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Tierärztliche Hochschule Hannover
Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen
bei equinen Spermien in vitro
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Janina Rau
Gehrden
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Harald Sieme
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
- Klinik für Pferde
Dr. Ir. Harriëtte Oldenhof
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
- Klinik für Pferde
1. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme
2. Gutachterin: Prof. Dr. Anne-Rose Günzel-Apel
Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2016
Gefördert durch ein Stipendium der Joachim und Irene Hahn-Stiftung
Diese Dissertation ist ein Beitrag aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin.
Für
all meine Lieben
INHALTSVERZEICHNIS
Abkürzungen ...…………………………………………………………………………….
1 Einleitung ………………………………………………………………………………… 11
2 Literaturübersicht ……………………………………………………………………….. 13
2.1. Vorbereitung von Spermien auf die Fertilisation ………………………………………. 13
2.1.1. Fertilisationsassoziierte Reaktionen equiner Spermien ……………………..... 14
2.1.1.1. Kapazitation ………………………………………………………………... 14
2.1.1.2. Hyperaktivierung …………………………………………………………... 20
2.1.1.3. Akrosomreaktion ………………………………………………………….... 22
2.2. Kalzium-Ionophor A23187 ……………………..……………………………………... 23
2.3. Procain …………………………………………………………………………………. 24
2.4. Vorbereitung von Oozyten auf die Fertilisation …………………………………..…... 26
2.4.1. Oozytengewinnung …………………………………………………………… 27
2.4.2. Oozytenreifung ………………………………………………………………. 28
2.5. Spermien-Zona pellucida Bindung ………………………………………………….…. 30
2.6. Fertilisation …………………………………………………………………………….. 32
2.7. In-Vitro-Kultivierung frühembryonaler Stadien …...…………………………………... 35
3 Material und Methoden …………………………………………………………………. 40
3.1. Experiment I:
Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro …………….. 40
3.1.1. Chemikalien und Reagenzien ……………………………………………….. 40
3.1.2. Samengewinnung und –aufbereitung ……………………………………….. 40
3.1.3. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien
durch Inkubation in speziellen Medien ……………………………………………... 41
3.1.4. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien
durch Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain …...……………………. 43
3.1.5. Einfluss der Reduktion des Kalzium-Ionophor A23187- oder Procaingehaltes
im Medium mittels Zentrifugation auf fertilisationsassoziierte Reaktionen
bei equinen Spermien …………………………………………….………..……...… 44
3.1.6. Computerassistierte Spermienanalyse ………………………………………. 46
3.1.7. Durchflusszytometrische Analyse der Plasma- und Akrosommembran ….… 46
3.1.8. Durchflusszytometrische Analyse der Spermienkapazitation ………….…… 47
3.2. Experiment II:
Untersuchung der Bindungsfähigkeit equiner Spermien an die Zona pellucida in vitro
maturierter porziner Oozyten ….……………………………………………………….…… 48
3.2.1. Chemikalien und Reagenzien ……………………………………………….. 48
3.2.2. Oozytengewinnung und –aufbereitung zur In-Vitro-Maturation …...………. 48
3.2.3. In-Vitro-Maturation porziner Oozyten ……...………………………………. 50
3.2.4. Heterologer Bindungsassay ………….……………………………………… 51
3.2.4.1. Aufbereitung in vitro maturierter porziner Oozyten für die Koinkubation
mit equinen Spermien ……………..………………………………………………... 51
3.2.4.2. Aufbereitung equiner Spermien für die Koinkubation mit
in vitro maturierten porzinen Oozyten ………...…………………….…………...… 52
3.2.4.3. Koinkubation equiner Spermien mit in vitro maturierten
porzinen Oozyten …..………………………………………………………………. 55
3.2.4.4. Bestimmung der Bindungsraten equiner Spermien an der Zona pellucida
in vitro maturierter porziner Oozyten ………………………………………………. 55
3.3. Statistische Auswertung ………………………………………………………………... 58
4 Ergebnisse ………………………………………………………………………………... 59
4.1. Experiment I:
Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro ………..…… 59
4.1.1. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien
durch Inkubation in modifizertem Whittens-Medium …………………………….... 59
4.1.2. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien
durch Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain …...……………………. 62
4.1.3. Einfluss der Reduktion des Kalzium-Ionophor A23187- oder Procaingehaltes
im Medium mittels Zentrifugation auf fertilisationsassoziierte Reaktionen
bei equinen Spermien …..……………………………………….…………………... 64
4.2. Experiment II:
Heterologer Bindungsassay mit in vitro maturierten porzinen Oozyten
und equinen Spermien ………………………………………………………………………. 67
4.2.1. In-Vitro-Maturation porziner Oozyten ………...……………………………... 67
4.2.2. Bestimmung einer geeigneten Konzentration equiner Spermien
für die Koinkubation mit porzinen Oozyten ……………………………………….. 68
4.2.3. Überprüfung der Inkubationsbedingungen für die equinen Spermien ……….. 71
4.2.4. Einfluss unterschiedlicher Spermienaufbereitungen auf die Bindungsfähigkeit
equiner Spermien an in vitro maturierte porzine Oozyten
und auf die Oozytenmorphologie ………..…………………………………………. 72
5 Diskussion …...…………………………………………………………………………… 77
5.1. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien
durch Inkubation in einem Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen Medium ……………. 77
5.1.1. Einfluss des Inkubationsmediums auf fertilisationsassoziierte Reaktionen
bei equinen Spermien …………………….…………………………………………. 78
5.1.2. Einfluss der Inkubationsbedingungen auf fertilisationsassoziierte Reaktionen
bei equinen Spermien …………………………………………………...………..…. 80
5.2. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen Spermien
durch Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain ……………………………...… 81
5.2.1. Einfluss von Kalzium-Ionophor A23187 auf fertilisationsassoziierte
Reaktionen bei equinen Spermien …………………………………….…………..… 82
5.2.2. Einfluss von Procain auf fertilisationsassoziierte Reaktionen
bei equinen Spermien ………………...………………………………………….…. 83
5.2.3. Induktion der Hyperaktivierung bei equinen Spermien ……………………… 84
5.3. Heterologer Bindungsversuch mit in vitro maturierten porzinen Oozyten
und equinen Spermien ……………………………………………………………………… 85
5.3.1. Einfluss des Inkubationsmediums und des Zusatzes von Kalzium-Ionophor
A23187 oder Procain auf die Bindungsfähigkeit equiner Spermien …………...…… 86
5.3.2. Einfluss der Inkubation in Magermilchverdünner
auf die Bindungsfähigkeit equiner Spermien ……………………………………..… 87
5.3.3. Einfluss des Spermieninkubationsmediums und des Zusatzes von Kalzium-
Ionophor A23187 oder Procain auf die Oozytenmorphologie ………………….…... 89
5.4. Schlussfolgerungen zur Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen
bei equinen Spermien und ihrer Bindungsfähigkeit an porzine Oozyten ….……..………… 91
5.5. In-Vitro-Fertilisation equiner Oozyten …………………………………….……...……. 93
6 Zusammenfassung ……………………………………………………………………….. 95
7 Summary …………………………………………………………………………………. 98
8 Abbildungsverzeichnis …………………………………………………………………. 100
9 Tabellenverzeichnis …………………………………………………………………….. 102
10 Literaturverzeichnis ………………………………………………………………….. 103
ABKÜRZUNGEN
ALH Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung
BCECF-AM Bis-Carboxyethyl-Carboxyfluorescein Acetoxymethyl Ester
BSA Bovines Serumalbumin
BWW Biggers-Whitten-Whittingham Medium
CaIP Kalzium-Ionophor A23187
cAMP Cyclisches Adenosinmonophosphat
CASA Computer assistierte Spermienanalyse
CO2 Kohlendioxyd
DAPI Diamidin-Phenylindol
DiSC3 3,3'-Dipropylthiadicarbocyanin Iodid
DMEM F-12 Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
eCG Equines Choriongonadotropin
EGF Epidermal Growth Factor
FCS Fetales Kälberserum
FF Follikelflüssigkeit
FGF Fibroblasten-Wachstumsfaktor
FITC-PNA Fluorescein Isothiocyanat konjugiertes Peanut Agglutinin
FSH Follikel stimulierendes Hormon
GH Growth Hormon
GnRH Gonadotropin Releasing Hormon
hCG Humanes Choriongonadotropin
HCO3- Bikarbonat
HEPES Hydroxyethyl-Piperazinyl-Ethansulfonsäure
HSM Humanes Spermienmedium
ICSI Intrazytoplasmatische Spermieninjektion
IGF-1 Insulin-like Growth Factor-1
IVM In-Vitro-Maturation
IVF In-Vitro-Fertilisation
KOK Kumulus-Oozyten-Komplex
LH Luteinisierendes Hormon
LIN Linearität
mM Millimolar
µM Mikromolar
MOT Gesamtmotilität
MW Modifiziertes Whittens-Medium
NBCS Neugeborenen-Kälberserum
NK Nichtkapazitations-Medium
nz Nicht zentrifugiert
OPU Ovum Pick Up
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung
PI Propidium-Iodid
PMS Progressiv motile Spermien
PTP Protein-Tyrosin-Phosphorylierung
PVA Polyvinylalkohol
PVI Perivitelline Injektion
SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
SOFM Synthetic Oviduct Fluid Medium
sp TALP Spermien- Tyrode's Albumin Laktat Pyruvat
STR Geradlinigkeit
(TC)M 199 (Tissue Culture) Medium 199
z Zentrifugiert
ZP Zona pellucida
EINLEITUNG ___________________________________________________________________
11
1 EINLEITUNG
Die In-Vitro-Fertilisation (IVF) findet im Bereich der assistierten Reproduktion beim
Pferd derzeit wissenschaftlich starke Beachtung. Die Erfolgsraten dieses Verfahrens sind
allerdings noch überaus gering, wohingegen IVF bei anderen Nutztieren (v.a. Rind) schon
routinemäßig angewendet wird. Seit 1992 (PALMER et al. 1991; BÈZARD 1992) konnte
mittels IVF (ausgenommen ICSI) kein lebendes Fohlen hervorgebracht werden.
Die Herausforderung der IVF besteht darin, Bedingungen im Labor zu schaffen, die sowohl
die weiblichen als auch die männlichen Gameten auf die Fertilisation vorbereiten. Das
wesentliche Vorgehen der IVF umfasst die Gewinnung intakter Oozyten und deren In-Vitro-
Maturation sowie die Spermiengewinnung und das Auslösen der fertilisationsassoziierten
Spermienreaktionen - Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion. Außerdem
müssen geeignete Inkubationsbedingungen in vitro geschaffen werden, welche die
Gametenreifung, die Fertilisation und die Kultivierung frühembryonaler Stadien ermöglichen.
Der Fertilisationserfolg der bisher zur Verfügung stehenden Protokolle, mit denen equine
Spermien und Oozyten auf die IVF vorbreitet werden, ist eingeschränkt, da erzeugte
frühembryonale Stadien sich bisher nicht über das 16-Zellstadium hinaus entwickeln konnten.
Die Lösung dieses Problems ist herausfordernd, da die komplexen reproduktionsbiologischen
und biochemischen Veränderungen, welche die Gameten während der Vorbereitung auf die
Fertilisation durchlaufen, derzeit noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Zudem weisen equine
Gameten spezielle Eigenschaften im Vergleich zu den Gameten anderer Nutztierarten auf,
sodass bestehende IVF-Protokolle nicht ohne Weiteres übernommen werden können.
Zur Optimierung von IVF-Verfahren mit equinen Gameten werden unterschiedliche
Lösungsansätze verfolgt. So gilt es besonders, die fertilisationsassoziierten Spermien-
reaktionen näher zu untersuchen, um sie effektiver und zeitgenau auslösen zu können.
Ebenfalls sind weiterführende Erkenntnisse nötig, um die In-Vitro-Maturation der Oozyten
unter Vermeidung von Veränderungen der Zona pellucida, welche das Eindringen der
Spermien behindern, zu optimieren. Im Weiteren sind zuverlässige Verfahren für die
Koinkubation der Gameten und die Kultivierung frühembryonaler Stadien zu etablieren.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Induzierbarkeit fertilisationsassoziierter
Reaktionen bei equinen Spermien in vitro zu untersuchen.
EINLEITUNG ___________________________________________________________________
12
Zur Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen wurde die Effektivität eines
Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen Mediums evaluiert und optimale
Inkubationsbedingungen bestimmt. Darüber hinaus wurden die Reagenzien Kalzium-
Ionophor A23187 und Procain auf ihre Wirkung in Bezug auf die Induktion der Kapazitation,
Hyperaktivierung und Akrosomreaktion equiner Spermien untersucht. Dabei sollte gezeigt
werden, ob und bei welcher Konzentration diese Reagenzien die Spermienreaktionen nach
einer Zeit der Vorinkubation verstärkt induzieren können. Da die verwendeten Reagenzien
nicht nur induzierende Effekte auf die Gameten zeigten, wurde außerdem überprüft, ob die
Reagenzien in der Spermiensuspension nach der Induktion der Spermienreaktionen durch ein
Zentrifugationsverfahren reduziert werden können und welche Auswirkungen dies auf die
Gameten hat.
In einem heterologen Bindungsassay wurde die Bindungsfähigkeit der equinen Spermien an
porzine Oozyten geprüft. In diesem Zusammenhang wurden die Einflüsse der
Inkubationsmedien sowie des Zusatzes von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain mit oder
ohne nachfolgendem Zentrifugationsverfahren zur Induktion fertilisationsassoziierter
Spermienreaktionen auf die Spermien-Oozyten-Bindungsrate und die Oozytenmorphologie
evaluiert.
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
13
2 LITERATUR
2.1. Vorbereitung von Spermien auf die Fertilisation
Die Fertilisationsergebnisse der In-Vitro-Verfahren für die assistierte Reproduktion
beim Pferd liegen deutlich hinter denen der In-Vivo-Besamung zurück. Daher schenken die
Arbeitsgruppen, die sich mit der In-Vitro-Fertilisation befassen, der Aufklärung der einzelnen
Schritte besondere Beachtung, die sowohl Spermium als auch Eizelle von ihrer Genese bis zur
Fertilisation und darüber hinaus durchlaufen. Orientiert an den Vorgängen in vivo sollen
möglichst optimale Bedingungen mit dem Endziel der Fertilisation in vitro geschaffen
werden.
Nach der Spermatogenese im Hodengewebe, wo der Aufbau von Zellorganellen und die
DNA-Transkription abgeschlossen wurden, reifen die Spermien im Nebenhoden aus. Dabei
finden v.a. Umordnungen der Plasmamembran statt, indem vom Nebenhodenepithel
sezernierte Proteine und Lipide in die Membran aufgenommen werden, Zytoplasma
abgegeben wird und die Spermien ihre Bewegungsfähigkeit erlangen (JOHNSON et al.
1980). Das reife Spermium weist eine sehr spezialisierte Zellstruktur auf: der Spermienkopf
enthält die DNA, seine Plasma- und Akrosommembran sind essentiell für die Interaktion mit
der Oozyte und die Mitochondrien des kaudal anschließenden Mittelstückes liefern die nötige
Energie für die Antriebsbewegung der Flagelle als Endstück (VARNER et al. 2015).
Bei der Ejakulation kommen die Samenzellen in Kontakt mit dem Seminalplasma, welches
Dekapazitationsfaktoren wie z.B. freies Cholesterol, Vitamin E und Phospholipid-Transfer-
Proteine enthält, welche die Spermien an der vorzeitigen Auslösung fertilisationsassoziierter
Reaktionen hindern (SUZUKI et al. 2002).
Unmittelbar nach der Ejakulation müssen die noch nicht befruchtungsfähigen Spermien die
strukturellen, molekularen und funktionellen Veränderungen der Kapazitation,
Hyperaktivierung und Akrosomreaktion durchlaufen, um eine Eizelle aus eigener Kraft
fertilisieren zu können. Diese Prozesse werden durch die Bedingungen im weiblichen
Genitaltrakt ausgelöst (CHANG 1951). Nachdem die Spermien in den Uteruskörper der
Stute ejakuliert wurden, gelangen sie durch die Eileiterpapille in den Eileiter, wo sich ein
Reservoir nicht kapazitierter Spermien bildet. Um den Zeitpunkt der Ovulation kapazitieren
die Spermien, lösen sich mit hyperaktivem Bewegungsmuster aus dem Reservoir und
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
14
schwimmen durch den selektierenden Eileiter zur reifen Oozyte, an deren Zona pellucida sie
nach Passage der Kumuluszellen binden (SUAREZ 2016). Diese Bindung löst die
Akrosomreaktion aus, welche die Penetration der Zona pellucida und somit das Eindringen
des Spermiums in den perivitellinen Raum der Oozyte ermöglicht, sodass die Fertilisation der
Gameten stattfinden kann.
Auch in vitro sind die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion notwendig für
die Fertilisation einer Oozyte durch Spermien. Nach der Ejakulation besitzen Spermien
grundsätzlich die Voraussetzungen, um unter geeigneten Bedingungen diese Reaktionen zu
durchlaufen (VISCONTI u. KOPF 1998). Demnach müssen entsprechende Bedingungen, die
die Induktion der Spermienreaktionen ermöglichen, im Labor simuliert werden. Es ist jedoch
zu beachten, dass es bei der Induzierbarkeit fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in
vitro große inter- und intraindividuelle Unterschiede gibt (PATRAT et al. 2002).
2.1.1. Fertilisationsassoziierte Reaktionen equiner Spermien
2.1.1.1. Kapazitation
Der Begriff Kapazitation bezeichnet Stoffwechsel- und Plasmamembran-assoziierte
Prozesse der Reifung von Spermien im weiblichen Genitale und ist Voraussetzung für die
Induzierbarkeit weiterer fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen. Der größte Anteil
dieser Vorgänge findet im kaudalen Isthmus des Eileiters statt (TÖPFER-PETERSEN u.
WABERSKI 2001). Nur kapazitierte Spermien sind in der Lage, fest und dauerhaft an
Eizellen zu binden. In vivo werden diese Prozesse durch verschiedene, sogenannte
„Kapazitationsfaktoren“ (z.B. Änderungen des Ionenmilieus und Vorkommen Cholesterol
bindender Lipoproteine) ausgelöst, sobald die Spermien in den weiblichen Genitaltrakt
gelangen (GADELLA et al. 2001). Beim Hengst dauert dieser Vorgang mit 6−8 Stunden
relativ lang, verglichen mit 1−2 Stunden beim Eber (YANAGIMACHI 1994).
Die biochemischen Prozesse der Kapazitation sind sehr komplex und z.T. nicht im Detail
aufgeklärt. In einem Review veranschaulichten FLESCH und GADELLA (2000) die
Veränderungen in der Plasmamembran von Säugetierspermien während der Kapazitation
und deren Zusammenhang mit weiteren fertilisationsassoziierten Prozessen. Demnach können
Membrankomponenten wie Proteine, Phospholipide und Cholesterol nicht mehr von
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
15
ejakulierten Spermien synthetisiert werden, sie können aber aus Genitalsekreten absorbiert,
strukturell modifiziert oder abgespalten werden. Starken Einfluss auf den Gehalt und die
Anordnung der Komponenten hat dabei in vivo das Mikromilieu des jeweiligen Abschnittes
des weiblichen Genitaltraktes, in dem sich die Spermien befinden.
Ein wesentlicher Prozess während der Kapazitation ist die Änderung der Lipid- und
Proteinordnung in der Plasmamembran des Spermiums, welche als Lipiddoppelschicht aus
v.a. Phospholipiden, Cholesterol und eingelagerten Proteinen aufgebaut ist. Für den Hengst
setzt sich die Lipiddoppelschicht zu 57% aus Phospholipiden, 37% Cholesterol und 6%
Glykolipiden zusammen (GADELLA et al. 2001).
Lipide sind transversal heterogen, inter- und intraindividuell unterschiedlich sowie
asymmetrisch in den Phospholipidschichten der Plasmamembran angeordnet. Die
Phospholipide selbst sind in den Membranschichten relativ ungeordnet, Sterole und
Sphingolipide aber lagern sich mit bestimmten Membranproteinen in stabilen Domänen an.
Diese Lipiddomänen werden als 'lipid-rafts' bezeichnet und finden sich in den verschiedenen
funktionalen Abschnitten des Spermienkopfes, sie strukturieren die Membran, machen sie
funktionell variabel und sind vermutlich v.a. für Zell-Zell-Interaktionen notwendig
(GADELLA u. BOERKE 2016). Während der Kapazitation werden die Phospholipide
umgeordnet. Dies erfolgt entlang der Doppelmembran durch Transportproteine über einen
Bikarbonat vermittelten Weg und wird auch als 'Scrambling' bezeichnet (HARRISON u.
MILLER 2000; RATHI et al. 2001).
Der Cholesterolgehalt der Spermien ist zwischen den Säugetieren sehr variabel und erscheint
als ein wesentlicher Faktor im Zusammenhang mit der Kapazitationsdauer der Spermien
unterschiedlicher Spezies (YANAGIMACHI 1994). Kennzeichnend für Hengstspermien ist
ein relativ hoher Cholesterolgehalt (37%) in der Plasmamembran (GADELLA et al. 2001),
wovon den Domänen ein großer Teil während der kapazitationsbedingten
Phospholipidumverteilung entzogen wird. Dieser Cholesterolverlust wird in vivo unterdrückt,
solange die Spermien vom Prostatasekret mit hohen Cholesterolkonzentrationen umgeben
sind, während er im weiblichen Genitale durch Sterol bindende Proteine in den Sekreten
gefördert wird (MINELLI et al. 1998). Die Verminderung des Cholseterolgehaltes in der
Plasmamembran kapazitierter Spermien führt zu einem neuen Cholesterol-Phospholipid-
Verhältnis. Dieses wiederum bedingt eine erhöhte Fluidität der Lipiddoppelschicht, wodurch
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
16
die Bildung neuer Cholesterol reicher 'lipid-rafts' in der Plasmamembran des apikalen
Bereichs des Spermienkopfes ermöglicht wird. Die resultierende kapazitationsassoziierte
Umorganisation apikaler Membrandomänen geht einher mit einem Verlust von
oberflächlichen Membranproteinen und einer Umverteilung von als Dekapazitationsfaktoren
fungierenden Seminolipiden vom apikalen in den äquatorialen Kopfbereich.
Durch den Verlust oberflächlicher Membranproteine und des fusionshindernden
Seminolipids im apikalen Bereich des Spermienkopfes werden Rezeptorproteine freigelegt,
die später an der Zona pellucida-Erkennung und -Bindung der Spermien sowie der folgenden
Akrosomreaktion beteiligt sind (GADELLA u. BOERKE 2016). Auch transmembrane
Proteine ordnen sich während der Kapazitation über den Spermienkopf hinweg neu, sodass
für die Gametenbindung und -fusion spezialisierte Domänen an der lateralen Kopfmembran
entstehen (sog. 'lateral reorganization') (CHENG et al. 1998; FLESCH u. GADELLA 2000;
GADELLA u. BOERKE 2016). Ein Teil der v.a. transmembranen Proteine durchläuft zudem
während des Kapazitationsprozesses die Tyrosin-Phosphorylierung (PTP), welche als Maß
für den Anteil kapazitierter Spermien in der Gesamtpopulation herangezogen werden kann.
Diese Reaktion wird in erster Linie durch transmembranen Transport von extrazellulärem
Bikarbonat in das Spermieninnere induziert. Dies aktiviert verbunden mit erhöhtem
Kalziumeinstrom in die Zelle die spermale Adenylatzyklase zur Synthese von cAMP,
wodurch die Protein-Kinase A aktiviert wird und letztlich die PTP erfolgt. Die PTP resultiert
in einer Aktivierung oder Deaktivierung der transmembranen Proteine durch enzymatische
Modifikation von Phosphatgruppen (VISCONTI u. KOPF 1998; DEMARCO et al. 2003).
Mit dem nach innen gerichteten Transport von Bikarbonationen ist neben der PTP eine
Erhöhung des intrazellulären pH-Wertes der Spermien verbunden. Dies stellten LEEMANS
et al. (2014) bei der In-Vitro-Bindung von equinen Spermien an isolierte Eileiterexplantate
fest, da sie erhöhte pH-Werte in epithelialen Drüsenzellen und gebundenen Spermien in
Verbindung mit höheren PTP-Werten beobachteten. Die Tyrosin-Phosphorylierung der
Proteine ist also vom Ionentransport (v.a. Kalzium und Bikarbonat) und somit von den intra-
und extrazellulären Ionenkonzentrationen sowie dem pH-Wert abhängig. So konnten im
weiblichen Genitaltrakt aufsteigend in den Sekreten höhere Kalziumkonzentrationen und pH-
Werte nachgewiesen werden (GONZALEZ-FERNANDEZ et al. 2012).
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
17
Schon HARRISON et al. (1993) beschrieben, dass kapazitationsassoziierte Umbauprozesse in
der Plasmamembran zu einem Status der vorübergehenden Instabilität mit erhöhter Fluidität
und somit zu einer gesteigerten Ionenpermeabilität der Plasmamembran einer Subpopulation
der Spermien führen. Die Spermien sind in vivo auf ihrem Weg vom Nebenhoden, in das
Seminalplasma und durch das weibliche Genitale unterschiedlichen extrazellulären
Ionenkonzentrationen ausgesetzt. Dies führt in der Spermienmembran zur Aktivierung
verschiedener Ionenkanäle und durch sich ändernde Ionenverhältnisse zu Änderungen im
Membranpotential (VISCONTI et al. 2011). Eine erhöhte Permeabilität der Membran für
Kalium- und Natriumionen resultiert in einer Hyperpolarisation der Plasmamembran, welche
wiederum spannungsabhängige Kalziumkanäle aktiviert und so einen verstärkten
Kalziumeinstrom in die Samenzelle bedingt (VISCONTI u. KOPF 1998). Somit kennzeichnet
auch ein Anstieg des intrazellulären Kalziumgehaltes den Kapazitationsvorgang.
Kalziumreservoirs im Zytosol equiner Spermien wie das Endoplasmatische Retikulum aus
denen endogen Kalziumionen freigesetzt werden können, sind bisher nicht nachgewiesen. Der
intrazelluläre Kalziumgehalt hängt daher entscheidend vom extrazellulären Ionengehalt ab,
dies erfordert den Zusatz von Kalziumverbindungen im Medium zur Induktion der
Kapazitation in vitro (FLESCH u. GADELLA 2000).
Die dargestellten ionenabhängigen Reaktionen sind molekular bisher noch nicht vollständig
aufgeklärt, machen aber zusammenfassend die Notwendigkeit einer spezifischen
Konzentration von v.a. Kalzium und Bikarbonat in den Kapazitationsmedien in vitro deutlich,
ebenso ist ein adäquater pH-Wert im Medium einzustellen.
In vitro werden durch Zentrifugations- oder Waschverfahren zunächst die im Seminalplasma
enthaltenen Dekapazitationsfaktoren entfernt. Ein geringer Teil der Spermien kapazitiert
bereits nach Wegfall der inhibierenden Faktoren (YANAGIMACHI 1994; SUZUKI et al.
2002). Zum Zwecke der IVF ist allerdings eine weitere Stimulation fertilisationsassoziierter
Spermienreaktionen notwendig. Die Änderungen in der Plasmamembranorganisation werden
v.a. durch die mehrstündige Inkubation der Spermien in bestimmten Medien provoziert.
Geeignete In-Vitro-Kapazitationsmedien (s. Tab. 2.1.) enthalten die Spermienmembran-
veränderungen unterstützende Komponenten. Als (Chole-)Sterol-Akzeptor werden bovines
Serumalbumin oder Cyclodextrine zugesetzt (VISCONTI et al. 1999; BROMFIELD et al.
2014). Bikarbonat fördert das 'Phospholipid-Scrambling' und die PTP und trägt zu einem
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
18
erhöhten pH-Wert bei (FLESCH et al. 2001). Außerdem werden dem Medium i.d.R.
extrazelluläre Kalziumdonoren und eine Energiequelle (Glukose, Laktat, Pyruvat) zugesetzt
(MC PARTLIN et al. 2008). Basismedien zur Negativkontrolle enthalten gewöhnlich kein
BSA und Bikarbonat. Orientiert an den Ergebnissen von MC PARTLIN und Mitarbeitern
(2008) gilt das modifizierte Whittens-Medium als Medium der Wahl zur Kapazitation equiner
Spermien. Sie konnten nach vierstündiger Inkubation in diesem Medium die
Akrosomreaktion und die PTP in hohem Maße auslösen. Mit demselben Medium wiesen
ORTGIES et al. (2012) bereits nach 30 min Kapazitationsprozesse der Spermien nach.
BROMFIELD et al. (2014) konnten die Eignung eines Nicht-Kapazitationsmediums (ohne
Bikarbonat) als Kurzzeittransport-Medium (ca. 4 Std.) belegen, obwohl auch in diesem
Medium physiologische Kapazitationsprozesse in begrenztem Maße abliefen.
Die Inkubationsbedingungen für die Kapazitation unterscheiden sich zwischen
verschiedenen Arbeitsgruppen. In einigen Studien wird die Inkubation in angefeuchteter Luft
mit 5% CO2 empfohlen, um eine unkontrollierte pH-Werterhöhung im Medium durch CO2-
Abgasung und HCO3--Bildung zu vermeiden (ALM et al. 2001; HINRICHS et al. 2002).
Andere Arbeitsgruppen halten eine Inkubation der Spermiensuspensionen in Luft für
geeignet, da eine bikarbonatvermittelte pH-Werterhöhung die PTP auslöst, was als Induktion
der Kapazitation interpretiert werden kann (GONZALEZ-FERNANDEZ et al. 2012;
MACÍAS-GARCÍA et al. 2015). Die Temperatur beträgt zumeist 37−38°C und die
Inkubationszeiten sind mit 30 min (ORTGIES et al. 2012) bis sechs Stunden (MC PARTLIN
et al. 2008) sehr variabel.
Die Kapazitation equiner Spermien kann zusätzlich zur Inkubation in einem
Kapazitationsmedium durch Zugabe von z.B. Phosphodiesterase-Inhibitoren und cAMP-
Analoga, welche den Reaktionsweg der PTP beeinflussen, durch Kalzium-Ionophore (z.B.
A23187 und Ionomycin) sowie durch Erhöhung des extrazellulären pH-Wertes unterstützt
werden (GONZALEZ-FERNANDEZ et al. 2012; ORTGIES et al. 2012; MORATÓ et al.
2013). Kalzium-Ionophore sind sehr effektive Kalziumdonoren, die als fettlösliche Moleküle
ihr Kation durch Zellmembranen transportieren können. Sie fördern sowohl die Kapazitation,
gemessen am intrazellulären Kalziumanstieg und folgender PTP, als auch die
Akrosomreaktion. Allerdings behindern sie in höheren Konzentrationen massiv die
Spermienmotilität. Mit Mausspermien konnte jedoch gezeigt werden, dass deren
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
19
Motilitätsparameter wieder ansteigen und sogar hyperaktive Bewegungsmuster in hohem
Maße provoziert werden, sobald das Reagenz abzentrifugiert wird (TATENO et al. 2013).
Ergänzend seien noch Kapazitationsmethoden erwähnt, die sich näher am In-Vivo-Modell
orientieren: Gemessen an einem Anstieg in der PTP führt eine Koinkubation von equinen
Spermien mit Eileiterepithel (LEEMANS et al. 2014), Follikelflüssigkeit (LEEMANS et al.
2015a) oder foetalem bovinen Serum (GONZÁLEZ-FERNÀNDEZ et al. 2015) zu einem
erhöhten Anteil kapazitierter Spermien in der Gesamtpopulation. Nachteilig bei der
Verwendung dieser Zusätze ist deren nicht definierte Zusammensetzung.
Aufgrund der vielschichtigen biochemischen Vorgänge während der Kapazitation besteht
bisher kein Konsens für ein geeignetes Kapazitationsprotokoll equiner Spermien.
Der Erfolg der Kapazitationsinduktion kann im Labor auf vielfältige Weise quantifiziert
werden: Die Analyse der Cholesterolumverteilung und des -effluxes kann mittels Filipin-
Assay erfolgen, da dieses Fluoreszenzmolekül unveresterte Sterole bindet und deren
Anordnung und Anteil in verschiedenen Lokalisationen der Plasmamembran visualisieren
kann (FLESCH et al. 2001). Die Phospholipidumordnung bzw. das „Scrambling“ kann durch
Anfärben mit dem Fluoreszenzfarbstoff Merocyanin 540, einem Marker für geänderte Lipid-
Packungsdichte, durchflusszytometrisch evaluiert werden (RATHI et al. 2001). Die
Ausprägung der PTP kann Antikörper vermittelt durch SDS-PAGE, Immunoblotting,
Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie bestimmt werden (MC PARTLIN et al.
2008). Der kationische DiSC3- Fluoreszenzfarbstoff zeigt Änderungen des
Membranpotentials an (LINARES-HERNÀNDEZ et al. 1998; PATRAT et al. 2002). Die
kapazitationsbedingte Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehaltes kann (an fixierten
Präparaten) mikroskopisch mittels Chlortetracyclinfärbung erfasst werden, welche die
Verteilung von Kalzium auf der Membranoberfläche der Spermien anzeigt (RATHI et al.
2001). Nach Färbung mit z.B. Fluo-3 kann der Kalziumeinstrom anhand eines Anstiegs der
Fluoreszenzintensität durchflusszytometrisch bestimmt werden (HARRISON et al. 1993).
Der intrazelluläre pH-Wertanstieg kann durch z.B. BCECF-AM-Färbung festgestellt werden,
da dieser pH-sensitive Fluoreszenzfarbstoff je nach pH-Wert unterschiedliche Spektren
emittiert (LEEMANS et al. 2014). Eine Aussage über den pH-Wert der
Gesamtspermienpopulation lässt auch der extrazelluläre Medien-pH zu.
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20
Für die Analyse von Kapazitationsparametern ist weniger das Erreichen von Schwellenwerten
als vielmehr ein Anstieg ausgewählter Parameter ausschlaggebend, da immer nur eine
Subpopulation der Spermien den Veränderungen durch Kapazitationsreaktionen unterliegt
und nicht alle Spermien der Gesamtpopulation gleichzeitig. Letztlich bietet auch die
Induzierbarkeit der Akrosomreaktion (Kap. 2.1.1.3.) ein gutes Maß für die erfolgte
Kapazitation der Spermien (ALM et al. 2001).
2.1.1.2. Hyperaktivierung
Der Begriff Hyperaktivierung beschreibt ein von der gleichmäßigen progressiven
Bewegung von Säugerspermien abweichendes Bewegungsmuster mit erhöhter
Schlagfrequenz, -amplitude und -asymmetrie der Flagelle.
In vivo dient die Hyperaktivierung dem Ablösen des Spermiums vom Epithel des
Eileiterreservoirs, dem Durchschwimmen des Eileitermukus sowie der Penetration von
Kumuluszellen und der Zona pellucida der Oozyte (HO u. SUAREZ 2001). Außerdem
erleichtert die stärkere seitliche Kopfauslenkung (amplitude of lateral head displacement =
ALH) dem Spermium das Auffinden der Oozyte im Eileiter. Wie SUAREZ und HO (2003)
darlegten, wird angenommen, dass diese Bewegungsmuster um den Zeitpunkt der Ovulation
durch vom Ovidukt, der Oozyte und der Follikelflüssigkeit ausgehende Signale initiiert
werden. In den weiblichen Genitalsekreten sind besonders zyklusbedingte Veränderungen des
extrazellulären Kalziumgehaltes und des pH-Wertes an der Initiation der Hyperaktivierung
beteiligt. Auch noch undefinierte, chemotaktische Aktivierungsreize durch den
Ovulationsprozess werden in Betracht gezogen. Ebenso wird die Rolle von freien
Sauerstoffradikalen im weiblichen Genitale diskutiert, welche eine Lipidperoxidation der
Spermienmembran durch reaktive Sauerstoffspezies bedingen und so die Hyperaktivierung
fördern (GADELLA et al. 2001).
Die biochemische Regulation der Hyperaktivierung ist noch nicht vollends aufgeklärt.
HINRICHS und LOUX (2012) fassten Erkenntnisse zur Hyperaktivierung von
Hengstspermien in vitro zusammen: durch eine extrazellulär bedingte intrazelluläre pH-
Erhöhung gelangt Kalzium aus dem Medium über den Spermien spezifischen, pH-aktivierten
CatSper-Kalziumkanal in die Samenzelle. Dadurch wird über die Aktivierung von
Calmodulin-Kinase die flagellare Dyneinfunktion geändert. Die Dyneinärmchen lassen die
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Mikrotubuli der Flagelle aneinander entlang gleiten, sodass die spezifische Schlagbewegung
entsteht (MC PARTLIN et al. 2009).
MC PARTLIN et al. (2009) und ORTGIES et al. (2012) beschrieben, dass in vitro eine
Subpopulation von ca. 25−30% der in Kapazitationsmedium inkubierten Spermien spontan
hyperaktivierte Bewegung zeigt, die als biphasische Suchbewegung der Spermien mit
abwechselnd kreisender und progressiver Bewegung erscheint. Gezielt induziert werden kann
die Hyperaktivierung sowohl kapazitierter als auch nicht kapazitierter equiner Spermien
(55−75%) mittels Applikation des Lokalanästhetikums Procain. So aktivierte Spermien zeigen
bei mikroskopischer Betrachtung unter dem Deckglas allerdings kein biphasisches, sondern
ein konstant kreis- bzw. sternförmiges Bewegungsmuster, wobei die kapazitationsassoziierte
Protein-Tyrosin-Phosphorylierung, die Plasmamembranordnung und die Akrosomreaktion
unbeeinträchtigt bleiben. Procain aktiviert CatSper-Kanäle, wirkt aber unabhängig von einem
Kalziumeinstrom und erhöht den intrazellulären pH-Wert. Ein hoher Medium-pH oder 4-
Aminopyridin können zur Induktion der Hyperaktivierung eingesetzt werden (LOUX et al.
2013). Auch durch Applikation von Ionomycin und die Vorselektion von Hengstspermien
kann die Hyperaktivierung ausgelöst werden (MORATÒ et al. 2013). Nach Inkubation in
vorbehandelter Follikelflüssigkeit konnten LEEMANS et al. (2015a) pH- und Kalzium-
(extrazellulär) abhängige Mechanismen nachweisen, die mit der Hyperaktivierung von
Hengstspermien verbunden waren.
Nach bisherigen Erkenntnissen stehen hyperaktive Bewegungsmuster nicht in direktem
Zusammenhang mit den Kapazitationsprozessen der Spermien, sodass die Induzierbarkeit der
Hyperaktivierung keine Auskunft über eine vorangegangene Kapazitation erlaubt (RATHI et
al. 2001).
Die computerassistierte Spermienananalyse liefert fünf Parameter, über die
Hyperaktivierung bestimmt werden kann: Anstieg der Geschwindigkeit auf der gebogenen
Linie (curvilinear velocity = VCL) und der ALH sowie Verminderung der Geschwindigkeit
auf gerader Strecke (straight line velocity = VSL), der Linearität (= LIN) und der Bewegung
auf der geraden Linie (straightness = STR). RATHI et al. (2001) stellten für Hengstspermien
Mindestwerte von VCL ≥180 µm s−1
und ALH ≥12 µm für hyperaktive Bewegung auf, ein
deutlicher Anstieg dieser Parameter zum Basalwert ist aber ebenso aussagekräftig für die
Induktion dieser fertilisationsassoziierten Spermienreaktion.
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
22
2.1.1.3. Akrosomreaktion
Das Akrosom liegt dem Spermienkopf als große, vesikuläre Struktur apikal auf und
enthält hydrolytische Enzyme, welche essentiell für die Penetration der Zona pellucida (ZP)
der zu befruchtenden Eizelle sind.
Die Akrosomreaktion wird physiologisch durch die Bindung des Kopfes eines kapazitierten
und akrosomintakten Spermiums an die Eizelle ausgelöst (YANAGIMACHI 1994). Die
Rezeptor-Protein-Bindung zwischen den Membranen der Gameten fördert den
Kalziumeinstrom in den Spermienkopf über spannungsabhängige Kanäle, was zur
multifokalen Fusion der Plasmamembran mit der äußeren Akrosommembran führt. Aus
beiden Membranen entstehen Vesikel, welche die hydrolytischen Enzyme des Akrosoms (v.a.
Akrosin und Hyaluronidase) enthalten. Diese Vesikel werden exozytotisch Richtung ZP
abgegeben und ermöglichen eine fokale Lyse dieser. Somit ist der Weg zur Plasmamembran
der Oozyte für das Spermium frei. Am Kopf akrosomreagierter Spermien ist die innere
Akrosommembran mit Proteinbindungsstellen für Integrine der Eizelle freigelegt. Die
Bindung dieser Membran an die Oozyte erfolgt zunächst mit der Kopfspitze des Spermiums.
Darauf bindet es sekundär fest mit dem äquatorialen Bereich, was in Verbindung mit
hyperaktivem Flagellenschlag das Eindringen des Spermienkopfes in den perivitellinen Raum
ermöglicht (GADELLA et al. 2001). Aufgrund ihres destabilisierten Membranstatus (Kap.
2.1.1.1.) sind kapazitierte Spermien besonders anfällig für Faktoren, die die Akrosomreaktion
auslösen (GADELLA u. HARRISON 2000). Daher weist ein geringer Anteil in vitro
kapazitierter Spermien eine spontane oder durch geringe Umweltreize (z.B. Temperatur-
schwankungen) ausgelöste Akrosomreaktion auf. Somit ist die Induzierbarkeit der
Akrosomreaktion ein guter Index für die erfolgte Kapazitation und kann sogar als Endpunkt
der Kapazitation interpretiert werden (MC PARTLIN et al. 2008).
In vitro kann die Akrosomreaktion in Bikarbonat-haltigem Medium kapazitierter
Hengstspermien durch Zugabe von CaIP (Kalzium-Iononophor A23187) induziert werden,
indem die transmembrane Kalziumpassage erleichtert wird (RATHI et al. 2001; RUNCAN et
al. 2013). Andere Kapazitationsbehandlungen wie z.B. die Inkubation der equinen Spermien
mit Cholesterol bindenden Cyclodextrinen erhöhen ebenfalls die Induzierbarkeit der
Akrosomreaktion (BROMFIELD et al. 2014). Progesteron, welches in hohem Maße in der
Flüssigkeit präovulatorischer Follikel vorkommt, löst nach Hyperpolarisation der
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Plasmamembran und Öffnung spannungsabhängiger Kalziumkanäle die akrosomale
Exozytose ebenfalls aus (PATRAT et al. 2002; MC PARTLIN et al. 2008).
Im Hinblick auf die IVF ist zu beachten, dass ein gezieltes Auslösen der Akrosomreaktion
terminiert erfolgen muss, da Spermien, die bereits vor Erreichen der Oozyte reagierten, ihre
Penetrationsfähigkeit verlieren (GADELLA et al. 2001).
Die Akrosomreaktion kann fluoreszenmikroskopisch unter Verwendung von
fluoreszenzmarkierten, Glykoproteine bindenden Lektinen oder von Chlortetracyclinen erfasst
werden, welche an die akrosomalen Membranen binden oder diese penetrieren (RATHI et al.
2001; AITKEN 2006). Fluorisothiozyanat-konjugiertes Peanut Agglutinin (FITC-PNA) oder
auch PNA-Alexa sind gebräuchliche Lektine, welche an ß-Galaktose-Reste der äußeren
Akrosommembran von Hengstspermien binden, deren Integrität anzeigen und somit intakte,
reagierende oder reagierte Akrosome detektieren (RATHI et al. 2001; MC PARTLIN et al.
2008).
2.2. Kalzium-Ionophor A23187
Wie bereits in Kapitel 2.1.1.1. erwähnt, finden Kalzium-Ionophore biotechnologisch
Anwendung bei der Induktion von Kapazitationsvorgängen und der Akrosomreaktion.
Ebenfalls werden sie für die Oozytenaktivierung (Kap. 2.7.) genutzt. Dabei macht man sich
die Löslichkeit der hydrophoben Ionophore in der Lipiddoppelschicht zum Nutzen. Sie
erhöhen die Membrandurchlässigkeit für anorganische Ionen entlang des elektrochemischen
Gradienten, indem sie die Ladung des transportierten Ions maskieren. Ionophore können als
Kanalbildner oder mobile Ionen-Carrier wirken (ALBERTS et al. 1995). In der
Reproduktionsbiologie wird zumeist das CaIP A23187 genutzt, welches als mobiler Carrier
bivalente Kationen (z.B. Ca2+
, Mg2+
) transportiert und somit deren intrazellulären Gehalt
erhöhen kann. Intrazelluläres Kalzium bindet u.a. an Calmodulin, welches dann Enzyme und
Membranproteine aktiviert oder auch über Ca2+
-Calmodulin-abhängige Kinasen die
Phosphorylierung von Proteinen auslöst (ALBERTS et al. 1995).
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
24
2.3. Procain
Procain ist ein Lokalanästhetikum des Esther-Typs, welches in der Lage ist, sich
aufgrund seiner lipophilen Eigenschaften in die Plasmamembran von Zellen einzulagern und
so v.a. spannungsabhängige Natrium- und in höheren Konzentrationen Kaliumkanäle zu
blockieren. Dies führt zur Störung der elektrochemischen Vorgänge an der Zellmembran oder
in der Zelle selbst. Durch das Blockieren von Natriumkanälen kann z.B. die Depolarisation
von (Nerven-) Zellmembranen behindert werden. MC PARTLIN et al. (2009) zeigten, dass
Procain in vitro die Hyperaktivierung equiner Spermien (Kap. 2.1.1.2.) hervorruft und
vermuteten, dass dies in der durch Procain erhöhten Permeabilität der Plasmamembran für
Kalziumionen begründet ist. Außerdem erhöht Procain als schwache Base den intrazellulären
pH-Wert und aktiviert so möglicherweise den pH-abhängigen Kalziumeinstrom durch Cat-
Sper Kanäle (LOUX et al. 2013). Im Detail sind die hyperaktivierenden Eigenschaften von
Procain auf Spermien jedoch noch nicht aufgeklärt.
Tabelle 2.1.: Zusammensetzung von Inkubationsmedien zur Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in vitro.
Arbeitsgruppe Patrat
et al.
2002
Lopez-
Gonzalez
et al. 2014
Tateno et al.
2013 Rathi et al.
2001 Mc
Partlin et
al. 2007
Mc
Partlin et
al. 2008
Gonzales-
Fernandez
2012
Bromfield et al.
2014
Rau et al. 2016
Spezies Mensch Mensch Maus Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd
Medium BWW HSM Tyrode Tyrode sp TALP MW MW BWW MW
Komponenten
(mM)
NaCl 95 120 119.4 96 100 100 100 91.5 100
KCl 4.8 4 4.8 3.1 3.1 4.7 4.7 4.6 4.7
CaCl 1.7 1.7 2 2 1.7 2.4
KH2PO4 1.2 1.2 0.3 0.3 1.2
NaH2PO4
MgSO4 1.2 1.2 0.4 1.2
MgCl2 1 0.4 1.2 1.2 1.2
Glucose 5.6 5 5.6 5 5 5.5 5.6 5
Na-Pyruvat 0.25 1 1 1 1 1 1 0.27 1
HEPES 20 10 20 10 22 22 20 22
NaHCO3 25 15 25 15 25 25 25 25 24.9
Laktat 20 10 21.7 21.6 4.8 2.4 44 2.4
BSA (mg mL-1
) 5 4 7 7 7 7 3 7
Antibiotika 50µg mL-1
Streptomycin 75µg mL
-1
Penicillin G
50µg mL-1
Kanamycin 5 I.E L
-1
Penicillin
5mg mL-1
Streptomycin
Besonderheit 1mg mL-1
PVA
Grau unterlegt: derzeit bevorzugt verwendetes Medium ('MW') zur Kapazitationsbehandlung equiner Spermien.
Letzte Spalte: Zusammensetzung des in der vorliegenden Studie verwendeten modifizierten Whittens-Mediums, die Abweichungen von 'MW'
sind durch Umrandung hervorgehoben. Die genauen Bezeichnungen der Medien sind dem Abkürzungsverzeichnis zu entnehmen.
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
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2.4. Vorbereitung von Oozyten auf die Fertilisation
Die Oozyten von Säugetieren wachsen in den Follikeln der Ovarien heran, welche sich
von Primär- über Sekundär- und Tertiärfollikeln zu präovulatorischen Graafschen Follikeln
entwickeln. Bei den physiologisch uniparen Equiden geht aus den FSH stimulierten
Follikelwellen i.d.R. nur ein präovulatorischer Follikel je Zyklus hervor. Im präovulatorischen
Follikel ist die Oozyte bereits vollständig ausgebildet mit einem von Ooplasma umgebenen
diploiden Zellkern und einer von Follikelepithelzellen (Corona radiata) und Kumuluszellen
umgebenen Zona pellucida. Die Oozyten befinden sich im Ruhestadium der ersten Meiose
(Dictyotänstadium), bis dieses durch die präovulatorische Reifungsinduktion unterbrochen
wird. Einige Stunden vor der Ovulation ist die erste meiotische Reifeteilung der Eizelle
beendet, wobei ein Polkörper mit einem einfachen Chromosomensatz in den perivitellinen
Raum abgeschnürt wurde. Unter Einfluss von FSH und LH erfolgt schließlich die Ovulation.
Die Eizelle verlässt den Follikel mit den umgebenen Kumuluszellen als Kumulus-Oozyten-
Komplex und wird vom Fimbrientrichter des Eileiters aufgenommen. Gleichzeitig beginnt,
getriggert vom periovulatorischen LH-Peak, die zweite Reifeteilung der Meiose, welche in
der Metaphase II arretiert, bis die Oozyte von einem Spermium fertilisiert wird. Eine
befruchtungsfähige Oozyte zeichnet sich demnach durch den Kernstatus der Metaphase II und
einen Polkörper aus. Sobald ein Spermium in die Eizelle eindringt, wird die zweite
Reifeteilung fortgesetzt und ein weiterer Polkörper abgeschnürt. Im Zellkern liegt dann ein
haploider Chromosomensatz vor, welcher mit dem des Spermiums verschmelzen kann. Die
Fertilisation findet beim Pferd am Übergang von Eileiterampulle und -isthmus statt
(BEZARD et al. 1989). Nicht befruchtete, equine Eizellen verbleiben im Eileiter und werden
dort resorbiert. Für fertilisierte Zygoten aber erfolgt eine Zellteilungsphase von etwa fünf bis
sechs Tagen im Eileiter, woraufhin sie als Morula in den Uterus gelangen und dort ihre
frühembryonale Entwicklung fortsetzen (FLOOD et al. 1979).
In Vorbereitung auf die In-Vitro-Fertilisation müssen die Oozyten zunächst aus den Ovarien
von Spendertieren gewonnen, selektiert und aufbereitet werden. Daraufhin erfolgt die In-
Vitro-Maturation, sodass schließlich eine reife Oozyte zur Fertilisation mit aufbereiteten
Spermien zur Verfügung steht.
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
27
2.4.1. Oozytengewinnung
Oozyten müssen für In-Vitro-Verfahren zunächst als Kumulus-Oozyten-Komplexe
(KOKs) aus den Follikeln isoliert werden.
Für Nutztierarten wie Rind und Schwein ist für gewöhnlich Schlachthofmaterial zugänglich.
Von aus dem Tier isolierten Ovarien können die Oozyten aus Follikeln durch Aspiration
über eine Kanüle, die mit einem Unterdrucksystem verbunden ist, oder durch Eröffnen des
Follikels mittels Skalpell und anschließendes Ausspülen oder Auskürettieren gewonnen
werden. Eine weitere Methode ist die des sog. `Slicing`, bei der die Ovaroberfläche mehrfach
mit Klingen eingeritzt wird und die KOKs aus den so eröffneten Follikeln ausgewaschen
werden. Bei der Gewinnung equiner KOKs ist zu beachten, dass diese mit breiter Basis über
ihre Kumuluszellen an der Follikelinnenseite befestigt sind und daher durch intensives Spülen
oder Kürettieren abgelöst werden müssen (ALM et al. 1997).
Bei wertvollen Individuen und geringer Verfügbarkeit von Schlachthofmaterial, wie es häufig
beim Pferd der Fall ist, kann der Follikelinhalt auf verschiedene Weise am lebenden Tier
gewonnen werden. Mit der Technik des Ovum Pick Up (OPU) können die Follikel auf den
Ovarien in situ punktiert werden. Dies kann entweder chirurgisch von der Flanke des Tieres
aus (PALMER et al. 1987) oder transvaginal ultraschallgeleitet (KANITZ et al. 1995) durch
Aspiration des Inhalts über eine lange Nadel vorgenommen werden. Aufgrund der geringeren
Invasivität ist die transvaginale Methode zu bevorzugen. Ein Vorteil des OPU ist außerdem,
dass nach regelmäßiger Follikelkontrolle des Spendertieres selektiv immature oder
präovulatorische Follikel gewonnen werden können.
Das erhaltene Follikelmaterial wird i.d.R. in isotonen Lösungen (z.B. PBS) sedimentiert und
die KOKs daraus isoliert. Zur weiteren Verarbeitung werden KOKs mit gleichmäßigen Kern-
und Zytoplasmastrukturen sowie intakten Kumuluszellschichten selektiert. Ebenso können die
gewonnenen KOKs nach kompakten und expandierten Kumulustypen selektiert werden. Bis
zum Einbringen in das Reifungsmedium verbleiben die KOKs in der zur Gewinnung
verwendeten Spülflüssigkeit (z.B. PBS) oder in dem für die Reifung vorgesehenen Medium
(DELL` AQUILA et al. 1995).
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
28
2.4.2. Oozytenreifung
Die Oozytenreifung beginnt mit dem Überwinden des Dictyotänstadiums der ersten
meiotischen Teilung und endet in vivo nach der Ovulation mit dem Erreichen des Kernstatus
der Metaphase II. Allerdings ist nicht nur die Kern- sondern auch die Zytoplasmareifung Teil
dieses Prozesses.
Im Dictyotänstadium liegen die Chromosomen noch ungeordnet mit einem Nukleolus im
Kernplasma vor. Nach LH-aktiviertem Start des Kernreifungsprozesses wird der Nukleolus
aufgelöst, die Chromosomen kondensieren, die Kernmembran wird abgebaut und ein
Spindelapparat entsteht (GRONDAHL et al. 1995). Nach der Chromatinkondensation werden
die Kernstadien der Metaphase I, Anaphase und Telophase, in der sich auch der erste
Polkörper abschnürt, durchlaufen, worauf die Metaphase II erfolgt.
Gleichzeitig wird im Zuge der Zytoplasmareifung der perivitelline Spaltraum erweitert, die
Mitochondrien und Lipidvesikel ordnen sich zentral an, der Golgiapparat wird reduziert und
kortikale Granula werden entlang des Oolemms angeordnet (GRONDAHL et al. 1995).
Des Weiteren zeigen die umgebenden Kumuluszellen eine zunehmende Expansion während
der Reifungsphase. Sie sind aufgrund ihrer nutritiven und protektiven Funktion essentiell für
eine erfolgreiche Maturation (BRACKETT u. ZUELKE 1993).
Die Reifung der aus Ovarien isolierten unreifen Oozyten bzw. KOKs unter Laborbedingungen
wird als In-Vitro-Maturation (IVM) bezeichnet. Die Reifungszeit der gewonnenen KOKs
ist tierartspezifisch unterschiedlich, ebenso wie die Anforderungen der KOKs an die
Zusammensetzung der Inkubationsmedien.
Für die IVM von Nutztieroozyten werden häufig industriell hergestellte Medien wie das
(TC)M 199, das Ham’s bzw. DMEM F-12 oder auch das SOFM mit Protein-, Hormon- und
Antibiotikazusätzen verwendet (Tab. 2.2.). Auch die Maturation equiner Oozyten in
Flüssigkeit aus präovulatorischen Follikeln war erfolgreich (HINRICHS et al. 2002; DOUET
et al. 2014a). Als Proteinzusätze in den Medien werden i.d.R. bovine Seren wie das fetale
Kälberserum (FCS) genutzt, für equine Oozyten finden auch homologe Seren Verwendung
(ALM et al. 2001). Diese Seren enthalten u.a. Hormone. Weitere Hormonzusätze sind zumeist
GnRH und Gonadotropin-Analoga, Östradiol 17ß, Wachstumshormon (GH) und
Wachstumsfaktoren wie EGF oder IGF-1 (LANDIM-ALVARENGA et al. 2002). Auch der
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
29
Zusatz von Granulosa,- Theka- oder Eileiterepithelzellen zum Medium kann die Eizellreifung
und Kumulusexpansion unterstützen (ALM et al. 1994).
Die Kultivierung zur IVM wird stets in Oozytengruppen vorgenommen. In feuchter Luft mit
5% CO2 werden equine Oozyten bei 37.5–39°C für 24–36 Std. und bovine Eizellen für 20–24
Std. bei 39°C inkubiert. Für porzine Oozyten sind Angaben von 37–39°C für 36–48 Std. zu
finden (Tab. 2.2.). Für selektiv präovulatorisch gewonnene equine KOKs ist eine verkürzte
Inkubationsdauer von 12–18 Std. als ausreichend beschrieben (HINRICHS et al. 2000).
PALMER et al. (1991) gelang es, mit präovulatorischen KOKs nach 6–12 Std. IVM ein
lebendes Fohlen nach IVF hervorzubringen (Kap. 2.6.). Eseloozyten reifen im direkten
Vergleich zu Pferdeoozyten mit 34 Std. etwas langsamer, stellen aber die gleichen
Anforderungen an die IVM-Bedingungen (GOUDET et al. 2016). Allgemein benötigen
Oozyten mit kompaktem Kumulus eine längere Maturationszeit als Eizellen mit expandiertem
Kumulus, was sich für die Fertilisationsraten aber als unbedeutend erwies (HINRICHS et al.
1997). ALM et al. (2001) empfehlen für bereits expandierte equine KOKs eine
Maturationszeit von 18–24 Std. und für kompakte KOKs von 26–40 Std.. GONZÁLEZ-
FERNÁNDEZ et al. (2015) konnten für expandierte equine KOKs eine bessere
Maturationsrate verzeichnen, wenn diese in TCM 199 statt in MW maturiert wurden, während
sich für kompakte KOKs kein wesentlicher Unterschied ergab.
GOUDET et al. (1997) beschrieben die In-Vivo-Reifung von aus Spenderstuten gewonnenen,
immaturen Oozyten nach Injektion in einen präovulatorischen Follikel einer Empfängerstute.
Die reifen Oozyten wurden anschließend kurz vor der Ovulation durch OPU aspiriert.
Die Beurteilung der Oozytenreifung erfolgt anhand der Kern- und Zytoplasmareifung sowie
der Kumuluszellexpansion. Der Kernstatus denudierter Oozyten (Kap. 2.5.) wird an fixierten
Präparaten phasenkontrastmikroskopisch nach Färbung mit Orzein oder Lacmoid beurteilt
(CHOI et al. 1993; DELL´ AQUILA et al. 1996). Auch fluoreszenzmikroskopisch ist dies
nach Anfärbung mit HOECHST, einem DNA-spezifischen Farbstoff, möglich (HINRICHS et
al. 1993). Die Reifungsprozesse im Zytoplasma können elektronenmikroskopisch beurteilt
werden (NEUMANN et al. 1996). Das Ausmaß der Kumulusexpansion wird
stereomikroskopisch erfasst.
Die Reifungsraten sind je nach Tierart, Gewinnungsmethode und Inkubationsbedingungen
sehr unterschiedlich. Für equine Oozyten werden allgemein IVM-Raten von 60–80%
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
30
verzeichnet (MUGNIER et al. 2009a; AMBRUOSI et al. 2013; GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ
et al. 2015).
2.5. Spermien-Zona pellucida Bindung
Wie bereits in Kapitel 2.1.1.1. erwähnt wurde, sind nur kapazitierte Spermien in der
Lage, fest und dauerhaft an die Zona pellucida (ZP) von Eizellen zu binden.
Nachdem das akrosomintakte Spermium die ZP der Oozyte mit seiner Kopfspitze kontaktiert
hat, erfolgt eine Rezeptor-Protein-Bindung, welche die Akrosomreaktion und so die fokale
Lyse der ZP auslöst (YANAGIMACHI 1994) (Kap. 2.1.1.3.). Eine Bindung zwischen
Proteinen der freigelegten inneren Akrosommembran und Integrinen der ZP folgt zunächst
mit der Kopfspitze des Spermiums, darauf bindet das Spermium mittels einer sog.
ʹHaarnadelstrukturʹ fest mit dem äquatorialen Bereich. Dies ermöglicht in Verbindung mit
hyperaktivem Flagellenschlag das Eindringen des Spermienkopfes in den perivitellinen Raum
der Oozyte, seine Bindung an das Oolemm und schließlich die Fertilisation (FLESCH u.
GADELLA 2000).
Die Bestimmung der Rate von an der ZP von Oozyten gebundenen Spermien gibt Auskunft
über die Bindungsfähigkeit der Spermien. Da die Spermien-Zona pellucida Bindung essentiell
für die Fertilisation ist, geht man davon aus, dass die Bindungsfähigkeit von Spermien etwas
über ihre Fertilisationspotenz aussagt. FAZELI et al. (1995) beschrieben diesbezüglich eine
Korrelation von Bindungsraten equiner Spermien mit den Fertilitätsindices von Hengsten.
Außerdem lassen die Bindungsraten Rückschlüsse auf den Erfolg der Induktion der
Kapazitation und z.T. auch der Akrosomreaktion zu (CLULOW et al. 2010).
Die Koinkubation von Spermien mit Oozyten (meist in vitro maturiert) zur Bestimmung von
Bindungsraten wird auch als ʹBindungsassayʹ bezeichnet. Bindungsassays können mit
Gameten heterologer oder homologer Herkunft durchgeführt werden. Aufgrund der besseren
Verfügbarkeit von Schlachthofmaterial und etablierten Maturationsverfahren werden häufig
porzine oder bovine Oozyten für heterologe Bindungsassays mit equinen Spermien genutzt.
Das Spermium erkennt die Oozyte an ihrer Oberflächenstruktur (Protein-Rezeptor
Interaktion). Die ZP weist jedoch speziesspezifische Unterschiede in der oberflächlichen
Glykoproteinzusammensetzung und in der elektronenmikroskopischen Struktur (z.B. Dicke,
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
31
Porendichte) auf, sodass die speziesspezifische Zusammensetzung und -struktur der ZP ein
bestimmender Faktor für die Spermienbindung ist (MUGNIER et al. 2009b; ACCOGLI et al.
2014). MUGNIER et al. (2009b) fanden für equine Spermien schlechtere Bindungsraten an
porzine als an equine Oozyten, während porzine Spermien keinen Bindungsunterschied
zwischen den Oozyten zeigten. BALAO DA SILVA et al. (2013) führten einen
Bindungsassay mit equinen Spermien (sex sorted) und in vitro maturierten porzinen Oozyten
durch. Sie stellten fest, dass die Bindungsrate unabhängig von der Koinkubationszeit (1.5 vs.
3 Std.) der Gameten ist, aber sehr stark zwischen den Hengsten variierte.
MACÍAS-GARCÍA et al. (2015) beschrieben höhere Bindungsraten für equine Spermien an
bovinen Oozyten, die in mit BSA oder Methyl-ß-Cyclodextrin supplemetierten Medien
inkubiert waren. Auch sie stellten starke hengstindividuelle Unterschiede heraus. MORAES et
al. (2015) verwendeten die Perivitellinmembran von Hühnereiern in einem Bindungsassay für
equine Spermien und bewerteten dieses Substrat als genauso effektiv wie bovine Oozyten.
Ein direkter Vergleich der Bindungsraten zweier Spermienproben an derselben Oozyte kann
erfolgen, indem diese halbiert und ein sog. 'Hemizona Assay' durchgeführt wird (FAZELI et
al. 1995).
Um die Anzahl der ZP-gebundenen Spermien und somit die Bindungsrate bestimmen zu
können, müssen die Eizellen von ihren Kumuluszellen befreit werden. Das sogenannte
Denudieren kann mechanisch durch wiederholtes Aufziehen in eine englumige Pipette, durch
Vortexen oder enzymatisch durch Inkubation der KOKs mit Hyaluronidase erfolgen (CHOI et
al. 1993; MACÍAS-GARCÍA et al. 2015). Nach Anfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen
können die gebundenen Spermien mikroskopisch gezählt werden (Tab. 2.2.). Dies kann mit
Quetschpräparaten oder nach dem Einbetten der Oozyten für die einzelnen mikroskopischen
Ebenen erfolgen. HOECHST 33342 ist der zu diesem Zweck gebräuchlichste
Fluoreszenzfarbstoff, da er das Kernchromatin der einzelnen Spermienköpfe deutlich und
spezifisch färbt.
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
32
2.6. Fertilisation
Der Begriff der Fertilisation beschreibt die Fusion einer männlichen und weiblichen
Keimzelle und ihrer Zellkerne.
In vivo findet die Fertilisation bei den Säugetieren im Eileiter statt. Nachdem das kapazitierte
Spermium an die Zona pellucida der Oozyte gebunden hat, penetriert es diese nach erfolgter
Akrosomreaktion (Kap. 2.1.1.3.) und gelangt in den perivitellinen Spalt der reifen Oozyte.
Diese setzt nun ihre zweite Reifeteilung fort. Der Spermienkopf wird nach Bindung mit der
Äquatorialregion an das Oolemm und Fusion der Membranen in die Eizelle aufgenommen,
wobei sowohl die Flagelle als auch die Zellmembranen entfernt werden. Allein der Zellkern
dringt als haploider männlicher Vorkern zu dem Kern der Oozyte vor und verschmilzt mit
diesem (Karyogamie). So entsteht die diploide Zygote, welche nun in die Prophase der ersten
mitotischen Furchungsteilung eintritt.
Bereits während der Fusion der Plasmamembran des Spermiums und des Oolemms kommt es
durch Depolarisation der Eizelle und Anstieg des intrazellulären Kalziumgehaltes zur
Entleerung am Oolemm befindlicher, kortikaler Granula in den perivitellinen Raum. Dieser
Vorgang löst den sogenannten ʹPolyspermieblockʹ bzw. das ʹZona hardeningʹ aus, sodass das
Eindringen weiterer Spermien in die Eizelle verhindert wird. Außerdem werden die
Rezeptorproteine für die Spermienbindung auf der Eizelloberfläche durch in den Granula
enthaltene Enzyme reduziert (YANAGIMACHI 1994).
In vitro wird die Fertilisation durch Koinkubation von Spermien mit Eizellen in
Fertilisationsmedien durchgeführt. Die in vivo ablaufenden Fertilisationsprozesse
verdeutlichen die Notwendigkeit der Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen
(Kapazitation, Akrosomreaktion, Hyperaktivierung) und der Oozytenmaturation in vivo oder
in vitro als Voraussetzung für die IVF. Das Ziel der IVF ist es, aus Spermien und Oozyten
unter Laborbedingungen präimplantative und transfertaugliche Embryonen zu erzeugen
(KANITZ 2008).
Ist die Induktion der fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen nicht erfolgreich bzw.
stehen nur befruchtungsunfähige Spermien zur Verfügung oder ist die ZP nach der in vitro
Aufbereitung durch vorzeitiges `Zona hardening` so verändert, dass die Spermien sie nicht
durchdringen können, kann dieses mithilfe der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion
(ICSI) umgangen werden. Der Vorteil der IVF gegenüber ICSI ist die natürliche Selektion
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
33
befruchtungsfähiger Spermien und Oozyten sowie der deutlich geringere technische
Aufwand.
Die Koinkubation der Gameten erfolgt in speziellen Fertilisationsmedien. Die
tierartspezifischen Inkubationsbedingungen entsprechen bezüglich der Temperatur und
Atmosphäre i.d.R. denen, wie sie für die Maturation angewendet werden (Kap. 2.4.2.). Häufig
werden Maturationsmedien mit Serumproteinen ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren und
Hormonen als IVF-Medien verwendet. Beispiele sind: TALP (Tyrode supplementiert mit
Albumin, Laktat und Pyruvat), SOFM, DMEM und TCM 199. Gelegentlich werden auch
Kapazitationsmedien (MW) zur Koinkubation der Gameten genutzt (Tab. 2.2.). GONZÁLEZ-
FERNÁNDEZ et al. (2015) machten allerdings deutlich, dass bei der Auswahl des
Fertilisationsmediums in erster Linie die Ansprüche der Eizellen an das Medium und weniger
die der Spermien zu berücksichtigen sind.
Equine Spermien werden in Konzentrationen von 1–5x106 Spermien mL
–1 für 18–24 Std. bei
38–39°C in angefeuchteter Luft mit 5% CO2 mit Eizellen koinkubiert (Tab. 2.2.).
Vergleichend werden für die IVF beim Rind Spermienkonzentrationen von 0.5–6x106
Spermien mL–1
im Fertilisationsmedium über denselben Zeitraum zur Koinkubation genutzt.
Auch eine Kombination aus In-Vivo- und In-Vitro-Verfahren ist möglich, indem z.B.
Oozyten gewonnen, in vitro maturiert und anschließend in die Eileiter oder in
präovulatorische Follikel besamter Empfängertiere eingesetzt werden (KASSENS et al.
2015). Ebenso können Zygoten direkt nach ICSI in die Eileiter transferiert werden, wo die
weitere Embryonenentwicklung stattfindet. Beide Methoden resultierten in einer
Trächtigkeitsrate von etwa 40% beim Pferd (CARNEVALE et al. 2004).
Der Fertilisationserfolg kann anhand einer Penetrations-, Fertilisations- oder
Embryonalentwicklungskontrolle beurteilt werden. Nach Orcein-, HOECHST-, Lacmoid-,
DAPI- oder Mito Tracker Green-Färbung kann der Spermienkopf nach der Penetration in der
Oozyte sowie die fortgesetzte Reifung des Eizellkerns detektiert werden. Nach erfolgter
Fertilisation können beide Vorkerne, Polkörper oder frühembryonale Teilung dargestellt
werden (ALM et al. 2001; MUGNIER et al. 2009a; TABENER et al. 2010; LEEMANS et al.
2015b).
Wie in Kapitel 2.1.1. erläutert, kann die Induktion der fertilisationsassoziierten
Spermienreaktionen auf sehr unterschiedliche Weise mit variierendem Ergebnis erfolgen.
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
34
Gleiches gilt für die Vorbereitung der Oozyten auf die Fertilisation (Kap. 2.4.), was in den
stark variierenden IVF-Raten der bisher veröffentlichten Studien von 0–72% zum Ausdruck
kommt (Tab. 2.2.).
BLUE et al. (1989) waren eine der ersten Arbeitsgruppen, die sich mit der IVF equiner
Gameten beschäftigten. Sie testeten verschiedene Kapazitationsbehandlungen equiner
Spermien mit denen sie Zona pellucida freie Hamster- und tiefgefrorene Pferdeoozyten
koinkubierten und erzielten eine Penetrationsrate von bis zu 46%. MC PARTLIN et al. (2009)
zeigten, dass die Koinkubation equiner Oozyten mit nicht kapazitierten Hengstspermien in
einer IVF-Rate von 0% resultierte. In dieser Studie waren in Kapazitationsmedium inkubierte
Spermien nur nach Procain-induzierter Hyperaktivierung in der Lage zu fertilisieren (61%)
(Kap. 2.1.1.2.). Nicht kapazitierte hyperaktivierte Spermien waren nicht befruchtungsfähig.
Mit einem vergleichbaren Protokoll wurden für die IVF mit Eselgameten lediglich zu 15%
zwei Vorkerne erreicht (GOUDET et al. 2016). LANGE-CONSIGLIO et al. (2011) konnten
nach Induktion der Hyperaktivierung und Akrosomreaktion durch Inkubation equiner
Spermien in präovulatorischer Follikelflüssigkeit (FF) equine Oozyten fertilisieren. Dabei
schien Progesteron der ausschlaggebende Faktor in der FF zu sein.
Die Herkunft der Oozyten aus in vivo- oder Schlachthofmaterial hat ebenso wie das Ausmaß
der Kumulusexpansion keinen wesentlichen Einfluss auf den Fertilisationserfolg, sofern die
längere Maturationsdauer (26–40 Std.) für kompakte KOKs berücksichtigt wird (ALM et al.
2001).
HINRICHS et al. (2002) konnten mit Oozyten, die in reiner FF maturiert wurden, deutlich
bessere IVF-Raten erzielen als mit in Maturationsmedium gereiften Eizellen (12 vs. 3%). Die
embryonale Entwicklung nach Eileitertransfer zeigte allerdings gegenläufige Ergebnisse (22
vs. 63% Teilungsrate). Durch eine der IVF vorausgehende 30-minütige Inkubation der in vitro
maturierten Oozyten mit homo- und heterologen Eileiterepithelzellen (MUGNIER et al.
2009a) oder in Eileiterflüssigkeit (AMBRUOSI et al. 2013) konnten die Raten ebenfalls
verbessert werden. MUGNIER et al. (2009a) zeigten außerdem, dass sich die
Fertilisationsfähigkeit equiner Spermien bei Koinkubation mit KOKs oder denudierten
Oozyten nicht unterschied.
Trotz der z.T. recht vielversprechenden IVF-Raten beim Pferd ist zu beachten, dass in vitro
erzeugte frühembryonale Entwicklungsstadien das 8-Zellstadium selten überschreiten.
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
35
Die Entwicklung frühembryonaler Stadien aus IVF-Zygoten wird in wenigen Studien
berichtet (AMBRUOSI et al. 2013; LANGE-CONSIGLIO et al. 2014). Bisher sind lediglich
zwei Geburten in vitro erzeugter Fohlen (exkl. ICSI) erwähnt (PALMER et al.1991;
BÈZARD 1992).
2.7. In-Vitro-Kultivierung frühembryonaler Stadien
Nach einer erfolgreichen IVF setzt die Furchungsteilung der Zygoten ein. In vitro
entstandene equine Embryonen können als Morula oder Blastozyste in den Uterus eines
Empfängertieres übertragen werden. Als Kulturmedien für frühembryonale Stadien werden
häufig TCM 199, DMEM F-12 und SOFM verwendet, welche mit Seren, Wachstumsfaktoren
(z.B. EGF, IGF-1) (Kap. 2.4.2.) und ggf. mit somatischen Zellen wie Eileiterepithel,
Granulosa- oder Kumuluszellen in Form von Monolayern oder konditionierten Medien
supplementiert sind.
Erste Teilungsschritte können nach etwa 30-stündiger Kultivierung unter denselben
Inkubationsbedingungen wie bei der In-Vitro-Maturation und -Fertilisation (38–39°C in
angefeuchteter Luft mit 5% CO2) unter dem Stereomikroskop oder fluoreszenzmikroskopisch
nach HOECHST-Färbung beobachtet werden (DOUET et al. 2015).
Besonders kritisch während der Teilungsphase ist die Entwicklung vom 8- zum 16-
Zellstadium (ʹIn-Vitro-Blockʹ), da eine Stoffwechselumstellung vom maternalen auf das
embryonale Genom erfolgt (TELFORD et al. 1990). Wie im Kapitel 2.6. erwähnt, entwickeln
sich aus IVF generierte Zygoten kaum über das 8-Zellstadium hinaus. GOUDET et al. (2015)
sahen den Entwicklungsstop nach Erreichen des 2- bis 4-Zellstadiums in einer schlechten
Qualität der in vitro produzierten Embryonen begründet. Nach 24-stündiger Kultivierung
konnten DOUET et al. (2014b) bessere Zygoten-Entwicklungsergebnisse erzielen, wenn als
Kultivierungsmedium DMEM F-12 anstelle von SOFM genutzt wurde (33–100% vs. 6–42%).
Durch IVF erzeugte Eselzygoten entwickelten sich in DMEM F-12 nicht weiter (GOUDET et
al. 2016).
Bei der Beurteilung frühembryonaler Entwicklungsstadien ist das mögliche Auftreten der
Oozytenaktivierung bzw. Parthenogenese von Eizellen zu beachten. Diese Eizellen
entwickeln sich ohne Befruchtung über die Metaphase II hinaus (OWEN 1849), stellen ihre
LITERATURÜBERSICHT ___________________________________________________________________
36
Zellteilung aber im weiteren Verlauf ein. Laut LAZZARI et al. (2002) kommen
parthenogenetisch entstandene Blastozysten in Raten von 4–16% vor. Als Ursache kommen
eine spontane, zelleigene oder durch exogene Stimuli (chemisch, physikalisch) bedingte
Entwicklungsaktivierung infrage. ALONSO et al. (2014) konnten 22% in vitro maturierter
equiner Oozyten mit Spermienextrakten parthenogenetisch aktivieren.
Tabelle 2.2.: Protokolle und Ergebnisse von In-Vitro-Fertilisationsverfahren mit equiden Spermien.
Teil 1:
Palmer
et al.
1991
Alm et
al. 2001
Hinrichs
et al.
2002
Mugnier
et al.
2009a
Mc
Partlin
et al.
2009
Tabener
et al. 2010
Balao
da Silva
et al.
2013
Ambruosi
et al. 2013
Douet et
al. 2014a
Session-
Bresna-
han et al.
2014
Lange-
Consiglio
et al. 2014
Macías-
García
et al.
2015
Leemans et
al. 2015b
Sper-
mien
equin,
frisch,
1x106
Sp. mL-1
equin,
frisch
oder TG,
1x106 Sp.
mL-1
equin,
frisch,
1x106 Sp.
mL-1
equin,
frisch,
2.5x106
Sp. mL-1
equin,
frisch,
1x106
Sp. mL-1
Esel, frisch
oder TG,
1x106
Sp. mL-1
equin,
frisch,
sex
sorted
equin,
frisch,
1x 106
Sp mL-1
equin,
frisch,
1x106
Sp. mL-1
equin,
frisch
oder TG
equin,
frisch,
1x106
Sp. mL-1
equin,
frisch,
1x106
Sp.
mL-1
equin,
frisch,
1x106
Sp. mL-1
Sper-
mien-
be-
hand-
lung
HHBSA
+ CaIP
(6µM)
Heparin,
CaIP
(7.14
µM)
CaIP
(3 - 7.14
µM)
CaIP
(6 µM)
6Std. in
MW,
dann
5mM
Procain
Iono-
mycin (0.1
µM),
sel. nach
Viabilität
CaIP
(5µM)
6 Std. in
MW, dann
5mM
Procain
5 Std. in
MW,
dann
5mM
Procain
Percoll
sel.,
PC12
6 Std. in
MW, dann
FF/ Pro-
gesteron/
Leptin
4 Std. in
MW ±
MßCD
(0.1-
1mM)
Percoll sel.,
6 Std. in
mod. MW ±
Procain (2.5
mM)
Oozy-
ten-
gewin-
nung
equin
OPU
equin
OPU,
isolierte
Ovarien
equin
isolierte
Ovarien
equin
OPU,
isolierte
Ovarien
equin
isolierte
Ovarien
bovin
isolierte
Ovarien
ohne ZP
porzin
isolierte
Ovarien
equin vs.
porzin
isolierte
Ovarien
equin
OPU,
isolierte
Ovarien
eq.: OPU
bov.:
isolierte
Ovarien
equin
isolierte
Ovarien
bovin
isolierte
Ovarien
equin
isolierte
Ovarien
IVM
Me-
dium
Medium
*
+ 15%
FCS o.
M199 +
HEPES
+ BSA
mod.
TCM 199
+ 20%
Pferde-
serum
+ 2-5
x106 GZ
mod.
M 199 +
FCS +
FSH
± EGF o.
± 20 -
100%
FF
mod.
TCM 199
+ 20%
FCS +
EGF
± eq. o.
porz. EEZ
TCM
199 +
10%
FCS +
FSH
mod.
TCM 199
+ 10%
FCS
+ EGF
NCSU
+Insulin,
Cystein,
EGF,
10% FF
porz.:
TCM199 +
EGF, FSH,
Cysteamin
eq.:
TCM199 +
EGF, 20%
FCS
TCM
199 +
20%
FCS
+ EGF
oder FF
bov.: Me-
dium**
eq.: mod.
TCM 199
+ 10%
FCS,
Pyruvat
TCM199
±
20% FCS,
FSH, LH
mod.
TCM
199
+ 10%
FCS,
FSH,
LH
DMEM-
F12
Legende für Tab. 2.2., Teil 1: Sp. = Spermien; TG = Tiefgefriersamen; HHBSA = Hank´s salts-HEPES-BSA-Medium; PC-12 = Dilauroylphosphatidylcholin-
Liposomen; MßCD = Methyl-ß-Cyclodextrin; sel. = selektiert; mod. = modifiziert; eq. = equin; bov. = bovin; porz. = porzin; * = IVM-Medium nach Ménézo
(1976); **= IVM-Medium n. De La Torre-Sanchez et al. (2006); GZ = Granulosazellen; EF = Eileiterflüssigkeit; FF = Follikelflüssigkeit;
EEZ= Eileiterepithelzellen; NCSU = North Carolina State University Medium; Übrige: s. Abkürzungsverzeichnis
Tabelle 2.2.: Protokolle und Ergebnisse von In-Vitro-Fertilisationsverfahren mit equiden Spermien.
Teil 2:
Palmer et
al. 1991
Alm et
al. 2001
Hinrichs
et al.
2002
Mugnier
et al.
2009a
Mc
Partlin
et al.
2009
Tabener
et al.
2010
Balao da
Silva et
al. 2013
Ambruosi
et al. 2013
Douet et
al. 2014a
Session-
Bresna-
han et al.
2014
Lange-
Consiglio
et al. 2014
Macías-
García
et al.
2015
Leemans et
al. 2015b
IVM
Ver-
fahren
In-Vivo-
Matura-
tion
18 – 40
Std.,
38.5°C,
5%
CO2,
f. Luft
24 – 42
Std..
38.2°C,
5% CO2,
f. Luft
26 – 30
Std.,
38.5°C,
5% CO2,
f. Luft
24 Std.,
38.5°C,
5% CO2,
f. Luft
24Std.,
38.5°C,
5% CO2,
f. Luft
44 Std.,
39°C,
5% CO2,
7% O2,
f. Luft
5% CO2,
f. Luft
porz.: 44
Std., 39°C
eq.: 26-30
Std., 38.5°C
+ 30min in
porz. EF
27 Std.,
38.5°C,
5%CO2
dann
30min in
porc. EF
±
DMBT1
bov.: 20-
24 Std.,
39°C,
5% CO2
eq.: 20
Std., 38.5
°C, 6%
CO2, Luft
29 Std.,
38.5°C,
5% CO2
24 Std.,
39°C,
5%
CO2,
f. Luft
28 Std.,
38.2°C, 5%
CO2,
f. Luft
IVF
Me-
dium
Medium*
+ 15%
FCS
TALP Fert-
TALP
TCM 199 MW mod.
Tyrode
mod.
Tyrode
porz.: Me-
dium***
eq.: MW
MW +
Procain
CDM MW MW MW +
Procain
IVF
Ver-
fahren
18 Std.,
38.5°C,
5% CO2,
f. Luft
24 Std.,
38.5°C,
5%
CO2,
f. Luft
24 Std.,
38.2°C,
5% CO2,
f. Luft
24 Std.,
38.5°C,
5% CO2,
f. Luft
18 Std.,
38.2°C,
5% CO2,
f. Luft
18-20
Std.,
38.5°C,
5% CO2,
f. Luft
1.5 – 3
Std.,
38°C,
5% CO2,
f. Luft
porz: 39°C
eq.: 38.5°C,
5% CO2,
24 Std.,
f. Luft
18-24
Std.,
38.5°C,
5% CO2
18 Std.,
38.5°C,
5% CO2
18 Std.,
38.5°C,
5% CO2
2 Std.,
39°C,
5%
CO2,
f. Luft
18 Std.,
38.2°C,
5% CO2,
f. Luft
IVF
Ana-
lyse
Penetr.
PK und
PN
(Orcein)
Penetr.
(Orcein)
PK,
Mitose
Chromatin
-integrität
(Hoe.)
Penetr.,
PK und
PN
(Hoe.)
Penetr.,
PN,
Teilung
(Hoe.)
Penetr.
(DAPI),
PN
Bin-
dungs-
assay
(Hoe.)
PN
(Hoe.)
PN,
Teilung
(Hoe.)
PN
(DAPI)
PN + Teil.
Penetr.
(Orcein),
(Hoe.)
Bin-
dungs-
assay
(Hoe.)
Penetr. (MT
Green), PN,
Teilung
(Hoe., Lac.)
IVM /
IVF
Ergeb-
nisse
(Pferd)
IVF: 27%
(1Träch-
tigkeit),
Embryo-
entwickl.
in vivo
IVF:
34%
IVF: 16%
nach In-
Vivo-
Fertil.:
77%
IVF:
15%
IVF:
84%;
Teilung
8-16
Zeller:
66%
IVF:
90%
IVF:
55%
Bindung
porc.:
IVM: 74%,
IVF: 70%
eq.:
IVM: 61%,
IVF: 62%
IVM:
TCM
199:
73-76%
FF:
67-91%
IVF:72%
IVF:
bov.:
26%
eq.: 0%
IVM: 45%
IVF:
51%
Penetr.
19%
Teilung
k.A. 0% IVF,
Teilung nur
durch
Zytokinese
(ca. 60%)
Legende für Tab. 2.2., Teil 2:
f. = feuchte; Penetr. = Penetration; PK = Polarkörper-Formation; PN = Pronukleus-Formation; mod. = modifiziert; eq. = equin; bov. = bovin;
porz. = porzin; * = IVM-Medium nach Ménézo (1976); ***= Medium nach Marchal et al. 2003; EF = Eileiterflüssigkeit; DMBT1 = Deleted in
malignant brain tumors 1 Protein; k.A. = keine Angabe; CDM = chem. definiertes Medium; Hoe. = HOECHST; Lac. = Lacmoid; MT-Green =
Mito-Tracker Green; Übrige: s. Abkürzungsverzeichnis
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
40
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1. Experiment I:
Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro
3.1.1. Chemikalien und Reagenzien
Alle Chemikalien, ausgenommen die folgend gelisteten, wurden von der Firma Carl
Roth (Karlsruhe, Deutschland) bezogen. Natriumpyruvat stammte von der Firma Merck
(Darmstadt, Deutschland), Natriumlaktat, Kalzium-Ionophor A23187, DMSO und der
Fluoreszenzfarbstoff Propidium Iodid von Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), FITC-
PNA von Vector Laboratories (Burlingame, California, USA), Fluo-3/AM von Enzo Life
Sciences (NY, USA), bovines Serum Albumin von Serva (Heidelberg, Deutschland) und
Procain von Fluka (Buchs, Schweiz).
3.1.2. Samengewinnung und –aufbereitung
Zur Samengewinnung wurden Hengste der Rasse Hannoveraner Warmblut vom
Niedersächsischen Landgestüt Celle eingesetzt, welche eine gute Fruchtbarkeit aufwiesen und
aktiv im Zuchteinsatz standen.
Unter Verwendung einer künstlichen Vagina wurden die Ejakulate der Hengste auf einem
Phantom gewonnen (beide Modell ‘Hannover’; Minitüb, Tiefenbach, Deutschland).
Unmittelbar darauf wurden der Gelanteil sowie grobe Schmutzpartikel des nativen Ejakulates
mit einem sterilen Zellstofffilter (Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) entfernt. Die Ejakulate
wurden zunächst makroskopisch auf Volumen, Farbe, Konsistenz, Geruch und
unphysiologische Beimengungen untersucht. Zur weiteren Aufbereitung wurden nur
physiologisch erscheinende Ejakulate verwendet. Diese wurden pasenkontrastmikroskopisch
auf die Motilität und morphologische Abweichungen der Spermatozoen sowie auf
Fremdzellen untersucht. Die Spermienkonzentration des Nativspermas wurde photometrisch
bestimmt (SpermCue®; Minitüb, Tiefenbach, Deutschland). Ejakulate von physiologischer
Beschaffenheit wurden weiterverwendet.
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
41
Das Sperma wurde auf 100×106 Spermien mL
−1 mit Nicht-Kapazitations Medium (NK: 100
mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 22 mM HEPES, 5 mM Glukose, 1 mM
Brenztraubensäure, 2.4 mM Natriumlaktat; pH 7.6; Osmolarität 300 mOsm kg−1
) verdünnt
und die Spermienkonzentration erneut photometrisch validiert. Die Spermiensuspension
wurde nach 30‒60 min weiter verarbeitet.
Mittels Zentrifugation (15 mL Röhrchen mit rundem Boden; bei 100×g für 1 min) wurden
weiterer Debris und tote Spermatozoen in der Spermiensuspension separiert und der
verbleibende Überstand in ein sauberes Probenröhrchen überführt. Die
Spermienkonzentration im Überstand wurde unter Verwendung eines Haemozytometers
(Thoma; Hecht-Assistant, Sandheim an der Rhön, Deutschland) bestimmt und die Probe
weiter auf 10×106 Spermien mL
−1 mit NK verdünnt.
3.1.3. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien durch
Inkubation in speziellen Medien
Mit dem Ziel die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion equiner
Spermien in vitro auszulösen, wurden zunächst zwei Aliquots einer aufbereiteten
Spermaprobe in Nicht-Kapazitationsmedium (NK; 10×106 Spermien mL
−1) zentrifugiert (15
mL-konische Röhrchen, bei 600×g für 5 min), der anfallende Überstand wurde vorsichtig
entfernt und das verbleibende Spermienpellet in NK (Kontrollmedium) oder
Kapazitationsmedium [modifiziertes Whittens-Medium (MW): 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl,
1.2 mM MgCl2, 2.4 mM CaCl2, 22 mM HEPES, 24.9 mM NaHCO3, 5 mM Glukose, 1 mM
Brenztraubensäure, 2.4 mM Natriumlaktat, 7 mg mL-1
BSA; pH 7.6; Osmolarität 300 mOsm
kg−1
] mit einer Endkonzentration von ~10×106 Spermien mL
−1 resuspendiert. Die
Spermiensuspensionen wurden daraufhin auf 500 µL Aliquots aufgeteilt, um eine
Inkubationszeitreihe - von bis zu vier Std. bei 37°C in angefeuchteter Luft - zur Evaluierung
von Motilitätsparametern (CASA) und eine durchflusszytometrische Analyse der
intrazellulären Kalziumkonzentration (Fluo-3) sowie Plasma- und Akrosommembranintegrität
der Spermien (s. Kap. 3.1.6–3.1.8.) durchzuführen (Abb. 3.1.).
Zusätzlich wurde über die Inkubationszeit der pH-Wert der Spermiensuspensionen mittels
pH-Streifen (Neutralit®, Merck, Darmstadt, Deutschland) bestimmt.
Abbildung 3.1.: Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur Erfassung fertilisationsassoziierter
Reaktionen bei equinen Spermien im Verlauf der 240-minütigen Inkubation in Kontrollmedium (NK) oder Kapazitationsmedium
(MW). Messzeitpunkte: 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180, 240 min.
pH-Wert
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
43
3.1.4. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien durch
Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain
Nach Festlegung des geeigneten Inkubations- und Kontrollmediums sowie der
adäquaten Inkubationszeit wurden die Effekte von Kalzium-Ionophor A23187 (CaIP) und
Procain auf die Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in MW
getestet. Die Stammlösung von CaIP wurde mit einer Konzentration von 2.5 mM in DMSO
erstellt, die von Procain als eine 2.5 M Stammlösung in destilliertem Wasser.
Die Spermien wurden aufbereitet wie im vorangegangenen Kapitel beschrieben (10×106
Spermien mL−1
in MW) und die Proben bei 37°C in angefeuchteter Luft für 60 min
vorinkubiert. Daraufhin wurden die Proben aliquotiert (492−500 µL) und die Stammlösungen
der Reagenzien mit einer Endkonzentration im Aliquot von 0−10 µM CaIP und 0−10 mM
Procain zugesetzt. Die erhaltenen Proben wurden für weitere 30 min bei 37°C inkubiert und
anschließend die Parameter der Spermienmotilität (CASA) und –kapazitation (Fluo-3) sowie
die Integrität der Plasmamembran (PI) analysiert (Abb. 3.2.).
Abbildung 3.2.:
Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur Erfassung
fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen Spermien nach Zusatz von
Kalzium-Ionophor A23187 oder Procain in unterschiedlichen Konzentrationen (CaIP: 0,
0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 3, 5, 10 µM; Procain: 0, 1, 2.5, 5, 8, 10 mM).
Präinkubation
60 min bei
37°C in
feuchter Luft
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
44
3.1.5. Einfluss der Reduktion des Kalzium-Ionophor A23187- oder Procaingehaltes im
Medium mittels Zentrifugation auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei equinen
Spermien
Zusätzlich zur Charakterisierung der Effekte des Zusatzes steigender Konzentrationen
von CaIP und Procain (im Folgenden auch als Reagenzien bezeichnet) nach 60-minütiger
Präinkubation in MW wurden die fertilisationsassoziierten Reaktionen nach Reduktion des
Reagenziengehaltes im Medium evaluiert. Dazu wurden die Spermaproben wie unter 3.1.3.
beschrieben aufbereitet. Die Präinkubation erfolgte allerdings mit einer
Spermienkonzentration von 25×106 mL
−1, um zentrifugationsbedingte Spermienverluste
auszugleichen und so die Anforderungen der Messgeräte an die Zellkonzentrationen in den
Proben nicht zu unterschreiten. Nach 60 min Inkubation bei 37°C wurden drei
unterschiedliche Proben erstellt: 25×106 Spermien mL
−1 in MW (1) ohne den Zusatz der
Reagenzien, (2) mit Zusatz von 2.5 µM CaIP oder (3) 2.5 mM Procain. Diese wurden 10 min
bei 37°C inkubiert und in Aliquots aufgeteilt, wobei die Hälfte der Proben dem
Zentrifugationsverfahren unterzogen wurde (600×g für 5 min). Unmittelbar nach der
Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und das entstandene Spermienpellet mit frischem
MW resuspendiert. Daraufhin wurden die unterschiedlichen Ansätze in 500 µL Aliquots
geteilt und bis zur Analyse der Spermienparameter bei 37°C inkubiert. Die
Parametermessungen erfolgten 15, 45 und 90 min nach der Zentrifugation. Diese
Postinkubationsphase (15−90 min) sollte der ‘Erholung’ der Spermien mit Anpassung des
Zellstoffwechsels und der Spermienmotilität sowie der Homogenisierung des Mediums
dienen. Die Motilität, die Plasma- und Akrosommembranintegrität und der intrazelluläre
Kalziumgehalt der Spermien wurden mittels CASA und fluoreszenzmikroskopisch ermittelt
(Abb. 3.3.).
45
Abbildung 3.3.:
Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur Erfassung
fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen Spermien nach Zusatz von
Kalzium-Ionophor A23187 oder Procain und nachfolgender Anwendung eines
Zentrifugationsverfahrens zur Verringerung des Reagenziengehaltes im Medium.
T1 + 2 = 2.5 µM CaIP
T4 + 5 = 2.5 mM Procain
T3 = kein Inducer
A = Zentrifugation 5 min bei 600xg, Resuspension in MW
B = ohne Zentrifugation
a = CASA, b = PI / Fluo-3, c = FITC-PNA; jeweils 15, 45 und 90 min Nachinkubationszeit
500 µL
Aliquot
s
Zugabe v. CaIP
o. Procain;
Inkub. 10 min
bei 37°C in
feuchter Luft
25x106 Sp. mL
-1
in MW, Präinkubation
60 min bei 37°C
in feuchter Luft
T1 A
T1
T2 B
T2
T3 B
T3
T5 A
T5
T4 B
T4
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
c
c
c
c
c
15, 45, 90 min
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
46
3.1.6. Computerassistierte Spermienanalyse
Das System der Computerassistierten Spermienanalyse (CASA, SpermVision®;
Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) wurde für die Analyse des Bewegungsmusters der equinen
Spermien angewendet. Das verwendete Gerät verfügt über ein Phasenkontrastmikroskop mit
einem beheizbaren und motorisch automatisierten Objekttisch, eine beheizbare Arbeitsplatte
(HT 300®; Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) sowie über eine Kamera. Die
Geräteeinstellungen wurden gemäß den Herstellerinformationen angewendet. Für die
Messungen wurden jeweils 3 µL der unterschiedlich aufbereiteten Spermaproben aus den
inkubierten 500 µL Aliquots entnommen und in eine Kammer eines 20 m Vierkammer-
Objektträgers (Leja Products BV, Nieuw Vennep, Niederlande) überführt. Die Analyse der
Bewegungsmuster wurde bei 37°C Probentemperatur durchgeführt. Für jede Probe errechnete
das Computerprogramm des Systems die Motilitätsparameter als Durchschnittswert von acht
Sichtfeldern. Zur genauen Beurteilung wurden folgende Parameter näher betrachtet: die
Gesamtmotilität (MOT, %), progressiv motile Spermien (PMS, %: mittlere Geschwindigkeit
auf einer geraden Bahn > 40 µm s−1
und Geradlinigkeit oder Geschwindigkeit auf einer
geraden Bahn vs. mittlere Geschwindigkeit > 0.5), Geschwindigkeit auf der gebogenen Linie
(VCL in µm s−1
) und die Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung (ALH in µm). Spermien
wurden als hyperaktiviert gewertet, sofern ein Anstieg der Werte für VCL und ALH
gegenüber den Basiswerten der Probe zu verzeichnen war.
3.1.7. Durchflusszytometrische Analyse der Plasma- und Akrosommembran
Der prozentuale Anteil der Spermien mit intakter Plasma- und Akrosommembran
wurde durchflusszytometrisch mittels Doppelfärbemethode unter Verwendung der
Fluoreszenzfarbstoffe Propidium Iodid (PI) und Fluorescein-Isothiocyanat konjugiertes
Peanut Agglutinin (FITC-PNA) bestimmt. Einer 500 μL Spermaprobe (10−25×106 Spermien
mL−1
in NK oder MW, mit oder ohne Reagenzien) wurden jeweils 3 µM PI und 0.45 mM
FITC-PNA zugesetzt. Die gefärbten Proben wurden für 10 min bei 37°C inkubiert, bevor sie
mit einem Cell Lab Quanta SC MPL Durchflusszytometer (Beckman-Coulter®, Fullerton,
California, USA) analysiert wurden. Dieses Durchflusszytometer war ausgestattet mit einem
488 nm Argon-Ionenlaser von 22 mW zur Anregung, einem 525/30 nm Bandpassfilter zur
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
47
Detektion von Grünfluoreszenz und einem 670 nm Longpassfilter zur Detektion von
Rotfluoreszenz. Als Durchflussmedium wurde gefiltertes PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl,
10 mM Na2HPO4, 1.8 KH2PO4, pH 7.4) verwendet, dessen Fließgeschwindigkeit auf ca. 30
µL min−1
eingestellt war, was in einer Zählrate von 200−500 counts s−1
resultierte. Je Probe
wurden mindestens 5000 Spermien analysiert, deren Selektion aus der Gesamtpartikelmasse
basierend auf den Eigenschaften ihrer Seitwärtsstreuung und ihres elektronischen Volumens
erfolgte.
Rot fluoreszierende Spermien wurden als plasmamembrangeschädigt gewertet (PI-positiv),
grün fluoreszierende dagegen als akrosomgeschädigt bzw. als Spermien mit erfolgter
Akrosomreaktion (FITC-PNA-positiv), da dieser Farbstoff nur an die innere
Akrosommembran binden kann. Folglich wurden Spermien als plasma- und
akrosommembranintakt angesehen, die weder grün noch rot fluoreszierten (PI- und FITC-
PNA-negativ).
3.1.8. Durchflusszytometrische Analyse der Spermienkapazitation
Um die Ausprägung der Kapazitation der behandelten Spermien bewerten zu können,
wurde deren intrazellulärer Kalziumgehalt mit Hilfe einer Doppelfärbemethode bestimmt. Ein
497 µL Aliquot der Spermaprobe (10–25×106 Spermien mL
−1 in NK oder MW, mit oder ohne
Reagenzien) wurde mit 0.88 µM Fluo-3/AM (Fluo-3) - gelöst in DMSO- und 3 µM PI
supplementiert und für 10 min bei 37°C inkubiert. Die DMSO-Endkonzentration betrug in der
Probe 0.2% (v/v). Die Proben wurden wie zuvor beschrieben durchflusszytometrisch
analysiert. Die mittlere Grünfluoreszenzintensität PI-negativer Spermien wurde als Maß für
den intrazellulären Kalziumgehalt plasmamembranintakter Spermien bestimmt. Ein Anstieg
der Fluoreszenzintensität wurde als Indikator für eine Erhöhung des intrazellulären
Kalziumgehaltes der Spermien im Zuge der Kapazitationsvorgänge interpretiert.
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
48
3.2. Experiment II:
Untersuchung der Bindungsfähigkeit equiner Spermien an die Zona pellucida in vitro
maturierter porziner Oozyten
3.2.1. Chemikalien und Reagenzien
Die Hersteller der Chemikalien und Reagenzien des verwendeten
Maturationsmediums sind der Tabelle 3.1. zu entnehmen. Der Fluoreszenzfarbstoff
HOECHST 33342 wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), Silikonöl von
(Serva, Heidelberg, Deutschland) und Dulbeccos PBS von (AppliChem, Darmstadt,
Deutschland) bezogen.
3.2.2. Oozytengewinnung und –aufbereitung zur In-Vitro-Maturation
Für den heterologen Bindungsversuch wurden in vitro maturierte Schweineeizellen
verwendet. Die Aufbereitung der Oozyten erfolgte wie von TIEDEMANN (2015)
beschrieben. Um die Oozyten zu erhalten, wurden am Schlachthof physiologisch
erscheinende Ovarien, die kein Corpus luteum aufwiesen, vom Genitaltrakt frisch
geschlachteter Sauen isoliert, in vorgewärmten, temperaturisolierten Transportgefäßen
gesammelt und innerhalb von zwei Stunden in das Labor verbracht. Nach dem Transport
wiesen die Ovarien eine Temperatur von 27–30°C auf. Vor der weiteren Verarbeitung wurden
die Ovarien in isotoner Kochsalzlösung gewaschen. Daraufhin wurden die Kumulus-Oozyten-
Komplexe (KOKs) aus 3–5 mm großen Follikeln isoliert. Zu diesem Zweck wurde ein
Aspirationssystem verwendet, bestehend aus einer mit einer Aspirationsvorrichtung
verbundenen 18G Nadel und einer Vakuumpumpe. Die aspirierten KOKs und die
Follikelflüssigkeit wurden in 50 mL-Röhrchen gesammelt, welche mit 37°C warmem
Handling-Medium (Dulbeccos PBS supplementiert mit 1% Neugeborenen-Kälberserum)
aufgefüllt wurden, sobald je etwa 20 mL Follikelinhalt gewonnen waren. Nach 15 min
aufrechter Lagerung setzte sich das zelluläre Material am Boden der Röhrchen ab und der
entstandene Überstand wurde abpipettiert. Das die KOKs enthaltende Sediment wurde durch
ein- bis zweimaliges Resuspendieren mit Handling-Medium, Sedimentieren und Entfernen
des Überstandes gewaschen (Medium : KOKs = 1 : 9 – 1 : 19), um den Anteil der Follikel-
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
49
flüssigkeit zu reduzieren. Die KOKs wurden in einer Petrischale unter dem Stereomikroskop
(SMZ-2T®, Nikon, Düsseldorf, Deutschland) selektiert. Nur KOKs mit mindestens drei
vollständigen Kumuluszellschichten und gleichmäßigem Zytoplasma wurden zur Maturation
ausgewählt (Abb. 3.4., A). Mit einer ausgezogenen Glaspipette wurden geeignete KOKs in
Gruppen zu je 50 aufgeteilt und 2× 1 min in Maturationsmedium (Tab. 3.1.) gewaschen.
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
50
3.2.3. In-Vitro-Maturation porziner Oozyten
Zur Maturation wurden je 50 selektierte KOKs in ein Well eines 4-Well
Kulturschälchens (Nunc A/S, Kamstrupvej, Dänemark) mit 500 µL Maturationsmedium (Tab.
3.1.) verbracht. Das Maturationsmedium war zuvor mindestens zwei Stunden lang bei 38.5°C
und 5% CO2 äquilibriert worden. Die In-Vitro-Maturation erfolgte unter diesen
Inkubationsbedingungen über 46 Stunden.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Expansion des Kumulus oophorus der KOKs
unter einem Stereomikroskop bei 20-facher Vergrößerung bewertet (Abb. 3.4., B). Zur
Einschätzung des Maturationserfolges wurden im Zuge der Auswertung des Bindungsassays
der Kernstatus und die Polkörperausbildung nach HOECHST-Färbung unter dem
Fluoreszenzmikroskop beurteilt (Kap. 3.2.4.4.).
Tabelle 3.1.: Zusammensetzung des Maturationsmediums nach TIEDEMANN (2015);
Mengenangaben für 1 ml Medium.
Substanz Menge Hersteller
DMEM-Medium 315 µL Life Technologies
(Darmstadt,
Deutschland) Ham´s F-12 Medium 315 µL
FCS 70 µL
L-Glutamin 0.26 mg
Sigma
(Seelze, Deutschland)
BSA 0.625 mg
Penicillin 0.04 mg
Streptomycin 0.03 mg
Wachstumsfaktoren:
EGF 50 ng
IGF-1 100 ng
FGF 5 ng
Hormone:
eCG 10 IU Intervet
(Haar, Deutschland) hCG 10 IU
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
51
3.2.4. Heterologer Bindungsassay
3.2.4.1. Aufbereitung in vitro maturierter porziner Oozyten für die Koinkubation mit
equinen Spermien
Nach erfolgter Maturation wurden die KOKs mit mindestens zweifach expandiertem
Kumulus zunächst durch intensives Auf- und Abpipettieren unter dem Stereomikroskop
denudiert (Abb. 3.4., C) und anschließend zweimalig in Handling-Medium gewaschen. Die
Aufbereitung der Oozyten erfolgte bei etwa 38°C. Die denudierten Oozyten wurden in 20er-
Gruppen in jeweils einen Koinkubationstropfen (Kap. 3.2.4.3.) verbracht.
C A B
Abbildung 3.4.:
Stereomikroskopische Bilder porziner Oozyten.
A: Oozyte mit gleichmäßigem Zytoplasma und mehrschichtigem Kumulus oophorus
nach Isolation aus dem Follikel. (Maßbalken = 100µm)
B: Oozyte mit stark expandiertem Kumulus oophorus nach 46 Std. In-Vitro-Maturation.
(Maßbalken = 200µm)
C: Denudierte Oozyte. (Maßbalken = 200µm)
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
52
3.2.4.2. Aufbereitung equiner Spermien für die Koinkubation mit in vitro maturierten
porzinen Oozyten
Die Samengewinnung und -aufbereitung erfolgte im Wesentlichen wie für das
Experiment I im Kapitel 3.1.2. beschrieben. Die Proben wurden jedoch nach der
Zentrifugation (100×g für 1 min) mit NK oder INRA82-Magermilchverdünner (VIDAMENT
et al. 2000) auf 100×106 Spermien mL
−1 verdünnt. Nach der Aufbereitung wurden zwei mit
NK und eine mit INRA82 verdünnte Probe zu je 25 mL in verschlossenen Probenröhrchen
mit einem Fassungsvermögen von 50 mL in einer Styroporbox innerhalb von 60 min in das
Labor des Instituts für Nutztiergenetik vom Friedrich-Loeffler-Institut in Mariensee
transportiert, wo die Oozytenaufbereitung und der heterologe Bindungsassay durchgeführt
wurden. Die Spermiensuspensionen wurden für 5 min bei 600×g zentrifugiert, der anfallende
Überstand vorsichtig entfernt und das verbleibende Spermienpellet in INRA82-Magermilch-
verdünner, NK (Nicht-Kapazitations-/Kontrollmedium) oder MW (Kapazitationsmedium)
resuspendiert. Die Proben wurden auf die gewünschte Endkonzentration (1‒100×106
Spermien mL−1
) verdünnt, 1 mL Aliquots wurden auf 1.5 mL Eppendorfgefäße verteilt und
bei 37°C in angefeuchteter Luft inkubiert. Zur Induktion fertilisationsassoziierter
Spermienreaktionen wurden fünf Aliquots mit in MW inkubierten Hengstspermien erstellt.
Eines der mit (1) MW sowie das mit (2) NK und das mit (3) INRA82 resuspendierte Aliquot
wurden für 120 min ohne weitere Behandlung inkubiert. Zwei weitere in MW präinkubierte
Aliquots wurden nach 110 min mit (4) 2.5 µm CaIP bzw. (5) 2.5 mM Procain supplementiert
und weitere 10 min inkubiert. Die beiden übrigen Aliquots in MW wurden bereits nach 85
min mit (6) 2.5 µm CaIP bzw. (7) 2.5 mM Procain supplementiert, wobei nach 10 min eine
Zentrifugation der Proben (5 min bei 600×g) erfolgte und die entstandenen Spermienpellets
mit frischem MW resuspendiert wurden, um die Konzentration der induzierenden Reagenzien
in der Spermiensuspension zu reduzieren (Kap. 3.1.5.). Die zentrifugierten Proben wurden
zunächst für 15 min nachinkubiert. Insgesamt wurden so sieben unterschiedliche
Spermienaufbereitungen (1–7) erstellt (Abb. 3.7.). Eine mikroskopische Motilitätskontrolle
(optische Schätzung der Gesamt- und Progressivmotilität) wurde jeweils nach der
Samengewinnung, dem Transport und der Inkubationszeit vorgenommen. Nur
Spermiensuspensionen mit >50% Gesamtmotilität wurden für die Koinkubation mit den
porzinen Oozyten verwendet.
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
53
Die 120 minütige Inkubation der Spermiensuspensionen erfolgte zunächst in geschlossenen
Aliquots mit wenig Luftüberstand im Wasserbad (37°C). Dabei fiel auf, dass die
Suspensionen nach der Inkubationszeit inhomogen erschienen und sich zelluläres Material am
Boden der Probe absetzte.
Um einen möglichen Zusammenhang mit der geschlossenen Inkubationsform zu evaluieren,
wurde diese gegen eine offene Inkubation getestet. Außerdem wurde der Einfluss der
Spermienkonzentration (10 bzw. 25×106 Spermien mL
−1) in der Suspension auf die
Spermienmotilität (CASA), den pH-Wert im Medium (pH-Streifen Neutralit®, Merck,
Darmstadt, Deutschland) und die makroskopisch beurteilbaren Parameter der
Spermiensuspensionen evaluiert. Dazu wurden 100×106 Spermien mL
−1 in NK für 60 min bei
37°C in feuchter Luft in offenen oder geschlossenen Röhrchen präinkubiert, anschließend
zentrifugiert (5min bei 600 xg) und in NK oder MW mit einer Endkonzentration von 10 bzw.
25×106 Spermien mL
−1 resuspendiert. Die Proben wurden auf 0.5 mL Aliquots verteilt und
für bis zu 240 min offen oder geschlossen bei 37°C in feuchter Luft inkubiert (Abb. 3.5.).
Anhand der Ergebnisse sollten die Inkubationsbedingungen für equine Spermien vor der
Koinkubation mit porzinen Oozyten optimiert werden.
54
Abbildung 3.5.:
Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur Erfassung der
Motilitätsparameter (CASA), des pH-Wertes (pH-Streifen) sowie zur Beurteilung von
Aussehen und Geruch der Proben im Verlauf der 240-minütigen Inkubation präinkubierter
equiner Spermien in offenen oder geschlossenen Röhrchen.
T1 = resuspendiert in MW
T2 = resuspendiert in NK
a = 10 x106 Sp. mL
-1
b = 25 x106 Sp. mL
-1
Messzeitpunkte: 10, 60, 120, 240 min
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
55
3.2.4.3. Koinkubation equiner Spermien mit in vitro maturierten porzinen Oozyten
Als Koinkubationsmedium für die Gameten wurde das Maturationsmedium ohne
Hormonzusätze und Wachstumsfaktoren verwendet (Tab. 3.1.). Nach mindestens
zweistündiger Äquilibrierung des Mediums unter Inkubationsbedingungen (38.5°C und 5%
CO2) wurden 90 µL Tropfen auf Petrischalen verteilt und mit Silikonöl überschichtet. In jeden
dieser Tropfen wurden 20 maturierte, denudierte Oozyten eingesetzt und 10 µL einer der
sieben aufbereiteten Spermiensuspensionen (Kap. 3.2.4.2.) zugegeben (100 µL Endvolumen
mit 0.1‒10×105 Spermien je 20 Oozyten). Die Koinkubation erfolgte über 120 min bei 38.5°C
und 5% CO2 (Abb. 3.7.).
Die für den folgenden Bindungsassay verwendeten Spermienkonzentrationen wurden in
einem Vorversuch auf ihre Eignung für die Koinkubation mit porzinen Oozyten geprüft. Dazu
wurden in NK verdünnte Spermaproben wie in Kapitel 3.2.4.2. beschrieben aufbereitet und
nach der Zentrifugation (5 min bei 600×g) in NK bzw. MW mit einer Endkonzentration von
1‒100×106 Spermien mL
−1 resuspendiert.
3.2.4.4. Bestimmung der Bindungsraten equiner Spermien an der Zona pellucida in
vitro maturierter porziner Oozyten
Nach Ablauf der Koinkubationszeit (120 min) wurden die Oozyten mit den daran
gebundenen Spermien aus den Koinkubationstropfen entnommen und wiederholt intensiv im
Handling-Medium auf und ab pipettiert, um nicht fest an die Zona pellucida gebundene
Spermien zu entfernen. Anschließend wurden die Spermien-Oozyten-Komplexe für 10 min in
einer HOECHST-Färbelösung (5 mg mL‒1
HOECHST 33342 in DPBS mit 10% NBCS) im
Dunkeln bei 38°C inkubiert und daraufhin erneut im Handling-Medium gewaschen.
Unmittelbar nach diesem Färbevorgang wurden die Spermien-Oozyten-Komplexe auf
Objektträger verbracht und bis zur Analyse im Dunkeln gelagert. Um eine dreidimensionale
Beurteilung und somit ein Auszählen der gebundenen Spermien auf allen Seiten der Oozyten
zu gewährleisten, wurden je fünf gefärbte Spermien-Oozyten-Komplexe innerhalb eines
Lochverstärkerringes in Silikonöl eingebettet (Abb. 3.6.). Die Auszählung der gebundenen
Spermien pro Oozyte erfolgte unter einem Fluoreszenzmikroskop mit Phasenkontrast
(Olympus BX 60, Olympus Tokio, Japan), welches mit einer Kamera (Olympus DP 72;
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
56
Olympus Deutschland GmbH, Hamburg) und zugehöriger Software ausgestattet war.
Ebenfalls wurden der Kernstatus, die Ausbildung eines Polkörpers und die Morphologie der
Oozyten evaluiert. Als maturiert wurden Oozyten gewertet, die einen Polkörper ausgebildet
und den Kernstatus der Metaphase II erreicht hatten.
Abbildung 3.6.:
Schematische Darstellung der Objekt-
träger zur fluoreszenzmikroskopischen
Auszählung der an der Zona pellucida in
vitro maturierter porziner Oozyten
gebundenen equinen Spermien.
Abbildung 3.7.:
Schematische Darstellung der Gametenaufbereitung, Inkubations- und Verfahrensschritte sowie der Analysemethode für den
heterologen Bindungsassay mit equinen Spermien und porzinen Oozyten.
Die sind veranschaulicht.
IVM
46 Std.
bei 38.5 °C
mit 5% CO2
MATERIAL & METHODEN ___________________________________________________________________
58
3.3. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte unter Verwendung der ‘SAS’ Software (SAS
Institute Inc., Cary, NC, USA) gemäß den Nutzungsanweisungen durch das Institut für
Biometrie und Epidemiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
Der Test auf Normalverteilung wurde jeweils mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test
durchgeführt, bevor für Varianzanalysen ein globaler F-Test für wiederholte Messungen bzw.
der Dunnett-Hsu-Test für Multivarianzanalysen angewendet wurde, um die durch CASA-
Messungen, durchflusszytometrisch und fluoreszenzmikroskopisch bestimmten Parameter zu
evaluieren. Varianzen wurden mit einem p-Wert < 0.05 als statistisch signifikant und mit p <
0.001 als statistisch hochsignifikant gewertet. Die Darstellung der Daten erfolgte als
arithmetische Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardabweichungen.
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
59
4 ERGEBNISSE
4.1. Experiment I:
Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro
4.1.1. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien durch
Inkubation in modifiziertem Whittens-Medium
Ziel dieses Versuchsteils war es herauszufinden, ob und nach welcher
Inkubationsdauer das modifizierte Whittens-Medium (MW) die Kapazitation,
Hyperaktivierung und Akrosomreaktion von Hengstspermien in vitro induziert. Ebenso wurde
der Frage nachgegangen, ob NK diese Reaktionen nicht beeinträchtigt und somit als
Kontrollmedium geeignet ist. Während der Inkubation in MW oder NK für bis zu vier
Stunden wurden vergleichend die Motilitätsparameter, der intrazelluläre Kalziumgehalt sowie
die Plasma- und Akrosommembranintegrität der Spermien analysiert; die Ergebnisse sind in
Abb. 4.1. veranschaulicht.
Während der vierstündigen Inkubation in NK war nur ein geringer, gleichmäßiger Abfall des
Anteils membranintakter Spermien (von 75% auf 65%) zu verzeichnen. Bei den in MW
inkubierten Spermien trat innerhalb von 120 min eine Verringerung des Anteils
membranintakter Spermien um 35% ein und dieser Status blieb während der weiteren
Inkubationszeit konstant. Das Inkubieren in MW steigerte sowohl den intrazellulären
Kalziumgehalt der Spermien (gemessen an einem Anstieg der Fluo3-Fluoreszenzintensität)
als auch den Anteil akrosomreagierter Spermien (FITC-PNA-fluoreszierende Spermien). Die
Fluo-3 Fluoreszenzintensität der Spermien erreichte nach einer Inkubationsdauer von 180 min
ein Maximum von 18.5 in NK mit einem Anstieg um das 1.6-Fache des Ausgangswertes
(11.9) (p=0.04). In MW zeigte sich eine 2.4-fache Steigerung der Fluoreszenzintensität
innerhalb von 120 min auf ein Maximum von 20.25 (p=0.003) mit nachfolgendem Abfall des
Wertes (16.1 nach 240 min). Dieses Ergebnis weist auf einen signifikanten Anstieg des
intrazellulären Kalziumgehaltes hin und lässt auf die Induktion des Kapazitationsprozesses
bei einem maximalen Anteil von Spermien in der Population der Proben nach 120-minütiger
Inkubation in MW schließen.
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
60
Die Akrosomreaktion durchliefen die Spermien mit einem maximalen Wert FITC-PNA
angefärbter Akrosome von 31% der Gesamtpopulation nach 120 min in MW. Die Steigerung
der Werte dieses Parameters gegenüber dem Ausgangswert (11%) war nach mehr als 60 min
Inkubationszeit hochsignifikant (p < 0.0001). In NK wurde lediglich ein Anstieg
akrosomreagierter Spermien von 7% nach 120-minütiger Inkubation verzeichnet (von 6 auf
13%). Der prozentuale Anteil progressiv motiler Spermien (PMS) verminderte sich um nur
6% (von 40 auf 34%) in NK während der ersten 120 min der Inkubation und um weitere 15%
während der folgenden zwei Stunden (19% nach 240 min). Inkubiert in MW fiel der Anteil
der PMS innerhalb der ersten 120 min um 20% ab (von 51 auf 31%; p=0.009). Dieser
Rückgang war v.a. bedingt durch einen signifikanten Anstieg der Geschwindigkeit auf der
gebogenen Linie von 140 auf 164.6 µm s−1
(p=0.01) und der Amplitude der seitlichen
Kopfauslenkung der Spermien von 2.1 auf 3.2 µm innerhalb 120-minütiger Inkubation.
Während der Inkubation in NK zeigte die Spermienpopulation nach 120 min keine Anzeichen
der Hyperaktivierung (VCL: 146−149 µm s−1
, ALH: 2.5−2.8 µm). In MW wurde der Anteil
vorwärtsbeweglicher Spermien außerdem durch mikroskopisch feststellbare Agglutinationen
mehrerer Spermienköpfe eingeschränkt. Derartige Agglutinationen waren in NK kaum zu
finden und hengstindividuell sehr unterschiedlich ausgeprägt.
Der pH-Wert der Spermiensuspensionen steigerte sich während der vierstündigen Inkubation
in MW von 7.5 auf 8.5 und somit stärker als in NK (von 7.0 auf 7.5).
Insgesamt wiesen die Spermien unterschiedlicher Hengste große interindividuelle
Unterschiede bezüglich des zeitlichen Verlaufs und des Ausmaßes der beschriebenen
fertilisationsassoziierten Reaktionen auf.
Das stärkste Ausmaß der Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen war im
Durchschnitt während einer 60−120 minütigen Inkubation in MW zu verzeichnen. In NK
konnten diese Reaktionen während der Inkubationsdauer nicht induziert werden. Folglich ist
MW als Kapazitations- und NK als Kontrollmedium geeignet.
61
Abbildung 4.1.:
Entwicklung der Motilitätsparameter, der Plasmamembranintegrität, des akrosomalen Status und des
intrazellulären Kalziumgehaltes equiner Spermien während der 240-minütigen Inkubation in
Kapazitationsmedium (MW) (A, C) oder Kontrollmedium (NK) (B, D).
Plasma- und akrosommembranintakte Spermien (%, rot) (A, B)
Akrosomgefärbte Spermien (%, grau gestrichelt) (A, B)
Fluo-3 Fluoreszenzintensität für membranintakte Spermien (a.u., grün gestrichelt) (A, B)
Progressiv motile Spermien (%, blau) (A, B)
Geschwindigkeit auf der gebogenen Linie (µm s-1
, VCL, violett) (C, D)
Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung (µm, ALH, orange) (C, D)
Die Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen für die Ejakulate von sechs
Hengsten.
Informationen zu den Signifikanzwerten der dargestellten Parameter sind Kap. 4.1.1. zu entnehmen.
Pro
gr.
mo
tile
Sp
. (%
)
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
62
4.1.2. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien durch
Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain
Aus dem vorangegangenen Versuchsteil wurde deutlich, dass nach einer
Gesamtinkubationsdauer von 60−120 min in MW maximale Werte für die Kapazitations-,
Akrosomreaktions- und Hyperaktivierungsparameter erreicht und somit fertilisations-
assoziierte Reaktionen bei Hengstspermien induziert werden konnten. Die Eignung von NK
als Kontrollmedium ist ebenfalls gegeben (Abb. 4.1.), da bei darin inkubierten Spermien die
genannten Reaktionen weitestgehend ausblieben.
Basierend auf diesen Ergebnissen sollte die Wirkung des Zusatzes von Kalzium-Ionophor
A23187 (CaIP) und Procain auf die Induktion fertilisationsassozierter Spermienreaktionen
getestet werden. Nach 60-minütiger Präinkubation in MW wurden CaIP mit Konzentrationen
von 0–10 µM und Procain mit 0–10 mM zugegeben und die Spermieneigenschaften nach 30
min Einwirkzeit evaluiert (Abb. 4.2.).
Der Prozentsatz plasmamembranintakter Spermien war durch den Zusatz der Reagenzien
auch bei maximalen Konzentrationen kaum beeinträchtigt. Ebenso zeigte die Fluo-3
Fluoreszenzintensität keine Veränderungen nach Behandlung der Proben mit steigenden
Procain-Konzentrationen. Nach Zugabe von CaIP stiegen die Werte dieses Parameters an und
kennzeichneten somit einen Anstieg des intrazellulären Kalziumgehaltes der Spermien. Eine
Steigerung um das 3.7-Fache von 26.4 auf ein Maximum von 96.8 wurde durch Applikation
von 3 µM CaIP erreicht (p < 0.0001). Der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien nahm bei
Zusatz steigender Konzentrationen von CaIP- und Procain ab. Dieser Anteil verringerte sich
hochsignifikant (p < 0.0001) nach Zugabe von CaIP mit Konzentrationen von mehr als 0.5
µM. Mit 3 µM CaIP konnten kaum noch progressiv motile (2%) oder hyperaktivierte
Spermien (VCL 80.4 µm s-1
, ALH 1.7 µm) vom CASA-System detektiert werden.
Mikroskopisch war erkennbar, dass ein großer Teil der Spermien, die mit CASA als immotil
erfasst waren, ein hochfrequentes Kopfzittern zeigten. Mit steigenden Procain-
Konzentrationen verringerte sich der Anteil progressiv motiler Spermien um 23%. Dieser
Werterückgang war statistisch hochsignifikant (p < 0.0001) nach Zusatz von Procain-
konzentrationen von mehr als 2.5 mM. Dabei wurde ein Zusammenhang mit einem Anstieg
der VCL und ALH ersichtlich. Die VCL erreichte ein Maximum vom 167 µm s−1
nach der
Inkubation mit 2.5 mM Procain gegenüber einem Ausgangswert von 135 µm s−1
(p = 0.01)
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
63
und die ALH erreichte ein maximales Plateau von 4.4 µm durch Zugabe von 2.5−5 mM
Procain gegenüber 2.2 µm ohne Zugabe von Procain (p < 0.0001).
Abbildung 4.2.:
Entwicklung der Motilitätsparameter, der Plasmamembranintegrität und des intrazellulären Kalzium-
gehaltes equiner Spermien nach 60-minütiger Präinkubation in Kapazitationsmedium (MW) und
nachfolgendem Zusatz von CaIP (A, C) oder Procain (B, D) für 30 min in unterschiedlichen
Konzentrationen.
Plasma- und akrosommembranintakte Spermien (%, rot) (A, B)
Fluo-3 Fluoreszenzintensität für membranintakte Spermien (grün gestrichelt) (A, B)
Progressiv motile Spermien (%, blau) (A, B)
Geschwindigkeit auf der gebogenen Linie (µm s-1
, VCL, violett) (C, D)
Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung (µm, ALH, orange) (C, D)
Die Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen für die Ejakulate von sieben
Hengsten.
Informationen zu den Signifikanzwerten der dargestellten Parameter sind Kap. 4.1.2. zu entnehmen.
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
64
4.1.3. Einfluss der Reduktion des Kalzium-Ionophor A23187- oder Procaingehaltes im
Medium mittels Zentrifugation auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei equinen
Spermien
In Hinblick auf die Koinkubation von Oozyten und Spermiensuspensionen sollte die
Konzentration der Reagenzien CaIP und Procain in den Medien durch Zentrifugation,
Entfernen des reagenzienhaltigen Überstandes und Resuspension der Spermienpellets in
frischem Medium reduziert werden. Es sollte festgestellt werden, ob die durch
Reagenzienzusatz induzierten fertilisationsassoziierten Prozesse bzw. Zustände der Spermien
auch nach der Zentrifugation beibehalten bleiben.
Die equinen Spermien wurden zunächst 60 min in Kapazitationsmedium präinkubiert und für
10 min mit 2.5 µM CaIP oder 2.5 mM Procain behandelt. Die Hälfte der Proben wurde
daraufhin zentrifugiert und das Pellet in MW resuspendiert. Die fertilisationsassoziierten
Reaktionen der Spermien wurden im Anschluss an die Zentrifugation nach 15−90 min
weiterer Inkubation bei 37°C mittels CASA und durchflusszytometrisch beurteilt.
Die Zugabe von CaIP oder Procain resultierte in einer Abnahme des Anteils progressiv
motiler Spermien verglichen mit den reagenzienfreien Proben in MW (PMS: 24% in MW, 9%
mit CaIP, 10% mit Procain) (Abb. 4.3.). Die zentrifugierten und resuspendierten Proben
wiesen einen geringeren Anteil plasmamembranintakter (PI neg.: 31% mit CaIP, 29% mit
Procain) und einen um 9% (CaIP) bzw. um 11% (Procain) signifikant höheren Anteil
akrosomreagierter Spermien auf als die Proben, die mit den Reagenzien supplementiert und
nicht zentrifugiert wurden (PI neg.: 32% mit CaIP, 37% mit Procain) (Akrosomreaktion: CaIP
p=0.014, Procain p=0.05). Die ALH war nach dem Zusatz der Reagenzien reduziert (2-fach
für CaIP nz, 1.2-fach für Proc nz vergl. zu MW). Dabei wiesen zentrifugierte und
resuspendierte CaIP-haltige Proben höhere ALH-Werte auf als nicht zentrifugierte Proben
(CaIP z: 2.8 vs. nz: 1.7 µm; Procain z: 2.5 vs. nz: 2.8 µm). Die Supplementierung mit CaIP
führte zu einem Anstieg der Fluo-3 Fluoreszenzintensität (2.2-fach, von 8.3 in MW auf 18.0
mit CaIP) und folglich zu einem erhöhten intrazellulären Kalziumgehalt der Spermien. Durch
die Reduktion des CaIP-Gehaltes im Medium durch Zentrifugation und Resuspension
verringerte sich die Fluo-3 Intensität (1.5-fach auf 12.3). Der Vergleich der
Fluoreszenzintensitäten für mit Procain behandelte Proben ergab eine 1.8-fach geringere
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
65
Fluo-3 Fluoreszenz von 8.1 für zentrifugierte Proben gegenüber 14.8 ohne Zentrifugation
(p=0.007).
Für die 15- bis 90-minütige Inkubationszeit nach Zentrifugation und Resuspension zeigten
sich nach 15 bis 45 min ähnliche Entwicklungen der Parameterwerte im Vergleich zwischen
verschiedenen Ejakulaten. Daher wurde eine Nachinkubationszeit von 15 min für die
`Spermienerholung` nach Zentrifugation für weitere Experimente ausgewählt.
Insgesamt bedingte die Zentrifugation und Resuspension der Proben Verluste
membranintakter Spermien. Das Ausmaß der Kapazitation (gemessen am intrazellulären
Kalziumgehalt) war durch das Abzentrifugieren der Reagenzien vermindert, das der
Akrosomreaktion aber positiv beeinflusst.
66
* * *
Abbildung 4.3.:
Entwicklung der Motilitätsparameter, der Akrosomintegrität und des intrazellulären Kalziumgehaltes
equiner Spermien nach Anwendung eines Zentrifugationsverfahrens im Anschluss an eine 60-
minütige Präinkubation in Kapazitationsmedium (MW) und Zusatz von 2.5 µM CaIP oder 2.5 mM
Procain für 10 min. Vor der Analyse wurden alle Proben für 15 – 90 min nachinkubiert.
Inkubation in MW (Kontrolle, grün)
Zusatz von CaIP für 10 min mit (z, blau) oder ohne Zentrifugation (nz, blau gestreift)
Zusatz von Procain für 10 min mit (z, gelb) oder ohne Zentrifugation (nz, gelb gestreift)
Progressiv motile Spermien (%, A)
Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung (µm, B)
Fluo-3 Fluoreszenzintensität für membranintakte Spermien (C)
Akrosomgefärbte Spermien (%, D)
Die Diagramme zeigen die Mittelwerte und Standardabweichungen für die Ejakulate von sechs
Hengsten nach 15 min Nachinkubationszeit.
* = Signifikante Unterschiede (p < 0.05) der Parameterwerte zwischen zentrifugierten und nicht
zentrifugierten Proben derselben Reagenzie.
Pro
gr. m
oti
le S
p. (
%)
Flu
o-3
Flu
ore
szen
z (a
.u.)
Akr
oso
mge
färb
te S
p. (
%)
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
67
4.2. Experiment II:
Heterologer Bindungsassay mit in vitro maturierten porzinen Oozyten und equinen
Spermien
4.2.1. In-Vitro-Maturation porziner Oozyten
Die aus Schlachthofovarien gewonnenen Kumulus-Oozyten-Komplexe zeigten nach
46-stündiger Inkubation in Maturationsmedium bei 38.5 °C und 5% CO2 mit einer Rate von
79.7% einen zwei- bis dreifach expandierten Kumulus oophorus sowie den Kernstatus der
Metaphase II und die Ausprägung eines Polkörpers (Abb 4.4.).
Sp.
PK
M II
Sp.
PK
M II
A B
Abbildung 4.4:
Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten nach 120 min
Koinkubation mit equinen Spermien.
Die Spermien-Oozyten-Komplexe sind mit HOECHST gefärbt, sodass die Kernstrukturen der
Gameten nach Anregung blau fluoreszieren. An der Zona pellucida (→) sind vereinzelt Spermien
(Sp.) gebunden; der Kernstatus der Metaphase II (M II) ist erreicht und ein Polkörper (PK)
ausgebildet.
A: Phasenkontrast-Dunkelfeld
B: Phasenkontrast-Hellfeld
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
68
4.2.2. Bestimmung einer geeigneten Konzentration equiner Spermien für die
Koinkubation mit porzinen Oozyten
Die Auswertung der Spermienbindungsrate an der Zona pellucida in vitro maturierter
porziner Oozyten erfolgte fluoreszenzmikroskopisch nach HOECHST-Färbung. Zur
Koinkubation mit den reifen Eizellen musste eine Spermienkonzentration ermittelt werden,
mit der eine repräsentative und gut auszählbare Anzahl von Spermien an die Oozyten band.
Sowohl in Kontrollmedium (NK) als auch in Kapazitationsmedium (MW) vorinkubierte
Spermaproben wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen 5−10 reifen Oozyten je
Koinkubationstropfen zugegeben. Die geschätzte Gesamtmotilität der Spermien betrug nach
120-minütiger Koinkubation durchschnittlich 55%.
Die Anzahl gebundener Spermien pro Oozyte stieg mit der Spermienkonzentration. Bei einer
Konzentration von 100×106 Spermien mL
−1 waren die gebundenen Spermien nur noch schwer
voneinander zu differenzieren (Abb. 4.5., Tab. 4.1). Außerdem zeigten die Spermien nach
Vorinkubation in MW eine 1.4- bis 2.6-fach höhere Bindungsrate als in NK. Bei
Koinkubation mit einer Konzentration von 25×106 Spermien mL
−1 waren durchschnittlich 28
(NK) bzw. 60 (MW) Spermien, mit 50×106 Spermien mL
−1 48 (NK) bzw. 122 (MW)
Spermien pro Oozyte gebunden (Tab. 4.1.).
Aufgrund der Ergebnisse aus Experiment I war zu erwarten, dass der Zusatz von CaIP und
Procain zu den Spermaproben zu einer Steigerung der Bindungsraten führen würde. Daher
wurde für die Experimente zur Bestimmung der Spermien-Oozyten-Bindung nach Induktion
fertilisationsassoziierter Reaktionen durch Inkubation in MW oder Zusatz von CaIP und
Procain eine Konzentration von 25×106 Spermien mL
−1 zur Koinkubation mit den porzinen
Oozyten verwendet. Diese Konzentration entsprach einer Spermienzahl von 2.5×105 je
Koinkubationstropfen von 100 µL mit 20 Oozyten.
Da in diesem Versuchsteil lediglich zwei Ejakulate eines Hengstes verwendet wurden, wurde
auf eine statistische Auswertung verzichtet.
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
69
Tabelle 4.1.: Mittlere Anzahl der gebundenen equinen Spermien pro in vitro gereifter
Schweineoozyte in Abhängigkeit von der Spermienkonzentration und dem Präinkubations-
medium.
Spermien-
konzentration (Sp. mL
−1)
Spermien pro
Oozyte nach
Präinkubation der
Spermien in NK
Spermien pro
Oozyte nach
Präinkubation der
Spermien in MW
1×106 3,6 5,2
25×106 27,6 59,4
50×106 47,6 122,4
100×106 n.a. > 300 n.a. > 300
Die Spermien wurden in NK (Kontrollmedium) oder MW (Kapazitationsmedium) für 120
min präinkubiert und dann für weitere 120 min mit den Oozyten koinkubiert. Die HOECHST-
gefärbten Spermien wurden an je 10 reifen Oozyten ausgezählt.
n.a. = nicht auszählbar.
Die für die Bindungsassays ausgewählte Spermienkonzentration ist hellgrau unterlegt.
70
Abbildung 4.5.:
Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten nach 120 min
Koinkubation mit unterschiedlich konzentrierten equinen Spermien (Phasenkontrast-
mikroskopie nach HOECHST-Färbung).
→: Zona pellucida, Sp.: Spermien, MII: Metaphase II, PK: Polkörper
A: Spermienkonzentration: 1 x 106 Sp. mL
-1. Bindung vereinzelter Spermien.
B: Spermienkonzentration: 25 x 106 Sp. mL
-1. Multifokale Spermienbindung. *
C: Spermienkonzentration: 50 x 106 Sp. mL
-1. Diffuse Spermienbindung mit guter
Differenzierbarkeit. *
D: Spermienkonzentration: 100 x 106 Sp. mL
-1. Diffuse Spermienbindung mit schlechter
Differenzierbarkeit. *
* Der Kernstatus (MII) der Oozyte ist in der abgebildeten Ebene nicht dargestellt.
Sp.
PK
M II
A
Sp.
C
Sp.
D
Sp. B
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
71
4.2.3. Überprüfung der Inkubationsbedingungen für die equinen Spermien
Bei 120-minütiger Inkubation der Spermiensuspensionen in geschlossenen Röhrchen
im Wasserbad (37°C) setzten sich Spermien und anderes zelluläres Material ab. Die
Bindungsrate an den porzinen Oozyten war für ein Ejakulat desselben Hengstes im Vergleich
zu einer Vorinkubation in einem Röhrchen mit 50% Luftüberstand um 44% reduziert.
Um einen möglichen Zusammenhang dieser Beobachtungen mit der geschlossenen
Inkubationsform zu evaluieren, wurde diese über 240 min gegen eine offene Inkubation
getestet. Außerdem wurde der Einfluss der Spermienkonzentration (10 bzw. 25×106 Spermien
mL−1
) und des Inkubationsmediums auf die Spermienmotilität, den pH-Wert im Medium und
die makroskopische Erscheinung der Spermiensuspensionen evaluiert.
Der Anteil progressiv motiler Spermien (PMS) war nach 240 min Inkubation in den
geschlossen inkubierten Proben (9 bzw. 19% in NK, 1.5 bzw. 6% in MW) im Vergleich zu
den offen inkubierten Proben (21 bzw. 26% in NK, 7.5 bzw. 7% in MW) geringer. Der PMS
in MW inkubierter Spermien war abhängig von den inkubierten Spermienkonzentrationen
insgesamt (1.5% bzw. 7.5%) geringer als für in NK inkubierte Spermien (9% bzw. 26%). Die
Spermienkonzentration (10 bzw. 25×106 Sp. mL
−1) zeigte für die Inkubation in NK (5 bzw.
10% Differenz) einen stärkeren Einfluss auf den PMS als in MW (1 bzw. 4% Differenz)
(Abb. 4.6. A). Für die VCL war nach 240 min im geschlossenen System eine deutliche
Verringerung zu verzeichnen. In MW betrug der Werteabfall für 10 bzw. 25×106 Sp. mL
−1 61
bzw. 65.2 µm s−1
und in NK 0 bzw. 14.4 µm s−1
.
In geschlossen inkubierten Proben kam es medienabhängig über die Zeit zu einem Abfall des
pH-Wertes (auf pH zwischen 6.75 und 7.5). Bei offener Inkubation in NK traten über 240 min
kaum pH-Änderungen auf (pH 7.5 bzw. 7.75), wohingegen in MW unabhängig von der
Spermienkonzentration ein Anstieg festgestellt wurde (auf pH 7.5 bzw. 8.5) (Abb. 4.6. B).
Bei pH ≤ 7.0 war durch grobsinnliche Beurteilung ein säuerlicher Geruch wahrnehmbar. Bei
geschlossener Inkubation agglutinierten Spermien nach 60 min am Boden der Röhrchen. Dies
war verstärkt in NK und mit höherer Spermienkonzentration (25×106 Spermien mL
−1)
festzustellen.
Aufgrund dieser Ergebnisse erfolgte die Vorbereitung der Spermien auf die Koinkubation mit
porzinen Oozyten zur Erfassung von Bindungsraten im offenen Inkubationssystem.
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
72
4.2.4. Einfluss unterschiedlicher Spermienaufbereitungen auf die Bindungsfähigkeit
equiner Spermien an in vitro maturierte porzine Oozyten und auf die Oozyten-
morphologie
Durch einen heterologen Bindungsassay sollte der Einfluss unterschiedlicher
Spermienaufbereitungen zur Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen auf die
Bindungsfähigkeit der Spermien an die Zona pellucida der porzinen Eizellen und die
Oozytenmorphologie evaluiert werden.
Spermienaufbereitungen in Kontroll- (NK) und Kapazitationsmedium (MW) mit bzw. ohne
Zusatz von CaIP und Procain und nach Reduktion des Reagenziengehaltes durch
Zentrifugation sowie in INRA82-Magermilchverdünner vorinkubierte Spermien wurden mit
in vitro maturierten porzinen Oozyten inkubiert.
pH
Pro
gr.
mo
tile
Sp
. (%
)
A
Abbildung 4.6.:
Anteil progressiv motiler Spermien (A) und pH-Wert (B) in Spermiensuspensionen mit
unterschiedlicher Konzentration bei geschlossener (zu, gestreifte Balken) und offener (o,
ausgefüllte Balken) Inkubation in Kapazitationsmedium (MW; grün, violett) oder Kontrollmedium
(NK; orange, blau, rot) über 240 min.
Inkubation mit 10 ×106 Spermien mL
−1 (blau, grün) bzw. 25 ×10
6 Spermien mL
−1 (rot, violett).
A: Progressiv motile Spermien (%) nach 240 min Inkubation.
B: pH-Wert: Basisprobe mit 100 ×106 Spermien mL
−1 in NK (orange) vor der Inkubationszeit;
verdünnte Proben nach 10 und 240 min Inkubation.
ERGEBNISSE ___________________________________________________________________
73
Die fluoreszenzmikroskopische Auswertung der Spermien-Oozyten-Komplexe nach Anfärben
mit HOECHST 33342 ergab im Mittel die höchste Bindungsrate für in INRA82-
Magermilchverdünner transportierte und vorinkubierte Spermien (durchschnittlich ~90 Sp.
pro Oozyte). Der Unterschied zu den Bindungsraten der Spermien aller anderen
Aufbereitungen war hochsignifikant (p < 0.0001) (Abb. 4.7., A). Die Vorinkubation in NK im
Vergleich zu MW resultierte in einer mehr als doppelt so hohen Anzahl gebundener Spermien
pro Oozyte (26 vs. 12). Die mit den induzierenden Reagenzien CaIP und Procain
aufbereiteten Spermiensuspensionen wiesen ebenfalls geringe Bindungsraten auf. Diese
wurden durch Zentrifugation der Proben zur Reduktion des Reagenziengehaltes im Medium
zusätzlich leicht verringert (Proc nz: 11 vs. Proc z: 8 und CaIP nz: 13 vs. CaIP z: 10).
Insgesamt unterschieden sich die Spermienbindungsraten sowohl inter- als auch
intraindividuell sehr stark (Abb. 4.7., B). Ferner war die Anzahl gebundener Spermien für die
einzelnen Oozyten eines Koinkubationstropfens sehr variabel.
Bei Betrachtung der Spermien-Oozyten-Komplexe fiel auf, dass das Ooplasma einiger
Oozyten eine abnormale, unregelmäßige Struktur aufwies (Abb. 4.8.). Diese Veränderungen
waren für alle Spermienaufbereitungen (in NK oder MW mit und ohne CaIP oder Procain) zu
verzeichnen. Oozyten, die mit in INRA82-Magermilchverdünner vorinkubierten Spermien
koinkubiert waren, zeigten diese Ooplasmaveränderungen nicht (Tab. 4.2.). Der größte Anteil
der Ooplasmaveränderungen trat bei Oozyten auf, die mit CaIP oder Procain vorbehandelten
und zentrifugierten Spermien koinkubiert wurden (CaIP z: 7%, Proc z: 9%). Insgesamt
wurden Ooplasmaabweichungen bei 5.4% aller analysierten Oozyten beobachtet (Tab. 4.2.,
Abb. 4.9.).
74
Abbildung 4.7.:
A: Anzahl gebundener equiner Spermien an in vitro maturierte porzine Oozyten nach 120 min
Koinkubation.
Spermienaufbereitungen: 120 min Präinkubation in NK bzw. MW oder in INRA82-
Magermilchverdünner (grün, rosa); 85-110 min Präinkubation in MW dann 10 min mit CaIP (blau)
oder Procain (gelb) mit (z) oder ohne (nz, schraffiert) anschließende Zentrifugation.
Das Diagramm zeigt die Mittelwerte und Standardabweichungen für sieben Ejakulate von vier
Hengsten an 870 Oozyten.
** = Unterschied zu allen anderen Behandlungen p < 0.001
* = Unterschied zwischen nicht zentrifugierten und zentrifugierten Proben mit Procainzusatz p < 0.05.
B: Spermienbindungsraten an in vitro maturierte porzine Oozyten für zwei verschiedene Ejakulate (a,
b) desselben Hengstes.
0
25
50
75
100Sp
erm
ien
je O
ozy
te
A S
perm
ien p
ro O
ozyte
*
** S
perm
ien p
ro O
ozyte
B
75
Sp
.
A
PK
B
Abbildung 4.8.:
Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten mit verändertem
Ooplasma nach 120 min Koinkubation mit equinen Spermien (Phasenkontrast-Dunkelfeld nach
HOECHST-Färbung). Trotz der Ooplasmaabweichungen sind Spermien (Sp.) an der Zona pellucida
(→) gebunden (A) und Polkörper (PK) als Zeichen der Kernreifung erkennbar (B).
76
Tabelle 4.2.:
Anzahl und prozentualer Anteil in vitro maturierter porziner Oozyten mit verändertem
Ooplasma nach 120 min Koinkubation mit unterschiedlich aufbereiteten equinen Spermien.
Spermienaufbereitungen: 120 min Präinkubation in NK bzw. MW oder in INRA82-
Magermilchverdünner; 85-110 min Präinkubation in MW dann 10 min mit CaIP oder Procain
mit (z) oder ohne (nz) anschließende Zentrifugation.
Medium Oozyten
gesamt
(n)
Oozyten mit
verändertem
Ooplasma (n)
Oozyten mit
verändertem
Ooplasma (%)
NK 186 8 4,30
MW 185 6 3,24
CaIP nz 184 12 6,52
CaIP z 180 13 7,22
Proc nz 186 11 5,91
Proc z 188 16 8,51
INRA 82 114 0 0,00
Gesamt 1223 66 5,4
Oo
zyte
n m
it
verä
ndert
em
Oopla
sm
a (
%)
Abbildung 4.9.:
Anteil (%) in vitro maturierter porziner Oozyten mit verändertem Ooplasma nach 120 min
Koinkubation mit unterschiedlich aufbereiteten equinen Spermien.
Spermienaufbereitungen: 120 min Präinkubation in NK bzw. MW oder in INRA82-
Magermilchverdünner (grün, rosa); 85-110 min Präinkubation in MW dann 10 min mit CaIP (blau)
oder Procain (gelb) mit (z) oder ohne (nz, schraffiert) anschließende Zentrifugation.
Das Diagramm zeigt die Mittelwerte für eine Gesamtzahl von 1223 untersuchten Oozyten unter
Verwendung von insgesamt zehn Ejakulaten sieben verschiedener Hengste.
DISKUSSION ___________________________________________________________________
77
5 DISKUSSION
Die In-Vitro-Fertilisation (IVF) mit equinen Gameten stellt im Bereich der assistierten
Reproduktionstechniken eines der wichtigsten Forschungsthemen für diese Spezies dar. Trotz
mehrerer Jahrzehnte intensiver Arbeit wird diese Technik beim Pferd noch nicht routinemäßig
angewandt. IVF-Protokolle, wie sie bei anderen Nutztierarten (v.a. Rind) angewendet werden,
konnten nicht erfolgreich übernommen werden. Daher müssen speziesspezifische Verfahren
zur Vorbereitung der Oozyten und Spermien auf die Fertilisation unter Laborbedingungen
entwickelt werden. Im Einzelnen müssen die Oozyten gewonnen und in vitro maturiert
werden, bei den Spermien müssen nach ihrer Gewinnung die fertilisationsassoziierten
Reaktionen Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion ausgelöst werden. Obwohl
einzelne Verfahrensschritte bereits erfolgreich in vitro durchgeführt werden können, läuft die
IVF equiner Gameten zumeist fehlerhaft oder unvollständig ab, was in sehr geringen
Entwicklungsraten frühembryonaler Stadien resultiert.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Induzierbarkeit fertilisationsassoziierter Reaktionen
equiner Spermien in vitro zu untersuchen und die Auswirkungen ausgewählter
Inkubationsbehandlungen auf die Bindungsfähigkeit equiner Spermien an porzine Oozyten zu
testen.
5.1. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien durch
Inkubation in einem Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen Medium
Zunächst wurde die Effektivität der Inkubation equiner Spermien in einem
Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen Medium (modifiziertes Whittens-Medium, MW)
zur Induktion der Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion evaluiert. Vor der
Inkubation zur Induktion der fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen wurden die
Hengstspermien nach ihrer Gewinnung durch Zentrifugation im Kontrollmedium aufbereitet,
um im Überstand enthaltene Dekapazitationsfaktoren des Seminalplasmas zu reduzieren.
SUZUKI et al. (2002) zeigten, dass das Reduzieren des Seminalplasmaanteils für die
Induktion der Kapazitation vorteilhaft ist, daher wurden geringe zu erwartende Verluste hoch
motiler Spermien, die wieder in den Überstand aufgeschwommen waren, toleriert.
DISKUSSION ___________________________________________________________________
78
5.1.1. Einfluss des Inkubationsmediums auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei
equinen Spermien
Mithilfe der Analyse von Parametern, die als Merkmale der Kapazitation,
Hyperaktivierung und Akrosomreaktion von Spermien etabliert sind, konnte die Eignung des
modifizierten Whittens-Mediums für die Induktion dieser Prozesse nachgewiesen werden. Im
Kontrollmedium (ohne Bikarbonat, Kalzium und BSA) wurden diese Reaktionen nicht
ausgelöst.
Die Inkubation von Spermien in Bikarbonat- und BSA- haltigen Medien zur Vorbereitung auf
die IVF findet in den Protokollen für mehrere Spezies Anwendung. Für equine Spermien wird
in Anlehnung an die Ergebnisse von MC PARTLIN et al. (2008) von vielen Arbeitsgruppen
das modifizierte Whittens-Medium zur Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen genutzt,
da dieses Medium sich in der Studie im Vergleich mit TALP und BWW als das effektivste
erwies. Dabei wurden Bikarbonat und BSA als die ausschlaggebenden Komponenten im
Medium identifiziert. ORTGIES et al. (2012) beobachteten für Whittens-Medium gegenüber
Tyrode-Medium außerdem einen protektiven Effekt auf die Plasmamembran der Spermien.
Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde für die Spermieninkubationen in der vorliegenden
Arbeit ebenfalls ein modifiziertes Whittens-Medium gewählt, welches zusätzlich
Kalziumchlorid enthielt.
Das im Medium enthaltene Bikarbonat beeinflusst als Ion die biochemischen Vorgänge
während der Spermienreaktionen und fördert v.a. die PTP und Änderungen im
Membranpotential während der Kapazitation (VISCONTI u. KOPF 1998).
Extrazelluläre Kalziumverbindungen erleichtern die Induktion der Kapazitations- und
Akrosomreaktionsvorgänge (FLESCH u. GADELLA 2000; RATHI et al. 2001).
BSA als (Chole-)Sterol-Akzeptor wird zugesetzt, da es die Abgabe und die Umverteilung von
Cholesterol während der kapazitationsbedingten Neuordnung der Spermienmembran und
somit die Spermien-Oozyten-Interaktion positiv beeinflusst (VISCONTI et al. 1999;
GADELLA u. BOERKE 2016). Diesen Effekt von BSA auf den Cholesterolefflux bei der
Kapazitation equiner Spermien zweifelten MACÍAS-GARCÍA et al. (2015) an, sie konnten
aber andere kapazitationsassoziierte Wirkungen von BSA nicht ausschließen. Allgemein ist zu
beobachten, dass es in BSA-haltigen Medien vermehrt zur Agglutination von Spermienköpfen
kommt (BROMFIELD et al. 2014). Dies konnte hengstindividuell in unterschiedlicher
DISKUSSION ___________________________________________________________________
79
Ausprägung auch in der vorliegenden Studie beobachtet werden (Kap. 4.1.1.). Es ist davon
auszugehen, dass aufgrund dessen die Messgenauigkeit der CASA- und durchfluss-
zytometrischen Analysen beeinträchtigt wurde. Da jedoch weniger die absoluten Werte als
vielmehr die Entwicklungen der untersuchten Merkmale als aussagekräftige Ergebnisse zu
werten sind, kann die BSA-bedingte Spermienagglutination weitgehend unberücksichtigt
bleiben. Alternativ zu BSA wurden in Studien auch auch PVA (Polyvinylalkohol) oder
Cyclodextrine als nichttierische Sterolakzeptoren eingesetzt, die zugleich eine stärkere
Wirkung zeigten und weniger Spermienagglutinationen bewirkten (LOUX et al. 2013;
BROMFIELD et al. 2014).
Als Kontrollmedium (NK) wurde entsprechend anderen IVF-Protokollen für Pferdesperma
(MC PARTLIN et al. 2008) das MW ohne Bikarbonat, BSA und Kalzium (CaCl) genutzt.
BROMFIELD et al. (2014) zeigten, dass ein solches Kontrollmedium auch als
Kurzzeittransport-Medium (ca. 4 Std.) geeignet ist, da während der Inkubation in diesem
Medium weniger fertilisationsassoziierte Spermienreaktionen auftreten als in
Magermilchverdünner. Auch für die in der vorliegenden Studie untersuchten
Spermienparameter waren während der vierstündigen Inkubation in NK keine signifikanten
Veränderungen der Parameterwerte und somit keine Induktion fertilisationsassoziierter
Spermienreaktionen zu verzeichnen. Dies spricht für die Eignung von NK als Transport- und
Spermienaufbereitungsmedium. So konnte auf einen magermilch- oder eidotterhaltigen
Transportverdünner verzichtet und mögliche, undefinierte Effekte von Verdünnerresten in den
Proben während der Versuche ausgeschlossen werden.
In der vorliegenden Studie wurde ein deutlicher Anstieg der Werte fertilisationsassoziierter
Spermienparameter zum Basiswert als eine Induktion der Spermienreaktionen interpretiert.
Insgesamt konnten starke inter- und intraindividuelle Varianzen in Bezug auf den zeitlichen
Verlauf und das Ausmaß der induzierten fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen
beobachtet werden, wie sie schon von PATRAT et al. (2002) beschrieben wurden. Auf den
Vergleich der Daten mit denen anderer Arbeitsgruppen oder empfohlenen Mindestwerten
(RATHI et al. 2001) wurde aufgrund dessen verzichtet.
DISKUSSION ___________________________________________________________________
80
5.1.2. Einfluss der Inkubationsbedingungen auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei
equinen Spermien
In MW war die stärkste Zunahme fertilisationsassoziierte Reaktionen kennzeichnender
Parameterwerte nach Inkubation über 60–120 min bei 37°C in offenen Röhrchen und
angefeuchteter Luft zu verzeichnen.
In einigen Studien wird eine Inkubationsatmosphäre aus angefeuchteter Luft mit 5% CO2
empfohlen, um den pH-Wert des Mediums konstant zu halten (ALM et al. 2001; HINRICHS
et al. 2002). Es wurde beobachtet, dass sich bei einer offenen Inkubation in angefeuchteter
Luft der pH-Wert zeitabhängig durch Abgasung von CO2 aus dem Medium und
Bikarbonatbildung erhöht (MC PARTLIN et al. 2008; MACÍAS-GARCÍA et al. 2015). Durch
diese pH-Werterhöhung im Inkubationsmedium wird v.a. die Kapazitationsreaktion durch
Induktion der PTP und verstärkten Kalziumeinstrom (GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ et al.
2012) und die Spermienhyperaktivierung (HINRICHS u. LOUX 2012; LOUX et al. 2013)
stimuliert. Daher wurden die Spermiensuspensionen in der vorliegenden Arbeit ebenfalls in
angefeuchteter Luft offen inkubiert und ein zeitabhängiger Anstieg des pH-Wertes im
Kapazitationsmedium auf 8.5 (nach 240 min) verzeichnet. Der pH-Wert des Kontrollmediums
blieb stabil. Die negativen Effekte der geschlossenen Inkubation wurden in Vorbereitung auf
den heterologen Bindungsversuch erkennbar. In geschlossenen Proben sank der pH-Wert auf
≤ 7, der Anteil motiler Spermien verringerte sich und die immotilen Spermien sedimentierten
in den Proben.
In Bezug auf die notwendige Inkubationszeit zur Induktion der Spermienreaktionen waren in
der vorliegenden Studie bereits nach 30 min Inkubation in MW erhöhte Parameterwerte für
die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion feststellbar, was die Ergebnisse von
ORTGIES et al. (2012) stützt. Maximale Werte waren nach 60 bis 120 min erreicht. Die
Inkubation in MW für mehr als 120 min resultierte in einer Verringerung der analysierten
Parameter. Dies steht den Ergebnissen von MC PARTLIN et al. (2008) entgegen, die eine
vier- bis sechsstündige Inkubationszeit in MW empfehlen und somit auch den dieser Studie
folgenden Spermien-Inkubationsprotokollen anderer Arbeitsgruppen für die equine IVF
(LANGE-CONSIGLIO et al. 2011; AMBRUOSI et al. 2013; DOUET et al. 2014a). Diese
empfohlene lange Inkubationszeit entspricht jedoch der Kapazitationsdauer equiner Spermien
von 6–8 Stunden in vivo (YANAGIMACHI 1994).
DISKUSSION ___________________________________________________________________
81
Die Messungen maximaler Parameterwerte nach 60–120 min Inkubation in MW in der
vorliegenden Arbeit war gleichbedeutend damit, dass nach dieser Inkubationszeit ein
maximaler Anteil der Spermienpopulation in der Probe die fertilisationsassoziierten
Reaktionen durchlaufen hatte. Subpopulationen der Spermien zeigten die Induktion der
Reaktionen in geringerem Maße über den gesamten Inkubationsverlauf von vier Stunden
(niedrigere Parameterwerte). Daraus kann geschlossen werden, dass das Auslösen der
Spermienreaktionen in vitro zeitlich gestaffelt in Subpopulationen stattfindet. Dies entspricht
der Heterogenität der individuellen Spermien in vivo, deren Reaktionen zu unterschiedlichen
Zeitpunkten auf Reize im weiblichen Genitale hin ausgelöst werden. Diese gestaffelte
Induktion von Spermienreaktionen einzelner Gruppen aus der Gesamtpopulation des
Ejakulates führt zur Ausdehnung des Zeitrahmens der Befruchtungsfähigkeit der Spermien
(GADELLA u. BOERKE 2016).
5.2. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen
Spermien durch Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain
Da fertilisationsassoziierte Reaktionen bei equinen Spermien in MW nach einer
Inkubationszeit von 60–120 min in hohem Maße ausgelöst werden konnten (Kap. 5.1.), wurde
eine Präinkubationszeit von 60 min in MW gewählt, um zu untersuchen, ob die
fertilisationassoziierten Reaktionen durch Zugabe von Kalzium-Ionophor A23187 (CaIP) und
Procain zusätzlich gesteigert werden können. Dazu wurde der Einfluss des Zusatzes der
Reagenzien in unterschiedlichen Konzentrationen auf die fertilisationsassoziierten
Spermienparameter evaluiert.
Da die Reagenzien nicht nur induzierende, sondern auch inhibierende Effekte auf die
Spermien zeigten und im Hinblick auf IVF-Versuche eine mögliche Embryotoxizität der
Reagenzien verringert werden sollte, wurden sie in den supplementierten Proben nach der
Induktion der Spermienreaktionen durch Zentrifugation und Resuspension reduziert und die
Auswirkungen dieser Maßnahmen auf die Gameten untersucht.
DISKUSSION ___________________________________________________________________
82
5.2.1. Einfluss von Kalzium-Ionophor A23187 auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei
equinen Spermien
Nach 60-minütiger Präinkubation in MW und weiterer Inkubation mit CaIP für 30 min
zeigten sich maximale Parameterwerte für den intrazellulären Kalziumgehalt equiner
Spermien unter Verwendung einer Konzentration von 3 µM CaIP. Auch ALM et al. (2001)
und HINRICHS et al. (2002) konnten die Kapazitation equiner Spermien mit 3–7.14 µM CaIP
induzieren.
Die Motilitätsparameter der Spermien waren in der vorliegenden Arbeit durch Zusatz von
CaIP in höheren Konzentrationen als 0.5 µM stark eingeschränkt. Da die
Plasmamembranintegrität vom CaIP-Zusatz in unterschiedlichen Konzentrationen
unbeeinträchtigt blieb, konnte gezeigt werden, dass die durch CaIP immobilisierten Spermien
nicht avital waren. Vielmehr zeigten sie ein mikroskopisch sichtbares hochfrequentes
Kopfzittern mit flagellarer Starre (Kap. 4.1.2.). Auch RATHI et al. (2001) beschrieben die
Lähmung der gesamten Population equiner Spermien nach CaIP-Zugabe und dreistündiger
Inkubation bei noch vorhandener Vitalität. HINRICHS et al. (2002) dagegen konnten weder
auf die Motilität noch auf die IVF-Rate equiner Spermien einen Effekt unterschiedlicher
CaIP-Konzentrationen feststellen. Die flagellare Starre nach CaIP-Supplementierung wurde
ebenfalls für Mausspermien beschrieben und mit einem exzessiv hohen intrazellulären
Kalziumgehalt begründet (TATENO et al. 2013). In dieser Studie wurde außerdem gezeigt,
dass die Spermien nach dem Abzentrifugieren des CaIP-haltigen Mediums und 30-minütiger
´Erholungszeit´ Merkmale der Hyperaktivierung aufwiesen. In der vorliegenden Arbeit
konnten auch für equine Spermien nach Abzentrifugieren des Ionophor-haltigen Überstandes
der Probe und 15-minütiger Nachinkubationszeit hyperaktivierte Bewegungsmuster in
begrenztem Maße festgestellt werden. Vergleichbare Ergebnisse für equine Spermien
beschrieben LOUX et al. (2013), die Spermien mithilfe hoher CaCl2-Konzentrationen oder
Ionomycin immobilisierten und diesen Effekt durch Zugabe von Kalzium- oder
Kalziumkanal-Antagonisten aufheben konnten. Sie vermuteten, dass die Immobilisierung
equiner Spermien durch die Überschreitung einer Art intrazellulärer Kalziumgrenze bedingt
ist.
Die Akrosomreaktion konnte in der vorliegenden Studie nicht durch Zugabe von CaIP zu in
MW präinkubierten Spermien induziert werden. Der Anteil akrosomreagierter Spermien
DISKUSSION ___________________________________________________________________
83
entsprach dem Wert, der nach 60-minütiger Inkubation in MW ermittelt wurde. Dies ist
gegensätzlich zu den Ergebnissen von RATHI et al. (2001), MC PARTLIN et al. (2008) und
RUNCAN et al. (2014), die die Akrosomreaktion bei zuvor in bikarbonathaltigem Medium
kapazitierten Hengstspermien mit CaIP A23187 auslösten. Eine in der vorliegenden Arbeit
beobachtete, etwa 10 prozentige Steigerung des Anteils akrosomreagierter Spermien durch die
Zentrifugation zur Reduktion des CaIP-Gehaltes im Medium beruht offenbar auf der
physikalischen Induktion der Akrosomreaktion durch die Zentrifugationskräfte, wie
GADELLA und HARRISON (2000) sie beschrieben.
5.2.2. Einfluss von Procain auf fertilisationsassoziierte Reaktionen bei equinen Spermien
Der Zusatz von 2.5–5 mM Procain zu in MW präinkubierten equinen Spermien
steigerte deren Hyperaktivierungsparameter VCL und ALH auf maximale Werte. Die
Plasmamembran- und Akrosomintegrität sowie der intrazelluläre Kalziumgehalt der Spermien
blieben durch den Zusatz von Procain auch in höheren Konzentrationen unbeeinträchtigt.
Für mit Procain behandelte Proben ist eine gewisse Fluoreszenzlöschung insbesondere für die
Fluo-3 Fluoreszenz beschrieben (LOUX et al. 2013). Somit ist der anhand der Fluo-3
Fluoreszenzintensität bestimmte Kapazitationsparameter in der vorliegenden Studie für mit
Procain behandelte Proben nicht zweifelsfrei auswertbar. In weiterführenden Arbeiten sollten
Procain supplementierte Proben mit anderen Kapazitationsanalyseverfahren als der Fluo-3
Färbung untersucht werden.
Auch MC PARTLIN et al. (2009) und ORTGIES et al. (2012) zeigten, dass Procain
ausschließlich die Parameterwerte der Hyperaktivierung erhöht und andere fertilisations-
assoziierte Spermienparameter unbeeinträchtigt bleiben. Für in Kapazitationsmedium
präinkubierte Spermien erwies sich in beiden Studien eine Konzentration von 2.5–5 mM
Procain als optimal zur Hyperaktivierung. Somit wird die in der vorliegenden Studie als
optimal bewertete Procainkonzentration von 2.5 mM bestätigt. Die isolierte Wirkweise von
Procain ohne Beeinflussung weiterer fertilisationassoziierter Spermienparameter ist für ein
induzierendes Reagens ungewöhnlich und lässt in Verbindung mit der Beobachtung von MC
PARTLIN et al. (2009), dass Procain ein kreis- bzw. sternenförmiges und kein physiologisch
biphasisches Bewegungsmuster der Hyperaktivierung hervorruft, den Zweifel an der
Fähigkeit zur Penetration der Zona pellucida durch mit Procain hyperaktivierte Spermien zu.
DISKUSSION ___________________________________________________________________
84
5.2.3. Induktion der Hyperaktivierung bei equinen Spermien
Hyperaktive Bewegungsmuster mit erhöhten VCL- und ALH-Werten waren in der
vorliegenden Arbeit in etwa gleichem Maße durch Inkubation in MW für 120 min und durch
Zusatz von 2.5–5 mM Procain zu präinkubierten Proben sowie in geringerem Maße nach
Zentrifugation CaIP-supplementierter Proben induzierbar.
Weder MC PARTLIN et al. (2008) noch ORTGIES et al. (2012) beobachteten hyperaktivierte
Bewegungsmuster nach Inkubation der Spermien in Whittens-Medium in angefeuchteter Luft,
sie konnten diese erst durch Zusatz von Procain induzieren. Als Ursache für die Induktion der
Hyperaktivierung durch Inkubation in MW als Ergebnis der vorgelegten Studie kommt im
Vergleich zum Medium der genannten Arbeitsgruppen die Verwendung einer anderen
Kalziumquelle (CaCl) in MW infrage. HINRICHS und LOUX (2012) erläuterten mögliche
Funktionen von Kalzium bei der Hyperaktivierung von Spermien unterschiedlicher Spezies
und folgerten, dass Kalzium in Verbindung mit einem erhöhten pH-Wert im Medium zur
Aktivierung von Dyneinärmchen und somit zu einem verstärkten Flagellenschlag führen
kann. LOUX et al. (2014) vermuteten, dass die Kalziumregulation der Flagellenbewegung in
equinen Spermien anders als in den Spermien anderer Tierarten erfolgt und die
Hyperaktivierung equiner Spermien in vivo auf anderem Wege induziert wird als durch den
Einfluss von Kalzium und pH-Wert.
Die Induktion der Hyperaktivierung equiner Spermien in der vorliegenden Studie durch
Zugabe von 2.5 mM Procain entspricht, wie bereits beschrieben, den Ergebnissen von MC
PARTLIN et al. (2009), die Befruchtungsraten von 61% bei equinen Oozyten durch mit
Procain hyperaktivierte Spermien erzielen konnten. Sie folgerten daraus, dass für die IVF ein
Mindestanteil hyperaktivierter Spermien für die Koinkubation mit Oozyten nötig ist, der nur
durch Zusatz von Procain erreicht werden kann. Auch nach CaIP induzierter Hyperaktivierung
befruchteten equine Spermien in vitro maturierte Pferdeoozyten, die sich aber nicht zu
Zygoten weiterentwickelten (ALM et al. 2001).
DISKUSSION ___________________________________________________________________
85
5.3. Heterologer Bindungsassay mit in vitro maturierten porzinen Oozyten und equinen
Spermien
Im heterologen Bindungsassay wurden equine Spermien mit in vitro maturierten
porzinen Oozyten koinkubiert, um die Oozytenbindungsfähigkeit der Spermien zu prüfen.
Zusätzlich wurde der Einfluss der Spermienaufbereitung auf die Oozytenmorphologie
evaluiert.
Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, erkennen equine Spermien porzine Oozyten
und binden abhängig von ihrer Aufbereitung an sie, obwohl die ZP equiner und porziner
Oozyten speziesspezifische Unterschiede in der elektronenmikroskopischen Struktur und der
Glykoproteinzusammensetzung aufweist (MUGNIER et al. 2009b; ACCOGLI et al. 2014).
MORAES et al. (2015) beschrieben, dass Hengstspermien auch an bovine Oozyten und die
Perivitellinmembran von Hühnereiern binden.
Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse eines heterologen mit einem homologen Bindungsassay
ist nach MUGNIER et al. (2009b) eingeschränkt, da equine Spermien schlechter an porzine
als an equine Oozyten binden. Dagegen banden porzine Spermien genauso gut an porzine wie
an equine Oozyten, sodass eine erhöhte Selektivität der ZP porziner Oozyten im Vergleich zur
equinen ZP oder eine stärkere Selektion durch die Hengstspermien zu vermuten ist.
Wie bei der Induzierbarkeit der fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen waren in der
vorliegenden Arbeit auch in Bezug auf die Bindungsfähigkeit der Spermien starke intra- und
interindividuelle Unterschiede feststellbar, die ebenfalls von BALAO DA SILVA et al. (2013)
beobachtet wurden. Ferner zeigten die Oozyten desselben Koinkubationstropfens deutliche
Unterschiede in der Anzahl gebundener Spermien. Eine individuelle Bindungsbereitschaft der
ZP verschiedener Oozyten wurde schon von FAZELI et al. (1995) beschrieben.
Aufgrund der in der vorliegenden Studie ermittelten deutlichen Bindungsunterschiede
verschieden aufbereiteter Spermien können anhand der Ergebnisse des heterologen
Bindungsassays Aussagen über die mögliche Fertilisationspotenz der Spermien getroffen und
Spermienaufbereitungen für weiterführende Versuche ausgewählt werden. FAZELI et al.
(1995) beschrieben eine Korrelation der Bindungsraten von Spermien an die ZP reifer
Oozyten mit den Fertilitätsindices von Hengsten. Daher ist es denkbar, den heterologen
Bindungsassay mit equinen Spermien zukünftig zur Erhebung von Fertilitäts-Indices für
Hengste anzuwenden.
DISKUSSION ___________________________________________________________________
86
5.3.1. Einfluss des Inkubationsmediums und des Zusatzes von Kalzium-Ionophor
A23187 oder Procain auf die Bindungsfähigkeit equiner Spermien
In Kontrollmedium vorinkubierte Spermien wiesen bessere Bindungsraten auf als
Spermien, bei denen die fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen durch Inkubation in
MW oder durch Zugabe von CaIP oder Procain induziert worden waren. Auch MACÍAS-
GARCÍA et al. (2015) verzeichneten keinen positiven Effekt auf die Bindungsfähigkeit
equiner Spermien durch Präinkubation in Whittens-Medium. Nicht kapazitierte equine
Spermien banden auch an Eileiterexplantate in höheren Raten (LEEMANS et al. 2014).
In der vorliegenden Studie war während der Inkubation in Bikarbonat-haltigem MW ein
initialer Verlust plasmamembranintakter Spermien zu beobachten. Der erhöhte Anteil
plasmamembrangeschädigter Spermien nach Präinkubation in MW begründet möglicherweise
die geringere Bindungsfähigkeit in MW- im Vergleich zu in NK-präinkubierten Spermien.
HARRISON et al. (1993) fanden heraus, dass der Zusatz von Bikarbonat den Anteil
membrangeschädigter Spermien erhöht. RATHI et al. (2001) verzeichneten 55%
membrangeschädigte Spermien nach 5-stündiger Inkubation in Kapazitationsmedium.
Nach den Ergebnissen von MC PARTLIN et al. (2009) sind nur kapazitierte und
hyperaktivierte equine Spermien in der Lage, Oozyten zu befruchten. Auch für andere Spezies
wurde festgestellt, dass nur kapazitierte Spermien die Zona pellucida (ZP) von Oozyten
erkennen und an sie binden können (YANAGIMACHI 1994).
Da in der vorliegenden Studie in NK vorinkubierte, nicht kapazitierte Spermien gute
Bindungsraten aufwiesen, ist zu vermuten, dass während des Bindungsassays Kapazitations-
prozesse im FCS- und BSA-haltigen Koinkubationsmedium stattgefunden haben.
BROMFIELD et al. (2014) und MACÍAS-GARCÍA et al. (2015) wiesen für die
Serumkomponente BSA und das Analogon Methyl-ß-Cyclodextrin eine fördernde Wirkung
auf die ZP-Bindungsfähigkeit equiner Spermien nach. Ob es sich dabei um eine
kapazitationsbedingte oder unspezifische Wirkung der Komponenten handelt, ist nicht
beschrieben. Nach Zugabe von FBS zu TCM 199 oder Whittens-Medium beobachteten
GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ et al. (2015) eine höhere Kapazitationsrate equiner Spermien als
in BSA supplementierten Medien. In der vorliegenden Arbeit wurde eine gute Verträglichkeit
des Koinkubationsmediums durch eine geschätzte Spermienmotilität von 55% nach 120-
minütiger Koinkubation belegt. In weiterführenden Studien sollte der Einfluss des
DISKUSSION ___________________________________________________________________
87
Koinkubationsmediums auf die fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen besonders unter
Berücksichtigung der einzelnen Serumkomponenten (FCS und BSA) erfolgen.
Der Zusatz von CaIP oder Procain zum MW steigerte die Spermien-Oozyten-Bindungsraten
gegenüber alleiniger Präinkubation in MW nicht. Auch BALAO DA SILVA et al. (2013)
konnten keinen Bindungsunterschied zwischen CaIP behandelten und unbehandelten equinen
Spermien feststellen.
Die geringsten Bindungsraten zeigten in der vorliegenden Studie Spermien, die zur Reduktion
des CaIP- oder Procaingehaltes im Medium zentrifugiert und resuspendiert worden waren.
Dies ist möglicherweise mit einem Verlust hoch motiler Spermien durch schnelles
Aufschwimmen nach der Zentrifugation und dem Verwerfen dieser Spermien mit dem
Medienüberstand zu erklären. Für diese Hypothese spricht der Nachweis hoher
Fertilitätsparameter für besonders hochmotile equine Spermien (Spermienselektion mittels
Dichtegradientenzentrifugation) durch MORATÓ et al. (2013).
Eine Spermienkonzentration von 2.5 x105 Spermien pro Koinkubationstropfen ermöglichte
eine gute Auszählbarkeit der gebundenen Spermien. Die Koinkubationszeit der Gameten
wurde auf zwei Stunden festgelegt und folgte so den Vorgaben von BALAO DA SILVA et al.
(2013), die zeigten, dass die Bindungsraten equiner Spermien sich bei einer
Koinkubationszeit von 1.5 oder 3 Std. in Kapazitationsmedium nicht unterschieden.
5.3.2. Einfluss der Inkubation in Magermilchverdünner auf die Bindungsfähigkeit
equiner Spermien
Die signifikant höchsten Bindungsraten wurden für Spermien verzeichnet, die in
INRA82-Magermilchverdünner transportiert und vorinkubiert waren. Auch COUNTINHO
DA SILVA et al. (2012, 2014) erzielten dreifach erhöhte Bindungsraten mit in (Kenneys-)
Magermilchverdünner inkubierten equinen Spermien an bovine oder equine Oozyten. Als
begünstigenden Faktor identifizierten sie im Verdünner enthaltene Caseine.
Möglicherweise beruhen die erhöhten Bindungsraten in Magermilchverdünner inkubierter
Spermien auf der Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in diesem Medium.
Erhöhte Werte mit diesen Spermienreaktionen assoziierter Parameter nach Inkubation in
Magermilchverdünner konnten im Vergleich zu einem BSA- und Bikarbonat-freien Medium
(BROMFIELD et al. 2014) sowie TALP (POMMER et al. 2002) gezeigt werden. Eine
DISKUSSION ___________________________________________________________________
88
Analyse fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen wurde in der vorliegenden Studie nach
Transport und Inkubation in Magermilchverdünner nicht durchgeführt.
Andererseits können die erhöhten Bindungsraten von Spermien dieser Proben auf einer
höheren Spermienviabilität (höherer Anteil motiler, plasmamembran- und akrosomintakter
Spermien) beruhen, die durch die nutritiven und membranprotektiven Komponenten des
Magermilchverdünners begünstigt ist. Daher wäre für weiterführende Untersuchungen zu
überprüfen, ob ein Zusatz von Milchproteinen zum Spermieninkubations- oder Fertilisations-
medium die Bindungs- und Fertilisationsfähigkeit equiner Spermien verbessert.
TABENER et al. (2010) und MORATÓ et al. (2013) zeigten, dass durch
Dichtegradientenzentrifugation vorselektierte Esel- und Pferdespermien mit hoher Viabilität
bovine Oozyten (ohne ZP) besser penetrierten als nichtselektierte Spermien. Eine
Spermienselektion stellt somit eine Möglichkeit der Optimierung von Befruchtungsraten mit
equinen Spermien dar.
Bei Betrachtung der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit fiel auf, dass im Zuge der
Bestimmung einer geeigneten Spermienkonzentration für die Koinkubation mit den porzinen
Oozyten (´Vorversuch´, Kap. 4.2.2.) die Bindungsrate der in MW präinkubierten Spermien
deutlich höher war als bei in NK präinkubierten Spermien. Dies war gegenläufig zu den
Ergebnissen der weiteren Bindungsversuche (´Hauptversuch´, Kap. 4.2.4.). Auch die
Bindungsraten insgesamt waren im `Vorversuch` höher als im `Hauptversuch`. Diese
Beobachtung kann ebenfalls durch eine möglicherweise herabgesetzte Spermienviabilität
erklärt werden, da die Transportzeiten für die Spermien des ´Hauptversuches´ doppelt so lang
waren wie für den ´Vorversuch´. In der Folge können die in NK transportierten Proben des
´Hauptversuches` während der 120-minütigen Vorinkubationszeit anfälliger für BSA-
abhängige Plasmamembranschädigungen durch Inkubation in MW gewesen sein (Kap.
5.3.1.). Eine durchflusszytometrische Überprüfung dieser Hypothese ist zu empfehlen.
DISKUSSION ___________________________________________________________________
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5.3.3. Einfluss des Spermieninkubationsmediums und des Zusatzes von Kalzium-
Ionophor A23187 oder Procain auf die Oozytenmorphologie
Bei 5.4% der beurteilten porzinen Oozyten fielen nach Koinkubation mit den equinen
Spermien Ooplasmaveränderungen auf. Davon ausgenommen waren Oozyten, die mit in
INRA82-Magermilchverdünner vorinkubierten Spermien koinkubiert wurden. Deutlich
verstärkt war der Anteil der Oozyten mit verändertem Ooplasma nach Koinkubation mit
Spermien, die in CaIP- oder procainhaltigen Medien inkubiert worden waren. Möglicherweise
besteht diesbezüglich ein Zusammenhang mit parthenogenetischen Veränderungen der
Oozyten.
Kalzium-Ionophore sind in der Lage, bei Oozyten ohne die Penetration durch ein Spermium
die Fortsetzung der Meiose zu stimulieren und erste Teilungsstadien zu induzieren (Kap.2.7.).
Diese Eigenschaft wird z.B. zur Erleichterung der Teilungsinduktion nach ICSI genutzt,
indem die sogenannte Oozytenaktivierung induziert wird, die mit einer Erhöhung des
intrazellulären Kalziumgehaltes der Oozyte und der Exozytose kortikaler Granula einhergeht
(LEEMANS et al. 2015b). ALONSO et al. (2015) beschrieben die parthenogenetische
Teilung equiner Oozyten mit einer Rate von 22 % nach Aktivierung durch Spermienextrakte
und das Ionophor Ionomycin. Im Gegensatz dazu konnten HINRICHS et al. (2002) equine
Oozyten nicht mit CaIP aktivieren.
LEEMANS et al. (2015b) fanden heraus, dass durch Procain neben der Hyperaktivierung
equiner Spermien auch die Zytokinese equiner Oozyten mit einer Rate von 60% induziert
wird. Bei den zytokinetisch aktivierten Oozyten war der pH-Wert des Zytoplasmas erhöht und
es bildete sich kein zweiter Polkörper aus. Die Entwicklung setzte sich bis zum 16-
Zellstadium fort. Die Parthenogeneserate von ca. 60% entspricht etwa den Fertilisationsraten
(bewertet anhand der Pronukleusbildung), die von MC PARTLIN et al. (2009) und
AMBRUOSI et al. (2013) für durch Procain hyperaktivierte equine Spermien postuliert
wurden. GOUDET et al. (2016) beschrieben nach Procainzusatz eine Parthenogeneserate von
11% bei equinen Oozyten und eine Fertilisationsrate von 15% (zwei Vorkerne) für
Eselgameten. Diese Daten lassen die Vermutung zu, dass erhebliche Anteile der nach IVF mit
Procain-behandelten Spermien beobachteten frühembryonalen Entwicklungsstufen nicht
durch Fertilisation sondern durch Parthenogenese entstanden sind. Aufgrund dessen waren
diese Mehrzeller nicht in der Lage, sich weiter zu entwickeln und arretierten im 8–16-
DISKUSSION ___________________________________________________________________
90
Zellstadium. Des Weiteren wurden in Procain-aktivierten Oozyten DNA-Fragmentationen
nachgewiesen (LEEMANS et al. 2015b). Diese kommen als mögliche Ursache für die in der
vorliegenden Arbeit gefundenen morphologischen Abweichungen der Oozyten infrage.
Die Reduktion des CaIP- und Procaingehaltes in den Spermiensuspensionen durch
Zentrifugation und Resuspension hatte keinen Einfluss auf den Anteil der Oozyten mit
Ooplasmaveränderungen. Daher wird für weiterführende Untersuchungen eine
Kontrollgruppe empfohlen, in der die Inkubationsmedien ohne Spermien mit oder ohne CaIP
und Procain den Koinkubationstropfen mit den Oozyten zugegeben werden, um
parthenogenetische Prozesse evaluieren zu können.
DISKUSSION ___________________________________________________________________
91
5.4. Schlussfolgerungen zur Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen
Spermien und ihrer Bindungsfähigkeit an porzine Oozyten
Die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion equiner Spermien konnten
durch eine 60- bis 120-minütige Inkubation in MW in angefeuchteter Luft induziert werden.
Demnach kann die von MC PARTLIN et al. (2008) beschriebene Inkubationszeit von bis zu
sechs Stunden in Kapazitationsmedien zur Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei
equinen Spermien deutlich verkürzt werden.
Der Zusatz von 3 µM CaIP erhöhte den intrazellulären Kalziumgehalt präinkubierter equiner
Spermien. Das Abzentrifugieren des CaIP-haltigen Überstandes resultierte in einer
geringfügigen Steigerung der ALH und VCL. Somit zeigten die Spermien Anzeichen der
Hyperaktivierung. Dieser Effekt wurde nach derzeitigem Kenntnisstand zuvor nicht bei
Hengstspermien beobachtet. Procain induzierte in einer Konzentration von 2.5 mM die
Hyperaktivierung der Spermien. Durch Zentrifugation und Resuspension konnten CaIP und
Procain nicht vollständig aus den Medien entfernt werden.
Im heterologen Bindungsassay wurde deutlich, dass equine Spermien grundsätzlich in der
Lage sind, porzine Oozyten zu erkennen und an sie zu binden.
In Magermilchverdünner vorinkubierte Spermien zeigten eine signifikant bessere
Bindungsfähigkeit im Vergleich mit in NK oder MW bzw. mit CaIP oder Procain
aufbereiteten Spermien. 5.4% der porzinen Oozyten wiesen nach Koinkubation mit
vorinkubierten equinen Spermien morphologische Abweichungen auf, insbesondere wenn
CaIP oder Procain zugesetzt worden waren. Bei Koinkubation mit in Magermilchverdünner
vorinkubierten Spermien traten keine Oozytenveränderungen auf.
Diese Ergebnisse zeigen zusammenfassend, dass eine Inkubation in MW und der Zusatz von
CaIP und Procain geeignet sind, die fertilisationsassoziierten Reaktionen bei equinen
Spermien zu induzieren. Diese Induktionsbehandlungen zeigen allerdings nur isoliert an den
Spermien positive fertilisationsassoziierte Effekte, während der Koinkubation mit porzinen
Oozyten resultieren sie in geringen Bindungsraten der Spermien und gehen mit
Ooplasmaveränderungen der Oozyten einher. Aufgrund dessen stellt sich die Frage, ob mit
den angewendeten etablierten Analyseverfahren das Reproduktionspotential der equinen
Spermien tatsächlich ausreichend bewertet werden kann. Ebenso ist zu bezweifeln, dass die
DISKUSSION ___________________________________________________________________
92
Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen in Vorbereitung auf die IVF überhaupt
gewinnbringend ist.
MACÍAS-GARCÍA et al. (2015) stellten für equine Spermien die Gültigkeit der für
Säugetierspermien allgemein etablierten Erkenntnisse über die Wirkung der üblicherweise in
Inkubationsmedien verwendeten Komponenten Bikarbonat, Kalzium und BSA auf die
Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in Frage. Sie vermuteten eine
speziesspezifische Regulation der Kapazitationsprozesse equiner Spermien, weshalb
standardmäßig verwendete Kapazitationsmedien diese Prozesse nicht induzieren können.
Diese Zweifel wurden von den Beobachtungen von GONZALEZ-FERNANDEZ et al. (2012)
gestützt. Sie konnten zeigen, dass die kapazitationsassoziierte Protein-Tyrosin-
Phosphorylierung nicht, wie von MC PARTLIN et al. (2008) postuliert, vom BSA-,
Bikarbonat- und Kalziumgehalt, sondern allein vom pH-Wert im Medium abhängt und BSA
und Kalzium die PTP bei physiologischen pH-Werten sogar inhibieren. Folglich äußerten sie
Zweifel an der grundsätzlichen Eignung der PTP als Kapazitationsparameter, auf den sich die
meisten Untersuchungen zur Kapazitation equiner Spermien stützen.
Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte Differenz zwischen dem Ausmaß der Induktion
fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen und der Oozytenbindungsrate bei equinen
Spermien führt zu der Empfehlung, weiterführende Untersuchungen weniger auf die
Erstellung von Protokollen zur Vorbereitung der Gameten auf die Fertilisation zu richten,
sondern den Fokus auf die Erfassung fertilisationsassoziierter Veränderungen von Spermien
und Oozyten während der Koinkubation, Bindung und Fertilisation zu legen. So können
möglicherweise weitere Erkenntnisse über die speziellen Anforderungen equiner Gameten an
In-Vitro-Bedingungen gewonnen und darauf abgestimmte IVF-Protokolle entwickelt werden.
DISKUSSION ___________________________________________________________________
93
5.5. In-Vitro-Fertilisation equiner Oozyten
In der vorliegenden Arbeit wurden fertilisationsassoziierte Prozesse im Wesentlichen
bei den Spermien beleuchtet, während die Seite der Oozyten diesbezüglich weniger
Beachtung fand. Daher werden im Folgenden noch einige Aspekte der IVF mit Blick auf die
equine Oozyte angeführt.
Wie eingangs erwähnt, ist die In-Vitro-Fertilisation beim Pferd eine noch nicht routinemäßig
durchgeführte Reproduktionstechnik mit sehr variablen Erfolgsraten. Seit 1992 (PALMER et
al. 1991; BÈZARD 1992) ist keine Geburt eines mittels IVF (ausgenommen ICSI)
entstandenen, lebenden Fohlens bekannt geworden. Darüber hinaus wurde seitdem kein
Protokoll entwickelt, welches die equinen Gameten so auf die IVF vorbereitet, dass sich
entstandene Embryonen über das 16-Zellstadium weiterentwickelten.
Demnach wird deutlich, dass sowohl die In-Vitro-Vorbereitung der Gameten auf die
Fertilisation mit Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen und Oozytenreifung
als auch die Fertilisation selbst und die nachfolgende In-Vitro-Kultivierung frühembryonaler
Stadien unvollständig oder fehlerhaft verliefen. IVF-Raten waren nach Anwendung
erfolgversprechender Protokolle bisher kaum reproduzierbar. Dies war sowohl der
unterschiedlichen Vorbereitung der Gameten auf die Fertilisation, als auch in der inter- und
intraindividuell sehr unterschiedlichen Fertilisationspotenz der aufbereiteten Gameten
geschuldet. Im Vergleich erreichten bei der In-Vitro-Produktion boviner Embryonen
durchschnittlich 40% das Blastozystenstadium (LONERGAN u. FAIR 2008).
In Bezug auf die equine IVF wird immer wieder diskutiert, dass die Penetration der Zona
pellucida durch die Spermien einen der herausforderndsten Verfahrensschritte darstellt. So
konnten nach partieller Dissektion oder Säurebehandlung der ZP gute Fertilisationsraten und
sogar Polyspermie nachgewiesen werden (CHOI et al. 1993). Auch durch ZP-Verdau mit
Pronase kann das Eindringen von Spermien erleichtert werden (TABENER et al. 2010).
MUGNIER et al. (2009a,b) stellten keine Penetration equiner Spermien durch die intakte ZP
in vitro maturierter equiner Oozyten fest, wohingegen ZP-freie Oozyten penetriert wurden.
Sie vermuteten, dass es bei der IVM equiner Oozyten zu einem frühzeitigen `Zona-hardening´
kommt, welches das Eindringen der Spermien verhinderte. Dafür spricht auch, dass unreife
und in vivo maturierte equine Oozyten eine dünnere ZP und eine andere Oberflächenstruktur
aufweisen als in vitro maturierte Eizellen (MUGNIER et al. 2009b; ACCOGLI et al. 2014).
DISKUSSION ___________________________________________________________________
94
Dagegen spricht jedoch, dass in vitro maturierte equine Oozyten in den Eileitern besamter
Stuten in vivo befruchtet wurden (HINRICHS et al. 2002).
Die Methode der Intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI), bei der ein einzelnes
Spermium direkt in die Oozyte injiziert wird und auf diese Weise sowohl das Hindernis der
ZP als auch die Notwendigkeit der Hyperaktivierung und Akrosomreaktion der Spermien
umgangen wird, wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen als Positivkontrolle ihres IVF-
Protokolls eingesetzt (SESSION-BRASNAHAN et al. 2014; LEEMANS et al. 2015b). Durch
ICSI erzielte Befruchtungsraten von 33% (Blastozystenstadium aus in vitro maturierten
Oozyten) (JACOBSON et al. 2010) und eine Trächtigkeitsrate von 62% (HINRICHS 2012)
zeigen, dass zumindest die Verfahrensschritte der Gametengewinnung und –aufbereitung
sowie der In-Vitro-Maturation der Oozyten und der In-Vitro-Kultivierung der Blastozysten
erfolgreich abliefen. ICSI ist mittlerweile ein etabliertes Verfahren, das allerdings nur mit
hohem technischen Aufwand durch spezialisiertes Personal durchgeführt werden kann.
SESSIONS-BRESNAHAN et al. (2014) konnten nachweisen, dass die perivitelline Injektion
(PVI) equiner Spermien in bovine Oozyten nicht zur Fertilisation führte und somit neben der
Unfähigkeit equiner Spermien eine ZP zu durchdringen weitere Faktoren für die schlechten
IVF-Raten beim Pferd verantwortlich sein dürften. So vermuteten MUGNIER et al. (2009b),
dass auch das Oolemm der equinen Oozyte ein Hindernis für die Spermien darstellen kann.
Trotz der bisher schlechten Erfolgsraten ist die klassische IVF ein erstrebenswertes Verfahren
der assistierten Reproduktion, da es Lösungsansätze für Fertilitätsprobleme auf der
männlichen und weiblichen Seite bereithält. So können Embryonen aus Stuten erzeugt
werden, bei denen aufgrund von Erkrankungen der Ovarien, der Eileiter oder des Uterus eine
Befruchtung nicht möglich ist, deren Oozyten nicht ausreichend heranreifen bzw. nicht
ovuliert werden oder die zum Austragen eines Fohlens nicht mehr in der Lage sind. Zudem
kann die IVF mit quantitativ und qualitativ eingeschränkten Spermaproben erfolgen. IVF-
Raten können zudem zur Beurteilung der Fertilisationspotenz der Spermien eines bestimmten
Hengstes herangezogen werden. Außerdem ist das Verfahren für die Arterhaltung gefährdeter
Equiden (v.a Zebra- und Wildeselarten), für die gezielte Anpaarung besonders wertvoller
Elterntiere und nicht zuletzt für die Erforschung der Physiologie, Kultivierung und
Konservierung equiner Embryonen sinnvoll einsetzbar, da Embryonen in großer Anzahl
erzeugt werden können.
ZUSAMMENFASSUNG ___________________________________________________________________
95
6 ZUSAMMENFASSUNG
Janina Rau (2016)
Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro
Die In-Vitro-Fertilisation (IVF) wird beim Pferd mit mäßigem Erfolg durchgeführt.
Abgesehen von einem Fall in den frühen neunziger Jahren wurde bisher kein durch IVF
entstandenes Fohlen geboren. Mit den zur Verfügung stehenden Protokollen zur Vorbereitung
der equinen Spermien und Oozyten auf die IVF konnten bisher keine frühembryonalen
Stadien erzeugt werden, die sich über das 16-Zellstadium hinaus entwickelten.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Induzierbarkeit der
fertilisationsassoziierten Reaktionen Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion
bei equinen Spermien in vitro zu untersuchen. In Bezug darauf wurde die Effektivität der
Inkubation equiner Spermien in einem Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen
modifizierten Whittens-Medium (MW) evaluiert. Zudem wurde untersucht, ob die Induktion
der Spermienreaktionen nach Vorinkubation in MW durch die Reagenzien Kalzium-Ionophor
A23187 (CaIP) und Procain verstärkt werden kann. Zur Beurteilung der
fertilisationsassoziierten Reaktionen wurden mittels computerassistierter Spermienanalyse
Motilitätsparameter erfasst, wobei die Geschwindigkeit auf der gebogenen Linie (VCL) und
die Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung (ALH) der Spermien als Maße für die
hyperaktivierte Bewegung herangezogen wurden. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurden
nach Anfärbung mit spezifischen Farbstoffen der intrazelluläre Kalziumgehalt (Fluo-3) sowie
die Plasma- (Propidium-Iodid) und Akrosommembranintegrität (FITC-PNA) als Parameter
für die Kapazitation, Viabilität und Akrosomreaktion der Spermien durchflusszytometrisch
analysiert. Weiterhin wurde ein heterologer Bindungsassay mit vorinkubierten equinen
Spermien und in vitro maturierten porzinen Oozyten durchgeführt. Dafür wurden zunächst
eine angemessene Spermienkonzentration und Inkubationszeit für die Koinkubation der
Gameten bestimmt. Darauf wurde der Einfluss der Präinkubation equiner Spermien in
Magermilchverdünner, Kontroll- und modifiziertem Whittens-Medium sowie die
Auswirkungen der Spermienbehandlung mit CaIP und Procain auf die Oozyten-
Bindungsfähigkeit der equinen Spermien und auf die Oozytenmorphologie untersucht.
ZUSAMMENFASSUNG ___________________________________________________________________
96
Die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion equiner Spermien konnten nach
Inkubation für 60–120 min in MW in angefeuchteter Luft bei 37°C induziert werden. Dies
war ersichtlich an einer Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehaltes, gesteigerten VCL- und
ALH-Werten sowie einer Verminderung des Anteils akrosomintakter Spermien. Im Vergleich
wurden die fertilisationsassoziierten Reaktionen durch die Inkubation der Spermien in einem
Medium ohne Bikarbonat, Kalzium und BSA nicht induziert.
Die Zugabe von CaIP zu Spermien, die 60 min in MW präinkubiert worden waren, resultierte
in einer kapazitationsassoziierten Steigerung des intrazellulären Kalziumgehaltes mit einem
Maximum bei einer CaIP-Konzentration von 3 µM. Nach Anwendung eines Zentrifugations-
verfahrens zur Reduktion des Kalzium-Ionophorgehaltes in der Spermiensuspension zeigten
die Spermien Anzeichen hyperaktivierter Bewegung. Die Zugabe von Procain förderte die
Hyperaktivierung deutlich mit einem maximalen Effekt bei einer Konzentration von 2.5–5
mM.
In dem heterologen Bindungsassay konnte gezeigt werden, dass die equinen Spermien in der
Lage sind, an in vitro maturierte porzine Oozyten zu binden. Für diesen Versuch wurden
2.5×105
Spermien mit 20 Oozyten für 120 min koinkubiert. Spermien, die vor der
Koinkubation eine Behandlung zur Induktion der fertilisationsassoziierten Reaktionen
durchlaufen hatten, wiesen unabhängig von einer Reduktion des CaIP- oder Procaingehaltes
in den Spermiensuspensionen durch Zentrifugation und Resuspension eine eingeschränkte
Bindungsfähigkeit an den Oozyten auf. Die besten Bindungsraten wurden mit Spermien
erreicht, die zuvor in Magermilchverdünner präinkubiert worden waren. Nach Koinkubation
mit equinen Spermien, die in einem anderen Medium als Magermilchverdünner vorinkubiert
worden waren und denen insbesondere CaIP oder Procain zugesetzt wurde, wies ein erhöhter
Anteil (bis 8.5%) der porzinen Oozyten morphologische Abweichungen auf.
Unabhängig von der Induktionsbehandlung war eine starke inter- und intraindividuelle
Variation sowohl im zeitlichen Verlauf als auch in dem Ausmaß der fertilisationsassoziierten
Reaktionen equiner Spermien und ihrer Bindungsfähigkeit an die Zona pellucida porziner
Oozyten zu beobachten.
Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass die fertilisationsassoziierten Reaktionen equiner
Spermien in vitro durch Inkubation in modifiziertem Whittens-Medium induziert werden
ZUSAMMENFASSUNG ___________________________________________________________________
97
können, nicht aber in einem Medium ohne Bikarbonat, Kalzium und BSA. Auch durch
Zugabe von Procain und Kalzium-Ionophor A23187 zu präinkubierten equinen Spermien
können die Kapazitation und Hyperaktivierung, nicht aber die Akrosomreaktion induziert
werden. Der heterologe Bindungsassay ermöglicht die Beurteilung der Auswirkungen
unterschiedlicher Spermienbehandlungen sowohl auf die Bindungsfähigkeit der Spermien als
auch auf die Oozytenmorphologie. Dies kann zur Beurteilung der Fertilisationspotenz equiner
Spermien im Hinblick auf die Entwicklung von IVF-Protokollen herangezogen werden.
SUMMARY ___________________________________________________________________
98
7 SUMMARY
Janina Rau (2016)
Induction of fertilization-associated reactions in equine spermatozoa in vitro
In horses, no great successes have been obtained with in vitro fertilization (IVF). Since
the early nineties no foal originating from IVF has been born. With the current protocols for
preparing equine spermatozoa and oocytes for IVF, early embryonic development typically
arrests before the 16-cell stage.
The aim of this study was to examine induction of the fertilization-associated reactions
capacitation, hyperactivation and acrosome reaction in equine sperm in vitro. The efficacy of
incubating sperm in modified Whittens medium (MW) containing bicarbonate, calcium and
BSA was evaluated. Special emphasis was on effects of addition of calcium ionophore
A23187 (CaIP) and procaine after pre-incubation of sperm in MW, to further induce
fertilization-associated reactions in sperm. In order to study fertilization-associated reactions
computer assisted sperm analysis was used for determining sperm motility characteristics,
including the curved line velocity (VCL) and amplitude of lateral head displacement (ALH)
related to hyperactivated motility. Using specific dyes and flow cytometry the intracellular
calcium content of sperm (fluo-3) as well as plasma (propidium-iodide) and acrosomal
membrane integrity (FITC-PNA) were determined as indicators for sperm capacitation,
viability and the acrosome reaction. Furthermore, a heterologous sperm-zona-binding assay
was performed, using induced equine spermatozoa and in vitro matured porcine oocytes.
First, a suitable sperm concentration and incubation time for co-incubation studies were
determined. Then, effects of pre-incubating sperm in skim milk extender, control or MW and
effects of CaIP and procaine treatment were determined on the number of sperm bound per
oocyte and oocyte morphology.
Incubation in MW in humidified air at 37°C resulted in initiation of stallion sperm
capacitation, hyperactivated motility and the acrosome reaction in vitro within 60–120 min.
This was evident as an increase in the intracellular calcium content, increased VCL and ALH
values and a decrease in acrosomal membrane intactness, respectively. Incubation in medium
SUMMARY ___________________________________________________________________
99
lacking bicarbonate, calcium and BSA did not result in initiation of fertilization-associated
reactions.
Addition of CaIP after pre-incubating sperm for 60 min in MW resulted in an additional
increase in the intracellular calcium content associated with sperm capacitation, exhibiting a
maximum when using a concentration of 3 µM. Sperm exhibited signs of hyperactivation
after subsequent removal of CaIP by centrifugation. Addition of procain induced a higher
level of hyperactivation, exhibiting a maximum effect when adding 2.5−5 mM.
In a heterologous sperm-zona binding assay equine sperm were able to bind in vitro matured
porcine oocytes. For these assays 2.5×105
sperm were coincubated with 20 oocytes for 120
min. Sperm treated for induction of fertilization-associated reactions prior to coincubation
showed poor binding to oocytes, irrespective of removal of CaIP or procaine via
centrifugation. Sperm pre-incubated in skim milk extender prior to binding assays showed the
highest rates of binding to oocytes. Increased numbers of oocytes (up to 8.5%) with abnormal
morphology were observed after coincubation with sperm treated in medium different from
skim milk extender, especially in case of presence of CaIP and procaine.
It was found that there was great inter- and intraindividual variation, both in the timing and
extent of fertilization-associated reactions in equine sperm and sperm-zona binding capacity,
irrespective of treatment with inducers.
In conclusion fertilization-associated reactions in equine sperm can be induced in vitro by
incubation in modified Whittens medium, but not in medium lacking BSA, bicarbonate and
calcium. The inducers calcium-ionophore A23187 and procaine can be added after pre-
incubation to further increase levels of sperm capacitation and hyperactive motility but not the
acrosome reaction.
Heterologous sperm-zona-binding assays can be used to study effects of sperm treatments on
the oocyte-binding capacity as well as oocyte morphology. This might be helpful for testing
fertilization potential of equine sperm with respect to development of IVF protocols.
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ________________________________________________________________
100
8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 3.1.: Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur
Erfassung fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien im Verlauf der 240-
minütigen Inkubation in Kontrollmedium (NK) oder Kapazitationsmedium (MW) ……….. 42
Abbildung 3.2.: Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur
Erfassung fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen Spermien nach
Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 oder Procain in unterschiedlichen Konzentrationen
……………………………………………………………………………………………….. 43
Abbildung 3.3.: Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur
Erfassung fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen Spermien nach
Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 oder Procain und nachfolgender Anwendung eines
Zentrifugationsverfahrens zur Verringerung des Reagenziengehaltes im Medium .………... 45
Abbildung 3.4.: Stereomikroskopische Bilder porziner Oozyten …………...…………….... 51
Abbildung 3.5.: Schematische Darstellung der Verfahrensschritte und Analysemethoden zur
Erfassung der Motilitätsparameter, des pH-Wertes sowie zur Beurteilung von Aussehen und
Geruch der Proben im Verlauf der 240-minütigen Inkubation präinkubierter equiner Spermien
in offenen oder geschlossenen Röhrchen ………..………………………………………….. 54
Abbildung 3.6.: Schematische Darstellung der Objektträger zur fluoreszenzmikroskopischen
Auszählung der an der Zona pellucida in vitro maturierter porziner Oozyten gebundenen
equinen Spermien ……..……………..……………………………………………………… 56
Abbildung 3.7.: Schematische Darstellung der Gametenaufbereitung, Inkubations- und
Verfahrensschritte sowie der Analysemethode für den heterologen Bindungsassay mit equinen
Spermien und porzinen Oozyten ……………………….…………………………………… 57
Abbildung 4.1.: Entwicklung der Motilitätsparameter, der Plasmamembranintegrität, des
akrosomalen Status und des intrazellulären Kalziumgehaltes equiner Spermien während der
240-minütigen Inkubation in Kapazitationsmedium (MW) oder Kontrollmedium (NK) ..… 61
Abbildung 4.2.: Entwicklung der Motilitätsparameter, der Plasmamembranintegrität und des
intrazellulären Kalzium-gehaltes equiner Spermien nach 60-minütiger Präinkubation in
Kapazitationsmedium (MW) und nachfolgendem Zusatz von CaIP oder Procain für 30 min in
unterschiedlichen Konzentrationen ……………………………………………...………….. 63
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ________________________________________________________________
101
Abbildung 4.3.: Entwicklung der Motilitätsparameter, der Akrosomintegrität und des
intrazellulären Kalziumgehaltes equiner Spermien nach Anwendung eines
Zentrifugationsverfahrens im Anschluss an eine 60-minütige Präinkubation in
Kapazitationsmedium (MW) und Zusatz von 2.5 µM CaIP oder 2.5 mM Procain für 10 min
……………………………………………………………………………………………..… 66
Abbildung 4.4: Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten
nach 120 min Koinkubation mit equinen Spermien ……………………………………..….. 67
Abbildung 4.5.: Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten
nach 120 min Koinkubation mit unterschiedlich konzentrierten equinen Spermien
(Phasenkontrastmikroskopie nach HOECHST-Färbung) ……...………………………….... 70
Abbildung 4.6.: Anteil progressiv motiler Spermien und pH-Wert in Spermiensuspensionen
mit unterschiedlicher Konzentration bei geschlossener und offener Inkubation in
Kapazitationsmedium (MW) oder Kontrollmedium (NK) über 240 min …...……………… 72
Abbildung 4.7.:
A: Anzahl gebundener equiner Spermien an in vitro maturierte porzine Oozyten nach 120 min
Koinkubation.
B: Spermienbindungsraten an in vitro maturierte porzine Oozyten für zwei verschiedene
Ejakulate desselben Hengstes ………………...…………………………………………….. 74
Abbildung 4.8.: Fluoreszenzmikroskopische Bilder von in vitro maturierten porzinen Oozyten
mit verändertem Ooplasma nach 120 min Koinkubation mit equinen Spermien
(Phasenkontrast-Dunkelfeld nach HOECHST-Färbung) .…………………………………... 75
Abbildung 4.9.: Anteil (%) in vitro maturierter porziner Oozyten mit verändertem Ooplasma
nach 120 min Koinkubation mit unterschiedlich aufbereiteten equinen Spermien …………76
TABELLENVERZEICHNIS ___________________________________________________________________
102
9 TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 2.1.: Zusammensetzung von Inkubationsmedien zur Induktion
fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in vitro ...…………………………………….. 25
Tabelle 2.2.: Protokolle und Ergebnisse von In-Vitro-Fertilisationsverfahren mit equiden
Spermien ………………………………………………………………………………… 37-39
Tabelle 3.1.: Zusammensetzung des Maturationsmediums nach TIEDEMANN (2015);
Mengenangaben für 1 ml Medium ……….…………………………………………………. 50
Tabelle 4.1.: Mittlere Anzahl der gebundenen equinen Spermien pro in vitro gereifter
Schweineoozyte in Abhängigkeit von der Spermienkonzentration und dem Präinkubations-
medium ………..…………………………………………………………………………….. 69
Tabelle 4.2.: Anzahl und prozentualer Anteil in vitro maturierter porziner Oozyten mit
verändertem Ooplasma nach 120 min Koinkubation mit unterschiedlich aufbereiteten equinen
Spermien ………………………………………….………………………………………… 76
LITERATURVERZEICHNIS ___________________________________________________________________
103
10 LITERATURVERZEICHNIS
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120
DANKSAGUNG
Das zweijährige Lebensabschnittsprojekt „Doktorarbeit“ ist nun abgeschlossen. Ich bin
glücklich, dass mich auch auf diesem Weg Menschen begleitet haben, die auf verschiedenste
Weise zum Gelingen dieses Projektes beigetragen haben.
Ein besonderer Dank gilt:
Prof. Dr. Harald Sieme: für die Überlassung dieses interessanten und herausfordernden
Dissertationsthemas, für produktive und auch amüsante Gespräche mit Ratschlägen für alle
Lebenslagen, für all die fachliche Unterstützung sowie die sowohl wissenschaftliche als auch
klinische Förderung. Ich freue mich auf Weiteres.
Jet Oldenhof: für das Weisen des richtigen Weges, die gute Zusammenarbeit, die kompetente
und geduldige Beantwortung all meiner Fragen sowie für nette Worte und Nervennahrung
wenn sie gebraucht wurden.
Prof. Dr. J. Hahn: für die finanzielle Unterstützung, den wissenschaftlichen und persönlichen
Austausch sowie für motivierende und zielgerichtete Ratschläge, die das Erreichen meiner
Ziele erleichterten.
Der Pferdeabteilung: Franzi, für alles was du mir beigebracht hast und gutes Teamwork mit
Power und Glitzerstaub. Hanna, Ana, Judith und Rahel für die Unterstützung im Labor und
mit den Gäulen sowie die gute Stimmung. Danni, für die Hilfe mit den „Schnuffis“ und einer
Tages-Überdosis an guter Laune. Dr. Karl Rohn für den Weg durch den Statistikwald.
Dank geht ebenfalls an das Landgestüt Celle für die Bereitstellung der Samenproben und
(re-)produktive Zusammenarbeit sowie an das FLI-Mariensee (insbes. AG Prof. Dr. D.
Rath) für die kompetente Zusammenarbeit und Hilfestellung.
Meinen lieben Freunden und Geschwistern: für ein Leben außerhalb der Repro, ohne euch
wäre es nichts. Und ja, vielleicht erscheint auch mal ein Artikel von mir in der „Wendy“.
Toni: Danke für all das Verständnis für die dir so fremden Dinge, die bedingungslose
Unterstützung in allem und dein großes Herz für mich.
Meiner Familie: Wenn die Wurzeln tief sind, braucht man den Wind nicht zu fürchten.
Mama und Papa, Danke für die Wurzeln und Flügel die ihr uns gebt.