.2,
86.1, 85.4, 74.8, 74.6, 73.9, 73.6, 64.0, 64.0, 58.9, 58.6, 58.5, 58.3, 55.0, 54.8, 54.7,
43.4, 43.4, 43.2, 43.2, 38.4, 38.2, 37.5, 30.0, 24.7, 24.6, 24.3, 20.4, 20.3, 20.1. - 31P-
NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 150.79, 148.83. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):
3412, 2964, 2929, 1629, 1528, 1346, 1252, 1177, 1033, 702. - UV: λMax [nm] MeCN:
330, 271, 243. - MS (FAB, m/z): ber.: 940.4149, gef.: 941.42 (M+H+).
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BC
D
111
NC
N(Me)2
α
α'
β'PNC
O N
Experimentalteil
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-
(N,N’-diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 112
Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt.
205
Es wurden 100 mg (0.22 mmol) N2-
Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-O-
5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 101
eingesetzt.
Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 122 mg (0.12
mmol, 97%) eines farblosen Feststoffs als
Gemisch zweier Diastereomere (I + II) im
Verhältnis 1:1. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan /Methanol 9:1 v/v): 0.58. - Smp.: 124 °C.
- [α]20546: - 28 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 11. 61 (s,
1H, NH (I)), 11.43 (s, 1H, NH (II)), 8.51 (s, 1H, NH-Dimethylanilin (I)), 8.43 (s, 1H, NH-
3,5-Dimethylanilin (II)), 6.54-7.65 (m, 36H, DMTr-H (I+II) + H-3,5-Dimethylanilin (I+II),
Hα (I+II)), 6.46 (dd, 3JHH = 5.5 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.36 (dd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.96-5.02 (m, 1H, H3’ (I)), 4.79-4.85 (m, 1H, H3’ (II)), 4.33-
4.37 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.33-3.74 (m, 26H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II)
+ H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II)), 2.59-2.79 (m, 13H, H2b’ (II) + Formamidin-CH3 (I+II)),
2.29-2.46 (m, 3H, H2b’ (I) + β’Ha (I) + β’Hb (I)), 2.16, 2.18 (2xs, 2x 6H, Dimethylanilin-
CH3 (I+II)), 1.89-1.94 (m, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 0.91-1.16 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.3, 159.2, 158.4, 158.0, 156.2, 146.1,
145.4, 145.3, 140.9, 140.7, 138.7, 138.6, 136.1, 116.5, 116.4, 113.7, 87.1, 86.8, 85.0,
84.8, 78.6, 78.7, 73.9, 73.1, 63.6, 62.9, 59.1, 57.2, 56.8, 54.9, 43.7, 43.6, 43.5, 41.1,
39.8, 34.8, 34.7, 24.7, 24.6, 24.5, 21.6, 21.5, 21.4, 20.6, 20.2, 20.1, 16. - 31P-NMR: δ
[ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 149.3, 148.7. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3411, 2965,
1686, 1629, 1528, 1341, 1250, 1103. - MS (ESI, m/z): ber.: 943.4510, gef.: 965.7158
(M+Na+).
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'4'
5'
2'
A
BCD
N(Me)2
α
112PO N
NCα'
β'
Experimentalteil
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’-
diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 113
206
Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt.
Es wurden 45 mg (0.05 mmol) N2-Formamidin-8-
N-(4-aminobiphenyl)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-
desoxyguanosin 102 eingesetzt.
Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 30 mg (0.03
mmol, 60%) eines gelben Feststoffs als Gemisch
zweier Diastereomere (I + II) im Verhältnis 1:1. -
DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v):
0.45. - Smp.: 64 °C. - [α]20546: + 13 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,
Benzol-d6): 12.23 (s, 2H, NH (I+II)), 8.36 (s, 1H, Hα (I)), 8.34 (s, 1H, Hα (II)), 7.96 (s,
2H, NH-4-Aminobiphenyl (I+II)), 7.52-6.67 (m, 44H, DMTr-H (I+II) + 4-Aminobiphenyl-
H (I+II)), 6.34 (dd, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.29 (dd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)), 5.00-4.91 (m, 2H, H3’ (I+II)), 4.29-4.20 (m, 2H, H4’ (I+II)),
3.64-3.29 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b
(I+II) + Formamidin-CH3 (I+II)), 2.80-2.75 (m, 1H, H2b’ (II)), 2.37-2.31 (m, 3H, H2b’ (I)
+ β’Ha (I) + β’Hb (I)), 1.81-1.73 (m, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 0.99-0.96 (m, 24H, iPr-
CH3 (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 177.3, 158.2, 158.1, 157.3,
154.6, 154.2, 146.6, 146.5, 144.3, 144.2, 136.1, 136.0, 136.0, 135.9, 133.9, 133.8,
130.7, 130.6, 130.6, 130.5, 128.8, 128.7, 128.6, 128.3, 128.2, 128.0, 127.2, 127.2,
120.4, 120.3, 118.9, 118.8, 118.2, 114.6, 113.6, 113.6, 87.1, 86.6, 86.5, 86.4, 86.3,
86.2, 85.6, 75.0, 74.8, 74.0, 73.8, 64.1, 64.0, 58.8, 58.6, 58.6, 58.5, 55.2, 46.6, 46.6,
46.5, 46.5, 38.6, 38.4, 37.7, 30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 19.6, 19.5, 19.3. - 31P-NMR: δ
[ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 149.04, 149.01. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3422,
2926, 1629, 1529, 1384, 1249, 1103. - UV: λMax [nm] MeCN: 330,296, 251, 226. - MS
(ESI, m/z): ber.: 991.4510,gef.: 1014.4410 (M+Na+).
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BCD
EF
G
H
113
N(Me)2
PO N
NC
α
α'β'
Experimentalteil
Synthese von N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’-
diisopropyl-amino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 114
Die Reaktion wurde nach AAV 6
durchgeführt.
207
Es wurden 50 mg (0.06 mmol) N2-
Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)- O - 5’-
dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 103 ein-
gesetzt.
Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 66 mg (0.06
mmol, 100%) eines farblosen Feststoffs
(zwei Diastereomere I + II). - DC: Rf-Wert
(Dichlor-methan/Methanol 9:1 v/v): 0.46. -
Smp.: 112 °C. - [α]20546:+ 3 ° (c = 0.21, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-
d6): 11.05 (s, 2 H, NH (I+II)), 8.39 (2 x s, 2 H, NH-Aminofluoren (I+II)), 8.10 (s, 1 H,
Hα(I)), 8.08 (s, 1 H, Hα(II)), 8.02 (m, 2 H, H(E)(I+II)), 7.76-7.70 (m, 4H, H(F)(I+II) +
H(B)(I+II)), 7.62-7.36 (m, 26 H, DMTr(I+II)), 7.28 (d, 3JHH =7,3 Hz, 2H, H(L)(I+II)),
7.21-7.15 (m, 2H, H(I)(I+II)), 7.03-7.01 (m, 4H, H(J)(I+II) + H(K)(I+II)), 6.59 (dd, 3JHH =
6.7 Hz, 1H, H1´(I)), 6.53 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1´(II)), 5.01-4.98 (m, 1H, H3´(I)),
4.91-4.88 (m, 1H, H3´(II)), 4.39 (m, 2H, H4´(I+II)), 3.70 (m, 10 H, H(G)(I+II), H3´(I+II),
H5a´(I+II), H5b´(I+II)), 3.33-3.18 (m, 12H, DMTr-CH3(I+II)), 2.63-2.51 (m, 14H,
N(Me)2(I+II), H2a´(I+II)), 1.89 (ddd, 3JHH = 5.6 Hz, 3JHH = 11.5 Hz, 2H H2b´(I+II)), 1.12
(dd, 3JHH = 6.1 Hz, 12H, Hα’ (I+II), Hβ’ (I+II), iPr-H(I+II)), 1.06 (d, 3JHH = 6.7 Hz, 6H,
iPr-CH3(I)), 0.93 (d, 3JHH = 6.7 Hz, 6H, iPr-CH3(II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
Benzol-d6): 160.7, 159.2, 158,2, 157.9, 156.1, 155.7, 149.3, 143.4, 136.1, 135.8,
130.6, 128.8, 128.6, 128.5, 128.3, 128.0, 127.8, 113.6, 54.9, 43.6, 34.7, 24.7, 24.6,
21.2, 20.5, 20.1, 8.4. - 31P-NMR: δ [ppm] (202 MHz, Benzol-d6): 162.0, 161.78. -IR:
Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3377, 2966, 2930, 2836, 2760, 2722, 1681, 1607, 1575, 1457,
1427, 1344, 1301, 1251, 1178, 1154, 1115, 1076, 1033, 978, 829, 767, 732, 703. -
UV: λMax [nm] MeCN: 336. - MS (FAB, m/z): ber.: 1003.4823, gef.: 1026.4440 (M+Na+).
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
HN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
114
AB
C
D
EF
GH
IJ
K
L M
N(Me)2
α
PO N
NC α'
β'
Experimentalteil
Synthese von 3´,5´-Bis-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2´-dG 121 Unter Stickstoffatmosphäre wurden 18.09 g
(67.67 mmol) 2´-dG*H2O 52 zweimal mit jeweils
20 mL abs. Pyridin coevaporiert. Anschließend
wurden 90 mL abs. Pyridin, 65.0 mL (173 mmol)
TBDMS-Cl (50%ig in Toluol) und 17.1 g (249
mmol) Imidazol hinzugegeben und über Nacht
bei RT gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte
mit Hilfe der DC (DCM/MeOH 9:1). Nach Zugabe von MeOH und Toluol und Entfernen
des Lösungsmittels erfolgte eine säulenchromatographische Reinigung (DCM/MeOH:
3% → 18%).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
4´3´ 2´
1´
9
8
7 65
43
2
5´
121
Ausbeute: 32.8 g (66.3 mmol, 98%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert
(DCM/MeOH 9:1): 0.31. - Smp.: 261 °C. - [α]20546: -17.6 ° (c= 1, CHCl3). - 1H-NMR: δ
[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.51 (s, 1H, NH), 7.77 (s, 1H, H8), 6.38 (s, 2H, NH2),
6.02 (dd, 3JH,H= 6.1 Hz, 3JH,H= 7.6 Hz, 1H, H1´), 4.40 (ddd, 3JH,H= 3.0 Hz, 3JH,H= 3.0
Hz, 3JH,H= 5.6 Hz, 1H, H3´), 3.72-3.69 (m, 1H, H4´), 3.61 (dddd, 2JH,H= 15.6 Hz, 2JH,H=
11.0 Hz, 3JH,H= 5.2 Hz, 2H, H5´a, H5´b), 2.57-2.50 (m, 1H, H2´a), 2.16 (ddd, 2JH,H=
13.2 Hz, 3JH,H= 6.0 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H2´b), 0.80 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.77
(s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.00 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.06, -0.07 (2 * s, 2 * 3H, Si(CH3)2) - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.7 (C6), 153.7 (C2), 135.1 (C8), 133.5
(C4), 130.6 (C5), 87.0 (C4´), 82.1 (C3´), 72.1 (C1´), 62.8 (C5´), 36.6 (C2´), 25.7
(SiC(CH3)3), 22.3 (SiC(CH3)3), 18.2 (SiC(CH3)3), 17.7 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.0
(SiC(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 1830, 1280, 1208, 1005, 987,
968, 713, 694, 620, 572, 498. - MS (FAB, m/z): ber.: 495.2697, gef.: 496.2789
[M+H]+.
208
Experimentalteil
Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-dG 40 Unter Schlenkbedingungen wurden 5.00 g (10.3 mmol)
3´,5´-Bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-dG 121 mit 5.32 g
(20.1 mmol) Triphenylphosphin versetzt und 15 Minuten
unter Vakuum gerührt. Nach Zugabe von 175 mL abs.
1,4-Dioxan, 2.1 mL (20.16 mmol) destilliertem
Benzylalkohol und 3.4 mL (20.16 mmol) DIAD wurde die
Reaktionsmischung 1.5 h bei RT gerührt. Nach Entfernen
des Lösungsmittels wurde der gelbe, ölige Rückstand in
60 mL Diethylether aufgenommen und 1 h bei -20 °C aufbewahrt. Der so entstandene
Niederschlag wurde filtriert und mit kaltem Ether gewaschen. Nach Einengen des
Filtrats konnte die weitere Aufreinigung am Chromatotron (PE/EE; 10% → 30%)
erfolgen.
O1
4´3´ 2´
1´
9
8
7 65
4
3
2
5´
N
N
N
NH2N
O
OTBDMS
209
Ausbeute: 4.00 g (6.83 mmol, 68%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.84. - Smp.: 69.2 °C. - [α]20546: -1.5° (c= 1, CHCl3). -
1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.05 (s, 1H, H8), 7.51-7.49 (m, 2H, Hc), 7.42-
7.37 (m, 2H, Hd), 7.37-7.33 (m, 1H, He), 6.48 (s, 2H, H2a), 6.21 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´), 5.5 (s, 2H, Ha), 4.52 (dd, 3JH,H= 7.1 Hz, 3JH,H= 5.4 Hz, 3JH,H=
2.8 Hz, 1H, H3´), 3.82 (ddd, 3JH,H= 4.3 Hz, 3JH,H= 3.7 Hz, 3JH,H= 3.7 Hz, 1H, H4´), 3.72
(dd, 2JH,H= 11.0 Hz, 3JH,H= 5.8 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H5´a), 3.65 (dd, 2JH,H= 12.9 Hz, 3JH,H= 5.8 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H5´b), 2.73 (ddd, 2JH,H= 13.2 Hz, 3JH,H= 7.6 Hz, 3JH,H=
5.8 Hz,1H, H2´a), 2.26 (ddd, 2JH,H= 12.9 Hz, 3JH,H= 5.8 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H2´b),
0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.86 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.11 (s, 6H,
Si(CH3)2), 0.03, 0.02 (2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-
d6): 160.0 (C6), 159.7 (C2), 137.4 (C8), 136.5 (Cb), 128.3 (Cc), 128.2 (Cd), 128.0
(Ce), 122.9 (C4), 113.0 (C5), 86.8 (C4´), 82.2 (C3´), 71.5 (C1´), 66.7 (Ca), 62.9 (C5´),
59.5 (C2´), 25.5 (2 x SiC(CH3)3), 21.7 (Si(CH3)2), 20.7 (Si(CH3)2), 13.9 (2 x SiC(CH3)3).
- IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3396, 2770, 2711, 1876, 1755, 1705, 1674,
1614, 1574, 1557, 1548, 1486, 1463, 1416, 1005, 985, 919, 619, 508. - MS (FAB,
m/z): ber.: 585.3167, gef.: 586.3253 [M+H]+.
TBDMSO
dc
ba
e
40
Experimentalteil
Darstellung von Nitrosobenzol 120 Es wurden 2.79 g (30.0 mmol) Anilin 1 in 9 mL MeOH gelöst und mit 16.5
mL (120 mmol) 30% H2O2 und 13.5 mL H2O versetzt. Anschließend erfolgte
die Zugabe von 432 mg (3.0 mmol) Mo(IV)O3 und 3 mL 1 mM KOH-Lösung.
Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach Zugabe
von 45 mL H2O wurde der braune Niederschlag filtriert, zweimal mit
jeweils 30 mL H2O und anschließend 15 mL kaltem MeOH gewaschen. Der
Niederschlag wurde aus Methanol umkristallisiert.
43
21
NO
120
Ausbeute: 420 mg (3.93 mmol, 13%) brauner Kristalle. – DC: Rf-Wert (Dichlormeth-
an/Methanol 9:1): 0.93. – Tm: 60.4 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 7.94
(dd, 3JH,H= 8.4 Hz, 4JH,H= 1.3 Hz, 2H, H2), 7.88 (tt, 3JH,H= 7.6 Hz, 3JH,H= 7.3 Hz, 1H,
H4), 7.75 (dt, 3JH,H= 7.6 Hz, 3JH,H= 7.6 Hz, 2H, H3). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 166.1 (C1), 136.6 (C3), 129.7 (C4), 120.6 (C2). - IR: Wellenzahl [cm-1]
(KBr-Pressling): 3091, 3059, 1990, 1706, 1456, 1295, 1255, 1126, 923, 714. - MS (EI,
m/z): ber.: 107.0371, gef.: 107 [M].
Versuch zur Darstellung von N2-Aza-anilino-2´-dG 119 Es wurden 41.0 mg (0.38 mmol) Nitrosobenzol
120 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL Essigsäure
gelöst und auf 40 °C geheizt. Anschließend
wurde eine Lösung von 100 mg (0.35 mmol) 2´-
dG·H2O 52 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL
Essigsäure langsam hinzugetropft. Die
Reaktionsmischung wurde 26 h bei 40 °C
gerührt. Unter Eiskühlung wurde die
Reaktionslösung mit halb konz. NaOH-Lösung alkalisch gemacht und mit Ether
dreimal extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit H2O gewaschen.
Die Reaktionskontrolle erfolgte dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 2:1).
1´
5´
4´
3´ 2´
7
8
9b´
e´
d´c´
5
43
2
16
119
NH
N
N
N
O
OH
HO
O
NN
Es konnten nur Zersetzungsprodukte erhalten werden.
210
Experimentalteil
Versuch zur Darstellung von 3´,5´-Bis(TBDMS)-N2-aza-anilino-2´-dG 119 Es wurden 50.0 mg (0.40 mmol)
Nitrosobenzol 120 in 3.5 mL Ethanol und
3.5 mL Essigsäure gelöst und auf 40 °C
geheizt. Anschließend wurde eine Lösung
von 200 mg (0.40 mmol) 3´,5´-Bis(TBDMS)-
2´-dG 121 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL
Essigsäure langsam hinzugetropft. Die
Reaktionsmischung wurde 26 h bei 40 °C
gerührt. Unter Eiskühlung wurde die Reaktionslösung mit halb konz. NaOH-Lösung
alkalisch gemacht und mit Ether dreimal extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen wurden mit H2O gewaschen. Die Reaktionskontrolle erfolgte
dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 2:1).
119
NH
N
N
N
O
OTBDMS
TBDMSO
O
NN
1´
b´9
8
7 65
43
2
1
5´
4´
3´ 2´
e´
d´c´
Bei dieser Reaktion erfolgte keine Umsetzung. Das Edukt konnte reisoliert werden.
Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-Bis(TBDMS)-N2-aza- anilino-2´-dG 119b Es wurden 40.0 mg (0.38 mmol) Nitrosobenzol
120 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL Essigsäure
gelöst und auf 40 °C geheizt. Anschließend
wurde eine Lösung von 183 mg (0.31 mmol) O6-
Benzyl-3´,5´-Bis(TBDMS)-2´-dG 40 in 3.5 mL
Ethanol und 3.5 mL Essigsäure langsam
hinzugetropft. Die Reaktionsmischung wurde 26
h bei 40 °C gerührt. Unter Eiskühlung wurde die
Reaktionslösung mit halb konz. NaOH-Lösung
alkalisch gemacht und mit Ether dreimal
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit H2O gewaschen. Die
Reaktionskontrolle erfolgte dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 2:1).
211
Bei dieser Reaktion erfolgte keine Umsetzung. Das Edukt konnte reisoliert werden.
119b
NH
N
N
N
O
OTBDMS
TBDMSO
O
ed
c
b
a
NN
1´
b´9
8
7 65
43
2
1
5´
4´
3´ 2´
e´
d´c´
Experimentalteil
Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-desoxyxanthosin 124 Es wurden 300 mg (0.52 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-
bis(TBDMS)-2´-dG 121 mit 500 mg Na2Fe(CN)5NO ·
2H2O in 5 mL 1 M NaOH gegeben. Die
Reaktionsmischung wurde 4 h bei 70 °C gerührt. Nach
Abkühlen der Reaktionslösung auf 25 °C wurden 10 mL
H2O hinzugegeben. Der pH-Wert wurde mit Essigsäure
auf 3.8 eingestellt. Nach Zugabe von 5 mL MeOH wurde
die Reaktionsmischung filtriert. Das Filtrat wurde
chromatographisch (PE/EE; 4:1) gereinigt.
N
NH
N
N
O
OTBDMS
TBDMSO
O
O
1
a
9
8
7 65
43
2
4´3´ 2´
1´
ed
c
b
5´
124
Es konnte keine Reaktion beobachtet werden. Das Edukt konnte reisoliert werden.
Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-desoxyxhanthosin 124 Es wurden 300 mg (0.52 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-
bis(TBDMS)-2´-dG 121 auf 0 °C gekühlt und mit
3.2 mL (2 mmol) tert-Butylnitrit versetzt. Die
Reaktionsmischung wurde 5 Minuten gerührt. Nach
Einengen der Reaktionslösung erfolgte die
chromatographische Aufreinigung am Chromatotron
(PE/EE; 4% → 100%).
N
NH
N
N
O
OTBDMS
DMSO
O
O
212
Ausbeute: 27 mg (0.05 mmol, 9%) eines orange
farbenen Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.56. -[α]20546: -0.6 °
(c= 0.64, CHCl3). - Smp.: 107 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.22 (s,
1H, NH), 8.27 (s, 1H, H8), 7.43-7.31 (m, 5H, arom.-H), 6.26 (dd, 3JH,H= 6.1 Hz, 3JH,H=
7.6 Hz, 1H, H1´), 5.54 (s, 2H, Ha), 4.59-4.54 (m, 1H, H3´), 3.86-3.83 (m, 1H, H4´),
3.60-3.49 (m, 2H, H5´a, H5´b), 2.73-2.66 (m, 1H, H2´a), 2.26 (dddd, 2JH,H= 13.2 Hz, 3JH,H= 6.0 Hz, 3JH,H= 2.9 Hz, 1H, H2´b), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.87 (s, 9H,
Si-C(CH3)3 an H5´), 0.11 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.1, 0.08 (s, 2 * 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ
[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.7 (C6), 154.3 (C2), 134.6 (C8), 129.7 (Cb), 128.4
(Cc), 128.1 (Cd), 128.0 (Ce), 125.5 (C4), 117.5 (C5), 88.0 (C4´), 87.4 (C3´), 48.6
(C1´), 47.7 (Ca), 45.0 (C5´), 38.2 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 22.3 (SiC(CH3)3), 18.2
1
a
9
8
7 65
43
2
4´3´ 2´
1´
ed
c
b
5´
124
TB
Experimentalteil
(SiC(CH3)3), 17.7 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.0 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-
Pressling): 3302, 2983, 2930, 2857, 1740, 1648, 1593, 1444, 1403, 1374, 1359, 1242,
1103, 1047, 836, 779, 740, 482. - MS (FAB, m/z): ber.: 586.3007, gef.: 587.3085
[M+H]+.
2. Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-desoxyxhanthosin 124 Es wurden 265 mg (0.451 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-
bis(TBDMS)-2´-dG 121 in 6.7 mL Aceton und 1.3
mL H2O gelöst. Nach Zugabe von 0.1 mL 70%
HClO4 wurde die Reaktionslösung auf 10 °C gekühlt
und mit 57 mg (0.82 mmol) NaNO2 in 2.6 mL H2O
tropfenweise versetzt. Nach 1 h Rühren bei 10 °C
wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der
Rückstand in 13 mL CH2Cl2 aufgenommen. Die
wässrige Phase wurde 3 x mit DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden über Natriumsulfat getrocknet. Die Reinigung erfolgte am Chromatotron
(DCM/MeOH; 0% → 100%).
TB
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OTBDMS
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1
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1´
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5´
124
Ausbeute: 17 mg (0.03 mmol, 6%) eines orangenen Feststoffs. Analytik siehe Seite
212.
Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-O2-trifluormethansulfonyl-2´-dG 123 Es wurden 15 mg (0.03 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-
bis(TBDMS)-2´-desoxyxhanthosin 124 mit 12 mg
(0.12 mmol) Triethylamin und einer katalytischen
Menge DMAP in 0.3 mL DCM versetzt. Unter
Eiskühlung erfolgte die Zugabe von 5 µL (5.23
mg; 0.03 mmol) Trifluor-
methansulfonsäureanhydrid. Die Reaktions-
mischung wurde 0.5 h bei 0 °C gerührt. Nach
Entfernen des Lösungsmittels konnte die
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N
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OTBDMS
TBDMSO
O
OS
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O CF31´
2
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9
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43
dc
ba
e
123
213
Experimentalteil
Aufreinigung am Chromatotron erfolgen (DCM/MeOH; 0% → 100%).
Ausbeute: 8.0 mg (0.01 mmol, 37%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.98. -[α]20546: -0.2 ° (c= 0.72, CHCl3). - 1H-NMR: δ
[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.26 (s, 1H, H8), 7.42-7.34 (m, 5H, arom.-H), 6.26 (dd, 3JH,H= 6.4 Hz, 3JH,H= 7.4 Hz, 1H, H1´), 5.54 (s, 2H, Ha), 4.59-4.54 (m, 1H, H3´), 3.86-
3.84 (m, 1H, H4´), 3.60-3.57 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.53-3.50 (m, 1H, H2´a), 2.26 (dddd, 2JH,H= 13.1 Hz, 3JH,H= 5.9 Hz, 3JH,H= 2.9 Hz, 1H, H2´b), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an
H3´), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.11 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.1, 0.07 (s, 2 * 3H,
Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.3 (C6), 153.3 (C2), 143.8
(CF3), 131.7 (C8), 130.0 (Cb), 128.4 (Cc), 128.1 (Cd), 128.0 (Ce), 125.7 (C4), 116.5
(C5), 88.0 (C4´), 81.1 (C3´), 72.5 (C1´), 67.6 (Ca), 61.2 (C5´), 32.2 (C2´), 25.7
(SiC(CH3)3), 24.8 (SiC(CH3)3), 19.2 (SiC(CH3)3), 17.7 (SiC(CH3)3), -3.6, -5.1
(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3433, 2855, 1735, 1685, 1511,
1431, 1253, 1102, 1031, 739, 481. - MS (FAB, m/z): ber.: 686.5171, gef.: 686.6
[M+H]+.
1. Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 122 Es wurden 20 mg (0.03 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-
bis(TBDMS)-O2-trifluormethansulfonyl-2´-dG 123
mit 20 µL Phenylhydrazin in 0.5 mL DMF versetzt.
Die Reaktionsmischung wurde 10 Tage bei RT
gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels
erfolgte die Reinigung am Chromatotron (PE/EE;
10%).
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ba d
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e´d´
c´
122Ausbeute: 10 mg (0.01 mmol, 53%) eines
(Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.45. – [α]
gelben Öls. - DC: Rf-Wert 20
546: + 13 °(c = 1.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ
[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 9.41 (s, 1H, NH an Cb´), 8.91 (d, 3JH,H= 2.3 Hz, 1H, NH
an C2), 8.09 (s, 1H, H8), 7.34-7.30 (m, 10H, arom.-H), 6.68 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H=
7.3 Hz, 1H, H1´), 5.45 (s, 2H, Ha), 4.49 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 5.7 Hz, 2H, H3´,
H4´), 3.70-3.63 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.60-3.57 (m, 1H, H2´a), 2.26 (dddd, 2JH,H= 13.1
Hz, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 3.3 Hz, 1H, H2´b), 0.88 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.85 (s,
9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.07 (dd, 2JH,H= 13.1 Hz, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 2.5 Hz, 6H,
214
Experimentalteil
Si(CH3)2), 0.02 (s, 6H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.1
(C6), 159.8 (C2), 138.6 (C8), 137.1 (Cb), 136.3 (Cb´), 128.8, 128.5, 128.3, 128.1,
128.0, 127.7, 127.0 (arom.-C), 126.1 (C4), 118.9 (C5), 87.2 (C4´), 82.8 (C3´), 72.2
(C1´), 66.9 (Ca), 62.8 (C5´), 38.4 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.9
(SiC(CH3)3), 17.6 (SiC(CH3)3), -5.0, -5.5 (Si(CH3)2). - MS (FAB, m/z): ber.: 676.5953,
gef.: 677.6 [M+H]+.
1. Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-brom-2´-dG 126 Es wurden 100 mg (1.70 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-
bis(TBDMS)-2´-dG 40 mit 0.6 mL tert-Butylnitrit und
0.6 mL Bromoform versetzt und 30 Minuten bei
90 °C refluxiert. Die Reaktionskontrolle erfolgte
dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 4:1). Nach
Entfernen des Lösungsmittels erfolgte die Reinigung
am Chromatotron (PE/EE; 10%).
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N
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2
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1´
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5´
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dc
b
126Das Produkt konnte nicht erhalten werden.
2. Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-brom-2´-dG 126
215
Es wurden 352 mg (5.12 mmol) NaNO2 und 0.66 mL
(5.1 mmol) TMS-Br in 2 mL CCl
4 gelöst und auf 0 °C
gekühlt. Nach Zugabe von 100 mg (1.70 mmol)
O
O
6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-dG 40 wurde die
Reaktionsmischung weitere 1.5 h bei dieser
Temperatur gerührt. Nach Erwärmen auf RT erfolgte
die dünnschichtchromatographische Reaktions-
kontrolle (PE/EE; 4:1). Nach Entfernen des Lösungsmittels erfolgte eine weitere
Aufreinigung am Chromatotron (PE/EE; 10%).
Das Produkt konnte nicht erhalten werden.
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Br
OTBDMS
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Experimentalteil
Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-brom-2´-dG 126
Es wurden 3.00 g (4.60 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-dG 40 mit 2.62 g (7.07
mmol) Antimon(III)bromid zusammen gegeben und
auf 0 °C gekühlt. Es wurden 41 mL zuvor auch auf
0 °C gekühltes CH2Br2 hinzugegeben. Anschließend
wurde die gesamte Reaktionsmischung auf -10 °C
gekühlt und mit 2.10 mL (17.6 mmol) t-Butylnitrit
versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei -10
°C gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte
dünnschicht-chromatographisch (PE/EE; 4:1). Der
Reaktionsabbruch erfolgte durch Zugabe von 8.13 g (96.8 mmol) Natriumbicarbonat in
203 mL Eis-Wasser. Der Niederschlag wurde filtriert und das Filtrat dreimal mit
Dichlormethan gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden über
Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels konnte die
Aufreinigung am Chromatotron (PE/EE; 5% → 10%) erfolgen.
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BrN
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126
Ausbeute: 1.21 g (1.86 mmol, 40%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert (Dichlor-
methan/Methanol 9:1): 0.88. - [α]20546: + 3.1 ° (c= 0.8, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm]
(400 MHz, DMSO-d6): 8.53 (s, 1H, H8), 7.53-7.51 (m, 2H, Hc), 7.44-7.38 (m, 3H, Hd,
He), 6.33 (dd, 3JH,H= 9.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 1H, H1´), 5.60 (s, 2H, Ha),
4.82-4.76 (m, 1H, H3´), 3.87-3.78 (m, 2H, H5´a, H4´), 3.65 (dd, 2JH,H= 11.0 Hz, 3JH,H= 9.3 Hz, 3JH,H= 4.2 Hz, 1H, H5´b), 2.92 (ddd, 3JH,H= 9.3 Hz, 3JH,H= 8.9 Hz, 3JH,H=
4.5 Hz, 1H, H2´b), 2.37 (ddd, 2JH,H= 9.3 Hz, 3JH,H= 6.9 Hz, 3JH,H= 1.8 Hz, 1H, H2´b),
0.90 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.13 (s, 6H,
Si(CH3)2), 0.00, -0.01 (2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-
d6): 159.0 (C6), 152.6 (C2), 143.4 (C8), 138.6 (Cb), 128.6 (Cc), 128.4 (Cd), 128.1
(Ce), 117.7 (C4), 110.6 (C5), 87.0 (C4´), 84.0 (C1´), 71.4 (C3´), 69.0 (Ca), 62.1 (C5´),
38.1 (C2´), 25.5 (2 x SiC(CH3)3), 21.7 (Si(CH3)2), 20.7 (Si(CH3)2), 13.9 (2 x SiC(CH3)3).
- IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3629.90, 3448.12, 2928.88, 2856.67, 1735.58,
1701.46, 1654.92, 1594.63, 1566.17, 1459.15, 1313.12, 836.83. - MS (FAB, m/z):
ber.: 648.2163, gef.: 649.2281 [M+H]+.
216
Experimentalteil
2. Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 122 Die Synthese wurde nach AAV 7 mit 782 mg
(1.25 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-
brom-2´-dG 126 durchgeführt.
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TBDMSO
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122
Ausbeute: 707 mg (1.04 mol, 83%) eines
orange farbenen Feststoffs.
Analytik siehe Seite 214.
Synthese von 3´,5´-Bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 118
Unter Wasserstoffatmosphäre wurden 210 mg
(0.32 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N-
phenylhydrazino-2´-dG 122 mit einer Spatelspitze
Pd/C und in 8 mL abs. Methanol versetzt und 5 h
bei RT gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte
dünnschicht-chromatographisch (DCM/MeOH;
9:1). Der Katalysator wurde mittels Zentrifuge entfernt. Nach Entfernen des
Lösungsmittels erfolgte die Reinigung am Chromatotron (DCM).
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OTBDMS
TBDMSO
O
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118
Ausbeute: 140 mg (0.21 mmol, 60%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.50. - [α]20546: - 2.0 ° (c= 0.18, CHCl3). - 1H-NMR: δ
[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.58 (s, 1H, NH), 10.20 (s, 1H, NH an Cb´), 8.42 (s, 1H,
NH an C2), 7.94 (s, 1H, H8), 7.74-7.63 (m, 2H, Hc´), 7.41-7.35 (m, 1H, He´), 7.18 (dd, 3JH,H= 8.4 Hz, 3JH,H= 7.5 Hz, 2H, Hd´), 6.12 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´),
4.74-4.71 (m, 1H, H3´), 4.49-4.47 (m, 2H, H4´, H5´a), 4.36-4.32 (m, 1H, H5´b), 3.71-
3.61 (m, 2H, H2´a, H2´b), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an
H5´), 0.10 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.04 (d, 3JH,H= 8.4 Hz, 4JH,H= 1.7 Hz, 6H, Si(CH3)2). - 13C-
NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 163.5 (C6), 151.1 (C2), 140.8 (C8), 139.8 (Cb´),
129.8 (Cc´), 128.8 (Cd´), 128.1 (Ce´), 127.0 (C4), 109.5 (C5), 87.1 (C4´), 82.3 (C3´),
72.2 (C1´), 62.8 (C5´), 36.7 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.7
(SiC(CH3)3), 17.4 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.0 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-
217
Experimentalteil
Pressling): 2954, 2928, 2857, 1687, 1109, 776, 740, 482. - MS (FAB, m/z): ber.:
586.3119, gef.: 587.3197 [M+H]+.
Synthese von 2-N-Phenylhydrazino-2´-dG 127 Unter Schlenkbedingungen wurden 140 mg (0.21
mmol) 3´,5´-Bis(TBDMS)-2-N-phenyl-hydrazino-2´-dG
118 in 4 mL abs. THF und 4 mL abs. DCM gelöst und
mit 0.1 mL Et3N und 0.3 mL Et3N·3HF versetzt. Die
Reaktionsmischung wurde 24 h bei RT gerührt. Die
Aufreinigung erfolgte am Chromatotron (DCM/MeOH;
9:1).
1´
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2
1
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d´c´
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OH
HO
O
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127
Ausbeute: 100 mg (0.27 mmol, 68%) eines roten Feststoffs. – DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol; 9:1): 0.12. – Smp.: 89 °C. - [α]20546: + 5.0 ° (c= 0.15,
CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.48 (s, 1H, NH), 9.01 (s,
1H, NH an Cb´), 8.04 (s, 1H, NH an C2), 7.96 (s, 1H, H8), 7.73-7.69 (m, 2H, Hc´),
7.20-7.16 (m, 1H, He´), 6.79-6.75 (m, 2H, Hd´), 6.42 (dd, 3JH,H= 6.8 Hz, 3JH,H= 6.8 Hz,
1H, H1´), 5.33 (d, 3JH,H= 4.2 Hz, 1H, 3´-OH), 4.93 (dd, 3JH,H= 5.6 Hz, 3JH,H= 5.6 Hz, 1H,
5´-OH), 4.42-4.41 (m, 1H, H3´), 3.90-3.85 (m, 1H, H5´a), 3.74-3.75 (m, 2H, H5´b, H4´),
2.66-2.59 (m, 1H, H2´a), 2.19-2.10 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 155.7 (C6), 152.7 (C2), 145.8 (C4), 134.2 (C8), 130.5 (C5), 129.7 (Ce´),
128.7 (Cd´), 123.6 (Cc´), 114.6 (Ca´), 83.6 (C4´), 82.5 (C5´), 70.5 (C1´), 61.5 (C5´),
45.6 (C2´). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3415, 2922, 1685, 1570, 1316,
1091. – UV: λMax [nm] MeCN: 256, 390. - MS (FAB, m/z): ber.: 358.1390, gef.: 359.1
[M+H]+.
218
Experimentalteil
Synthese von 5´-O-(DMTr)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 128
Es wurden 288 mg (0.77 mmol)
2-N-Phenylhydrazino-2´-dG 127 in 12 mL
Pyridin gelöst und mit 376 mg (1.11 mmol)
DMTrCl versetzt und 20 h bei
Raumtemperatur gerührt. Die
Reaktionskontrolle erfolgte dünnschicht-
chromatographisch (DCM/MeOH: 9/1). Zur
Beendigung der Reaktion wurden je 20 mL Natriumcarbonatlösung und Dichlormethan
zugegeben und die wässrige Phase dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet. Das
Lösungsmittel wurde durch zweimalige Coevaporation mit Toluol entfernt. Das Produkt
wurde am Chromatotron (DCM/MeOH 0% → 50%) aufgereinigt.
O
NH
N
N
NH
N
O
OH
219
Ausbeute: 49 mg (0.07 mmol, 10%) eines orangefarbigen Feststoffes. - DC: Rf-Wert
(Dichlormethan/Methanol: 9/1): 0.37. - Smp.: 89 °C. - [α]20546:+ 5.0 ° (c= 0.15, CHCl3).
1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.20 (s, 1H, NH), 8.36 (s, 1H, H8), 7.91 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, HB), 7.51 (d, 3JH,H= 8.5 Hz, 2H, HC), 7.29-7.27 (m, 1H, NH an CA),
7.19-7.10 (m, 10H, Hc, Hg, Hh, Hi, NH an C2), 6.74-6.68 (m, 4H, Hd), 6.45 (dd, 3JH,H=
6.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 1H, H1´), 5.40 (d, 3JH,H= 4.7 Hz, 1H, 3’-OH), 4.43-4.40 (m, 1H,
H3´), 4.03-3.99 (m, 1H, H4´), 3.68 (s, 6H, 2xOMe), 3.74-3.67 (m, 2H, H5’a, H5´b),
2.87-2.82 (m, 1H, H2´a), 2.47 (s, 3H, Me), 2.39-2.32 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ
[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160 (C6), 158.2 (2xCe), 156.0 (C2), 149.2 (CD), 145.3
(CA), 140.4 (C8), 130-128 (aromatische C), 124.7 (C4), 124.5 (C5), 113.3 (4x Cd),
86.0 (C4´), 86.9 (Ca), 83.7 (C1´), 70.9 (C3´), 61.5 (C5´), 55.3 (2xOMe), 40.1 (C2´),
21.7 (Me). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3415, 2922, 1685, 1570, 1316,
1091. - MS (FAB, m/z): ber.: 674.2853, gef.: 675.2932 [M+H]+.
DMTrO
1
8
7 65
43
2
3´ 2´
1´
9
5´
128
HN
D
CB
A
4´
Experimentalteil
Versuch zur Darstellung von 3’-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N’-diisopropylamino)-
phosphinyl)]-5´-O- (DMTr)-2-N-p-tolylhydrazino-2´-dG 129 33 mg (0.049 mmol) 5’-O-DMTr-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 128 wurden in je 3 mL
Dichlormethan und Acetonitril gelöst und mit 2 mL Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-
cyanoethyl)-phosphit 107 versetzt und 1.5 h bei Raumtemperatur gerührt.
220
.Ausbeute: 30 mg (0.034 mmol, 70%)
Nach Zugabe von 5%iger
Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurde die
wässrige Phase dreimal mit DCM extrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen wurden
über Natriumsulfat getrocknet, vom
Lösungsmittel befreit und säulen-
chromatographisch über Aluminium(III)oxid
getrennt ( Laufmittel: DCM/MeOH 0% → 2%)
eines gelben Feststoffes, welcher sich jedoch augenblicklich an der Luft zersetzt
(Grünfärbung).
NH
N
N
NH
N
O
O
DMTrO
O1
8
7 65
43
2
3´ 2´
1´
9
5´
4´
129
HN A
D
CB
PO N
NC
Synthese von 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134
In einem Kolben wurden 12.5 g (200 mmol) Natriumnitrit in 10 mL Wasser
gelöst und zu einer Lösung aus 25.0 g (185 mmol)
2-(4-Aminophenyl)ethanol 133 und 125 mL eines Salzsäure/Eis-Gemisches
(Verhältnis 2:3) bei 3 °C getropft. Nach anschließender Neutralisation mit
Natriumcarbonat-Lösung wurde die Lösung bei 0 °C zu 300 mL einem mit
Kupfercyanid-Lösung (18.5 g Kupferchlorid und 24.5 g Natriumcyanid in 125
mL Wasser) überschichteten Toluol/Benzol-Gemisch (Verhältnis 1:1) getropft. Nach
weiterem Rühren für eine Stunde bei 0 °C, wurde die Lösung bei Raumtemperatur
eine Stunde und anschließend für 1.5 Stunden bei 50 °C stehengelassen. Nach
Abtrennung der organischen Phase wurde die wässrige Phase dreimal mit je 50 mL
Dichlormethan extrahiert, bevor die vereinigten organischen Phasen über
Natriumsulfat getrocknet und vom Lösungsmittel befreit wurden. Das Rohprodukt
wurde säulenchromatographisch gereinigt (DCM/MeOH; 0% → 5%).
CN
OH
αβ
γδ
12
134
Experimentalteil
Ausbeute: 12.0 g (81.6 mmol, 44%) eines orangenen Feststoffs. – DC: Rf-Wert
(DCM/Methanol 9:1): 0.54 – Smp.: 49 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):
7.73 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, Hγ), 7.43 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, Hβ), 4.70 (t, 3JHH = 5.2 Hz, 3JHH = 5.2 Hz, 1H, OH), 3.63 (ddd, 3JHH = 5.2 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 2H,
H1), 2.79 (t, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 2H, H2) - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 146.2 (Cα), 132.1 (Cβ), 130.0 (Cγ), 119.2 (Cδ), 108.8 (CN), 61.5 (C1), 39.0
(C2) – IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2356, 2078, 1826, 1705, 1676, 1207, 741
- MS (FAB, m/z): ber.: 147.06, gef.: 148.07 (M+H+).
Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2´-dG 135 Es wurden 32.8 g (66.3 mmol) 3´,5´-bis-O-
(TBDMS)-2´-dG 121 mit 42.3 g (161 mmol)
Triphenylphosphin und 33.2 g (225 mmol) 2-(4-
Cyanophenyl)ethanol 134 in 500 mL abs. Dioxan
gelöst. Bei 0 °C wurden 22.7 mL (22.1 g, 109 mmol)
DIAD zugetropft und die Lösung über Nacht bei RT
gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels DC
(PE/EE: 1:1). Nach Entfernen des Lösungsmittels
wurde das Produkt säulenchromatographisch
(PE/EE: 10% → 30%) gereinigt.
N
N
N
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
O1
8
7 65
43
2
3´ 2´
1´
9
5´
4´
135
a
bc
fe
d CN
Ausbeute: 38 g (61 mmol, 92%) eines gelben Feststoffes. - DC: Rf-Wert (PE/EE: 1:1):
0.51. - Smp.: 69 °C. - [α]20546: -0.5 ° (c= 1.67, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,
DMSO-d6): 7.93 (s, 1H, H8), 7.68-7.62 (m, 2H, Hd), 7.46 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, He),
6.36 (s, 2H, NH2), 6.11 (dd, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 7.4 Hz, 1H, H1´), 4.70 (ddd, 3JH,H=
6.2 Hz, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 12.4 Hz, 1H, H3´), 3.95 (q, 3JH,H= 7.1 Hz, 3JH,H= 7.1 Hz, 3JH,H= 7.1 Hz, 1H, H4´), 3.73-3.70 (m, 1H, H5´a), 3.63 (dd, 3JH,H= 5.9 Hz, 2JH,H= 11.0
Hz, 1H, H5´b), 3.55 (dd, 3JH,H= 5.2 Hz, 3JH,H= 6.7 Hz, 2H, Ha), 2.69 (t, 3JH,H= 5.7 Hz,
2H, Hb), 2.66-2.60 (m, 1H, H2´a), 2.17 (ddd, 2JH,H= 13.1 Hz, 3JH,H= 6.0 Hz, 3JH,H= 3.2
Hz, 1H, H2´b), 0.78 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.75 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.00 (s,
6H, Si(CH3)2), -0.07, -0.08 (2 * s, 2 * 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 160.4 (C6), 160.2 (C2), 137.9 (C8), 137.8 (Cf), 134.9 (Cb), 133.4 (Cc),
221
Experimentalteil
130.4 (Cd), 129.2 (C4), 119.1 (Ce), 114.1 (C5), 109.7 (CN), 87.3 (C4´), 82.6 (C3´),
72.5 (C1´), 67.59 (Ca), 65.9 (C5´), 60.1 (C2´), 26.0 (2 * SiC(CH3)3), 22.2 (Si(CH3)2),
21.1 (Si(CH3)2), 14.4 (2 * SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3373,
2929, 2884, 2857, 2228, 1733, 1611, 1585, 1506, 1462, 1410, 1372, 1332, 1252,
1178, 1111, 1070, 968, 939, 838, 780, 671, 640, 562. - MS (FAB, m/z) ber.: 625.3354,
gef.: 625.3348 [M+H]+.
Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2-brom-2´-dG 132 Es wurden 37.95 g (60.73 mmol) O6-2-(4-
Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2´-dG
135 mit 30.00 g (46.23 mmol) Antimon(III)bromid
zusammengegeben und auf 0 °C gekühlt. Dann
wurden 150 mL zuvor auch auf 0 °C gekühltes
CH2Br2 hinzugegeben, die gesamte
Reaktionsmischung auf -10 °C gekühlt und mit
22.0 mL (22.8 g, 119.4 mmol) t-Butylnitrit versetzt.
Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei -10 °C
gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels DC (PE/EE: 4:1). Der
Reaktionsabbruch erfolgte durch Zugabe zu 60 g Natriumhydrogencarbonat in 1000
mL Eis-Wasser. Der Niederschlag wurde filtriert und dreimal gründlich mit DCM
gewaschen. Die wässrige Phase wurde dreimal mit DCM extrahiert und die
vereinigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen
des Lösungsmittels konnte die Reinigung säulenchromatographisch (PE/EE: 10% →
35%) erfolgen.
132
N
N
N
BrN
O
OTBDMS
TBDMSO
O1
8
7 65
43
2
3´ 2´
1´
9
5´
4´
a
bc
fe
d CN
Ausbeute: 20.9 g (30.3 mmol, 50%) eines gelben Sirups - DC: Rf-Wert (PE/EE: 4:1):
0.61. - [α]20546: +8.7 ° (c= 0.19, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.38
(s, 1H, H8), 7.66 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, Hd), 7.44 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, He), 6.22 (t, 3JH,H= 6.4 Hz, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´), 4.58 (dd, 3JH,H= 9.4 Hz, 3JH,H= 4.8 Hz, 1H, H3´),
3.93-3.88 (m, 2H, H4´, H5´a), 3.74-3.65 (m, 2H, Ha), 3.54 (dd, 2JH,H= 11.0 Hz, 3JH,H=
4.3 Hz, 1H, H5´b), 3.11 (t, 3JH,H= 6.5 Hz, 2H, Hb), 2.82-2.76 (m, 1H, H2´a), 2.26 (ddd, 2JH,H= 13.2 Hz, 3JH,H= 6.7 Hz, 3JH,H= 4.8 Hz, 1H, H2´b), 0.77 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´),
0.67 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.00 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.13, -0.17 (2 * s, 2 * 3H,
222
Experimentalteil
Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.6 (C2), 160.2 (C6), 152.9
(C5), 144.4 (C8), 143.8 (Cb), 142.3 (Cf), 132.6 (Cc), 130.4 (Cd), 121.1 (C4), 119.2
(Ce), 109.8 (CN), 87.4 (C4´), 84.3 (C3´), 71.1 (C1´), 67.8 (C5´), 62.5 (Ca), 60.1 (C2´),
26.0 (2 * SiC(CH3)3), 22.6 (Si(CH3)2), 21.1 (Si(CH3)2), 18.1 (2 * SiC(CH3)3) - IR:
Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3854, 3446, 2954, 2930, 2857, 2228, 1734, 1653,
1596, 1569, 1507, 1472, 1430, 1362, 1314, 1256, 1227, 1164, 1110, 1070, 1030, 837,
778. - MS (FAB, m/z): ber.: 729.3854, gef.: 730.3899 [M+H]+.
Synthese von 4-Hydrazinobiphenyl 125 1.52 g (9.00 mmol) 4-Aminobiphenyl 2 wurden in einem
Gemisch aus 15 mL Wasser und 5.7 mL konzentrierter
Salzsäure suspendiert und auf -10 °C gekühlt. Dann wurde
eine Lösung aus 0.65 g (9.00 mmol) Natriumnitrit in 5 mL
Wasser langsam zugetropft. Man ließ noch 4 Stunden bei -10 °C rühren und gab dann
die hellgelbe Lösung in der Kälte zu einer Lösung von 7.6 g (40 mmol) SnCl2 in 7.6 g
konzentrierter Salzsäure. Nach 1 Stunde wurde der Niederschlag abfiltriert und das
Produkt durch Eintragen des Niederschlages in 25%-ige Ammoniaklösung in Freiheit
gesetzt. Das Hydrazin 125 wurde mit Ether extrahiert, die organische Phase über
Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
3
4
5 6
1
2
1'
2' 3'
4'
5'6'
NHNH2
125
Ausbeute: 1.42 g (7.21 mmol, 80%) hellgelbe, glänzende Blättchen. - DC: Rf-Wert
(DCM/MeOH 19:1): 0.65. - Smp.: 135 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, CDCl3): 7.48
(d, 3JH,H= 7.2 Hz, 2H, H2´, H6´), 7.42 (d, 3JH,H= 8.7 Hz, 2H, H2, H6), 7.34 (d, 3JH,H= 7.2
Hz, 2H, H3´, H5´), 7.31-7.28 (m, 1H, H4´), 6.82 (d, 3JH,H= 8.7 Hz, 2H, H3, H5), 5.17 (s,
1 H, NH), 3.54 (2H, NH2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, CDCl3):150.7 (C8), 132.5
(C4), 128.8 (C2,C2´), 128.0 (C8, C8´), 126.6 (C1, C3, C3´), 126.5 (C5), 112.5 (C7,
C7´). - MS (EI, m/z): ber.: 184.10, gef.: 184 [M].
Synthese von 2-Hydrazinofluoren 125.2
223
HN NH2
1
2
34
5
67
89
10
1112
13
125.2
Es wurden 1.0 g (5.5 mmol) 2-Aminofluoren 3 in 4 mL
konz. Salzsäure suspendiert und auf 0 °C gekühlt. Es
Experimentalteil
erfolgte die tropfenweise Zugabe von 378 mg (5.50 mmol) Natriumnitrit, gelöst in 4 mL
kaltem Wasser, und weiteres Rühren bei 0 °C für 30 Minuten. Anschließend erfolgte
die tropfenweise Zugabe von 3.10 g (16.5 mmol) Zinnchlorid, gelöst in 6 mL kalter
konz. Salzsäure, bei 0 °C. Nach Lagerung über Nacht wurde der Niederschlag filtriert
und mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung und Petrolether:Diethylether (2:1)
gewaschen. Nach Aufnahme des Niederschlags in frisch angesetzter Natronlauge
wurde mit Diethylether extrahiert und die organische Phase über Natriumsulfat
getrocknet. Das Hydrochlorid konnte nachließen durch Fällung mit konz. Salzsäure
unter Eiskühlung erhalten werden. Das freie Hydrazin wurde durch Extraktion mit
Diethylether gegen Natronlauge und abschließendem Einengen der organischen
Phase erhalten.
Ausbeute: 533 mg (2.36 mmol, 43%) eines orangen Feststoffs. - Smp.: 104 °C. - 1H-
NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 7.89 (d, 3JHH = 7.7Hz, 1H, H(4)), 7.59-7.67 (m,
2H, H(1) + H(12)), 7.24-7.50 (m, 3H, H(3)+H(9)+) H(10), 7.08-7.21 (m, 1H, H(11)),
5.16 (s, 1H, NH), 3.91 (s, 1H, CH2-a), 3.77 (s, 1H, CH2-b), 3.72 (s, 2H, NH2). - 13C-
NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.3 (C(2)), 148.4 (C(5)), 143.3 (C(13)), 142.4
(C(8)), 141.4 (C(6)), 126.7 (C(3)), 126.6 (C(1)), 125.1 (C(11)), 120.4 (C(9)), 119.9
(C(10)), 117.8 (C(12)), 112.8 (C(4)), 36.2 (C(7)). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3822,
3736, 3650, 3283, 1582, 1455, 730. - MS (EI, m/z): ber.: 196.1008, gef.: 196 (M).
Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-
2’-dG 136 Die Synthese wurde nach AAV 7 durchgeführt.
Es wurden 3.05 g (4.40 mmol) O6-2-(4-
Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-brom-
2’-dG 132 eingesetzt.
Ausbeute: 2.52 g (3.52 mmol, 80%) eines
braunen Feststoffes. - DC: RF-Wert (PE/EE 1:1)
0.24. - [α]20546: -3° (c= 1.0, CHCl3). - Smp.: 84-87
°C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):
8.46 (s, 2H, H-8), 7.43– 6.82 (m, 9H, HAr), 6.67
(dd, 3JH,H = 7.3 Hz, 3JH,H
= 7.2 Hz, 1H, H-1’), 5.34 (s, 2H, NH), 4.42 – 4.19 (m, 2H, H-
N
N
N
O
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
CN
136
1'
2'3'
4'
5'
1
34 2
567
8
9A B
C
D
a
b c
de
f
224
Experimentalteil
a), 3.72-3.71 (m, 3H, H4´, H5´a, H5´b), 3.06 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb),
2.97-2.91 (m, 1H, H2´a), 1.91 (s, 1H, H2´b), 0.75 (s, 9H, Si(CH3)3 an C3´), 0.80 (s, 9H,
Si(CH3)3 an C5´), 0.00 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.15 (2 * s, 2 * 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ
[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C-6), 156.7 (C-2), 152.4 (C-D), 145.7 (C-A), 144.4
(C-f), 139.6 (C-8), 130.0 (C-C), 129.5 (C-c), 127.6 (C-d), 127.5 (C-e), 123.6 (C-4),
119.0 (C-B), 118.6 (-CN), 114.8 (C-5), 87.1 (C-4´), 84.0 (C-1´), 71.6 (C-3´), 67.8 (C-a),
62.8 (C-5´), 39.7 (C-2´), 34.7 (2 * SiC(CH3)3), 34.3 (C-b). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):
3744, 3037, 1737, 1695, 1612, 1507, 1110, 838. - MS (FAB, m/z): ber.: 715.3698,
gef.: 716.3736 (M+H+).
Synthese von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(TBDMS)-2-(4-
methylphenylhydrazino)-2’-desoxyguanosin 138
Die Synthese wurde nach AAV 7
durchgeführt.
225
Es wurden 150 mg (2.12 mmol) O6-2-(p-
Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(tert.-butyl-
trimethylsilyl)-2-brom-2’-desoxyguanosin
132 eingesetzt.
Ausbeute: 103 mg (1.85 mmol; 75%) als
orangenes Öl erhalten.
DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1):
0.48. – [ ]20 °C
546 nm Hgα = + 10.1 ° (c = 1.0, CH2Cl2).- 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-
d6): 8.62 (s, 1H, H8), 7.79-7.89 (m, 2H, Hd), 7.56-7.61 (m, 2H, He), 7.33-7.47 (m, 6H,
Hb’, Hc’, NH), 6.43 (dd, 3JH,H= 6.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 1H, H1´), 4.87 (t, 3JH,H= 6.8 Hz,
2H, Ha), 4.47-4.53 (m, 1H, H3’), 3.79-3.88 (m, 1H, H4´), 3.59-3.70 (m, 2H, H5’), 3.21-
3.25 (m, 2H, Hb), 2.99-3.03 (m, 1H, H2´a), 2.44 (s, 3H, He’), 2.39-2.41 (m, 1H, H2´b),
0.84 (s, 9 H, Si-C(CH)3 an C3´), 0.76 (s, 9 H, Si-C(CH)3 an C5´), 0.10 (s, 3 H, Si-
(CH3)2 an C3´), -0.05 (s, 3 H, Si-(CH3)2 an C3´), -0.08 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C5´). - 13C-
NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.1 (C6), 152.3 (C2), 150.1 (C(d’)), 144.2 (C8),
143.5 (Cf), 142.7 (Cc), 132.1 (Cd), 129.9 (Ce), 128.9 (C(b’)), 128.5 (C4), 123.2 (C(c’)),
120.8 (C(a’)), 118.9 (CN), 109.3 (C5), 87.1 (C4´), 83.9 (C1´), 72.2 (C3´), 66.8 (Ca),
62.3 (C5´), 58.1 (C2´), 34.4 (Cb), 25.7 (SiC(CH3)3), 21.8 (Ce’), 14.0 (SiC(CH3)3), -4.7, -
N
N
N
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NH
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OTBDMS
TBDMSO
HN
CN
138
1'
2'3'
4'
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34 2
5 67
8
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c'
d'
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b c
de
f
e'
Experimentalteil
5.6 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3211, 2929, 1696, 1569, 1471,
1361, 1254, 836. - MS (FAB, m/z): ber.: 729.3854, gef.: 730.3899 [M+H]+
Synthese von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(TBDMS)-2-(3,5-
dimethylphenylhydrazino)-2’-desoxyguanosin 139
Es wurden 330 mg (0.48 mmol) O6-2-(p-
Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(tert.-butyl-
trimethylsilyl)-2-brom-2’-desoxyguanosin
132 eingesetzt.
226
Ausbeute: 184 mg (0.25 mmol; 52%) eines
gelben Öl.
DC: Rf-Wert (Dichlormethan /Methanol 9:1):
0.44. – [α]20546: = + 7.8 ° (c = 1.2, CH2Cl2). -
1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):
8.86 (s, 2H, NH), 8.16 (s, 1H, H8), 7.73-7.75 (m, 2H, Hd), 7.40-7.44 (m, 2H, He), 7.26
(s, 2H, Hb’), 6.70 (s, 1H, Hd’), 6.26-6.30 (m, 1H, H1´), 4.73-4.80 (m, 2H, Ha), 4.58-
4.64 (m, 1H, H3’), 3.81-3.83 (m, 1H, H4´), 3.55-3.64 (m, 2H, H5’), 3.12-3.17 (m, 2H,
Hb), 2.95-3.00 (m, 1H, H2´a), 2.24-2.27 (m, 1H, H2´b), 2.21 (s, 6H, He’), 0.89 (s, 9 H,
Si-C(CH)3 an C3´), 0.83 (s, 9 H, Si-C(CH)3 an C5´), 0.10 (s, 3 H, Si-(CH3)2 an C3´),
0.00 (s, 3 H, Si-(CH3)2 an C3´), -0.02 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C5´). - 13C-NMR: δ [ppm]
(101 MHz, DMSO-d6): 156.1 (C6), 153.2 (C2), 144.8 (C(c’)), 140.2 (C8), 144.1 (Cf),
136.3 (Cc), 132.1 (Cd), 130.0 (Ce), 124.8 (C(b’)), 128.0 (C4), 121.3 (C(d’)), 118.9
(CN), 118.8 (C(a’)), 109.3 (C5), 87.9 (C4´), 83.4 (C1´), 73.5 (C3´), 65.9 (Ca), 62.8
(C5´), 59.7 (C2´), 34.5 (Cb), 25.2 (SiC(CH3)3), 21.9 (Me), 9.6 (SiC(CH3)3), -4.1, -5.4
(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2930.90, 2835.32, 2226.98,
1618.35, 1463.31, 1384.12, 1301.26, 1256.47, 1175.19, 1032.77, 827.69, 703.66,
583.54. - MS (FAB, m/z): ber.: 743.4011, gef.: 744.4125 [M+H]+
N
N
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NH
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OTBDMS
TBDMSO
HN
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139
1'
2'3'
4'
5'
1
34 2
5 67
8
9a' b'
c'
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a
b c
de
f
e'
Experimentalteil
Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2-N-4-
biphenylhydrazino-2´-dG 137 Die Synthese wurde nach AAV 7
durchgeführt. Es wurden 2.36 g
(3.42 mmol) O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-
3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-brom-2’-dG 132
eingesetzt.
Ausbeute: 1.35 g (1.71 mmol, 50%) eines
gelben Feststoffes. - DC: Rf-Wert (PE/EE:
9:1): 0.12. – [α]20546: +25 ° (c= 0.4,
CHCl3). - Smp.: 75-78 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.19 (s, 1H, H8),
7.77-7.33 (m, 13H, Har), 6.31 (dd, 3JH,H= 6.7 Hz, 1H, H1´), 5.37, 5.20 (2 * s, 2 * 1H,
NH), 4.70 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Ha), 4.54-4.51 (m, 2H, H3´), 3.85-3.82 (m, 1H, H4´),
3.72-3.62 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.17 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb), 2.97-2.90 (m, 1H,
H2´a), 2.30-2.24 (m, 1H, H2´b), 0.88, 0.84 (2 * s, 2 * 9H, Si(CH3)3 ), 0.10, 0.00 (2 * s, 2
* 6H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.2 (C6), 157.5, 153.1
(C4), 148.2 (C2), 144.1, 139.7 (C8), 132.0, 128.7, 126.1, 118.7 (CN), 115.1 (C5), 87.1
(C4´), 83.2 (C1´), 72.3 (C3´), 65.8 (Ca), 62.8 (C5´), 38.3 (C2´), 34.1 (Cb), 25.6, 25.5 (2
* SiC(CH3)3), -5.6, -5.1 (2 * Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2954,
2928, 2857, 1687, 1109, 776, 740, 482. - MS (FAB, m/z): ber.: 791.4011, gef.:
791.4035 [M+H]+.
N
N
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NH
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OTBDMS
TBDMSO
HN
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1371'
2'3'
4'
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567
8
9
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C
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b c
d
ef
E
H
G
F
227
Experimentalteil
Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylhydrazino-2’-dG 140 und
O6-2-(4-Cyano-phenyl)ethyl-2-N-phenylazo-2’-dG 142
Die Synthese wurde nach AAV 8 durchgeführt. Es wurden 1.18 g (1.65 mmol) O6-2-(4-
Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2’-dG 136 eingesetzt.
O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylhydrazino-2’-dG 140
Ausbeute: 385 mg (0.79 mmol, 48%) eines beigen
Feststoffes. - DC: Rf-Wert: (DCM/MeOH 9:1) 0.38.
- [α]20546: +34° (c = 1.0, DCM/MeOH 1:1). - Smp.:
95-99 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-
d6): 8.22 (s, 1H, H-8), 7.75 (d, 3JH,H= 8.4 Hz, 2H,
H-e), 7.64 (dd, 4JH,H= 1.2 Hz, 3JH,H= 8.7 Hz, 2H,
H-B), 7.41 (d, 3JH,H= 8.4 Hz, 2H, H-d), 7.35-7.29
(m, 2H, H-C), 7.07 (dd, 3JH,H= 7.4 Hz, 4JH,H= 1.1
Hz, 1H, H-D), 6.31 (dd, 3JH,H= 7.4 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz
3’-OH), 4.94-4.84 (m, 1H, 5’-OH), 4.62 (t,
N
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NH
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HO
HN
CN
140
1'
2'3'
4'
5'
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567
8
9
AB
C
D
a
b c
d
ef
, 1H, H-1’), 5.34-5.26 (m, 3H, NH, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, H-a), 4.40-4.35 (m, 1H, H-
3’), 3.86-3.81 (m, 1H, H-4’), 3.60-3.44 (m, 2H, H-5’), 3.12 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, H-b),
2.78-2.73 (m, 1H, H-2’a), 2.24 (ddd, 3JH,H= 3.1 Hz, 3JH,H = 6.2, 1H, H-2’b). - 13C-NMR:
δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C-6), 157.7 (C-2), 145.1 (C-A), 144.0 (C-f),
139.6 (C-8), 132.2 (C-e), 130.0 (C-d), 127.7(C-C), 123.7 (C-B), 123.3 (C-D), 119.5 (C-
4), 118.8 (CN), 114.9 (C-5), 109.2 (C-c), 87.7 (C-4’), 83.2 (C-1’), 70.8 (C-3’), 65.7 (C-
a), 61.7 (C-5’), 38.7 (C-2’), 34.4 (C-b). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3403,
2361, 2227, 1653, 1611, 1577, 1507, 1395, 1241, 1056. - MS (FAB, m/z): ber.:
487.1968, gef.: 488.2046 [M+H]+.
228
Experimentalteil
O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylazo-2’-dG 142
Ausbeute: 216 mg (0.44 mmol, 27%) eines orangen
Feststoffes. - DC: Rf-Wert: (DCM/MeOH 9:1) 0.39. -
[α]20546: +71° (c = 1.0, DCM/MeOH 1:1). - Smp.: 95-
99 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):
8.72 (s, 1H, H-8), 8.01-7.98 (m, 2H, H-B), 7.81-7.77
(d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, H-e), 7.68 (d, 3JH,H= 1.7 Hz,
2H, H-C), 7.66 (d, 3JH,H= 2.1 Hz, 1H, H-D), 7.60 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, H-d), 6.48 (dd, 3JH,H= 6.6 Hz, 3JH,H= 6.6 Hz, 1H, H-1’), 5.39-5.30 (m, 1H, 3’-OH), 5.01 – 4.92 (m, 1H, 5’-OH), 4.89 (t, 3JH,H= 6.6 Hz, 2H, H-a), 4.46-4.42 (m, 1H, H-3’), 3.92-3.88 (m, 1H, H-4’), 3.58-3.49 (m,
2H, H-5’), 3.29-3.27 (m, 2H, H-b), 2.78-2.70 (m, 1H, H-2’a), 2.40-2.31 (m, 1H, H-2’b).
- 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.4 (C-6), 152.2, 144.8 (C-f), 132.1 (C-e),
130.1 (C-d), 129.6 (C-C), 123.1 (C-B), 119.3 (-CN), 109.3 (C-c), 86.1 (C-1’), 83.8 (C-
4’), 71.4 (C-5’), 70.5 (C-3’), 66.9 (C-a), 61.5, 39.1 (C-2’), 34.3 (C-b). - IR: Wellenzahl
[cm-1] (KBr-Pressling): 3886, 3854, 3744, 3752, 3675, 3447, 1701, 1654, 1597, 1437. -
MS (FAB, m/z): ber.: 485.4946, gef.: 486.1890 [M+H]+.
N
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NN
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142
1'
2'3'
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8
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C
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b c
d
ef
Des Weiteren wurden 75 mg (0.15 mmol, 9%) als Mischfraktion erhalten.
1. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-
phenylhydrazino-2´-dG 140
56 mg (0.12 mmol) des Produktgemisches
140 / 142 wurden in Methanol gelöst und
mit 25 mg (1.04 mmol) Magnesium und 56
mg (11.2 mmol) Ammoniumchlorid versetzt.
Es wurde für 24 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt, die
Reaktionslösung anschließend filtriert und
mit Methanol gewaschen. Das
Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in
Chloroform aufgenommen. Anschließend wurde zweimal mit gesättigter
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8
7 65
43
2
3´ 2´
1´
9
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HN A
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140
229
Experimentalteil
Natriumchlorid-Lösung und einmal mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat
getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand
wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradient (0 - 10%).
Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.
2. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-
phenylhydrazino-2´-dG 140
52 mg (0.11 mmol) des
Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden mit
18 mg (0.22 mmol) Natriumhydrogencrbonat
versetzt und in Ethanol gelöst. Es wurde
eine katalytische Menge Zirkoniumdioxid
und 10 µL (0.17 mmol) Hydrazinhydrat
hinzugegeben und anschließend für 24
Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das
Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde
säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradient (0 - 10%).
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3´ 2´
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140
Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.
3. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-
phenylhydrazino-2´-dG 140
53 mg (0.11 mmol) des
Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden zu
einer Lösung aus 70 mg (0.28 mmol) Iod
und 35 mg (0.13 mmol) Magnesiumiodid in
2 mL Ether/Benzol (1:2) gegeben. Es wurde
eine Spatelspitze Magnesium hinzugegeben
und für 72 Stunden bei Raumtemperatur
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43
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HN A
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140
230
Experimentalteil
gerührt.
Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.
4. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-
phenylhydrazino-2´-dG 140
57 mg (0.12 mmol) des
Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in
THF gelöst. Diese Lösung wurde zu einer
Lösung aus 11 mg (0.21 mmol)
Natriumborhydrid in 1 mL THF gegeben. Die
Reaktionslösung wurde mit 25 mg (0.10
mmol) Iod in 2 mL THF versetzt.
Anschließend wurde 24 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt. Nach der Zugabe von 3 M Salzsäure wurde mit Ether
extrahiert und mit 3 M Natronlauge gewaschen. Es wurde über Natriumsulfat
getrocknet, das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand
wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradient (0 - 10%).
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140
Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.
5. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-
phenylhydrazino-2´-dG 140
68 mg (0.14 mmol) des
Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in 5
mL abs. Methanol gelöst, mit einer
Spatelspitze Pd/C (10%) versetzt und 5 min
mit Ultraschall behandelt. Nach der Zugabe
von 50 µL Hydrazinhydrat wurde die
Suspension über Nacht bei
Raumtemperatur gerührt. Der Katalysator
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4´
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BC
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140
231
Experimentalteil
wurde durch Zentrifugation und Dekantieren der Lösung entfernt. Die erhaltene
Lösung wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand
wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradient (0 - 10%).
Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.
6. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-
phenylhydrazino-2´-dG 140
53 mg (0.11 mmol) des
Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in 5
mL abs. Methanol gelöst, mit einer
Spatelspitze Pd/C (10%) versetzt und 10
min mit Ultraschall behandelt. Nach der
Zugabe von 50 µL Hydrazinhydrat wurde
die Suspension über Nacht bei
Raumtemperatur gerührt. Der Katalysator
wurde durch Zentrifugation und Dekantieren der Lösung entfernt. Die erhaltene
Lösung wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand
wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradient (0 - 10%).
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2
3´ 2´
1´
9
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4´
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bc
fe
d CN
HN A
BC
D
140
Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.
7. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-
phenylhydrazino-2´-dG 140
fe
d CN
232
500 mg (1.03 mmol) des
Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in
30 mL abs. Methanol gelöst, mit einer
Spatelspitze Pd/C (10%) versetzt und 10
min mit Ultraschall behandelt. Nach der
Zugabe von 100 µL Hydrazinhydrat wurde
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140
Experimentalteil
die Suspension über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es wurden zusätzlich 300 µL
Hydrazinhydrat hinzugegeben und die Reaktionslösung auf 50 °C erhitzt. Der
Katalysator wurde durch Zentrifugation und Dekantieren der Lösung entfernt. Die
erhaltene Lösung wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der
Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente
Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%).
Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.
8. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-
phenylhydrazino-2´-dG 140
60 mg (0.13 mmol) des
Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in 5
mL abs. Methanol gelöst und mit 100 µL
Hydrazinhydrat versetzt. Es wurde auf die
Zugabe von Katalysator verzichtet und
stattdessen über Nacht auf 60 °C erhitzt.
Das Lösungsmittel wurde unter
vermindertem Druck vom Lösungsmittel
befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent
diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%).
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7 65
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3´ 2´
1´
9
5´
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d CN
HN A
BC
D
140
Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.
9. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-
phenylhydrazino-2´-dG 140
fe
d CN
233
94 mg (0.20 mmol) des
Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in 5
mL abs. Ethanol gelöst und mit 1 mL
Hydrazinhydrat versetzt. Die
Reaktionslösung färbte sich rot. Es wurde
über das Wochenende auf 60 °C erhitzt.
N
N
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8
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2
3´ 2´
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9
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HN A
BC
D
140
Experimentalteil
Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der
Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente
Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%).
Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.
1. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-
phenylazo-2´-dG 142
Es wurden 650 mg (1.37 mmol) des
Reaktionsgemisches 140 / 142 in 30 mL
Toluol gelöst und mit 840 mg (1.18 mmol)
Kaliumsuperoxid versetzt. Es wurde 48
Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach
der Zugabe von 20 mL Wasser wurden die
Phasen getrennt. Die wässrige Phase wurde
fünfmal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über
Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.
Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente
Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%).
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2
3´ 2´
1´
9
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d CN
N AB
C
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142
Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.
2. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-
phenylazo-2´-dG 142
Es wurden 40 mg (0.08 mmol) des
Reaktionsgemisches 140 / 142 in 2 mL
DCM gelöst und mit 40 μL Pyridin und 10
mg (0.13 mmol) NBS versetzt. Es wurde
1.5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Nach der Entfernung des Lösungsmittels
wurde der Rückstand
säulenchromatographisch gereinigt. Als
fe
d CN
234
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7 65
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N AB
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142
Experimentalteil
Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 5%).
Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.
Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 141 und O6-
2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 143
Die Synthese wurde nach AAV 8 durchgeführt. Es wurden 1.35 g (1.71 mmol) O6-2-(p-
Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 137 einge-
setzt.
O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 141 Ausbeute: 299 mg (0.53 mmol, 31%) eines hell-orangen Feststoffes. - DC: Rf-Wert
(DCM/MeOH: 9:1): 0.35 - [α]20546: +54 °
(c= 0.8, DCM/MeOH). - Smp.: 90 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):
8.25 (s, 1H, H8), 7.77-7.32 (m, 13H,
Har), 6.34 (dd, 3JH,H= 6.6 Hz, 1H, H1´),
5.76, 5.37 (2 * s, 2 * 1H, NH), 5.30 (d, 3JH,H= 4.0 Hz, 1H, 3´-OH), 4.90 (t, 3JH,H=
5.5 Hz, 1H, 5´-OH), 4.66 (t, 3JH,H= 6.9
Hz, 2H, Ha), 4.41-4.38 (m, 1H, H3´),
3.86-3.83 (m, 1H, H4´), 3.58-3.49 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.15 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb),
2.97-2.79 (m, 1H, H2´a), 2.29-2.23 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 159.1 (C6), 155.6 (C2), 153.2 (C4), 144.1 (Ca), 139.7 (C8), 134.6, 130.0
(Cb, Cb´), 118.8 (C5), 116.2 (CN), 109.1 (Cd), 87.6 (C4´), 83.1 (C1´), 70.8 (C3´), 65.8
(Ca), 61.7 (C5´), 39.7 (C2´), 34.4 (Cb). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3448,
2922, 2857, 2227, 1718, 1609, 1384, 1238, 1105, 832, 763, 701. - MS (FAB, m/z):
ber.: 563.2281, gef.: 563.2402 [M].
N
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1411'
2'3'
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Experimentalteil
O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 143 Ausbeute: 240 mg (0.43 mmol, 25%) eines orangenen Feststoffes. - DC: Rf-Wert
(DCM/MeOH: 9:1): 0.34 - [α]20546: +4 °
(c= 1.2, DCM/MeOH). - Smp.: 92 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):
8.15 (s, 1H, H8), 7.86-7.62 (m, 13H,
Har), 6.38 (dd, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´),
5.36 (d, 3JH,H= 4.5 Hz, 1H, 3´-OH), 4.90
(t, 3JH,H= 5.5 Hz, 1H, 5´-OH), 4.79 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, Ha), 4.50-4.43 (m,
1H, H3´), 3.97-3.93 (m, 1H, H4´), 3.67-
3.63 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.26 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, Hb), 3.02-2.94 (m, 1H, H2´a),
2.41-2.35 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.2 (C6), 157.5,
153.1 (C4), 148.2 (C2), 144.1, 139.7 (C8), 132.0, 128.7, 126.1, 118.7 (CN), 115.1
(C5), 87.1 (C4´), 83.2 (C1´), 72.3 (C3´), 65.8 (Ca), 62.8 (C5´), 38.3 (C2´), 34.1 (Cb). -
IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3473, 1718, 1637, 1384, 1237, 1150, 767, 701,
636. - MS (FAB, m/z): ber.: 561.2125, gef.: 561.3241 [M].
N
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1431'
2'3'
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Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylhydrazino-O-5’-dimethoxytrityl-2’-
dG 144 Die Synthese wurde nach AAV 10 durchgeführt. Es wurden 371 mg (0.76 mmol) des
Hydrazino-Addukt 140 eingesetzt,
Ausbeute: 414 mg (0.52 mmol, 69%) eines
gelborangenen Feststoffes. - DC: Rf-Wert:
(DCM/MeOH 9:1) 0.84. - [α]20546: -19 ° (c = 1.2,
CHCl3). - Smp.: 124-125 °C. 1H-NMR: δ [ppm]
(400 MHz, DMSO-d6): 8.01 (s, 1H, H-8), 7.35 -
7.16 (m, 22H, HAr), 6.09 (t, 3JH,H= 6.5 Hz, 1H,
H-1’), 5.75 (s, 2H, NH), 5.26 (d, 3JH,H= 3.7 Hz,
1H, 3’OH), 4.35 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, H-a),
4.15-4.06 (m, 1H, H-3’), 3.98-3.91 (m, 1H, H-4’), 3.58 (m, 8H, -O-CH3, H-5’), 2.95 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, H-b), 2.69-2.59 (m, 1H, H-2’a), 2.25-2.14 (m, 1H, H-2’b). - 13C-NMR:
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1441'
2'3'
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236
Experimentalteil
δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.5 (C-6), 157.9, 157.3 (C-8), 152.9 (C-4), 144.8 (C-
Ar), 143.8 (C-Ar), 141.5 (C-8), 136.2 (C-Ar), 135.5, 132.1 (C-e), 130.3, 129.6, 129.0
(C-Ar), 127.6 (C-Ar), 124.9, 113.0, 112.2, 109.2 (C-d), 86.5 (C-4’), 79.2 (C-1’), 71.1 (C-
3’), 65.4 (C-a), 60.9 (C-5’), 54.9, 39.1 (C-2’), 34.2 (C-b). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-
Pressling): 3447, 2930, 2834, 2361, 2227, 1609, 1579, 1507, 1442, 1382, 1300, 1249,
1176, 1070, 1033, 827, 789. - HRMS (FAB, m/z): ber.: 789.3275, gef.: 790.3353
[M+H]+.
Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylazo-O-5’-dimethoxytrityl-2’-dG
146
Die Synthese wurde nach AAV 9 durchgeführt.
Es wurden 114 mg (0.23 mmol) des Azo-
Addukts 142 eingesetzt.
Ausbeute: 125 mg (0.16 mmol, 68%) eines
orangen Feststoffes. - DC: Rf-Wert:
(DCM/MeOH 9:1) 0.72. - [α]20546: -42° (c = 0.9,
CHCl3). - Smp.: 98-102 °C. - 1H-NMR: δ [ppm]
(400 MHz, DMSO-d6): 8.71 (s, 1H, H-8), 7.81 –
6.84 (m, 22H, HAr), 6.21 (s, 1H, H-1’), 5.43 -
5.29 (m, 1H, 3’-OH), 4.76-4.71 (m, 3H, H-a, H-3´), 3.97-3.96 (m, 2H, H-5´a, H-5´b),
3.90-3.87 (m, 1H, H-4´), 3.20-3.16 (m, 6H, DMTr-CH3), 3.15 (t, 3JH,H= 6.6 Hz, 3JH,H=
6.6 Hz, 2H, H-b), 2.98-2.95 (m, 1H, H-2´a), 1.95 (s, 1H, H-2´b). - 13C-NMR: δ [ppm]
(101 MHz, DMSO-d6): 158.1 (C-6), 139.9 (C-8), 137.1, 132.1 (C-e), 130.0 (C-c), 129.6,
128.8, 127.6, 123.1, 115.2 (-CN), 112.7, 109.7, 87.6 (C-4’), 79.5 (C-1’), 70.6 (C-3’),
61.5 (C-5’), 54.1, 39.2 (C-2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3854, 3821,
3752, 3675, 3421, 1735, 1701, 1607, 1507, 1437, 1249, 1176, 1033, 827. - MS (FAB,
m/z): ber.: 787.3118, gef.: 788.3201 (M+H+).
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1461'
2'3'
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237
Experimentalteil
Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-biphenylhydrazino-O-5’-dimethoxytrityl-
2’-dG 145 Die Synthese wurde nach AAV 10
durchgeführt. Es wurden 150 mg (0.27
mmol) O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-
biphenyl-hydrazino-2´-dG 141 eingesetzt.
Ausbeute: 145 mg (0.17 mmol, 62%) eines
orangenen Feststoffes. - DC: Rf-Wert
(PE/EE: 9:1): 0.76. - Smp.: 85 °C. - [α]20546:
+92 ° (c= 0.6, DCM/MeOH). - 1H-NMR: δ
[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.02 (s, 1H, H8), 7.66-6.61 (m, 26H, Har), 6.11 (dd, 3JH,H=
6.9 Hz, 1H, H1´), 5.76, 5.37 (2 * s, 2 * 1H, NH), 5.25 (d, 3JH,H= 4.0 Hz, 1H, 3´-OH),
4.38 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Ha), 3.95-3.93 (m, 1H, H4´), 3.72-3.64 (m, 8H, H5´a, H5´b,
OCH3), 2.98 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb), 2.70-2.64 (m, 1H, H2´a), 2.24-2.19 (m, 1H,
H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C6), 155.6 (C2), 153.2 (C4),
144.1 (Ca), 139.7 (C8), 135.6, 134.6, 130.0 (Cb, Cb´), 127.8, 122.3, 118.8 (C5), 116.2
(CN), 109.1 (Cd), 87.6 (C4´), 83.1 (C1´), 70.8 (C3´), 65.8 (Ca), 61.7 (C5´), 39.7 (C2´),
34.4 (Cb). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3462, 1718, 1701, 1654, 1637,
1560, 1508, 1384, 1247, 1107, 701, 582, 465. - MS (FAB, m/z): ber.: 865.3588, gef.:
865.3781 [M].
N
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1451'
2'3'
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238
Experimentalteil
Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-biphenylazo-O-5’-dimethoxytrityl-2’-dG
147 Die Synthese wurde nach AAV 9
durchgeführt. Es wurden 143 mg (0.26
mmol) O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-
biphenylazo-2´-dG 143 eingesetzt.
Ausbeute: 168 mg (0.19 mmol, 76%)
eines orangenen Feststoffes. - DC: Rf-
Wert (PE/EE: 9:1): 0.87. - Smp.: 112 °C. -
[α]20546: -69 ° (c= 1.6, DCM/MeOH). - 1H-
NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.15
(s, 1H, H8), 7.86-6.62 (m, 26H, Har), 6.38 (dd, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´), 5.36 (d, 3JH,H=
4.5 Hz, 1H, 3´-OH), 4.79 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, Ha), 4.50 -4.43 (m, 1H, H3´), 3.97-3.93
(m, 1H, H4´), 3.67-3.63 (m, 8H, H5´a, H5´b, OCH3), 3.26 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, Hb),
3.02-2.94 (m, 1H, H2´a), 2.41-2.35 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 159.1 (C6), 155.6 (C2), 153.2 (C4), 144.1 (Ca), 139.7 (C8), 135.6, 134.6,
130.0 (Cb, Cb´), 127.8, 122.3, 118.8 (C5), 116.2 (CN), 109.1 (Cd), 87.6 (C4´), 83.1
(C1´), 70.8 (C3´), 65.8 (Ca), 61.7 (C5´), 39.7 (C2´), 34.4 (Cb). - IR: Wellenzahl [cm-1]
(KBr-Pressling): 3416, 1637, 1617, 1560, 1508, 1458, 1384, 1314, 1247, 1175, 1075,
619, 477. - MS (FAB, m/z): ber.: 863.3431, gef.: 864.2978 [M+H]+.
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239
Experimentalteil
Synthese von 3'-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N'-diisopropyl-amino)-phosphinyl)]-O6-2-(4-
cyanophenyl)ethyl-5’-O-dimethoxytrityl-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 148
Die Synthese wurde nach AAV 12 durchgeführt.
Es wurden 200 mg (0.25 mmol)
O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenyl-
hydrazino-O-5’-dimethoxytrityl-2’-dG 144 einge-
setzt.
240
Ausbeute: 185 mg (0.19 mmol, 75%) eines
beigen Feststoffes, welcher als
Diastereomerengemisch (I+II) vorliegt. - DC: Rf-
Wert: (DCM/MeOH 9:1) 0.93. - [α]20546: +183° (c
= 1.0, CHCl3). - Smp.: 68-71 °C. 1H-NMR: δ
[ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 7.84 (s, 1H, H-8
(I)), 7.81 (s, 1H, H-8 (II) ), 7.71-7.41 (m, 44H,
HAr(I+II), DMTr-H (I+II)), 6.25 (dd, 3JH,H= 6.4 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 2H, H-1’(I+II)), 4.74-
4.58 (m, 2H, NH (I)), 4.47-4.37 (m, 2H, NH (II)), 4.16-4.05 (m, 4H, H-a (I+II)), 3.58-
3.35 (m, 12H, -OCH3, H-5’a/b (I-II), H-b(I)) 3.15-3.02 (m, 2H, H-b (II)), 2.54-2.29 (m,
12H, iPr-H (I+II), H-α (I+II), H-2’a/b (I+II)), 1.81 (t, 2H, H-β (I)), 1.73 (m, 2H, H-β(II)),
1.15-1.01 (m, 24H, CH3iPr (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 160.1,
159.3, 158.7, 148.2, 145.8, 143.3, 138.0, 137.4, 136.1, 132.0, 131.4, 130.6, 130.1,
129.8, 119.0, 113.7, 113.0, 111.0, 87.1, 74.4, 74.2, 66.0, 54.8, 45.3, 43.6, 35,1, 24.7,
24.6, 22.8. - 31P-NMR: δ [ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 149.35, 149.19. - IR: Wellenzahl
[cm-1] (KBr-Pressling): 3870, 3816, 3752, 3744, 3676, 3447, 2966, 1654, 1609, 1581,
1508,1465, 1383, 1250, 1179, 1034, 829. - MS (FAB, m/z): ber.: 989.4353 , gef.:
990.5 [M+H]+.
N
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1481'
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β
Experimentalteil
Synthese von 3'-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N'-diisopropyl-amino)-phosphinyl)]-O6-2-(4-
cyanophenyl)ethyl-5’-O-dimethoxytrityl-2-N-phenylazo-2´-dG 150
Die Synthese wurde nach AAV 11 durchgeführt.
Es wurden 125 mg (0.16 mmol) des Azo-Addukts
146 eingesetzt.
Ausbeute: 78 mg (0.08 mmol, 51%) eines
gelborangenen Feststoffes. - DC: Rf-Wert:
(DCM/MeOH 9:1): 0.92. - [α]20546:+39° (c = 1.0,
CHCl3). - Smp.: 86-89 °C. 1H-NMR: δ [ppm] (400
MHz, Benzol-d6): 7.88 (s, 1H, H-8 (I)), 7.85 (s, 1H,
H-8 (II)), 7.62-6.58 (m, 49 H, DMTr-H (I+II), HAr
(I+II)), 6.27-6.18 (m, 2H, H-1´(I+II)), 5.07-4.95 (m,
2H, H-3´(I+II)), 4.73-4.67 (m, 4H, H-a (I+II)), 4.13-
4.06 (m, 2H, H-4´(I+II)), 3.54-3.26 (m, 20H, -OCH3 (I+II), H-b (I+II), H-5´(I+II)), 3.00-
2.82 (m, 2H, H-2´a (I+II)), 2.72-2.61 (m, 8H, iPr-H(I+II), H-α (I+II)), 2.56-2.47 (m, 1H,
H-2´b(I)), 2.41-2.29 (m, 1H, H-2´b(II)), 1.73-1.67 (m, 4H, H-β(I+II)), 1.13-1.05 (m, 24H,
CH3iPr (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 190.6, 186.5, 185.4, 177.7,
169.4, 168.0, 163.6, 159.3, 153.4, 146.1, 145.8, 143.3, 136.3, 132.1, 130.7, 129.9,
129.4, 124.0, 113.8, 87.6, 87.0, 54.8, 47.5, 43.6, 35.2, 24.6. - 31P-NMR: δ [ppm] (162
MHz, Benzol-d6): 149.46, 149.16. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3854, 3744,
3676, 3432, 2965, 2227, 1607, 1508, 1445, 1341, 1251, 1178, 1034. - MS (FAB, m/z):
ber.: 987.4197, gef.: 988.7 [M+H]+.
N
N
N
O
NN
ODMTrO
N
CN
1501'
2'3'
4'
5'
1
34 2
567
8
9
AB
C
D
a
b c
d
ef
O
PON
CNα
β
241
Experimentalteil
Synthese von 3’-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N’-diisopropylamino)-phosphinyl)]-O6-2-(4-
Cyanophenyl)ethyl-O-5´-dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 149
Die Synthese wurde nach AAV 12
durchgeführt. Es wurden 135 mg (0.15 mmol)
O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-O-5´-
dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-
dG 145 eingesetzt.
242
Ausbeute: 148 mg (0.14 mmol, 90%) eines
orangenen Feststoffes, welcher als
Diastereomerengemisch (I+II) vorliegt. -
Smp.: 75-78 °C. - DC: Rf-Wert (DCM/MeOH:
9:1): 0.84. - [α]20546: +33° (c= 0.1, CHCl3). -
1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 7.88
(s, 1H, H8 (I)), 7.86 (s, 1H, H8 (II)), 7.62-6.58 (m, 52 H, DMTr-H (I+II), Har (I+II)), 6.29-
6.19 (m, 2H, H1´(I+II)), 5.76, 5.37 (2 * s, 2 * 2H, NH(I+II)), 5.04-5.01 (m, 2H, H3´(I+II)),
4.60-4.50 (m, 4H, Ha (I+II)), 4.13-4.08 (m, 2H, H4´(I+II)), 3.52-3.17 (m, 20H, OCH3
(I+II), Hb (I+II), H5´(I+II)), 2.98-2.93 (m, 1H, H2´a (I)), 2.89-2.84 (m, 1H, H2´a (II)),
2.71-2.68 (m, 8H, iPr-H(I+II)+α(I+II)), 2.56-2.48 (m, 1H, H2´b(I)), 2.41-2.34 (m, 1H,
H2´b(II)), 1.73-1.67 (m, 4H, ß(I+II)), 1.13-1.05 (m, 24H, CH3iPr (I+II)). - 13C-NMR: δ
[ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.1, 155.6, 153.2, 144.1, 139.7, 135.6, 134.6, 130.0,
127.8, 122.3, 118.8, 116.2, 109.1, 87.6, 83.1, 70.8, 65.8, 61.7, 39.7, 34.4. - 31P-NMR:
δ [ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 149.87, 149.09. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling):
3744, 3675, 2966, 1607, 1457, 1200, 1077, 978. - MS (FAB, m/z): ber.: 1065.4666,
gef.: 1066.6 [M+H]+.
N
N
N
O
NH
N
ODMTrO
HN
CN
1491'
2'3'
4'
5'
1
34 2
567
8
9
a
b c
d
ef
O
P
AB
C
DE
H
G
F
ONCN
α
β
Experimentalteil
Synthese von 3’-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N’-diisopropylamino)-phosphinyl)]-O6-2-(4-
Cyanophenyl)ethyl-O-5´-dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 151
Die Synthese wurde nach AAV 11
durchgeführt. Es wurden 163 mg (0.19
mmol) O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-O-5´-
dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 147 eingesetzt.
243
Ausbeute: 70 mg (66 µmol, 35%) eines
orangenen Feststoffes, welcher als
Diastereomerengemisch (I+II) vorliegt. -
Smp.: 63-65 °C. - DC: Rf-Wert
(DCM/MeOH: 9:1): 0.85. - [α]20546: -13 ° (c=
0.4, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,
Benzol-d6): 7.88 (s, 1H, H8 (I)), 7.86 (s, 1H, H8 (II)), 7.62-6.58 (m, 59 H, DMTr-H (I+II),
Har (I+II)), 6.29-6.19 (m, 2H, H1´(I+II)), 5.04-5.01 (m, 2H, H3´(I+II)), 4.60-4.50 (m, 4H,
Ha (I+II)), 4.13-4.08 (m, 2H, H4´(I+II)), 3.52-3.17 (m, 20H, OCH3 (I+II), Hb (I+II),
H5´(I+II)), 2.98-2.93 (m, 1H, H2´a (I)), 2.89-2.84 (m, 1H, H2´a (II)), 2.71-2.68 (m, 8H,
iPr-H(I+II)+α(I+II)), 2.56-2.48 (m, 1H, H2´b(I)), 2.41-2.34 (m, 1H, H2´b(II)), 1.73-1.67
(m, 4H, ß(I+II)), 1.13-1.05 (m, 24H, CH3iPr (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
Benzol-d6): 159.1, 155.6, 153.2, 144.1, 139.7, 135.6, 134.6, 130.0, 127.8, 122.3,
118.8, 116.2, 109.1, 87.6, 83.1, 70.8, 65.8, 61.7, 39.7, 34.4. - 31P-NMR: δ [ppm] (162
MHz, Benzol-d6): 149.29, 149.08. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3821, 3675,
3447, 2966, 1734, 1700, 1653, 1507, 1363, 1179, 1033, 829. - MS (FAB, m/z): ber.:
1063.4510, gef.: 1064.7 [M+H]+.
N
N
N
O
NN
ODMTrO
N
CN
1511'
2'3'
4'
5'
1
34 2
567
8
9
a
b c
d
ef
O
P
AB
C
DE
H
G
F
ONCN
α
β
Experimentalteil
Synthese von N-Phenylhydroxylamin 155 In einem 500 mL Kolben wurden 24.1 (0.45 mol) Ammoniumchlorid in
240 mL dest. Wasser gelöst und 12.55 mL (97.88 mmol) Nitrobenzol 156
dazugegeben. Anschließend wurde der Reaktionsansatz auf 60°C
erhitzt und über einen Zeitraum von 20 min sukzessive mit 17.7 g
(270 mmol) Zink versetzt. Nach der Zugabe wurde die noch heiße Lösung filtriert und
der Rückstand mit 200 mL dest. Wasser (90°C) gewaschen. Das Filtrat wurde mit 200
g (3.42 mol) Natriumchlorid gesättigt und über Nacht im Kühlschrank gelagert. Der
entstandene Niederschlag wurde filtriert und in Diethylether aufgenommen und über
Natriumsulfat getrocknet. Schließlich wurde das Lösungsmittel unter vermindertem
Druck entfernt und ein leuchtend gelber, kristalliner Feststoff erhalten.
3
41
2
NHOH
155
Ausbeute: 4.6 g (42 mmol, 43%) eines gelben kristallinen Feststoffs. – DC: Rf-Wert
(DCM/Methanol 9:1): 0.61. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.32 (d, 1H, 3JH,H= 2.2 Hz, NH), 8.25 (bs, 1H, OH), 7.19 (dd, 2H, 3JH,H= 7.4 Hz, 3JH,H= 8.4 Hz, H-3),
6.87 (d, 1H, 3JH,H= 7.9 Hz, H-2), 6.78 (t, 1H, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 7.3 Hz, H-4). - 13C-
NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 152.0 (C-1), 128.7 (C-3), 119.2 (C-4), 113.0 (C-
2). Weitere Analytik konnte aufgrund der Instabilität des Produktes nicht durchgeführt
werden.
Synthese von N-Phenylbenzohydroxamsäure 159 Es wurden 3.18 g (29.1 mmol) N-Phenylhydroxylamin 155 in 25 mL
Diethylether gelöst und mit 2.2 g (40 mmol)
Natriumhydrogencarbonat in 50 mL Wasser versetzt und auf 0°C
gekühlt. Über einen Zeitraum von 20 Minuten wurden 2.9 mL (25.1
mmol) Benzoylchlorid, gelöst in 12.5 mL Diethylether hinzugegeben,
wobei die Temperatur 5 °C nicht überstieg. Nach anschließender 3stündigem Rühren
wurde das Produkt filtriert und getrocknet.
NOH
O
a
b
cd
a'b'
c'
d'
159
Ausbeute: 4.24 g (19.8 mmol, 68%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert
(Petrolether/Ethylacetat 1:1 v/v): 0.36. - Schmelzpunkt: 117 °C. - [α]20546: + 2 ° (c = 0.1,
CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.70 (s, 1H, OH), 7.62-7.64 (m, 2H,
H-b’), 7.55-7.57 (m, 2H, H-b), 7.35-7.46 (m, 5H, H-c’, H-c, H-d’), 7.18-7.22 (m, 1H, H-
244
Experimentalteil
d). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 167.8 (quart. Bz-C), 141.9 (Ca’), 135.4
(Ca), 130.1 (Cd’), 128.4 (Cb’), 128.2 (Cc’), 127.7 (Cc), 125.5 (Cd), 122.1 (Cb). - IR:
Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3131, 1921, 1578, 1495, 1322, 1221, 1181, 1075, 1025, 844.
- MS (FAB, m/z): ber.: 213.0790, gef.: 214.0887 (M+H+).
Synthese von N-Benzyl-N-phenylhydroxylamin 158 Unter Stickstoffgasatmosphäre wurden 2.00 g (18.3 mmol) 155 in
einen 50 mL Kolben eingewogen und in 4 mL abs. Pyridin gelöst.
Dann wurden unter Lichtausschluss 2.00 mL (2.43 g; 19.3 mmol)
Benzylchlorid hinzugegeben und die gelbe Lösung bei RT für 19 h
gerührt. Die nun orange-gelbe Lösung wurde auf 50 °C erhitzt
und anschließend auf 0 °C gekühlt. Dann wurden 4 mL 2N Salzsäure (kalt)
hinzugegeben. Nach Zugabe von Diethylether wurden die Phasen getrennt und die
wässrige Phase dreimal mit Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet. Schließlich wurde das Lösungsmittel
unter vermindertem Druck entfernt und der gelbe Feststoff im Hochvakuum
getrocknet. Die Reinigung des Rohproduktes erfolgte am Chromatotron mittels DCM
als Eluent.
4
3 2
1 NOH
5 69
87
158
Ausbeute: 771 mg (3.87 mmol, 21%) eines gelben kristallinen Feststoffs. – DC: Rf-
Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.84. – Smp.: 66-69 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,
DMSO-d6): 8.83 (s, 1H, OH), 7.39 (d, 2H, 3JH,H= 7.1 Hz, H-7), 7.30-7.33 (m, 2H, H-8),
7.20-7.26 (m, 3H, H-3 und H-9), 7.11-7.14 (m, 2H, H-2), 6.84 (t, 1H, 3JH,H= 7.2 Hz,
3JH,H= 7.2 Hz, H-4), 4.44 (s, 2H, H-5). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 153.8
(C-1), 138.4 (C-6), 128.4 (C-7), 128.0 (C-3) 127.6 (C-8), 126.5 (C-9), 119.6 (C-4),
114.7 (C-2), 62.1 (C-9). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3059, 2888, 1700,
1696, 1635, 1506, 1487, 1387, 1295, 1190, 1027, 892, 693, 572. - MS (FAB, m/z):
ber.: 199.0997, gef.: 199.0994 [M].
245
Experimentalteil
Synthese von N-Acetyl-phenylhydroxamsäure 157
In einen 100 mL Kolben wurden unter Inertgasatmosphäre 2.00 g
(18.3 mmol) 155 und 1.7 g (20 mmol) Natriumhydrogencarbonat
eingewogen und mit 20 mL abs. Diethylether versetzt. Anschließend
wurde die Suspension mit Hilfe eines Eisbades auf 0 °C gekühlt und 1.50 mL (1.65 g,
210 mmol) Acetylchlorid hinzugegeben, dabei trat eine Entfärbung der Lösung auf und
die Lösung wurde trübe. Schließlich wurde bei RT für 40 h gerührt. Nach beendeter
Reaktion wurde die Suspension filtriert und mit dest. Wasser ausgeschüttelt. Dann
wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit Diethylether
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet
und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Nach Trocknung im
Hochvakuum wurde das Rohprodukt (gelbes Öl) am Chromatotron mit DCM als Eluent
gereinigt.
3
41
2
NOH
5
O6
157
Ausbeute: 1.65 g (10.9 mmol, 60%) eines braunen, viskosen Öls. – DC: Rf-Wert
(DCM/Methanol 9:1): 0.63. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.62 (s, 1H,
OH), 7.61 (d, 2H, 3JH,H= 7.9 Hz, H-2), 7.34-7.38 (m, 2H, H-3), 7.14 (t, 1H, 3JH,H= 7.3
Hz, 3JH,H= 7.3 Hz, H-4), 2.20 (s, 3H, H-6). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6):
170.1 (C-5), 142.0 (C-1), 128.7 (C-3), 123.3 (C-4), 119.3 (C-2), 22.8 (C-6). - IR:
Wellenzahl [cm-1]: 2901, 1641, 1593, 1545, 1308, 1177, 1101, 1034, 907, 691. - MS
(FAB, m/z): ber.: 151.0633, gef.: 152.0712 [M+H]+.
Versuche zur Darstellung von N-Acetyl-N-(3´5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-
desoxyguanosin-O6-yl)-phenylamin 154 mittels Mitsunobu-Reaktion:
246
Versuch Nr. 1
Zu einer Lösung aus 100 mg (0.2 mmol) 121, 53 mg
(0.1 mmol) Triphenylphosphin, 35 mg (0.2 mmol) 157
und 8 mL abs. THF wurden und 39 µL (0.2 µmol) DIAD
hinzugefügt. Nachdem die Lösung 16 Stunden bei RT
gerührt wurde, wurde das Lösungsmittel unter
vermindertem Druck entfernt und das erhaltene
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
154
NAca
b
cd
Experimentalteil
Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit
einem Methanolgradienten (0 - 25%). Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten
werden.
Versuch Nr. 2
Zu einer Lösung aus 100 mg (0.2 mmol) 121, 53 mg
(0.1 mmol) Triphenylphosphin und 8 mL abs. THF
wurden 35 mg (0.2 mmol) 157, 14 mg (0.2 mmol)
Imidazol und 39 µL (0.2 µmol) DIAD hinzugefügt.
Nachdem die Lösung 16 Stunden bei RT gerührt
wurde, wurde das Lösungsmittel unter vermindertem
Druck entfernt und das erhaltene Rohprodukt
säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente
Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 -
25%). Das gewünschte Produkt konnte nicht isoliert werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
154
NAca
b
cd
Versuch Nr. 3
Für diesen Versuch wurden zwei verschiedene
Reaktionslösungen angefertigt.
Für die Reaktionslösung I wurden zu einer Lösung aus
79 mg (0.3 mmol) Triphenylphosphin und 5 mL
Acetonitril bei einer Temperatur von 0 °C 54 µL (0.3
µmol) DIAD hinzugefügt. Diese Lösung wurde
anschließend noch 30 Minuten bei 0 °C gerührt um
anschließend bei -40 °C zu der Lösung II
hinzugegeben zu werden, welche sich aus 100 mg
(0.2 mmol) 121, 15 mg (0.1 mmol) 157 und 5 mL abs.
Acetonitril zusammensetzte. Die gesamte Lösung wurde dann für weitere 20 Stunden
bei RT gerührt und schließlich unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit.
Die säulenchromatographische Reinigung erfolgte zunächst mit Petrolether und
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
154
NAca
b
cd
247
Experimentalteil
Ethylacetat in einem Verhältnis von 2:1 und endete mit Dichlormethan mit einem
Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent. Das gewünschte Produkt konnte nicht
erhalten werden.
Versuch Nr. 4
Für diesen Versuch wurden zwei verschiedene
Reaktionslösungen angefertigt.
Für die Reaktionslösung I wurden zu einer Lösung aus
79 mg (0.3 mmol) Triphenylphosphin und 5 mL
Acetonitril bei einer Temperatur von 0 °C 54 µL (0.3
µmol) DIAD hinzugefügt. Diese Lösung wurde
anschließend noch 30 Minuten bei 0 °C gerührt um
anschließend bei - 40 °C zu der Lösung II
hinzugegeben zu werden, welche sich aus 50 mg (0.1
mmol) 121, 30 mg (0.2 mmol) 157 und 5 mL abs.
Acetonitril zusammensetzte. Die gesamte Lösung wurde dann ebenfalls für 20
Stunden bei RT gerührt und schließlich unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel
befreit. Die säulenchromatographische Reinigung erfolgte zunächst mit Petrolether
und Ethylacetat in einem Verhältnis von 2:1 und endete mit Dichlormethan mit einem
Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent. Das gewünschte Produkt wurde nicht
erhalten.
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
248
Versuch Nr. 5
Eine Lösung aus 100 mg (0.2 mmol) 121, 8 mL abs.
Dichlormethan, 150 mg (1 mmol) 157 und 262 mg (1
mmol) Triphenylphosphin wurde zunächst für 30
Minuten gerührt bevor die Zugabe von 193 µL (1
mmol) DIAD und 68 mg (1 mmol) Imidazol erfolgte.
Die Lösung wurde dann 20 Stunden bei RT gerührt
und anschließend unter vermindertem Druck vom
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
154
NAca
b
cd
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
154
NAca
b
cd
Experimentalteil
Lösungsmittel befreit. Die säulenchromatographische Reinigung erfolgte auch hier
zunächst mit Petrolether und Ethylacetat in einem Verhältnis von 2:1 und endete mit
Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent. Das gewünschte
Produkt konnte nicht erhalten werden.
Synthese von 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin 165
Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um
Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen.
Es wurden 8.0 g (30 mmol) 2’-Desoxyguanosin-
Monohydrat 52 zweimal mit je 40 mL absolutem Pyridin
coevaporiert und anschließend in 400 mL absolutem
Acetonitril suspendiert. Nach Zugabe von 330 mg (1.2
mmol) DMAP, 10 mL (14.4 mmol) Triethylamin und 7.0
mL (72 mmol) Essigsäureanhydrid wurde für 20 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Nach Zugabe von 5 mL Methanol, Filtration und Waschen mit Ethanol und
Diethylether wurde das Produkt erhalten.
NH
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
165
Insgesamt konnten 10.3 g (29.3 mmol, 98%) eines farblosen Farbstoffes erhalten
werden. – DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.64. - Smp: 235 °C. -
[α]20546: + 16 ° (c = 0.67, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.66 (s,
1H, NH), 7.91 (s, 1H, H8), 6.49 (s, 2H, NH2), 6.13 (dd, 3JHH = 5.8 Hz, 3JHH = 8.7 Hz,
1H, H1’), 5.29 (ddd, 3JHH = 1.9 Hz, 3JHH = 4.2 Hz, 1H, H3’), 4.15-4.20 (m, 3H, H4’,
H5’a, H5’b), 2.91 (m, 1H, H2a’), 2.44 (m, 1H, H2b’), 2.07 (s, 3H, Ac-CH3), 2.03 (s, 3H,
Ac-CH3). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.1 (quart. Ac-C), 169.9
(quart.Ac-C), 156.6 (C6), 153.7 (C2), 151.1 (C4), 135.1 (C8), 116.7 (C5), 82.5 (C1’),
81.4 (C4’), 74.4 (C3’), 63.5 (C5’), 35.4 (C2’), 20.7 (Ac-CH3), 20.5 (Ac-CH3). - IR:
Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3177, 1743, 1685, 1634, 1228, 1081, 844. - MS (FAB, m/z):
ber.: 351.1179, gef.: 352.1238 (M+H+).
249
Experimentalteil
Synthese von 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-desoxyribosylpurin 166
Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um Sauerstoff
und Feuchtigkeit auszuschließen.
Es wurden 7.0 g (20 mmol) 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin
165 und 9.8 g (59 mmol) vorgetrocknetes (2 d bei 120 °C im
vakuumierten Exsikkator über Phosphorpentoxid)
Tetraethylammoniumchlorid in 70 mL absolutem Acetonitril
gelöst und mit 2.8 mL (20 mmol) destilliertem N,N-
Dimethylanilin und 9.8 mL (20 mmol) Phosphorylchlorid versetzt. Die Lösung wurde
anschließend zehn Minuten mit einem vorgewärmten Ölbad unter Rückfluss gerührt,
bevor die flüchtigen Komponenten im Vakuum entfernt wurden und der ölige
Rückstand in Chloroform und Eis aufgenommen wurde. Nach 15minütigem Rühren
wurde die wässrige Phase fünfmal mit Chloroform extrahiert, bevor die vereinigten
organischen Phasen zunächst dreimal mit kaltem Wasser, einmal mit 5%iger
Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, anschließend über Magnesiumsulfat
getrocknet und vom Lösungsmittel befreit wurden. Eine chromatographischen
Reinigung mit Dichlormethan: Methanol (0 - 25%) lieferte das gewünschte Produkt.
N
N
N
Cl
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
166
Insgesamt konnten 5.18 g (22.1 mmol; 70%) eines farblosen Feststoffs erhalten
werden. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.57. - Smp: 71 °C. - [α]20546:
- 5 ° (c = 0.2, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.34 (s, 1H, H8), 7.00
(s, 2H, NH2), 6.24 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 8.2 Hz, 1H, H1’), 5.33 (m, 1H, H3’), 4.18-
4.29 (m, 3H, H4’, H5’a, H5’b), 3.03 (ddd, 3JHH = 6.5 Hz, 3JHH = 8.3 Hz, 2JHH = 14.4 Hz,
1H, H2a’), 2.50-2.55 (m, 1H, H2b’), 2.08 (s, 3H, Ac-CH3), 2.01 (s, 3H, Ac-CH3). - 13C-
NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.1 (quart. Ac-C), 169.9 (quart.Ac-C), 159.7
(C6), 153.7 (C2), 159.6 (C4), 130.7 (C8), 123.5 (C5), 83.0 (C1’), 81.6 (C4’), 74.3 (C3’),
63.5 (C5’), 35.1 (C2’), 20.7 (Ac-CH3), 20.5 (Ac-CH3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):
3367, 1742, 1616, 1560, 1230, 1100, 909. - MS (FAB, m/z): ber.: 369.0840, gef.:
370.0908 (M+H+).
250
Experimentalteil
Versuch zur Synthese von O6-N-(Phenylamino)-3’,5’-O-acetyl-2’-desoxyguanosin 167
Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um
Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen.
Es wurden 100 mg (0.27 mmol) 6-Chlor-3’,5’-O-
acetyl-2’-iso-desoxyadenosin 166 und 100 mg (0.95
mmol) Phenylhydroxylamin in 12 mL abs. Ethanol
vorgelegt und bei 80 °C für 15 h gerührt. Nach
Filtration des entstandenen Niederschlags, Einengen
und chromatographischer Reinigung (Petrolether
/Essigsäureethylester 10-50%) konnte ein
gekuppeltes Produkt erhalten werden, welches jedoch nicht mit der Hydroxylgruppe
substituiert wurde, sondern mit der NH-Funktion. Desweiteren konnte die Abspaltung
der OH-Gruppe (als Wasser) beobachtet werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NHa
b
cd
Versuche der Darstellung von N-Benzyl-N-(3´5´-diacetyldesoxyguanosin-O6-yl)-
phenylamin 167 mittels Substitution:
Versuch Nr.1
Zunächst wurden 100 mg (0.3 mmol) 166 und 700 mg (3.5 mmol) 158 mit 12 mL Ethanol versetzt, 0.1 mL (0.7
mmol) Triethylamin und eine Spatelspitze DMAP
hinzugefügt und die Lösung dann 20 Stunden bei 80 °C
gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel unter
vermindertem Druck entfernt und das erhaltene
Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als
Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradienten (0 - 25%).
251
Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NBna
b
cd
Experimentalteil
Versuch Nr. 2
Einer Lösung aus 100 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.5
mmol) 158 und 12 mL abs. THF wurden 24 mg (1 mmol)
Natriumhydrid hinzugefügt. Die Lösung wurde dann 20
Stunden bei 80 °C gerührt. Nach Zugabe von Wasser und
Dichlormethan wurden die Phasen getrennt, und die
organische Phase dreimal mit Wasser extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden über
Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck
vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde
säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dic
Methanolgradienten (0 - 25%).
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NBna
b
cd
hlormethan mit einem
Das gewünschte Produkt wurde nicht erhalten.
Versuch Nr. 3
Zunächst wurde eine Lösung aus 100 mg (0.5 mmol) 166,
24 mg (1 mmol) Natriumhydrid und 12 mL abs. THF zwei
Stunden bei RT gerührt. Anschließend wurden 100 mg (0.3
mmol) 158 hinzugefügt und die Lösung 20 Stunden bei 80
°C gerührt. Nach Zugabe von Wasser und Dichlormethan
wurden die Phasen getrennt, und die organische Phase
dreimal mit Wasser extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter
vermindertem Druck wurden flüchtige Komponenten
entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt, wobei
Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent diente.
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NBna
b
cd
Das gewünschte Produkt konnte nicht isoliert werden.
252
Experimentalteil
Versuch Nr. 4
253
Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3
mmol) 158 und 12 mL abs. Ethanol ca. 70 Stunden bei 80
°C gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel unter
vermindertem Druck entfernt und das erhaltene
Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent
diente Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 -
25%).
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NBna
b
cd
Das gewünschte Produkt wurde nicht erhalten.
Versuch Nr. 5
Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3
mmol) 158 und 12 mL abs. Pyridin ca. 70 Stunden bei 80
°C gerührt. Die erhaltene schwarze Lösung wurde
verworfen, da eine Zersetzung der Edukte dünnschicht-
chromatographisch beobachtet wurde.
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NBna
b
cd
Versuch Nr. 6
Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3
mmol) 158 und 12 mL abs. Pyridin ca. 70 Stunden bei
RT gerührt. Die erhaltene schwarze Lösung wurde
verworfen, da eine Zersetzung der Edukte
dünnschichtchromatographisch beobachtet wurde.
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NBna
b
cd
Experimentalteil
Versuch Nr. 7
Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3
mmol) 158 und 12 mL abs. Ethanol ca. 70 Stunden bei RT
gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel unter
vermindertem Druck entfernt und das erhaltene
Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent
diente Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 -
25%). Es wurden die Edukte reisoliert.
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NBna
b
cd
Versuch Nr. 8
Es wurde eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg
(0.3 mmol) 158 und 12 mL Formamid ca. 40 Stunden bei
100 °C gerührt. Nach Zugabe von Wasser und Diethylether
wurden die Phasen getrennt, und die organische Phase
dreimal mit Wasser extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter
vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der
Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als
Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradienten (0 - 25%).
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
254
Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten werden
Versuch Nr. 9
Zu eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3
mmol) 158 und 12 mL abs. DME wurden 80 mg (0.6 mmol)
Kaliumcarbonat hinzugefügt. Die Lösung wurde ca. 40
Stunden bei 100 °C gerührt und da bei der
dünnschichtchromatographischen Überprüfung keine
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NBna
b
cd
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NBna
b
cd
Experimentalteil
Umsetzung der Edukte beobachtet werden konnte, wurde die Lösung dann verworfen.
Versuche zur Darstellung von N-Acetyl-N-(3´5´-diacetyl-2´-desoxyguanosin-O6-yl)-
phenylamin 167 mittels Substitution:
Versuch Nr. 1
255
Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3
mmol) 157 und 12 mL abs. Ethanol für 3 Tage bei 80 °C
gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel unter
vermindertem Druck entfernt und das erhaltene
Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als
Eluent diente Dichlormethan mit einem
Methanolgradienten (0 - 25%). Das gewünschte Produkt
konnte nicht erhalten werden.
Versuch Nr. 2
Zu einer Lösung aus 100 mg (0.3 mmol) 166, 30 µL (0.4
µmol) abs. Pyridin und 12 mL abs. Ethanol wurden 50
mg (0.3 mmol) 157 hinzugefügt. Die Lösung wurde für 3
Tage bei 80 °C gerührt. Anschließend wurde das
Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und
eine säulenchromatographische Reinigung mit
Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%)
als Eluent durchgeführt. Das gewünschte Produkt wurde
nicht erhalten.
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NAca
b
cd
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NAca
b
cd
Experimentalteil
Versuch Nr. 3
Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3
mmol) 157, 55 µL (0.3 µmol) DIPEA und 12 mL abs.
Ethanol für 3 Tage bei 80 °C gerührt. Danach wurde das
Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das erhaltene
Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent
diente Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 -
25%). Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten
werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NAca
b
cd
Versuch Nr. 4
256
Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3
mmol) 157 und 12 mL abs. Ethanol 16 Stunden bei 80 °C
gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel unter
vermindertem Druck entfernt und das erhaltene
Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent
diente Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 -
25%). Das gewünschte Produkt wurde jedoch nicht
erhalten.
N
N
N
O
NH2N
O
OAc
AcO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
167
NAca
b
cd
Synthese von 6-Chlor-2’-iso-desoxyadenosin 168
N
N
N
Cl
NH2N
O
OH
HO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
168
In ein Gemisch aus 11.5 mL Triethylamin (82.9 mmol), 4.5
mL Wasser (254 mmol) und 23.6 mL Methanol (580 mmol)
wurden 1.8 g 166 (4.9 mmol) gegeben und bei RT für 3
Stunden gerührt.
Danach wurde das Produkt unter vermindertem Druck vom
Lösungsmittel befreit. Insgesamt konnten 1.4 g (4.9 mmol, 99%) eines farblosen
Feststoffs erhalten werden. – Smp.: 113.4 °C. -DC: Rf-Wert (DCM/MeOH 9:1) = 0.77.
Experimentalteil
– [α]20546: + 17 ° (c = 0.3, MeOH/CH2Cl2). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):
8.33 (s, 1H, H8), 6.93 (s, 2H, NH2), 6.21 (t, 3JHH = 7.1 Hz, 1H, H1’), 5.29 (s, 1H, H3’),
4.93 (s, 1H, NH), 4.37 (t, , 3JHH = 2.6 Hz, 1H, H-3´), 4.08 (s, 2H, H5´a+b), 3.83 (dd, 3JHH = 4.5 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H-4´), 3.54 (ddd, 3JHH = 4.6 Hz, 3JHH = 7.2 Hz, 2JHH =
11.7 Hz, 1H, H-2a´), 2.64-2.58 (m, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-
d6): 159.7 (C-2), 153.6 (C-6), 149.4 (C-4), 141.0 (C-8), 123.5 (C-5), 87.7 (C-4), 83.0
(C-1´), 70.5 (C-4´), 61.5 (C-3´), 48.6 (C-5´), 45.7 (C-2´). – MS (EI, m/z): ber.:
285.0629, gef.: 285 [M]. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2955, 1613, 1472,
1258, 1110.
Synthese von 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxy-
ribosylpurin 169 Zu einer Lösung aus 1.4 g (4.9 mmol) 168 und 15 mL
Pyridin wurden 2 g (29 mmol) Imidazol und 2.3 g (15.2
mmol) TBDMS-Cl-Lösung hinzugegeben und 16
Stunden bei RT gerührt. Abschließend wurde das
Produkt unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel
befreit und säulenchromatographisch gereinigt
(DCM/MeOH; 0% - 25%).
N
N
N
Cl
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
169Insgesamt konnten 2.3 g (4.5 mmol, 90%) eines hellgelben Feststoffs erhalten
werden. – Smp.: 51.0 °C. -DC: Rf-Wert (DCM/MeOH 9:1) = 0.87. – [α]20546: - 35 ° (c =
0.5, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.28 (s, 1H, H8), 6.94 (s, 2H,
NH2), 6.20 (t, 3JH,H= 6.7 Hz, 1H, H1´), 4.51 (ddd, 3JH,H= 2.7 Hz, 3JH,H= 3.4 Hz, 3JH,H=
5.3 Hz, 1H, H3´), 3.84-3.81 (m, 1H, H4´), 3.71 (dd, 2JH,H= 16.8 Hz, 3JH,H= 5.7 Hz, 1H,
H5´a), 3.63 (dd, 2JH,H= 15.6 Hz, 3JH,H= 4.47 Hz, 1H, H5´b), 2.79-2.72 (m, 1H, H2´a),
2.31-2.25 (m, 1H, H2´b), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.84 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an
H5´), 0.10 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.02, 0.01 (2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm]
(101 MHz, DMSO-d6): 159.8 (C6), 153.7 (C2), 149.5 (C4), 123.6 (C5), 135.1 (C8),
87.1 (C4´), 82.7 (C3´), 71.9 (C1´), 62.6 (C5´), 38.6 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 25.6
(SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), 17.6 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.5 (Si(CH3)2). – MS (EI, m/z):
ber.: 513.2358, gef.: 513 [M]. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2927, 1613,
1373, 1093.
257
Experimentalteil
Versuche der Darstellung von N-Benzyl-N-(3´5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-
desoxyguanosin-O6-yl)-phenylamin 170 mittels Substitution:
Versuch Nr. 1
258
Eine Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg (0.03
mmol) 158 und 1.2 mL abs. Ethanol wurde 16
Stunden bei 80 °C gerührt. Nach Entfernung des
Lösungsmittels unter vermindertem Druck, folgte eine
säulenchromatographische Reinigung mit
Dichlormethan mit einem Methanol-Gradienten
(0 - 25%) als Eluent.
Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten
werden.
Versuch Nr. 2
Zu einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg
(0.03 mmol) 158 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 8 mg
(0.06 mmol) Kaliumcarbonat hinzugefügt. Die Lösung
wurde 16 Stunden bei 80 °C gerührt. Anschließend
wurde das Rohprodukt säulenchromatographisch
gereinigt, wobei Dichlormethan mit einem Methanol-
Gradienten (0 - 25%) als Eluent diente.
Das gewünschte Produkt wurde nicht erhalten.
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
170
NBna
b
cd
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
170
NBna
b
cd
Experimentalteil
Versuch Nr. 3
Einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg (0.03
mmol) 158 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 5.50 µL
(0.03 mmol) DIPEA hinzugefügt. Die Lösung wurde
anschließend 16 h bei 80 °C gerührt, bei vermindertem
Druck vom Lösungsmittel befreit und das erhaltene
Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt, wobei
Dichlormethan mit einem Methanol-Gradienten (0 -
25%) als Eluent diente.
Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten
werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
170
NBna
b
cd
Versuch Nr. 4
259
Zu einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg
(0.03 mmol) 158 und 1.2 mL abs. Dimethylsulfoxid
wurden 5.50 µL (0.03 mmol) DIPEA hinzugefügt bevor
diese 16 Stunden bei 80 °C gerührt wurde. Nach
Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem
Druck konnte das gewünschte Produkt jedoch nicht
erhalten werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
170
NBna
b
cd
Experimentalteil
Versuche zur Darstellung von N-Acetyl-N-(3´5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-
desoxyguanosin-O6-yl)-phenylamin 170 mittels Substitution:
260
Versuch Nr. 1
Eine Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg (0.03
mmol) 157 und 1.2 mL abs. Ethanol wurde 16
Stunden bei 80 °C gerührt. Bei dieser Reaktion
erfolgte keine Umsetzung. Die Edukte konnte
reisoliert werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
170
NAca
b
cd
Versuch Nr. 2
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
170
NAca
b
cd
Zu einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg
(0.03 mmol) 157 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 8 mg
(0.06 mmol) Kaliumcarbonat hinzugefügt. Die Lösung
wurde 16 Stunden bei 80 °C gerührt. Bei dieser
Reaktion konnte keine Umsetzung beobachtet werden.
Versuch Nr. 3
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
170
NAca
b
cd
Einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg
(0.03 mmol) 157 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 5.5
µL (0.03 µmol) DIPEA hinzugefügt. Die Lösung
wurde anschließend 16 h bei 80 °C gerührt. Bei
dieser Reaktion erfolgte keine Umsetzung.
Experimentalteil
Versuch Nr. 4
261
Zu einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg
(0.03 mmol) 157 und 1.2 mL abs. Dimethylsulfoxid
wurden 5.5 µL (0.03 µmol) DIPEA hinzugefügt bevor
diese 16 Stunden bei 80 °C gerührt wurde. Eine
Umsetzung konnte bei dieser Reaktion nicht
beobachtet werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
170
NAca
b
cd
Synthese von N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoylchlorid 172
Es wurden 34.5 g (132 mmol) PPh3, 7.3 mL (53 mmol) Triethylamin
in 21.1 mL (220 mmol) Tetrachlorkohlenstoff vorgelegt und unter
Eiskühlung mit 3.4 mL (44 mmol) Trifluoressigsäure 171 versetzt
und für 10 min. gerührt. Nach anschließender Zugabe von 6.3 mL
(53 mmol) Anilin 1, gelöst in 21.1 mL Tetrachlorkohlenstoff, wurde die Lösung für 20 h
refluxiert. Nach Einengen der Lösung wurde der Rückstand in Hexan aufgenommen
und filtriert. Der Niederschlag wurde mehrmals mit Hexan gewaschen. Nach dem
Einengen des Filtrats wurde der Rückstand im Vakuum destilliert. Die
Übergangstemperatur betrug 33 °C (Ölpumpenvakuum).
N
Cl
FF
F172
EA
B
C
D
Ausbeute: 2.04 g (9.82 mmol, 22%) einer farblosen Flüssigkeit - 1H-NMR: δ [ppm] (400
MHz, CDCl3): 7.44 (t, 3JH,H= 7.86 Hz, 3JH,H= 7.86 Hz, 2H, HC), 7.30 (t, 3JH,H= 7.48 Hz, 3JH,H= 7.48 Hz, 1H, HD), 7.10 dd, 3JH,H= 8.46 Hz, 4JH,H= 1.09 Hz, 2H, HB). - 13C-NMR:
δ [ppm] (101 MHz, CDCl3 ): 143.6 (CA), 129.3 (CC), 127.5 (CE), 120.8 (CB), 118.3
(CF3), 115.6. - 19F-NMR: δ [ppm] (188 MHz, CDCl3 ): - 76. - IR: Wellenzahl [cm-1]
(NaCl): 3071, 1696, 1489, 1287, 1222, 1162, 947, 827, 764, 691. - MS (FAB, m/z):
ber.: 207.0063, gef.: 207.0063 (M+H+).
Experimentalteil
Synthese von O6-N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-
2’-desoxyguanosin 173
.
262
DMSO
N
FF
F
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 1.4 g (2.8 mmol)
TBDMS-dG 121 in 56 mL abs. Dichlormethan gelöst.
Es wurden 1.3 g (0.4 mmol) N-Phenyl-2,2,2-
trifluoracetimidoyl-chlorid, 0.78 mL (4.8 mmol) abs.
Triethylamin sowie eine Spatelspitze
Dimethylaminopyridin hinzugegeben. Die Lösung wurde
über Nacht gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte
mittels DC in DCM/MeOH 9:1. Das Lösungsmittel
wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zweimal mit Hilfe des
Chromatotron gereinigt. Zunächst mit DCM als Eluenten und bei zweiten Durchlauf mit
PE mit einem Ethylacetatgradienten von 0-10%.
TBO
N
N
N
N
O
NH2
OTBDMS
1731'
2'3'
4'
5'
1
2
34
5 6
10
8
A
B
C
D
Ausbeute: 750 mg (1.13 mmol, 40%) eines hellgelben klebrigen Öls. -[α]20546: -93°
(c=0.025, CHCl3)- 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.19 (s, 1H, H8), 7.31-7.27
(m, 2H, HC), 7.17-7.11 (m, 3H, HB, HD), 6.77 (bs, 2H, NH2), 6.15 (dd, 3JH,H= 6.6 Hz, 3JH,H= 6.6 Hz, 1H, H1´), 4.52-4.49 (m, 1H, H3´), 3.81 (dd, , 3JH,H= 7.8 Hz, 3JH,H= 5.1
Hz, 1H, H4´), 3.71-3.61 (m, 2H, H5´), 2.75-2.70 (m, 1H, H2´a), 2.26 (ddd, 2JH,H= 13.1
Hz, 3JH,H= 6.1 Hz, 3JH,H= 3.7 Hz, 1H, H2´b), 0.88 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.84 (s,
9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.09 (s, 6H, Si(CH3)2 an C5’), 0.01 (s, 3H, Si(CH3) an C3’),
0.00 (s, 3H, Si(CH3) an C3’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6 ): 159.2 (C6),
155.8 (C2), 155.7 (C10), 143.6 (C8), 139.9 (C4), 129.4 (C5), 129.3 (CC), 128.9
(CA),126.9 (CD), 121.5 (CB), 118.9 (CF3), 87.0 (C4´), 82.8 (C1´), 72.0 (C3´), 62.5
(C5´), 39.9 (C2´), 25.6 ( SiC(CH3)3), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), 17.6
(SiC(CH3)3), -5.5, -5.6 (SiC(CH3)2). - 19F-NMR: δ [ppm] (188 MHz, CDCl3 ): - 58. - IR:
Wellenzahl [cm-1] (NaCl): 3853, 3821, 3801, 3752, 3744, 3675, 3628, 3339, 2930,
2857, 2359, 1718, 1684, 1653, 1635, 1576, 1507, 1472, 1405, 1323, 1205, 1068, 836,
779, 668. - MS (FAB, m/z): ber.: 666.2993, gef.: 667.3071 (M+H+).
Experimentalteil
Versuch der Darstellung von O6-(N-Phenylacetamido)-3’,5’-bis-O-(tert-
butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 170
Unter Stickstoffatmosphäre wurden in einen
100 mL Kolben 1 g aktiviertes Molsieb gegeben. Es
wurden 150 mg (0.22 mmol) 173 sowie 72 mg (0.48
mmol) 157 hinzugegeben und in 3 mL abs. DCM
gelöst. Die Lösung wurde für 1 h bei RT gerührt und
anschließend auf -20°C abgekühlt und 40 μL (0.22
mmol) TMSOTf zugegeben. Anschließend für 3 h bei
RT gerührt. Dann mit 0.2 mL Triethylamin versetzt
und filtriert, das Filtrat wurde eingeengt und am Chromatotron, mit DCM, mit einem
Methanolgradienten von 0-5%, als Eluenten getrennt. Das gewünschte Produkt konnte
auf diesem Weg nicht erhalten werden.
ON
N
N
N
O
NH2
OTBDMS
TBDMSO
N
O
CH3
1701'
2'3'
4'
5'
1
2
34
5 6
1011
12
13
8
14
1. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’-
desoxyguanosin 170 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt,
um Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen.
263
174, 17.5
Es wurden 50 mg (0.08 mmol) O6-Benzotriazolyl-
3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin
mg (0.08 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure
159 und 3.6 mg (0.0032 mmol) [IrCl(cod)]2 in 2
mL Dichlormethan gelöst und 24 h bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden
6 mg (0.08 mmol) Calciumhydroxid hinzugegeben und weitere 72 h bei
Raumtemperatur gerührt. Es konnte jedoch kein Umsatz beobachtet werden. Das
Edukt konnte reisoliert werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 678
9
1'3'
4'
5'
2'
170
N
O
AB
C
DA'B'
C'
D'
Experimentalteil
2. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’-
desoxyguanosin 170 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt,
um Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen.
264
174, 17.5
Es wurden 50 mg (0.08 mmol) O6-Benzotriazolyl-
3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin
mg (0.08 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure
159 und 3.6 mg (0.0032 mmol) Pd(PPh3)4 in 2
mL Acetonitril gelöst und 24 h bei
Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden
6 mg (0.08 mmol) Calciumhydroxid hinzugegeben und weitere 72 h bei
Raumtemperatur gerührt. Es konnte jedoch kein Umsatz beobachtet werden. Das
Edukt konnte reisoliert werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 678
9
1'3'
4'
5'
2'
170
N
O
AB
C
DA'B'
C'
D'
3. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’-
desoxyguanosin 170 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt,
um Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen.
Es wurden 495 mg (1 mmol) 3’,5’-bis-TBDMS-2’-
desoxyguanosin 121, gelöst in 20 mL
Dichlormethan, mit 0.52 mL (3.7 mmol)
Triethylamin, 10 mg (0.08 mmol) DMAP und 500
mg (1.6 mmol) Mesitylsulfonylchlorid versetzt
und für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Anschließend wurde die Reaktion auf 0 °C gekühlt und mit 1 mL (9.5 mmol) N-
Methylpyrrolidin, gelöst in 3 mL Dichlormethan, langsam versetzt und für 3 h in der
Kälte gerührt, bevor die Zugabe von 280 mg (1.4 mmol) N-
Phenylbenzohydroxamsäure 159, gelöst in 3 mL Dichlormethan erfolgte und für 48
Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach anschließendem Einengen und Trennung
des Substanzgemisches mit Dichlormethan/Methanol (0-20%) konnte jedoch kein
gekuppeltes Produkt erhalten werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 678
9
1'3'
4'
5'
2'
170
N
O
AB
C
DA'B'
C'
D'
Experimentalteil
1. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 160
Es wurden 28.5 mg (0.1 mmol) 2’-
Desoxyguanosin-Monohydrat 52, gelöst in 2 mL
Wasser (pH=9), mit 2 mL Acetonitril und 100 mg
(0.46 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure 159
versetzt und für 7 Tage bei Raumtemperatur
gerührt. Es konnte jedoch keine Umsetzung
beobachtet werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
1
2
34
5 678
9
1'3'
4'
5'
2'
160
N
O
AB
C
DA'B'
C'
D'
2. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 160
Es wurden 28.5 mg (0.1 mmol) 2’-
Desoxyguanosin-Monohydrat 52, gelöst in 2 mL
Wasser (pH=10), mit 2 mL Acetonitril und 100
mg (0.46 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure
159 versetzt und für 7 Tage bei Raumtemperatur
gerührt. Es konnte jedoch keine Umsetzung
beobachtet werden.
N
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
1
2
34
5 678
9
1'3'
4'
5'
2'
160
N
O
AB
C
DA'B'
C'
D'
3. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 160
Es wurden 28.5 mg (0.1 mmol) 2’-
Desoxyguanosin-Monohydrat 52, gelöst in 2 mL
Wasser (pH=10), mit 2 mL Pyridin und 100 mg
(0.46 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure 159
versetzt und für 7 Tage bei Raumtemperatur
gerührt. Es konnte jedoch keine Umsetzung
beobachtet werden.
265
N
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
1
2
34
5 678
9
1'3'
4'
5'
2'
160
N
O
AB
C
DA'B'
C'
D'
Experimentalteil
Synthese von O6-(Benzotriazol-1-yl)-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 174
Unter Inertgasatmosphäre wurden 1.10 g
(2.21 mmol) 3’,5’-Bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 121 und 2.03 g (4.59 mmol) BOP
in einem 100 mL Kolben eingewogen, in 23 mL
abs. DMF gelöst und mit 0.80 mL (0.60 g, 4.6
mmol) DIPEA versetzt. Anschließend wurde die
Lösung bei RT für 72 h gerührt, dabei färbte sich
die Lösung langsam rot-braun. Dann wurde das
DMF unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (50 mL)
aufgenommen, mit dest. Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und
schließlich das Ethylacetat am Rotationsverdampfer entfernt. Das rot-braun viskose
Rohprodukt wurde am Chromatotron gereinigt. Als Eluent wurde mit PE (EE-
Gradienten von 50% → 100%) begonnen, dann EE mit einem DCM Gradienten von
0% → 100% verwendet und schließlich DCM mit einem Methanolgradienten von 0%
→ 10% abgeschlossen.
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
174
N
NN
16 15
14
1312
11
Ausbeute: 0.89 g (1.45 mmol, 65%) eines gelben kristallinen Feststoffs. – DC: Rf-Wert
(DCM/Methanol 9:1): 0.89. - Smp: 88-90 °C. - [ ]546
20α : + 27° (c = 0.22, CHCl3). - 1H-
NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.30 (s, 1H, H-8), 8.11 (d, 1H, 3JH,H= 8.4 Hz, H-
14), 7.75 (d, 1H, 3JH,H= 8.3 Hz, H-11), 7.64 (t, 1H, 3JH,H= 7.2 Hz, 3JH,H= 7.2 Hz, H-12),
7.51-7.55 (m, 1H, H-13), 6.74 (bs, 2H, NH2), 6.25 (dd, 1H, 3JH,H= 6.7 Hz, 3JH,H= 6.7 Hz,
H-1’), 4.54 (ddd, 1H, 3JH,H= 3.4 Hz, 3JH,H= 3.4 Hz, 3JH,H= 8.6 Hz, H-3’), 3.83-3.86 (m,
1H, H-4’), 3.70 (dddd, 2H, 3JH,H= 5.2 Hz, 2JH,H= 11.1 Hz, 2JH,H= 15.6 Hz, H-5’a, H-5’b),
2.75-2.82 (m, 1H, H-2’a), 2.31 (ddd, 1H, 3JH,H= 3.6 Hz, 3JH,H= 6.1 Hz, 2JH,H= 13.2 Hz,
H-2’b), 0.89 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.86 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.11 (s, 6H,
Si(CH3)2 an C3’), 0.04, 0.03 (2·s, 2·3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 159.1 (C-6), 158.9 (C-2), 156.7 (C-4), 142.6 (C-15), 139.7 (C-8), 129.2 (C-
10), 128.9 (C-12), 124.9 (C-13), 119.3 (C-14), 111.8 (C-5), 109.0 (C-11), 86.9 (C-4’),
82.6 (C-1’), 71.8 (C-3’), 62.4 (C-5’), 38.8 (C-2’), 26.1 (SiC(CH3)3), 24.6
(SiC(CH3)3),17.9 (SiC(CH3)3), 17.5 (SiC(CH3)3), -5.1 (SiC(CH3)2), -6.5 (SiC(CH3)2). -
IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3204, 2954, 2928, 2884, 1514, 1445, 1280,
266
Experimentalteil
1227, 1190, 946, 882, 780, 742. - MS (FAB, m/z): ber.: 612.3024, gef.: 613.3102
[M+H]+.
Synthese von C8-N-(N-Benzoylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin 175.2 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um
Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen.
Es wurden 50 mg (0.08 mmol) O6-Benzotriazolyl-
3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxy-guanosin 174, 26 mg
(0.12 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure 158 und
39 mg (0.12 mmol) Cäsiumcarbonat in 2 mL 1,2-
Dimethoxyethan gelöst und 12 h bei
Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 3 mL Wasser wurden die Phasen
getrennt und die wässrige Phase dreimal mit Dichlormethan extrahiert, bevor die
vereinigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet und vom
Lösungsmittel befreit wurden. Eine chromatographische Reinigung erfolgte am
Chromatotron mit Dichlormethan/Methanol (0-5%).
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
BzN
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
A
BCD
175.2
Ausbeute: 11.0 mg (0.02 mmol, 20%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert
(Ethylacetat/Petrolether 1:1 v/v): 0.25. - Schmelzpunkt: 148 °C. - [α]20546: + 61 ° (c =
0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.78 (s, 1H, NH), 7.14-7.63 (m,
10H, HB, HC, HD, Bz-H), 6.36 (s, 2H, NH2), 5.97-6.07 (m, 1H, H1´), 4.39-4.49 (m, 1H,
H3´), 3.68-3.75 (m, 3H, H5´, H4´), 2.95-3.01 (m, 1H, H2´a), 1.71-1.75 (m, 1H, H2´b),
0.86 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.06 (s, 6H,
(Si(CH3)2)2), 0.03 (s, 6H, (Si(CH3)2)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 167.4
(quart. Bz-C), 155.3 (C6), 152.0 (C2), 149.5 (C8), 143.2 (C4), 141.9 (Ca’), 141.3 (C5),
135.3 (CA), 130.1 (Cd’), 128.4 (Cb’), 128.2 (C(D)), 128.0 (Cc’), 127.0 (C(C)), 122.5
(C(B)), 86.8 (C4´), 82.5 (C3´), 72.3 (C1´), 62.7 (C5´), 36.5 (C2´), 25.4 (Si(CH3)2), 25.3
(Si(CH3)2), 17.7 (SiC(CH3)3), 17.4 (SiC(CH3)3), -5.1 (SiC(CH3)3), -5.3 (SiC(CH3)3).- IR:
Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3853, 3744, 3447, 2927, 1700, 1696, 1653, 1570, 1437, 1030.
- MS (FAB, m/z): ber.: 690.3381, gef.: 691.3403.
267
Experimentalteil
1. Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 175
Unter Inertgasatmosphäre wurden 321 mg (520 µmol)
174, 340 mg (1.04 mmol) Cäsiumcarbonat und 157
mg (1.04 mmol) 157 in einen 25 mL Kolben
eingewogen und in 7 mL abs. DME suspendiert.
Anschließend wurde die Suspension bei RT für 2 h
gerührt. Danach wurde die Suspension in DCM
aufgenommen und mit dest. Wasser ausgeschüttelt.
Die wässrige Phase wurde noch zweimal mit DCM extrahiert und die vereinigten
organischen Phasen über Magensiumsulfat getrocknet. Nach der Entfernung des
Lösungsmittels wurde das Rohprodukt am Chromatotron mit DCM/MeOH 19:1
gereinigt.
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
175
15
14
13 12
11
NO
Ausbeute: 171 mg (272 µmol, 52%) eines hellbraunen Feststoffs – DC: Rf-Wert
(DCM/Methanol 19:1): 0.17. – Smp.: 227-229 °C (Zersetzung). - [ ] : + 90° (c =
0.17, CHCl
546
20α
3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.65 (s, 1H, H-1), 7.60-7.62
(m, 2H, H-11), 7.33-7.36 (m, 2H, H-12), 7.12-7.15 (m, 1H, H-13), 6.40 (bs, 2H, NH2),
5.90-6.09 (m, 1H, H-1’), 4.49-4.58 (m, 1H, H-3’), 3.66-3.75 (m, 4H, H-2’a, H-4’, H-5’a
und H-5’b), 3.06-3.17 (m, 1H, H-2’b), 2.19 (s, 3H, H-15), 0.86 (s, 9H, SiC(CH3)3 an
C3´), 0.80 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.07 (m, 6H, Si(CH3)2), -0.04 (s, 6H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.2 (C-14), 156.2, 153.5, 141.6, 129.1,
128.6, 128.3, 122.9, 118.9, 118.7, 115.1, 87.3 (C-4’), 83.2 (C-1’), 72.2 (C-3’), 63.8 (C-
5’), 25.6 (SiC(CH3)3), 25.5 (SiC(CH3)3), 22.4 (C-15), 17.8 (SiC(CH3)3), 17.5
(SiC(CH3)3), -5.4 (SiC(CH3)2), -5.5 (SiC(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling):
2954, 2886, 1704, 1602, 1542, 1431, 1330, 1112, 1031, 812, 779, 691. - MS (FAB,
m/z): ber.: 628.3225, gef.: 629.3303 [M+H]+.
268
Experimentalteil
2. Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-
desoxyguanosin 175
Unter Inertgasatmosphäre wurden 100 mg (161 µmol)
174 und 157 mg (1.04 mmol) 157 in einen 25 mL
Kolben eingewogen und in 5 mL abs. Pyridin
suspendiert. Anschließend wurde die Suspension bei
RT für 16 h gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel
entfernt und das Rohprodukt am Chromatotron mit
DCM/MeOH 19:1 gereinigt.
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
175
15
14
13 12
11
NO
Ausbeute: 75 mg (120 µmol, 75%) eines hellbraunen Feststoffs.
Analytik siehe Seite 268.
Versuch zur direkten Synthese von C8-N-(N-Acetylylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’-
desoxyguanosin 175 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um
Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen. NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
1
2
34
5 678
9
1'3'
4'
5'
2'
175
A
B
CD
NOEs wurden 50 mg (0.1 mmol) 3’,5’-bis-TBDMS-2’-
desoxyguanosin 121, 36 mg (0.16 mmol) N-
Acetylbenzohydroxamsäure 157 und 57 mg (0.11
mmol) BOP in 2 mL DMF gelöst und 96 h bei
Raumtemperatur gerührt. Es konnte jedoch kein
Umsatz beobachtet werden.
269
Experimentalteil
Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-2’-desoxyguanosin 176
Die Synthese wurde nach AAV 3 durchgeführt. Es wurden
140 mg (222 µmol) 175 eingesetzt.
Ausbeute: 85 mg (0.21 mmol, 96%) eines gelb-hellbraunen
Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.11. –
Smp.: 138-140 °C. - [ ] : + 55° (c = 0.29, DCM/MeOH
1:1). -
546
20α
1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.83 (s,
1H, H-1), 7.35-7.50 (m, 5H, H-11, H-12 und H-13), 6.44
(bs, 2H, NH2), 6.04-6.10 (m, 1H, H-1’), 5.24 (bs, 1H, OH), 4.96 (bs, 1H, OH), 4.35-4.40
(m, 1H, H-3’), 3.80-3.83 (m, 1H, H-4’), 3.53-3.67 (m, 2H, H-5’a und H-5’b), 3.06-3.12
(m, 2H, H-2’a und H-2’b), 2.02 (s, 3H, H-15). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-
d6): 128.9, 126.1 und 125.0 (C-11, C-12 und C-13), 87.9 (C-4’), 83.6 (C-1’), 71.3 (C-
3’), 62.3 (C-5’), 45.5 (C-2’), 22.3 (C-15). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2937,
1718, 1680, 1671, 1647, 1576, 1369, 842. - MS (FAB, m/z): ber.: 400.15, gef.: 401.3
[M+H]+.
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
176
15
14
13 12
11
NO
Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-N2-formamidin-2’-desoxyguanosin 177
Die Synthese wurde nach AAV 4 durchgeführt. Es
wurden 75 mg (0.18 mmol) 176 eingesetzt
270
Ausbeute: 50 mg (0.11 mmol, 61%) eines gelben, leicht
bräunlichen Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol
7:3): 0.81. – Smp.: 153-155 °C. - [ ]546
20α 59° (c = 0.29,
DCM/MeOH 1:1). -
: + 1H-NMR: δ [ppm] (500 MHz, DMSO-
d6): 11.48 (s, 1H, H-1), 8.47 (s, 1H, Hα), 7.33-7.45 (m,
5H, H-11, H-12 und H-13), 6.11-6.15 (m, 1H, H-1’), 5.30-5.33 (m, 1H, H-3’), 4.87-4.90
(m, 1H, H-5’a), 4.42-4.47 (m, 1H, H-5’b), 3.80-3.86 (m, 1H, H-4’), 3.52-3.65 (m, 2H, H-
2’a und H-2’b), 3.13 (s, 3H, Me-Formamidin), 3.03 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.03 (s,
3H, H-15). - 13C-NMR: δ [ppm] (125.7 MHz, DMSO-d6): 158.4, 129.0, 126.7, 87.8,
83.9, 70.8, 61.4, 40.7, 34.5, 22.1. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2931, 1734,
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
177
15
14
13 12
11
NO
N
α
Experimentalteil
1653, 1594, 1569, 1491, 1436, 1357, 1286, 1055, 844. - MS (FAB, m/z): ber.:
455.1917, gef.: 456.1977 [M+H]+.
Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-N2-formamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2’-
desoxyguanosin 178
Die Synthese wurde nach AAV 5 durchgeführt. Es
wurden 45 mg (98 µmol) 177 eingesetzt. Ausbeute:
42 mg (55 µmol, 56%) eines weiß-hellbraunen
Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.13.
- Smp.: 111 °C. - [ ]546
20α : + 21° (c = 0.1, CHCl3). -
1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.48 (s,
1H, H-1), 8.19 (s, 1H, H-16), 7.11-7.41 (m, 14H, H-
11, H-12, H-13 und arom. H vom DMTr) 6.67-6.74 (m, 4H, H-11, H-12, H-13 und
arom. H vom DMTr), 6.17-6.23 (m, 1H, H-1’), 5.31-5.39 (m, 1H, H-3’), 4.58-4.62 (m,
1H, H-4‘), 3.89-3.94 (m, 1H, H-5’a), 3.68-3.70 (m, 8H, OCH3-DMTr und H-5’b), 3.00 (s,
3H, Me-Formamidin), 2.94 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.04 (s, 3H, H-15), die 2’-Protonen
wurden vom Wasser und DMSO Signal überlagert. - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,
DMSO-d6): 156.9 (Cα), 129.4, 128.9, 127.2, 126.6, 112.6, 112.4, 85.5 (3.9), 82.9 (C-
1’), 70.5 (4.6), 54.6 (OCH3-DMTr), 40.6 (Me-Formamidin), 34.4 (Me-Formamidin), 22.4
(C-15). - MS (FAB, m/z): ber.: 757.3224, gef.: 758.3336 [M+H]+.
NH
N
N
O
NN
O
OH
DMTrO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
178
15
14
13 12
11
NO
N
α
271
Experimentalteil
Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)- N2-formamidin-3’-O-[(2-cyanoethoxy)-(N,N-
diisopropylamino)-phosphinyl]-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2’-desoxyguanosin 179
Die Synthese wurde nach AAV 6 durchgeführt. Es
wurden 39 mg (51 µmol) 178 eingesetzt.
Ausbeute: 34 mg (35 µmol, 68%) eines weißen
Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1):
0.26. – Smp.: 68-70 °C. - : + 74° (c = 0.06,
CHCl
[ ]546
20α
3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6):
11.39 (s, 2H, NH (I+II)), 8.36 (s, 1H, Hα (I)), 8.23
(s, 1H, Hα (II)), 7.62-6.62 (m, 36H, DMTr-H (I+II) +
Anil-H (I+II)), 6.41 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.31 (dd, 3JHH = 6.3
Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.88-4.86 (m, 1H, H3’ (I)), 4.85-4.83 (m, 1H, H3’ (II)),
4.37-4.33 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.56-3.30 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’
(I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II) + Me-Formamidin + H15 (I+II)), 2.77 (m, 1H, H2b’
(II)), 2.58 (m, 2H, H2b’ (I) + β’Ha (I)), 2.23 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 2.04 (s, 6H, H-15 (I+II)),
1.85 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 1.15-0.96 (m, 24H, iPr-
CH3 (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 178.7, 159.3, 159.2, 158.2,
147.6, 147.5, 145.3, 145.3, 136.3, 133.2, 130.9, 130.8, 130.7, 130.6, 130.5, 129.3,
128.8, 128.7, 128.6, 128.4, 118.4, 118.2, 114.6, 113.7, 113.6, 87.1, 86.6, 85.6, 75.0,
74.8, 74.0, 73.8, 64.1, 64.0, 58.7, 58.6, 58.5, 58.5, 55.1, 54.9, 54.8, 43.6, 43.6, 43.5,
43.5, 38.6, 38.4, 37.7, 30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 20.6, 20.5, 20.3. - 31P-NMR: δ [ppm] (162
MHz, Benzol-d6): 147.4 und 147.1 (Diastereomere des Phosphoramidits), 9.5 (H-
Phosphonat). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2968, 2932, 1700, 1696, 1680,
1672, 1629, 1554, 1517, 1493, 1368, 1326, 1116, 1079, 979. - MS (ESI+, m/z): ber.:
957.4302, gef.: 980.4199 [M+Na]+.
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
1
2
34
5 67
8
9
1'3'
4'
5'
2'
179
15
14
13 12
11
NO
N
α
PO N
NC α'
β'
272
Experimentalteil
8.6 Oligonucleotide
Synthese des Standardoligonucleotids 56 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdGpdCpdCpdApdTpdC-3´
M: 3582.4
HPLC: tR (Methode A): 27.33 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 594.46 (-6), 713.32 (-5), 892.16 (-4), 1189.34 (-3).
Synthese des Standardoligonucleotids 183 5´-dGpdApdTpdGpdGpdCpdGpdCpdCpdGpdApdG-3´
M: 3711.5
HPLC: tR (Methode A): 26.48 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 615.93 (-6), 739.36 (-5), 924.39 (-4), 1232.76 (-3).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 184 5´-dCpdTpdCpdG(Anilin)pdGpdCpdGpdCpdCpdApdTpdC-3´
M: 3673.4
HPLC: tR (Methode A): 29.49 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 609.7 (-6), 731.42 (-5), 1219.37 (-3).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 185 5´-dCpdTpdCpdG(4-Aminobiphenyl)pdGpdCpdGpdCpdCpdApdTpdC-3´
M: 3750.4
HPLC: tR (Methode A): 34.23 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 626.01 (-6), 751.71 (-5), 940.15 (-4).
273
Experimentalteil
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 186 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdG(Anilin)pdCpdCpdApdTpdC-3´
M: 3673.4
HPLC: tR (Methode A): 30.35 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 523.46 (-7), 731.78 (-5), 914.92 (-4).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 188 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdG(Anisidin)pdCpdCpdApdTpdC-3´
M: 3703.4
HPLC: tR (Methode A): 32.48 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 468.03 (-8), 737.18 (-5), 921.79 (-4).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 187 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdG(4-Aminobiphenyl)pdCpdCpdApdTpdC-3´
M: 3750.4
HPLC: tR (Methode A): 34.58 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 626.44 (-6), 751.62 (-5), 939.50 (-4).
Synthese des Standardoligonucleotids 57 5´-dGpdTpdApdGpdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3643.5
HPLC: tR (Methode A): 27.71 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 454 (-8), 519 (-7), 606 (-6).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 189 5´-dGpdTpdApdG(Anilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3736.63
HPLC: tR (Methode A): 30.93 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 465.39 (-8), 531.98 (-7), 620.71 (-6).
274
Experimentalteil
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 196 5´-dG(Anilin)pdTpdApdGpdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3736.63
HPLC: tR (Methode A): 37.04 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 531.38 (-7), 619.84 (-6), 743.78 (-5), 930.72 (-4), 1240.74
(-3).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 190 5´-dGpdTpdApdG(4-Anisidin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3765.56
HPLC: tR (Methode A): 30.67 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 472.03 (-8), 550.31 (-7), 624.60 (-6).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 191 5´-dGpdTpdApdG(4-Toluidin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3749.56
HPLC: tR (Methode A): 32.35 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 471.85 (-8), 536.15 (-7), 625.30 (-6).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 192 5´-dGpdTpdApdG(4-Cyanoanilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3735.55
HPLC: tR (Methode A): 32.29 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 468.24 (-8), 535.41 (-7), 624.75 (-6).
275
Experimentalteil
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 193 5´-dGpdTpdApdG(3,5-Dimethylanilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3764.68
HPLC: tR (Methode A): 32.83 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 468.79 (-8), 536.02 (-7), 625.26 (-6).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 194 5´-dGpdTpdApdG(4-Aminobiphenyl)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3812.73
HPLC: tR (Methode A): 35.28 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 474.91 (-8), 542.87 (-7), 633.08 (-6).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 197 5´-dG(4-Aminobiphenyl)pdTpdApdGpdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3812.73
HPLC: tR (Methode A): 34.08 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 476.18 (-8), 540.48 (-7), 631.24(-6).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 195 5´-dGpdTpdApdG(2-Aminofluoren)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3823.74
HPLC: tR (Methode A): 35.17 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 476.33 (-8), 544.48 (-7), 635.30 (-6).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 200 5´-dGpdTpdApdG(N2-Azo-Anilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3733.74
HPLC: tR (Methode A): 32.51 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 621 (-6), 745 (-5), 931 (-4).
276
Experimentalteil
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 201 5´-dGpdTpdApdG(N2-Azo-Biphenyl)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3810.74
HPLC: tR (Methode A): 36.08 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 632 (-6), 750 (-5).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 198 5´-dGpdTpdApdG(N2-Hydrazino-Anilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3735.74
HPLC: tR (Methode A): 31.33 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 466 (-8), 531 (-7), 619 (-6).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 199 5´-dGpdTpdApdG(N2-Hydrazino-Biphenyl)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´
M: 3812.74
HPLC: tR (Methode A): 34.29 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 631 (-6), 757 (-5), 1263 (-3).
Synthese des Standardoligonucleotids 58 5´-dApdApdApdTpdGpdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCpdApdGp
dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´
M: 9104
HPLC: tR (Methode B): 26.24 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 700 (-13), 759 (-12), 826(-11).
Synthese des Standardoligonucleotids 202 5´-dCpdGpdTpdTpdCpdGpdTpdCpdCpdTpdGpdApdApdGpdGpdApdGpdGpdApdTpdApdGp
dGpdT pdTpdCpdApdTpdTpdT-3´
M: 9308.1
HPLC: tR (Methode B): 19.17 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 716 (-13), 775 (-12), 846 (-11), 931 (-10). 277
Experimentalteil
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 203 5´-dApdApdApdTpdG(Anilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCp
dApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´
M: 9195
HPLC: tR (Methode B): 28.43 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 723 (-13), 781 (-12), 881 (-11).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 204 5´-dApdApdApdTpdG(Anisidin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCp
dApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´
M: 9225.1
HPLC: tR (Methode B): 28.19 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 708 (-13), 767(-12), 835 (-11), 921 (-10).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 205 5´-dApdApdApdTpdG(Toluidin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCp
dApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´
M: 9209.1
HPLC: tR (Methode B): 27.15 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 708 (-13), 837 (-11).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 206 5´-dApdApdApdTpdG(3,5-Dimetyhlanilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCp
dTpdTpdCpdApdGpdGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´
M: 9223.1
HPLC: tR (Methode B): 33.16 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 719 (-13), 769 (-12), 837 (-11), 910 (-10).
278
Experimentalteil
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 207 5´-dApdApdApdTpdG(4-Aminobiphenyl)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCp
dCpdTpdTpdCpdApdGpdGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´
M: 9271.2
HPLC: tR (Methode B): 28.61 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 772 (-12), 842 (-11), 926 (-10).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 208 5´-dApdApdApdTpdG(2-Aminofluoren)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTp
dTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´
M: 9283.2
HPLC: tR (Methode B): 32.48 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 713 (-13), 772 (-12), 843 (-11), 927 (-10), 1030 (-9).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 211 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Azo-Anilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTp
dTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´
M: 9193
HPLC: tR (Methode B): 30.71 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 757 (-12), 841 (-11), 1016 (-10)
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 212 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Azo-Biphenyl)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTp
dCpdCpdTpdTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´
M: 9269.2
HPLC: tR (Methode B): 34.32 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 656 (-14), 712 (-13), 771 (-12), 853 (-11), 926 (-10).
279
Experimentalteil
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 209 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Hydrazino-Anilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCp
dCpdTpdTpdCpdApdGpdGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´
M: 9195
HPLC: tR (Methode B): 29.65 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 658 (-14), 709 (-13), 768 (-12), 803 (-11).
Synthese des modifizierten Oligonucleotids 210 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Hydrazino-Biphenyl)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCp
dCpdTpdCpdCpdTp dTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´
M: 9271.2
HPLC: tR (Methode B): 33.47 min.
MS: ESI, m/z (Ladung): 723 (-13), 779 (-12), 844 (-11).
280
Gefahrstoffverzeichnis
9. Gefahrstoffverzeichnis
Substanz Gefahren-symbole R-Sätze S-Sätze
Aceton F, Xi 11-36-66-67 9-16-26
Acetonitril F, T 11-23/24/25 16-27-45
Acetylchlorid F, C 11-14-34 9-16-26-45
4-Aminobiphenyl T 45-22 53-45
2-Aminofluoren Xn 20/21/22-40 ?
2-(4-Aminophenyl)ethanol A - ?
Ammoniak C, N 34-50 26-36/37/39-45-61
Ammoniumchlorid Xn 22-36 22
Ammoniumsulfat - - -
Anilin T, N 20/21/22-40-48/23/24/25-
50
28.6-36/37-45-61
p-Anisidin T+, N 45-
E26/27/28-33-50
53-28.1-36/37-45-61
Antimon(III)bromid C,N 34-51/53 26-45-61
Benzol T, F
45-46-11-36/38-
48/23/24/25-65
53-45
Benzoylchlorid C 34 26-45
Benzylalkohol Xn 20/22 26
Benzylbromid Xi 36/37/38 39
Benzylchlorid T 45-E22-E23-37/38-41
53-45
BOP Xi 36/37/38 -
Bromoform T, N 23-36/38-51/53
28-45-61
N-Bromsuccinimid Xn 22-36/37/38 26-36
281
Gefahrstoffverzeichnis
tertButylnitrit F, Xn 11/20-22 16-24-46
Cäsiumcarbonat Xi 36/37/38-46 -
Chloroform Xn 22-38-40-48/20/22
36/37
p-Cyanoanilin Xn 20/21/22-36/37/38
-
DBU C 22-34-52/53 26-36/37/39-45
2’-Desoxyguanosin - - -
Dibrommethan Xn, N 20-52/53-59 26/59/61
DCI F, T 11-23/24/25 16-28-36/37-39-45
DIAD Xn36/37/38-40-
48/20/22 36
Dibrommethan Xn 20-52/53 24-61
Dichlormethan Xn 40 23-24/25-36/37
Diethylether F+, Xn12-19-22-66-
67 9-16-29-33
Diisopropylamin F, C 11-20/22-34 16-26-36/37/39-45
Diisopropylethylamin
F, C 11-22-34-52/53
16-26-36/37/39-45-61
1,2-DME Xn 20/21/22-37 24/25
N,N-Dimethylamin F, C 11-20/22-34 3-16-26-29-36/37/39-45
4-Dimethyl-aminopyridin T 24/25-36/38 22-36/37-45
3,5-Dimethylanilin T, N 23/24/25-33-51/53
(1/2)28-36/37-45-61
N,N-Dimethyl-formamid-diethylacetal Xi 10-36/37/38 16-26-36
DMSO - - -
1,4-Dioxan F, Xn11-19-36/37-
40-66 9-16-36/37-46
DTT Xn 22-36/38 -
Essigsäure C 10-35 23.2-26-45
Essigsäureanhydrid C 10-20/22-34 26-36/37/39-45
282
Gefahrstoffverzeichnis
Ethanol F 11 7-16
Ethylacetat F, Xi 11-36-66-67 16-26-33
Formamid T 61 53-45
Hexan F, Xn, N 11-38-48/20-51/53-62-65-
67
9-16-29-33-36/37-61-62
Hydrazin-Hydrat T, C, N 45-10-23/24/25-34-
45-50/53
?
Imidazol C 22-34-63 22-26-36/37/39-45
KBr - - -
Kaliumcarbonat Xi 36/37/38 22-26
Kaliumphosphat Xi 36/38 -
Kalium-superoxid O, C 8-35 17-26-36/37/39-45
Kieselgel T - 22
Kupfer(I)chlorid Xn, N 22-50/53 22-60-61
Mesitylensulfonylchlorid C 34 26-36/37/39-45
Methanol F, T 11-23 /24/ 25-39/23/
24/25 7-16-36-37-45
Methylamin F+, Xn 12-20-37/38-41 16-26-29
β-Mercaptoethanol T, N 22-24-34-51/53 26-36/37/39-45
Molybdän(VI)oxid Xn36/37-
48/20/22 (2)-22-25
Natriumacetat - - -
Natriumborhydrid F, T 15-24/25-35 14-26-36/37/39-43-45
Natriumcacodylat N, T 23/25-50/53 1/2-20/21-28-45-60-61
Natriumcyanid T+, N 26/27/28-32-50/53
7-28-29-45-60-61
Natriumhydrogencarbonat - - -
Natriumhydrid F, C 15-34 7/8-26-36/37 /39-43.6-45
283
Gefahrstoffverzeichnis
Natriumhydroxid C 35 26-36/37/39-45
Natriumnitrit O, T, N 8-25-50 45-61
Natriumsulfat - - -
Na2Fe(CN)5NO · 2H2O T 23/24/25-32 ?
Nitrobenzol T, N 23/24/25-40-48/23/ 24-51/53-62
28.3-36/37-45-61
Oxone® O, C 8-34 26-36/37/39-45
Pd/C - - -
Perchlorsäure C, O 5-8-35 23B-26-36/37/39-45
Petrolether F, Xn 11-52/53-65 9-16-23.2-24-33-62
Phenylhydrazin T, N
45-23/24/25-36/38-43-
48/23/24/25-50-68
53-45-61
Phosphortrichlorid T+, C 14-26/28-35-48/20 7/8-26-36/37/39-45
Phosphorylchlorid T+, C 14-22-26-35-48/23
7/8-26-36/37/39-45
Pyridin F, Xn 11-20/21/22 26-28.1
rac-BINAP Xi 38 -
Salzsäure C 34-37 26-36/37/39-45
TBDMS-Cl C 22-35-40 26-27-28-36/37/39-45
TBAI Xn 22
Tetrachlorkohlenstoff T, N 23/24/25-40-48/23-52/53-
59
(1/2-)23-36/37-45-59-61
Tetrahydrofuran F, Xi 11-19-36/37 16-29-33
p-Toluidin T, N 23/24/25-36-40-43-50 28-36/37-45-61
Toluol F, Xn 11-20 16-23-25-29
Triethylamin F, C 11-20/21/ 22-35
3-16-26-29-36/37/39-45
Triethylamin-Trihydrofluorid T+, C 26/27/28-35 7/9-26-36/37/39-45
284
Gefahrstoffverzeichnis
Triethylammoniumchlorid C 34 26-36/37/39-45
Trifluoressigsäure C 20-35-52/53 9-26-27-28-45-61
Trifluoressigsäureanhydrid C 14-20-35-52/53
9-26-36/37/39-45-61
Trimethylsilylbromid C 10-34 ?
Triphenylphosphin Xn 22-43-53 36/37-60
Tris Xi 36/37/38 -
Wasserstoffperoxid 30% Xn 22-41 26-39
Zink-Pulver N 50/53 60-61
Zinnchlorid Xn22-36/37/38-
43 24-26-37
Zirkoniumoxid A - -
285
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300
Anhang
301
11. Anhang Synthese-Protokoll für unmodifizierte Phosphoramidite
Schritt Funktion Zeit [s]
1 Begin
2 MeCN to waste 3
3 MeCN to Column 10
4 Reverse Flush 10
5 Block Flush 4
6 Phos Prep 3
7 Column 1 On
8 Block Vent 2
9 DCI to Waste 1.7
10 Base+DCI to Column 5
11 DCI to Column 2
12 Base+DCI to Column 5
13 DCI to Column 2
14 Base+DCI to Column 5
15 Push to Column
16 Column 1 Off
17 Wait 25
18 Cap Prep 3
19 MeCN to Waste 4
20 Reverse Flush 7
21 Block Flush 3
22 Cap to Column 10
23 Wait 5
24 MeCN to Waste 4
25 Reverse Flush 7
26 Block Flush 3
Anhang
302
27 Ox. to Column 8
28 MeCN to Waste 4
29 Block Flush 3
30 Wait 15
31 MeCN to Column 10
32 Flush to Waste 6
33 MeCN to Column 10
34 Reverse Flush 7
35 Block Flush 3
36 Start Detrityl
37 MeCN to Waste 4
38 MeCN to Column 10
39 Reverse Flush 7
40 Block Flush 3
41 If Monitoring
42 DCM to Column 35
43 Deblok. to Column 3
44 Monitor Trityl
45 Deblok. to Column 85
46 Monitor Noise
47 Deblok. to Column 10
48 Stop Monitor
49 MeCN to Column 10
50 Reverse Flush 8
51 If not Monitoring
52 Deblok. to Column 6
53 Trityl Flush 5
54 Deblok. to Column 6
55 Wait 5
56 Trityl Flush 5
57 Deblok. to Column 6
58 Wait 5
Anhang
303
59 Trityl Flush 5
60 Deblok. to Column 6
61 Wait 5
62 Trityl Flush 5
63 MeCN to Column 10
64 Trityl Flush 8
65 End Monitoring
66 MeCN to Column 8
67 Reverse Flush 7
68 Block Flush 4
69 End
Anhang
304
Synthese-Protokoll für modifizierte Phosphoramidite
Schritt Funktion Zeit [s]
1 Begin
2 MeCN to waste 3
3 MeCN to Column 10
4 Reverse Flush 10
5 Block Flush 4
6 Phos Prep 3
7 Column 1 On
8 Block Vent 2
9 DCI to Waste 2
10 DCI to Column 3
11 Base+DCI to Column 5
12 Base+DCI to Column 5
13 Wait 500
14 DCI to Column 3
15 Base+DCI to Column 5
16 Base+DCI to Column 5
17 Wait 500
18 MeCN to Column 5
19 Push to Column
20 Block Vent 2
21 DCI to Waste 2
22 DCI to Column 3
23 Base+DCI to Column 5
24 Base+DCI to Column 5
25 Wait 500
26 DCI to Column 3
27 Base+DCI to Column 5
28 Base+DCI to Column 5
29 Wait 500
Anhang
305
30 MeCN to Column 5
31 Push to Column
32 Block Vent 2
33 DCI to Waste 2
34 DCI to Column 3
35 Base+DCI to Column 5
36 Base+DCI to Column 5
37 Wait 500
38 DCI to Column 2
39 Base+DCI to Column 5
40 Base+DCI to Column 5
41 Wait 500
42 MeCN to Column 5
43 Push to Column
44 Block Vent 2
45 Wait 30
46 Cap Prep 3
47 MeCN to Waste 4
48 Reverse Flush 7
49 Block Flush 3
50 Cap to Column 10
51 Wait 5
52 MeCN to Waste 4
53 Reverse Flush 7
54 Block Flush 3
55 Ox. to Column 8
56 MecN to Waste 4
57 Block Flush 3
58 Wait 15
59 MeCN to Column 10
60 Flush to Waste 6
61 MeCN to Column 10
Anhang
306
62 Reverse Flush 7
63 Block Flush 3
64 Start Detrityl
65 MeCN to Waste 4
66 MeCN to Column 10
67 Reverse Flush 7
68 Block Flush 3
69 If Monitoring
70 DCM to Column 35
71 Deblok. to Column 3
72 Monitor Trityl
73 Deblok. to Column 85
74 Monitor Noise
75 Deblok. to Column 10
76 Stop Monitor
77 MeCN to Column 10
78 Reverse Flush 8
79 If not Monitoring
80 Deblok. to Column 6
81 Trityl Flush 5
82 Deblok. to Column 6
83 Wait 5
84 Trityl Flush 5
85 Deblok. to Column 6
86 Wait 5
87 Trityl Flush 5
88 Deblok. to Column 6
89 Wait 5
90 Trityl Flush 5
91 MeCN to Column 10
92 Trityl Flush 8
93 End Monitoring
Anhang
307
94 MeCN to Column 8
95 Reverse Flush 7
96 Block Flush 4
97 End
Anhang
308
Natrix Kristallisations-Screen
Anhang
309
MPD Kristallisations-Screen
Anhang
310
Verbindungsliste
NH
N
N
O
NH2N
O
OH
HO
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
Br
N
N
N
OBn
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
HNAryl
Aryl: phenyl 66 4-methoxyphenyl 67 4-methylphenyl 68 4-cyanophenyl 69 3,5-dimethylphenyl 70 4-biphenyl 71 2-fluorenyl 72
52 63
NH
N
N
O
NN
O
OH
HO
HNAryl
Aryl: phenyl 87 4-methoxyphenyl 88 4-methylphenyl 89 4-cyanophenyl 90 3,5-dimethylphenyl 91 4-biphenyl 92 2-fluorenyl 93
N(Me)2
NH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
HNAryl
Aryl: phenyl 108 4-methoxyphenyl 109 4-methylphenyl 110 4-cyanophenyl 111 3,5-dimethylphenyl 112 4-biphenyl 113 2-fluorenyl 114
N(Me)2
PO N(iPr)2
NC
N
N
N
OCPE
BrN
O
OTBDMS
TBDMSO
132
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OTBDMS
TBDMSO
HN
Aryl
Aryl: phenyl 136 4-biphenyl 137 4-methylphenyl 138 3,5-dimethylphenyl 139
N
N
N
OCPE
NH
N
O
OH
HO
HN
Aryl
Aryl: phenyl 140 4-biphenyl 141
N
N
N
OCPE
NN
O
OH
HON
Aryl
Aryl: phenyl 142 4-biphenyl 143
Anhang
311
N
N
N
OCPE
NH
N
O
O
DMTrO
HN
Aryl
Aryl: phenyl 148 4-biphenyl 149
N
N
N
OCPE
NN
O
O
DMTrON
Aryl
Aryl: phenyl 150 4-biphenyl 151
P PO
NCN(iPr)2 O N(iPr)2
NC
N
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
174
NNH
N
N
O
NN
O
O
DMTrO
AcNN(Me)2
PO N(iPr)2
NC
NH
N
N
O
NH2N
O
OTBDMS
TBDMSO
AcN
175 179
NN
5'-d(CTCG*GCGCCATC)
5'-d(GTAG*AATTCTAC) 5'-d(AAATG*AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)
5'-d(CTCGGCG*CCATC) 5'-d(G*TAGAATTCTAC)
G*: C8-Anil 184 C8-4-ABP 185
G*: C8-Anil 186 C8-4-ABP 187 C8-Anis 188
G*: C8-Anil 196 C8-4-ABP 197
G*: C8-Anil 189 C8-Anis 190 C8Tol 191 C8-4-Cyano 192 C8-3,5-DMA 193 C8-4-ABP 194 C8-2-AF 195 N2-Hydr. Anil 198 N2-Hydr. 4-ABP 199 N2-Azo Anil 200 N2-Azo 4-ABP 201
G*: C8-Anil 203 C8-Anis 204 C8Tol 205 C8-3,5-DMA 206 C8-4-ABP 207 C8-2-AF 208 N2-Hydr. Anil 209 N2-Hydr. 4-ABP 210 N2-Azo Anil 211 N2-Azo 4-ABP 212
Persönliches
12. Persönliches Veröffentlichungen
- Vukadinović, D; Böge, N.P.H.; Balzarini, J.; Meier, C. Nucl., Nucl., Nucleic
Acids, 2005, 24, 939-942.
- Böge, N.; Gräsl, S.; Meier, C. J. Org. Chem. 2006, 71, 9728-9738.
- Böge, N.; Szombati, Z.; Meier, C. Nucl., Nucl., Nucleic Acids 2007, 26, 705-
708.
- Böge, N.; Krüger, S.; Schröder, M.; Meier, C. Synthesis 2007, 24, 3907-3914.
- Böge, N.; Krüger, S.; Meier, C. Coll. Czech. Chem. Commun. 2008, submitted.
- Böge, N.; Schröder, M.; Meier, C. Synlett 2008, submitted.
- Böge, N.; Jacobsen, M.; Di Pasquale, F.; Marx, A; Meier, C. Angew. Chem.
2008, submitted.
Posterbeiträge 12.5.2005 Criegee-Festveranstaltung an der Universität Karlsruhe
3.9.-6.9.2006 17th International Roundtable on Nucleosides,
Nucleotides and Nucleic Acids in Bern
312
Persönliches
Persönliche Daten
Nicolas Böge
am 21.4.1981 geboren
in Hamburg
Schul- und Hochschulausbildung 1987-1991 Besuch der Grundschule Turmweg in Hamburg
1991-2000 Besuch des Gymnasium Eppendorf mit Abschluss Abitur
Oktober 2000 Beginn des Chemie-Studiums an der Universität Hamburg
16.9.2004 Mündliche Diplomhauptprüfungen an der Universität
Hamburg
1.10.2004-24.3.2005 Anfertigung der Diplomarbeit („Arylamin-modifizierte
Oligonucleotide“) im Arbeitskreis von Prof. Dr. C. Meier im
Institut für Organische Chemie an der Universität
Hamburg
24.3.2005 Verleihung des akademischen Grad des Diplom-Chemiker
1.4.2005 Beginn der Promotion im Arbeitskreis von Prof. Dr. C.
Meier im Institut für Organische Chemie an der Universität
Hamburg
Universitäre Arbeiten 2004-2006 Betreuung des „Integrierten Synthesepraktikum“
2004-2006 Betreuung des „Fortgeschrittenenpraktikum in
Organischer Chemie“
2006-2007 Betreuung des „Grundpraktikum in Allgemeiner Chemie“
Stipendien und Einladungen - Einladung zur Criegee-Festveranstaltung 2005 in Karlsruhe durch Prof.
Richert
- Reisekostenstipendium durch die „Gesellschaft deutscher Chemiker“
(Fachgruppe Biochemie) zur Teilnahme am 17. International Roundtable on
Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids in Bern 2006
313
Persönliches
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig
angefertigt habe und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und
Hilfsmittel verwandt habe.
Ich erkläre außerdem, dass diese Dissertation werde in gleicher noch in anderer
Form bereits in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat.
Ich habe früher außer mit den im Zulassungsversuch urkundlich vorgelegten Graden
keine weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht.
Hamburg, den 17.1.2008
314