TADEJA VAJGER - uni-lj.si

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

TADEJA ŠVAJGER

MAGISTRSKA NALOGA

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA

Ljubljana, 2015

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

TADEJA ŠVAJGER

VPLIV SESTAVE MATRIKSA NA REZULTAT

KROMATOGRAFSKE ANALIZE HIPERICINA

INFLUENCE OF SAMPLE'S MATRIX ON

CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF HYPERICIN

Ljubljana, 2015

i

Eksperimentalni del magistrske naloge sem opravljala na Katedri za farmacevtsko biologijo

Fakultete za farmacijo pod mentorstvom prof. dr. Sama Krefta, mag. farm. in somentorstvom

asist. dr. Eve Tavčar Benković, mag. farm.

»Kdor išče cilj, bo ostal prazen, ko ga bo dosegel,

kdor pa najde pot, bo cilj vedno nosil v sebi.«

N. Zaplotnik, Pot

ii

ZAHVALA

Iskrena hvala prof. dr. Samu Kreftu za sprejem mentorstva, strokovno usmerjanje in napotke

pri izdelavi magistrskega dela. Hvala za zanimiva in poučna predavanja, ki so mi vlila

dodatno motivacijo, pozitivno voljo in željo po doseganju novega znanja.

Asist. dr. Evi Tavčar Benković za sprejem somentorstva, za ves vložen čas, kritičen, a

kljubtemu pedagoški poduk ob natančnem branju magistrskega dela. Hvala za vse

sproščene, nepozabne ure preživete v laboratoriju, katere so se mi zagotovo globoko vtisnile

v spomin.

Hvala tudi vsem ostalim zaposlenim na Katedri za farmacevtsko biologijo.

Mami in očetu, za vsestransko pomoč in podporo pri študiju. Hvala za življenjske napotke,

skozi katere sta mi pokazala razsežnost, da v življenju ob močni volji in želji nič ni

nedosegljivo ali nemogoče.

Vsem bližnjim, starim staršem in vsem sorodnikom, ki so mi kakorkoli pomagali na moji

življenjski poti.

Starejši sestri Andreji, ki je kljub razdalji briljantno opravljala svoje poslanstvo – življenjske

zaupnice. Brez tebe bi mi bilo težje.

Hvala vsem študijskim prijateljem za vse nepozabne trenutke, smeh, veselje, tolažbo in vse

spodbudne besede, ki ne bodo nikdar pozabljene!

Mojemu Blažu, da me je našel, izpopolnil in osrečil. Hvala za tvojo brezpogojno ljubezen, ki

mi jo vseskozi daješ. Hvala za podporo, da počnem in sanjam to, česar brez tebe ne bi.

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod vodstvom mentorja prof. dr.

Sama Krefta, mag. farm. in somentorice asist. dr. Eve Tavčar Benković, mag. farm.

Predsednik komisije: izr. prof. dr. Marko Anderluh, mag. farm.

Članica komisije: izr. prof. dr. Mojca Kerec Kos, mag. farm.

Ljubljana, 2015 Tadeja Švajger

iii

KAZALO VSEBINE

POVZETEK .................................................................................................................... VIII

ABSTRACT ........................................................................................................................ X

1 UVOD ................................................................................................................................ 1

1.1 SPLOŠNO O ŠENTJANŽEVKI (Hypericum perforatum) .......................................... 1

1.2 SESTAVA .................................................................................................................... 2

1.3 UPORABA ................................................................................................................... 4

1.3.1 Uporaba v farmaciji .............................................................................................. 4

1.4 HIPERICINI ................................................................................................................. 7

1.4.1 Hipericin................................................................................................................ 7

1.5 EKSTRAKT ............................................................................................................... 11

1.5.1 Standardizacija.................................................................................................... 11

1.5.2 Delovanje ekstrakta ............................................................................................. 12

1.5.3 Topilo za ekstrakcijo ........................................................................................... 12

2 NAMEN DELA ............................................................................................................... 13

3 MATERIALI IN METODE .......................................................................................... 15

3.1 MATERIALI .............................................................................................................. 15

3.1.1 Rastlinski material............................................................................................... 15

3.1.2 Reagenti in topila ................................................................................................ 15

3.1.3 Aparature in laboratorijska oprema ................................................................... 16

3.1.4 Material za HPLC analize vzorcev ..................................................................... 17

3.1.5 Drugo .................................................................................................................. 17

3.2 METODE ................................................................................................................... 18

3.2.1 Priprava osnovnih raztopin ................................................................................. 18

3.2.2 Priprava vzorcev standarda in ekstrakta za analize ........................................... 21

3.2.3 Spektrofotometrično merjenje absorbance ......................................................... 22

3.2.4 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) ........................................ 23

3.2.4.1 HPLC metode za analize vzorcev ................................................................. 24

iv

4 REZULTATI IN RAZPRAVA ...................................................................................... 25

4.1 OPAŽANJA PRI PRIPRAVI VZORCEV ................................................................. 25

4.1.1 Priprava osnovne raztopine standarda ............................................................... 25

4.1.2 Priprava vzorcev standarda in ekstrakta za analize ........................................... 25

4.2 ANALIZA STANDARDA HIPERICINA ................................................................. 26

4.2.1 Dodatki soli k standardu hipericina .................................................................... 27

4.2.1.1 Dodatki različnih koncentracij mešanice soli ter posameznih komponent te

mešanice ................................................................................................................... 27

4.2.1.2 Dodatki različnih koncentracij aluminijevega sulfata .................................. 29

4.2.2 Dodatki kisline in baze k standardu hipericina ................................................... 34

4.2.3 Vpliv stekla na površino pod krivuljo standarda hipericina ............................... 35

4.3 ANALIZA EKSTRAKTA ŠENTJANŽEVKE .......................................................... 38

4.3.1 Dodatki soli k ekstraktu šentjanževke.................................................................. 38


mešanice ................................................................................................................... 38

4.3.1.2 Dodatki različnih koncentracij aluminijevega sulfata .................................. 39

4.3.2 Dodatki kisline in baze k ekstraktu šentjanževke ................................................ 41

4.4 PRIMERJAVA UPORABLJENIH METOD PRI HPLC ANALIZAH .................... 44

5 SKLEP ............................................................................................................................. 47

6 LITERATURA ............................................................................................................... 49

7 PRILOGA ....................................................................................................................... 54

v

KAZALO SLIK

Slika 1: Šentjanževka ............................................................................................................ 1

Slika 2: Strukturne formule značilnih spojin v šentjanževki ................................................. 3

Slika 3: Biosintezna pot hipericina in psevdohipericina iz emodina v celicah temnih žlez .. 8

Slika 4: Oštevilčena struktura hipericina in prikaz bay ter peri regije spojine .................... 9

Slika 5: Od prisotnosti dovolj močne baze odvisno ravnotežje 7,14-diketo tavtomera

hipericina (Q7,14) in njegove stabilne anionske oblike ................................................. 10

Slika 6: Posušena šentjanževka, rastlinski material za pripravo ekstrakta ........................ 15

Slika 7: Pripravljena osnovna raztopina standarda ........................................................... 18

Slika 8: Pripravljene osnovne raztopine različnih koncentracij mešanice soli, različnih

koncentracij aluminijevega sulfata, 0,5 % posameznih soli, ocetne kisline in

trietilamina ................................................................................................................... 21

Slika 9: Pripravljeni vzorci standarda za HPLC analize ................................................... 22

Slika 10: Pripravljeni vzorci ekstrakta za HPLC analize ................................................... 22

Slika 11: Aparatura za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti na Katedri za

farmacevtsko biologijo ................................................................................................. 24

Slika 12: Spremembe barv vzorcev standarda hipericina po različnih dodatkih ............... 25

Slika 13: Spremembe barv vzorcev ekstrakta šentjanževke po različnih dodatkih ............. 26

Slika 14: Kromatogram standarda hipericina po dodatkih različnih koncentracij

aluminijevega sulfata, metoda 1................................................................................... 31

Slika 15: Vpliv dolžine metode na ločevanje vrhov pri novonastali spojini ....................... 34

Slika 16: Pripravljeni vzorci standarda v svetlih/temnih vialah različnih proizvajalcev pri

testiranju stekla na vpliv AUC-ja standarda hipericina .............................................. 36

Slika 17: Predviden mehanizem pretvorbe psevdohipericina v izopsevdohipericin ........... 42

Slika 18: Kromatogram ekstrakta šentjanževke, metoda 1, absorbančni detektor ............. 43

Slika 19: Kromatogram standarda hipericina, metoda B, fluorescenčni detektor ............. 45

Slika 20: Kromatogram standarda hipericina, metoda 1, fluorescenčni detektor .............. 45

Slika 21: Kromatogram ekstrakta šentjanževke, metoda B, fluorescenčni detektor ........... 45

Slika 22: Kromatogram ekstrakta šentjanževke, metoda 1, fluorescenčni detektor ........... 46

vi

KAZALO GRAFOV

Graf 1: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli na AUC, metode A .............. 27

Graf 2: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli na AUC, metoda B .............. 28

Graf 3: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli na AUC. Primerjava vplivov

med različnimi metodami (metode A in metoda B) ...................................................... 29

Graf 4: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega sulfata

na AUC, metoda 1 ........................................................................................................ 29


na AUC, metoda B ........................................................................................................ 30


na AUC. Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B) ....... 31

Graf 7: Celoten UV-VIS spekter po dodatkih različnih koncentracij aluminijevega sulfata k

standardu hipericina .................................................................................................... 32

Graf 8: Znižanje odziva hipericina po dodatkih različnih koncentracij aluminijeve soli ... 33

Graf 9: Prikaz AUC-ja predvidenega nastanka kompleksa po dodatkih različnih

koncentracij aluminijevega sulfata k standardu hipericina, metoda 1 ........................ 33

Graf 10: Vpliv dodatkov kisline in baze na AUC hipericina po metodah A ter metodi B ... 34

Graf 11: Vpliv stekla na AUC standarda hipericina, metoda B ......................................... 37

Graf 12: Vpliv stekla na AUC standarda hipericina, metoda 1 .......................................... 37

Graf 13: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih soli na AUC hipericina.

Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B) ...................... 39

Graf 14: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega

sulfata na AUC hipericina. Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in

metoda B) ..................................................................................................................... 40

Graf 15: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov kisline ter baze na AUC hipericina.

Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B) ...................... 41

Graf 16: Primerjava UV-VIS absorpcijskih spektrov ekstrakta brez dodatka in ekstrakta po

dodatku baze ................................................................................................................. 43

vii

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica I: Znanstvena klasifikacija šentjanževke, Hypericum perforatum L. ............... 1

Preglednica II: Priprava nižjih koncentracij aluminijeve soli iz 0,5 % aluminijeve soli ... 20

Preglednica III: Priprava različnih koncentracij mešanice soli iz 1 % osnovne raztopine

mešanice soli ................................................................................................................ 20

Preglednica IV: Priprava vzorcev standarda/ekstrakta z različnimi dodatki .................... 21

Preglednica V: Viale različnih proizvajalcev ..................................................................... 35

Preglednica VI: Priprava vzorcev standarda v različne viale............................................ 36

viii

POVZETEK

V zadnjem času je duševno zdravje čedalje pogosteje predmet razprave v širši javnosti.

Problematika težav na tem področju postaja vse bolj aktualna, ljudje pa vse bolj posegajo po

alternativnih metodah zdravljenja in zaradi tega narašča tudi zanimanje za šentjanževko.

Izvleček šentjanževke s svojim antidepresivnim delovanjem predstavlja alternativo

sinteznim antidepresivom. Hypericum perforatum L. vsebuje široko paleto biološko aktivnih

spojin, med katerimi je tudi hipericin.

V magistrski nalogi smo se osredotočili predvsem na sestavo matriksa vzorca in vpliv, ki ga

le-ta ima na analize hipericina s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). V ta

namen smo standardu hipericina in ekstraktu šentjanževke dodajali različne koncentracije

(0,25 %, 0,5 % in 1 %) mešanice soli, ki vsebuje natrijev klorid, magnezijev klorid, kalcijev

karbonat in aluminijev sulfat, 0,5 % posamezne komponente te mešanice, različne

koncentracije aluminijevega sulfata (0,006 %, 0,025 %, 0,1 %, 0,25 % in 0,4 %), ocetno

kislino in trietilamin. Pri analizah smo se usmerili v uporabo »metod A« in »metode B«, pri

čemer metoda B predstavlja farmakopejsko metodo za hipericin. Dodatek soli ali sprememba

pH-ja bi lahko znižala ali zvišala površino pod krivuljo hipericina, ki se v farmakopejski

metodi uporablja za kvantifikacijo suhega ekstrakta šentjanževke, in tako bi lahko dobili

napačne rezultate.

Ugotovili smo, da je do značilnega znižanja površine pod krivuljo hipericina prišlo po

dodatku aluminijevega sulfata. Vpliv aluminijeve soli na hipericin je bil večji pri uporabi

standarda kakor pri ekstraktu šentjanževke. Razlog je najverjetneje ta, da ekstrakt

šentjanževke vsebuje številne druge spojine, ki preprečujejo nastanek kompleksa hipericina

z aluminijem in zaradi tega ne pride do tako velikih sprememb površine pod krivuljo. Prav

tako so spremembe površine pod krivuljo hipericina bistveno manjše pri uporabi metode B

kot pri metodah A. Sklepamo, da do tega pride zaradi prisotnosti fosfatnih ionov v pufru

metode B, ki bi lahko interagirali z aluminijevimi ioni in s tem preprečili nastanek kompleksa

hipericina z aluminijem. Obenem ima metoda B ustreznejšo pufrno kapaciteto. Drugi

dodatki niso imeli večjega vpliva na kromatografski vrh hipericina. Do večjih sprememb po

dodatku baze pa je prišlo pri psevdohipericinu v ekstraktu šentjanževke. Po dodatku baze k

ekstraktu se je precej znižala površina pod krivuljo psevdohipericina, pri višjem

retencijskem času pa je nastal nov vrh, ki pripada izopsevdohipericinu. V preteklih

ix

diplomskih nalogah so pri raziskovanju hipericinu podobnih spojin opazili neponovljive

rezultate HPLC analiz. Zaradi suma, da lahko na analitske rezultate med drugim vpliva tudi

tip stekla vial in insertov ter predhodno spiranje le-teh z metanolom, smo to preverili in

ugotovili, da ti parametri ne vplivajo na rezultate.

Ključne besede: hipericin, HPLC, matriks, šentjanževka, tekočinska kromatografija visoke

ločljivosti.

x

ABSTRACT

Mental health is becoming an increasingly popular subject of discussion in the general

public. The difficulties in this area are becoming increasingly topical, and people are seeking

alternative methods of therapy and because of this, there is an increasing interest in the St.

John's wort. St. John's wort extract works as an antidepressant and thus represents an

alternative to synthetic antidepressants. Hypericum perforatum L. contains a wide range of

biologically active compounds, which also include hypericin.

In the thesis we are focusing mainly on the composition of the sample matrix and its impact

on the analysis of hypericin using high-performance liquid chromatography (HPLC). For

this purpose, we added various concentrations (0,25 %, 0,5 % and 1 %) of a mixture of salts

which includes sodium chloride, magnesium chloride, calcium carbonate and aluminium

sulphate, 0,5 % of the individual components of this mixture, different concentrations of

aluminum sulphate (0,006 %, 0,025 %, 0,1 %, 0,25 % and 0,4 %), acetic acid and

triethylamine to the standard of hypericin and St. John's wort extract. In the analysis we

focused on the use of »methods A« and »method B«, wherein the method B represents

pharmacopeic method for hypericin. The addition of salts or a change in pH could decreased

or increased the area under the curve of hypericin, which is used in pharmacopoeial method

for quantification of dry extract of St. John's wort, which could lead to erroneous results.

We have found that the addition of aluminum sulphate caused a significant decrease in the

area under the hypericin curve. The effect of aluminum salt on hypericin was greater when

applying the standard than with the St. John's wort extract. The reason is probably that the

extract of St. John's wort contains a number of other compounds that prevent the formation

of the hypericin complex with aluminum, and because of this, there is no significant changes

in the areas under the curve. Also, the changes of area under the hypericin curve are

significantly lower when using method B than with methods A. We conclude that this is due

to the presence of phosphate ions in the buffer of method B which may interact with the

aluminum ions, thereby preventing the formation of complex with aluminum and hypericin.

Method B also has an adequate buffering capacity. Other additives had no significant impact

on the chromatographic peak of hypericin. Major changes occurred after the addition of base

in pseudohypericin in the extract of St. John's wort. After adding a base to extract, the area

under the curve of pseudohypericin decreased significantly and at a higher retention time a

xi

new peak occured, which belongs to isopseudohypericin. When researching hypericin like

compounds in past diplomas, they observed unrepeatable results of HPLC analyses. Due to

the suspicion that the analytical results can be affected also by the type of glass vials and

inserts and pre-washing those tools with methanol, we examined it and found that these

parameters do not affect the results.

Keywords: hypericin, HPLC, matrix, St. John's wort, high-performance liquid

chromatography.

xii

SEZNAM OKRAJŠAV

Okrajšava Razlaga

AUC (angl.: area under the curve) površina pod krivuljo

CYP3A4 izoforma citokroma P450 3A4

EtOH etanol

GABA (angl.: gamma-aminobutyric acid) γ-aminobutanojska kislina

HPLC (angl.: high-performance liquid chromatography) tekočinska kromatografija

visoke ločljivosti

MeOH metanol

Ph. Eur. Evropska farmakopeja

RP-HPLC (angl.: reversed-phase reverznofazna tekočinska

high-performance liquid chromatography) kromatografija visoke ločljivosti

rpm (angl.: rotations per minute) obrati na minuto

SSRI (angl.: selective serotonin reuptake inhibitor) selektivni zaviralci ponovnega

privzema serotonina

SNRI (angl.: serotonin-noradrenaline reuptake inhibitor) zaviralci ponovnega privzema

serotonina in noradrenalina

TFA (angl.: trifluoroacetic acid) trifluoroocetna kislina

tr retencijski čas

UV ultravijolična svetloba

UZ ultrazvok

VIS vidna svetloba

Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina

1

Slika 1: Šentjanževka (10)

1 UVOD

1.1 SPLOŠNO O ŠENTJANŽEVKI (Hypericum perforatum)

Krčnica ali Hypericum je rod, ki je razširjen po vsem svetu in vsebuje okoli 400 vrst. V

medicinske namene največ uporabljamo vrsto Hypericum perforatum L., katera je bila in je

še vedno najbolj cenjena v fitoterapiji (1). V preglednici I je podana znanstvena klasifikacija

šentjanževke. Šentjanževka (slika 1) je trpežna, delno lesena trajnica s pokončno rastjo, ki

zraste do enega metra visoko. Cvetovi so zlato rumeni, zvezdasto oblikovani, s petimi

zelenimi čašnimi listi in petimi zlato rumenimi venčnimi listi. Cvetijo od sredine meseca

junija do avgusta. Čašni listi (čaša ali kaliks) in venčni listi (venec ali korola) vsebujejo

številne črne žlezne pike. Majhni gladki ovalni listi, ki nastopajo v nasprotnih parih vzdolž

peclja, imajo značilne številne drobne oljne žleze. Majhni jajčasti stroki vsebujejo okrogla

črna semena (2, 3, 4, 5). Ime šentjanževka izhaja iz dejstva, da je rastlina v največjem

razcvetu za šentjanževo, ko goduje sv. Janez, tj. 24. junija. Iz strtih cvetov se izloči krvavo

rdeč sok, ki naj bi po eni izmed legend predstavljal Kristusovo kri. Druga legenda pa pravi,

da je rastlina zrasla iz kapljic krvi ob obglavljenju Janeza Krstnika (4, 6). Rodovno ime

hypericum izvira iz grških besed hyper (nad) in eikon (sliko) (7). Če list pridržimo proti

svetlobi, so lepo vidne drobne oljne žleze. Dobimo občutek »preluknjanega« lista, od koder

izvira vrstno ime perforatum.

Preglednica I: Znanstvena klasifikacija šentjanževke, Hypericum perforatum L.(9)

Kraljestvo Plantae (rastline)

Deblo Magnoliophyta

(kritosemenke)

Razred Magnoliopsida

(dvokaličnice)

Red Malpighiales

Družina Hypericaceae

(krčničevke)

Rod Hypericum

(krčnica)

Vrsta H. perforatum


2

Ljudska imena: grilavec, ivanovka, janževka, kamenika, krčevec, krčnica, krčno zele, kri

sv. Janeza, križevec, krvavec, krvočistnik, navadna krčna zel, navadna krčnica, počist, roža

sv. Ivana, rumena naniknica, šentjanženca, šentjanževa roža (8).

1.2 SESTAVA

Šentjanževka vsebuje širok spekter različnih naravnih razredov spojin (11, 12). Čas

pobiranja šentjanževke (pred, med ali po cvetenju) je zelo pomemben z vidika fitokemije,

saj stadij razvoja rastline bistveno vpliva na sestavo učinkovin.

Naftodiantroni: 0,06–0,4 %, večinoma psevdohipericin, hipericin (1), protohipericin,

protopsevdohipericin (2) in ciklopsevdohipericin (3) (13). Njihova vsebnost variira zaradi

različnih načinov kultivacije, prisotnosti svetlobe, nadmorske višine, obdobja leta in

okoljskih dejavnikov (16, 17).

Največ naftodiantronov se nahaja v listih in cvetovih (18). Njihova koncentracija narašča od

prvega brstenja do popolnoma odprtih cvetov. Prav tako je njihova vsebnost močno odvisna

od faze razvoja, z najvišjo vsebnostjo v fazi cvetenja in drastičnim upadom v fazi zorenja

plodov, fruktifikacije (17). Šentjanževemu olju dajejo značilno rdečo barvo (2).

Zaradi njihove aromatske konjugacije so v primerjavi s fluoroglucinolnimi derivati bolj

stabilni. Izjema sta proto obliki, ki imata odprto obročno strukturo in nista stabilni pod

vplivom svetlobe, saj pride do pretvorbe protohipericina v hipericin in

protopsevdohipericina v psevdohipericin (14, 15).

Fluoroglucinolni derivati: 0,2–4,0 %, odvisno od starosti droge. Največ je hiperforina (4),

sledita mu njegova analoga adhiperforin in furanohiperforin. Večja količina hiperforina se

tvori šele po cvetenju, ko ima rastlina že plodove (13). Občutljivi so na oksidacijo, v

raztopini pa so najbolj nestabilni, kadar so izpostavljeni svetlobi in zraku (14, 15).


3

1 2

hipericin: R = H protohipericin: R = H

psevdohipericin: R = OH protopsevdohipericin: R = OH

3 4

ciklopsevdohipericin hiperforin

Slika 2: Strukturne formule značilnih spojin v šentjanževki. Hipericin in psevdohipericin (1),

protohipericin in protopsevdohipericin (2), ciklopsevdohipericin (3), hiperforin (4).

Flavonoidi: 2–4 %, glikozidi kvercetina (hiperozid, rutin, kvercitrin in izokvercitrin),

biflavonoidi (biapigenin, amentoflavon).

Procianidini: 6–15 %, procianidin B2, tanini s katehinskim skeletom.

Ksantoni: v sledovih.

Eterično olje: 0,1–0,25 %, največ 2-metiloktana.

Druge komponente: nasičene maščobne kisline (palmitinska, stearinska, izovalerijanska),

vitamini in njihovi analogi (karatenoidi, holin, nikotinamid, nikotinska kislina), pektin itd.

(13, 7, 19).


4

1.3 UPORABA

Šentjanževka je znana kot zdravilna rastlina, njena uporaba je v ljudski medicini zelo dobro

zakoreninjena. Že od nekdaj so ljudje verjeli, da odganja zle duhove, čarovnije in varuje hiše

pred strelami, zato so jo obešali nad vhode, verske slike ipd. (2). V poletne kresove so jo

metali kot zelišče za varovanje in očiščenje. Še danes pa je simbol poletnega obrata ali

solsticija (3). Stoletja se je uporabljala za zdravljenje ran in razjed, motenj presnov in zlasti

kot sredstvo s protivnetnim in diuretičnim učinkom.

Dandanes je še posebej izpostavljeno antidepresivno delovanje ekstrakta šentjanževke, le-ta

pa deluje tudi protivirusno, protimikrobno in protivnetno. V zadnjih letih se prav tako

povečuje število raziskav, v katerih hipericin prepoznavajo kot potencialni fotosenzibilizator

v fotodinamični terapiji za zdravljenje nekaterih rakavih obolenj, luskavice in možganskih

tumorjev (20, 21, 22).

1.3.1 UPORABA V FARMACIJI

Po Pravilniku o razvrstitvi zdravilnih rastlin je šentjanževka uvrščena v kategorijo Z. V to

kategorijo so razvrščene zdravilne rastline, ki so namenjene za preprečevanje in zdravljenje

bolezni in bolezenskih stanj (23).

V današnjem času se ekstrakti šentjanževke uporabljajo predvsem kot rastlinski antidepresiv

za zdravljenje blage do srednje težke depresije. Uporablja se za izboljšanje razpoloženja,

zmanjša občutek izčrpanosti, utrujenosti, brezvoljnosti, odžene potrtost in malodušje (12,

24, 18). Rastlinski pripravki šentjanževke predstavljajo alternativo sinteznim

antidepresivom, saj povzročajo manj stranskih učinkov (25).

Droga je zel šentjanževke (Hypericii herba), ki jo sestavljajo celi ali zmleti posušeni cvetovi.

Nabiramo jih v času cvetenja, saj je takrat količina naftodiantronov najvišja (19, 13, 17).

Farmakološki učinki

Šentjanževka vsebuje številne spojine, ki so dokazano biološko aktivne. Spojine, katerim se

posveča največ pozornosti, vključujejo naftodiantrona hipericin in psevdohipericin, široko

paleto flavonoidov in fluoroglucinola hiperforin ter adhiperforin. Kljub temu, da obstajajo

odprta vprašanja, je iz večine podatkov možno razbrati, da za antidepresivno delovanje ni

odgovorna zgolj ena spojina, temveč več skupin aktivnih spojin, ki delujejo sinergistično

(26, 27, 28).


5

Antidepresivno delovanje

Področje problematike težav v duševnem zdravju postaja vse bolj aktualno tako v evropskem

kot tudi v širšem svetovnem merilu. Duševno zdravje je v zadnjem času čedalje pogosteje

predmet razprave v širši javnosti. Duševne motnje niso nekaj oddaljenega in čudaškega,

temveč so prisotne v domala vseh strukturah družbe in imajo pomembno vlogo pri

posameznikovem splošnem počutju, telesnem zdravju in življenju nasploh. Ljudje zaradi

različnih vzrokov vse bolj posegajo po alternativnih metodah zdravljenja, zaradi česar

narašča tudi zanimanje za šentjanževko, ki s svojim antidepresivnim delovanjem predstavlja

alternativo sinteznim antidepresivom. V kliničnih poskusih so učinek antidepresivnega

delovanja ekstrakta šentjanževke primerjali s standardnimi antidepresivi kot so amitriptilin,

fluoksetin, imipramin, sertralin (29). V raziskavah so uporabili Hamiltonovo (HAMD)

lestvico za ocenjevanje depresije in ugotovili, da je izmed naštetih sinteznih antidepresivov

izvleček šentjanževke primerljiv z vsemi razen z amitriptilinom (30).

Sprva so antidepresivne učinke ekstraktov pripisovali zgolj naftodiantronom, hipericinu in

psevdohipericinu. Najnovejša dognanja trdijo, da ta učinek ni odvisen zgolj od ene same

sestavine ali skupine sestavin. Poenostavljen pogled: ena rastlina – ena aktivna spojina – en

mehanizem delovanja, je torej nepravilen (26). Do izboljšanja stanja bolezenskih znakov

pride zaradi medsebojnega delovanja različnih sestavin (18). Dandanes je znano, da ima

pomembno vlogo pri tem delovanju fluoroglucinolni derivat hiperforin in tudi številni

flavonoidi (31, 25). Prav tako pa flavonoidi, zlasti hiperozid in procianidini, povečajo

topnost hipericina v vodi, kar pomeni tudi boljšo biorazpoložljivost hipericina (26).

Učinkovine v izvlečku zavirajo ponovni privzem monoaminov (noradrenalina, serotonina,

dopamina) in aminokislinskih nevrotransmiterjev (GABA, glutamata) v predsinaptične

nevrone (15, 56).

Odmerek

Za zdravljenje blage in zmerno hude depresije oz. za zmanjšanje simptomov je pomemben

zadosten odmerek suhega izvlečka. Priporočen začetni dnevni odmerek je med 500 in

1000 mg izvlečka, v nadaljevanju pa zadoščajo odmerki med 300 in 600 mg dnevno (2).

Plazemska koncentracija se postopno zvišuje več tednov, zato so za izražen klinični učinek

potrebni dva do štirje tedni (29).


6

Varnost

Neželeni učinki

Uporaba ekstrakta šentjanževke v primerjavi z ostalimi antidepresivi ne izkazuje nobenega

resnega neželenega učinka. Pri nizkem odstotku ljudi se lahko pojavijo blagi stranski učinki

kot so prebavne motnje, suha usta, glavobol, povečana tesnoba, utrujenost in nemir (29).

Interakcije

Poleg učinkovitosti šentjanževke je znana tudi problematika glede interakcij spojin v

izvlečku šentjanževke. Le-te so v primerjavi z neželenimi učinki, ki so blagi in redki, vredne

večje pozornosti. Morebitne interakcije izvlečka šentjanževke tako predstavljajo omejujoč

dejavnik za njegovo uporabo.

Šentjanževka v telesu inducira nastajanje encimov iz skupine citokromov P450 (najbolj

izoformo CYP3A4, ki metabolizira veliko danes uporabljenih zdravilnih učinkovin) in

transmembranskega prenašalca glikoproteina P, ki skrbi za izločanje učinkovin iz celic.

Posledica tega je pospešen metabolizem zdravilnih učinkovin in s tem zmanjšanje njihovega

učinka. Interakcije se torej lahko pojavijo ob hkratni uporabi šentjanževke in zdravilnih

učinkovin, ki se presnavljajo z navedenimi izoformami citokromov P450 ali se prenašajo z

glikoproteinom P (32). Za indukcijo citokromov P450 in glikoproteina P je odgovoren

hiperforin, katerega količina v različnih izvlečkih se razlikuje. Poleg interakcij, ki jih

povzroča hiperforin, pa pomembno prispeva tudi k antidepresivnemu delovanju izvlečkov

šentjanževke, zato njegova vsebnost kljub vsemu ne sme biti premajhna (33).

Novejše raziskave relativizirajo nevarnost interakcij šentjanževke z ostalimi zdravili. Pri

višjih odmerkih (zdravljenje blagih do zmernih depresivnih epizod) je kontraindicirana

sočasna raba teh zdravil z imunosupresivi (ciklosporinom, takrolimusom), nekaterimi

zdravili za terapijo infekcij s HIV (amprenavirjem, indinavirjem), zdravili proti raku

(irinotekanom) in antikoagulanti kumarinskega tipa (varfarinom). Pri nižjih odmerkih

zdravil (za lajšanje blažjih simptomov) nevarnosti interakcij niso klinično pomembne (34).

V primeru jemanja pripravkov šentjanževke skupaj s selektivnimi zaviralci ponovnega

privzema serotonina (SSRI) ali zaviralci ponovnega privzema serotonina in noradrenalina

(SNRI), lahko pride do serotoninskega sindroma.

Zaradi teh interakcij naj bi pripravke iz šentjanževke svetovali za samozdravljenje blagih

oblik depresije (brezvoljnost, potrtost), če je le možno ljudem, ki ne jemljejo drugih zdravil.


7

Navsezadnje predstavljajo pripravki iz izvlečka šentjanževke, ob upoštevanju možnosti

interakcij z drugimi zdravili in v primernem dnevnem odmerku ter primerni izbiri bolnika,

varno in učinkovito alternativo sinteznim antidepresivom v primeru blage do srednje hude

depresije (34).

Fototoksičnost (hipericizem)

Hipericizem oziroma fototoksičnost šentjanževke je znana predvsem iz veterine. Doslej so

opazovali vnetja kože in gobca pri ovcah, konjih in kravah, ki so s hrano zaužili velike

količine šentjanževke. Pri ljudeh so plazemske koncentracije hipericina med antidepresivno

terapijo s šentjanževko prenizke, da bi lahko prišlo do fototoksičnih reakcij. Do tega bi prišlo

v primeru 30–50 krat višje priporočene dnevne doze (18, 11, 29). Ob jemanju priporočenih

terapevtskih odmerkov se znaki fotosenzibilizacije (preobčutljivosti na svetlobo) naj ne bi

pojavili. V primeru, da pride do večje prekoračitve odmerka, pa bi se moral bolnik nekaj

časa izogibati ultravijoličnemu sevanju (2).

1.4 HIPERICINI

Hipericini so naravni rastlinski proizvodi, ki zaradi njihove strukture pripadajo skupini

naftodiantronov. Hipericini vključujejo spojine hipericin, psevdohipericin, protohipericin,

protopsevdohipericin in njihove derivate (izohipericin, ciklopsevdohipericin itd.), ki se

pojavljajo v precej nižjih koncentracijah. Protohipericin je predhodnik hipericina,

protopsevdohipericin pa psevdohipericina (11).

1.4.1 HIPERICIN

Hipericin (C30H16O8, 504,44 g/mol) je naravna spojina prisotna v rastlinah roda Hypericum

ali pridobljena sintezno. Kljub temu, da je bila struktura hipericina odkrita že več desetletij

nazaj, je njegova podrobna molekulska struktura še vedno predmet debate (21). Standard

hipericina je v vodi praktično netopen, njegova topnost v vodi pa se v ekstraktu poveča zaradi

prisotnosti različnih spojin (rutin, hiperozid, procianidini itd.) (13, 35).


8

Biosinteza

Slika 3 prikazuje biosintezo hipericina v celicah temnih žlez rastline (listi, steblo, venčni in

cvetni listi, prašniki). Različna količina temnih žlez v teh rastlinskih organih je razlog za

različno vsebnost hipericina. Največ hipericina najdemo v cvetovih, saj se največ temnih

žlez nahaja ravno v prašnikih (36).

+

Slika 3: Biosintezna pot hipericina in psevdohipericina iz emodina v celicah temnih žlez (prirejeno

po (36))

acetat + malonat

OGLJIKOVI HIDRATI

(glukoza, fruktoza, galaktoza)

glukoza-6-fosfat

glikogen

malonil

CoA

piruvična kislina

acetil CoA

emodin

emodin antron

oksidacija

protopsevdohipericin protohipericin

psevdohipericin hipericin

svetloba svetloba

temna žleza

zeleno tkivo


9

Struktura in značilnosti

Molekula hipericina ni planarna, saj stranske verige iz aromatskih skeletov odbijajo druga

drugo in na ta način preprečujejo, da bi molekula zavzela planarno konformacijo (16).

5

Slika 4: Oštevilčena struktura hipericina (5) in prikaz bay (pozicije 3, 4 in 10, 11) ter peri regije

(pozicije 6, 7, 8 ter 1, 13, 14) spojine

Molekula hipericina ima tako imenovani bay in peri regiji (slika 4). Ti dve regiji

predstavljata podskupini različnih kislosti. Kisla bay regija (hidroksilni skupini na pozicijah

3, 4), katere protoni so bolj kisli kakor hidroksilni protoni peri regije (pozicije 1, 6, 8, 13, ti

so bližje karbonilnim skupinam) (37, 38).

Hipericin lahko reagira z anorganskimi materiali na dva različna načina:

lahko tvori fenolate z njegovo kislo bay regijo,

ali pa vzpostavi kelatni tip koordinacijskega kompleksa na območju peri hidroksilnih

in karbonilnih skupin (38).

Pomemben faktor, ki prav tako lahko povzroči spremembe v strukturi naftodiantronov, je

pH. V kislem okolju pride do protonacije, v alkalnem pa do deprotonacije molekule

hipericina. Alkalno okolje pa povzroči hitro degradacijo psevdohipericina v raztopinah

standarda in ekstrakta (16).


10

Falk in sod. so raziskali deprotonacijo in protonacijo molekule hipericina ter ocenili pKa

vrednosti posameznih regij molekule hipericina. Po dodatku močne kisline (npr. vsaj 70 %

žveplove kisline) pride do mono oz. diprotonacije karbonilnih skupin (pKa = –5, –6,

C=OH+). Fenolna OH skupina bay regije je bolj kisla (pKa = 2) kot fenoli peri regije, zato

tukaj pride do monodeprotonacije, pri čemer je nastali fenolatni anion stabiliziran z vodikovo

vezjo z drugo fenolno skupino bay regije. Monodeprotonirana oblika je tako prevladujoča

oblika hipericina pri pH vrednostih med 2 in 10. Do dideprotonacije v bay in peri regiji pride

pri pH vrednostih med 11 in 13 (fenolne skupine peri regije imajo pKa ocenjeno na 11) (57).

5 (=OH+)2 5 5 bay–O– 5 bay–O–, peri–O–

Obe strukturi, tako anionska kot tudi nevtralna oblika, pa sta v obliki 7,14-diketo izomera

(slika 5, 21).

Slika 5: Od prisotnosti dovolj močne baze odvisno ravnotežje 7,14-diketo tavtomera hipericina

(Q7,14) in njegove stabilne anionske oblike (prirejeno po (21))

Molekula hipericina je nagnjena k tavtomernemu ravnotežju (keto-enol tavtomerija) (39).

Obstaja šestnajst teoretičnih tavtomerov hipericina, izmed katerih je najbolj stabilen 7,14-

diketo (Q7,14 ) tavtomer. Le-ta ima na 7. in 14. mestu pozicionirano karbonilno skupino.

Najstabilnejšemu tavtomeru Q7,14 sledita tavtomera Q1,7 in Q1,6 (40, 21).

V različnih topilih je pomembno poznati različne konformacijske, tavtomerne lastnosti, ki

so značilne za posamezna topila in tako interpretirati fotofizikalno obnašanje v vzbujenem

stanju, ki je odgovorno za biološko aktivnost spojine (21). Poznavanje strukturnih in

elektronskih lastnosti je pomembno tudi v primeru optimiziranja strategij za terapevtsko

aplikacijo (41).

pKa = 11 pKa = 2 pKa = -5, -6


11

Stabilnost

Raztopine standarda so stabilne pri temperaturi –20 °C v temi čez preiskovano časovno

obdobje 140 dni. Pri višjih temperaturah, ob prisotnosti svetlobe ali piridina, poteka

degradacija psevdohipericina pospešeno. Pri tem predstavlja najbolj agresivni faktor

prisotnost svetlobe. Hipericin v primerjavi s psevdohipericinom izkazuje večjo stabilnost,

do znižanja koncentracije hipericina pride le v primeru prisotnosti svetlobe. Obe spojini pa

sta bolj stabilni v ekstraktih (16). Večjo stabilnost naftodiantronov v ekstraktih si lahko

razlagamo zaradi prisotnosti različnih antioksidantov, zaradi katerih so radikalske reakcije,

ki lahko vplivajo na strukturo naftodiantronov, upočasnjene (42).

V študiji, ki je raziskovala vpliv svetlobe in pH-ja na različne strukture v metanolnih

izvlečkih šentjanževke, so Liu in sod. za naftodiantrone ugotovili sledeče:

nevtralni pH brez izpostavitve svetlobi; ni sprememb,

kisel pH brez izpostavitve svetlobi; ne pride do pretvorbe proto oblik v hipericin in

psevdohipericin, majhno znižanje AUC-ja,

nevtralni pH po izpostavitvi svetlobi; spojini z zaprto obročno strukturo (hipericin in

psevdohipericin) na začetku hitro narasteta na račun protohipericina in

protopsevdohipericina, ki imata odprto obročno strukturo,

kisel pH po izpostavitvi svetlobi; poteče pretvorba proto oblik v hipericin in

psevdohipericin, AUC hipericina in psevdohipericina pa se niža konstantno s časom

(14).

1.5 EKSTRAKT

1.5.1 STANDARDIZACIJA

Standardizacija kompleksnih mešanic rastlinskih materialov je izziv, saj so rastline

podvržene naravnim variacijam. Variacije med različnimi komercialnimi ekstrakti so

posledica različnih metod kultivacije, okoljskih faktorjev, časa cvetenja, postopka

ekstrakcije in shranjevanja (43). Od kakovosti pridobljene droge je izjemno pomembna

kakovost samega izvlečka (2). Večina produktov šentjanževke je še vedno standardiziranih

glede na vsebnost »totalnih hipericinov«, tj. vsote hipericina in psevdohipericina (44).


12

Ravno to predstavlja pereč problem in vzbuja skepticizem, saj številne študije dokazujejo,

da je za farmakološke učinke ekstrakta šentjanževke odgovornih več aktivnih skupin in ne

le hipericin. Vrednost totalnih hipericinov se določa po izpostavitvi vzorca svetlobi, saj tako

poteče pretvorba proto oblik hipericina in psevdohipericina. Kot že omenjeno, je znano, da

ob prisotnosti vidne svetlobe (400–750 nm) pride do pretvorbe protohipericina in

protopsevdohipericina v hipericin in psevdohipericin (25).

Kljub temu, da se zadnje čase daje poudarek antidepresivnemu učinku hiperforina,

informacije o vsebnosti hiperforina pogosto ni (45). Hiperforin se za standardizacijo

ekstraktov šentjanževke še ne uporablja rutinsko, najverjetneje zaradi njegove nestabilnosti,

zlasti ob prisotnosti svetlobe in kisika (24, 42, 7).

1.5.2 DELOVANJE EKSTRAKTA

Številne študije so pokazale, da je terapevtski učinek odvisen od načina priprave ekstrakta

in same farmacevtske oblike. Vodni ekstrakti, ki so bogati s hidrofilnimi spojinami

(flavonoidni glikozidi, tanini, fenoli), se uporabljajo pri prebavnih težavah (proti driski,

želodčnim bolečinam, menstrualnim težavam). Infuzi se uporabljajo kot obloge na slabo

celjene rane. Etanolni/metanolni vodni ekstrakti (50–80 %) v večji meri vsebujejo hipericin,

hiperforin, ksantone in flavonoide, ki imajo učinek na centralno živčni sistem ter se

uporabljajo za zdravljenje blage depresije (19).

1.5.3 TOPILO ZA EKSTRAKCIJO

Pri ekstrakcijskih mešanicah topil, ki vsebujejo več kot 50 % EtOH ali MeOH v vodi, je

vsebnost hipericina v ekstraktu neodvisna od deleža organske faze. Za razliko od hipericina

pa je vsebnost hiperforina močno odvisna od deleža organske faze (13). Optimalne količine

hipericina in psevdohipericina so bile pridobljene z 80 % MeOH pri temperaturi 80 °C

(46, 5). Najpogostejše metode ekstrakcije iz posušenih cvetov šentjanževke vključujejo

ekstrakcijo z uporabo metanola v vodni kopeli s stresanjem ali v ultrazvočni kadički (5).

V farmacevtske namene uporabljamo suhe izvlečke z razmerjem med drogo in izvlečkom

4–7:1, kot topilo pa se uporabljata metanol ali etanol (2).


13

2 NAMEN DELA

V magistrskem delu bomo z uporabo reverznofazne tekočinske kromatografije visoke

ločljivosti (RP-HPLC) proučevali vpliv sestave matriksa vzorca na analize standarda

hipericina in hipericina v ekstraktu šentjanževke. V ta namen bomo standardu hipericina in

ekstraktu šentjanževke dodajali različne koncentracije mešanice soli (0,25 %, 0,5 % in 1 %),

ki vsebuje natrijev klorid, magnezijev klorid, aluminijev sulfat in kalcijev karbonat, 0,5 %

posamezne komponente te mešanice, različne koncentracije aluminijevega sulfata (0,006 %,

0,025 %, 0,1 %, 0,25 % in 0,4 %), ocetno kislino in trietilamin. Zanimal nas bo vpliv teh

dodatkov na površino pod krivuljo standarda hipericina in hipericina v ekstraktu

šentjanževke. Nato bomo raziskali tudi vpliv stekla (uporaba različnih vial) na odziv

standarda hipericina.

Pri našem delu bomo uporabljali »metode A« in »metodo B«. Metoda B predstavlja

farmakopejsko metodo za hipericin in vsebuje fosfatni pufer, pH pa je uravnan na 2. Zaradi

ustreznejše pufrne kapacitete sklepamo, da bodo spremembe po različnih dodatkih k

standardu hipericina in k ekstraktu šentjanževke na AUC vrha hipericina pri tej metodi

manjše. Metoda A je bila razvita na Katedri za farmacevtsko biologijo in se sicer uporablja

pri analizi fagopirinov iz ajde, ki so strukturno zelo podobni hipericinu, vendar zanje

standard ni na razpolago in se v ta namen uporablja hipericin. Med raziskovanjem

fagopirinov so bile opažene določene naključne spremembe odziva v odvisnosti od matriksa

vzorca. V ta namen smo se odločili, da bomo metodo A uporabili tudi pri raziskovanju

hipericina, saj bi se lahko spremembe, ki so bile zaznane pri analiziranju fagopirinov,

razložile tudi na podlagi opažanj sprememb pri hipericinu.

To magistrsko delo bo nadaljnje raziskovanje že opravljene diplomske naloge Andraža

Počiča na to temo (»Vpliv matriksov vzorca na analizo standarda hipericina in ekstraktov

šentjanževke s tekočinsko kromatografijo visoke zmogljivosti«), kjer so bile zaznane

določene spremembe odziva hipericina v odvisnosti od sestave matriksa vzorca in stekla

(58). Naš namen bo rezultate te diplomske naloge raziskati dalje oziroma jih potrditi ali

ovreči.

V prvem delu magistrske naloge bomo pripravili osnovno raztopino standarda in izvedli

ekstrakcijo hipericina iz šentjanževke ter naredili osnovne raztopine dodatkov. Vzorce bomo


14

analizirali s pomočjo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti. Sledila bo obdelava

dobljenih kromatogramov in primerjava kromatografskih vrhov hipericina. Morebitne

dobljene značilne spremembe bomo poskušali pojasniti tudi s pomočjo podatkov iz

literature.

Naš cilj bo torej s pomočjo reverznofazne tekočinske kromatografije visoke ločljivosti

ugotoviti vpliv posameznih dodatkov in stekla na kromatografski vrh hipericina.


15

3 MATERIALI IN METODE

3.1 MATERIALI

3.1.1 RASTLINSKI MATERIAL

Šentjanževko (Hypericum perforatum L., slika 6) smo nabrali ob suhem, lepem vremenu v

času cvetenja na Koroškem nad krajem Vuhred (kmetija »Brdnik«, junij 2014). Sušila se je

en teden v suhem, senčnem, čistem in zračnem prostoru na podstrešju. Pri eksperimentalnem

delu – izdelavi ekstrakta, smo uporabili posušene zmlete cvetove šentjanževke, saj se v njih

nahaja najvišja količina preiskovane spojine – hipericina (17).

Slika 6: Posušena šentjanževka, rastlinski material za pripravo ekstrakta

3.1.2 REAGENTI IN TOPILA

Topila za ekstrakcijo

Metanol, p.a. (Panreac, Barcelona, Španija)

Prečiščena voda (Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani)

Topila in reagenti za mobilne faze

Voda, p.a. (J. T. Baker, Deventer, Nizozemska)

Acetonitril, p.a. (J. T. Baker, Deventer, Nizozemska)

Voda, p.a. (Panreac, Barcelona, Španija)

Acetonitril, p.a. (Panreac, Barcelona, Španija)

Trifluoroocetna kislina (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija)

Etilacetat, p.a. (Carlo Erba, Milano, Italija)

Natrijev dihidrogenfosfat (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija)


16

Metanol, p.a. (Carlo Erba, Milano, Italija)

Ortofosforna kislina (Fluka, Buchs, Švica)

Standard

Hipericin (PhytoLab, Vestenbergsgreuth, Nemčija)

Soli

NaCl (Carlo Erba, Milano, Italija)

MgCl26H2O (Kemika, Zagreb, Hrvaška)

Al2(SO4)318H2O (Kemika, Zagreb, Hrvaška)

CaCO3 (KEFO, Ljubljana, Slovenija)

Kislina

Ocetna kislina (Merck, Darmstadt, Nemčija)

Baza

Trietilamin (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija)

Voda

Prečiščena voda (Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani)

Metanol

Metanol (Panreac, Barcelona, Španija)

3.1.3 APARATURE IN LABORATORIJSKA OPREMA

Homogeniziranje

Mlinček za homogenizacijo droge IKA A10 (IKA-Werke, Staufen, Nemčija)

Tehtanje

Analitska tehtnica XS205 DualRange (Mettler Toledo, Zürich, Švica)

Precizna tehtnica AX4202 (Sartorius, Goettingen, Nemčija)

Centrifugiranje

Centrifuga Centric 200R (Tehtnica, Železniki, Slovenija)

Centrifuga Centric 400R (Tehtnica, Železniki, Slovenija)

Stresanje

Stresalnik Vibromix 40 (Tehtnica, Železniki, Slovenija)

Soniciranje

Ultrazvočna kad Bandelin Sonorex Digitec (Bandelin, Berlin, Nemčija)

Rotavapiranje

Rotavapor R-200 (Büchi, Flawil, Švica)


17

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)

Sistem UFLC XR Shimadzu 20 AD XR (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska):

- detektor Diode Array SPD-M20A,

- fluorescenčni detektor RF-10A XL,

- zbiralec frakcij FRC-10A.

Kolona Phenomenex Kinetex 2,6 μm C18 100 Å (1004,60 mm) S/N 528234-58,

B/N 5569-138 (Phenomenex, Torrance, CA, ZDA)

Računalniški program LC Solution Shimadzu 1,24 SP1 (Shimadzu Corporation,

Kyoto, Japonska)

Spektrofotometrično merjenje absorbance

Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA)

3.1.4 MATERIAL ZA HPLC ANALIZE VZORCEV

Injekcijske igle

Plastične epruvete (1,5 mL)

Temna viala z vgrajenim insertom Chromacol (pri vseh analizah)

Steklene viale različnih proizvajalcev (pri raziskovanju morebitnega vpliva stekla na

odziv standarda hipericina na detektorju, poglavje 4.2.3):

- temna viala brez inserta, Supelco SU 860033,

- temna viala brez inserta, La-Pha-Pack 11 09 0520,

- temna viala z dodanim insertom, viala Supelco SU 860033, insert Supelco SU

860066,

- temna viala z vgrajenim insertom, Chromacol 03-FIRV(A),

- prozorna viala brez inserta, Supelco SU 854165,

- prozorna viala brez inserta, Chromacol 2-SVW,

- prozorna viala brez inserta, La-Pha-Pack 11 09 0519.

3.1.5 DRUGO

Bučke, erlenmajerice, čaše, steklene palčke, plastične epruvete (15 mL, 50 mL),

čolnički, steklene pipete, žogica za pipetiranje, pincete, spatule, avtomatska pipeta

(Biohit-Proline, Helsinki, Finska), nastavki za pipeto, filtri za injekcijske brizge,

injekcijske brizge.


18

3.2 METODE

3.2.1 PRIPRAVA OSNOVNIH RAZTOPIN

Standard hipericina

0,65 mg standarda hipericina smo raztopili v 41,6 mL MeOH (dodajali smo ga postopoma,

41,6 mL predstavlja končni dodan volumen).

Postopek priprave osnovne raztopine standarda:

Na analitski tehtnici smo na čolniček natehtali 0,65 mg standarda hipericina, ga prenesli v

50 mL plastično epruveto in mu postopoma dodajali MeOH. Med postopnim raztapljanjem

smo raztopino večkrat postavili v UZ kadičko in sonificirali ter nato centrifugirali (5 min,

4500 rpm, 24 °C). S tem smo preverjali ali je usedlina še vedno prisotna in ali je za raztopitev

le-te potreben dodatek MeOH. Končni dodan volumen MeOH je bil 41,6 mL. Plastično

epruveto smo nato ponovno za 5 minut sonificirali. Vzorec smo še zadnjič centrifugirali

(5 min, 4500 rpm, 24 °C), da bi preverili, če se je ves hipericin raztopil. Tako pripravljeno

osnovno raztopino standarda smo hranili v hladilniku v 50 mL plastični epruveti (slika 7).

Slika 7: Pripravljena osnovna raztopina standarda v 50 mL plastični epruveti

Ekstrakt šentjanževke

Ekstrakt šentjanževke smo pripravili tako, da smo iz stebel rastlinskega materiala

(poglavje 3.1.1) postrgali cvetove in jih približno 1 minuto mleli v mlinčku za

homogenizacijo droge. Nato smo 1 g zmlete droge prenesli v 15 mL plastično epruveto in


19

dodali 10 mL 80 % MeOH. 30 minut smo sonificirali na temperaturi 50 °C, stresali na

stresalniku 15 min, nato pa centrifugirali (5 min, 3000 rpm, 25 °C). Supernatant smo prenesli

v bučko. Topilo smo odstranili pri znižanem tlaku. Suhi preostanek je znašal 0,18 g. Ekstrakt

smo postopoma raztopili v 21,43 mL MeOH, prenesli v 50 mL plastično epruveto,

sonificirali 5 min in centrifugirali (5 min, 3000 rpm, 25 °C). Supernatant smo prenesli v 50

mL plastično epruveto in za 8 minut izpostavili ksenonski svetlobi (765 W/m2). Z

izpostavitvijo svetlobi pride do pretvorbe protohipericina v hipericin in

protopsevdohipericina v psevdohipericin. Takšen način priprave ekstrakta preprečuje, da bi

do ciklizacije na svetlobi prišlo šele po opravljenih analizah. Tako pripravljen ekstrakt smo

hranili v hladilniku.

Opomba: Mletja cvetov šentjanževke smo se poslužili z namenom, da povečamo površino

droge in s tem izboljšamo ekstrakcijo.

Ocetna kislina, 10 v/v %

V 10 mL bučko smo odpipetirali 0,5 mL ocetne kisline in 4,5 mL MeOH. Dobili smo

osnovno raztopino ocetne kisline (0,1 mL ocetne kisline/mL raztopine oz. 0,1 μL ocetne

kisline/μL raztopine). Raztopino ocetne kisline smo pripravljali sproti, tik preden smo vzorce

začeli pripravljati v viale.

Trietilamin (TEA), 10 v/v %

V 10 mL bučko smo odpipetirali 0,5 mL trietilamina in 4,5 mL MeOH. Dobili smo osnovno

raztopino TEA (0,1 mL TEA/mL raztopine oz. 0,1 μL TEA/μL raztopine). Raztopino

trietilamina smo pripravljali sproti, tik preden smo vzorce začeli pripravljati v viale.

Raztopine posameznih soli, 0,5 ut/vol %

V 50 mL plastične epruvete smo posebej natehtali 250 mg vsake od naslednjih soli: natrijev

klorid, magnezijev klorid, aluminijev sulfat in kalcijev karbonat. Dodali smo 50 mL

prečiščene vode in 10 minut sonificirali. Vsako posamezno raztopino soli smo nato

prefiltrirali skozi filter s porami 0,45 µm. Dobili smo 0,5 % raztopine posameznih soli, ki

smo jih shranjevali v 50 mL plastičnih epruvetah na sobni temperaturi v omarici. Iz 0,5 %

aluminijevega sulfata smo pripravili še nižje koncentracije te soli. Postopek priprave je

prikazan v preglednici II.


20

Preglednica II: Priprava nižjih koncentracij aluminijevega sulfata iz 0,5 % aluminijevega sulfata

Ime vzorca V (0,5 % aluminijev sulfat) [mL] V (H2O) [mL]

0,4 % 8 2

0,25 % 5 5

0,1 % 2 8

0,025 % 0,5 9,5

0,006 % 0,125 9,875

Raztopine različnih koncentracij aluminijevega sulfata smo shranjevali v 15 mL plastičnih

epruvetah na sobni temperaturi v temnem prostoru (v omarici).

Raztopina mešanice soli, 1 ut/vol %

Pripravili smo 1 % mešanico naslednjih soli: natrijev klorid, magnezijev klorid, aluminijev

sulfat in kalcijev karbonat. 250 mg vsake soli smo posamično natehtali na čolniček in

prenesli v 100 mL bučko ter s prečiščeno vodo dopolnili do oznake. Bučko smo za 10 minut

postavili v ultrazvočno kadičko. Raztopino smo nato prefiltrirali skozi filter s porami

0,45 µm. Dobili smo 1 % raztopino mešanice soli. Iz dobljene 1 % raztopine mešanice soli

smo pripravili še 0,5 % in 0,25 % raztopino mešanice soli. Količine so navedene v

preglednici III.

Preglednica III: Priprava različnih koncentracij mešanice soli iz 1 % osnovne raztopine

mešanice soli

Ime vzorca V (1 % osnovna raztopina mešanice soli) [mL] V (H2O) [mL]

1 % mešanica soli 10 0

0,5 % mešanica soli 5 5

0,25 % mešanica soli 2,5 7,5

0 % mešanica soli (slepa) 0 10

Raztopine smo shranjevali v 15 mL plastičnih epruvetah, v temnem prostoru in na sobni

temperaturi (v omarici).

Opomba: Obstajala je možnost vpliva stekla oziroma plastike na vzorec, zato smo vse

osnovne raztopine (razen kisline in baze) shranjevali v plastičnih epruvetah (slika 8). Želeli

smo, da bi bil morebitni vpliv materiala, v katerem shranjujemo vzorce, na vse enak.


21

Slika 8: Pripravljene osnovne raztopine različnih koncentracij mešanice soli, različnih koncentracij

aluminijevega sulfata (v 15 mL plastičnih epruvetah), 0,5 % posameznih soli (v 50 mL plastičnih

epruvetah), ocetne kisline in trietilamina (v bučkah)

3.2.2 PRIPRAVA VZORCEV STANDARDA IN EKSTRAKTA ZA ANALIZE

V 1,5 mL plastične epruvete smo pripravili po 400 µL vsakega vzorca po postopku

prikazanem v preglednici IV.

Preglednica IV: Priprava vzorcev standarda/ekstrakta z različnimi dodatki

Različni dodatki Ime vzorca V (standard

ali ekstrakt)

[µL]

V (dodatek)

[µL]

V(MeOH)

[µL]

Brez dodatka Standard ali ekstrakt 200 / 200

Dodatek vode H2O 200 20 180

Dodatek različnih

koncentracij mešanice

soli

1 % sol 200 20 180

0,5 % sol 200 20 180

0,25 % sol 200 20 180

Dodatek 0,5 %

posameznih komponent

mešanice soli

0,5 % NaCl 200 20 180

0,5 % MgCl2 200 20 180

0,5 % Al2(SO4)3 200 20 180

0,5 % CaCO3 200 20 180

Dodatek nižjih

koncentracij

aluminijeve soli

0,4 % Al2(SO4)3 200 20 180

0,25 % Al2(SO4)3 200 20 180

0,1 % Al2(SO4)3 200 20 180

0,025 % Al2(SO4)3 200 20 180

0,006 % Al2(SO4)3 200 20 180


22

Dodatek kisline in baze

0,5 % ocetna kislina 200 20 180

0,25 % ocetna kislina 200 10 190

1 % TEA 200 40 160

0,5 % TEA 200 20 180

Vzorce v 1,5 mL plastičnih epruvetah smo centrifugirali (5 min, 10000 rpm, 24 °C). Po

centrifugiranju smo si raztopine dobro ogledali in opažanja tudi fotografirali. Po 100 µL

vsakega vzorca smo iz 1,5 mL plastične epruvete prenesli v temne viale z vgrajenimi inserti

(slika 9 in 10) in po približno 24 urah (hranili smo jih v hladilniku) analizirali po metodah A

in metodi B (metodi sta opisani v poglavju 3.2.4). Preostalim supernatantom v plastičnih

epruvetah smo pomerili absorbanco po metodi, ki je opisana v naslednjem poglavju.

Opomba: Osnovno raztopino standarda/ekstrakta in vse osnovne raztopine soli smo pred

uporabo in pripravo vzorcev še centrifugirali (5 min, 3000 rpm, 24 °C). Odstotki ocetne

kisline (0,25 % in 0,5 %) in trietilamina (0,5 % in 1 %) predstavljajo končno koncentracijo

v raztopini.

Slika 9: Pripravljeni vzorci standarda za HPLC analize

Slika 10: Pripravljeni vzorci ekstrakta za HPLC analize

3.2.3 SPEKTROFOTOMETRIČNO MERJENJE ABSORBANCE

Spektrofotometrično merjenje absorbance smo izvajali na napravi Nanodrop ND-1000

(Fakulteta za farmacijo), UV-VIS spektrofotometru, ki omogoča zelo natančne analize

majhnih volumnov vzorcev. Uporablja tehnologijo zadrževanja vzorcev na mestu zaradi

površinske napetosti, kar odpravlja potrebo po uporabi kivet. Zaradi majhnega volumna

vzorca, ki smo ga imeli na voljo, nam je način analize brez uporabe kivet predstavljal

optimalno rešitev za merjenje absorbance vzorcev.


23

Merili smo absorbanco vzorcev standarda in ekstrakta po celotnem UV-VIS spektru (220–

750 nm). Iz preostalih vzorcev v 1,5 mL plastičnih epruvetah (poglavje 3.2.2), smo z

avtomatsko pipeto odpipetirali po 4 µL vzorca direktno na površino za merjenje in jih

analizirali. Kot slepo raztopino smo uporabili 90 % metanol.

3.2.4 TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI (HPLC)

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti temelji na detekciji in ločevanju spojin v tekoči

fazi in predstavlja eno izmed najbolj pogosto uporabljenih analiznih tehnik. Pri

eksperimentalnem delu smo vzorce analizirali z reverznofazno tekočinsko kromatografijo

visoke ločljivosti (RP-HPLC), ki je daleč najpogostejša in obsega največji odstotek aplikacij

HPLC. Pri RP-HPLC imamo nepolarno stacionarno fazo in polarno mobilno fazo, kar vpliva

na obratni vrstni red elucije posameznih komponent kot pri normalnofazni kromatografiji

(48, 49). Polarne spojine se iz kolone izločijo prej, medtem ko se manj polarne dalj časa

zadržujejo na koloni in je posledično njihov retencijski čas daljši. Pri RP-HPLC kot mobilno

fazo uporabljamo mešanico vode in organskega topila. Najpogosteje se uporablja mešanica

acetonitrila in vode ali metanola in vode. Od razmerja mešanice topil je odvisen čas elucije

določene spojine. Retencijski čas je odvisen tudi od fizikalno-kemijskih lastnosti spojine in

je karakteristična značilnost analizirane spojine, ki ga uporabljamo za identifikacijo (47).

HPLC sistem (slika 11) sestavljajo naslednje komponente:

rezervoar za mobilno fazo,

razplinjevalec mobilne faze,

injektor (injicira vzorec na kromatografsko kolono),

črpalka (poganja mobilno fazo skozi sistem),

kromatografska kolona (poteka ločevanje komponent vzorca),

termostat,

rezervoar za odpadna topila,

detektor (zazna komponente vzorca),

in instrument za zapis signala, programska oprema za obdelavo podatkov.


24

Slika 11: Aparatura za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti na Katedri za farmacevtsko

biologijo

3.2.4.1 HPLC metode za analize vzorcev

»Metode A«

Vsem metodam A so bili skupni naslednji parametri:

pretok 2 mL/min, volumen injiciranja 5 μL, temperatura kolone 40 °C,

detekcija na UV-VIS detektorju pri 590 nm, na fluorescenčnem detektorju pri

ekscitacijski valovni dolžini 330 nm in emisijski valovni dolžini 590 nm.

Topilo A: voda, 2 % acetonitrila, 0,1 % TFA.

Topilo B: acetonitril, 2 % vode, 0,1 % TFA.

Metoda 1: izokratska elucija, mobilna faza A/B (3/7), čas trajanja analize 6 min.



»Metoda B« (metoda po Ph. Eur. 8.0, glej prilogo)

Parametri metode B:

pretok 1 mL/min, volumen injiciranja 20 μL, temperatura kolone 40 °C,

detekcija na UV-VIS detektorju pri 590 nm, na fluorescenčnem detektorju pri

ekscitacijski valovni dolžini 330 nm in emisijski valovni dolžini 590 nm.

Metoda B: izokratska elucija, mobilna faza etilacetat/raztopina natrijevega dihidrogenfosfata

(15,6 g/L)/metanol (39/41/160), pH = 2 (uravnan s fosforno kislino), čas trajanja analize 15

min.


25

4 REZULTATI IN RAZPRAVA

4.1 OPAŽANJA PRI PRIPRAVI VZORCEV

4.1.1 PRIPRAVA OSNOVNE RAZTOPINE STANDARDA

Med pripravo osnovne raztopine standarda hipericina smo MeOH dodajali postopoma,

dokler se standard hipericina ni popolnoma raztopil (opisano v poglavju 3.2.1). Volumen

porabljenega MeOH je bil 41,6 mL na 0,65 mg standarda hipericina (15,6 µg/mL), kar se

ujema s podatki iz literature, kjer je navedeno, da se v čistem MeOH raztopi maksimalno

37,17 µg/mL. Glede na informacije, ki jih posreduje članek, bi bilo morda smiselno standard

hipericina raztopiti v mešanici MeOH in piridina (99:1), saj piridin precej poveča topnost

hipericina. Topnost hipericina se v tem primeru poveča na 320,91 µg/mL, vendar v primeru

dodatka piridina pride do pospešene degradacije psevdohipericina (50).

4.1.2 PRIPRAVA VZORCEV STANDARDA IN EKSTRAKTA ZA ANALIZE

Vzorce za HPLC analize smo pripravljali v 1,5 mL plastične epruvete, ki smo jih

centrifugirali (5 min, 10000 rpm, 24 °C) in nato prenesli del v viale ter s tem preprečili

morebitni nanos delcev na HPLC kolono in druge težave oziroma napačne rezultate, ki bi

lahko bili posledica tega.

Med pripravo vzorcev standarda v 1,5 mL plastične epruvete smo opazili, da so nekatere

raztopine spremenile barvo (iz rožnate v modrikasto, slika 12). Ta sprememba se je zgodila

pri vseh koncentracijah mešanice soli in pri vseh koncentracijah aluminijevega sulfata. Iz

tega lahko sklepamo, da je bil za spremembo barve odgovoren dodatek aluminijevega

sulfata.

Slika 12: Spremembe barv vzorcev standarda hipericina po različnih dodatkih

mešanice soli posamezne soli

(NaCl, MgCl2, CaCO3)

različne koncentracije aluminijevega

sulfata kislina baza


26

Pri pripravi vzorcev ekstrakta v plastične epruvete pa se je opazna sprememba barve zgodila

po dodatku baze (iz svetlejše rdeče v temnejšo rdečerjavo, slika 13).

Slika 13: Spremembe barv vzorcev ekstrakta šentjanževke po različnih dodatkih

4.2 ANALIZA STANDARDA HIPERICINA

Na Katedri za farmacevtsko biologijo so tekom raziskovanja fagopirinov iz ajde opažali, da

med HPLC analizami na vidnost fagopirinov na detektorju vplivajo različni dejavniki. Ker

za fagopirine ni ustreznega referenčnega standarda, so pojav pričeli raziskovati na fagopirinu

podobni spojini, hipericinu, in sicer v sklopu diplomske naloge Andraža Počiča. Pojav smo

nadalje raziskovali v tej magistrski nalogi. Ugotavljali smo, ali matriks, v katerem se nahaja

hipericin, vpliva na vidnost hipericina na detektorju, zato smo k standardu hipericina dodali

različne koncentracije mešanice soli, 0,5 % posamezne komponente mešanice soli, različne

koncentracije aluminijevega sulfata, ocetno kislino in trietilamin. Vzorce smo analizirali z

različno dolgimi metodami (metode A, poglavje 3.2.4), da bi videli, ali dolžina metode vpliva

na odziv hipericina na detektorju. Prav tako smo pri analizah uporabili farmakopejsko

metodo (metoda B, poglavje 3.2.4).

V vseh vzorcih je bila enaka koncentracija standarda hipericina, vendar so bili odzivi na

detektorju ponekod različni. Posneli smo kromatograme standarda hipericina z različnimi

dodatki in želeli ugotoviti, ali ima matriks, v katerem se nahaja hipericin v vzorcih, vpliv na

njegovo površino pod krivuljo.

mešanice soli posamezne soli

(NaCl, MgCl2, CaCO3)

različne koncentracije aluminijevega

sulfata kislina baza


27

4.2.1 DODATKI SOLI K STANDARDU HIPERICINA

Zanimal nas je vpliv dodatka različnih soli na kromatogram oziroma na kromatografski vrh

hipericina. V temne viale z vgrajenim insertom smo k standardu hipericina dodali različne

koncentracije mešanice soli (0,25 %, 0,5 %, 1 %), 0,5 % posamezne komponente te mešanice

soli in nižje koncentracije aluminijevega sulfata (postopek priprave vzorcev je opisan pod

poglavjem 3.2.2) ter analizirali po metodah A in metodi B.


mešanice

Graf 1 prikazuje vpliv dodatkov različnih koncentracij mešanice soli (0,25 %, 0,5 %, 1 %)

in 0,5 % posameznih komponent te mešanice na odziv hipericina po metodi 1, 2 in 3. Iz

grafa 1 lahko vidimo, da večina dodatkov ne vpliva značilno na AUC standarda hipericina,

razen dodatka aluminijevega sulfata. Po dodatku te soli se je odziv pri vseh metodah znižal

skoraj za 90 % glede na standard brez dodatka. Sklepamo, da je zaradi dodatka aluminijeve

soli hipericin tvoril kompleks oz. se je spremenila njegova struktura. Kompleks oz.

spremenjena struktura imata lahko različno specifično fluorescenco in posledično se je znižal

odziv pri retencijskem času osnovne oblike hipericina, nastala pa je nova spojina, ki ima

krajši retencijski čas. Ostali dodatki niso presegli 10 % spremembe AUC-ja glede na

standard brez dodatka. Zaradi vpliva, ki ga ima dodatek aluminijevega sulfata na odziv

hipericina, smo se odločili pripraviti in raziskati še nižje koncentracije te soli.

Graf 1: Standard hipericina in vpliv različnih koncentracij mešanice soli in 0,5 % posamezne

komponente te mešanice na AUC standarda po metodah A (metoda 1, 2 in 3)

0

2.000.000

4.000.000

6.000.000

8.000.000

10.000.000

12.000.000

brez

dodatka

H2O 0,25% sol 0,5% sol 1% sol 0,5% NaCl 0,5%

MgCl2

0,5%

CaCO3

0,5%

Al2(SO4)3

AU

C

Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli, metoda 1, 2 in 3,

fluorescenčni detektor

6 min 15 min 30 min


28

Pri vseh treh metodah (metoda 1, metoda 2, metoda 3) so vplivi na površine pod krivuljo

standarda hipericina zelo podobni. Iz tega sklepamo, da dolžina oz. trajanje metode nima

večjega vpliva na odziv standarda hipericina po dodatkih različnih soli. Najbolj optimalna

izmed metod A bi torej lahko bila metoda 1, ki je najkrajša in imamo z njo posledično

najmanjšo porabo mobilne faze in s tem najnižje stroške.

Rezultate, ki smo jih dobili pri farmakopejski metodi (metoda B), prikazuje graf 2. Vpliv

aluminijevega sulfata na odziv hipericina na detektorju je pri tej metodi manjši. Odziv se v

tem primeru zniža za okoli 50 % v primerjavi s standardom brez dodatka, kar je precej manj

kot pri metodah 1, 2 in 3. Dodatki ostalih soli k standardu hipericina tudi tukaj nimajo

občutnega vpliva na njegovo površino pod krivuljo.

Graf 2: Standard hipericina in vpliv različnih koncentracij mešanice soli in 0,5 % posamezne

komponente te mešanice na AUC standarda po metodi B

Na grafu 3 je prikazana primerjava vplivov med metodami A in metodo B. Mobilna faza, ki

jo uporabljamo pri metodi B je pufer in vsebuje fosfatne ione, ki bi lahko interagirali z

aluminijevimi ioni in s tem preprečili nastanek kompleksa med hipericinom in aluminijevimi

ioni. Pri metodi A v mobilni fazi ni pufra, zato je več hipericina kompleksiralo aluminijeve

ione, kar se na kromatogramu odraža kot večje znižanje AUC-ja hipericina.

0

200.000

400.000

600.000

800.000

1.000.000

1.200.000

1.400.000

0

100.000

200.000

300.000

400.000

500.000

600.000

700.000

800.000

900.000

AU

C (

flu

ore

scen

čni

det

ekto

r)

AU

C (

abso

rban

čni

det

ekto

r)

Standard hipericina in vpliv različnih dodatkov soli, metoda B

absorbančni detektor



29

Graf 3: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli na njegov AUC. Primerjava vplivov med

različnimi metodami (metode A in metoda B). Na levi (primarni) navpični osi je podan odziv za

metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan odziv za metodo B.

V naslednjem koraku smo se zaradi značilnega vpliva aluminijevega sulfata na

kromatografski vrh hipericina odločili pripraviti in analizirati nižje koncentracije te soli.

4.2.1.2 Dodatki različnih koncentracij aluminijevega sulfata

Dodatek aluminijevega sulfata k standardu hipericina je izmed vseh dodanih soli povzročil

najbolj značilno spremembo odziva hipericina na detektorju. Želeli smo podrobneje raziskati

vpliv aluminijevega sulfata, zato smo k standardu dodali nižje koncentracije te soli. V temne

viale z insertom smo k standardu hipericina dodali 0,006 %, 0,025 %, 0,1 %, 0,25 %, 0,4 %

in 0,5 % aluminijevega sulfata (poglavje 3.2.2). Vzorce smo analizirali po metodah A in

metodi B.

Graf 4: Standard hipericina in vpliv različnih koncentracij aluminijevega sulfata na površino pod

krivuljo, metoda 1

0

200.000

400.000

600.000

800.000

1.000.000

1.200.000

1.400.000

0

2.000.000

4.000.000

6.000.000

8.000.000

10.000.000

12.000.000

AU

C (

met

od

a B

)

AU

C (

met

od

e A

)

Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli, metode A in metoda B,


metoda 1 metoda 2 metoda 3 metoda B

0

2.000.000

4.000.000

6.000.000

8.000.000

10.000.000

12.000.000

0

10.000

20.000

30.000

40.000

50.000

60.000

70.000

brez

dodatka

0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%

AU

C (

flu

ore

scen

čni

det

ekto

r)

AU

C (

abso

rban

čni

det

ekto

r)

Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega

sulfata, metoda 1

absorbančni detektor



30

Graf 4 prikazuje kako dodatki različnih koncentracij aluminijevega sulfata vplivajo na

površino pod krivuljo standarda hipericina po metodi 1. Razberemo lahko, da je najmanjši

vpliv na odziv pri najnižji koncentraciji aluminijeve soli (0,006 %), kar smo pričakovali

(znižanje za okrog 60 % glede na standard brez dodatka). Pri ostalih dodatkih pa lahko iz

grafa razberemo, da se odzivi pri vseh znižajo za približno 90 % glede na standard brez

dodatka. Iz tega lahko sklepamo, da že dodatek 0,1 % aluminijevega sulfata povzroči

kvantitativno pretvorbo hipericina, zaradi česar so odzivi pri vseh nadaljnjih dodanih

koncentracijah podobni. Ko reakcija enkrat poteče do konca, vsak nadaljnji dodatek ne

vpliva več bistveno na površino pod krivuljo hipericina.

Tudi pri metodi 2 in 3 je situacija podobna. Najmanjše znižanje povzroči dodatek 0,006 %

aluminijeve soli (okrog 60 % glede na standard brez dodatka), ostali dodatki pa ravno tako

kot pri metodi 1 znižajo odziv na detektorju za okrog 90 %. Iz tega lahko sklepamo, da

dolžina metode ne vpliva na površino pod krivuljo standarda hipericina. Prav tako

predvidevamo, da je prišlo do pretvorbe hipericina v kompleks z aluminijem.

Pri metodi B (graf 5) največje znižanje povzroči 0,025 % aluminijeva sol (90 % glede na

standard brez dodatka), najmanjše pa 0,5 % aluminijeva sol (50 % glede na standard brez

dodatka). Pri metodi B so znižanja odzivov pri ostalih dodatkih aluminijevih soli manjša kot

pri metodah A.

Graf 5: Vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega sulfata na AUC standarda hipericina,

metoda B

0

200.000

400.000

600.000

800.000

1.000.000

1.200.000

1.400.000

0

100.000

200.000

300.000

400.000

500.000

600.000

700.000

800.000

900.000

brez

dodatka

0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%

AU

C (

flu

ore

scen

čni

det

ekto

r)

AU

C (

abso

rban

čni

det

ekto

r)


sulfata, metoda B

absorbančni detektor fluorescenčni detektor


31

Graf 6: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega sulfata na njegov

AUC. Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B). Na levi (primarni)

navpični osi je podan odziv za metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan odziv za

metodo B.

Opazili smo, da je bil pri analiziranju izredno pomemben tudi čas, kako dolgo smo pustili

vzorec z dodatkom aluminijeve soli stati. Pri prehitro injiciranem vzorcu pretvorba še ni

potekla do konca, kar se je odražalo na kromatografskem vrhu hipericina, katerega AUC se

do takrat še ni znižal. Vzorec namreč potrebuje nekaj časa, da se stabilizira, oziroma da

pretvorba poteče do konca. Pri metodah 1, 2 in 3, smo na kromatogramu po dodatku

aluminijeve soli zasledili nov kromatografski vrh, za katerega sklepamo, da pripada

novonastali spojini – kompleksu hipericina z aluminijem. Hipericin lahko tvori kelatne

koordinacijske komplekse z aluminijem, ki vključujejo peri hidroksi in okso skupine

(pozicije 1, 6, 8, 13 in 7, 14) (38).

Slika 14: Kromatogram standarda hipericina po dodatkih različnih koncentracij aluminijevega

sulfata, metoda 1

0

200.000

400.000

600.000

800.000

1.000.000

1.200.000

1.400.000

0

2.000.000

4.000.000

6.000.000

8.000.000

10.000.000

12.000.000

brez

dodatka

0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%

AU

C (

met

od

a B

)

AU

C (

met

od

e A

)


sulfata, metode A in metoda B, fluorescenčni detektor


0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

120000

130000

140000

150000

uV

hipericin

kompleks hipericina z aluminijem


32

Na sliki 14 je na desni strani kromatograma prikazan kromatografski vrh hipericina. Na levi

strani pa je nastal nov kromatografski vrh, ki najverjetneje pripada kompleksu hipericina z

aluminijem. Pri kromatografskem vrhu hipericina od določene koncentracije aluminijevega

sulfata naprej pričakujemo enak odziv, saj je količina aluminijeve soli dovolj velika za

kvantitativno pretvorbo hipericina. Kvantitativno pretvorbo hipericina pri nas povzroči

dodatek 0,1 % aluminijevega sulfata. V primeru nastanka nove spojine je vpliv različnih

koncentracij aluminijevih soli v skladu s količino nastale spojine (pri metodah A). Pri najvišji

dodani koncentraciji aluminijevega sulfata k standardu hipericina je nastala najvišja

koncentracija nove spojine itd. (graf 9), vendar tudi tukaj opazimo, da graf ne narašča

konstantno strmo, temveč pri določenih koncentracijah prihaja do fenomena nasičenja.

V skladu s temi rezultati lahko interpretiramo batokromne premike, ki smo jih opazili, ko

smo posneli absorbance po celotnem UV-VIS spektru (graf 7). Batokromni efekt bi tako

lahko bil posledica tvorbe peri kompleksa hipericina z aluminijem. Iz spektrov lahko ravno

tako razložimo spremembo barve, ki smo jo opazili pri pripravi vzorcev standarda (poglavje

4.1.2). Barva vzorcev, ki smo jim dodali aluminijevo sol, se je namreč iz rožnate obarvala v

modrikasto, kar pomeni, da se je absorbirana svetloba pomaknila k rdečemu delu spektra

(rdeči premik) oz. k višjim valovnim dolžinam, kar je razvidno tudi iz dobljenega UV-VIS

spektra. Hipericin je obarvan in ob prisotnosti aluminija tvori kompleks, aluminij v

kompleksu pa vpliva na porazdelitev elektronske gostote v konjugiranem sistemu hipericina,

kar ima za posledico premik absorpcijskega maksimuma in spremembo njegove intenzitete.

Graf 7: Celoten UV-VIS spekter po dodatkih različnih koncentracij aluminijevega sulfata k

standardu hipericina

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Ab

sorb

anca

Valovna dolžina [nm]brez dodatka H2O 0,006% 0,025%0,1% 0,25% 0,4% 0,5%

standard brez

dodatkadodatki različnih

koncentracij

aluminijevega sulfata


33

Iz spektrov lahko razberemo, da pride po dodatku aluminijeve soli k standardu hipericina do

pomika absorbanc k daljšim valovnim dolžinam (batokromni efekt) in do znižanja intenzitete

absorbanc (hipokromni efekt).

Graf 8: Prikaz znižanja odziva hipericina po dodatkih različnih koncentracij aluminijevega sulfata

in odziv novonastalega kromatografskega vrha pri retencijskem času 0,7 min

Graf 9: Prikaz AUC-ja (absorbančni detektor) in AUC-ja (fluorescenčni detektor) predvidenega

nastanka kompleksa po dodatkih različnih koncentracij aluminijeve soli k standardu hipericina

Prav tako je potrebno omeniti, da se pri metodi 2 in 3 kromatografski vrh, ki se pojavi ob

dodatku aluminija, začne ločevati v dva vrhova. Sklepamo lahko, da je dolžina metode v tem

primeru pomemben faktor. Hipotetično je možno, da potekata v vzorcih dve reakciji.

Hyp + Al ↔ Hyp-Al

Hyp-Al + Al ↔ Hyp-Al-Al

0

100.000

200.000

300.000

400.000

500.000

0

1.000.000

2.000.000

3.000.000

4.000.000

5.000.000

0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%

AU

C (

ko

mp

leksa

)

AU

C (

hip

eric

ina)

Nastanek kompleksa in spremenjen odziv hipericina po dodatkih različnih

koncentracij aluminijevega sulfata, metoda 1, fluorescenčni detektor

hipericin kompleks

0

100.000

200.000

300.000

400.000

500.000

0

5.000

10.000

15.000

20.000

25.000

30.000

0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%

AU

C (

flu

ore

scen

čni

det

ekto

r)

AU

C (

abso

rban

čni

det

ekto

r)

Nastanek kompleksa po dodatkih različnih koncentracij aluminijevega

sulfata, metoda 1

absorbančni detektor fluorescenčni detektor


34

Slika 15: Vpliv dolžine metode na ločevanje vrhov pri novonastali spojini (6 min – levo, 15 min – na

sredini, 30 min – desno)

Hipericin lahko tvori kompleks z enim ali z dvema aluminijevima ionoma, pri daljši metodi

pa se pričneta kromatografska vrhova teh kompleksov ločevati.

4.2.2 DODATKI KISLINE IN BAZE K STANDARDU HIPERICINA

Zaradi naključnih opažanj preteklih diplomskih nalog pri raziskovanju fagopirinov iz ajde

in nadalje še pri raziskovanju hipericina, smo z naslednjim poskusom želeli preveriti, kakšen

je vpliv dodatka kisline in baze na vidnost hipericina na detektorju. K standardu hipericina

smo dodali ocetno kislino, da je bila njena končna koncentracija 0,25 % in 0,5 % ter

trietilamin, katerega končna koncentracija je bila 0,5 % in 1 % (poglavje 3.2.2).

Koncentraciji smo izbrali na podlagi verjetnosti, da se takšna koncentracija tudi realno pojavi

v vzorcu (iz rastline, stekla ipd.). Analizirali smo po metodah A in metodi B.

Graf 10: Vpliv dodatkov kisline in baze na AUC hipericina po metodah A in metodi B. Na levi

(primarni) navpični osi je podan odziv za metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan

odziv za metodo B.

Glede na rezultate, ki smo jih dobili po dodatkih kisline in baze lahko zaključimo, da večjega

vpliva na AUC hipericina ni. Pri metodah 1, 2 in 3 so vse spremembe znotraj 7 % glede na

standard brez dodatka, kar pa ni toliko, da bi lahko govorili o bistvenih spremembah, ki bi

0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 min

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

uV

0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 1.05 1.10 1.15 min

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

22500

25000

27500

30000

32500

35000

37500

uV

0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 min

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

22500

uV

1.120.0001.140.000

1.160.000

1.180.0001.200.0001.220.000

1.240.000

1.260.0001.280.000

9.000.000

9.500.000

10.000.000

10.500.000

11.000.000

11.500.000

brez dodatka 0,25% ocetna

kislina

0,5% ocetna

kislina

0,5% TEA 1% TEA

AU

C (

met

od

a B

)

AU

C (

met

od

e A

)

Standard hipericina in vpliv dodatkov kisline ter baze, metode A in metoda

B, fluorescenčni detektor



35

bile posledice teh dodatkov. Pri metodah A je dodatek ocetne kisline povzročil majhno

znižanje odziva hipericina na detektorju, medtem ko je dodatek trietilamina v splošnem

povzročil majhno zvišanje odziva na detektorju. Pri opazovanju kromatogramov smo

opazili, da je po dodatku baze prišlo do spremembe oblike kromatografskega vrha hipericina

(znižanje vrha na levi strani in zvišanje na desni strani), kar pa nima večjega vpliva na

površino pod krivuljo.

Pri metodi B so vsi dodatki znižali površino pod krivuljo hipericina, vendar so tudi tukaj vse

spremembe znotraj 10 % glede na standard brez dodatka. Zatorej ne moremo sklepati na

značilen vpliv ocetne kisline in trietilamina na kromatografski vrh standarda hipericina. Prav

tako je mogoče, da sta tako kislina kot baza prešibki, da bi povzročili vpliv na absorbanco

hipericina in bi bilo to možno pričakovati pri močnejših kislinah in bazah, katerih pa v

naravnih ekstraktih ni pričakovati. Prav tako pa je količina injicirane kisline in baze izredno

nizka, obe mobilni fazi pa vsebujeta tudi kisli komponenti.

4.2.3 VPLIV STEKLA NA POVRŠINO POD KRIVULJO STANDARDA

HIPERICINA

V naslednjem koraku nas je zanimal vpliv stekla različnih vial na odziv hipericina na

detektorju. Preizkusili smo viale različnih proizvajalcev, ki smo jih imeli na voljo v

laboratoriju (preglednica V). Viale so se razlikovale po barvi stekla, vsebnosti inserta in ali

smo jih predhodno sprali z metanolom ali ne.

Preglednica V: Viale različnih proizvajalcev

Viala Proizvajalec, model Tip stekla

Temna viala brez inserta Supelco SU 860033 Hidrolitično steklo, tip 1

Temna viala brez inserta La-Pha-Pack 11 09 0520 Hidrolitično steklo, tip 1

Temna viala z dodanim insertom Viala: Supelco SU 860033

Insert: Supelco SU 860066

Hidrolitično steklo, tip 1

Temna viala z vgrajenim

insertom

Chromacol 03-FIRV(A) Hidrolitično steklo, tip 1

Svetla viala brez inserta Supelco SU 854165 Hidrolitično steklo, tip 1

Svetla viala brez inserta Chromacol 2-SVW Hidrolitično steklo, tip 1

Svetla viala brez inserta La-Pha-Pack 11 09 0519 Hidrolitično steklo, tip 1


36

Preglednica VI: Priprava vzorcev standarda v različne viale

Viala V (standarda) [μL] V(MeOH) [μL]

Temna viala brez inserta, Supelco 200 200

Temna viala brez inserta, La-Pha-Pack 200 200

Temna viala z dodanim insertom, Supelco 100 100

Temna viala z vgrajenim insertom, Chromacol 100 100

Svetla viala brez inserta, Supelco 200 200

Svetla viala brez inserta, Chromacol 200 200

Svetla viala brez inserta, La-Pha-Pack 200 200

Analizo vpliva stekla na odziv hipericina smo izvedli v dveh serijah. Ene serije vial nismo

sprali z metanolom, drugo serijo pa smo z metanolom napolnili do vrha in pustili stati 2 uri.

Nato smo viale do suhega posušili. Pripravili smo vzorce s standardom hipericina, ki smo

mu dodali metanol (preglednica VI, slika 16).

V vse viale (razen v viali z vgrajenim in dodanim insertom) smo z injekcijo odmerili 200 μL

osnovne raztopine standarda ter 200 μL MeOH. Viali z vgrajenim in dodanim insertom imata

manjši volumen, zato smo v ti dve viali pripravili po 100 μL osnovne raztopine standarda in

dodali 100 μL MeOH.

Slika 16: Pripravljeni vzorci standarda v svetlih/temnih vialah različnih proizvajalcev pri testiranju

stekla na vpliv AUC standarda hipericina


37

Graf 11: Vpliv stekla na površino pod krivuljo hipericina, metoda B. Vzorci so v vialah stali 6 ur

pred injiciranjem.

Graf 11 prikazuje vpliv različnih vial na kromatografski vrh hipericina, na njegovo površino

pod krivuljo po metodi B. Med različnimi vialami je največja razlika AUC-ja znotraj 5 %

(med temno vialo z dodanim insertom Supelco in prozorno vialo Chromacol). Iz navedenega

izhaja, da vpliv različnih vial na kromatografski vrh hipericina ni pomemben. Če primerjamo

rezultate serije različnih vial, ki jih predhodno nismo sprali z MeOH, s serijo vial, ki smo jih

predhodno sprali z MeOH, so vse spremembe manjše od 2 %.

Graf 12: Vpliv stekla na površino pod krivuljo hipericina, metoda 1. Vzorci so v vialah stali 26 ur

pred injiciranjem.

Vpliv stekla na AUC hipericina po metodi 1 predstavlja graf 12. Največja razlika AUC-ja

med posameznimi vialami je okrog 6 % (med temno vialo z dodanim insertom Supelco in

prozorno vialo Chromacol).

1.140.000

1.160.000

1.180.000

1.200.000

1.220.000

1.240.000

1.260.000

1.280.000

prozorna La-

Pha-Pack

prozorna

Chromacol

prozorna

Supelco

temna La-

Pha-Pack

temna

Supelco

temna z

vgrajenim

insertom

Chromacol

temna z

dodanim

insertom

Supelco

AU

CVpliv stekla na AUC standarda hipericina, metoda B, fluorescenčni detektor

brez spiranja spiranje z MeOH

10.000.000

10.200.000

10.400.000

10.600.000

10.800.000

11.000.000

11.200.000

11.400.000

prozorna La-

Pha-Pack

prozorna

Chromacol

prozorna

Supelco

temna La-

Pha-Pack

temna

Supelco

temna z

vgrajenim

insertom

Chromacol

temna z

dodanim

insertom

Supelco

AU

C

Vpliv stekla na AUC standarda hipericina, metoda 1, fluorescenčni detektor

brez spiranja spiranje z MeOH


38

Iz tega lahko sklepamo, da je vpliv stekla na AUC pri vseh metodah zelo podoben. Kot pri

metodi B tudi pri metodi 1 predhodno spiranje vial z MeOH ne povzroči občutnih sprememb

na površino pod krivuljo hipericina (vse spremembe so znotraj 2 %).

Različne viale vseh proizvajalcev so izdelane iz hidrolitičnega stekla tip 1, ki ima visoko

hidrolitično odpornost. To lahko pojasni, da do večjih sprememb med vialami ni prišlo.

Majhna odstopanja so lahko posledice eksperimentalnih napak, vezave hipericina na

površino stekla, manj verjetno pa odpuščanja ionov (npr. aluminijevih), ki bi tvorili

komplekse s hipericinom.

4.3 ANALIZA EKSTRAKTA ŠENTJANŽEVKE

Ekstrakt, ki smo ga pripravili iz šentjanževke (poglavje 3.2.1), smo analizirali po metodah A

in metodi B. Tako kot pri analizi standarda, nas je tudi pri analizi ekstrakta šentjanževke

zanimal vpliv matriksa vzorca na kromatogram oziroma na kromatografski vrh hipericina. S

tem namenom smo tudi k ekstraktu dodali različne koncentracije mešanice soli, posamezne

komponente mešanice soli, različne koncentracije aluminijevega sulfata, kislino in bazo.

Želeli smo izvedeti, kakšen je vpliv posameznih dodatkov na kromatografski vrh hipericina

v ekstraktu šentjanževke in ali so vplivi različnih dodatkov pri ekstraktu drugačni v

primerjavi s spremembami pri standardu.

4.3.1 DODATKI SOLI K EKSTRAKTU ŠENTJANŽEVKE

V temne viale z vgrajenim insertom smo k ekstraktu šentjanževke dodali različne

koncentracije mešanice soli (0,25 %, 0,5 %, 1 %), 0,5 % posamezne komponente te mešanice

soli in nižje koncentracije aluminijevega sulfata ter analizirali po metodah A in metodi B.


mešanice

Graf 13 prikazuje vpliv dodatkov različnih soli na kromatografski vrh hipericina. Vidimo,

da je trend pri metodah A zelo podoben. Pri vseh dodatkih se je odziv nekoliko znižal. Tako

pri standardu kakor tudi pri ekstraktu, opazimo največjo spremembo pri dodatku

aluminijevega sulfata. Tukaj se je odziv po dodatku 0,5 % aluminijevega sulfata znižal za

okrog 10 % v primerjavi z ekstraktom brez dodatka, kar je precej manj kot pri standardu,

kjer se je odziv znižal za 90 %.


39

Razlog je verjetno v tem, da je v ekstraktu poleg hipericina prisotnih še mnogo drugih spojin,

ki bi lahko imele vpliv na takšen rezultat. Te spojine lahko namreč delujejo kot nekakšen

»pufer«, ki veže aluminijeve ione in s tem preprečuje značilne spremembe odziva.

Pri metodi B je bil vpliv aluminijeve soli na kromatografski vrh hipericina manjši. Pri tej

metodi se odziv zniža za približno 4 % glede na ekstrakt brez dodatka. Farmakopejska

metoda se je tudi pri raziskovanju hipericina v ekstraktu šentjanževke izkazala kot

ustreznejša.

Graf 13: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih soli na AUC hipericina. Primerjava

vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B). Na levi (primarni) navpični osi je podan

odziv za metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan odziv za metodo B.

4.3.1.2 Dodatki različnih koncentracij aluminijevega sulfata

Največjo spremembo pri odzivu hipericina tudi pri ekstraktu povzroči dodatek

aluminijevega sulfata, zato smo tudi k ekstraktu dodali še nižje koncentracije te soli. V temne

viale z insertom smo k ekstraktu šentjanževke dodali 0,006 %, 0,025 %, 0,1 %, 0,25 %,

0,4 % in 0,5 % aluminijevo sol (poglavje 3.2.2). Vzorce smo analizirali po metodah A in

metodi B.

1.200.000

1.250.000

1.300.000

1.350.000

1.400.000

1.450.000

1.500.000

1.550.000

10.000.000

10.500.000

11.000.000

11.500.000

12.000.000

12.500.000

13.000.000

AU

C (

met

od

a B

)

AU

C (

met

od

e A

)

Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih soli, metode A in metoda




40

Graf 14: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega sulfata na

AUC hipericina. Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B). Na levi

(primarni) navpični osi je podan odziv za metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan

odziv za metodo B.

Iz grafa 14 lahko vidimo, da so vplivi oziroma trend različnih aluminijevih dodatkov na

kromatografski vrh hipericina v ekstraktu pri različnih metodah podobni. Pri vseh dodatkih

pride do znižanja odziva hipericina. Obstajajo pa majhne razlike med posameznimi

metodami. Z daljšanjem metode se vpliv dodatka aluminijeve soli na kromatografski vrh

hipericina nekoliko zmanjša. Največja sprememba odziva se tako odraža po dodatku 0,5 %

aluminijeve soli k ekstraktu šentjanževke pri metodi 1 (okrog 10 % v primerjavi z ekstraktom

brez dodatka). Sledi metoda 2 (znižanje odziva za okrog 8 % glede na ekstrakt brez dodatka)

in nato metoda 3 (znižanje odziva za približno 7 % v primerjavi z ekstraktom brez dodatka).

Še manjše znižanje odziva (za okrog 4 % glede na ekstrakt brez dodatka) povzroči dodatek

aluminijeve soli k ekstraktu pri metodi B. Razlog za takšno spremembo smo omenili že pri

analizah standarda hipericina in sicer pufer pri metodi B vsebuje fosfatne ione, ki bi lahko

interagirali z aluminijevimi ioni in s tem preprečili tvorbo kompleksa med aluminijem in

hipericinom. Tako kot pri standardu je tudi pri ekstraktu farmakopejska metoda tista, pri

kateri je prišlo do najnižjih sprememb po dodatkih aluminijevega sulfata. Glede na

odstotkovne spremembe AUC-jev pri standardu, ki smo mu dodali različne koncentracije

aluminijeve soli, opazimo, da spremembe pri ekstraktu niso tako velike. Razlog je lahko ta,

da so v ekstraktu prisotne razne snovi, ki preprečujejo vezavo aluminija na hipericin. Zaradi

tega dodatek aluminijeve soli nima tolikšnega vpliva na spremembo vrednosti AUC-ja

hipericina v ekstraktu.

1.200.000

1.250.000

1.300.000

1.350.000

1.400.000

1.450.000

1.500.000

1.550.000

10.000.000

10.500.000

11.000.000

11.500.000

12.000.000

12.500.000

13.000.000

brez

dodatka

0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%

AU

C (

met

od

a B

)

AU

C (

met

od

e A

)

Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih koncentracij

aluminijevega sulfata, metode A in metoda B, fluorescenčni detektor



41

Za razliko od standarda hipericina je vrh, ki domnevno pripada kompleksu aluminija s

hipericinom, prisoten že na kromatogramu ekstrakta brez dodatka. Iz tega lahko sklepamo,

da je takšen kompleks prisoten že v naravi, v rastlini.

4.3.2 DODATKI KISLINE IN BAZE K EKSTRAKTU ŠENTJANŽEVKE

Z naslednjim poskusom smo želeli preveriti vpliv pH-ja (dodatek kisline in baze) na AUC

hipericina v ekstraktu šentjanževke. V temne viale z vgrajenim insertom smo pripravili

vzorce, kot je opisano v poglavju 3.2.2. Analizirali smo po metodah A in metodi B.

Graf 15: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov kisline ter baze na AUC hipericina. Primerjava

vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B). Na levi (primarni) navpični osi je podan

odziv za metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan odziv za metodo B.

Glede na dobljene rezultate, ki jih predstavlja graf 15 lahko sklepamo, da dodatek kisline in

baze k ekstraktu šentjanževke nima večjega vpliva na AUC hipericina (vse spremembe so

manjše od 6 % glede na ekstrakt brez dodatka). Hipericin je v vodno-alkoholnih raztopinah

stabilen tako pri nizkih kot tudi pri visokih pH-jih (53).

V primerjavi s standardom pa so spremembe pri ekstraktu tudi po dodatku kisline in baze

manjše. Takšni rezultati so lahko prav tako posledica dejstva, da so v ekstraktu poleg

hipericina prisotne še druge spojine, ki kot pufer preprečujejo velike spremembe AUC-jev

oziroma povečajo stabilnost hipericina.

Pri metodah A je pri kromatografskem vrhu hipericina po dodatku baze prišlo do manjše

spremembe izgleda vrha (rahlo znižanje na desni strani vrha in zvišanje na levi strani),

vendar to ni imelo večjega vpliva na skupno površino pod krivuljo.

1.200.000

1.250.000

1.300.000

1.350.000

1.400.000

1.450.000

1.500.000

1.550.000

10.000.000

10.500.000

11.000.000

11.500.000

12.000.000

12.500.000

13.000.000

brez dodatka 0,25% ocetna

kislina

0,5% ocetna

kislina

0,5% TEA 1% TEA

AU

C (

met

od

a B

)

AU

C (

met

od

e A

)

Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov kisline ter baze, metode A in metoda




42

Pri opazovanju kromatogramov smo opazili, da je po dodatku baze prišlo do občutnih

sprememb pri psevdohipericinu. Psevdohipericin je na dodatek baze veliko bolj občutljiv

kot hipericin. Na sliki 17 je prikazan predviden mehanizem pretvorbe psevdohipericina v

alkalnem mediju, kjer pride do ireverzibilne degradacije, ki vodi do nastanka nove spojine

– izopsevdohipericina (51, 52). Kadar je pH nižji od 4, je psevdohipericin stabilen in ne pride

do tvorbe izopsevdohipericina. Če je pH višji od 10, je pretvorba psevdohipericina v

izopsevdohipericin hitra in popolna. Do vzpostavitve ravnotežja med spojinama v vodno-

alkoholnih raztopinah pa pride pri pH vrednostih med 4 in 10 (53).

Slika 17: Predviden mehanizem pretvorbe psevdohipericina v izopsevdohipericin (prirejeno po (52))

Izopsevdohipericin je ciklični eter, izomer psevdohipericina. Retencijski čas in UV-VIS

spekter izopsevdohipericina sta odvisna od pH-ja. Retencijski čas izopsevdohipericina je

višji od tr psevdohipericina, kar prikazuje slika 18 (54).


43

Slika 18: Kromatogram ekstrakta šentjanževke, metoda 1, absorbančni detektor. Roza barva

ponazarja spremembe AUC-jev po dodatku baze. Vidimo, da se vrh psevdohipericina precej zniža,

desno od njega (višji tr) pa se pojavi nov vrh, ki po naših predvidevanjih predstavlja

izopsevdohipericin.

V UV-VIS spektru (graf 16) je po dodatku baze prišlo do zmanjšanja intenzitete

absorpcijskega maksimuma – hipokromnega efekta. Prav tako se je pri višjih valovnih

dolžinah intenziteta nekoliko povišala. Večjo spremembo spektra opazimo tudi pri valovni

dolžini okrog 400 nm. Vse te spremembe v UV-VIS spektru so lahko odgovorne za opaženo

spremembo barve vzorcev ekstrakta po dodatku baze (poglavje 4.1.2), kjer so se vzorci po

dodatku baze obarvali v temnejšo rjavordečo barvo.

Graf 16: Primerjava UV-VIS absorpcijskih spektrov ekstrakta brez dodatka in ekstrakta po dodatku

baze. Del spektra pod 400 nm najverjetneje predstavlja šum, ki je verjetno posledica prekoračene

zmogljivosti spektrofotometra.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

22500

25000

27500

30000

32500

35000

uV

0

1

2

3

4

5

6

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Ab

sorb

anca

Valovna dolžina [nm]

brez dodatka H2O 0,5% TEA 1% TEA

ekstrakt brez

dodatka

psevdohipericin

izopsevdohipericin

dodatek

baze


44

Po dodatku baze pride namreč do nastanka fenolatnega aniona, kar pa vpliva na porazdelitev

elektronske gostote. Posledica tega bi lahko bila sprememba barve in absorpcijskega

maksimuma.

4.4 PRIMERJAVA UPORABLJENIH METOD PRI HPLC ANALIZAH

Pri eksperimentalnem delu smo HPLC analize opravljali z različnimi uporabljenimi

metodami, ki so opisane v poglavju 3.2.4.

Pri primerjavi različno dolgih metod A smo opazili, da je retencijski čas hipericina najkrajši

pri metodi 1, ki vsebuje največji delež organskega topila. Čas, ki je potreben za elucijo

določene spojine iz kolone, je v veliki meri odvisen od razmerja med komponentama v

mobilni fazi. Spojina tvori interakcije s stacionarno fazo na osnovi lipofilnosti, hkrati pa so

najverjetneje prisotni še drugi parametri, ki vplivajo na zadrževanje spojine na koloni:

sterični vpliv, vpliv gibljivosti (vezi okoli katerih se molekula vrti in tako zavzema različne

konformacije) in vodikove vezi. Ločevanje komponent se odvija na osnovi porazdeljevanja

spojine med mobilno in stacionarno fazo. Manj polarne molekule se v večji meri

porazdeljujejo na stacionarno fazo, zato je njihov retencijski čas daljši, bolj polarne molekule

pa se iz kolone izločijo prej. Strukturne lastnosti predstavljajo pomembno vlogo pri

zadrževanju analizirane spojine. Takšno obnašanje hipericina si lahko razlagamo tako, da

večji kot je delež vode v mobilni fazi, bolj je ta polarna, manjša je afiniteta nepolarne spojine

do polarne mobilne faze in spojina se pozneje izloči iz kolone. Ko pa se poveča delež

acetonitrila, se zmanjša retencijski čas spojine, saj »močno« topilo na nekakšen način

tekmuje s stacionarno fazo.

Farmakopejska metoda (metoda B, slika 19 in 21) se je pri našem eksperimentalnem delu s

hipericinom pokazala kot boljša izbira, saj ima kratek čas analize, obenem pa večjo simetrijo

vrhov (manjši »tailing«), kar je povezano z ločljivostjo in možnostjo kvantifikacije – v

našem primeru je to izredno pomembno, saj vsebuje ekstrakt zelo pester spekter različnih

spojin. Prav tako pufer pri metodi B vsebuje fosfatne ione, ki bi lahko interagirali z

aluminijevimi ioni in tako preprečili tvorbo kompleksa med aluminijevimi ioni in

hipericinom ter s tem znižanje površine pod krivuljo hipericina.

Pri metodah A (slika 20 in 22) pa je zaradi nesimetričnih vrhov zaradi »tailinga« otežena

kvantifikacija. Prav tako je pri teh metodah večji vpliv matriksa na odziv na detektorju.


45

Metoda A zatorej ne predstavlja optimalne metode za raziskovanje hipericina, vendar se

nenazadnje v prvotnem namenu uporablja pri raziskovanju fagopirinov, za katere pa se je

izkazala kot zelo primerna.

Slika 19: Kromatogram standarda hipericina pri metodi B, fluorescenčni detektor

Slika 20: Kromatogram standarda hipericina pri metodi 1, fluorescenčni detektor

Slika 21: Kromatogram ekstrakta šentjanževke pri metodi B, fluorescenčni detektor

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

uV

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

uV

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

uV

hipericin

hipericin

kompleks hipericina

z aluminijem

hipericin

psevdohipericin


46

Slika 22: Kromatogram ekstrakta šentjanževke pri metodi 1, fluorescenčni detektor

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

uV

hipericin

psevdohipericin

izopsevdohipericin

kompleks

hipericina z

aluminijem


47

5 SKLEP

V magistrskem delu smo raziskali vpliv matriksa vzorca na rezultat HPLC analize. K

standardu hipericina in ekstraktu šentjanževke smo dodali različne koncentracije mešanice

soli (natrijev klorid, magnezijev klorid, kalcijev karbonat in aluminijev sulfat), 0,5 %

posamezne komponente te mešanice, različne koncentracije aluminijevega sulfata, ocetno

kislino in trietilamin. Preverili smo tudi vpliv stekla različnih vial na odziv hipericina na

detektorju. Pri pripravljanju vzorcev smo pri določenih dodatkih zaznali spremembo barve.

Pri standardu hipericina je spremembo barve iz rožnate v modrikasto povzročil dodatek

aluminijevega sulfata, pri ekstraktu šentjanževke pa je dodatek trietilamina spremenil barvo

iz svetlejše rdeče v temnejšo rdečerjavo.

Tekom magistrskega dela smo ugotovili, da najbolj značilno spremembo površine pod

krivuljo hipericina povzroči dodatek aluminijevega sulfata. Tako smo si razložili tudi

spremembo barve raztopine standarda hipericina po dodatku te soli. Posneli smo celoten

UV-VIS spekter in tudi tam opazili, da je po dodatku te soli prišlo do premika absorpcijskega

vrha hipericina. Natrijev klorid, magnezijev klorid, kalcijev karbonat, ocetna kislina in

trietilamin nimajo bistvenega vpliva na površino pod krivuljo hipericina. Sprememba

površine pod krivuljo hipericina je bila pri vseh dodatkih večja pri uporabi standarda

hipericina kakor pri ekstraktu šentjanževke. Sklepamo, da kompleksen ekstrakt šentjanževke

vsebuje spojine, ki preprečujejo nastanek kompleksa aluminijevih ionov s hipericinom in

zaradi tega ne pride do takšne spremembe površine pod krivuljo kromatografskega vrha

hipericina. Pri opazovanju kromatogramov smo opazili, da je po dodatku baze prišlo do

občutnih sprememb pri psevdohipericinu. V alkalnem mediju pride do ireverzibilne

degradacije psevdohipericina, ki vodi do nastanka nove spojine – izopsevdohipericina, le-ta

ima višji tr kot psevdohipericin. Ugotovili smo, da tip stekla, iz katerega je viala, ter

predhodno spiranje vial z MeOH, ne vpliva na odziv hipericina na detektorju.

Ugotovili smo, da je pri uporabi metod A opaziti večji vpliv matriksa na odziv hipericina na

detektorju. Razlog je najverjetneje ta, da pufer pri metodi B vsebuje fosfatne ione, ki bi lahko

interagirali z aluminijevimi ioni in s tem preprečili tvorbo kompleksa med hipericinom in

aluminijevimi ioni ter s tem preprečili znižanje AUC-ja. Kromatografski vrhovi pri

metodah A so nesimetrični in zaradi tega je otežena tudi kvantifikacija. Farmakopejska


48

metoda (metoda B) ima boljšo simetrijo vrhov (manjši »tailing«) in s tem tudi boljšo možnost

kvantifikacije.

Rezultati, ki smo jih pridobili tekom analiz v magistrski nalogi, niso potrdili sprememb, ki

so bile opažene pri raziskovanju hipericinu podobnih spojin (fagopirinov iz ajde) in so bile

v kasnejši diplomski nalogi Andraža Počiča na temo hipericina potrjene. Te sklepe smo z

našim magistrskim delom ovrgli.

Zaključili smo, da je za analizo hipericina najprimernejša farmakopejska metoda. Sklepamo,

da k temu pripomore prisotnost fosfatnega pufra in ustrezna pufrna kapaciteta te metode, ki

dobro nasprotuje spremembam pH-ja. K manjšemu vplivu dodatkov na kromatografski vrh

hipericina prispevajo tudi spojine, ki so poleg hipericina prisotne v kompleksnem izvlečku

šentjanževke. Pri analiziranju manj kompleksnih raztopin, kot je standardna raztopina

hipericina, pa je pozornost potrebno nameniti prisotnosti aluminijevih soli, ki lahko vplivajo

na analitski rezultat. V prihodnosti bi lahko preizkusili, kako je pojav odvisen od tipa

aluminijeve soli.


49

6 LITERATURA

1. Gîtea D, Şipoş M, Mircea T, Paşca B: The analysis of alcoholic extracts of

Hypericum species by UV/VIS spectrophotometry. Tom. XWII/1, 2010; pp. 111–5.

2. Kreft S, Kočevar Glavač N, Stojilkovski K, Mlinarič A, Injac R, Novak A, Doljak B,

Štrukelj B, Slanc Može P, Umek A, Lunder M, Kristl J, Janeš D, Berlec A, Sabotič

J, Glavač I: Sodobna fitoterapija: z dokazi podprta uporaba zdravilnih rastlin,

Slovensko farmacevtsko društvo, Ljubljana, 2013: 50–5.

3. Reader's Digest: Velika knjiga o zeliščih, Mladinska knjiga Založba, d. d., Ljubljana,

2014: 107.

4. Grünwald J, Jänicke C: Zelena lekarna, Mladinska knjiga Založba, d. d., Ljubljana,

2007: 359–60.

5. Rao V, Veeresham G: An overview on Hypericum perforatum Linn. Natural Product

Radiance, 2005; 4(5): 368–81.

6. Gupta R. K, Möller H.-J: St. John's Wort, An option for the primary care treatment

of depressive patients? European Archives of Psychiatry and clinical Neuroscience,

2003; 253: 140–8.

7. Barnes J, Anderson L, Phillipson J.D: St John's wort (Hypericum perforatum L.): a

review of its chemistry, pharmacology and clinical properties. Journal of Pharmacy

and Pharmacology, 2001; 53: 583–600.

8. Willfort R: Zdravilne rastline in njih uporaba, Založba obzorja Maribor, Maribor,

1988: 303–4.

9. http://en.wikipedia.org/wiki/Hypericum_perforatum (dostop november 2014).

10. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Hypericum_perforatum_i01.jpg (dostop

november 2014).

11. Ernst E (urednik): Hypericum, The genus Hypericum, Taylor&Francis, London, New

York, 2003: 77–8.

12. Piovan A, Filippini R, Borsarini A, Caniato R: Letter to the Editor. Rapid

Communications in Mass Spectrometry, 2004; 18: 131–2.

13. EMEA, Committee on herbal medicinal products (HMPC), Assessment report on

Hypericum perforatum L., herba, 2009.


50

14. Liu F, Pan C, Drumm P, Ang C: Liquid chromatography-mass spectrometry studies

of St. John's wort methanol extraction: active constituents and their transformation.

Journal of Pharmaceutical and Biomedicinal Analysis, 2005; 37: 303–12.

15. Cossuta D, Vatai T, Báthori M, Hohmann J, Keve T, Simándi B: Extraction of

hyperforin and hypericin from St. John's wort (Hypericum perforatum L.) with

different solvents. Journal of Food Process Engineering, 2011; 1–14.

16. Karioti A, Bilia A. R: Hypericins as Potential Leads for New Therapeutics.

International Journal of Molecular Sciences, 2010; 11: 562–94.

17. Xenophontos M, Stavropoulos E, Avramakis E, Navakoudis E, Dörnemann D,

Kotzabasis K: Influence of the Developmental Stage on the (Proto)Hypericin and

(Proto)Pseudohypericin Levels of Hypericum Plants from Crete. Planta Med, 2007;

73: 1309–15.

18. Galle-Toplak K: Zdravilne rastline na Slovenskem, Založba Mladinska knjiga,

Ljubljana, 2002: 132–3.

19. Anyżewska M, Kowalczuk A, Łozak A, Jabłczyńska R, Fijałek Z: Determination of

total hypericins in St. John's wort and herbal medicinal products. Acta Poloniae

Pharmaceutica-Drug Research, 2010; 67(6): 586–93.

20. Darmanyan A, S. Jenks W, Eloy D, Jardon P: Quenching of Excited Triplet State

Hypericin with Energy Acceptors and Donors and Acceptors of Electrons. The

Journal of Physical Chemistry B, 1999; 103: 3323–31.

21. Skalkos D, Tatsis E, P. Gerothanassis I, Trogranis A: Towards a consensus

structure of hypericin in solution: direct evidence for a single tautomer and different

ionization states in protic and nonprotic solvents by the use of variable temperature

gradient 1H NMR. Tetrahedron, 2002; 58: 4925–9.

22. Berlanda J, Kiesslich T, Engelhardt V, Krammer B, Plaetzer K: Comparative in

vitro study on the characteristics of different photosensitizers employed in PDT.

Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2010; 100: 173–80.

23. Pravilnik o razvrstitvi zdravilnih rastlin, 2008, Uradni list RS št. 103/2008, 30. 10.

2008, str. 13637.

24. De los Reyes G, Koda R: Determining hyperforin and hypericin content in eight

brands of St. John's wort. American Journal of Health-System Pharmacy, 2002; 59:

545–7.


51

25. Rückert U, Likussar W, Michelitsch A: Simuntaneous Determination of Total

Hypericin and Hyperforin in St. John's Wort Extracts by HPLC with

Electrochemical Detection. Phytochemical Analysis, 2007; 18: 204–8.

26. Butterweck V, Schmidt M: St. John's wort: Role of active compounds for its

mechanism of action and efficacy. Wiener Medizinische Wochenschrift, 2007;

157/13–14: 356–61.

27. Kennedy D. O, Wightman E. L: Herbal Extracts and Phytochemicals: Plant

Secondary Metabolites and the Enhancement of Human Brain Function. Advances

in Nutrition, 2011; 2: 32–50.

28. Li W, Fitzloff J. F: High performance liquid chromatographic analysis of St. John's

Wort with photodiode array detection. Journal of Chromatography B, 2001; 765:

99–105.

29. Lawvere S, Mahoney M. C: St. John's Wort. American Family Physician, 2005;

72(11): 2249–54.

30. Tracy T. S, Kingston R. L (urednika): Herbal products: toxicology and clinical

pharmacology, Humana Press, New Yersey, 2007: 71–95.

31. Tolonen A, Hohtola A, Jalonen J: Fast High-performance Liquid Chromatographic

Analysis of Naphthodianthrones and Phloroglucinols from Hypericum perforatum

Extracts. Phytochemical Analysis, 2003; 14: 306–9.

32. Izzo AA, Ernst E: Interactions between herbal medicines and prescribed drugs: a

systematis review. Drugs, 2001; 61: 2163–75.

33. Madabushi R, Frank B, Drewelow B, Derendorf H, Butterweck V: Hyperforin in St.

John's wort drug interactions. European Journal of Clinical Pharmacology, 2006; 62:

225–33.

34. Kreft S: Varni in učinkoviti: nova spoznanja o izvlečkih šentjanževke (Hypericum

perforatum). Farmacevtski vestnik, 2014; 65: 349–53.

35. Jürgenliemk G, Nahrstedt A: Dissolution, solubility and cooperativity of phenolic

compounds from Hypericum perforatum L. in aqueous systems. Pharmazie, 2003;

58: 200–3.

36. Zobayed S. M. A, Afreen F, Goto E, Kozai T: Plant-Environment Interactions:

Accumulation of Hypericin in Dark Glands of Hypericum perforatum. Annals of

Botany, 2006; 98: 793–804.


52

37. Obermüller R. A, Schütz G. J, Gruber H. J, Falk H: Concerning Regioselective

Photochemical Intermolecular Proton Transfer from Hypericin. Monatshefte für

Chemie, 1999; 130: 275–81.

38. Falk H, Mayr E: Concerning bay Salt and peri Chelate Formation of

Hydroxyphenanthroperylene Quinones (Fringelites). Monatshefte für Chemie, 1997;

128: 353–60.

39. Amer A. M, Falk H, Tran H. T. N: The Dissociation and Tautomerization Equilibria

of Hypericin: Alkyl Protected Hydroxyl Derivates. Monatshefte für Chemie, 1998;

129: 1237–44.

40. Dax T. G, Falk H, Kapinus E. I: A Structural Proof for the Hypericin 1, 6-Dioxo

Tautomer. Monatshefte für Chemie, 1999; 130: 827–31.

41. Mylrajan M, Hildebrandt P, Mazur Y: Vibrational spectroscopy of hypericin, its

sodium salt and pyridinium complex. Journal of Molecular Structure, 1997; 407: 5–

10.

42. Baugh S. F: Simultaneous Determination of Protopseudohypericin, Pseudohypericin,

Protohypericin, and Hypericin Without Light Exposure. Journal of AOAC

International, 2005; 88(6): 1607–12.

43. Gemal Jensen A, Cornett C, Gudiksen L, Honoré Hansen S: Characterisation of

Extracts of Hypericum perforatum L. using an On-line HPLC System with

UV/Visible and Fluorescence Detection Prior to and after Photochemical Conversion

of the Effluent. Phytochemical Analysis, 2000; 11: 387–94.

44. Zotou A, Loukou Z: Determination of Hypericin and Pseudohypericin in Extracts

from Hypericum Perforatum L. and Pharmaceutical Preparations by Liquid

Chromatography-Fluorescence Detection. Chromatographia, 2001; 54(3/4): 218–24.

45. Gemal Jensen A, Honoré Hansen S: Separation of hypericins and hyperforins in

extracts of Hypericum perforatum L. using non-aqueous capillary electrophoresis

with reversed electro-osmotic flow. Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, 2002; 27: 167–76.

46. Wagner H, Bladt S: Pharmaceutical quality of hypericum extracts. Journal of

Geriatric Psychiatry and Neurology, 1994; 7(1): 65–8.

47. Žorž M: HPLC, Samozaložba, Ljubljana, 1991: 5.

48. Žakelj S: Dejavniki, ki vplivajo na HPLC-ločbo in parametri s katerimi jo opišemo.

Instrumentalne analizne metode v farmaciji, predavanja, 2012.


53

49. Skoog D. A, Holler F. J, Crouch S. R: Principles of instrumental analysis, 2007: 316–

32

50. Wirz A, Meier B, Sticher O: Solubility of hypericin in methanol and methanol-

pyridine. Pharmazie, 2002; 57(8):543–5.

51. Fourneron J.-D, Herbette G, Caloprisco E: Pseudohypericin and hypericin in St.

John's wort extracts. Breakdown of pseudohypericin. Comptes Rendus de l'Académie

des Sciences Paris, 1999; 2: 127–31.

52. Hecka A, Maunit B, Aubriet F, Muller J.-F: Study of active naphtodianthrone St

John's Wort compounds by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron

resonance and multi-stage mass spectrometry in sustained off-resonance irridiation

collision-induced dissociation and infrared multiphoton dissociation modes. Rapid

Communications in Mass Spectrometry, 2009; 23: 885–98.

53. Naït-Si Y, Fourneron J.-D: Chemical and Chromatographic Behavior of

Pseudohypericin and Isopseudohypericin, and the Occurrence of Isopseudohypericin

in Saint John's Wort (Hypericum perforatum) Extracts. Monatshefte für Chemie,

2005; 136: 159–68.

54. Fourneron J.-D, Naït-Si Y, Rosas R, Faure R, Viant P: Identification of

isopseudohypericin, a new phenanthroperylene quinone obtained by the alkaline

treatment of pseudohypericin. Tetrahedron Letters, 2003; 44: 6285–8.

55. Evropska farmakopeja 8.0, 2014. St. John's Wort dry extract, quantified (Hyperici

herbae extractum siccum quantificatum). European Pharmacopoeia 8.0, 2014; 1393.

56. Lekarniška zbornica Slovenije: Uporaba zdravil rastlinskega izvora pri duševnih

motnjah, Lekarniška zbornica Slovenije, Ljubljana, 2004: 18.

57. Leonhartsberger J. G, Falk H: The Protonation and deprotonation Equilibria of

Hypericin Revisited. Monatshefte für Chemie, 2002; 133: 167–72.

58. Počič A: Vpliv matriksov vzorca na analizo standarda hipericina in ekstraktov

šentjanževke s tekočinsko kromatografijo visoke zmogljivosti. Diplomsko delo.

Ljubljana, 2013.


54

7 PRILOGA

FARMAKOPEJSKA METODA (55), kvantifikacija suhega ekstrakta šentjanževke

(Ph. Eur. 8.0, Hyperici herbae extractum siccum quantificatum).

Postopek za določanje vsebnosti celokupnih hipericinov se izvaja s tekočinsko

kromatografijo (LC).

Priprava ekstrakta: ekstrakt se pripravi z uporabo etanola ali metanola (50–80 V/V %).

Testna raztopina: 70,0 mg ekstrakta raztopimo v 25,0 mL metanola R, nato obdelujemo v

ultrazvočni kadički in centrifugiramo. Raztopino izpostavimo svetlobi ksenonski luči z

močjo 765 W/m2 za osem minut.

Referenčna raztopina: količino suhega ekstrakta šentjanževke HRS, ki ustreza 0,15 mg

hipericinom, raztopimo v 25,0 mL metanola R. Nato postavimo na ultrazvok in

centrifugiramo ter za osem minut izpostavimo svetlobi ksenonske luči z močjo 765 W/m2.

Kolona:

l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm,

stacionarna faza: oktadecil silikagel za kromatografijo R (5 μm),

temperatura: 40 °C.

Mobilna faza: 39 volumskih enot etil acetata R, 41 volumskih enot 15,6 g/L raztopine

natrijevega dihidrogenfosfata R, pH se uravna s pomočjo fosforne kisline R na 2 in 160

volumskih enot metanola R.

Pretok: 1,0 mL/min.

Detekcija: spektrofotometer, valovna dolžina 590 nm.

Injiciranje: 20 μL.

Čas ločbe: 15 min.

Identifikacija vrhov: za identifikacijo vrhov hipericina in psevdohipericina primerjamo

kromatogram suhega ekstrakta šentjanževke HRS ter kromatogram referenčne raztopine.


55

Ustreznost sistema: referenčna raztopina:

dobljen kromatogram je podoben kromatogramu suhega ekstrakta šentjanževka

HRS,

resolucija je minimalno 2 med kromatografskima vrhovoma psevdohipericina in

hipericina.

Po sledeči formuli izračunaj odstotek celokupnih hipericinov, izraženih kot hipericin:

(A1+A2) x m2 x p

A1: površina pod krivuljo psevdohipericina, kromatogram testne raztopine;

A2: površina pod krivuljo hipericina, kromatogram testne raztopine;

A3: površina pod krivuljo hipericina, kromatogram referenčne raztopine;

m1: masa ekstrakta (g) za pripravo testne raztopine;

m2: masa suhega ekstrakta šentjanževke HRS (g) za pripravo referenčne raztopine;

p: odstotek vsebnosti hipericina v suhem ekstraktu šentjanževke HRS.

A3 x m1

Documents

TADEJA VAJGER - uni-lj.si