Thema: Die Rolle Foxp3-positiver regulatorischer T-Zellen ... · Aqua bidestillata AK Antikörper APC Antigen-präsentierende Zelle bzw. beziehungsweise ... GITR Glukokortikoid-induziertes

Aus der Abteilung für Immunologie

(Leiterin Prof. Dr. med. Barbara M. Bröker)

dem Institut für Immunologie und Transfusionsmedizin

der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Thema: Die Rolle Foxp3-positiver regulatorischer T-Zellen in der murinen

Sepsis

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktor der Medizin

(Dr. med.)

der

Medizinischen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2010

vorgelegt von:

Matthias Rath

geb. am: 13. Februar 1986

in: Lübz

II

Dekan: Prof. Dr. Heyo K. Kroemer

1. Gutachter: Prof. Dr. Barbara M. Bröker

2. Gutachter: Prof. Dr. Jochen Hühn

Ort, Raum: Greifswald, Besprechungsraum der Klinik für Anästhesiologie und

Intensivmedizin

Tag der Disputation: 23.04.2013

III

Meiner Familie und meinem Lebensgefährten Erik -

Ich danke Euch für die Unterstützung in schweren Zeiten.

Inhaltsverzeichnis

IV

Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS .................................................................................................................. IV

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................................... VIII

1 EINLEITUNG ................................................................................................................................. 1

1.1 SEPSIS, SIRS UND INTRA-ABDOMINELLE INFEKTIONEN ................................................................... 1

1.1.1 Definitionen ....................................................................................................................................... 1

1.1.2 Epidemiologie und Prognose ...................................................................................................... 3

1.1.3 Die abdominelle Sepsis .................................................................................................................. 4

1.1.4 Immunregulationsmechanismen in der Sepsis ................................................................... 4

1.2 REGULATORISCHE T-ZELLEN (TREGS) ............................................................................................... 7

1.2.1 Bedeutung der Tregs für die Immunhomöostase .............................................................. 7

1.2.2 Phänotyp der Tregs ........................................................................................................................ 8

1.2.3 Subtypen von Tregs und ihre Entwicklung .......................................................................... 9

1.2.4 Mechanismen der Immunmodulation durch Tregs ....................................................... 10

1.3 REGULATORISCHE T-ZELLEN IN MIKROBIELLEN INFEKTIONEN .................................................... 13

1.3.1 Immunmodulation durch Tregs in mikrobiellen Infektionen ................................... 13

1.3.2 Induktion von Tregs im Rahmen von Infektionen .......................................................... 13

1.3.3 Antigenspezifitäten von Tregs im Kontext mikrobieller Infektionen .................... 14

1.4 INHALT UND ZIELE DER ARBEIT ....................................................................................................... 15

2 MATERIAL .................................................................................................................................. 17

2.1 LABORGERÄTE ..................................................................................................................................... 17

2.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN ............................................................................................................... 18

2.3 ZELLBIOLOGISCHE ARBEITEN ............................................................................................................ 19

2.3.1 Reagenzien und Chemikalien .................................................................................................. 19

2.3.2 Medien, Puffer und Lösungen .................................................................................................. 21

2.3.3 Kits ...................................................................................................................................................... 21

2.4 PROTEINBIOCHEMISCHE ARBEITEN .................................................................................................. 21

2.4.1 Kits ...................................................................................................................................................... 21

Inhaltsverzeichnis

V

2.5 ANTIKÖRPER ....................................................................................................................................... 22

2.5.1 Antikörper für die Durchflusszytometrie ........................................................................... 22

2.5.2 Antikörper für die Immunfluoreszenzmikroskopie ....................................................... 23

2.6 TIEREXPERIMENTELLE ARBEITEN .................................................................................................... 24

2.7 DATENBANKEN UND SOFTWARE ....................................................................................................... 25

3 METHODEN ............................................................................................................................... 26

3.1 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN .................................................................................................. 26

3.1.1 Genehmigungen, Tiere und Tierhaltung ............................................................................ 26

3.1.2 Verwendete Mausstämme ........................................................................................................ 26

3.1.3 Typisierung ..................................................................................................................................... 27

3.1.4 Narkose ............................................................................................................................................. 27

3.1.5 In vivo Depletion von Foxp3+ Tregs ...................................................................................... 27

3.1.6 Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) ......................................................................... 28

3.1.7 Überlebenskinetiken ................................................................................................................... 28

3.1.8 Bewertung der Symptomschwere in septischen Tieren ............................................... 29

3.1.9 Tötung von Versuchstieren ...................................................................................................... 30

3.1.10 Serumgewinnung und Peritoneallavage ......................................................................... 30

3.1.11 Organexplantation .................................................................................................................... 30

3.1.12 Bakteriologische Untersuchungen ..................................................................................... 31

3.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN ......................................................................................................... 31

3.2.1 Isolation muriner Splenozyten ............................................................................................... 31

3.2.2 Zellzahlbestimmungen und Vitalitätsprüfung ................................................................ 32

3.2.3 Färbungen für die durchflusszytometrischen Analysen .............................................. 32

3.3 HISTOLOGISCHE METHODEN ............................................................................................................. 34

3.3.1 Herstellung von Kryostatschnitten ....................................................................................... 34

3.3.2 Immunfluoreszenzmikroskopische Dreifachfärbung von

CD4/Foxp3/CTLA-4 ................................................................................................................................... 34

3.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN ............................................................................................... 35

3.4.1 Bestimmung der Zytokinkonzentrationen in Serum und Lavage ........................... 35

3.4.2 Luminexmessung zur Bestimmung der Serumkonzentrationen von

IL-9 und IL-17 ............................................................................................................................................. 35

3.5 STATISTISCHE AUSWERTUNG ............................................................................................................ 36

Inhaltsverzeichnis

VI

4 ERGEBNISSE .............................................................................................................................. 37

4.1 EXPERIMENTELLE VORARBEITEN ..................................................................................................... 37

4.1.1 Prophylaktische Depletion von Tregs in vivo ................................................................... 37

4.1.2 Ansatz zur verzögerten Depletion von Tregs ................................................................... 38

4.1.3 Einfluss von Diphtherietoxin auf das bakterielle Wachstum .................................... 40

4.2 GRÖßE UND AKTIVIERUNGSSTATUS DER FOXP3+ TREG-POPULATION IN DER CASP ................. 40

4.3 EINFLUSS DER FOXP3+ TREGS AUF DEN SCHWEREGRAD DER POLYMIKROBIELLEN SEPSIS ........ 42

4.3.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell. ......................................... 42

4.3.2 Untersuchungen am Modell der verzögerten Treg - Depletion ................................ 43

4.4 EINFLUSS DER FOXP3+ TREGS AUF DIE BAKTERIELLE CLEARANCE UND DEN INFLUX VON

INNATEN IMMUNZELLEN INS PERITONEUM NACH CASP .......................................................................... 44

4.4.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell .......................................... 44


4.5 EINFLUSS DER FOXP3+ TREGS AUF DEN AKTIVIERUNGSSTATUS DES IMMUNSYSTEMS

UNTER BASALEN UND SEPTISCHEN BEDINGUNGEN .................................................................................... 49

4.5.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell .......................................... 49


4.6 UNTERSUCHUNGEN ZUM AUSSCHLUSS EINER TRANSIENTEN FOXP3+-EXPRESSION IN

AKTIVIERTEN TEFF-ZELLEN......................................................................................................................... 56

4.7 SERUMKONZENTRATIONEN VON IL-9 UND IL-17 IN DER SEPSIS ................................................. 58

5 DISKUSSION .............................................................................................................................. 60

5.1 GRÖßE UND AKTIVIERUNGSSTATUS DER TREG - POPULATION IM KONTEXT EINER

POLYMIKROBIELLEN SEPSIS ......................................................................................................................... 60

5.2 ROLLE UND FUNKTION DER FOXP3+ TREGS IN DER MURINEN SEPSIS .......................................... 63

5.3 WARUM HABEN HOCHGRADIG AKTIVIERTE TREGS KEINEN EINFLUSS AUF DIE

IMMUNANTWORT IN DER SEPSIS? ............................................................................................................... 66

6 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................. 70

7 LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................................................... 72

8 ANHANG: .................................................................................................................................... 79

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ........................................................................................................ 81

Inhaltsverzeichnis

VII

DANKSAGUNG ................................................................................................................................. 83

EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG .............................................................................................. 85

LEBENSLAUF .................................................................................................................................... 86

Abkürzungsverzeichnis

VIII


A. bidest. Aqua bidestillata

AK Antikörper

APC Antigen-präsentierende Zelle

bzw. beziehungsweise

CASP Colon Ascendens Stent Peritonitis

CBA Cytometric Bead Array

CD Differenzierungsantigen

(cluster of differentiation)

CFU Kolonie-bildende Einheiten

(colony forming units)

CLP Cecal ligation and puncture

CTLA-4 Zytotoxisches T-Lymphozyten Antigen - 4

(cytotoxic T lymphocyte antigen - 4)

DC Dendritische Zelle

DT Diphtherie-Toxin

DTR Diphtherie-Toxin-Rezeptor

eGFP verstärktes grün-fluoreszierendes Protein

(enhanced green fluorescent protein)

FACS Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

(fluorescence activated cell sorting)

FCS Fötales Kälberserum

(fetal calf serum)

FITC Fluorescein-Isothiocyanat

Foxp3 Forkhead box P3

G Gauge

GITR Glukokortikoid-induziertes Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-

verwandtes Protein

(glucocorticoid-induced TNF-Receptor- related protein)

ICOS induzierbarer Kostimulator

(inducible co-stimulator)


IX

IDO Indolamin-(2,3)-Dioxygenase

IFN Interferon

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

INR (internal normalized ratio)

iTreg induzierte regulatorische T-Zelle

KG Körpergewicht

LAG-3 Lympozyten-Aktivierungsgen 3

Mac-3 Makrophagen-Antigen -3

MCP-1 Monozyten chemoattraktives Protein 1

(monocyte chemoattractant protein 1)

nTreg natürliche regulatorische T-Zelle

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

(phosphate buffered saline)

PE Phycoerythrin

PE-Cy7 Phycoerythrin- Cyanine 7

POD Peroxidase

PTT partielle Thromboplastinzeit

(partial Thromboplastin time)

Rpm Umdrehungen pro Minute

(rounds per minute)

SIRS systemic inflammatory response syndrome

SD Standardabweichung

TCR T-Zell-Rezeptor

Th3 Typ 3 T-Helferzellen

TNF Tumor Nekrose Faktor

(tumor necrosis factor)

TNP Trinitrophenol

TRAIL Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand

Treg Regulatorische T-Zelle

Tr1 Typ 1 regulatorische T-Zellen

TRITC Tetramethyl-Rhoadamine-Isothiocyanat

TSA Tyramid Signal-Amplifikation

WT Wildtyp

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Sepsis, SIRS und intra-abdominelle Infektionen

Obwohl die 2002 auf dem Kongress der Europäischen Gesellschaft für Intensivmedizin

gegründete „Surviving Sepsis Campaign“ von jährlich 18 Millionen Sepsiserkrankten

weltweit ausgeht [1], ist dieses Krankheitsbild einer deutschen Studie zufolge der breiten

Öffentlichkeit noch immer weitgehend unbekannt [2]. Trotz intensiver Forschungs-

anstrengungen und höchsten intensivmedizinischen Behandlungsstandards konnte in den

letzten Jahrzehnten kein entscheidender Durchbruch in der Reduktion der Sepsismortalität

erreicht werden. Allein in Deutschland sterben noch immer etwa 60.000 Menschen jährlich an

dieser schweren Form der generalisierten Infektion [3]. Aufgrund der offensichtlichen

Diskrepanz zwischen der medizinischen und gesamtgesellschaftlichen Bedeutung auf der

einen und der öffentlichen Wahrnehmung auf der anderen Seite scheint es gerechtfertigt, die

Sepsis als völlig unterschätztes Krankheitsbild zu bezeichnen.

1.1.1 Definitionen

Da am Anfang der wissenschaftlichen Auseinandersetzung mit einer Krankheit immer die

eindeutige Definition derselben stehen muss, soll im Folgenden auf die klinisch verbreiteten

und oft überlappend verwendeten Bezeichnungen der Sepsis und des Systemic Inflammatory

Response Syndroms (SIRS) eingegangen werden.

Das 1992 auf der Sepsis Konsensus-Konferenz eingeführte Konzept des SIRS [4] zeichnet

sich durch das Vorliegen von mindestens zwei der folgenden Kriterien aus: 1. Fieber bzw.

Hypothermie, 2. Tachykardie, 3. Tachypnoe und 4. Leukozytose bzw. Leukopenie (nähere

Einzelheiten: siehe Tabelle 1). Dabei ist das Auftreten einer Infektion als Ursache dieser

systemischen Entzündungsreaktion nicht zwingend notwendig, da auch schwere primär

abakterielle Entzündungen wie Pankreatitiden und Verbrennungen zum klinischen Bild des

SIRS führen können [4]. Obwohl dieses Konzept mit den neuen Definitionen der

Internationalen Sepsis Konferenz von 2001 als offiziell zu unspezifisch verlassen wurde, gilt

es weiterhin als klinisch sehr praktikabel. Entsprechend wird seine Anwendung zur Diagnose

der schweren Sepsis und des septischen Schocks durch die Leitlinien der Deutschen

Sepsis-Gesellschaft e.V. und der Deutschen Interdisziplinären Vereinigung für Intensiv- und

Notfallmedizin weiter empfohlen [3].

Einleitung

2

Demgegenüber kann die Sepsis entsprechend den Empfehlungen der Sepsis Konferenz von

2001 abgegrenzt werden als eine systemische Entzündungsreaktion, welche im Rahmen einer

mikrobiologisch nachgewiesenen oder klinisch vermuteten Infektion auftritt [5, 6]. Neben

dem Infektionsnachweis gehören dabei zu den Diagnosekriterien der Sepsis wiederum das

Vorliegen von klassischen Entzündungsparametern und pathologischen Organdysfunktions-,

Gewebeperfusions- und hämodynamischen Merkmalen, wie sie auch bei dem abakteriellen

SIRS gefunden werden (Tabelle 1) [7-9].

1. Nachweis der Infektion

Diagnose der Infektion über den mikrobiologischen Nachweis oder durch klinische Kriterien

2. Systemic Inflammatory Response Syndrom (SIRS) (mind. 2 Kriterien)

Fieber ( 38 °C) oder Hypothermie ( 36 °C)

Tachykardie (Herzfrequenz 90 Schläge/min)

Tachypnoe (Frequenz 20/min) oder Hyperventilation (PaCO2 4,3 kPa/ 33 mmHg)

Leukozytose ( 12000/mm3) oder Leukopenie ( 4000/mm3) oder 10 % unreife

Neutrophile im Differentialblutbild

3. Akute Organdysfunktion (mind. 1 Kriterium)

Akute Enzephalopathie: eingeschränkte Vigilanz, Desorientiertheit, Unruhe, Delirium

Relative oder absolute Thrombozytopenie (Abfall der Thrombozyten um mehr als 30 %

innerhalb von 24 h oder Thrombozytenzahl unter 100.000/mm3. Akute Blutungen oder

immunologische Ursachen müssen ausgeschlossen sein.

Renale Dysfunktion: Eine Diurese von 0,5 ml/kg/h für wenigstens 2 h trotz ausreichender

Volumensubstitution und/oder Anstieg des Serumkreatinins > 2x oberhalb des üblichen

Referenzbereiches

Metabolische Azidose: Base Excess -5 mmol/l oder eine Laktatkonzentration

> 1,5x oberhalb des üblichen Referenzbereiches

Arterielle Hypoxämie: PaO2 10 kPa unter Raumluft oder ein PaO2/FiO2-Verhältnis von

33 kPa unter Sauerstoffapplikation. Manifeste Herz- oder Lungenerkrankungen müssen

als Ursache ausgeschlossen sein

Sepsis: Kriterien 1 und 2

Schwere Sepsis: Kriterien 1, 2 und 3

Septischer Schock: Kriterien 1 und 2 sowie für wenigstens 1 Stunde ein systolischer Blutdruck 90 mmHg

bzw mittlerer arterieller Druck Blutdruck 65 mmHg oder notwendiger Vasopressoreinsatz. Die

Hypotension besteht trotz adäquater Volumengabe und ist nicht durch andere Ursachen zu erklären

Tabelle 1: Diagnosekriterien für die Sepsis entsprechend S-2 Leitlinien der Deutschen Sepsis-

Gesellschaft e.V. und der Deutschen Interdisziplinären Vereinigung für Intensiv- und Notfallmedizin

(mod. nach [3])

Einleitung

3

Entscheidend jedoch ist, dass das klinische Bild der Sepsis als ein Krankheitskontinuum

verstanden werden muss, das in seinen extremen Ausprägungen der schweren Sepsis und des

septischen Schocks mit einer höheren Letalität assoziiert ist. Nach den Empfehlungen der

Expertenkonferenz wird dabei die schwere Sepsis charakterisiert durch zusätzlich zu den

allgemeinen Sepsiskriterien auftretende akute Organdysfunktionen. Davon abgegrenzt wird

der septische Schock, der trotz adäquater Volumensubstitution mit einer persistierenden

Hypotension assoziiert ist [5]. Dennoch ist keines der Diagnosekriterien für die Sepsis

spezifisch, was die Heterogenität des Krankheitsbildes unterstreicht.

1.1.2 Epidemiologie und Prognose

In einer europaweiten Studie zum Auftreten der Sepsis bei akut kranken Patienten

(SOAP-study) wurde gezeigt, dass nahezu jeder dritte Patient, der in eine Intensivstation

(ITS) eingeliefert wird, während seiner Hospitalisierung an einer Sepsis erkrankt [6, 10]. Für

Deutschland bedeutet dies eine Inzidenz von 154.000 Sepsiserkrankungen pro Jahr. Davon

sind 75.000 Patienten durch die gefährlichen Komplikationen einer schweren Sepsis oder

eines septischen Schocks bedroht [3, 11].

Sepsis geht vor allem von Pneumonien, Blutstrominfektionen, Infektionen des

Urogenitaltraktes, intra-abdominellen und chirurgischen Wund- sowie Weichteilinfektionen

aus oder ist mit intravasalen Kathetern assoziiert [12]. Das Erregerspektrum dieser

generalisierten Infektionen hat sich in den letzten Jahrzehnten kontinuierlich verändert und zu

einer deutlichen Zunahme von Gram-positiven Bakterien und Pilzen als Infektionsauslösern

geführt, sodass heute etwa 40 % der Sepsisfälle auf Intensivstationen durch Gram-positive

und 38 % durch Gram-negative Bakterien ausgelöst werden [10, 13]. Besonders

problematisch ist das häufige Auftreten von Mischinfektionen bei den auf der Intensivstation

selbst akquirierten Infektionen, welche die Behandlung deutlich erschweren.

Die mit der Sepsis verbundene Mortalität ist individuell schwer vorhersagbar und hängt

entscheidend von dem Schweregrad der Erkrankung ab [14]. Während bei der einfachen

Sepsis etwa 27 % der betroffenen Patienten versterben, ist die Letalität der schweren Sepsis

und des septischen Schocks mit 40 % und 56 % deutlich höher, wie eine neue Studie aus

Deutschland zeigt [8, 9]. Einige Studien sprechen sogar von Letalitäten bis zu 70 % für

Patienten im septischen Schock [9].

Einleitung

4

Die mit Sepsis verbundenen Kosten sind erheblich. Allein die direkten jährlichen Kosten für

die intensivmedizinische Betreuung der Patienten werden auf 1,77 Milliarden Euro

geschätzt [3], womit die Sepsis zu den teuersten Erkrankungen im deutschen Gesundheits-

system gehört [7, 8, 15, 16].

1.1.3 Die abdominelle Sepsis

Intraabdominelle Infektionen (IAI) sind eine der Haupttodesursachen auf chirurgischen

Intensivstationen. Insbesondere die healthcare-acquired Infektionen (HA-IAI), deren

Therapie sich durch das häufige Auftreten von mehrfach resistenten Keimen und damit der

Notwendigkeit zur Behandlung mit Breitspektrum-Antibiotika schwierig gestaltet [17], sind

als Komplikation nach viszeralchirurgischen Eingriffen gefürchtet. Da eine Entzündung im

Bauchraum unweigerlich zu einer Mitreaktion von Peritoneum und Darm führt [18], muss

jede intraabdominelle Infektion als potenziell lebensbedrohlich eingestuft werden und bedarf

intensivmedizinischer Behandlung. Mit einer postoperativen Inzidenz von 9-12 % und einer

Letalität von 42-80 % trägt die abdominelle Sepsis als generalisierte Form einer diffusen

Peritonitits wesentlich zur postoperativen Morbidität und Mortalität bei [18, 19].

1.1.4 Immunregulationsmechanismen in der Sepsis

Die Sepsis muss als ein hochgradig komplexes und dynamisches Krankheitsgeschehen

verstanden werden, das sich durch zahlreiche Interaktionen zwischen den eindringenden

pathogenen Mikroorganismen und den Abwehrsystemen des Wirts auszeichnet.

Das volle Ausmaß dieser zahlreichen Wechselwirkungen und die Gründe für die

Entgleisungen der Immunhomöostase sind nicht ausreichend verstanden. Während die

Bedeutung einer schnellen und effektiven anti-mikrobiellen Therapie für den

Behandlungserfolg der Sepsis unbestritten ist, muss das Bewusstsein für die Rolle und

Bedeutung des Wirts in diesem Prozess noch weiter gestärkt werden. Einige Autoren gehen in

diesem Zusammenhang soweit zu postulieren, dass die Letalität der Sepsis weniger durch den

direkten Einfluss der Pathogene als vielmehr durch die komplexe immunologische Reaktion

des Wirts verursacht wird [20].

Die systemische Abwehrreaktion des Wirts auf die generalisierte Infektion verläuft in der

Sepsis biphasisch. Zu Beginn überwiegt die Hyperinflammation, die sich durch hohe

systemische Konzentrationen der proinflammtorischen Zytokine IL-1, TNF und IL-6

auszeichnet, im späteren Sepsisverlauf folgt meist eine hypoinflammatorische Phase, in

Einleitung

5

welcher hohe Spiegel der antiinflammatorischen Zytokine IL-10, TGF- und IL-4 im

Organismus zu finden sind [21-23] (Abbildung 1).

Abbildung 1: Biphasischer Verlauf der systemischen Immunantwort in der Sepsis. Adaptiert

nach Hotchkiss et al. [22] und Grimminger et al. [21].

Insbesondere, aber nicht ausschließlich Zellen des angeborenen Immunsystems wie

Makrophagen und neutrophile Granulozyten, welche die erste Front der zellulären Abwehr

darstellen, tragen in hoher Dichte Rezeptoren zur Erkennung von konservierten Strukturen

von Pathogenen auf ihrer Oberfläche und können innerhalb kurzer Zeit aktiviert werden [24].

Sie sezernieren dann große Mengen proinflammatorischer Zytokine, welche verschiedene

Mediatorkaskaden des Immun-, des Gerinnungs- und des neuroendokrinen Sytems

anschalten.

In der Konsequenz wird von verschiedenen Zellen die Produktion von Zytokinen wie

beispielsweise TNF, IFN und IL-12, aber auch von Leukotrienen, Prostaglandinen,

Hormonen und Enzymen (Proteasen, Elastasen) stark hochreguliert [25].

Aus diesen Gründen wurde in verschiedenen klinischen Studien (z. B. mit Kortikosteroiden

[26] oder IL-1-Rezeptorantagonisten [27]) versucht den „Zytokinsturm“ in der frühen

Hyperinflammation zu blockieren, um so das Überleben der Sepsispatienten zu verbessern. In

Placebo-kontrollierten Untersuchungen konnten hierdurch jedoch keine signifikanten

Überlebensvorteile gezeigt werden, obwohl präklinische Untersuchungen im Tiermodell sehr

vielversprechende Ergebnisse zeigten [26, 27].

Auf der Suche nach Ursachen für diese Fehlschläge wurden auch die kompensatorischen

antiinflammatorischen Mechanismen und die Rolle des erworbenen Immunsystems in den

Einleitung

6

Blick genommen, welche bisher eher im Hintergrund gestanden hatten. Vorarbeiten aus

unserem Labor zeigten im murinen Sepsismodell einer generalisierten, diffusen Peritonitis,

dass CD4-positive T-Lymphozyten innerhalb von Stunden nach der Induktion der Sepsis

systemisch aktiv werden und die lokale Immunantwort begrenzen. Diese Zellen hemmen

folglich die effektive Eindämmung einer systemischen Streuung der Bakterien und

beeinflussen das Überleben negativ [28]. Welche spezifische Subpopulation der

CD4+ T-Zellen (Th1, Th2, Th17, regulatorische T-Zellen) dafür verantwortlich ist, ist nicht

bekannt.

Die Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen legen nahe, dass ein Zusammenspiel von

zellulären Mechanismen, z. B. eine Immunsuppression durch Tregs und/oder eine durch

Apoptose in der Sepsis ausgelöste Anergie von Effektorzellen für die gefährliche

Immunparalyse bei Sepsis verantwortlich ist [22].

Da unter intensivmedizinischer Betreuung inzwischen weniger Sepsispatienten im initialen

Zytokinsturm versterben, sind sie besonders durch den Verlust ihrer Immunkompetenz und

durch schwere Sekundärinfektionen gefährdet [22, 29]. Eine Aufgabe in Zukunft besteht

folglich darin, eine individualisierte Therapie für Sepsispatienten zu entwickeln, die die

unterschiedlichen Phasen der Erkrankung berücksichtigt. Um dieses Ziel zu erreichen und

neue Therapieansätze zu identifizieren, müssen wir verstehen, welche Zellen eine protektive

Immunreaktion begrenzen und wie durch eine gezielte lokale Aktivierung der anti-

bakteriellen Abwehrmechanismen ein besseres Überleben erreicht werden kann.

Einleitung

7

1.2 Regulatorische T-Zellen (Tregs)

Das Immunsystem ist dafür ausgelegt, den Wirt effektiv vor Infektionen durch eindringende

pathogene Mikroorganismen zu schützen. Das interaktive und hoch komplexe Netzwerk der

verschiedenen Abwehrzellen muss dabei präzise reguliert werden, um Gewebeschäden durch

überschießende Immunantworten gegen Pathogene oder Allergene auf der einen sowie

Angriffe gegen lebensnotwendige kommensale Darmbakterien und gegen Selbstantigene auf

der anderen Seite zu verhindern [30, 31].

1.2.1 Bedeutung der Tregs für die Immunhomöostase

Dass neben passiven auch aktive zellvermittelte Regulationsmechanismen zur Begrenzung

einer Immunantwort und zur Aufrechterhaltung einer Selbst-Toleranz von entscheidender

Bedeutung sind, wurde seit langem vermutet [32, 33]. Heute ist die aktive Immunmodulation

durch eine Subpopulation der CD4-positiven T-Lymphozyten, die regulatorischen T-Zellen

(Treg), gut dokumentiert [30, 34, 35]. Es gibt immer mehr Hinweise dafür, dass diese

Regulatoren neben der Verhinderung von Autoimmunerkrankungen weitere mannigfaltige

Funktionen besitzen. Sie leisten einen wichtigen Beitrag zur Unterdrückung von Asthma und

Allergien, zur Induktion von Toleranz gegenüber Nahrungsantigenen, zur maternalen

Immuntoleranz gegenüber dem Fetus, zur Hemmung einer Immunantwort gegen kommensale

Mikroorganismen im Darm und zur Verhinderung der Aktivierung von T-Zellen durch

schwache antigene Stimuli sowie schließlich zur Feedback-Kontrolle einer durch T-Helfer-

Zellen vermittelten Effektorantwort [36].

In Anbetracht dieser zahlreichen Aufgaben in der Immunhomöostase ist es nicht erstaunlich,

dass der Verlust dieser Zellen mit schwerwiegenden pathologischen Dysregulationen und

Autoimmunerkrankungen assoziiert ist. So entwickelt sich bei Mäusen ohne regulatorische

T-Zellen ein als scurfy bezeichneter Phänotyp, der sich durch massive Lymphoproliferation

und durch multiple Autoimmunreaktionen in zahlreichen Organsystemen manifestiert [37-39]

und innerhalb von wenigen Wochen zum Tode führt. Beim Menschen entspricht diesem

Phänotyp das sogenannte IPEX-Syndrom (immune dysregulation, polyendocrinopathy,

enteropathy, X-linked syndrome), ebenfalls eine schwere genetische Erkrankung [40, 41].

Diese Symptomkomplexe verdeutlichen die herausragende Rolle der Tregs und haben einige

Autoren veranlasst, diese Zellpopulation als „Meister der Regulation“ oder „Hüter des

Lebens“ zu bezeichnen [42, 43].

Einleitung

8

1.2.2 Phänotyp der Tregs

Zunächst wurden Tregs experimentell durch das Oberflächenmolekül CD25 charakterisiert.

Jedoch ist CD25 auf Tregs zwar in hoher Dichte konstitutiv exprimiert, aber nicht spezifisch

für diese T-Zellen [44, 45]. Einerseits regulieren konventionelle T-Lymphozyten nach

Aktivierung CD25 hoch [46, 47], andererseits wurden in speziellen Geweben, wie

beispielsweise im Darm, CD25-negative Tregs beschrieben [48].

Als spezifischster Marker für Tregs gilt heute das X-chromosomal kodierte Forkhead box p3

Protein (Foxp3) [49-51], welches zur Gruppe der Forkhead-Transkriptionsfaktoren gehört.

Ihm wird eine zentrale Rolle in der Entwicklung, Funktion und Homöostase der Tregs

zugesprochen [50, 52, 53].

Obwohl derzeit kein einzelner spezifischer Oberflächenmarker für Tregs bekannt ist, gibt es

doch ein charakteristisches Expressionsprofil von Molekülen auf der Oberfläche von Tregs,

welche in ihrer Gesamtheit und in Verbindung mit Foxp3 [50] im Zellkern eine sichere

Charakterisierung der Tregs erlauben. So exprimieren Tregs schon unter homöostatischen

Bedingungen verschiedene Effektormoleküle, wie das zytotoxische T-Lymphozyten

Antigen 4 (CTLA-4), den Glukokortikoid-induzierten Tumor-Nekrose-Faktor-

Rezeptor (GITR), das Lymphozyten-Aktivierungs-Gen 3 (LAG-3), CD39 und CD73,

außerdem eine Reihe von kostimulatorischen Molekülen wie CD28, CD80/86, CD40, OX40

und 4-1BB und schließlich Chemokinrezeptoren wie CCR4 und CCR8 in hoher Dichte auf

ihrer Oberfläche [52].

Trotzdem bleibt die Isolierung von Foxp3-positiven Tregs schwierig, da nahezu alle diese

Oberflächen-assoziierten Moleküle auch auf aktivierten Effektor-T-Lymphozyten exprimiert

werden können [28]. Zudem wird durch neuere Studien die Rolle von Foxp3 als Marker für

Tregs beim Menschen hinterfragt. Diese zeigen, dass Foxp3 in aktivierten T-Zellen transient

hochreguliert wird und nicht zwangsläufig mit einem suppressorischen Potential dieser Zellen

assoziiert zu sein scheint [54, 55]. In der Maus wurde dieses Phänomen bisher nicht

beschrieben, so dass hier Foxp3 nach wie vor als Marker für Treg angesehen wird.

Von großer Bedeutung für die Rolle von regulatorischen T-Zellen, insbesondere bei der

Begrenzung von Gewebeschäden durch Mechanismen der Infektabwehr, ist die Tatsache, dass

Tregs nicht nur über ihren T-Zell-Rezeptor aktiviert werden können. Vielmehr konnten

verschiedene Studien zeigen, dass diese Zellen verschiedene Toll-like-Rezeptoren, darunter

TLR4, TLR5, TLR7 und TLR8 in hoher Dichte sowie geringe Mengen von TLR1, 3, 5 und 9,

als auch andere Pattern Recognition Rezeptoren (PRRs) exprimieren [56, 57]. Dadurch sind

Einleitung

9

sie in der Lage, hoch konservierte Strukturen von verschieden Mikroorganismen und

endogene Gefahrensignale, wie z. B. Stressproteine, zu erkennen, und sie können Antigen-

unabhängig aktiviert werden.

1.2.3 Subtypen von Tregs und ihre Entwicklung

CD4-positive Tregs werden heute nach ihrem Entwicklungsort in zwei große Gruppen

eingeteilt:

Natürliche regulatorische T-Zellen (nTreg)

Natürliche regulatorische T-Zellen (nTregs) entwickeln sich aus lymphoiden Vorläufer-

Zellen des Knochenmarks und reifen im Zuge der positiven und negativen Selektion im

Thymus. Sie weisen ein breites Repertoire an T-Zellrezeptor-Spezifitäten für Selbst-

Antigene auf [58]. In der Peripherie machen sie etwa 5-10 % der CD4-positiven

T-Lymphozyten aus [59, 60] und ihr Verlust führt im Mausmodell zu katastrophalen

Autoimmunerkrankungen mit schweren Entgleisungungen des immunologischen

Gleichgewichts durch Ausfall der peripheren Selbsttoleranz [37, 39].

Induzierte regulatorische T-Zellen (iTreg)

Eine zweite Gruppe von regulatorischen T-Zellen entsteht unter speziellen Bedingungen

durch Konversion außerhalb des Thymus in sekundären lymphatischen Organen aus

konventionellen nicht-regulatorischen T-Zellen [52]. Diese Zellen, welche zumindest

teilweise Foxp3-negativ bleiben [52, 58, 59, 61], werden als adaptive oder induzierte

Tregs bezeichnet [62]. Zu dieser heterogenen Population von Zellen mit

suppressorischem Potential gehören sowohl Typ 1 regulatorische T-Zellen (Tr1), die

durch Antigenstimulation in Anwesenheit von IL-10 induziert werden, als auch Typ 3

T-Helfer-Zellen (Th3), welche durch geringe Dosen von oral applizierten Antigenen in

Anwesenheit von TGF- induziert werden können und selbst über die lösliche oder

membrangebundene Form dieses Zytokins suppressorisch wirken [63]. Daneben wurde

von einigen Autoren auch die Existenz von IL-10+ TGF-+ CD4+ Tregs und

verschiedenen CD8-positiven suppressorischen T-Lymphozyten beschrieben [59]. Im

Unterschied zu nTregs ist die T-Zell-Rezeptorspezifität der iTregs oft auf einen

bestimmten Zelltyp beziehungsweise wenige Tumor- oder Fremdantigene beschränkt.

Einleitung

10

Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz und

der Begrenzung von Gewebeschäden bei chronischen Infektionen. Von zentraler

Bedeutung ist dies in der Darmmukosa und im Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe

(GALT) [58].

1.2.4 Mechanismen der Immunmodulation durch Tregs

Zu den Zielzellen der Treg-vermittelten Suppression gehören neben CD4+ und

CD8+ T-Lymphozyten auch eine Reihe weiterer Effektorzellen wie dendritische Zellen,

B-Zellen, Makrophagen, Osteoblasten, Mast-Zellen, NK- und NKT-Zellen [42, 64]. Zur

Hemmung der Proliferation und Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen verfügen

Tregs über ein ganzes Arsenal von Möglichkeiten, die Immunantworten des Abwehrsystems

über teilweise Zellkontakt-abhängige und teilweise Zellkontakt-unabhängige Wege zu

dämpfen [65]. Vignali et al. teilen die zahlreichen suppressorischen Mechanismen von Tregs

nach den ihnen zugrunde liegenden Prinzipien in vier große Gruppen ein [58, 66] (Abbildung

2):

1. Suppression durch Ausschüttung von inhibitorischen Zytokinen

Zahlreiche in vitro Studien haben die Bedeutung des direkten Zell-Zell-Kontaktes zur

Entfaltung des suppressorischen Potentials von Tregs belegt [66, 67]. Dennoch gibt es

immer mehr Hinweise dafür, dass in vivo auch die Ausschüttung von inhibitorischen

Zytokinen durch Tregs entscheidend ist [31, 64]. Obwohl ihr jeweiliger Beitrag im

Einzelfall noch kontrovers diskutiert wird, ist die generelle Bedeutung der inhibitorischen

Zytokine IL-10 und TGF-, die in großen Mengen insbesondere von iTregs produziert

werden, für die Treg-vermittelte Kontrolle von Entzündung und homöostatischer

Expansion von Immunzellen durch zahlreiche in vivo Modelle gesichert [65, 68]. Mit

IL-35 wurde durch Vignali et al. ein neues Mitglied in der Gruppe der inhibitorischen

Zytokine beschrieben, das sowohl in vivo als auch in vitro für die Suppression durch

Tregs wichtig zu sein scheint [69]. So verringert der Verlust von IL-35 die

suppressorische Kompetenz von Tregs drastisch [65].

2. Suppression durch Veränderung der metabolischen Aktivität der Zielzelle

Neben inhibitorischen Zytokinen wurde auch die Modulation der metabolischen Aktivität

von Effektorzellen durch die intra- oder extrazelluläre Ausschüttung von Adenosin-

Einleitung

11

Nukleosiden als ein Suppressionsmechanismus von Tregs beschrieben [66]. Tregs

exprimieren die Oberflächenmoleküle CD39 und CD73, welche durch ihre Enzymaktivität

Adenosin extrazellulär freisetzen, so dass es in der Umgebung der Zelle akkumuliert.

Adenosin entfaltet seine suppressorische Wirkung auf die Zielzelle durch Bindung an

Typ 1 purinerge Adenosin-Rezeptoren [70]. Des Weiteren scheint auch zyklisches

Adenosin-Monophosphat (cAMP), welches über Gap Junctions von Tregs in Effektor-

Zellen eindringt und dort als potenter Second Messenger wirkt, an der direkten

Suppression der Zielzelle beteiligt zu sein [71].

Einer der wichtigsten Wege, den Tregs für ihre Suppression nutzen, ist der Verbrauch von

IL-2, welches einen wichtigen anti-apoptotischen Stimulus für Effektorzellen darstellt. Da

Tregs die -Kette des IL-2-Rezeptors (CD25) in hoher Dichte auf ihrer Oberfläche

exprimieren, sind sie in der Lage große Mengen IL-2 zu binden. Dadurch entsteht bei

Teff-Zellen ein IL-2-Mangel, welcher eine Bim-vermittelten Apoptose der Zielzelle

auslöst [64]. Diese Form der Apoptose wird auch „Tod durch Vernachlässigung“ genannt.

3. Suppression durch Modulation der Funktion von Antigen-präsentierenden dendritischen

Zellen

Neben der direkten inhibitorischen Wirkung von Tregs auf ihre Zielzellen supprimieren

sie diese auch indirekt, indem sie die Reifung und Funktion von Antigen-präsentierenden

Zellen (APC) hemmen [66]. Dies geschieht durch einen Wettbewerb mit Effektor-Zellen

um APC-Bindungsstellen und durch direkte Veränderung der APC-Funktionen über

Interaktion verschiedener Oberflächenmoleküle. Durch die Bindung von CTLA-4,

welches konstitutiv auf Tregs exprimiert wird, an CD80/86 auf dendritischen Zellen (DC)

kommt es beispielsweise zur Aktivierung der Indolamin-(2,3)-Dioxygenase (IDO) in DCs,

welche die essentielle Aminosäure Tryptophan enzymatisch in ihr pro-apoptotisches

Abbauprodukt Kynurenin umsetzt. Da Tryptophan für Teff-Zellen einen

lebensnotwendigen proliferativen Stimulus darstellt, kommt es durch dessen Mangel

schnell zur Induktion des Zelltodes in Teff-Zellen [72, 73]. Auch die Inhibition der

Reifung von DCs durch die Bindung von LAG3 an MHC-II-Moleküle auf unreifen DCs

scheint einen Beitrag zur indirekten Suppression zu leisten [66].

4. Suppression durch Induktion von Zytolyse oder Apoptose in der Zielzelle

Regulatorische T-Zellen verfügen letztendlich auch über eine Reihe von Möglichkeiten

zur direkten Induktion des Zelltodes in den Zielzellen. So können CD4+Foxp3+ Tregs zum

Einleitung

12

Beispiel nach Aktivierung die Expression von Granzym A hochregulieren und so

Zielzellen über einen Perforin-abhängigen Mechanismus in den Zelltod schicken [66].

Neuere Studien belegen auch die Fähigkeit von Tregs, Apoptose in Zielzellen über

TRAIL-abhängige und Galectin-1-abhängige Mechanismen zu induzieren [74].

Die Frage, ob ein einzelner Mechanismus für die Funktion der Tregs entscheidend ist oder ob

immer ein Zusammenspiel verschiedener Suppressionswege nötig ist, ist bis heute schwer zu

beantworten.

Bei der Betrachtung der suppressorischen Mechanismen von Tregs ist allerdings von

besonderer Bedeutung, dass sie zwar zumeist Antigen-spezifisch über ihren T-Zell-Rezeptor

aktiviert werden müssen, die von ihnen getragene Suppression von Effektorzellen jedoch

Antigen-unspezifisch ablaufen kann. Das heißt, dass nach dem Prinzip der bystander

suppression einmal aktivierte Tregs Teff-Zellen mit vielen verschiedenen Antigenspezifitäten

inhibieren können [42].

Abbildung 2: Mechanismen der Tregs zur Suppression von Effektor-T-Lymphozyten (Teff). Modifiziert

nach Vignali et al. [52, 58, 66]

Einleitung

13

1.3 Regulatorische T-Zellen in mikrobiellen Infektionen

1.3.1 Immunmodulation durch Tregs in mikrobiellen Infektionen

In Anbetracht der bisher beschrieben vielfältigen immunsuppressiven Mechanismen und der

Bedeutung der Tregs für die Begrenzung von Immunantworten stellt sich die Frage, ob und

wie unter diesen Bedingungen eine effektive Abwehr von pathogenen Mikroorganismen

durch den Wirt überhaupt möglich ist.

Verschiedene Autoren haben vermutet, dass Tregs eine zweischneidige Funktion im Rahmen

einer mikrobiellen Infektion haben, indem sie auf der einen Seite übermäßige kollaterale

Gewebeschäden durch die Abwehrmechanismen des Immunsystems verhindern, auf der

anderen Seite dadurch aber auch eine effektive Kontrolle der Infektion beeinträchtigen und

eine Langzeit-Persistenz der Pathogene fördern können [48]. So konnte beispielsweise in

murinen Infektionsmodellen mit Helicobacter hepaticus [75], Listeria monocytogenes [76],

Pneumocystis carinii [77], Schistosoma mansoni [78] oder Candida albicans [79] gezeigt

werden, dass CD4+CD25+ Tregs die Immunantwort des angeborenen und erworbenen

Abwehrsystems zum Wohle des Wirts begrenzen und eine Immunpathologie am Ort der

Infektion verhindern. In anderen hauptsächlich parasitären und viralen Infektionen mit

Plasmodium yoelii [80], Plasmodium berghei [81], Litomosoides sigmodontis [82] oder dem

Friend Virus [83] scheinen murine Tregs dagegen jedoch eine ungebremste Vermehrung der

Pathogene durch die Dämpfung einer effektiven Immunantwort zu begünstigen. Man muss

hier schlussfolgern, dass Tregs unter bestimmten Voraussetzungen zu einer persistierend

verlaufenden Infektion führen und das Überleben des Wirts gefährden können.

1.3.2 Induktion von Tregs im Rahmen von Infektionen

Um ihr eigenes Überleben im Wirt zu sichern, haben verschiedene Mikroorganismen im

Laufe der Evolution gelernt, sich aktiv einer effektiven Beseitigung durch das Immunsystem

des Wirts zu entziehen (Immunevasion). Pathogene schaffen dafür durch die

Funktionsmodulation von APCs oder die direkte Beeinflussung von Tregs über Ligation von

Toll-like-Rezeptoren ein Mikromilieu, welches die Rekrutierung und das Überleben von

Tregs am Ort der Infektion fördert und eine Induktion von iTregs begünstigt [48, 84]. So regt

beispielsweise Bordetella pertussis dendritische Zellen zur Produktion und Sekretion von

IL-10 an und schafft so die Voraussetzungen zur Bildung von Tr1-Zellen aus naiven

T-Lymphozyten [85]. Besonders in chronischen Infektionen ist die Fähigkeit von einigen

Pathogenen wie Trypanosoma cruzi [86] oder Plasmodium yoelii [87] bekannt, in

Einleitung

14

dendritischen Zellen neben IL-10 auch eine TGF--Produktion zu induzieren und so eine

Umgebung zu schaffen, welche die periphere Konversion zu Foxp3+ Zellen mit

suppressorischem Potential fördert [48]. Während sich manche pathogene Mikroorganismen

durch Dämpfung einer gegen sie gerichteten Immunantwort eine immunologische Nische

schaffen können, sind unter den Bedingungen einer akuten Infektion die pro-

inflammotorischen Reize meist offenbar so stark, dass eine periphere Foxp3-Induktion in

konventionellen T-Zellen hier nicht stattfindet [48].

1.3.3 Antigenspezifitäten von Tregs im Kontext mikrobieller Infektionen

Während die Frage nach der Antigenspezifität für die in einer Infektion induzierten Tregs

relativ klar zu beantworten ist, bleibt dies für die an der Entzündungsbegrenzung beteiligten

nTregs schwierig. Während iTregs Antigenspezifitäten gegen mikrobielle Antigene

aufweisen [48], erscheint es nach Belkaid et al. naheliegend, dass nTregs, welche im Thymus

reifen und auch dort einer Selektion unterlaufen, in der frühen Phase der Infektion Selbst-

Antigene erkennen, die bei infektionsbedingten Gewebeschäden Tregs auch in der Peripherie

zugänglich werden. Insbesondere im Verlauf chronischer Infektion sind auch Foxp3+ Tregs zu

finden, die mikrobielle Antigene erkennen [78] und nach Bindung an diese stark proliferieren

[88]. Daher schlagen die gleichen Autoren eine Erklärung vor, nach der diese Zellen auf den

Ort der Infektion beschränkt sind und kompartimentalisiert werden, da sie für ihr Überleben

der Präsenz ihres kognaten Antigens bedürfen [48, 88].

Einleitung

15

1.4 Inhalt und Ziele der Arbeit

Trotz moderner Intensivmedizin stellt die abdominelle Sepsis durch Anastomoseninsuffizienz

nach großen viszeralchirurgischen Eingriffen für Patienten noch immer eine

lebensbedrohliche Komplikation dar.

In vorangegangenen Arbeiten aus unserem Labor konnte gezeigt werden, dass insbesondere

CD4-positive T-Lymphozyten schon innerhalb weniger Stunden nach Induktion einer

diffusen Peritonitis im murinen Sepsis-Modell der Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP)

systemisch aktiviert werden, zahlreiche Effektormoleküle hochregulieren und das Überleben

negativ beeinflussen [28]. Durch eine Antikörper-vermittelte Depletion der CD4+ T-Zellen

konnte in diesem Modell nicht nur die bakterielle Dissemination, sondern auch die Letalität in

der Sepsis signifikant gesenkt werden.

Da verschiedene Subpopulationen zu den CD4+ T-Zellen gehören, war unklar, welche davon

für den beobachteten schädlichen Einfluss auf die Immunantwort in der abdominellen Sepsis

verantwortlich ist. Die Hemmung der lokalen Immunantwort, das Zytokinmuster und die

phänotypische Charakterisierung des T-Zell-Kompartiments in der Sepsis ließen eine direkte

Beteiligung der immunmodulatorisch wirkenden CD4+Foxp3+ Tregs an diesem Prozess

vermuten. Bisherige in vivo Untersuchungen zur Aufklärung der Rolle der Tregs im murinen

Sepsismodell der Cecal Ligation and Puncture (CLP) hatten zur Charakterisierung der Tregs

meist auf CD25 zurückgegriffen und kamen zu sehr widersprüchlichen Ergebnissen [89-91].

Die Interpretation dieser Daten ist schwierig, weil CD25 nicht für Treg spezifisch ist. Deshalb

fordern verschiedene Forscher, für die Untersuchung von Infektionsmodellen Foxp3 als

Marker für Tregs zu verwenden [48, 92]. Dies war das Ziel dieser Arbeit.

Es sollte das DEREG-Mausmodell eingesetzt werden, um die Rolle der Foxp3+ Tregs in der

polymikrobiellen Sepsis zu beleuchten. In diesem Mausstamm wird ein Fusionsprotein

bestehend aus eGFP und dem Diphtherietoxin-Rezeptor unter der Kontrolle des Foxp3-

Promotors exprimiert. Dies ermöglicht eine selektive Depletion der Foxp3+ Tregs in vivo und

einfache Charakterisierung ex vivo. Aktuell sind DEREG-Mäuse das beste verfügbare

Mausmodell zur Untersuchung der Funktion der Tregs. Als Sepsismodell wurde die Colon

ascendens Stentperitonitis (CASP) gewählt, weil diese der klinische Situation einer fäkalen

Peritonitis nach chirurgischer Nahtinsuffizienz besonders nahe kommt. Um die systemischen

und lokalen Auswirkungen einer selektiven Depletion der Tregs in diesem Modell zu

charakterisieren, sollten vergleichende Überlebenskinetiken erstellt und Organ- und Serum-

Einleitung

16

proben durchflusszytometrisch, immunfluoreszenzmikroskopisch und bakteriologisch

analysiert werden.

Material

17

2 Material

2.1 Laborgeräte

Analysewaage Sartorius, Göttingen

Auflichtmikroskop Hund, Wetzlar

Autoklaven Tuttnauer Systec, Wettenberg

Bechergläser (100 ml, 200 ml, 500 ml)

Bürker-Zählkammer Optiklabor, Friedrichsdorf

Digitalwaage Sartorius, Göttingen

CO2 – Inkubator WTB – Binder, Tuttlingen

Durchflusszytometer

FACS Scan Becton Dickinson, NJ, USA

FACS Calibur Becton Dickinson, NJ, USA

FACS Aria Becton Dickinson, NJ, USA

Durchlichtmikroskop Carl Zeiss, Jena

Erlenmeyerkolben (200 ml, 500 ml)

Flockeneisbereiter Enodis, Herborn

Fluoreszenzmikrokop Carl Zeiss, Jena

Homogenisator

Ultra-Turrax T25 IKA Werke, Staufen

Inkubationsschüttler New Brunswick Scientific, NJ, USA

Koloniezähler eCount Heathrow Scientific LLC, New Basford,

UK

Kühlschrank Liebherr, Biberach an der Riss

Laborschüttler KL-2 Merck, Darmstadt

Luminex 200 System Bio-Rad Laboratories, München

Magnetrührer Heidolph, Schwabach

Mehrkanalpipetten Eppendorf, Hamburg

Mikrotom-Kryostat Cryostar HM 560 Microm International, Walldorf

Pipetten Eppendorf, Hamburg und Brand,

Wertheim

Material

18

Pipetus-Akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt

Präparierbesteck

(Schere, Pinzette, Skalpell)

Quarzpipette Biometra, Göttingen

Sicherheitswerkbank Heraeus Instruments, Hanau

Stickstoffbehälter KGW Isotherm, Karlsruhe

Tiefkühlschrank -80° C Heraeus Instruments, Hanau

UV-Photometer Biometra, Göttingen

Vakuum-Pumpe Bio-Rad Laboratories, München

Vortexer Janke & Kunkel IKA Labortechnik,

Staufen

Wasserbad Thermo Haake, Karlsruhe

Zentrifugen

Biofuge pico/ fresco Heraeus Instruments, Hanau

Megafuge 1.0/ 1.0 R Heraeus Instruments, Hanau

Galaxy Mini VWR, Darmstadt

2.2 Verbrauchsmaterialien

Aluminiumfolie

Deckgläschen Langenbrick, Tenningen

Columbia Blutagarplatten BD Biosciences, Franklin Lakes, USA

EDTA-Vakutainer BD, Heidelberg

Einbettschälchen

Cryomold Tissue Tek intermediate Sakura, Zoeterwoude, Niederlande

End-to-End-Kapillaren Sarstedt, Nümbrecht

Ethilon 4/0 und 7/0 Ethicon, Norderstedt

FACS-Röhrchen BD, Heidelberg

Kanülen Dispomed, Gelnhausen und BD,

(19G x 1½´´, 20G x 1½´´und Erembodegen, Belgien

30G x ½´´)

Klebefolie für Mikrotiterplatten Roth, Karlsruhe

Material

19

Latex-Untersuchungshandschuhe Dahlhausen, Köln

Mikro-Hämatokrit-Kapillaren Brand, Wertheim

Nitril-Handschuhe Ansell, München

Zellkulturplatten (6- und 96- Loch) Greiner, Frickenhausen und NUNC A/S,

Roskilde, Dänemark

Objektträger Superfrost Plus R. Langenbrinck, Emmendingen

Petrischale (10 cm) Greiner, Frickenhausen

Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg und Sarstedt,

Nümbrecht

PP-Röhrchen (12 ml und 5 ml, steril) Greiner, Frickenhausen

Reaktionsgefäße (0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml) Eppendorf, Hamburg und Sarstedt,

Nümbrecht

Spritzen (2 ml) B. Braun, Melsungen

Spritzen (10 ml) BD, Erembodegen, Belgien

Tuberkulin-Spritzen (27G ½´) BD, Erembodegen, Belgien

Venenverweilkatheter (16G) BD, Heidelberg

Wachsstift DAKO, Glostrup, Dänemark

Zellsiebe, Nylon (70 μm) BD, Erembodegen, Belgien

Zentrifugenröhrchen (15 ml und 50 ml) Sarstedt, Nümbrecht und BD, Le Pont De

Claix, Frankreich

2.3 Zellbiologische Arbeiten

2.3.1 Reagenzien und Chemikalien

Aceton Hedinger, Stuttgart

Biotin Blocking-System DAKO, Glostrup, Dänemark

Concanavalin A Sigma, Steinheim

DMSO Sigma, Steinheim

Dulbecco´s PBS PAA Laboratories, Pasching, Österreich

Einbettmedium Tissue Tek Sakura, Zoeterwoude, Niederlande

Eosin Merck, Darmstadt

Ethanol 99,8% Carl Roth, Karlsruhe

FACS-Puffer BD, Heidelberg

Material

20

FACS-Clean BD, Heidelberg

Fix & Perm Zellpermeabilisierungskit An der Grub Bio Research, Wien,

Österreich

Fluoprep bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich

Fötales Kälberserum (FCS) Gibco BRL, Eggenstein

Hämalaunlösung nach Mayer Merck, Darmstadt

Heparin-Natrium Ratiopharm, Ulm

Hoechst Nr. 33258, Kernfarbstoff Sigma, Steinheim

LB Broth EZMix™ Sigma, Steinheim

L-Glutamin mit Penicillin/Streptomycin PAA Laboratories, Pasching, Österreich

Lysepuffer für Durchflusszytometrie

ADG-Lyse An der Grub Bio Research, Wien,

Österreich

Opti-Lyse B Beckman Coulter, Krefeld

Natriumacid (NaN3) Sigma, Deisenhof

Natriumhydroxid Sigma, Steinheim

Paraformaldehyd (PFA) Sigma, Steinheim

PBS PAA Laboratories, Pasching, Österreich

RPMI 1640 (ohne Glutamin) PAA Laboratories, Pasching, Österreich

Saponin (weiß, rein) Merck, Darmstadt

Schwefelsäure (2N) Carl Roth, Karlsruhe

Streptavidin-Alexa647 Invitrogen Molecular Probes, Karlsruhe

Streptavidin-TRITC Dianova, Hamburg

Tertiäres Amylalkohol Sigma, Steinheim

2,2,2 Tribromethanol Sigma, Steinheim

Trypanblau-Lösung Biochem AG, Berlin

Wasserstoffperoxid (30%) Merck, Darmstadt

Material

21

2.3.2 Medien, Puffer und Lösungen

FACS-Waschpuffer 990 ml PBS

10 ml FCS

0,02 % Natriumacid

LB-Medium 20,6 g LB Broth EZMix™

Ad 1 l A. bidest.

R10F 500 ml RPMI 1640 (ohne Glutamin)

10 % FCS

2 % L-Glutamin (200 nM)

2 % Penicillin-Streptomycin

Saponin-Puffer 500 ml FACS-Waschpuffer

0,5 g Saponin

Trypanblau-Lösung 50 ml Trypanblau-Stammlösung

50 ml PBS

2.3.3 Kits

ApoScreen Annexin-V-PE Kit Southern Biotech, Birmingham, USA

TSA Biotin System NEL 700 NEN Life Science Products, Boston, USA

2.4 Proteinbiochemische Arbeiten

2.4.1 Kits

CBA Mouse Inflammation Kit BD Biosciences, San Diego, USA

Bio-Plex Mouse IL-17 und IL-9 Assay Bio-Rad Laboratories, München

Cytokine Assay Kit

Cytokine Reagent Kit

Diluent Kit

Cytokine Panel mouse IL-9 and IL-17

Material

22

2.5 Antikörper

2.5.1 Antikörper für die Durchflusszytometrie

Primärantikörper

Antigen Konjugat Klon Isotyp Lieferant

Maus CD25 PE 3C7 Ratte IgG2b, κ Southern Biotech,

Birmingham

Maus CD4 PE RM4-5 Ratte IgG2a, κ BD Biosciences,

Heidelberg

Maus CD4 biotinyliert GK1.5 Ratte IgG2b, κ eBioscience, Hitfield,

UK

Maus CD45 PE-Cy7 I3/2.3 Ratte IgG Beckman Coulter,

Krefeld

Maus CD69 PE H1.2F3 Armenischer Hamster

IgG1, λ

BD Biosciences,

Heidelberg

Maus CTLA-4 unmarkiert UC10-

4F10-11

Armenischer Hamster

IgG1, λ

BD Biosciences,

Heidelberg

Maus F4/80 PE A3-1 Ratte IgG2b, κ Acris Antibodies,

Hiddenhausen

Maus ICOS PE 7E.17G9 Ratte IgG2b, κ eBioscience, Hitfield,

UK

Maus Ly6G PE 1A8 Ratte IgG2a Miltenyi Biotech,

Bergisch Gladbach

Maus Mac3 FITC M3/84 Ratte IgG1, λ BD Biosciences,

Heidelberg

Material

23

Sekundärantikörper


Hamster IgG biotinyliert G70-204,

G94-56

Maus IgG1, κ und

IgG2b, κ

BD Biosciences,

Heidelberg

Isotypkontrollen


TNP unmarkiert A19-3 Hamster IgG1, κ BD Biosciences,

Heidelberg

TNP PE G235-

2356

Armenischer Hamster

IgG1, λ

BD Biosciences,

Heidelberg

TNP PE A95-1 Ratte IgG2b, λ BD Biosciences,

Heidelberg

2.5.2 Antikörper für die Immunfluoreszenzmikroskopie

Primärantikörper


Maus CTLA-4 unmarkiert UC10-

4F10-11

Armenischer Hamster

IgG1, λ

BD Biosciences,

Heidelberg

Maus CD4 Alexa647 GK1.5 Ratte IgG2b, κ eBioscience, Hatfield,

UK

Maus Foxp3 Alexa488 FJK-16s Ratte IgG2a, κ eBioscience, Hatfield,

UK

Material

24

Sekundärantikörper


Hamster IgG biotinyliert G70-204,

G94-56

Maus IgG1, κ und

IgG2b, κ

BD Biosciences

Pharmingen,

Heidelberg

Isotypkontrollen


TNP unmarkiert A19-3 Hamster IgG1, κ

BD Biosciences

Pharmingen,

Heidelberg

Alexa647 Ratte IgG2a eBioscience, Hatfield,

UK

Alexa488 Ratte IgG2a, κ eBioscience, Hatfield,

UK

2.6 Tierexperimentelle Arbeiten

Avertin-Mausnarkose 100% 1 g 2,2,2-Tribrommethanol (Aldrich T4)

1 ml 2-Methyl-2-butanol

Diphtherie-Toxin Merck, Darmstadt

Inhalationsanästhetikum Sevofluran Abbott, Maidenhead, UK

Material

25

2.7 Datenbanken und Software

FlowJo 7.2 Tree Star Inc., Ashland, OR, USA

GraphPad Prism 5.0.1 GraphPad Software Inc., San Diego, CA,

USA

NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

MetaMorph Offline 7.1.4.0 Molecular Devices, Downingtown, PA,

USA

Spot Advanced 4.6 Diagnostic Instruments, Sterling Heights,

MI, USA

Methoden

26

3 Methoden

3.1 Tierexperimentelle Methoden

3.1.1 Genehmigungen, Tiere und Tierhaltung

Unter Aktenzeichen LALLF M-V/TSD/7221.3-1.1-037/08 wurden alle durchgeführten

Tierversuche durch das Landesveterinär- und Lebensmitteluntersuchungsamt des

Bundeslandes Mecklenburg-Vorpommern entsprechend des deutschen Tierschutzgesetzes vor

Versuchsbeginn genehmigt.

Als Versuchstiere wurden ausschließlich weibliche Mäuse im Alter zwischen 8 bis 12

Wochen und mit einem Gewicht von 20 bis 25 g eingesetzt. Alle Tiere stammten aus der

eigenen Zucht. Sowohl die Haltung als auch die Zucht der Versuchsmäuse erfolgten in

Übereinstimmung mit den Richtlinien des deutschen Tierschutzgesetzes in konventionellen

Tierräumen der Universität Greifswald im Biotechnikum (Walther-Rathenau-Straße 49a,

17489 Greifswald).

3.1.2 Verwendete Mausstämme

Um die Rolle von CD4+Foxp3+ T-Zellen in der Sepsis zu beleuchten, wurde in dieser Arbeit

die transgene DEREG-Mauslinie (depletion of regulatory T cells) verwendet. Diese Tiere sind

auf dem genetischen C57Bl/6-Hintergrund und exprimieren ein Fusionsprotein aus einem

Diphtherie-Toxin-Rezeptor (DTR) und eGFP (enhanced green fluorescent protein), welches

unter der Kontrolle des Foxp3-Lokus steht [39]. Da in Wildtyp-Mäusen kein funktioneller

Rezeptor für Diphtherie-Toxin (DT) existiert und murine Wildtyp-Zellen deshalb nicht

sensitiv für die Proteinbiosynthese-inhibierende Wirkung von DT sind [93], ist in DEREG-

Mäusen die selektive Depletion von Foxp3-positiven Zellen über eine DT-Applikation in vivo

möglich. Gleichzeitig erlaubt die Expression von eGFP die einfache Visualisierung dieser

Zellen ex vivo über Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie. In den Experimenten

und in der Zucht (DEREG x C57Bl/6) wurden ausschließlich heterozygote DEREG-Tiere

verwendet, da Tiere, welche für das DTR-eGFP-Konstrukt homozygot sind, nicht lebensfähig

waren. Als Kontrollen dienten C57Bl/6-Wildtypmäuse.

Methoden

27

3.1.3 Typisierung

Zur Unterscheidung der heterozygoten DEREG-Mäuse von ihren C57Bl/6-Wildtyp-

Wurfgeschwistern wurde allen weiblichen Mäusen der Zucht im Alter zwischen 6 und 8

Wochen durch Retroorbitalpunktion 150 µl Blut entnommen. Alle Blutentnahmen wurden

unter Sevoflurananästhesie durchgeführt. Bis zur weiteren Verwendung wurden die

Vollblutproben mit 50 µl Heparin antikoaguliert und kühl gelagert.

Zur durchflusszytometrischen Analyse wurden die Proben mit 100 µl eines PE-markierten

anti-CD4-AK (verdünnt 1:500 in FACS-Puffer) für 30 Minuten auf Nasseis in Dunkelheit

inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 200 µl eines Lysepuffers zur

Erythrozytenlyse, der 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur mit der Probe reagierte.

Daraufhin wurde mit 2 ml Aqua bidest. für weitere 15 Minuten inkubiert.

Nach zwei Waschschritten (301,6 × g; 4° C; für 6 Minuten) wurden die Zellpellets in 250 µl

FACS-Waschpuffer resuspendiert und mit dem Durchflusszytometer (FACScan) analysiert.

Proben mit deutlich doppelt-positiven Populationen für CD4 und GFP wurden als von

DEREG-Mäusen stammend gewertet.

3.1.4 Narkose

Zur Narkose der Versuchsmäuse vor chirurgischen Eingriffen wurden 17 µl/g Körpergewicht

einer 2,5 %-igen Avertinlösung intraperitoneal appliziert.

3.1.5 In vivo Depletion von Foxp3+ Tregs

Prophylaktischer Ansatz

Zur prophylaktischen Depletion der CD4+ Foxp3+ Tregs wurde DEREG-Mäusen

48 und 24 Stunden vor Induktion der Sepsis jeweils 1 µg Diphtherie Toxin gelöst in

100 µl PBS intravenös über die laterale Schwanzvene appliziert. Als Kontrollmäuse dienten

DEREG-Tiere, welchen 100µl PBS als Volumenkontrolle intravenös appliziert wurde, und

C57Bl/6-Mäuse, welche ebenfalls 1 µg DT in 100 µl PBS intravenös bekamen. Alle

Lösungen wurden vor der Infusion auf 37° C erwärmt um eine Aktivierung des

Immunsystems zu verhindern.

Verzögerter Depletions-Ansatz

In einem verzögerten Depletions-Ansatz wurde den unterschiedlichen Gruppen jeweils

4 Stunden vor Induktion der Sepsis 1 µg Diphtherie Toxin in 100µl PBS oder die

entsprechende PBS- Volumenkontrolle intravenös über die laterale Schwanzvene appliziert.

Alle Lösungen wurden körperwarm verabreicht.

Methoden

28

3.1.6 Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP)

Zur Induktion einer polymikrobiellen Sepsis wurde das CASP-Modell verwendet. Dieses

spiegelt sehr reproduzierbar die klinische Situation einer diffusen Peritonitis und

abdominellen Sepsis infolge einer Nahtinsuffizienz nach chirurgischen Eingriffen wider.

Vor der chirurgischen Intervention wurden die Versuchsmäuse mit einer intraperitonealen

Applikation von 17 µl/ g KG einer 2,5 %-igen Avertinlösung narkotisiert, bevor sie

anschließend fixiert und die Bauchhaut durchtrennt wurde. Nach Eröffnung der

Peritonealhöhle mit einem 1,5 cm langen Schnitt entlang der Linea alba konnte der Übergang

des Ileums ins Caecum aufgesucht werden. Der Darm wurde hier aus der Bauchhöhle

entnommen und 1,5 cm distal der Ileozäkalklappe auf der anti-mesenterialen Seite mit einem

16 Gauge Venenverweilkatheter punktiert und mit 7/0 Ethilon fixiert. Anschließend wurde

der Mandrin entfernt und der Stent 1 mm oberhalb der Serosa abgeschnitten. Zur Überprüfung

von Lage und Durchlässigkeit des Stents wurde eine kleine Menge Fäzes aus dem Darm in

die Bauchhöhle gedrückt bevor der Darm wieder in die Situs gebracht wurde. Zur

Volumensubstitution wurden anschließend 0,5 ml physiologische Kochsalzlösung appliziert

und die Wundränder von Peritoneum und Bauchhaut mit 4/0 Ethilon vernäht. Schon nach

wenigen Stunden entwickelten die Tiere deutliche Symptome einer systemischen

Entzündung. Soweit nötig dienten Tiere mit gleicher Vorbehandlung aber ohne CASP-

Operation als entsprechende Kontrolltiere.

Alle Operationen wurden von der kooperierenden Chirurgin Dr. med. Katharina Cziupka aus

der Abteilung für Allgemeine Chirurgie, Viszeral-, Thorax- und Gefäßchirurgie des

Universitätsklinikums Greifswald durchgeführt.

3.1.7 Überlebenskinetiken

Das Überleben der Versuchstiere nach Induktion der Sepsis durch CASP-Operation wurde für

72 Stunden in zeitlichen Intervallen von 3 Stunden beobachtet und dokumentiert.

Anschließend wurde für weitere 7 Tage einmal täglich der Zustand der Tiere kontrolliert.

Überlebende Mäuse wurden zur Serumgewinnung 14 Tage nach Induktion der Sepsis mittels

Avertin narkotisiert und über retroorbitale Punktion entblutet, bevor sie schmerzfrei durch

zervikale Dislokation getötet wurden. Über den gesamten Zeitraum war der Untersucher für

die Gruppenzugehörigkeit der einzelnen Mäuse verblindet. Erst nach Abschluss der

Überlebenskinetiken erfolgte die Entblindung.

Methoden

29

3.1.8 Bewertung der Symptomschwere in septischen Tieren

Parallel zu den Überlebenskinetiken wurde in den ersten 72 Stunden nach CASP-Operation

die Schwere der Krankheitssymptome der septischen Tiere erfasst. Dafür wurde der

Allgemeinzustand jedes einzelnen septischen Tieres beobachtet und dokumentiert. Tabelle 2

zeigt die beurteilten Parameter, Bewertungskriterien und die ihnen zugeordnete Score-Werte.

In zeitlichen Intervallen von 3 Stunden wurden die Mäuse nach diesen Parametern bewertet

und für jeden Beobachtungszeitpunkt durch Aufsummierung der Einzelscore-Werte ein

Belastungsscore (0 bis 12 Score-Punkte) ermittelt. Der Untersucher war dabei für die

Gruppenzugehörigkeit der einzelnen Tiere verblindet. Diese Verblindung wurde erst nach

Abschluss des Experiments aufgelöst. Nach dem Beobachtungszeitraum von 3 Tagen hatten

alle Versuchstiere entweder den Ausgangsscore-Wert wieder erreicht oder waren bereits in

der Sepsis gestorben.

Parameter Untersuchung Bewertung Score-Wert

Erscheinungsbild Inspektion - normal, sauber gepflegtes Fell

- gesträubtes Fell

- nasses Fell

- schleimige Augen

0

1

2

3

Atmung Inspektion - normal

- beschleunigt

- schwer

- schwach

0

1

2

3

Spontanverhalten Beobachtung - normal, lebhaft, neugierig

- verlangsamt, sitzende Haltung

- träge, buckelige Haltung,

schwankender Gang

- Seitenlage

0

1

2

3

Provoziertes

Verhalten

Beobachtung - Maus flieht bei Käfigöffnung

- flieht bei Annäherung der

Hand

- flieht erst bei Berührung

- flieht gar nicht

0

1

2

3

Tabelle 2: Bewertungsparameter zur Einschätzung der Schwere der Krankheitssymptome der septischen

Tiere nach CASP-Operation

Methoden

30

3.1.9 Tötung von Versuchstieren

Die Versuchstiere wurden entsprechend den Bestimmungen des Deutschen

Tierschutzgesetzes mit Avertin narkotisiert und durch zervikale Dislokation getötet.

3.1.10 Serumgewinnung und Peritoneallavage

Versuchsmäuse wurden zur Serumgewinnung 20 h nach CASP mittels Avertin narkotisiert

und durch retroorbitale Punktion entblutet. Anschließend erfolgte die Zentrifugation des

gewonnen Vollblutes bei 16060 × g für 10 Minuten. Das gewonnene Serum wurde

abgenommen, in ein neues Reaktionsgefäß überführt und einem weiteren

Zentrifugationsschritt zugeführt. Abschließend wurde das Serum erneut in ein neues

Reaktionsgefäß überführt, bei -156° C in flüssigem Stickstoff schockgefroren, und bis zur

weiteren Analyse bei - 80° C gelagert.

Zur Lavage der Peritonealhöhle erfolgte die schmerzfreie Tötung der Tiere 20 h nach

Sepsisinduktion durch zervikale Dislokation und die anschließende Desinfektion der Haut in

70 %-igem Ethanol. Alle weiteren Arbeitsschritte wurden steril unter der

Sicherheitswerkbank durchgeführt, um bakterielle Kontaminationen zu verhindern.

Anschließend wurde die Bauchhaut mit sterilem Präparationsbesteck unter Vermeidung einer

peritonealen Perforation vom Bauchfell gelöst. Daraufhin erfolgte die Spülung der

Bauchhöhle mit 2 ml eiskaltem PBS, von dem etwa 1,5 ml für anschließende bakteriologische

Untersuchungen und Kryokonservierung zurückgewonnen werden konnten. Danach wurde

die Bauchhöhle erneut mit 5 ml 20 % FCS/PBS lavagiert um peritoneale Zellen zu gewinnen,

welche der durchflusszytometrischen Analyse zugeführt wurden.

3.1.11 Organexplantation

Zur Explantation der Organe wurden Brust- und Peritonealhöhle unter sterilen Bedingungen

chirurgisch eröffnet. Die Milz, die Leber, eine Niere, die beiden Lungenflügel und der

Thymus wurden entnommen, in 2 ml steriles PBS überführt und bis zur weiteren Verwendung

auf Eis gelagert. Anschließend wurden die Organe samt PBS gewogen und das

Nettoorgangewicht bestimmt.

Des Weiteren wurden der mesenteriale Lymphknoten und 2 bis 3 Peyer’sche Plaques samt

Darmabschnitt entnommen und zur Kryokonservierung in Einbettmedium überführt. Nach

gleichem Vorgehen wurde auch der Thymus und ein Teil der Milz zur Konservierung

vorbereitet, bevor sie zusammen mit den anderen Asservaten in flüssigem Stickstoff

Methoden

31

schockgefroren und anschließend bei – 80° C bis zur histologischen Aufbereitung gelagert

wurden.

3.1.12 Bakteriologische Untersuchungen

Zur Bestimmung der bakteriellen Last in verschiedenen Organen wurden die Gewebe jeweils

in 2 ml steriles PBS überführt und mittels Ultraturax bei 9500 rpm homogenisiert. Die

gewonnen Homogenisate wurden in unterschiedlichen Verdünnungen (Tabelle 3) auf Columbia

Blutagar ausplattiert und für 22 Stunden bei 37° C und 5 Vol.-% CO2 kultiviert. Anschließend

wurde die Zahl der gewachsenen Kolonien bestimmt und auf das Gesamtorgangewicht

bezogen. Jede Verdünnungsstufe wurde dabei als Dreifachbestimmung durchgeführt.

3.2 Zellbiologische Methoden

3.2.1 Isolation muriner Splenozyten

Zur Isolation der murinen Splenozyten wurden die entnommen Milzen durch ein steriles

Zellsieb mit 70 µm Maschenweite gepresst und in 50 ml 20 % FCS/PBS aufgenommen. Nach

einer Zentrifugation (301,6 × g, 4° C, 6 Minuten) wurde das Zellpellet zur Erythrozytenlyse in

5 ml Aqua bidest. resuspendiert, anschließend die Suspension mit 20 % FCS/PBS auf 50 ml

aufgefüllt und erneut zentrifugiert.

Danach konnte der Überstand verworfen und das Pellet in 5 ml 20 %/PBS zur weiteren

Analyse aufgenommen werden.

Organ Eingesetztes Volumen

pro Platte

Verdünnungsstufen

Blut, Niere, Lunge 10 µl Unverdünnt ; 1:10; 1:100

Lavage, Leber 10 µl 1:10; 1:100; 1:1000

Milz 100 µl Unverdünnt ; 1:10; 1:100

Tabelle 3: eingesetzte Verdünnungsstufen zur Bestimmung der bakteriellen Last in verschieden Organen

nach CASP

Methoden

32

3.2.2 Zellzahlbestimmungen und Vitalitätsprüfung

Zellzahlbestimmungen wurden mittels Trypanblau-Färbung durchgeführt. Dafür wurden 10 µl

der Zellsuspension mit 90 µl Trypanblau-Lösung gemischt. Anschließend wurde

lichtmikroskopisch die Zellzahl in 10 µl dieses Gemisches mittels Bürker-Kammer ermittelt

und über Verdünnungsfaktor und Kammerfaktor die Gesamtzellzahl der Ausgangsuspension

bestimmt.

Da der blaue Farbstoff nur in tote Zellen eindringen kann, war gleichzeitig eine

Unterscheidung zwischen vitalen (hellen) und toten (blauen) Zellen möglich.

3.2.3 Färbungen für die durchflusszytometrischen Analysen

Färbung muriner Splenozyten

Zur phänotypschen Charakterisierung der murinen Splenozyten anhand bestimmter

Aktivierungsmarker und Oberflächenantigene wurde die Durchflusszytometrie genutzt. Zur

Färbung membranständig-extrazellulärer Strukturen wurde die Zellzahl pro FACS-Röhrchen

auf 1×106 eingestellt und die Zellsuspension mit 50 µl der in FACS-Waschpuffer verdünnten

Antikörperlösung (Antikörperverdünnungen siehe Tabelle 4) bzw. der Isotypkontrollen in

entsprechender Konzentration inkubiert (30 Minuten, auf Eis). Anschließend wurde die

Antikörperlösung durch zweimalige Zentrifugation heruntergewaschen (301,6 × g, 4° C,

6 Minuten) und die Zellen mit 50 µl des Sekundärantikörpers, verdünnt in FACS-

Waschpuffer, inkubiert. Nach zwei abschließenden Waschschritten wurde das Zellpellet in

250 µl FACS-Puffer resuspendiert und mittels Durchflusszytometer analysiert.

Zur Färbung des intrazellulären CTLA-4-Moleküls schloss sich an die Inkubation mit dem

anti-CD4-PE-Antikörper eine sofortige Inkubation mit 50 µl der Reagenz A des Fix & Perm-

Kits an. Anschließend wurden die Proben einmal mit Saponin-Puffer gewaschen (301,6 × g,

4° C, 6 Minuten) und dann mit 100 µl des anti-CTLA-4-Antikörpers, verdünnt in Reagenz B

des Kits, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden dann einmal mit Saponin-Puffer

gewaschen und daraufhin mit dem sekundären anti-Hamster-IgG-Antikörper inkubiert, bevor

nach zwei weiteren Waschschritten mit 50 µl Streptavidin-Alexa-647, verdünnt in Saponin-

Puffer, inkubiert wurde. Vor der Analyse am Durchflusszytometer wurden die Proben

abschließend einmal mit Saponin-Puffer gewaschen und in 250 µl FACS-Puffer

aufgenommen.

Alle Inkubationsschritte wurden bei 4°C im Dunkeln für 30 Minuten und

Zentrifugationsschritte mit 301,6× g bei 4° C für 6 Minuten durchgeführt. Die abschließende

Auswertung der gewonnenen Daten erfolgte mit der FlowJo-Analysesoftware.

Methoden

33

Färbung peritonealer Zellen

Zur Isolation der Zellen aus der Peritoneallavage wurde diese in 10 ml 20 % FCS/PBS

aufgenommen und zweimal bei 301,6 × g für 6 Minuten bei 4° C gewaschen. Anschließend

wurde die Färbung von Makrophagen (F4/80+ bzw. Mac3+), neutrophilen Granulozyten

(Ly6G+) und CD4+ T-Zellen analog zur Färbung muriner Splenozyten durchgeführt. Für die

eingesetzte Antikörperkonzentration siehe Tabelle 5

Färbung von Vollblutproben

Färbungen zur durchflusszytometrischen Analyse von Vollblut-Proben wurden analog zum

Typisierungsprotokoll (siehe 3.1.2) durchgeführt

Antikörper Ausgangskonzentration Eingesetzte Verdünnung

aCD69-PE 0,2 mg/ml 1:100

aCD25-PE 0,1 mg/ml 1:50

aICOS-PE 0,2 mg/ml 1:50

aCD4-PE 0,2 mg/ml 1:500

aCD4-biotinyliert 0,5 mg/ml 1:100

aCD45-PECy7 0,1 mg/ml 1:500

aCTLA-4-unmarkiert 0,5 mg/ml 1:25

aHamster-IgG-biotinyliert 0,5 mg/ml 1:50

Streptavidin-Alexa647 1:800

Tabelle 4: eingesetzte Antikörperverdünnungen zur durchflusszytometrischen Analyse muriner Splenozyten

Antikörper Ausgangskonzentration Eingesetzte Verdünnung

aCD4-biotinyliert 0,5 mg/ml 1:100

aMac-3-FITC 0,5 mg/ml 1:100

aF4/80-PE 1:100

aLy6G-PE 5,5 µg/ml 1:50

Streptavidin-Alexa647 1:800

Tabelle 5: eingesetzte Antikörperverdünnungen

Methoden

34

3.3 Histologische Methoden

3.3.1 Herstellung von Kryostatschnitten

Kryostatschnitte der Milzen für histologische Analysen wurden in 6 µm Dicke mit Hilfe des

Microtom-Kryostats angefertigt. Nach Trocknung der Schnitte über Nacht wurden die

Objekte für 5 Minuten in Aceton fixiert, getrocknet und anschließend bei – 80° C bis zur

weiteren Bearbeitung gelagert.

3.3.2 Immunfluoreszenzmikroskopische Dreifachfärbung von CD4/Foxp3/CTLA-4

Zur Darstellung von CD4, Foxp3 und CTLA-4 in Kryostatschnitten muriner Milzen wurden

die Objekte auf Raumtemperatur gebracht und anschließend mit 20 µl 20 % FCS/PBS für

10 Minuten inkubiert um unspezifische Bindungen zu verhindern und den Schnitt zu

rehydratisieren. Wie alle weiteren Reaktionsschritte auch erfolgte diese Inkubation bei

Raumtemperatur in einer feuchten Kammer. Anschließend erfolgte die sequentielle

Behandlung der Kryostatschnitte mit 50 µl einer 1,5 %-igen H2O2-Lösung zur Inaktivierung

endogener Peroxidasen und mit einem Biotin-Blocking-System entsprechend den Angaben

des Herstellers zur Blockung endogenen Biotins. Zwischen allen Schritten wurde jeweils

zweimal für 4 Minuten in PBS gewaschen.

Folgend wurden die Objekte mit 75 µl des Hamster-anti-Maus CTLA-4-Antikörpers (1:250 in

20 % FCS/PBS) bzw. der entsprechenden Isotypkontrolle über Nacht bei 4° C inkubiert. Nach

zweimaligem Waschen erfolgte die Zugabe des zweiten Antikörpergemisches bestehend aus

biotinyliertem anti-Hamster-IgG (1:100), Alexa-647 konjugiertem anti-Maus-CD4 (1:50) und

Alexa-488 gekoppelten anti-Maus-Foxp3 (1:100) bzw. den entsprechenden Isotypkontrollen

und Inkubation bei Raumtemperatur für 60 Minuten. Die Verdünnung aller Antikörper

erfolgte in 20 % FCS/PBS.

Nach zwei Waschschritten in PBS wurden die Proben für 30 Minuten mit 50 µl Streptavidin-

POD (1:500 in PBS) inkubiert. Anschließend wurde zweimal gewaschen und für 3 Minuten

mit 50 µl Biotinyltyramid (1:200 in Amplifikationsdiluenten des TSA-Kits) erneut inkubiert.

Danach erfolgte nach zwei weiteren Waschschritten die 60-minütige Inkubation mit 50 µl

Streptavidin-TRITC (1:100 in 20 % FCS/PBS), bevor nach Waschen in PBS mit Fluoprep

eingedeckelt wurde.

Die Begutachtung der Schnitte erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop von Zeiss, mit dem

eine Aufnahme von digitalen Fotos zur späteren Auswertung mit der Metamorph-Software

möglich war.

Methoden

35

3.4 Proteinbiochemische Methoden

3.4.1 Bestimmung der Zytokinkonzentrationen in Serum und Lavage

Zur Bestimmung der Konzentrationen der Zytokine IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF und

IL-12p70 in Serum und Lavage wurde ein kommerziell erhältliches CBA-Maus-

Inflammations-Kit verwendet. Diese Technik erlaubt es mehrere Zytokine in einer relativ

kleinen Probenmenge zu messen. Zur Optimierung der Messprozedur wurden die Angaben

des Herstellers in leicht abgewandelter Form befolgt. Dafür wurden jeweils 20 μl der zu

untersuchenden Probe mit 20 μl des PE-Detektions-Reagenzes und 20 μl eines Gemisches der

sechs Fang-Beads (jeweils 1/6 von jedem spezifischen Fang-Bead) für 3 Stunden zusammen

bei Raumtemperatur in einer 96-Lochboden-Platte inkubiert. Anschließend wurden die

Proben mit 200 μl des Waschpuffers für 4 Minuten mit 250 x g zentrifugiert, der Überstand

abgekippt und in 200 μl des Waschpuffers resuspendiert. Die Proben wurden daraufhin

mittels des Durchflusszytometers gemessen und mit der entsprechenden Software des

Herstellers zur Ermittlung von Absolutkonzentrationen ausgewertet.

3.4.2 Luminexmessung zur Bestimmung der Serumkonzentrationen von IL-9 und

IL-17

Zur quantitativen Bestimmung der Zytokinkonzentrationen von IL-9 und IL-17 im Serum

wurde ein kommerziell erhältliches Kit zur Auswertung mit dem Luminexsystem eingesetzt.

Diese Technologie erlaubt eine gleichzeitige und sehr sensitive Messung verschiedener

Zytokine in einem begrenzten Probenvolumen und einem weiten dynamischen Messrahmen.

Die Probenvorbereitung erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Zu einem kurzen Abriss

des Vorgehens: Nach Rekonstitution der Zytokinstandards in entsprechendem Standard-

Diluenten wurde dieser für 30 Minuten auf Eis inkubiert, bevor zur Herstellung von

Standardkurven eine serielle Verdünnung vorgenommen wurde. Anschließend wurden die

Anti-Zytokin konjugierten Beads verdünnt und eine 96-Lochbodenfilterplatte mittels

Vakuumfiltration vorbereitet, bevor 50 µl der Beadlösung in jede Vertiefung gegeben wurde.

Nachdem der Puffer entfernt und die Platte mit Waschpuffer gewaschen wurde, erfolgte die

Zugabe der entsprechend verdünnten Standard- bzw. Probenlösung, welche für 30 Minuten

bei Raumtemperatur auf einer Rüttelplatte in Dunkelheit inkubierten. Anschließend wurde der

Puffer durch Vakuumfiltration entfernt, die Platte gewaschen, 25 µl der

Detektionsantikörperlösung zugegeben und unter gleichen Bedingungen für 30 Minuten

inkubiert. Nach mehreren Waschschritten erfolgte jeweils die Zugabe von 50 µl Streptavidin-

PE-Lösung in entsprechender Verdünnung, welche ebenfalls 30 Minuten inkubierte.

Methoden

36

Abschließend wurde die Platte dreimal mit Waschpuffer gewaschen und die Beads in 100 µl

Assay-Puffer resuspendiert. Die Messung der Proben wurde nach Anleitung des Herstellers

am Luminexsystem vorgenommen.

3.5 Statistische Auswertung

Zur statistischen Testung der im Ergebnisteil gezeigten Daten auf signifikante Unterschiede

wurde der nicht-parametrische zweiseitige Mann-Whitney-U Test verwendet.

Abweichend davon wurde die statistische Auswertung der vergleichenden

Überlebenskinetiken mit Hilfe der Kaplan-Meier-Überlebenskurven und dem log rank Test

durchgeführt.

Soweit nicht anders angegeben, sind alle im Ergebnisteil gezeigten Daten als Mediane der

entsprechenden Gruppen dargestellt.

Statistisch signifikante Unterschiede mit einem p-Wert < 0,05 wurden mit

einem * gekennzeichnet. War p < 0,01 wurden Unterschiede als hoch signifikant gewertet und

mit ** verdeutlicht. Höchst signifikante Unterschiede mit einem p-Wert < 0,001 wurden

mit *** gekennzeichnet.

Ergebnisse

37

4 Ergebnisse

4.1 Experimentelle Vorarbeiten

4.1.1 Prophylaktische Depletion von Tregs in vivo

Im Vorfeld der Experimente zur Rolle der Tregs in der Sepsis musste ein sicheres

Applikationsschema von Diphtherie-Toxin (DT) zur Depletion der Tregs etabliert werden.

Dabei stand besonders die Vermeidung einer peritonealen Reizung vor Induktion der Sepsis

im Vordergrund. Da die Peritonealhöhle den Fokus in unserem Sepsismodell CASP darstellt,

schien die bisher publizierte intraperitoneale Gabe von DT dafür ungeeignet [39]. Um

auszuschließen, dass residuale Abwehrzellen im Vorfeld der CASP durch DT aktiviert oder

andere innate Immunzellen ins Peritoneum rekrutiert werden, wurde deshalb ein intravenöses

Applikationsschema gewählt.

DEREG-Mäuse, die ein eGFP-DTR- (Diphtherie-Toxin-Rezeptor) Fusionsprotein unter der

Kontrolle des Foxp3-Lokus exprimieren, erhielten zur Depletion ihrer Foxp3+ Tregs 1 µg DT

gelöst in einem Volumen von 100 µl sterilem PBS an zwei Zeitpunkten (t1= - 48 h und

t2= - 24 h) über die laterale Schwanzvene. Die Effizienz der Depletion wurde mit einer

durchflusszytometrischen Analyse des Vollblutes und der Splenozyten, sowie der

fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung der Thymi gesichert. Zum Zeitpunkt t3= 0 h

konnten in keinem der untersuchten Gewebe und Körperflüssigkeiten CD4+Foxp3+ Tregs

nachgewiesen werden (Abbildung 3).

Die applizierte Dosis DT war für die Tiere nicht toxisch. Zu keinem Zeitpunkt im Verlauf der

gesamten Experimente waren DEREG-Mäuse oder C57Bl/6-Wildtypkontrollen durch die

Verabreichung von DT per se in ihrem allgemeinen Erscheinungsbild oder ihrem normalen

Verhalten beeinträchtigt.

Ergebnisse

38

4.1.2 Ansatz zur verzögerten Depletion von Tregs

Die Immunantwort in der Sepsis verläuft biphasisch [94] (siehe 1.1.4). Nach einer

hyperinflammatorischen Immunantwort mit hohen Konzentrationen der pro-

inflammatorischen Zytokine TNF-, IL-1 und IL-6 kommt es zu einer kompensatorischen

anti-inflammatorischen Immunantwort mit steigenden Serumspiegeln von IL-10 und TGF-.

Um diesen dynamischen Prozessen in der systemischen Entzündungsreaktion Rechnung zu

tragen, sollte neben der prophylaktischen Depletion auch ein Modell zur verzögerten

Depletion der Tregs etabliert werden. Unter der Hypothese, dass regulatorische T-Zellen in

der sehr frühen Hyperinflammation für eine Begrenzung einer überschießenden

Immunantwort wichtig sind, später aber in die Immunparalyse führen, sollte der Einfluss

einer verzögerten Depletion auf den Verlauf der Sepsis untersucht werden.

Abbildung 3: Vollständige Depletion der CD4+ Foxp3+ regulatorischen T-Zellen nach

zweimaliger i.v. Applikation von Diphtherie-Toxin (DT)

DEREG-Mäusen im Alter von 10 Wochen wurde zu den Zeitpunkten t1= -48 h und t2= -24 h jeweils

1 µg DT i.v. appliziert. Zum Zeitpunkt t3= 0 h wurden Blut, Milz und Thymus gewonnen. Vollblut und

murine Splenozyten wurden mit aCD4-PE bzw. biotinyliertem aCD4 und Streptavidin-Alexa-647

angefärbt und durchflusszytometrisch analysiert (linke Spalte und Mitte). Kryostatschnitte des Thymus

wurden mit aFoxp3-Alexa488 (grün) und aCD4-Alexa647 (blau) gefärbt und

fluoreszenzmikroskopisch untersucht (rechte Spalte). Als Kontrolle dienten mit sterilem PBS

behandelte DEREG-Mäuse. 24 h nach der letzten DT-Applikation waren nahezu keine CD4+Foxp3+

Zellen (weiße Pfeile) mehr nachweisbar. n = 2 Tiere/ Gruppe; Ergebnisse eines Tieres exemplarisch

gezeigt

Ergebnisse

39

Zur Aufklärug der Rolle der Tregs in solch einem verzögerten Interventionsansatz in der

CASP musste geprüft werden, ob und in welcher Kinetik durch eine einmalige intravenöse

Applikation von DT eine hinreichende Treg-Depletion erreicht werden kann. Dazu wurden

DEREG-Mäuse wie oben genannt mit 1 µg DT behandelt. Zu definierten Zeitpunkten wurden

dann Splenozyten isoliert und das Ausmaß der Treg-Depletion verfolgt.

Die durchflusszytometrischen Analysen (Abbildung 4) zeigten, dass eine einmalige intravenöse

Gabe von DT innerhalb der ersten 24 h nach Applikation zu einer kontinuierlichen Abnahme

und schließlich zu einer nahezu vollständigen Depletion der CD4+Foxp3+ Treg-Population

führte.

Ausgehend von diesen Daten wurde für die weiteren Experimente zur verzögerten Depletion

der Tregs ein Applikationzeitpunkt t-1= -4 h vor Induktion der Sepsis gewählt. Zum Zeitpunkt

t0 der CASP-Operation ist nach diesem Schema der prozentuale Anteil der Foxp3-positiven

Tregs sowohl an den Gesamtlymphozyten als auch an CD4-positiven T-Zellen noch fast

unverändert. Damit konnte erreicht werden, dass die Tregs in der frühen Phase der

Hyperinflammation der Sepsis noch im System sind, im weiteren Verlauf aber kontinuierlich

abfallen und 20 h nach CASP vollständig verschwunden sind.

Abbildung 4: Eine einmalige i.v. Applikation von Diphtherietoxin führt in den ersten 24 h zur

kontinuierlichen Abnahme der Treg-Population

DEREG-Mäusen wurde zum Zeitpunkt t0=0 h jeweils 1 µg DT i.v. über die laterale Schwanzvene

appliziert. Nach unterschiedlichen Zeiten (t1= +4 h, t2= +12 h, t3= +16 h oder t4= +24 h) wurden die

Milzen gewonnen und die Splenozyten isoliert. Diese wurden mit einem aCD4-PE Antikörper gefärbt

und durchflusszytometrisch die Abnahme der CD4+Foxp3+ Treg-Population an den Gesamtlymphozyten

analysiert. Dargestellt sind jeweils die Dot-Plots (FL1: Foxp3-GFP gegen FL2: CD4-PE) im

Lymphozytengate; n = 1 Maus/ Zeitpunkt

Ergebnisse

40

4.1.3 Einfluss von Diphtherietoxin auf das bakterielle Wachstum

Obwohl beschrieben ist, dass das vom Corynebacterium diphtheriae gebildete Diphtherie-

Toxin nur die eukaryotische Proteinbiosynthese durch ADP-Ribosylierung des

Elongationsfaktors eEF-2 inhibiert [95], sollte eine Interferenz mit dem bakteriellen

Wachstum der in unserem Sepsismodell bedeutsamen Mikroorganismen ausgeschlossen

werden. Exemplarisch wurde dies bei Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli

(E. coli) und Proteus geprüft. Der Zusatz von 1 µg/ml Diphtherie-Toxin zum Medium

veränderte das bakterielle Wachstum nicht (Daten nicht gezeigt).

4.2 Größe und Aktivierungsstatus der Foxp3+ Treg-Population in der CASP

Im Folgenden sollte der Einfluss einer polymikrobiellen Sepsis auf den Anteil der Foxp3-

positiven Tregs am Pool der CD4-Lymphozyten sowie auf deren Aktivierungsstatus

untersucht werden. Als murines Sepsismodell diente dabei die Colon ascendens Stent

Peritonitis (CASP), welche die klinische Situation einer diffusen Peritonitis nach

chirurgischer Nahtinsuffizienz widerspiegelt.

Um zu untersuchen, wie Tregs auf die generalisierte Infektion in diesem Modell reagieren,

wurden weibliche DEREG-Mäuse einer CASP-Operation unterzogen. 20 Stunden nach

Sepsisinduktion wurden die Milzen dieser Tiere entnommen und durchflusszytometrisch die

Expression von Foxp3 und von verschiedenen Aktivierungsmarkern in der Population der

CD4-positiven T-Lymphozyten bestimmt. Alle Versuchstiere erhielten dabei 48 und

24 Stunden vor CASP intravenös steriles PBS um eine Vergleichbarkeit mit der DT-

Behandlung in den folgenden Experimenten gewährleisten zu können.

Im Vergleich zu unbehandelten Kontrollmäusen hatte sich der prozentuale Anteil von

CD4+Foxp3+ regulatorischen T-Zellen an den CD4-positiven Splenozyten nach CASP

verdoppelt (Mediane: 7,9 % vs. 13,9 %; P < 0,01; Abbildung 5A). Dieses zugunsten der Tregs

verschobene Verhältnis von CD4+Foxp3+ Tregs zu CD4+Foxp3- Effektor-T-Lymphozyten

kann wahrscheinlich nicht ausschließlich durch eine periphere Konversion von

konventionellen T-Zellen zu induzierten Tregs erklärt werden. So stieg die auf die

Gesamtmilz bezogene Absolutzellzahl von Tregs nach der CASP (Unbehandelt vs. CASP:

1,1 x 106 vs. 1,7 x 106; P > 0,05) in geringerem Maße an als ihr prozentualer Anteil an der

Ergebnisse

41

CD4-Gesamtpopulation. Dies spricht für einen verstärkten Zelltod von Effektorzellen bei

gleichzeitiger relativer Apoptose-Resistenz von Tregs.

Des Weiteren hatten CD4+Foxp3+ Tregs bereits 20 h nach CASP im Vergleich zu nicht-

septischen Tieren die Aktivierungsmarker CD69 (Unbehandelt vs. CASP: 8,3 % vs. 25,5 %;

P < 0,01; Abbildung 5B), CTLA-4 (23,9 % vs. 65,1 %; P < 0,01; Abbildung 5C) und ICOS

(26,3 % vs. 38,2 %; P = 0,052; Abbildung 5D) stark hochreguliert.

Im Rahmen der polymikrobiellen Sepsis zeigt diese rasche Hochregulation von

Effektormolekülen auf Tregs in der Milz, dass diese Zellpopulation schnell in die

generalisierte immunologische Abwehrreaktion des Wirts einbezogen wird.

Abbildung 5: CASP führte zu einer raschen Aktivierung von CD4+Foxp3+ Tregs und zu

einem erhöhten prozentualen Anteil dieser T-Zell-Subpopulation

Weibliche PBS-vorbehandelte DEREG-Mäuse (PBS an t= -48 h und -24 h) wurden einer CASP-

OP unterzogen. 20 h später wurden die Milzen entnommen und der prozentuale Anteil der Foxp3-

positiven Zellen an den CD4+ T-Lymphozyten ermittelt (A). Zusätzlich wurde die Expression der

Aktivierungsmarker CD69, CTLA-4 und ICOS auf Tregs (CD4+Foxp3+) bestimmt (B-D). Als

Kontrolle dienten DEREGs, die nach zweimaliger PBS-Applikation unbehandelt gelassen wurden.

Dargestellt sind die Mediane jeder Gruppe; n = 5-6 Tiere /Gruppe; **: P< 0,01.

Ergebnisse

42

4.3 Einfluss der Foxp3+ Tregs auf den Schweregrad der polymikrobiellen Sepsis

4.3.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell.

Da Foxp3+ Tregs in der Sepsis stark aktiviert wurden, stellte sich die Frage, welchen Einfluss

diese Zellen auf die Schwere des Symptomverlaufs und auf das Gesamtüberleben haben. Um

diese Frage zu beantworten, wurden DEREG-Mäuse prophylaktisch 48 und 24 h vor CASP

mit Diphtherie-Toxin vorbehandelt, um regulatorische T-Zellen selektiv zu depletieren. Durch

die Erhebung eines Belastungsscores, der sich aus den Einzelparametern: (1.) allgemeines

Erscheinungsbild, (2.) Atemfrequenz, (3.) spontanes und (4.) provoziertes Verhalten

zusammensetzte, zeigte sich, dass die Treg-Depletion insbesondere in den ersten 36 Stunden

nach Induktion der Sepsis die Krankheitssymptomatik verstärkte (Abbildung 6A). Dennoch

hatte die Depletion der regulatorischen T-Lymphozyten in diesem Modell keinen Einfluss auf

das Überleben der DEREG-Mäuse im Vergleich zu DT-behandelten C57Bl/6-Kontrolltieren

(40 % vs. 50 %; P > 0,05; Abbildung 6B).

Abbildung 6: Eine prophylaktische Treg-Depletion führte zu einer Verschlimmerung des

Krankheitsverlaufs aber nicht zu einem veränderten Überleben in der CASP

DEREG- und C57Bl/6-Mäuse wurden mit DT (1 µg DT in 100 µl PBS an Tag -1 und -2) vorbehandelt

und anschließend einer CASP-OP unterzogen. Die Schwere der Krankheitssymptome wurde über einen

Belastungsscore erhoben (A) und das Überleben (B) über 3 Tage beobachtet. Der Untersucher war dabei

für die Gruppenzugehörigkeit verblindet. Dargestellt sind die Mediane und Interquartilabstände für

jeden Zeitpunkt (A) und die Kaplan Meier-Überlebenskurven (B); n = 10 Tiere/ Gruppe

Ergebnisse

43

4.3.2 Untersuchungen am Modell der verzögerten Treg - Depletion

Um zu untersuchen, ob eine verzögerte Depletion der Tregs den beobachteten

Krankheitsverlauf bei CASP mildern oder das Gesamtüberleben positiv beeinflussen kann,

wurden DEREG-Mäuse 4 h vor CASP-induzierter Sepsis mit DT behandelt.

Dabei zeigten die Belastungsscores trotz erheblicher interindividueller Streuung ähnliche

Ergebnisse wie in der frühen Depletion beobachtet. Auch hier waren die Symptome

insbesondere in den ersten Stunden der Sepsis stärker ausgeprägt, jedoch in geringerem Maß

als bei früher Treg-Depletion (Abbildung 7A).

Die Überlebenskinetiken zeigten in diesem Ansatz ebenfalls keine signifikanten Unterschiede.

Anzumerken ist allerdings, dass die bei einer 16 G-CASP erwartete Überlebensrate von etwa

20-30 % hier mit 70 % vs. 80 % (DEREG-DT vs. C57Bl/6-DT) deutlich höher lag als normal

(Abbildung 7B). Eine Ursache dafür konnte nicht eruiert werden.

Abbildung 7: Die verzögerte Treg-Depletion führt zu einem erschwerten Symptomverlauf, aber

nicht zu einem veränderten Überleben in der CASP

DEREG- und C57Bl/6-Mäuse wurden 4 h vor der Induktion der Sepsis mit 1 µg DT vorbehandelt. Der

Belastungsscore (A) und das Überleben in Zeitintervallen von 3 Stunden überwacht (B). Bei allen

Beobachtungen war der Untersucher für die Gruppenzugehörigkeit verblindet. Dargestellt sind die

Mediane und Interquartilabstände für jeden Zeitpunkt des Belastungsscores (A) und die Kaplan-Meier-

Überlebenskurven (B); n = 10 Tiere/ Gruppe

Ergebnisse

44

4.4 Einfluss der Foxp3+ Tregs auf die bakterielle Clearance und den Influx von

innaten Immunzellen ins Peritoneum nach CASP

In vorangegangenen Arbeiten aus unserem Labor (Mandy Busse, Christian Pötschke) konnte

gezeigt werden, dass eine Antikörper-vermittelte Depletion aller CD4-positiven Zellen vor

der CASP nicht nur das Überleben günstig beeinflusst, sondern auch durch eine Verstärkung

der lokalen Immunantwort eine systemische Streuung der endogenen Darmbakterien

eindämmt [28]. Des Weiteren konnten durch diese lokal umschriebene Entfesselung der

immunologischen Abwehrreaktion das Ausmaß der Hyperinflammation und des initalen

Zytokinsturms deutlich begrenzt werden.

4.4.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell

Um den Beitrag der Foxp3+ Tregs zu diesem in der CD4-Depletion beobachteten Effekt auf

die Stärke der lokalen Abwehrreaktion in der CASP hin zu klären, wurde im Folgenden das

Peritoneum als primärer Infektionsfokus in unserem Sepsismodell genauer untersucht. Dafür

wurden (1.) die bakterielle Last im Peritoneum, (2.) die von hier ausgehende systemische

bakterielle Streuung und (3.) der Influx von innaten Immunzellen genauer analysiert.

Prophylaktisch Treg-depletierte Mäuse wurden dafür einer CASP unterzogen und die

bakterielle Last in verschiedenen Körperflüssigkeiten und Organen (Blut, Peritoneallavage,

Leber, Lunge, Niere, Milz) 20 h nach Induktion der Sepsis im Vergleich zu nicht-depletierten

Kontroll-Tieren bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass die Treg-Depletion weder einen

signifikanten Einfluss auf die lokale Bakterienzahl in der Peritonealhöhle (DEREG-DT vs.

DEREG-PBS vs. C57Bl/6: 0,2 x 106/ml vs. 0,86 x 106/ml vs. 2,7 x 106/ml; P > 0,05), noch auf

das Ausmaß der systemischen bakteriellen Streuung hatte (Abbildung 8). Während in

unbehandelten Tieren sterile Bedingungen vorgefunden wurden, zeigten septische Tiere

unabhängig von der Anwesenheit von Tregs regelmäßig hohe bakterielle Lasten im Blut und

allen untersuchten Geweben. Diese Daten sprechen für eine rasche hämatogene Streuung der

Bakterien, deren lokale Eindämmung durch Clearance-Mechanismen des Wirts durch Tregs

anscheinend nicht beeinflusst wird.

Ergebnisse

45

Abbildung 8: Treg-Depletion hat keinen Einfluss auf die systemische bakterielle Streuung in der

CASP

Blut, Peritoneallavage-Flüssigkeit, Leber, Lunge, Niere und Milz wurden 20 h nach Induktion der CASP

von DT-vorbehandelten DEREG-Mäusen gewonnen. Als Kontrollen dienten entweder PBS-

vorbehandelte DEREGs oder DT-vorbehandelte C57Bl/6-Tiere. Die Flüssigkeiten und Gewebs-

homogenisate wurden für 22 h bei 37° C auf Columbia Blut-Agar-Platten inkubiert und anschließend die

Zahl der Kolonie-bildenden Einheiten (CFUs) auf das Organgewicht bezogen. Die Treg-Depletion hatte

weder Einfluss auf die lokale Clearance noch auf die systemische bakterielle Streuung. Gezeigt sind die

Mediane jeder Gruppe; n = 6 Tiere/ Gruppe

Als erste Abwehrfront des Organismus sind innate Immunzellen am Fokus der Infektion für

die Eindämmung der bakteriellen Streuung unerlässlich. Besonders neutrophile Granulozyten

(Ly6G+) migrierten sehr schnell nach Sepsisinduktion ins Peritoneum, um die eindringenden

Mikroorganismen zu bekämpfen und abzuräumen (DEREG-DT vs. DEREG-PBS vs.

C57Bl/6-DT: 68 % vs. 67 % vs. 51 % des zellulären Infiltrates; Abbildung 9B). Die Gesamtzahl

der peritonealen Makrophagen (F4/80+) dagegen blieb im Sepsisverlauf nahezu unverändert,

was in Anbetracht des massiven Neutrophilen-Influxes zu einem Abfall ihres prozentualen

Anteils am zellulären Gesamtinfiltrat führte (Abbildung 9C).

Ergebnisse

46

In Übereinstimmung mit den bakteriologischen Daten blieb auch die lokale Abwehrreaktion

des angeborenen Immunsystems im Peritoneum durch die Treg-Depletion unbeeinflusst.

Weder die Gesamtzahl der innaten Immunzellen, die im Verlauf der Sepsis ins Peritoneum

wanderten (DT-vorbehandelte DEREGs: 0,9 x 106/ml; PBS- vorbehandelte DEREGs:

1,3 x 106/ml; DT-vorbehandelte C57Bl/6: 1,2 x 106/ml; P > 0,05; Abbildung 9A), noch die

zelluläre Zusammensetzung des Influxes aus Makrophagen und neutrophilen Granulozyten

wurden durch die Depletion der Foxp3+ Tregs signifikant verändert (Abbildung 9B,C).

Abbildung 9: Sowohl Gesamtzahl als auch Zusammensetzung der im Verlauf der CASP ins

Peritoneum wandernden Zellen ist durch die prophylaktische Treg-Depletion unbeeinflusst

20 h nach CASP wurden durch Peritoneallavage mit 5 ml PBS, welches 10 % fötales Kälberserum

enthielt, Zellen aus der Peritonealhöhle von DT-behandelten DEREGs, PBS-behandelten DEREGs und

DT-behandelten C57Bl/6-Mäusen gewonnen. Unbehandelte Tiere dienten als Kontrolle. Die Gesamtzahl

der erhaltenen Zellen wurde bestimmt und auf das Volumen der zurückgewonnenen Lavage-Flüssigkeit

bezogen (A). Anschließend wurde durchflusszytometrisch der Anteil der Makrophagen (F4/80+) und

Neutrophilen (Ly6G+) bestimmt (B,C).

Dargestellt sind die Mediane jeder Gruppe; n = 5-6 Tiere/ Gruppe

Ergebnisse

47


Im Folgenden sollte untersucht werden, wie sich in der CASP die lokale Immunantwort im

Peritoneum ändert, wenn die Population der Tregs in der Phase der Proinflammation erst

sukzessive kleiner wird. Auch in diesem Depletionsansatz zeigten sich hohe bakterielle

Lasten in allen untersuchten Geweben und Körperflüssigkeiten von verzögert Treg-

depletierten DEREG-Mäusen (Milz 0,1 x 106 CFU/g; Leber: 0,06 x 106 CFU/g; Lunge

0,13 x 106 CFU/g; Niere: 0,02 x 106 CFU/g) (Abbildung 10). Signifikante Unterschiede im

Vergleich zu den verschiedenen Kontrollgruppen konnten jedoch auch hier nicht beobachtet

werden. Insgesamt konnte damit auch durch die verzögerte Treg-Depletion kein

nennenswerter Einfluss auf die bakterielle Clearance in der CASP erreicht werden.

Abbildung 10: Die verzögerte Depletion der Tregs hat keinen Einfluss auf das Ausmaß der

bakteriellen Streuung in der CASP

20 h nach Induktion einer polymikrobiellen Sepsis durch CASP wurden Blut, Peritoneallavage-Flüssigkeit,

Leber, Lunge, Niere und Milz von verzögert DT-behandelten DEREG-Mäusen entnommen. Als Kontrollen

dienten PBS-vorbehandelte DEREG- und DT-vorbehandelte C57Bl/6-Mäuse. Die Flüssigkeiten und

Gewebshomogenisate wurden für 22 h bei 37° C auf Columbia Blutagar-Platten inkubiert. Anschließend

wurde die Zahl der Kolonie-formenden Einheiten (CFUs) bestimmt und die bakterielle Last auf das

Organgewicht bezogen. Die verzögerte Treg-Depletion hatte keinen Einfluss auf lokale bakterielle

Clearance oder bakterielle Streuung. Dargestellt sind die Mediane jeder Gruppe, n = 6 Tiere/Gruppe

Ergebnisse

48

Auch in diesem Ansatz blieben Gesamtzahl des peritonealen Zellinfiltrates (DEREG-DT vs.

DEREG-PBS vs. C57Bl/6-DT: 1,9 x 106/ml vs. 1,7 x 106/ml vs. 1,5 x 106; Abbildung 11A) und

dessen Zusammensetzung unverändert (LyG6+ Neutrophile: 58,4 % vs. 62,8 % vs. 58,5 %;

Abbildung 11C). Auffällig ist jedoch, dass der Gesamtinflux im Vergleich zu den

prophylaktischen Depletionsexperimenten deutlich größer. Eine Ursache hierfür konnte nicht

ermittelt werden.

Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die von Busse et al. beschriebene

dämpfende Wirkung von CD4+ T-Zellen auf die lokale antimikrobielle Abwehrreaktion des

Wirts [28] wahrscheinlich nicht durch CD4+ Foxp3+ Tregs verursacht ist.

Abbildung 11: Kein Einfluss einer verzögerten Treg-Depletion auf die Zellzahl oder

Zusammensetzung des peritonealen Zellinfiltrats in der CASP

DEREG-Mäuse wurden therapeutisch 4 h vor Induktion der Sepsis mit 1 µg DT i.v. behandelt. 20 h nach

CASP wurden die sich in der Peritonealhöhle befindlichen Zellen durch Lavage mit 5 ml PBS, das 10 %

fötales Kälberserum enthielt, gewonnen. Als Kontrollen dienten PBS-behandelte DEREGs und DT-

behandelte C57Bl/6-Mäuse nach CASP und entsprechend nicht-septische Tiere. Die gewonnene

Gesamtzellzahl wurde bestimmt und auf das in der Lavage zurückerhaltene Volumen bezogen (A).

Durchflusszytometrisch wurde anschließend der Anteil der Makrophagen (Mac3+) und der Neutrophilen

(Ly6G+) am Zellinfiltrat bestimmt (B,C). Dargestellt sind die Mediane der entsprechenden Gruppen;

n = 5-6 Tiere/ Gruppe

Ergebnisse

49

4.5 Einfluss der Foxp3+ Tregs auf den Aktivierungsstatus des Immunsystems

unter basalen und septischen Bedingungen

Weder die Experimente zur bakteriellen Streuung noch zur Stärke der initialen lokalen

Immunantwort des Wirts konnten die Verstärkung der Krankheitssymptome erklären, die

nach Treg-Depletion beobachtet wurde. Deshalb sollte im Folgenden der Einfluss der

Depletion auf die systemische Entzündungsantwort und den Aktivierungsstatus der

verbleibenden CD4+Foxp3- Effektor-T-Zellen (Teff) beleuchtet werden. Dafür wurde die

Expression der Aktivierungsmarker CD69, CTLA-4 und ICOS auf Teff-Zellen und die

systemischen Konzentrationen verschiedener Zytokine im Serum unter septischen und nicht-

septischen Bedingungen bestimmt.

4.5.1 Untersuchungen am prophylaktischen Depletionsmodell

Schon unter nicht-inflammatorischen Bedingungen konnte bereits 3 Tage nach der ersten DT-

Gabe in der Milz von prophylaktisch Treg-depletierten DEREGs eine Verdopplung des

Anteils von CD69-positiven (DEREG-DT vs. DEREG-PBS: 10,3 % vs. 4,6 %; P < 0,05), von

ICOS-positiven (28,8 % vs. 15,2 %; P < 0,01) und von CTLA-4-exprimierenden CD4+Foxp3-

Teff (5,9 % vs. 1,9 %; P < 0,01) beobachtet werden (Abbildung 12A-C).

In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen waren auch die Serumkonzentrationen von TNF

(DEREG-DT vs. DEREG-PBS: 12,5 pg/ml vs. 5,6 pg/ml; P < 0,05), MCP-1 (169,4 pg/ml vs.

73,5 pg/ml; P < 0,01) und IL-6 (5,2 pg/ml vs. 1,7 pg/ml, P < 0,05) in Treg-depletierten

DEREGs zu diesem Zeitpunkt um den Faktor 2 erhöht (Abbildung 12D-F). Auch im Peritoneum

fanden sich auf niedrigem Grundniveau signifikant erhöhte Zytokinkonzentrationen

(TNF: 5,3 pg/ml vs 1,4 pg/ml, P < 0,01; MCP-1: 31,4 pg/ml vs 0 pg/ml; P < 0,01). Keine

Unterschiede ergaben sich dagegen in den Serumspiegeln von IL-10 und IFN.

Diese Daten sprechen für eine kontinuierliche Treg-vermittelte Suppression der Teff- Zellen

im Steady State und zeigen, dass das Immunsystem in Treg-depletierten Mäusen vor

Induktion der Sepsis durch CASP aktiviert war. Diese Präaktivierung liefert eine mögliche

Erklärung für den schwereren Symptomverlauf dieser Mäuse, der in den ersten Stunden nach

Sepsisinduktion besonders ausgeprägt war.

Ergebnisse

50

Abbildung 12: Einfluss der prophylaktischen Treg-Depletion auf die Aktivierung von

Effektor-T-Zellen und die Zytokinkonzentrationen im Serum unter basalen und septischen

Bedingungen

Mit DT vorbehandelte DEREG-Mäuse wurden entweder einer CASP-OP unterzogen oder ohne

weitere Behandlung belassen. PBS-vorbehandelte DEREG-Tiere und DT-vorbehandelte C57Bl/6-

Mäuse dienten als Kontrollen. 20 h später wurden Blut und Milz gewonnen und die Expression

der Aktivierungsmarker CD69, ICOS und CTLA-4 auf Teff analysiert (A-C). Die Treg-Depletion

führte zur Verdopplung des Anteils präaktivierter Teff unter basalen Bedingungen. Diese

Unterschiede wurden jedoch durch die starke systemische Aktivierung der Teff während der

CASP nivelliert. In Übereinstimmung damit waren auch die basalen Zytokinkonzentrationen im

Serum nach Treg-Depletion erhöht (D-F); nicht mehr jedoch nach Sepsisinduktion (Daten nicht

gezeigt)

Dargestellt sind die Mediane jeder Gruppe ; n = 4-6 Tiere/ Gruppe; *: P < 0,05; **: P < 0,01

Ergebnisse

51

Zwanzig Stunden nach CASP waren die Teff-Zellen dagegen anscheinend durch die massive

Flut eindringender Pathogene so stark aktiviert und zur Sekretion proinflammatorischer

Zytokine angeregt, dass die basalen Unterschiede im Aktivierungsstatus und in den Serum-

Zytokinkonzentrationen nach Treg-Depletion nivelliert wurden (DEREG-DT vs. DEREG-

PBS in CASP- CD69: 19,9 % vs. 18,8 %; CTLA-4: 24,3 % vs. 14,6 %; TNF: 95,6 pg/ml vs.

86,4 pg/ml; MCP-1: 1335 pg/ml vs. 1682 pg/ml; IL-6: 5545 pg/ml vs 4210 pg/ml; IL-

10: 1221 vs. 970 pg/ml, P > 0,05; Abbildung 12A-C und Abbildung 13).

Des Weiteren waren auch die lokalen Konzentrationen von TNF (DEREG-DT: 114,3 pg/ml;

DEREG-PBS: 142,2 pg/ml; C57Bl/6-DT: 123,1 pg/ml), MCP-1 (4714 pg/ml vs. 3138 pg/ml

vs. 4451pg/ml), IL-6 (7227 pg/ml vs. 4081 pg/ml vs. 4312 pg/ml) und IL-10 (69,6 pg/ml vs.

66,3 pg/ml vs. 33,3 pg/ml) im Peritoneum nach der Sepsis unabhängig von der Anwesenheit

von Tregs stark erhöht (Abbildung 13) .

Abbildung 13: CASP führt zur Nivellierung der durch die Treg-Depletion erhöhten basalen Serum-

zytokinkonzentration

DT- vorbehandelte DEREG-Mäuse und entsprechende Kontrolltiere wurden einer CASP unterzogen.

20 h später wurden Serum (obere Reihe) und Peritoneallavage-Flüssigkeit (untere Reihe) gewonnen und

die Konzentrationen von TNF, MCP-1, IL-6 und IL-10 bestimmt.


Ergebnisse

52


Bisher hatten sich ähnliche Ergebnisse in dem prophylaktischen und in dem verzögerten

Depletionsansatz gezeigt: Unverändertes Überleben bei schwererem Krankheitsverlauf und

keine Beeinflussung der lokalen Abwehrreaktion. In Anbetracht der Präaktivierung des

Immunsystems durch die prophylaktische Treg-Depletion stellte sich die Frage, ob auch in

der deutlich kürzeren Zeit einer verzögerten Depletion ein erhöhter basaler Aktivierungsstatus

des Immunsystems ausgelöst wurde.

Aus diesem Grund wurde auch in diesem Ansatz die basale Expression der

Aktivierungsmarker CD69, ICOS und CTLA-4 auf Teff-Zellen und die basalen

Zytokinspiegel von TNF, MCP-1 und IL-6 im Serum 24 h nach DT-Gabe analysiert.

Dabei zeigte sich, dass zwar die späteren Aktivierungsmarker CTLA-4 (DEREG-DT vs.

DEREG-PBS: 0,4 % vs. 0,82 % CTLA4+/CD4+Foxp3-; P > 0,05; Abbildung 14C) und ICOS

(11,2 % vs. 8,3 % ICOS+/CD4+Foxp3-; P > 0,05; Abbildung 14B) nicht signifikant in ihrer

basalen Expression auf Foxp3- Teff erhöht waren. Dagegen war beim sehr frühen

Aktivierungsmarker CD69 bereits eine hoch signifikante Zunahme der Expression unter

nicht-inflammatorischen Bedingungen zu erkennen (7,4 % vs. 5,4 % CD69+/CD4+Foxp3-;

P < 0,01; Abbildung 14A).

Diese Beobachtungen wurden auch durch die Untersuchung der systemischen Zytokinspiegel

bestätigt. Bereits innerhalb der relativ kurzen Zeitspanne von 24 h nach DT-Gabe, in welcher

die Gesamtzahl der Tregs kontinuierlich abfiel, kam es zu einer gewissen Präaktivierung des

Abwehrsystems. Sowohl die Serumspiegel von TNF (DEREG-DT vs. DEREG-PBS vs.

C57Bl/6-DT: 9 pg/ml vs. 0 pg/ml vs. 2,2 pg/ml; P < 0,05) als auch von MCP-1 (62,8 pg/ml

vs. 0 pg/ml vs. 9,1 pg/ml; P < 0,05) waren signifikant erhöht (Abbildung 14). Während auch die

Konzentration von IL-10 signifikant erhöht war (11,9 pg/ml vs. 0 pg/ml vs. 0 pg/ml) zeigten

sich bei IL-6 keine signifikanten Unterschiede.

Ergebnisse

53

Abbildung 14: Eine verzögerte Treg-Depletion führt innerhalb von 24 h zur Erhöhung des

basalen Aktivierungsgrades

Zur Ermittlung des Einflusses einer verzögerten Treg-Depletion auf den Aktivierungsstatus des

Immunsystems wurden 24 h nach einmaliger DT-Applikation Splenozyten und Serum von

DEREG-Mäusen gewonnen. Anschließend wurde die Expression von CD69, ICOS und CTLA-4

auf den verbleibenden CD4+Foxp3+ Teff-Zellen und die Konzentration der pro-inflammatorischen

Zytokine TNF, MCP-1 und IL-6 im Serum bestimmt. Als Kontrollen dienten PBS-behandelte

DEREGs und DT-behandelte C57Bl/6-Mäuse, sowie entsprechend behandelte Tiere 20 h nach

CASP.

Dargestellt sind die Mediane der jeweiligen Gruppen, n = 5 Tiere/ Gruppe, *: P < 0,05 **: P < 0,01

Ergebnisse

54

Diese Daten sprechen für eine geringgradige Aktivitätssteigerung des Immunsystems bei

langsam abnehmender Treg-vermittelter Suppression. Dadurch wird deutlich, dass die

Präaktivierung des Immunsystems Zeit braucht.

Mit diesem Ansatz bestätigte sich erneut, dass in der Sepsis eine Maximalaktivierung des

Immunsystems als Reaktion auf die eindringenden Mikroorganismen vorliegt, welche von

den Tregs nicht kontrolliert werden kann. So zeigten sich in den lokalen und systemischen

Zytokinkonzentrationen 20 h nach CASP auch hier keine signifikanten Unterschiede mehr

(DEREG-DT vs. DEREG-PBS vs. C57Bl/6-DT im Serum: TNF 5,9 pg/ml. vs. 91,4 pg/ml vs.

20,1 pg/ml; MCP-1 1815 pg/ml vs. 25948 pg/ml vs. 1729 pg/ml; IL-6 93 pg/ml vs.

4367 pg/ml vs. 180 pg/ml; IL-10 0 pg/ml vs. 653 pg/ml 93 pg/ml). Die Konzentrationen

einiger Zytokine erschienen tendenziell erniedrigt, jedoch war die interindividuelle

Variabilität so groß, dass keine Schlussfolgerungen möglich sind.


zytokinkonzentration im verzögerten Depletionsansatz

DT- vorbehandelte DEREG-Mäuse und entsprechende Kontrolltiere wurden einer CASP unterzogen.

20 h später wurden Serum (obere Reihe) und Peritoneallavage-Flüssigkeit (untere Reihe) gewonnen und

die Konzentrationen von TNF, MCP-1, IL-6 und IL-10 bestimmt.


Ergebnisse

55

Auffällig in diesem Ansatz war dagegen der Phänotyp der Teff in Treg-depletierten DEREGs

20 h nach CASP. Während CD69 (Unbehandelt vs. CASP: 7,4 % vs. 13,7 %

CD69+/CD4+Foxp3-; P < 0,01; Abbildung 14A) unabhängig von der sinkenden Treg-Zahl in der

Sepsis stark hochreguliert wurde, zeigte sich keine Expressionssteigerung von CTLA-4

(0,4 % vs. 2,1 % CTLA4+/CD4+Foxp3-; Abbildung 14C). Auch histologisch konnte in der Milz

von Treg-depletierten DEREGs gezeigt werden, dass Teff-Zellen nach CASP CTLA-4-

negativ blieben (Abbildung 16). In nicht-depletierten Tieren konnte dagegen eine deutliche

CTLA-4-Expression auf Foxp3- Teff-Zellen nach der CASP sowohl durchflusszytometrisch

als auch histologisch nachgewiesen werden (Abbildung 14C und Abbildung 16).

Abbildung 16: Gestörte CTLA-4-Expression auf murinen Teff-Zellen nach verzögerter Treg-

Depletion und CASP

Zur Beurteilung der CTLA-4-Expression 20 h nach CASP-induzierter Sepsis in PBS-vorbehandelten

DEREGs (A) und verzögert Treg-depletierten Tieren (B) wurden Kryostatschnitte der asservierten

Milzen angefertigt und immunfluoreszenzmikroskopisch analysiert. Gefärbt wurde dafür mit aCD4-

Alexa647 (blau), aFoxp3-Alexa488 und purified aCTLA-4, der über einen biotinylierten aHamster-Ak

und Streptavidin-TRITC (rot) angefärbt wurde. Weiße Pfeile markieren CTLA-4+Foxp3- Teff-Zellen.

n= 4 Tiere/ Gruppe ; jeweils ein Überlagerungsbild exemplarisch dargestellt

DEREG-PBS-CASP DEREG-DT-CASP

Ergebnisse

56

4.6 Untersuchungen zum Ausschluss einer transienten Foxp3+-Expression in

aktivierten Teff-Zellen

Im humanen System wurde gezeigt, dass aktivierte Teff-Zellen transient Foxp3-positiv

werden [54]. Dieses Phänomen ist in der Maus bisher nicht beschrieben. Da Foxp3 als

Transkriptionsfaktor die Expression von verschiedenen Effektormolekülen in Tregs

kontrolliert, ist seine Expression auch mit einer hohen Dichte von CTLA-4 in der Zelle

assoziiert [96]. CTLA-4 wird allerdings in der Maus nicht ausschließlich auf Tregs exprimiert

sondern auch auf aktivierten Teff-Zellen [97]. Bisher war unklar, ob die Expression von

CTLA-4 hier unter der Kontrolle einer transienten Foxp3-Expression steht.

In diesem Kontext war es erstaunlich, dass im hier vorgestellten verzögerten Depletionsansatz

selbst 20 h nach Sepsisinduktion kein CTLA-4 auf Teff-Zellen zu finden war. Wir vermuteten

deshalb, dass aktivierte Teff-Zellen nicht nur CTLA-4, sondern obendrein transient Foxp3

exprimiert hatten. Da in der DEREG-Maus auch der DTR unter der Kontrolle des Foxp3-

Lokus steht, würde DT, das 4 h nach Applikation noch im System ist, transient Foxp3+

exprimierende CTLA-4+ Teff-Zellen in Apoptose schicken.

Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden DEREG-Mäuse prophylaktisch Treg-depletiert

(DT an den Zeitpunkten -48 h und -24 h vor CASP), um eine natürliche Foxp3-Expression in

diesen Tieren auszuschalten. Dabei wurde davon ausgegangen, dass 24 h nach der letzten

Applikation kein DT mehr im System ist. Zum Zeitpunkt t0 wurden die depletierten Tiere

dann einer CASP-Operation unterzogen. Zeitgleich erhielt eine Gruppe erneut DT, um

transient Foxp3-positive Zellen über den ko-exprimierten DTR zu depletieren. Eine zweite

Gruppe erhielt als Volumenkontrolle steriles PBS. Als Read-Out wurde die CTLA-4-

Expression nach CASP analysiert

Im Ergebnis zeigten sich in beiden Gruppen hohe Expressionsgrade von CTLA-4 auf Teff-

Zellen 20 h nach Sepsisinduktion (DT vs. PBS: 29,9 % vs. 16,0 % CTLA-4+/CD4+Foxp3-;

P = 0,40) (Abbildung 17). In der DT-Gruppe schien die CTLA-4-Expression sogar tendenziell

erhöht zu sein, auch wenn sich hier durch die relativ große Streuung keine signifikanten

Unterschiede ergaben.

Insgesamt legen die hier gewonnenen Daten nahe, dass die CTLA-4-Expression auf Teff-

Zellen in der CASP unabhängig von der Anwesenheit von DT ist. Das Auftreten von transient

CTLA-4+Foxp3+ Teff-Zellen im verzögerten Depletionsansatz wird damit unwahrscheinlich.

Ergebnisse

57

Im verzögerten Depletionsansatz muss deshalb wahrscheinlich von einem direkten Einfluss

der in Apoptose begriffenen Tregs oder einer durch die Depletion ausgelösten Apoptose-

induzierten Anergie in Teff-Zellen ausgegangen werden.

Abbildung 17: Kein Einfluss einer unmittelbaren Anwesenheit von DT im System auf

CTLA-4 Expression auf Teff-Zellen

Um das Auftreten von transient CTLA-4+Foxp3+Teff-Zellen im verzögerten Depletionsansatz

auszuschließen, wurden DEREG-Mäuse prophylaktisch an t-2= -48 h und t-1= -24 h mit DT

vorbehandelt. Zum Zeitpunkt t0= wurden beide Gruppen einer CASP unterzogen. Dabei erhielt

eine Gruppe zeitgleich DT (schwarz ausgefüllte Kreise) während die andere als Volumenkontrolle

PBS erhielt (schwarz gerahmte Rechtecke). Als Read-Out wurde 20 h nach der CASP die

Splenozyten isoliert und die CTLA-4 Expression auf CD4+Foxp3- Teff-Zellen bestimmt.

Dargestellt sind jeweils die Mediane beider Gruppen; n = 3 Tiere/Gruppe; n.s.: nicht signifikant

Ergebnisse

58

4.7 Serumkonzentrationen von IL-9 und IL-17 in der Sepsis

IL-17 ist ein Mitglied der IL-17-Zytokinfamilie, das zahlreiche Funktionen innerhalb des

Immunsystems hat. Es wird unter anderem von Typ 17 T-Helfer-Zellen (Th17-Zellen)

gebildet und wirkt synergistisch mit TNF und IL-6. Durch Aktivierung von Makrophagen,

Endothelzellen und Fibroblasten kann es zur Gefäßaktivierung, zu vielfältigen Entzündungs-

reaktionen und zur Zerstörung der extrazellulären Matrix führen [98]. Es gibt Hinweise auf

eine reziproke Regulation von Th17-Zellen und Tregs [99]; auch wurde beim Menschen

beobachtet, dass Tregs in Anwesenheit von IL-6 und IL-1 selbst zur IL-17 Sekretion

stimuliert werden [100]. Deshalb sollte geprüft werden, welchen Einfluss eine Treg-Depletion

auf die Serumkonzentration dieses Zytokins im CASP-Modell hat. Auch IL-9 gelangte in den

Fokus des Interesses. Dieses Zytokin ist ein potenter Wachstumsfaktor für T-Zellen, induziert

die Bildung von Th17-Zellen und verstärkt die suppressorischen Eigenschaften von Foxp3+

regulatorischen T-Zellen [101].

Um den Einfluss einer generalisierten mikrobiellen Infektion auf die Serumkonzentrationen

von IL-9 und IL-17 zu bestimmen und den Effekt einer Treg-Depletion auf diese zu

untersuchen, wurden DT-vorbehandelte DEREG-Mäuse einer CASP unterzogen. Als

Kontrollen dienten PBS-vorbehandelte DEREGs und DT-vorbehandelte C57Bl/6- Mäuse

nach CASP und entsprechend unbehandelte Tiere.

Überraschenderweise zeigte sich bei allen Gruppen eine signifikante Abnahme der Serum-

spiegel von IL-9 20 h nach CASP im Vergleich zu nicht-septischen Kontrolltieren

(Unbehandelt vs. CASP :DEREG-DT 860 vs. 227 pg/ml, P < 0,01; DEREG-PBS 972 vs.

365 pg/ml, P < 0,01; C57Bl/6 1220 vs. 561 pg/ml, P = 0,057; Abbildung 18). Diese Daten

deuten darauf hin, dass unabhängig von einer Treg-vermittelten Suppression die Serumspiegel

dieses potenten Wachstumsfaktors für T-Zellen in der Sepsis fallen. Auffällig ist jedoch, dass

sowohl unter septischen als auch unter nicht-septischen Bedingungen die Konzentrationen in

Treg-depletierten DEREGs im Vergleich zu C57Bl/6 Mäusen signifikant erniedrigt waren.

Ergebnisse

59

Auch die Konzentrationen von IL-17 waren in septischen Tieren tendenziell, aber nicht

signifikant erniedrigt (Unbehandelt vs. CASP: DEREG-DT 60 vs. 23 pg/ml; DEREG-PBS 64

vs. 38 pg/ml; C57Bl/6-DT 77 vs. 56 pg/ml, P > 0,05; Abbildung 18)

Im verzögerten Depletionsansatz wurden die beschriebenen Beobachtungen tendenziell aber

durch die teilweise sehr geringen auswertbaren Gruppengrößen nicht signifikant bestätigt

(siehe Anhang: Abbildung 19). Die Robustheit des zuvor beschriebenen Effekts wird deshalb zu

hinterfragen sein. Da die Auswirkungen von akutem Stress, wie er durch eine i.v. Applikation

im verzögerten Ansatz gesetzt wird, auf die folgende Immunantwort umfassend in der

Literatur beschrieben ist, kann hier eine Beeinflussung durch erhöhte Katecholamin- oder

Glukokortikoidspiegel nicht ausgeschlossen werden.

Abbildung 18: CASP führte zu veringerten Serum-Konzentrationen von IL-9 und IL-17

DT-vorbehandelte DEREG- und C57Bl/6- Mäuse als auch PBS-vorbehandelte DEREG-Tiere wurden einer

CASP-Operation unterzogen. 20 h später wurde das Blut gewonnen und die Konzentrationen von IL-9 und

IL-17 im Serum bestimmt. CASP führte zu einer signifikanten Abnahme der IL-9-Spiegel, während die

Konzentration von IL-17 im Serum nur tendenziell erniedrigt war.

Dargestellt sind die Mediane jede Gruppe; n = 3-6 Tiere/ Gruppe; *: P < 0,05 **: P < 0,01

Diskussion

60

5 Diskussion

5.1 Größe und Aktivierungsstatus der Treg - Population im Kontext einer

polymikrobiellen Sepsis

Am Anfang dieser Arbeit stand die Beobachtung, dass eine fulminante, fäkale Peritonitis das

systemische Verhältnis zwischen CD4+Foxp3+ Tregs und CD4+Foxp3- Teff-Zellen stark

zugunsten der Tregs verschiebt. Dies zeigte sich eindrucksvoll in einer Verdopplung des

Anteils Foxp3-exprimierender Zellen in der Population der CD4+ Splenozyten 20 h nach

CASP-induzierter Sepsis.

In bisherigen Untersuchungen zum Einfluss generalisierter Infektionen und schwerer

Traumata wurde diese Zellpopulation zumeist über die konstitutive Co-Expression von CD4

und CD25 charakterisiert. So fanden Scumpia et al. im murinen Sepsismodell der Cecal

ligation and Puncture (CLP) den prozentualen Anteil der CD4+CD25+ Tregs durch die

generalisierte Infektion um den Faktor 2 bis 2,5 erhöht [90]. Darüber hinaus wurde beim

Menschen durch Monneret et al. [103] und Venet et al. [104, 105] gezeigt, dass der

prozentuale Anteil dieser Zell-Population im peripheren Blut von Patienten im septischen

Schock stark erhöht ist. Die Autoren vermuteten eine Suppressionsverstärkung, die eine

Ursache für die Entwicklung einer oft letal verlaufenden Immunparalyse im Sepsisgeschehen

sein könnte. Diese Effekte scheinen dabei nicht auf mikrobiell ausgelöste Immunreaktionen

beschränkt zu sein. So wurden auch in murinen Traumamodellen nach großflächigen

Verbrennungen [106] und im Blut von Patienten mit akutem Schlaganfall [107] relativ

erhöhte Treg-Zahlen gefunden. Wenn auch massive Traumen und großflächige

Gewebszerstörungen zu einer Verschiebung des Treg/Teff-Verhältnisses führen, ist dies nicht

infektionsspezifisch. Insgesamt sind die in der Literatur beschriebenen Beobachtungen

konsistent mit den Ergebnissen dieser Arbeit für CD4+Foxp3+ Tregs im CASP-Modell.

Wodurch wird dieser starke prozentuale Anstieg der Tregs in der Sepsis ausgelöst? Eine

mögliche Erklärung könnte die periphere Konversion von Foxp3- T-Zellen zu

Foxp3+ induzierten Tregs sein. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass Tregs nicht nur

im Thymus generiert werden können. Vielmehr scheint auch in der Peripherie eine Induktion

der Foxp3-Expression in naiven T-Zellen möglich zu sein. Zu den wichtigen

Voraussetzungen gehört der Einfluss von TGF- [108-110]. Da Foxp3 eng mit den immun-

Diskussion

61

modulatorischen Funktionen von Tregs assoziiert ist [49, 111], zeigen diese iTregs ebenfalls

ein ausgeprägtes suppressorisches Potential [109] und sind phänotypisch kaum von

natürlichen Tregs aus dem Thymus zu unterscheiden.

Es muss jedoch neben der Möglichkeit der T-Zellkonversion auch ein zweiter

Erklärungsansatz in Betracht gezogen werden. Untersuchungen in vitro und in vivo haben im

humanen und murinen System deutlich belegt, dass sich Tregs im Vergleich zu Teff-Zellen

durch eine relative Apoptoseresistenz auszeichnen [112-114]. Sie könnten also bei Sepsis, die

mit massivem Zelltod von Immunzellen einhergeht, einen Überlebensvorteil gegenüber Teff-

Zellen haben. Auch hierin könnte eine Ursache für die beobachtete Verschiebung des

Treg/Teff-Verhältnisses liegen. In Überstimmung damit wurde durch Venet et al. in der

humanen Sepsis gezeigt, dass der relative Anstieg der CD4+CD25+ Tregs in der Sepsis nicht

durch eine Expansion dieser Zellpopulation bedingt ist, sondern durch eine verstärkte

Apoptose von CD4+CD25- nicht-regulatorischen T-Zellen verursacht wird [104]. Auch

Scumpia et al. konnten eine signifikante Zunahme der Absolutzellzahl der Tregs erst 3 Tage,

nicht aber 24 h nach Sepsisinduktion beobachten [90]. In dieser Arbeit war die Absolutzahl

von CD4+Foxp3+ Tregs 20 h nach Sepsisinduktion tendenziell, aber nicht signifikant, erhöht.

Dies legt den Schluss nahe, dass hauptsächlich der Tod von Teff-Zellen für das verschobene

Treg/Teff-Verhältnis verantwortlich ist. Diese Hypothese wird zusätzlich gestützt durch

in vitro Untersuchungen zur Kinetik der Foxp3-Induktion in naiven T-Zellen. Selvaraj und

Geiger zeigten, dass nur ein enges kinetisches Fenster nach TCR-Stimulation zur Induktion

von Foxp3 durch TGF- besteht und dass eine Foxp3-Expression erst mit einer Verzögerung

von 2 Tagen nachweisbar war [115]. Auch wenn sich dies nicht unmittelbar auf die Situation

in vivo übertragen lässt, ist es doch unwahrscheinlich, dass bereits 20 h nach Sepsisinduktion

eine periphere Konversion stattgefunden hat, die den relativen Anstieg des Treg-Anteils

erklären könnte. Trotz alledem kann diese Möglichkeit oder auch ein Zusammenspiel von

Apoptoseresistenz und peripherer Konversion nicht völlig ausgeschlossen werden.

Ein weiteres zentrales Anliegen dieser Arbeit bestand darin zu beleuchten, wie endogene

CD4+Foxp3+ Tregs auf den Stimulus einer diffusen Peritonitis reagieren. Sowohl im murinen

CLP-Modell als auch in der humanen Sepsis wurde bisher beschrieben, dass die CD4+CD25+

Treg-Population bei Sepsis nicht aktiviert werden, weil sie CD69-negativ und CD45RO-

positiv bleiben [90, 103, 116]. Diese Beobachtungen stehen teilweise im Widerspruch zu den

Ergebnissen dieser Arbeit.

Diskussion

62

Bei Vergleichen mit älteren Studien gilt es allerdings zu bedenken, dass der dort zumeist

verwendete Marker CD25 nicht als Treg-spezifisch anzusehen ist. Vielmehr wird CD25 zum

einen auch auf aktivierten Teff-Zellen hochreguliert [117, 118], zum anderen gibt es in

einigen peripheren Geweben CD25-negative Tregs [119]. Es ist deshalb wahrscheinlich, dass

bei Fokussierung auf CD4+CD25+ Treg-Zellen eine heterogene Population untersucht wurde,

was die Interpretation der Daten erschwert. Wenngleich auch für Foxp3 im humanen System

eine transiente Expression in aktivierten Teff-Zellen beschrieben wurde [55], ist dieses

Phänomen in der Maus bisher nicht beobachtet worden. Der in dieser Arbeit als Treg-Marker

verwendete Foxp3-Transkriptionsfaktor ist damit im murinen System weiterhin der

spezifischste Marker für diese Zellpopulation.

In teilweisem Widerspruch zu den Ergebnissen von Scumpia et al. [90] konnte hier gezeigt

werden, dass offensichtlich schon in der frühen hyperinflammatorischen Phase ein großer Teil

der CD4+Foxp3+ Tregs die Expression der Aktivierungsmarker CD69, CTLA-4 und ICOS

stark hochregulierte. Dies zeigte sich eindrucksvoll in einer Verdreifachung des Anteils

CD69-positiver und CTLA-4-exprimierender Tregs in der Milz 20 h nach CASP. Diese

Ergebnisse legen nahe, dass auch endogene Foxp3-positive Tregs von der systemischen

Infektion in der Sepsis nicht unbeeinflusst bleiben, sondern auf die Überflutung des

Organismus mit endogenen Darmbakterien rasch mit Aktivierung reagieren.

Lehrbuchmeinung war bisher, dass für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems mehrere

Tage notwendig sind. Dies ließ es sehr unwahrscheinlich escheinen, dass diese Zellen eine

hoch akut verlaufende Sepsis beeinflussen könnten. Im Gegensatz dazu wurde in dieser

Arbeit eine rasche und systemische Aktivierung von CD4+Foxp3+ Tregs in der CASP

beobachtet. Es stellt sich nun die Frage, wie diese Zellen in der Sepsis aktiviert werden. Es

sind dafür mehrere Möglichkeiten vorstellbar. Im Verlauf einer generalisierten Infektion

kommt es erstens durch die Invasion der Pathogene selbst und zweitens in Folge der starken

proinflammatorischen Abwehrreaktion des Wirtes zu ausgedehnten Gewebsdestruktionen.

Dadurch werden Selbstantigene des Wirts für Zellen des Abwehrsystems frei zugänglich

[120, 121]. Natürliche Tregs, welche im Thymus reifen und zum großen Teil Selbst-Antigen-

spezifische TCRs tragen [122, 123], könnten durch die Präsentation dieser Selbst-Antigene

und entsprechende ko-stimulatorische Signale aktiviert und zur Expression verschiedener

Effektormoleküle angeregt worden sein. Zweitens gilt als gesichert, dass Tregs Toll-like- und

andere Rezeptoren zur Erkennung konservierter mikrobieller Strukturen und Danger

Associated Molecular Patterns (DAMPs) auf ihrer Oberfläche tragen [56, 57]. Durch die

Diskussion

63

Ligation dieser Rezeptoren können Tregs einerseits schnell aktiviert und in ihrer suppressiven

Eigenschaft verstärkt andererseits aber auch selbst supprimiert werden [124].

Ob aktivierte Tregs in der Sepsis eine pathophysiologisch bedeutsame Suppression auf die

Immunantwort ausüben und damit den von Busse et al. [28] beschrieben dämpfenden Effekt

auf die lokale Immunantwort vermitteln, lässt sich auf der Basis dieser Überlegungen nicht

vorhersagen.

5.2 Rolle und Funktion der Foxp3+ Tregs in der murinen Sepsis

Um die Rolle der Tregs bei der Sepsis zu beleuchten, wurde in dieser Arbeit ein Mausmodell

eingesetzt, das die induzierte Depletion von Foxp3+ Tregs nach dem Prinzip des Toxin-

Rezeptor-vermittelten konditionalen Zell-Knock-Outs (TRECK) [125] ermöglicht.

In der Literatur ist umfänglich beschrieben, dass murinen WT-Zellen ein funktioneller

Diphtherierezeptor fehlt, so dass sie unfähig zur Aufnahme des Diphtherie-Toxins und

deshalb resistent gegen seine Proteinbiosynthese-inhibierende Wirkung sind [126, 127]. Die

in dieser Arbeit verwendete transgene DEREG-Maus exprimiert dagegen einen DT-Rezeptor

unter der Kontrolle des Foxp3-Lokus [39], was die selektive Depletion der Foxp3-positiven

Tregs mit Diphtherietoxin ermöglichte. Damit konnte untersucht werden, wie sich die

Immunantwort des Wirts auf die generalisierte Infektion in der CASP ändert, wenn Tregs

prophylaktisch oder verzögert aus dem System entfernt werden.

Es zeigte sich, dass durch eine prophylaktische Depletion von endogenen Foxp3+ Tregs vor

der CASP weder (1.) das Ausmaß der lokalen Abwehrreaktion im Peritoneum, noch (2.) die

systemische Immunantwort, oder (3.) die bakterielle Streuung verändert wurden. Diese

Ergebnisse konnten auch in einem zweiten Ansatz mit verzögerter Depletionsstrategie

bestätigt werden. In diesem experimentellen Ansatz sollte eine eventuell dämpfende Wirkung

der Tregs auf die sehr frühe Hyperinflammation und die damit verbundenen

Immunpathologien aufrechterhalten werden. Im Nachhinein kann nicht sicher ausgeschlossen

werden, dass Tregs bereits direkt nach der DT-Applikation in ihrer Proteinbiosynthese

inhibiert [128] und damit in der Hyperinflammation nicht mehr ansprechbar waren. Dennoch

konnte in diesem Ansatz zumindest die Interferenz mit der durch die Treg-Depletion

ausgelösten Präaktivierung des Immunsystems dadurch minimiert werden, dass die Zeit, in

welcher Teff-Zellen vor der Sepsisinduktion ohne Treg-vermittelte Kontrolle waren,

Diskussion

64

möglichst gering gehalten wurde. Aus den in dieser Arbeit gezeigten Ergebnissen zur

prophylaktischen und verzögerten Treg-Depletion lässt sich deshalb zusammen klar

schlussfolgern, dass endogene CD4+Foxp3+ Tregs keinen Einfluss auf die Stärke und

Ausprägung der lokalen und systemischen Immunantwort in der hyperinflammatorischen

Phase einer CASP-induzierten Sepsis haben. Sie können damit das Überleben nicht

signifikant beeinflussen.

Damit sind diese Daten in prinzipieller Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die sowohl

Scumpia et al. [90] als auch Wisnoski et al. [91] in der CLP über eine Anti-CD25-Antikörper-

vermittelte Depletionsstrategie der Tregs erhalten haben. Auch hier zeigten sich weder das

Überleben noch die systemische Immunantwort in der Sepsis durch die prophylaktische

Ablation der CD4+CD25+ Tregs verändert. Ein Widerspruch ergibt sich dagegen zu den

Ergebnissen von Chen et al. [129], die bei einer Antikörper-vermittelten Depletion von

CD4+CD25+ Tregs vor CLP-induzierter Sepsis ein deutliche Steigerung der Überlebensraten

beobachten konnten. Allerdings lassen sich die genannten Studien mit dieser Arbeit nicht

unbedingt vergleichen. So wurde durch Couper et al. publiziert, dass die Behandlung mit dem

von allen genannten Gruppen verwendeten Anti-CD25-Antikörper (PC61) lediglich zu einer

inkompletten Depletion führt und CD25lowFoxp3+ und CD25-Foxp3+ Tregs durch den

Antikörper nicht erfasst werden [130]. Dieselbe Arbeitsgruppe zeigte im murinen

Malariamodell nach einer Anti-CD25-Behandlung eine rasche Repopulation der

CD4+CD25+Foxp3+ Tregs durch Expansion der CD4+CD25-Foxp3+ Zellen und eine

Hochregulation von CD25 [130]. Es ist deshalb unklar, wie sich eine Anti-CD25-Antikörper-

vermittelte Ablation von Tregs auf diese heterogene Zellpopulation vor der Sepsisinduktion

und auf ihre Repopulation in der Sepsis selbst auswirkt. Auch kann nicht ausgeschlossen

werden, dass dieser Antikörper, der sich nach der Sepsisinduktion noch im System befindet,

auch aktivierte Effektor-T-Zellen depletiert, die ebenfalls CD25 exprimieren. Die Depletion

von endogenen Tregs nach dem Kriterium der Foxp3-Expression, wie sie in dieser Arbeit

eingesetzt wurde, ist spezifischer.

Zwei weitere Gründe erschweren den direkten Vergleich der hier gezeigten mit den in der

Literatur beschriebenen Ergebnissen. Erstens sind Depletionsstrategien per se immer ein

Eingriff ins Gesamtsystem des Organismus. Fraglich ist, ob die Ergebnisse einer Antikörper-

vermittelten Zelllyse mit einer DT-vermittelten Apoptoseinduktion [131] verglichen werden

können, denn apoptotischer Zelluntergang beeinflusst das Immunsystem anders als

nekrotischer Zelltod [132]. Zweitens wurde in dieser Arbeit ein anderes Modell zur

Diskussion

65

Sepsisinduktion gewählt. Maier et al. [133] haben gezeigt, dass das CASP-Modell sehr gut

die klinische Situation einer diffusen Peritonitis mit kontinuierlich ins System flutenden

Darmbakterien abbildet, während die CLP die intra-abdominale Abszess-Formation mit

geringerer systemischer Entzündungsreaktion modelliert [133].

Es gilt festzuhalten, dass nach dieser Arbeit zwar deutlich ist, dass CD4+Foxp3+ Tregs den

von Busse et al. [28] beschriebenen negativen Effekt der CD4+ T-Zellen auf die lokale

Immunantwort und das Überleben in der CASP nicht vermitteln, daraus kann jedoch nicht

zwangsläufig geschlussfolgert werden, dass die in sich heterogene Population der

regulatorischen T-Zellen in ihrer Gesamtheit keine Rolle in der Sepsis spielt. Auch könnten

die anti-CD4 Antikörper weitere Zelltypen beeinflusst haben. So sind in der Literatur auch

CD4-exprimierende -T-Zellen oder NKT-Zellen mit suppressorischem Potential

beschrieben, deren Rolle in der Sepsis bisher nicht aufgeklärt ist [92]. Auch Nebeneffekte

einer Depletion von myeloiden dendritischen Zellen, welche teilweise ebenfalls CD4 auf der

Oberfläche tragen [134], kann bei Busse et al. nicht ausgeschlossen werden. Letztendlich

muss in Zukunft auch der Einfluss von peripheren iTregs hinterfragt werden, welche nicht

unmittelbar in der Sepsis durch periphere Konversion entstanden sind, sondern schon vor der

Induktion der diffusen Peritonitis existent waren. Besonders im Darm-assoziierten

lymphatischen Gewebe gibt es viele induzierten Tregs (Tr1-, Th3- Zellen). Diese erhalten

unter anderem die periphere Toleranz gegenüber kommensalen Darmbakterien aufrecht. Da

nicht geklärt ist, ob diese iTregs Foxp3 exprimieren [135-138], ist unklar, ob diese Zellen von

der DT-vermittelte Depletionsstrategie erfasst werden. Somit können nach dieser Arbeit keine

sicheren Aussagen darüber getroffen werden, wie iTregs auf eine systemische Überflutung

mit Darmbakterien im Rahmen einer fäkalen Peritonitis reagieren.

Obwohl durch die Treg-Depletion das Überleben der Sepsis nicht beeinflusst wurde, war doch

über den gesamten Experimentalverlauf auffallend, dass depletierte Tiere eine verstärkte

Krankheitssymptomatik zeigten. Sowohl im prophylaktischen als auch im verzögerten

Depletionsansatz waren schon in den ersten Stunden nach Induktion der diffusen Peritonitis

die Belastungsscores der Treg-depletierten Tiere deutlich höher als in der Kontrollgruppe. Die

offensichtliche Diskrepanz zwischen dem unveränderten Überleben und der verstärkten

Sepsissymptomatik, wirft die Frage nach den Ursachen auf. Eine mögliche Erklärung ist die

Präaktivierung des Immunsystems durch die Treg-Depletion. Wie schon durch Kim et al. in

der Foxp3DTR-Maus beschrieben [37], zeigten sich auch in der hier vorliegenden Arbeit nach

Treg-Ablation deutlich erhöhte Expressionsgrade der Aktivierungsmarker CD69, CTLA-4

Diskussion

66

und ICOS auf den verbleibenden Teff-Zellen. Auch die Zytokinkonzentrationen von TNF,

IL-6 und MCP-1 waren in den Seren dieser depletierten Tiere bereits unter homöostatischen

Bedingungen signifikant erhöht. Dieser Effekt war in DEREG-Mäusen überraschenderweise

schon 24 Stunden nach einmaliger DT-Applikation deutlich und verstärkte sich im

prophylaktischen Treg-Depletionsregime nach zweimaliger DT-Gabe zusätzlich. Zu keinem

Zeitpunkt wurde das Immunsystem in C57Bl/6-Wildtyp-Mäuse durch eine DT-Applikation

per se aktiviert. Die Daten zeigen deshalb, dass Foxp3+ Tregs schon unter nicht-

inflammatorischen Bedingungen aktiv sind und Teff-Zellen supprimieren.

Diese Interpretation wird durch den phänotypischen Vergleich von Tregs und Teff-Zellen im

Basalzustand gestützt. Tregs exprimierten bei nicht-septischen Tieren alle untersuchten

Aktivierungsmarker in höherer Dichte als Foxp3- Teff-Zellen. Tregs scheinen also permanent

aktiv zu sein, vermutlich um die Teff homöostatisch zu supprimieren. Dies erklärt, weshalb

das Immunsystem von Treg-depletierten DEREG-Mäusen zum Zeitpunkt der Sepsisinduktion

bereits präaktiviert war. Es ist zu erwarten, dass der Anstieg der proinflammatorischen

Zytokine und Effektormoleküle der Teff-Zellen bei der Sepsis in diesen Tieren schneller

erfolgen als in nicht-präaktivierten Tieren. Die vor der CASP durch die Treg-Depletion

ausgelöste Enthemmung des Immunsystem könnte somit erklären, warum in diesen Tiere die

Krankheitssymptome in den ersten Stunden der Sepsis verstärkt waren.

Diese Unterschiede im Aktivierungsstatus des Immunsystems ware jedoch 20 h nach CASP

nivelliert. Offenbar wird in der polymikrobiellen Sepsis das gesamte Immunsystems maximal

aktiviert und unterliegt dann keiner Kontrolle mehr durch Foxp3+ Tregs. Auch wenn vieles

dafür spricht, dass die Tregs die Kinetik der Immunantwort in den ersten Stunden der Sepsis

beeinflussen, kann der Gipfel der septischen Hyperinflammation durch Tregs nicht begrenzt

werden.

5.3 Warum haben hochgradig aktivierte Tregs keinen Einfluss auf die

Immunantwort in der Sepsis?

In Infektionsmodellen mit Aspergillus fumigatus [139], Schistosoma mansoni [140] und

anderen exogenen Pathogenen [48, 61, 84] wurde gezeigt, dass murine Tregs die Entwicklung

lokaler Gewebeschäden durch das Immunsystem begrenzen und damit die Überlebenswahr-

scheinlichkeit des Wirts erhöhen.

In dieser Arbeit konnte dagegen zwar eine Aktivierung von endogenen CD4+ Foxp3+ Tregs in

der polymikrobiellen Sepsis gezeigt werden, aber kein Einfluss dieser Zellpopulation auf die

Diskussion

67

Ausprägung oder Effektivität der Immunantwort. Es stellt sich deshalb die Frage, warum

gerade unter den Bedingungen einer massiven systemischen Entzündungsreaktion Tregs,

welche ein Vielzahl von Immunreaktionen dirigieren [57], nicht aktiv in die Modulation der

Pathogenabwehr eingreifen können. Zwei Erklärungsmöglichkeiten bieten sich an, die im

Folgenden diskutiert werden sollen. Einerseits könnten Tregs im Rahmen einer Infektabwehr

aktiv inhibiert werden, um eine effektive Immunreaktion zu gewährleisten. Andererseits ist

auch denkbar, dass Effektorzellen im hochgradig proinflammatorischen Milieu der Sepsis

zeitweise nicht mehr auf die Suppressionsmechanismen der Tregs antworten und für diese

refraktär werden.

In der Literatur finden sich Hinweise für ein komplexes Regulationssystem der

Immunsuppression bei Infektionen, welches Lucy S.K. Walker als „tuned suppression“

bezeichnete [141]. Experimentelle Daten, die dieses Konzept untermauern, wurden

beispielsweise für das GITR-(glucocorticoid-induced TNF-receptor family-related receptor)-

System veröffentlicht [142]. GITR wird konstitutiv auf Tregs exprimiert und findet seinen

passenden Liganden (GITRL) vor allem auf APCs [143]. Jedoch regulieren auch Teff-Zellen

GITR rasch nach Aktivierung hoch [143]. Nach Shevach und Stephans kommt dem GITR-

GITRL-System in der sehr frühen antimikrobiellen Immunreaktion eine entscheidende

Bedeutung zu [142, 143]. Die Ligation von GITR auf Teff-Zellen wirkt nämlich als ko-

stimulatorisches Signal, unterstützt die frühe Aktivierung dieser Zellen, entzieht sie

kurzfristig durch Resistenz der Kontrolle durch Tregs und ist insgesamt günstig für das

Überleben [143]. Die transiente Entkopplung der Effektorfunktionen von der Treg-

vermittelten Suppression ist in dieser Phase der Infektabwehr offenbar für eine effektive

Clearance unerlässlich. Im Verlauf der Immunantwort regulieren Teff-Zellen jedoch die

GITR-Expression rasch wieder auf Basis-Niveau herunter und nur Tregs bleiben stark GITR

positiv [143]. Die durch GITR-GITRL-Interaktion aktivierten und expandierten Tregs können

dann Teff-Zellen erneut supprimieren.

Neben GITR wird auch weiteren Mitgliedern der TNF-Rezeptor-Superfamilie, wie OX-40

[144], 4-1BB [145] und dem TNF-Rezeptor Typ II (TNFRII) [146], eine entscheidende Rolle

bei der Modulation der Treg-vermittelten Suppression zugeschrieben. Der TNFRII

beispielsweise wird beim Menschen vor allem auf CD4+CD25high Tregs exprimiert und bindet

TNF. Bei Mensch und Maus gilt die pathogenetische Bedeutung von TNF im Sepsisverlauf

als umfänglich belegt. Auch in dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die lokale und

systemische Konzentration dieses gemeinhin als proinflammatorisch betrachteten Zytokins in

der CASP rasch ansteigt. Durch Valencia et al. wurde jedoch beobachtet, dass TNF über den

Diskussion

68

TNFRII auch eine stark immunmodulatorische Wirkung hat und als Bindeglied zwischen

innatem und adaptiven Immunsystem in der Lage ist humane CD4+CD25high Tregs direkt zu

supprimieren und ihre FOXP3-Expression zu senken [146].

Auch bei der Maus gibt es Hinweise für eine ähnliche Wirkung von TNF. So wurde durch

Chen et al. in vitro gezeigt, dass TNF durch den TNFRII vermittelt kurzfristig das

suppressorische Potential muriner Tregs aufhebt, bei längerer Exposition jedoch eine

Expansion und deutliche Expressionsteigerung von CD25 und Foxp3 auslöst und so mit

verzögerter Kinetik ihr Inhibitionsvermögen steigert [129].

Diese Publikationen legen nahe, dass im Verlauf einer Immunantwort verschiedene

Mechanismen sicherstellen, dass die initalen Abwehrreaktionen zeitweise von der Kontrolle

durch Tregs entkoppelt werden, so dass die Elimination der invasiven Mikroorganismen

schneller und effektiver ablaufen kann. In der Sepsis könnte dadurch jedoch eine Entgleisung

der Immunantwort in einen septischen Schock mit einem letalen Zytokinsturm begünstigt

werden.

Interessanterweise führen die gleichen Mechanismen, welche die transiente Inhibition der

Tregs und die zeitweise Resistenz der Teff-Zellen vermitteln, wahrscheinlich auch zur

langfristigen Expansion und Aktivitätssteigerung der Tregs. Diese könnte wichtig sein, um

nach einer gewissen Zeit eine durch die verstärkte Inhibition der Tregs vermittelte Rückkehr

zur Immun-Homöostase zu gewährleisten. Dies bedeutet, dass Infektionen neben der

peripheren Konversion und der Apoptoseresistenz das Verhältnis zwischen Tregs und Teffs

eventuell noch durch einen dritten Mechanismus verschieben. Es ist auch denkbar, dass bei

Sepsis (CASP) durch starke proinflammatorische Signale die Hyporesponsivität und Anergie

von Tregs gebrochen wird und diese aktiv proliferieren.

Das Konzept der „tuned suppression“ [141] wird auch durch experimentelle Beobachtungen

gestützt, die zeigen dass Teff-Zellen in vitro durch starke antigen-spezifische Stimulation

zeitweise gegenüber einer Suppression refraktär werden [147]. Im Verlauf der CASP kommt

es durch die den Organismus überschwemmenden und sich rasch teilenden Pathogene schnell

zu hohen Antigenkonzentrationen, welche die Suppressionsresistenz der Teff-Zellen

gegünstigen könnten. Auch TLRs scheinen an diesem komplexen Regulationssystem beteiligt

zu sein. So wurde durch Pasare und Medzhitov beobachtet, dass die Ligation von TLR4 durch

das Lipopolysaccharid (LPS) und die Bindung von unmethylierten CpG DNA-Motiven an

TLR9 auf dendritischen Zellen (DCs) zu einer Aktivierung dieser Zellen und konsekutiv zu

einer Blockierung der suppressiven Effekte von CD4+CD25+ Tregs führt [148].

Diskussion

69

In der Zusammenschau mit den beschriebenen Daten anderer Arbeitsgruppen legen die

Ergebnisse dieser Arbeit die folgende Interpretation nahe: Bei einer polymikrobiellen Sepsis

stellen verschiedene Regulationsmechanismen in der initialen hyperinflammatorischen Phase

sicher, dass Tregs abgeschaltet und/oder Teff refraktär für deren Suppression werden. Die

„tuned suppression“ [141] fördert die effektive Pathogenabwehr. Dieses Modell würde

erklären, weshalb die Entfernung der Tregs bereits 20 h nach CASP die Stärke der

systemischen Entzündung nicht mehr beeinflusste. Die hyperinflammatorische

Abwehrreaktion bei Sepsis läuft wahrscheinlich in dieser Phase ohnehin ohne aktive

Regulation durch Tregs ab.

Dies erlaubt jedoch keine Schlussfolgerung über eine mögliche Funktion der Tregs in

späteren Phasen des Sepsisverlaufs und insbesondere in der Immunparalyse. Diese späte

Phase der Sepsis stand in dieser Arbeit nicht im Zentrum. Modelle von Sekundärinfektionen

nach überstandener Sepsis könnten in Zukunft Aufschluss darüber geben, ob Tregs nach der

Hyperinflammation wieder angeschaltet werden und in ein kompensatorisches

antiinflammatorisches Syndrom (CARS) führen.

Zusammenfassung

70

6 Zusammenfassung

Die seit Jahrzehnten nahezu unverändert hohe Letalität von Patienten mit abdomineller Sepsis

in Folge chirurgischer Nahtinsuffizienz zeigt, dass das komplexe Zusammenspiel der

verschiedenen Immunzellen in der Sepsis nicht ausreichend verstanden ist.

CD4+ Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) beeinflussen zahlreiche Immunreaktionen und

sind unerlässlich für die Aufrechterhaltung einer peripheren Selbsttoleranz und für die

Verhinderung von Autoimmunerkrankungen. Ihre Rolle bei generalisierten bakteriellen

Infektionen wird dagegen kontrovers diskutiert. Arbeiten aus unserem Labor deuteten auf eine

Beteiligung dieser Zellpopulation an der Dämpfung der lokalen Immunantwort, die das

Überleben im Mausmodell negativ beeinflusst.

In der hier vorliegenden Arbeit wurde deshalb die DEREG-Mauslinie verwendet, um den

Einfluss einer selektiven Depletion Tregs auf die lokale und systemische Immunreaktion im

murinen Sepsismodell der Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) zu beleuchten. DEREGs

sind transgene Mäuse, die ein Fusionsprotein aus eGFP und dem Diphtherietoxin-Rezeptor

unter der Kontrolle des Foxp3-Lokus exprimieren. Sie sind aktuell das beste verfügbare

Mausmodell zur Untersuchung von Foxp3+ Tregs bei Infektion, denn einerseits leuchten die

Tregs grün und lassen sich deshalb leicht identifizieren, andererseits können sie mit

Diphtherietoxin selektiv depletiert werden. Die dafür notwendige Dosis ist für die Tiere nicht

toxisch. Zur Charakterisierung des Einflusses der Tregs auf die lokale Abwehrreaktion im

Peritoneum und die systemische Hyperinflammation bei CASP wurden Überlebenskinetiken

sowie bakteriologische, durchflusszytometrische und immunfluoreszenzmikroskopische

Analysen durchgeführt

Die Sepsis führte innerhalb von 20 h zu einer systemischen Aktivierung Tregs erkennbar an

einer Steigerung der Expression verschiedener Oberflächenmoleküle. Auch das Verhältnis

zwischen Tregs und Effektor-T-Zellen (Teff) wurde durch die systemische Infektion stark

zugunsten der Tregs verschoben. In nicht septischen Tieren ließ sich klar zeigen , dass Treg-

Depletion zu einer Aktivierung des Immunsystems führte. Tregs tragen also im Basalzustand

zu einer stetigen Dämpfung des Immunsystems bei. In der Sepsis ließ sich dagegen kein

immunmodulatorischer Effekt der Tregs beobachten. Weder die Migration von innaten

Immunzellen zum Infektionsfokus im Peritoneum, noch die systemische Streuung der

Bakterien, noch die heftige systemische Inflammationsreaktion wurden durch die Treg-

Zusammenfassung

71

Depletion beeinflusst. Folglich war auch das Überleben Treg-depletierter Mäuse nicht

verändert.

Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen damit das Konzept der „tuned suppression“: starke

inflammatorische Reize und hohe Antigenkonzentrationen, wie sie in der Sepsis beobachtet

werden, führen zu einem transienten Verlust der suppressorischen Eigenschaften von Tregs

und ermöglichen eine effektive anti-bakterialle Abwehr in der akuten Infektion.

Literaturverzeichnis

72

7 Literaturverzeichnis

1. Slade E, Tamber PS, Vincent JL. 2003. The Surviving Sepsis Campaign: raising awareness to

reduce mortality. Crit Care 7: 1-2

2. Rubulotta FM, Ramsay G, Parker MM, et al. 2008. An international survey: Public awareness

and perception of sepsis*. Crit Care Med

3. Reinhart K, Brunkhorst F, Bone H, et al. 2006. [Diagnosis and therapy of sepsis. Guidelines of

the German Sepsis Society Inc. and the German Interdisciplinary Society for Intensive and

Emergency Medicine]. Internist (Berl) 47: 356, 8-60, 62-8, passim

4. Bone RC, Balk RA, Cerra FB, et al. 1992. Definitions for sepsis and organ failure and

guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus

Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care

Medicine. Chest 101: 1644-55

5. Levy MM, Fink MP, Marshall JC, et al. 2003. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS

International Sepsis Definitions Conference. Crit Care Med 31: 1250-6

6. Vincent JL. 2008. Clinical sepsis and septic shock--definition, diagnosis and management

principles. Langenbecks Arch Surg 393: 817-24

7. Nguyen HB, Smith D. 2007. Sepsis in the 21st century: recent definitions and therapeutic

advances. Am J Emerg Med 25: 564-71

8. Moerer O, Quintel M. 2009. [Sepsis in adult patients - definitions, epidemiology and

economic aspects.]. Internist (Berl)

9. Lever A, Mackenzie I. 2007. Sepsis: definition, epidemiology, and diagnosis. Bmj 335: 879-

83

10. Vincent JL, Sakr Y, Sprung CL, et al. 2006. Sepsis in European intensive care units: results of

the SOAP study. Crit Care Med 34: 344-53

11. Engel C, Brunkhorst FM, Bone HG, et al. 2007. Epidemiology of sepsis in Germany: results

from a national prospective multicenter study. Intensive Care Med 33: 606-18

12. Bochud PY, Glauser MP, Calandra T. 2001. Antibiotics in sepsis. Intensive Care Med 27

Suppl 1: S33-48

13. Martin GS, Mannino DM, Eaton S, Moss M. 2003. The epidemiology of sepsis in the United

States from 1979 through 2000. N Engl J Med 348: 1546-54

14. Alberti C, Brun-Buisson C, Goodman SV, et al. 2003. Influence of systemic inflammatory

response syndrome and sepsis on outcome of critically ill infected patients. Am J Respir Crit

Care Med 168: 77-84

15. Schmid A, Burchardi H, Clouth J, Schneider H. 2002. Burden of illness imposed by severe

sepsis in Germany. Eur J Health Econ 3: 77-82

16. Edbrooke DL, Hibbert CL, Kingsley JM, et al. 1999. The patient-related costs of care for

sepsis patients in a United Kingdom adult general intensive care unit. Crit Care Med 27:

1760-7

17. Pieracci FM, Barie PS. 2007. Intra-abdominal infections. Curr Opin Crit Care 13: 440-9

18. Maier S, Traeger T, Westerholt A, Heidecke CD. 2005. [Special aspects of abdominal sepsis].

Chirurg 76: 829-36

19. Emmanuel K, Weighardt H, Bartels H, et al. 2005. Current and future concepts of abdominal

sepsis. World J Surg 29: 3-9

20. Thomas L. 1972. Germs. N Engl J Med 287: 553-5

21. Grimminger F, Mayer H, Seeger W. 1997. Gibt es eine gesicherte Immuntherapie bei der

Sepsis? Internist (Berl) 38: 541-52

22. Hotchkiss RS, Coopersmith CM, McDunn JE, Ferguson TA. 2009. The sepsis seesaw: tilting

toward immunosuppression. Nat Med 15: 496-7

23. Hotchkiss RS, Karl IE. 2003. The pathophysiology and treatment of sepsis. N Engl J Med 348:

138-50


73

24. Robertson CM, Coopersmith CM. 2006. The systemic inflammatory response syndrome.

Microbes Infect 8: 1382-9

25. Philippart F, Cavaillon JM, Charles D. 2009. Inflammatory Mediators. In Sepsis and Non-

infectious Systemic Inflammation, ed. JM Cavaillon, C Adrire, pp. 177-204. Weinheim:

WILEY-VCH Verlag GmbH&Co

26. Bone RC, Fisher CJ, Jr., Clemmer TP, et al. 1987. A controlled clinical trial of high-dose

methylprednisolone in the treatment of severe sepsis and septic shock. N Engl J Med 317:

653-8

27. Fisher CJ, Jr., Slotman GJ, Opal SM, et al. 1994. Initial evaluation of human recombinant

interleukin-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome: a randomized, open-

label, placebo-controlled multicenter trial. Crit Care Med 22: 12-21

28. Busse M, Traeger T, Potschke C, et al. 2008. Detrimental role for CD4+ T lymphocytes in

murine diffuse peritonitis due to inhibition of local bacterial elimination. Gut 57: 188-95

29. Adib-Conquy M, Cavaillon JM. 2009. Compensatory anti-inflammatory response syndrome.

Thromb Haemost 101: 36-47

30. Feuerer M, Hill JA, Mathis D, Benoist C. 2009. Foxp3+ regulatory T cells: differentiation,

specification, subphenotypes. Nat Immunol 10: 689-95

31. Maloy KJ, Powrie F. 2001. Regulatory T cells in the control of immune pathology. Nat

Immunol 2: 816-22

32. Gershon RK, Kondo K. 1971. Infectious immunological tolerance. Immunology 21: 903-14

33. Gershon RK, Cohen P, Hencin R, Liebhaber SA. 1972. Suppressor T cells. J Immunol 108:

586-90

34. Sakaguchi S, Ono M, Setoguchi R, et al. 2006. Foxp3+ CD25+ CD4+ natural regulatory T

cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease. Immunol Rev 212: 8-27

35. O'Neill E J, Sundstedt A, Mazza G, et al. 2004. Natural and induced regulatory T cells. Ann N

Y Acad Sci 1029: 180-92

36. Corthay A. 2009. How do regulatory T cells work? Scand J Immunol 70: 326-36

37. Kim JM, Rasmussen JP, Rudensky AY. 2007. Regulatory T cells prevent catastrophic

autoimmunity throughout the lifespan of mice. Nat Immunol 8: 191-7

38. Sharma R, Sung SS, Fu SM, Ju ST. 2009. Regulation of multi-organ inflammation in the

regulatory T cell-deficient scurfy mice. J Biomed Sci 16: 20

39. Lahl K, Loddenkemper C, Drouin C, et al. 2007. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T

cells induces a scurfy-like disease. J Exp Med 204: 57-63

40. Nieves DS, Phipps RP, Pollock SJ, et al. 2004. Dermatologic and immunologic findings in the

immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome. Arch Dermatol

140: 466-72

41. van der Vliet HJ, Nieuwenhuis EE. 2007. IPEX as a result of mutations in FOXP3. Clin Dev

Immunol 2007: 89017

42. Tang Q, Bluestone JA. 2008. The Foxp3+ regulatory T cell: a jack of all trades, master of

regulation. Nat Immunol 9: 239-44

43. Hill JA, Benoist C, Mathis D. 2007. Treg cells: guardians for life. Nat Immunol 8: 124-5

44. Josefowicz SZ, Rudensky A. 2009. Control of regulatory T cell lineage commitment and

maintenance. Immunity 30: 616-25

45. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al. 1995. Immunologic self-tolerance maintained by

activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single

mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol 155: 1151-64

46. Le NT, Chao N. 2007. Regulating regulatory T cells. Bone Marrow Transplant 39: 1-9

47. Annacker O, Pimenta-Araujo R, Burlen-Defranoux O, et al. 2001. CD25+ CD4+ T cells

regulate the expansion of peripheral CD4 T cells through the production of IL-10. J Immunol

166: 3008-18

48. Belkaid Y, Tarbell K. 2009. Regulatory T cells in the control of host-microorganism

interactions (*). Annu Rev Immunol 27: 551-89

49. Zheng Y, Rudensky AY. 2007. Foxp3 in control of the regulatory T cell lineage. Nat Immunol

8: 457-62


74

50. Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. 2003. Foxp3 programs the development and function

of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat Immunol 4: 330-6

51. Khattri R, Cox T, Yasayko SA, Ramsdell F. 2003. An essential role for Scurfin in

CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol 4: 337-42

52. Workman CJ, Szymczak-Workman AL, Collison LW, et al. 2009. The development and

function of regulatory T cells. Cell Mol Life Sci 66: 2603-22

53. Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. 2003. Control of regulatory T cell development by the

transcription factor Foxp3. Science 299: 1057-61

54. Wang J, Ioan-Facsinay A, van der Voort EI, et al. 2007. Transient expression of FOXP3 in

human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur J Immunol 37: 129-38

55. Ziegler SF. 2007. FOXP3: not just for regulatory T cells anymore. Eur J Immunol 37: 21-3

56. Caramalho I, Lopes-Carvalho T, Ostler D, et al. 2003. Regulatory T cells selectively express

toll-like receptors and are activated by lipopolysaccharide. J Exp Med 197: 403-11

57. Liu G, Zhao Y. 2007. Toll-like receptors and immune regulation: their direct and indirect

modulation on regulatory CD4+ CD25+ T cells. Immunology 122: 149-56

58. Vignali DA, Collison LW, Workman CJ. 2008. How regulatory T cells work. Nat Rev

Immunol 8: 523-32

59. Cools N, Ponsaerts P, Van Tendeloo VF, Berneman ZN. 2007. Regulatory T cells and human

disease. Clin Dev Immunol 2007: 89195

60. Sakaguchi S. 2004. Naturally arising CD4+ regulatory t cells for immunologic self-tolerance

and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol 22: 531-62

61. Demengeot J, Zelenay S, Moraes-Fontes MF, et al. 2006. Regulatory T cells in microbial

infection. Springer Semin Immunopathol 28: 41-50

62. Shevach EM. 2006. From vanilla to 28 flavors: multiple varieties of T regulatory cells.

Immunity 25: 195-201

63. Nakamura K, Kitani A, Strober W. 2001. Cell contact-dependent immunosuppression by

CD4(+)CD25(+) regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming growth

factor beta. J Exp Med 194: 629-44

64. Shevach EM. 2009. Mechanisms of foxp3+ T regulatory cell-mediated suppression. Immunity

30: 636-45

65. Sojka DK, Huang YH, Fowell DJ. 2008. Mechanisms of regulatory T-cell suppression - a

diverse arsenal for a moving target. Immunology 124: 13-22

66. Vignali D. 2008. How many mechanisms do regulatory T cells need? Eur J Immunol 38: 908-

11

67. Thornton AM, Shevach EM. 1998. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress

polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production. J Exp Med 188:

287-96

68. Li MO, Sanjabi S, Flavell RA. 2006. Transforming growth factor-beta controls development,

homeostasis, and tolerance of T cells by regulatory T cell-dependent and -independent

mechanisms. Immunity 25: 455-71

69. Collison LW, Workman CJ, Kuo TT, et al. 2007. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to

regulatory T-cell function. Nature 450: 566-9

70. Deaglio S, Dwyer KM, Gao W, et al. 2007. Adenosine generation catalyzed by CD39 and

CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med 204: 1257-65

71. Bopp T, Becker C, Klein M, et al. 2007. Cyclic adenosine monophosphate is a key component

of regulatory T cell-mediated suppression. J Exp Med 204: 1303-10

72. Fallarino F, Grohmann U, Hwang KW, et al. 2003. Modulation of tryptophan catabolism by

regulatory T cells. Nat Immunol 4: 1206-12

73. Beissert S, Schwarz A, Schwarz T. 2006. Regulatory T cells. J Invest Dermatol 126: 15-24

74. Ren X, Ye F, Jiang Z, et al. 2007. Involvement of cellular death in TRAIL/DR5-dependent

suppression induced by CD4(+)CD25(+) regulatory T cells. Cell Death Differ 14: 2076-84

75. Kullberg MC, Jankovic D, Gorelick PL, et al. 2002. Bacteria-triggered CD4(+) T regulatory

cells suppress Helicobacter hepaticus-induced colitis. J Exp Med 196: 505-15

76. Kursar M, Bonhagen K, Fensterle J, et al. 2002. Regulatory CD4+CD25+ T cells restrict

memory CD8+ T cell responses. J Exp Med 196: 1585-92


75

77. Hori S, Carvalho TL, Demengeot J. 2002. CD25+CD4+ regulatory T cells suppress CD4+ T

cell-mediated pulmonary hyperinflammation driven by Pneumocystis carinii in

immunodeficient mice. Eur J Immunol 32: 1282-91

78. Hesse M, Piccirillo CA, Belkaid Y, et al. 2004. The pathogenesis of schistosomiasis is

controlled by cooperating IL-10-producing innate effector and regulatory T cells. J Immunol

172: 3157-66

79. Montagnoli C, Bacci A, Bozza S, et al. 2002. B7/CD28-dependent CD4+CD25+ regulatory T

cells are essential components of the memory-protective immunity to Candida albicans. J

Immunol 169: 6298-308

80. Hisaeda H, Maekawa Y, Iwakawa D, et al. 2004. Escape of malaria parasites from host

immunity requires CD4+ CD25+ regulatory T cells. Nat Med 10: 29-30

81. Long TT, Nakazawa S, Onizuka S, et al. 2003. Influence of CD4+CD25+ T cells on

Plasmodium berghei NK65 infection in BALB/c mice. Int J Parasitol 33: 175-83

82. Taylor MD, LeGoff L, Harris A, et al. 2005. Removal of regulatory T cell activity reverses

hyporesponsiveness and leads to filarial parasite clearance in vivo. J Immunol 174: 4924-33

83. Zelinskyy G, Kraft AR, Schimmer S, et al. 2006. Kinetics of CD8+ effector T cell responses

and induced CD4+ regulatory T cell responses during Friend retrovirus infection. Eur J

Immunol 36: 2658-70

84. Belkaid Y, Rouse BT. 2005. Natural regulatory T cells in infectious disease. Nat Immunol 6:

353-60

85. McGuirk P, McCann C, Mills KH. 2002. Pathogen-specific T regulatory 1 cells induced in the

respiratory tract by a bacterial molecule that stimulates interleukin 10 production by dendritic

cells: a novel strategy for evasion of protective T helper type 1 responses by Bordetella

pertussis. J Exp Med 195: 221-31

86. Poncini CV, Alba Soto CD, Batalla E, et al. 2008. Trypanosoma cruzi induces regulatory

dendritic cells in vitro. Infect Immun 76: 2633-41

87. Ocana-Morgner C, Wong KA, Lega F, et al. 2007. Role of TGF-beta and PGE2 in T cell

responses during Plasmodium yoelii infection. Eur J Immunol 37: 1562-74

88. Suffia IJ, Reckling SK, Piccirillo CA, et al. 2006. Infected site-restricted Foxp3+ natural

regulatory T cells are specific for microbial antigens. J Exp Med 203: 777-88

89. Heuer JG, Zhang T, Zhao J, et al. 2005. Adoptive transfer of in vitro-stimulated CD4+CD25+

regulatory T cells increases bacterial clearance and improves survival in polymicrobial sepsis.

J Immunol 174: 7141-6

90. Scumpia PO, Delano MJ, Kelly KM, et al. 2006. Increased natural CD4+CD25+ regulatory T

cells and their suppressor activity do not contribute to mortality in murine polymicrobial

sepsis. J Immunol 177: 7943-9

91. Wisnoski N, Chung CS, Chen Y, et al. 2007. The contribution of CD4+ CD25+ T-regulatory-

cells to immune suppression in sepsis. Shock 27: 251-7

92. Venet F, Chung CS, Monneret G, et al. 2008. Regulatory T cell populations in sepsis and

trauma. J Leukoc Biol 83: 523-35

93. Mitamura T, Higashiyama S, Taniguchi N, et al. 1995. Diphtheria toxin binds to the epidermal

growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth

factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J Biol Chem

270: 1015-9

94. Bone RC. 1996. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS. Crit Care Med 24: 1125-8

95. Kessel M, Klink F. 1980. Archaebacterial elongation factor is ADP-ribosylated by diphtheria

toxin. Nature 287: 250-1

96. Wing K, Onishi Y, Prieto-Martin P, et al. 2008. CTLA-4 control over Foxp3+ regulatory T

cell function. Science 322: 271-5

97. Peggs KS, Quezada SA, Chambers CA, et al. 2009. Blockade of CTLA-4 on both effector and

regulatory T cell compartments contributes to the antitumor activity of anti-CTLA-4

antibodies. J Exp Med 206: 1717-25

98. Miossec P, Korn T, Kuchroo VK. 2009. Interleukin-17 and type 17 helper T cells. N Engl J

Med 361: 888-98


76

99. Kim CH. 2008. Regulation of FoxP3 regulatory T cells and Th17 cells by retinoids. Clin Dev

Immunol 2008: 416910

100. Beriou G, Costantino CM, Ashley CW, et al. 2009. IL-17-producing human peripheral

regulatory T cells retain suppressive function. Blood 113: 4240-9

101. Elyaman W, Bradshaw EM, Uyttenhove C, et al. 2009. IL-9 induces differentiation of TH17

cells and enhances function of FoxP3+ natural regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A

106: 12885-90

102. Huser N, Tertilt C, Gerauer K, et al. 2005. CCR4-deficient mice show prolonged graft

survival in a chronic cardiac transplant rejection model. Eur J Immunol 35: 128-38

103. Monneret G, Debard AL, Venet F, et al. 2003. Marked elevation of human circulating

CD4+CD25+ regulatory T cells in sepsis-induced immunoparalysis. Crit Care Med 31: 2068-

71

104. Venet F, Pachot A, Debard AL, et al. 2004. Increased percentage of CD4+CD25+ regulatory

T cells during septic shock is due to the decrease of CD4+CD25- lymphocytes. Crit Care Med

32: 2329-31

105. Venet F, Chung CS, Kherouf H, et al. 2009. Increased circulating regulatory T cells

(CD4(+)CD25 (+)CD127 (-)) contribute to lymphocyte anergy in septic shock patients.

Intensive Care Med 35: 678-86

106. Ni Choileain N, MacConmara M, Zang Y, et al. 2006. Enhanced regulatory T cell activity is

an element of the host response to injury. J Immunol 176: 225-36

107. Yan J, Greer JM, Etherington K, et al. 2009. Immune activation in the peripheral blood of

patients with acute ischemic stroke. J Neuroimmunol 206: 112-7

108. Wang J, Huizinga TW, Toes RE. 2009. De novo generation and enhanced suppression of

human CD4+CD25+ regulatory T cells by retinoic acid. J Immunol 183: 4119-26

109. Chen W, Jin W, Hardegen N, et al. 2003. Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells

to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. J Exp

Med 198: 1875-86

110. Peng Y, Laouar Y, Li MO, et al. 2004. TGF-beta regulates in vivo expansion of Foxp3-

expressing CD4+CD25+ regulatory T cells responsible for protection against diabetes. Proc

Natl Acad Sci U S A 101: 4572-7

111. Fontenot JD, Rudensky AY. 2005. A well adapted regulatory contrivance: regulatory T cell

development and the forkhead family transcription factor Foxp3. Nat Immunol 6: 331-7

112. Banz A, Pontoux C, Papiernik M. 2002. Modulation of Fas-dependent apoptosis: a dynamic

process controlling both the persistence and death of CD4 regulatory T cells and effector T

cells. J Immunol 169: 750-7

113. Chen X, Murakami T, Oppenheim JJ, Howard OM. 2004. Differential response of murine

CD4+CD25+ and CD4+CD25- T cells to dexamethasone-induced cell death. Eur J Immunol

34: 859-69

114. Tao R, Hancock WW. 2008. Resistance of Foxp3+ regulatory T cells to Nur77-induced

apoptosis promotes allograft survival. PLoS ONE 3: e2321

115. Selvaraj RK, Geiger TL. 2007. A kinetic and dynamic analysis of Foxp3 induced in T cells by

TGF-beta. J Immunol 178: 7667-77

116. Kessel A, Bamberger E, Masalha M, Toubi E. 2009. The role of T regulatory cells in human

sepsis. J Autoimmun 32: 211-5

117. Bushell A, Wood K. 2007. GITR ligation blocks allograft protection by induced CD25+CD4+

regulatory T cells without enhancing effector T-cell function. Am J Transplant 7: 759-68

118. Fontenot JD, Rasmussen JP, Williams LM, et al. 2005. Regulatory T cell lineage specification

by the forkhead transcription factor foxp3. Immunity 22: 329-41

119. Leithauser F, Meinhardt-Krajina T, Fink K, et al. 2006. Foxp3-expressing CD103+ regulatory

T cells accumulate in dendritic cell aggregates of the colonic mucosa in murine transfer

colitis. Am J Pathol 168: 1898-909

120. Mackay IR, Leskovsek NV, Rose NR. 2008. Cell damage and autoimmunity: a critical

appraisal. J Autoimmun 30: 5-11

121. Belkaid Y. 2008. Role of Foxp3-positive regulatory T cells during infection. Eur J Immunol

38: 918-21


77

122. Pacholczyk R, Kern J. 2008. The T-cell receptor repertoire of regulatory T cells. Immunology

125: 450-8

123. Hsieh CS, Liang Y, Tyznik AJ, et al. 2004. Recognition of the peripheral self by naturally

arising CD25+ CD4+ T cell receptors. Immunity 21: 267-77

124. van Maren WW, Jacobs JF, de Vries IJ, et al. 2008. Toll-like receptor signalling on Tregs: to

suppress or not to suppress? Immunology 124: 445-52

125. Kimura Y, Saito M, Kimata Y, Kohno K. 2007. Transgenic mice expressing a fully nontoxic

diphtheria toxin mutant, not CRM197 mutant, acquire immune tolerance against diphtheria

toxin. J Biochem 142: 105-12

126. Saito M, Iwawaki T, Taya C, et al. 2001. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and

targeted cell ablation in transgenic mice. Nat Biotechnol 19: 746-50

127. Pappenheimer AM, Jr., Harper AA, Moynihan M, Brockes JP. 1982. Diphtheria toxin and

related proteins: effect of route of injection on toxicity and the determination of cytotoxicity

for various cultured cells. J Infect Dis 145: 94-102

128. Uchida T, Pappenheimer AM, Jr., Harper AA. 1973. Diphtheria toxin and related proteins. II.

Kinetic studies on intoxication of HeLa cells by diphtheria toxin and related proteins. J Biol

Chem 248: 3845-50

129. Chen X, Baumel M, Mannel DN, et al. 2007. Interaction of TNF with TNF receptor type 2

promotes expansion and function of mouse CD4+CD25+ T regulatory cells. J Immunol 179:

154-61

130. Couper KN, Blount DG, de Souza JB, et al. 2007. Incomplete depletion and rapid regeneration

of Foxp3+ regulatory T cells following anti-CD25 treatment in malaria-infected mice. J

Immunol 178: 4136-46

131. Weinrauch Y, Zychlinsky A. 1999. The induction of apoptosis by bacterial pathogens. Annu

Rev Microbiol 53: 155-87

132. Peng Y, Martin DA, Kenkel J, et al. 2007. Innate and adaptive immune response to apoptotic

cells. J Autoimmun 29: 303-9

133. Maier S, Traeger T, Entleutner M, et al. 2004. Cecal ligation and puncture versus colon

ascendens stent peritonitis: two distinct animal models for polymicrobial sepsis. Shock 21:

505-11

134. Shortman K, Liu YJ. 2002. Mouse and human dendritic cell subtypes. Nat Rev Immunol 2:

151-61

135. Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. 2009. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells:

more of the same or a division of labor? Immunity 30: 626-35

136. Suvas S, Rouse BT. 2006. Treg control of antimicrobial T cell responses. Curr Opin Immunol

18: 344-8

137. Nicolson KS, Wraith DC. 2006. Natural and induced regulatory T cells: targets for

immunotherapy of autoimmune disease and allergy. Inflamm Allergy Drug Targets 5: 141-8

138. Saurer L, Mueller C. 2009. T cell-mediated immunoregulation in the gastrointestinal tract.

Allergy 64: 505-19

139. Montagnoli C, Fallarino F, Gaziano R, et al. 2006. Immunity and tolerance to Aspergillus

involve functionally distinct regulatory T cells and tryptophan catabolism. J Immunol 176:

1712-23

140. Singh KP, Gerard HC, Hudson AP, et al. 2005. Retroviral Foxp3 gene transfer ameliorates

liver granuloma pathology in Schistosoma mansoni infected mice. Immunology 114: 410-7

141. Walker LS. 2009. Regulatory T cells overturned: the effectors fight back. Immunology 126:

466-74

142. Stephens GL, McHugh RS, Whitters MJ, et al. 2004. Engagement of glucocorticoid-induced

TNFR family-related receptor on effector T cells by its ligand mediates resistance to

suppression by CD4+CD25+ T cells. J Immunol 173: 5008-20

143. Shevach EM, Stephens GL. 2006. The GITR-GITRL interaction: co-stimulation or

contrasuppression of regulatory activity? Nat Rev Immunol 6: 613-8

144. Valzasina B, Guiducci C, Dislich H, et al. 2005. Triggering of OX40 (CD134) on

CD4(+)CD25+ T cells blocks their inhibitory activity: a novel regulatory role for OX40 and

its comparison with GITR. Blood 105: 2845-51


78

145. Choi BK, Bae JS, Choi EM, et al. 2004. 4-1BB-dependent inhibition of immunosuppression

by activated CD4+CD25+ T cells. J Leukoc Biol 75: 785-91

146. Valencia X, Stephens G, Goldbach-Mansky R, et al. 2006. TNF downmodulates the function

of human CD4+CD25hi T-regulatory cells. Blood 108: 253-61

147. George TC, Bilsborough J, Viney JL, Norment AM. 2003. High antigen dose and activated

dendritic cells enable Th cells to escape regulatory T cell-mediated suppression in vitro. Eur J

Immunol 33: 502-11

148. Pasare C, Medzhitov R. 2003. Toll pathway-dependent blockade of CD4+CD25+ T cell-

mediated suppression by dendritic cells. Science 299: 1033-6

Anhang

79

8 Anhang:

Abbildung 19: CASP im verzögerten Depletionsansatz führte zur tendenziell veringerten Serum-

Konzentrationen von IL-9 aber nicht von IL-17

DT-vorbehandelte DEREG- und C57Bl/6- Mäuse als auch PBS-vorbehandelte DEREG-Tiere wurden einer

CASP-Operation unterzogen. 20 h später wurde das Blut gewonnen und die Konzentrationen von IL-9 und IL-17

im Serum bestimmt. CASP führte zu einer signifikanten Abnahme der IL-9-Spiegel, während die Konzentration

von IL-17 im Serum nur tendenziell erniedrigt war.

Dargestellt sind die Mediane jede Gruppe; n = 3-6 Tiere/ Gruppe; *: P < 0,05 **: P < 0,01

Anhang

80

CTLA-4 Expression im verzögerten Depletionsansatz

Abbildung 20: Kryostatschnitte der Milzen von PBS-vorbehandelten DEREGs und verzögert Treg-depletierten

Tieren wurden Zur Beurteilung der CTLA-4-Expression 20 h nach CASP-induzierter Sepsis

immunfluoreszenzmikroskopisch analysiert. Gefärbt wurde mit aCD4-Alexa47 (blau), aFoxp3-Alexa488 und

purified aCTLA-4, der über einen biotinylierten aHamster-Ak und Streptavidin-TRITC (rot) angefärbt wurde.

Weiße Pfeile markieren CTLA-4+Foxp3- Teff-Zellen.

DEREG-PBS-CASP DEREG-DT-CASP

Anhang

81

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Biphasischer Verlauf der systemischen Immunantwort in der Sepsis. Adaptiert nach

Hotchkiss et al. [22] und Grimminger et al. [21]. ......................................................................................... 5

Abbildung 2: Mechanismen der Tregs zur Suppression von Effektor-T-Lymphozyten (Teff).

Modifiziert nach Vignali et al. [52, 58, 66] ................................................................................................... 12

Abbildung 3: Vollständige Depletion der CD4+ Foxp3+ regulatorischen T-Zellen nach zweimaliger

i.v. Applikation von Diphtherie-Toxin (DT) ................................................................................................ 38

Abbildung 4: Eine einmalige i.v. Applikation von Diphtherietoxin führt in den ersten 24 h zur

kontinuierlichen Abnahme der Treg-Population ..................................................................................... 39

Abbildung 5: CASP führte zu einer raschen Aktivierung von CD4+Foxp3+ Tregs und zu einem

erhöhten prozentualen Anteil dieser T-Zell-Subpopulation ................................................................ 41

Abbildung 6: Eine prophylaktische Treg-Depletion führte zu einer Verschlimmerung des

Krankheitsverlaufs aber nicht zu einem veränderten Überleben in der CASP .............................. 42

Abbildung 7: Die verzögerte Treg-Depletion führt zu einem erschwerten Symptomverlauf, aber

nicht zu einem veränderten Überleben in der CASP ................................................................................ 43

Abbildung 8: Treg-Depletion hat keinen Einfluss auf die systemische bakterielle Streuung in der

CASP ............................................................................................................................................................................ 45

Abbildung 9: Sowohl Gesamtzahl als auch Zusammensetzung der im Verlauf der CASP ins

Peritoneum wandernden Zellen ist durch die prophylaktische Treg-Depletion

unbeeinflusst .......................................................................................................................................................... 46

Abbildung 10: Die verzögerte Depletion der Tregs hat keinen Einfluss auf das Ausmaß der

bakteriellen Streuung in der CASP ................................................................................................................. 47

Abbildung 11: Kein Einfluss einer verzögerten Treg-Depletion auf die Zellzahl oder

Zusammensetzung des peritonealen Zellinfiltrats in der CASP ........................................................... 48

Abbildung 12: Einfluss der prophylaktischen Treg-Depletion auf die Aktivierung von Effektor-T-

Zellen und die Zytokinkonzentrationen im Serum unter basalen und septischen

Bedingungen ........................................................................................................................................................... 50


zytokinkonzentration .......................................................................................................................................... 51

Abbildung 14: Eine verzögerte Treg-Depletion führt innerhalb von 24 h zur Erhöhung des basalen

Aktivierungsgrades .............................................................................................................................................. 53


zytokinkonzentration im verzögerten Depletionsansatz ...................................................................... 54

Abbildung 16: Gestörte CTLA-4-Expression auf murinen Teff-Zellen nach verzögerter Treg-

Depletion und CASP .............................................................................................................................................. 55

Anhang

82

Abbildung 17: Kein Einfluss einer unmittelbaren Anwesenheit von DT im System auf CTLA-4

Expression auf Teff-Zellen ................................................................................................................................. 57

Abbildung 18: CASP führte zu veringerten Serum-Konzentrationen von IL-9 und IL-17 ..................... 59

Abbildung 19: CASP im verzögerten Depletionsansatz führte zur tendenziell veringerten Serum-

Konzentrationen von IL-9 aber nicht von IL-17 ......................................................................................... 79

Abbildung 20: Kryostatschnitte der Milzen von PBS-vorbehandelten DEREGs und verzögert Treg-

depletierten Tieren wurden Zur Beurteilung der CTLA-4-Expression 20 h nach CASP-

induzierter Sepsis immunfluoreszenzmikroskopisch analysiert. Gefärbt wurde mit aCD4-

Alexa47 (blau), aFoxp3-Alexa488 und purified aCTLA-4, der über einen biotinylierten

aHamster-Ak und Streptavidin-TRITC (rot) angefärbt wurde. Weiße Pfeile markieren CTLA-

4+Foxp3- Teff-Zellen. ............................................................................................................................................ 80

Danksagung

83

Danksagung

Mein großer Dank gilt Frau Prof. Dr. Barbara M. Bröker für die freundliche Bereitstellung

dieses spannenden Forschungsthemas, aber noch mehr für ihre exzellente wissenschaftliche

Betreuung, die stetige Bereitschaft mit mir über die Daten zu diskutieren und nicht zuletzt

dafür, dass sie in mir die Leidenschaft für Forschung erweckte.

Mein herzlicher Dank richtet sich auch insbesondere an Christian Pötschke, ohne den diese

Arbeit so nicht möglich gewesen wäre, der mich in das wissenschaftliche Arbeiten einführte,

niemals müde wurde, meine zahlreichen Fragen zu beantworten und mich stets mit seinem

wissenschaftlichen Sachverstand bei der Interpretation der Ergebnisse unterstütze. Danke,

dass du mir beigebracht hast, dass Wissenschaft viel mehr ist als die bloße „Jagd nach

Signifikanzsternen“!

Ein großes Dankeschön gilt auch Dr. Katharina Cziupka, die neben ihrer Forschung und

Kliniktätigkeit stets die Zeit fand, die CASP-Operationen für mich durchzuführen. Danke für

die tolle Zusammenarbeit.

Ganz herzlich danken möchte ich auch Dodo Grumann, die mir bei den CBA-Analysen half,

mir einen Einblick in die Molekularbiologie und Mikrobiologie gab, mit mir „kleine grüne

Zellen sortierte“ und nicht selten ihre Freizeit opferte, um mit mir über das Manuskript zu

dieser Arbeit zu diskutieren. Ich danke dir, dass du mir geholfen hast den Blick für das

Wesentliche zu schärfen.

Ein großes Dankeschön geht an Oliver Nicolai und Julia van der Linde für stets kritische, aber

immer konstruktive Diskussionen und die viele Stunden, in denen Oli Agar-Platten schütteln

musste oder mit mir über das Manuskript zu dieser Arbeit diskutierte. Es war eine tolle Zeit

mit euch. Danke für den Spaß, den ihr in den Laboralltag brachtet.

Danksagung

84

Mein besonderer Dank gilt natürlich Erika Friebe, die immer mit Rat und Tat zur Seite stand,

auch im Angesicht von hunderten Agar-Platten nicht ihr Lächeln verlor und immer

aufzumuntern wusste, wenn etwas einfach nicht klappen wollte. Ich danke dir Erika, „es war

ein Traum“!

Frau Dr. Birte Holtfreter gilt mein Dank für die Unterstützung in Fragen der statistischen

Auswertung.

Unseren Kooperationspartnern Prof. Dr. Jochen Hühn und Prof. Dr. Tim Sparwasser danke

ich für die hilfreiche Diskussion bei der Gestaltung des Manuskripts und für die freundliche

Bereitstellung der DEREG-Mauslinie, ohne die diese Arbeit nicht möglich geworden wäre.

Und schließlich möchte ich mich von ganzem Herzen bei meiner Familie und meinem Partner

Erik bedanken, die mich stets unterstützt haben, mir Halt gaben und immer Verständnis

hatten, wenn die Freizeit mal knapp wurde.

Ich bin euch ewig dankbar, dass ihr mir auch in dunklen Zeiten ein Licht am Ende des

Tunnels wart.

Anhang

85

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe. Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden. Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.

Datum Unterschrift

Anhang

86

LEBENSLAUF

Matthias Rath

Persönliche Informationen

Familienstand: ledig

Nationalität: deutsch

Geburtstag: 13.02.1986

Geburtsort: Lübz

Ausbildung

Aug. 1992 – Juni 1996 Grundschule Lübz Lübz

Aug. 1996 – Juni 2005 Gymnasium Lübz Lübz

Abschluss: Abitur (Note: 1,0)

seit Okt. 2005 Studium der Humanmedizin an der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Sept. 2007 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

(Note: 1,5)

Nov. 2012 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

(Note: 1,5)

Promotion

Juni 2008 – Mai 2009 Promotionsstipendiat im Gerhard-Domagk-

Nachwuchsförderprogramm der Medizinischen Fakultät der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald zu dem Thema :

„Die Rolle Foxp3-positiver regulatorischer T-Zellen in der

murinen Sepsis“

(Betreuerin: Prof. Dr. med. Barbara M. Bröker)

Anhang

87

Juni 2008 – Juni 2010 Assoziiert im Graduiertenkolleg (GRK 840) der Deutschen

Forschungsgemeinschaft (DFG) „Wechselwirkungen zwischen

Erreger und Wirt bei generalisierten bakteriellen Infektionen“

_______________________ _______________________

Ort und Datum Unterschrift

Documents

Thema: Die Rolle Foxp3-positiver regulatorischer T-Zellen ... · Aqua bidestillata AK Antikörper APC Antigen-präsentierende Zelle bzw. beziehungsweise ... GITR Glukokortikoid-induziertes