Tierärztliche Hochschule Hannover Das Tiermodell des ... · Bei Morbus Parkinson, der im Jahre 1817 zum ersten Mal von einem englischen Chirurgen namens James Parkinson als „Shaky

Tierärztliche Hochschule Hannover

Das Tiermodell des Morbus Parkinson - Verhaltensstudien und

morphologische Evaluation nach Transplantation neuronaler Progenitorzellen

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades der Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Nina Christin Schulze, geb. Halfer

Essen

Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. rer. nat Claudia Grothe,

Institut für Neuroanatomie, Medizinische

Hochschule Hannover

2. Prof. Dr. rer. nat. Manuela Gernert,

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und

Pharmazie, Stiftung Tierärztliche Hochschule

Hannover

1. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Manuela Gernert

Prof. Dr. rer. nat. Claudia Grothe

2. Gutachter: Prof. Dr. Gerd Bicker

Tag der mündlichen Prüfung: 18.04.2013

III

Für Opa Felix und Gerti

Für Mama und Papa

Für Nicolai

Für Philipp

Für mich

IV

Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits in folgenden Arbeiten publiziert:

Topology of intrastriatal dopaminergic grafts determines functional and emotional

outcome in neurotoxin-lesioned rats.

Jungnickel J, Kalve I, Reimers L, Nobre A, Wesemann M, Ratzka A, Halfer N,

Lindemann C, Schwabe K, Töllner K, Gernert M, Grothe C.

Behav Brain Res. 2011 Jan 1;216(1):129-35. Epub 2010 Jul 22.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20655334


V

Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................... VIII

1 EINLEITUNG ...................................................................................................... 1

2 SCHRIFTTUM ..................................................................................................... 3

2.1 Die Parkinsonsche Erkrankung ........................................................................ 3

2.1.1 Epidemiologie und Klinik ....................................................................................................... 3

2.1.2 Ätiologie und Pathophysiologie ............................................................................................. 4

2.1.2.1 Der physiologische Regelkreis der Basalganglien ........................................................ 5

2.1.2.2 Die Pathophysiologie des Regelkreises der Basalganglien bei Morbus Parkinson ...... 9

2.1.3 Therapie .............................................................................................................................. 11

2.1.3.1 Medikamentelle Therapie ........................................................................................... 11

2.1.3.2 Operative Therapie ..................................................................................................... 12

2.1.3.2.1 Tiefe Hirnstimulation .............................................................................................. 12

2.1.3.2.2 Transplantation – regenerativer Ansatz ................................................................. 12

2.2 Das Tiermodell des M. Parkinson .................................................................. 16

2.3 Transfektion als Methode zur genetischen Modifizierung von Säuger-Zellen . 18

2.4 Neurotrophe Faktoren – FGF-2 ..................................................................... 20

2.4.1 Effekte von FGF-2 Isoformen auf dopaminerge Neurone in vitro ........................................ 21

2.4.2 Effekte von FGF-2 Isoformen auf dopaminerge Zellen in vivo ............................................ 22

2.5 Verhaltensstudien im Offenfeld und Elevated Plus-Maze ............................... 23

2.6 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit ............................................................... 24

3 MATERIAL UND METHODEN .......................................................................... 27

3.1 Chemikalien ................................................................................................... 27

3.2 Geräte ........................................................................................................... 28

3.3 Antikörper ...................................................................................................... 28

3.4 Sonstiges ....................................................................................................... 29

VI

3.5 OP-Besteck ................................................................................................... 30

3.6 Puffer und Lösungen ..................................................................................... 30

3.7 Versuchsdesign Transplantationsversuche .................................................... 32

3.8 Präparation der E12 Zellen ............................................................................ 32

3.9 Zellkultur ........................................................................................................ 33

3.10 Transfektion ................................................................................................... 34

3.11 Das unilaterale 6-OHDA Läsions-Modell........................................................ 34

3.12 Transplantation der E12 Zellen ...................................................................... 35

3.13 Perfusion und histologische Aufarbeitung ...................................................... 35

3.14 Verhaltensstudien zur funktionellen Evaluation .............................................. 37

3.14.1 Das Offenfeld .................................................................................................................. 38

3.14.2 Das Elevated Plus-Maze ................................................................................................. 39

3.15 Statistik .......................................................................................................... 40

4 ERGEBNISSE................................................................................................... 43

4.1 Transplantationsversuche .............................................................................. 43

4.1.1 Überleben transfizierte Zellen die Transplantation? ............................................................ 44

4.1.2 Ist eine verstärkte Astrozytose auf die Transplantate zu beobachten? ............................... 44

4.1.3 Sind neuronale Progenitorzellen in den Transplantaten zu finden? .................................... 45

4.1.4 Sind Neurone in den Transplantaten nachzuweisen? ......................................................... 47

4.1.5 Sind TH-positive Neurone nachzuweisen? .......................................................................... 48

4.1.6 Zusammenfassung .............................................................................................................. 49

4.2 Verhaltensstudien .......................................................................................... 60

4.2.1 Das Offenfeld ...................................................................................................................... 60

4.2.2 Das Elevated Plus-Maze ..................................................................................................... 64

VII

5 DISKUSSION .................................................................................................... 71

5.1 Transplantationsversuche .............................................................................. 71

5.1.1 Einfluss der Transfektion ..................................................................................................... 72

5.1.2 Einfluss von FGF-2.............................................................................................................. 75

5.1.3 Astrozytäre Reaktion ........................................................................................................... 77

5.1.4 Nachweisbarkeit des flag-tags – Immunhistochemie........................................................... 78

5.1.5 Ausblick ............................................................................................................................... 79

5.2 Verhaltensstudien .......................................................................................... 80

6 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................... 91

7 SUMMARY ....................................................................................................... 93

8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS .......................................................................... 95

9 TABELLENVERZEICHNIS ............................................................................... 97

10 LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................... 99

VIII

Abkürzungsverzeichnis

® eingetragenes

Warenzeichen

°C Grad Celsius

% Prozent

µl Mikroliter

µm Mikrometer

Abb. Abbildung

A. dest. Aqua destillatum

AP anteror-posterior

ATP Adenosintriphosphat

BDNF Brain Derived Neurotrophic

Factor

BG Basalganglien

BMSC Knochenmark-Stammzellen

BSA Bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CDNF Conserved Dopamine

Neurotrophic Factor

cm Zentimeter

CO2 Kohlendioxid

d Tag

D1 / D2 Dopamin 1/2

DA Dopamin, dopaminerg

Dapi 4`,6 Diamidino-2-phenyindol

DMEM Dulbecco's Modified Eagle

Medium

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

d. h. das heißt

EPM Elevated Plus – Maze

hESC humane embryonale

Stammzellen

et al. et alii (und andere)

etc. et cetera

FCS Fetales Kälberserum

FGF – 2 Fibroblast Growth Factor - 2

g Gramm

GABA Gamma-Aminobuttersäure

GDNF Glial Cell Derived Neurotrophic

Factor

GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein

ggf. gegebenenfalls

Girk2 G-Protein activated invard

rectifier potassium channel

G.p.e./i Globus pallidus externus /

internus

hgr. Hochgradig

HMW high weight isoform

Hrsg. Herausgeber

kDa kilo-Dalton

KGW Körpergewicht

KM Körpermasse

l Liter

LAT lateral

L-Dopa 1-3,4 Dihydroxyphenylalanin

LMW low weight isoform

MAO Monoaminooxidase

max. maximal

MFB mediales Vorderhirnbündel

mg Milligramm

min. Minute

mind. mindestens

mmol Millimol

MPP(+) 1-Methyl 4-Phenylpyridium

MPTP 1-Methyl 4-Phenyl 1,2,3,6-tetra-

Hydropyridium

mRNA messanger ribonucleid acid

MW Mittelwert

IX

n Anzahl

N. c. Nucleus caudatus

n. s. nicht statistisch signifikant

NSC neuronale Stammzellen

NST Nucleus subthalamicus

NTF Neurotropher Faktor

o. ä. oder ähnliches

OF Offenfeld

p Wahrscheinlichkeit

PBS gepufferte physiologische

Kochsalzlösung

P.c. Pars compacta

PET Positron-Emissions-

Tomographie

pH potentia hydrogenii

P.r. Pars reticularis

Pu Putamen

rpm rounds per minute

s Standardabweichung

S. Seite

S. n. Substantia nigra

s. o. siehe oben

TH Tyrosinhydroxylase

THS Tiefe Hirnstimulation

VERT vertikal

z. B. zum Beispiel

ZNS Zentrales Nervensystem

z. T. zum Teil

6-OHDA 6-Hydroxydopamin

X

Einleitung

1

1 Einleitung

Der Morbus Parkinson ist nach der Alzheimer Erkrankung die zweithäufigste

neurodegenerative Erkrankung des Menschen und wird mit der zunehmenden

Alterung der Gesellschaft ein immer wichtigeres Thema werden. Die Erkrankung

geht mit einer progredienten Degeneration der dopaminergen Neurone in der

Substantia nigra Pars compacta einher. Dies führt zu einer Verarmung von Dopamin

im Putamen und es kommt zu Störungen in den Regelkreisen der Basalganglien, die

sich in starken motorischen Beeinträchtigungen ausdrücken. Die Kardinalsymptome

sind Bradykinese, Tremor und Rigor. Daneben treten aufgrund weiterer beteiligter

Gehirnareale und Regelkreise aber auch nicht-motorische Symptome auf, die

somatische wie auch psychische Einschränkungen umfassen. Somit führt die

Erkrankung zu einer deutlichen Minderung der Lebensqualität der Patienten.

Da die bisher vornehmlich angewandten Behandlungen gegen die motorischen

Symptome – medikamentelle Therapie bzw. tiefe Hirnstimulation - zu einem

gewissen Maß limitiert sind und vor allem nicht die Ursache der Erkrankung

bekämpfen, liegt ein Forschungsschwerpunkt auf der Erarbeitung regenerativer

Therapien. Im einzelnen bedeutet dies den Ersatz der im Rahmen der Erkrankung

absterbenden dopaminergen Neurone durch fetale oder aus Stammzellen generierte

Zellen, um die Informationsverarbeitung in den nachgeschalteten Basalganglien

wieder reibungslos zu ermöglichen.

Dieses Konzept ist bereits seit vielen Jahren Gegenstand umfangreicher Studien,

und sowohl im Tiermodell als auch klinisch konnten eine Reinnervation des Striatums

und funktionelle Verbesserungen durch Zelltransplantationen erzielt werden. Jedoch

ist der breite klinische Einsatz durch vielerlei Probleme bis dato nicht möglich:

Ethische Einwände gegen den Gebrauch fetaler Zellen, die limitierte Menge an

geeigneten Spenderzellen, das schlechte Überleben der transplantierten Zellen im

Empfängergewebe, divergierende Ergebnisse bezüglich der klinischen Wirksamkeit

am Menschen und unzureichende Charakterisierung der implantierten Zellen in vivo.

Diese Arbeit beschäftigt sich vornehmlich mit dem Problem der schlechten

Einleitung

2

Überlebensraten der transplantierten Zellen: Unter anderem wird in diesem

Zusammenhang ein Mangel an neurotrophen Faktoren als eine mögliche Ursache

diskutiert. Um diesem zu begegnen, wurden in der Vergangenheit verschiedene

Wachstumsfaktoren untersucht und auf verschiedenen Wegen appliziert, z.B. durch

Vorbehandlung der zu transplantierenden Zellen, intracerebrale Infusionen oder Co-

Transplantationen mit Wachstumsfaktor exprimierenden Zellen. Auf diesen Wegen

konnten bereits bessere Ergebnisse erzielt werden als ohne neurotrophe

Unterstützung, jedoch erscheint es sinnvoll, die zu transplantierenden Zellen selbst

derartig genetisch zu verändern, dass sie ihren eigenen Wachstumsfaktor verstärkt

exprimieren.

In unserem Institut konnte gezeigt werden, dass expandierte neuronale

Progenitorzellen erfolgreich transfiziert werden können, so dass sie einen

neurotrophen Faktor überexprimieren und eine intrastriatale Transplantation in ein

Rattenmodell des Morbus Parkinson überleben und dass dopaminerge Zellen in den

Transplantaten nachzuweisen sind. In der Folge soll diese Arbeit nun dazu beitragen,

das Transplantationsprotokoll v.a. hinsichtlich der Expansions-, Differenzierungs- und

Transfektionsmethodik derart zu optimieren, dass die Effizienz dieses Konzepts

weiter gesteigert werden kann. Es wurden mesencephale neuronale Progenitorzellen

mit FGF-2 transfiziert und in ein Rattenmodell des M. Parkinson transplantiert. In

einer Kurzzeitstudie wurde anschließend die Morphologie und Integration im

Empfängergewebe sowie die vorhandenen Zelltypen untersucht.

Zudem beschäftigt sich diese Arbeit mit dem Symptom Angst, welches bei an M.

Parkinson erkrankten Menschen als eines der bereits erwähnten nicht-motorischen

Symptome in hoher Prävalenz auftritt und die Lebensqualität der Patienten deutlich

beeinflussen kann. Es soll hier untersucht werden, inwieweit Angst-assoziiertes

Verhalten in dem von uns verwendeten Rattenmodell des M. Parkinson gezeigt wird.

In einer anschließenden Arbeit am Institut wurde auf diese Befunde aufbauend der

Effekt der intrastriatalen Transplantation in diesem Kontext untersucht.

Schrifttum

3

2 Schrifttum

2.1 Die Parkinsonsche Erkrankung

2.1.1 Epidemiologie und Klinik

Bei Morbus Parkinson, der im Jahre 1817 zum ersten Mal von einem englischen

Chirurgen namens James Parkinson als „Shaky Palsy“ beschrieben wurde, handelt

es sich um die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung des Menschen, die ca.

1% der über 60jährigen betrifft (SAMII et al., 2004). Auch ein früheres Auftreten der

Erkrankung ist beschrieben, in diesen Fällen spricht man von Early Onset Parkinson

Disease. Dies tritt familiär gehäuft auf und macht ca. 5-10% der Fälle aus (SAMII et

al, 2004). Für die übrigen Fälle der dann so genannten Late Onset Parkinson

Disease kann gesagt werden, dass genetische Faktoren eher eine untergeordnete

Rolle spielen (BERTRAM und TANZI, 2005).

Erste Symptome sind häufig Schmerzen in den Gliedmaßen, Riechstörungen sowie

depressive Verstimmungen, erst im weiteren Verlauf entwickeln sich die

Kardinalsymptome Rigor, Ruhe- bzw. Haltetremor und Bradykinese: Man beobachtet

einen verstärkten Muskeltonus, ein Zittern zumeist in den distalen Gliedmaßen, das

in Ruhe auftritt und in der einmal gestarteten Bewegung nicht mehr festzustellen ist,

sowie eine starke Verlangsamung sämtlicher Bewegungen, die vor allem in einer

zunehmenden Verarmung der Gesichtsmimik und dem damit verbundenen,

krankheitstypischen `Maskengesicht` ihren Ausdruck findet.

Zu den motorischen Symptomen, zu denen auch posturale Instabilität zählt, kommen

diverse nicht-motorische Symptome wie Depression, Demenz, autonome

Dysfunktion, Ermüdung und Schlafstörungen (ZIEMSSEN und REICHMANN, 2007;

TRUONG et al., 2008).

Außerdem stellen Angstzustände ein weiteres Symptom dar, das häufig mit M.

Parkinson in Zusammenhang gesehen wird. Angst tritt oft gleichzeitig mit

Depressionen auf und stellt möglicherweise einen Teil dieser dar (AARSLAND et al.,

1999; CHAUDHURI und SCHAPIRA, 2009).

Bei bis zu 40% der an M. Parkinson erkrankten Personen treten Angstzustände

Schrifttum

4

klinisch in Erscheinung und zeigen sich als Panikstörungen (zumeist in sogenannten

off-Phasen, das heißt, wenn bei auf L-Dopa eingestellten Patienten (s.u.) die

therapeutische Konzentration unterschritten wird), phobische Zustände und

generalisierte Angstzustände (AARSLAND et al., 2009; WALSH und BENNETT,

2001).

2.1.2 Ätiologie und Pathophysiologie

Die Ätiologie des M. Parkinson ist in der Mehrzahl der Fälle unklar (LOTHARIUS und

BRUNDIN, 2002). Für ca. 10% der Fälle kann eine Verbindung zu genetischen

Defekten hergestellt werden, z.B. die autosomal dominante Mutation des α-Synuclein

(PARK 1) in familiärem Parkinson oder die autosomal rezessive Mutation des Parkin

(FEANY und BENDER, 2000; NUSSBAUM und ELLIS, 2003).

Außerdem werden unter anderem Defekte in der Komplex I Aktivität der

Mitochondrien (dem ersten Schritt von vier an der Mitochondrienmembran mittels

derer im Rahmen der Atmungskette ATP (Adenosintriphosphat) gewonnen wird) und

oxidativer Stress für die Pathogenese von M. Parkinson diskutiert (BETARBET,

2002).

Für die Entstehung der typischen Symptome ist eine zunehmende Degeneration der

dopaminergen (DA) Projektionsneurone in der Pars compacta (Pc) der Substantia

nigra (Sn) und die damit einhergehende Verarmung an Dopamin (DA) im dorsalen

Putamen verantwortlich (s.u.). Klinische Symptome sind jedoch erst zu beobachten,

wenn das striatale DA um ca. 80% reduziert ist (FEARNLY und LEES, 1991;

BETARBET, 2002) bzw. 50% der nigralen Neurone zerstört sind (SAMII et al, 2004).

Auf histologischer Ebene ist hier das Absterben der DA Neurone und eosinophile,

intracytoplasmatische, proteinartige Einschlusskörperchen in den überlebenden

dopaminergen Zellen zu beobachten. Diese werden als Lewy-Körperchen bezeichnet

und enthalten als einen Hauptbestandteil das Protein α-Synuclein (SPILLANTINI et.

al., 1997). α-Synuclein ist ein präsynaptisches Protein welches in der

Neurotransmitter-Übermittlung eine Rolle spielt (OLANOW et al., 2004). Das zeitliche

Auftreten von Lewy-Körperchen wird im Zusammenhang mit dem Auftreten nicht-

motorischer Symptome gesehen, da sie bereits festzustellen sind, bevor eine

Schrifttum

5

klinische Diagnose anhand motorischer Symptome gestellt werden kann

(CHAUDHURI und SCHAPIRA, 2009). Das Auftreten der Lewy-Körperchen bei M.

Parkinson wird im Zusammenhang gesehen mit einer Dysfunktion des Ubiquitin-

Proteasom-Systems. Über dieses werden physiologischerweise (fehlerhafte)

Proteine, die zum Abbau bestimmt sind, gekennzeichnet und abgebaut. Bei einem

Defekt dieses Systems, der auch bei familiären Parkinson beobachtet wird, findet

dieser Abbau nicht statt und die fehlerhaften Proteine sammeln sich u.a. als Lewy-

Körperchen in den Neuronen (BURKE, 2004; SAMII et al., 2004).

Generell sind der Verlust von Zellen und das Auftreten von Lewy-Körperchen auch in

anderen Regionen des Nervensystems zu beobachten, eingeschlossen sind hier

cholinerge, serotonerge und noadrenerge Zellen in bestimmten Regionen des

cerebralen Cortex, des olfaktorischen Systems, des basalen Vorderhirns, des

Hirnstamms, des Rückenmarks und des peripheren Nervensystems (OLANOW et al.,

2009). Diese Veränderungen könnten verantwortlich zeichnen für diverse der nicht-

motorischen Symptome des M. Parkinson.

Im Einzelnen kann das Auftreten speziell von Depressionen und Angstzuständen

zum einen eine psychische Reaktion auf die physischen Symptome der Erkrankung

sein, zum anderen aber auch eine Folge gewisser neurochemischer Veränderungen.

Hier wird angenommen, dass Veränderungen im Stoffwechsel von Noradrenalin,

Serotonin, Dopamin und γ-Aminobuttersäure (GABA) im Zusammenhang mit der

Entstehung von Depressionen und Angstzuständen stehen (WALSH und BENNETT,

2001).

Der Zusammenhang zwischen medikamenteller Parkinsontherapie und

Angstzuständen bleibt abzuklären (AARSLAND et al., 1999).

2.1.2.1 Der physiologische Regelkreis der Basalganglien

Bei den Basalganglien (BG) handelt es sich um Kerngebiete, welche im Hirnstamm

gelegen sind und unter anderem für den reibungslosen Ablauf von Bewegungen eine

wichtige Rolle spielen.

Die Initiierung einer Bewegung geht vom Cortex aus und wird an den Hirnstamm und

spinale motorische Neurone weitergeleitet. Die Modulation einer Bewegung erfolgt

Schrifttum

6

auf dem Weg dorthin unter anderem in den Basalganglien. Die Regelkreise der BG

(Abb.1) sind somit mitverantwortlich für die Ablaufsteuerung von Bewegungen, das

heißt, sie lassen willkürliche Bewegungen zu oder inhibieren bzw. beenden diese, so

dass fließende Bewegungsabläufe entstehen können (PURVES et al., 2004).

Zu den BG gehören der Nucleus caudatus (Nc) und das Putamen (Pu), zusammen

als Corpus striatum (oder nur Striatum) bezeichnet, da sie aufgrund ihrer

gemeinsamen Entwicklungsgeschichte streifenartig aussehen. Beide Kerne gehen

aus dem Ganglienhügel hervor und werden während der Entwicklung durch

Projektionsfasern so getrennt, dass nur noch Zellbrücken stehenbleiben, welche sich

als Streifen darstellen. Desweiteren werden der Globus pallidus (Gp) mit seinem

internen (i) und seinem externen (e) Anteil, der Nucleus subthalamicus (NST) und die

Substantia nigra (Sn) mit ihrer Pars reticularis (Pr) und ihrer Pars compacta (Pc) zu

den BG gezählt.

Physiologischerweise werden Informationen aus dem assoziativen, limbischen und

motorischen Cortex über die BG zum Thalamus und von dort wieder zum Cortex

geleitet. Man unterscheidet eine limbische, eine okkulomotorische, zwei assoziative

und eine motorische Schleife (ALEXANDER und CRUTCHER, 1990; ALEXANDER

et al., 1990), wobei ich mich im Folgenden mit der motorischen Schleife befassen

werde.

Der „Eingangskern“ der BG ist das Striatum. Hierhin senden der motorische, der

prämotorische, der supplementärmotorische und der sensomotorische Cortex ihre

Efferenzen, via des Transmitters Glutatmat wird das Striatum exzitatorisch stimuliert.

Die „Ausgangskerne“ der BG sind die Sn Pr und der Gpi. Sie werden über einen

direkten und einen indirekten Weg stimuliert.

Beim direkten Weg projizieren die Neurone des Striatums zu Sn Pr und Gpi. Die

Neurotransmitter γ-Aminobuttersäure (GABA) und Substanz P vermitteln hemmende

Wirkung. Dadurch kommt es zu einer Inhibition des hemmenden Einfluss der

Ausgangskerne auf den Thalamus, dessen Projektionsneurone wiederum den Cortex

aktivieren können. Der indirekte Weg führt vom Striatum aus zum Gpe und weiter

zum NST. Die Projektionen zum Gpe wirken mit GABA und Enkephalin inhibitorisch,

vom Gpe aus inhibieren wiederum GABAerge Projektionen den NST. Der NST

Schrifttum

7

steigert über seine Projektionen zum Gpi und der Sn Pr mittels des

Neurotransmitters Glutamat als einziger exzitatorischer Kern die Aktivität der

Ausgangskerne und damit deren hemmende Wirkung auf den Thalamus und den

Cortex.

Moduliert werden diese beiden Wege nun von der Sn Pc. Deren dopaminerge

Neurone innervieren das Striatum, wo es durch unterschiedliche Rezeptoren

unterschiedliche Wirkungen entfaltet (AIZMANN et al., 2000). Die Stimulierung der

sogenannten D1-Rezeptoren durch Dopamin im Striatum führt zur Exzitation von Gpi

und Sn Pr auf dem direkten Weg. Seine D2-Rezeptoren hingegen werden durch

Dopamin inhibiert, es kommt zu einer Hemmung des Gpe. Damit fördert Dopamin die

Aktivierung des Thalamus und damit des Cortex auf beiden Wegen: Erstens über

eine Reduzierung der Erregbarkeit und zweitens über eine Förderung der Hemmung

der hemmenden Ausgangsneurone Gpi und Sn Pr. Der Thalamus wird nicht

gehemmt und kann somit seine Wirkung auf den Cortex entfalten: Bewegung wird

initiiert.

Schrifttum

8

Abbildung 1: Der physiologische Regelkreis der Basalganglien Transmitter Glutamat, exzitatorisch Transmitter GABA, inhibitorisch Transmitter Dopamin

Substantia nigra Pars compacta

Globus pallidus externus

motorik-

hemmend

D2

Globus pallidus internus /

Substantia nigra Pars reticularis

Nuclues subthalamicus

motorik-

fördernd

D1

Striatum

Cortex motorische

Cortexareale

Thalamus

Schrifttum

9

2.1.2.2 Die Pathophysiologie des Regelkreises der Basalganglien bei

Morbus Parkinson

Im Falle des M. Parkinson kommt es zu Degeneration der dopaminergen Neurone

der Sn Pc. Der Untergang der Zellen tritt zunächst unilateral auf, greift aber im Laufe

der Erkrankung auch auf die zweite Seite über. Dennoch bleibt eine Körperseite bei

Parkinson Patienten immer stärker betroffen als die andere.

Die Degeneration der Neurone führt zu einem Dopaminmangel im Striatum. So wird

die ansonsten doppelte Sicherung der Aktivierung des Thalamus und so des Cortex

verhindert: die mangelnde Aktivierung der D1-Rezeptoren führt zu mangelndem

inhibitorischem Einfluss von Sn Pr und Gpi, wodurch sich deren hemmende Wirkung

voll auf Thalamus und in der Folge den Cortex entfalten kann. Auch D2-Rezeptoren

erfahren keine Stimulation durch Dopamin mehr. Hierdurch wird der indirekte Weg zu

den Ausgangskernen umgekehrt und der NST wird nicht gehemmt. Die Hyperaktivität

des NST führt zu einer verstärkten Hemmung des Thalamus durch die

Ausgangsneurone und setzt die Aktivität des Cortex herab. Flüssige

Bewegungsinitiation ist somit nicht möglich (Abbildung 2).

Schrifttum

10

Abbildung 2: Die Pathophysiologie des Regelkreises der Basalganglien bei M. Parkinson Transmitter Glutamat, exzitatorisch Transmitter GABA, inhibitorisch Transmitter Dopamin, fällt weg Verminderte hemmende Wirkung Verstärkte hemmende Wirkung Verstärkte erregende Wirkung

Substantia nigra

Pars compacta

Globus pallidus externus

motorik-

hemmend

D2

Globus pallidus internus /

Substantia nigra Pars reticularis

Nuclues subthalamicus

motorik-

fördernd

D1

Striatum

Cortex motorische

Cortexareale

Thalamus

Schrifttum

11

2.1.3 Therapie

2.1.3.1 Medikamentelle Therapie

Die medikamentelle Therapie des M. Parkinson erfolgt zumeist unter Einsatz der

Aminosäure L-Dopa (1-3,4 Dihydroxyphenylalanin). Diese kann über einen aktiven

Transporter die Blut-Hirn-Schranke passieren und wird dann von noch intakten

nigrostriatalen dopaminergen (aber auch anderen) Neuronen aufgenommen, und

durch eine Dopa-Decarboxylase in Dopamin umgewandelt. Es wird dadurch der

fehlende Transmitter ersetzt, um somit die Symptome zu unterdrücken. Durch die

Therapie wird das Fortschreiten der Erkrankung allerdings nicht verhindert, auch

wenn OLANOW gewisse Argumente für mögliche neuroprotektive Effekte anführt

(OLANOW, 2009). Zudem lässt die Wirksamkeit des L-Dopa im fortgeschrittenen

Zustand der Erkrankung nach. Desweiteren treten im Laufe der Behandlung zum Teil

starke Nebenwirkungen auf. Hierzu zählen Bewegungsschwankungen, Dyskinesien

wie unfreiwillige plötzliche Bewegungen sowie psychische Probleme (WINKLER et

al., 2002; OLANOW, et al., 2004, DAMIER, 2009).

Aus diesem Grund werden soweit möglich v. a. in frühen Stadien der Erkrankung

andere Dopamin-Agonisten, die die Rezeptoren direkt beeinflussen (also auch ohne

die dopaminergen Neurone des Patienten wirken können), sowie

Monoaminooxidase-B-Inhibitoren angewendet (Monoaminooxidase (MAO):

Membranproteine der äußeren Mitochondrien-Membran, die für den Abbau von

Catecholaminen im zentralen Nervensystem (ZNS) zuständig sind). Als Beispiele

sind hier Bromocriptin, Pergolid, Pramipexol und Ropinirol (WINKLER et al., 2002)

bzw. Selegilin und Rasigilin zu nennen. Für diese Wirkstoffe werden weniger

motorische Nebenwirkungen beschrieben, jedoch treten im Zusammenhang mit

Dopamin-Agonisten neuropsychiatrische Probleme wie Halluzinationen, starke

Schlaflosigkeit und Suchtverhalten auf und die anti-symptomatischen Effekte sind

nicht so effektiv wie die von L-Dopa (HEDLUND und PERLMANN, 2009). Zwar

werden auch für diese Wirkstoffe mögliche neuroprotektive Wirkungen diskutiert,

jedoch erscheint dies in vivo bis dato sehr unsicher (OLANOW, 2009).

Schrifttum

12

2.1.3.2 Operative Therapie

2.1.3.2.1 Tiefe Hirnstimulation

Die tiefe Hirnstimulation (THS) hat sich seit 1987 zu einer routinemäßig

angewendeten Therapie gegen die motorischen Symtome des M. Parkinson etabliert

(Benabid et al., 2009). Waren in früheren Zeiten der Nucleus thalamicus und der Gpi

Zielstrukturen dieses operativen Eingriffs, wird heute zumeist die Hochfrequenz-

Stimulation des NST praktiziert (VOLKMANN, 2007; BENABID et al., 2009). Bei

dieser wird durch Implantation einer Elektrode im Zielgebiet (bilateral) dieses mithilfe

eines internen Pulsgenerators variabel stimuliert, mit hochfrequenten elektrischen

Impulsen von 130 – 185 Hertz (HEDLUND und PERLMANN, 2009). Der abnormale

Anstieg neuronaler Aktivität im NST wird somit durch die THS gehemmt, womit der

Thalamus und seine corticalen Projektionsgebiete nicht mehr übermäßig gehemmt

werden und eine Normalisierung der Bewegungen eintritt.

Die Vorteile dieser Methode sind die unter THS deutlich niedriger dosierbaren

Medikamente und die dadurch reduzierten Nebenwirkungen, insgesamt wurde eine

Steigerung der Lebensqualität um 25% beschrieben (BERNEY, VINGERHOETS et

al., 2002; DEUSCHL, SCHADE-BRITTINGER et al., 2006). Limitierungen stellen

jedoch die eingeschränkte Anwendbarkeit für bestimmte Patientengruppen sowie die

zum Teil unzureichende Wirksamkeit dar: Für Patienten mit Demenz, akuten

Psychosen sowie deutlichen Depressionen eignet sich die THS ebenso wenig wie für

Patienten, die auf die Anwendung von L-Dopa nicht ausreichend ansprechen. Die

motorischen Symptome, die sich mit L-Dopa nicht unterdrücken lassen, werden auch

durch die THS keine Besserung erfahren (VOLKMANN, 2007). Zudem werden

psychische Störungen (SAINT-CYR, TREPANIER et al., 2000) sowie

Persönlichkeitsveränderungen unter dem Einfluss der THS beschrieben (BERNEY,

VINGERHOETS et al., 2002, VOLKMANN, 2007; WITT, DANIELS et al., 2008).

2.1.3.2.2 Transplantation – regenerativer Ansatz

Die Limitierungen der bisher genannten therapeutischen Ansätze haben dazu

geführt, dass intensiv an der Entwicklung regenerativer Therapiemöglichkeiten

Schrifttum

13

gearbeitet wird. Hier stehen Zelltransplantationen in die betroffenen Gehirnregionen

im Fokus. Zellen verschiedener Quellen werden als mögliche Spenderzellen

untersucht: fetale Zellen, genetisch modifizierte Zelllinien, embryonale oder

somatische Stammzellen.

Dopaminerge Neurone, welche aus fetalen Mittelhirn gewonnen werden, wurden im

Tierexperiment (BRUNDIN und BJÖRKLUND, 1987, NIKKHAH et al., 1994 (1,2,3),

WINKLER et al., 2000, TORRES et al., 2007) und in klinischen Studien (LINDVALL

und ODIN, 1994; LINDVALL und HAGELL, 2000; POLGAR et al., 2003) intrastriatal

transplantiert. In der Folge konnte eine Reinnervation des Striatums mit

Verbindungen von und zu den transplantierten Zellen beobachtet werden. Die

transplantierten Zellen gaben gleichmäßig Dopamin ab und führten zu einer

funktionellen Verbesserung.

In klinischen Studien wurde die Verbesserung der klinischen Bilder unterstützt durch

den Nachweis einer gesteigerten Fluorodopa- Aufnahme in PET-Scans (Positron-

Emission-Tomographie). Mit dieser Methode wird anhand der Fluorodopa-Aufnahme

im Striatum auf die Menge an Dopamin geschlossen, da sich Fluorodopa genauso

verhält wie Dopamin. (ANDRES und MEYER, 2008; BROOKS, 2010).

Es muss jedoch festgehalten werden, dass gerade in der Anwendung von fetalen

Spenderzellen eine Reihe von Problemen bis dato nicht gelöst werden konnten, die

die routinemäßige Anwendung ermöglichen würden. So ist zum einen die limitierte

Verfügbarkeit von geeigneten Spenderzellen sowie deren unzureichende

Standardisierung und Reinheit zu nennen, was sich folglich auch in sehr

unterschiedlichen Erfolgen widerspiegelt (BJÖRKLUND, 2000). Ebenso stellen die

mit der Transplantation von abortiertem fetalen Material verbundenen ethischen

Einwände ein gewichtiges Problem bei der Weiterentwicklung dieser Methodik dar.

Desweiteren wurden in klinischen Doppel-Blind-Studien schwere Nebenwirkungen in

Form von Dyskinesien beobachtet (FREED et al., 2001; HAGELL et al., 2002),

wodurch vorherige Erfolge relativiert wurden. Folglich liegt der Fokus unter anderem

auf der Entwicklung alternativer Zellquellen wie immortalisierte neuronale Zelllinien,

embryonale und neuronale Stammzellen und genetisch modifizierte Zellen

(GOLDMANN und WINDREM, 2006).

Schrifttum

14

2.1.3.2.2.1 Zellquellen für die Transplantationstherapie

Zellen, die für die Anwendung in der Transplantationstherapie in Betracht gezogen

werden, sollten idealerweise folgende Eigenschaften aufweisen: Sie sollten die

Transplantation in ausreichender Zahl überleben (LINDVALL und BJÖRKLUND,

2004), die Fähigkeit besitzen, Dopamin zu synthetisieren und in geregelter Art und

Weise zu sezernieren, Axone zur Reinnervation auszubilden, Girk2 auszuprägen (G-

Protein activated inward rectifier potassium channel-2, typisch vor allem für die

dopaminergen Neurone der Sn Pc, s.u.) und motorische Defizite zu beheben

(CORREIA et al., 2005).

Stammzellen sind undifferenzierte Zellen, die in der Lage sind zu proliferieren, sich

zu reproduzieren und Progenitorzellen zu generieren, die wiederum in

verschiedenste Zelltypen differenziert werden können. Im Detail untersucht werden

embryonale Stammzellen (ESC), neuronale Stammzellen (NSC), Stammzellen aus

adultem Knochenmark (BMSC), sowie Stammzellen aus Nabelschnurblut (MEYER

und ANDRES; 2008). Auch Zellen aus der subventrikulären Zone Erwachsener

werden auf ihre Eignung hin untersucht (CORREIA et al., 2005).

Humane ESC (hESC), die aus der inneren Masse von Blastozysten gewonnen

werden (5-6 Tage nach Befruchtung), sind pluripotent. Sie lassen sich in großer

Menge expandieren und gerichtet in jeden gewünschten Zelltyp differenzieren und

werden deshalb als vielversprechende Möglichkeit in der Transplantationsforschung

angesehen.

NSC (auch neuronale Progenitorzellen genannt) werden in bestimmten Regionen

des sich entwickelnden aber auch des adulten zentralen Nervensystems gefunden,

wie z.B. in der subventrikulären Zone, im Hippocampus, Cortex und Rückenmark.

Unter bestimmten Konditionen und unter dem Einfluss bestimmter

Wachstumsfaktoren entwickeln sich diese multipotenten Zellen gerichtet in die

verschiedenen neuronalen und glialen Zelltypen.

Sowohl Stammzellen als auch Progenitorzellen wurden vielfach im Tiermodell

transplantiert und führten zu positiven Ergebnissen (BJÖRKLUND et al., 2002,

ANDRES und MEYER, 2008; HAHN et al., 2009). Die Nachteile von embryonalen

Stammzellen sind jedoch unter anderem die Gefahr der Tumor- bzw.

Schrifttum

15

Teratombildung. In Kulturen wurden Chomosomenabberationen beobachtet

(DRAPER et al., 2004, LI et al. 2008), auch in vivo wurden Neoplasien nachgewiesen

(NISHIMURA et al., 2003). Desweiteren stellen immunologische Unterschiede

zwischen Spender und Empfänger sowie ethische Aspekte eine Limitierung für den

ungehinderten Einsatz embryonaler Stammzellen in der regenerativen Parkinson

Therapie dar (TIMMER et al., 2006). Progenitorzellen weisen diese Nachteile nicht

auf. Zudem sind sie gut expandierbar (STUDER et al., 1998) sowie erfolgreich

genetisch zu verändern (CESNULEVICIUS et al., 2006).

Immortalisierte Linien neuronaler Progenitorzellen stellen eine weitere mögliche

Zellquelle für Transplantationen dar. Theoretisch ist hier das Problem des

Zellnachschubs gelöst, auch lassen sich diese Zellen anhand von Reporter-Genen

im Zielgewebe gut identifizieren. Solche Zelllinien wurden bereits in Tierversuchen

untersucht und teilweise konnte eine Differenzierung der Zellen in vivo nachgewiesen

werden. Jedoch bleiben auch bei diesem Ansatz Probleme bestehen, vor allem

hinsichtlich der Entstehung von Neoplasien (MEYER und ANDRES; 2008)

2.1.3.2.2.2 Limitierungen der bisherigen Ansätze

Es wurden bereits einige ungelöste Probleme angesprochen, namentlich ethische

Einwände bei der Verwendung fetaler und embryonaler Stammzellen, unzureichende

Standardisierung des nur limitiert vorhandenen zu transplantierenden fetalen

Materials sowie die Gefahr von tumorösen Entartungen bei der Verwendung

pluripotenter embryonaler Stammzellen.

Im Folgenden wird auf diese und einige weitere Aspekte im Detail eingegangen.

Zunächst sind die schlechten Überlebensraten und die mangelnde funktionelle

Integration transplantierter Zellen in vivo zu nennen: 1-5% der transplantierten

fetalen Zellen überleben die Transplantation (FREEMAN et al., 1995; ROSENSTEIN,

1995, BARKER et al., 1996; WINKLER et al., 1999, SORTWELL et al., 2000). Es

wird jedoch geschätzt, dass mindestens 100.000 Zellen überleben müssen um eine

funktionelle Erholung zu induzieren (CORREIA et al., 2005), so dass ein Drittel bis zu

der Hälfte des Putamenvolumens reinnerviert ist und eine Fluorodopa-Aufnahme von

ca. 50% erfolgt (LINDVALL und BJÖRKLUND, 2004). Die Verbesserung der

Schrifttum

16

motorischen Funktion steht in Korrelation mit dem Maß der Reinnervation des

Striatums. NIKKHAH et al. stellten 1994 bezüglich des Maßes der Reinnervation des

Striatums heraus, dass multiple Injektionsstellen die axonale Integration der

denervierten Gegend verbessern können (NIKKHAH et al., 1994(1)).

Als mögliche Ursache der geringen Überlebensraten wird unter anderem ein Mangel

an neurotrophen Faktoren diskutiert, weshalb die Einbindung diverser neurotropher

Faktoren in Transplantationsversuchen vielfach untersucht wird. Hier spielen vor

allem die Wachstumsfaktoren Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), Glial Cell

Derived Neurotrophic Factor (GDNF), Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) und

Conserved Dopamine Neurotrophic Factor (CDNF) eine Rolle (s.u.).

Desweiteren sind bis dato mangelnde Kenntnisse über Faktoren, die die Migration,

das Wachstum und die Differenzierung der transplantierten Zellen beeinflussen als

unzureichend gelöste Probleme zu nennen. Hierzu ist es wichtig, die transplantierten

Zellen in vivo eindeutig identifizieren zu können (SØRENSEN et al., 2010).

Als weitere Punkte, deren Einfluss auf die Ergebnisse von Transplantationen vor

allem in klinischen Studien noch nicht ausreichend geklärt sind, sind die Auswahl der

Patienten, die exakte Transplantat-Platzierung sowie – Zusammensetzung und

immunologische Reaktion des Empfängers auf die Spenderzellen (LINDVALL und

BJÖRKLUND, 2004).

2.2 Das Tiermodell des M. Parkinson

Für M. Parkinson sind diverse Tiermodelle etabliert, die sich in ihren Qualitäten und

Anwendungsgebieten unterscheiden.

Als erstes wurden vornehmlich Stoffe angewendet, die im Tiermodell selektiv das

catecholaminerge System angreifen und somit Charakteristika des M. Parkinson

hervorrufen. Hier sind z.B. Reserpin, Metamphetamin und auch MPTP (1-methyl 4-

Phenyl 1,2,3,6-tetrahydropyridin) zu nennen. Letzteres wird, nachdem es von nicht-

dopaminergen Zellen in seinen toxischen Metaboliten MPP(+) (1-Methyl-4-

Phenylpyridium) umgewandelt worden ist, von dopaminergen Neuronen per

Dopamin-Transporter aufgenommen, zerstört die nigrostriatalen Bahnen und führt

vor allem bei Primaten zu motorischen Defiziten wie Bradykinese, Rigidität und

Haltungsanomalien (PRZEDBORSKI et al., 2001). Diese Symptome sind denen des

Schrifttum

17

an M. Parkinson erkrankten Menschen so ähnlich, dass dieses Modell für die

Entwicklung neuer symptomatischer Behandlungsstrategien herangezogen werden

kann.

Neuere Entwicklungen sind Modelle mit landwirtschaftlichen Chemikalien wie

Paraquat und Rotenon. Rotenon inhibiert systemisch den Komplex I der

Mitochondrien, führt aber dennoch zu einer selektiven Zerstörung der nigrostriatalen

Bahnen, einschließlich der Bildung Lewy-Körperchen-ähnlicher Einschlüsse sowie

oxidativer Schäden (BETARBET et al, 2002). Zukünftig werden auch genetische

Modelle weiter in den Vordergrund rücken. Sie orientieren sich an bei familiärem

Parkinson auftretenden Mutationen. Hier sind z.B. transgene Mauslinien zu nennen,

die humanes α-Synuclein überexprimieren bzw. wo dieses in sogenannten Knock-out

Linien gar nicht exprimiert wird (Betarbet et al. 2001). Diese Modelle zeigen

unterschiedliche Ausprägungen verschiedener Parkinson-Symptome und werden

daher auch jeweils für spezielle Fragestellungen eingesetzt.

Bei dem in dieser Arbeit eingesetzten 6-OHDA Modell der Ratte kommt es zur

permanenten, selektiven Degeneration der dopaminergen Zellen der nigrostriatalen

Bahnen durch 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) (UNGERSTEDT, 1968). 6-OHDA wird in

einer stereotaktischen Operation in das Rattengehirn injiziert, da es nicht in der Lage

ist, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren. Die Injektion kann in das Striatum erfolgen,

das mediale Vorderhirnbündel (MFB) oder auch in die Sn. Es kann somit eine

partielle oder eine komplette Läsion erfolgen. In der vorliegenden Arbeit wurde das

Toxin in das MFB injiziert. Das 6-OHDA zerstört die dopaminergen Projektionen

durch retrograden axonalen Transport (HUDSON et al., 1993). Die Zellen nehmen es

via der eigenen Catecholamin-Transportmechanismen in sich auf. Durch die dort

stattfindende Oxidation entstehen freie Radikale und Wasserstoffperoxid, welche

Proteine, Membranen und Nucleinsäuren angreifen (FULCERI et al., 2006). Zumeist

werden die Tiere in diesem Modell nur unilateral lädiert, weil es sonst zu zu

schweren motorischen Schäden kommt (UNGERSTEDT, 1971). Zudem dient die

gesunde Seite als interne Kontrolle.

Zur Überprüfung des Modells kommen u. a. zwei sogenannte Rotationstests in

Frage: Zum einen wird Amphetamin systemisch angewendet: als präsynaptischer,

Schrifttum

18

also indirekter Dopamin-Agonist kann es bei einem unilateral lädierten Tier nur auf

der gesunden Seite wirken: die Dopaminausschüttung der gesunden Seite wird

gesteigert, zusätzlich wird die Wiederaufnahme des Dopamins gehemmt. Das

gesteigerte Dopaminaufkommen am postsynaptischen Rezeptor führt somit zu einer

Rotation des Tieres ipsilateral zur Läsion. 6.-20 Umdrehungen pro Minute können für

zwei Stunden nach der Injektion beobachtet werden (TORRES und DUNNETT,

2006).

Im Gegensatz dazu kommt es nach der systemischen Applikation von Apomorphin

zu Rotationsverhalten contralateral zu lädierten Seite. Die Dopamin-Rezeptoren (D1

und D2, s.u.) werden hier durch den Dopamin-Agonisten direkt stimuliert. Durch die

Degeneration der dopaminergen Zellen kommt es zu einer Hypersensitivität der

postsynaptischen Rezeptoren auf der denervierten Seite und im Falle einer

Stimulierung durch Apomorphin zu einer Rotation contralateral zur lädierten Seite, da

das Apomorphin hier aufgrund der empfindlicheren Rezeptoren stärker wirken kann

als auf der gesunden Seite (SCHWARTING und HUSTON, 1996). Bereits geringe

Dosen Apomorphin reichen aus, um bei maximal lädiertem Striatum und Sn

Rotationen auszulösen. Damit ist Apomorphin besser geeignet, um maximale

Degenerationen sicher anzuzeigen (HUDSON et al., 1993).

2.3 Transfektion als Methode zur genetischen Modifizierung von Säuger-

Zellen

Als Transfektion bezeichnet man das Einschleusen fremder Nucleinsäuren in das

Genom der Empfängerzelle. Sie hat zum Ziel, die Empfängerzelle genetisch zu

modifizieren, zum Beispiel die Überexpression eines Wachstumsfaktors zu bewirken.

Prinzipiell sind zwei methodische Ansätze zu unterscheiden, due virale und die nicht-

virale Transfektion. Bei der viralen Transfektion werden aus Viren gewonnene

Vektoren in die Empfängerzelle eingeschleust. Diese Methode bietet den Vorteil

hoher Transfektionsraten, ist aber aufgrund verschiedener Limitierungen nicht gut

geeignet für den Einsatz in klinischen Studien: Die Produktion der Vektoren ist sehr

aufwendig und teuer, die Sicherheitsanforderungen sehr hoch. Zudem ist die Größe

der einzuschleusenden Partikel begrenzt und es besteht die Gefahr immunologischer

Schrifttum

19

Reaktionen (GRESCH et al., 2004).

Bei den nicht-viralen unterscheidet man nach physikalischen und chemischen

Methoden. Erstere umfassen

1.Elektroporation (WELLS et al., 2004),

2.ballistischer Gentransfer (WELLS et al.,2004),

3.Mikroinjektion (DAVIS et al., 2000).

Bei der Elektroporation wir die Zellmembran (sowohl von prokaryotischen als auch

von eukaryotischen Zellen) mittels eines elektrischen Impulses kurzfristig permeabel

für die Aufnahme verschiedener biologischer Moleküle gemacht, so auch für DNA

(GRESCH et al., 2004). Diese Methoden führte aufgrund niedriger

Transfektionsraten und hoher Zellverluste jedoch nicht zu ausreichend

zufriedenstellenden Ergebnissen (GRESCH et al., 2004).

Die chemischen Methoden umfassen

1.Liposom-basierten Gentransfer oder Lipofektion ( FELGNER et al., 1987; WU et

al., 2000),

2.Calciumphosphat-mediierten Gentransfer (CHEN und OKAYAMA, 1988),

3.DEAE-dextran Transfektionstechnik (PARI und XU, 2004),

4.Polyethyleneeimine (PEI)-mediierten Gentransfer (CORSO et al., 2005),

5.Nukleofektion (GRESCH et al., 2004; CESNULEVICIUS et al., 2006).

Bei der Lipofektion binden kationische Liposome, die einen Komplex mit der

einzuschleusenden DNA bilden, an die zu transfizierenden Zellen. Ihre

Lipidmembran fusioniert mit der Plasmamembran der Zelle und schleust so die DNA

in die Zelle ein. Nachteile dieser Methode sind die recht geringen Transfektionsraten

in Zellsuspensionen und die Abhängigkeit von Zellteilung und hoher Endozytoserate

(GRESCH et al., 2004). Für die Transfektion von neuronalen Progenitorzellen wurde

von CESNULEVICIUS et al. 2006 eine neue, nicht-virale Methode erarbeitet. Die

Nukleofektion erwies sich hier im Vergleich mit Lipofektion und Elektroporation als

effizienteste Art und Weise, eine Überexpression neurotropher Wachstumsfaktoren

zu erreichen (CESNULEVICIUS et al., 2006). Bei der Nukleofektion handelt es sich

um eine auf der Elektroporation basierenden Methode, bei der das Plasmid mittels

einer speziellen Nukleofektor-Lösung und unter bestimmten Spannungsparametern

Schrifttum

20

direkt in den Zellkern eingeschleust wird. Hiermit wird es möglich, auch aufgrund

ihrer niedrigen Teilungsrate sonst schwer zu transfizierende Zellen effizient genetisch

zu modifizieren (5-fache Steigerung der Transfektionseffizienz im Vergleich mit

Elektroporation und Lipofektion, bis zu 47% Transfektionsrate). Zudem wird durch

diese Methode die Fähigkeit zur Differenzierung in dopaminerge Zellen nicht

beeinflußt und die Transfektion ist transient (CESNULEVICIUS et al., 2006).

In einem ersten Versuch wurden derartig genetisch modifizierte Zellen in ein 6-

OHDA-Modell des M. Parkinson transplantiert. Die Zellen überlebten die

Transplantation, prägten den Marker Tyrosinhydroxylase (TH) für dopaminerge

Zellen aus und exprimierten das auf dem Plasmid kodierte Protein. Jedoch war die

Anzahl der die Transplantation überlebenden Zellen sehr gering und auch die

Reinnervation war nicht sehr deutlich ausgeprägt (CESNULEVICIUS et al., 2006).

2.4 Neurotrophe Faktoren – FGF-2

Wie bereits oben genannt könnte einer der Gründe für das geringe Überleben

transplantierter Zellen ein Mangel an neurotrophen Faktoren (NTF) sein.

Es konnten für diverse NTF positive Effekte auf kultivierte dopaminerge Neurone in

vitro gezeigt werden (KRIEGLSTEIN, 2004), v. a. vier Faktoren wurden im Hinblick

auf ihre physiologische und funktionelle Relevanz in vivo untersucht: BDNF, GDNF,

FGF-2 (BEAN et al., 1992; GROTHE und WEWETZER, 1996; GROTHE und

TIMMER; 2007) und CDNF (LINDHOLM et al., 2007).

Bei den FGFs handelt es sich um eine Familie von Wachstumsfaktoren mit 23

Mitgliedern, von denen 10 im Gehirn nachgewiesen werden konnten. (REUSS und v.

BOHLEN UND HALBACH, 2003). Es sind vier Rezeptoren bekannt, FGR 1-4.

FGFs spielen wichtige Rollen sowohl im sich entwickelnden als auch im adulten ZNS

(DONO, 2003). Für diese Arbeit von besonderem Interesse ist FGF-2. FGF-2 findet

sich natürlicherweise in Neuronen und Glia-Zellen in vielen Bereichen des ZNS,

unter anderem in Medulla, Pons, Thalamus und Hirnstamm, aber auch in der Sn und

im Striatum (REUSS und v. BOHLEN UND HALBACH, 2003).

Als Regulator pränataler ebenso wie postnataler und adulter Neurogenese induziert

FGF-2 die Proliferation neuronaler Progenitorzellen im Hippocampus und der

Schrifttum

21

subventrikulären Zone (REUSS und v. BOHLEN UND HALBACH, 2003). Es ist

desweiteren während der Entwicklung des nigrostriatalen Systems wirksam (BEAN

et al., 1992) und hat einen Einfluss auf die Anzahl dopaminerger Neurone (TIMMER

et al., 2007). Für Hippocampus und Cortex konnte gezeigt werden, dass FGF-2 die

axonale Verzweigung von Neuronen begünstigt (REUSS und v. BOHLEN UND

HALBACH, 2003).

Bei FGF-2 lassen sich sogenannte hoch-und niedermolekulare Isoformen (high und

low weight isoforms, HMW und LMW), also Isoformen mit 18kDa bzw. 21 und 23 kDa

Molekulargewicht unterscheiden. Sie alle werden generiert von verschiedenen

Regionen einer mRNA und werden sowohl im Striatum als auch in der Sn adulter

Ratten exprimiert (GROTHE und TIMMER, 2007). Claus et al. konnten zudem

zeigen, dass im Verhältnis eher HMW-FGF-2 im Striatum und in der Sn von intakten

Ratten auftritt, LMW-FGF-2 dort ebenso, jedoch in geringerem Umfang

nachzuweisen ist. Die Rezeptoren für FGF-2 (FGFR 1-3) sind ebenso in den

genannten Strukturen vorhanden und lassen sich auch nach einer Läsion mit 6-

OHDA noch nachweisen (CLAUS et al., 2004).

2.4.1 Effekte von FGF-2 Isoformen auf dopaminerge Neurone in vitro

Untersucht man die Effekte von FGF-2 auf dopaminerge Zellen in vitro, können unter

anderem folgende Beobachtungen gemacht werden: HMW und LMW FGF-2 fördern

die Proliferation und das Überleben von Kulturen mesencephaler dopaminerger

Neurone und begünstigen das Auswachsen von Neuriten. So zeigen sich nach 6

Tagen in Kultur signifikant mehr TH-positive Zellen in mit verschiedenen Isoformen

von FGF-2 versetzten Kulturen als in der Kontrollkultur (GROTHE et al., 2000;

JENSEN et al., 2008). Auch in einer Kultur von mesencephalen Neuronen mit HMW-

FGF-2 überexprimierenden Schwann Zellen wurde eine signifikant höhere Anzahl

TH-Positiver Neurone vorgefunden als in der Kontrollkultur (GROTHE et al., 2000).

Zusätzlich bietet FGF-2 in verschiedener Hinsicht Schutz vor Zytotoxizität: Versetzt

man oben genannte Kulturen mit 6-OHDA, so gehen ca. 55% der dopaminergen

Neurone zugrunde. Werden diese Kulturen mit FGF-2 vorbehandelt, sinkt die

Verlustrate nach Zusatz von 6-OHDA um 15% (GROTHE et al., 2000). Darüber

Schrifttum

22

hinaus zeigten mit FGF-2 behandelte mesencephale dopaminerge Neurone eine

erhöhte Resistenz gegenüber L-Glutamat vermittelter Toxizität (CASPER und BLUM,

1995). Auch die Morphologie der dopaminergen Neurone wird durch die Behandlung

mit FGF-2 Isoformen positiv beeinflusst. Für sowohl HMW als auch LMW FGF-2

konnten Grothe et al. 2000 zeigen, dass die Neuritenbildung in Kulturen fetaler

dopaminerger Neurone begünstigt wird, die totale Faserlänge pro Neuron wird

signifikant größer. HMW FGF-2 verstärkt die Ausbildung der neuronalen Soma, LMW

FGF-2 fördert die Ausbildung von Verknüpfungspunkten (GROTHE et al., 2000).

2.4.2 Effekte von FGF-2 Isoformen auf dopaminerge Zellen in vivo

Auch in vivo wurden die Effekte von FGF-2 untersucht. So zeigten DATE et al. 1993,

dass FGF-2 im MPTP-Mausmodell positive Effekte auf DA-Neurone hat. Intrastriatale

Infusionen von FGF-2 führte zu einer Erholung der dopaminergen Fasern und des

Dopamin-Gehalts und schützte das nigrostriatale System vor Neurotoxizität. Ähnliche

Beobachtungen machten TIMMER et al. 2007 im Bezug auf ein weiteres Maus-

Modell: Unterzog man FGF-2 Knockout Mäuse einer 6-OHDA Behandlung, so

überlebten signifikant weniger dopaminerge Neurone als im Wildtyp, der FGF-2

normal exprimieren kann. FGF-2 schützt also auch hier vor Neurotoxizität. Auch der

Einfluss von FGF-2 auf das Überleben von transplantierten Zellen bestätigt die

neurotrophen Effekte des Faktors. Das Überleben transplantierter dopaminerger

Zellen wurde durch wiederholte intracerebrale Infusion von FGF-2 ebenso

verbessert wie nach Vorbehandlung der Zellen mit FGF-2 (MAYER et al., 1993).

Ferner wurden im Rattenmodell des M. Parkinson fetale dopaminerge Neurone mit

FGF-2 überexprimierenden Fibroblasten (TAKAYAMA et al., 1995) bzw. Schwann

Zellen (TIMMER et al., 2004) co-transplantiert. Die dopaminergen Zellen zeigen

erhöhte Überlebensraten nach der Transplantation und eine bessere Reinnervation

des Striatums. Zudem ist eine Verbesserung der Funktion im Rotationstest

festzustellen. TIMMER et al konnten daneben zeigen, dass die FGF-2 vermittelten

Effekte bei unmittelbaren Co-Transplantationen deutlicher ausgeprägt sind als bei

räumlich und zeitlich versetzten Transplantationen (TIMMER et al., 2004).

Auch eine Vorbehandlung der zu transplantierenden Zellen mit FGF-2 vermittelt

Schrifttum

23

ähnliche Effekte. Werden Zellen aus dem ventralen Mesencephalon von 12 Tage

alten Rattenembryonen über vier bzw. acht Tage in der Gegenwart von FGF-2

kultiviert und nach anschließender Differenzierung im Rattenmodell des M. Parkinson

transplantiert, zeigen sich bessere Überlebensraten, höhere TH-Immunoreaktivität

und verbesserte Funktionalität als im entsprechenden Kontrollversuch (JENSEN et

al., 2008)

2.5 Verhaltensstudien im Offenfeld und Elevated Plus-Maze

Wie bereits zu Anfang erläutert, stellen Angstzustände ein häufiges nicht

motorisches Symptom bei an M. Parkinson erkrankten Menschen dar. Sie treten oft

mit Depressionen, aber auch mit anderen psychischen Beschwerden zusammen auf

und mindern daher die Lebensqualität der Patienten zum Teil erheblich (AARSLAND

et al., 2009; BROWN et al., 2011).

Für Tiermodelle gibt es unter anderem zwei Verhaltensversuche, mit denen

Angstzustände untersucht und evaluiert werden können. Zum einen das Elevated

Plus-Maze (EPM): In diesem ca. einem Meter hohen, kreuzförmig angeordneten

Versuchsaufbau (s. Material und Methode) mit 2 offenen und zwei geschlossenen

Armen kann anhand des Verhaltens der Versuchstiere deren dann so genanntes

Angst-assoziiertes Verhalten bewertet werden (HANDLEY und MITHANI, 1984). Das

Prinzip des EPM beruht auf den konkurrierenden Verhaltensweisen von Nagern,

einerseits offene und auch hohe Areale zu meiden und andererseits neue Areale

erkunden zu wollen. Es kann z.B. eingesetzt werden, um den anxiolytischen oder

anxiogenen Effekt von Substanzen zu untersuchen, aber auch um die Beteiligung

verschiedener Regionen des ZNS an Angstverhalten zu studieren (WALF und FRYE,

2007).

In der runden, oben offenen Versuchsanordnung des Offenfeldes (OF) (s. Material

und Methode) wird vor allem exploratives und lokomotorisches Verhalten untersucht.

Hieraus lässt sich indirekt auf Angstverhalten schließen. Auch hier halten sich Nager

natürlicherweise eher am Rand der Arena auf denn im offenen und damit

ungeschützten Mittelteil. Eine Verschiebung der Verhältnisse der Aufenthaltszeiten in

den verschiedenen Bereichen und anderer Parameter zeigt Veränderungen im

Angstverhalten an (PRUT und BELZUNG, 2003). Das OF kann für ähnliche Zwecke

Schrifttum

24

eingesetzt werden wie das EPM.

In anderen als dem von uns gewählten Tiermodellen für M. Parkinson konnte

vermehrtes Angst-assoziiertes Verhalten im EPM nachgewiesen werden (TAYLOR et

al, 2009). Auch in 6-OHDA Modellen wurde von verschiedenen Gruppen der

emotionale Status der Versuchstiere erfasst. In einem bilateralen 6-OHDA Modell

konnte von TADAIESKY et al. z.B. ebenfalls vermehrtes Angst-assoziiertes

Verhalten im EPM nachgewiesen werden, zudem zeigte sich eine verringerte

lokomotorische Aktivität im OF (TADAIESKY et al., 2008). Dahingegen wurde jedoch

von BRANCHI et al. ein verringertes Angst-assoziiertes Verhalten nach bilateraler 6-

OHDA Injektion in das Striatum beobachtet (BRANCHI et al., 2008). Wiederum von

diesen Ergebnissen abweichend konnten Kuan et al. keine Veränderung im Angst-

assoziierten Verhalten im EPM nach unilateraler 6-OHDA Injektion feststellen, sie

beobachteten lediglich ein verändertes Aufrichtungsverhalten (KUAN et al., 2008).

Der Einfluss neuronaler Transplantationen auf Angst-assoziiertes Verhalten ist am

Institut für Neuroanatomie in Folgeversuchen untersucht worden (JUNGNICKEL et

al., 2011).

2.6 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit

Das erste Ziel dieser Studie ist die Optimierung eines möglichen

Transplantationsprotokolls für die Zell-basierte Therapie des M. Parkinson.

Es soll die Möglichkeit aufgezeigt werden, das Überleben und die funktionelle

Integration transplantierter Zellen durch eine Transfektion mit einem

Wachstumsfaktor zu verbessern.

Zu diesem Zweck wurden mesencephale neuronale Progenitorzellen in das

(vollständige) unilaterale 6-OHDA Rattenmodell des M. Parkinson transplantiert.

Verglichen wurde die intrastriatale Transplantation naiver Zellen mit der transfizierter

Zellen, bei diesen wurde unterschieden zwischen mit FGF-2 23kD und mit einem

leeren Vektor transfizierten Zellen.

In einer orientierenden Kurzzeitstudie wurden nach einer bzw. zwei Wochen die 3

Gruppen verglichen: Histologisch wurde die Morphologie und die Integration der

transplantierten Zellen untersucht, die durch die Transplantation hervorgerufene

Schrifttum

25

immunologische Reaktion im Empfängergewebe dargestellt und das Überleben

dopaminerger Neurone im Transplantat betrachtet.

Im zweiten Teil der Arbeit soll gezeigt werden, inwieweit Angstverhalten im hier

angewandten Rattenmodell des M. Parkinson zu beobachten und in

Verhaltensstudien zu evaluieren ist.

Hierzu wurden einseitig mit 6-OHDA lädierte Ratten im Offenfeld und im Elevated

Plus-Maze bezüglich ihres Angst-assoziierten Verhaltens untersucht und verglichen.

Material und Methoden

27

3 Material und Methoden

3.1 Chemikalien

Ammoniumnickel(II)sulfat Sigma-Aldrich, Steinheim

Ascorbinsäure Sigma-Aldrich, Steinheim

Bovines Serumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich, Steinheim

B 27 – Supplement Gibco, Invitrogen, Karlsruhe

Corbit-Balsam I. Hecht, Kiel-Hasseer

DAB Sigma-Aldrich, Steinheim

Dapi (4´,6Diamdino-2-pheyindol) Sigma-Aldrich, Steinheim

D (+)-Sacharrose Roth, Karlsruhe

DMEM/Ham´s F12 PAA GmbH, Linz, Österreich

DNAse Roche, Mannheim

Essigsäure 0,1% Riedel-de Haën, Seelze

Ethylenglycol Riedel-de Haën, Seelze

Fetales Kälberserum (FCS) PAA GmbH, Linz, Österreich

Gelatine Merck, Darmstadt

Glutamin PAA GmbH, Linz, Österreich

Glycerin Merck, Darmstadt

H2O2 Sigma Aldrich, Taufkirchen

Laminin BD Bioscience, Heidelberg

Methanol J. T. Baker, Deventer, Holland

Natriumchlorid J. T. Baker, Deventer, Holland

Natrium-Chlorid (NaCl) 0,9 % Braun, Melsungen

Natriumpyruvat PAA GmbH, Linz, Österreich

Normal Goat Serum (NGS) Gibco, Invitrogen, Karlsruhe

N2-Supplement Gibco, Invitrogen, Karlsruhe

Phosphate Buffered Saline (PBS) Dulbecco Biochrom AG, Berlin

Paraformaldehyd (PFA) Fluka, Sigma Aldrich, Steinheim

Polyornithin Sigma Aldrich, Steinheim

TritonX Fluka, Sigma Aldrich, Steinheim


28

Trypanblau Sigma Aldrich, Steinheim

Trypsin/EDTA PAA GmbH, Linz, Österreich

Xylol J.T. Baker, Deventer, Holland

FGF -2 23 kDa Tebu Bio, Frankfurt

3.2 Geräte

Brutschrank Sanyo, Bad Nenndorf

CCTV Camera (VW-BP330/GE) Panasonic,

ColorView Kamera, Soft Imaging Olympus, Hamburg

Elevated Plus-Maze

Licht- und Fluoreszenzmikroskop BX-60 Olympus, Hamburg

Kryostat, Leica CM 3050 TechnoMed, Bielefeld

Magnetrührer Ika-Labortechnik, Staufen

Neubauer Zählkammer Superior, Marienfeld

Offenfeld Zimmermann & Collegen,

Hannover

Pipettierhilfe Integra Bioscience, Fernwald

Schüttler Ika-Labortechnik, Staufen

Stereotakt Stölting, Illinois, USA

Sterilbank Microflow Nunc, Roskilde, Dänemark

Vertical Pipette Puller David Kopf Instruments,

Tujunga, Californien, USA

Viedeokassetten VHS E-240 Kodak

Videorekorder (FX 7500) Aiwa

Waage Sartorius universal Sartorius, Göttingen

Wasserbad GFL®, Burgwedel

Zentrifuge Varifuge3.0R Hereaus, Langenseebold

3.3 Antikörper

βIII-Tubulin-Antikörper, monoclonal Biomol, Hamburg

Biotinylierter Kaninchen-Anti-Maus Antikörper Dako, Glostrup, Dänemark


29

cy2-Anti-Kaninchen-Antikörper Jackson/Dianova, Hamburg

cy3-Anti-Ziege-Antikörper Sigma Aldrich, Taufkirchen

flagM2-Antikörper, monoclonal Sigma Aldrich, Taufkirchen

GFAP-Antikörper, monoclonal Sigma-Aldrich, Taufkirchen

GFAP-Antikörper, polyclonal Dako, Glostrup, Dänemark

Nestin-Antikörper, monoclonal Chemicon, Hofheim

TH-Antikörper, monoclonal Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Vectastain ABC Kit, Maus IgG Linaris, Wertheim

3.4 Sonstiges

6er Well-Platten Nunc, Roskilde, Dänemark

Bohrer Minimot 40/E Proxxon, Niersbach

Deckgläser (24x60mm) Menzel-Gläser®, Braunschweig

Einmalspritzen Luer 1 ml, 5 ml Braun, Melsungen

Einmalkanülen Luer 0,8 mm x 40 mm Braun, Melsungen

0,5 mm x 16 mm

Falcon® Röhrchen 15 ml Becton Dickinson, Heidelberg

Fluoreszent Mounting Medium Dako, Glostrup, Dänemark

Glaswaren Schott, Braunschweig

Glasstangen Leica, Nussloch

Hamilton-Spritzen 2µl, 5µl Hamilton, Bonaduz, Schweiz

Intrafix® Infusionssystem Braun, Melsungen

Ketaminhydrochlorid 5% Albrecht GmbH, Aulendorf

Kimwipes® Lite 2000 KimberlyClark, Zaventem,

Belgien

Latexhandschuhe Digitil PF Hartmann, Heidenheim

Mikroliter-Kapillaren Drummond, Broomall, USA

Nitrilhandschuhe Purple Nitrile Kimberly-Clark, Zaventem,

Belgien

Objektträger Menzel-Gläser®, Braunschweig

Objektträger, silanisiert Sigma-Aldrich, Taufkirchen


30

Petrischalen (ø 10 cm) Becton Dickinson, Heidelberg

Pipetten Eppendorf, Wessling-Berzdorf

Pipettenspitzen: gelb (0,2ml), blau (1ml) Sarstedt, Nümbrecht

Polyethylenschlauch ø 0,38mm, 0,58mm Becton Dickinson, Heidelberg

Präparategläser 4ml, 20ml Roth, Karlsruhe

Probenröhrchen 50ml Sarstedt, Nümbrecht

Reaktionsgefäße:

Eppendorf® 0,5ml, 1,5ml, 2ml Sarstedt, Nümbrecht

Rompun® 2% (Xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen

Stabpipetten 5ml, 10ml, 25ml, 50ml Sarstedt, Nümbrecht

Zellkulturflaschen 25mm Nunc, Roskilde, Dänemark

3.5 OP-Besteck

Chirurgische Pinzette No. 08-231-130 Allgaier Instrumente GmbH Frittlingen

Chirurgische Schere No. 04-124-145 Allgaier Instrumente GmbH, Frittlingen

Feine Schere , Iris scissor straight WPI, USA

Fixierungsklemme, J.H. Bulldog Clamp World Precision Instruments, USA

Knopfkanüle Fine Science Tools GmbH, Heidelberg

Metzenbaum-Schere Fine Science Tools GmbH, Heidelberg

Michelklemmen Aesculap, Tuttlingen

Raspiratorium Aesculap, Tuttlingen

Skalpellhalter Aesculap, Tuttlingen

Skalpellklinge Aesculap, Tuttlingen

Uhrmacher-Pinzette Dumont, No. 5 Fine Science Tools GmbH, Heidelberg

Vannas-Mikroschere, No. 15003-08 Fine Science Tools GmbH, Heidelberg

3.6 Puffer und Lösungen

DMEM/Ham´s F12 PAA GmbH, Linz, Österrich

Hank´s Pufferlösung PAA GmbH, Linz, Österreich

RMPI 1640 Medium Biochrom AG, Berlin


31

Medium I (Anheftungsmedium) DMEM/Ham´s F12

3% FCS 20ng/ml FGF-2 B27 N2 1 mM Natriumpyruvat 0,25% BSA 2 mM Glutamin

Medium II (Proliferationsmedium) DMEM/Ham´s F12

20ng/ml FGF-2 N2 1 mM Natriumpyruvat 0,25% BSA 2 mM Glutamin

Medium III (Differenzierungsmedium) DMEM/Ham´s F12

1% FCS B27 100µM Ascorbinsäure 0,25% BSA 2 mM Glutamin

Blocking-Puffer I 3% NGS

0,3% TritonX PBS

Blocking-Puffer II 1% BSA 0,3% TritonX PBS Blocking-Puffer III 10% BSA 0,3% TritonX PBS Blocking-Puffer IV 3% BSA 0,3% TritonX PBS Blocking-Puffer V 1% NGS 0,3% TritonX PBS


32

3.6.1 Versuchsdesign Transplantationsversuche

Abbildung 3: Übersicht Versuchsablauf Transplantationsversuche

3.7 Präparation der E12 Zellen

Zur Gewinnung der mesencephalen Progenitorzellen wurde das ventrale

Mesencephalon 12 Tage alter Rattenembryonen (Sprague Dawley, bezogen von

Charles River, Sulzfeld, so wie beschrieben von NIKKHAH et al. präpariert

(NIKKHAH et al., 1994 (1), NIKKHAH et al., 1994 (2)). Grundlage hierzu ist die Zell-

Suspensions-Technik nach BJÖRKLUND et al. (BJÖRKLUND et al., 1983). Die

trächtigen weiblichen Ratten wurden mit CO2 getötet und die Embryonen aus den

Uteri entnommen. Die abgeschnittenen Köpfe der Embryonen wurden in sterilen

Petrischalen gefüllt mit Hank´s Pufferlösung gesammelt. Unter mikroskopischer

Kontrolle wurde das Mittelhirn-Neuralrohr präpariert, anschließend die dorsalen und

lateralen Anteile am Präparat entfernt und die so erhaltenen ventralen Anteile in

DMEM/Ham´sF12 gesammelt. Die ventralen Mesencephalonstücke wurden dann in

einer Lösung aus DMEM/Ham´s F12, 0,05% DNAse, 2mmol L-Glutamin, B27 und 1

mmol Natriumpyruvat bei 37°C für 20 Minuten inkubiert. Die Inkubation wurde durch

Zugabe von Medium I (Anheftungsmedium) gestoppt und die Suspension für 5

Minuten bei 100 rpm zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde in 1ml Medium I

6-OHDA Injektion

Präparation E12 Zellen

3 Tg Proliferation

mind 8 Wochen

Trans

fektion

3 Tg Proliferation,

4Tg Differenzierung

Transplantation

Perfusion

1 Wo

Perfusion 2 Wo


33

(Anheftungsmedium) resuspendiert und eine Einzel-Zell-Suspension wurde

hergestellt durch mechanische Dissoziation mit Eppendorf-Pipetten (1ml, 5-10x,

200µl, 5-10x). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels einer Trypan-Blau-

Färbung festgestellt und betrug nahezu 100%.

Pro Embryo konnten - abhängig von der Größe - ca. 60.000 – 80.000 Zellen

gewonnen werden.

3.8 Zellkultur

Die Zellkultur wurde wie von Timmer et al. beschrieben durchgeführt (TIMMER et al.,

2006). Zunächst wurden die Zellen in einem Hemocytometer gezählt und auf

2.000.000 bis 3.000.000 Zellen/ml eingestellt. Dann wurde je 1 ml der Zellsuspension

mit 5 ml des Mediums I (Anheftungsmedium) in 25ml Zellkulturflaschen ausgesät, die

vorher mit Polyornithin (100µg/ml) und Laminin (6µg/ml) beschichtet wurden. Die

Beschichtung erfolgte in destilliertem Wasser für 24 Stunden bei Raumtemperatur.

Anschließend wurden die Flaschen zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen.

Nach 24 Stunden wurde das Anheftungsmedium durch Medium II

(Proliferationsmedium) ersetzt und die Zellen hierin für 3 Tage kultiviert. Nach der

Proliferationsphase wurde das Medium von den Flaschen entfernt, die Oberfläche

einmal mit PBS gewaschen und die Zellen mithilfe von Trypsin/EDTA innerhalb von

3-4 Minuten abgelöst. Die Trypsinisierung wurde durch Zugabe von

Anheftungsmedium gestoppt. Die Zellen wurden erneut gezählt und auf die

benötigten Zellzahlen (2.000.000 Zellen pro Transfektion) eingestellt und transfiziert.

(s. u.).

Nach der Transfektion wurden die Zellen wieder mit in wie oben beschichteten 25ml

Zellkulturflaschen ausgesät (1,5 – 2 Millionen Zellen/Flasche) und über Nacht in 5ml

Anheftungsmedium inkubiert, das anschließend wieder für 3 Tage durch

Proliferationsmedium ersetzt wurde. Abschließend wurde das Proliferationsmedium

durch Medium III (Differenzierungsmedium) ersetzt und die Zellen für weitere 4 Tage

inkubiert.

Alle Inkubationsphasen fanden bei 37°C in einem befeuchteten 5% CO2 - 95% Luft

Inkubator unter normalen Sauerstoff-Verhältnissen (ca. 20%) statt.


34

Unmittelbar vor der Transplantation wurden die Zellen wieder wie oben beschrieben

mit Trypsin/EDTA abgelöst, die Trypsinisierung mit Anheftungsmedium gestoppt, die

Zellen gezählt und die Lebensfähigkeit mit Trypanblau überprüft. Die Suspension

wurde nun für 5 Minuten bei 1000rpm zentrifugiert und anschließend in

Proliferationsmedium, jedoch ohne FCS, dafür mit 0,05% DNAse, resuspendiert und

auf die Endkonzentration von ca. 100.000 Zellen /µl eingestellt.

In der Kontrollgruppe wurden nicht transfizierte Zellen verwendet.

3.9 Transfektion

Die gewählte Art der Transfektion in diesem Versuch ist die Nucleofektion. Hierzu

wurde das ´Basic Nucleofector Kit` für primäre Säugetierneuronen der Firma Amaxa,

Köln, benutzt.

Der proteinkodierende Bereich vom FGF-2 (23kd Isoform) –Gen der Ratte wurde in

das Expressionsplasmid p3xFlag kloniert. Dieses Plasmid wird im folgenden flag23kd

genannt. 2.000.000 Zellen wurden je mit flag23kd oder für die Kontrollgruppe mit

dem leeren Vektor (im folgenden empty flag genannt) nach dem Protokoll, das von

CESNULEVICIUS in unserer Arbeitsgruppe erstellt wurde, transfiziert

CESNULEVICIUS et al., 2006). Diese Prozedur überlebten ca. 1.000.000 Zellen.

3.10 Das unilaterale 6-OHDA Läsions-Modell

Weibliche Sprague-Dawley Ratten, ebenfalls bezogen von Charles River, Sulzfeld,

wurden im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover in Gruppen

von 3-5 Tieren bei einer Raumtemperatur von 22-24°C, einer Luftfeuchtigkeit von 50-

60% und einem künstlichen Tag/Nacht-Rhythmus von jeweils 12 Stunden in

Makrolon® Typ IV Käfigen auf Standardeinstreu für Labortiere (Altromin, Altrogge,

BRD) gehalten. Die Tiere erhielten Altromin-Haltungsfutter (Altromin, Altrogge, BRD)

und Wasser ad libitum.

Es wurden insgesamt 68 Ratten verwendet, die zum Zeitpunkt der Lädierung ein

Gewicht von ca. 200g hatten.

Unter intraperitoneal applizierter Injektionsnarkose (Ketaminhydrochlorid 5%


35

0,1ml/100g KGW und Xylazin 2% 0,02ml/100g KGW, TIMMER et al., 2004) wurden

die Tiere in stereotaktische Rahmen eingespannt und erhielten jeweils eine 6-

Hydroxydopamin (6-OHDA) Injektion mit einer 5 ml Hamilton-Spritze in das rechte

mediale Vorderhirnbündel an folgenden Koordinaten in Bezug auf Bregma und Dura:

1. 2,5 µl 6-OHDA (3.6 µg /µl in 0,2 mg/ml L-Ascorbinsäure – Saline) bei: AP: -4,4,

LAT: -1,2, VERT: -7,8, Zahnbalken: -2,3; 3µl 6-OHDA bei AP: -4, LAT: -0,8, VERT: -

8, Zahnbalken: +3,4. Die Injektionsrate betrug 1µl/ Minute und die Kanüle wurde

nach der Injektion für weitere 3 Minuten an Ort und Stelle belassen und dann

langsam entfernt. Nach der Lädierung wurde für mindestens 8 Wochen abgewartet,

bevor die Transplantation vorgenommen wurde.

3.11 Transplantation der E12 Zellen

Die nach oben beschriebener Art und Weise vorbereiteten Zellen wurden

stereotaktisch in das rechte Striatum der lädierten Ratten implantiert. Hierbei wurden

folgende Gruppen gebildet: 11 Tiere wurden mit mit flag23kd transfizierten Zellen

transplantiert, 11 Tiere wurden mit mit flag empty transfizierten Zellen transplantiert

sowie 4 Tiere mit naiven Zellen.

Hierzu wurde eine Glas-Kapillare mit einem äußeren Umfang von 50-70 µm mit Hilfe

eines Plastik-Schlauches an einer 2µl Hamilton-Spritze befestigt und jeweils ein

Depot von 2 µl an folgenden Stellen im Bezug auf Bregma und Dura injiziert: 1. AP:

+1, LAT: -2,3, VERT: -4; 2. AP: +1, LAT: -2,3, VERT: -5; 3. AP: +1, LAT: -3,3, VERT:

-4, 4. AP: +1, LAT: -3,3, VERT: -5, Zahnbalken: 0 für alle 4 Koordinaten. Die

Injektionsrate betrug 1µl/min und die Kanüle wurde kurz nach der Injektion entfernt

(NIKKHAH et al, 1994(2)).

3.12 Perfusion und histologische Aufarbeitung

Eine Woche nach der Transplantation (Gruppe empty flag n = 5 ; Gruppe flag23kd n

= 6 ; Gruppe naiv n = 2) bzw. 2 Wochen nach der Transplantation (Gruppe empty

flag n = 6 ; Gruppe flag23kd n = 6 ; Gruppe naiv n = 2) wurden die Ratten unter tiefer

Narkose zunächst mit 250ml NaCl 0,9% und anschließend mit 250ml


36

Paraformaldehyd 4% in PBS intracardial perfundiert, und die Gehirne unmittelbar

danach präpariert und über Nacht in 4% Paraformaldehyd bei 4°C immersionsfixiert,

um danach bis zum Absinken im Gefäß (Dehydratation, maximal 7 Tage) in 30%

Succrose-Lösung zu verbleiben.

Anschließend wurden 6 Serien coronale Gefrierschnitte bei -20°C Objekt- und

Kammertemperatur mit einer Dicke von 30 µm (bzw. für die Verhaltensversuche 40

µm) aus den Gehirnen angefertigt. Hierzu werden die Gehirnschnitte je fortlaufend

einer von 6 Serien zugeordnet, nach 6 Schnitten beginnt die Zuteilung stets von vorn,

so dass alle Serien Schnitte mit 150 µm Abstand aufweisen). Diese wurden bis zur

Weiterbearbeitung in Anti-Freeze-Medium (30% Glycerin, 30% Ethylenglycol, 40%

PBS) bei -20°C gelagert.

Es wurden für alle Gehirne soweit möglich folgende immunhistologische Färbungen

im Free-Floating-Verfahren durchgeführt: TH-Färbung zum Nachweis dopaminerger

Neurone (Präinkubation in 3% H202, 10%Methanol, PBS für 10 Minuten, TH-

Antikörper (Sigma Aldrich, Taufkirchen) 1:5000 in Blocking-Puffer II über Nacht;

Visualisierung mittels Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Kit und 3´,3- Diaminobenzidin

DAB (NIKKHAH et al., 1994(2)); Dapi-Färbung zur Visualisierung von Zellkernen

(1:1500 in PBS für 30 Minuten). Für alle folgenden Färbungen erfolgte die

Visualisierung mittels fluoreszierendem Zweitantikörper Cy2 (1:200) bzw. Cy3 (1:500,

nur Tubulin 1:1000) im Blocking-Puffer entsprechend dem Erstantikörper; Tubulin-

Färbung zum Nachweis von Neuronen (Präinkubation in Blocking-Puffer I für 20

Minuten, Tubulin-Antikörper (Biomol) 1:1000 in Blocking-Puffer V über Nacht );

Nestin-Färbung zum Nachweis von Progenitorzellen (Präinkubation in Blocking-

Puffer I für 20 Minuten, Nestin-Antikörper (Chemicon) 1:550 in Blocking-Puffer V über

Nacht); GFAP- Färbung zum Nachweis von Astrozyten (Präinkubation in Blocking-

Puffer I für 60 Minuten, GFAP-Antikörper (monoclonal: SigmaAldrich; polyclonal:

Dako) 1:400 in Blocking-Puffer II über Nacht); flag-Färbung zum Nachweis

transfizierter Zellen (Präinkubation in Blocking-Puffer III für 10 Minuten, flagM2-

Antikörper (Sigma Aldrich, Taufkirchen) 1:500 in Blocking-Puffer IV über Nacht).

Alle Schnitte wurden mit Hilfe von Gelatine (7,2 g/l A. dest.) auf mit 100% Alkohol

entfettete oder silanisierte Objektträger aufgezogen und nach mindestens einer


37

Nacht Trocknungszeit eingedeckelt (Fluoreszenzschnitte: Fluoreszent Mounting

Medium; DAB-Schnitte: Corbit Balsam).

3.13 Verhaltensstudien zur funktionellen Evaluation

Für die Verhaltensstudien wurden ebensolche Sprague-Dawley Ratten verwendet

wie für die Transplantationsversuche. Es erfolgte eine Einteilung in 3 Gruppen:

Gruppe 1: Naive Ratten, Gruppe 2: Sham-lädierte Ratten, Gruppe 3: 6-OHDA-

lädierte Ratten. Die Lädierung der Ratten erfolgte wie oben beschrieben, für die

Sham-Läsionen wurde anstelle des Toxins lediglich das Lösungsmittel injiziert. Die

naiven Ratten wurden lediglich in den Stereotakt eingespannt und für ca. 10 Minuten

dort belassen. Zwischen der Lädierung und den Verhaltensexperimenten wurden die

Ratten gehandelt um sie an den Umgang mit Menschen zu gewöhnen.

In den Verhaltensstudien wurden zwei Experimente durchgeführt, in denen

lokomotorisches, exploratives und angstassoziiertes Verhalten untersucht werden

sollte (Abbildung 4).

Die Durchführung der Verhaltensversuche erfolgte in einem Raum, in dem die

Apparaturen in einem durch weiße Laken abgehängten Bereich unterhalb der für die

Aufzeichnung nötigen Videokamera aufgestellt wurden. Der Raum war klimatisiert

(23°C) und durch Leuchtstoffröhren indirekt beleuchtet (50–80 Lux), die

Störgeräuschunterdrückung erfolgte mittels eines White Noise Generators bei 60 dB.

Beide Versuchsreihen wurden jeweils zur gleichen Tageszeit und jeweils von den

gleichen Experimentatoren durchgeführt und die Tiere 30 Minuten vor

Versuchsbeginn in einen dem Versuchsraum angrenzenden Vorbereitungsraum

verbracht. Das Verbringen der Tiere in und aus den Arenen erfolgte mittels eines

Transportkäfigs, der, ebenso wie die Arenen selbst, zwischen den

Versuchsdurchläufen mit Essigsäure gereinigt wurde.

Zum Tracking der Ratten wurde das Computerprogramm EthoVision® (Noldus

Information Technology, Wageningen, Niederlande) verwendet, das 1 Sekunde nach

dem Einsetzen der Tiere mit dem Aufzeichnen begann. Die Versuchsdauer betrug je

5 Minuten.

Die Versuche fanden randomisiert und für die Experimentatoren verblindet bezüglich

der Gruppenzugehörigkeit statt.


38

Abbildung 4: Versuchsablauf Verhaltensstudien

3.13.1 Das Offenfeld

Bei der Offenfeld-Arena (im Folgenden OF) handelt es sich um eine nach oben

offene, runde Polypropylen-Box mit einem Außendurchmesser von 80 cm und einer

4 mm starken Wand von 25 cm Höhe, die auf einem Tisch in 78,5 cm Höhe platziert

wurde (Abbildung 5).

Die Arena wird in 3 Zonen (Zentrum, innen, außen) von je ca. 13–13,5 cm Radius

aufgeteilt.

6-OHDA bzw.

Sham-Läsion

Mind. 8 Wo

Offenfeld

Elevated Plus Maze

Perfusion und histologische Aufarbeitung


39

Abbildung 5: Aufbau Offenfeld (nach C. Lindemann)

Die Ratten wurden mit konstanter Blickrichtung in den Zentrumsbereich gesetzt und

es wurden für 5 Minuten folgende Parameter erfasst: die insgesamt zurückgelegte

Laufstrecke, das Eintreten der Ratten in die jeweiligen Zonen, die Verweildauer in

den jeweiligen Zonen sowie (mittels EthoVision); Häufigkeit und Dauer von

Aufrichtungs- und Putzverhalten (Rearing und Grooming) in den jeweiligen Zonen

(mittels Sondertastatur in Verbindung mit EthoVision) sowie Anzahl der

hinterlassenen Kotboli (manuell).

3.13.2 Das Elevated Plus-Maze

Beim Elevated Plus–Maze (EPM) handelt es sich um eine kreuzförmige

Versuchsarena, die auf 86,5 cm hohen Säulen befestigt ist. Zwei Arme des Kreuzes

sind offen, zwei von 30 cm hohen und 9 mm dicken Wänden begrenzt. Die Maße der

Arme betragen 49 cm x 14 cm. Das Zentrum (14 cm x 14 cm) ist ebenfalls offen

(Abbildung 6).


40

Abbildung 6: Aufbau Elevated Plus-Maze (nach C. Lindemann)

Die Ratten wurden konstant mit Blickrichtung in einen offenen Arm in das Zentrum

der Arena gesetzt und es wurden für 5 Minuten folgende Parameter erfasst: die

insgesamt zurückgelegt Laufstrecke, das Eintreten der Ratten in die jeweiligen

Zonen sowie die die Verweildauer in den jeweiligen Zonen (mittels EthoVision);

Häufigkeit und Dauer von Aufrichtungs- und Putzverhalten in den jeweiligen Zonen

sowie des Herabschauens der Tiere von den offenen Armen (Head Dips) (mittels

Sondertastatur in Verbindung mit EthoVision) sowie Anzahl der hinterlassenen

Kotboli (manuell).

3.14 Statistik

Die statistische Auswertung der Verhaltensstudien erfolgte mittels des

Computerprogramms GraphPad InStat, Version 3.0. Zunächst wurde mit Hilfe des

Kolmogorov-Smirnov-Tests ermittelt, ob sich die Daten gemäß einer Gauß`schen

Normalverteilung verhalten. Entsprechend des Ergebnisses wurde zum Vergleich der


41

je 3 Gruppen eine einfaktorielle Varianzananalyse (One-Way-Anova) bzw. bei nicht

parametrischen Daten eine Kruskal-Wallice-Varianzanalyse durchgeführt. Als post

hoc-Tests wurden anschließend der Bonferroni Multiple Comparison Test bzw. bei

nicht parametrischen Daten der Dunn Multiple Comparison Test verwendet. Das

Signifikansniveau wurde auf p < 0,05 festgesetzt.

Zur genauen Bestimmung der p-Werte wurden die im post-hoc Test als signifikant

erkannten Gruppen mittels eines t-Tests verglichen.

Ergebnisse

43

4 Ergebnisse

4.1 Transplantationsversuche

Die hier erzielten Ergebnisse sind als Grundlage für nachfolgende Studien

hinsichtlich der Entwicklung eines effizienten Transplantationsprotokolls für

transfizierte neuronale Progenitorzellen im Rattenmodell des Morbus Parkinson zu

sehen. Zu diesem Zweck wurden hier in einer Kurzzeitstudie Zellen aus dem

Mesencephalon 12 Tage alter Rattenembryonen verwendet um ihr Verhalten nach

Transfektion und Transplantation zu beurteilen.

Hierzu wurden drei experimentelle Gruppen gewählt: in der ersten wurden naive

Progenitorzellen, die in vitro insgesamt 6 Tage proliferiert und 4 Tage differenziert

wurden, transplantiert. Für die zweite Gruppe wurden die Zellen bei ansonsten

gleicher Behandlung nach 3 Tagen Proliferation mit flag23kD transfiziert, in der

dritten Gruppe erfolgte zu diesem Zeitpunkt eine Transfektion mit einem leeren flag-

Vektor.

Die Evaluation der Morphologie und Integration der transplantierten Zellen erfolgte je

nach einer bzw. nach zwei Wochen.

Die Analyse der angefertigten Gefrierschnitte beinhaltet die Erfassung der in den

Transplantaten vorhandenen Zelltypen mithilfe immunhistochemischer Marker, die

vorhanden Zelltypen wurden auf Ihre Verteilung, ihre Morphologie und Integration hin

untersucht. Zur Darstellung der Zelltypen wurden Antikörper für folgende Marker

gewählt:

1. GFAP: zur Darstellung von Astrozyten, also der astroglialen Reaktion

2. Nestin: zur Darstellung von neuronalen Progenitorzellen sowie reaktiver

Astrozyten

3. Tubulin: zur Darstellung von Neuronen

4. TH: zur Darstellung dopaminerger Neurone

Zudem wurden die Präparate mit Dapi zur Markierung der Zellkerne angefärbt, um

damit einen Hinweis auf die Zelldichte im Präparat zu erhalten.

Vor allem bei den Darstellungen von Neuronen und TH-positiven Neuronen kam es

zu teils sehr unterschiedlicher Anfärbbarkeit der verschiedenen Präparate mit zum

Ergebnisse

44

Teil erheblicher Hintergrundfärbung.

Zudem wurden alle Transplantate auf die Ausprägung des flag-tags untersucht. Es

zeigte sich jedoch in keinem der Schnitte eine Immunreaktivität für das Fusions-Tag,

wohingegen in vitro das flag-tag (vgl. Abb. 7) darzustellen ist.

4.1.1 Überleben transfizierte Zellen die Transplantation?

Anhand der Dapi-Färbung lässt sich erkennen, dass die transfizierten Zellen die

Transplantation überlebt haben: In den Bereichen, wo die Transplantate zu erwarten

sind, zeigen sich deutlich abgrenzbare Bereiche erhöhter Zelldichte, und das in allen

drei experimentellen Gruppen, sowohl eine (Abb. 8, 10, 12 D) als auch zwei Wochen

(Abb. 9, 11, 13 D) nach der Transplantation. Besonders interessant wird diese

Beobachtung, wenn man die Anfärbbarkeit der Zellkerne mit der für die anderen

Marker vergleicht (s. u.).

4.1.2 Ist eine verstärkte Astrozytose auf die Transplantate zu beobachten?

Zur Darstellung der astrozytären Reaktion wurden die angefertigten Gefrierschnitte

mit einem Antikörper für GFAP, einem Bestandteil des Zytoskeletts von Astrozyten,

immunhistochemisch untersucht. Die Astrozyten stellen sich aufgrund des gewählten

sekundären Antikörpers grün dar.

Es kann für alle Gruppen gezeigt werden, dass die Gehirnhälfte, in der die

Transplantation erfolgt ist, insgesamt eine stärkere astrozytäre Reaktion zeigt als die

nicht transplantierte Seite: Die angefärbten Astrozyten sind hier insgesamt dicker und

weisen mehr Zellausläufer auf, dadurch erscheint die gesamte Gehirnhälfte stärker

leuchtend.

In allen experimentellen Gruppen stellt sich zudem eine vermehrte Reaktivität der

Astrozyten direkt um die Transplantate dar: Alle Transplantate sind von einem

Bereich umgeben, in dem besonders viele reaktive Astrozyten zu finden sind: Diese

kennzeichnen sich dadurch, dass sie noch einmal größer und dicker sind und dass

sie mehr Ausläufer aufweisen als die Astrozyten, die innerhalb der Transplantate und

in den übrigen Bereichen der Gehirnhälfte zu sehen sind (vgl. z. B. Abb. 13 G1 und

Ergebnisse

45

G2).

Die Astrozyten, die sich im Inneren der Transplantate anfärben lassen, weisen eine

feinere Struktur auf, sind kleiner und scheinen so weniger zu leuchten. Sie füllen die

Transplantate in unterschiedlicher Dichte aus.

Die Differenzierung, ob die reaktiven Astrozyten um die Transplantate herum liegen

oder Teil von Ihnen sind, ist deshalb möglich, weil in der Doppelmarkierung mit Dapi

zu sehen ist, dass der Bereich der besonders hohen Dichte an Zellen (also der

Bereich, in dem die transplantierten Zellen sich befinden) umgeben ist von einem

Bereich der vermehrten glialen Reaktion (also vermehrt GFAP-positiven Zellen) und

dass sich diese beiden unterschiedlichen Zellanordnungen nicht überschneiden. Es

lässt sich also folgern, dass die äußere Grenze der Transplantate mit dem Beginn

der vermehrten glialen Reaktion zusammenfällt. Die Bereiche der transplantierten

Zellen scheint also durch die reaktiven Astrozyten eingegrenzt zu werden (Abb. 8,

T/G2)

Zwischen den experimentellen Gruppen lassen sich keine deutlichen Unterschiede in

Maß und Ausbreitung der glialen Reaktion erkennen. Jedoch ist zu bemerken, dass

die gliale Reaktion nach einer Woche jeweils deutlicher ausgeprägt ist und die

Astrozyten eher unregelmäßig angeordnet erscheinen, wohingegen nach zwei

Wochen die gliale Reaktion weniger stark, die saumartige Abgrenzung der

Transplantate durch reaktive Astrozyten weniger deutlich ist. Außerdem erscheinen

die Zellen insgesamt etwas regelmäßiger angeordnet, sie orientieren sich teilweise in

Richtung der Mitte der Transplantate, teilweise liegen sie konzentrisch um die

Transplantate angeordnet.

Ebenso wie um die Transplantate herum ist im Bereich des Einstichs der

Transplantationsnadel eine vermehrte Reaktivität von Astrozyten zu sehen, die sich

trichterförmig in die Tiefe verjüngt. Sie steht nicht in räumlichem Kontakt mit den

Bereichen, in denen die transplantierten Zellen zu finden sind.

4.1.3 Sind neuronale Progenitorzellen in den Transplantaten zu finden?

Die Darstellung von neuronalen Progenitorzellen erfolgt mithilfe des Markers Nestin.

Nestin ist ebenfalls ein Bestandteil des Zytoskeletts und kommt in Progenitorzellen

Ergebnisse

46

vor, aber auch in reaktiven Astrozyten. Nestin-immunreaktive Zellen stellen sich

aufgrund des gewählten zweiten Antikörpers rot dar (Beachte: Aufgrund der

besseren Darstellbarkeit ist die Farbe in einigen Schnitten digital nach gelb

verändert).

Nestin-positive Zellen finden sich in fast allen Schnitten. Sie sind überwiegend in und

um die Transplantate zu sehen (Die Differenzierung erfolgt auch hier durch die

Doppelfärbung mit Dapi).

Die Gestalt der Nestin-immunreaktiven Zellen erinnert an die von Astrozyten. Jedoch

sind sie insgesamt filigraner: Ihre Zellkörper ebenso wie ihre Ausläufer sind

schlanker und erscheinen dadurch länger (z.B. Abb. 12 Nes2 und G2).

In den Gruppen mit transfiziert transplantierten Zellen liegen die Nestin-positiven

Zellen ähnlich den reaktiven Astrozyten vornehmlich um die Transplantate herum

und die in den Transplantaten zu sehenden Nestin-positiven Zellen sind noch einmal

kleiner und feiner als die übrigen. Nach einer Woche sind in diesen beiden Gruppen

fast keine Nestin-positiven Zellen innerhalb der Transplantate zu sehen. Nach zwei

Wochen sind innerhalb der Transplantate mehr Nestin-positive Zellen zu sehen als

nach einer Woche, insgesamt ist die Dichte an Nestin-positiven Zellen aber geringer.

In den Transplantaten mit nicht transfizierten, naiv transplantierten Zellen sind

insgesamt deutlich weniger Zellen Nestin-positiv. Die immunreaktiven Zellen liegen

fleckenartig um und in den Transplantaten verteilt, es zeigt sich nicht ein so deutlich

abgrenzbarer Bereich immunreaktiver Zellen um die Transplantate. Auch hier sind

nach 2 Wochen weniger immunreaktive Zellen zu sehen.

Reaktive Astrozyten können ebenfalls Nestin-positiv sein (KRUM und ROSENSTEIN,

1999). Daher wurden GFAP- und Nestin-Immunreaktivität verglichen. Aus

methodischen Gründen konnte keine direkte Doppelfärbung für beide Marker

angefertigt werden, somit werden benachbarte histologische Schnitte verglichen: in

den Fällen, wo GFAP- und Nestin-positive Zellen wie als Ring um die Transplantate

herum zu liegen kommen, kommen die beiden Zelltypen nebeneinander vor.

Vermutlich sind hier einige Zellen für beide Marker positiv. Auch in den

Transplantaten, wo Nestin- und GFAP-positive Zellen innerhalb der Transplantate zu

finden sind, liegen sie in den gleichen Bereichen (z.B. Abb. 9 N/G).

Ergebnisse

47

4.1.4 Sind Neurone in den Transplantaten nachzuweisen?

Zum Nachweis von Neuronen dient der Marker Tubulin, der ein Bestandteil der

Mikrotubuli, also des Zytoskeletts von Neuronen ist. Da alle im Gehirn vorhandenen

Neurone angefärbt werden, dienen die nicht in unmittelbarer Nähe der Transplantate

liegenden Zellen automatisch als Positiv-Kontrolle.

Auch bei der Evaluierung des Verhältnisses der Tubulin-immunreaktiven Zellen zu

den Transplantaten wird die Doppelmarkierung mit Dapi genutzt. Es lassen sich bei

dieser Markierung Unterschiede in der Verteilung, der Morphologie und der Dichte

der Tubulin-immunreaktiven Zellen zwischen den experimentellen Gruppen

feststellen (Abb. 8-13, T/D1 und T/D2)

In der Gruppe der naiv transplantierten Zellen zeigen sich im Transplantat sehr viele,

gleichmäßig angeordnete Tubulin-immunreaktive Zellen. Nach zwei Wochen

scheinen es noch einmal mehr zu sein als nach einer Woche, da die Färbung hier

intensiver ist. Die Zellen weisen eine gleichmäßige Morphologie mit rundlichen

Zellkörpern auf und unterscheiden sich kaum von denen der Umgebung, sie sind mit

denen in der Zellkultur vergleichbar (Abb. 8 und 9, Tub1/Tub2).

Im Gegensatz dazu findet man in der Gruppe der mit leerem Vektor transfizierten

Zellen nach einer Woche kaum Tubulin-positive Zellen (Abb. 10, Tub1/Tub2). Die

Tubulin-positiven Zellen, die im Bereich der Transplantate zu sehen sind, haben eher

unregelmäßige Gestalt und sind zum Teil kleiner als die im umgebenden Gewebe.

Nach zwei Wochen allerdings sind die Transplantate von deutlich mehr Tubulin-

positiven Zellen durchzogen, und auch sind die Zellkörper regelmäßiger rund geformt

(Abb. 11, Tub1/Tub2).

Bei der Gruppe der mit flag23kD transfizierten Zellen sind in den Transplantaten

nach einer Woche (Abb. 12) sowohl Bereiche mit kaum angefärbten Zellen, die auch

von unregelmäßiger Form sind als auch Bereiche mit vielen Neuronen, die eine

gleichmäßig runde Morphologie aufweisen, vorzufinden. Nach zwei Wochen (Abb.

13) sind die Transplantate überwiegend mit Tubulin-positiven Zellen ausgefüllt, diese

sind gleichmäßig rundlich. Durch unterschiedlich intensive Färbung entsteht der

Eindruck von Bereichen mit mehr bzw. weniger dicht gelagerten Zellen. In der

Doppelfärbung mit Dapi wird aber deutlich, dass in den Bereichen, wo die Färbung

Ergebnisse

48

weniger intensiv erscheint, die Zellkerndichte höher ist als in den stark leuchtenden

Bereichen (Abb. 13 T/D1 / TD2).

4.1.5 Sind TH-positive Neurone nachzuweisen?

Als Positiv-Kontrolle für eine gelungene TH-Markierung dient die nicht lädierte Seite

des Gehirns. Somit kann – bei positiver Kontrolle – sicher gesagt werden, ob TH-

positive Zellen auf der transplantierten Seite zu finden sind oder nicht.

Es konnten in fast allen Fällen TH-immunreaktive Zellen im Bereich der

Transplantate gefunden werden. Wie jedoch in Tabelle 1 zu sehen ist, sind die

Mengen sehr unterschiedlich und es wurden insgesamt nicht viele TH-positive Zellen

nachgewiesen. Dort wo mehrere Zellen in Gruppen zusammenliegen, sind Zell-zu-

Zell-Verbindungen ausgeprägt.

Trotz des geringen Vorhandenseins lässt sich feststellen, dass bei den naiv

transplantierten Zellen die meisten TH-positiven Zellen im Transplantat zu finden

sind (Abb. 14). Allerdings gilt es festzuhalten, dass die Ergebnisse früherer Versuche

dieser Art nicht reproduziert werden konnten (TIMMER et al., 2004, TIMMER et al.,

2006)

Die Morphologie der TH-positiven Zellen ist ebenfalls in den verschiedenen Gruppen

unterschiedlich. Die in den Transplantaten mit naiven Zellen zu findenden TH-

positiven Neurone zeigen eine recht regelmäßige Form und gleichmäßige Größe, sie

haben überwiegend mehrere und längere Zellausläufer und sind in ihrer Morphologie

mit TH-positiven Zellen in Kultur vergleichbar. Bei den beiden Gruppen mit

transfiziert transplantierten Zellen (Abb. 15) sind die TH-immunreaktiven Zellen

deutlich unregelmäßiger, haben kürzere oder keine Ausläufer und sind kleiner.

Jedoch erscheinen die Zellen in der Gruppe der mit flag23kD transfizierten Zellen

insgesamt noch etwas `gesünder`, mit gleichmäßiger wirkenden Zellkörpern und

regelmäßigerer Gestalt.

Ergebnisse

49

Tabelle 1: Übersicht TH-Färbung

Flag

empty

1 Wo

Flag

empty

2 Wo

Flag

23kDa

1 Wo

Flag

23KDa

2 Wo

Naiv

1 Wo

Naiv

2 Wo

Lx ±

2 Zellen

Lx +

3 Zellen

Lx ±

1 Zelle

Nicht

auswertbar

Lx +

167 Zellen

Lx ±

80 Zellen

Lx –

4 Zellen

Lx ±

9 Zellen

Nicht

auswertbar

Lx +

220 Zellen

Lx ±

151 Zellen

Lx +

88 Zellen

Lx –

29 Zellen

Lx +

2 Zellen

Lx ±

11 Zellen

Lx ±

4 Zellen

Lx +

0 Zellen

Lx +

1 Zelle

Lx ±

2 Zellen

Lx +

28 Zellen

Lx +

0 Zellen

Lx +

0 Zellen

Lx +

2 Zellen

Lx +

0 Zellen

Lx +

4 Zellen

Lx +

4 Zellen

Lx - / / + : Läsion nicht / mäßig / gut geglückt; die angegebenen Zellzahlen beziehen sich auf die

jeweils im einzusehenden Transplantatbereich der jeweiligen Serien gezählten TH-positiven Zellen

und sind nicht auf die gesamte Transplantatfläche hochgerechnet.

Anhand der TH-Färbung lässt sich zusätzlich erkennen, ob die nigrostriatale

Degeneration vollständig erfolgt ist. Dies ist nicht in allen Tieren der Fall (Tabelle 1).

Ebenso ist zum Teil eine starke Hintergrundfärbung zu beobachten.

4.1.6 Zusammenfassung

Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass durch Nukleofektion transfizierte

neuronale Progenitorzellen eine Transplantation in das Striatum des 6-OHDA-

Rattenmodells des M. Parkinson überleben und sich TH-positive, also dopaminerge

Zellen in den Transplantaten nachweisen lassen.

Es kommt zu keinem Unterschied in der immunologischen Reaktion in den

verschiedenen Gruppen.

Allerdings zeigt sich, dass die Transfektion die Verteilung, die Morphologie und das

Ergebnisse

50

Überleben von Progenitorzellen und Neuronen zu beeinflussen scheint und dass

insbesondere dopaminerge Neurone in Transplantaten mit transfizierten Zellen nur in

sehr geringer Zahl überleben.

In den folgenden Abbildungen werden die oben beschriebenen Ergebnisse anhand

von exemplarischen Fotos der immunhistochemisch untersuchten Gefrierschnitte

noch einmal bildlich dokumentiert.

Ergebnisse

51

Abbildung 7: E12 Zellen in vitro, Immunreaktivität für TH bzw. das flag-tag Die zu transplantierenden Zellen wurden unmittelbar vor der Transplantation hinsichtlich der TH-Immunreaktivität

sowie der Darstellbarkeit des flag-tags in vitro untersucht. In vitro ist das flag-tag und somit die erfolgreiche

Transfektion sowohl für den leeren Vektor als auch für die Kombination mit FGF nachzuweisen.

Ergebnisse

52

Abbildung 8: E12 naiv, 1 Wo in vivo Immunfluoreszenz für Nestin (N, Nes), Tubulin (T, Tub), GFAP (G), Dapi (D) sowie entsprechende

Doppelfärbungen. Bild 2 zeigt jeweils eine Auschnittvergrößerung zu Bild 1, die Färbung ist zur besseren

Darstellbarkeit zum Teil digital verändert.

Ergebnisse

53

Abbildung 9: E12 naiv, 2 Wo in vivo Immunfluoreszenz für Nestin (N, Nes), Tubulin (T, Tub), GFAP (G), Dapi (D) sowie entsprechende



Ergebnisse

54

Abbildung 10: E12 flag empty, 1 Wo in vivo Immunfluoreszenz für Nestin (N, Nes), Tubulin (T, Tub), GFAP (G), Dapi (D) sowie entsprechende



Ergebnisse

55

Abbildung 11: E12 flag empty, 2 Wo in vivo Immunfluoreszenz für Nestin (N, Nes), Tubulin (T, Tub), GFAP (G), Dapi (D) sowie entsprechende



Ergebnisse

56

Abbildung 12: E12 23kDa, 1 Wo in vivo Immunfluoreszenz für Nestin (N, Nes), Tubulin (T, Tub), GFAP (G), Dapi (D) sowie entsprechende

Doppelfärbungen. . Bild 2 zeigt jeweils eine Auschnittvergrößerung zu Bild 1, die Färbung ist zur besseren


Ergebnisse

57

Abbildung 13: E12 23kDa, 2 Wo in vivo Immunfluoreszenz für Nestin (N, Nes), Tubulin (T, Tub), GFAP (G), Dapi (D) sowie entsprechende



Ergebnisse

58

Abbildung 14: E12 naiv, TH Färbung nach 1 (TH1-4) und 2 Wo (TH5-8) in vivo Darstellung der TH-positiven Zellen in Transplantaten naiver transplantierter E12 Zellen. Die Zellen sind von recht

regelmäßiger Morphologie und weisen mehrere Zellausläufer auf.

Ergebnisse

59

Abbildung 15: E12 flag empty (fe) und flag 23kD (f23), TH-Färbung nach 1 (A/B) bzw.

2 Wo (C/D) in vivo Die nach Transplantation der mit FGF 23kD transfizierten Zellen darzustellenden TH-positiven Zellen in vivo

weisen eine gleichmäßigere Morphologie und mehr Zellausläufer auf als bei mit leerem Vektor transfizierten

transplantierten Zellen. FeB stellt einen vergrößerten Auschnitt aus feA dar.

Ergebnisse

60

4.2 Verhaltensstudien

4.2.1 Das Offenfeld

In diesem Szenario werden die Tiere im Hinblick auf ihr lokomotorisches und

Erkundungsverhalten evaluiert.

Die untersuchten Gruppen sind naive, sham-lädierte und mit 6-OHDA lädierte Tiere.

Es wird als erstes die gesamte von den Tieren zurückgelegte Wegstrecke betrachtet:

Hierbei ist zu sehen, dass die Gruppe der lädierten Tiere eine signifikant kürzere

Wegstrecke zurückgelegt hat als die Gruppe der Sham-lädierten (p=0,0010) und der

naiven Tiere (0,0025) (Abbildung 16). Dieses Ergebnis hat Einfluss auf die

Betrachtungsweise des Parameters Eintrittsfrequenz in die verschiedenen Zonen –

Zentrum, innen und außen: Da anzunehmen ist, dass die gelaufene Wegstrecke in

Zusammenhang mit der Häufigkeit des Eintritts steht, sind die Daten hier von 5

Minuten Versuchsdauer auf 1900 cm Wegstrecke umgerechnet und damit normiert

worden. Vergleicht man nun, sind für keine der drei Zonen – Zentrum, innen, außen

– signifikante Unterschiede in der Eintrittshäufigkeit für die drei Gruppen festzustellen

(Abbildung 17, Abbildung 18, Abbildung 19).

Abbildung 16: Gesamtwegstrecke im OF

Naiv Sham Läsion1500

2000

2500

3000

3500

4000

Gesam

tweg

str

ecke (

cm

)

Ergebnisse

61

Abbildung 17: Frequenz der Eintritte ins Zentrum im OF

Abbildung 18: Frequenz der Eintritte in die innere Zone im OF

Abbildung 19: Frequenz der Eintritte in die äußere Zone im OF

Ebenfalls keine signifikanten Unterschiede sind zu beobachten bei der gesamten

Aufenthaltsdauer der Tiere in den einzelnen Zonen (Abbildung 20, Abbildung 21,

Abbildung 22), dem Zeitpunkt des ersten Eintritts in die einzelnen Zonen, der

Naiv Sham Läsion0.0

2.5

5.0

7.5

Zentrum

Fre

qu

en

z


10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

Innen

Fre

qu

en

z


2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

Außen

Fre

qu

en

z

Ergebnisse

62

Häufigkeit und der gesamten Dauer des gezeigten Putzverhaltens (

Tabelle 2).

Abbildung 20: Aufenthaltsdauer im Zentrum im OF

Abbildung 21: Aufenthaltsdauer in der inneren Zone im OF

Abbildung 22: Aufenthaltsdauer in der äußeren Zone im OF

Naiv Sham Läsion

-5

0

5

10

15

20

25

Zentrum

Au

fen

thalt

sd

au

er

(s)

Naiv Sham Läsion0

10

20

30

40

50

Innen

Au

fen

thalt

sd

au

er

(s)

Naiv Sham Läsion225230235240245250255260265270275280285290295

Außen

Au

fen

thalt

sd

au

er

(s)

Ergebnisse

63

Tabelle 2: Putzverhalten im OF

Frequenz Dauer

Zentrum Innen Außen Zentrum Innen Außen

Naiv

0,14±0,38 0,29±0,49 2,43±1,13 0,0±0,0 0,0±0,0 13,86±12,63

Sham-

lädiert

0±0 0,44±0,73 3,44±2,40 0,0±0,0 0,0±0,0 15,67±18,21

Lädiert

0,2±0,45 0±0 4,80±2,17 1,2±2,68 0,0±0,0 22,2±8,53

Gezeigt wird der Mittelwert plus Standardabweichung ° = signifikant gegenüber Naiv, ^ = gegenüber Sham-Läsioniert *p < 0,05; **p < 0,005

Desweitern wurden die Häufigkeit des Aufrichtens und die gesamte Dauer des

Aufrichtens in den einzelnen Zonen dokumentiert: die lädierten Tiere haben sich

sowohl in der inneren wie auch in der äußeren Zone signifikant seltener (innen

p=0,0020, außen p=0,0029) und signifikant weniger lange (innen p=0,0092, außen

p=0,0025) aufgerichtet als die naiven Tiere.

Außerdem haben sich die lädierten Tiere in der äußeren Zone signifikant seltener

aufgerichtet als die Sham-lädierten Tiere (p=0,0029). Auch die Dauer des Aufrichtens

war bei den lädierten Tieren signifikant kürzer als die der Sham-lädierten Tiere, und

zwar sowohl in der inneren (p=0346) als auch in der äußeren Zone (p=0,0070)

(Tabelle 3).

Ergebnisse

64

Tabelle 3: Aufrichtungsverhalten im OF

Frequenz Dauer

Zentrum Innen Außen Zentrum Innen Außen

Naiv

8,00±3,46 37,14±7,19 0,71±0,95 5,71±2,43 86,00±25,59

Sham-

lädiert

4,55±3,81 32,22±5,58 0,22±0,44

2,66±4,00

°*

74,33±21,72

Lädiert

1,20±1,30

°*

17,40±10,35

°** / ^**

0,04±0,09

0,80±1,30

°*

34,80±19,81

°** / ^*

Gezeigt wird der Mittelwert plus Standardabweichung ° = signifikant gegenüber Naiv, ^ = gegenüber Sham-lädiert *p < 0,05; **p < 0,005

4.2.2 Das Elevated Plus-Maze

Im Elevated Plus-Maze werden die Tiere auf ihr Erkundungsverhalten evaluiert. Auch

hier umfassen die untersuchten Gruppen naive, Sham-lädierte und mit 6-OHDA

lädierte Tiere. Es wird auch hier zunächst die insgesamt auf dem EPM zurückgelegte

Wegstrecke betrachtet: Es kann kein signifikanter Unterschied zwischen den von den

drei Gruppen zurückgelegten Wegstrecken verzeichnet werden, folglich kann bei

dieser Evaluierung jegliche Normierung auf eine bestimmte Strecke entfallen

(Abbildung 23).

Ergebnisse

65

Abbildung 23: Gesamtwegstrecke im EPM

Bezüglich der Eintrittshäufigkeiten in die einzelnen Zonen (Abbildung 24, Abbildung

25, Abbildung 26) kann gesagt werden, dass die lädierten Tiere signifikant seltener in

die offenen Arme eingetreten sind als die naiven Tiere (p=0,0025). Die

Aufenthaltsdauer in den offenen Armen ist bei den lädierten Tieren ebenso signifikant

kürzer als bei den Naiven (p=0,0001) ebenso im Vergleich zu den Sham-lädierten

(p=0,0033) (Abbildung 27, Abbildung 28, Abbildung 29).

In den geschlossenen Armen stellt es sich umgekehrt dar: Hier ist die

Aufenthaltsdauer der Lädierten signifikant länger als die der Naiven (p=0,0001) und

der Sham-lädierten (p=0,0143) Betrachtet man die Zeitpunkte des ersten Eintritts in

die einzelnen Zonen können keinerlei signifikante Unterschiede zwischen den drei

Gruppen festgestellt werden (nicht dargestellt).

Naiv Sham Läsion1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

2750

Gesam

tweg

str

ecke (

cm

)

Ergebnisse

66

Abbildung 24 Frequenz der Eintritte ins Zentrum des EPM

Abbildung 25: Frequenz der Eintritte in die geschlossenen Arme des EPM

Abbildung 26: Frequenz der Eintritte in die offenen Arme des EPM

Naiv Sham Läsion0

10

20

30

Zentrum

Fre

qu

en

z

Naiv Sham Läsion0

5

10

15

20

Geschlossene Arme

Fre

qu

en

z


2.5

5.0

7.5

10.0

Offene Arme

Fre

qu

en

z

Ergebnisse

67

Abbildung 27: Aufenthaltsdauer im Zentrum des EPM

Abbildung 28: Aufenthaltsdauer in den geschlossenen Armen des EPM

Abbildung 29: Aufenthaltsdauer in den offenen Armen des EPM

Naiv Sham Läsion0

102030405060708090

100110120130140

Zentrum

Au

fen

thalt

sd

au

er

(s)

Naiv Sham Läsion90

110

130

150

170

190

210

230

°**

*̂

Geschlossene Arme

Au

fen

thalt

sd

au

er

(s)

Naiv Sham Läsion0

20

40

60

80

100

°***̂*

Offene Arme

Au

fen

thalt

sd

au

er

(s)

Ergebnisse

68

Beim Aufrichtungsverhalten sind signifikante Unterschiede nur im Zentrum zu

verzeichnen: die lädierten Tiere richten sich hier signifikant seltener auf als die

naiven (p=0,0277) und die Sham-lädierten Tiere (p=0,0440). Desweiteren ist die

gesamte Dauer des Aufrichtungsverhaltens im Zentrum in der Gruppe der lädierten

Tiere signifikant kürzer als in der Gruppe der Naiven (p<0,05) (Tabelle 4).

Tabelle 4: Aufrichtungsverhalten im EPM

Frequenz Dauer

Zentrum Geschlossen Offen Zentrum Geschlossen Offen

Naiv

4,29±4,11 17,14±4,74 0,43±0,53 3,29±3,45 28,00±8,76 0,00±0,00

Sham-

lädiert

2,22±1,99 16,00±6,75 0,11±0,33 1,00±2,29 26,22±842 0,00±0,00

Lädiert

0,20±0,45

°* / ^*

12,80±4,15 0,00±0,00

0,00±0,00

°*

23,80±13,50 0,00±0,00


Das Putzverhalten ist lediglich in den geschlossenen Armen unterschiedlich oft zu

beobachten: Die lädierten Tiere haben sich hier signifikant öfter geputzt als die

naiven und die Sham-lädierten Tiere (p=0,0189 bzw. p=0,0351) (Tabelle 5).

Ergebnisse

69

Tabelle 5: Putzverhalten im EPM

Frequenz Dauer


Naiv

0,14±0,38 1,71±1,38 0,00±0,00 0,00±0,00 7,71±8,08 0,00±0,00

Sham-

lädiert

0,00±0,00 2,44±1,81 0,00±0,00 0,00±0,00 13,33±20,85 0,00±0,00

Lädiert

0,00±0,00

5,80±3,56

°* / ^*

0,00±0,00 0,00±0,00 35,80±44,65 0,00±0,00


Die letzten erfassten Parameter sind die Häufigkeit und Dauer der Head-Dips (d. h.

die Ratten beugen sich über den Rand des EPM und schauen herab): Sowohl die

Frequenz als auch die Dauer der Head-Dips, die die lädierten Tiere auf den offenen

Armen gezeigt haben ist geringer als die der beiden anderen Gruppen. Die hier

ermittelten p-Werte waren für die Frequenz: Lädiert gegen Naiv p=0,0025; Lädiert

gegen Sham-lädiert p=0,0093; und für die Dauer: Lädiert gegen Naiv p=0,0073;

lädiert gegen Sham-lädiert p=0,0120 (Tabelle 6).

Ergebnisse

70

Tabelle 6: Head Dips im EPM

Frequenz Dauer


Naiv

5,00±1,63 0,14±0,38 12,26±4,96 10,43±5,47 0,14±0,38 21,74±11,25

Sham-

lädiert

5,55±4,39 0,11±0,33 9,66±2,87 10,55±10,36 0,04±0,13 13,68±6,24

Lädiert

3,60±2,07 0,40±0,55

2,40±1,81

°** / ^*

5,20±4,38 0,20±0,45

3,48±3,22

°* / ^*


Diskussion

71

5 Diskussion

5.1 Transplantationsversuche

Die Transplantation dopaminerger Neurone, die aus mesencephalen

Progenitorzellen gewonnen werden, ist Gegenstand zahlreicher Studien (LINDVALL

und BJÖRKLUND, 2004). Die geringen Überlebensraten der transplantierten Zellen

stellen nach wie vor ein gewichtiges Problem für die erfolgreiche Anwendung dieses

Konzepts dar (BRUNDIN et al., 2000). Die Supplementierung mit

Wachstumsfaktoren ist in vielerlei Art und Weise durchgeführt worden (MAYER et al.,

1992; TAKAYAMA et al., 1995, TIMMER et al., 2004), jedoch nicht mit ausreichend

zufriedenstellenden Ergebnissen.

Daher wurde in dieser Arbeit der Ansatz verfolgt, die zu transplantierenden Zellen mit

der Fähigkeit auszustatten, ihren eigenen Wachstumsfaktor vermehrt zu exprimieren

und somit das Überleben der Zellen in vivo zu verbessern. Nachdem von

CESNULEVICIUS et al. eine effektive Methode zur Transfektion von neuronalen

Progenitorzellen entwickelt (CESNULEVICIUS et al., 2006) und der prinzipielle

Beweis erbracht wurde, dass diese Zellen eine Transplantation überleben und TH-

positive Zellen in den Transplantaten nachgewiesen werden können, galt es nun hier

eine Strategie zu erarbeiten, neuronale Progenitorzellen unter Einbeziehung der

Transfektion derart zu kultivieren, dass sie anschließend erfolgreich transplantiert

werden können, diese in höherer Zahl überleben und dass eine größere Menge TH-

positiver Zellen in den Transplantaten nachweisbar ist.

Zu diesem Zweck wurden Zellen aus dem ventralen Mesencaphalon 12 Tage alter

Rattenembryonen mit Hilfe eines flag-tags mit einem Plasmid für FGF-2 23kDa bzw.

dem leeren Vektor transfiziert. Nach sechs Tagen Proliferation und vier Tagen

Differenzierung wurden diese Zellen in das unilateral durch 6-OHDA denervierte

Striatum adulter Ratten transplantiert.

Die vorliegende Arbeit hatte also zum Ziel, eine erste qualitative Analyse dieses

Ansatzes durchzuführen. Aus diesem Grund wurden die erlangten Transplantate vor

allem qualitativ hinsichtlich ihrer Zusammensetzung, der ausgelösten Immunreaktion

und ihrer morphologischen Integrität untersucht. Bei der Evaluation wurden

Diskussion

72

verschiedene Marker verschiedener Zelltypen auf ihr Vorkommen überprüft und

Zellzahlen semiquantitativ erfasst.

Die Ergebnisse dieser Versuche lassen drei zentrale Erkenntnisse zu:

Erstens, dass die transfiziert transplantierten Zellen in vivo schlechter überleben und

die Integration nicht so gut erfolgt wie bei nicht transfizierten Zellen, und zweitens

dass aber die Überexprimierung von FGF-2 im Gegensatz zum Nicht-Vorhandensein

einer Supplementierung bei leerem Vektor einen positiven Einfluss auf das

Überleben und die Qualität der überlebenden Zellen zu haben scheint. Drittens ist die

Anzahl der in vivo nachweisbaren TH-positiven Zellen sehr gering.

Im folgenden werden also alle Aspekte kritisch hinterleuchtet, die einen Einfluss auf

das erzielte Ergebnis haben können bzw. es wird diskutiert, an welchen Bereichen

das Vorgehen verändert werden könnte, um bessere Ergebnisse zu erzielen.

5.1.1 Einfluss der Transfektion

Die Nukleofektion stellt eine relativ neue Methode der Transfektion dar, die auf der

Elektroporation basiert und bei der mithilfe von Spannung und spezieller

Nukleofektor-Lösung die genetische Information in den Kern der Zielzelle

eingeschleust wird (GRESCH, 2004). Diese Methode wurde bereits erfolgreich für

zum Beispiel Zellen der hämatopoetischen Reihe (TROMPETER et al., 2003;

SCHOENBERG et al., 2008), Stammzellen (LAKSHIMIPATY et al., 2004; LORENZ

et al., 2004; ZARAGOSI et al., 2007) und auch für Neurone und neuronale

Stammzellen angewendet (GÄRTNER et al.; 2006, CESNULEVICIUS et al., 2006;

KERAVALA et al., 2008; DIETERLEN et al, 2009). In allen Fällen konnte gezeigt

werden, dass die Nukleofektion nicht zu einer Veränderung des Phänotyps der

Zellen führt, die Zellen weiter proliferiert werden können und die Fähigkeit zur

Differenzierung in alle möglichen Zelltypen in vitro erhalten bleibt. Dies lässt sich in

den hier durchgeführten Versuchen in vivo prinzipiell bestätigen, denn es können alle

zu erwartenden Zelltypen in den Transplantaten nachgewiesen werden und die

Differenzierung zu TH-positiven Neuronen ist möglich. Dennoch stellt sich die Frage,

ob und inwiefern die Transfektion auf die Mengen und die Verhältnisse der einzelnen

Zelltypen in vivo einen Einfluss hat.

Diskussion

73

Die Zellzusammensetzung in den Transplantaten mit naiv und transfiziert

transplantierten Zellen unterscheidet sich bezüglich der GFAP-positiven Zellen kaum.

Die Transfektion und die damit verbunden Behandlungsschritte scheinen die

Astrozytenreaktivität in den Implantaten nicht zu verändern (s. u.).

Bezüglich der Verteilung von Progenitorzellen in und um die Transplantate zeigen

sich beim Vergleich der transfiziert und nicht transfiziert transplantierten Zellen

allerdings Unterschiede. In den Transplantaten mit naiven transplantierten Zellen

sind insgesamt deutlich weniger Nestin-immunreaktive Zellen zu finden, und zum

ersten Kontrollzeitpunkt nach einer Woche sind Nestin-positive Zellen innerhalb der

Transplantate zu sehen. Dahingegen sind bei den transfizierten transplantierten

Zellen in den Transplantaten nach einer Woche so gut wie keine Nestin-positiven

Zellen zu finden, lediglich außen herum. Da der Nachweis des flag-tags in vivo nicht

gelungen ist, kann nicht differenziert werden, welche der Nestin-positiven Zellen aus

dem Transplantat stammen und welche vom Empfänger. Da reaktive Astrozyten

ebenfalls Nestin-immunreaktiv sind (CLARKE et al., 1994), ist es möglich, dass

einige der angefärbten Zellen also reaktive Astrozyten des Empfängers sind und

keine Vorläuferzellen aus dem Transplantat, und auch die genauere Interpretation

der Wirkung des vermehrt exprimierten FGF-2 bleibt spekulativ. Um die genauen

Verhältnisse der Zellen zueinander und ihre Zugehörigkeit abschließend zu bewerten

und somit auch den Einfluß des FGF-2 genauer abschätzen zu können, sind

Folgeversuche abzuwarten, in denen die Identifizierung der Spenderzellen in vivo

gelingt.

Auch die Morphologie und Verteilung der Neurone sowie die Intensität ihrer

Immunreaktivität für Tubulin ist in den verschiedenen Gruppen unterschiedlich: Die

Zellen mit der gleichmäßigsten Erscheinung sind in den untransfizierten

transplantierten Gruppen zu sehen, wohingegen die Neurone in den Transplantaten

der transfizierten transplantierten Zellen vor allem nach einer Woche deutlich

weniger gleichmäßig rundlich und groß sind. Somit scheint die Transfektion

zumindest in der ersten Woche nach der Transplantation einen negativen Einfluss –

sei es auf das Überleben oder auf die Ausdifferenzierung von Neuronen - zu haben.

Nach zwei Wochen allerdings ist das Erscheinungsbild der Neuronen für naiv und mit

Diskussion

74

flag23kDa transfiziert transplantierte Zellen sehr ähnlich. Auf den möglichen Einfluss

von FGF-2 wird im Folgenden noch eingegangen.

Die intracerebrale Transplantation von Zellen, die mit der Nukleofektion genetisch

modifiziert wurden, ist noch nicht oft durchgeführt worden. GEOFFRY et al konnten

nach der Transplantation proliferierter und differenzierter neuronaler Progenitorzellen

in vivo keine Neurone nachweisen (GEOFFRY et al., 2007). Dieterlen et al haben

humane neuronale Progenitorzellen in das intakte Rattenstriatum transplantiert,

haben allerdings keine Immunhistochemie für TH durchgeführt. Der Nachweis von

Ionen-Kanälen in den eGFP-positiven Zellen ist aber ein Hinweis auf deren

Überleben und neuronale Differenzierung (DIETERLEN et al., 2009).

Das in diesem Versuch durchgeführte in vitro Protokoll orientiert sich an den

Ergebnissen von TIMMER et al., 2006. Dort wurden mit einem Proliferationszeitraum

von sechs Tagen und einer Differenzierungszeit von vier Tagen für E12 Zellen die

besten Ergebnisse für das Überleben der dopaminergen Zellen in vivo und bezüglich

der funktionellen Verbesserung erzielt. Mit diesem Vorgehen konnten die Zellen

eines ventralen Mesencephalon eines Rattenembryos um das 40fache vermehrt

werden und die Kulturen enthielten 30% TH-positive Neurone, was 70% der Neurone

in Kultur darstellte. Als Zeitpunkt für die Transfektion wurde hier die Mitte der

Proliferationszeit festgelegt, und die Zeit in vitro nach der Transfektion wurde um

einen Tag Wiederanheftung ergänzt. Der Zeitraum für die Differenzierung wurde

auch deshalb gewählt, weil die Reifung der dopaminergen Zellen noch nicht so weit

fortgeschritten ist, dass bei der Verarbeitung der Zellen große Schäden an

Fortsätzen entstehen würden (TIMMER et al., 2006).

Als weitere Grundlage dienten die Versuche von CESNULEVICIUS, der den

prinzipiellen Beweis erbracht hat, dass mit Nucleofektion transfizierte

Progenitorzellen eine Transplantation überleben und TH ausprägen können

(CESNULEVICIUS et al., 2006). Jedoch waren die Zellen, die in diesem Fall

transplantiert wurden nicht differenziert und es wurde ein anderes Konstrukt

verwendet, peGFP-N2.

Diskussion

75

5.1.2 Einfluss von FGF-2

Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die mit der Transfektion und der damit

verbundenen Überexpression von FGF-2 erbrachten Ergebnisse hinsichtlich des

Überlebens und der Integration von Neuronen jedoch trotz des oben erklärten in vitro

Protokolls keine Verbesserung gegenüber den Ergebnissen mit naiven

transplantierten Zellen erbringen können, da das in vitro Intervall mit der Transfektion

einen zu negativen Einfluss auf das Überleben der Zellen hat.

Dennoch ist im Vergleich der mit FGF-2 transfizierten und der mit Kontrollvektor

transfizierten Zellen ein Unterschied auszumachen, der auf den Einfluss von FGF-2

zurückzuführen sein kann. Da die Rezeptoren für FGF-2 auch im 6-OHDA Modell

ausgeprägt werden (CLAUS et al., 2004), kann es seine Wirkung entfalten.

Das betrifft zum einen die (nicht weiter spezifizierten) Neuronen in den

Transplantaten. Die Tubulin-immunreaktiven Zellen erscheinen in den

Transplantaten der flag23kDa Gruppe regelmäßiger als in der flagempty Gruppe, ihre

Morphologie gleicht mehr der der umgebenden Zellen. Auch sind hier vor allem zum

ersten Kontrollzeitpunkt nach einer Woche deutlich mehr Tubulin-positive Zellen zu

sehen als in der flagempty Gruppe. Nach 2 Wochen stellen sich die Tubulin-

immunreaktiven Zellen in der Gruppe der flag23kDa ähnlich denen der naiv

transplantierten Gruppe dar: Die negativen Effekte, die die Transfektion und die

damit verbundenen Arbeitsschritte auf die Entwicklung der Neurone haben, scheint

also durch die Wirkung des FGF-2 relativiert zu werden.

Zum anderen ist die Anzahl (soweit hier zu beurteilen) und die Morphologie der TH-

positiven Zellen in den beiden Gruppen mit transfizierten Zellen unterschiedlich. In

der flag23kDa Gruppe sind mehr TH-positive Zellen zu sehen als in der flag empty

Gruppe, und auch das Erscheinungsbild der Zellen ist gleichmäßiger, es

unterscheidet sich weniger von der üblichen Morphologie TH-positiver Zellen. Auch

in dieser Hinsicht scheint also die Überexprimierung des Wachstumsfaktors seinen

positiven Einfluss zu bestätigen.

Diese Ergebnisse ergänzen die einer vorangehenden Studie, wo das FGF-2 über co-

transplantierte Schwann-Zellen supplementiert wurde und der Nachweis erbracht

wurde, dass HMW-FGF-2 einen signifikant positiven Einfluss auf das Überleben

Diskussion

76

dopaminerger Zellen, die Reinnervation und auch auf die funktionelle Regeneration

nach intrastriataler Transplantation mesencephaler dopaminerger Neurone hat

(TIMMER et al. 2004). Bereits vorher wurden die positiven Effekte von FGF-2 für die

Zellkultur gezeigt, auch hier konnten u.a. die Neuritenbildung verbessert werden

(GROTHE et al., 2000).

Aufgrund der angesprochenen vorangehenden Studien erschien es plausibel, den

Ansatz der Co-Transplantation weiterzuentwickeln, um die positiven Wirkungen von

FGF-2 noch effektiver nutzen zu können. Eine Co-Transplantation hat die Nachteile,

dass aufgrund zweier Kulturen mehr Arbeitsschritte entstehen, und die zweite Zellart

einen weiteren sowohl mechanischen als auch immunogenen Reiz setzt. Außerdem

lässt sich aus oben genannten Versuchen schlussfolgern, dass enge Zell-Zell

Kontakte nötig sind, um die bestmöglichen Ergebnisse zu erzielen (TIMMER et al.,

2004). Also kann angenommen werden, dass die selbständige Produktion des

Wachstumsfaktors durch die Spenderzellen von Vorteil ist, da in diesem Fall keine

räumliche und zeitliche Trennung der transplantierten Zellen und des

Wachstumsfaktors anfällt. Es hat sich jedoch gezeigt, dass bei dem hier

angewandten Protokoll die negativen Einflüsse, die die Bearbeitung der Zellen für

eine Transfektion hat, die positiven Effekte von FGF-2 überwiegen.

In einer vergleichbaren Studie von O´SULLIVAN et al. (O´SULLIVAN et al., 2010)

wurden andere Beobachtungen gemacht. Auch hier konnten zwar nicht signifikant

mehr TH-positive Neurone in intrastriatalen Transplantaten nachgewiesen werden,

die aus (in diesem Fall mit GDF5 – Growth/Differentiation Factor 5) transfiziert

transplantierten Zellen bestanden als bei solchen mit frischen E14 Zellen. Allerdings

war die Anzahl TH-positiver Zellen auch bei Sham-transfiziert transplantierten Zellen

nicht signifikant anders. Hier hat also die Transfektion zwar keinen negativen Einfluss

auf das Geschehen, die Expression des Wachstumsfaktors allerdings auch keinen

positiven. Da in dieser Studie lediglich eine in vitro Phase von je einem Tag vor und

nach der Transfektion eingeplant wurde, ist zu bedenken, ob das von uns angesetzte

in vitro Intervall vielleicht zu lang ist. Da aber zumindest ohne Transfektion dieses in

vitro-Intervall in vorangegangenen Studien (TIMMER et al, 2006) für die von uns

untersuchten Zellen als sinnvoll erarbeitet wurde und die Studie von O´Sullivan sich

Diskussion

77

noch in vielen anderen methodischen Punkten, zum Beispiel auch in der

Transfektionsmethode, unterscheidet, ist ein direkter Vergleich nicht möglich.

5.1.3 Astrozytäre Reaktion

Anhand des Markers GFAP kann eine deutliche astrogliale Reaktion im Bereich der

Transplantate erkannt werden: GFAP ist ein Marker für Zellen der astroglialen Reihe,

es gehört zur Zytoskelett-Protein-Familie und soll mitverantwortlich sein für die

Modulierung der Astrozytenbeweglichkeit und deren Form (ENG et al, 2000). Die

vermehrte Infiltration von Astrozyten in ein Gewebe ist ein zuverlässiger Marker für

ein Trauma und andere stressauslösende Situationen. Als Reaktion auf ein Trauma

werden Astrozyten, die als ubiquitäre Glia alle zellulären Komponenten des ZNS

umgeben, reaktiv, eine verstärkte Synthese des intermediären Filaments GFAP führt

zu einer verstärkten Anfärbbarkeit der Zellen und sie werden hypertroph und

hyperplastisch (ENG et al., 2000). Diese Phänomene können um sämtliche

Transplantate herum beobachtet werden.

Es wurde beschrieben, dass die demarkierende Funktion der Astrozyten einen

negativen Einfluss auf die Regeneration neuronaler Axone hat (SOFRONIEW, 2005),

und dass das Maß der glialen Reaktion mit der Anzahl der überlebenden Zellen im

Transplantat korreliert (BARTLETT et al., 2004). Jedoch haben BRANDIS et al 1998

gezeigt, dass für dieses Modell und die von uns angewandte Transplantationstechnik

der Microtransplantation keine Immunsuppresion nötig ist, da die entstehende

immunologische Reaktion eine untergeordnete Rolle für das Überleben der Zellen in

den Transplantaten spielt.

Wie schon erwähnt, kommt es in allen experimentellen Gruppen zu einer Astrozytose

im Bereich der Transplantate, die je nach einer Woche stärker ist als nach zwei

Wochen und sich in ihrer Ausprägung kaum unterscheidet. Die für uns

entscheidende Frage, ob der veränderte in vitro Intervall mit der Transfektion eine

Verstärkung der astrozytären Reaktion hervorruft kann also mit nein beantwortet

werden. Das flag-tag hat eine sehr geringe Größe und weist eine sehr geringe

Immunogenität auf (TERPE, 2003).

Interessant ist dies vor dem Hintergrund, dass FGF-2, welches in der flag23kDa

Diskussion

78

Gruppe überexprimiert sein sollte, offenbar keinen Einfluss auf die gliale Rektion

nimmt. Dies steht im Gegensatz zu anderen Veröffentlichungen, die zeigen, dass

FGF-2 eine verstärkende Wirkung auf die GFAP-Immunreaktivität im ZNS bzw. in

intrastriatalen Transplantaten hat (ZENG et al., 1996; GODDARD, 2002).

5.1.4 Nachweisbarkeit des flag-tags – Immunhistochemie

Flag ist ein Fusions-Tag, also eine Kennzeichnung für ein Protein, um es nachweisen

zu können. Es besteht aus 8 Aminosäuren (AS) und wurde ursprünglich für die

Immunaffinitätschomatographie entwickelt, um Proteine aufzureinigen (EINHAUER,

2001; TERPE, 2003). Es ist sehr klein und gilt daher als sehr wenig immunogen und

soll die Tertiärstruktur und die biologische Aktivität der angehängten Proteine sehr

wenig beeinflussen (EINHAUER, 2001; TERPE, 2003). Es wurden verschiedene

monoklonale Antikörper gegen das Protein entwickelt, so M1, M2 und M5. In diesem

Versuch wurde 3xflag verwendet, eine Weiterentwicklung des normalen flag-tags: es

besteht aus 22 AS und zeichnet sich durch bessere Nachweisbarkeit aus (ZHANG,

2001; TERPE, 2003). Als Antiköper wurde M2 verwendet, er ist für übliche

immunologische Methoden geeignet.

Über die Anwendung des flag-tags in vivo ist bisher relativ wenig Information

vorhanden (TERPE, 2003, LOBBESTAEL, 2010). SHEVTSOVA et al. haben

verschiedene gebräuchliche tags in verschiedenen Gehirnregionen

immunhistochemisch nachgewiesen und für das flag-tag in Kombination mit dem M2

Antikörper eine relativ starke Hintergrundfärbung festgestellt, die sich im Verhältnis

zum Hauptsignal auch durch Verdünnen des Antikörpers nicht verbessern ließ

(SHEVTSOVA et al., 2006). Erst kürzlich haben LOBBESTAEL et al. eine Studie

veröffentlicht, in der sie einige kommerziell erhältliche und gebräuchliche tags im

Gehirn immunhistochemisch nachgewiesen haben und ihre Sensitivität und Spezifität

verglichen haben. Es zeigte sich, dass fast alle untersuchten Antigen-Antikörper-

Kombinationen einschließlich derer für das flag und 3xflag für die Anwendung an

Gehirnschnitten gut geeignet sind (LOBBESTAEL, 2010). Es wurde aber auch zu

bedenken gegeben, dass – vor allem da es eine unendliche Anzahl an Möglichkeiten

der tag-Antikörper-Kombinationen gibt – die richtige Kombination für jedes tag und

Diskussion

79

jede Anwendung eine andere sein kann. Die in jenem Experiment angewandte

Methodik unterscheidet sich in einigen Punkten von dem hier angewandten System,

beispielsweise enthalten unsere Puffer immer zu einem gewissen Prozentsatz BSA,

bei LOBBESTAEL et al. wird ausschließlich NSG verwendet. Auch die

Antikörperkonzentration ist bei uns zehn mal höher (1:500 – 1:5000). Bereits diese

Punkte könnten für das Nicht-Gelingen der Färbung verantwortlich zeichnen, immer

gesetzt den Fall, das tag wird in vivo überhaupt exprimiert. SHEVTSOVA et al.

verwenden in ihren Puffern ebenfalls NGS, daher sollte die Anwendung dieses

Serums im Blocking Puffer zukünftig geprüft werden. Auch die Cryoprotektion des

Materials erfolgt bei SHEVTSOVA anders: lediglich 30% Glukose kommen zum

Einsatz, im Gegensatz zur hiesigen Anwendung von Glukose und Anti-Freeze

Medium. Das darin enthaltene Glycerin und Ethylenglykol könnte eine negative

Wirkung auf die Anfärbbarkeit des flag-tags haben.

Auch bezüglich der Divergenzen in den Ausprägungen der Tubulin und TH-

Färbungen ist die Methodik kritisch zu hinterleuchten. Insbesondere Fixations- und

Verarbeitungsschritte, denen das zu untersuchende Material unterzogen wird, haben

Einfluss auf die immunhistochemische Anfärbbarkeit (FRITSHY; 2008), so z.B. Art

des Fixationsmittels, Fixationsprozess, Postfixierung, Frostschutz, Einfrieren von

Schnitten, Schneiden des Materials u.v.m.. Hier sind vor allem individuelle Variablen

zu hinterfragen, wie zum Beispiel der für Fehler sehr anfällige Fixationsprozess: Bei

einer vaskulären Perfusion beeinflusst der physiologische Zustand des Versuchstiers

den vaskulären Durchfluss und damit die Geschwindigkeit und Stärke der Fixierung,

was wiederum die Stärke und Spezifität der Färbung beeinflusst (FRITSCHY, 2008).

So ist bei zukünftigen Versuchen also darauf zu achten, neben allen möglichen

Variablen im Prozess vor allem die physiologischen Variablen des Einzeltiers so gut

als möglich zu minimieren.

5.1.5 Ausblick

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das hier durchgeführte in vitro-

Intervall mit der Transfektion ungeeignet ist. In Zukunft müssen weitere

Kombinationen von Proliferations- und Differenzierungsphasen auf ihre Eignung

Diskussion

80

untersucht werde. Zur Verbesserung der Widerstandsfähigkeit der Zellen wäre zum

Beispiel eine weitere Supplementierung mit Wachstumsfaktoren in vitro denkbar:

eine Kombination aus FGF-2, FGF-8 und Shh (Sonic-hedgehog-factor) hat

beispielsweise zu einer verbesserten TH-Expression bei mit Lipofektion transfizierten

Progenitorzellen in vitro geführt (PARISH et al., 2008). Auch in vivo konnten TH-

positive Zellen nachgewiesen werden. Die Menge an zugesetztem FGF-2 braucht

allerdings nicht erhöht zu werden, auch 40 oder 80ng/ml bringen keinen Vorteil

gegenüber 20ng/ml (JENSEN et al., 2007). Auch eine Veränderung des

Sauerstoffgehalts in der Zellkultur (STUDER et al., 2000; JENSEN et al., 2011)

könnte als weitere Möglichkeit in Betracht gezogen werden.

Bereits TIMMER et al. haben festgestellt, dass das Ablösen der Zellen einen sehr

kritischen Teil der in vitro Phase darstellt und versucht werden muss, den dadurch

entstehenden Schaden geringer zu halten. (TIMMER et al., 2006).

Basierend auf den in der vorliegenden Arbeit erzielten Erkenntnissen wurde am

Institut für Neuroanatomie das in vitro Protokoll weiterentwickelt, was zu sehr guten

in vivo Befunden nach Transplantation führte (RATZKA et al., 2011).

Desweiteren muss die Darstellbarkeit der transplantierten Zellen in vivo erreicht

werden, um den Ursprung und damit die Bedeutung der vorhandenen Zelltypen

besser bewerten zu können. Als Alternative zu flag könnte beispielsweise GFP

(grünes fluoreszierendes Protein) gewählt werden, welches auch bei

CESNULEVICIUS et al zum Einsatz kam.

In der auf dieser Arbeit basierenden Folgestudie konnten die transplantierten Zellen

auf Grund ihres fluoreszierenden Transkripts sehr effizient dargestellt werden

(RATZKA et al., 2011).

5.2 Verhaltensstudien

Der zweite Fragestellung, die mit dieser Arbeit verfolgt werden sollte, ist die

Evaluierung des 6-OHDA Modells hinsichtlich explorativen und Angst-assoziierten

Verhaltens: Da neben motorischen auch nicht-motorische Symptome in den Komplex

des M. Parkinson fallen, wollten wir darstellen, ob das hier angewandte Modell

Diskussion

81

diesbezüglich Informationen bietet und wie diese im Zusammenhang mit

regenerativen Therapieansätzen von Nutzen sein können.

Dafür wurden naive, Sham-lädierte und 6-OHDA-lädierte Tiere im Offenfeld und im

Elevated Plus-Maze beobachtet und ihr exploratives und Angst-assoziiertes

Verhalten untersucht.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Läsion mit 6-OHDA sowohl das

explorative als auch das Angst-assoziierte Verhalten beeinflusst und zwar

dahingehend, dass das explorative vermindert und das Angst-assoziierte Verhalten

aber vermehrt gezeigt wird.

Im OF wird das explorative Verhalten sowie das Angst-assoziierte Verhalten der

Versuchstiere, in unserem Fall Ratten, untersucht:

Der alleinige Aufenthalt in der Versuchsanordnung sowie die Agarophobie der Ratte

(natürliche Angst vor offenen Arealen) triggern Angst-assoziiertes Verhalten per se

(PRUT und BELZUNG, 2003) und es sollte hier untersucht werden, ob die Läsion mit

6-OHDA anxiolytische oder anxiogene Effekte hat.

Zum einen legten die lädierten Tiere eine kürzere Wegstrecke zurück als die naiven

und die Sham-lädierten Tiere – die horizontale Aktivität ist also reduziert. Zudem ist

das vertikale Verhalten – also das Aufrichtungsverhalten – im Vergleich zu den

naiven Tieren im inneren sowie im äußeren Bereich reduziert. Die gesamte

Aufenthaltsdauer in den einzelnen Zonen ist jedoch in den verschiedenen Gruppen

nicht signifikant unterschiedlich. Hieraus lässt sich ableiten, dass das explorative

Verhalten der lädierten Ratten reduziert ist, möglicherweise aufgrund von erhöhter

Angst oder aber aufgrund von Apathie.

Im EPM wird vor allem das Angst-assoziierte Verhalten der Ratten untersucht.

Normalerweise meiden Ratten die offenen Arme des EPM: der offene Raum und die

nicht vorhandene Möglichkeit zur Thigmotaxis (Orientierung aufgrund von Tastreizen

an den Wänden) auf den offenen Armen sind die anxiogenen Stimuli und

anxiolytische Medikation führt zu einer längeren Aufenthaltsdauer der Tiere auf den

offenen Armen (TREIT et al., 1993). Die Frequenz der Eintritte in die offenen Arme

sowie die gesamte dort verbrachte Zeit gilt als Maß für Angst, während die totale

Anzahl der Eintritte in die verschiedenen Zonen eher ein Maß für die Aktivität der

Diskussion

82

Tiere darstellt. In unseren Experimenten konnte eine Steigerung der Angst vor den

offenen Armen bei den lädierten Tieren beobachtet werden, und zwar vor allem

anhand der signifikant selteneren und kürzeren Aufenthalte dieser Tiere in den

offenen Armen im Vergleich mit den anderen Gruppen. Komfortverhalten – also

Putzen – wurde von den lädierten Tieren in den geschlossenen Armen öfter gezeigt,

Aufrichtungsverhalten im Zentrum des EPM dagegen seltener. Auch die

sogenannten Head-Dips als Zeichen für geringeres Angst-Niveau wurden von den

lädierten Tieren signifikant seltener gezeigt. Insgesamt zeigten die lädierten Tiere

also auch im EPM ein deutlicheres Angst-assoziiertes Verhalten als nicht oder

Sham-lädierte Tiere.

Bei an M. Parkinson erkrankten Menschen ist das Auftreten nicht-motorischer

Symptome immer vor dem Einsetzen motorischer Defizite zu beobachten. Die

Prodromalphase wird mit bis zu 7 Jahren angenommen, in denen sich bereits

Symptome wie Apathie, Depressionen, Angstzustände und Schlafstörungen zeigen

können (WOLTERS, 2008, RODRIGUEZ-OROZ et al., 2009). Dies kann auch

histopathologisch dargestellt werden durch das Auftreten von Lewy-Körperchen in

Arealen, die mit diesen Verhaltensdefiziten in Verbindung stehen: So können Lewy-

Körperchen zuerst nachgewiesen werden im Tuberculum olfactorium, dem Nucleus

olfactorius anterior, der Medulla oblongata und dem Tegmentum pontis. Erst danach

treten sie in der Sn, der VTA und dem Nucleus basalis auf. Zum Schluss dann im

Neocortex (WOLTERS, 2007). Unter den zuerst betroffenen Strukturen befinden sich

auch die serotonergen Raphekerne sowie der noradrenerge Locus ceruleus

(FULCERI et al., 2006; AARSLAND et al., 2009). Eine Desintegration dieser beiden

Gebiete, die als Teil des Brain stem sensory relay center für die Modulation von

Gemütszustand und Affektion zuständig sind, führt zum Auftreten von Depression

und Angst beim Menschen (WOLTERS; 2007, WALSH und BEENNETT, 2001).

Bezüglich des Auftretens von Angst und Depression beim an M. Parkinson

erkrankten Menschen wurde außerdem festgestellt, dass sich hinsichtlich der

Schädigung der Untergruppen der DA Neurone Unterschiede darstellen lassen im

Vergleich mit Erkrankten ohne diese Symptome: Bei Menschen mit Angst und

Depression sind neben den A9 Neuronen in der S.n. vermehrt auch die A10 Neurone

Diskussion

83

der VTA (s.u.) betroffen, was bei Erkrankten ohne diese Symptome weniger der Fall

ist (WOLTERS und FRANCOT, 1998).

Für das Auftreten von Angstzuständen beim Menschen wird zudem auch immer der

psychosoziale Stress der Erkrankung an sich in Betracht gezogen (WALSH und

BENNETT, 2001) - dies lässt sich jedoch auf das Modell nicht übertragen.

Für Depressionen und Apathie beim Parkinson Patienten wird also angenommen,

dass sie u.a. in Verbindung stehen mit dopaminerger Denervation des ventralen

Striatums und des mesolimbischen Sytems (Rodriguez-Oroz et al., 2009). Dies wird

erhärtet durch die Tatsache, dass diese Symptome sich mit dopaminerger Therapie

verbessern lassen können.

Bezüglich der Frage nach Verhaltensaspekten im hier angewandten Modell sind

folglich die DA Neurone und ihre Projektionen genauer zu betrachten. Diese werden

im Folgenden klassifiziert als das mesostriatale und das mesolimbocorticale System

(SCHWARTING und HUSTON, 1996). Ersteres stellt die Verbindung zwischen den

mesencephalen dopaminergen Neuronen der S.n. (A9 Neurone) zum dorsalen

Striatum (dorsaler Teil) und der VTA (A10 Neurone) zum ventralen Striatum

(ventraler Teil), welches u.a. den Ncl. accumbens einschließt. Zweiteres verbindet

die VTA (und die mediale S.n.) mit limbischen und corticalen Systemen, u.a. die

Amygdala und den präfrontalen Cortex.

Die Verbindungen zwischen den mesencephalen Zellen und ihren Zielgebieten

stellen den nigrostriatalen Pfad und das MFB dar.

Das mesostriatale System hat vornehmlich, aber nicht ausschließlich, Bedeutung für

motorische Abläufe, wohingegen das mesolimbocorticale System durch seine

Verbindungen zu limbischen Strukturen bedeutsam für Verhaltensaspekte ist.

Für das Auftreten von Angst-assoziiertem Verhalten im hier angewendeten 6-OHDA-

Modell der Ratte gibt es also– wie auch für das Auftreten von Angststörung beim an

M. Parkinson erkrankten Menschen – verschiedene Erklärungsmöglichkeiten. Im

Modell wird, wie bereits erwähnt, das Toxin 6-OHDA in das MFB injiziert. Mit der

Injektion ins MFB können die besten Ergebnisse bezüglich einer kompletten

Denervation des Striatums erzielt werden (SCHWARTING und HUSTON, 1996).

Jedoch werden bei dieser Methode auch die DA Neurone der VTA (A10) erreicht und

Diskussion

84

werden in dieser Region ebenfalls zerstört, da die von der VTA kommenden Axone

im MFB mit wandern. Dies hat wiederum zur Folge, dass das der ventrale Teil des

mesostriatalen und das mesolimbocorticale System mit beeinträchtig werden.

Aufgrund dieser Tatsache kann sich erklären, dass in dem von uns angewandten

Modell nicht nur motorische Symptome auszulösen sind, sondern auch Symptome,

die emotionale und Verhaltensänderungen beinhalten.

Das vermehrte Angst-assoziierte Verhalten kann also zum einen durch ein Dopamin-

Defizit selbst hervorgerufen werden:

Werden bei der Läsion im hier angewandten Modell die dopaminergen Neurone der

VTA mit betroffen, verändert sich (u.a.) deren Einfluß auf den L.c., ein noradrenerges

Kerngebiet in der Formatio reticularis: Ein Teil der Afferenzen des L.c., die von der

VTA kommen, sind dopaminerg (ORNSTEIN et al., 1987), und wirken über D2-artige

Rezeptoren am L.c. (YOKOYAMA et al., 1994). Bei einer selektiven Läsion der VTA

konnte nachgewiesen werden, dass die Aufhebung des inhibitorischen Einflusses der

VTA auf den L.c. dessen Aktivität um 33% steigert (GUIARD et al., 2008). Der L.c.,

der auch in Verbindung zum limbischen System steht, ist als eine Art Alarmsystem

bei Stresssituationen gesteigert aktiv und führt zu Angstempfinden und auch

Tachykardie. Wird also im hier angewandten Modell die Feuerrate des L.c. erhöht,

lässt sich hierdurch das vermehrte Angst-assoziierte Verhalten erklären. Diese

Erklärung deckt sich mit Beobachtungen, die beim Menschen gemacht wurden: Bei

M. Parkinson kommt es – wie bereits erwähnt schon im frühen Stadium der

Erkrankung und vor dem Auftreten motorischer Symptome – ebenfalls zu einem

Dopamindefizit im Lc, und damit möglicherweise zum vermehrten Auftreten von

Angstgefühlen (WALSH und BENNETT, 2001). Ebenfalls passend ist die bereits

erwähnte Beobachtung, dass bei Patienten mit Angst und Depressionen die A10

Neurone der VTA vermehrt betroffen sind (WOLTERS und FRANCOT, 1998).

Desweiteren wird im Modell über die Depletion der DA Neurone der VTA und dem

damit einhergehenden DA Defizit deren Verbindung zum Nucl. acc. beeinflusst, bzw.

auch im Ncl. acc. selbst werden die DA Neurone beeinflusst: Der Ncl. acc., der zum

ventralen Striatum gezählt wird, kann auch schon als Teil des limbischen Systems

betrachtet werden und steht in Verbindung zu weiteren Regionen, die zum

Diskussion

85

limbischen System gezählt werden (KANDEL et al., 2000). Er spielt demnach eine

Rolle bei Emotionen und bei der Umsetzung von Motivation in Aktion bzw. Emotion in

Lokomotion (TREPEL, 2008). Hierüber ließe sich also nicht nur das Auftreten von

Angst-assoziiertem Verhalten erklären, auch die verminderte Lokomotion

(ausgedrückt durch eine kürzere zurückgelegte Wegstrecke im OF durch die

lädierten Ratten) und die verminderte vertikale Aktivität (Aufrichtungsverhalten)

scheint hierdurch erklärbar, sei es, dass die Motivation zur Aktion herabgesetzt ist

oder dass die veränderte Emotion das Lokomotionsverhalten verändert.

Zudem stellt sich die Frage, welche außer dopaminerger Zellen durch das Toxin im

hier angewandten Modell noch beeinflusst werden können.

In 6-OHDA Modellen können – je nach genauer Ausführung - Veränderungen in

verschiedensten Transmittersystemen festgestellt werden: Noradrenalin wird in

vielen Regionen reduziert (aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit der Catecholamine

können noradrenerge Zellen 6-OHDA ebenfalls aufnehmen) (FULCERI, 2006), die

GABA-ergen Mechanismen werden in der zur Läsion ipsilateralen Hälfte eher

gesteigert, in der contralateralen herabgesetzt. Auch der Serotonin- und der ACh-

Stoffwechsel wird zum Teil beeinflusst (SCHWARTING und HUSTON, 1996). Diese

Beobachtungen passen zu denen bei an M. Parkinson erkrankten Menschen: im

PET-Scan ist ein Verlust in noradrenergen, serotonergen und cholinergen

Transmittersystemen nachzuweisen (WOLTERS, 2007).

In der hier ausgeführten Art des Modells mit Injektion des Toxins in das MFB werden

das dopaminerge und das noradrenerge System in jedem Fall beeinflusst

(SCHWARTING und HUSTON, 1996), eine Beeinflussung der anderen Systeme ist

anzunehmen. Diese unspezifischen Schäden am serotonergen und noradrenergen

System können ebenfalls für gesteigertes Angst-assoziiertes Verhalten

verantwortlich sein.

Die herabgesetzte motorische Aktivität im OF ist einerseits durch die oben

genannten Mechanismen zu erklären. Ein weiterer Punkt, den es diesbezüglich zu

vergleichen gilt ist die beim Menschen zu beobachtende Apathie (RODRIGUEZ-

OROZ, 2009): Sie ist eins der initialen Symptome bei M. Parkinson und wird bei 27%

der Patienten beobachtet. So kann man annehmen, dass auch im Modell eine

Diskussion

86

gewisse Apathie gezeigt wird, möglicherweise in verminderter Bewegung und

Exploration der Umgebung. Die als Gründe für Depression und Apathie von

RODRIGUEZ-OROZ et al., 2009 angeführten Veränderungen sind ventrale striatale

und mesolimbische Denervation, Veränderungen im noradrenergen Stoffwechsel

sowie striatale Dopamindefizite. Da diese Veränderungen auch in unserem Modell

anzutreffen sind erscheint das Auftreten von Apathie also durch solche

Veränderungen möglich. Der mögliche Einfluß des Ncl. acc. wurde ja bereits im

vorherigen Abschnitt erläutert.

Vergleicht man die hier erzielten Ergebnisse mit denen anderer Gruppen, die

ähnliche Fragestellungen bearbeitet haben, so lassen sich Unterschiede feststellen,

die sich überwiegend mit unterschiedlicher Methodik erklären lassen.

BRANCHI et al. haben 2008 das Modell wiederholt über 12 Wochen nach der Läsion

in Verhaltensversuchen untersucht. Jedoch handelte es sich hier um ein 6-OHDA

Modell für die frühe Phase von M. Parkinson, bei dem die Läsion bilateral in das

dorsale Striatum erfolgte. Fünf Wochen nach Läsion hielten die lädierten Tiere sich

länger auf den offenen Armen des EPM auf als die Sham-lädierten. Außerdem

zeigten sie mehr Head-Dips. Im Gegensatz zu unserem Experiment, bei dem nur

vollständig lädierte Tiere einbezogen wurden und wo wie bereits diskutiert nicht nur

dopaminerge Zellen von der Läsion betroffen sind, waren bei BRANCHI et al. nur

dopaminerge Neurone und von diesen auch nicht alle zerstört. Das Modell spiegelt

daher auch nur den motorischen Aspekt der frühen Veränderungen des M. Parkinson

wieder.

Kuan et al. haben 2008 mit einem Modell für Levodopa induzierte Dyskinesien (LID)

gearbeitet: Diese Tiere wurden unilateral in das MFB lädiert und anschließend mit L-

Dopa behandelt um LIDs zu induzieren. Für diese Tiere wurde bereits vor der Läsion

ein Angst-Grundwert ermittelt, der dann zur Gruppeneinteilung führte: Wie in unseren

Versuchen war die Aufenthaltsdauer im Zentrum sowie die Latenz zum Eintritt in

einen der offenen Arme durch die Läsion nicht beeinflusst. Die hier als Gruppe mit

hohem Angst-Niveau geführten Tiere hielten sich signifikant kürzer in den offenen

Armen auf als in den geschlossenen. Beachten muss man im Vergleich jedoch hier,

dass die Gruppe der als mit niedrigem Angst-Niveau eingestuften Tiere sich etwas

Diskussion

87

anders darstellt: zwar verbrachten diese Tiere signifikant mehr Zeit in den

geschlossenen Armen als vor der Läsion, jedoch war die Aufenthaltsdauer in den

offenen Armen zu beiden Zeitpunkten nicht signifikant verschieden. Die Tatsache,

dass es Tiere mit höheren bzw. niedrigerem Angst-Niveau gibt deckt sich mit der

Tatsache, dass auch bei an M. Parkinson erkrankten Menschen nur 40% der

Patienten manifeste Angst-Symptome aufweisen (WALSH und BENNETT, 2001).

Hier sind jedoch unterschiedliche Ausprägungen und Stadien der Erkrankung als

Ursache anzunehmen, wohingegen im Modell, wo alle Tiere gleich geschädigt sein

sollten, diese Erklärung nicht ausreichend erscheint. Es muss also hier eine bereits

vor der Erstellung des Modells vorliegende Diskrepanz auch nach der Läsion einen

Unterschied bewirken.

Anders als bei unseren Versuchen konnten KUAN et al. für das OF keine

signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen feststellen. Es wurde allerdings

auch der von uns differenziert betrachtete Parameter des Aufrichtens nicht für die

einzelnen Zonen erfasst, so dass ein direkter Vergleich nicht möglich ist. Auch die

insgesamt zurückgelegte Wegstrecke, die für die lädierten Tiere in unserem Versuch

kürzer war, wurde nicht dokumentiert. Eine weitere Studie, die auch mit einer

unvollständigen, bilateralen 6-OHDA Läsion gearbeitet hat, hat wie wir eine

verminderte Eintrittshäufigkeit und –dauer in den offenen Armen festgestellt

(TADAIESKY et al., 2008). Die Läsion wurde hier im ventralen Striatum gesetzt und

führte zu einer unvollständigen Läsion der striatalen dopaminergen Neurone (55%).

Dies lässt (in Deckung mit bereits oben beschrieben Zuständen) darauf schließen,

dass das ventrale Striatum für das Auslösen verstärkten Angst-assoziierten

Verhaltens eine Rolle spielt, da auch schon die partielle Läsion zu Unterschieden

führt: Das ventrale Striatum erhält seine Afferenzen aus dem dorsalen Teil der Sn

und der VTA, und deren weitere Projektionen gehören zum mesocorticolimbischen

System (SCHWARTING und HUSTON, 1996, WOLTERS und FRANCOT, 1998,

JOEL und WEINER, 2000). Es lässt sich also folgern, dass in der Tat wie bereits

diskutiert dieser Teil des Systems für derartige Verhaltensveränderungen

verantwortlich zeichnet.

Auch zu diesen Schlussfolgerungen passend ist, dass TADAIESKY et al., 2008 im

Diskussion

88

Gegensatz zu uns keine Veränderungen im OF feststellen konnten. Der Einfluss der

Läsion auf das motorische System war offenbar noch nicht so weitreichend, dass

sich dies im Maß der lokomotorischen Aktivität im OF widerspiegeln hätte können.

Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass all diese Studien verdeutlichen, dass

die Entstehung von Angst-assoziiertem Verhalten und Veränderungen im

lokomotorischen und explorativen Verhalten ein komplexes Geschehen ist, welches

durch die verschiedenen Unterregionen im Bereich des Striatums und der anderen

BG beeinflusst wird und alle in dieser Region vorhandenen Zelltypen und die durch

die Erkrankung / das Modell hervorgerufenen Veränderungen in ihren Abstufungen

von Bedeutung sind. Bedacht werden muss in jedem Fall immer, dass dieses Modell

zwar den pathologischen Zustand gut darstellen kann, aber immer nur eine

Momentaufnahme der eigentlich progressiven Erkrankung M. Parkinson erfasst

werden kann, und zwar eine im fortgeschrittenen Stadium. Außerdem ist zu

beachten, dass beim Menschen das Auftreten von Angst nicht korreliert mit der

Schwere der motorischen Symptome (WALSH und BENNETT, 2001), sondern wie

gesagt mit der Beteiligung der verschieden Neuronengruppen (WOLTERS und

FRANCOT, 1998).

Die Frage also, inwieweit das hier eingesetzte 6-OHDA- Ratten-Modell (v. a. bzgl.

der Platzierung des Toxins) das Richtige ist, bzw. inwiefern es unter

Berücksichtigung der nicht-motorischen Aspekte für Transplantationsversuche

sinnvoll eingesetzt werden kann, hängt einmal mehr von der Fragestellung ab:

solange sich die Versuche wie in diesem Fall vornehmlich auf qualitative Aspekte der

Transplantation beziehen, also zunächst kurzfristig das Überleben und die

morphologische Integration der genetisch modifizierten Zellen betrachtet werden soll

um die effektivste Methode der Kultivierung und Differenzierung herauszuarbeiten, ist

dieses Modell durchaus sinnvoll. Vor allem vor dem Hintergrund, dass so die beste

Denervierung erzielt werden kann im Vergleich zu den anderen Platzierungen (z.B. in

der Sn selbst, SCHWARTING und HUSTON, 1996), und dies für den Erfolg der

Transplantation von Bedeutung ist. Zudem ist die Applikation des Toxins in das MFB

routinemäßig eine zuverlässige Methode.

Wenn für die morphologische Integration das richtige Protokoll erarbeitet wurde und

Diskussion

89

die funktionelle Integration anhand von Verhaltensversuchen untersucht werden soll,

so muss differenziert werden, ob rein der motorische Aspekt oder auch der

emotionale Aspekt betrachtet werden soll.

Möchte man lediglich die motorischen Aspekte der Erkrankung studieren erscheint

es sinnvoller, ein Modell zu wählen, welches möglichst selektiv die A9 Neurone der

Sn zerstört und die A10 Zellen der VTA intakt lässt, so dass lediglich der

nigrostriatale Weg betroffen ist. Idealerweise erfolgt dann auch eine weitere

Spezifizierung des Modells durch den Einsatz von DMI: Eine zusätzliche Behandlung

mit Desmethylimipramin (DMI) bei der Erstellung des Modells schont die

noradrenergen Zellen, da dies bei einer Infusion von 2µl 6-OHDA eine selektive

Blockade der noradrenergen Zellen bewirkt. Zu bedenken ist hierbei, dass bei der

von uns gewählten, größeren Menge an Toxin dieser Schutz jedoch vermutlich nicht

effektiv wäre und dies entsprechend angepasst werden müsste (FULCERI, 2006).

Sollen hingegen die Veränderungen im mesocorticolimbischen System (wie sie auch

im M. Parkinson entstehen) mit betrachtet werden, so erscheint es durchaus sinnvoll,

das hier untersuchte Modell zu wählen, da bei diesem auch Strukturen wie die VTA

und somit u. a. zum Beispiel auch der Ncl. acc. und der L.c. direkt oder indirekt mit

geschädigt werden.

Zusammenfassung

91

6 Zusammenfassung

Nina Schulze, geb. Halfer

Das Tiermodell des Morbus Parkinson - Verhaltensstudien und morphologische

Evaluation nach Transplantation neuronaler Progenitorzellen

Im ersten Teil der hier dargestellten Versuche sollte ein Protokoll zur Transplantation

neuronaler Progenitorzellen erarbeitet werden und deren Überleben und Integration

im Rattenmodell des Morbus Parkinson untersucht werden.

Hier konnten drei zentrale Erkentnisse gewonnen werden: Zum einen überleben die

zuvor transfizierten transplantierten Zellen die Transplantation schlechter als die

nicht transfizierten transplantierten Zellen. Zudem erfolgt deren Integration nicht so

gut wie die der nicht transfizierten Zellen. Zweitens konnte aber gezeigt werden, dass

die Überexprimierung von FGF-2 im Gegensatz zum Nicht-Vorhandensein einer

Supplementierung bei leerem Vektor einen positiven Einfluss auf das Überleben und

die Qualität der überlebenden Zellen zu haben scheint. Und drittens musste

festgestellt werden, dass die Anzahl der in vivo nachweisbaren TH-positiven Zellen

sehr gering ist.

Hieraus lässt sich zusammengefasst schlussfolgern, dass das

Transfektionsprotokoll weiter zu überarbeiten ist, um den negativen Einfluß, den die

Transfektion auf das Überleben der transplantierten Zellen hat, zu minimieren.

Desweiteren kann aber auf dem positiven Einfluß, den das exprimierte FGF-2 auf

das Ergebnis in vivo hat, aufgebaut werden und der Effekt in den folgenden

Ansätzen genutzt werden.

Im zweiten Teil dieser Arbeit ist das Auftreten Angst-assoziierten Verhaltens im hier

verwendeten 6-OHDA Rattenmodell des M. Parkinson mit Hilfe des Offenfeldes und

des Elevated-Plus–Maze untersucht worden. Hierfür lässt sich festhalten, dass im

Vergleich zum naiven Tier und auch zum Sham-Lädierten vermehrt Angst-

assoziiertes Verhalten für das Modell zu erkennen ist. Damit kann gezeigt werden,

Zusammenfassung

92

dass das hier verwendete Modell nicht nur motorische Aspekte des M. Parkinosn

darstellt, sondern aufgrund der im Modell betroffenen Strukturen mit Verbindungen

zum limbischen System und der vermutlichen Beteiligung anderer

Transmittersysteme neben dopaminerger auch für Verhaltensaspekte eine Rolle

spielen kann und somit in der Folge verwendet werden kann, um nicht nur

morphologische und motorische, sondern auch andere Verhaltensänderungen zu

untersuchen, die durch Transplantationen in diesem Zusammenhang modifiziert

werden können.

Summary

93

7 Summary

Nina Schulze, geb. Halfer

The animal model of Parkinson´s disease – behavioural studies and morphological

evaluation after transplantation of neuronal progenitor cells

In the first part of these experiments we wanted to establish a protocol for the

transplantation of transfected neuronal progenitor cells and investigate their survival

and integration in a rat model of Parkinson´s disease.

Here we could get three central findings: First of all, cells that were transplanted after

having undergone transfection survived less well than naivly transplanted cells.

Additionally, their integration was not as well as seen with not transfected cells.

Secondly, on the other hand, it could be shown that the overexpression of FGF-2 had

a positive influence on the survival and the quality of the transfected cells after

transplantation if compared with the results for those cells that were transfected just

with an empty vector. And thirdly it was found that the survival rate of TH-positve

cells was overall quite low.

Consequently it can be concluded that the transfection protocol needs revising to

minimize the negative influence that the transfection procedure has upon the survival

of the transplanted cells. Furthermore, based upon the positive influence of the

overexpression of FGF-2 in vivo, this approach and its effects can be used in the

establishing of subsequent trials.

In the second part of this work the appearing of anxiety like behaviour in the 6-OHDA

model of Parkinson´s disease was evaluated by the means of the Open-Field and

the Elevated-Plus-Maze. Here it can be stated that, when compared to naïve animals

and sham-lesioned animals, increased anxiety like behaviour can be detected in the

6-OHDA model. This shows that the model applied in these experiments not only

displays motoric aspects but that it also can play a role concerning behavioural

Summary

94

aspects, which due to the infliction of structures having a certain connectivity to limbic

structures and due to a presumable involvement of other transmitter systems than

the dopaminergic system. So in the following, this model can be useful not only to

evaluate morphological and motoric aspects but also to investigate other behavioural

changes that can be modified in this context.

Abbildungsverzeichnis

95

8 Abbildungsverzeichnis

ABBILDUNG 1: DER PHYSIOLOGISCHE REGELKREIS DER BASALGANGLIEN............................................................ 8

ABBILDUNG 2: DIE PATHOPHYSIOLOGIE DES REGELKREISES DER BASALGANGLIEN BEI M. PARKINSON ............. 10

ABBILDUNG 3: ÜBERSICHT VERSUCHSABLAUF TRANSPLANTATIONSVERSUCHE ................................................ 32

ABBILDUNG 4: VERSUCHSABLAUF VERHALTENSSTUDIEN .................................................................................. 38

ABBILDUNG 5: AUFBAU OFFENFELD (NACH C. LINDEMANN) ............................................................................. 39

ABBILDUNG 6: AUFBAU ELEVATED PLUS-MAZE (NACH C. LINDEMANN) ............................................................ 40

ABBILDUNG 7: E12 ZELLEN IN VITRO, IMMUNREAKTIVITÄT FÜR TH BZW. DAS FLAG-TAG ................................. 51

ABBILDUNG 8: E12 NAIV, 1 WO IN VIVO ............................................................................................................ 52

ABBILDUNG 9: E12 NAIV, 2 WO IN VIVO ............................................................................................................ 53

ABBILDUNG 10: E12 FLAG EMPTY, 1 WO IN VIVO .............................................................................................. 54

ABBILDUNG 11: E12 FLAG EMPTY, 2 WO IN VIVO .............................................................................................. 55

ABBILDUNG 12: E12 23KDA, 1 WO IN VIVO ....................................................................................................... 56

ABBILDUNG 13: E12 23KDA, 2 WO IN VIVO ....................................................................................................... 57

ABBILDUNG 14: E12 NAIV, TH FÄRBUNG NACH 1 (TH1-4) UND 2 WO (TH5-8) IN VIVO ...................................... 58

ABBILDUNG 15: E12 FLAG EMPTY (FE) UND FLAG 23KD (F23), TH-FÄRBUNG NACH 1 (A/B) BZW. 2 WO (C/D) IN

VIVO ........................................................................................................................................................ 59

ABBILDUNG 16: GESAMTWEGSTRECKE IM OF ................................................................................................... 60

ABBILDUNG 17: FREQUENZ DER EINTRITTE INS ZENTRUM IM OF ...................................................................... 61

ABBILDUNG 18: FREQUENZ DER EINTRITTE IN DIE INNERE ZONE IM OF ............................................................ 61

ABBILDUNG 19: FREQUENZ DER EINTRITTE IN DIE ÄUßERE ZONE IM OF ........................................................... 61

ABBILDUNG 20: AUFENTHALTSDAUER IM ZENTRUM IM OF .............................................................................. 62

ABBILDUNG 21: AUFENTHALTSDAUER IN DER INNEREN ZONE IM OF ................................................................ 62

ABBILDUNG 22: AUFENTHALTSDAUER IN DER ÄUßEREN ZONE IM OF ............................................................... 62

ABBILDUNG 23: GESAMTWEGSTRECKE IM EPM ................................................................................................ 65

ABBILDUNG 24 FREQUENZ DER EINTRITTE INS ZENTRUM DES EPM .................................................................. 66

ABBILDUNG 25: FREQUENZ DER EINTRITTE IN DIE GESCHLOSSENEN ARME DES EPM........................................ 66

ABBILDUNG 26: FREQUENZ DER EINTRITTE IN DIE OFFENEN ARME DES EPM .................................................... 66

ABBILDUNG 27: AUFENTHALTSDAUER IM ZENTRUM DES EPM.......................................................................... 67

ABBILDUNG 28: AUFENTHALTSDAUER IN DEN GESCHLOSSENEN ARMEN DES EPM ........................................... 67

ABBILDUNG 29: AUFENTHALTSDAUER IN DEN OFFENEN ARMEN DES EPM ....................................................... 67

Tabellenverzeichnis

97

9 Tabellenverzeichnis

TABELLE 1: ÜBERSICHT TH-FÄRBUNG ................................................................................................................ 49

TABELLE 2: PUTZVERHALTEN IM OF .................................................................................................................. 63

TABELLE 3: AUFRICHTUNGSVERHALTEN IM OF ................................................................................................. 64

TABELLE 4: AUFRICHTUNGSVERHALTEN IM EPM ............................................................................................... 68

TABELLE 5: PUTZVERHALTEN IM EPM................................................................................................................ 69

TABELLE 6: HEAD DIPS IM EPM ......................................................................................................................... 70

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Tierärztliche Hochschule Hannover Das Tiermodell des ... · Bei Morbus Parkinson, der im Jahre 1817 zum ersten Mal von einem englischen Chirurgen namens James Parkinson als „Shaky