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Tierärztliche Hochschule Hannover
Zerebrale Energie-Stoffwechsel-Veränderungen
im Kontext der Epileptogenese und als
therapeutisches Target zur Epilepsie-Prävention
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Ina Leiter Heidelberg
Hannover 2017
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Marion Bankstahl
Institut für Pharmakologie,
Toxikologie und Pharmazie
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachterin: Prof. Dr. med. vet. Marion Bankstahl
2. Gutachter: PD Dr. rer. nat. Karl-Heinz Esser
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2017
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Promotionsförderung der
Konrad-Adenauer-Stiftung gefördert.
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ............................................................................................................... 1
2 Literaturübersicht .................................................................................................. 3
2.1. Epilepsie .......................................................................................................... 3
2.1.1 Ätiologie, Klassifizierung und Bedeutung ................................................... 3
2.1.2 Temporallappenepilepsie ........................................................................... 6
2.2 Epileptogenese und Konzepte für Antiepileptogenese ...................................... 7
2.2.1 Definition und Bedeutung ........................................................................... 7
2.2.2 Tiermodelle für Epileptogenese .................................................................. 8
2.2.3 Energiestoffwechsel des Gehirns ............................................................. 11
2.2.4 Veränderungen während der Epileptogenese .......................................... 16
2.2.4.1 Glukosestoffwechselveränderungen ...................................................... 16
2.2.4.2 Blut-Hirn-Schranken-Veränderungen .................................................... 18
2.2.4.3 Inflammation .......................................................................................... 19
2.2.5 Konzepte für Antiepileptogenese .............................................................. 21
2.2.5.1 Energiestoffwechsel-beeinflussende Therapien chronischer Epilepsie . 22
2.2.5.2 Wirkungsweise der ketogenen Diät ....................................................... 23
2.2.5.3 Wirkungsweisen der 2-Desoxy-D-Glukose ............................................ 26
2.3 Positronen-Emissionstomographie und Epilepsie ........................................... 28
2.3.1 Prinzip und Bedeutung der Positronen-Emissionstomographie ................ 28
2.3.2 [18F]FDG und zerebraler Glukosemetabolismus ....................................... 30
2.3.3 [18F]GE-180 und TSPO ............................................................................. 32
2.3.4 [18F]Flumazenil und zentraler Benzodiazepinrezeptor .............................. 34
3 Ziele der Arbeit .................................................................................................... 36
4 Material und Methoden ........................................................................................ 38
4.1 Versuchstiere und Haltung .............................................................................. 38
4.2 Manuskript 1: Untersuchungen im kornealen Kindlingmodell .......................... 39
4.2.1 Corneales Kindling ................................................................................... 40
4.2.2 2-Desoxy-D-Glukose-Behandlung ............................................................ 41
4.2.3 [18F]FDG-PET und Datenauswertung ....................................................... 42
4.2.4 Immunhistochemische Färbungen GLUT-1, IBA-1, GFAP und Fluoro-Jade-
C-Färbung ......................................................................................................... 44
4.2.5. Statistik .................................................................................................... 47
4.3 Manuskript 2: Untersuchungen im Pilocarpinmodell ....................................... 47
4.3.1 Induktion des Status epilepticus ............................................................... 47
4.3.2 Magnetresonanztomographie ................................................................... 48
4.3.3 FITC-Albumin ........................................................................................... 48
4.3.4 Immunfluoreszenzfärbungen .................................................................... 50
4.3.5 Beurteilung der Neurodegeneration .......................................................... 50
4.3.6 Statistik ..................................................................................................... 51
4.4 Manuskript 3: Untersuchungen im intrahippokampalen Kainatmodell ............. 51
4.4.1 Intrahippokampale Kainatinjektion ............................................................ 52
4.4.2 Fütterung der ketogenen Diät ................................................................... 53
4.4.3 PET und Datenauswertung ...................................................................... 54
4.4.4 Irwin-Screen ............................................................................................. 55
4.4.5 Elektrodenimplantation ............................................................................. 55
4.4.6 Elektroenzephalographie, Video-Überwachung und Datenauswertung .... 56
4.4.7 ActiMot -Test ............................................................................................ 57
4.4.8 Statistik ..................................................................................................... 57
5 Manuskripte ......................................................................................................... 58
5.1 Attenuation of epileptogenesis by 2-deoxy-d-glucose treatment is reflected in 2-
deoxy-2-[18F]fluoroglucose brain kinetics .............................................................. 58
5.2 Blood-brain barrier leakage during early epileptogenesis is associated with
rapid remodeling of the neurovascular unit ........................................................... 91
5.3 Pronounced and long-term disease-modifying effects of transient ketogenic diet
in the intrahippocampal kainate mouse model of epileptogenesis: a longitudinal
theranostic study ................................................................................................. 132
6 Diskussion ......................................................................................................... 169
6.1 Reflexion zur Methodik der Arbeit ................................................................. 169
6.2 Glukose-Stoffwechsel-Veränderungen während der Epileptogenese ........... 174
6.2.1 [18F]FDG-PET-Daten aus zwei Tiermodellen .......................................... 174
6.2.2 Befunde zum Kontext der Epileptogenese ............................................. 177
6.3 Glukose-Stoffwechsel-Veränderungen als therapeutisches Target .............. 186
6.3.1 Effekte von 2-Desoxy-D-Glukose und ketogener Diät auf den zerebralen
Glukose-Stoffwechsel ...................................................................................... 186
6.3.2 Effekte der 2-Desoxy-D-Glukose und der ketogenen Diät auf
Epileptogenese und Inflammation ................................................................... 189
6.4 Schlussfolgerungen und Ausblick ................................................................. 191
7 Literaturverzeichnis........................................................................................... 193
8 Zusammenfassung ............................................................................................ 228
9 Summary ............................................................................................................ 230
10 Publikationen ................................................................................................... 232
11 Anhang ............................................................................................................. 234
11.1 Graphische Darstellung von Ergebnissen aus nicht in die Manuskripte
aufgenommenen Teilstudien ............................................................................... 234
11.2 Immunhistochemische Färbungen .............................................................. 242
12 Danksagung ..................................................................................................... 248
1 Einleitung
1
1 Einleitung
Epilepsie ist eine seit dem Altertum bekannte neurologische Erkrankung, die schon
von Hippokrates beschrieben wurde (Breitenfeld et al., 2014). Ihr liegt eine
Prädisposition zur Entwicklung epileptischer Anfälle zugrunde (Fisher et al., 2014). Die
spontan auftretenden, wiederkehrenden Anfälle entspringen exzessiven elektrischen
Entladungen von Neuronengruppen (WHO, 2017). Schätzungsweise haben allein in
Europa etwa sechs Millionen Menschen Epilepsie (Baulac et al., 2015). Mit den derzeit
verfügbaren Antiepileptika können allerdings nur in etwa zwei Drittel der Patienten
effektiv Anfälle unterdrückt werden (Brodie et al., 2012, Löscher, 2016).
Nach Informationen der Weltgesundheitsorganisation liegt in 60% der Fälle eine
idiopathische Epilepsie vor (WHO, 2017). Die Gruppe der symptomatischen Epilepsien
hat vielfältige Ätiologien, vor allem Gehirntumoren, gefolgt von subarachnoidalen
Blutungen, traumatischen Gehirnverletzungen, Encephalitiden und weiteren Ursachen
(Herman, 2002, Lowenstein, 2009). Eine typischerweise durch einen solchen
Gehirninsult ausgelöste Form der Epilepsie ist die mesiale Temporallappenepilepsie
(French et al., 1993), die zu den häufigsten Ausprägungen der Epilepsie im Menschen
gehört (Engel, 1996). Ein Insult des Gehirns führt allerdings nur bei einem Teil der
Patienten auch zur Entwicklung einer Epilepsie. Dieser als Epileptogenese
bezeichnete Vorgang besteht aus einer Kaskade von strukturellen und funktionellen
Veränderungen im Gehirn, die nach einer oft vorhandenen symptomlosen
sogenannten Latenzphase schließlich zu klinisch sichtbaren spontanen
wiederkehrenden Anfällen führen (Löscher und Brandt, 2010, Pitkänen et al., 2016).
Es fehlen bislang entsprechende Biomarker, um Risikopatienten für eine
Epileptogenese zu identifizieren. Bisher gibt es zudem keine präventiven oder
Epilepsie heilenden Pharmakotherapien. Auch im Hinblick darauf, dass die mesiale
Temporallappenepilepsie die häufigste pharmakoresistente partielle Epilepsie
darstellt, mit einem Versagen der medikamentösen Therapie in 75% der Patienten
(Spencer, 2002), besteht hier weiterer Forschungsbedarf.
1 Einleitung
2
Auf der Suche nach einer epilepsie-präventiven, also antiepileptogenen
Therapie, die in diesem sich bietenden Zeitfenster zwischen einem epileptogenen
Gehirninsult und den ersten klinischen Anfällen eingesetzt werden müsste, stellt sich
grundsätzlich die Frage nach ursächlichen Mechanismen. Der Fokus dieser Arbeit liegt
hierbei zum einen auf dem zerebralen Glukosestoffwechsel. Dass Veränderungen
desselben eine wichtige Rolle bei Epilepsie spielen, lassen erfolgreiche diätetische
Therapien einer bestehenden Epilepsie, wie die ketogene Diät, vermuten (Martin et al.,
2016, Felton und Cervenka, 2015). Unter Verwendung des Radiotracers 2-[18F]Fluoro-
desoxy-D-Glukose ([18F]FDG) mit Positronen-Emissionstomographie (PET) wurden in
ersten präklinischen Untersuchungen mit verschiedenen Tiermodellen Anfalls-
assoziierte hypermetabolische Veränderungen gefunden (Mirrione et al., 2006,
Mirrione et al., 2007, Kornblum et al., 2000), während schon ein bis zwei Tage später
und chronisch eher ein Hypometabolismus in Epilepsie-assoziierten Gehirnregionen
beobachtet wurde (Jupp et al., 2012, Lee et al., 2012). Die [18F]FDG-PET wird beim
Patienten wegen ihrer Stärke, einen Anfallsherd anhand des interiktal vorkommenden
Hypometabolismus darzustellen, in der prächirurgischen Evaluation genutzt
(Theodore, 2017), wobei sie auch bei einem negativen Befund aus der Untersuchung
mit Magnetresonanztomographie (MRT) helfen kann. Zum anderen untersucht diese
Arbeit weitere Mechanismen der Epileptogenese, indem sie den Glukosestoffwechsel
im Kontext mit Entzündungsvorgängen und Störungen der Blut-Hirn-Schranke
untersucht. Entzündungen mit Aktivierung von Microglia und Astrozyten können durch
den initialen Gehirninsult ausgelöst werden, wobei eine verstärkte Expression
proinflammatorischer Moleküle zu einer veränderten neuronalen Erregbarkeit und
beeinträchtigter Kommunikation zwischen Neuronen und Glia (Vezzani et al., 2013)
und auch Beeinträchtigungen der Blut-Hirn-Schranke führen kann (Yu et al., 2013).
Eine gesteigerte Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke kann wiederum ebenfalls
prokonvulsiv wirken (van Vliet et al., 2007).
In dieser Arbeit wurde neben immunhistochemischen Methoden,
Elektroenzephalographie und MRT schwerpunktmäßig die Positronen-
Emissionstomographie mit verschiedenen Radiotracern verwendet. Sie bietet die
Möglichkeit, verschiedenste Stoffwechselaspekte im zeitlichen Verlauf der
2 Literaturübersicht
3
Epileptogenese in vivo im selben Tier zu untersuchen. Ließe sich mittels eines oder
einer Kombination geeigneter PET-Tracer ein generelles Muster der Epileptogenese
in einem geeigneten Modell evaluieren, wäre diese Technik als potentieller Biomarker
in die klinische Forschung translatierbar.
Zwei Strategien zur Beeinflussung des zerebralen Glukosestoffwechsels
während der Epileptogenese wurden in dieser Arbeit als potentielle antiepileptogene
Therapiestrategien untersucht: Der pharmakologische Ansatz dieser Arbeit besteht in
der Gabe von 2-Desoxy-D-Glukose (2-DG) während der Epileptogenese. Gegenwärtig
in der präklinischen Entwicklung zur Therapie einer chronischen Epilepsie (Bialer et
al., 2015), finden sich erste Hinweise auf eine potentielle antiepileptogene Wirkung
dieses Glukoseanalogons (Sutula und Franzoso, 2008, Garriga-Canut et al., 2006,
Yang et al., 2013). Die in dieser Arbeit verfolgte diätetische Strategie besteht in der
Verabreichung einer ketogenen Diät direkt nach der Induktion einer Epileptogenese.
Beide Methoden manipulieren den Energiestoffwechsel, aber über verschiedene
Mechanismen. Viele Details sind beschrieben worden, dennoch ist ihre Wirkungsweise
bisher unzureichend charakterisiert.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung Veränderungen des
zerebralen Glukosemetabolismus im Verlauf der Epileptogenese, auch im Kontext mit
epileptogenen Mechanismen, und der Eignung einer therapeutischen Beeinflussung
des Glukosestoffwechsels zur Prävention oder Abschwächung der Epileptogenese in
verschiedenen Tiermodelllen.
2 Literaturübersicht
2.1. Epilepsie
2.1.1 Ätiologie, Klassifizierung und Bedeutung
In den Industrieländern liegt die Lebenszeitprävalenz für Epilepsie mit 5,8 von 1000
Personen deutlich niedriger als in den Entwicklungsländern mit 15,4 von 1000 (Ngugi
et al., 2010). Beim Hund wird die Prävalenz derzeit mit 0,62% - 0,75% angegeben
2 Literaturübersicht
4
(Kearsley-Fleet et al., 2013, Heske et al., 2014). Damit ist Epilepsie weltweit eine der
häufigsten neurologischen Erkrankungen bei Mensch und Hund. Epilepsie ist eine
Erkrankung des Gehirns unterschiedlichster Genese. Laut Definition ist sie
charakterisiert durch eine dauerhafte Prädisposition zur Generierung epileptischer
Anfälle, wie auch durch ihre neurobiologischen, kognitiven, psychologischen und
sozialen Auswirkungen (Fisher et al., 2014). Zur Diagnosestellung „Epilepsie“
bestehen drei für sich allein stehend gültige Kriterien: eines beschreibt ein Minimum
von zwei nicht provozierten (oder reflektorischen) Anfällen, die in einem Abstand von
über 24 Stunden auftreten; ein anderes fordert einen nicht-provozierten (oder
reflektorischen) Anfall und eine dem generellen Rezidiv-Risiko nach zwei nicht-
provozierten Anfällen ähnliche Wahrscheinlichkeit für weitere Anfälle über die
nächsten 10 Jahre; ein weiteres stellt die Diagnose eines Epilepsiesyndroms dar. Eine
Epilepsie gilt als überwunden, wenn eine Person ohne antiepileptische Therapie über
die letzten fünf Jahre für 10 Jahre anfallsfrei geblieben ist, oder wenn eine Person ein
altersabhängiges Epilepsiesyndrom hatte und nun über das entsprechende Alter
hinaus ist. In der Veterinärmedizin hingegen wird durch die International Veterinary
Epilepsy Task Force dann von einer Epilepsie gesprochen, wenn ein Tier das erste
Kriterium – zumindest zwei nicht-provozierte epileptische Anfälle in mehr als 24
Stunden Abstand – erfüllt (Berendt et al., 2015).
Anfallstypen werden durch die International League Against Epilepsy (ILAE)
folgendermaßen klassifiziert: in fokale Anfälle, die weiterhin unterteilt werden in
motorisch oder nicht-motorisch, nach Vorhandensein des Bewusstseins, in fokal bis
zu bilateral tonisch-klonisch, und des Weiteren in Anfälle mit unbekanntem Anfang, die
ähnlich eingeteilt werden, sowie in generalisierte Anfälle (Fisher et al., 2016). Zur
Diagnosestellung werden nach einer neuen Richtlinie der International League Against
Epilepsy Diagnosen auf drei Ebenen getroffen (Scheffer et al., 2017): zum Anfallstyp,
zur Epilepsieart (generalisiert, fokal, kombiniert oder unbekannt) und zu einem
möglichen Epilepsiesyndrom. Auf allen drei Ebenen wird nach der Ätiologie gesucht,
die sich einteilen lässt in genetisch, strukturell, metabolisch, immunbedingt, infektiös
und unbekannt (Scheffer et al., 2013). Für Epilepsie gibt es in der Veterinärmedizin in
Anlehnung an die Humanmedizin zwei Arten der Klassifikation (Berendt et al., 2015):
2 Literaturübersicht
5
in Bezug auf die Ätiologie wird zwischen idiopathischen Epilepsien, die genetisch
bedingt sein können, und strukturellen Epilepsien, die durch verschiedene Pathologien
verursacht werden, unterschieden. Eine Differenzierung der Anfalls-Symptomatologie
unterteilt in fokale, generalisierte und erst fokale, dann aber generalisierte epileptische
Anfälle, die die häufigste Ausprägung beim Hund darstellen.
Häufige Komorbiditäten bei Epilepsiepatienten sind psychische Erkrankungen,
die bei Epilepsiepatienten häufiger als in der gesamten Bevölkerung vorkommen
(Saha et al., 2017). Dabei werden Depressionen in epileptischen Patienten mit einer
vier- bis fünffach höheren Inzidenz gegenüber anderen Personen angegeben (Kanner
und Palac, 2000). Nicht nur bei Epilepsie besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit für
eine Depression, sondern auch bei Depression eine höhere Wahrscheinlichkeit für
eine Epilepsieentwicklung (Korczyn et al., 2013), wobei Pathomechanismen der
Depression teilweise möglichen epileptogenen Mechanismen entsprechen.
Angststörungen sind mit Angaben von bis zu 40% ähnlich häufig anzutreffen (Munger
Clary, 2014). Für kognitive Defizite werden ähnliche Häufigkeiten genannt (Vlooswijk
et al., 2010). Diese Komorbiditäten, aber auch eine mögliche soziale Ausgrenzung und
Stigmatisierung sowie Angst davor können die Lebensqualität stark beeinträchtigen
(Steiger und Jokeit, 2017). Epilepsiepatienten haben zudem ein dreifach erhöhtes
Selbstmordrisiko verglichen mit anderen Menschen (Korczyn et al., 2013). Die
Therapie dieser Komorbiditäten stellt eine Herausforderung dar, da beispielsweise
Antidepressiva im Hinblick auf die Epilepsie mit besonderer Sorgfalt eingesetzt werden
müssen und Antiepileptika je nach Wirkstoff stimmungsstabilisierende oder -
verändernde Effekte haben können (Kwon und Park, 2014). Im Hinblick auf die
vorliegende Arbeit sind deutliche Hinweise aus [18F]FDG-PET-Studien auf eine Rolle
des zerebralen Glukosemetabolismus bei Depression interessant, da Depression
allgemein, aber auch bei Patienten mit Temporallappenepilepsie mit einem fokalen
Hypometabolismus im Frontallappen assoziiert wird (Salzberg et al., 2006) und
zugleich ein Hypermetabolismus in limbischen Arealen auftritt, wobei beides durch
eine erfolgreiche Paroxetin-Therapie normalisiert werden kann (Kennedy et al., 2001).
2 Literaturübersicht
6
2.1.2 Temporallappenepilepsie
Es wird angenommen, dass diese Form der Epilepsie bei Kindern und Erwachsenen
am häufigsten vorkommt (Engel, 1996). Episodische Gedächtnisdefizite im Alltag
stellen die häufigste kognitive Beeinträchtigung von Menschen mit
Temporallappenepilepsie und hippokampaler Sklerose dar (Rzezak et al., 2017).
Im Hinblick auf die hohe Pharmakoresistenzrate, die bis zu drei Viertel der Patienten
betrifft (Spencer, 2002) und die angesprochenen möglichen Komorbiditäten, die das
soziale Leben erschweren können, besteht ein Forschungsbedarf für weitere
Erkenntnisse zu Mechanismen der Epileptogenese und Therapiemethoden. Als
Hippokampussklerose wird das Auftreten von Gliose und Neuronenverlust bezeichnet
(Morimoto et al., 2004). Oft beinhaltet die Vorgeschichte bei mesialer
Temporallappenepilepsie Fieberanfälle oder einen Status epilepticus, also eine
andauernde Anfallsaktivität, die laut der gemeinhin verwendeten Definition über 30
Minuten andauert und damit irreparable neuronale Schädigungen verursacht (Trinka
et al., 2015). Histologisch und immunhistochemisch werden verschiedene
Erscheinungsformen des Hippokampus gesehen (de Lanerolle et al., 2003): Gewebe
von Patienten mit mesialer Temporallappenepilepsie kann typisch mit starkem
Neuronenverlust und neuronaler Reorganisation erscheinen, etwas weniger starkem
Neuronenverlust oder mit Neuronenverlust in der CA1 (Region 1 des Cornu ammonis).
Temporallappenepilepsie kann mit einer extrahippokampalen Massenläsion assoziiert
sein, wobei ein geringgradiger Neuronenverlust im Hippokampus vorkommt. Eine
paradoxe Temporallappenepilepsie ist ohne Hinweise auf eine Hippokampussklerose
im Elektroenzephalogramm nachweisbar und weist nur eine geringgradige
Neurodegeneration im Hippokampus auf. Der Anfallsherd ist bei der
Temporallappenepilepsie oft im Hippokampus, aber auch in der Amygdala oder in
beiden Strukturen gelegen (Engel, 1996). Um diesen Anfallsherd im Hinblick auf eine
chirurgische Therapie oder auch für die Planung invasiver Ableitung von
Elektroenzephalogrammen zu evaluieren, werden neben der neurologischen
Untersuchung, iktaler und interiktaler Elektroenzephalographie (EEG) nicht-invasive
Bildgebungstechniken wie simultane EEG- und fMRT-Untersuchungen (funktionelle
MRT), Einzel-Photonen-Emissionscomputertomographie (SPECT) und [18F]FDG-PET
2 Literaturübersicht
7
eingesetzt (Pittau et al., 2014). Zur Erforschung von Mechanismen, die zur
Epileptogenese führen und eine Temporallappenepilepsie ausmachen, und zur
Findung von Therapieansätzen wurden diverse Tiermodelle entwickelt. Auf die für die
vorliegende Arbeit relevanten Tiermodelle wird im Abschnitt 2.2.2 eingegangen.
2.2 Epileptogenese und Konzepte für Antiepileptogenese
2.2.1 Definition und Bedeutung
Mit dem Begriff Epileptogenese (siehe Abbildung 1) werden alle Abläufe beschrieben,
die vor dem ersten spontanen Anfall auftreten, aber auch die Prozesse, die der
Progression der Krankheit zu Grunde liegen (Goldberg und Coulter, 2013, Pitkänen
und Lukasiuk, 2011). Klassischerweise wird die Epileptogenese mit drei Phasen
beschrieben: zuerst geschieht der induzierende Gehirninsult, darauf folgt die
Latenzphase, in der die in Gang gesetzten Veränderungen das Gehirn in ein
epileptisches Gehirn umwandeln, woran sich dann die Phase der chronischen und
klinisch manifesten Epilepsie anschließt (Goldberg und Coulter, 2013). Nach dem
ersten klinischen Anfall kann sich dann mit den folgenden rekurrierenden Anfällen eine
Progression der Epileptogenese ergeben oder auch nicht. Während der
Epileptogenese und der chronischen Phase der Epilepsie ist auch mit den in Absatz
2.1.1 angesprochenen Komorbiditäten zu rechnen (Kanner et al., 2014). Eine
Diagnose wird im Patienten also erst nach der Latenzphase gestellt, wenn klinische
Symptome offenbar werden. Eine nun einsetzende medikamentöse Therapie mit
Antiepileptika zielt darauf ab, die Anfälle symptomatisch zu behandeln, um weitere
Schädigungen des Gehirngewebes einzugrenzen. Bei der Epileptogenese verändert
sich das Gehirngewebe funktionell dahingehend, dass abnorme elektrische Aktivitäten
auftreten und somit spontane Anfälle generiert werden können (Pitkänen und
Lukasiuk, 2011). Auf den initiierenden Insult kann eine Epileptogenese folgen, mit
Veränderungen wie Neurodegeneration, Neurogenese, Gliose, Axonschädigung,
Sprießen von Axonen, dendritischer Plastizität, Blut-Hirn-Schranken-Schädigung,
Einwanderung inflammatorischer Zellen in das Hirngewebe, Reorganisation der
extrazellulären Matrix, Dysregulierung von Ionenkanälen und
2 Literaturübersicht
8
Neurotransmitterrezeptoren und Reorganisation neuronaler Schaltkreise (Gorter et al.,
2015, Pitkänen und Lukasiuk, 2011). Zusätzliche Details zu finden, das
Zusammenwirken und die Relevanz der einzelnen Mechanismen zu entdecken und zu
verstehen, ist nach wie vor Gegenstand der Forschung.
Abbildung 1: (Löscher und Brandt, 2010) Darstellung der Stufen der Epileptogenese und Progression
der Temporallappenepilepsie mit Angriffspunkten für therapeutische Interventionen
2.2.2 Tiermodelle für Epileptogenese
Tiermodelle sind in der Epilepsieforschung trotz umfangreicher Bemühungen, die
Anzahl der verwendeten Tiere zu reduzieren, weiterhin unverzichtbar
(Dedeurwaerdere et al., 2014). Die Ethik verbietet einen sofortigen Test neuer
Therapien mit allen möglichen Risiken am Menschen. Von Patienten kann lediglich
reseziertes Gewebe im Rahmen von epilepsiechirurgischen Eingriffen für
Untersuchungen verwendet werden, nicht jedoch Kontrollgewebe. Zudem sind Studien
zur (Anti-) Epileptogenese am Patienten bisher nahezu undurchführbar, da nur ein
kleiner Teil nach einem primären Insult eine Epilepsie entwickelt und bisher keine
2 Literaturübersicht
9
zuverlässigen Biomarker für ein erhöhtes Epileptogeneserisiko zur Verfügung stehen
(Lukasiuk und Becker, 2014). Zur Untersuchung der Epileptogenese gibt es jedoch gut
geeignete Tiermodelle für symptomatische Epilepsie, unter anderem Kindlingmodelle
und Post-Status-epilepticus-Modelle der Temporallappenepilepsie (Löscher und
Brandt, 2010). Kindling, als fortschreitender epileptogener Prozess mit täglichen
Stimulationen über Elektroden, bietet die Möglichkeit, potentiell anti-epileptogene
Therapien zu untersuchen. Durch wiederholte, zunächst subkonvulsive Stimulationen
über eine implantierte Tiefenhirnelektrode kommt es mit der Zeit zu einer chronisch
erniedrigten Anfallsschwelle und zu Anfällen von zunehmender Schwere und Dauer
(McIntyre et al., 2002). Es können wertvolle Kenntnisse darüber erlangt werden, ob die
Verabreichung von potentiell anti-epileptogen wirkenden Substanzen den Kindling-
Prozess verlangsamt bzw. verhindert oder die Ausprägung der Anfälle positiv
beeinflusst. Mit Post-Status-epilepticus-Modellen, die durch die Entwicklung
spontaner, wiederkehrender Anfälle der Erkrankung beim Menschen besonders
ähnlich sind, lassen sich durch die vorhandene Latenzzeit zwischen dem primären
Hirninsult und den ersten spontanen Anfällen ebenfalls anti-epileptogene Strategien
testen. Hierbei wird entweder elektrisch oder über ein systemisch verabreichtes
Konvulsivum wie Kainat oder Pilocarpin zunächst ein Status epilepticus ausgelöst.
Dieser setzt eine Kaskade von Veränderungen in Gang, die neben den späteren
spontanen Anfällen eine der Situation im Patienten vergleichbare Neuropathologie
(z.B. Hippokampussklerose), sowie Veränderungen im Verhalten und in kognitiven
Fähigkeiten der Tiere hervorruft. Alternativ kann Kainat oder Pilocarpin auch gezielt in
die Amygdala oder den Hippokampus injiziert werden (Riban et al., 2002, Liu et al.,
2013), wodurch das Modell bezüglich der nun lokal begrenzten Gehirnveränderungen
der Situation beim Patienten noch näherkommt.
Kindlingmodelle wie das in dieser Arbeit eingesetzte korneale Kindling beruhen
darauf, dass wiederholte elektrische Stimulationen zu fortschreitenden Veränderungen
in den Gehirnfunktionen führen, die man als „Kindling-Effekt“ bezeichnet. In dem von
Goddard et al. zuerst beschriebenen konventionellen Kindlingmodell bei der Ratte
werden Tiefenelektroden in Gehirnregionen des limbischen Systems (Amygdala,
Hippokampus) verwendet (Goddard et al., 1969). Anfangs wirkt der Stimulus noch
2 Literaturübersicht
10
nicht konvulsiv. Durch die wiederholte Stimulation entwickeln sich zunächst partielle
und dann sekundär generalisierte Anfälle, die im Schweregrad weiter zunehmen, was
dem Prozess der Epileptogenese ähnelt. Ein gekindeltes Tier zeichnet sich durch eine
dauerhaft, über den Kindling-Verlauf hinweg gesenkte Anfallsschwelle aus (Racine,
1972), die auf chronische Veränderungen im Gehirn zurück zu führen sind (Löscher
und Brandt, 2010). Das konventionelle Kindlingmodell ist ein gut geeignetes Modell für
die Temporallappenepilepsie, doch durch die zu implantierenden Elektroden recht
arbeits- und kostenaufwändig (Potschka und Löscher, 1999). Das von Matagne und
Klitgaard charakterisierte und validierte transkorneale Kindlingmodell bei der Maus ist
in der Durchführung wesentlich weniger aufwändig (Matagne und Klitgaard, 1998,
Leclercq et al., 2014), weniger invasiv und wird mittlerweile vermehrt in vielen
Bereichen der Epilepsieforschung eingesetzt, auch in dem vom National Institute of
Neurological Disorders and Stroke der Vereinigten Staaten von Amerika geförderten
Anticonvulsant Screening Program (Wilcox et al., 2013).
Post-Status-epilepticus-Modelle werden genutzt, um die Pathophysiologie und
Therapie chronischer Temporallappenepilepsie zu untersuchen. Die Tiere zeigen
dabei nach einer Latenzphase spontan wiederkehrende Anfälle, wobei der Status
epilepticus die Epileptogenese primär in Gang setzt (Turski et al., 1989). Vergleichbar
mit den hier genannten Modellen besitzt die Temporallappenepilepsie mit
Hippokampussklerose oft ein auslösendes Ereignis in der frühen Kindheit, daraufhin
folgt eine Latenzzeit bis hin zum ersten Anfall, binnen derer die Epileptogenese
stattfindet (Bouilleret et al., 1999). Im Pilocarpinmodell wird zur Auslösung eines Status
epilepticus Pilocarpin, ein muscarinerger Agonist am Cholin-Rezeptor, genutzt. Die
Verabreichung von Lithiumchlorid tags zuvor erhöht die Empfänglichkeit der Ratten für
Anfälle durch Pilocarpin und verringert dadurch deutlich die Mortalität (Turski et al.,
1989, Glien et al., 2001). Das im intrahippokampalen Kainatmodell genutzte Kainat ist
ein Glutamat-Analogon mit exzitatorisch-toxischer Wirkung, das in der Rotalge
Digenea simplex vorkommt (Tanaka et al., 1992). Durch die intrahippokampale Kainat-
Injektion wird in Mäusen ein überwiegend nicht-konvulsiver Status epilepticus
ausgelöst (Gouder et al., 2003). Auf diesen folgen dann nach kurzer Latenzzeit
frequent wiederkehrende partielle Anfälle, die über die Ableitung eines
2 Literaturübersicht
11
Elektroenzephalogramms (EEG) erkennbar sind. Diese Anfälle können wie bei der
Temporallappenepilepsie des Menschen sekundär generalisieren. Da
pathohistologische Veränderungen des kornealen Kindling- und des Pilocarpinmodells
in der übergreifenden Diskussion im Kontext der Ergebnisse aus den Teilstudien der
Arbeit noch zur Sprache kommen, möchte ich hier nur exemplarisch die des
Kainatmodells vorstellen. Im intrahippokampalen Kainat-Modell wie im Patienten ist
eine Neurodegeneration im ipsilateralen Hippokampus (Hilus des Gyrus dentatus, CA
1, CA 3c) mit Verlust von Pyramidenzellen und Interneuronen beschrieben, was als
Hippokampussklerose bezeichnet wird (Suzuki et al., 1995, Bouilleret et al., 1999, Le
Duigou et al., 2005). Es kommt zu einer Dispersion von Körnerzellen (Heinrich et al.,
2006), zum Sprießen der Moosfaser-Axone in der supragranulären Molekularschicht
des Gyrus dentatus und im infrapyramidalen Stratum oriens (Bouilleret et al., 1999).
Ipsilateral proliferieren Astrozyten. Histopathologisch wird im kontralateralen
Hippokampus chronisch kein Unterschied zu einem mit einer Mikroinjektion von
physiologischer Kochsalz-Lösung behandelten Hippokampus festgestellt, bis auf das
mögliche Vorkommen von Moosfaserwachstum. Durch die Kainatinjektion wird eine
erhöhte mitotische Aktivität im Hilus des Gyrus dentatus stimuliert, die ihr maximales
Ausmaß ipsilateral an Tag drei und kontralateral an Tag sieben aufweist (Kralic et al.,
2005). Die Neurogenese wird innerhalb der ersten Woche ipsilateral vermindert,
während sie kontralateral unbeeinflusst bleibt (Heinrich et al., 2006) und stagniert ganz
nach zwei Wochen.
2.2.3 Energiestoffwechsel des Gehirns
Allgemein anerkannt ist die Annahme, dass Glukose ein essentielles Substrat zur
Energiegewinnung im adulten Gehirn darstellt (Bouzier-Sore et al., 2006, Jakoby et al.,
2014). In besonderen Situationen wie Fasten, unkontrolliertem Diabetes,
andauerndem körperlichem Training oder in der Säuglingszeit werden Ketonkörper
wichtige Energielieferanten des Gehirns (Magistretti und Allaman, 2015). Die am
stärksten Energie konsumierenden Zellen sind Neuronen mit etwa 75 – 80% der
produzierten Energie.
2 Literaturübersicht
12
Glukose scheint von Gliazellen im Vergleich zu Neuronen deutlich bevorzugt
aufgenommen und metabolisiert zu werden (Jakoby et al., 2014). Aerobe Glykolyse
und Laktatproduktion kommen vor allen in Astrozyten vor, jedoch kaum in Neuronen
(Magistretti und Allaman, 2015, Bélanger et al., 2011). Die Glykolyse ist in Neuronen
durch eine ständige Degradation des bifunktionellen Enzyms 6-Phosphofrukto-
2kinase/fructose-2,6-bishposphatase 3 stark begrenzt, wodurch in Neuronen eine
Erhöhung der glykolytischen Aktivität verhindert wird (Herrero-Mendez et al., 2009). In
Astrozyten sind diese vollständig aktiv. Dies ist anscheinend nötig, weil eine erhöhte
Glykolyse den Ablauf des Pentose-Phosphat-Weges in Neuronen einschränken (siehe
Abbildung 2), somit die Regeneration von reduziertem Glutathion verringern und damit
in oxidativen Stress und Apoptose führen würde. Somit scheint eine konstant
begrenzte neuronale Glykolyse sehr wichtig zu sein für ihre antioxidativen Fähigkeiten.
Abbildung 2: (Mergenthaler et al., 2013) Wege des
Glukosestoffwechsels. Bei Glukose-6-Phosphat (Glc-6-P) ist eine
Zweigstelle: hier kann das Molekül anstatt weiter zu gehen in der
direkten Glykolyse auch den Pentosephosphatweg (PPP)
einschlagen, der Glutathion regeneriert, oder aber bei Astrozyten
zur Glycogensynthese (Glyc) eingesetzt werden. Pyruvat aus der
Glykolyse wird entweder in Laktat umgewandelt und aus der Zelle
transportiert oder im Zitratzyklus oxidativ verstoffwechselt. Die
Glykolyse führt zur Gewinnung von zwei ATP-Molekülen, der
Zitratzyklus zu 30 weiteren. (MAS = Malat-Aspartat-Shuttle zur
Regeneration von NAD+ für die Pyruvatbildung, ETC =
Elektronen-Transport-Kette, GLUT = Glukosetransporter)
Neuronen und Astrozyten besitzen zwar vergleichbare Mengen an
Mitochondrien, jedoch ist die oxidative Verstoffwechslung von Laktat für Neuronen von
Vorteil, da sie auch mehr ATP liefert als die Glykolyse (Bélanger et al., 2011).
Astrozyten hingegen sind auf Glykolyse spezialisiert. Im Gegensatz zu Neuronen sind
Astrozyten in der Lage, Glykogen zu lagern (Magistretti und Allaman, 2015). Zwar sind
auch Neuronen mit den entsprechenden Enzymen zur Glykogenbildung ausgestattet,
die aber weitgehend inaktiv sind (Bélanger et al., 2011). Astrozytäres Glykogen wird
2 Literaturübersicht
13
bei Bedarf, also bei synaptischer Stimulation, zu Laktat abgebaut, das auch an
Neuronen weitergegeben wird. Diese Laktatversorgung der Neuronen durch
Astrozyten ist unerlässlich für die Langzeit-Gedächtnisbildung (Suzuki et al., 2011). In
separaten Neuronenkulturen von neonatalen Wistar-Ratten mit gleicher Glukose- und
Laktatverfügbarkeit in jeweils physiologisch vorkommenden Konzentrationen wurde
mittels Modellrechnungen ermittelt, dass der neuronale oxidative Stoffwechsel zu
einem Viertel auf exogener Glukose und zu drei Vierteln auf exogenem Laktat beruht
(Bouzier-Sore et al., 2006). Neuronen besitzen im Gegensatz zu Astrozyten keine
Pyruvatcarboxylase (Pyruvat wird zu Oxalacetat), sondern nur die
Pyruvatdehydrogenase (Pyruvat wird zu Acetyl-CoA) zur Einführung von Pyruvat in
den Zitratzyklus, und können dementsprechend nur einen metabolischen Pfad nutzen.
1994 wurde eine Hypothese beschrieben (siehe Abbildung 3), die die Kopplung
zwischen synaptischer Aktivität und Energieverteilung über das sogenannte
Astrozyten-Neuronen-Laktat-Shuttle erklärt (Pellerin und Magistretti, 1994). Demnach
stimuliert Glutamat, das aus dem synaptischen Spalt im Symport mit Natrium in
Astrozyten aufgenommen wird und dann in Glutamin umgewandelt wird, die
Glukoseaufnahme und Laktatproduktion in Astrozyten, da sowohl der Transport
(Aufrechterhaltung des Natriumgradienten durch die Na+/K+ATPase) und die
Umwandlung ATP verbrauchen. Dies geschieht durch Enthemmung der glykolytischen
Schlüsselenzyme Hexokinase und Phosphofruktokinase. Überschüssiges Glutamat
wird in α-Ketoglutarat umgewandelt und fließt in den Zitratzyklus ein. Über die
Monocarboxylattransporter MCT1 (auch in anderen Gliazellen und Endothelzellen)
und MCT4 (nur in Astrozyten) wird das produzierte Laktat freigesetzt, dann über
neuronale MCT2 aufgenommen, in Pyruvat konvertiert und dann oxidativ im
Zitratzyklus metabolisiert (Magistretti und Allaman, 2015). Das hauptsächlich aus dem
Glutamat gewonnene Glutamin wird freigesetzt, von Neuronen aufgenommen und
wieder zu Glutamat recycelt. Zwei Mechanismen tragen dazu bei, dass mehr Glukose
durch die Glutamatstimulation in die Astrozyten aufgenommen wird und in Laktat
umgewandelt wird: zum einen wird die astrozytäre mitochondriale Kapazität zur
oxidativen Phosphorylierung durch Azidifizierung der mitochondrialen Matrix durch
Glutamat reduziert (Azarias et al., 2011), zum anderen führt glutamaterge Aktivität zur
2 Literaturübersicht
14
Inhibition der Glukoseaufnahme in Neuronen bei gleichzeitig erhöhter
Glukoseaufnahme in Astrozyten (Porras et al., 2004). Damit wird der
Glukoseverbrauch verlagert hin zu den Astrozyten, während die Neuronen vermehrt
auf Laktat zurückgreifen.
Abbildung 3: (Magistretti und Allaman, 2015) Überblick zum Astrozyten-Neuronen-Laktat-Shuttle.
Erklärungen befinden sich im Text direkt oberhalb der Abbildung. (EAATs = Excitatory Amino Acid
Transporters, hier sind GLT-1 (Glutamat-Transporter 1) und GLAST (Glutamat-Aspartat-Transporter)
gemeint, GS = Glutaminsynthetase, GLS = Glutaminase, LDH = Laktatdehydrogenase).
Die Reduktion einer Substratverstoffwechslung durch die andere wird als
Redox-Switch-Hypothese beschrieben (Cerdan et al., 2006). Laktat- und
Glukosestoffwechsel konkurrieren um zytosolisches NAD+ (Laktatdehydrogenase
versus Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, die beide NAD+ verbrauchen.
NAD+ wird bei geringem Sauerstoffpartialdruck durch Konversion von Pyruvat zu
Laktat regeneriert). Wenn nun durch neuronale Aktivierung die Laktatverfügbarkeit
steigt, wird vorrangig dieses metabolisiert, während die Glykolyse abnimmt. Dies
geschieht sowohl in Neuronen wie auch Astrozyten. Bei dieser Hypothese gibt es also
je einen Pyruvat- und Glutamat-Pool in Astrozyten oder Neuronen, der von
extrazellulären Monocarboxylaten oder Glukose herrührt (Cruz et al., 2001). Damit
wird die Idee des Astrozyten-Neuronen-Laktat-Shuttles erweitert (Garcia-Espinosa et
al., 2004). Die Reduktionsäquivalente Laktat und Pyruvat werden demnach abhängig
2 Literaturübersicht
15
von der Thermodynamik reversibel zwischen Neuronen und Astrozyten ausgetauscht
und nicht unilateral transportiert (Cerdan et al., 2006). So kann der Zitratzyklus
während der Erregung wohl in Neuronen und Glia ablaufen. Es ist durchaus plausibel,
dass dies zu Beginn einer glutamatergen Erregung der Fall ist und dann die
Mechanismen des Astrozyten-Neuronen-Laktat-Shuttles in den Vordergrund treten
(Magistretti und Allaman, 2015).
Eine weitere Überlegung zu einem möglichen Mechanismus der neuronalen
Bevorzugung von Laktat gegenüber Glukose bei glutamaterger Aktivierung ist ein
Ascorbinsäure-vermitteltes metabolisches Umschalten (Castro et al., 2009).
Abgegeben von Astrozyten (vermutlich in oxidierter Form über GLUT1 aus dem Blut
aufgenommen) infolge glutamaterger Aktivierung, wird Ascorbinsäure über SVCT2 in
Neuronen aufgenommen, trägt zum antioxidativen Schutz bei und verhindert weitere
Glukosekonsumierung mit zugleich gesteigerter Laktataufnahme.
Ketonkörper sind eine alternative Energiequelle des Gehirns (Morris, 2005).
Acetoacetat, Aceton und ß-Hydroxybutyrat werden in der Leber hauptsächlich aus
Fettsäuren gebildet. Aceton, das durch spontane Decarboxylierung aus Acetoacetat
entsteht, hat eine geringe physiologische Bedeutung für den Energiestoffwechsel. Der
Monocarboxylattransporter MCT1 ist verantwortlich für den Transport der Ketonkörper
durch die Blut-Hirn-Schranke (Gerhart et al., 1997). Durch eine sechswöchige
ketogene Diät in adulten Ratten war MCT1 achtfach stärker exprimiert (Leino et al.,
2001). Im Mausgehirn werden MCT1 und MCT2 exprimiert (Pellerin et al., 1998). Das
Gehirn selbst kann keine Fettsäuren oxidieren (Morris, 2005). Ketonkörper spielen
eine bevorzugte Rolle in der zerebralen Lipidsynthese (Webber und Edmond, 1977,
Lopes-Cardozo et al., 1986), scheinen dabei aber nicht unabdingbar zu sein (Morris et
al., 1998).
Generelle Übereinstimmung besteht darin, dass infolge neuronaler Aktivität sich
der zerebrale Blutfluss im Allgemeinen der metabolischen Nachfrage angepasst
steigert, und dass sowohl oxidativer und nichtoxidativer Stoffwechsel daran beteiligt
sind, den energetischen Anforderungen zu entsprechen (Bélanger et al., 2011).
Zerebraler Blutfluss und Glukoseverbrauch (CMRglc) ändern sich parallel (Gjedde et
2 Literaturübersicht
16
al., 2002), obwohl der Glukosetransport unabhängig von Blutflussänderungen ist. Die
Laktatbildung ist das mögliche Bindeglied zwischen zerebralem Blutfluss und
Glukoseverbrauch (Vafaee et al., 2012). In Gehirnschnitten von Ratten konnte gezeigt
werden, dass bei einer verminderten Sauerstoffverfügbarkeit astrozytäre Glykolyse
und Laktatfreisetzung maximiert werden (Gordon et al., 2008). Extrazelluläres Laktat
trägt zur Prostaglandin E2-Ansammlung bei, wodurch eine Vasodilatation zustande
kommt. Entsprechend wurde auch beobachtet, dass das zytosolische NADH-NAD+-
Verhältnis und das Laktat-Pyruvat-Verhältnis den zerebralen Blutfluss während der
neuronalen Aktivität beeinflussen (Vlassenko et al., 2006).
Astrozyten sind in der Lage, Ketonkörper zu produzieren (Guzmán und
Blázquez, 2004). Dies scheint durch den Glutamattransport in Astrozyten gesteigert
zu werden, auch durch cAMP-induzierende Rezeptoren wie ß-Adrenozeptoren und
Vasoaktives Intestinalpeptid-Rezeptoren in Astrozyten und Endocannabinoide. Bei
neuronaler Aktivität wird also eine weitere Energieversorgung geschaffen. Hypoxie
induziert in vitro Ketonkörperbildung in Neuronen wie in Astrozyten (Takahashi et al.,
2014).
2.2.4 Veränderungen während der Epileptogenese
2.2.4.1 Glukosestoffwechselveränderungen
Neurotransmission, Stoffwechselkreisläufe und Hyperexzitabilität stehen in engem
Zusammenhang (Pan et al., 2008). In der Latenzphase der Epileptogenese im
Kainatmodell in Ratten zeigte sich mittels Magnetresonanzspektroskopie eine
Erhöhung nicht-metabolisierter [1-13C]Glukose in mesialen temporalen Strukturen als
Hinweis auf einen verringerten Glukosestoffwechsel (Alvestad et al., 2011). Von [1,2-
13C]Acetat wurde im Hippokampus weniger 13C in Glutamat, Glutamin und GABA
inkorporiert, was auf einen verminderten astrozytären Stoffwechsel hindeutet. In
hippokampalen Astrozyten nahm im Vergleich zu Kontrolltieren das Verhältnis von
Acetat zu Glukose als Ausgangssubstrate zur Glutamat-Synthese zu, wobei für die
GABA-Synthese ein vermindertes Verhältnis von Acetat zu Glukose als Ursprung zu
finden war. Mögliche Erklärungen für die Verringerung des Glutamat- und Glutamin-
Umsatzes, wie auch des Umsatzes von GABA (vor allem im mesialen
2 Literaturübersicht
17
Temporallappen) sind eine Beeinträchtigung der Glykolyse, Neurodegeneration,
mitochondriale Dysfunktion in Astrozyten und Neuronen und beeinträchtigte Kreisläufe
von Glutamat, Glutamin und GABA während der Latenzphase in diesem Modell. In der
chronischen Phase fand man in diesem Tiermodell im Hippokampus und entorhinalen
Cortex weniger absolutes und mit 13C (aus intraperitonealer [1-13C]Glukose-Injektion
stammendes) gekennzeichnetes Glutamat und weniger markiertes Glutamin im
Hippokampus (Alvestad et al., 2008). Dies ging einher mit einer mitochondrialen
Dysfunktion im Hippokampus und Neuronenverlust. Im Neocortex hingegen war
vermehrt absolutes und radioaktiv markiertes GABA vorhanden. Allerdings wurde in
der Phase der chronischen Epilepsie im Lithium-Pilocarpinmodell in Ratten keine
Korrelation zwischen interiktalem (Glukose-)Hypometabolismus und Neuronenverlust
beobachtet (Dube et al., 2001). Der iktale Hypermetabolismus, der durch den Lithium-
Pilocarpin-induzierten Status epilepticus hervorgerufen wird, korrelierte dagegen mit
der neuronalen Schädigung in adulten Ratten (Fernandes et al., 1999). In reseziertem
Hippokampusgewebe von Patienten mit mesialer Temporallappenepilepsie fand man
eine verminderte Expression der Glutamin-Synthetase bei unverändertem
Expressionsniveau von EAAT2, dem hauptsächlichen Glutamattransporter in
Gliazellen des Hippokampus (Eid et al., 2004). Im epileptischen Hippokampus ist der
Gutamat-Glutamin-Kreislauf verlangsamt, es ist weniger Glutamin vorhanden bei
zugleich relativ mehr Glutamat (Petroff et al., 2002). Dies spricht für eine
beeinträchtigte Glutamatverstoffwechslung durch Astrozyten, die eine kontinuierliche
geringgradige Excitotoxizität begünstigen würde. Binnen Minuten nach Beginn von
Anfallsaktivität, induziert durch Pentylentetrazolinjektion in Ratten, wird die maximale
Geschwindigkeit der Glukosetransporter in der Blut-Hirn-Schranke und damit die
Glukosepermeabilität gesteigert (Cornford et al., 2000). Insulin kann Neuronen in
Zellkultur gegen Glutamattoxizität schützen und die in Folge von simultaner Sauerstoff-
und Glukosedeprivation stattfindende Internalisierung von GABAA-Rezeptoren
begrenzen (Mielke und Wang, 2005).
2 Literaturübersicht
18
2.2.4.2 Blut-Hirn-Schranken-Veränderungen
Die Blut-Hirn-Schranke besteht aus Endothelzellen, die über Tight Junctions
verbunden sind (van Vliet et al., 2015). Zusammen mit den benachbarten Astrozyten,
Perizyten und Neuronen bilden sie die neurovaskuläre Einheit, die für die Homöostase
des Gehirnmilieus unerlässlich ist (siehe Abbildung 4).
Abbildung 4: (Rustenhoven et al., 2017) Schematische Darstellung der neurovaskulären Einheit aus
Endothelzellen, Perizyten, Astrozyten und Neuronen, mit perivaskulärer Microglia.
Bei einem Status epilepticus ist eine gesteigerte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-
Schranke eine der ersten auftretenden pathologischen Folgen (Gorter et al., 2015), die
auch typisch für andere epileptogene Gehirninsulte ist. Diese Schädigung kann weitere
Prozesse nach sich ziehen, die vermutlich die Epileptogenese fördern (Weissberg et
al., 2011). Eine Studie konnte durch Induktion einer Blut-Hirn-Schranken-
Durchlässigkeit mittels Gallensalzen in Ratten einen epileptischen Fokus auslösen
(Seiffert et al., 2004). Eine Patientenstudie, die im Rahmen einer intraarteriellen
Chemotherapie zuvor mittels Mannitolinfusion eine Durchlässigkeit der Blut-Hirn-
Schranke induzierte, rief hierbei bei einem Viertel der Prozeduren akute Anfälle hervor,
was sich auch in einem angeschlossenen Experiment mit Schweinen bestätigte
(Marchi et al., 2007a). Anfälle wiederum können die Blut-Hirn-Schranke weiter
schädigen (van Vliet et al., 2015). Inwieweit eine Beeinträchtigung der Blut-Hirn-
Schranke zu Anfällen führt, wird kontrovers diskutiert aufgrund verschiedener
Studienergebnisse und auch der Tatsache, dass das Risiko für eine Epileptogenese
2 Literaturübersicht
19
bei einer Blut-Hirn-Schranken-Schädigung im Zusammenhang mit einem Trauma oder
einem Status epilepticus deutlich höher ist als beispielsweise bei Alzheimer
(Rosenberg, 2012). Die Untersuchung von Mechanismen der Blut-Hirn-Schranken-
Störung im zeitlichen Verlauf stellt im Hinblick auf mögliche Ansätze für
antiepileptogene Therapiestrategien ein interessantes Feld dar, da sie offensichtlich
während der gesamten Epileptogenese und in geringerem Ausmaß auch später in der
chronischen Phase anzutreffen ist (Roch et al., 2002b, van Vliet et al., 2016) und auch
in dem zweiten Manuskript dieser Arbeit verfolgt wurde. Eine Koinzidenz mit
inflammatorischen Prozessen in denselben Gehirnarealen wurde beobachtet (van
Vliet et al., 2007, Librizzi et al., 2012, Roch et al., 2002b). Es ist hochwahrscheinlich,
dass Entzündungsgeschehen eine zentrale Rolle in der Epileptogenese spielt
(Pitkänen et al., 2016). Für ein Entzündungsgeschehen relevante Strukturen, wie die
Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1, E- und P-Selektin, werden als Biomarker für
eine Epileptogenese diskutiert (Vezzani und Friedman, 2011), da sie nach einem
Status epilepticus auf der Oberfläche von Endothelzellen vermehrt exprimiert sind.
Die Integrität der Blut-Hirn-Schranke lässt sich mittels verschiedenster
Methoden untersuchen – elektronenmikroskopische und lichtmikroskopische
Protokolle mit Markern wie Meerrettichperoxidase, Evans Blue oder Fluoreszein
können eingesetzt werden. Für Untersuchungen in vivo eignen sich bildgebende
Verfahren, insbesondere kontrastmittelverstärkte MRT, aber auch [68Ga]DTPA-
Positronen-Emissionstomographie (PET) und [99mTc]DTPA-Einzelphotonen-
Emissionscomputertomographie (van Vliet et al., 2015, Breuer et al., 2016). In der
vorliegenden Arbeit wurde, wie in Abschnitt 4.3.2 beschrieben, die MRT verwendet.
Der besondere Vorteil dieser Bildgebungsmethoden liegt darin, dass ein Tier für die
Erfassung eines Zeitverlaufs wiederholt untersucht werden kann. Die MRT bietet von
den drei genannten Verfahren außerdem die beste Auflösung.
2.2.4.3 Inflammation
Untersuchungen in Gehirngewebe epileptischer Patienten und in Tiermodellen haben
gezeigt, dass Gliazellen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Wiederkehr von
Anfällen spielen (Vezzani et al., 2013, Gorter et al., 2015), und lassen darauf
2 Literaturübersicht
20
schließen, dass ein positiver Feedback-Zyklus zwischen der Epileptogenese und
entzündlichen Prozessen im Gehirn besteht (Shimada et al., 2014). So können
systemische Immunantworten auf eine Infektion mit dem Influenza-A-Virus zu einer
Epileptogenese nach febrilen Anfällen führen (Kawada et al., 2003). Aber auch die
Induktion anfallsartiger Aktivität kann im isolierten Meerschweinchengehirn die
Produktion von IL-1ß in Astrozyten hervorrufen und die Integrität der Blut-Hirn-
Schranke stören (Gorter et al., 2015). Zu den physiologischen Aufgaben von Gliazellen
gehört unter anderem die Kontrolle extrazellulärer Neurotransmitterkonzentrationen
(Eulenburg und Gomeza, 2010), die astrozytenvermittelte neurovaskuläre Kopplung
zwischen Neuronen und zerebralen Blutgefäßen, wodurch die Perfusion an die
neuronale Aktivität angepasst werden kann (Petzold und Murthy, 2011) und die
bidirektionale Kommunikation zwischen Neuronen und Astrozyten, die so die
synaptische Transmission und die Plastizität beeinflussen können (Santello et al.,
2012). Eine inflammatorische Reaktion auf eine Infektion oder andere Noxen ist per se
ein Verteidigungsmechanismus, der im Falle einer Beteiligung in der Epileptogenese
offenbar außer Kontrolle gerät und entsprechend fehlgeleitet Schaden anrichten kann
(Vezzani und Friedman, 2011). Gewebeproben aus Läsionen von Patienten mit
Temporallappenepilepsie und in Gewebe von chronisch epileptischen Ratten wurde
sowohl in Astrozyten, Microglia als auch in Neuronen eine verstärkte Expression von
IL-1ß und seinem Rezeptor IL-1R1 beschrieben (Ravizza et al., 2008). Proben aus
Läsionen von Patienten mit fokaler kortikaler Dysplasie zeigen neben der Aktiverung
der mTOR-Kaskade (Mammalian Target of Rapamycin) auch eine Aktivierung des
Komplementsystems (Iyer et al., 2010). Eine Überexpression des Toll-like Receptor 4
in Neuronen und Astrozyten und seines endogenen Liganden HMGB1 (High Mobility
Group Box 1) in Microglia und Astrozyten wurde in chronisch epileptischen Mäusen
wie in Patienten mit Temporallappenepilepsie, mesialer temporaler Sklerose und
fokaler kortikaler Dysplasie gefunden (Maroso et al., 2010, Zurolo et al., 2011). Es ist
anzunehmen, dass Microglia und Astrozyten eine wichtige Rolle bei der
Aufrechterhaltung der inflammatorischen Prozesse bei Epilepsie spielen, da sie auf
eine HMGB1-Stimulation hin eine Reihe verschiedener proinflammatorischer
Mediatoren produzieren (Vezzani et al., 2013). IL-1ß wirkt über eine Phosphorylierung
2 Literaturübersicht
21
der NR2B-Unterheit des N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptors (NMDA-Rezeptor)
prokonvulsiv, da der NMDA-abhängige Ca2+-Influx gesteigert wird (Balosso et al.,
2008). Im Hinblick auf die im Abschnitt 2.2.4.1 beschriebenen Veränderungen im
Glukosemetabolismus während der Epileptogenese ist unter den in der Literatur
beschriebenen möglichen Interaktionen zwischen inflammatorischen Mechanismen
und der Epileptogenese die Inhibition der astrozytären Glutamataufnahme durch IL-1ß
zu nennen (Hu et al., 2000). Eine Entzündung kann die Blut-Hirn-Schranken-Integrität
beeinträchtigen (Ferrari et al., 2004). Die darauffolgende Albuminextravasation kann
über TGF-ß-Rezeptoren (Transforming Growth Factor ß) in Astrozyten die
Herabregulierung von Kalium-Kanälen (Kir 4.1) induzieren, wodurch extrazelluläres
Kalium durch die Astrozyten nicht mehr genügend gepuffert werden kann und eine
NMDA-Rezeptor-vermittelte neuronale Hyperexzitabilität folgt (Ivens et al., 2007). In
Gewebe von Patienten mit Temporallappenepilepsie senkt IL-1ß GABAA-Ströme, nicht
aber in gesundem Gewebe (Roseti et al., 2015). Verquickungen von
inflammatorischen Prozessen und der Epileptogenese sind hinsichtlich der Aktivierung
von Astrozyten und Microglia in dieser Arbeit immunhistochemisch untersucht worden
(siehe erstes und zweites Manuskript). Zudem wurde zur Untersuchung der
Aktivierung von Microglia in vivo die [18F]GE-180-Positronen-Emissionstomographie
eingesetzt (siehe Manuskript 3 und Abschnitt 2.3.3).
2.2.5 Konzepte für Antiepileptogenese
Im Hinblick auf die hohe Anzahl an pharmakoresistenten Epilepsiepatienten, die mit
einem Drittel beziffert wird (Brodie et al., 2012), wie auch auf die bisher fehlende
Möglichkeit, eine Epilepsie medikamentös zu heilen, liegt eine Hoffnung in dem
Konzept der Antiepileptogenese (Baulac et al., 2015). Durch den Eingriff in die
Veränderungen des Gehirns während der Epileptogenese soll damit eine
Epilepsieprävention erreicht werden, oder aber zumindest die Krankheit
abgeschwächt werden (Löscher und Brandt, 2010) (vergl. Abbildung 1 in Abschnitt
2.2.1). Weitere Zeitpunkte des Eingreifens sind generell denkbar – eine Therapie vor
Beginn der Epileptogenese im Sinne einer Insultmodifikation könnte diese verhindern
oder verzögern. Eine Behandlung nach der Diagnosestellung könnte die Progression
2 Literaturübersicht
22
der Erkrankung verhindern oder einer Pharmakoresistenz entgegenwirken, und wäre
somit krankheitsmodifizierend (Galanopoulou et al., 2012, Lagae et al., 2003). Zugleich
wäre eine Beeinflussung der Komorbiditäten von Epilepsie durch eine antiepileptogene
Therapie denkbar.
Auf der Suche nach wirksamen antiepileptogenen Therapieansätzen werden
verschiedene Ansätze verfolgt. Unter anderem wurde untersucht, wie sich die Gabe
von Neuroprotektiva (Paradiso et al., 2009, Gu et al., 2015), antiinflammatorischer
Wirkstoffe (Jung et al., 2006, Holtman et al., 2009, Polascheck et al., 2010, Noe et al.,
2013, Russmann et al., 2016) oder Inhibitoren der Entzündungszelladhäsion an das
Endothel der Blut-Hirn-Schranke zur Blockade der Einwanderung peripherer
Immunzellen (Fabene et al., 2008) auf die Epileptogenese auswirken. In diesem
Zusammenhang besteht ein weiterer Ansatz, der nun auch in dieser Arbeit verfolgt
wird, darin, Veränderungen des Energiestoffwechsels durch die Epileptogenese
genauer zu erforschen und als möglichen Angriffspunkt für eine Therapie zu
untersuchen, wie in Abschnitt 4.2 und 4.4 genauer beschrieben.
2.2.5.1 Energiestoffwechsel-beeinflussende Therapien chronischer Epilepsie
Es gibt vier verbreitete Diäten zur Behandlung einer chronischen Epilepsie bei
Humanpatienten, die alle eine recht hohe und ähnliche Effizienz aufweisen, wobei die
klassische ketogene Diät etwas effektiver sein kann (Dhamija et al., 2013): Die
klassische ketogene Diät mit einem festgelegten Verhältnis von Fett zu Protein und
Kohlenhydraten besteht hauptsächlich aus langkettigen Triglyzeriden und wurde 1921
beschrieben (Wilder, 1921). Eine Variante mit Einsatz von Öl bestehend aus
mittelkettigen Triglyzeriden (MCT) bildet die von Huttenlocher et al. zuerst
beschriebene MCT-Diät (Huttenlocher, 1976). Für die modifizierte Atkins-Diät werden
die Kohlenhydrate begrenzt (Kossoff et al., 2006), für die Diät mit Beachtung eines
niedrigen glykämischen Index die Kohlenhydrate einzeln bewertet (Pfeifer und Thiele,
2005). Die Diäten bedeuten je nach Design besondere Einschränkungen für die
alltägliche Ernährung und erlauben unterschiedlich etwas mehr Freiheiten als die
klassische ketogene Diät, die zwar sehr strikt und aufwändig, dafür aber auch sehr
genau steuerbar ist. Am häufigsten wird eine ketogene Diät bei pharmakoresistenter
2 Literaturübersicht
23
Epilepsie eingesetzt (Cervenka et al., 2016, Felton und Cervenka, 2015), wobei bisher
eine breit gefächerte Wirksamkeit bei Epilepsien unterschiedlicher Genese beobachtet
wurde (Haas et al., 1986, Kossoff et al., 2005, Crumrine, 2011, Kossoff et al.). In den
letzten Jahren hat die ketogene Diät zudem eine Art Renaissance erfahren, da sie im
Hinblick auf die Therapie pharmakoresistenter Epilepsien eine wertvolle Option bietet
und nun auch in adulten Patienten eingesetzt wird (Cervenka et al., 2016, Coppola et
al., 2002, Schoeler et al., 2014). Noch in der Erforschung ist die Supplementierung der
täglichen Nahrung mit Ketonestern (Ciarlone et al., 2016, Viggiano et al., 2016, Hashim
und VanItallie, 2014).
2.2.5.2 Wirkungsweise der ketogenen Diät
Die ketogene Diät wie auch das Fasten führt zu einer Umstellung des Stoffwechsels
von der hauptsächlichen Nutzung von Glukose hin zu Ketonkörpern als Substrat zur
Energiegewinnung, deren genaue antikonvulsive Wirkungsmechanismen noch
weitergehend zu erforschen sind (Boison et al., 2013, Masino et al., 2011). Studien
konnten schon einige mögliche relevante Mechanismen aufdecken, wie die Wirkung
an Adenosin-Rezeptoren, auf die Mitochondrienzahl, auf KATP-Kanäle, auf die
Synthese von Kynurensäure, auf die Konzentration von GABA, auf den vesikulären
Glutamattransport, und direkte Wirkungen von Ketonkörpern. Diese sollen im
Folgenden jeweils kurz angesprochen werden.
Nach einer Studie in Mäusen ist die Wirksamkeit der ketogenen Diät
offensichtlich abhängig vom Vorhandensein von Adenosin A1-Rezeptoren (A1R)
(Masino et al., 2011) und wirkt zugleich hemmend auf die Expression von
Adenosinkinase. Tiere mit einer Überexpression von Adenosinkinase (gesteigerte
Adenosin-Clearance) und Tiere mit einem oder zwei fehlenden A1R-Allelen zeigen
elekroenzephalographisches Anfallsgeschehen, das bei dreiwöchiger Fütterung einer
ketogenen Diät in Tieren mit Adenosinkinaseüberexpression fast vollständig, in Tieren
mit einem fehlenden A1R-Allel weniger stark und in Tieren ohne A1R-Allele supprimiert
wird (Masino et al., 2011). Dieser Effekt kann durch Glukosegabe oder A1R-Blockade
aufgehoben werden. Dazu passend wurde in Pyramidenzellen der CA3 entdeckt, dass
verringerte extrazelluläre Glukoseverfügbarkeit bei zugleich ausreichend oder
2 Literaturübersicht
24
vermehrtem intrazellulären ATP (eine Situation wie bei einer ketogenen Diät) über
extrazelluläres Adenosin an A1R zu einer verringerten neuronalen Erregbarkeit führt
(Kawamura et al., 2010). Dieses Adenosin entsteht durch Dephosphorylierung von
ATP, das in dieser Situation autoregulatorisch über Pannexin-1 freigesetzt wird und
dann an A1R wirkt, die in funktioneller Verbindung mit KATP-Kanälen zu einer
Hyperpolarisierung der Neuronen führen. Durch eine chronische ketogene Diät wird in
der Ratte die Aktivität von glykolytischen und Zitratzyklus-assoziierten Enzymen nicht
verändert (Bough et al., 2006), wobei Energiestoffwechsel-assoziierte Enzyme und
mitochondriale Proteine verstärkt exprimiert werden. Elektronenmikroskopisch wurden
im Gyrus dentatus mehr Mitochondrien gezählt als bei mit Standarddiät gefütterten
Kontrollratten. In einem Mausmodell für Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase-
Mangel konnte eine ketogene Diät die Zahl der hippokampalen Mitochondrien wieder
erhöhen und damit die ATP-Konzentration normalisieren (Nylen et al., 2009).
In einer Mikrodialysestudie in Ratten, die über 15 Tage eine ketogene Diät
erhielten, fand man im Vergleich zu Kontrolltieren einen Anstieg der GABA- und
Agmantin-Konzentration, wobei Glutamat unverändert blieb (Calderon et al., 2017). In
GABAergen Neuronen der Substantia nigra in Gehirnschnitten von noch gesäugten
Mäusen und Ratten verursachen ß-Hydroxybutyrat wie auch Azetoazetat die Öffnung
von KATP-Kanälen und damit eine Hemmung ihres Feuerns (Ma et al., 2007). Die
Autoren stellen die Hypothese auf, dass die ATP-Konzentration durch eine ketogene
Diät zwar global gesteigert wird, aber die glykolytische ATP-Bildung lokal an der
neuronalen Plasmamembran sinkt. Hierdurch werden die verbreitet vorkommenden
KATP-Kanäle enthemmt und es kommt zur Verminderung der neuronalen Aktivität.
Ein möglicher Wirkmechanismus von ß-Hydroxybutyrat könnte die Steigerung
der Synthese von Kynurensäure sein, die einen endogenen Antagonist von Glutamat-
und α7-nicotinergen Rezeptoren darstellt (Chmiel-Perzynska et al., 2011). In
kultivierten Astrozyten bewirkt ß-Hydroxybutyrat eine Unterdrückung der GABA-
Transaminase und der Expression von GABA-Transporter 1 (Suzuki et al., 2009).
Allerdings wird ein Einfluss auf die GABA-Konzentration kontrovers diskutiert, da es
sowohl positive als auch negative Studien hierzu gibt (McNally und Hartman, 2012).
Ein erhöhter Flux durch die Glutamatdehydrogenase könnte ursächlich für eine
2 Literaturübersicht
25
vermehrte GABA-Synthese sein, wenn aus Glutamat mangels Oxalacetat (im Mangel
bei einer Ketose) weniger Aspartat entsteht (Yudkoff et al., 2005).
Vesikuläre Glutamattranporter (VGLUT1-3) spielen offenbar auch eine Rolle bei
den Wirkungsweisen einer ketogenen Diät (Juge et al., 2010). Acetoacetat kann den
vesikulären Glutamattransport reversibel hemmen, indem es die allosterische
Modulation durch Chloridionen inhibiert. Diese Inhibition geschieht vermutlich über
eine kompetitive Bindung an die Chlorid-Bindungsstellen. Eine glutamaterge
synaptische Übertragung würde so gehemmt.
Die ketogene Diät zeigt neuroprotektive Eigenschaften bei einer Kainatinjektion
in zuvor über vier Wochen mit der Diät gefütterten Ratten (Noh et al., 2008) und auch
bei Ratten, deren einwöchige Fütterung mit ketogener Diät erst direkt nach einer
kontrollierten traumatischen Gehirnverletzung begann (Prins et al., 2005). Ein
möglicher Mechanismus könnte hierbei eine Abschwächung der Glutamattoxizität
durch eine Verminderung der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sein, wie
es in einer Zellkulturstudie mit Azetoazetat gesehen wurde (Noh et al., 2006). Eine
chronische ketogene Diät steigert in Ratten die antioxidative Kapazität mit einem
Anstieg der Glutathion-Peroxidase im Hippokampus (Ziegler et al., 2003).
Neuroprotektiv könnte die ketogene Diät auch über die Hemmung des Kalzium-
induzierten mitochondrialen Permeabilitätsüberganges MPT) wirken, worauf eine
Studie in epileptischen Kcna1-null Mäusen hindeutet (Kim et al., 2015). In einer
Untersuchung inhibiert ß-Hydroxybutyrat selektiv Histon-Deacetylasen, wodurch die
Transkription von Genen für die Resistenzfaktoren FOXO3A (Forkhead Box O3) und
MT2 (Metallothionein 2) gegen oxidativen Stress ansteigt und somit mit ß-
Hydroxybutyrat behandelte Mäuse vor oxidativem Stress geschützt werden (Shimazu
et al., 2013).
Die ketogene Diät kann die Glutathion-Synthese erhöhen, offenbar über den
Nrf2-Transkriptionsfaktor (Nuclear Factor 2), der am Anfang einer ketogenen Diät
durch den akut hervorgerufenen und später ausgeglichenen milden oxidativen Stress
aktiviert wird (Milder et al., 2010). Dies führt zu einer chronischen zellulären
Anpassung mit einem verbesserten mitochondrialen Redoxstatus. Eine Injektion des
Transkriptionsfaktors in viralen Vektoren in Mäusen zwei Wochen nach
2 Literaturübersicht
26
pilocarpininduziertem Status epilepticus führte zu Neuroprotektion, weniger
generalisierten Anfällen und verminderter Microgliaaktivierung (Mazzuferi et al., 2013).
Eine ketogene Diät kann in Mäusen durch Aktivierung des mitochondrialen
Entkopplungsproteins (UCP) die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies senken (Sullivan
et al., 2004).
In Mäusen wurde durch ß-Hydroxybutyrat das NLRP3-Inflammosom (NLR
(Nucleotide-Binding Domain, Leucine-Rich Repeat) Family Pyrin Domain Containing
3) in verschiedenen Krankheitsmodellen inhibiert und somit die IL-1ß-Sekretion
vermindert (Youm et al., 2015). Dieses Inflammasom ist unter anderem Teil des
Entzündungsgeschehens bei Epilepsie (Zhou et al., 2016, Meng et al., 2014). Für
Azeton wurden direkte antikonvulsive Wirkungen in verschiedenen Tiermodellen
beschrieben (Likhodii et al., 2008), für ß-Hydroxybutyrat wurde eine Erhöhung der
Anfallsschwelle im Pilocarpinmodell in Mäusen gefunden (Yum et al., 2012).
Acetoacetat inhibiert spannungsabhängige Ca2+-Kanäle und vermindert
exzitatorische postsynaptische Potentiale in Gehirnschnitten mit epileptiformer
Aktivität (Kadowaki et al., 2017).
Somit sind für die ketogene Diät viele Teilaspekte der Wirkungsentfaltung gezeigt oder
postuliert worden. Dennoch sind hier noch viele Fragen offen. Beschreibungen einer
deutlich verminderten Anfallshäufigkeit bei Patienten noch über die Dauer der
ketogenen Diät hinaus (Hemingway et al., 2001, Marsh et al., 2006) geben Hinweise
darauf, dass die ketogene Diät krankheitsmodifizierende Effekte haben könnte. Eine
Studie im Kainatmodell in Ratten fand einen positiven Effekt im Hinblick auf die
späteren spontanen Anfälle (Muller-Schwarze et al., 1999).
2.2.5.3 Wirkungsweisen der 2-Desoxy-D-Glukose
2-Desoxy-D-Glukose (2-DG) ist ein Glukoseanalogon, das die Glykolyse hemmt (Xi et
al., 2014). Die 2-DG befindet sich derzeit in der präklinischen Entwicklung zum
therapeutischen Einsatz bei Epilepsie (Bialer et al., 2015). Bezüglich der Entwicklung
zur Verwendung von 2-DG in der Onkologie wurden schon Ergebnisse von klinischen
Phase I/II-Studien publiziert. Diese zeigen eine gute Verträglichkeit (Stein et al., 2010,
Singh et al., 2005, Raez et al., 2013). 2-DG führt in Brustkrebszellen dosisabhängig zu
2 Literaturübersicht
27
einer verstärkten Expression von GLUT1, damit zu verstärkter Aufnahme in die Zelle,
zu Glukosedeprivation und schließlich zur Apoptose (Aft et al., 2002).
2-DG wird wie Glukose in Zellen aufgenommen und zu 2-DG-6-Phosphat
phosphoryliert (Kipnis und Cori, 1959), akkumuliert dann aber intrazellulär, weil sie nur
noch über den Pentosephosphatweg weiter verstoffwechselt werden kann (Zabos et
al., 1978, Forte et al., 2016) und damit zu vermehrt NADPH führt. 2-DG-6-Phosphat
inhibiert die Glukoseaufnahme über die Glukosetransporter (Kipnis und Cori, 1959)
und konkurriert mit Glukose-6-Phosphat um die Phosphoglukoseisomerase (Wick et
al., 1957, Nirenberg und Hogg, 1958). Außerdem scheint 2-DG-6-Phosphat die
Hexokinase allosterisch zu hemmen (Chen und Gueron, 1992). Durch die Blockade
der glykolytischen Energiegewinnung wird alternativ die Synthese von Ketonkörpern
stimuliert, was zu einer Verbesserung der Mitochondrienfunktion führt (Yao et al.,
2011). Diese Eigenschaften führen wahrscheinlich dazu, dass 2-DG sowohl
antikonvulsive, als auch prokonvulsive Wirkung haben kann (Gasior et al., 2010). Die
antikonvulsive Wirkung wird zu einem Teil der Hemmung der Glukoseaufnahme und
vor allem der Hemmung der Glykolyse und nachfolgender Verstärkung des
Pentosephosphatweges zugeschrieben, die prokonvulsive Wirkung vor allem der in
der jeweiligen Situation übermäßigen Hemmung der Glukoseaufnahme.
2-DG führt über eine verstärkte Neurosteroidproduktion (über den
Pentosephosphatweg) mit Wirkung auf extrasynaptische GABAA-Rezeptoren zu einer
verstärkten GABAergen tonischen Inhibition im Hippokampus (Forte et al., 2016). 2-
DG vermindert in einem Kindlingmodell die anfallsinduzierte Hochregulierung von
BDNF und TrkB im Hippokampus, die für das Kindling erforderlich sind (Garriga-Canut
et al., 2006). Dies geschieht über den Transkriptionsrepressor NRSF und seinen
NADH-sensitiven Ko-Repressor CtBP – durch die NADH-Verringerung im Rahmen der
Glykolyseinhibition bewirkt 2-DG die Dissoziation von CtBP von NRSF, wodurch die
Expression von BDNF und TrKB vermindert wird. Anderenfalls würde durch die
neuronale Aktivierung auch die Glykolyse gesteigert und folglich mehr NADH
produziert. Die Hochregulierung von den KATP-Kanaluntereinheiten Kir6.1 und Kir6.2
wird auch als antiepileptische Wirkungsweise der 2-DG beschrieben (Yang et al.,
2013). Es wäre möglich, dass durch eine Hemmung der Glykolyse in Membrannähe
2 Literaturübersicht
28
weniger ATP vorhanden ist, wodurch sich die KATP-Kanäle öffnen und es zu einer
Hyperpolarisation der Zelle kommen würde (Ma et al., 2007). 2-DG wird von
metabolisch aktiven Zellen aufgenommen und wirkt somit aktivitätsabhängig (Masino,
2016). Eine Studie im Kainatmodell in Ratten zeigt, dass 2-DG
konzentrationsabhängig (in moderaten Dosen) neuroprotektiv wirkt, die Bildung
reaktiver Sauerstoffspezies hemmen und die intrazelluläre Kalzium-Homöostase
bewahren kann (Lee et al., 1999). Das Hitzeschockprotein HSP70 und das
glukoseregulierte Protein GRP78 werden in Gegenwart von 2-DG in hippokampalen
Neuronen vermehrt gebildet und führen wahrscheinlich zu der erhöhten Resistenz
gegenüber oxidativem und metabolischem Stress – durch die Unterdrückung von
ROS-Bildung, den Erhalt des Kalzium-Gleichgewichts und der mitochondrialen
Funktion. Entscheidend für die Verträglichkeit und positive Wirkung der 2-DG scheint
neben der Dosis auch das Behandlungsregime zu sein, da eine chronische Gabe
intrazerebroventrikulär pro-epileptogene Effekte in Ratten zeigt (Samokhina et al.,
2017). Die 2-DG könnte antiepileptogene Wirkungen haben, wie ein Tagungsbeitrag
zum Kindlingmodell in Ratten über den Tractus perforans (Sutula und Franzoso, 2008)
vermuten lässt, da die Gabe von 2-DG bis zu 10 Minuten nach den Anfällen zu einer
verlangsamten Kindlingprogression führt.
2.3 Positronen-Emissionstomographie und Epilepsie
2.3.1 Prinzip und Bedeutung der Positronen-Emissionstomographie
Die Positronen-Emissions-Tomographie ist eine Bildgebungsmethode, die seit den
1970er Jahren für den Einsatz am Menschen entwickelt (Bankstahl und Bankstahl,
2012) und klinisch in vielen Anwendungsgebieten eingesetzt wird. Beispielsweise dient
sie in der Onkologie zur Diagnose von Tumoren, in der Kardiologie zur Untersuchung
der myokardialen Perfusion und in der Neurologie unter anderem zur
Charakterisierung früher Stadien von Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson (Miller
et al., 2008). Die Entwicklung von Scannern mit einer besonders hohen Auflösung von
unter 1,5 mm, die zur Untersuchung von Ratten- und Mausmodellen geeignet sind,
begann allerdings erst Ende der 1990er Jahre (Bankstahl und Bankstahl, 2012) und
brachte damit ganz neue Möglichkeiten für die präklinische Forschung.
2 Literaturübersicht
29
Die biologische Grundlage der PET liegt darin, dass ein zu untersuchendes
Molekül, der sogenannte Radiotracer, radioaktiv markiert in vivo auf der Ebene des
vollständigen lebenden Organismus detektiert und visualisiert wird (Cherry und
Gambhir, 2001). Der am häufigsten eingesetzte Radiotracer ist [18F]FDG
(Dedeurwaerdere et al., 2007), der sowohl für die Epilepsiediagnostik als auch die
Epilepsieforschung wichtig ist und im Abschnitt 2.3.2 charakterisiert wird. Mit der
Darstellung der Verteilung des Radiotracers können dessen Transport, seine
Verstoffwechselung und Ausscheidung, aber auch Interaktionen oder
Signaltransduktionen zwischen Organen untersucht werden. Bei dynamischen PET-
Untersuchungen kann nach intravenöser Radiotracer-Injektion die Tracerverteilung
über die Zeit hinweg direkt nachvollzogen werden. Einsatzgebiete sind beispielsweise
Untersuchungen von Blutfluss, Stoffwechsel von Substraten, Proteinsynthese,
Rezeptoren, Enzymaktivität und Genexpression (Cherry und Gambhir, 2001, Xi et al.,
2011).
Die Entdeckung der physikalischen Grundlage dieser Technik, die Emission von
Positronen aus radioaktiven Kernen, begann ab 1933 (Bailey et al., 2004). Beim ß+-
Zerfall besteht das emittierte Positron nur etwa für 10-9 s, bevor es mit einem Elektron
zusammentrifft und beide mit der Annihilation in zwei entgegengesetzt wegstrahlende
Photonen mit einer Energie von je 511 keV überführt werden (Geworski et al., 2005).
Der ß+-Zerfall kommt nur bei künstlich hergestellten Radionukliden vor. Bei der
Durchdringung von Materie wird diese Strahlung durch Photoabsorption und Compton-
Streuung abgeschwächt. Bei der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wird nun
die Annihilationsstrahlung des zuvor in Form eines Radiopharmakons inkorporierten
ß+-Strahlers mittels Koinzidenzmessung durch einen Detektorring erfasst (siehe
Abbildung 5). Die Koinzidenzauflösungszeit ist abhängig von Laufzeitunterschieden
der у-Quanten und der Güte des Detektormaterials. Ansonsten ist das Messergebnis
abhängig von der Detektorfläche, der Detektoranzahl, der Detektorendichte, den
Zählverlusten bei starker Strahlung und der Absorption der Strahlung auf dem Weg
zum Detektor. Die in den Organismus injizierte Dosis an Strahlung wie auch die
Aquisitionsdauer sind weitere entscheidende Bildparameter für das Signal-Rausch-
Verhältnis (Cherry und Gambhir, 2001).
2 Literaturübersicht
30
Abbildung 5: (Miller et al., 2008)
Prinzip der PET: Der injizierte
Radiotracer zerfällt während
seiner Verteilung im Körper und
strahlt Positronen ab. Bei dem
Zusammentreffen mit Elektronen
im Gewebe kommt es zur
Annihilation und zwei diametral
voneinander wegstrahlende у-
Quanten entstehen, die dann als
Koinzidenz vom Detektorring
erfasst werden.
Ein großer Vorteil der PET ist, dass fast alle biologisch aktiven Strukturen aus
Elementen bestehen, zu denen passende Radioisotope verfügbar sind. Somit kann
man diese radioaktiv markieren, ohne ihre biologische Funktionsweise zu beeinflussen
(Schnöckel et al., 2010). Wichtig ist, dass die Menge an benötigtem Radiotracer
abhängig von seiner spezifischen Aktivität ist (= Radioaktivität / Masse des Tracers)
und meist deutlich unter einer für pharmakologische Wirkungen nötigen Konzentration
im Körper vorliegt (Virdee et al., 2012). Im Gegensatz zu möglichen anderen
Techniken wie Autoradiographie oder Immunhistochemie ist die Methode nicht final,
erfordert also verhältnismäßig geringe Tierzahlen, da longitudinale Studien
durchgeführt werden können und die Tiere teilweise zugleich als ihre eigene Kontrolle
dienen können (Bankstahl und Bankstahl, 2012, Schnöckel et al., 2010). Zudem
können die Entwicklung und der Verlauf einer Erkrankung mitsamt Therapiewirkungen
innerhalb ein und desselben Tieres verfolgt werden (Dedeurwaerdere et al., 2007).
2.3.2 [18F]FDG und zerebraler Glukosemetabolismus
Das Glukoseanalogon 2-[18F]Fluoro-desoxy-D-Glukose ([18F]FDG) ist der in Klinik und
Forschung am häufigsten eingesetzte Radiotracer (Dedeurwaerdere et al., 2007).
[18F]FDG dient der Untersuchung der Glukoseaufnahme und des
Glukosemetabolismus, mit hauptsächlichem Einsatz als Tracer in der Onkologie, der
Neurologie und der Kardiologie. Durch die [18F]FDG-PET kann damit zusätzlich zu
2 Literaturübersicht
31
einer diagnostischen Beurteilung auch die Effektivität einer Tumor-Therapie überwacht
werden. [18F]FDG wird genau wie Glukose in die Zelle aufgenommen, dort aber nicht
wie Glukose letztlich in den Zitronensäure-Zyklus eingebracht, sondern als
Fehlmetabolit in der Zelle „gefangen“ („Trapping“). Insbesondere bei
pharmakoresistenten Epilepsiepatienten besteht ein klinischer Einsatz der [18F]FDG-
PET darin, die Position und Ausdehnung des epileptischen Fokus vor einer möglichen
chirurgischen Resektion näher einzugrenzen, wenn eine MRT kein oder kein
eindeutiges Ergebnis geliefert hat (Bankstahl und Bankstahl, 2012). Bei Patienten mit
Temporallappenepilepsie, der häufigsten Epilepsieform (Löscher und Brandt, 2010),
findet man durch die [18F]FDG-PET bei fast 20 % der Kinder und bei bis zu 50 % der
Erwachsenen mit kürzlich begonnenem Anfallsauftreten einen Hypometabolismus. Bei
Patienten mit subklinischen Anfällen oder interiktalen Spikes ist die [18F]FDG-PET
hingegen mit einem Hypermetabolismus assoziiert (Stefan und Theodore, 2012). Auch
präklinische PET-Untersuchungen in Nagermodellen zeigen, dass Veränderungen im
zerebralen Glukose-Stoffwechsel während der Epileptogenese auftreten.
Übereinstimmend mit den klinischen Befunden finden sich eine erhöhte Aufnahme von
[18F]FDG im Hippokampus in verschiedenen Anfalls- und Epilepsiemodellen bei Ratten
und Mäusen (Mirrione et al., 2006, Kornblum et al., 2000). Im Pilocarpinmodell der
Ratte zeigt die [18F]FDG-PET bereits in der frühen Latenzphase nach einem Status
epilepticus in diversen Gehirnregionen eine Abnahme des Glukosemetabolismus, die
während der chronischen Phase der Epilepsie im Hippokampus und Thalamus
bestehen bleibt (Guo et al., 2009). Eine weitere Studie an Ratten nach systemischer
Kainat-Injektion ergab, dass der hippokampale Hypometabolismus im Laufe der
Latenzphase etwas abnimmt und schließlich wieder deutlicher wird, sobald die ersten
spontanen Anfälle auftreten (Jupp et al., 2012). Anhand dieser und weiterer Arbeiten
lässt sich darauf schließen, dass Veränderungen des Glukosemetabolismus eine
wichtige Rolle bei der Entwicklung von Epilepsien spielen. Da nicht alle Patienten bzw.
Tiere nach einem Hirninsult auch eine Epilepsie entwickeln, werden die
glukometabolischen Veränderungen auch als prognostischer PET-Biomarker für ein
erhöhtes Risiko zur Epileptogenese diskutiert. Eine mögliche Hemmung oder
Normalisierung dieser glukometabolischen Veränderungen stellt eine
2 Literaturübersicht
32
vielversprechende Strategie zur Epilepsie-Prävention oder Krankheitsmodifikation dar.
Bisher stehen Studien, die eine potentielle pharmakotherapeutische Beeinflussbarkeit
dieser metabolischen Veränderungen untersuchen, allerdings noch weitestgehend
aus.
2.3.3 [18F]GE-180 und TSPO
Der Radiotracer [18F]GE-180 (Flutriciclamid) ist ein Ligand des sogenannten
„Translocator Protein“ (TSPO). Dieses Protein hat ein Molekulargewicht von 18kDa
und kommt hauptsächlich in der äußeren Mitochondrienmembran vor (Papadopoulos
et al., 2006). Die TSPO-PET hat sich als geeignete Methode gezeigt, um longitudinal
Entzündungsverläufe während der Epileptogenese im Pilocarpinmodell in Ratten zu
untersuchen (Brackhan et al., 2016, Yankam Njiwa et al., 2016b). Ratten zeigten
während der frühen Epileptogenese im Kainatmodell ein erhöhtes TSPO-PET-Signal
im Hippokampus und der Amygdala (Dedeurwaerdere et al., 2012). Die
immunhistochemisch nachgewiesene Microglia-Aktiverung korrelierte mit der
Autoradiographie zur Untersuchung der TSPO-Expression. Eine weitere Studie im
Kainatmodell in Ratten zeigte ebenfalls eine deutlich erhöhte TSPO-Expression
während der Epileptogenese, die auch während der chronischen Epilepsie noch
detektierbar war, und mit Microglia-Aktivierung und Neurodegeneration korrelierte
(Amhaoul et al., 2015). In Ratten nach elektrisch induziertem Status epilepticus wurde
mit TSPO-PET ein stärkeres TSPO-Signal gefunden, wenn Anfälle nicht erfolgreich
mit Phenobarbital supprimiert werden konnten (Bogdanovic et al., 2014). Tiere mit
erfolgreicher Phenobarbitaltherapie zeigten hinsichtlich der TSPO-Expression keine
Unterschiede zu Kontrolltieren, obwohl beide Tiergruppen nach Status epilepticus
histologisch eine Neurodegeneration und eine Microglia-Aktivierung zeigten.
TSPO scheint bei verschiedensten pathologischen Geschehen eine Rolle zu
spielen, unter anderem bei Alzheimer, Parkinson, Metastasierung, Entzündung und
Angststörungen (Li et al., 2016). 1977 wurde es als ein Benzodiazepin-bindendes
Protein in peripheren Geweben entdeckt (Braestrup und Squires, 1977). Seitdem
wurde es als wichtig erachtet für den Cholesteroltransport von der äußeren zur
innneren Mitochondrienmembran (Krueger und Papadopoulos, 1990) und mit einer
2 Literaturübersicht
33
regulierenden Funktion auf die Steroidgenese (Mukhin et al., 1989), einer
immunmodulatorischen Wirkung (Lenfant et al., 1986) und mit regulierendem Einfluss
auf die Zellatmung (Hirsch et al., 1989) beschrieben. Bis heute ist seine Rolle in der
Steroidsynthese nicht geklärt. TSPO kann allgemein als Orphan-Rezeptor
beschrieben werden, da unbekannt ist, welche Liganden physiologisch relevant sind
(Li et al., 2016). Allerdings gibt es erste Studien, die Liganden wie Etifoxin erfolgreich
gegen Angststörungen einsetzen konnten (Nguyen et al., 2006). Der Ligand Ro5-4864
zeigte sich als neuroprotektiv in einem Rattenmodell für periphere diabetische
Neuropathie (Giatti et al., 2009).
Es gibt mehrere Generationen von Tracern für die TSPO-PET. Der
antagonistische TSPO-Ligand [11C]PK11195 gehört zur ersten Generation und wird
als Tracer für Neuroinflammation bei der Forschung in vivo zu Schlaganfall,
Neurodegeneration, traumatischer Gehirnverletzung und Neoplasien eingesetzt
(Turkheimer et al., 2015). [18F]GE-180 als TSPO-Ligand der neueren Generation hat
den Vorteil, dass kein Zyklotron für die Produktion vor Ort nötig ist, da die Halbwertszeit
von 18F bei 109,8 Minuten liegt (bei 11C nur bei 20,4 Minuten). Es gibt wie bei
[11C]PK11195 zwei Enantiomere, die unterschiedliche Bindungseigenschaften
aufweisen (Chau et al., 2015). Auch zeigt es eine gute Lipophilität (Feeney et al.,
2016). [18F]GE-180 wurde als Entzündungsmarker während der Therapie in einem
chronischen Rattenmodell für multiple Sklerose eingesetzt (Airas et al., 2015) und des
Weiteren im PS2APP Alzheimer-Mausmodell (Brendel et al., 2016). Die Ergebnisse
bei der Verwendung dieses Radiotracers in der Bildgebung korrelieren gut mit
Autoradiographie und immunhistochemischen Methoden. Das Signal-Rausch-
Verhältnis zeigte sich als verbessert im Vergleich zum Einsatz von [11C]PK11195 in
einem Rattenmodell für Schlaganfall (Boutin et al., 2015) und einem akuten
Lipopolysaccharid-induzierten Modell für Entzündung des zentralen Nervensystems
(Dickens et al., 2014).
Erste TSPO-PET-Studien in einzelnen epileptischen Patienten sind
beschrieben und zeigen zum Teil gute Übereinstimmungen mit anderen Methoden bei
der Lokalisation von Anfallsherden (Theodore, 2017). Eine klinische Studie in einem
2 Literaturübersicht
34
kleinen Patientenkollektiv konnte mit TSPO-PET Entzündungsvorgänge bei Epilepsie
darstellen (Gershen et al., 2015).
2.3.4 [18F]Flumazenil und zentraler Benzodiazepinrezeptor
Das Benzodiazepinderivat Flumazenil wurde 1981 mit einer hohen Bindungsaffinität
an den zentralen Benzodiazepinrezeptor beschrieben (Hunkeler et al., 1981).
Flumazenil wird klinisch hauptsächlich eingesetzt, um im Notfall die Depression von
Kreislauf und Respiration bei einer Benzodiazepin-Sedation zu antagonisieren (Neave
et al., 2000). Die Autoren zeigen, dass Flumazenil nicht wie ursprünglich angenommen
kaum intrinsische Wirkungen besitzt, sondern die Kognition, die Stimmung und den
Kreislauf beeinflussen kann. Flumazenil zeigte in Mäusen bei Injektion in die
Amygdala anxiolyseähnliche Effekte (Barbalho et al., 2009). Auch der Schlaf- und
Wachzustand können beeinflusst werden über agonistische, invers agonistische und
antagonistische Effekte auf den Benzodiazepinrezeptor (Steiger et al., 1994).
[18F]Flumazenil wurde als Alternative zu [11C]Flumazenil entwickelt, wiederum
mit dem Vorteil, unabhängig von einem Zyklotron in direkter räumlicher Nähe zu sein.
Es zeigt sich als dem [18F]Fluoroflumazenil durch ein besseres Signal-Rausch-
Verhältnis überlegen, mit einer langsameren Verstoffwechslung und geringeren
Metabolitenkonzentrationen im Gehirn (Dedeurwaerdere et al., 2009). Da Fluor schon
im Flumazenil-Molekül an sich vorliegt, gleichen die Bindungseigenschaften denen von
[11C]Flumazenil (Odano et al., 2009, Ryzhikov et al., 2005). Die Zeit-Aktivitätskurven
sind wie das kinetische Verhalten vergleichbar (Odano et al., 2009).
Im epileptischen Patienten konnten mit [11C]Flumazenil-PET epileptische Foki als
Areale verminderter Tracer-Bindung dargestellt werden (Savic et al., 1988). Die
Autoradiographie mit [11C]Flumazenil in Gewebe von Patienten mit
Temporallappenepilepsie ergab eine Abnahme der Tracer-Bindung in anterioren
mesialen temporalen Regionen, die mit dem Ausmaß der Neurodegeneration durch
die Hippokampussklerose korrelierte (Burdette et al., 1995). Eine Korrelation zwischen
verminderter [11C]Flumazenil-Bindung und Neurodegeneration, Astrogliose und
vermindertem Hippokampusvolumen wurde in einer Kombinationsstudie mit PET,
MRT und Histologie bei Patienten mit Temporallappenepilepsie gesehen (Lamusuo et
2 Literaturübersicht
35
al., 2000). Bei einer Studie in Kindern mit Extratemporallappenepilepsie war
[11C]Flumazenil-PET sensitiver als [18F]FDG-PET in der Detektion von kortikalen
Anfallsursprungsregionen (Muzik et al., 2000). Der Einsatz der [11C]Flumazenil-PET in
der prä-chirurgischen Untersuchung zeigte sich in einer prospektiven Studie mit 100
epileptischen Patienten insofern positiv, als dass sie zu MRTund [18F]FDG-PET
zusätzliche nützliche Informationen zum Anfallsursprung liefern konnte (Ryvlin et al.,
1998). Eine Wiederholung der [11C]Flumazenil-PET eine Woche nach der ersten
Untersuchung kann ihre Sensitivität und Spezifität bezüglich der prächirurgischen
Lokalisierung eines Anfallherdes erhöhen (Bouvard et al., 2005). Interessanterweise
war in dieser Studie die im kinetischen Modeling berechnete totale Dichte von
Rezeptoren umso geringer, je kürzer das Inter-Anfalls-Intervall war. In einer Phase
I/IIa-Studie wurde gezeigt, dass [18F]Flumazenil-PET in Verbindung mit einem
kinetischen Modeling eine epileptogene Zone in Form eines reduzierten
Tracerbindungspotentials deutlich begrenzter anzeigt, als es bei der Verwendung von
[18F]FDG als PET-Tracer zur Darstellung des Hypometabolismus der Fall ist (Vivash
et al., 2013), was in einem weiteren Vergleich bestätigt werden konnte (Hodolic et al.,
2016). Im Rattenmodell zeigte sich fünf Wochen nach intraperitonealer Kainatinjektion
und nachfolgendem Status epilepticus mit [18F]Flumazenil-PET eine Abnahme der
intrahippokampalen Rezeptordichte bei gleichzeitiger Zunahme der berechneten
Affinität (Vivash et al., 2014). Dies stand nicht in direktem Zusammenhang mit
hippokampaler Volumenabnahme oder Zellverlust.
Der zentrale Benzodiazepinrezeptor wird durch α- und у-Untereinheiten der
GABAA-Rezeptoren, die als Heteropentamer angeordnet sind, gebildet (Leidenheimer,
2008, McKernan et al., 1995). In einem Modell für Status epilepticus aus kultivierten
hippokampalen Neuronen verringert sich die GABAerge synaptische Inhibition nach
andauernden epileptiformen Entladungen durch Internalisierung von GABA-
Rezeptoren (Goodkin et al., 2005). Verminderte postsynaptische GABA-Ströme
zusammen mit weniger nachweisbaren α-Untereinheiten des GABAA-Rezeptors durch
verminderte Membranexpression des GABAA-Rezeptors werden auf den Membranen
kultivierter hippokampaler Neuronen in einem Modell für Epileptogenese beobachtet
(Blair et al., 2004). Eine Blockade der Internalisierung führt zu einem Sistieren der
3 Ziele der Arbeit
36
spontanen wiederkehrenden epileptiformen Entladungen. Die Internalisierung der
GABAA-Rezeptoren wird mit als Ursache für den Übergang von einzelnen Anfällen in
einen Status epilepticus und für dessen Resistenz gegenüber Benzodiazepinen
vermutet (Naylor et al., 2005). Eine autoradiographische Untersuchung im
Kainatmodell in Ratten fand 24 Stunden nach Status epilepticus eine Erhöhung der
Dichte des zentralen Benzodiazepinrezeptors im Hippokampus und im Cortex (Vivash
et al., 2011). Zwei, vier und sechs Wochen später war die Dichte der zentralen
Benzodiazepinrezeptoren im Hippokampus vermindert, nicht aber im Gyrus dentatus,
wobei die Rezeptorbindungsaffinität zu keinem Zeitpunkt verändert war. Eine
verminderte Rezeptordichte konnte auch zwei und sieben Tage nach Kainatinjektion
in Ratten mit [11C]Flumazenil-PET festgestellt werden (Syvänen et al., 2012), ebenso
in vollständig über die Amygdala gekindelten Ratten (Liefaard et al., 2009).
3 Ziele der Arbeit
Das übergeordnete Ziel der Arbeit war die longitudinale Untersuchung des zerebralen
Glukosestoffwechsels im Verlauf der Epileptogenese mittels [18F]FDG-PET in
geeigneten Tiermodellen. Zugleich auftretende zerebrale Veränderungen während der
frühen Epileptogenese sollten im Kontext untersucht werden. Zwei Therapieansätze,
die 2-DG und die ketogene Diät, sollten hinsichtlich ihrer potentiellen antiepileptogenen
Effektivität und ihres Einflusses auf die untersuchten Veränderungen des zerebralen
Glukosestoffwechsels untersucht werden.
Das spezifische Ziel der ersten Studie im kornealen Kindlingmodell war die
Untersuchung der antiepileptogenen Wirksamkeit von 2-DG in diesem Tiermodell.
[18F]FDG-PET sollte zur Untersuchung des Einflusses des kornealen Kindlings, der 2-
DG und der Kombination aus Kindling und 2-DG auf den zerebralen
Glukosestoffwechsel eingesetzt werden. Zugleich sollten durch immunhistochemische
Untersuchungen eine potentiell auftretende Inflammation und die Expression von
Glukosetransportern der Blut-Hirn-Schranke dargestellt werden, um gezeigte
3 Ziele der Arbeit
37
Veränderungen des zerebralen Glukosestoffwechsels und potentielle antiepileptogene
Wirkungen in einen Kontext einordnen zu können. Die Arbeitshypothesen waren:
- Korneales Kindling und die 2-DG haben Effekte auf den zerebralen
Glukosestoffwechsel, die mit [18F]FDG-PET darstellbar sind.
- Die quantitative Auswertung der [18F]FDG-PET-Daten mit einem kinetischen
Modeling gibt Hinweise auf den Wirkungsmechanismus von 2-DG und kann
zugleich als theranostischer Marker eingesetzt werden.
- Die chronische Gabe von 2-DG wirkt anti-inflammatorisch und beeinflusst die
Expression von GLUT1.
In der zweiten Studie im Pilocarpinmodell sollten Veränderungen der Blut-Hirn-
Schranke und dabei involvierter Zellen im Verlauf der frühen Epileptogenese nach
einem Gehirninsult detailliert multimodal untersucht werden, um Hinweise darauf zu
erlangen, welche Mechanismen als mögliche therapeutische Angriffspunkte für eine
antiepileptogene Therapie in Frage kommen. Die Arbeitshypothesen waren:
- Kontrastmittelverstärkte MRT und histologische Untersuchung der FITC-
Albumin-Extravasation nach Status epilepticus ermöglichen eine präzise
Darstellung der zeitlich-räumlichen Ausprägung der gesteigerten
Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke während der frühen Epileptogenese
und damit eine Eingrenzung des therapeutischen Zeitfensters.
- Die Extravasation von FITC-Albumin führt zu veränderten Immunsignalen von
zellulären und strukturellen Komponenten der neurovaskulären Einheit.
In der dritten Studie im intrahippokampalen Kainatmodell wurde bewusst ein
Tiermodell für Epileptogenese nach initiierendem Gehirninsult und einer Latenzphase
ausgewählt, um potentielle antiepileptogene Eigenschaften und Mechanismen der
ketogenen Diät longitudinal zu untersuchen. Die Arbeitshypothesen waren:
- Die Fütterung einer ketogenen Diät über die Dauer der Latenzphase im
intrahippokampalen Kainatmodell wirkt antiepileptogen.
- Die Epileptogenese im intrahippokampalen Kainatmodell ist mit Veränderungen
im zerebralen Glukosemetabolismus, der GABAA-Rezeptordichte und mit
4 Material und Methoden
38
Microgliaaktivierung verbunden, welche mittels [18F]FDG-PET, [18F]GE-180-
PET bzw. [18F]Flumazenil-PET darstellbar sind.
- Die vorgenannten zerebralen Veränderungen werden durch die ketogene Diät
positiv beeinflusst, was mit den PET-Bildgebungsmarkern dargestellt werden
kann (theranostische Marker).
4 Material und Methoden
4.1 Versuchstiere und Haltung
Die im Folgenden beschriebenen Versuche wurden vom Niedersächsischen
Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit genehmigt und im
Einklang mit der EU-Richtlinie 86/609/EWG durchgeführt. Grundsätzlich wurde den
Tieren nach Ankunft im Labor mindestens eine Woche Adaptationszeit bis zum Beginn
der jeweiligen Studie gewährt. Die Ratten wurden wiederholt mittels Durchführung
gängiger Fixationsgriffe an das Handling gewöhnt. Die Mäuse konnten sich durch
wiederholtes Handling im Rahmen der Erhebung des Körpergewichts und der Ohr-
und Schwanzmarkierung (Ohrlochung in kurzer Isoflurannarkose beziehungsweise
wiederholte Filzstiftmarkierung der Schwanzwurzel) ebenfalls an den Experimentator
gewöhnen. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, das Leiden der Tiere auf ein
Minimum zu begrenzen. Die Haltungsbedingungen waren wie folgt: Die Tiere wurden
in isoliert ventilierten, zuvor autoklavierten Käfigen (Allentown, Neuss, Deutschland)
mit Einstreu und Nestbaumaterial gehalten. Autoklaviertes Trinkwasser und eine
Standard-Diät für Labornager (Altromin, Lage, Deutschland) wurden ad libitum zur
Verfügung gestellt. Die Raumtemperatur wurde konstant bei 20 – 22 °C gehalten, bei
einer Luftfeuchte von 40 – 70%. Der Tag-Nacht-Rhythmus wurde durch 14 Stunden
Hellphase (7:00 – 21:00 Uhr) und 10 Stunden Dunkelphase geregelt. Die Tiere
wurden, soweit möglich in Paaren von zwei Ratten oder in Gruppen von maximal neun
Mäusen pro Käfig gehalten.
Für die beiden Studien im kornealen Kindlingmodell und im intrahippokampalen
Kainatmodell (erstes und drittes Manuskript) wurden männliche NMRI-Mäuse von
4 Material und Methoden
39
Charles River (Sulzfeld, Deutschland) verwendet (Alter bei der Bestellung sechs bis
sieben Wochen). Für die Untersuchungen zur neurovaskulären Einheit (zweites
Manuskript) wurden adulte weibliche Sprague-Dawley-Ratten (200 – 220 g) von Harlan
(Horst, Niederlande) verwendet. Die Tiere wurden entweder (für den Bildgebungsteil)
zu zweit unter den oben beschriebenen Bedingungen gehalten oder für die
Verwendung in der Immunhistochemie in Gruppen von fünf Tieren in offenen Käfigen
(21 – 23 °C, 45 – 55% Luftfeuchte, Tag-Nacht-Rhythmus von 12 Stunden).
4.2 Manuskript 1: Untersuchungen im kornealen Kindlingmodell
Tiergruppen: Korneales Kindling + Vehikel n = 18
Korneales Kindling + 2-DG n = 18
2-DG n = 12
Abbildung 6: Übersicht zum Ablauf der Untersuchung im kornealen Kindlingmodell. Die Tiere wurden
für diesen Versuch über 21 Tage hinweg korneal gekindelt, um den Prozess der Epileptogenese
nachzustellen. Dies geschah zweimal täglich, mit einem Mindestabstand von sechs Stunden zwischen
beiden Stimulationen. Es wurden zwei Gruppen gekindelt, denen entweder 2-Desoxy-D-Glukose (2-
DG) oder das dazugehörige Vehikel (0,9%ige Natriumchloridlösung) jeweils eine Minute nach jeder
Stimulation verabreicht wurde, und eine ungekindelte Tiergruppe, die mit 2-DG entsprechend zweimal
täglich behandelt wurde. Die gestrichelte Linie stellt Behandlungsdauer dar. [18F]FDG-PET-Scans
wurden an drei Zeitpunkten durchgeführt: 18 – 20 Stunden nach der ersten Behandlung und vor
Beginn des Kindlings (am Abend des Scan-Tages), am 10. Tag des Kindlings und am 17. Tag des
Kindlings. Die Tiere wurden an Tag 21 nach Kindlingbeginn perfundiert, um die Gehirne für die
anschließende histologische Untersuchung zu entnehmen.
4 Material und Methoden
40
Nicht in der Abbildung inbegriffen, wie auch nicht in der finalen histologischen
Untersuchung und dem vorbereiteten Manuskript, ist eine zusätzliche Tiergruppe aus
12 Mäusen, die gekindelt und jeweils 30 min vor jeder Kindlingstimulation mit 2-DG
behandelt wurde (siehe Anhang).
4.2.1 Corneales Kindling
Für das korneale Kindling wurde ein Stimulator (ECT UNIT, 57800) der Firma Ugo
Basile, Italien, verwendet. Mit dem Kindling wurde am Abend des ersten PET-Scan-
Tages begonnen, also in etwa mit einem Tag Abstand zur ersten 2-DG-Behandlung.
Über die 21 Tage des kornealen Kindlings, das zweimal täglich an den Tieren mit
einem minimalen Inter-Stimulus-Intervall von sechs Stunden durchgeführt wurde,
waren die Stimulusparameter wie folgt: monopolar, drei Sekunden Dauer, Frequenz
von sechs Hertz, Stromstärke von 44 Milliampere, Pulsdauer von 0,2 Millisekunden.
Diese Parameter wurden einer vorherigen Beschreibung des kornealen Kindlings
entnommen (Leclercq et al., 2014). Mindestens eine Viertelstunde vor jedem
Stimulationsdurchgang wurde der Stimulator eingeschaltet, die mit Leder bezogenen
Korneaelektroden in sterile physiologische Kochsalzlösung getaucht und die
Funktionsfähigkeit des Stimulators getestet. Zuvor wurden die Tiere schon in den
Versuchsraum gebracht und die Käfigoberteile geöffnet, damit sich die Mäuse an die
Laborbedingungen gewöhnen konnten. Zwei Minuten vor jeder Stimulation wurden die
Augen der Tiere jeweils mit einem Tropfen zweiprozentiger Tetracainlösung behandelt.
Die Herstellung der Tetracainlösung wurde durch Lösung von Tetracain-Hydrochlorid
(Sigma-Aldrich, Deutschland, Steinheim, Deutschland) in Aqua ad injectabilia und
anschließender Filtrierung über sterile Spritzenvorsatzfilter (0,2 µm, VWR International
GmbH, Hannover, Deutschland) vorgenommen. Während der Stimulation wurde jedes
Tier manuell fixiert und danach augenblicklich aus dem Griff entlassen, um den Grad
der (Anfalls-)Reaktion zu beobachten. Eine Minute nach Ende des Stimulus erhielt das
Tier die jeweilige Behandlung (2-DG oder Vehikel) als intraperitoneale Injektion. Die
Zeiten zwischen Tetracainapplikation und Stimulation, sowie Stimulation und
Behandlung wurden mit einer Stoppuhr verfolgt. Der Grad der Anfalls-Antwort auf den
4 Material und Methoden
41
Stimulus wurde mittels des folgenden modifizierten Einstufungssystems nach Racine
(Racine, 1972) beurteilt (siehe Abbildung 7).
Abbildung 7: Visualisierung
der Anfallsbewertung im
kornealen Kindlingmodell.
Nähere Erläuterungen finden
sich in der untenstehenden
Tabelle.
Anfallsgrad Klinisches Bild
0 Immobilität oder keine Reaktion oder Rennen und Springen
1 milder fazialer Klonus: Augenzwinkern, -schließen, Zucken der
Vibrissen, stereotypes Schnuppern
2 starker fazialer Klonus: Kauen, Kopfnicken, myoklonische
Zuckung der Vordergliedmaße
3 klonische Konvulsionen einer Vordergliedmaße ohne Aufrichten
4 klonische Konvulsionen beider Vordergliedmaßen mit oder ohne
Aufrichten
5 generalisierte klonische Konvulsionen mit sofortigem
Gleichgewichtsverlust (auch in Seitenlage)
6 tonischer Krampf der Vorder- und Hintergliedmaßen
Mäuse, bei denen mindestens acht von zehn aufeinanderfolgenden Stimulationen mit
einem Anfallsgrad von „fünf“ auftraten, galten als vollständig gekindelt und reagierten
damit zuverlässig auf einen Stimulus mit generalisierten Anfällen mit sofortigem
Gleichgewichtsverlust.
4.2.2 2-Desoxy-D-Glukose-Behandlung
Alle Behandlungen bestanden aus intraperitonealen Injektionen, die im Falle der
beiden Kindling-Gruppen jeweils eine Minute nach jeder Stimulusgabe verabreicht
0
I
II III IV
V
VI
4 Material und Methoden
42
wurden und im Falle der allein mit 2-DG behandelten Gruppe den Kindlingzeiten
entsprechend zweimal täglich über 21 Tage. Die Behandlung wurde am Abend vor
dem ersten PET-Scan begonnen, in einem Abstand von möglichst 18 - 20 Stunden vor
der jeweiligen Bildgebung. Am Vormittag eines jeden Bildgebungstages wurden die
Tiere nicht behandelt, um eine Messung von akuten Wirkstoff-bedingten Effekten zu
verhindern, da eine Untersuchung der Auswirkungen auf den Prozess der
Epileptogenese angestrebt war. Dementsprechend wurde auch die jeweilige Kindling-
Stimulation ausgesetzt, um das aktive Forcieren der nachgestellten Epileptogenese
nicht ohne Wirkstoff geschehen zu lassen. 2-DG (Sigma-Aldrich, Deutschland) wurde
in einer Dosierung von 250 mg/kg verabreicht, gelöst in 10 ml/kg steriler
physiologischer Kochsalzlösung als Vehikel. Die Vehikel-Behandlung geschah
entsprechend mit 10 ml/kg steriler physiologischer Kochsalzlösung. Für die Injektion
wurden Einweg-Spritzen mit einem Injektionsvolumen von einem Milliliter und Kanülen
der Größe 27 Gauge verwendet.
4.2.3 [18F]FDG-PET und Datenauswertung
Für die [18F]FDG-PET-Untersuchungen nach der ersten Behandlung und vor
Kindlingbeginn (Baseline), an Tag 10 und an Tag 17 des kornealen Kindlings wurde
ein spezifischer Kleintier-PET-Scanner verwendet (Inveon DPET, Siemens, Knoxville,
TN, USA). Zu Beginn der Prozedur wurde jedes Tier gewogen, dann mittels Isofluran
in Narkose versetzt (Einleitung mit drei Prozent Isofluran in drei Litern Sauerstoff pro
Minute). Zur Regulation der Narkosetiefe wurde die Atemfrequenz zur Orientierung
genutzt, wobei etwa 60 – 80 Atemzüge pro Minute erwünscht waren. Die
Atemfrequenz wurde mit einem Überwachungssystem gemessen (BioVet®, MILabs,
Utrecht, Niederlande). Direkt nach Anästhesiebeginn wurde ein Tropfen Blut zur
Messung der Blutglukosekonzentration mit einem Glukometer (Contour XT®, Bayer
Consumer Care, Basel, Schweiz) aus der Vena saphena oder der Vena femoralis
entnommen. Anschließend wurde ein Katheter für die spätere Radiotracerinjektion in
die laterale Schwanzvene gelegt (Katheterbestandteile: zwei 27 G Kanülen, stumpf
und spitz, ein medizinischer Mikrovolumenschlauch, Kleinfeld Labortechnik, Gehrden,
Deutschland, Tygon S-54-JL, Nr. 9.205 504). Die Tiere wurden nun paarweise
4 Material und Methoden
43
nebeneinander in Bauchlage in die auf 37 °C geheizten Tierbetten (Minerve, Esternay,
Frankreich) verbracht. Dann wurde Augensalbe aufgetragen (Bepanthen®, Bayer Vital
GmbH, Leverkusen, Deutschland). Anschließend wurden die Tiere in definierter
Position im PET-Scanner platziert. Mit dem Start der [18F]FDG-Injektion wurde die
dynamische PET-Aufnahme gestartet. Auf die Tracer-Injektion (0,15 ml) folgte weiter
0,15 ml Spülung mit heparinisierter physiologischer Kochsalzlösung. Die
Aufnahmedauer betrug 60 Minuten. Die aufgenommenen List Mode Daten wurden in
32 Frames (5 x 2 s, 4 x 5 s, 3 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 60 s, 4 x 300 s, 3 x 600 s)
histogrammiert. Die Bildrekonstruktion in eine 128 x 128 x 159 Matrix (0,78 x 0,78 x
0,8 mm) wurde mittels eines dreidimensionalen ordered subset expectation
maximization (3D-OSEM) / maximum a posteriori (MAP) Algorithmus (β =1, OSEM
Iterationen = 2, MAP Iterationen = 18) durchgeführt. Eine Schwächungskorrektur
wurde mit Hilfe eines Transmissions-Scans durchgeführt (zwei 57 Cobalt-Quellen, 185
MBq, 20 min Aufnahmedauer). Auf den PET-Scan folgte jeweils ein zehnminütiger
Standardscan im Computertomographen (Siemens Inveon PET-CT, Knoxville, USA).
Die Scan-Prozedur endete jeweils mit einer weiteren Messung der
Blutglukosekonzentration, wobei Blut bei der Entfernung des Katheters aus der
Schwanzvene entnommen wurde. Im Anschluss wurde die Anästhesie beendet und
die Tiere konnten sich auf einer Wärmematte erholen.
Die PET-Daten wurden mit PMOD 3.6 (PMOD Technologies LLC, Schweiz)
ausgewertet. Zunächst wurde jedes CT-Bild mit dem in PMOD integrierten Standard-
MRT-Maus-Atlas (T2-gewichtet, (Ma et al., 2005)) überlagert. Daraufhin wurde das
CT-Bild mit dem jeweiligen PET-Bild koregistriert. Schließlich folgte die Transformation
mit der exakten Überlagerung von MRT-Atlas und PET-Bild.
Der [18F]FDG-Uptake wurde mittels des von PMOD angebotenen Maus-Atlas
(Mirrione et al., 2007) und einer das gesamte Gehirn einbeziehenden Region of
Interest quantifiziert. Von den durch den Atlas angebotenen Gehirnregionen wurden
folgende ausgewählt: Cortex (rechts, links), Hippokampus (dorsal, ventral, rechts,
links), Thalamus (rechts, links), Striatum (rechts, links), Amygdala (rechts, links) und
Cerebellum. Die Werte für den [18F]FDG-Uptake der einzelnen Gehirnregionen wurden
4 Material und Methoden
44
aus den beiden letzten Frames berechnet, also den letzten 20 Minuten der PET-
Aufnahme, und als Prozent injizierte Dosis pro Kubikzentimeter ausgedrückt. Für das
kinetische Modeling wurde das FDG 2-Compartment Model (Huang, 2008) aus dem
Modul Kinetic Modeling von PMOD verwendet. Für die Erstellung der hierfür
erforderlichen sogenannten Image-Derived Input Function (IDIF) wurde die Zeit-
Aktivitätskurve für das Gesamtblut in einer Region of Interest (2 x 2 x 4 mm) berechnet,
die in den frühen Frames der PET-Bild-Daten in die Vena cava caudalis positioniert
wurde (Lanz et al., 2014, Thorn et al., 2013). Die verwendete Lumped Constant LC
war 0,67 (Thorn et al., 2013). Diese Konstante beschreibt den Unterschied im
Verhalten des Tracers [18F]FDG zu Gukose in Bezug auf Uptake und
Phosphorylierung. Die Werte aus den beiden Messungen der Blut-Glukose-
Konzentration vor und nach jedem Scan wurden gemittelt und in das Modeling
integriert. Für die Auswertung der Modeling-Daten wurden die beiden Parameter Ki
(Net Influx Rate) und MRGlu (Glucose Metabolic Rate) eingesetzt.
4.2.4 Immunhistochemische Färbungen GLUT-1, IBA-1, GFAP und Fluoro-Jade-
C-Färbung
Zur Vorbereitung des Gehirngewebes für die histologischen Untersuchungen wurden
die Mäuse in tiefer Ketamin/Xylazin-Narkose transkardial mit 25 ml 0,01 M Phosphat-
gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und anschließend mit 25 ml vierprozentiger
Paraformaldehydlösung (Paraformaldehyd achtprozentig unter Erhitzung auf 70 °C
gelöst in destilliertem Wasser, geklärt mit 1 M Natronlauge, dann verdünnt in 0,2 M
Phosphatpuffer, pH = 7,4) perfundiert. Dies geschah mit einer peristaltischen Pumpe
(ISM596D, Ismatec, Wertheim, Deutschland), die auf eine Pumpgeschwindigkeit von
13,3 ml/min eingestellt war. Zur Perfusion wurde eine Knopfkanüle in die Spitze des
linken Ventrikels eingestochen, mit einer Klemme fixiert, die Perfusionspumpe
gestartet und sofort das rechte Atrium mit einem Scherenschnitt eröffnet. Die Gehirne
wurden entnommen, über 24 Stunden bei 4 °C in vierprozentiger
Paraformaldehydlösung gelagert und schließlich in einer Lösung aus 30% Saccharose
(AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland) und 0,2% Natrium-Azid (Sigma Aldrich,
Steinheim, Deutschland) in 0,1 M Phosphatpuffer.
4 Material und Methoden
45
Die Gehirne wurden auf einem Gefriermikrotom in einer Schnittdicke von 40 µm
geschnitten (Frigomobil CM 1325, Leica. Wetzlar, Deutschland). Die Gewebeschnitte
wurden in 0,1 M PBS gelagert.
Grundsätzlich wurde bei jeder immunhistochemischen Anfärbung mit
freischwimmenden Schnitten wie folgt vorgegangen: Für die Färbeschritte wurden
Wellplatten verwendet. Bis zu acht Schnitte wurden in einem Well zugleich gefärbt. Für
die Spülschritte wurde die Lösung jeweils nach Augenmaß eingefüllt, für alle sonstigen
Schritte wurde ein Volumen von je einem Milliliter verwendet. Alle Inkubationen und
Spülungen wurden nach Möglichkeit auf einem Plattformschüttler durchgeführt
(Heidolph Titramax 1000, Heidolph Instruments Labortechnik, Schwabach,
Deutschland; S-3.16L, LTF-Labortechnik, Wasserburg, Deutschland; IKA-VIBRAX-
VXR, Staufen, Deutschland; je verwendetem Modell bei 60 bis 120 rpm, wobei
vorsichtig ein langsames Kreiseln der Schnitte in der jeweiligen Flüssigkeit angestrebt
wurde). Die Gewebeschnitte wurden jeweils je nach Stabilität mit einem Glashaken
oder einem feinen Pinsel in die Wells überführt. Vor jeder eigentlichen Färbung wurden
Testfärbungen mit verschiedenen in Frage kommenden Konzentrationen der
Primärantikörper angefertigt, um anschließend die optimale Konzentration verwenden
zu können. Negativkontrollen wurden grundsätzlich parallel bei jeder Färbung
angefertigt, indem der jeweilige Primärantikörper nicht zur Inkubationslösung
hinzugefügt wurde. Die Protokolle der im Folgenden genannten
immunhistochemischen Färbungen befinden sich im Anhang.
4.2.4.1 GLUT1
Der Glukosetransporter GLUT1 wurde immunhistochemisch angefärbt, entsprechend
eines modifizierten schon zuvor verwendeten Protokolls (Volk et al., 2004), das im
Anhang beschrieben wird. Der verwendete Antikörper bindet sowohl die 55 kDA- als
auch die 45 kDa-Form von GLUT1. Die erste Variante kommt in der Blut-Hirn-
Schranke vor (Gerhart et al., 1989), die zweite in Astrozyten und Oligodendrozyten (Yu
und Ding, 1998).
4 Material und Methoden
46
4.2.4.2 IBA1
Das Ionized Calcium-binding Adapter Molecule IBA1 wurde entsprechend dem von
Krueger et al. (2015) verwendeten Protokoll mit einer anschließenden Visualisierung
durch die Diaminobenzidin-Nickel-Methode angefärbt und zur Darstellung aktivierter
Microglia (Imai und Kohsaka, 2002) verwendet.
4.2.4.3 GFAP
Das Glial Fibrillary Acidic Protein GFAP wurde entsprechend der Methode von Härtig
et al. (2009) mit einer anschließenden Visualisierung durch die Diaminobenzidin-
Nickel-Methode angefärbt. GFAP diente zur Darstellung aktivierter Astrozyten (Yang
und Wang, 2015).
4.2.4.4 Fluoro-Jade-C-Färbung
Für die Fluoro-Jade C-Färbung wurde das selbe Protokoll verwendet wie in der Studie
(Gröticke et al., 2008). Sie dient der Darstellung degenerierender Neuronen
(Schmued, 2016).
4.2.4.5 Auswertung der Histologie
Für die IBA1- und die GFAP-Färbung wurden Schnitte der Ebenen Bregma -1,94 mm
und -3,16 / -3,28 mm verwendet (Paxinos und Franklin, 2004). In diesen Ebenen
wurden die folgenden Gehirnregionen lichtmikroskopisch (Leica, Wetzlar,
Deutschland) ausgewertet: CA1 (Cornu ammonis), CA3a/c, Hilus des Gyrus dentatus,
Thalamus und piriformer Cortex. Hier wurde eine verblindete Person eingesetzt, die
semiquantitativ die Expression von IBA1 und GFAP nach einer Skala beurteilte: 0 =
inaktive Microglia / Astrozyten, weniger als 10% aktivierte Zellen, 1 = vorwiegend
inaktive Microglia / Astrozyten mit etwa 30% aktivierten Zellen, 2 = etwa 60% aktivierte
Microglia / Astrozyten, 3 = über 90% aktivierte Microglia / Astrozyten. Die Schnitte mit
GLUT1-Anfärbung wurden zunächst unverblindet lichtmikroskopisch untersucht.
Hierbei ergaben sich keine Hinweise darauf, dass Unterschiede zwischen den
Gruppen bestanden, weshalb auf eine anschließende quantitative Analyse durch eine
verblindete Person verzichtet wurde. Die Schnitte der Fluoro-Jade-C-Färbung wurden
4 Material und Methoden
47
einzeln sorgfältig am Mikroskop durchgesehen, wobei sich eine weitere graduelle
Einteilung von Veränderungen ebenfalls erübrigte, da keinerlei degenerierende
Neuronen zu sehen waren (im Gegensatz als Positivkontrollen mitgeführten
Vergleichsfärbungen von Gehirnschnitten mit bekanntem Absterben von Neuronen
von Tieren nach Status epilepticus).
4.2.5. Statistik
Für die statistische Auswertung wurde GraphPad Prism 7 für Windows verwendet
(GraphPad Software, San Diego California USA). Unterschiede in den
Anfallsantworten während der Kindling-Progression und in der histologischen
Auswertung wurden mit einem Kruskal-Wallis-Test mit anschließendem Dunn’s
Multiple Comparison Test erfasst. Eine einfache Varianzanalyse mit Bonferroni post
hoc wurde für Vergleiche der PET-Daten zwischen den Gruppen eingesetzt, eine
Varianzanalyse mit wiederholten Messungen kombiniert mit Bonferroni post hoc
wurde Vergleichen zwischen Scan-Zeitpunkten innerhalb einer Gruppe eingesetzt.
Eine einfache ANOVA mit Bonferroni post hoc wurde auch bei weiteren Vergleichen
zwischen drei Tiergruppen eingesetzt. Für Vergleiche von zwei Datensätzen
(Anfallsschwere, Kindlingdauer) wurde ein t-Test angewendet.
4.3 Manuskript 2: Untersuchungen im Pilocarpinmodell
4.3.1 Induktion des Status epilepticus
Der Status epilepticus wurde in den Ratten wie schon zuvor beschrieben (Bankstahl
et al., 2012, Brackhan et al., 2016) induziert. 127 mg/kg Lithiumchlorid (Sigma Aldrich,
Schnelldorf, Deutschland) wurden hierzu in 3 ml/kg physiologischer Kochsalzlösung
peroral am Vorabend (14 – 16 Stunden vor) der Status-Induktion verabreicht. 30
Minuten vor der Pilocarpingabe wurde Methylscopolamin (Sigma Aldrich, Schnelldorf,
Deutschland; 1 mg/kg in 2 ml/kg physiologischer Kochsalzlösung) intraperitoneal
injiziert. Pilocarpin (Sigma Aldrich, Schnelldorf, Deutschland) wurde fraktioniert nach
Bedarf in einem Abstand von 30 Minuten (bis zu dreimal) injiziert: die erste Injektion
4 Material und Methoden
48
bestand aus 30 mg/kg in 1ml/kg physiologischer Kochsalzlösung, die weiteren nur aus
einem Drittel der Dosierung. Nach 90 Minuten wurde der Status epilepticus mit
Diazepam (Diazepam-Ratiopharm, Ratiopharm, Ulm, oder Faustan, Temmler Pharma
GmbH, Marburg, Deutschland; 10 mg/kg in 2 ml/kg, intraperitoneal) abgebrochen,
wobei zwei Wiederholungen im Abstand von 15 Minuten und 30 Minuten durchgeführt
wurden (zweite Wiederholung nur mit der halben Dosierung).
4.3.2 Magnetresonanztomographie
Die Ratten wurden vor Induktion des Status epilepticus (Baseline, n = 13), sowie zwei
Tage (n = 5), vier Tage (n = 6) und zehn Tage (n = 5) nach Status epilepticus mittels
MRT untersucht. Das Prozedere für diese Untersuchungen wurde zuvor schon
beschrieben (Breuer et al., 2016). Verwendet wurde ein 7-Tesla-MRT-System für
Kleintiere (Bruker Pharmascan 70/16) mit der Aufnahme-Software ParaVision 5.1
(Bruker, Ettlingen, Deutschland). Zur Untersuchung einer Ödembildung wurden T2-
gewichtete 2D-MSME-Aufnahmen durchgeführt (Multi Slice Multi Echo; Repetitionszeit
2500 ms, Echozeit 11 ms, 96 Schichten von 0,8 mm, 256 x 256 Matrix, 35 x 35 x 25,6
mm3 Messfeld). T1-gewichtete 3D-MDEFT-Aufnahmen (Repetitionszeit 2500 ms,
Echozeit 11 ms, 96 Schichten von 0,8 mm, 256 x 256 Matrix, 35 x 35 x 25,6 mm3
Messfeld) zur Diagnostik einer erhöhten Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke wurden
vor und nach intravenöser Infusion von Gadopentetat-Dimeglumin (Magnevist, 0,5
mmol/l, Bayer HealthCare, Leverkusen, Deutschland) durchgeführt.
Die MRT-Daten wurden mit PMOD 3.6 Software ausgewertet wie schon zuvor
beschrieben (Breuer et al., 2016). T1- und T2-Signale wurden dabei relativ zur Pons
normalisiert. Die Aufnahmen vom Zeitpunkt 48 Stunden nach SE wurden voxelweise
mit den Baseline-Aufnahmen verglichen (MATLAB Software und SPM12).
4.3.3 FITC-Albumin
Zu den Zeitpunkten fünf (n = 6), 24 (n = 5) und 48 (n = 16) Stunden nach Status
epilepticus wurden jeweils Ratten mit bovinem Albumin-Fluoreszein-Isothiocyanat-
Konjugat (FITC-Albumin), verdünnt in 10 ml/kg 0,1 molarer PBS, unter
4 Material und Methoden
49
Isoflurannarkose infundiert, ebenso 10 Kontrolltiere. Die Perfusion mit 125 ml 0,1 M
PBS und 250 ml vierprozentigem Paraformaldehyd (in 0,1 M PBS) in tiefer Narkose
folgte zwei Stunden später (Breuer et al., 2016). Die Gehirne wurden entnommen, über
24 Stunden in 4%iger Paraformaldehydlösung gelagert, schließlich in eine 30%ige
Saccharoselösung (0,1 M PBS mit 0,2% Natriumazid) überführt und bei vier Grad
Celsius aufbewahrt. Die Gehirne wurden koronal mit einem Gefriermikrotom
(Frigomobil 1205; Jung, Heidelberg, Deutschland) geschnitten (Schnittdicke 30 µm).
Jeder zehnte Schnitt wurde nun dreifach mit TBS für je mindestens 10 Minuten
gewaschen, kurz mit destilliertem Wasser gespült und auf Objektträger aufgezogen
(Menzel, Braunschweig, Deutschland). Nach Lufttrocknung wurden die Objektträger
mit Entellan (Merck, Darmstadt, Deutschland) eingedeckt.
Zur semiquantitativen Auswertung von extra- und intrazellulärem FITC-Albumin
wurden die Schnitte in 40facher Vergrößerung mit einem Fluoreszenzmikroskop mit
integrierter Kamera (Biorevo, BZ-9000E, Keyence) fotografiert. Je Tier wurden vier
Schnittebenen analysiert: -0,36 mm, -1,56 mm, -3,72 mm und -4,90 mm in Bezug auf
Bregma (Paxinos und Watson, 2007). Dabei wurden die Regionen Hippokampus,
Thalamus, Amygdala, piriformer Cortex, entorhinaler Cortex und Striatum unter
Verwendung eines semiquantitativen Scoring-Systems beurteilt. Ein Mittelwert wurde
aus den bilateralen Bewertungen, wie auch aus den einzelnen Ebenen, für jede
Gehirnregion berechnet. Für die zelluläre FITC-Albumin-Aufnahme war die
Bewertungsskala wie folgt: Score 0 für keine, Score 1 für sporadische, Score 2 für
mittlere und Score 3 für hochgradige zelluläre FITC-Albumin-Aufnahme. Für die
extrazelluläre FITC-Albumin-Ansammlung war die Bewertung entsprechend, wobei
Score 1 eine geringgradige Menge extrazellulären FITC-Albumins oft nahe der
Blutgefäße beschrieb, Score 2 eine mittelgradige Menge und Score 3 wiederum eine
hochgradige extrazelluläre FITC-Albumin-Ansammlung beschrieb.
Zusätzlich wurde die Albumin-Extravasation auch lichtmikroskopisch ausgewertet,
indem eine Konvertierung des Fluoreszenzsignals mittels Diaminobenzidin-Nickel-
Färbung (DAB-Nickel) durchgeführt wurde, wie schon zuvor beschrieben (Michalski et
al., 2010) (siehe Anhang). Für die Auswertung wurden nach dem oben bereits
4 Material und Methoden
50
beschriebenen Verfahren die Schnitte der relevanten Schnittebenen fotografiert.
Daran schloss sich eine computergestützte Auswertung mittels einer
Bildauswertungssoftware an (Volocity 4.3.2, PerkinElmer, Waltham, MA, USA), die die
Größe der gefärbten Areale relativ zur Größe des gesamten Gehirnschnittes
berechnete (Michalski et al., 2010).
4.3.4 Immunfluoreszenzfärbungen
NeuN, GFAP, IBA1, STL, Laminin, Collagen IV, AQP4, S100ß, CD45c, CD8b
In Kooperation mit Wolfgang Härtig (Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung der
Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig) wurden Immunfluoreszenzfärbungen
angefertigt. Die durchgeführten Doppelfärbungen und die verwendeten Antikörper sind
im Anhang aufgelistet. Die untersuchten Zielstrukturen waren das Neuron-specific
Nuclear Protein (NeuN) für Neuronen, das Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) für
Astrozyten, Ionized Calcium-binding Adapter Molecule 1 (IBA1) für Microglia,
Endothelzellen mit Anfärbung durch Solanum-Tuberosum-Lektin (STL), die vaskuläre
Basalmembran des Endothels mit Laminin und Collagen IV, astrozytäre Endfüßchen
mit Aquaporin 4 (AQP4), astrozytäre Somata mit S100ß, aktivierte Microglia mit CD45c
und T-Zellen mit CD8b.
4.3.5 Beurteilung der Neurodegeneration
Zur Beurteilung des Ausmaßes der Neurodegeneration wurde eine Nissl-Färbung
durchgeführt und mit einem Beurteilungssystem bewertet, wie schon beschrieben
(Bankstahl et al., 2012). Score 0 beschreibt keine ersichtlichen Schäden, Score 1 eine
leichte Veränderung der normalen Erscheinung ohne klar ersichtlichen
Neuronenverlust, Score 2 Läsionen, die 20 – 50% der Neuronen betreffen, und Grad
3 Läsionen, die über 50% der Neuronen betreffen. Hierbei wurden pro Tier vier
Schnittebenen bezüglich CA1, CA3a, Amygdala, piriformem und entorhinalem Cortex
beurteilt (−2,4 mm, −3,36 mm, -4,68 mm und −5,64 mm in Bezug auf Bregma (Paxinos
und Watson, 2007)). Die erhaltenen Werte beider Seiten wurden gemittelt. Wie schon
beschrieben (Polascheck et al., 2010), wurde die Zahl polymorpher Neuronen im Hilus
des Gyrus dentatus computergestützt mit der AxioVision Software (Zeiss) erfasst.
4 Material und Methoden
51
Hierzu wurden die Schnittebenen −2,4 mm, −3,36 mm und −4,68 mm herangezogen
und die erhaltenen Werte wiederum gemittelt.
4.3.6 Statistik
Mit Prism 7 Software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) wurden alle Daten aus
Bewertungsskalen mit einem Kruskal-Wallis-Test mit Dunn’s Multiple Comparison
post-hoc im Vergleich zur Kontrollgruppe untersucht. MRT-Daten und Daten aus der
quantitativen histologischen Auswertung wurden hierbei mit einer einfachen
Varianzanalyse und Dunnett‘s Multiple Comparison Test post-hoc analysiert, die für
den Vergleich aller Gruppen zu Baseline-Werten diente. P-Werte < 0.05 wurden als
statistisch signifikant eingestuft.
4.4 Manuskript 3: Untersuchungen im intrahippokampalen Kainatmodell
Tiergruppen: Status epilepticus + ketogene Diät (n = 11)
Status epilepticus + Standarddiät (n =10)
Sham-Operation + Standarddiät (n = 10 )
Baseline-Untersuchungen: n = 10 bzw. 6
Abbildung 8: Übersicht zum Ablauf der Studie im intrahippokampalen Kainatmodell. Hier wurde
longitudinal die Entwicklung der Epileptogenese nach einer intrahippokampalen Kainatinjektion mit
sich anschließender vierwöchiger (gestrichelte graue Linie) ketogener Diät im Vergleich zu einer
Standarddiät untersucht. Sieben und 14 Tage nach der Mikroinjektion wurden [18F]GE-180-PET-Scans
durchgeführt, nach vier Wochen und schließlich neun bis zehn Wochen [18F]FDG- und
[18F]Flumazenil-PET-Scans. In der elften Woche wurden Elektroden zum anschließenden Monitoring
mit Elektroenzephalogramm-Ableitung (EEG) und simultaner Videoaufnahme implantiert. Nicht im
4 Material und Methoden
52
Schema abgebildet sind die durchgeführten Verhaltensuntersuchungen (modifizierter Irwin Screen vor
jeder PET-Untersuchung; ActivityCage 13-14 Wochen post Status epilepticus).
Nicht in der Abbildung inbegriffen, wie auch nicht im dritten vorbereiteten Manuskript,
sind weitere [18F]FDG-PET-Untersuchungen an Mäusen, die im Rahmen einer
vorbereitenden Untersuchung zur Ermittlung des Zeitverlaufs potentieller
glukometabolischer Veränderungen zu den Zeitpunkten 48 Stunden, fünf Tage, 21
Tage und 49 Tage nach Status epilepticus untersucht wurden (Darstellung der
Ergebnisse im Anhang). Ebenfalls nicht in der Abbildung inbegriffen ist eine Gruppe
von 10 gesunden Tieren, die in einem vorbereitenden Versuch chronisch mit ketogener
Diät gefüttert wurden. Diese Mäuse wurden ebenfalls zu mehreren Zeitpunkten einer
[18F]FDG-PET-Untersuchung unterzogen (Baseline, Tag 10, 17, 25, 35 und 49 der
Fütterung der ketogenen Diät (Darstellung der Ergebnisse im Anhang).
4.4.1 Intrahippokampale Kainatinjektion
Die stereotaktische Operation zur intrahippokampalen Injektion von Kainat gleicht im
Prinzip der ersten Beschreibung dieses Tiermodells (Suzuki et al., 1995). Die Narkose
wurde mit einer Bolus-Injektion von Chloralhydrat eingeleitet (500 mg/kg
intraperitoneal, gelöst in 10 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung) und mit
Nachinjektionen von 0,05 ml derselben Lösung nach Bedarf aufrechterhalten.
Die Koordinaten der anvisierten Injektionsstelle (siehe Abbildung 9) im rechten
dorsalen Hippokampus (Cornu ammonis 1) waren bezogen auf Bregma anterior-
posterior -2,1 mm, laterolateral -1,6 mm und dorso-ventral -2,3 mm entsprechend einer
früheren histologischen Validierung für männliche NMRI-Mäuse (Twele et al., 2016b).
als Positivkontrollen mitgeführten Vergleichsfärbungen von Gehirnschnitten mit
bekanntem Absterben von Neuronen von Tieren nach Status epilepticus
4 Material und Methoden
53
Abbildung 9: (Paxinos and Franklin, 2004)
Darstellung der Kainatinjektionsstelle im
Gehirnatlas (Pfeil).
Zur Herstellung der Kainat-Lösung wurden 10 mg Kainat (Sigma Aldrich, Deutschland)
in 2345 µl steriler physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Ein Volumen von 50 nl wurde
mit einer 0,5 µl umfassenden Spritze (VWR International, Hannover, Deutschland)
über eine Minute hinweg injziert, wobei die Kanüle für jeweils zwei Minuten vor und
nach der eigentlichen Injektion im Gewebe belassen wurde, um zum einen das richtige
Vordringen der Kanüle im Gewebe zu erlauben, und zum anderen, um einen Reflux
zu vermeiden (Twele et al., 2016a, Gröticke et al., 2008, Klein et al., 2015b). Direkt im
Anschluss an die Operation wurden 0,5 ml einer 5%igen Glukoselösung mit
Elektrolyten (Sterofundin® HEG-5 Infusionslösung, ½ E, G-5%; B. Braun Melsungen
AG, Melsungen, Deutschland) subkutan verabreicht, wie weitere 10 ml/kg
intraperitoneal. Bis zur Erholung von der Operation wurden, falls nötig, subkutane
Injektionen mit physiologischer Kochsalzlösung gegeben. Die Tiere wurden nun
entweder mit ketogener Diät oder mit der Standarddiät gefüttert, wobei über die ersten
Tage die Pellets der letzteren zuvor in Wasser eingeweicht wurden.
4.4.2 Fütterung der ketogenen Diät
Die ketogene Diät wurde von Harlan Laboratories GmbH bezogen (TD.96355, Venray,
Niederlande). Mit ihrer gekühlt marzipanähnlichen Konsistenz wurde sie jeden Tag
frisch zu kleinen „Pellets“ geformt ad libitum in der üblichen Futterraufe der Käfige
angeboten. Täglich wurde der Verbrauch ermittelt, um einen durchschnittlichen
Futteraufnahmewert berechnen zu können. Das Verhältnis von Fett zu Protein und
Kohlenhydraten betrug 4,25 (6,7 kcal/g, 9,1% kcal aus Proteinen, 0,4% kcal aus
Kohlenhydraten, 90,5% kcal aus Fetten). Die Inhaltstoffe der Diät waren:
4 Material und Methoden
54
hydrogeniertes pflanzliches Fett (586,4 g/kg), Kasein (173,3 g/kg), Zellulose (87,97
g/kg), Maisöl (86,2 g/kg), Mineralmischung (Kalzium-Phosphor-defizient, 79055, 20
g/kg), dibasisches Kalziumphosphat (19,3 g/kg), Vitaminmischung (40060, 13 g/kg),
Kalziumkarbonat (8,2 g/kg), DL-Methionin (2,6 g/kg), Cholin-Bitartrat (2,5 g/kg),
Magnesiumoxid (0,4 g/kg), Antioxidans 2-tert-Butylhydrochinon (0,13 g/kg).
4.4.3 PET und Datenauswertung
4.4.3.1 [18F]FDG
Die [18F]FDG-PET zur Darstellung des zerebralen Glukosemetabolismus wurde vier
und neun bis zehn Wochen nach der (Sham-)Operation durchgeführt, entsprechend
dem in Abschnitt 4.2.3 beschriebenen Prozedere. Im Rahmen der Blutentnahme für
die Glukosemessung vor dem Scan wurde auch die Blutkonzentration von ß-
Hydroxybutyrat mit einem Teststreifen gemessen (GlucoMen® LX ß ketone sensors,
A. Menarini Diagnostics, Firenze, Italy). Eine zweite Messung der
Blutglukosekonzentration wurde nach dem Scan durchgeführt. Pro Maus wurde eine
Aktivitätsdosis von 10,17 ± 2,224 MBq injiziert. Die Bilddatenverarbeitung in PMOD
3.6 für die anschließende Auswertung wurde wie in 3.2.3 durchgeführt, ebenso die
Auswertung der [18F]FDG-Daten mit Uptake und FDG 2-Compartment Model.
4.4.3.2 [18F]GE-180
Die [18F]GE-180-PET zur Darstellung von TSPO (Translocator Protein 18 kDa) wurde
entsprechend dem Prozedere bei der [18F]FDG-PET durchgeführt, mit nur der ersten
Messung der Blutglukosekonzentration. Die injizierte Aktivitätsdosis pro Maus war
11,08 ± 3,450 MBq. Die Auswertung der [18F]GE-180-Daten bestand aus der
Berechnung des Uptake entsprechend der Methode für [18F]FDG, wobei die letzten
drei Bildframes verwendet wurden. Des Weiteren wurde getestet, ob das 2-
Compartment Model (PMOD 3.6) auch in der Maus mit ihrer geringen Größe eine
geeignete Möglichkeit bietet, das Verteilungsvolumen (Vt) des Tracers im Gewebe zu
ermitteln. Die dazu benötigte IDIF (Image-derived Input Function) wurde durch
Platzierung einer Region of Interest (2 x 2 x 4 mm) in den frühen Bildframes in die
vorzugsweise rechte Arteria carotis gewonnen.
4 Material und Methoden
55
4.4.3.3 [18F]Flumazenil
Die [18F]Flumazenil-PET zur Darstellung der zentralen Benzodiazepin-Rezeptoren
wurde entsprechend dem Prozedere der [18F]GE-180-PET durchgeführt.
Den Mäusen wurde eine Aktivitätsdosis von 12,61 ± 1,128 MBq injiziert. Für die
Auswertung der [18F]Flumazenil-Daten wurde das Simplified Reference Tissue Model
von PMOD 3.6 herangezogen, das auf den Beschreibungen von Lammertsma und
Hume (Lammertsma und Hume, 1996), sowie Gunn et al. (Gunn et al., 1997) beruht.
Der Hirnstamm wurde als Referenzregion ausgewählt, um das geschätzte Binding
Potential PBND zu ermitteln (Ergebnisse siehe Anhang).
4.4.4 Irwin-Screen
In dieser Arbeit wurde eine modifizierte und gekürzte Version der ursprünglich von
Irwin et al. beschriebenen ausführlichen Verhaltensbeobachtung (Irwin, 1968)
verwendet. Die Experimente wurden immer zur selben Zeit am Morgen des Vortages
der Operation für die Mikroinjektion, eines jeden PET-Scans und schließlich noch final
durchgeführt. Jede Maus wurde in einem leeren offenen Käfig getestet, der zwischen
den einzelnen Tieren mit 0,1%iger Essigsäure ausgewischt wurde. Dabei wurden die
folgenden Parameter erfasst und mit einer Skala beurteilt: Körperposition, Haltung des
Schwanzes, Geschwindigkeit der Vorwärtsbewegung, Aktivität (Aufrichten),
stereotypes Verhalten, Neugierverhalten (Reaktion auf die Annäherung eines Stiftes),
Fluchtantwort auf Berührung mit einem feinen Pinsel, Schreckhaftigkeit (Reaktion auf
einen Klicker) und Verhalten während des Fangens der Maus am Schwanz. Bei dieser
Skala reichten die Werte meist von 0 bis 4, wobei zwei eine normale Reaktion und 0
keine Reaktion oder keine Bewegung bezeichnete und 4 eine starke Reaktion oder
Hyperaktivität (siehe Tabelle im dritten Manuskript)).
4.4.5 Elektrodenimplantation
Die Elektrodenimplantation wurde elf Wochen nach der Mikroinjektion durchgeführt,
unter Aufsuchen derselben Koordinaten wie für die vorherige Operation und
entsprechend der zuvor beschriebenen Methode (Twele et al., 2016a, Gröticke et al.,
4 Material und Methoden
56
2008, Klein et al., 2015b). Mögliche elektrodenbedingte Artefakte in der Bildgebung
wurden auf diese Weise ausgeschlossen. Allerdings wurde für die bessere
Steuerbarkeit der Anästhesie nun Isofluran verwendet. Zur Fixation der bipolaren
Elektrode wurde Zahnzement (Paladur®) verwendet, der die Elektrode nicht nur mit
der gereinigten und getrockneten Schädeloberfläche verband, sondern auch mit drei
weiteren Metallschrauben, unter denen zwei reine Halteschrauben und eine weitere
die mit der Erdung direkt verbundene Erdungsschraube darstellte. Dazu wurden zwei
Schrauben in jedes Os frontale gedreht und die dritte in das Os parietale sinistrum.
4.4.6 Elektroenzephalographie, Video-Überwachung und Datenauswertung
Die Überwachungskäfige für die Mäuse wurden für einen besseren Kontrast mit
dunkler Einstreu ausgestattet (Cellu Dri®). Besonders leichte, speziell für diese
Anwendung hergestellte Elektroenzephalogramm EEG-Ableitkabel, sorgten für eine
geringstmögliche Bewegungsbeeinträchtigung der Tiere während der EEG-
Aufzeichnung. EEG und Video (NyctoVision, Wunstorf, Deutschland) wurden simultan
und kontinuierlich aufgezeichnet. Dazu wurde die Software LabChart in den Versionen
6 und 8 (ADInstruments GmbH, Spechbach, Deutschland) eingesetzt. Während der
Dunkelphase wurden die Käfige durch Infrarot-Dioden beleuchtet. Die gesamte
Aufnahmezeit betrug 96 bis 148 Stunden. Nach etwa drei Tagen wurde die Aufnahme
für eine Pause von etwa zwei Tagen unterbrochen, um den Mäusen eine Erholung
vom Tragen des Kabelgewichtes zu ermöglichen. Die EEG-Datei wurde zu folgenden
Uhrzeiten genau auf elektroenzephalographische Ereignisse ausgewertet: 8:00 - 9:00
Uhr, 14:00 - 15:00 Uhr, 20:00 - 21:00 Uhr und 02:00 – 03:00 Uhr. Damit waren es
jeweils zwei Stunden in der Dunkel- und zwei in der Hellphase.
Elektroenzaphalographische Ereignisse wurden in High Voltage Sharp Waves
(HVSW), Hippocampal Paroxysmal Discharges (HPD) und Mixed Events (ME)
kategorisiert, wie zuvor beschrieben (Twele et al., 2016a). Das gesamte EEG-Material
wurde außerdem auf generalisiertes Anfallsgeschehen untersucht.
4 Material und Methoden
57
4.4.7 ActiMot -Test
Abschließend wurde in der 13. bis 14. Woche nach der Mikroinjektion jede Maus für
10 Minuten im sogenannten Activity Cage (ActiMot, TSE Systems GmbH, Bad
Homburg, Deutschland) getestet. In diesem Versuch wurde jede Maus in eine
quadratische Test-Arena aus Plexiglas gesetzt, die von einem auf Infrarot-
Lichtschranken basiertem Detektionssystem umgeben und mit einem Computer und
der zugehörigen ActiMot Software (TSE Systems GmbH, Bad Homburg, Deutschland)
verbunden war. Damit wurden automatisch Geschwindigkeit, aktive Zeit,
zurückgelegte Strecke, Besuche im Zentrum, Aufenthaltsdauer im Zentrum, Anzahl
des Aufrichtens, Aufenthaltsdauer am Rand und ein Laufbild aufgezeichnet. Zwischen
zwei Tieren wurde die Arena mit verdünnter Essigsäure (0,1%) geruchsneutralisiert.
4.4.8 Statistik
GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego California USA) wurde für die
statistischen Berechnungen verwendet. Eine einfache Varianzanalyse kombiniert mit
Dunnett’s Multiple Comparison Test oder Sidak’s Test post-hoc wurde für Vergleiche
zwischen den Gruppen bei den PET-Bild-Daten durchgeführt. Ein Kruskal-Wallis-
Test mit Dunn’s Multiple Comparison Test post-hoc wurde für die Vergleiche bei
skalierten Ergebnissen verwendet. Der Mann-Whitney U-Test wurde für die
Vergleiche von gezählten elektroenzephalographischen Ereignissen verwendet. Der
Barnard‘s Test (http://scistatcalc.blogspot.de/2013/11/barnards-test-calculator.html)
wurde für die Analyse von Kontingenztabellen eingesetzt. P-Werte < 0.05 wurden als
statistisch signifikant eingestuft. Alle Graphen zeigen Mittelwerte mit Standardfehler.
5 Manuskripte
58
5 Manuskripte
5.1 Attenuation of epileptogenesis by 2-deoxy-d-glucose treatment is reflected
in 2-deoxy-2-[18F]fluoroglucose brain kinetics
Ina Leiter1,2, Pablo Bascuñana2, Frank Michael Bengel2, Jens Peter Bankstahl2#,
Marion Bankstahl1#*
1 Department of Pharmacology, Toxicology and Pharmacy, University of Veterinary
Medicine Hannover and Center for Systems Neuroscience, Bünteweg 17, 30559
Hannover, Germany
2 Department of Nuclear Medicine, Hannover Medical School, 30625 Hannover,
Germany
*Corresponding author: Marion Bankstahl, University of Veterinary Medicine
Hannover, Department of Pharmacology, Toxicology and Pharmacy, Bünteweg 17,
D-30559 Hannover, Germany, Tel: +49-511-9538729, Fax: +49-511-9538581, E-
mail: [email protected]
#These authors contributed equally to this study.
Key words: cerebral glucometabolism, mouse model, PET imaging, epilepsy,
microglia
Abstract
Rationale: Hitherto, processes leading to acquired epilepsy cannot be prevented.
Modulation of cerebral glucose metabolism by 2-deoxy-D-glucose treatment (2-DG, an
inhibitor of glycolysis) might exert anti-epileptogenic effects. 2-Deoxy-2-
5 Manuskripte
59
[18F]fluoroglucose positron emission tomography ([18F]FDG PET) was used to
investigate effects of 2-DG treatment during epileptogenesis.
Methods: 6 Hz-corneal kindling model was performed to imitate epileptogenesis in
male NMRI mice by twice daily electrical corneal stimulation for 21 days. Kindling
groups received intraperitoneal injections of 250 mg/kg 2-DG (n = 18) or saline (n=12)
1 min after each stimulation. Further, twelve unstimulated mice were treated with 2-
DG. Dynamic 60-min [18F]FDG PET/CT scans were acquired at baseline and inter-
ictally on days 10 and 17. [18F]FDG uptake (%ID/cc) was quantified using a MRI-based
brain atlas. Kinetic modelling (FDG-2-compartment model, image-derived input
function out of the vena cava caudalis) was performed to evaluate glucose metabolic
rate MRGlu and net influx rate Ki. Immuno-histochemical stainings of glucose
transporter 1 (GLUT1), glial fibrillary acidic protein (GFAP) and ionized calcium-binding
adapter molecule 1 (IBA1), as well as a Fluoro-Jade-C staining were performed.
Results: 2-DG treatment resulted in attenuated kindling progression, mainly in the early
phase (up to 29.3 ± 11.8%, p<0.01), in less fully-kindled mice and in lower overall
percentage of shown type five seizures. 2-DG treated mice during kindling had an
regionally increased [18F]FDG uptake at day 10, and higher uptake levels compared to
pure 2-DG treatment at days 10 and 17. Further, 2-DG treatment during kindling
caused higher MRGlu values compared to vehicle-treatment in thalamus and
hippocampus at day 17. The Ki was increased partly at days 10 and 17, and was higher
than that of the only 2-DG treated group at day 10. Kindling progression without
treatment neither altered [18F]FDG uptake nor kinetic parameters. In unstimulated
mice, 2-DG treatment resulted in decreased [18F]FDG uptake at day 17 in several brain
regions, whereas MRGlu and Ki values were globally increased. Kindling caused
activation of astrocytes, but not neurodegeneration. Surprisingly, 2-DG treatment led
to microglial activation (independent of kindling). Impact of kindling or 2-DG treatment
on GLUT1 staining was not observed.
Conclusions: 2-DG treatment exerts disease-modifying effects in the 6 Hz mouse
corneal kindling model of difficult to treat seizures. Both the alleviation of astroglial
5 Manuskripte
60
activation and the unexpected activation of microglia by 2-DG might contribute to its
positive interference with epileptogenesis. While [18F]FDG PET does not seem to be a
promising marker for active epileptogenic processes during 6 Hz corneal kindling, it
facilitates specific insight into the drug-disease interaction in combination with 2-DG
treatment.
Introduction
To date, there is no evidence-based epilepsy-preventive therapy known (Baulac et al.,
2015). In view of the one-third of pharmacoresistant epilepsy patients (Brodie et al.,
2012), it is a major medical need to develop a practicable treatment after a potentially
epilepsy-inducing brain insult interfering with epileptogenesis or modifying the disease
progression (Löscher and Brandt, 2010).
Previous and ongoing research has shed further light on cerebral processes following
epileptogenic brain insults potentially contributing to epilepsy development. 2-Deoxy-
2-[18F]fluoroglucose positron emission tomography ([18F]FDG PET) studies show that
changes in brain glucose metabolism occur in several animal models of epilepsy during
epileptogenesis. Whereas a cerebral hypermetabolism is described for the acute
phase of epilepsy induction (Mirrione et al., 2007, Mirrione et al., 2006, Kornblum et
al., 2000), the occurrence of cerebral hypometabolism represents a common finding
during subacute and subsequent stages of epileptogenesis (Jupp et al., 2012, Liu et
al., 2010, Lee et al., 2012, Goffin et al., 2009, Zhang et al., 2015). This is consistent
with the hypometabolic appearance of epileptic foci in interictal [18F]FDG PET imaging
used for pre-surgical evaluation in patients (Burneo et al., 2015, Drzezga et al., 1999).
In view of these glucometabolic alterations as a typical feature of epileptogenesis and
chronic epilepsy, we hypothesize that targeting cerebral energy metabolism already
during disease development might exert positive influence on later disease outcome.
2-Deoxy-D-glucose (2-DG), a candidate anti-seizure drug under preclinical evaluation
(Bialer et al., 2015), impedes the glycolytic pathway (Xi et al., 2014) and represents an
eligible compound for influencing cerebral glucose metabolism. After penetration into
the cell and transformation to 2-DG-6-phosphate by hexokinase, it cannot be further
metabolized and accumulates in the cell (Kipnis and Cori, 1959). As a result, 2-DG-6-
5 Manuskripte
61
phosphate blocks cellular glucose uptake by glucose transporters (Kipnis and Cori,
1959) and competes with glucose-6-phosphate for phosphoglucose isomerase (Wick
et al., 1957, Nirenberg and Hogg, 1958). Furthermore, 2-DG-6-phosphate seems to
inhibit hexokinase non-competitively (Chen and Gueron, 1992). Further, ketogenesis
is stimulated as a consequence of reduced glycolysis and ketone bodies as an
alternative energy source then enhance mitochondrial energy metabolism (Yao et al.,
2011).
2-DG exerts acute anticonvulsant effects in the 6-Hz psychomotor seizure test in
mice (Gasior et al., 2010, Stafstrom et al., 2009), the rat pilocarpine model (Lian et
al., 2007), the mouse pilocarpine model (Yang et al., 2013) and in Fring’s mice with
audiogenic stimulation (Stafstrom et al., 2008). Sustained anticonvulsant effects were
seen in terms of increased afterdischarge thresholds in the perforant path kindling
model in rats (Stafstrom et al., 2009). Beyond this, impeded kindling progression was
reported in three rat kindling models (amygdala kindling, perforant path kindling, and
olfactory bulb kindling) (Garriga-Canut et al., 2006, Stafstrom et al., 2009),
suggesting also anti-epileptogenic properties of 2-DG. In this regard, it is of particular
relevance that a retardation in perforant path kindling progression was also described
with a 2-DG treatment administered up to ten minutes after each stimulation (Sutula
and Franzoso, 2008), hereby excluding acute anticonvulsant activity as a major
reason for kindling deceleration.
Aim of this study was to evaluate the impact of 2-DG treatment on epileptogenesis in
the mouse 6 Hz corneal kindling model, a model characterized by resistance to
several anti-seizure drugs (Leclercq et al., 2014). Moreover, using [18F]FDG PET and
complementary histological analyses, effects of kindling with and without chronic 2-
DG treatment on cerebral glucose metabolism, astro- and microglial activation,
glucose transporter 1 (GLUT1) expression and neuronal viability were investigated.
Materials and methods
Animals
Male NMRI mice from Charles River (Sulzfeld, Germany) were used in all experiments.
They were purchased at an age of about six weeks, weighing 30 – 35 g. Experiments
5 Manuskripte
62
commenced after one week of adaptation. Animals were housed in groups of 10
animals in individually ventilated cages (Allentown, Neuss, Germany) with bedding and
nesting material, under constant laboratory conditions: 20 – 22°C, air humidity of 40-
70%, 14 hours light phase (7 am to 9 pm) and 10 hours dark phase. Autoclaved water
and a standard rodent diet (Altromin, Lage, Germany) was offered ad libitum. Any
efforts were made to diminish suffering of the experimental animals at the best. All
experiments were performed in conformity with the EU directive 86/609/EWG and the
German animal welfare act (Tierschutzgesetz), with the permission of the Lower
Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety (LAVES).
Drugs
For the intraperitoneal (i.p.) injections, 250 mg/kg 2-DG (Sigma-Aldrich, Steinheim,
Germany, D8375) were freshly dissolved in 10 ml/kg 0.9% sterile saline. Vehicle-
treated animals received i.p. injections of 10 ml/kg 0.9% sterile saline. Tetracaine
hydrochloride (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany, T7508) was dissolved in aqua ad
injectabilia to produce a two percent tetracaine eye drops solution.
Animal groups and treatment
During the experiment, two groups of mice were kindled: A 2-DG-treated group (2-
DG+kindling, n=18), injected i.p. with 250 mg/kg 2-DG one minute after each
stimulation, and a vehicle-treated group (vehicle+kindling, n=18) receiving i.p.
injections of saline one minute after each stimulation. An additional group of mice (2-
DG w/o kindling, n=12) was not stimulated, but was injected with 250 mg/kg 2-DG i.p.
at the same time points as the kindled animals. The last treatment before each PET
scanning was performed on the evening before, i.e. 18 - 20 h prior [18F]FDG PET, to
avoid concealing of kindling-medidated effects on brain glucometabolism by acute
influence of 2-DG. The next kindling stimulation and treatment was performed in the
evening after PET scanning.
5 Manuskripte
63
Corneal kindling
A stimulator (ECT UNIT, 57800, Ugo Basile, Comerio, Italy) with leather-covered
corneal electrodes was used to deliver the corneal kindling stimuli twice daily for 21
days. The stimuli were monopolar, lasted for 3 s, had a frequency of 6 Hz, a current
intensity of 44 mA, and a pulse duration of 0.2 ms (Leclercq et al., 2014). The inter-
stimulation interval was at least six hours. At least 15 min before start of the first
stimulation, the stimulator was switched on, the electrodes’ leather covers were soaked
with saline and the stimulator performance was thereupon tested. Before this
procedure, the animal cage tops were opened and the animals could adapt to the
environment during the experimental course. Two minutes prior to stimulation, the
individual animal received a drop of the tetracaine eye drops solution in both eyes. A
stop watch was used to ensure the appropriate timeperiod to induce the local
anesthesia. During stimulation, the animals were manually restrained. Immediately
afterwards, the mice were unclasped and closely observed for the expression of motor
seizures within the first minute after stimulation. The seizure severity was scored using
a modified Racine scale (Racine, 1972): score 0, immobility or no reaction, running
and bouncing; score 1, mild facial clonus: eye blinking / closing, twitching of the
vibrissae, stereotyped sniffing; score 2, severe facial clonus: chewing, head nodding,
and/or myoclonic twitches of the forelimbs; score 3, clonic convulsions of one forelimb
without rearing; score 4, clonic convulsions of both forelimbs with / without rearing;
score 5, generalized clonic convulsions with immediate loss of balance (also in lateral
position); score 6, tonic seizure of fore- and hindlimbs. Mice showing at least eight of
ten consecutive stage five seizures were declared fully kindled. Body weight was
determined each day in order to deliver the appropriate treatment dosage and to
control the health status of the animals. The first corneal kindling stimulation was done
in the evening after the first [18F]FDG PET scan.
Image acquisition
A dedicated small animal PET-CT scanner was used for imaging brain glucose
metabolism (Inveon DPET, Siemens, Knoxville, TN, USA). Mice were scanned at three
timepoints: At day 1 (baseline), i.e. after first 2-DG or vehicle treatment but before first
5 Manuskripte
64
kindling stimulation, at day 10, and at day 17 of kindling. Anesthesia induction was
performed with three percent isoflurane in three liters oxygen per minute. During the
scanning procedure, the isoflurane concentration (in 0.6 liters of oxygen per minute)
was adapted to each animal to maintain a respiration frequency of about 60 – 80 /min.
Prior to tracer injection, blood glucose was measured from the vena saphena (Contour
XT® meter, Bayer Consumer Care, Basel, Switzerland). Animals were then placed
side-by-side in a double mouse scan bed (Minerve, Esternay, France). During
anesthesia, respiration frequency was monitored and bed temperature was maintained
at 37 °C. The head of the mice was positioned in the center field of view. The tracer
(8.38 ± 0.46 MBq (mean ± SD) [18F]FDG in a volume of 0.15 ml) was injected into the
lateral tail vain using a catheter made of two 27 G cannulas and a medical micro
volume tube (Kleinfeld Labortechnik, Gehrden, Germany, Tygon S-54-JL, no. 9.205
504). Dynamic acquisitions of 60 min were obtained starting with tracer injection. The
acquired list mode data were histogrammed to 32 frames. The image reconstruction
to a 128 x 128 x 159 matrix (0.78 x 0.78 x 0.8 mm3) was done with a three-dimensional
ordered subset expectation maximization (3D-OSEM) / maximum a posteriori (MAP)
algorithm (β =1, OSEM iterations =2, MAP iterations =18) with scanner-applied scatter
correction. Attenuation was corrected using a 57Co transmission scan. After each
[18F]FDG PET scan, a standard CT acquisition followed. After the scanning procedure,
blood glucose levels were measured again, in blood drops taken from the tail vein after
removal of the catheter. Average duration of anesthesia was 114.9 ± 9.56 min (mean
± SD).
Image data processing and kinetic modelling
Image data were processed using PMOD 3.6 software (PMOD Technologies,
Switzerland). First, each CT image was co-registered to the standard mouse MRI atlas
of PMOD (T2-weighted, (Ma et al., 2005)). Second, each CT image was co-registered
to the correlating PET image. Finally, the transformation followed with the exact
overlap of MRI atlas and PET image. The [18F]FDG uptake was analysed using the
Mirrione mouse atlas provided in this PMOD version (Mirrione et al., 2007). The tracer
uptake values of the analyzed brain regions were calculated from the last two frames
5 Manuskripte
65
(i. e. the last twenty minutes of the acquisition) and expressed as percent injected dose
per cubic centimetre. The kinetic modelling was performed using the FDG 2-
compartiment model offered in the kinetic modelling tool of the PMOD 3.6 version. For
this, an image-derived input function (IDIF) was obtained by calculation of the whole
blood time-activity-curve for a region of interest (2 x 2 x 4 mm3) positioned in the early
frame images on the vena cava caudalis (Lanz et al., 2014, Thorn et al., 2013). The
used lumped constant LC (which delineates the different properties of glucose and
[18F]FDG concerning the uptake and the phosphorylation) was 0.67 (Thorn et al.,
2013). Individual blood glucose values of both measurements (before and after each
scan) were averaged and then introduced in the modelling process.
Immunohistochemistry
On day 22 after start of kindling, mice were deeply anesthetized using ketamine and
xylazine. They were transcardially perfused with 25 ml 0.01 M phosphate buffered
saline and thereafter with 25 ml 4% paraformaldehyde solution (dissolved in 0.1 M
phosphate buffer, pH = 7.4). Brains were removed, transferred into 4%
paraformaldehyde solution for 24 h and stored in a solution of 30% sucrose and 0.2%
sodium azide in 0.1 M phosphate buffer until slicing. Brains of six mice randomly
chosen per group were sliced on a sliding microtome (Frigomobil CM 1325, Leica,
Wetzlar). Slices (40 µm thickness) were stored in 0.1 M phosphate buffered saline until
used for immunohistochemical staining (free-floating method). Rabbit anti-mouse
glucose transporter 1 (GLUT1) antibody (diluted 1:1000; Biotrend Chemikalien GmbH,
Cologne, Germany, GT-11A, lot no. 1105859A 1.3-P) was used as primary antibody.
Endogenous peroxidase activity was inhibited using 0.5% hydrogen peroxide.
Unspecific antibody binding sites were blocked with 10% donkey serum. Slices were
incubated for 20 h in the primary antibody solution at 7°C. Slices were exposed to the
secondary antibody (biotin-SP-conjugated affinipure donkey anti-rabbit IgG, 1:500;
Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe, Suffolk, UK, code no. 711-065-152)
for 1 h at room temperature. Vectastain ABC kit (Burlingame, CA, USA) provided the
avidin-biotin complex for the final visualization reaction with 3,3’-diaminobenzidine
solution and hydrogen peroxide. Stainings of microglia and astrocytes were performed
5 Manuskripte
66
according to a protocol varying in the following steps: Endogenous peroxidase activity
was inhibited using 0.6% hydrogen peroxide and the blocking step was done using 5%
normal goat serum. Brain slices were exposed to the primary antibody, anti-ionized
calcium-binding adapter molecule 1 (IBA1) antibody (diluted 1:500; Synaptic Systems,
Göttingen, Germany, cat. no. 234 003) or the anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP)
antibody (1:5000; Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Germany, Z 0334, lot no.
20013978) for 18 h at room temperature. Peroxidase affinipure goat anti-rabbit IgG
(1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe, Suffolk, UK, code no. 111-
035-144) was used as secondary antibody. Slices were mounted on glass slides
(Menzel-Gläser, Thermo Scientific, Braunschweig, Germany) and cover-slipped with
mounting medium (Entellan, Merck, Darmstadt, Germany).
GLUT1-stained sections of the four groups were visually inspected using a light
microscope. GLUT-1-staining intensity in the regions of interest mentioned above was
compared between groups. Microglial (IBA1) and astroglial (GFAP) activation was
semi-quantitatively scored in a blinded fashion as recently described (Brackhan et al.,
2016); score 0 = inactive cells, less than 10% activated, score 1 = predominantly
inactive cells, about 30% activated, score 2 = some inactive cells, about 60% activated,
score 3 = more than 90% activated cells). At section levels -1.94 mm and -3.16/-3.28
mm relative to bregma (Paxinos and Franklin, 2007), the following brain regions were
assessed: hippocampal cornu ammonis (CA)1, CA3a, and dentate hilus, as well as
thalamus, amygdala, and piriform cortex. Microglial and astroglial scores were each
averaged for the two assessed brain section levels. To visualize neurodegeneration,
Fluoro-Jade C staining was performed as described by Gröticke et al. (Gröticke et al.,
2007). Briefly, brain slices were mounted on protein glycerol coated glass slides and
air-dried. Directly before staining, the slides were bathed twice in ethanol (80%, five
minutes, and 70%, two minutes) and in destilled water to remove the latter. Staining
was performed with 0.0001% Fluoro-Jade C solution for 30 minutes. Slices were cover-
slipped with mounting medium (DPX mountant for histology, Sigma-Aldrich, Steinheim,
Germany). The stained slices (-1.94 mm relative to bregma) were microscopically
screened for fluorescence-positive neurons concerning the target regions described
above.
5 Manuskripte
67
Statistical analysis
All statistical tests were calculated using GraphPad Prism version 5.00 for Windows
(GraphPad Software, San Diego California USA). For comparison of only two data sets
(seizure severity, kindling duration) a Student’s t-test was used. Inter-group differences
concerning seizure response during kindling progression and histological evaluation
were analyzed performing a Kruskal-Wallis analysis of variance (ANOVA) followed by
Dunn’s Multiple Comparison Test. One-way ANOVA with Bonferroni testing was
conducted regarding the inter-group comparisons of all PET imaging data and
repeated-measures ANOVA with Bonferroni testing was used concerning intra-group
and inter-time point comparisons of imaging data. All graphs show mean values with
standard error of the mean.
Results
Corneal kindling
The 6 Hz corneal kindling course started with seizure responses of type two to three
in most animals (Figure 1A). On days three, four and five of kindling, the 2-DG-treated
animals showed significantly attenuated seizure responses (p<0.05; Figure 1C). On
days eight and nine, the duration of the seizure response was shorter in the 2-DG
treated group (p=0.023 and p=0.030). Over the course of the kindling process, 2-DG-
treated mice showed less seizures of type five than vehicle-treated mice (p=0.0004;
Figure 1C). According to our definition of a fully-kindled state, the percentage of
completely kindled mice per group after 39 stimulations was 88.9% in the vehicle group
and 50% in the 2-DG group. The arithmetic mean number of stimulations needed to
achieve a fully-kindled state was increased by 2-DG treatment (20.81 vs. and 29.11
stimulations, vehicle group vs. 2-DG group, p=0.0058; Figure 2D). No mortality
occurred during corneal kindling. However, five mice had to be killed before end of
kindling due to recurrent penis prolapse (Fig. 1C, indicated in grey). The highest stage
of shown seizures was type five (Figure 1A). Body weight of corneally-kindled mice
remained stable over time (34.36 ± 0.4576 vs. 33.98 ± 0.4784 g, mean ± SEM, day 1
vs. day 21, vehicle-treated group, p= 0.5761; 34.46 ± 0.4961 vs. 33.41 ± 0.5332 g,
mean ± SEM, day 1 vs. day 21, 2-DG-treated group, p= 0.1607), and the mean body
5 Manuskripte
68
weight did not differ between kindled groups at any investigated time point (not shown).
Unstimulated mice treated with 2-DG generally gained about three grams of body
weight over the treatment period of 21 days (35.77 ± 0.5245 vs. 38.58 ± 0.5371 g,
mean ± SEM, day 1 vs. day 21, p= 0.0045).
Imaging
[18F]FDG uptake: The 2-DG-treated unstimulated group showed a reduced [18F]FDG
uptake on day 17 compared to baseline in thalamus, amygdala, cortex, and striatum
(Figure 2 B-E). While tracer uptake did not change in vehicle-treated kindled mice
(Figure 2 A-F), an increased [18F]FDG uptake was detected in 2-DG-treated kindled
mice on day 10 in thalamus and cerebellum (Figure 2 B, F). On day 10 of 2-DG
treatment, a higher [18F]FDG uptake was seen in kindled versus unstimulated mice in
all analyzed brain regions except for the amygdala (Figure 2 A-F), whereas on day 17
this was found in amygdala and striatum (Figure 2 C,F).
[18F]FDG two compartment modeling: The metabolic rate MRGlu as well as the influx
rate Ki increased in the 2-DG-treated unstimulated group on day 17 compared to
baseline in all analyzed brain regions apart from amygdala (Figure 3 A-F, Figure 4 A-
F). While kindling alone did neither alter Ki nor MRGlu (Figure 3 A-F, Figure 4 A-F),
MRGlu was higher in hippocampus and thalamus of the 2-DG-treated kindled mice
compared to the vehicle-treated kindled mice at day 17 (Figure 4 A, B). Raised Ki
values were detected on days 10 and 17 in the 2-DG-treated kindled group compared
to baseline in hippocampus, thalamus, amygdala, and cerebellum. Ki in 2-DG-treated
kindled mice was also higher than in 2-DG-treated unstimulated mice at day 10 in all
analyzed brain regions as well as on day 17 in amygdala.
Blood glucose levels measured directly before each scan remained stable in the
vehicle-treated kindled animals compared to baseline values before start of kindling
(not shown). Treatment with 2-DG led to a decrease of blood glucose levels at day 17
in the unstimulated group, while reduced levels were found on days 10 and 17 in the
kindled group (not shown).
5 Manuskripte
69
Immunohistochemistry
GLUT1 staining did not reveal any obvious differences between groups (not shown).
Activation of microglia (IBA1) and astrocytes (GFAP) was occasionally seen in brain
sections of control mice. While vehicle-treated kindled mice did not differ from naïve
controls (Figure 5A,B), distinctly elevated microglial activation was found in the CA3a
region, dentate hilus, and thalamus of 2-DG-treated kindled mice. The CA1 region and
the piriform cortex showed a tendency towards increased microglial activation
(p=0.0711 and 0.0521, respectively; Figure 5B). In amygdala, no group differences
were found. Unexpectedly, IBA1 staining revealed prominent microglial activation also
in the 2-DG-treated unstimulated group in all analyzed hippocampal subregions (CA1,
CA3a, dentate hilus) and the thalamus (Figure 5A,B). GFAP staining revealed raised
astroglial activation in the vehicle-treated kindled group in the CA3a region, dentate
hilus, and piriform cortex, whereas in the 2-DG-treated kindled group this was only
seen in the dentate hilus (Figure 6A,B). 2-DG treatment alone did lead to astroglial
activation higher than in naïve controls (Figure 6A,B). Fluorojade-C-positive neurons
were not detected in any group (not shown).
Discussion
Glucometabolic changes during epileptogenesis represent a target for therapeutic
intervention. This study was designed to evaluate potential anti-epileptogenic or
disease-modifying effects of the glycolysis inhibitor 2-DG in the 6 Hz corneal kindling
model and how this might be reflected in brain glucometabolism as assessed by
translational [18F]FDG PET. Our main findings are: 1. Chronic 2-DG treatment reduces
epileptogenesis progression and seizure severity during 6 Hz corneal kindling. 2.
Kindling-mediated epileptogenesis indeed results in prominent astroglial activation, but
does not alter interictal brain glucometabolism, neuronal viability, or activation state of
microglia. 3. Kindling-mediated epileptogenesis in combination with 2-DG treatment,
however, leads to increased cerebral glucose turnover, as well as to microglial
activation. 4. Chronic 2-DG treatment unexpectedly also results in microglial activation
in unstimulated mice, but partially alleviates astroglial activation in kindled mice.
5 Manuskripte
70
Disease-modifying effects of 2-DG in the 6 Hz corneal kindling model
Kindling-decelerating effects of 2-DG treatment have been shown before in rat models
of kindling-mediated epileptogenesis (Garriga-Canut et al., 2006, Stafstrom et al.,
2009). We here applied the recently described 6 Hz corneal kindling model, which
seems advantageous over the 50 Hz corneal kindling model (Matagne et al., 2008,
Matagne and Klitgaard, 1998, Potschka and Löscher, 1999, Willis et al., 2010, Rowley
and White, 2010) because it displays robust kindling development and is not
associated with mortality (Leclercq et al., 2014). Both seizures induced in healthy and
fully kindled mice by 6 Hz stimulation are characterized by limited response to anti-
seizure drugs (Bankstahl et al., 2013, Barton et al., 2001, Leclercq et al., 2014). We
here show, that despite this treatment resistance of 6 Hz seizures, a positive influence
of 2-DG on kindling progression and outcome could be achieved. Although seizure
responses were positively influenced mainly in the early phase of kindling, the overall
outcome shows less fully-kindled animals and less type-five seizures in the 2-DG-
treated group.
Beyond demonstrating that the epileptogenesis-modifying effects of 2-DG extent to
another species, i.e. mice, we here provide further evidence that 2-DG can manipulate
epileptogenesis also when administered after rather than before kindling stimulations.
Epileptogenesis progression during kindling is based on growing susceptibility to the
same seizure-inducing stimulus, reflected by increasing seizure severity during
kindling course. Therefore, a true anti-epileptogenic effect in terms of preventive
activity against epileptogenesis-promoting consequences of seizures is difficult to be
separated from a merely anticonvulsant action of a test compound (or a mixture of
both). We aimed to account for this obstacle by choosing a treatment time point of one
minute after each stimulation, hereby minimizing a direct anticonvulsant action of 2-
DG as far as possible. To our knowledge, pharmacokinetic data for mice are not
available in the literature, but pharmacokinetics of 2-DG have been studied in humans
and rats. In humans, chronic oral 2-DG treatment did result in an elimination half-life
of about 5 h and was not associated with accumulation (Gounder et al., 2012, Raez et
al., 2013). For rats, a biphasic decrease of 2-DG blood concentration after intravenous
injection is described (first half-life 0.7 h, second half-life 2.9 h) (Umegae et al., 1990).
5 Manuskripte
71
Assuming a similar pharmacokinetic profile of 2-DG in mice and considering a reported
peak of 2-DG’s anticonvulsant action against 6 Hz seizures in mice at 1 h post
administration (Stafstrom et al., 2009), it seems unlikely that 2-DG should still exert a
distinct direct anticonvulsant effect on the next stimulation, which was applied at least
6 h later.
The starting point in seizure severity was higher in the present study compared to
findings of Leclercq et al. (2014) (mean seizure score of 2.56 vs. 1.8, present study vs.
study by Leclercq et al.). It has been described before, that seizure susceptibility can
depend on rodent strain (Ferraro et al., 1995, Borges et al., 2003), but can even be
influenced by intrastrain differences (Bankstahl et al., 2012, Brandt et al., 2016, Müller
et al., 2009). Taking into account that we used male NMRI mice from Charles River
Germany and not France like Leclercq and colleagues, such a substrain difference
could explain this slightly deviating finding.
Importantly, we show that the disease-modifying effect of 2-DG was not associated
with any obvious side effects, but confirm tolerability of chronic 2-DG treatment, as
shown before in rats and in a dose escalation study in human patients (Singh et al.,
2005, Ockuly et al., 2012), also in mice. At the chosen 2-DG dosage (250 mg/kg twice
daily), we did neither observe behavioral abnormalities nor other obvious systemic side
effects during daily handling and observation of mice. Monitoring of bodyweight in two
additional groups of unstimulated vehicle- or 2-DG-treated mice (n=8 per group, 250
mg/kg 2-DG twice daily over 21 days) showed a comparable slight increase in
bodyweight over time in both groups. Body weight of 2-DG-treated mice was higher on
days 15 to 17 of treatment compared to baseline and to vehicle-treated mice (p<0.05,
not shown).
Effects of kindling and 2-DG treatment on cerebral glucometabolism
To our knowledge, this is the first study investigating whether kindling-mediated
epileptogenesis in mice is associated with cerebral glucometabolic alterations.
[18F]FDG PET represents a reliable and translational in vivo method to examine brain
glucose metabolism (Goffin et al., 2008, O'Brien and Jupp, 2009). According to an
increasingly accepted concept, energy supply for neurons in the healthy brain is mainly
5 Manuskripte
72
provided by astroglia (Magistretti and Allaman, 2015). Glucose is taken up via GLUT1
expressed in astroglial endfeet covering the blood-brain barrier (BBB), and energy is
then transferred to neurons in the form of lactate by the so-called astrocyte-neuron-
lactate-shuttle (Magistretti, 2006, Pellerin and Magistretti, 2012). In the brain
undergoing epileptogenesis, increased energy demand of neurons for synaptic
transmission might lead to astroglial activation. Astroglial activation might play a crucial
role during epileptogenesis, e.g. as a consequence of extravasated albumin
(Weissberg et al., 2015) or resulting from genetically-mediated induction (Robel et al.,
2015). Indeed, we here also discovered astroglial activation in several limbic brain
regions (Figure 6), which is in agreement with recent findings in the 50 Hz corneal
kindling model (Loewen et al., 2016).
Unexpectedly, however, we found that kindling alone did not influence [18F]FDG
turnover (Fig. 2, 3, and 4), neither during nor at the end of epileptogenesis, which
corresponds to results of a [14C]2-DG autoradiography study in a rat rapid kindling
model (Lothman et al., 1985). One explanation for not finding glucose
hypermetabolism during kindling progression could be that we performed PET
interictally. This was done to rule out detecting increased [18F]FDG uptake as a mere
result of convulsions itself (Blackwood et al., 1981) instead of imaging energy-
demanding processes associated with epileptogenesis itself. In the interictal phase
during epileptogenesis in the 6 Hz kindling model, however, astroglial (and neuronal)
activation state might not be pronounced enough to be detected by FDG PET.
In patients with temporal lobe epilepsy as well as in rodent models of chronic epilepsy,
a glucose hypometabolism is typically observed (Kim et al., 2003, Jupp et al., 2012,
Zhang et al., 2015), which might partially be attributable to neuronal loss occurring in
conjunction with hippocampal sclerosis or a general reduction in neuronal activity due
to epilepsy-associated functional impairment (Guo et al., 2009). However, we here
report for the first time that 6 Hz corneal kindling is not associated with degenerating
neurons in kindled mice, which is in line with data from the 50 Hz corneal kindling
model (Loewen et al., 2016) and with data from amygdala and audiogenic kindling
models, in which neuronal loss is not observed or present only to a minor degree
(Khurg
5 Manuskripte
73
el et al., 1995, Osawa et al., 2001, Romcy-Pereira and Garcia-Cairasco, 2003). This
lack of distinct neurodegeneration might explain why no hypometabolism was detected
in fully- kindled mice. Supporting this idea, a recently published study using
pentylentetrazole-mediated kindling in rats, which is accompanied by
neurodegeneration indeed (Pavlova et al., 2006, Park et al., 2006, Fang and Lei, 2010),
found reduced [18F]FDG uptake in the hippocampus being predictive for positive
kindling response (Bascunana et al., 2016).
To the best of our knowledge, impact of chronic 2-DG treatment on cerebral
glucometabolism has not been evaluated in vivo before. Chronic 2-DG treatment led
to reduction of [18F]FDG uptake in brain tissue (day 17 of treatment, Fig. 2), whereas
cerebral glucose turnover (influx rate constant Ki, Figure 3, and metabolic rate MRGlu,
Figure 4) was concurrently raised globally in the brain (apart from amygdala).
Maximum Ki and MRGlu values were reached only on day 17, suggesting that prolonged
2-DG treatment is necessary to evolve its complete effectiveness.
Interestingly, kindling seemed to enhance the effects of 2-DG on glucose influx,
especially during kindling progression (day 10; Figure 3). As neuronal firing due to
seizing leads to a higher energy demand, glucose uptake, but also uptake of [18F]FDG
and 2-DG, is expected to increase. This combination effect was still present when part
of the 2-DG-treated mice were already fully kindled (day 17). A combined effect of 2-
DG and kindling was also reflected by an increase of MRGlu at day 17 in hippocampus
and thalamus, i.e. in brain regions relevant for seizure origin and spread, whose
neurons might be especially energy demanding due to seizure responses of increasing
severity during the kindling course.
Effects of kindling and 2-DG treatment on constituents of the neurovascular unit and
blood glucose
We wondered whether the altered glucose turnover could be explained by an altered
expression of GLUT1 transporters, being responsible for glucose uptake by astrocytes
across the BBB. Expression of glucose transporters can be influenced by blood
glucose levels. Changes concerning the 55-kDa GLUT1 due to chronic hypoglycemia
have been described before (Simpson et al., 1999), whereas chronic hyperglycemia
5 Manuskripte
74
had no impact (Simpson et al., 1999). In our study, 2-DG led to reduced blood glucose
values at day 17 of treatment in unstimulated mice and already at day 10 in mice
undergoing kindling, suggesting that seizure activity might enhance the reduction in
blood glucose levels. Other studies with chronic 2-DG supplementation via daily diet
also detected a chronic decrease of blood glucose levels using higher dosages of 2-
DG than we did (Minor et al., 2010, Yao et al., 2011). However, the
immunohistochemical staining did not reveal any influence of kindling or 2-DG
treatment on GLUT1 expression. As the used antibody binds GLUT1 transporters at a
C-terminal epitope, different glycosylation patterns should not hamper the detection of
the different GLUT1 types (45-kDa GLUT1 and 55-kDa GLUT1) (Choeiri et al., 2002).
Apart from changes in GLUT1 expression, cerebral glucose uptake might also be
influenced by altered transporter activity. In this regard, pentylenetetrazole-induced
seizures resulted in an upregulation of BBB glucose transporter activity within three
minutes as determined by an increased Vmax and glucose permeability (Cornford et al.,
2000). A higher intrinsic activity of GLUT1 transporters seems to be the underlying
factor. A similar induction of GLUT1 activity by 6 Hz induced seizures seems possible,
but might be only of short duration and therefore not be detectable with interictal
[18F]FDG PET. Nevertheless, it might have partially contributed to the increased
glucose influx and metabolism observed in 2-DG-treated mice undergoing kindling.
According to our results, a higher glucose uptake seems only to occur as a combined
effect of 2-DG and kindling, whereas 2-DG per se reduces [18F]FDG uptake, but
nevertheless leads to increased glucose influx. 2-DG itself was shown to increase
blood flow in a variety of brain regions within 30 minutes after intravenous
administration (Breier et al., 1993, Horinaka et al., 1997). In addition, electrical
stimulation per se temporary increases cerebral microcirculation (Leniger-Follert and
Lubbers, 1976). It therefore seems plausible that increased blood flow contributed to
the increase in glucose uptake and turnover observed in 2-DG-treated mice
undergoing kindling.
As the Fluoro-Jade- C staining did not reveal dying neurons, positive effects of 2-DG
on corneal kindling progress cannot be attributed to a possible neuroprotective action.
Rather, 2-DG treatment partially alleviated astroglial activation as seen in the
5 Manuskripte
75
hippocampal CA3 region and the piriform cortex. Stimulation of IL-ß production by
induced astrocytes is described to be associated with kindling epileptogenesis
(Ravizza et al., 2008). An indirect mitigation of the IL-ß system therefore might be a
possible mechanism of 2-DG effects on kindling progression.
IBA1 staining did not reveal microglial activation induced by kindling higher than in
brain slices of naïve control mice (Figure 5), which is in line with data from 50-Hz-
kindled mice (Loewen et al., 2016). IBA1 is a protein specifically expressed in
monocytic cell lines (Imai et al., 1996) and increased in activated
macrophages/microglia where it is necessary for membrane ruffles in order to change
cell shape (Ito et al., 1998). Surprisingly, however, we found that 2-DG led to microglial
activation both in mice undergoing kindling and in unstimulated mice. Cumulating
evidence suggests that microglial activation plays a crucial role in epileptogenesis
(Vezzani, 2015, Amhaoul et al., 2015, Brackhan et al., 2016). However, different
activation states of microglia can be distinguished, which are often referred to as pro-
inflammatory (M1) and anti-inflammatory (M2) microglia. While microglia of the M1
activation state is more likely to negatively contribute to the epileptogenic process, e.g.
by producing pro-inflammatory cytokines, microglia of the M2 activation state might
exert beneficial or neuroprotective effects, e.g. by expressing anti-inflammatory
cytokines (Boche et al., 2013, Colton, 2009). It has been shown that both phenotypes
are subject to alterations during epileptogenesis in mice (Benson et al., 2015).
Immunostaining with IBA1 is not suitable for differentiation of the M1 and M2 state.
Therefore, it remains to be elucidated in future investigations whether 2-DG might
preferentially induce the reparative anti-inflammatory M2 phenotype and whether this
might contribute to the disease-modifying effects of 2-DG found in the present study.
Conclusion
Taken together, we show that chronic 2-DG treatment in mice is well tolerated and
exerts true disease-modifying effects in a kindling model of difficult-to-treat seizures.
As revealed by [18F]FDG PET, 2-DG leads to increased glucose supply in the mouse
brain undergoing kindling-mediated epileptogenesis. Further, both the alleviation of
astroglial activation and the unexpected activation of microglia by 2-DG might
5 Manuskripte
76
contribute to its positive interference with epileptogenesis. While [18F]FDG PET does
not seem to be a promising marker for active epileptogenic processes during 6 Hz
corneal kindling, it facilitates specific insight into the drug-disease interaction in
combination with 2-DG treatment.
Abbreviations
2-DG: 2-deoxy-D-glucose; 3D-OSEM: three-dimensional ordered subset expectation
maximization; [18F]FDG: 2-Deoxy-2-[18F]fluoroglucose; GFAP: glial fibrillary acidic
protein; GLUT1: glucose transporter 1; IBA1: ionized calcium-binding adapter molecule
1; ID: injected dose; IDIF: image-derived input function; Ki: net influx rate; LC: lumped
constant; MAP algorithm: maximum a posteriori algorithm; MRGlu: glucose metabolic
rate; MRI: magnetic resonance imaging; PET: positron emission tomography.
Acknowledgements
This study was funded by the European Union Seventh’s Framework Programme
(FP7/2007-2013) under grant agreement n°602102 (EPITARGET). Ina Leiter was
supported by a scholarship from the Konrad-Adenauer-Stiftung e.V.. We are grateful
to Silvia Eilert, Petra Felsch, Alexander Kanwischer, Dr Tobias Ross, Simone Mehler,
Michael Weißing, Nathalie Hildebrandt, and Annika Thomer for excellent technical
assistance. Dr. Wolfgang Härtig is kindly acknowledged for help with
immunohistochemical staining. We thank Dr. Helge Frieling for providing the stimulator
used for corneal kindling.
Competing Interests
The authors have declared that no competing interest exists.
5 Manuskripte
77
Figures
Figure 1: Effects of 2-DG (2-deoxy-D-glucose) treatment on corneal kindling
(A) Heat map (purple to red) indicating seizure responses to each stimulation in mice treated with vehicle
(left, n=18) or 2-DG (right, n=18) one minute after each stimulation. (B) Seizure responses of vehicle-
and 2-DG-treated mice over the kindling course of 21 days. (C) Percentage of overall shown type-5
seizures in vehicle- and 2-DG-treated mice. (D) Number of stimulations needed to achieve a fully kindled
state, defined as at least 8 of 10 consecutive type 5 seizures, in vehicle- and 2-DG-treated mice. Mean
± SEM; Kruskal-Wallis ANOVA, Dunn’s multiple comparison post hoc test (B), Student’s t-test (C, D);
p<0.05. Asterisk indicates significant difference between treatment groups.
5 Manuskripte
78
Figure 2: [18F]FDG uptake
2-deoxy-D-glucose (2-DG)-treated, unstimulated mice (2-DG w/o kindling, n=12), vehicle-treated mice
undergoing kindling (vehicle+kindling, n=18), and 2-DG- treated mice undergoing kindling (2-
DG+kindling, n=18) were subjected to [18F]FDG PET at baseline (Bl; after first treatment, before start of
kindling) and at days 10 and 17 of kindling. Regional [18F]FDG uptake in (A) hippocampus, (B) thalamus,
(D) cortex, (E) striatum and (F) cerebellum, was quantified as percent injected dose per cubic centimeter
(%ID/cc). Mean ± SEM; one-way ANOVA, Bonferroni post hoc test; p<0.05. Asterisk indicates significant
difference between indicated pairs; diamond indicates significant difference to baseline. For details
about treatment groups and group sizes see legend of Figure 1.
5 Manuskripte
79
Figure 3: Ki values of the [18F]FDG-2-compartment model
Regional Ki in (A) hippocampus, (B) thalamus, (D) cortex, (E) striatum und (F) cerebellum are shown.
The input function for the 2-compartment model was calculated directly from the image data of the three
PET scan timepoints by positioning a volume of interest in the caudal vena cava. Mean ± SEM; one-
way ANOVA, Bonferroni post hoc, Bonferroni post hoc test; p<0.05. Asterisk indicates significant
difference between indicated pairs; diamond indicates significant difference to baseline. For details
about treatment groups and group sizes see legend of Figure 1.
5 Manuskripte
80
Figure 4: MRGlu values of the [18F]FDG-2-compartment model
Regional MRGlu values in (A) hippocampus, (B) thalamus, (D) cortex, (E) striatum and (F) cerebellum
are shown. The input function for the 2-compartment model was calculated directly from the image data
of the three PET scan timepoints by positioning a volume of interest in the caudal vena cava. Mean ±
SEM; one-way ANOVA, Bonferroni post hoc, Bonferroni post hoc test; p<0.05. Asterisk indicates
significant difference between indicated pairs; diamond indicates significant difference to baseline. For
details about treatment groups and group sizes see legend of Figure 1.
5 Manuskripte
81
Figure 5: Results of the IBA1 immunostaining
(A) Representative images of the right hippocampal area showing IBA1-positive microglia of each
experimental group at day 22 after start of experiment. (B) Data of semi-quantitative assessment of
microglial activation in hippocampal subregions, thalamus, amygdala and piriform cortex. Naïve,
untreated and unstimulated control group, n=6; 2-DG w/o kindling, 2-deoxy-D-glucose-treated,
unstimulated mice, n=6; vehicle+kindling, vehicle-treated mice undergoing kindling, n=6; 2-DG+kindling,
2-DG- treated mice undergoing kindling, n=6; CA, cornu ammonis. Mean ± SEM; Kruskal-Wallis
ANOVA, Dunn’s multiple comparison post hoc test; p<0.05. Asterisk indicates significant difference to
baseline. Bar in (A) indicates 50 µm and 10 µm (magnified detail), respectively.
5 Manuskripte
82
Figure 6: Results of the GFAP immunostaining
(A) Representative images of the right hippocampal area showing GFAP-positive astroglia of each
experimental group at day 22 after start of experiment. (B) Data of semi-quantitative assessment of
astroglial activation in hippocampal subregions, thalamus, amygdala and piriform cortex. Mean ± SEM;
Kruskal-Wallis ANOVA, Dunn’s multiple comparison post hoc test; p<0.05. Asterisk indicates significant
difference to baseline. Bar in (A) indicates 50 µm and 10 µm (magnified detail), respectively. For details
about treatment groups and abbreviations see legend of Figure 5.
5 Manuskripte
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5 Manuskripte
91
5.2 Blood-brain barrier leakage during early epileptogenesis is associated with
rapid remodeling of the neurovascular unit
Marion Bankstahl1*, Heike Breuer1,2, Ina Leiter1,2, Martin Märkel3, Pablo Bascuñana2,
Dominik Michalski4, Frank M. Bengel2, Wolfgang Löscher1, Martin Meier5, Jens P.
Bankstahl2#, Wolfgang Härtig3#
1 Department of Pharmacology, Toxicology and Pharmacy, University of Veterinary
Medicine Hannover and Center for Systems Neuroscience, Bünteweg 17, 30559
Hannover, Germany
2 Department of Nuclear Medicine, Hannover Medical School, 30625 Hannover,
Germany
3 Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Liebigstr. 19,
04103 Leipzig, Germany
4 Department of Neurology, University of Leipzig, Liebigstr. 20, 04103 Leipzig,
Germany
5 Preclinical Imaging Labs, Central Laboratory Animal Facility & Institute for
Laboratory Animal Science, Hannover Medical School, 30625 Hannover, Germany
*Corresponding author: Marion Bankstahl, University of Veterinary Medicine
Hannover, Department of Pharmacology, Toxicology and Pharmacy, Bünteweg 17,
D-30559 Hannover, Germany, Tel: +49-511-9538729, Fax: +49-511-9538581, E-
mail: [email protected]
#These authors contributed equally to this study.
Abstract
Increased permeability of the blood-brain barrier (BBB) following cerebral injury results
in regional extravasation of plasma proteins and can critically contribute to the
pathogenesis of epilepsy. Here, we comprehensively explored the spatiotemporal
evolution of a main extravasation component, albumin, and illuminate associated
responses of the neurovascular unit (NVU) contributing to early epileptogenic
5 Manuskripte
92
neuropathology. Applying translational in vivo MR imaging and complementary
immunohistochemical analyses in the widely used rat pilocarpine-post status
epilepticus (SE) model, we demonstrate rapid BBB leakage affecting major
epileptogenesis-associated brain regions, peaking between 1 and 2 days post SE, and
rapidly declining thereafter, accompanied by cerebral edema generally following the
same time course. At peak of BBB leakage, albumin colocalized with NVU
constituents, like vascular components, neurons and brain immune cells. Surprisingly,
astroglial markers did not colocalize with albumin and aquaporin-4 was clearly reduced
in areas of leaky BBB, indicating a severe disturbance of astrocyte-mediated
endothelial-neuronal coupling. In addition, a distinct adaptive reorganization process
of the NVU vasculature apparently takes place at sites of albumin presence,
substantiated by reduced immunoreactivity of endothelial and changes in vascular
basement membrane markers. Taken together, degenerative events at the level of the
NVU, affecting vessels, astrocytes and neurons, seem to outweigh reconstructive
processes. Considering the rapidly occurring BBB leakage and subsequent substantial
degenerative events at the NVU level, our data support the necessity of a prompt BBB-
restoring treatment as one component of rational therapeutic intervention to prevent
epileptogenesis and the development of other detrimental sequelae of SE.
Significance statement
Blood-brain barrier (BBB) leakage is critically involved in brain insult-mediated epilepsy
development. Here, we demonstrate rapid but transient BBB damage within hours after
experimental status epilepticus (SE), an epileptogenic insult, and subsequent
degenerative events at the level of the so called neurovascular unit (NVU), which
reflects the anatomical and functional interplay between brain vasculature, glial cells
and neurons. Analysis at tissue level revealed degeneration of various NVU
components, which seem to outweigh reconstructive processes, thus providing
potential targets for protective pharmacotherapy. The findings emphasize the
requirement and expedience of rapid BBB-stabilizing treatment as a primary element
of epilepsy-preventive therapeutic intervention.
5 Manuskripte
93
Introduction
Different kinds of cerebral injury, like head trauma, stroke, cerebral infection, or status
epilepticus (SE) may lead to the development of epilepsy in a certain proportion of
affected patients (Pitkänen and Immonen, 2014, Schmidt and Sillanpää, 2016). The
mechanisms subjacent to the process of epileptogenesis following brain insults,
though, are not well understood. One common characteristic of epileptogenic brain
insults is an impairment of the blood-brain barrier (BBB). A leakage of the BBB results
in extravasation of albumin and subsequent activation of glia and inflammatory
responses and is considered as one likely key factor triggering epileptogenesis
(Marcon et al., 2009, van Vliet et al., 2007, Seiffert et al., 2004, Ivens et al., 2007).
Albumin extravasation into the brain, eventually resulting in recurrent electrographic
seizures (Weissberg et al., 2015, Bar-Klein et al., 2014), is observed in various post-
SE models of epileptogenesis (Breuer et al., 2016, Michalak et al., 2013, van Vliet et
al., 2007). Importantly, increased BBB permeability is currently under investigation as
potential prognostic biomarker for stratifying individuals at risk to develop epilepsy
following epileptogenic brain insults (Pitkänen et al., 2016, Walker et al., 2016) and as
treatment target for attenuation or prevention of epileptogenesis by applying drugs
stabilizing or restoring BBB function during the latency phase preceding appearance
of the first clinical seizure (van Vliet et al., 2016, Janigro, 2012, Friedman and
Heinemann, 2012). For both objectives, it is crucial to reveal the in vivo spatiotemporal
pattern of BBB leakage following cerebral injury. Furthermore, elucidating its cellular
and parenchymal distribution pattern of extravasated albumin and associated changes
in the neurovascular unit (NVU) will be beneficial for better understanding of
pathological cascades finally leading to chronic seizure generation.
Therefore, we here i) present detailed data on the in vivo spatiotemporal pattern of
BBB leakage during epileptogenesis in the lithium-pilocarpine-post-SE model of
epileptogenesis in rats assessed by contrast-enhanced MR imaging for which we
recently published a methodological paper identifying the most suitable translational
imaging approach (Breuer et al., 2016), ii) determined the cellular uptake and
extracellular distribution pattern of fluorescein-linked albumin, and iii) applied multiple
fluorescence staining to identify colocalization of extravasated albumin with various
5 Manuskripte
94
histochemical markers for cellular and acellular constituents of the extended NVU, i.e.
BBB endothelium, the vascular basement membranes, the glia-endothelial interface,
astrocytes, microglia, and neurons.
Material and Methods
Animals
Adult female Sprague Dawley rats (200-220 g, n = 60) were obtained from Harlan
Laboratories. They were housed in pairs under controlled climate conditions (22±1°C,
humidity 45-55%) in individually ventilated cages under a 14/10 h light-dark cycle (rats
used for imaging experiments), or in groups of 5 in open cages (22±1°C, humidity 45-
55%) under a 12/12 h light-dark cycle (rats used for immunohistochemistry). Standard
diet (Altromin 1324; Altromin, Lage, Germany) and water were accessible ad libitum.
After delivery, animals were allowed to adapt to the new conditions, were repetitively
handled for at least one week before being subjected to experiments, and randomized
to experimental groups. Experiments were conducted in accordance with European
Communities Council Directives 86/609/EEC and 2010/63/EU and were formally
approved by the responsible local authority. Experiments were reported according to
ARRIVE (Animal Research: Reporting in Vivo Experiments) guidelines.
Chemicals, drugs, and antibodies
Isoflurane (Isofluran Baxter) was obtained from Baxter (Unterschleißheim, Germany)
and CP-Pharma (Burgdorf, Germany), diazepam as commercial solution (Faustan or
Diazepam-ratiopharm) from Temmler Pharma GmbH (Marburg, Germany) or
Ratiopharm (Ulm, Germany), respectively, and glucose electrolyte solution
(Sterofundin HEG-5) from B. Braun (Melsungen, Germany). Gadolinium-DTPA (Gd-
DTPA, Magnevist 0.5 mmol/ml) was purchased from Bayer HealthCare (Leverkusen,
Germany). All immunoreagents were obtained from Dianova (Hamburg, Germany) as
supplier for Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA). Unless stated
otherwise, all further chemicals were of analytic grade and purchased from Sigma-
Aldrich (Schnelldorf, Germany).
5 Manuskripte
95
Induction of status epilepticus
SE was induced in rats (n=42) as described elsewhere (Bankstahl et al., 2012). Shortly,
14–16 h after the administration of lithium chloride (127 mg/kg in 3 ml/kg 0.9% saline,
p.o.) and 30 min after methyl scopolamine (1 mg/kg in 2 ml/kg 0.9% saline, i.p.),
injection of pilocarpine (10 mg/kg, repeated up to 5 times, in 1 ml/kg 0.9% saline, i.p.)
was repeated until SE, which was characterized by the onset of repetitive generalized
convulsive seizures (stage 4 or 5) without intermediate recovery of normal behavior.
SE was interrupted after 90 min by administration of diazepam (10 mg/kg in 2 ml/kg,
i.p.). Diazepam injection was repeated after 15 min (10 mg/kg), and, if needed, after
30 min using half of the first dose (5 mg/kg). Self-sustaining SE successfully
established in 90.5% of animals, which required an average pilocarpine dose of 35.4
± 9.6 mg/kg (mean ± SD). Three rats in which SE could not be induced served as
additional control group for albumin extravasation. The overall mortality rate was zero.
Age-matched control rats (n = 10) for histological analysis were treated identically but
received saline instead of pilocarpine. After SE, rats were hand-fed with mashed
laboratory chow and received injections of glucose-electrolyte solution until they
resumed normal feeding behavior.
Magnetic resonance imaging
Rats were scanned before (baseline, n = 13) and 48 h (n = 5), 4 days (n = 6), and 10
days (n = 5) following SE. MRI was conducted as described recently (Breuer et al.,
2016) on a 7 T (300 MHz) small animal MRI system (Bruker Pharmascan) using
ParaVision 5.1 acquisition software (Bruker, Ettlingen, Germany). Rats were
anesthetized with isoflurane and a catheter was placed in a lateral tail vein for contrast
agent infusion. Following transfer of rats into the imaging chamber, which was
constantly kept at 37°C, the rat maxilla was placed in a tooth bar for comparable
positioning. The receive coil was placed at a defined position over the rat head.
Breathing rate of rats during image acquisition was kept at 40 to 60 breaths/min. T2-
weighted 2D multi slice multi echo images (MSME; repetition time=2500 ms, echo
time=11 ms, 96 slices of 0.8 mm, 256x256 matrix, 35x35x25.6 mm3 field of view) were
acquired for detection of brain edema. T1-weighted images were acquired using a 3D
5 Manuskripte
96
modified driven equilibrium Fourier transform method (MDEFT; 0.8 mm slice thickness,
256x256x32 matrix, 35x35x25.6 mm3 field of view) before and 30 min after start of
contrast agent infusion. The resulting voxel size was 0.136x0.136x0.8 mm3. Gd-DTPA
was intravenously infused via a syringe pump (PHD Ultra, Harvard Apparatus, South
Natick, MA, USA) utilizing a 20 min step-down infusion schedule as described recently
(Breuer et al., 2016).
Image analysis
MRI data were co-registered to a rat brain atlas published by Schwarz et al. (2006)
using PMOD software (PMOD Technologies Ltd., Zurich, Switzerland), and data from
six brain regions (hippocampus, thalamus, amygdala, piriform cortex, entorhinal
cortex, and cerebellum) were extracted. T1- and T2 signals were normalized to pons,
for which no alterations in contrast agent uptake or T2 MRI signal was observed after
SE (Breuer et al., 2016). Voxelwise comparison to baseline (two-sample unpaired t-
test, significance level threshold: 0.001, minimum cluster size: 100 voxels) led to Gd-
DTPA leakage t-maps using MATLAB software (MathWorks, Natick, MA, USA) and
SPM12 (UCL, London, UK) as described earlier (Breuer et al., 2016).
FITC-albumin infusion and brain slicing
For histological analysis of albumin extravasation, rats were infused with 100 mg/kg
bovine albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-albumin) diluted in 10
ml/kg 0.1 M phosphate buffered saline (PBS) at a rate of 1 ml/min under short
isoflurane anesthesia without prior SE (control, n = 10), and 5 h (n = 6), 24 h (n = 5),
or 48 h following SE (n = 16). Two hours later, rats were perfused with 125 ml 0.01 M
PBS followed by 250 ml of 4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS at a flow rate of 16.6
ml/min. Following removal, brains were kept for 24 h in 4% phosphate-buffered
paraformaldehyde for post-fixation and were then stored in 30% sucrose in 0.1 M PBS
with 0.2% sodium azide at 4°C until sectioning. Coronal sectioning of the forebrain of
each rat was performed using a freezing microtome (Frigomobil 1205; Jung,
Heidelberg, Germany) and a slice thickness of 30 µm. For analysis of FITC-albumin
extravasation patterns, series comprising each 10th coronal serial section from the
5 Manuskripte
97
forebrains of all rats were washed 3 times with TBS for at least 10 min, briefly rinsed
with distilled water, mounted onto fluorescence-free slides (Menzel, Braunschweig,
Germany), air-dried and cover-slipped with Entellan (Merck, Darmstadt, Germany).
Semi-quantitative analysis of extra- and intracellular FITC-albumin
The extent of extracellular and cellular FITC-albumin uptake was scored blinded to
experimental groups. Whole brain slice images were acquired using an all-in-one
fluorescence microscope (Biorevo, BZ-9000E, Keyence). Four coronal brain sections
were analyzed per animal (-0.36 mm, -1.56 mm, -3.72 mm and -4.9 mm relative to
bregma) (Paxinos and Watson, 2007). Target regions were hippocampus, thalamus,
amygdala, piriform cortex, entorhinal cortex, and caudate putamen. Scoring was
performed separately for cellular and extracellular FITC-albumin occurrence: (1)
cellular FITC-albumin uptake: score 0, no cellular uptake, score 1, sporadic cellular
uptake, score 2, medium amount of labeled cells, brain region is only affected in parts,
score 3, high amount of labeled cells, brain region is globally affected; (2) extracellular
FITC-albumin uptake: score 0, no extracellular FITC-albumin, score 1, minimal
extracellular uptake, often near to blood vessels, score 2, medium extracellular FITC-
albumin accumulation, rather focal, score 3, high-grade extracellular FITC-albumin
accumulation, rather global. Target regions were scored in both hemispheres and
means of left and right and of the four section levels were calculated.
Quantification of albumin extravasation following conversion into a light
microscopically visible adduct
The immunohistochemical conversion of the FITC-albumin signal into a light
microscopically visible adduct based on an anti-fluorescein-horseradish peroxidase
(HRP) conjugate (Dianova) and nickel-enhanced diaminobenzidine (DAB-Ni) as
chromogen for the marker enzyme. For this conversion, serial sections were
extensively rinsed with TBS followed by abolishing of endogenous peroxidase activity
within the tissue by treatment with 0.6% hydrogen peroxide in TBS for 30 min. After 3
further rinses with TBS for 10 min each, non-specific binding sites for the
immunoreagent were blocked with TBS containing 2% bovine serum albumin and 0.3%
5 Manuskripte
98
Triton X-100 (TBS-BSA-T) for 30 min. Subsequently, all sections were incubated with
anti-fluorescein-HRP (1:2000 in TBS-BSA-T) for 2 h. Next, the sections were rinsed
twice with TBS and once with 0.05 M Tris buffer, pH 8, for 10 min each. The sections
were then stained by reacting for 4 min with a DAB-Ni solution (containing 40 mg nickel
ammonium sulfate, 2 mg DAB tetrahydrochloride and 5 µl of hydrogen peroxide (30%)
in 10 ml of 0.05 M Tris buffer, pH 8).
For quantification of FITC-albumin extravasation, images of whole brain sections were
acquired at -0.36 mm, -1.56 mm, -3.72 mm, and -4.90 mm relative to bregma by a
Keyence microscope and analyzed with an image quantification software (Volocity
4.3.2, PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Stained areas were calculated by the total
number of pixels in the stained area relative to the total area of the respective brain
section as described recently (Michalski et al., 2010).
Multiple fluorescence staining
Furthermore, selected FITC-albumin-pre-labeled sections were applied to double
fluorescence staining. For this purpose, the sections were extensively rinsed with TBS
prior to blocking of unspecific binding sites with TBS containing 5% normal donkey
serum and 0.3% Triton X-100 (TBS-NDS-T). The sections were then applied to
mixtures of antibodies or of antibodies and lectins as listed in Table 1. Thereby, all
markers were diluted in TBS-NDS-T, and in general the incubation time was 20 h at
room temperature. Three rinses with TBS for 10 min each were followed by incubation
with cocktails of carbocyanine (Cy)3- and Cy5-conjugated immunoreagents, which
were used at 20 µg/ml TBS-BSA for 1 h. The omission of primary antibodies and lectins
in histological control experiments resulted in the expected absence of any cellular
fluorescence labeling. Pictures at lower magnifications for Fig. 2 B and D were
acquired with a Keyence microscope BZ 9000, all other pictures with a confocal laser
scanning microscope LSM 510 Meta from Zeiss (Göttingen, Germany).
Assessment of neurodegeneration
Assessment of neurodegeneration was performed in Nissl-stained coronal brain
sections in a blinded fashion with respect to the time point following SE. First, severity
5 Manuskripte
99
of neuronal damage was semi-quantitatively assessed by a grading system as
previously described (Bankstahl et al., 2012): score 0, no obvious damage; score 1,
slightly abnormal appearance of the structure without clear evidence of visible neuronal
loss; score 2, lesions involving 20–50% of neurons; score 3, lesions involving >50% of
neurons. Scoring was performed in hippocampal subregions (CA1, CA3a), amygdala,
and piriform and entorhinal cortex in four sections per rat (−2.4 mm, −3.36 mm, -4.68
mm, and −5.64 mm relative to bregma according to Paxinos and Watson, 2007).
Averaged scores from these sections of both hemispheres in each rat were used for
calculation of group data. Second, the amount of polymorph neurons in the dentate
hilus was quantified as described earlier (Polascheck et al., 2010) using AxioVision
software (Zeiss). The dentate hilus was defined as the inner border of the granule cell
layer and two straight lines connecting the tips of the granule cell layer and the proximal
end of the CA3c region. Only cells of neuronal morphology and a diameter larger than
8 μm were counted. Per rat, three sections (at −2.4 mm, −3.36 mm, and −4.68 mm
relative to bregma) were analyzed and number of neurons were averaged from these
sections.
Statistical analysis
Statistical analyses were performed using Prism 7 software (GraphPad Software, La
Jolla, CA, USA). Depending on whether data were normally distributed or not, either
parametric or non-parametric tests were used for statistical evaluation. All rank or
score data were analyzed by non-parametric tests. MRI data and data resulting from
quantitative histological analysis were analyzed by one-way analysis of variance
(ANOVA), followed by Dunnett’s multiple-comparison test comparing baseline to each
time point after SE. Non-parametric data resulting from semi-quantitative analysis of
immunohistochemical staining were analyzed by Kruskal–Wallis ANOVA, followed by
Dunn’s post-hoc test comparing the control group with the SE groups at each time
point. All tests were used two-sided. If not stated otherwise, values of p < 0.05 were
considered statistically significant.
5 Manuskripte
100
Results
In vivo spatiotemporal pattern of blood-brain barrier leakage during early
epileptogenesis
To determine the time course of BBB impairment during epileptogenesis, rats were
scanned prior to and at 5 h, 48 h, 4 days, and 10 days post SE using recently published
contrast-enhanced T1-weighted as well as T2-weighted MRI sequences (Breuer et al.,
2016). Gd-DTPA extravasation, resulting in elevated T1 values and indicating BBB
leakage, was absent at baseline and at 5 h post SE in all investigated brain regions
(Fig. 1 A, B). Strongly increased T1 values vs. baseline were present 48 h post SE in
epileptogenesis-associated brain regions (p < 0.0001 for all brain regions), but not in
the cerebellum (Fig. 1 B). The maximal signal increase occurred in the amygdala with
a T1 intensity increase of 221%. At 4 and 10 days post SE, a much lower but still
significant Gd-DTPA leakage was only detected in the amygdala (day 4, p = 0.040),
piriform (day 4, p = 0.016, day 10, p = 0.0036) and entorhinal (day 10, p = 0.030)
cortex, proposing a recovery of BBB integrity in the other formerly affected brain
regions (Fig. 1 B). Elevated T2 values, indicative of brain edema, were present at 48 h
post SE in all investigated brain regions including cerebellum (p < 0.045 for all brain
regions) with the highest T2 value increase of 23% in the amygdala (Fig. 1 C, D). At 4
days post SE, T2 values were still increased in hippocampus (p = 0.035), thalamus (p
= 0.011), and entorhinal cortex (p = 0.021). Subsequently, edema further decreased
and no significantly changed T2 values were present at 10 days following SE (Fig. 1D).
Extent and spatiotemporal pattern of FITC-albumin extravasation following status
epilepticus evaluated by histological analyses
Histological analysis of DAB-converted FITC-albumin signals revealed distinct
extravasation in thalamic areas, amygdala, piriform and entorhinal cortices (Fig. 2A).
Quantification of stained area showed significantly elevated extravasation in thalamus
at 24 (p = 0.0017) and 48 h post SE (p = 0.0028), whereas in amygdala and
piriform/entorhinal cortex, significantly increased values were found at all investigated
time points (5 h, p = 0.038, 24 h, p = 0.0001, 48 h, p = 0.013; Fig. 2B). The
hippocampus was moderately affected only in individual animals, but signal
5 Manuskripte
101
quantification did not reach statistical significance on group level (data not shown).
Comparison of ex vivo extravasation pattern (Fig. 2A) with in vivo contrast-enhanced
MRI leakage map revealed a very comparable spatial distribution of albumin 48 h post
SE (Fig. 2C). Intra- and extracellular distribution of extravasated FITC-albumin differed
between individuals (Fig. 2D), but semiquantitative histological group analysis of native
FITC-albumin signal revealed extracellular FITC-albumin in thalamus (p = 0.025),
amygdala (p = 0.0019), piriform cortex (p = 0.034), entorhinal cortex (p = 0.014), and
caudate putamen (p = 0.0063) already at 5 h following SE (Fig. 2E). At 24 h post SE,
extracellular FITC-albumin reached its maximum in all analyzed brain regions (p ≤
0.0011), and declined again at 48 h post SE (Fig. 2E). At 5 h following SE, intracellular
FITC-albumin was observed only in amygdala (p = 0.0015) and entorhinal cortex (p =
0.045), whereas it was found in all analyzed brain regions (p ≤ 0.022) at 24 h following
SE (Fig. 2F). At 48 h following SE, it still reached significance in hippocampus (p =
0.0048), thalamus (p = 0.0017), and piriform cortex (p = 0.0006; Fig. 2F). In brain slices
of control rats, neither extra- nor intracellular FITC-albumin was observed.
Furthermore, we did not observe FITC-albumin leakage in pilocarpine-treated rats
without SE development (data not shown).
Time course and extent of neurodegeneration following status epilepticus
Semi-quantitative analysis of neurodegeneration in hippocampal and cortical
subregions as well as amygdala revealed neuronal loss already at 24 h following SE
in the amygdala (24 h, p = 0.018, 48 h, p = 0.0018) and the piriform and entorhinal
cortices (24 h, p = 0.0097; Fig. 2H). At 48 h after SE, also hippocampal pyramidal cells
of CA3c subregion reached statistical significance (p = 0.017; Fig. 2H). Moreover, the
number of hilar mossy cells and interneurons as assessed by cell counting was
significantly reduced at 48 h following SE (p = 0.026; Fig. 2G).
Colocalization of FITC-albumin with cellular or extracellular cerebral markers
Randomly selected sections from rats 24 h and 48 h after SE were applied to multiple
fluorescence labeling. FITC-albumin, counterstained with biotinylated anti-NeuN (Fig.
3A’), displayed only minor colocalization (Fig. 3A’’’), despite intracellular location of
5 Manuskripte
102
FITC-albumin in cells of obvious neuronal morphology (Figure 3A), exemplarily shown
for pyramidal cell layer of hippocampal CA1 region. In contrast to NeuN-positive
neurons, FITC-albumin-positive cells of neuronal morphology exhibited only limited
spatial overlap with endothelial basement membranes visualized by laminin
immunolabeling (Figure 3A’’). It was described before that neurons can lose NeuN
immunoreactivity despite preservation of nuclear membrane integrity after an ischemic
brain insult (Ünal-Cevik et al., 2004). Ünal-Cevik and colleagues suggest that this loss
of NeuN antigenicity might be caused by severe insult-induced metabolic perturbations
of neurons, or by depletion or alteration of the antigen. Therefore, the colocalization of
FITC-albumin with NeuN-negative cells of neuronal morphology, as described here,
indicates FITC-albumin uptake by damaged, but morphologically integer neurons. This
assumption is supported by findings from another group who found extravasated
albumin-bound Evans Blue after SE often in Fluoro-Jade B-positive, i.e. dying, neurons
(van Vliet et al., 2007).
Spatial relationships between FITC-albumin and vascular markers with GFAP-
expressing astroglia are shown in the hippocampal pyramidal cell layer at lower
magnification (Fig. 4A-A’’’) and higher magnified (Fig. 4B-B’’’). FITC-albumin was again
predominantly found in pyramidal cells, and to a lower extent in close vicinity to laminin-
positive vascular structures (Fig. 4A), which becomes more obvious in the merged
staining patterns (arrow in Fig. 4A’’’). In parallel, GFAP-immunopositive structures (Fig.
4A’’,B’’) appeared separated in the overlays of staining patterns, but with astrocytic
endfeet contacting endothelial cells stained with biotinylated STL (arrow in Fig. 4B’’’).
Thalamic FITC-albumin apparently within cells (Fig. 5A) was additionally
counterstained with anti-collagen IV in basal membranes (Fig. 5A’) and biotinylated
STL detecting endothelial cells (Fig. 5A’’). The even distribution of STL-stained vessels
contrasted with the local upregulation of collagen IV expression. The overlay of staining
patterns (Fig. 5A’’’) revealed that FITC-albumin-positive areas concomitantly displayed
up-regulated vascular collagen IV-immunoreactivity which was frequently allocated
with STL-binding sites also in thinned vessels.
Next, FITC-albumin and STL staining were combined with the immunolabeling of
aquaporin-4 known as marker for astrocytic endfeet. This triple staining is exemplarily
5 Manuskripte
103
shown in the thalamus at lower magnification (Fig. 6A-A’’’) and higher magnified (Fig.
6B-B’’’). SE-affected regions as indicated by intracellular FITC-albumin (Fig. 6A,B)
were largely devoid of immunosignals for AQP4 (asterisks in Fig. 6A’,B’) whereas
adjacent tissue within the affected areas displayed much higher levels of vessel-
associated AQP4. In parallel, STL staining in the affected regions was either
diminished (Fig. 6A’’, arrow) or appeared unaltered (Fig. 6B’’,B’’’).
To analyze the spatial relationships between astroglial markers as well as between
astrocytes and FITC-albumin deposition, the immunolabeling of AQP4 was combined
with the detection of GFAP (Fig. 7A-A’’’) or S100β (Fig. 7B-B’’’) in SE-affected thalamic
tissue containing FITC-albumin-filled cells. FITC-albumin (Fig. 7A) was observed in
regions lacking apparent AQP4-immunoreactivity (Fig. 7A’) and with weakened GFAP-
immunodecoration (Fig. 7A’’). Merged staining patterns (Fig. 7A’’’) indicated a nearly
complementary occurrence of FITC-albumin and AQP4 expression together with
remnants of mostly punctate GFAP immunoreactive structures. Subsequently, FITC-
albumin-positive areas (Fig. 7B) were counterstained with anti-S100β (Fig. 7B’) which
predominantly reveals astroglial somata with numerous processes, whereas the
immunodetection of GFAP with Cy5 (Fig. 7B’’, color-coded in blue) visualizes astrocytic
intermediate filaments. The merged staining patterns (Fig. 7B’’’) clearly demonstrated
numerous astrocytes co-expressing both astroglia-specific markers, but lacking
allocated FITC-albumin.
For the simultaneous detection of astroglia and microglia/ macrophages, FITC-albumin
was counterstained with GFAP and Iba which is exemplified for the thalamus (Fig. 8A-
A’’’). SE-induced leakage of the BBB again led to extravasation of FITC-albumin
followed by its internalization by neuron-like cells (Fig. 8A). Numerous Iba-
immunopositive amoeboid microglial cells were seen in the same tissue (Fig. 8A’) and
were intermingled by active, proliferating astrocytes (Fig. 8A’’). The overlay of staining
patterns (Fig. 8A’’’) only rarely indicated FITC-albumin-filled glial cells (Fig. 8A’’’). Cy3-
immunodetection of Iba (Fig. 8B’) was combined with the Cy5-staining of STL-binding
sites which were found in vessels as well as in amoeboid perivascular
microglia/macrophages (Fig. 8B’’). A majority of perivascular Iba-positive activated
microglia displayed in the overlay of staining patterns (Fig. 8B’’’) both lectin- and
5 Manuskripte
104
immunohistochemical labeling. FITC-albumin was occasionally also found in Iba-
positive microglia (arrowhead).
For specifying immune cells exemplified in the thalamus 48 h after SE, Iba was
counterstained either with anti-CD45c in activated microglia (Fig. 9A-A’’’) or with anti-
CD8b in T lymphocytes (Fig. 9B-B’’’). FITC-albumin-filled cells (Fig. 9A) were observed
in a clearly delineated zone with reduced Cy3-immunolabeling of CD45c (Fig. 9A’),
while Iba-immunoreactivity (Fig. 9A’’) was found in ameboid immune cells
accumulating close to FITC-albumin-positive cells. Merged staining patterns (Fig. 9A’’’)
elucidated several cells co-expressing both microglial markers (arrow in Fig. 9A’’’). At
higher magnification, FITC-albumin (Fig. 9B) was occasionally found in immune cells
expressing CD8b (Fig. 9B’) as well as Iba (Fig. 9B’’) which is exemplified in the overlay
(Fig. 9B’’’) by the arrow-marked cell.
In brain slices of control rats, neither extra- nor intracellular FITC-albumin was
observed. Further, none of the alterations in immunosignals or abnormal staining
patterns described above were seen in slices of control rats which underwent the
identical staining procedures (not shown).
Discussion
SE and prolonged febrile seizures represent clear risk factors for developing temporal
lobe epilepsy which is strongly supported by data from human and animal studies
(French et al., 1993, Mathern et al., 1995, Scott et al., 2003, Patterson et al., 2014),
and BBB leakage is proposed to represent a crucial event contributing to
epileptogenesis (Marchi et al., 2007a, Friedman et al., 2009). Purpose of this study
was to provide comprehensive data of the spatiotemporal evolution of SE-induced BBB
leakage in vivo by translational MR imaging and ex vivo by complementary
immunohistochemical analyses characterizing the response of NVU components to
the epileptogenic brain insult. Our data provide important information for therapeutic
intervention after epileptogenic brain insults and suggest that a very prompt BBB-
stabilizing intervention will be necessary to prevent distinct albumin extravasation and
subsequent pro-epileptogenic consequences following SE. The main findings are: (i)
SE-induced BBB leakage peaks between 1 and 2 days post SE affecting main
5 Manuskripte
105
epileptogenesis-associated brain regions, and rapidly declines thereafter; (ii) increase
in T2-weighted MRI mainly follows the time course of contrast agent extravasation; (iii)
at the time of maximum BBB leakage, extravasated albumin colocalizes with the
perivascular basement membranes, neurons, and brain immune cells, but not with
astrocytes; (iv) albumin-positive areas are characterized by reduced immunoreactivity
for astroglial markers (GFAP, AQP4), as well as endothelial STL-binding sites,
whereas collagen IV, a marker of perivascular basement membranes, is elevated.
Uncovering the time course of BBB leakage is of particular relevance for timing
therapeutic intervention during epileptogenesis. Although the temporal evolution of
increased BBB permeability was lately determined for another post-SE model of
epileptogenesis (van Vliet et al., 2016), respective data for the pilocarpine model,
which is often applied to examine therapeutic intervention during epileptogenesis
(Löscher, 2012), were not available so far. Here, we applied a translational MRI-based
imaging method, which we recently identified to be the method of choice for detection
and quantification of BBB leakage (Breuer et al., 2016). After peak leakage about two
days after SE, BBB leakage clearly declined on day 4 suggesting a partial recovery of
BBB integrity in formerly affected brain regions like hippocampus and thalamus (Fig.
1).
Additionally, we evaluated T2-weighted MRI to spatiotemporally assess SE-induced
brain edema and inflammation, as T2-weighted MRI was suggested also as an
indicator of active inflammation (Michoux et al., 2015, Peixoto-Santos et al., 2017). T2-
signal increase was found to a lesser extent than T1-signal increase, but with a similar
spatiotemporal profile (Fig. 1), suggesting cerebral edema to appear predominantly
early after SE and to resolve soon thereafter. Our findings correspond to those of
previous pre-clinical studies by Roch et al. (2002), Choy et al. (2010) and Duffy et al.
(2014) who detected peaks of T2 intensity around 2 to 4 days following pilocarpine-
induced SE. Importantly, our data are also in line with clinical data on hippocampal
edema to occur within 48 h after SE in human subjects, too (Scott et al., 2002,
VanLandingham et al., 1998). In a recent study, we longitudinally assessed the time
course of microglia activation after pilocarpine-induced SE by [11C]PK11195 positron
emission tomography (Brackhan et al., 2016). We found inflammation peaking
5 Manuskripte
106
between 1 and 2 weeks post SE, i.e. distinctly later than T2-signal increase observed
in the present study, suggesting that T2-weighted MRI does not reflect microglia
activation but other aspects of post-SE neuroinflammation.
To substantiate our analysis, we performed additional histological assessment of FITC-
albumin extravasation. Importantly, extravasation pattern analyzed ex vivo was
generally congruent with in vivo MRI findings (Fig. 1 and 2). Our results corroborate
peak albumin extravasation between 24 and 48 h after SE. Whereas converting the
albumin signal into a light-microscopically visible adduct (Michalski et al., 2010)
provides quantitative values even at electron microscopic level (Krueger et al., 2015),
the score-based analysis gives similar results and allows to differentiate between
extra- and intracellular appearance of green fluorescence. Detection of intracellular
FITC-albumin at 5 h post SE demonstrates that cells of neuron-like shape are
pathologically affected at this time point to allow albumin uptake.
Histological examinations were performed to evaluate consequences of albumin
extravasation for the NVU in further detail. Areas with albumin extravasation and
uptake in neuron-like cells also showed loss of NeuN-immunoreactivity and
colocalization with the vascular basement membrane marker laminin (Fig. 3). We
interpret the loss of NeuN-immunoreactivity as being indicative for injured neurons
containing extravasated albumin (Ünal-Cevik et al., 2004). This is also in line with the
distinct neurodegeneration found on days one and two after SE in Nissl-stained
temporal lobe subregions (Fig. 2). In concordance with our data, neurons were
reported to be the only or major cell type containing albumin following acute seizures
or SE, i.e. in an affected brain (Marchi et al., 2007b, van Vliet et al., 2007). Accordingly,
neuronal uptake was frequently observed in regions of Evans Blue extravasation in the
porcine hippocampus following osmotic BBB impairment and adherent acute seizures
(Marchi et al., 2007a). Interestingly, however, in vitro exposure of naïve rat cortical
brain slices to FITC-albumin or prolonged (72 h) infusion of albumin into the lateral
ventricle of naïve mice did not result in colocalization of albumin with neurons (Ivens
et al., 2007, Weissberg et al., 2015). These conflicting findings suggest that albumin
behaves different in the seizing versus the naïve brain, and that albumin uptake into
neurons might be favored by an impaired environment. This assumption is also
5 Manuskripte
107
supported by Michalak et al. (2012) who tracked the uptake of extravasated IgG into
neurons in chronic TLE patients and rats during epileptogenesis.
Assessment of albumin colocalization with a variety of further cellular markers exposed
spatial overlap of albumin also with microglia and CD8b-positive T cells (Figs. 3-9).
Surprisingly and despite the use of three markers labeling different astrocytic
compartments, i.e. intermediate filaments (GFAP), predominantly somata (S100ß),
and endfeet (AQP4), astroglia were devoid of detectable FITC-albumin in the present
study. This is in contrast to the reported selective transport of albumin into astrocytes
in vitro in cortical brain slices or cultured astrocytes (Ivens et al., 2007, Bar-Klein et al.,
2014), but in general accordance with observations after electrically-induced SE (van
Vliet et al., 2007) and after acute seizures (Marchi et al., 2007b). Furthermore, we
report that in FITC-albumin-positive areas after SE, staining intensity of astrocytic
markers was reduced (GFAP) or lacking (AQP4), indicating a severe disturbance of
the endothelial-neuronal coupling mediated by astrocytes. Importantly, partial loss of
perivascular AQP4 was also found in hippocampi of epilepsy patients (Eid et al., 2005,
Peixoto-Santos et al., 2017). Additionally, our observations suggest that at sites of
albumin leakage components of endothelial cells (Solanum tuberosum lectin) are less
present than in areas without visible FITC-albumin. In combination with the reduced
AQP4 and increased collagen IV-immunoreactivity, these alterations point to a distinct
adaptive reorganization process of the NVU vasculature taking place within 48 h after
SE. The obvious impairment of astrocytes (reduced GFAP and AQP4) might entail
disordered or dying neurons, e.g. by reduced glutamate uptake from the extracellular
space resulting in neurotoxic concentrations, or by impaired astrocytic energy supply
for neurons, an assumption supported by in vivo PET imaging studies demonstrating
cerebral glucose hypometabolism shortly after SE (Goffin et al., 2009, Guo et al., 2009,
Jupp et al., 2012, Lee et al., 2012, Zhang et al., 2015). As collagen IV is a stabilizing
constituent in the endothelial architecture of the NVU/BBB and part of the
immunological BBB (Dyrna et al., 2013), the observed increase in collagen IV-
immunoreactivity at sides of BBB leakage could represent the beginning of local repair
processes to re-establish BBB integrity. Interestingly, increased collagen IV expression
was also observed following other brain insults leading to NVU/BBB injury like
5 Manuskripte
108
experimental stroke (Hawkes et al., 2013). Moreover, colocalization of FITC-albumin
with brain immune cell markers (Iba, CD45c for activated microglia) and CD8b (for T
cells) did not reveal any obvious cellular preference, suggesting involvement of the
entire brain immune system in epileptogenesis-associated remodeling of the NVU.
In conclusion, we provide a detailed in vivo and ex vivo analysis of the spatiotemporal
course of BBB leakage and associated NVU alterations focusing on the early time
period post SE in a widely used rat model of epileptogenesis. Our data demonstrate
that BBB damage is an important triggering factor for epileptogenesis-associated
changes and arises very soon after SE. Subsequent degenerative events at the level
of the NVU, including degeneration of brain vessels, astrocytes and neurons, seem to
outweigh reconstructive processes. In conjunction with other studies we further
conclude that the seizing brain with leaky BBB seems to promote predominantly
neuronal albumin uptake, an observation requiring further investigation to define its
role in epilepsy development. Taken together, our data strongly support the necessity
of early BBB-restoring treatment, such as isoflurane (Bar-Klein et al., 2016),
glucocorticoids (Marchi et al., 2012) or levetiracetam (Itoh et al., 2016), as one
component of rational therapeutic intervention to ameliorate the development of
temporal lobe epilepsy and other detrimental sequelae of SE.
Acknowledgements:
This study was funded by the European Union Seventh’s Framework Programme
(FP7/2007-2013) under grant agreement n°602102 (EPITARGET). Heike Breuer was
supported by a scholarship from the Studienstiftung des Deutschen Volkes. Ina Leiter
was supported by a scholarship from the Konrad-Adenauer-Stiftung e.V.. We are
grateful to Johannes Kacza, Jens Grosche, Bianca Mages, Christian Bergen,
Nathalie Hildebrandt, Annika Thomer, and Friederike Twele for excellent assistance.
Competing Interests:
The authors have declared that no competing interest exists.
5 Manuskripte
109
Tables
Table 1
Double fluorescence staining of FITC-albumin pre-labeled rat forebrain tissue
sections
First
primary antibodies
First
visualising
immunoreagent
s
Second
primary antibodies
Second
visualising
immunoreagents
biotinylated mouse-
anti-NeuN (1:100;
Merck Millipore,
Billerica, MA,USA)
Cy3-streptavidin
rabbit-anti-laminin (1:200;
Dakocytomation, Hamburg,
Germany)
Cy5-donkey-anti-
rabbit IgG
rabbit-anti-laminin
(1:400;
Dakocytomation)
Cy3-donkey-
anti-rabbit IgG
guinea pig-anti-GFAP
(1:200; Synaptic Systems,
Göttingen, Germany)
Cy5-donkey-anti-
guinea pig IgG
biotinylated STL (10
µg/ml; Vector,
Burlingame, CA,
USA)
Cy3-streptavidin guinea pig-anti-GFAP
(1:200; Synaptic Systems)
Cy5-donkey-anti-
guinea pig IgG
rabbit-anti-collagen
IV (1:100; Merck
Millipore
Cy3-donkey-
anti-rabbit IgG
biotinylated STL (20 µg/ml;
Vector) Cy5-streptavidin
rabbit-anti-AQP4
(1:100; Alomone,
Jerusalem, Israel)
Cy3-donkey-
anti-rabbit IgG
biotinylated STL (20 µg/ml;
Vector) Cy5-streptavidin
rabbit-anti-AQP4
(1:100; Alomone)
Cy3-donkey-
anti-rabbit IgG
guinea pig-anti-GFAP
(1:200; Synaptic Systems)
Cy5-donkey-anti-
guinea pig IgG
rabbit-anti-S100β
(1:600; Synaptic
Systems)
Cy3-donkey-
anti-rabbit IgG
guinea pig-anti-GFAP
(1:200; Synaptic Systems)
Cy5-donkey-anti-
guinea pig IgG
rabbit-anti-Iba
(1:400; Synaptic
Systems)
Cy3-donkey-
anti-rabbit IgG
guinea pig-anti-GFAP
(1:200; Synaptic Systems
Cy5-donkey-anti-
guinea pig IgG
rabbit-anti-Iba
(1.200; Synaptic
Systems)
Cy3-donkey-
anti-rabbit IgG
biotinylated STL (20 µg/ml;
Vector) Cy5-streptavidin
biotinylated mouse-
anti-CD45c (1:20;
Serotec, Oxford,UK)
Cy3-streptavidin rabbit-anti-Iba (1:200;
Synaptic Systems)
Cy5-donkey-anti-
rabbit IgG
biotinylated mouse-
anti-CD8b (1:25;
Serotec)
Cy3-streptavidin rabbit-anti-Iba (1:200;
Synaptic Systems)
Cy5-donkey-anti-
rabbit IgG
5 Manuskripte
110
All fluorescent immunoreagents were obtained from Dianova (Hamburg, Germany)
and used at 20 µg/ml for 1 h. Abbreviations: NeuN neuronal nuclei; GFAP – glial
fibrillary acidic protein; STL – Solanum tuberosum agglutinin (= potato lectin); AQP4 –
aquaporin-4; Iba – ionized calcium binding adapter molecule-1.
Table 2
Summary of results gained by analysis of fluorescence staining after SE
Marker Target Colocalization with
FITC-albumin?
Altered
immunosignal in
FITC-albumin-
positive compared
to FITC-albumin-
negative areas?
NeuN Neurons Yes (but also
colocalization with
NeuN-negative cells of
neuronal morphology)
n.d.
GFAP Astroglia No Reduced
Iba1 Microglia Yes n.d.
STL Vasculature/
endothelial cells,
perivascular
microglia
No Reduced
Laminin Vascular basement
membranes of
endothelium
Yes No
Collagen IV Vascular basement
membranes of
endothelium
No Elevated
AQP4 Astroglial endfeet No Reduced
S100ß Astroglial somata No No
CD45c Activated microglia No Reduced
CD8b Subset of T cells Yes No
AQP4, aquaporin-4, GFAP, glial fibrillary acidic protein, Iba1, ionized calcium binding
adaptor molecule 1, n.d., not determined, NeuN, neuronal nuclei, STL, Solanum
tuberosum lectin
5 Manuskripte
111
Figures
Figure 1
Figure 1: Spatiotemporal course of blood-brain barrier (BBB) impairment and cerebral edema following
status epilepticus (SE) as assessed in vivo by 7T MRI. (A) Exemplary contrast-enhanced T1-weighted
coronal brain images in identical grey scale displaying region-dependent severity of blood-brain barrier
(BBB) leakage during epileptogenesis at 5 h, 48 h, 4 days and 10 days post status epilepticus (SE). (B)
Quantified T1-modified driven equilibrium Fourier transform (MDEFT) values measured after infusion of
gadolinium-diethylenetriamine pentaacetic acid (Gd-DTPA) as surrogate marker for BBB leakage prior
to (n = 13), 5 h (n = 5), 48 h (n = 5), 4 days (n = 6) and 10 days (n = 5) post SE. (C) Exemplary T2-
weighted coronal brain images displaying region-dependent severity of cerebral edema during
epileptogenesis. (D) Quantified T2 multi-slice-multi-echo (MSME) values measured prior to (n = 13), 5
h (n = 4), 48 h (n = 5), 4 days (n = 6) and 10 days (n = 5) post SE. Data in (B) and (D) are normalized
to pons and illustrated as mean ± SEM. *p < 0.05 vs. baseline (B), one-way ANOVA, Dunnett’s post-
hoc test.
5 Manuskripte
112
Figure 2
Figure 2: Histological evaluation of albumin extravasation and neurodegeneration during early
epileptogenesis. (A) Distribution of FITC-labeled albumin (FITC-Alb) after its conversion into a light
5 Manuskripte
113
microscopically visible adduct with anti-FITC-HRP and nickel-enhanced DAB in a representative section
from a rat 48 h following status epilepticus (SE). The extravasation marker indicating leakage of
allocated BBB is predominantly visible in the thalamus and the piriform cortex. Scale bar = 1 mm. (B)
Quantification of DAB-positive area relative to the total section area in control rats (n = 10), and rats at
5 h (n = 6), 24 h (n = 5), and 48 h (n = 16) following SE. *p<0.05 compared to control, one-way ANOVA,
Dunnett’s multiple comparison test. (C) Coronal Gd-DTPA-enhanced T1 MRI leakage map resulting
from comparison between baseline and 48 h post SE. Note the striking similarity of BBB leakage pattern
in the ex-vivo DAB-converted FITC-albumin slice (A) and in vivo contrast-enhanced MRI (C). Leakage
t-map was calculated by SPM12 software (two-sample unpaired t-test, p<0.001, and a minimum cluster
size of 100 voxels; scale bar displays t-values). (D) Exemplary whole brain sections and a higher
magnified image of the thalamus from two rats, predominantly showing extracellular distribution (left, 48
h post SE) or intracellular uptake (right, 24 h post SE) of extravasated FITC-labeled albumin. (E) Semi-
quantitative analysis of extracellular FITC-labeled albumin in control rats (n = 10), and rats at 5 h (n =
6), 24 h (n = 5), and 48 h (n = 14) following SE. (F) Semi-quantitative analysis of intracellular FITC-
labeled albumin in control rats (n = 10), and rats at 5 h (n = 6), 24 h (n = 5), and 48 h (n = 14) following
SE. (E) and (F) show peak values of FITC-albumin presence at 24 h post SE. (G) Number of hilar
neurons in control rats (n = 6), and rats at 5 h (n = 6), 24 h (n = 5), and 48 h (n = 4) following SE,
revealing neurodegeneration only at 48 h post SE. (H) Semi-quantitative analysis of neurodegeneration
in hippocampal subregions, amygdala, as well as cortical subregions in control rats (n = 6), and rats at
5 h (n = 6), 24 h (n = 5), and 48 h (n = 4) following SE. *p<0.05 compared to control, (B,E,F,H) Kruskal-
Wallis ANOVA, Dunn’s multiple comparison test. (G) One-way ANOVA, Dunnett’s multiple comparison
test. Data are illustrated as box-and-whisker plots. CA, cornu ammonis. Co, control, Pir./entorh.,
piriform/entorhinal.
5 Manuskripte
114
Figure 3
Figure 3: Concomitant detection of FITC-labeled albumin (FITC-Alb) (A) in the pyramidal layer of the
hippocampal CA1 region 48 h after SE shows predominantly intracellular FITC-Alb. Neuronal somata
are stained with biotinylated anti-NeuN and red fluorescent Cy3-streptavidin (A’), while vascular
basement membranes are visualized with rabbit-anti-laminin and Cy5-donkey anti-rabbit (A’’,
immunosignals color-coded in blue). The overlay of staining patterns (A’’’) elucidates only rare
colocalization of FITC-Alb and NeuN-positive neurons. Scale bar = 50 µm.
5 Manuskripte
115
Figure 4
5 Manuskripte
116
Figure 4: Hippocampal pyramidal cell layer in the CA1 region with FITC-labeled albumin (FITC-Alb)
(A,B) 48 h following SE and (A’) laminin-immunoreactivity (vascular basement membranes, Cy3, red) or
(B’) binding sites for biotinylated Solanum tuberosum lectin (STL; endothelial cells, Cy3, red), each
combined with immunolabeling of astroglial GFAP (A’’, B’’, Cy5, color-coded in blue) at lower
magnification (A-A’’’) and higher magnified (B-B’’’). Merged staining patterns (A’’’, B’’’) elucidate FITC-
Alb in close vicinity to laminin-immunopositive structures (arrow in A’’’), but no obvious colocalization of
FITC-Alb and GFAP-positive astrocytes (A’’’, B’’’). Scale bars: A’’ (also valid for A, A’) = 100 µm, A’’’ =
50 µm, B’’ (also valid for B, B’) = 50 µm, B’’’ = 25 µm.
5 Manuskripte
117
Figure 5
Figure 5: Simultaneous demonstration of thalamic FITC-labeled albumin (FITC-Alb) 24 h following SE
combined with the detection of the vascular marker collagen IV and binding sites for Solanum tuberosum
lectin (STL). FITC-Alb (A) is seen in neuron-like cells in SE-affected regions, mainly marked by
apparently up-regulated collagen IV (Coll IV)-immunoreactivity (A’, Cy3, red). Concomitant lectin-
histochemical staining with STL (A’’, Cy5, color-coded in blue) reveals vessels which appear thinner and
of lower STL signal in tissue with detectable FITC-Alb. Vascular structures containing both Coll IV and
STL-binding sites appear purple in (A’’’). Scale bar = 75 µm.
5 Manuskripte
118
Figure 6
5 Manuskripte
119
Figure 6: Concomitant visualization of thalamic FITC-labeled albumin (FITC-Alb) 24 h after SE with
astroglial aquaporin-4 (AQP4, astrocytic endfeet) and endothelial Solanum tuberosum lectin (STL)
binding as overview (A-A’’’) and at higher magnification (B-B’’’). FITC-Alb is seen in numerous neuron-
like cell somata (A, B). AQP4 immunolabeling (A’, B’) is largely absent in FITC-Alb-positive tissue
marked by asterisks in A’, but distinctly expressed in adjacent areas. STL staining in the same area
appears diminished (A’’, arrow). The overlay of staining patterns (A’’’, B’’’) elucidates allocated AQP4-
immunoreactive astrocytic endfeet and endothelial STL-binding sites appearing as purple vessels in
close vicinity to many FITC-Alb-filled cells. Scale bars: A’’ (also valid for A, A’) = 200 µm, A’’’ = 100 µm,
B’’ (also valid for B, B’) = 50 µm, B’’’ = 25 µm.
5 Manuskripte
120
Figure 7
5 Manuskripte
121
Figure 7: Detection of GFAP and cellular FITC-labeled albumin (FITC-Alb) in SE-affected thalamus 48
h after SE onset combined with immunolabeling of aquaporin-4 (AQP4; A-A’’’) or of S100β (B-B’’’). FITC-
Alb in (A) is seen in region devoid of Cy3-staining for AQP4 (A’) and diminished GFAP-immunosignals
(A’’). The overlay of staining patterns (A’’’) reveals a nearly complementary occurrence of FITC-Alb and
AQP4 expression, but also shows remnants of mostly punctuate GFAP-immunoreactive structures. At
higher magnification, in another thalamic area from the same animal Cy3-counterstaining of S100β (B’)
predominantly reveals astroglial somata with numerous processes, whereas the immunodetection of
GFAP with Cy5 (B’’, color-coded in blue) visualizes astrocytic intermediate filaments. The merge of
staining patterns (B’’’) clearly demonstrates numerous astrocytes co-expressing both astroglia-specific
markers, but lacking allocated FITC-Alb. Scale bars: A’’ (also valid for A, A’) = 100 µm, A’’’ = 50 µm, B’’
(also valid for B, B’) = 50 µm, B’’’ = 25 µm.
5 Manuskripte
122
Figure 8
5 Manuskripte
123
Figure 8: Demonstration of FITC-labeled albumin (FITC-Alb) and Iba-immunoreactive
microglia/macrophages combined with thalamic GFAP immunolabeling 48 h after SE onset (A-A’’’) and
the detection of hippocampal Solanum tuberosum lectin (STL)-binding sites 24 h after SE onset
(endothelial cells, B-B’’’). FITC-Alb in the thalamus is predominantly visible within neuron-like cells (A).
The same region contains Iba-immunopositive ameboid microglia which is even stronger labelled in
adjacent tissue with less FITC-Alb (A’). In parallel, proliferating astrocytes are revealed by GFAP-
immunostaining (A’’). The merge of staining patterns (A’’’) allows for the identification of single FITC-
Alb-filled immune cells displaying the mixed color yellow (arrow in A’’’). Additionally, hippocampal FITC-
Alb-positive cells are allocated with Cy5-staining of STL-binding sites and Cy3-immunolabeling of Iba
(arrowhead, B’’’). Scale bars: A’’, B’’ (also valid for A, A’, B, B’) = 100 µm, A’’’, B’’’ = 50 µm.
5 Manuskripte
124
Figure 9
5 Manuskripte
125
Figure 9: Triple fluorescence labeling of FITC-labeled albumin (FITC-Alb) and Iba combined with the
immunodetection either of immune cells expressing CD45c (A-A’’’) or CD8b (B-B’’’) in thalamic regions
48 h after SE. FITC-Alb-filled cells are here restricted to a clearly delineated zone (A), whereas CD45c-
immunodetection (A’) visualizing the leukocyte common antigen is stronger in tissue devoid visible FITC-
Alb and Iba (A’’), which is seen in more evenly distributed ameboid immune cells. The overlay of staining
patterns (A’’’) clearly shows several cells co-expressing both microglial markers (exemplified by arrows
in A’’’), whereas all FITC-Alb-stained cells appear mono-labeled. At higher magnification, one cell
displays not only a cytoplasmic label with FITC-Alb (B), but also a small, round compartment with a
much stronger fluorescence signal. This cell and three other cells with similar ameboid appearance are
additionally Cy3-labeled for CD8b indicating a subset of lymphoyctes, whereas Cy5-immunostaining of
Iba (B’’, color-coded in blue) is also present in apparently CD8b-immunonegative cells. The overlay of
staining patterns clearly demonstrates two cells co-expressing both immune cell markers either
containing FITC-Alb (arrow) or being devoid of FITC-Alb (arrowhead). Scale bars: A’’ (also valid for A,
A’) = 100 µm, A’’’ = 50 µm, B’’ (also valid for B, B’) = 25 µm, B’’’ = 10 µm.
5 Manuskripte
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5 Manuskripte
132
5.3 Pronounced and long-term disease-modifying effects of transient ketogenic
diet in the intrahippocampal kainate mouse model of epileptogenesis: a
longitudinal theranostic study
Ina Leiter1,2, Pablo Bascuñana2, Jens Peter Bankstahl2#, Marion Bankstahl1#*
1 Department of Pharmacology, Toxicology and Pharmacy, University of Veterinary
Medicine Hannover and Center for Systems Neuroscience, Bünteweg 17, 30559
Hannover, Germany
2 Department of Nuclear Medicine, Hannover Medical School, 30625 Hannover,
Germany
*Corresponding author: Marion Bankstahl, University of Veterinary Medicine
Hannover, Department of Pharmacology, Toxicology and Pharmacy, Bünteweg 17,
D-30559 Hannover, Germany, Tel: +49-511-9538729, Fax: +49-511-9538581, E-
mail: [email protected]
#These authors contributed equally to this study.
Key words (3-6): cerebral energy metabolism, neuroinflammation, PET imaging,
epilepsy
Abstract
Rationale: Alterations in cerebral glucometabolism during insult-mediated
epileptogenesis represent a potential treatment target for prophylactic intervention.
The ketogenic diet (KD) has shown disease-modifying potential in animal models of
epileptogenesis before, and the underlying mechanism of action being not fully
understood to date might partially be based on KD’s interference with cerebral energy
metabolism. This study was designed to meet the following aims: 1. To evaluate the
short- and long-term effects of a transient KD on brain glucose metabolism, microglial
activation and GABAA receptor density during epileptogenesis and the chronic disease
5 Manuskripte
133
phase by translational nuclear imaging. 2. To evaluate the long-term impact of transient
KD on seizure outcome and behavior.
Methods: Male NMRI mice were used for induction of status epilepticus (SE) by
intrahippocampal kainate injection. A group of eleven animals received a KD for four
weeks starting directly after surgery (SE+KD group). A second SE group (SE+SD
group) of ten mice as well as a third, sham-operated mouse group (sham control, n=10)
received a standard diet (SD). Positron emission tomography (PET) was performed
with [18F]GE-180 (microglial activation) at days 7 and 14 post surgery as well as with
[18F]fludeoxyglucose ([18F]FDG; glucose metabolism) and [18F]flumazenil (GABAA
receptor density) at 4 and 9-10 weeks after surgery. For analysis of [18F]FDG PET
data, a pharmacokinetic modeling was applied. A modified Irwin screen was performed
at baseline, the day prior to each PET scan and after three months. Electrodes were
implanted eleven weeks post SE for seizure monitoring with video-combined
electroencephalography. Mice were finally tested in the 13th week post SE concerning
activity and exploration in an open field test.
Results: KD feeding after SE induction resulted in increased blood ß-hydroxybutyrate
levels and faster weight gain compared to SD feeding. Focal inflammation (TSPO
expression) was observed in terms of an elevated [18F]GE-180 uptake in the dorsal
ipsilateral hippocampus on day seven in the SE+KD group and on day 14 in the SE+SD
group compared to baseline or sham controls. [18F]FDG uptake was decreased at
week four in sham controls and SE+SD mice, but not in mice fed with KD. Six weeks
later, i.e. after discontinuation of KD, global hypometabolism was seen in all groups.
Glucose metabolic rate MRGlu time course revealed a decreased glucose turnover in
the SE+SD group and sham controls both at 4 and 10 weeks, while MRGlu values in
the SE+KD group did not differ from baseline values at any time point. Glucose influx
rate constant Ki was not affected by KD. The binding potential BPnd calculated from the
[18F]Flumazenil PET data did not differ between SE+KD and SE+SD mice. At 2 weeks
post SE, the Irwin screen revealed an increased summation score in the SE+SD group,
while the SE+KD group did not differ from baseline and sham control values. The open
field test in week 13 did not uncover any differences among the groups. The number
of mice developing seizure-like events was significantly lower in the SE+KD group.
5 Manuskripte
134
Further, KD-fed mice showed significantly less and shorter seizure-like events than
SD-fed mice.
Conclusion: This study revealed short- and long-term disease-modifying effects of an
intermittent KD on epileptogenesis. PET imaging allows therapeutic monitoring of KD
effects and demonstrates that both microglial activation and cerebral glucose
metabolism are positively affected by KD.
Introduction
Chronic epilepsy in human patients but also in rodent epilepsy models is associated
with cerebral glucose hypometabolism (Theodore et al., 2004, Zhang et al., 2015). As
cerebral energy metabolism is also subject to alterations during epileptogenesis (Goffin
et al., 2009, Jupp et al., 2012, Lee et al., 2012), it might represent a target for
therapeutic intervention following epileptogenic brain insults. The ketogenic diet (KD)
represents a long-established alternative or add-on treatment to anti-seizure drugs with
effectiveness also in pharmacoresistant epilepsy patients (Felton and Cervenka, 2015,
Coppola et al., 2002). Consisting of high-fat, low-protein and low-carbohydrate
nutrition, it induces ketosis. KD has been shown to be associated with increased brain
uptake of both glucose and ketone bodies using positron emission tomography (PET)
with the radiolabeled glucose analogon [18F]fluorodeoxyglucose [18F]FDG (Roy et al.,
2012, Pifferi et al., 2011). Besides its successful application in children (Lambrechts et
al., 2017), the therapeutic value of KD (and related diets) has recently also been
demonstrated for adult epilepsy patients (Ye et al., 2015, Cervenka et al., 2016, Klein
et al., 2010). Furthermore, KD is efficient in diverse types of epilepsy (Stenger et al.,
2017, Felton and Cervenka, 2015, Zhang et al., 2016). Preclinically, KD has shown
anticonvulsive effects in different rodent models of acute seizures (Samala et al., 2008,
Bough et al., 2002, Hori et al., 1997). Importantly, besides the acute anticonvulsive
activity, findings in rodent models of epileptogenesis, i.e. kindling and post statues
epilepticus (SE) models, also suggest a potential disease-modifying or even anti-
epileptogenic effect of KD (Jiang et al., 2012, Hansen et al., 2009, Muller-Schwarze et
al., 1999, Dustin and Stafstrom, 2016, Lusardi et al., 2015). This idea is supported by
data from a patient study with 150 children showing that a KD can have long-lasting
5 Manuskripte
135
positive effects on seizure outcome even after discontinuation of the diet (Marsh et al.,
2006).
The present study aimed at assessing potential long-term anti-epileptogenic effects of
transient KD in the intrahippocampal mouse model of epileptogenesis. Translational
non-invasive PET imaging of cerebral glucometabolism, neuroinflammation and
GABAA receptor density was performed for monitoring of therapeutic response and for
getting further insight into the mechanisms of action of KD.
Materials and methods
Animals
Male NMRI mice (Charles River, Germany) were used. They were purchased at an
age of seven weeks and allowed to adapt to the laboratory for at least one week.
Animals were housed in groups of up to nine animals in individually ventilated cages
(Allentown, Neuss, Germany), under controlled room conditions: 20 – 22°C, air
humidity of 40-70%, 14 h light phase (7 am to 9 pm) and 10 h dark phase. Autoclaved
water and a standard rodent diet (Altromin, Lage, Germany) was offered ad libitum to
all animals before start of experiments, as well as an appropriate amount of autoclaved
bedding and nesting material. The study was carried out according to EU directive
86/609/EWG and the German animal welfare act (Tierschutzgesetz), with the
permission of the Lower Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety
(LAVES).
Diet
The ketogenic diet (KD) was purchased from Harlan Laboratories GmbH (TD.96355,
Venray, Netherlands). The ratio of fat to protein and carbohydrates was 4.25 (6.7
kcal/g, 9.1% kcal from protein, 0.4% kcal from carbohydrate, 90.5% kcal from fat). The
formula consisted of: hydrogenated vegetable shortening (586.4 g/kg), casein (173.3
g/kg), cellulose (87.97 g/kg), corn oil (86.2 g/kg), mineral mix (Ca-P deficient, 79055,
20 g/kg), dibasic calcium phosphate (19.3 g/kg), vitamin mix (40060, 13 g/kg), calcium
carbonate (8.2 g/kg), DL-methionine (2.6 g/kg), choline bitartrate (2.5 g/kg),
magnesium oxide (0.4 g/kg), antioxidant TBHQ (0.13 g/kg). Formed to small portions
5 Manuskripte
136
of cylindrical shape by hand, KD was offered to the animals every day freshly prepared
and ad libitum in the usual feeder and weighed to calculate the averaged daily feed
intake. The control diet was the standard rodent diet (SD) described above, also fed at
libitum.
Kainate microinjection and electrode implantation
The surgery for status epilepticus (SE) induction resembles the first description of this
model (Suzuki et al., 1995). Mice were anesthetized with a bolus injection of chloral
hydrate (500 mg/kg i. p., dissolved in 10 ml sterile saline), with re-injections of 0.05 ml
of the chloral hydrate solution for maintaining anaesthesia. The injection site for the
kainate in the right dorsal hippocampus (CA1 region) was determined using a
stereotactic frame (coordinates from Bregma: anterior-posterior: -2.1, latero-lateral: -
1.6, dorso-ventral: -2.3). A volume of 0.05 µl kainate solution was injected (20 mM, 10
mg kainate (Sigma Aldrich, Germany) dissolved in 2345 µl sterile saline) with a 0.5 µl
syringe (VWR International, Hannover, Germany). After the surgery, mice received one
injection of 0.5 ml electrolyte solution with five percent glucose subcutaneously and
another of 10 ml/kg intraperitoneally. Until complete recovery from surgery, smashed
food pellets were provided and subcutaneous saline injections were repeated if
necessary.
Electrode implantation was performed eleven weeks later to avoid imaging artefacts,
with the same coordinates under isoflurane anaesthesia. Two screws were inserted in
each os frontale for the fixation of the electrode with dental cement (Paladur®, Heraeus
Kulzer GmbH, Hanau, Germany), one further screw in the os parietale sinistrum served
as grounding for the bipolar electrode.
Animal groups, treatment and study design
Three groups of mice underwent surgery: eleven mice (SE+KD) were fed KD for four
weeks directly starting after SE induction (KD), ten mice (SE+SD) were fed standard
diet (SD) after kainate injection and ten mice were sham-operated (saline instead of
kainate injection) and fed a SD (Sham). The study was designed as follows (for an
overview, see figure 1): Directly after stereotaxic surgery in order to induce SE or mimic
5 Manuskripte
137
the microinjection, mice were fed according to the different diet groups (after four
weeks, the KD group received SD again). PET scans were performed at seven and 14
days to image brain translocator protein 18 kDa (TSPO) ([18F]GE-180), in weeks four
and nine to ten in order to evaluate brain glucose metabolism ([18F]FDG) and in weeks
four and ten to analyse central benzodiazepine receptor density ([18F]Flumazenil), as
detailed later. On the day before surgery, before each PET scan timepoint and finally
after 12 to 13 weeks before killing the animals, a modified Irwin Screen was performed
(Irwin, 1968) as described later. In the eleventh week, electrodes were implanted in a
second stereotaxic surgery for EEG and video monitoring (see below), which started
about three days later. Beta-hydroxybutyrate concentrations in blood were measured
before surgery, directly before each PET scan and before killing the animals using
whole blood and commercial test strips (GlucoMen® LX ß ketone sensors, A. Menarini
Diagnostics, Firenze, Italy).
Before the experiments started, we first evaluated the influence of a chronic KD on
brain glucose metabolism in a group of ten healthy mice. These mice received KD for
72 days. [18F]FDG PET scans were performed at baseline, 10 days, 17 days, 25 days,
35 days and 49 days of feeding the diet. Blood ß-hydroxybutyrate concentrations were
measured in naive control mice of the same age (n=7) and in the KD mice at days 35
and 54.
Image acquisition
For imaging brain translocator protein 18 kDa (TSPO) ([18F]GE-180), glucose
metabolism ([18F]FDG) and central benzodiazepine receptor density ([18F]Flumazenil),
a small animal PET-CT scanner (Inveon DPET, Siemens, Knoxville, TN, USA) was
used. Isoflurane anaesthesia was induced with three percent isoflurane in three litres
oxygen per minute. Subsequently, the isoflurane concentration was adjusted
individually to maintain a respiration frequency of about 60 – 80 /min (monitored
continuously). Directly before catheterization (self-made catheters out of 27 G
cannulas and a medical micro volume tube (Kleinfeld Labortechnik, Gehrden,
Germany, Tygon S-54-JL, no. 9.205 504)) of the lateral tail for later tracer application,
a drop of blood was taken preferably from the vena saphena to measure blood glucose
5 Manuskripte
138
levels (Contour XT meter, Bayer Consumer Care, Basel, Switzerland). Mice were
scanned side-by-side in a double mouse scan bed (Minerve, Esternay, France) being
warmed to 37°C. Mouse brains were at the centre field of view. Tracers were injected
simultaneously with the start of the 60 minutes dynamic acquisitions. The mean
injected radioactivity per mouse was 11.08 ± 3.450 MBq (mean ± SD) [18F]GE-180,
10.17 ± 2.224 MBq (mean ± SD) [18F]FDG, or 12.61 ± 1.128 MBq (mean ± SD)
[18F]Flumazenil. For histogrammation of the acquired list mode data, 32 frames were
chosen. The image reconstruction to a 128 x 128 x 159 matrix (0.78 x 0.78 x 0.8 mm3)
was done with a three-dimensional ordered subset expectation maximization (3D-
OSEM) / maximum a posteriori (MAP) algorithm (β = 1, OSEM iterations = 2, MAP
iterations = 18) with scanner-applied scatter correction. Attenuation was corrected
using a 57Co transmission scan. A CT acquisition followed each PET scan. In the case
of [18F]FDG scans, blood glucose levels were measured again afterwards, with blood
taken from the tail vein after the catheter removal. Finally, the animals were allowed to
awake again.
Image data processing and kinetic modelling
For image data processing, PMOD 3.6 software (PMOD Technologies, Zurich,
Switzerland) was used. After co-registration of each CT image to the standard T2-
weighed mouse MRI atlas of PMOD 3.6 (Ma et al., 2005), the step was repeated with
its corresponding PET image. Then, the transformation ensured the accurate overlap
of MRI atlas and PET image.
[18F]FDG: The Mirrione mouse atlas provided by PMOD (Mirrione et al., 2007) and a
region of interest covering the whole brain was applied for semi-quantitative analysis
of [18F]FDG uptake. Calculation of the standardized uptake values (percent injected
dose per cubic centimetre) took account of the last three frames (i.e. the last thirty
minutes of the acquisition). The FDG 2-compartment model in PMOD was chosen for
kinetic modelling. The required image-derived input function (IDIF) was calculated
using a region of interest (2 x 2 x 4 mm3) positioned in the early image frames of the
vena cava caudalis (Lanz et al., 2014, Thorn et al., 2013). The lumped constant LC
5 Manuskripte
139
was set 0.67 (Thorn et al., 2013). The averaged values of the two blood glucose
measurements per scan timepoint were entered into the modelling process.
[18F]GE-180: The [18F]GE-180 uptake in each brain region was calculated as described
above for the [18F]FDG uptake.
[18F]Flumazenil: Here was the simplified reference tissue model of PMOD 3.6 used,
based on the descriptions of Lammertsma and Hume (Lammertsma and Hume, 1996)
and Gunn et al. (Gunn et al., 1997), with the brain stem as reference region to
determine the estimated binding potential BPnd.
Irwin screen
This test was a modified version of the comprehensive observational assessment
originally described by Irwin et al. (Irwin, 1968) and adapted by Klee et al. (Klee et al.,
2015). The experiments were timed always in the morning at the same time. Each
mouse was tested in an empty and clean open cage. The following parameters were
evaluated: body position, tail elevation, spatial locomotion (speed), transfer arousal
(activity), stereotyped behaviour, curiosity behaviour as a reaction to the approach of
a pen, touch escape, startle response (the sound was evoked using a clicker) and
behaviour whilst picking up the mouse by the tail. A scoring system described each
test parameter (see table 1). A score of 2 represented the normal condition.
Activity cage
In the 13th week post SE, each mouse was put for a ten-minute trial into a square test
arena surrounded by an infrared light based activity detection system (ActiMot, TSE
Systems GmbH, Bad Homburg, Germany) as described before (Bankstahl et al.,
2013). The parameters velocity, active time, covered distance, stops in the middle,
time spent in the middle, number of rearings and time spent at the margin were
measured automatically by the system.
EEG and video monitoring
EEG and video monitoring was performed as described before (Klein et al., 2015).
Mice were kept singly on dark bedding material (Cellu Dri®, LBS, Limburgerhof,
5 Manuskripte
140
Germany) in special cages with swivels. EEG and video was simultaneously and
continuously recorded using LabChart6 and LabChart8 software (ADInstruments
GmbH, Spechbach). During dark phases, cages were illuminated by infrared diodes.
Total recording time was about 100 hours, with a break of two days to let animals
recover from bearing the weight of the cable. Four hours per day of EEG were analysed
for seizure-like events (8:00 am - 9:00 am, 02:00 pm - 03:00 pm, 8:00 pm - 9:00 pm,
02:00 am - 03:00 am). Seizure-like events were categorized into high voltage sharp
waves (HVSW) and hippocampal paroxysmal discharges (HPD) as already described
by Twele et al. (Twele et al., 2016a). The whole monitoring data were screened for
generalized seizures.
Statistical analysis
All statistical tests were calculated using GraphPad Prism version 7.00 for Windows
(GraphPad Software, San Diego California USA). One-way ANOVA with Dunnett’s
Multiple Comparison Test or Sidak’s Test was conducted regarding the comparisons
of all PET imaging data versus baseline or between groups. A Kruskal-Wallis test in
combination with a Dunn’s Multiple Comparison test was used for comparing scoring
results and with Mann-Whitney U-Test for comparing seizure-like events. Barnard‘s
Test (http://scistatcalc.blogspot.de/2013/11/barnards-test-calculator.html) was applied
for analysis of contingency tables. P-values of < 0.05 were considered statistically
significant. All graphs show mean values with standard error of the mean.
Results
Development of body weight, ketogenic diet intake and blood parameters
Mice under KD gained weight faster than mice being fed the SD (Figure 2B). Starting
from day 13, their weights were significantly higher than those of the Sham group. On
day 31, there was a mean difference between mice fed the two different diets of about
five grams. Mice needed about five days to adapt to the KD meaning to find their usual
daily consumption, which comprised on average 3.4 grams per mouse per day (Figure
2A). There was no difference in body weight development between both SD groups –
the Sham and the SD group. In the chronic phase with SD in all groups, the KD induced
5 Manuskripte
141
difference vanished (Figure 2B). Based on the measurements at the scan days, no
effects by KD on blood glucose concentrations were observed, except for the
measurement on day 14, when blood glucose levels were significantly higher in the KD
group compared to the SD group, but similar to the Sham group (Figure 2D). The KD
group had elevated blood ß-hydroxybutyrate concentrations compared to baseline
measurements as well as compared to the SD group at two and four weeks after start
of KD (Figure 2C).
PET imaging
[18F]GE-180 PET
The quantification of regional tracer uptake by calculation of the standardized uptake
values showed no differences among the groups on day seven except for the dorsal
right hippocampus: here, the KD group had an increased uptake compared to baseline
values (Figure 3A). The outcome of the fourteen days scan showed a decrease of the
tracer uptake in the KD group compared to the seven days timepoint in the ventral
ipsilateral hippocampus, the ipsilateral striatum and the ipsilateral thalamus (Figure
3B,D,E). The dorsal hippocampus had ipsilateral a higher tracer uptake in the SD group
than in the Sham group on day 14. In the dorsal ipsilateral hippocampus, the tracer
uptake was elevated in the SD group compared to baseline and compared to the
contralateral side (Figure 3A).
[18F]FDG PET
The tracer uptake decreased generally in the Sham and SD group at four weeks (SD
group not in the amygdala) compared to baseline values and compared to the KD
group that did not change (Figure 4A-E). At the chronic time point of nine weeks, the
Sham and SD groups still had a decreased uptake (SD group not in the amygdala),
and the KD group assimilated at this time point, i.e. ~ 10 weeks after end of KD feeding
(Figure 4A-F). The influx rate Ki did not change four weeks after surgery (Figure 5A-
F). The metabolic rate MRGlu (Figure 6A-F) resembled the image of the tracer uptake:
In almost all analyzed brain regions, a decrease at four weeks could be seen in the SD
and Sham group (not ventral hippocampus, amygdala) compared to baseline values
5 Manuskripte
142
und to the KD group that did not change (if SD and KD compared, not in amygdala,
and if Sham and KD compared, not in dorsal left hippocampus). This decrease was
still manifest in all analyzed brain regions but in the amygdala regarding at the later
time point. The KD group did not show a significant difference compared to baseline,
but it also did not differ any more from both other groups (Figure 6A-F).
The preliminary experiment with healthy mice fed the KD for 72 days revealed an
increase in tracer uptake on day 35 in hippocampus, thalamus and cerebellum and on
day 49 in thalamus. Ki values did not change over time. The MRGlu was increased on
day 25 in hippocampus.
[18F]Flumazenil PET
The estimated binding potential BPnd had comparable levels in all three groups in week
four post surgery. An increase comparing both time points was seen in the Sham group
in cortex, right striatum, right thalamus and whole brain as a region. Sham mice and
SD mice differed at the later time point in ventral left hippocampus and right striatum
(see appendix of thesis).
EEG and video monitoring
The KD feeding for four weeks directly starting after SE induction did not lead to
differences in the amount of shown generalized seizures at any time point. Due to
animal loss, electrode loss or practicability issues, nine KD, nine SD and three Sham
animals could be monitored electroencephalographically. Noticeably, there were no
significant differences concerning the amount of seizure-like events shown by KD mice
and Sham mice (not shown). A significantly higher amount of HVSW, ME, as well as
ME and HPD or all electroencephalographic events in total, could be observed in SD
mice compared to KD animals (Figure 10D). Regarding the average cumulative
duration of seizure-like events (HVSW, ME, total events) per hour and the average
duration of those events, SD mice differed from KD and Sham mice (Figure 10E,F).
KD mice had on average less and less long electroencephalographic events than SD
mice (Figure 10D-F). Sham mouse EEGs did not have any of the three events but rare
and isolated spikes.
5 Manuskripte
143
Behavioral tests
The activity cage experiment could not reveal any differences in behavior among the
three groups. The Irwin screen results were evaluated by calculating an average score
per group and time point (Figure 8) or a summation score for every animal, including
score values for speed, activity, startle response, finger approach, touch escape, and
elevating at tail (Figure 9). This resulted in elevated scores for the SD group in week
two (startle response) compared to baseline. In week 4, the KD group displayed a
higher speed compared to Sham animals. The summation score reveals distinct
abnormalities at 2 weeks post SE (Figure 9). Directly after the EEG monitoring period,
meaning three months after SE induction, the Irwin screen did not result in any
differences among the groups.
Discussion
The main finding of our study, the electroencephalographic outcome with no significant
differences between KD and Sham animals but evidently more seizure-like events
shown by SD animals than by Sham or KD, supports the fundamental hypothesis of a
disease-modifying efficacy of the KD. Furthermore, the average cumulative duration
as well as the average duration of electroencephalographic events was higher in SD
than in KD (and Sham) animals. One of nine SE+SD mice, but five of nine SE+KD
mice had no seizure-like events at all during the monitoring period. Symptoms of SE
shown after awakening from anesthesia were transient immobility, intermittent head
tilt, chewing and in some cases circling, which is in line with observations described
earlier (Bouilleret et al., 2000, Bouilleret et al., 1999, Riban et al., 2002). Only rarely,
the evoked SE has convulsive parts (Gröticke et al., 2008). Spontaneous generalized
seizures were observed during daily routine or EEG/video monitoring in five out of ten
SE+SD mice but only three of eleven SE+KD mice.
Individual animals were followed-up during the anticipated time-course of
epileptogenesis by PET imaging and the Irwin Screen. The higher additive score in the
Irwin Screen at week two in the SE+SD group compared to baseline and Sham controls
can be considered as a general indicator for epileptogenesis-associated alterations in
the brains of those mice. Later, in the chronic phase, no difference among groups was
5 Manuskripte
144
observed, which is in line with an earlier study in the mouse intrahippocampal kainate
model (Gröticke et al., 2008).
With regard to evaluate epileptogenesis by PET imaging, the tracers [18F]FDG and
[18F]flumazenil have been shown to be useful in epilepsy diagnostics (Burneo et al.,
2015) and epilepsy research (Dedeurwaerdere et al., 2007, Dedeurwaerdere et al.,
2009, Juhasz et al., 2000). [18F]FDG PET is described to reveal a hypometabolic state
in chronic epilepsy in several animal models (Jupp et al., 2012, Lee et al., 2012, Liu et
al., 2010, Zhang et al., 2015). Four weeks after surgery, mice are supposed to have
developed already spontaneous recurrent seizures (Twele et al., 2016b). As rats
injected with kainate also showed a global decrease in cerebral [18F]FDG uptake at
that time (Jupp et al., 2007), the reduced tracer uptake in the SE+SD group observed
here was as expected. Strikingly, the [18F]FDG PET images showed a similar pattern
in the sham control group. As the sham surgery represented the very same mechanical
trauma with the microinjection of sterile saline instead of kainate, one could argue that
the main part of the [18F]FDG signal is trauma- and not epileptogenesis-associated in
this model. Mild traumatic brain injury was shown to induce similar hypometabolic
patterns in rats (Vallez Garcia et al., 2016), whereby, in contrast to our experiment,
also inflammation was seen. It was observed before that prolonged depth electrode
implantation led to a more pronounced SE caused by electrical stimulation (Bankstahl
et al., 2014) or a faster kindling (Blackwood et al., 1982). As electrode implantation in
the hippocampus of mice led to micro-haemorrhages with iron deposition (Boast et al.,
1976), one might assume that this is also the case when lowering a cannula in the
tissue. Unpublished data from our group show that the blood-brain barrier can be
impaired by sham surgery. The induction of focal ischemia due to damage and clotting
caused by leaving of the cannula for five minutes in the tissue is also conceivable.
Having these obvious changes in brain glucose metabolism in mind, it is impressive
that the KD seems to help the brain tissue to recover after this insult as can be seen in
the unaltered [18F]FDG uptake values at the time point of four weeks later. The effect
of the KD could also be interpreted as an assistance to counterbalance the insult
consequences, with regard to the assimilated uptake values more than a month after
the end of the KD treatment. The results for the [18F]FDG uptake of the preliminary
5 Manuskripte
145
experiment in healthy animals receiving KD go into the same direction as an increase
in tracer uptake could be seen on day 35 in hippocampus, thalamus and cerebellum
and also on day 49 in thalamus (see appendix of the thesis). Interestingly, the MRGlu
values of the SE+KD mice at 10 weeks post SE still did not differ from the baseline
values. This could be a hint for an effectiveness of the KD outlasting the treatment
period.
[18F]Flumazenil-PET did not reveal any difference between SE+KD and SE+SD mice
or SE+KD and Sham controls. There were no changes seen between the two
timepoints in the chronic phase after surgery in both SE groups. Only the Sham group
showed increases in binding potential PBnd bilaterally in cortex, in whole brain as one
VOI and in the right striatum and thalamus. As a baseline value is missing in our study,
one can only conclude that the KD did not seem to directly influence the GABAergic
system. Possibly, the results reflect the regeneration of the sham animals after the
insult. Decreased [11C]flumazenil binding in PET studies in epileptic patients or
autoradiography can correlate with neurodegeneration (Lamusuo et al., 2000, Burdette
et al., 1995) but does not have to, as seen with [18C]flumazenil in a rat model five
weeks after kainate (Vivash et al., 2014). Increases in GABAA receptor subunit
expression were shown in the dentate gyrus in the mouse kainate model (four weeks
after kainate injection under isoflurane anaesthesia), but not in CA1 or CA3
(Stamboulian-Platel et al., 2016). That our results differed from these findings could be
due to the anaesthetic used during SE induction or based on the relatively small size
of the dentate gyrus as a subregion in the whole hippocampal VOI. Concerning
[18F]GE-180 uptake, at the timepoint seven days, an elevated expression of TSPO was
only visible in the SE+KD group in the dorsal hippocampus, whereas the inflammation-
associated signal was not seen in the two other groups. After two weeks, the situation
changed: the SE+SD group had an increased uptake in the region of the former kainate
injection, being ipsilaterally higher than that of the Sham controls. Simultaneously, the
tracer signal of the SE+KD group decreased again in some brain regions (ventral right
hippocampus, right striatum and left thalamus). TSPO-signal is mainly associated with
microglial activation and macrophage immigration as described for animal models of
epileptogenesis (Brackhan et al., 2016), multiple sclerosis (Airas et al., 2015), stroke
5 Manuskripte
146
(Boutin et al., 2015), acute LPS-induced CNS inflammation (Dickens et al., 2014) and
Alzheimer disease (Brendel et al., 2016). TSPO was linked to pro-inflammatory
microglial activation as increases in [11C]PBR28 uptake correlated with rises in serum
levels of IL-1ß and IL-6 in baboons following LPS administration (Hannestad et al.,
2012). Analyzing microglial polarization, TSPO was colocalized to CD86 in a multiple
staining, but interestingly also to CD206-microglia close to Aß-positive plaques, but not
to afar CD206-positive microglia in an AD mouse model (Liu et al., 2015). Microglial
activation does not depend on TSPO as TSPO knock-out mice also have activated
microglia (Banati et al., 2014). TSPO PET signal is also caused by astrocytes
overexpressing TSPO (Lavisse et al., 2012). Thus, histology at the seven and fourteen
days timepoints would be interesting to see the most probable origin of the TSPO
signal. Since its discovery in 1977 (Braestrup and Squires, 1977) as a benzodiazepine
binding protein in peripheral tissue, TSPO has been linked to cholesterol transport,
steroidogenesis, immunomodulation and cellular respiration (Liu et al., 2014). The
primarily intra-mitochondrial location of TSPO is ensured. It was described as being
localized in the outer mitochondrial membrane (Chen and Guilarte, 2008). Increased
TSPO expression in cerebral injury and inflammation could be caused by production
of reactive oxygen species (ROS), IL-1 or TNF α (Batarseh and Papadopoulos, 2010).
However, there are several observations of a KD increasing mitochondrial biogenesis
in hippocampal tissue (Bough et al., 2006, Lauritzen et al., 2016). Yet, it was shown,
that a KD fed to rats causes transient mild oxidative stress driving the activation of the
Nrf2 pathway und leading finally to a better mitochondrial redox state (Milder et al.,
2010). Thus, it is possible that the increasing amount of mitochondria in combination
with the mild production of ROS caused the TSPO signal in the KD group on day seven.
The only in the dorsal right hippocampus significant TSPO signal would therefore be
the result of the exacerbation of the mild oxidative stress by the aftermath of the
intrahippocampal microinjection. In this regard, a [18F]GE-180-PET-Scan of healthy
mice being fed KD would be interesting. TSPO does not seem to be indispensable for
mitochondrial function, but in case of metabolic challenges like during inflammation, it
becomes relevant (Gut et al., 2015), perhaps even with a direct influence on energy
metabolism (Gut et al., 2013). As glial activation and the activated state is highly
5 Manuskripte
147
energy-consuming, TSPO shifts from a low baseline to an upregulated expression.
Concerning the time course of increased TSPO detectability after kainate injection, a
study with [3H]Ro5-4864 binding in homogenized rat striatal tissue (kainate was
injected in this target region) found an incline in tracer binding already two days after
kainate injection, becoming maximal after one week and remaining on a plateau for at
least six weeks after the brain insult (Schoemaker et al., 1982). This severe increase
in TSPO might have been measured due to a pre-selection of rats concerning
behavioral response. General anti-inflammatory effects of a KD were seen in
lipopolysaccharide-induced cerebral inflammation in rats (Dupuis et al., 2015) with less
IL1ß in hippocampus and less IL1ß and TNFα in blood four hours after LPS injection
in comparison with controls. In contrast to our study, the diet had been started two
weeks before the insult, whereas in our study, the KD needed first time until onset of
efficacy.
Blood ß-hydroxybutyrate concentration was elevated latest on day 14 after starting the
diet. To evaluate the efficacy of a KD treatment, the resulting synthesis of ketone
bodies is often taken account of. Nevertheless, there is evidence that ketosis does not
matter for efficacy of a KD (Dhamija et al., 2013). Representing the ketone body
synthesis during a KD, blood ß-hydroxybutyrate concentration is usually quantified in
animal studies: One report about KD in male Swiss mice (Zarnowska et al., 2016)
mentions higher blood ß-hydroxybutyrate levels than in our study (2.3 ± 0.3 mM/ml).
Mice also showed hypoglycemia. A study in male EL mice also describes an enormous
variation of blood ß-hydroxybutyrate levels resulting from a KD fed ad libitum
(Todorova et al., 2000). At most of the measurement time points in our mice, blood
glucose levels were not influenced by the KD. Both working groups fasted the mice
before initiating the KD. Fasting at the diet initiation in combination with a calorie-
restricted feeding also led to higher blood ß-hydroxybutyrate levels than ad libitum
administration (Bough et al., 2000). Required pentylenetetrazole doses to evoke
seizures were significantly elevated in restrictively KD fed mice compared to
restrictively SD fed, whereas this difference was not seen between both ad libitum
groups. Today, it is usual to start a KD with a non-fasting protocol (Schoeler and Cross,
2016). There is evidence for a better efficacy in patients after three months of diet if it
5 Manuskripte
148
was initiated at full calories, even if the development of ketosis is minimally retarded
(Bansal et al., 2014). Extra fasting was avoided in our study because mice had to adapt
to the new diet. One study concluded that the efficacy of a KD does not depend on the
blood ketone concentration, but on the diet itself with its ketogenic ratio (Bough et al.,
1999).
Conclusion
As observed by electroencephalographic monitoring and the repeated Irwin screen
during the course of epileptogenesis, there is evidence for disease-modifying effects
of an intermittent KD. If there are more effective ways of designing the diet or if there
is a more effective time period for dietary treatment remains to be determined.
Conflict of interest
The authors declare no conflicts of interest.
Acknowledgements
This study was funded by the European Union Seventh’s Framework Programme
(FP7/2007-2013) under grant agreement n°602102 (EPITARGET). Ina Leiter was
supported by a scholarship from the Konrad-Adenauer-Stiftung e.V.. We are grateful
to Silvia Eilert, Petra Felsch and Alexander Kanwischer for their skillful assistance.
5 Manuskripte
149
Table 1
Score Body
position
Tail
elevation
Spatial
loco-
motion
Transfer
arousal
Stereo-
typed
behavior
Startle Curiosity
behavior
Touch
escape and
elevating at
tail
0 flattened no tone none
none
- no reaction
no reaction
no escape /
freezing
1 partially
flattened
slight tone
slow hypo-active
yes barely noticed
only head
movement
slow escape
2 typical horizontal normal
active none
immediate
moderate
freezing
whole body
movement,
whisker-
contact
moderate
escape
3 rearing 45° rapid
hyper-active - immediate
strong
freezing,
jumping,
strong escape
nose-contact run escape
4 rigid posture 90° extremely
rapid
- - -
aggressive Strong
escape,
towards the
hand
5 - retrograde - - - - - -
Table 1: Scoring system used for the Irwin Screen.
5 Manuskripte
150
Figures
Figure 1 Experimental Design
Figure 1: Experimental Design. Epileptogenesis after kainate-induced status epilepticus (SE) with or
without a four-week ketogenic diet (dashed grey line) was longitudinally assessed. [18F]GE180 PET
scans were performed at baseline and seven and 14 days after microinjection. [18F]FDG PET scans
were performed at baseline and, like [18F]Flumazenil PET scans, 4 and 9-10 weeks post SE. Electrodes
were implanted at 11 weeks post SE for EEG and video monitoring. A modified Irwin Screen was
performed at the day before each PET scan as well as in the 13th week, when an open field test was
also done.
5 Manuskripte
151
Figure 2
Figure 2: Consumption of ketogenic diet (A) Daily diet intake. (B) Body weight development. # =
SE+SD vs. SE+KD, ° = SE+KD vs. Sham, one-way ANOVA + Tukey's test. (C) Blood ß-hydroxybutyrate
levels. * = one-way ANOVA + Dunnett‘s test vs. baseline (BL), # = Student‘s t-test, SE+SD vs. SE+KD.
(D) Blood glucose levels. # = SE+SD vs. SE+KD, Student‘s t-test. SE = status epilepticus, KD =
ketogenic diet, SD = standard diet, Sham = sham-operated.
5 Manuskripte
152
Figure 3
Figure 3: [18F]GE180 uptake. Results for left (contra) and right (ipsi) sides of (A) dorsal and (B) ventral
hippocampus, (C) cortex, (D) striatum, (E) thalamus, and (F) amygdala are shown for the scan
timepoints BL (baseline), seven and 14 days after microinjection. [18F]GE180 uptake was increased in
ipsilateral dorsal hippocampus seven days post status epilepticus in mice fed a ketogenic diet (A), but
not on day 14, in contrast to mice fed a standard diet. A decrease in [18F]GE180 uptake values between
both timepoints during KD feeding was observed in ventral hippocampus, striatum and thalamus. * =
ipsilateral vs. BL, one-way ANOVA + Dunnett's test, ° = SE+SD/SD+KD/Sham ipsilateral, one-way
ANOVA + Dunnett's test, # = contra- vs. ipsilateral, one-way ANOVA + Sidak's test, ∆ = one-way ANOVA
(ipsilateral) + Sidak's test. SE = status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard diet, Sham =
sham-operated.
5 Manuskripte
153
Figure 4
Figure 4: [18F]FDG uptake. Results for left (contra) and right (ipsi) sides of (A) dorsal and (B) ventral
hippocampus, (C) cortex, (D) striatum, (E) thalamus, and (F) amygdala are shown for the scan
timepoints BL (baseline), four and 10 weeks after microinjection. In week four, mice fed with ketogenic
diet differ from mice fed with standard diet, but not from baseline measurements. * = one-way ANOVA
+ Dunnett's test vs. BL, # = one-way ANOVA + Sidak'stest, SE+SD vs. SE+KD, ° = one-way ANOVA +
Sidak's test, Sham vs. SE+KD. SE = status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard diet, Sham
= sham-operated.
5 Manuskripte
154
Figure 5
Figure 5: Ki values of the [18F]FDG-2-compartiment model. Results for left (contra) and right (ipsi)
sides of (A) dorsal and (B) ventral hippocampus, (C) cortex, (D) striatum, (E) thalamus, and (F) amygdala
are shown for the scan timepoints BL (baseline), four and 10 weeks after microinjection. Ki values were
neither influenced by epileptogenesis or sham operation, nor by ketogenic diet feeding. * = one-way
ANOVA + Dunnett's test vs. BL, # = one-way ANOVA + Sidak'stest, SE+SD vs. SE+KD, ° = one-way
ANOVA + Sidak's test, Sham vs. SE+KD. SE = status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard
diet, Sham = sham-operated.
5 Manuskripte
155
Figure 6
Figure 6: MRGlu values of the [18F]FDG-2-compartiment model. Results for left (contra) and right (ipsi)
sides of (A) dorsal and (B) ventral hippocampus, (C) cortex, (D) striatum, (E) thalamus, and (F) amygdala
are shown for the scan timepoints BL (baseline), four and 10 weeks after microinjection. MRGlu values
of baseline measurement were maintained in mice fed a ketogenic diet. * = one-way ANOVA + Dunnett's
test vs. BL, # = one-way ANOVA + Sidak'stest, SE+SD vs. SE+KD, ° = one-way ANOVA + Sidak's test,
Sham vs. SE+KD. SE = status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard diet, Sham = sham-
operated.
5 Manuskripte
156
Figure 7 ActiMot
Figure 7: Open field test (ActiMot). Results for each parameter are shown for sham-operated mice
(grey), mice fed a standard diet (red) and mice fed a ketogenic diet (green). No differences were
observed concerning the travelled distance, the velocity, the activity, the time spent at margin and in
center, the visits in center, the time spent active and hyperactive, and the number of rearings. KD =
ketogenic diet, SD = standard diet.
S h a m S E + S D S E + K D
0
5 0
1 0 0
1 5 0
D is ta n c e t ra v e lle d
Dis
tan
ce
[m
]
S h a m S E + S D S E + K D
0
1 0
2 0
3 0
4 0
V e lo c ity
[cm
/s]
S h a m S E + S D S E + K D
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
T im e s p e n t a c t iv e
[s]
S h a m S E + S D S E + K D
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
A c tiv ity
[%
]
S h a m S E + S D S E + K D
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
T im e s p e n t a t m a rg in
[s]
S h a m S E + S D S E + K D
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
T im e s p e n t in c e n te r
[s]
S h a m S E + S D S E + K D
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
V is its in c e n te r
Nu
mb
er
S h a m S E + S D S E + K D
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
R e a r in g s
Nu
mb
er
S h a m S E + S D S E + K D
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
T im e s p e n t h y p e r a c t iv e
[s]
5 Manuskripte
157
Figure 8 Irwin Screen
Figure 8: Irwin Screen: results of single parameters. The analyzed parameters speed, activity, startle
response, finger approach, touch escape and elevating at tail are shown for the timepoints baseline
(BL), one, two, four, 10 and 12 weeks after induction of status epilepticus (SE) or sham-operation. ° =
Kruskal-Wallis ANOVA + Dunn's test, SE+KD vs. Sham, * = Kruskal Wallis ANOVA + Dunn's test vs.
BL. SE = status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard diet, Sham = sham-operated.
A c tiv ity
0
1
2
3
T im e p o in t
Sc
ore
B L 2 4 10 1 2 w k s p o s t S E1
S ta r t le re s p o n s
0
1
2
3
T im e p o in t
Sc
ore
B L 2 4 10 1 2 w k s p o s t S E1
*
F in g e r a p p ro a c h
0
1
2
3
4
T im e p o in t
Sc
ore
B L 2 4 10 1 2 w k s p o s t S E1
T o u c h e s c a p e
0
1
2
3
T im e p o in t
Sc
ore
B L 2 4 10 1 2 w k s p o s t S E1
E le v a tin g a t ta il
0
1
2
3
T im e p o in t
Sc
ore
B L 2 4 10 1 2 w k s p o s t S E1
S p e e d
0
1
2
3
T im e p o in t
Sc
ore
B L 2 4 10 1 2 w k s p o s t S E1
*
B a s e lin e
S h a m
S E + S D
S E + K D
5 Manuskripte
158
Figure 9 Irwin Screen
Figure 9: Irwin Screen: total sum score. Sum score was calculated from the scores of the parameters
speed, activity, startle response, finger approach, touch escape and elevating at tail. The sum score
was higher in mice fed a standard diet during epileptogenesis than in sham-operated mice. * = Kruskal-
Wallis ANOVA + Dunn's test vs. BL, ∆ = Kruskal-Wallis ANOVA + Dunn's test, SE+SD vs. Sham. SE =
status epilepticus, KD = ketogenic diet, SD = standard diet, Sham = sham-operated.
0
1
2
3
4
T o ta l S u m S c o r e
T im e p o in t
To
tal
Su
m S
co
re
B L 2 4 10 1 2 -1 4 w k s p o s t S E1
*
B a s e lin e
S h a m
S E + S D
S E + K D
5 Manuskripte
159
Figure 10
Figure 10: Results of the EEG analysis. (A) Less mice showed HVSW (high voltage sharp waves) in
the group fed a ketogenic diet (KD) than in the group fed a standard diet (SD) after induction of status
epilepticus. (B) Less mice showed ME+HPD (mixed events and hippocampal paroxysmal discharges)
in the group fed a ketogenic diet (KD) than in the group fed a standard diet (SD). (C) The number of
mice showing SRS (spontaneous recurrent seizures) did not differ significantly between both groups.
Only SRS shown during the EEG monitoring period were included in statistical analysis. (D) Mice fed a
ketogenic diet after status epilepticus (SE+KD) showed less HVSW, ME, and ME+HPD per hour than
mice fed a standard diet after status epilepticus (SE+SD). (E) SE+KD mice had seizure-like events of
shorter duration than SE+SD mice. (F) SE+KD mice showed a shorter cumulative duration of seizure-
like events per hour in EEG than SE+SD mice (not concerning HPD). (A-C) Barnard‘s test, (D-F) Mann-
Whitney U-Test. # = SE+SD vs. SE+KD.
0
1 0
2 0
3 0
E v e n ts p e r h o u r
S L E ty p e
Ev
en
t fr
eq
ue
nc
y [
1/h
]
H V S W M E H P D
S E + S D
S E + K D
M E + H P D All
##
#
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
C u m u la tiv e e v e n t d u ra t io n
S L E ty p e
Du
ra
tio
n [
s]
H V S W M E H P D M E + H P D All
## #
#
0
2 0
4 0
6 0
E v e n t d u ra t io n p e r h o u r
Du
ra
tio
n [
s]
S L E ty p e
H V S W M E H P D M E + H P D All
## # #
#
S D K D
0
5
1 0
1 5
Nu
mb
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ice
H V S W n o H V S W
*
S D K D
0
5
1 0
1 5
D ie t
Nu
mb
er o
f m
ice
M E + H P D n o M E + H P D
*
S D K D
0
5
1 0
1 5
D ie t
Nu
mb
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f m
ice
S R S n o S R S
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6 Diskussion
169
6 Diskussion
6.1 Reflexion zur Methodik der Arbeit
Kleintierbildgebung mit PET – Auflösungsvermögen und Translationalität
Die Kleintierbildgebung mit PET bietet die Möglichkeit, Stoffwechselgeschehen in vivo
zu untersuchen. Im Hinblick auf die Epilepsieforschung bietet das die Möglichkeit, die
komplette Epileptogenese und die chronische Phase longitudinal in einem Tier zu
untersuchen, was einen enormen Vorteil gegenüber Studien mit histologischen,
immunhistochemischen oder autoradiographischen Untersuchungen darstellt. Dies ist
im Sinne des Tierschutzes (3R-Konzept), da weniger Versuchstiere benötigt werden
(Bankstahl und Bankstahl, 2012). Als Aufnahmeprotokolle sind statische Akquisitionen
mit Injektion des Radiotracers vor Beginn des eigentlichen PET-Scans möglich oder
dynamische mit gleichzeitiger Injektion des Radiotracers zum Start des PET-Scans.
Letzteres bietet die Möglichkeit, ein kinetisches Modeling der erhaltenen PET-Daten
durchzuführen, um Aussagen über die Kinetik des Tracers im Tierkörper treffen zu
können. Das Auflösungsvermögen des in dieser Arbeit verwendeten PET-Scanners,
ein Siemens Inveon PET-CT, liegt bei 1,4 mm FWHM für die PET-Komponente und
bei 40 µm für die CT-Komponente, die die CT-Bilder für die Koregistrierung der PET-
Daten liefert. Bei diesen Größenordnungen gestalten sich Untersuchungen in Ratten
weniger herausfordernd als in Mäusen, wobei letztere dennoch unersetzlich sind, auch
im Hinblick auf mögliche Speziesunterschiede. Der Aspekt der Translationalität dieser
Methodik liegt auf der Hand: Allgemein können Radiotracer nach der präklinischen
Evaluierung weiter klinisch getestet werden und bereits zugelassene Radiotracer
können präklinisch für weitere Anwendungsgebiete getestet werden. In Bezug auf die
vorliegende Arbeit wurde zum Beispiel das klinisch für Anwendung in der
prächirurgischen Evaluierung bei Epilepsie etablierte [18F]FDG (Capraz et al., 2015)
zur Untersuchung der Epileptogenese und ihrer Beeinflussung durch die beiden
Therapieansätze 2-DG und ketogene Diät untersucht.
6 Diskussion
170
Tiermodelle
Als Modell zur Imitation einer Epileptogenese wurde in der ersten Studie das korneale
Kindlingmodell der Maus gewählt. Eine zugrundeliegende Stimulusfrequenz von sechs
Hertz wurde verwendet, weil sie als tierschonend (Leclercq et al., 2014) und bezüglich
der Effektivität der zuvor verwendeten Stimulusfrequenz von 50 Hertz (Matagne et al.,
2008, Matagne und Klitgaard, 1998, Potschka und Löscher, 1999, Willis et al., 2010,
Rowley und White, 2010) als ebenbürtig beschrieben wurde. Die hiesigen
Untersuchungen bestätigen dies. Die im Mittel schon recht stark ausgeprägte
Anfallsantwort auf den ersten Kindlingstimulus sowie die schnelle Kindling-
Progression in unserer Studie erschweren allerdings die Interpretation der Ergebnisse.
Ersteres wurde möglicherweise durch den anderen Herkunftsort der männlichen
NMRI-Mäuse als in der Erstbeschreibung des Modells verursacht (Charles River
Deutschland anstatt Charles River Frankreich). Die schnelle Kindlingprogression wie
auch das Ergebnis stehen im Einklang mit dem schon beschriebenen Kindlingverlauf
und der verminderten Wirksamkeit von Antiepileptika in diesem Tiermodell (Leclercq
et al., 2014). Die Versuche wurden in dieser Erwartung, die Wirkung von 2-DG in einem
Modell für pharmakoresistente Epilepsie zu untersuchen, durchgeführt. Außerdem
wird das korneale Kindling als ein Modell betrachtet, das die Charakteristika humaner
partieller Epilepsie mit einem ähnlichen pharmakologischen Profil gut wiederspiegelt
(Rowley und White, 2010).
Neben dem kornealen Kindlingmodell wurde in dieser Arbeit das
intrahippokampale Kainat-Modell der Maus für Temporallappenepilepsie verwendet.
Dieses zeichnet sich sowohl durch einen auch im Patienten vorkommenden Epilepsie
auslösenden Gehirninsult, den Status epilepticus, als auch durch pathohistologische
Parallelen zur Temporallappenepilepsie im Patienten aus (Duveau et al., 2016,
Houser, 1990). Hingegen wurde im kornealen Kindlingmodell bisher (wie auch durch
die vorliegenden Daten bestätigt) keinerlei Neurodegeneration beschrieben (Loewen
et al., 2016). Das intrahippokampale Kainatmodell wie auch das korneale
Kindlingmodell sind Modelle für pharmakoresistente Epilepsie (Klein et al., 2015a,
Klein et al., 2015b). Die elektroenzephalographischen Muster der im
intrahippokampalen Kainatmodell auftretenden spontanen rekurrierenden Anfälle und
6 Diskussion
171
anfallsähnlicher Ereignisse sind den durch Tiefenelektroden im Patienten messbaren
Entladungen ähnlich (Stamboulian-Platel et al., 2016).
Behandlungszeiträume während der Epileptogenese
Im kornealen Kindlingmodell wurde während der Kindling-Progression behandelt, also
während der imitierten Epileptogenese. Der erste Behandlungszeitpunkt wurde
festgelegt auf 18 – 20 Stunden vor der ersten PET-Untersuchung, um auch den
Baseline-Scan in dem definierten Abstand zu einer vorherigen Behandlung
durchzuführen und Effekte einer einmaligen Gabe von 2-DG auf den
Glukosestoffwechsel zu untersuchen. Die Tiere wurden nach dieser Untersuchung
zusammen am Abend desselben Tages zum ersten Mal korneal stimuliert.
Infolgedessen lag zwischen Behandlung und Kindlingstimulus eine Zeitspanne von
über 24 Stunden. Zur Pharmakokinetik von 2-DG gibt es wenige Studien. Im Menschen
wird eine Halbwertszeit zur Elimination von etwa fünf Stunden beschrieben, bei einer
Dosis von 60mg/kg und einer maximalen Plasmakonzentration nach einer Stunde
(Gounder et al., 2012, Raez et al., 2013), ohne Akkumulation. Bei Ratten wird ein
biphasischer Abfall der 2-DG-Konzentration im Blut gezeigt (Umegae et al., 1990).
Nach intravenöser Injektion von 100 mg/kg liegt die Serumkonzentration von 2-DG
nach fünf Stunden nur noch bei 0,2 µmol/ml Serum (kurz nach Injektion wurden 1,5
µmol/ml gemessen). Aufgrund dieser Daten und weiteren experimentellen
Dosierungen anderer Studien mit und ohne Effekt (siehe Abschnitt „Dosierung und
Verabreichungswege von 2-DG und ketogener Diät“) kann man auch trotz möglicher
Speziesunterschiede annehmen, dass hiermit kein direkter Einfluss auf den ersten
Kindlingstimulus erfolgte. Der Abstand zwischen Behandlung und PET-Untersuchung
beziehungsweise Kindlingstimulation wurde auch bei den folgenden zwei Zeitpunkten
beibehalten. Bei den übrigen Stimulationen erfolgte die Behandlung der Tiere bewusst
genau eine Minute nach jeder Einzelstimulation, da ein direkter antikonvulsiver Effekt
möglichst ausgeschlossen werden sollte.
Im intrahippokampalen Kainatmodell wurde die Behandlung in Form der
ketogenen Diät direkt im Anschluss an die Induktion des Status epilepticus begonnen.
Der Behandlungsbeginn wurde auch deshalb so gewählt, weil er im Patienten in dieser
6 Diskussion
172
Art durchführbar wäre. In diesem Modell wird für den nicht konvulsiven Status
epilepticus eine Länge von mehreren Stunden angegeben, eine Studie nennt bis zu
fünf Stunden (Bouilleret et al., 1999), eine andere etwa 18 Stunden (Twele et al.,
2016b). Diese Dauer wurde in der vorliegenden Arbeit nicht gesondert durch
elektroenzephalographische Überwachung geprüft. Die Tiere benötigten meist über
eine Stunde, um aus der Chloralhydrat-Narkose nach der Kainat-Mikroinjektion wieder
zu erwachen. Bis zur ersten, sehr kurzen Futteraufnahme mit wenigen Bissen
(ketogene Diät beziehungsweise Standarddiät in Brei- und Pellettform) vergingen
zumeist weitere Stunden. Die Aufnahme an ketogener Diät lag am ersten
Fütterungstag durchschnittlich bei 1,8 g pro Tier (das Fressen fand nachts statt,
tagsüber waren nur minimale Zahnspuren am Futter erkennbar) und nicht bei 3,4 g wie
in den folgenden Tagen, nachdem sich die Tiere an das Futter gewöhnt hatten.
Zugleich gab es keine signifikanten Unterschiede im Gewichtsverlust zwischen den
unterschiedlichen Tiergruppen, der auf die Operation folgte. Also lässt sich davon
ausgehen, dass eine direkte Beeinflussung des Gehirninsultes durch die ketogene Diät
minimal ist. Der Behandlungszeitraum von vier Wochen wurde festgelegt auf Grund
der bestehenden Daten zum intrahippokampalen Kainat-Modell. Es wird allgemein
davon ausgegangen, dass spontane rekurrierende Anfälle im Falle einer
anschließenden Epileptogenese nach dieser Zeit zuverlässig auftreten und somit die
Epileptogenese weitestgehend fortgeschritten ist (Riban et al., 2002, Kralic et al., 2005,
Maroso et al., 2011). Eine bestehende Epilepsie zu behandeln, war nicht Ziel der
Arbeit.
Dosierung und Verabreichungswege von 2-Desoxy-D-Glukose und ketogener Diät
Zur Dosisfindung für die Verabreichung von 2-DG wurden andere Studien
herangezogen. Es gibt mehrere Publikationen, in denen 2-DG bei der Ratte während
des Kindlings über den Tractus perforans eingesetzt wurde (Stafstrom et al., 2009,
Garriga-Canut et al., 2006, Sutula und Franzoso, 2008). Hier wurden akut
antikonvulsive Wirkungen mit einer Dosis von 250 mg/kg gesehen. Andere Studien in
weiteren Tiermodellen, auch in der Maus, legen ebenfalls diese Dosierung nahe. Es
wurden antikonvulsive Effekte gefunden in Fring’s Mäusen und im 6 Hz-Modell bei der
6 Diskussion
173
Maus (Stafstrom et al., 2009, Gasior et al., 2010), im Maus-Pilocarpinmodell (Yang et
al., 2013) und im Pilocarpinmodell in Ratten und bei Pentylentetrazol-Injektion in
Ratten (Lian et al., 2007). Laut diesen Studien scheint eine zweimal tägliche Gabe von
2-DG angebracht zu sein. Es traten jeweils keine besonderen unerwünschten
Wirkungen bei Anwendung dieser Dosierung in den Tieren auf. Im Hinblick auf eine
mögliche Übertragbarkeit auf den Menschen lässt sich eine Dosis-Eskalationsstudie
nennen, die eine oral verabreichte Dosis von bis zu 250 mg/kg als sicher eingestuft
hat (Singh et al., 2005).
EEG- und Video-Monitoring
Das intrahippokampale Kainatmodell wurde bezüglich des Vorkommens spontaner
rekurrierender Anfälle und den elektroenzephalographisch nachweisbaren
anfallsähnlichen Entladungen mit Subtypenunterscheidung bisher recht gut
charakterisiert und bietet somit mit der Ableitung eines Elektroenzephalogramms eine
gute Möglichkeit, Effekte einer zu untersuchenden Therapiestrategie nicht nur im
Hinblick auf klinisch sichtbare Anfälle, sondern auch auf abnorme elektrische
Entladungen auszuwerten. Bei den chronisch auftretenden elektroenzephalographisch
sichtbaren anfallsähnlichen Entladungen (Bouilleret et al., 1999) wurde in der
vorliegenden Arbeit zwischen High Voltage Sharp Waves (HVSW), Mixed Events (ME)
und Hippocampal Paroxysmal Discharges (HPD) unterschieden, wie anderweitig
schon beschrieben (Heinrich et al., 2011, Riban et al., 2002, Arabadzisz et al., 2005,
Maroso et al., 2011, Twele et al., 2016a). Die in der Veröffentlichung von Twele et al.
beschriebenen Unterscheidungskriterien der Ereignistypen wurden verwendet. Ein
Vorteil dieser strikten Kriterien zur Beschreibung der Ereignisse und damit zur
Auswertung eines Elektroenzephalogramms liegt in der weitgehenden Objektivierung
des manuellen Analysevorganges. Nachteilig ist allerdings eine hohe Zeitintensivität
der Auswertung nach dieser Methodik. Daher wurden für diese Arbeit pro Tier und
Aufnahme-Tag jeweils vier zuvor zeitlich festgelegte, gleichmäßig über den Tag
verteilte, Stunden der EEG-Aufnahme detailliert analysiert. Das gesamte EEG-
Material (bis auf die für die Tiere notwendigen Unterbrechungen von etwa zwei Tagen
über jeweils zwei bis drei Tage ununterbrochen aufgenommen) wurde mit dem Ziel der
6 Diskussion
174
Erfassung und Klassifizierung der sekundären generalisierenden Anfälle gesichtet. Zur
Anfallsklassifizierung auf der Grundlage der ursprünglichen Beschreibung von R. J.
Racine (Racine, 1972) ist die parallele Video-Überwachung der Tiere unerlässlich.
Automatisierte EEG-Auswertungsverfahren, die abstrahierte Merkmale wie
beispielsweise die Signallinienlänge nach Wavelet-Zerlegung (Bergstrom et al., 2013)
oder Kontinuierliche Wavelet-Transformation in Kombination mit einer adaptierten
Mother Wavelet (Tieng et al., 2016) nutzen, erkennen zuverlässig Abnormalitäten im
EEG, klassifizieren diese aber nicht. Es kommt dabei leicht zu falsch-positiven oder
falsch-negativen Ergebnissen. Bei der Auswertung der Daten für das dritte Manuskript
wurde Wert daraufgelegt, den Zugang zu allen analysierbaren Informationen über
potentielle Auswirkungen der ketogenen Diät und der Epileptogenese auf einzelne
Muster im EEG wie die untersuchten High Voltage Sharp Waves, Mixed Events und
Hippocampal Paroxysmal Discharges nicht zu verlieren.
6.2 Glukose-Stoffwechsel-Veränderungen während der Epileptogenese
6.2.1 [18F]FDG-PET-Daten aus zwei Tiermodellen
Untersuchungen mit [18F]FDG-PET im kornealen Kindlingmodell wurden bisher nicht
publiziert. Die Untersuchungen zum kornealen Kindlingmodell, beschrieben im ersten
Manuskript, zeigen, dass in den [18F]FDG-PET-Daten keine Anhaltspunkte für eine
Beeinflussung des interiktalen Glukosestoffwechsels durch die Epileptogenese
vorhanden sind. Weder die Quantifizierung des Tracer-Uptake, noch die beiden
Parameter MRGlu und Ki aus dem [18F]FDG-2-Tissue Compartiment Model führen im
Laufe der drei PET-Untersuchungszeitpunkte zu veränderten Werten. Diese Befunde
passen zu einer Autoradiographie-Studie mit [14C]2-DG in einem Rattenmodell für ein
schnelles Kindling innerhalb weniger Stunden (Lothman et al., 1985), bei der interiktal
der Glukosemetabolismus nicht erkennbar verändert war, wohl aber iktal. Vollständig
über die Amygdala gekindelte Ratten zeigten ebenfalls interiktal keine Unterschiede
im Glukosemetabolismus verglichen mit Tieren, die nur eine Elektrode implantiert
hatten (Blackwood et al., 1981), was darauf hindeutet, dass die Anfälle selbst
entscheidend für Veränderungen sind. Daten aus konventionellen Kindlingmodellen
6 Diskussion
175
sind allerdings nur bedingt mit dem kornealen Kindling vergleichbar, unter anderem da
in letzterem die Fluoro-Jade-Färbung keinerlei neuronale Schädigung offenbarte
(siehe erstes Manuskript) und da im kornealen Kindling keine implantierten Elektroden
vorhanden sind, wodurch es nicht invasiv ist. Im Patienten mit
Temporallappenepilepsie zeigt sich dagegen mit der [18F]FDG-PET bei fast 20 % der
Kinder und bei bis zu 50 % der Erwachsenen mit kürzlich begonnenem Anfallsauftreten
ein Hypometabolismus (Stefan und Theodore, 2012), wohingegen subklinische Anfälle
oder interiktale Spikes mit einem Hypermetabolismus assoziiert sind.
Im intrahippokampalen Kainatmodell (siehe drittes Manuskript) hingegen fand
sich in der chronischen Phase der Epilepsie ein globaler Hypometabolismus, der auch
schon nach vier Wochen zugegen war, also einem Zeitpunkt, an dem in diesem Modell
spontane rekurrierende Anfälle auftreten (Twele et al., 2016b). Somit liegen beide
Untersuchungszeitpunkte bereits hinter der eigentlichen Epileptogenese, wobei auch
das größte Ausmaß neuronaler Schädigung bereits einen Monat nach der
Kainatinjektion zu erwarten ist (Bouilleret et al., 1999). Die MRGlu-Werte (Glucose
Metabolic Rate) sind hier dem Tracer-Uptake-Verhalten entsprechend verändert,
wohingegen die Ki-Werte (Influx-Konstante) weitestgehend unverändert bleiben. Die
Formeln zur Berechnung beider Parameter enthalten zwar die drei
Transportkonstanten (K1 und k2 für den Transport aus dem Blut in das Gewebe bzw.
zurück und k3 für die Phosphorylierung von [18F]FDG), in die Berechnung von MRGlu
fließen aber noch zusätzlich die arterielle Plasmakonzentration und eine weitere
Konstante, die sogenannte Lumped Constant (LC) zur Beschreibung der Unterschiede
zwischen [18F]FDG und Glukose ein (Alf et al., 2013). In der statistischen
Untersuchung der Glukosekonzentrationen im Blut waren signifikante Unterschiede
zwischen den Gruppen oder den Zeitpunkten nicht erkennbar, außer einer höheren
Blutglukosekonzentration zwei Wochen nach der Mikroinjektion in der Gruppe mit
ketogener Diät im Vergleich zur Standarddiät. Dennoch werden diese Ergebnisse für
die MRGlu erhalten, da jede Glukosemessung als Faktor in die Formel einfließt, der
durch dieselbe LC dividiert wird (Alf et al., 2013). Nach diesem kinetischen Modell
scheint also der Glukosetransport weitgehend unverändert. In der Literatur findet sich
eine autoradiographische Untersuchung mit [14C]2-DG im intrahippokampalen
6 Diskussion
176
Kainatmodell, die hypermetabole Veränderungen ipsilateral im Hippokampus (nicht
kontralateral) beschreibt, beginnend während des Status epilepticus bis zu 30 Tagen
danach (Bouilleret et al., 1999). Nach 120 Tagen fanden sich hippokampale fokale
hypo- oder hypermetabolische Veränderungen unabhängig von der Läsionsgröße und
ein Hypermetabolismus in den thalamischen Kernen. Zum Zeitpunkt 30 Tage nach
Kainatinjektion war der Glukosestoffwechsel, gemessen durch die [14C]2-DG-Technik
zur Berechnung des lokalen zerebralen Glukoseverbrauchs (LCMRglc), im
ipsiliateralen entorhinalen Cortex und partiell im Thalamus vermindert, was sich
chronisch nach 120 Tagen auch bilateral auf die zentrale Amygdala ausdehnte
(Bouilleret et al., 2000). Zwar wurde in der vorliegenden Arbeit dieselbe Kainatdosis
verwendet wie bei diesen Autoren, nicht aber Swiss Albino-Mäuse. Dies könnte
zusammen mit der Beobachtung, dass in diesem Mausstamm keine anfallsfreie
Latenzzeit auftrat, was beim Kainatmodell mit männlichen NMRI-Mäusen aber der Fall
ist (Twele et al., 2016b), die etwas abweichenden Ergebnisse bezüglich der
Ausdehnung der hypometabolischen Areale erklären. Diese war deutlich begrenzter
als in unseren Ergebnissen aus der [18F]FDG-PET-Studie. Auch die andere Anästhesie
während der Kainatinjektion wäre eine mögliche Erklärung. Allerdings könnte man
auch die Hypothese aufstellen, das [18F]FDG Veränderungen im Glukosestoffwechsel
sensibler erfasst als [14C]-2-DG, da eine Arbeitsgruppe für [18F]FDG in vitro eine
deutlich bessere Glykolyseinhibition beobachtete als für 2-DG (Lampidis et al., 2006).
Eine präoperative [18F]FDG-PET-Studie in Patienten mit mesialer
Temporallappenepilepsie fand zumeist einen Hypometabolismus im mesialen und
lateralen Temporallappen, wie auch im Thalamus, in einzelnen Patienten auch weiter
ausgedehnt (Henry et al., 1994).
Nicht in die drei Manuskripte eingeschlossene Daten aus einem Versuch im
intrahippokampalen Kainatmodell mit multiplen [18F]FDG-PET-Untersuchungen
zeigen chronisch zum Zeitpunkt sieben Wochen keinen Hypometabolismus, sondern
in einzelnen Regionen wie dem ventralen Hippokampus sogar einen
Hypermetabolismus (siehe Anhang). Allerdings wurde chronisch in der schon oben
erwähnten Studie nach 120 Tagen auch teilweise ein Hypermetabolismus gesehen
(Bouilleret et al., 2000). Eine mögliche Erklärung für dieses abweichende Ergebnis
6 Diskussion
177
innerhalb der Untersuchungen zu dieser Dissertationsarbeit stellt die Art der Narkose
während der Induktion des Status epilepticus dar, die in den vorbereitenden
Untersuchungen mit Isofluran anstatt Chloralhydrat durchgeführt wurde. Während die
Chloralhydratnarkose deutlich über das Ende der Operation hinaus wirkte, waren die
Tiere nach der Isoflurannarkose schnell wiedererwacht. Es ist beobachtet worden,
dass der Status epilepticus mit Isoflurannarkose schwerer ausfällt und es zu einer
verkürzten Latenzzeit kommen kann (Twele et al., 2016b). Inwiefern dies sich auf die
chronische Phase der Epilepsie im Vergleich zum Chloralhydrat-Einsatz auswirkt, ist
noch offen. Im Hinblick auf das intrahippokampale Kainatmodell lässt sich
offensichtlich nicht von Ergebnissen in Ratten auf mögliche Ergebnisse in Mäusen
extrapolieren, da Studien zeigen konnten, dass Isofluran Ratten vor einer
Epileptogenese nach Kainatinjektion bewahren kann (Bar-Klein et al., 2016, Klee et
al., 2017) und sich bei Ratten andere elektroenzephalographische Muster sowie
Anfallsfrequenzen finden (Klee et al., 2017).
6.2.2 Befunde zum Kontext der Epileptogenese
Die Untersuchungen im Pilocarpin-Modell zur neurovaskulären Einheit (zweites
Manuskript) zeigen in den MRT-Ergebnissen mit Gadolinium-DTPA eine erhöhte
Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zwei Tage und in geringerem Maße vier und
10 Tage nach Status epilepticus. Das für die Untersuchungen in vivo verwendete MRT-
Protokoll zeigte sich zuvor im Vergleich mit [68Ga]DTPA-PET und [99mTc]DTPA-SPECT
vorteilhaft (Breuer et al., 2016), weshalb es hier eingesetzt wurde.
Kontrastmittelverstärkte MRT zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranke wurde auch in
einer anderen Studie in Ratten, allerdings mit systemischer Kainatgabe, eingesetzt
(van Vliet et al., 2016). Hier zeigte sich schon einen Tag nach Status epilepticus eine
erhöhte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke in Bereichen des Cortex und
Temporallappens, die zum Teil auch noch nach sechs Wochen durch eine ähnlich
starke Kontrastmittelextravasation sichtbar war. Dieser chronische Befund könnte
durch das Tiermodell verursacht sein, der akute Befund weist in dieselbe Richtung wie
bei unseren Daten im Pilocarpinmodell.
6 Diskussion
178
Immunhistochemisch wurde eine FITC-Albumin-Extravasation schon fünf Stunden
nach dem Gehirninsult gefunden, mit einer maximalen Ausprägung nach 24 Stunden,
die nach 48 Stunden wieder weniger stark vorhanden war. Diese Befunde scheinen
nur im Zusammenhang mit der Entwicklung eines Status epilepticus vorzukommen
und daher nicht durch Pilocarpin an sich verursacht zu sein, da keines der Tiere ohne
Status epilepticus eine FITC-Albumin-Extravasation zeigte. Pilocarpin selbst zeigt
systemisch eine proinflammatorische Wirkung, es führt zu einer erhöhten
Konzentration an IL-1ß und einer Verminderung des Verhältnisses von CD4- zu CD8-
T-Zellen (Marchi et al., 2007b). Die beobachtete Durchlässigkeit der Blut-Hirn-
Schranke nach zwei und zehn Tagen entspricht den Ergebnissen einer Studie mit IgG-
Anfärbung im Pilocarpinmodell (Ndode-Ekane et al., 2010) und einer mit Evans Blue
und Albumin in einem elektrisch induzierten Modell für Status epileptus in Ratten (van
Vliet et al., 2007). Die histologische Untersuchung verdeutlicht, dass ein negatives
MRT-Ergebnis nach einem Gehirninsult eine geringgradige Störung der Blut-Hirn-
Schranke nicht ausschließt.
Ödematöse Veränderungen waren in den entsprechenden Gehirnregionen
ebenfalls an Tag zwei in der T2-gewichteten Sequenz sichtbar, die an Tag vier wieder
abnahmen und schließlich an Tag 10 nicht mehr nachweisbar waren. Dieser
Zeitverlauf ähnelt den Befunden zur gesteigerten Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke
aus den kontrastmittelverstärkten T1-gewichteten MRT-Untersuchungen, wobei die
Veränderungen schon früher wieder abklingen. Ein ähnlicher Verlauf von ödematösen
Veränderungen wurde von Roch et al. (2002a) gefunden. Unsere Ergebnisse
entsprechen auch einer weiteren Studie im Pilocarpinmodell, die ebenso an Tag zwei
das Maximum der Veränderungen in T1- und T2-gewichteten MRT-Aufnahmen fand
(Choy et al., 2010), wobei die Höhe dieser Veränderungen am zweiten Tag mit der
späteren Hippokampus-Volumenänderung in Zusammenhang stand. Dies wurde auch
von Duffy et al. (2014) bestätigt. Klinische Daten von Kindern nach Status epilepticus
(Scott et al., 2002) bzw. langen fokalen Fieberanfällen (VanLandingham et al., 1998)
zeigen ebenfalls diesen Zeitverlauf für Ödembildung.
In der anschließenden erweiterten histologischen Untersuchung zeigten FITC-
Albumin-positive Areale im Thalamus einen Anstieg an Kollagen IV-Expression als
6 Diskussion
179
Marker für Basalmembranen, die teilweise im Zusammenhang mit STL-gefärbten
Endothelzellen standen. Sonst war das Muster der STL-Immunreaktivität sehr
gleichmäßig. In den vom Status epilepticus betroffenen Regionen war die STL-
Färbung entweder unverändert oder verringert, während Laminin, ein Marker für die
vaskuläre Basalmembran des Endothels, auch vermindert zu sein schien. Da die
Menge an Kollagen IV anstieg, sprechen diese Veränderungen für einen wieder
stabilisierenden Umbau der neurovaskulären Einheit zwei Tage nach Status
epilepticus. Kollagen IV hat stabilisierende Eigenschaften für die Blut-Hirn-Schranke
(Dyrna et al., 2013) und wurde auch in einem Modell für Schlaganfall als vermehrt
exprimiert beschrieben (Hawkes et al., 2013). Aquaporin 4 als Marker für astrozytäre
Endfüßchen war in Arealen mit intrazellulärer FITC-Albumin-Aufnahme reduziert,
ebenso GFAP als Marker für intermediäre Filamente in Astrozyten. Dies spricht für
eine geschwächte Vermittlung von Astrozyten zwischen Endothelzellen und
Neuronen. In den Arealen mit FITC-Albumin-Aufnahme waren vereinzelt sowohl
aktivierte Microglia, als auch T-Zellen mit intrazellulärer FITC-Aufnahme nachweisbar.
FITC-Albumin zeigte keine Kolokalisation mit den drei astrozytären Markern GFAP,
S100ß und Aquaporin 4. In einer anderen Studie mit Ratten nach elektrisch
induziertem Status epilepticus konnte Albumin dagegen immunhistochemisch auch in
Astrozyten nachgewiesen werden (van Vliet et al., 2007). In einer weiteren Studie mit
direkter Albumin-Exposition von Gehirnschnitten in vitro konnte auch Albumin-
Aufnahme in Astrozyten gezeigt werden (Ivens et al., 2007), ebenso nach Exposition
gegenüber mit Alexa 488 markiertem bovinen Serumalbumin (Bar-Klein et al., 2014).
Allerdings fand auch eine Studie keine nachweisbare Aufnahme von FITC-Albumin in
GFAP-positiven Astrozyten, wohl aber eine gesteigerte IL-1ß-Produktion derer
(Frigerio et al., 2012). Methodische Ursachen wie das verwendete Tier- oder In-vitro-
Modell oder die Art der Albuminmarkierung wären denkbar. Für die intrazelluläre
Aufnahme von Albumin nach Schädigung der Blut-Hirn-Schranke in Neuronen scheint
eine beeinträchtigte Umgebung wichtig zu sein, da im Gegensatz zu einer
Untersuchung mit osmotischer Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke und
resultierender akuter Anfallsaktivität im Schwein (Marchi et al., 2007a) Studien mit
direkter FITC-Albumin-Exposition von kortikalem Gewebeschnitten aus naiven Ratten
6 Diskussion
180
oder mit Infusion von Albumin in den lateralen Ventrikel in naiven Mäusen über 72
Stunden keine Aufnahme von Albumin in Neuronen zeigte (Ivens et al., 2007,
Weissberg et al., 2015).
Eine Neurodegeneration war bei den Untersuchungen zur Blut-Hirn-Schranke
nach 24 Stunden zunächst in der Amygdala und im piriformen wie im entorhinalen
Cortex zu sehen, wobei Pyramidenzellen in der CA3c und Interneuronen des Hilus
nach 48 Stunden signifikant verringert waren. FITC-Albumin-positive Zellen mit
deutlicher neuronaler Morphologie waren nur zu einem geringen Anteil zugleich NeuN-
positiv. Ein Verlust der NeuN-Immunreaktivität zeigt nicht zwingend eine zerstörte
Kernmembran an, wie im Falle einer Studie nach einem ischämischen Gehirninsult
beschrieben (Ünal-Cevik et al., 2004), wobei aber von verletzten Neuronen
ausgegangen werden kann. Zellen mit neuronaler Morphologie und FITC-Albumin-
Aufnahme zeigten stellenweise eine Kolokalisation mit Laminin. Diese Kolokalisation
von Neuronen mit der Basalmembran der Blut-Hirn-Schranke lässt sich als Folge der
beschädigten Morphologie der neurovaskulären Einheit infolge von
Neurodegeneration interpretieren. Die Daten zeigen, dass auf eine Schädigung der
Blut-Hirn-Schranke schon früh nach einem Gehirninsult die Degeneration der
neurovaskulären Einheit folgt. Diese Vorgänge sind nach aktuellem Wissenstand
wichtige auslösende Faktoren für eine Epileptogenese. So wurde in der Studie von
van Vliet et al. (2007) gezeigt, dass die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke mit der
Anfallsfrequenz korreliert, wobei eine Öffnung der Blut-Hirn-Schranke mit Mannitol
selbst Anfälle hervorrufen kann. Ein möglicher Mechanismus hierfür wurde
beschrieben (Ivens et al., 2007): eine über TGF-ß-Rezeptoren vermittelte Aufnahme
von Albumin in Astrozyten induziert eine Herabregulierung von Kalium-Kanälen (Kir
4.1), wodurch extrazelluläres Kalium aktivitätsabhängig nicht mehr genügend gepuffert
werden kann und eine N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor-vermittelte neuronale
Hyperexzitabilität folgt. Eine weitere Untersuchung derselben Arbeitsgruppe zeigte
auch, das Albumin über die Bindung an TGF-ß-Rezeptoren diese Wirkung hat
(Cacheaux et al., 2009). Den Ergebnissen von Frigerio et al. (2012) zufolge scheint
eine intrazelluläre Aufnahme von Albumin nicht nötig für die Aktivierung der TGF-ß-
Signalkette mit folgenden Effekten auf die Kaliumkanäle. Die Aktivierung der TGF-ß-
6 Diskussion
181
Signalkette in Astrozyten führt außerdem zur exzitatorischen Synaptogenese, nicht zur
inhibitorischen (Weissberg et al., 2015). Eine gesteigerte neuronale Erregung bzw.
Anfallsgeschehen verbraucht verstärkt Glukose, was sich in einem iktal sichtbaren
Hypermetabolismus zeigt (Lothman und Collins, 1981). Dieser korreliert im Fall eines
Status epilepticus im Lithium-Pilocarpinmodell mit einer neuronalen Schädigung
(Fernandes et al., 1999). Die in der Immunhistochemie im Pilocarpinmodell gefundene
verminderte Kolokalisation von Markern für Astrozyten mit Arealen mit FITC-Albumin-
Extravasation könnte auch bedeuten, dass die Energieversorgung der Neuronen oder
auch das Recycling von Glutamat über das Astrozyten-Neuronen-Laktat-Shuttle (siehe
Abschnitt 2.2.3) beeinträchtigt sind.
Im kornealen Kindlingmodell (siehe erstes Manuskript) wurde in dieser Arbeit
keine Neurodegeneration gefunden, was im Hinblick auf die nur provoziert
auftretenden und kurzen Anfälle mit einer (klinischen) Dauer von meist deutlich unter
einer Minute zu erklären sein könnte. In der klinischen Praxis wird entsprechend einem
Konsensus der Task Force der Internationalen Liga gegen Epilepsie davon
ausgegangen, dass ab einer Anfallsdauer von fünf Minuten ein zu behandelnder
prolongierter Anfall vorliegt, der irreversible neuronale Schädigungen nach sich ziehen
könnte (Trinka et al., 2015). Im intrahippokampalen Kainatmodell (siehe drittes
Manuskript) steht die histologische Untersuchung der Gehirne noch aus. Allerdings ist
beschrieben, dass im intrahippokampalen Kainat-Modell wie im Patienten eine
Neurodegeneration im ipsilateralen Hippokampus (Hilus des Gyrus dentatus, CA 1,
CA 3c), mit Verlust von Pyramidenzellen und Interneuronen, als Hippokampussklerose
bezeichnet, stattfindet (Suzuki et al., 1995, Bouilleret et al., 1999, Le Duigou et al.,
2005). Ebenso kommt es zu einer Dispersion von Körnerzellen (Heinrich et al., 2006)
und zum Sprießen von Moosfaser-Axonen im Gyrus dentatus (Bouilleret et al., 1999);
ipsilateral kommt es zu einer Astrozytenproliferation, wobei die Astrozyten
hauptsächlich zwischen den Körnerzellen liegen. Histopathologisch wird im
kontralateralen Hippokampus kein Unterschied zu einem mit einer Mikroinjektion von
physiologischer Kochsalz-Lösung behandelten Hippokampus festgestellt, bis auf das
mögliche Vorkommen von Moosfaserwachstum (Bouilleret et al., 1999), wobei eine
6 Diskussion
182
vorrübergehende Astrozyten- und Microgliaaktivierung ohne Neurodegeneration auch
kontralateral gefunden wurde (Pernot et al., 2011).
Eine Astrozytenaktivierung findet sich auch im kornealen Kindlingmodell mit
dem Stimulusparameter von 50 Hertz (Loewen et al., 2016), allerdings nicht begleitet
von einer Microgliaaktivierung, die in dem in dieser Dissertationsarbeit verwendeten
kornealen Kindling mit einer Stimulusfrequenz von sechs Hertz gefunden wurde. Für
dieses hinsichtlich der Astrozytenaktivierung und der fehlenden Neurodegeneration
pathohistologisch ähnlich erscheinende Kindling wurde bisher unseres Wissens nach
keine diese Eigenschaften beschreibende histologische Untersuchung publiziert. Für
eine Untersuchung von Folgen einer Blut-Hirn-Schranken-Störung sind sowohl das
Pilocarpin- als auch das Kainat-Modell geeignet. Eine Arbeit im Kainatmodell in
Mäusen zeigt eine verstärkte Angiogenese an Tag drei und fünf nach Status
epilepticus (Zhai et al., 2016). Dies wird auf einen gesteigerten Ablauf des Jagged1-
Signalweges in Astrozyten ab einem Tag nach Status epilepticus zurückgeführt, der
den Notch1-Pfad in Endothelzellen induziert. Allerdings wurde für das Pilocarpinmodell
zwei Tage nach Status epilepticus eine verminderte hippokampale Blutgefäßdichte mit
Anfärbung des Endothelial Barrier Antigen und des Rat Endothelial Cell Antigen 1
gemessen (Ndode-Ekane et al., 2010), was zu unseren Befunden bezüglich der
Ödembildung an Tag zwei und der verringerten STL- und Lamininimmunreaktivität
passt, die auf eine Zerstörung der Integrität von Blutgefäßen hindeuten. Die
verminderte Blutgefäßdichte erholte sich nach zwei Wochen wieder bis hin zu oder
über die Ausgangwerte hinaus, wobei die Zahl proliferierender Endothelzellen an Tag
vier nach Status epilepticus schon maximal war (Ndode-Ekane et al., 2010). Ebenfalls
im Pilocarpinmodell in Ratten wurde gezeigt, dass Astrozyten bald nach dem Status
epilepticus progressiv VEGF überexprimieren (Rigau et al., 2007), wobei VEGF
(Vascular Endothelial Growth Factor) mit dem Notch-Pfad in Verbindung steht (Liu et
al., 2003). In Gewebe aus dem Anfallsherd von Patienten mit Temporallappenepilepsie
wurde auch eine verstärkte VEGF-Expression gefunden, zusammen mit einer
erhöhten Dichte an Blutgefäßen (Rigau et al., 2007). Es stellt sich die Frage, ob dies
als eine Adaptation auf das Anfallsgeschehen hin geschieht, da ein erhöhter zerebraler
Blutfluss und Metabolismus iktal im Menschen (Fernandez et al., 2015, Ergun et al.,
6 Diskussion
183
2016, da Silva et al., 1997), wie auch in Tiermodellen beschrieben ist (Cornford et al.,
2000, Cremer et al., 1983, Makino et al., 1988). VEGF bewirkt allerdings durch seine
Hypoxie- oder Inflammations-bedingte Induktion über den VEGF-Rezeptor 2 von
Endothelzellen die Proteolyse der Basalmembran, Endothelzellproliferation und
Unterbrechung der Tight Junctions (Morin-Brureau et al., 2012). Als Randnotiz ist im
Zusammenhang mit Beobachtungen von Blutgefäßen zu sagen, dass wir mit bloßer
Betrachtung der indirekten Anfärbung der Blutgefäße durch die Glukosetransporter-1-
Färbung (in der Blut-Hirn-Schranke) im kornealen Kindlingmodell keine
Veränderungen in der Erscheinung der Gefäße zwischen naiven und vollständig
gekindelten Tieren finden konnten. Dies steht im Einklang mit den vorherigen
Ausführungen.
Der Status epilepticus im Pilocarpinmodell führt schon innerhalb weniger
Stunden zu einer Aktivierung von Microglia und Astrozyten mit folgender Interleukin
1ß-Expression (Ravizza et al., 2008), das in der benannten Studie als Marker für
Inflammation verwendet und als sehr stark exprimiert im Bereich der astrozytären
Endfüßchen in Arealen mit FITC-Albumin-Extravasation vorgefunden wurde. Das
Ausmaß des Entzündungsgeschehens wurde in dieser Arbeit für die Untersuchung der
Blut-Hirn-Schranke im Pilocarpinmodell nicht quantitativ oder im Verlauf erfasst.
Deutlich wurde allerdings, dass unterschiedlichste Zelltypen beteiligt waren.
Die Untersuchung von entzündlichen Vorgängen im Verlauf der Latenzphase in
Form von [18F]GE-180-PET-Untersuchungen war Teil der Untersuchungen im
intrahippokampalen Kainatmodell (siehe drittes Manuskript). Die [18F]GE-180-PET
zeigt die Ausprägung der TSPO-Expression an, wobei das Signal hauptsächlich mit
der Aktivierung von Microglia (Airas et al., 2015, Boutin et al., 2015, Brendel et al.,
2016, Dedeurwaerdere et al., 2012) bzw. Makrophagen (Benavides et al., 1990)
assoziiert ist, aber in geringerem Ausmaß auch mit Astrozytenaktivierung (Lavisse et
al., 2012), siehe auch Absatz 2.3.3. Die [18F]GE-180-PET zeigte im
intrahippokampalen Kainatmodell einen Anstieg des Tracer-Uptake im ipsilateralen
dorsalen Hippocampus an Tag 14 nach Status epilepticus, mit einem deutlichen
Unterschied auch gegenüber den Werten in der Sham-Gruppe. Im Vergleich mit einer
Arbeit mit subkutaner Kainatinjektion zeigt sich, dass dort mit [18F]PBR111-PET die
6 Diskussion
184
verstärkte TSPO-Expression erwartungsgemäß deutlich ausgedehnter in mehreren
Gehirnregionen zu finden war (Amhaoul et al., 2015). Allerdings ist der zeitliche Verlauf
ähnlich der vorliegenden Arbeit mit einem Maximum 14 Tage nach Status epilepticus.
Die Ergebnisse der [18F]PBR111-PET nach zwei und vier Wochen zur TSPO-
Expression korrelierten des Weiteren mit den Ergebnissen von chronisch
durchgeführten Tests zu Komorbiditäten, zudem konnte eine
Hauptkomponentenanalyse der PET-Daten aus der zweiten, nicht aber der vierten
Woche den Bereich der Häufigkeit der chronisch gezeigten spontanen Anfälle
vorhersagen (Bertoglio et al., 2017). Dies spricht ebenfalls dafür, dass dieses
Maximum der gezeigten Entzündung relevant für den späteren Krankheitsverlauf ist.
Die Ergebnisse aus dem Irwin-Test in unserer Studie konnten zu diesem Zeitpunkt
einen deutlichen Unterschied zwischen den Tieren nach Status epilepticus mit
Standarddiät im Vergleich zu den Sham-Tieren und auch den Tieren mit ketogener
Diät nach Status epilepticus ausmachen. Im Pilocarpinmodell in Ratten konnte schon
ab fünf bis sieben Tagen eine deutlich erhöhte TSPO-Expression mit PET dargestellt
werden, die in schwächerer Ausprägung auch noch drei Wochen später vorhanden
war (Yankam Njiwa et al., 2016a, Brackhan et al., 2016). In der Arbeit von Brackhan
et al. zeigte interessanterweise die autoradiographische Untersuchung mit [18F]GE-
180 nach 14 Tagen die stärkste Tracerbindung. Sowohl die Ergebnisse aus der
[18F]GE-180-Autoradiographie als auch die der [11C]PK11195-PET korrelierten gut mit
der histologisch nachgewiesenen Aktivierung von Microglia und Astrozyten. In beiden
Arbeiten wurde auch ein kinetisches Modeling durchgeführt, das mit den Parametern
Volume of Distribution und Binding Potential plausible und dem Tracer-Uptake
ähnliche Ergebnisse lieferte. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Modelle
(Simplified Reference Tissue Model und Two Tissue Compartment Model) für ein
kinetisches Modeling getestet, die jedoch keine ausreichend validen Daten erbrachten
(Daten daher nicht gezeigt). Es zeigte sich als schwierig, eine gute Input-Funktion aus
den Bilddaten von der Vena cava caudalis oder der Arteria carotis zu entnehmen, was
vermutlich an der geringen Tiergröße und dem Partial Volume Effect, wie auch den
Tracer-Eigenschaften liegt. Hier sind Studien in Ratten im Vorteil, da sowohl die
Blutgefäßstrukturen größer sind, als auch die Tracerapplikation zügig vonstattengehen
6 Diskussion
185
kann, da auch ein relativ kleinerer Anteil von Lösungsmitteln wie Ethanol in der
Tracerlösung besser vertragen wird. Allerdings führt die Quantifizierung des [18F]GE-
180-Uptake in Mäusen zu zuverlässigen Ergebnissen, wie oben im Vergleich mit der
Literatur dargestellt.
Mit dem Gedanken, dass [18F]Flumazenil-PET auch einen Anfallsherd im
Patienten (Vivash et al., 2013) als Areal verringerter Tracerbindung darstellen kann,
und eine ketogene Diät die Expression von α1-Untereinheiten des GABAA-Rezeptors
beeinflussen kann (Lauritzen et al., 2016), wurde dieser Tracer ebenfalls in die Studie
im intrahippokampalen Kainatmodell integriert. Zur Auswertung der PET-Daten wurde
in unserer Untersuchung als Referenzregion für das Simplified Reference Tissue
Model der Hirnstamm genutzt. Für [3H]Flumazenil wurde in Mäusen gezeigt, dass etwa
fünf Minuten nach intravenöser Injektion der maximale Tracer-Uptake in
Gehirnregionen erscheint, der über die weitere Zeit hinweg wieder deutlich abnimmt
(Sakiyama et al., 2006). In Ratten wurde für Flumazenil eine Eliminationshalbwertszeit
von etwa acht Minuten nach intravenöser Gabe ermittelt (Mandema et al., 1991). Für
das Modeling wurden in einer anderen Studie in Mäusen mit [18F]Flumazenil-PET Teile
der Stammhirn-Region verwendet (Müller Herde et al., 2017), wobei von allen
untersuchten Gehirnregionen die Traceraufnahme im Stammhirn am geringsten war.
Unsere Daten konnten zum Zeitpunkt neun Wochen nach Status epilepticus ein
vermindertes Binding Potential BPnd im rechten Striatum und ventralen linken
Hippokampus verglichen mit Sham-Tieren ausmachen. Hier könnte man noch eine
Baseline-Untersuchung anschließen oder auch die Referenzregion wie bei der Studie
von Müller Herde et al. weiter eingrenzen bzw. voxelweise die beiden Zeitpunkte vier
und neun Wochen und die Gruppen untereinander vergleichen, um nicht über die
Definition größerer Regionen kleinere Unterschiede zu übersehen. In Bezug auf den
zerebralen Energiestoffwechsel ist zu sagen, dass mit der bisherigen Auswertung
keine Auswirkungen auf das Tracerverhalten durch die ketogene Diät eindeutig
festzustellen waren, wenngleich auch nicht die gleichen Unterschiede zu dem der
Sham-Gruppe bestanden.
6 Diskussion
186
6.3 Glukose-Stoffwechsel-Veränderungen als therapeutisches Target
6.3.1 Effekte von 2-Desoxy-D-Glukose und ketogener Diät auf den zerebralen
Glukose-Stoffwechsel
Ein Ziel der Arbeit war die Untersuchung von zwei den Energiestoffwechsel
beeinflussenden Therapie-Ansätzen hinsichtlich ihrer Wirkung auf den
Glukosemetabolismus, auch im Vergleich. Zwar wird die 2-DG oft im Zusammenhang
mit dem Thema der ketogenen Diät genannt, hat jedoch andere Wirkmechanismen
(siehe Abschnitte 2.2.5.2 und 2.2.5.3). 2-DG verursachte in den Untersuchungen im
kornealen Kindlingmodell (siehe erstes Manuskript) bei der Behandlung gesunder
Tiere an Tag 17 eine Verringerung des [18F]FDG-Uptake in Thalamus, Cortex, Striatum
und Amygdala. Zugleich stiegen im Two-Tissue Compartiment Model die Ki (Influx-
Konstante) und die MRGlu (Metabolic Rate) an. Einen [18F]FDG-Uptake-steigernden
Effekt durch die 2-DG-Behandlung konnte man während der Epileptgenese nur an Tag
10 des Kindlings für den Thalamus und das Cerebellum beobachten, wobei an diesem
Zeitpunkt der [18F]FDG-Uptake oft signifikant höher war als der der Tiere ohne
Epileptogenese. An Tag 17 gab es diesen Unterschied nur noch in der Amygdala und
im Striatum. Wenn man die offensichtlich größte Wirkung von 2-DG auf den
Glukosestoffwechsel an Tag 17 in gesunden Mäusen betrachtet, stellt sich die Frage,
weshalb an Tag 10 dieser gegenteilige den Tracer-Uptake steigernde Effekt zu sehen
ist. Im Verlauf dieser Zeit wandelt sich das gesunde Gehirn hin zu einem gekindelten
Zustand. Zugleich wird 2-DG von metabolisch aktiven Zellen aufgenommen (Masino,
2016), also den Zellen in für die Anfallsaktivität verantwortlichen Arealen und
Schaltkreisen. Wichtig für den Kindlingprozess ist eine strukturelle und synaptische
Plastizität, die von TrkB (Tyrosine Receptor Kinase B) abhängig zu sein scheint (He et
al., 2004, Kotloski und McNamara, 2010). Dieser wird durch das Neurotrophin BDNF
(Brain-Derived Neurotrophic Factor) aktiviert, dessen mRNA nach limbischen Anfällen
vermehrt exprimiert wird (Isackson et al., 1991) und die vermehrt auch in
Hippokampusgewebe von Patienten mit pharmakoresistenter
Temporallappenepilepsie gefunden wird (Murray et al., 2000). Es konnte gezeigt
werden, dass 2-DG die anfallsinduzierte vermehrte Expression von BDNF und TrkB
vermindern kann, was über die Wirkung von weniger vorhandenem NADH aus der
6 Diskussion
187
Glykolyse auf die Aktivität des Transkriptionsrepressors NRSF und seinen NADH-
sensitiven Ko-Repressor CtBP geschieht (Garriga-Canut et al., 2006). Eine durch die
neuronale Aktivität gesteigerte Glykolyse würde zu höherer NADH-Verfügbarkeit
führen, die die Dissoziation des Ko-Repressors von NRSF ermöglicht, wodurch die
Transkriptionsrepression von BDNF und TrkB vermindert wird (Huang und McNamara,
2006). Auch die beschriebene Steigerung der Expression der KATP-
Kanaluntereinheiten Kir6.1 und Kir6.2 durch 2-DG wäre ein möglicher Mechanismus
für eine anfallsunterdückende Wirkung von 2-DG, wenn eine Hemmung der Glykolyse
vor allen in den aktiven Neuronen zu weniger ATP in Membrannähe führen und somit
die Öffnung der KATP-Kanäle verursachen würde (Yang et al., 2013). Eine gesteigerte
Nachfrage nach Glukose durch metabolisch aktive Zellen, die zugleich vermehrt in
ihrer Glykolyse inhibiert werden, würde eine Steigerung des Tracer-Uptakes erklären,
ebenso die Ergebnisse zur Influx-Konstante und der Metabolic Rate. Auf die Ki war die
Wirkung von 2-DG während der Epileptogenese ähnlich wie im gesunden Tier, wobei
ein Anstieg der Werte auch schon an Tag 10 gefunden werden konnte. Gleichzeitig
bestand an Tag 10 wieder eine deutliche Differenz zwischen beiden 2-DG-Gruppen.
Das Kindling scheint in Bezug auf Ki die Wirkung der 2-DG zu verstärken. Die MRGlu
wurde durch die 2-DG während der Epileptogenese kaum beeinflusst, nur im Vergleich
mit der Vehikel-Kindling-Gruppe zeigten sich an Tag 17 höhere MRGlu-Werte. Passend
zu der genannten Theorie zur Verstärkung der Wirkung von 2-DG durch das Kindling,
das zu einem erhöhten Glukosebedarf metabolisch aktiver Zellen führt, war an Tag 10
und 17 in der gekindelten und 2-DG-behandelten Gruppe die Blutglukosekonzentration
im Vergleich zum Anfang verringert, bei der nur mit 2-DG behandelten Gruppe erst an
Tag 17. Um den gesteigerten Glukosetransport weiter zu erklären, haben wir
immunhistochemisch den Glukosetransporter 1 als den für den Glukosetransport über
die Blut-Hirn-Schranke verantwortlichen Glukosetransporter untersucht, allerdings
ohne Unterschiede in den Färbeintensitäten zwischen den Gruppen oder im Vergleich
mit naiven Tieren zu festzustellen. Eine chronische Hypoglykämie kann die Expression
von 55-kDa GLUT1, welcher in der Blut-Hirn-Schranke vorkommt, beeinflussen
(Simpson et al., 1999), wobei die Expression von 45-kDa GLUT1, der in Astrozyten
und Oligodendrozyten, aber nicht in Microglia vorkommt (Yu und Ding, 1998) und der
6 Diskussion
188
neuronale 45-kDa GLUT3 unverändert bleibt. Allerdings fand eine andere Studie einen
geringen, aber signifikanten Anstieg von GLUT3 (Uehara et al., 1997). Aber auch eine
höhere intrinsische Aktivität von Glukosetransportern könnte für eine Steigerung des
Glukosetransportes im Zusammenhang mit Anfällen ursächlich sein (Cornford et al.,
2000).
Hinsichtlich der Wirkung der ketogenen Diät auf den Glukosestoffwechsel
konnten wir in einer Gruppe von 10 gesunden Tieren feststellen, dass der [18F]FDG-
Uptake am 35. Tag der Fütterung in Hippokampus, Thalamus und Cerebellum erhöht
war und an Tag 49 auch noch im Thalamus. Gleichzeitig war keine Veränderung der
Blutglukosekonzentration messbar. Hier wurde im Unterschied zur Studie im
intrahippokampalen Kainatmodell (siehe drittes Manuskript) die Blut-ß-
Hydroxybutyratkonzentration nicht gemessen. Die Metabolic Rate war im
Hippokampus am 35. Tag erhöht und ebenso im gesamten Gehirn, wenn es als eine
große Region of Interest betrachtet wurde, während die Influx-Konstante über die Zeit
hinweg unverändert blieb. Eine Studie in Ratten konnte schon nach zwei Wochen der
Fütterung ketogener Diät mit einer milden Ketonämie einen Anstieg des [18F]FDG-
Uptake erkennen, ebenso eine erhöhte Konzentration von Monocarboxylattransporter
1 (MCT1), der unter anderem für den Transport von Ketonkörpern über die Blut-Hirn-
Schranke verantwortlich ist (Pifferi et al., 2011). Die Expression von GLUT1 war
unverändert. Im intrahippokampalen Kainatmodell (siehe drittes Manuskript) wurde der
Glukosestoffwechsel in dieser Arbeit nach vier Wochen, also zu einem Zeitpunkt
untersucht, an dem das Auftreten spontaner Anfälle zu erwarten ist, und nach zehn
Wochen und damit in der chronischen Phase der Epilepsie in diesem Modell (Twele et
al., 2016b). Die ketogene Diät wirkte während ihrer Verabreichung der Entwicklung der
schon beschriebenen Verminderung des Glukosestoffwechsels durch die
Epileptogenese entgegen, da keine Veränderung des [18F]FDG-Uptake zu erkennen
war, wohl aber ein Unterschied zu der Standarddiät-Gruppe nach Status epilepticus
und auch zu den Sham-Tieren. In der chronischen Phase der Epilepsie, also über fünf
Wochen nach Beendigung der Diät, konnte dieser Effekt für den [18F]FDG-Uptake nicht
mehr beobachtet werden. Allerdings war bezüglich der Metabolic Rate nach wie vor
kein signifikanter Unterschied zwischen Ausgangsniveau und den Werten der zehnten
6 Diskussion
189
Woche erkennbar. Passend zu den Ergebnissen für die Influx-Konstante aus unseren
Voruntersuchungen in den gesunden Tieren hatte die ketogene Diät auch in
epileptischen Tieren keinen Einfluss auf diese. Die ketogene Diät führte wiederum
nicht zu Veränderungen in der Blutglukosekonzentration.
6.3.2 Effekte der 2-Desoxy-D-Glukose und der ketogenen Diät auf
Epileptogenese und Inflammation
Sowohl bei dem Einsatz der 2-DG als ein die Glykolyse hemmender Faktor als auch
der ketogenen Diät als eine die Glykolyse umgehende und alternative
Energiesubstrate liefernder Faktor während der Epileptogenese in einem Tiermodell
konnten in dieser Dissertationsarbeit Hinweise auf eine mögliche antiepileptogene
Wirksamkeit gefunden werden. Auf die Beeinflussung des Glukosestoffwechsels
wurde schon eingegangen, noch nicht aber auf die Ergebnisse der Untersuchungen
hinsichtlich inflammatorischer Prozesse: Die 2-DG-Behandlung per se und in
Kombination mit dem Kindling führte zur Aktivierung von Microglia in limbischen
Gehirnregionen. Zugleich konnte sie die Aktivierung von Astrozyten in der CA3a und
dem piriformen Cortex zumindest eingrenzen. In vitro konnte eine zytotxische Wirkung
von 2-DG auf Microglia beobachtet werden (Vilalta und Brown, 2014), in vivo wurden
bei mindestens doppelt so hoher Dosierung wie in der vorliegenden Arbeit
dosisabhängig eine vermehrte Leukozytenzahl in der Milz, eine vermehrte T-
Lymphozytenzahl im Thymus und in vitro eine geringere Proliferation von T-
Lymphozyten als Antwort auf Lipopolysaccharide beschrieben (Dréau et al., 1998).
Somit zeigt die 2-DG Auswirkungen auf das Immunsystem. Auch eine erhöhte
Corticosteron-Konzentration im Blut wurde bei hohen Dosierungen von 2-DG
festgestellt (Dréau et al., 2000). In dieser Dissertationsarbeit stellt sich die Frage, ob
der aktivierte Zustand von Microglia in diesem Fall auch anti-inflammatorischer Natur
sein könnte, da es Microglia eher pro- und eher anti-inflammatorischer Aktivität gibt.
Die ketogene Diät führte interessanterweise zunächst zu einer gesteigerten Aufnahme
von [18F]GE-180 spezifisch im dorsalen rechten Hippokampus an Tag sieben, wobei
in mehreren Gehirnregionen an Tag 14 wieder eine Verringerung auf das
Augangsniveau gesehen werden konnte. Diesen Effekt können die Ergebnisse der
6 Diskussion
190
Arbeit von Milder et al. (2010) erklären, die einen vorrübergehenden milden oxidativen
Stress in der frühen Phase einer ketogenen Diät zeigen, der durch den Nrf2-Signalweg
(Nuclear Factor) zu einem besseren mitochondrialen Redoxstatus führte. Die Bildung
reaktiver Sauerstoffspezies kann die TSPO-Expression steigern, was mit einer
vermehrten Anzahl von Mitochondrien durch die ketogene Diät (Bough et al., 2006,
Lauritzen et al., 2016) zu einem gesteigerten TSPO-PET-Signal führen würde.
Von allen Ergebnissen zu den beiden Therapieansätzen sind die beobachteten
Auswirkungen auf die sichtbare Epileptogenese im kornealen Kindlingmodell und die
chronische Phase im intrahippokampalen Kainatmodell als eigentliche Hinweise auf
eine antiepileptogene Effektivität am wichtigsten: Die 2-DG-Behandlung führte
während des kornealen Kindlings zu anfangs weniger starken Anfallsantworten,
insgesamt zu weniger Anfälllen von Typ 5 und einer deutlichen Erhöhung der
benötigten Stimulationen, um ein Tier in den vollständig gekindelten Zustand zu
bringen, im Vergleich mit vehikelbehandelten Tieren. Die ketogene Diät führte nach
einem Status epilepticus zu weniger elektroenzephalographisch sichtbaren
anfallsähnlichen Entladungen (High Voltage Sharp Waves und Mixed Events) im
Vergleich mit den Standarddiät-Tieren, obwohl zwischen dem Beginn der EEG-
Ableitung und dem Ende der ketogenen Diät zwei Monate lagen. Dies spricht für einen
Langzeit-Effekt. Des Weiteren war die durchschnittliche Dauer aller gezeigten
elektroenzephalographisch sichtbaren Events kürzer, ebenso ihre kumulative
stündliche Dauer. Zwar unterschied sich nicht die Zahl der klinischen generalisierten
spontanen Anfälle, aber es kann durchaus sein, dass die Überwachungszeit zu kurz
war, um Behandlungsunterschiede valide bestimmen zu können. Eine Untersuchung
im Kainatmodell in Ratten zeigte weniger und kürzere spontane Anfälle, wenn eine
ketogene Diät im Anschluss an die Induktion eines Status epilepticus gefüttert wurde
(Muller-Schwarze et al., 1999). Ein großer Unterschied zu der in dieser
Dissertationsarbeit durchgeführten Studie bestand darin, dass die ketogene Diät über
die komplette Zeit der Anfallsüberwachung gefüttert wurde (acht Wochen), weshalb
antiepileptogene Effekte nicht von antikonvulsiven Effekten zu unterscheiden sind, und
die Anfallsüberwachung nicht nur in der chronischen Phase stattfand.
6 Diskussion
191
Beide Behandlungen zeigten sich als gut verträglich, wobei die 2-DG-
Injektionen per se keinen Einfluss auf die Körpergewichtsentwicklung zeigten. In allen
gekindelten Gruppen waren die Körpergewichte niedriger und zwischen den Gruppen
dabei ähnlich, was man auf den Stress durch die zwei zusätzlichen Fixierungen mit
jeweils Augentropfengabe bzw. Kindlingstimulation oder die Epileptogenese
zurückführen kann. Tiere unter ketogener Diät nahmen schneller zu, wie auch in
Ratten beobachtet wurde (Calderon et al., 2017), wobei sich das Körpergewicht schon
bald nach Absetzen der Diät wieder dem der anderen Tiere anglich. Im
intrahippokampalen Kainatmodell zeigte der Irwin Screen zur Einschätzung von
Unterschieden im Verhalten in der additiven Auswertung der Einzelbeurteilungen, dass
durch die Epileptogenese bedingte auftretende Abweichungen von Ausgangswerten
in der zweiten Woche nicht in der Gruppe mit ketogener Diät zu finden waren. Nach
deutlich längerer Fütterung einer ketogenen Diät in Ratten wurde eine höhere
lokomotorische Aktivität beschrieben (Ziegler et al., 2005), die wir allerdings im
ActiMot-Test nicht finden konnten.
6.4 Schlussfolgerungen und Ausblick
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die [18F]FDG-PET die Untersuchungen der
Behandlungs-assoziierten Veränderungen des zerebralen Glukosestoffwechsels
ermöglichte. Allerdings wurden Veränderungen des zerebralen Glukosestoffwechsels
durch die eigentliche Epileptogenese nicht im kornealen Kindlingmodell, sondern nur
im intrahippokampalen Kainatmodell beobachtet. Eine mögliche zukünftige alleinige
Verwendung von [18F]FDG zur Evaluation des Verlaufes einer Epileptogenese im
Patienten, auch unter Therapie, scheint unwahrscheinlich, da die Tiermodelle wie
vermutlich auch die potentiell epileptogenen Gehirninsulte in den Patienten in den
Ergebnissen variieren und die Einschätzung des Fortschrittes der Epileptogenese nur
bedingt möglich ist. Eine Kombination der bildgebenden Untersuchungen von
Glukosestoffwechsel, Inflammation und Blut-Hirn-Schranken-Integrität stellt hingegen
einen vielversprechenden Ansatz dar.
Beide untersuchten Strategien, die 2-DG wie die ketogene Diät, zeigten Potential zum
Einsatz als antiepileptogene Therapie. Die nächste spannende Frage zur 2-DG ist die
6 Diskussion
192
Rolle und die Art ihrer Wirkung auf Microglia, um die Mechanismen der Wirkung weiter
zu erforschen. Zur ketogenen Diät ist im Hinblick auf diese Arbeit noch die
histologische Auswertung für eine weiter verbesserte Einschätzbarkeit der Ergebnisse
interessant.
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8 Zusammenfassung
228
8 Zusammenfassung
Ina Leiter
Zerebrale Energie-Stoffwechsel-Veränderungen im Kontext der Epileptogenese
und als therapeutisches Target zur Epilepsie-Prävention
Epilepsien, die infolge eines Hirninsults entstehen, machen einen hohen Anteil unter
den verschiedenen Epilepsieformen aus. Bisher gibt es keine epilepsiepräventiven
Therapien, um die durch einen Insult des Gehirns ausgelöste Epileptogenese zu
verhindern oder zu beschränken. Zur Entwicklung epilepsiepräventiver Therapien
müssen die einer Epileptogenese zugrundeliegenden Mechanismen besser
verstanden werden. Veränderungen im zerebralen Energiestoffwechsel scheinen eine
wichtige Rolle bei der Epilepsieentwicklung zu spielen, ebenso auch
Entzündungsgeschehen und Beeinträchtigungen der Blut-Hirn-Schranken-Integrität.
Translationale Bildgebungsverfahren wie die Positronen-Emissionstomographie (PET)
und die Magnetresonanztomographie (MRT), die in vivo eine longitudinale
Untersuchung der Epileptogenese ermöglichen, wurden in dieser Arbeit eingesetzt,
um den zerebralen Glukosestoffwechsel im Kontext mit anderen relevanten Aspekten
der Epileptogenese zu untersuchen. Die PET mit den Tracern [18F]FDG zur
Untersuchung des zerebralen Glukosestoffwechsels und [18F]GE-180 zur Darstellung
von Entzündungsgeschehen (Microgliaaktivierung) wurde während der
Epileptogenese wiederholt angewendet, um den Verlauf hinsichtlich beider Aspekte
und Effekte von Therapieansätzen zugleich in vivo analysieren zu können. Im Rahmen
dieser Untersuchungen wurden die Effekte der beiden in den Energiestoffwechsel
eingreifenden Therapieansätze 2-Desoxy-D-Glukose (2-DG) und ketogene Diät (KD)
im Hinblick auf eine potentielle antiepileptogene Wirkung getestet.
In der ersten Teilstudie wurde der zerebrale Glukosestoffwechsel mit [18F]FDG-
PET während der Epileptogenese und unter Beeinflussung durch eine Behandlung mit
2-DG im kornealen Kindlingmodell in Mäusen untersucht. Ein kinetisches Modeling der
PET-Daten wurde durchgeführt. Die Kindlingprogression war in den mit 2-DG-
8 Zusammenfassung
229
behandelten Tieren in der frühen Phase abgeschwächt und es wurden insgesamt
weniger Anfälle vom höchsten Schweregrad gezeigt. Die [18F]FDG-PET ließ erkennen,
dass die 2-DG-Behandlung während der kindlingvermittelten Epileptogenese die
Glukoseversorgung im Mausgehirn steigert. Das Kindling verursachte eine Aktivierung
von Astrozyten, die durch 2-DG abgeschwächt wurde. Zusammen mit der zugleich
durch 2-DG bewirkten Aktivierung von Microglia könnte dies einen Teil des positiven
Einflusses auf die Epileptogenese ausmachen. Eine veränderte Expression des
Glukosetransporter 1 war in keiner Tiergruppe ersichtlich, ebenso wenig eine
Neurodegeneration. Die 2-DG-Behandlung zeigte damit Hinweise auf antiepileptogene
Eigenschaften im kornealen Kindlingmodell in der Maus. Behandlungseffekte auf den
zerebralen Glukosestoffwechsel konnten während der Kindlingprogression mit der
[18F]FDG-PET nachvollzogen werden.
In der zweiten Teilstudie wurde der Verlauf und die Ausprägung der
Albuminextravasation im Kontext mit der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke in der
frühen Epileptogenese nach einem Status epilepticus (SE) im Pilocarpinmodell in
Ratten mit Immunhistochemie und MRT untersucht. Damit assoziierte und zur frühen
epileptogenen Neuropathologie beitragende Reaktionen der neurovaskulären Einheit
(NVU) wurden immunhistochemisch untersucht. Die Blut-Hirn-Schranken-Integrität
zeigte sich am ersten bis zweiten Tag nach dem SE in epileptogeneseassoziierten
Gehirnregionen am stärksten beeinträchtigt und erholte sich dann, begleitet von einem
zerebralen Ödem, das in einem ähnlichen Zeitverlauf auftrat. Auf dem Höhepunkt der
Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke wurde Albumin mit Teilen der NVU
kolokalisiert, nicht aber mit Astrozyten. Die Immunreaktivität eines Markers für
astrozytäre Endfüßchen war in Arealen mit Albumin-Extravsation reduziert. Anzeichen
für adaptive Reorganisationsvorgänge in Gefäßen waren eine verminderte
Immunreaktivität des Endothels und Veränderungen von Markern für die
Basalmembran. Die frühe Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke und die folgenden
degenerativen Effekte auf die NVU unterstreichen die Notwendigkeit einer sofortigen
therapeutischen Intervention, wenn die Blut-Hirn-Schranken-Integrität im Rahmen
einer potentiellen antiepileptogenen Therapie wiederhergestellt werden soll.
9 Summary
230
In der dritten Teilstudie wurde die Epileptogenese im intrahippokampalen
Kainatmodell in Mäusen während und nach einer vierwöchigen, sich direkt an die
Induktion des SE anschließenden ketogenen Diät untersucht. Dazu wurden mehrfach
[18F]GE-180- und [18F]FDG-PET-Scans durchgeführt. Elf Wochen nach SE wurden
intrahippokampal Elektroden zur folgenden Ableitung eines Elektroenzephalogramms
(EEG) bei gleichzeitiger Videoüberwachung implantiert. Im Gegensatz zu mit
Standarddiät gefütterten Tieren zeigten mit KD gefütterte Tiere zwei Wochen nach SE
keine Entzündung im [18F]GE-180-PET und vier Wochen nach SE einen
unveränderten Glukosestoffwechsel. Erst sechs Wochen nach dem Absetzen der KD
fand sich auch ein Hypometabolismus. Das EEG der Tiere mit KD zeigte weniger und
durchschnittlich kürzere anfallsähnliche elektrische Entladungen als das der Tiere mit
Standarddiät. Dies deutet auf eine mögliche antiepileptogene Wirksamkeit der KD in
diesem Tiermodell mit einem Langzeiteffekt hin.
9 Summary
Ina Leiter
Changes in cerebral energy metabolism in the context of epileptogenesis and
as therapeutic target for epilepsy prevention
Epilepsies induced by a brain insult constitute a significant proportion among the
various forms of epilepsy. Hitherto, there are no epilepsy-preventive therapies
established to suppress or modify epileptogenesis after brain insult. In order to develop
epilepsy-preventive therapies, mechanisms of epileptogenesis need to be better
understood. Changes in cerebral glucose metabolism seem to play a key role in
epileptogenesis, as well as inflammation and blood-brain barrier leakage. Translational
imaging techniques allowing longitudinal studies of epileptogenesis in vivo like positron
9 Summary
231
emission tomography (PET) and magnetic resonance imaging (MRI) were used for the
evaluation of cerebral glucose metabolism in the context of other relevant aspects of
epileptogenesis. PET with the tracers [18F]FDG for imaging cerebral glucose
metabolism and [18F]GE-180 for measuring inflammation was used repeatedly during
epileptogenesis to concurrently analyze the time courses of both aspects and effects
of therapeutic strategies in vivo. Within the scope of these investigations, the effects
of two therapeutic strategies influencing energy metabolism, 2-deoxy-d-glucose (2-
DG) and ketogenic diet (KD), were assessed in view of a potential anti-epileptogenic
efficacy.
The first substudy investigated cerebral glucose metabolism during
epileptogenesis and during 2-DG treatment in the mouse corneal kindling model using
[18F]FDG PET. Kinetic modeling of PET data was performed. Kindling progression was
attenuated in 2-DG treated animals during the early phase and less seizures of the
most severe type occurred. [18F]FDG PET revealed that 2-DG treatment during
kindling-mediated epileptogenesis increases glucose supply in the mouse brain.
Kindling induced astroglial activation, which was alleviated by 2-DG. Together with the
simultaneous induction of microglial activation by 2-DG, this could contribute to the
positive interference with epileptogenesis. Altered expression of glucose transporter 1
was not seen in any group, as well as any sign of neurodegeneration. Thus, 2-DG
treatment showed hints of anti-epileptogenic effects in the mouse corneal kindling
model. Treatment effects on cerebral glucose metabolism can be monitored during
kindling progression using [18F]FDG PET.
The second substudy analyzed the time course and characteristics of albumin
extravasation in the context of blood-brain barrier leakage during early epileptogenesis
post status epilepticus (SE) in the rat pilocarpine model using immunohistochemistry
and MRI. Associated reactions of the neurovascular unit (NVU), contributing to early
epileptogenic pathology, were assessed immunohistochemically. Blood-brain barrier
leakage peaked between days one and two post SE in epileptogenesis-associated
brain regions and declined thereafter, accompanied by cerebral edema occurring in a
similar time course. At the peak of blood-brain barrier leakage albumin was colocalized
with parts of the NVU but not with astrocytes. Immunoreactivity of a marker for
10 Publikationen
232
astrocytic endfeet was reduced in areas of albumin extravasation. Signs of adaptive
reorganization processes of the NVU vasculature were seen in terms of decreased
immunoreactivity of endothelium and in changes of basement membrane markers.
Early impairment of blood-brain barrier and following degenerative events at the level
of the NVU show the need for a prompt therapeutic intervention in order to restore
blood-brain barrier integrity during a potential antiepileptogenic therapy.
The third substudy assessed epileptogenesis in the mouse intrahippocampal
kainic acid model during and after a four-week KD treatment directly starting after
induction of SE. Therefore, multiple [18F]GE-180 and [18F]FDG PET scans were
performed. At eleven weeks after SE, electrodes for the following
electroencephalography (EEG) with simultaneous video monitoring were
intrahippocampally implanted. In contrast to animals being fed a standard diet, KD fed
mice did not show inflammation with [18F]GE-180 PET at two weeks after SE and an
unchanged glucose metabolism at four weeks after SE. As late as at six weeks after
the end of the KD, a hypometabolism was also found. EEG of KD fed animals showed
less and generally shorter seizure-like events than those of animals fed a standard
diet. This is an evidence for a potential anti-epileptogenic efficacy of the ketogenic diet
in this animal model with a long-term effect.
10 Publikationen
Kongressbeiträge:
I. Leiter, F. M. Bengel, J. Bankstahl, M. Bankstahl, (2015). „2-Deoxy-D-glucose alters
brain F-18-FDG uptake during corneal kindling in mice.” Poster (P 75) vorgestellt auf
der 53. Jahrestagung der deutschen Gesellschaft für Nuklearmedizin in Hannover,
http://www.nuklearmedizin.de/jahrestagungen/abstr_online2015/abstract_detail.php?
navId=162&aId=173 (abgerufen am 27.03.2017).
10 Publikationen
233
I. Leiter, P. Bascuñana Almarcha, A. Thomer, F.M. Bengel, J.P. Bankstahl, M.
Bankstahl (2015). “Attenuation of corneal kindling progression by 2-deoxy-d-glucose
treatment is reflected in 18-F-fluoro-deoxy-d-glucose brain kinetics.” Poster
(Präsentationsnummer 497.27) vorgestellt auf dem jährlichen Treffen der Society for
Neuroscience in Chicago, 2015, https://www.sfn.org/annual-meeting/neuroscience-
2015/sessions-and-events/program/abstract-pdfs-2015 (abgerufen am 27.03.2017).
I. Leiter, P. Bascuñana Almarcha, S. Peter, F.M. Bengel, J.P. Bankstahl, M.
Bankstahl (2016). “2-deoxy-D-glucose-mediated deceleration of kindling-induced
epileptogenesis is reflected by 18-F-FDG brain kinetics.” Poster vorgestellt auf dem
Europäischen Kongress für Epileptologie der Internationalen Liga gegen Epilepsie in
Prag, 2016, Epilepsia, 57(Suppl. 2):6–225, 2016, DOI: 10.1111/epi.13609.
Vorträge:
I. Leiter (2015). „Zerebrale Glukose‐Stoffwechsel‐Veränderungen als Biomarker der
Epileptogenese und therapeutisches Target zur Epilepsie‐Prävention.“ Vorgetragen
in der Veranstaltungsreihe „Pharmakologisches Kolloquium“ des Instituts für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover.
I. Leiter (2016). “Manipulation and imaging of cerebral energy metabolism during
epileptogenesis.” Vorgetragen als Seminar im Arbeitsgruppentreffen „MITRe
Rounds“ der Klinik für Nuklearmedizin, Medizinische Hochschule Hannover.
I. Leiter, P. Bascuñana, S. Peter, F. M. Bengel, J. P. Bankstahl, M. Bankstahl (2016).
“Manipulation and imaging of cerebral energy metabolism during epileptogenesis.”
Vorgetragen auf dem VetPharm-Symposium in München.
11 Anhang
234
11 Anhang
11.1 Graphische Darstellung von Ergebnissen aus nicht in die Manuskripte
aufgenommenen Teilstudien
Untersuchung des zerebralen Glukosestoffwechsels mit [18F]FDG-PET im
Verlauf der Epileptogenese im intrahippokampalen Kainatmodell in Mäusen
(Kainatinjektion unter Isoflurannarkose)
Abbildung 10: [18F]FDG-Uptake zu verschiedenen Zeitpunkten während der Epileptogenese. Die
Epileptogenese zeigte sich im intrahippokampalen Kainatmodell mit Injektion von Kainat unter
Isoflurannarkose als kaum den zerebralen Glukosestoffwechsel beeinflussend. In der chronischen
Phase war ein Normometabolismus zu sehen, nur in der Amygdala war kontralateral ein
Hypermetabolismus auffällig. Bl = Baseline. * one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=7-10.
11 Anhang
235
Untersuchung des zerebralen Glukosestoffwechsels mit [18F]FDG-PET im
Verlauf der Epileptogenese im intrahippokampalen Kainatmodell in Mäusen
(Kainatinjektion unter Isoflurannarkose)
Abbildung 11: MRGlu (FDG Two-Tissue Compartiment Model) zu verschiedenen Zeitpunkten während
der Epileptogenese. Die Epileptogenese zeigte im intrahippokampalen Kainatmodell mit Injektion von
Kainat unter Isoflurannarkose nur zum Teil ähnliche Auswirkungen auf MRGlu wie bei Kainatinjektion
unter Chloralhydratnarkose (siehe drittes Manuskript): die teilweise erniedrigte MRGlu zum Zeitpunkt drei
Wochen passt zu den MRGlu-Daten im Manuskript zum Zeitpunkt vier Wochen. Der chronische Zeitpunkt
unterscheidet sich. Bl = Baseline. * one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=7-10.
11 Anhang
236
Untersuchung des zerebralen Glukosestoffwechsels mit [18F]FDG-PET im
Verlauf der Epileptogenese im intrahippokampalen Kainatmodell in Mäusen
(Kainatinjektion unter Isoflurannarkose)
Abbildung 12: Ki (FDG Two-Tissue Compartiment Model) zu verschiedenen Zeitpunkten während der
Epileptogenese. Die Epileptogenese zeigte im intrahippokampalen Kainatmodell mit Injektion von
Kainat unter Isoflurannarkose ähnlich wie unter Chloralhydratnarkose (siehe drittes Manuskript) keine
Auswirkungen auf Ki. Bl = Baseline. one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=7-10.
Abbildung 13: Blutglukosekonzentration, gemessen zu
jedem Scan-Zeitpunkt. Hier sind keine Unterschiede zu
erkennen. one-way ANOVA + Bonferroni Test, vs. Bl. n=7-
10.
Glucose levels
Bl 2d 5d 21d 49d0
5
10
15
Scan timepoint (days post OP)
Glu
co
se [
mm
ol/l]
11 Anhang
237
Untersuchung des zerebralen Glukosestoffwechsels mit [18F]FDG-PET im
Verlauf einer chronischen Fütterung ketogener Diät in gesunden Mäusen
Abbildung 14: [18F]FDG-Uptake von gesunden Mäusen im Verlauf einer chronisch gefütterten
ketogenen Diät. Bl = Baseline. one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=10.
Abbildung 15: MRGlu (FDG Two-Tissue Compartiment Model) von gesunden Mäusen im Verlauf einer
chronisch gefütterten ketogenen Diät. Bl = Baseline. one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=10.
11 Anhang
238
Untersuchung des zerebralen Glukosestoffwechsels mit [18F]FDG-PET im
Verlauf einer chronischen Fütterung ketogener Diät in gesunden Mäusen
Abbildung 16: Ki (FDG Two-Tissue Compartiment Model) von gesunden Mäusen im Verlauf einer
chronisch gefütterten ketogenen Diät. Bl = Baseline. one-way ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=10.
Abbildung 17: Blutglukosekonzentrationen und ß-Hydroxybutyratkonzentration im Blut von
gesunden Mäusen im Verlauf einer chronisch gefütterten ketogenen Diät. Bl = Baseline. one-way
ANOVA + Bonferroni-Test, vs. Bl. n=10.
11 Anhang
239
Untersuchung des zentralen Benzodiazepinrezeptors mit [18F]Flumazenil-PET im
intrahippokampalen Kainatmodell in Mäusen (nicht im dritten Manuskript
gezeigte Daten)
Abbildung 18: BPnd (Simplified Reference Tissue Model mit Gehirnstamm als Referenzregion). one-
way ANOVA + Bonferroni-Test, # = Vergleich zwischen Zeitpunkten in einer Gruppe, o = Vergleich
zwischen zwei Gruppen.
11 Anhang
240
Untersuchung der Effekte von 2-Desoxy-D-Glukose auf den zerebralen
Glukosestoffwechsel mit [18F]FDG-PET und auf die Epileptogenese im
kornealen Kindlingmodell in der Maus – zusätzliche Darstellung der Gruppe,
die 2-DG 30 Minuten vor jeder Kindlingstimulation erhielt
Abbildung 19: Anfallsantworten im Verlauf der Epileptogenese im kornealen Kindlingmodell, mit
Stimulation über 21 Tage. Mittelwert mit Standardfehler, Kruskal-Wallis ANOVA, Dunn’s Multiple
Comparison Test post hoc, * Vergleich zwischen den 2-DG-Gruppen und der Vehikel-Gruppe. 2-DG
30 min before (Behandlung mit 2-DG vor jeder Stimulation): n=12. Sonst n=18.
A
Kindling progress
3 6 9 12 15 18 210
2
4
6
Vehicle
2-DG 30 min before
2-DG 1 min after
* ***
* * *
Stimulation day
Seiz
ure
severi
ty [
Sco
re]
11 Anhang
241
B
C
Abbildung 20: (A) [18F]FDG-Uptake. (B) Ki ([18F]FDG-Two-Tissue Compartiment Model). (C) MRGlu
([18F]FDG-Two-Tissue Compartiment Model). 2-DG w/o kindling = Tiere mit nur 2-DG-Behandlung, 2-
DG before + kindling = 2-DG-Behandlung 30 Minuten vor jeder Einzelstimulation, 2-DG after + kindling
= 2-DG-Behandlung eine Minute nach jeder Einzelstimulation. Mittelwert mit Standardfehler, one-way
ANOVA, Bonferroni Test post hoc. # = Vergleich mit Bl (Baseline), *=Vergleich innerhalb eines
Zeitpunktes.
11 Anhang
242
1.2 Immunhistochemische Färbungen
Protokoll zur Anfärbung des Glukosetransporters GLUT1 (freischwimmende
Schnitte):
- Herstellung der Trägerlösung: 100 ml TRIS-gepufferte Kochsalzlösung (TBS),
1 ml Eselserum, 1 g bovines Serum-Albumin (BSA), 1,5 ml 20%iges Triton X
100
- Viermaliges Spülen der Gewebeschnitte in TBS für jeweils 10 Minuten
- Hemmung endogener Peroxidasen: 30 Minuten in 0,5% Wasserstoffperoxid
- Dreimaliges Spülen für jeweils 10 Minuten in TBS
- Blockade unspezifischer Antikörperbindungsstellen: eine Stunde in
Trägerlösung mit 10% Eselserum und mit 20 mg/ml BSA
- Inkubation mit Primärantikörper über 20 Stunden bei Raumtemperatur,
Verdünnung 1:1000 in Trägerlösung: Kaninchen-anti-Maus-GLUT1-Antikörper
(Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Deutschland, GT-11A, Lot-Nummer
1105859A 1.3-P)
- Dreimaliges Spülen der Gewebeschnitte in TBS für jeweils 10 Minuten
- Eine Stunde Inkubation mit sekundärem Antikörper bei Raumtemperatur,
Verdünnung 1:500 in Trägerlösung: Biotin-SP-konjugiertes Esel-anti-
Kaninchen Immunglobulin G (IgG) (AffiniPure, Jackson ImmunoResearch
Laboratories Europe, Suffolk, England, 711-065-152)
- Herstellung der TRIS-Nickel-Lösung: 0,3 g Nickelammoniumsulfat in 50 ml
TBS (pH 7,6 kontrollieren beziehungsweise korrigieren)
- Dreimaliges Spülen der Gewebeschnitte in TBS für jeweils 10 Minuten
- Eine Stunde Inkubation in Lösung aus Vectastain-Kit (Vectastain ABC Kit,
Burlingame, CA, USA), die mindestens 30 Minuten zuvor angesetzt wurde,
und einen Avidin-Biotin-Komplex enthält: 100 µl Lösung A, 100 µl Lösung B
und 25 ml TBS
- 15 Minuten Inkubation in 8 µl DAB-Lösung (3,3’-Diaminobenzidin) pro Milliliter
TRIS-Nickel-Lösung
11 Anhang
243
- 10 Minuten Reaktion mit 4 µl Wasserstoffperoxid-Lösung (50 µl 35%iges
Wasserstoffperoxid in 150 µl TBS)
- Dreimaliges Spülen der Gewebeschnitte in TBS für jeweils 10 Minuten
- Aufziehen der Schnitte mit Chromgelatine, Trocknen über Nacht, Eindecken
Protokoll zur Anfärbung von IBA1 (Ionized Calcium-binding Adapter Molecule
1) in Microglia / Makrophagen, freischwimmende Gewebeschnitte:
- Viermaliges Spülen der Schnitte in TBS für je 10 Minuten
- Beseitigung endogener Peroxidase-Aktivität mit 0,6% Wasserstoffperoxid in
TBS über 30 min
- Spülen mit TBS, 3 x 10 min
- Blocken unspezifischer Antikörper-Bindungsstellen mit 5% Ziegen-
Normalserum in TBS, 0,3% Triton X-100 enthaltend = NGS-TBS-T) für eine
Stunde
- Inkubation mit Primärantikörper über 18 Stunden bei Raumtemperatur, 1:500
Verdünnung mit Trägerlösung (= Blockierlösung): Kaninchen-anti-Iba1, von
Synaptic Systems (Göttingen, www.sysy.com; Art.-Nr. 234003; „affinitäts-
gereinigt“)
- Spülen mit TBS, 3 x 10 min
- Inkubation mit Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur,
Verdünnung 1:500 in 2% BSA in TBS: biotinyliertes Ziege-anti-Kaninchen IgG
(AffiniPure, Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe, Suffolk, England,
111-035-144)
- Spülen mit TBS, 3 x 10 min
- Inkubation für eine Stunde mit Vectastain Kit (mindestens 30 min vor
Gebrauch ansetzen): 4 µl jeder Lösung pro Milliliter TBS
- Spülen mit TBS, 2 x 10 min
- Waschen mit ml 0,05 M TRIS-Puffer, pH 8,0, 10 min
- Vorinkubation über 15 Minuten mit Nickel-DAB-Lösung (in 100 ml 0,05 M
TRIS-Puffer sind 20 mg Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid und 551 mg
11 Anhang
244
Nickelammoniumsulfat-Hexahydrat gelöst, mit 1 M Natronlauge auf pH 8
eingestellt, bei einer Temperatur von etwa 25 – 30 °C zum Lösen)
- Visualisierungsreaktion mit 0,5 µl 30%iger Wasserstoffperoxid-Lösung je Well
- Spülen mit TBS, 3 x 10 min
- Aufziehen der Schnitte auf Objektträger mit Chromgelatine, Lufttrocknung
über Nacht, Eindecken der Schnitte
Protokoll zur Anfärbung GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) in Astrozyten
(freischwimmende Gewebeschnitte):
- Viermaliges Spülen der Schnitte in TBS für je 10 Minuten
- Beseitigung endogener Peroxidase-Aktivität mit 0,6% Wasserstoffperoxid in
TBS über 30 min
- Spülen mit TBS, 3 x 10 min
- Blocken unspezifischer Antikörper-Bindungsstellen mit 5% Ziegen-
Normalserum in TBS, 0,3% Triton X-100 enthaltend = NGS-TBS-T) für eine
Stunde
- Inkubation mit Primärantikörper über 18 Stunden bei Raumtemperatur,
Verdünnung 1:5000 in Trägerlösung (= Blockierlösung): Kaninchen-Anti-GFAP
(Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland, Z 0334, Lotnr. 20013978)
- Spülen mit TBS, 3 x 10 min
- Inkubation mit Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur,
Verdünnung 1:500 in 2% BSA in TBS: biotinyliertes Ziege-anti-Kaninchen IgG
(AffiniPure, Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe, Suffolk, England,
111-035-144)
- Spülen mit TBS, 3 x 10 min
- Inkubation für eine Stunde mit Vectastain Kit (mindestens 30 min vor
Gebrauch ansetzen): 4 µl jeder Lösung pro Milliliter TBS
- Spülen mit TBS, 2 x 10 min
- Waschen mit ml 0,05 M TRIS-Puffer, pH 8,0, 10 min
- Vorinkubation über 15 Minuten mit Nickel-DAB-Lösung (in 100 ml 0,05 M
TRIS-Puffer sind 20 mg Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid und 551 mg
11 Anhang
245
Nickelammoniumsulfat-Hexahydrat gelöst, mit 1 M Natronlauge auf pH 8
eingestellt, bei einer Temperatur von etwa 25 – 30 °C zum Lösen)
- Visualisierungsreaktion mit 0,5 µl 30%iger Wasserstoffperoxid-Lösung je Well
- Spülen mit TBS, 3 x 10 min
- Aufziehen der Schnitte auf Objektträger mit Chromgelatine, Lufttrocknung
über Nacht, Eindecken der Schnitte
Protokoll zur Fluoro-Jade-C-Färbung zur Anfärbung degenerierender
Neuronen:
Grundsätzlich wurde ab dem Schritt mit dem Eintauchen der Glasgondel in die
Kaliumpermanganat-Lösung die jeweilige Flüssigkeit gerührt. Für die Färbung wurde
eine Glasgondel verwendet, die jeweils in die verschiedenen Färbetröge getaucht
wurde. Die für die Fluoro-Jade-C-Färbung nötige Dunkelheit wurde mit der
Umhüllung aller Färbetröge mit Alufolie erreicht.
- Aufziehen der zu färbenden Gewebeschnitte aus destilliertem Wasser auf mit
Eiweiß-Glycerin beschichtete Objektträger und Trocknen über Nacht
- Spülen der Schnitte für drei Minuten in 100% Ethanol
- Spülen der Schnitte für drei Minuten in 80% Ethanol
- Spülen der Schnitte für zwei Minuten in 70% Ethanol
- Spülen der Schnitte mit destilliertem Wasser für zwei Minuten
- 10 Minuten 0,06%ige Kaliumpermanganat-Lösung (60 mg in 100 ml
destilliertem Wasser)
- Eine bis zwei Minuten spülen mit destilliertem Wasser
- In Dunkelheit: 30 Minuten in 0,0001% Fluoro-Jade C in 0,1% Essigsäure
- In Dunkelheit: dreimal eine Minute mit destilliertem Wasser spülen
- In Dunkelheit über Nacht trocknen lassen
- Eindecken der Schnitte mit Xylol und DPX Mounting Medium
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DAB-Nickel-Färbung zur Konvertierung des FITC-Albumin-Fluoreszenzsignals:
- Viermaliges Spülen der Schnitte mit TBS für je 10 Minuten
- Beseitigung endogener Peroxidase-Aktivität mit in einer 0,6%igen
Wasserstoffperoxidlösung für 30 Minuten
- Dreimaliges Spülen mit TBS für jeweils 10 Minuten
- Blocken unspezifischer Antikörper-Bindungsstellen in 2%igem Rinderserum-
Albumin mit 0,3% Triton X-100 in TBS über 30 Minuten
- Inkubation mit Anti-Fluoreszein-Meerrettichperoxidase-Konjugat (Dianova,
1:2000, in der vorherigen Blockierlösung) über zwei Stunden
- Zweimaliges Spülen mit TBS für je 10 Minuten
- Spülen mit 0,05 M TRIS-Puffer (pH = 8) für 10 Minuten
- Vorinkubation über 15 Minuten mit Nickel-DAB-Lösung (40 mg Nickel-
Ammonium-Sulfat, 2 mg DAB-Tetrahydrochlorid, 10 ml 0,05 M TRIS-Puffer)
- Visualisierungsreaktion mit 0,5 µl 30%iger Wasserstoffperoxid-Lösung je Well
- Spülen mit TBS, 3 x 10 min
- Aufziehen der Schnitte auf Objektträger mit Chromgelatine, Lufttrocknung
über Nacht, Eindecken der Schnitte
In Kooperation angefertigte Doppelfärbungen zur Untersuchung der
neurovaskulären Einheit:
Die Immunfluoreszenzfärbungen wurden jeweils als Doppelfärbungen durchgeführt,
wie in den folgenden Publikationen beschrieben, mit den jeweils genannten Primär-
(jeweils 20 Stunden Inkubationszeit) und Sekundärantikörpern / -Reagenzien (jeweils
von Dianova, Hamburg; eine Stunde Inkubationszeit mit 20 µl/ml):
- NeuN = neuron-specific nuclear protein, biotinyliertes Maus-anti-NeuN (1:100;
Merck Millipore, Billerica, MA, USA) mit Cy3-Streptavidin (Härtig et al., 2009)
und Laminin, Kaninchen-anti-Laminin (1:200; Dakocytomation, Hamburg,
Germany) mit Cy5-Esel-anti-Kaninchen IgG (Krueger et al., 2015)
- STL = Solanum-Tuberosum-Lektin, Kaninchen-anti-Laminin (1:400;
Dakocytomation) mit Cy3-Esel-anti-Kaninchen IgG (Härtig et al., 2009)
und GFAP = glial fibrillay acidic protein, Meerschweinchen anti-GFAP (1:200;
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Synaptic Systems, Göttingen, Deutschland) mit Cy5-Esel-anti-
Meerschweinchen IgG (Härtig et al., 2009)
- STL, biotinyliertes STL (10 µg/ml; Vector, Burlingame, CA, USA), mit Cy3-
Streptavidin, und GFAP, mit Cy5-Esel-anti-Meerschweinchen IgG
- Kollagen IV, Kaninchen-anti-Kollagen IV (1:100; Merck Millipore), mit Cy3-
Esel-anti-Kaninchen IgG (Hawkes et al., 2013) und STL, biotinyliertes STL (20
µg/ml; Vector, Burlingame, CA, USA), mit Cy5-Streptavidin
- AQP4 = Aquaporin 4, Kaninchen-anti-Aquaporin 4 (1:100; Alomone,
Jerusalem, Israel), mit Cy3-Esel-anti-Kaninchen IgG (Hawkes et al., 2013),
und STL, biotinyliertes STL (20 µg/ml; Vector, Burlingame, CA, USA), mit Cy5-
Streptavidin
- S100ß, Kaninchen-anti-S100ß (1:600; Synaptic Systems), mit Cy3-Esel-anti-
Kaninchen IgG, und GFAP, Meerschweinchen-anti-GFAP (1:200; Synaptic
Systems), mit Cy5-Esel-anti-Kaninchen IgG (Härtig et al., 2009)
- IBA1 = ionized calcium binding adapter molecule-1, Kaninchen-anti-IBA1
(1:400; Synaptic Systems), mit Cy3-Esel-anti-Kaninchen IgG (Krueger et al.,
2015), und GFAP, Meerschweinchen-anti-GFAP (1:200; Synaptic Systems),
mit Cy5-Esel-anti-Meerschweinchen IgG
- IBA1, Kaninchen-anti-IBA1 (1:200; Synaptic Systems), mit Cy3-Esel-anti-
Kaninchen IgG, und STL, biotinyliertes STL (20 µg/ml; Vector, Burlingame,
CA, USA), mit Cy5-Streptavidin
- CD45c, biotinyliertes Maus-anti-CD45c (1:20; Serotec, Oxford, England), mit
Cy3-Streptavidin (Lehmann et al., 2014), und IBA1, Kaninchen-anti-IBA1
(1:200; Synaptic Systems), mit Cy5-Esel-anti-Kaninchen IgG
- CD8b, biotinyliertes Maus-anti-CD8b (1:25; Serotec), mit Cy3-Streptavidin,
und IBA1, Kaninchen-anti-IBA1 (1:200; Synaptic Systems), mit Cy5-Esel-anti-
Kaninchen IgG
12 Danksagung
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12 Danksagung
Ich möchte ganz herzlich allen Menschen danken, die mich unterstützt haben, sei es
durch fachkundigen Rat, Hilfe bei den Experimenten, oder durch ihre wunderbare
Gesellschaft.
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