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Tierärztliche Hochschule Hannover
Thrombozytenfunktionsdiagnostik bei Hunden mit inflammatorischen Erkrankungen und Optimierung
der Messzeit des Multiplate® Aggregometers
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Monia Abid
Essen
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke Klinik für Kleintiere 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. K. Feige
Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2011
Meiner Familie
„Klingt komisch, ist aber so.”
- Die Sendung mit der Maus -
Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Form eines Posters auf folgender
Fachtagung präsentiert:
19. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik“ der DVG
(InnLab 2011):
Thrombozytenfunktionsmessung mit dem Multiplate® analyser: Optimierung der
Messzeit für canines Blut
Inhaltsverzeichnis
I Einleitung ....................................................................................................... 1
II Literaturübersicht ........................................................................................ 4
1. Thrombozytenfunktion .................................................................................................... 4
1.1. Interaktion der Thrombozyten mit dem Endothel ........................................................ 4
1.2. Aktivierung der Thrombozyten .................................................................................... 5
1.2.1. Signaltransduktion ................................................................................................. 5
1.3. Sekretion der Granula-Inhaltsstoffe ............................................................................. 6
1.4. Aggregation der Thrombozyten ................................................................................... 6
1.5. Die Rolle der Thrombozyten für die Blutgerinnung (zellbasiertes Modell) ................ 7
1.5.1. Initiation ................................................................................................................ 7
1.5.2. Amplifikation ........................................................................................................ 7
1.5.3. Propagation ............................................................................................................ 8
2. Agonisten und ihre Thrombozytenoberflächenrezeptoren ........................................... 8
2.1. Kollagen und Kollagenrezeptoren ............................................................................... 8
2.2. Thrombin und Protease-aktivierte Rezeptoren ............................................................ 9
2.3. ADP und ADP-Rezeptoren ........................................................................................ 10
2.4. Eicosanoide ................................................................................................................ 10
2.5. Epinephrin .................................................................................................................. 11
3. Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel ........................................................ 11
4. Thrombozytenfunktionsdiagnostik ............................................................................... 12
4.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit ................................................................................... 13
4.2. Plättchenfunktionsanalysator PFA-100 ..................................................................... 13
4.3. Turbidimetrische Aggregometrie nach BORN .......................................................... 14
4.4. Vollblutaggregometrie ............................................................................................... 15
5. Einfluss entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion .................... 18
5.1. Übersicht vorhandener Studien .................................................................................. 18
5.2. Pathogenese entzündlich bedingter Thrombozytendysfunktionen ............................ 24
5.2.1. Thrombozytopenie als Ursache der verminderten Aggregation.......................... 24
5.2.2. Thrombozytenfunktions“erschöpfung“ ............................................................... 24
5.2.3. Anti-Plättchen Antikörper ................................................................................... 25
5.2.4. Einfluss von Endotoxinen/Lipopolysacchariden (LPS) auf die
Thrombozytenfunktion .................................................................................................. 25
5.2.5. Aggregationsinduktion durch zirkulierende Immunkomplexe............................ 26
5.2.6. Microbial surface components reacting with adhesive matrix molecules
(MSCRAMMs) .............................................................................................................. 26
III Material, Tiere und Methoden ................................................................. 28
1. Material ........................................................................................................................... 28
1.1. Geräte und Bezugsquellen ......................................................................................... 28
1.2. Reagenzien, Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen ................................................ 29
2. Studiendesign .................................................................................................................. 30
3. Tiere ................................................................................................................................. 31
4. Blutentnahme .................................................................................................................. 33
5. Probenbehandlung .......................................................................................................... 33
6. Versuchsdurchführung .................................................................................................. 34
6.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit ................................................................................... 34
6.2. Plättchenfunktionsanalysegerät (PFA-100) ............................................................... 34
6.3. Turbidimetrische Thrombozytenaggregationsmessung ............................................. 35
6.4. Impedanzaggregometrie ............................................................................................. 35
6.5. Thrombozytenzahl und Hämatokrit ........................................................................... 36
7. Datenanalyse ................................................................................................................... 37
8. Statistische Auswertungen ............................................................................................. 37
IV Manuskript I ............................................................................................. 38
Abstract ............................................................................................................................... 39
Introduction ........................................................................................................................ 40
Materials and methods ....................................................................................................... 41
Results .................................................................................................................................. 44
Discussion ............................................................................................................................ 45
References ............................................................................................................................ 48
V Manuskript II ............................................................................................. 58
Abstract ............................................................................................................................... 59
Introduction ........................................................................................................................ 60
Materials and methods ....................................................................................................... 61
Results .................................................................................................................................. 67
Discussion ............................................................................................................................ 68
Conclusion ........................................................................................................................... 75
References ............................................................................................................................ 76
VI Übergreifende Diskussion ......................................................................... 83
VII Zusammenfassung ................................................................................... 92
VIII Summary ................................................................................................ 95
IX Literaturverzeichnis ................................................................................. 97
X Tabellarischer Anhang ............................................................................. 119
XI Danksagungen ......................................................................................... 151
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
AA Arachidonsäure, arachidonic acid
ADP Adenosindiphosphat, adenosine diphosphate
AS Arachidonsäure, arachidonic acid
ASS Acetylsalizylsäure, acetylsalicylic acid
ATP Adenosintriphosphat, adenosine triphosphate
AU Aggregationseinheit, aggregation unit
AUC Fläche unter der Kurve, area under the curve
Ca2+ Kalzium, calcium
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat, cyclic adenosine monophosphate
ClF A Gerinnungsfaktor A, clotting factor A
cm Zentimeter, centimetre
Col Kollagen, collagen
COX Zyklooxygenase, cyclooxygenase
CT Verschlusszeit, closure time
DG Diacylglycerol
EPCR endothelialer Protein C Rezeptor, endothelial cell protein c receptor
EPI Epinephrin, epinephrine
et al. et alii (lat. und andere, and others)
F Gerinnungsfactor, coagulation factor
Fig Abbildung, figure
g Erdbeschleunigung (1 g = 9,81 m/s2), gravity
°C Grad Celsius, degree centigrade
GP Glykoprotein, glycoprotein
GV Gesamtvolumen, total volume
Htk Hämatokrit, haematocrit
IgG Immunglobulin G, immunoglobuline G
IL Interleukin, interleukin
IP3 Inositol-1,4,5-Triphosphat, inositol-1,4,5-triphosphate
kg Kilogramm, kilogram
Kol Kollagen, collagen
L Liter, litre
LPS Lipopolysachharid, lipopolysaccharide
M Mol, mol
Max Maximum, maximum
MEA Mehrfachelektroden Aggregometrie, multiple electrode aggregometry
mg Milligramm, milligram
min Minute(n), minute(s)
Min Minimum, minimum
mL Milliliter, millilitre
mm Millimeter, millimetre
mmHg Millimeter Quecksilbersäule, millimeter mercury
mmol Millimol, millimol
MSCRAMM microbial surface component reacting with adhesive matrix molecules
n Anzahl, number
NaCl Natriumchlorid, sodium chloride
p p-Wert (Irrtumswahrscheinlichkeit), p-value
PAR Protease-aktivierter Rezeptor, protease-activated receptor
PFA Plättchenfunktionsanalysegerät, platelet function analyser
PFP plättchenfreies Plasma, platelet free plasma
PIP2 Phosphoinositol-4,5-biphosphonat, phosphoinositol-4,5-biphosphate
PSGL P-Selektin Glykoprotein Ligand, P-selectin glycoprotein ligand
PRP plättchenreiches Plasma, platelet rich plasma
PTFE Polytetrafluorethylen, polytetrafluoroethylene
SD Standardabweichung, standard deviation
sec Sekunde(n), second(s)
SIRS systemisches inflammatorisches Response-Syndrom, systemic inflammatory
response syndrome
Tab. Tabelle, table
TF tissue factor
TNF Tumornekrosefaktor, tumor necrosis factor
TV Gesamtvolumen, total volume
TXA2 Thromboxan A2, thromboxane A2
TXB2 Thromboxan B2, thromboxane B2
vWF von Willebrand Faktor, von Willebrand factor
VZ Verschlusszeit, closure time
µg Mikrogramm, microgram
µL Mirkoliter, microlitre
µm Mikrometer, micrometre
µM Mikromol, micromol
I Einleitung
1
I Einleitung
Die Messung der Thrombozytenfunktion stellt eine wichtige Untersuchung im
Rahmen der Diagnostik von Hämostasestörungen dar. Die am häufigsten verwendeten
Verfahren sind die kapilläre in vivo Blutungszeit (NOLTE et al. 1997), die turbidimetrische
Thrombozytenaggregationsmessung nach Born (BORN 1962) und die automatische
Thrombozytenfunktionsanalyse mit dem Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100
(MISCHKE u. KEIDEL 2003).
Die erstmals 1980 beschriebene Impedanzaggregometrie mit Vollblut (CARDINAL u.
FLOWER 1980) war zunächst durch ihre relativ aufwendige Handhabung wenig praktikabel.
Diesem Nachteil wurde mit denen in jüngster Vergangenheit entwickelten Vollblut-
Impedanzaggregometern Rechnung getragen. Das Messprinzip beruht auf der Zunahme des
elektrischen Widerstands zwischen zwei Elektroden, wenn sich aggregierende Thrombozyten
an diese anlagern (DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Die Vorteile des Einsatzes von
Vollblut im Gegensatz zur photometrischen Methode basierend auf plättchenreichem Plasma
(PRP) bestehen in der weniger aufwendigen Probenvorbereitung und Anwesenheit aller
Blutzellen. Dies bedeutet zum einen eine Zeitersparnis und zum anderen wird durch den
Verzicht auf die Zentrifugation eine artifizielle Veränderung der Plättchenvolumen-
Zusammensetzung verhindert (DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005).
Eines der neueren Geräte, das sich dieses Messprinzips bedient, ist das Multiplate®
Aggregometer. Da es ursprünglich für den Einsatz in der Humanmedizin konzipiert wurde,
fand in einer früheren Studie eine Anpassung verschiedener Parameter an Hundeblut statt
(KALBANTNER et al. 2010). Eine entsprechende Überprüfung des Parameters Messzeit
wurde hingegen bisher noch nicht durchgeführt. Die in der Humanmedizin empfohlene
Messzeit von sechs Minuten wurde in der vorherigen Studie für Hundeblut auf 12 Minuten
erhöht.
Das Ziel des methodischen ersten Teils der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss
der Messzeit auf die Referenzwerte und die Sensitivität der Messergebnisse für Hundeblut zu
ermitteln und zu prüfen, ob eine Verkürzung der Messzeit ohne negative Auswirkungen auf
die Aussagekraft der Messergebnisse möglich ist.
I Einleitung
2
Entzündliche und infektiöse Erkrankungen, die eine häufige Ursache für eine
Thrombozytopenie beim Hund darstellen (GRINDEM et al. 1991), können ebenso auch mit
erworbenen Thrombozytenfunktionsstörungen einhergehen. Verschiedene Studien
untersuchten die Thrombozytenfunktion bei Hunden mit bestimmten infektiösen
Erkrankungen zumeist mit lediglich einer einzigen Methode, bei der es sich meistens um die
turbidimetrische Aggregometrie handelte (CORONA et al. 2004; BRANDAO et al. 2006).
Daneben nutzten Studien zur Untersuchung der primären Hämostase auch die kapilläre
Blutungszeit bei Hunden mit Leishmaniose (MORENO et al. 1998) und die
Plättchenfunktionsanalyse mit dem Pättchenfunktionsanalysegerät PFA-100 bei Hunden mit
experimentell induzierter Endotoxämie (YILMAZ et al. 2005). Die Mehrheit dieser Studien,
die den Einfluss von experimentell induzierten und natürlich auftretenden entzündlichen
Erkrankungen auf die Thrombozyten untersuchten, konnten eine beeinträchtigte
Plättchenfunktion in vitro beobachten (JACOBS et al. 1986; HARRUS et al. 1996a;
VALLADARES et al. 1998). Einzelne Studien berichten aber auch von einer gesteigerten
maximalen Aggregation bei Hunden mit Herzwurminfektion (BOUDREAUX et al. 1989).
Ebenso existieren im Bereich der Humanmedizin widersprüchliche Ergebnisse der
turdidimetrischen Aggregometrie aus Studien mit septischen Patienten (GAWAZ et al. 1997;
YAGUCHI et al. 2004).
Infektiöse Erkrankungen können die primäre Hämostase über verschiedene
Pathomechanismen beeinflussen. So kann die Bindung von sowohl zirkulierenden
Immunkomplexen als auch Komplexen bestehend aus Clotting factor A (ClF A, einem
adhäsivem Matrixmolekül grampositiver Bakterien), Fibrinogen und Antikörpern an den
Thrombozyten eine frühe, systemische Aktivierung der Plättchen mit anschließender
Agglutination und gesteigertem Verbrauch induzieren (LOUGHMAN et al. 2005). Des
Weiteren können Endotoxine zum einen über Bindung an die Thrombozytenoberfläche
(SABA et al. 1984; SALDEN u. BAS 1994) und zum anderen durch Modifikation der
thrombozytären Rezeptoren (NYSTROM et al. 1994) zu einer direkten Beeinträchtigung der
Plättchenfunktion führen.
Unabhängig von der Ätiologie kann jeder schwere und/oder fortgeschrittene
entzündliche Prozess zu einer ausgeprägten systemischen Reaktion des Körpers führen. Ein
systemisches inflammatorisches Response-Syndrom (SIRS) stellt eine ernste, möglicherweise
I Einleitung
3
lebensbedrohliche Lage dar, die häufig mit Hämostasestörungen assoziiert ist und ein
schnelles therapeutisches Handeln verlangt (HOPPER 2005).
Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, den Einfluss entzündlicher
Erkrankungen aufgrund bakterieller und protozoischer Infektionen auf die
Thrombozytenfunktion bei Hunden zu untersuchen. Dies geschah mittels verschiedener
Globaltests und spezifischer Methoden, zu denen auch das im ersten Teil bearbeitete, relativ
neue Multiplate® Impedanzaggregometer gehörte. Die Ergebnisse wurden mit denen einer
gesunden Kontrollgruppe verglichen und darüber hinaus wurden die Ergebnisse von Patienten
mit SIRS und ohne SIRS miteinander verglichen.
II Literaturübersicht
4
II Literaturübersicht
1. Thrombozytenfunktion
Thrombozyten sind in der Lage, kleine endotheliale Defekte durch die Formation eines
primären Thrombus zu verschließen und dienen somit der Aufrechterhaltung der
Gefäßintegrität (SCHARF 1997). Des Weiteren fördern sie die Heilung der
Gefäßwandverletzung und spielen eine wichtige Rolle bei Entzündungsprozessen (GENTRY
1992).
1.1. Interaktion der Thrombozyten mit dem Endothel
Eine Verletzung der Gefäßwand führt zur Freilegung subendothelialer Strukturen, die
aus Struktur- und Adhäsionsproteinen zusammengesetzt sind und deren Interaktion mit den
Thrombozyten normalerweise durch das intakte Endothel verhindert wird (RUGGERI 1994).
Von Bedeutung für die primäre Hämostase sind v.a. Kollagene, Fibronektin und Laminin,
sowie der von-Willebrand-Faktor (vWF), der vom Endothel sezerniert wird und im Fall eines
Gefäßwanddefektes an das freigelegte Kollagen binden kann (JACKSON et al. 2000). Diese
Faktoren bilden die Grundelage für die Adhäsion der Thrombozyten an den Defekt.
Die an der Adhäsion beteiligten Rezeptoren und Liganden sind abhängig von den
vorherrschenden Scherkräften: in Bereichen mit niedrigen Scherkräften (venöses
Gefäßsystem) ist die irreversible Bindung von Kollagen, Fibronektin und Laminin an die
entsprechenden thrombozytären Integrine ausreichend, um eine Ansammlung und Adhäsion
der Plättchen zu ermöglichen (KROLL et al. 1996). Bei hohen Scherkräften, wie sie im
arteriellen Stromgebiet und in der Mikrozirkulation vorherrschen, sind Bindungen mit höherer
Affinität erforderlich. In diesem Fall findet die Interaktion zunächst zwischen dem vWF und
dem thrombozytären GPIb/IX/V-Rezeptor statt (REININGER et al. 2006). Im Anschluss
erfolgt eine Stabilisierung der Plättchenadhäsion durch die bereits erwähnten irreversiblen
Bindungen mit Kollagen, Fibronektin und Laminin (SIXMA et al. 1995). Die Adhäsion der
Thrombozyten führt zum sogenannten „shape change“, einer Formveränderung der Zelle, die
mit Ausbildung von Pseudopodien einhergeht. Sie führen zur Oberflächenvergrößerung und
somit einer besseren Abdichtung des Defekts (GAWAZ 1999).
II Literaturübersicht
5
1.2. Aktivierung der Thrombozyten
Die Aktivierung der Thrombozyten führt zu strukturellen und funktionellen
Veränderungen der Zelle und ist Voraussetzung für den Ablauf der Aggregation. Sie wird
zum einen durch den Adhäsionsvorgang selbst, zum anderen durch chemische Stimuli in
Form von Agonisten induziert (GAWAZ 1999). Diese werden sowohl vom Thrombozyt
selbst, als auch vom umliegenden Gewebe produziert und binden an spezifische Rezeptoren
auf der Thrombozytenoberfläche. Neben dem bereits erwähnten „shape change“ und der
Freilegung des GPIIb/IIIa-Rezeptors kommt es zu einer Umorientierung der
Membranphospholipide. Von übergeordneter Bedeutung ist dabei die Translokation des
Phosphatidylserins von innen nach außen, das als Bindungsstelle für aktivierte
Gerinnungsfaktoren dient und maßgeblich an der Generierung von aktiviertem Faktor X und
Thrombin beteiligt ist (ZWAAL u. SCHROIT 1997).
1.2.1. Signaltransduktion
Die Signaltransduktion dient der Weiterleitung von Reizen außerhalb der Zelle ins
Zellinnere. Dabei sind in der Regel eine Vielzahl von Enzymen und „second messenger“
beteiligt. Im Rahmen der Thrombozytenaktivierung haben die verschiedenen
Signaltransduktionswege alle eine Erhöhung der intrazellulärem Ca2+-Konzentration zum
Ziel, die durch den Influx von extrazellulärem Ca2+ und der Degranulation erreicht wird
(ROSENFELD u. GRALNICK 1997). Die drei Enzyme Phospholipase C, Phospholipase A2
und Adenylatzykalse sind daran maßgeblich beteiligt.
Zunächst bindet ein Agonist an seinen spezifischen thrombozytären
Oberflächenrezeptor, die zur Gruppe der Guaninnukleotid-bindenden Proteine (G-Proteine)
gehören. Das aktivierte G-Protein wiederum aktiviert zwei Enzyme: die Phospholipase C und
die Phospholipase A2.
Die Phospholipase C führt zu einer hydrolytischen Spaltung des
Membranphospholipids Phosphoinositol-4,5-biphosphonat (PIP2) in Inositol-1,4,5-
Triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DG). Während IP3 zu einem Anstieg des intrazellulären
Ca2+ führt, aktiviert DG die Proteinkinase C, welche über weitere Signalproteine zur
Degranulation und der Aktivierung des GPIIb/IIIa-Rezeptors führt (BRASS et al. 1997).
II Literaturübersicht
6
Die Phospholipase A2, zusätzlich durch die erhöhte Ca2+-Konzentration aktiviert,
bedingt die Freisetzung von Arachidonsäure (AS) aus der Plasmamembran. Sie dient als
Substrat für die Cyclooxygenase-1 (COX-1) und die Thromboxansynthetase, welche daraus
Thromboxan A2 (TxA2) bilden. Neben der Degranulation bewirkt TxA2 auch eine
Vasokonstriktion und agiert außerdem selbst als Agonist (BRASS et al. 1997).
Handelt es sich bei dem durch den Agonisten aktivierten G-Protein um ein
inhibitorisches G-Protein, führt dies zu einer Hemmung der Adenylatzyklase, was eine
erniedrigte zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP)-Konzentration zur Folge hat. cAMP
wirkt antagonistisch auf die Thrombozytenaktivierung (BRASS et al. 1997).
1.3. Sekretion der Granula-Inhaltsstoffe
Im Verlauf des Adhäsionsvorgangs kommt es zur Freisetzung der thrombozytären
Granula-Inhaltsstoffe. Dies geschieht per Exozytose (Fusion der Granulamembran mit der
Plasmamembran) und durch Verschmelzung der Granula mit dem offenen kanalikulären
System (RENDU u. BROHARD-BOHN 2001). Die Degranulation ist abhängig von der
intrazellulären Ca2+ -Konzentration, wobei jeder der drei verschiedenen Granulatypen eine
andere Schwellenkonzentration aufweist, die überschritten werden muss. Dadurch bedingt
werden zunächst die dichten Granula und dann die α -Granula, gefolgt von den Lysosomen
freigesetzt (GAWAZ 1999). Folge der Degranulation ist die Verstärkung der
Thrombozytenaktivierung, die Einleitung der Aggregation und die Rekrutierung weiterer
Blutplättchen. Im Rahmen der Degranulation der α-Granula kommt es darüber hinaus zu einer
Translokation des P-Selektins von der Granula-Membran auf die Thrombozytenoberfläche
(PENG et al. 1994).
1.4. Aggregation der Thrombozyten
Die Aggregation umfasst den Vorgang der Koadhäsion zweier Thrombozyten
(GAWAZ 1999). Eine zentrale Rolle spielt dabei der GPIIb/IIIa-Rezeptor der Blutplättchen.
Im Rahmen der Thrombozytenaktivierung werden Bindungsstellen für Fibrinogen am
GPIIb/IIIa-Rezeptor freigelegt und es findet eine primäre Aggregation statt, bei der reversible
Fibrinogenbrücken zwischen den Plättchen entstehen (RUGGERI 1994). Sobald es zur
II Literaturübersicht
7
Degranulation der Thrombozyten kommt, verfestigen sich die Fibrinogenbrücken, es findet
eine irreversible, sekundäre Aggregation statt (GAWAZ 1999).
Von entscheidender Bedeutung für den Prozess der Aggregation ist Ca2+, denn nur in
Anwesenheit dieses Kations kann plasmatisches Fibrinogen an den GPIIb/IIIa-Rezeptor
binden (SIESS 1989). Ca2+ und auch Fibrinogen sind außerdem in den Granula gespeichert
und liegen deshalb nach der Degranulation in besonders hoher Konzentration vor (MEYERS
et al. 1982).
1.5. Die Rolle der Thrombozyten für die Blutgerinnung (zellbasiertes Modell)
Das in den letzten Jahren etablierte zellbasierte Modell der Hämostase hat deutlich
gemacht, dass eine strikte Trennung von primärer und sekundärer Hämostase, wie es in der
Vergangenheit üblich war, in vivo nicht gegeben ist. Der Vorgang der Blutstillung wird
demnach in drei Phasen unterteilt, die überlappend ablaufen und als Initiation, Amplifikation
und Propagation bezeichnet werden (HOFFMAN u. MONROE 2001; SMITH 2009).
1.5.1. Initiation
Ein Integritätsverlust des Endothels führt zur Freilegung tissue factor (TF)-tragender
Zellen, die sich im Subendothel der Gefäßwand befinden. Physiologischerweise im Blut
zirkulierender Gerinnungsfaktor (F) VIIa bildet einen Komplex mit dem freigelegten TF
(SMITH 2009). Dieser Komplex aktiviert FX und FIX, woraufhin FXa an den Cofaktor FVa
bindet und damit einen Prothrombinasekomplex erzeugt, der aus einer kleinen Menge
Prothrombin Thrombin generieren kann (BECKER 2005). Der Prozess der Initiation findet
bis hierhin auf der TF-tragenden Zelle statt. Während FXa nach Abspaltung von der TF-
tragenden Zelle sofort durch Antithrombin und tissue factor pathway inhibitor inaktiviert
wird, ist FIXa in der Lage zu dissoziieren und zur Thrombozytenmembran zu gelangen
(ROBERTS et al. 2006).
1.5.2. Amplifikation
Das während der Initiation generierte Thrombin diffundiert in den Blutfluss und setzt
weitere Mechanismen in Gang. Auf der Thrombozytenoberfläche führt Thrombin zur
Aktivierung von FV und FXI und darüber hinaus wird FVIII mithilfe des Thrombins vom
II Literaturübersicht
8
zirkulierenden vWF abgespalten und aktiviert (SMITH 2009). Während FVIIIa zu einer
Amplifikation der Thrombingenerierung führt, induziert der isolierte vWF die
Thrombozytenadhäsion (s. Kap. 1.2.) und –aggregation (s. Kap. 1.4.) (HOFFMAN u.
MONROE 2001). Außerdem bindet Thrombin direkt an Rezeptoren auf der
Thrombozytenoberfläche und aktiviert dadurch die Blutplättchen. Diese vollziehen einen
„shape change“, erzeugen durch Umverteilung der Membranphospholipide eine negative
geladene, prokoagulatorische Oberfläche, die zur Bildung weiteren Thrombins beiträgt und
setzen den Inhalt ihrer Granula frei (s. Kap 1.3.) (ZWAAL u. BEVERS 1983).
1.5.3. Propagation
Die Degranulation der Thrombozyten führt zur Rekrutierung weiterer Blutplättchen,
auf deren Oberfläche Liganden exprimiert werden, die die Aggregation induzieren (SMITH
2009). Durch Aktivierung weiterer Faktoren auf der Thrombozytenoberfläche kommt es zur
Generierung größerer Mengen Thrombin, das letztendlich durch Abspaltung von Peptiden aus
Fibrinogen Fibrin bildet (BECKER 2005).
2. Agonisten und ihre Thrombozytenoberflächenrezeptoren
Die Aktivierung der Thrombozyten wird durch verschiedene lösliche Substanzen
induziert, den Agonisten. Über verschiedene Signaltransduktionswege führen sie letztendlich
alle zu einer Aktivierung des GPIIb/IIIa-Rezeptors und damit der Freilegung der Fibrinogen-
Bindungsstellen. Es existiert eine Vielzahl von Plättchen-aktivierenden Substanzen, darunter
Kollagen, Thrombin, Adenosindiphosphat (ADP), AS, Ristocetin, Serotonin und Epinephrine,
die je nach Spezies unterschiedlich potent sind. Alle bisher bekannten Agonist-spezifischen
Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche gehören zur Gruppe der G-Proteine (GENTRY
2000).
2.1. Kollagen und Kollagenrezeptoren
Das Subendothel der Gefäße enthält hauptsächlich Kollagen vom Typ I, III und VI
(SAVAGE et al. 2001). Kommt es zu einer Verletzung des Endothels, werden
II Literaturübersicht
9
Kollagenfibrillen freigelegt und können in Kontakt mit den Thrombozyten treten. Dabei
binden sie direkt an spezifische Kollagenrezeptoren auf der Plättchenoberfläche und dienen
somit sowohl der Adhäsion als auch der Aktivierung. Thrombozyten besitzen drei
verschiedene Kollagenrezeptoren: das Integrin GPIb/IIa, den zur Immunoglobulin-
Superfamilie gehörenden GPVI-Rezeptor und den von-Willebrand-Rezeptor (GPIb/IX/V)
(FARNDALE 2006). Bindet Kollagen nun an einen entsprechenden Rezeptor, kommt es zur
Freisetzung von AS aus der Plättchenmembran. Diese wird mit Hilfe der thrombozytären
Zyklooxygenase (COX-1) in Thromboxan A2 umgewandelt, welches wiederum ein potenter
Plättchenaktivator ist (YARDUMIAN et al. 1986).
2.2. Thrombin und Protease-aktivierte Rezeptoren
Thrombin ist eine Serinprotease, die Fibrinogen zu Fibrin spalten kann und einen der
potentesten aggregationsinduzierenden Agonisten darstellt (SAVAGE et al. 2001). Es wird
aus seinem inaktiven Vorläufer Prothrombin im Rahmen der Gerinnungskaskade generiert.
Dieser Vorgang wird maßgeblich durch die Anwesenheit aktivierter Thrombozyten gefördert,
deren negativ geladene Membranphospholipide die Bildung des Prothrombinasekomplexes
ermöglichen (QUINN 2005). Thrombozyten produzieren darüber hinaus selbst Thrombin,
was einen amplifizierenden Effekt auf die Aggregation hat.
Thrombin bindet an thrombozytäre Protease-aktivierte Rezeptoren (PAR), die G-
Protein gekoppelt sind (MOLINO et al. 1997). Insgesamt sind vier dieser Rezeptoren bekannt:
PAR-1, PAR-2, PAR-3 und PAR-4. Während PAR-2 nicht thrombin-sensitiv ist, wird PAR-3
nur auf Mäuse-Blutplättchen exprimiert (P. J. O'BRIEN et al. 2001). Humane Thrombozyten
besitzen demnach PAR-1 und PAR-4, wobei sich die zwei Rezeptoren in ihrer Affinität für
Thrombin unterscheiden (KAHN et al. 1999). PAR-1 wird bereits durch geringe
Konzentrationen von Thrombin stimuliert und führt zu einer schnellen und kurzen
Aktivierung, für die Stimulierung von PAR-4 sind höhere Konzentrationen erforderlich
(SHAPIRO et al. 2000). Da Studien gezeigt haben, dass Thrombozyten von Hunden nicht in
gleichem Maße auf humanes Thrombin reagieren wie menschliche Thrombozyten (DERIAN
et al. 1995), scheint es Unterschiede in der Verteilung oder Sensitivität der PAR zu geben, die
aber noch nicht hinreichend geklärt sind.
II Literaturübersicht
10
Neben den mäßig affinen PA-Rezeptoren existiert noch ein weiterer, hochaffiner
Rezeptor für Thrombin: der GPIb-Rezeptor, welcher Bestandteil des vWF-Rezeptors
(GPIb/IX/V) ist (SOSLAU et al. 2001). Die Aktivierung dieses Rezeptors führt zu einer
Hemmung der Fibrinogenspaltung durch Thrombin, steigert aber gleichzeitig die Aktivierung
von PAR-1 (DE CANDIA et al. 2001; LI et al. 2001).
2.3. ADP und ADP-Rezeptoren
ADP ist ein Purinnukleotid, das in den dichten Granula der Thrombozyten gespeichert
und von Erythrozyten und beschädigtem Endothel freigesetzt wird (GAARDER et al. 1961;
MEYERS et al. 1982). Canine Thrombozyten weisen eine sehr unterschiedliche Sensitivität
gegenüber ADP auf, die im Verdacht steht rasseabhängig zu sein (NIELSEN et al. 2007), aber
dennoch wesentlich höher ist als die humaner Blutplättchen (SOLOVIEV et al. 1999).
Auf der Thrombozytenoberfläche befinden sich drei verschiedene Bindungsstellen für
ADP. P2Y1 und P2Y12 sind G-Protein-gekoppelte, purinerge Rezeptoren (JIN et al. 1998).
P2Y1 induziert einen „shape change“, Ca2+-Freisetzung und aktiviert die Phospholipase C,
während P2Y12 die Adenylatzyklase hemmt (DANIEL et al. 1998). Die Bindung an beide
Rezeptoren induziert letztendlich die Aggregation. Der P2X1-Rezeptor hingegen ist ein
Ionenkanal, an den sowohl ADP als auch ATP binden kann. Er ermöglicht den Influx von
Ca2+, scheint aber keine bedeutende Rolle für die Aggregation zu spielen (SAVI et al. 1997).
Seine genaue Funktion ist noch nicht hinreichend geklärt.
2.4. Eicosanoide
Eicosanoide sind hormonähnliche Signalstoffe, die von einer Vielzahl von Zellarten
und Geweben produziert werden. Dabei handelt es sich um Abkömmlinge mehrfach
ungesättigter C20-Fettsäuren, insbesondere der AS.
Die aktivierte Phospholipase A2 setzt aus der Plasmamembran AS frei (QUINN 2005).
Diese dient als Substrat für die thrombozytäre COX-1, welche daraus als Zwischenmetabolit
Prostaglandin (PG) H2 produziert. PGH2 wird mit Hilfe der Thromboxan-Synthetase in TxA2
umgewandelt (REILLY u. FITZGERALD 1993). TxA2 ist eine labile Substanz, die eine kurze
Halbwertszeit von nur ca. 30 s hat und schnell in das inaktive Thromboxan B2 (TB2)
hydrolysiert wird (HALUSHKA et al. 1989).
II Literaturübersicht
11
Es existieren zwei Isoformen von TxA2-Rezeptoren: TxRα und TxRβ, die beide G-
Protein-gekoppelt sind (PAUL et al. 1999). Während TxRα die Phospholipase C aktiviert,
führt TxRβ zu einer Hemmung der Adenylatzyklase. Auch der TxA2-Vorläufer PGH2 ist in
der Lage, die Rezeptoren zu stimulieren (HALUSHKA et al. 1995). In niedrigen
Konzentrationen hat PGH2 einen amplifizierenden Effekt, während es in hohen
Konzentrationen inhibitorisch wirkt (QUINN 2005).
Nicht alle Spezies sprechen in gleichem Ausmaß auf AS und TxA2 an. Humane
Thrombozyten reagieren insgesamt stärker als Thrombozyten domestizierter Tiere (GENTRY
2000) und auch innerhalb der Spezies Hund existieren Unterschiede, die erblich bedingt zu
sein scheinen und evtl. rasseabhängig sind (NIELSEN et al. 2007; KALBANTNER et al.
2010). Auch der primäre Agonist hat einen Einfluss auf die TxA2-Produktion: eine
Aktivierung der Thrombozyten durch Kollagen oder Thrombin verursacht eine höhere TxA2-
Synthese als durch ADP (GENTRY 2000).
2.5. Epinephrin
Das Hormon Epinephrin (Adrenalin) wird im Nebennierenmark gebildet und in
Stresssituationen freigesetzt. Neben einer Vielzahl anderer lebenswichtiger Funktionen spielt
es auch eine Rolle im Rahmen der Thrombozytenaktivierung. Epinephrin bindet sowohl an
thrombozytäre stimulierende α-Rezeptoren, die zur Hemmung der Adenylatzyklase führen,
als auch an inhibitorische β-Rezeptoren (SOLOVIEV et al. 1999). Dies erklärt die
unterschiedliche Sensitivität verschiedener Spezies gegenüber Epinephrin, da die
Rezeptorendichte (α/β-Verhältnis) speziesabhängig ist (KERRY et al. 1984). Canine
Thrombozyten sprechen nur sehr schlecht auf Epinephrine an (FEINGOLD et al. 1986), es
kann lediglich den Effekt anderer Agonsiten amplifizieren (GENTRY 2000).
3. Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel
Clopidogrel ist ein Thienopyridin, das den P2Y12-ADP-Rezeptor blockiert. Dieses,
zurzeit nur in Tablettenform verfügbare Medikament, stellt eine „prodrug“ dar, welche
zunächst durch Cytochrom P450 in der Leber in ihren aktiven Metaboliten verstoffwechselt
II Literaturübersicht
12
werden muss (SAVI et al. 1994). Die dabei entstehenden Metaboliten sind beim Menschen
bereits eingehend untersucht worden, beim Hund hingegen noch relativ unbekannt. Beim
Menschen entstehen der aktive Metabolit R-130964, ein Thiolderivat, und der inaktive
Metabolit SR 26334 (PEREILLO et al. 2002). Letzterer konnte auch bei mit Clopidogrel
behandelten Hunden nachgewiesen werden, wenn auch in etwas niedrigeren Konzentrationen
(BRAINARD et al. 2010).
Der aktive Metabolit des Clopidogrels bindet irreversibel an den P2Y12-Rezeptor und
führt zu dessen Inaktivierung (MUELLER et al. 2007). Dadurch wird die Hemmung der
Adenylatzyklase antagonisiert, was zu einem erhöhten cAMP-Spiegel im Thrombozyten führt
(SAVI et al. 2001). Clopidogrel hemmt die ADP-induzierte Sekretion der α-Granula und die
Adhäsion am Subentdothel (GAWAZ 1999). Letztendlich führt all dies indirekt zur
Hemmung der GPIIb/IIIa-Rezeptor-Aktivierung. Außerdem scheint Clopidogrel die
Fibrinolyse zu steigern (GAWAZ 1999).
Die in der Humanmedizin gängige Dosierung von 75 mg/Tag führt nach 3–7 Tagen zu
einem steady state (SAVCIC et al. 1999). In einer Studie von BRAINARD et al. (2010)
wurde die Pharmakodynamik von Clopidogrel bei Hunden mittels Thrombelastografie,
turbidimetrischer und Impedanzaggregometrie untersucht. Die Hunde erhielten Clopidogrel in
einer Dosierung von 0,32–1,3 mg/kg/Tag über 3–5 Tage. Dabei zeigte sich, dass es bereits
drei Stunden nach Therapiebeginn zu einer signifikanten Hemmung der ADP-induzierten
Thrombozytenaggregation kommt und dass die Wirkdauer auch beim Hund ca. 24 Stunden
beträgt, wobei eine vollständige Wiederherstellung der Plättchenfunktion ca. 7 Tage nach
Absetzen des Medikaments erfolgte.
4. Thrombozytenfunktionsdiagnostik
Es existiert eine Vielzahl verschiedener Analyseverfahren zur Messung der
Thrombozytenfunktion, aber nur wenige konnten sich bisher in der Routinediagnostik
durchsetzen. Dies liegt u.a. daran, dass viele der Verfahren sehr aufwendig sind und eine
schlechte Standardisierbarkeit aufweisen. Zu den am häufigsten verwendeten Verfahren
gehören die kapilläre in-vivo Blutungszeit, die automatische Thrombozytenfunktionsanalyse
II Literaturübersicht
13
mit dem Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100, die turbidimetrische
Thrombozytenaggregationsmessung nach Born und die Impedanzaggregometrie.
4.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit
Die Messung der kapillären Blutungszeit gehört zu den ältesten Verfahren der
Thrombozytenfunktionsdiagnostik in der Humanmedizin (RAND et al. 2003). Der Test dient
als Screeningverfahren zur Feststellung von Störungen der primären Hämostase aufgrund
einer Thrombozytopenie, Thrombozytendysfunktion oder eines Mangels an vWF (MISCHKE
u. KEIDEL 2003).
Beim Hund wird die Blutungszeit zumeist an der bukkalen Maulschleimhaut getestet,
indem eine Inzision an der Innenseite der Lefze durchgeführt und die Zeit bis zum Stillstand
der Blutung gemessen wird. Im Rahmen der Evaluierung der Methode durch JERGENS et al.
(1987) konnten verlängerte Blutungszeiten bei Hunden mit Thrombozytopenie, von-
Willebrand-Erkrankung und Urämie, sowie nach Acetylsalizylsäure (ASS)-Verabreichung
gemessen werden. Von Nachteil bei dieser relativ weit verbreiteten Methode ist die in der
Regel erforderliche Sedation, da die Inzision schmerzhaft ist und demnach schlecht toleriert
wird (FORSYTHE u. WILLIS 1989; BRASSARD u. MEYERS 1991) und die
Schwierigkeiten, die sich beim Stoppen der Blutung im Fall einer ernsthaften
Hämostasestörung ergeben.
In den 90er Jahren stellten NOLTE et al. (1997) eine Methode zur Messung der
kapillären Blutungszeit an der Zehe von nicht-anästhesierten Hunden vor. Zur Evaluierung
der Methode erfolgten Messungen der kapillären Blutungszeit und der Kollagen-induzierten
maximalen Thrombozytenaggregation bei 11 klinisch gesunden Hunden, die zuvor intravenös
ASS appliziert bekommen hatten. Dabei konnte eine reproduzierbare Verlängerung der
Blutungszeit beobachtet werden. Die Vorteile dieser Methode sind die nicht erforderliche
Narkose und die bessere, wenn auch nicht vollständige Standardisierbarkeit (zur
Durchführung s. S. 34).
4.2. Plättchenfunktionsanalysator PFA-100
Die automatische Plättchenfunktionsanalyse mittels PFA-100 kann als ein Globaltest
der primären Hämostase angesehen werden. 1985 stellten KRATZER und BORN erstmals ein
II Literaturübersicht
14
Verfahren zur in vitro Messung der Blutungszeit vor (KRATZER u. BORN 1985), auf dessen
Prinzip auch der PFA-100 basiert. Dabei wird Vollblut unter einem Vakuum durch eine
Kapillare gesaugt, an deren Ende sich eine Agonisten-beschichtete Membran befindet, die
eine zentrale Öffnung aufweist und die Zeit bis zu deren Verschluss durch die Thrombozyten
gemessen wird (s. S. 34). Aufgrund der Einbeziehung von hohen Scherkräften ist der PFA-
100 besonders sensitiv gegenüber Störungen des vWF (CALATZIS 2007). Der Vorteil
gegenüber der in vivo Blutungszeit besteht in der besseren Standardisierbarkeit und einem
geringeren Aufwand (MUELLER et al. 2009).
Da das Gerät ursprünglich für den Einsatz in der Humanmedizin konzipiert wurde,
prüften verschiedene Studien seine Eignung für die Untersuchung von Hundeblut (CALLAN
u. GIGER 2001; KEIDEL 2001). Dabei stellte sich heraus, dass der PFA-100 durchaus auch
für die Untersuchung von Hundeblut geeignet ist, wobei eine der zwei verschiedenen
Messzelltypen zu bevorzugen ist (Kollagen/ADP-Messzelle). CALLAN u. GIGER (2001)
untersuchten im Einzelnen die Anwendbarkeit des Gerätes bei Hunden mit
Thrombozytopenie, Thrombopathie und von-Willebrand-Erkrankung und konnten verlängerte
Verschlusszeiten bei diesen Hunden feststellen. Aufgrund des signifikanten Einflusses des
Hämatokrits auf die Messergebnisse ist der klinische Anwendbarkeit jedoch begrenzt
(MISCHKE u. KEIDEL 2003).
4.3. Turbidimetrische Aggregometrie nach BORN
Die von BORN im Jahre 1962 vorgestellte turbidimetrische Aggregometrie basiert auf
der Änderung der optischen Dichte von plättchenreichem Plasma (PRP) nach Zugabe eines
aggregationsinduzierenden Agonisten. Diese Methode galt lange Zeit als „Goldener Standard“
in der Thrombozytenfunktionsdiagnostik, was insbesondere an der guten Standardisierbarkeit
lag (HARRISON 2005). So kann die Thrombozytenzahl im PRP problemlos durch
Verdünnung oder Aufkonzentrieren eingestellt werden, was es ermöglicht, die
Thrombozytenfunktion unabhängig von quantitativen Einflüssen zu untersuchen. Nachteil
dieser Methode ist die relativ aufwendige Probenaufbereitungszeit, die mehrere
Zentrifugationsschritte umfasst und einige unerwünschte Nebeneffekte mit sich bringt. So
werden größere Thrombozyten, die in der Regel besonders aktiv sind, häufig mit
abzentrifugiert und es kann während der Zentrifugation zu Zellschädigungen kommen
II Literaturübersicht
15
(DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Studien haben gezeigt, dass je nach
Separationsmethode im Durchschnitt nur 61–90% der gesamten Thrombozyten in die
Messung mit eingehen (PERSIDSKY u. LING 1982). Des Weiteren ist die Messung in
lipämischem oder ikterischem Plasma nicht möglich (RAND et al. 2003). In einer Studie von
MISCHKE et al. (2004), in der die Plättchenaggregation einer großen Anzahl klinisch
gesunder Hunde gemessen wurde, zeigte sich, dass die turbidimetrische Methode besonders
sensitiv gegenüber verminderter Aggregation ist. Dabei erwiesen sich Konzentrationen von >
25 µmol/L ADP, 10 µg/mL Kollagen und 1 IU/mL Thrombin als besonders geeignet,
wohingegen die Agonisten Ristocetin und Epinephrin für die Untersuchung von caninem
Plasma ungeeignet sind. Dies bestätigen Ergebnisse aus verschiedenen früheren Studien, die
ebenfalls ein schlechtes Ansprechen caniner Thrombozyten auf Ristocetin (LEIS et al. 1980)
und Epinephrin (CLEMMONS u. MEYERS 1984; FEINGOLD et al. 1986) im PRP
beobachten konnten.
4.4. Vollblutaggregometrie
In den letzten 25 Jahren wurden immer wieder Methoden entwickelt, die die
Aggregation im Vollblut messen (CALATZIS 2007). Der Vorteil gegenüber der Messung im
PRP besteht, neben dem Wegfall der Zentrifugation und der damit einhergehenden
Zeitersparnis, vor allem im Vorherrschen eines physiologischen Milieus. Studien haben den
Einfluss von roten und weißen Blutzellen auf die Thrombozytenfunktion aufgezeigt. So
konnten GAARDER et al. (1961) das Vorhandensein von ADP in roten Blutzellen und dessen
Effekt auf die Plättchenadhäsion belegen. SANTOS et al. (1991) konnten in ihrer Studie an
klinisch gesunden Menschen zeigen, dass Erythrozyten einen modulierenden Effekt auf die
Thrombozytenreaktivität haben, indem sie zu einer gesteigerten Plättchenaktivierung, einer
erhöhten Mobilisierung von AS aus dem Thrombozyten und einer vermehrten Ansammlung
von AS in der zellulären Umgebung führen. Dies erklärt, warum beim Vollblutverfahren im
Vergleich zum PRP eine höhere Menge an ADP zugesetzt werden muss, um eine Aggregation
zu induzieren und auf der anderen Seite weniger AS nötig ist (SIESS 1989). Ebenso haben
Leukozyten Einfluss auf die Thrombozytenfunktion: über ihren P-Selektin Glykoprotein
Liganden (PSGL) binden sie an das auf der Oberfläche aktiver Thrombozyten exprimierte P-
Selektin, was zu einer zusätzlichen Thrombingenerierung führt (BOUCHARD u. TRACY
II Literaturübersicht
16
2001). Ein weiterer Vorteil der Vollblutaggregometrie ist die Möglichkeit, auch ikterische
oder lipämische Proben untersuchen zu können (INGERMAN-WOJENSKI et al. 1983).
Eine Studie von DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. (2005) verglich beim Menschen
die turbidimetrische mit der Vollblutimpedanz-Aggregometrie. Dabei stellte sich die
Aggregationsmessung im Vollblut als überlegen heraus, konnte doch anhand mehrerer
Fallstudien eine verminderte Thrombozytenaggregation im Vollblut bei Patienten mit
Thrombozytendysfunktionen bzw. unter Therapie mit Plättchenhemmern festgestellt werden,
die bei der Untersuchung im PRP im Normalbereich lag. Insbesondere die Sensitivität
gegenüber Plättchenhemmern, aber auch gegenüber erblichen und erworbenen
Thrombozytendysfunktionen war im Vollblutverfahren höher.
Den ersten, erfolgversprechenden Ansatz zur Messung der Thrombozytenfunktion im
Vollblut lieferten 1979 Cardinal und Flower mit der Impedanzaggregometrie. Das Prinzip
dieser Methode basiert auf der elektrischen Widerstandserhöhung zwischen zwei Elektroden
(CARDINAL u. FLOWER 1980). Kommen die Thrombozyten in Kontakt mit der
thrombogenen Metalloberfläche der Elektroden, bilden sie eine Monoschicht auf diesen.
Durch Zugabe eines aggregationsinduzierenden Agonisten (z.B. ADP oder Kollagen) zu der
mit Kochsalzlösung verdünnten Vollblutprobe kommt es zur Anlagerung weiterer
Thrombozyten an die Monoschicht. Der sich dadurch ändernde Widerstand wird mit einem
Schreiber grafisch dargestellt (CARDINAL u. FLOWER 1980).
Eines der neuesten Verfahren basierend auf der Impedanzaggregometrie ist die
„multiple electrode aggregometry“ (MEA). Alle vorherigen Verfahren bedienten sich
wiederverwendbarer Elektroden, die nach jeder Messung gereinigt werden mussten, was eine
potentielle Fehlerquelle darstellt (TOTH et al. 2006). Bei der MEA kommen Einweg-
Messzellen zum Einsatz, die zwei Elektrodenpaare beinhalten. TÓTH et al. (2006)
untersuchten in ihrer Studie u.a. den Einfluss der Thrombozytenzahl auf die detektierte
maximale Aggregation und konnten keine Abhängigkeit feststellen, wobei allerdings alle
gemessenen Proben eine Plättchenzahl aufwiesen, die nur innerhalb des Referenzbereichs
schwankte. Des Weiteren konnte eine geringgradige spontane Thrombozytenaggregation,
evtl. durch den Rührmagneten verursacht, beobachtet werden, die bei Verwendung von
Hirudin als Antikoagulanz deutlich niedriger ausfiel als bei Citrat. Messungen mit der MEA
wiesen eine relativ hohe interindividuelle Variabilität auf, die für den Agonisten ADP
II Literaturübersicht
17
besonders ausgeprägt war. Die Thrombozytenaggregation war bei Hirudin-antikoagulierten
Proben signifikant höher als bei Citrat-antikoagulierten, was im Konsens mit einer anderen
Studie steht, die den Einfluss von Antikoagulantien auf die Aggregationsmessung im Vollblut
untersuchte (WALLEN et al. 1997).
In einer Studie von KALBANTNER et al. (2010) wurde erstmals systematisch die
Eignung eines Impedanzaggregometers (Multiplate® Aggregometer) für die Messung von
Hundeblut geprüft. Dabei wurden Referenzwerte etabliert (Tab. 1), verschiedene
Antikoagulantien getestet und optimale Konzentrationen verschiedener
aggregationsinduzierender Agonisten ausgearbeitet. Es stellte sich heraus, dass die Agonisten
Ristocetin und „Thrombin-Rezeptor aktivierendes Peptid 6“ (TRAP-6) keine zuverlässige
Aggregation beim Hund induzieren konnten. Für die weiteren Agonisten konnten optimale
Konzentrationen von 10 µmol/L ADP, 5 µg/mL Kollagen und 1 mmol/L AS eruiert werden,
die damit etwas höher als die für humanes Blut empfohlenen Konzentrationen liegen.
Hirudin erwies sich als Anitkoagulanz gegenüber Citrat und Citratpuffer überlegen, was mit
Beobachtungen bei humanem Blut übereinstimmt. Die für humanes Blut empfohlene
Messzeit von 6 min wurde in der Studie auf 12 min verlängert, um der Aggregationskurve das
Erreichen eines Plateaus zu ermöglichen, sodass die tatsächliche, maximale Aggregation
erfasst werden konnte.
Tabelle 1: Referenzbereiche der „area under the curve“ (AUC) und der maximalen
Aggregation für die Messung von Hundeblut für verschiedene Agonisten in ihren optimalen
Konzentrationen (KALBANTNER et al. 2010).
Agonist Referenzbereich
AUC (AU*min) max. Aggregation (AU)
ADP (10 µmol/L) 1481–3448 105–234
Kollagen (5µg/mL) 2017–3460 155–246
Arachidonsäure (1 mmol/L) 1011–3457 73,9–228
II Literaturübersicht
18
5. Einfluss entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion
5.1. Übersicht vorhandener Studien
In der Veterinärmedizin existieren einige wenige Studien, die den Einfluss
entzündlicher Erkrankungen auf die primäre Hämostase beim Hund untersucht haben. Zur
Messung der Thrombozytenaggregation wurde dazu in der Mehrzahl der Studien die
turbidimetrische Aggregometrie verwendet (Tab. 2). Dabei ergaben die meisten Studien eine
signifikant herabgesetzte Aggregation, die unabhängig vom eingesetzten Agonisten zu sein
schien. So konnte bei Hunden mit Leishmaniose (VALLADARES et al. 1998; CORONA et
al. 2004) und Ehrlichiose (HARRUS et al. 1996a; BRANDAO et al. 2006) eine im Vergleich
zur Kontrollgruppe signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation beobachtete werden.
Lediglich bei Herzwurminfektionen (BOUDREAUX et al. 1989) und in der frühen Phase der
experimentell induzierten akuten Pankreatitis (LUKASZYK et al. 1989) war die
Thrombozytenaggregation erhöht. Der Stichprobenumfang war bei vielen Untersuchungen
relativ klein und bei dem untersuchten Krankheitsgeschehen handelte es sich zumeist um
Infektionskrankheiten.
Hinsichtlich des Einflusses entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenzahl
existieren unterschiedliche Ergebnisse (Tab. 3). Die Mehrzahl der Studien konnte eine
signifikant erniedrigte Plättchenzahl beobachten (NAVARRO u. KOCIBA 1982;
HAUPTMAN et al. 1997; SCHETTERS et al. 2009), es wird jedoch auch vom Fehlen
signifikanter Unterschiede berichtet (BOUDREAUX et al. 1989; MORENO et al. 1998; DE
LAFORCADE et al. 2003; MORITZ et al. 2005).
Neben der turbidimetrischen Aggregometrie kamen weitere Untersuchungsverfahren
zur Beurteilung der Plättchenfunktion beim Hund zum Einsatz (Tab. 4). Dies waren die
kapilläre Blutungszeit, die bei Hunden mit Leishmaniose verlängert war (MORENO et al.
1998), der PFA-100, bei dem eine verlängerte Verschlusszeit bei Hunden mit Endotoxämie
beobachtet werden konnte (YILMAZ et al. 2005), die Durchflusszytometrie, die eine erhöhte
Expression von P-Selektin auf der Thrombozytenoberfläche von Hunden mit entzündlichen
Erkrankungen detektierte (MORITZ et al. 2005) und die Thrombelastografie, deren
II Literaturübersicht
19
Messungen eine höhere Amplitude bei Hunden mit Parvovirose aufzeigten (OTTO et al.
2000).
Studien aus der Humanmedizin, die die Thrombozytenaggregation mittels
turbidimetrischer Aggregometrie untersuchten (Tab. 5), konnten in Übereinstimmung mit den
Ergebnissen bei Hunden eine verminderte Aggregation bei Menschen mit Endotoxämie bzw.
Sepsis nachweisen (SABA et al. 1984; YAGUCHI et al. 2004; WOTH et al. 2011). Die
beobachtete verkürzte Verschlusszeit bei Untersuchungen mit dem PFA-100 von Menschen
mit Sepsis und spontaner akuter Pankreatitis hingegen weicht von den Ergebnissen beim
Hund ab (HOMONCIK et al. 2000; MIMIDIS et al. 2004).
II Literaturübersicht
20
Tabelle 2: Übersicht der Studien zur Messung der Thrombozytenfunktion mittels turbidimetrischer Aggregometrie bei Hunden mit
entzündlichen Erkrankungen.
ADP = Adenosindiphosphat, AS = Arachidonsäure, Epi = Epinephrin, exp. = experimentell, klin. = klinisch, Kol = Kollagen
Studie n (n Kontrolle) klin. exp. Erkrankung Agonisten Ergebnisse
Boudreaux et al. (1989) 28 (34) X Herzwurm-
infektion ADP, Kol signifikant höhere ADP- und kollagen-induzierte maximale Aggregation im Vergleich zur Kontrollgruppe
Brandão et al. (2006) 7 (3) X Ehrlichiose ADP/Epi,
Kol/Epi signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation bei beiden Agonistenkombinationen
Corona et al. (2004) 30 (10) X Leishmaniose ADP, Kol signifikant niedrigere maximale Aggregation
(Kollagen > ADP) Harrus et al.
(1996a) 6 X Ehrlichiose ADP, Kol, Epi Hemmung der Plättchenaggregation bei 5 von 6 Hunden bei mindestens einem Agonisten
Jacobs et al. (1986) 4 (3) X akute
Pankreatitis ADP, Kol, AS signifikant niedrigere Aggregation bei allen Agonisten
Lukaszyk et al. (1989) 10 X akute
Pankreatitis ADP, AS
erhöhte Sensitivität der Thrombozyten für ADP bis 60 min nach Induktion, signifikant niedrigere Sensitivität nach 2h und 4h; keine Unterschiede bzgl. AS-induzierter Aggregation
Valladares et al. (1998) 6 (2) X Leishmaniose Kol signifikant niederigere kollagen-induzierte
Thrombozytenaggregation
II Literaturübersicht
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Tabelle 3: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf
die Thrombozytenzahl beim Hund.
exp. = experimentell, klin. = klinisch
Studie n (n Kontrolle) klin. exp. Erkrankung Ergebnisse
Boudreaux et al. (1989) 28 (34) X Herzwurm-
infektion keine signifikanten Unterschiede
de Larforcade et al. (2003) 20 (28) X Sepsis keine signifikanten Unterschiede
Harrus et al. (1996a) 6 X Ehrlichiose
signifikant niedrigere Thrombozytenzahl mit Tiefpunkt zwischen Tag 17 + 24 nach der Infektion
Hauptman et al. (1997) 30 (320) X Sepsis
signifikant niedrigere Thrombozytenzahl bei septischen Hunden im Vergleich zu nicht-septischen
Jacobs et al. (1986) 4 (3) X akute
Pankreatitis
keine signifikanten Unterschiede, aber signifikant niedrigere Thrombozytenzahl bei erkrankten Hunden und Kontrollgruppe post OP
Lukaszyk et al. (1989) 10 X akute
Pankreatitis
signifikant niedrigere Thrombozytenzahl bis 4 h nach Induktion
Moreno et al. (1998) 26 (10) X Leishmaniose keine signifikanten Unterschiede
Moritz et al. (2005) 20 (20) X Entzündung keine signifikanten Unterschiede
Navarro et al. (1982) 5 (5) X Leptospirose
signifikant niedrigere Thromobozytenzahl, niedrigste Konzentrationen an Tag 2 + 4 nach Infektion, Ausgangsniveau an Tag 10 wieder erreicht
Schetters et al. (2009) 10 X Babesiose
dramatische Abnahme der Thrombozytenzahl proportional zur Infektionsdosis.
Valladares et al. ( 1998) 6 (2) X Leishmaniose
signifikant, fortschreitend niedrigere Thrombozytentzahl, Ausgangsniveau innerhalb von 6 Monaten nach Therapie erreicht
Yilmaz et al. (2005) 17 (8) X Endotoxämie
signifikant niedrigere Thrombozytenzahl mit Tiefpunkt 0,5 h nach Infektion
II Literaturübersicht
22
Tabelle 4: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion (außer
turdidimetrische Aggregometrie) beim Hund.
CADP = Kollagen/ADP-Messzelle, CEPI = Kollagen/Epinephrin-Messzelle, exp. = experimentell, klin. = klinisch, MPC = mittlere Plättchenkonzentration, PFA = Plättchenfunktionsanalysegerät, VZ = Verschlusszeit
Studie n (n Kontrolle) Klin. Exp. Erkrankung Tests Ergebnisse
Moreno et al. (1998) 26 (10) X Leishmaniose kapilläre Blutungszeit
signifikante Verlängerung der Blutungszeit, insbesondere bei erkrankten Hunden mit hohen Kreatininwerten
Moritz et al. (2005) 20/20 X
gemischtes Kollektiv an
entzündl. Erkrankungen
Durchflusszytometrie (P-Selektin), MPC
zirkulierende, aktivierte Thrombozyten bei 60% der Hunde mit entzündlichen Erkrankungen; MPC sensitiver als P-Selektin zur Detektion von aktiverten Plättchen
Otto et al. (2000) 9/9 X Parvovirose Thrombelastografie signifikant höhere maximale Amplitude im
Vergleich zur Kontrollgruppe
Yilmaz et al. (2005) 17 (8) X Endotoxämie
(E.coli) PFA-100,
Hämatokrit
verkürzte VZ 0,5 h (CADP + CEPI) und verlängerte VZ 1 h (CEPI) bzw. 2 h (CADP) nach Endotoxin-Applikation; bei hochdosiertem Endotoxin VZ auch nach 48 h noch verlängert; keine signifikanten Veränderungen hinsichtlich Htk.
II Literaturübersicht
23
Tabelle 5: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion beim
Menschen.
ADP = Adenosindiphosphat, AS = Arachidonsäure, CADP = Kollagen/ADP-Messzelle, CEPI = Kollagen/Epinephrin-Messzelle, Epi = Epinephrin, exp. = experimentell, klin. = klinisch, Kol = Kollagen, PFA = Plättchenfunktionsanalysegerät, VZ = Verschlusszeit
Studie n (n Kontrolle) klin. exp. Erkrankung Tests Ergebnisse
Homoncik et al. (2000) 20 (10) X Sepsis PFA-100 verkürzte VZ sowohl bei Messungen mit CADP als
auch mit CEPI
Mimidis et al. (2004) 16 (32) X akute
Pankreatitis PFA-100 verkürzte VZ bei Messungen mit CADP, keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe bei Messungen mit CEPI
Saba et al. (1984)
nicht spezifiziert in vitro Endotoxämie
turbidimetrische Aggregometrie (ADP, Kol, AS)
signifikant niedrigere Plättchenaggregation bei allen Agonisten, Hemmung proportional zur Endotoxin-Konzentration
Whitworth et al. (1989)
nicht spezifiziert in vitro Endotoxämie
turbidimetrische Aggregometrie
(ADP, Kol, EPI); Impedanzaggregometrie
(ADP, Kol)
Impedanzaggregometrie: signifikant höhere kollagen-induzierte Aggregation turbidimetrische Aggregometrie: signifikant höhere epinephrin-induzierte Aggregation + signifikant niedrigere kollagen-induzierte Aggregation (S.enteritidis)
Woth et al. (2011) 45 (30) X Sepsis
turbidimetrische Aggregometrie
(ADP, Kol, Epi)
signifikant niedrigere Aggregation bei allen Agonisten
Yaguchi et al. (2004) 47 (15) X Sepsis
turbidimetrische Aggregometrie
(ADP, Kol, AS)
signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation bei allen septischen Patienten, unabhängig vom verwendeten Agonisten; AS-induzierte Aggregation am deutlichsten erniedrigt
II Literaturübersicht
24
5.2. Pathogenese entzündlich bedingter Thrombozytendysfunktionen
5.2.1. Thrombozytopenie als Ursache der verminderten Aggregation
Viele entzündliche Erkrankungen sind mit einer Thrombozytopenie assoziiert
(HAUPTMAN et al. 1997; VALLADARES et al. 1998; SCHETTERS et al. 2009). Diese
kann das Resultat eines erhöhten Verbrauchs, einer beeinträchtigten Produktion oder einer
gestörten Verteilung sein (FELDMAN et al. 1988). Darüber hinaus kann das Auftreten von
Anti-Plättchen Antikörpern (s. Kap. 5.2.3.) eine Thrombozytopenie verursachen
(TERRAZZANO et al. 2006). Eine Studie von GRINDEM et al. (1991) fand heraus, dass die
Thrombozytopenie von 987 Hunden in 23% der Fälle entzündlich bzw. infektiös bedingt war.
Eine mögliche Thrombozytopenie ist außerdem von Interesse bei der Auswertung der
Aggregationsmessungen. So konnte gezeigt werden, dass Thrombozytenzahlen unter 100
x103/µL zu einer deutlichen Abnahme der turbidimetrisch erfassten Aggregation führen
(RAND et al. 2003; ZHOU u. SCHMAIER 2005). Im Fall der Impedanzaggregometrie haben
bereits Thrombozytenzahlen von unter 150 x103/µL einen negativen Einfluss auf die
Messergebnisse (MENGISTU et al. 2009).
Eine Thrombozyopenie ist sicherlich in vielen Fällen maßgeblich an einer
verminderten Thrombozytenaggregation beteiligt (VALLADARES et al. 1998; YILMAZ et
al. 2005), doch haben verschiedene Studien immer wieder gezeigt, dass auch in Fällen mit
Thrombozytenzahlen im Normalbereich eine Hemmung der Plättchenfunktion auftritt
(MORENO et al. 1998; MORITZ et al. 2005). Aus diesem Grund müssen weitere
Mechanismen existieren, die eine gestörte Thrombozytenfunktion verursachen.
5.2.2. Thrombozytenfunktions“erschöpfung“
MORITZ et al. (2005) vermuten aufgrund des Nachweises einer erhöhten P-Selektin-
Expression auf der Thrombozytenoberfläche, dass Hunde mit entzündlichen Erkrankungen
vermehrt zirkulierende, aktivierte Thrombozyten aufweisen. Diese können in vitro teilweise
hypofunktional erscheinen, da sie durch die vorangegangene Aktivierung in vivo refraktär
gegenüber einer weiteren Aktivierung sind. Ähnliches konnte bei Menschen mit Morbus
Crohn (COLLINS et al. 1994) und Sepsis (GAWAZ et al. 1995) beobachtet werden.
PEERSCHKE (1985) fand heraus, dass diese Refraktärphase mit einer gehemmten
II Literaturübersicht
25
intrathrombozytären Ca2+-Mobilisation und dem Unvermögen, Fibrinogen zu binden
einhergeht. Dies würde letztendlich in einer verminderten Aggregationsfähigkeit resultieren.
Andere Autoren bezeichnen dieses Phänomen als „Erschöpfung“ der Thrombozytenfunktion,
die auch im Rahmen der caninen Ehrlichiose (BRANDAO et al. 2006) und bei Hunden mit
akuter Pankreatitis (JACOBS et al. 1986) beobachtet wurde. Diese Thrombozyten zirkulieren
weiterhin im Blut und beeinflussen somit mögliche Messungen in vitro (J. R. O'BRIEN
1978).
5.2.3. Anti-Plättchen Antikörper
Im Serum von an Ehrlichiose oder Leishmaniose erkrankten Hunden konnten Anti-
Plättchen Antikörper nachgewiesen werden. Im Fall der Leishmaniose besteht ein
Zusammenhang zwischen klinischem Stadium der Erkrankungen, der Thrombozytenzahl und
dem Auftreten von Antikörpern (TERRAZZANO et al. 2006), während im Fall einer
Ehrlichiose Anti-Plättchen Antikörper insbesondere in der akuten Phase vorhanden sind
(HARRUS et al. 1996b). Die Eliminierung durch die Antikörper führt zu einer
Thrombozytopenie, während eine Bindung der Antikörper an die Thrombozytenoberfläche,
v.a. wenn diese an Rezeptoren erfolgt, eine Thrombozytendysfunktion hervorrufen kann. In
einer weiteren Studie von HARRUS et al. (1996a) kam es aber auch dann zu einer Hemmung
der Thrombozytenaggregation, wenn keine Antikörper mehr vorhanden waren. Diese
Beobachtung spricht dafür, dass es weitere Faktoren geben muss, die zu einer
Thrombozytenfunktionstörung führen.
5.2.4. Einfluss von Endotoxinen/Lipopolysacchariden (LPS) auf die
Thrombozytenfunktion
Studien konnten zeigen, dass Endotoxine bzw. LPS über verschiedene Mechanismen
Einfluss auf die Thrombozytenfunktion nehmen können (SABA et al. 1984; YAGUCHI et al.
2004; WOTH et al. 2011). So konnte gezeigt werden, dass Endotoxine in der Lage sind,
direkt an Thrombozyten zu binden und auf diese Weise die Thrombozytenfunktion zu
beeinträchtigen (SALDEN u. BAS 1994). Darüber hinaus können LPS das Endothel der
Gefäßwand schädigen (HARLAN et al. 1983) und zu einer gesteigerten Expression von
Adhäsionsmolekülen auf dem Endothel führen (JILMA et al. 1999) und im Speziellen die
II Literaturübersicht
26
vermehrte Freisetzung von vWF induzieren (GRALNICK et al. 1989). Dies resultiert in einen
erhöhten Verbrauch an Blutplättchen, was eine Thrombozytopenie zur Konsequenz hat. Ein
weiterer Mechanismus wird von NYSTROM et al. (1994) beschrieben, die eine herabgesetzte
Reaktionsfähigkeit der Thrombozyten von Patienten mit Endotoxämie gegenüber dem
Agonisten Epinephrin feststellen konnten und dies auf einen Mangel an Adrenorezeptoren auf
der Thrombozytenoberfläche zurückführten. Ähnliches konnte in einer Studie von SABA et
al. (1984) für den Agonisten bzw. Metaboliten TxA2 beobachtet werden. Das stark reduzierte
Ansprechen der Thrombozyten auf TxA2 scheint das Resultat einer Hemmung der
Plättchendegranulation und einer Beeinträchtigung des Calciumtransports zu sein.
5.2.5. Aggregationsinduktion durch zirkulierende Immunkomplexe
Immunkomplexe sind in der Lage, über einen thrombozytären IgG-Rezeptor, den
FcγIIA-Rezeptor, eine Agglutination der Plättchen zu induzieren (CLARK et al. 1982).
Antikörper des Immunkomplexes binden an den auf der Thrombozytenoberfläche
exprimierten FcγIIA-Rezeptor und führen dadurch zu einer Agglutination der Thrombozyten
(SJOBRING et al. 2002; JANCAR u. SANCHEZ CRESPO 2005). Zirkulierende
Immunkomplexe wurden bereits im Rahmen der caninen Leishmaniose nachgewiesen
(PUMAROLA et al. 1991; LOPEZ et al. 1996).
5.2.6. Microbial surface components reacting with adhesive matrix molecules
(MSCRAMMs)
Auf der Oberfläche grampositiver Bakterien (insbesondere Staphylokokken) konnte
eine Gruppe von Oberflächenadhesinen, sogenannte „microbial surface components reacting
with adhesive matrix molecules“ (MSCRAMMs) identifiziert werden, die u.a. die Adhäsion
an und Aktivierung von Thrombozyten bewirken können (PATTI et al. 1994). Zu diesen
MSCRAMMs zählt auch der clotting factor A (ClF A), an den sowohl Fibrinogen als auch
spezifische Antikörper binden können. Das gebundene Fibrinogen kann, da es aufgrund der
Immobilisation eine Konformationsänderung erfährt, an den inaktiven GPIIa/IIIb-Rezeptor
auf der Thrombozytenoberfläche binden und somit über Brückenbildung eine Vernetzung der
Thrombozyten induzieren (PATTI et al. 1994). Des Weiteren führt der an den ClF A
gebundene Antikörper über Bindung an den thrombozytären FcγIIA-Rezeptor zur Aktivierung
II Literaturübersicht
27
des Thrombozyten (LOUGHMAN et al. 2005). Eine Studie von KERRIGAN et al. (2008)
zeigte außerdem, dass die alleinige Bindung des Fibrinogen-ClF A-Komplexes an den
Thrombozyten nicht ausreicht, um eine vollständige Aggregation zu induzieren. Erst die
simultane Bindung von Fibrinogen und Antikörpern an den ClF A ermöglicht dies. Dieser
Pathomechanismus kann somit letztendlich die Anzahl der refraktären Thrombozyten erhöhen
und somit eine gehemmte in vitro Aggregation hervorrufen.
III Material, Tiere und Methoden
28
III Material, Tiere und Methoden
1. Material
1.1. Geräte und Bezugsquellen
Beckman Coulter GmbH, Krefeld
Allegra™ 6 KR Centrifuge
Dynabyte Informationssysteme GmbH, München
Multiplate® 5.0 Analyzer
ERKA. Kallmeyer Medizintechnik GmbH & Co. KG, Bad Tölz
Pädiatrisches Sphygomanometer
Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim
ACCU-CHEK Softclix® Classic
Rolf Greiner Biochemica GmbH, Flacht
APACT 4
Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn
Advia 120 Hematology System
Dade PFA-100
Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz
Sigma 1-14 Mikrozentrifuge
III Material, Tiere und Methoden
29
1.2 Reagenzien, Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen
B.Braun Melsungen AG, Melsungen
Isotone Kochsalzlösung 0,9%
Softasept® N Hautdesinfektionsmittel
Becton Dickinson GmbH, Drogheda, Irland
BD Microlance™ 3 sterile Kanüle 1,2 x 40 mm (18G x 1 ½ “) (rosa)
Bioanalytic GmbH, Umkirch/Freiburg
Natriumcitratlösung 0,11 mol/L
BioHit Oyj, Helsinki, Finnland
BioHit Optifit Tip 350 µL
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Ingelheim am Rhein
Finalgon® Capsicum Creme 26,5 mg/50 g
Brand Plastibrand® GmbH, Wertheim
Pipettenspitzen 50-1000 μl, blau
Pipettenspitzen 2-100 μl, gelb
Dynabyte GmbH, München
Multiplate® ADPtest (Adenosindiphosphat)
Multiplate® COLtest (Kollagen)
Multiplate® ASPItest (Arachidonsäure)
Dynabyte Informationssysteme GmbH, München
Multiplate® 4,5 ml Hirudin Blood Tube
III Material, Tiere und Methoden
30
Eppendorf AG, Hamburg
Einkanal Pipette Reference® (variabel) 10-100 μl, 100-1000 μl
Einkanal Pipette Reference® (fix) 25 μl, 50 μl, 200 μl
Eppendorf Reaktionsgefäße 3810 (1,5ml)
LABiTec GmbH, Ahrensburg
Micro cuvettes + Mixer micro (1x4mm)
Sarstedt Aktiengesellschaft & Co., Nürnbrecht
1,3 ml-Mikroprobengefäße mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (1,6 mg/ml)
1,3 ml-Mikroprobengefäße mit Tri-Natrium-Citrat-Lösung (0,13 ml Citratlösung)
Röhre 10 ml, 95 x 16,8 mm, PS
S-Monovette® 3,8 ml 9 NC (PFA)
Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn
DADE® PFA Collagen/EPI Test Cartridge
DADE® PFA Collagen/ADP Test Cartridge
Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien
Terumo® sterile Kanüle 0,9 x 40 mm (20G x 1 ½ “) (gelb)
Verum Diagnostica GmbH, München
Multiplate® Messzellen
2. Studiendesign
Im ersten Teil der Dissertation wurden Messungen von 134 Proben von 117 Hunden
mit unterschiedlichen Erkrankungen und 83 klinisch gesunden Hunden mit dem Multiplate®
Aggregometer durchgeführt. Dabei kamen 3 verschiedene Agonisten in ihren optimalen
Konzentrationen zum Einsatz (s.u.) und die Parameter “area under the curve“ (AUC) und
“maximale Aggregation” wurden nach Testzeiten von 6 min, 8 min, 10 min und 12 min
III Material, Tiere und Methoden
31
berechnet. Basierend auf den gesunden Hunden wurden Referenzwerte für die jeweiligen
Messzeiten und Agonisten erstellt und die Messergebnisse der erkrankten Hunde in Relation
dazu in erniedrigt, normal und erhöht eingeteilt. Die Verteilung innerhalb dieser Kategorien
wurde zu den unterschiedlichen Messzeiten verglichen. Zusätzlich wurden 8 Proben mit
definierter Aggregationsschwäche von 4 klinisch gesunden Hunden, die mit dem
Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel behandelt wurden, untersucht. Die Hunde
erhielten Clopidogrel in einer Dosierung von 2–4 mg/kg/d per os an 3 aufeinanderfolgenden
Tagen und die Blutproben wurden an Tag 3 und 4 entnommen. Da kein Effekt auf eine
Kollagen-induzierte Aggregation zu erwarten war, wurden nur die Agonisten ADP und AS
verwendet. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte wie bereits beschrieben.
Im zweiten Teil der Dissertation erfolgte die Untersuchung der Thrombozytenfunktion
25 entzündlich erkrankter Hunde und einer Kontrollgruppe (n=27–69) mittels kapillärer
Blutungszeit, automatischer Plättchenfunktionsanalyse mit dem
Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100, turbidimetrischer
Thrombozytenaggregationsmessung nach Born, Vollblutimpedanzaggregometrie mit dem
Multiplate® Aggregometer, Thrombozytenzahl und Hämatokrit. Die Messergebnisse der
erkrankten Hunde wurden mit denen der Kontrollgruppe verglichen. Die erkrankten Hunde
wurden außerdem in zwei Gruppen eingeteilt: SIRS (n=15) und NonSIRS (n=10), basierend
auf den Kriterien des systemischen inflammatorischen Response-Syndroms. Demnach
mussten mindestens zwei der folgenden Befunde gegeben sein, um eine Zuordnung zur SIRS-
Gruppe vorzunehmen: Herzfrequenz > 120/min, Atemfrequenz > 20/min, Körpertemperatur
< 38°C oder > 39°C, Leukozytenzahl > 18.000 oder < 5.000 (modifiziert nach HAUPTMAN
et al., 1997). Die zwei Gruppen wurden miteinander verglichen.
3. Tiere
Die 117 erkrankten Hunde im methodischen ersten Teil der Arbeit waren Patienten der
Kleintierklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Sie umfassten 67 Patienten mit
Neoplasien (22 maligne Lymphome, 10 Leukämien, 15 Karzinome (inkl. 4
Mammakarzinome), 7 maligne Histiozytosen, 3 Hämangiosarkome, 2 multiple Myelome und
8 Hunde mit jeweils 1 anderen Neoplasie), 14 Hunde mit nicht-neoplastischen Hepatopathien
(7 portosystemische Shunts, 5 degenerative Hepatopathien und 2 andere), 18 mit lokalen oder
III Material, Tiere und Methoden
32
systemischen Infektionserkrankungen (4 mit Leptospirose, 2 mit Leishmaniose, 6 Abszesse, 2
mit Pyothorax, 2 mit Bronchopneumonie, 1 Pyometra, 1 Sepsis), 3 mit immunhämolytischer
Anämie, 2 mit Hämophilie A, 2 mit von Willebrand Krankheit, 3 Niereninsuffizienzen, 2 mit
Prostatazysten und 6 mit anderen Erkrankungen. Von 9 Tieren wurde mehr als eine Blutprobe
entnommen (bis zu 4).
Eine Vorbehandlung mit gerinnungsbeeinflussenden Medikamenten und/oder das
Vorliegen anderer Primärerkrankungen führten zum Ausschluss der Tiere. Zur Erstellung der
Referenzwerte wurden 83 klinisch gesunde Hunde unterschiedlichen Geschlechts, Rasse und
Alters herangezogen. Die Tiere wurden von Privathaltern zur Verfügung gestellt. Bei den mit
Clopidogrel behandelten Hunden handelte es sich um klinisch gesunde Beagle aus dem Besitz
der Kleintierklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Die 25 unter einer entzündlichen Erkrankung leidenden Hunde im zweiten Teil der
Arbeit setzten sich aus 15 Hündinnen (davon 3 kastriert) und 10 Rüden (davon 1 kastriert)
zusammen, das Alter betrug 9 Monate bis 12 Jahre, mit einem Median von 5 Jahren und 10
Monaten. Folgende Rassen waren vertreten: 4 Mischlinge, 2 Deutsche Schäferhunde, 2
Beagle, 2 Golden Retriever und jeweils 1 Airedale Terrier, Bracke, Kleiner Münsterländer,
Border Collie, Gordon Setter, Briard, Entlebucher Sennenhund, American Staffordshire
Terrier, Alano, Rhodesian Ridgeback, Hovawart, Bordeauxdogge, Labrador, Norfolk Terrier,
Dobermann und American Cocker Spaniel. Die Erkrankungen setzten sich wie folgt
zusammen: Abszess (n=6), Leptospirose (n=3), Leishmaniose (n=3), Prostatitis (n=3),
Pyometra (n=3), Bronchopneumonie (n=3), Pankreatitis (n=2), Sepsis (n=1) und Peritonitis
(n=1). Auch diese Tiere erhielten keine Vorbehandlung mit Medikamenten, die die primäre
Blutgerinnung beeinflussen und wiesen keine weitere Grunderkrankung auf.
Bei der kapillären Blutungszeit dienten 47, beim PFA-100 41, bei der
turbidimetrischen Methode 27, bei der Impedanzaggregometrie 65 und bei der Plättchenzahl
und dem Hämatokrit 69 klinisch gesunde Hunde der Erstellung von Referenzwerten. Auch
diese Tiere stammten aus privater Haltung.
Der Tierversuch erfolgte gemäß den Bestimmungen des Deutschen
Tierschutzgesetzes. Eine Genehmigung der Versuche erfolgte durch den offiziellen
Tierschutzbeauftragten der Tierärztlichen Hochschule und die Ethikkommission beim
III Material, Tiere und Methoden
33
Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
(Referenznummer 07A 514).
4. Blutentnahme
Die Blutproben wurden durch Punktion der zuvor mit einem alkoholischen
Desinfektionsmittel desinfizierten Vena saphena medialis, Vena cephalica antebrachii oder
Vena jugularis externa mittels einer sterilen Einmalkanüle (1,2 x 40 mm) entnommen. Um
eine frühzeitige Aktivierung der Thrombozyten zu verhindern, wurde lediglich leichter Druck
zur Stauung der Vene angewendet. Für die jeweiligen Messungen kamen unterschiedliche
Blutprobengefäße zum Einsatz: a) mit gepufferter Citratlösung (Tri-Natriumcitrat /
Citronensäure-Puffer-Lösung 0,129 mol/L pH 5,5) beschickte Probengefäße
(Fassungsvermögen 3,8 mL) für die Analyse mittels PFA-100, b) Probengefäße mit einem
Volumen von 10 mL, die 1 mL Citratlösung enthielten und zur Herstellung des PRP für die
Methode nach Born dienten, c) 4,5 mL fassende, mit dem Antikoagulanz Hirudin beschichtete
Probengefäße zur Messung mit dem Multiplate® Analyzer und d) mit EDTA beschickte 1,3
mL Probengefäße zur Anfertigung eines Blutbildes. Mit Ausnahme des letztgenannten
Probengefäßes wurden alle bis zum markierten, maximalen Fassungsvermögen mit Blut
gefüllt. Unverzüglich nach der Entnahme wurden Blut und Antikoagulanz durch behutsames
Schwenken miteinander vermischt.
5. Probenbehandlung
Die Proben zur Funktionsanalyse der Thrombozyten wurden frühestens 30 min und
spätestens 3 Stunden nach Entnahme untersucht, so wie es für humanes Blut empfohlen wird.
Während dieser Zeit wurde das Blut bei Raumtemperatur gelagert und unmittelbar vor den
jeweiligen Messungen vorsichtig geschwenkt.
Um das für die turbidimetrische Thrombozytenaggregationsmessung benötigte PRP
herzustellen, wurde das Vollblut bei 250 x g für 15 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die
Plättchenzahl des separierten Überstandes wurde mittels automatischem Blutzellmessgerät
ermittelt und, falls nötig, auf 150 x 10³/µL durch Hinzufügen von plättchenfreiem Plasma
(PFP) verdünnt. Die Herstellung des PFPs erfolgte durch weitere Zentrifugation.
III Material, Tiere und Methoden
34
6. Versuchsdurchführung
6.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit
Zur Messung der kapillären Blutungszeit kam die Methode nach NOLTE et al. (1997)
zum Einsatz. Im Gegensatz zu der häufig angewendeten Schleimhaut-Blutungszeit müssen
die Tiere nicht narkotisiert werden. Die Hunde wurden in Seitenlage gebracht und die
Außenseite der Vorderzehe wurde rasiert. Zur Gewährleistung von standardisierten
Bedingungen wurde eine durchblutungsfördernde Salbe (Finalgon® Crème, Boehringer
Ingelheim) auf den rasierten Bereich aufgetragen und nach 1 Minute wieder entfernt. Im
Anschluss sorgte eine pädiatrische Blutdruckmanschette um das Vorderbein 1 Minute vor
Beginn und während der Messung für einen konstanten Druck von 70 mmHg. Mit einer
sterilen, halbautomatischen Blutlanzette (Softclix II®, Roche Diagnostics) wurden zwei
Stiche oberhalb des Ballenhorns gesetzt und die austretenden Blutstropfen alle 15 Sekunden
bis zum Stillstand der Blutung mit einem Tupfer vorsichtig von der Seite aufgesaugt. Die
durchschnittliche Blutungszeit wurde durch Berechnung des Mittelwerts beider Messungen
ermittelt.
6.2. Plättchenfunktionsanalysegerät (PFA-100)
Das Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100 (Siemens Healthcare Diagnostics) stellt
eine in-vitro Methode zur Messung der Thrombozytenfunktion im Vollblut dar und wurde in
der Vergangenheit auch für Hundeblut optimiert (KEIDEL 2001). Das System besteht aus
einem Mikroprozessor-gesteuerten Gerät und Einmaltestzellen, die ein verletztes Blutgefäß
simulieren (KUNDU et al. 1995). Vollblut wird in das Probenreservoir der zuvor in das Gerät
eingesetzten Testzelle pipettiert und unter einem konstanten Vakuum von 40 mmHg durch
eine Kapillare gesogen. Diese leitet das aspirierte Blut zu einer je nach Messzelltyp
unterschiedlich beschichteten Membran, die eine zentrale Öffnung aufweist, an der sich die
Plättchen anlagern und einen Thrombus bilden. Die Zeit bis zum vollständigen Verschluss
dieser Öffnung wird als „Verschlusszeit“ (in s; maximale Messzeit: 300 s) und der Verbrauch
an Blut als „Gesamtvolumen“ (in µL) angegeben. Die Messungen wurden nach den
Empfehlungen des Herstellers durchgeführt, wobei nur ein Testkanal verwendet wurde, d.h.
III Material, Tiere und Methoden
35
es fand keine Parallelmessung statt. Es kamen zwei verschiedene Agonistenkombinationen
zum Einsatz: Kollagen/ADP-Messzellen und Kollagen/Epinephrin-Messzellen.
6.3. Turbidimetrische Thrombozytenaggregationsmessung
Die turbidimetrische Thrombozytenaggregationsmessung nach BORN (1962) galt
lange Zeit als der „Goldstandard“ zur Feststellung von Plättchenfunktionsstörungen
(DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Das Messprinzip basiert auf einer Änderung der
optischen Dichte des PRP nach Zugabe eines aggregationsinduzierenden Agonisten aufgrund
des Ausfallens der aggregierenden Thrombozyten. In dieser Studie wurde ein Aggregometer
mit 4 Kanälen und einer computerbasierten Kurvenauswertung genutzt (APACT 4, Rolf
Greiner Biochemica). Jeder Kanal wurde vor jeder Messung kalibriert, indem zuerst eine
Küvette mit 200 µL PFP und 20 µL NaCl gemessen und als Referenz für eine Aggregation
von 100% festgelegt wurde und anschließend eine Küvette mit 200 µL PRP und 20 µL NaCl
eine Aggregation von 0% markierte. In den darauf folgenden Messungen kamen folgende
Agonisten in den angeführten Endkonzentrationen zum Einsatz: ADP in den
Endkonzentrationen 10 µmol/L, 20 µmol/L und 40 µmol/L und Kollagen in den
Endkonzentrationen 10 µg/mL, 20 µg/mL und 40 µg/mL. Im Anschluss an die Kalibrierung
wurden 20 µL des Agonisten in 200 µL PRP pipettiert und die Messung im Moment der
Zugabe gestartet. Während der Messung wurde das Probengemisch mittels Magnetrührer
vermengt. Die Messungen wurden über 12 Minuten in Form einer Kurve aufgezeichnet und
die maximale Aggregation automatisch berechnet.
6.4. Impedanzaggregometrie
Das Multiplate® Aggregometer ist eine Weiterentwicklung der erstmals von Cardinal
und Flower beschriebenen elektrischen Vollblutaggregometrie (CALATZIS 2007). Das Gerät
besitzt 5 Kanäle, die mit Einwegmesszellen bestückt werden. Jede Messzelle beinhaltet zwei
unabhängige Sensoren, die jeweils aus zwei silberbeschichteten Kupferdrähten mit einer
Länge von 3,2 mm bestehen. Eine Messzelle besitzt einen Buchsenbereich, der die Sensoren
mit dem Instrument verbindet, einen Pipettiereinlass, ein Probenreservoir, in das die
Sensordrähte hineinragen und einen PTFE-beschichteten Magnetrührstab. Die Messungen
wurden wie vom Herstellen empfohlen durchgeführt. Zunächst wurden 300 µL einer auf 37°C
III Material, Tiere und Methoden
36
erwärmten NaCl-Lösung und 300 µL der mit Hirudin antikoagulierten Blutprobe in das
Probenreservoir der Messzelle pipettiert. Nach einer Inkubationszeit von 3 Minuten bei 37°C
wurden 20 µL des jeweiligen Agonisten hinzugefügt und die Messung gestartet. Die Messzeit
von in der Humanmedizin üblichen 6 Minuten wurde auf 12 Minuten erhöht, um den
Aggregationskurven das Erreichen eines Plateaus zu ermöglichen (KALBANTNER et al.
2010). Die aggregierenden Thrombozyten heften sich an die Sensordrähte und führen zu
einem Anstieg des elektrischen Widerstandes, welcher vom Gerät erfasst und in die
willkürliche Einheit „aggregation units“ (AU) konvertiert wird. Zur Quantifizierung der
Aggregation wurde die „area under the curve“ (AUC in AU*min), die von der Steigung
(„velocity“ in AU/min) und der maximalen Aggregation abhängig ist, herangezogen
(CALATZIS 2007). Da die zwei Sensorpaare den elektrischen Widerstand unabhängig
voneinander aufzeichnen, dienen sie als interne Kontrolle. Jedes Sensorpaar erzeugt eine
Aggregationskurve. Im Falle einer Abweichung von mehr als 20% vom Mittelwert oder
einem Korrelationskoeffizient unter 0,98 wurde die Messung wiederholt.
Die Messungen im ersten, methodischen Teil der Arbeit wurden mit folgenden
Agonisten in ihren optimalen Endkonzentrationen durchgeführt: ADP in einer Konzentration
von 10 µmol/L, Kollagen in einer Konzentration von 5 µg/mL und AS in einer Konzentration
von 1 mmol/L. Im zweiten Teil der Studie wurde eine größere Bandbreite an Konzentrationen
eingesetzt: ADP in Endkonzentrationen von 5 µmol/L, 10 µmol/L und 20 µmol/L, Kollagen
in den Endkonzentrationen 3 µg/mL, 5 µg/mL und 10 µg/mL und AS in Endkonzentrationen
von 0,5 mmol/L und 1 mmol/L.
6.5. Thrombozytenzahl und Hämatokrit
Die Thrombozytenzahl und der Hämatokrit im EDTA-Vollblut und im PRP wurden
mittels automatischem Blutzellmessgerät (ADVIA 120, Siemens Healthcare Diagnostics,
Eschborn) gemessen. Das Gerät detektiert Blutplättchen und Erythrozyten mit Hilfe eines
lasergestützen Multiparameter-Hämatologiesystems. Dies beruht auf einer Doppelwinkel-
Laser-Streulicht-Messung an isovolumetrisch gekugelten Erythrozyten und Thrombozyten
oder an Zellkernen sowie auf der Messung eines Streulichtsignals. Der Hämatokrit wird dabei
nach folgender Formel berechnet: Hämatokrit [%] = MCV [fL] x Erythrozytenzahl [/pL] / 10.
III Material, Tiere und Methoden
37
7. Datenanalyse
Im methodischen Teil der Arbeit wurden die Aggregationskurven der
Impedanzaggregometrie vom Multiplate® Analyser auf einen Computer mit der
Tabellenkalkulationssoftware Microsoft Excel™ exportiert. Die exportierten Tabellen geben
die Aggregation [AU] in 0,57 sec Intervallen wieder, sodass die Umrechnung in die Einheit
„area under the curve“ [AU*min] nötig war. Dies erfolgte gemäß der Herstellerempfehlung
durch Addition der einzelnen Aggregationswerte über die Zeit (6, 8, 10 und 12 min) und
Division der Summe durch 60. Außerdem wurde durch Bestimmung des höchsten
Aggregationswerts im Messzeitraum die maximale Aggregation ermittelt.
8. Statistische Auswertungen
Die vergleichende Statistik wurde mit dem Programm SPSS 16.0 durchgeführt. Initial
erfolgte die Überprüfung sämtlicher Stichproben mittels Kolmogorov-Smirnov-Test auf
Normalverteilung. Zur Ermittlung der Referenzwerte wurden die 2,5%- und 97,5%- bzw. 5%-
und 95%-Quantile berechnet. Im methodischen ersten Teil der Arbeit wurde für jeden
Agonisten und die Parameter AUC und maximale Aggregation Mehrfeldertafeln angelegt,
die die Anzahl der Messergebnisse unterhalb des, im und oberhalb des Referenzbereichs zu
den verschiedenen Messzeiten enthielten. Sie wurden mit Hilfe eines Chi-Quadrat-Tests
ausgewertet. Des Weiteren dienten ANOVA mit Messwiederholungen und gepaarte t-Tests
dem Vergleich der Referenzwerte zu den verschiedenen Messzeiten. Die mit Clopidogrel
behandelten Hunde wurden zu den verschiedenen Zeitpunkten mittels ungepaartem t-Test mit
der Kontrollgruppe verglichen.
Im zweiten Teil der Studie wurden die Mittelwerte der Kontrollgruppe und der
erkrankten Tiere sowie der Tiere mit und ohne SIRS mittels ungepaarten t-Tests verglichen.
Zum Gruppenvergleich der Daten des PFA-100 wurde der Mann-Whitney-Test herangezogen,
da aufgrund der zensierten Werte für diese Messgröße keine Normalverteilung gegeben war.
Wurde bei der Messung die maximale Messzeit von 300 s erreicht, so wurde der Wert zur
statistischen Auswertung durch den Wert 301s ersetzt. Als signifikant wurden jeweils
Differenzen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von < 5% (p < 0,05) bezeichnet.
IV Manuskript I
38
Influence of test time on results of the
Multiplate® impedance aggregometer in dogs
Running title: Optimal test time of the Multiplate® analyser
Monia Abid, Kerstin Kalbantner, Reinhard Mischke1
IV Manuskript I
From the Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hanover
1Corresponding Author: Reinhard Mischke, Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hanover,
Bünteweg 9, D-30559 Hannover, Germany. [email protected]
(Tel: +49 511 9536200; fax: +49 511 6204)
IV Manuskript I
39
Abstract. The Multiplate® analyser is a relatively new impedance aggregometer designed for
human medicine, but was recently evaluated for canine blood. The aim of this study was to
determine the influence of test time on reference values and the validity of measurement
results in canine blood. Based on blood samples of 83 healthy dogs, reference values for
different test times (6, 8, 10 and 12 min) were established for maximum aggregation and area
under the curve (AUC) values for ADP-, collagen-, and arachidonic acid-induced aggregation.
The results of 134 samples of 117 dogs with various diseases and 8 samples with reduced
platelet function owing to treatment with the platelet aggregation inhibitor clopidogrel were
calculated at the different test times and classified as decreased, normal or increased.
Maximum aggregation and AUC values increased significantly with increasing test time. Chi-
square test did not show significant differences between the various test times with regard to
the number of increased and decreased measurement results for any agonists. All samples of
dogs treated with clopidogrel and measured with the agonist ADP revealed decreased AUC
values at any time point. The results of our study indicate that test time significantly
influences absolute maximum aggregation and AUC values, but has limited influence on
sensitivity of measurement results of canine blood using the investigated instrument.
Key words: Whole blood aggregometry; ADP; collagen; arachidonic acid; reference values;
sensitivity; clopidogrel
IV Manuskript I
40
Introduction
The measurement of platelet function is an important part of haemostasis diagnostics.
Several laboratory methods have been developed through the last decades, one of them is the
impedance aggregometry. This method measures the increase in electrical resistance in whole
blood resulting from platelet accumulation between test electrodes.5 Advantages of using
whole blood aggregometry in comparison to the turbidimetry on platelet-rich plasma (PRP)
are the lacking necessity to prepare PRP. Therefore, the method is less time consuming and
no artificial changes of platelet volume composition can occur. In addition, the presence of
other blood cells and of a surface may better imitate physiologic conditions.5
One of the newer devices which is based on this principle is the Multiplate® analyser.
As primarily designed for human blood samples, an adjustment of several parameters was
made to allow measurements in canine plasma.7 A parameter not elaborated in detail so far is
the test time. The manufacturer recommends a test time of 6 minutes for human blood in
order to reduce time exposure. In contrast, a recording time of 12 minutes was used for canine
blood in the previous study, allowing the curves to almost plateau.7
The aim of this study was to determine the influence of the test time on reference
values and on the sensitivity of measurement results of the Multiplate® analyser in canine
plasma and to prove whether a reduction of the test time can be performed without negative
influence on the validity of the assay.
IV Manuskript I
41
Materials and methods
Study design
Measurements of 83 healthy dogs and 134 samples from 117 dogs with various
diseases were performed using 3 different agonists (adenosine diphosphate [ADP], collagen,
arachidonic acid [AA]) and the test parameters “area under the curve” (AUC) and “maximal
aggregation” were calculated after a test time of 6, 8, 10 and 12 minutes. Based on the
clinically healthy dogs, reference values for each test time and agonist were calculated. The
results of the diseased dogs were classified in relation to reference values as decreased,
normal or increased and the distribution among categories between the different test times
was compared.
In addition, 8 samples with defined aggregation deficiency which were taken from 4
healthy dogs that were treated with the platelet aggregation inhibitor clopidogrel were
measured. Dogs received clopidogrela in doses of 2–4 mg/kg/d orally on three consecutive
days and blood samples were collected on the third and fourth day. Aggregation was induced
with ADP and AA and the data were analysed as described in experiment 1.
The experimental procedure was approved by the appropriate ethics committee (Lower
Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety, reference number 07A 514).
Animals
The clinically healthy dogs included animals of different gender and breeds and were
provided by private owners. The age of the dogs varied from 1 to 12 years with a median of
IV Manuskript I
42
2.5 years. The health status was defined based on clinical examination, a blood cell count and
biochemical profile. An exclusion criterion was treatment with any drug influencing platelet
function.
All 117 diseased dogs used in this study were patients of the Small Animal Clinic,
University of Veterinary Medicine Hannover. There were 67 patients with neoplasia (22
lymphomas, 10 leukaemias, 15 carcinomas (incl. 4 mammary carcinomas), 7 histiocytic
sarcomas, 3 haemangiosarcomas, 2 multiple myeloma and 8 dogs with individually different
other neoplasias, respectively), 14 dogs with non-neoplastic hepatopathies (7 portosystemic
shunts, 5 degenerative hepatopathies and 2 others), 18 with local or systemic infectious
diseases (4 leptospirosis, 2 leishmaniosis, 6 abscesses, 2 pyothorax, 2 bronchopneumonias, 1
pyometra, 1 sepsis), 3 with immunohaemolytic anaemia, 2 with haemophilia A, 2 with von
Willebrand diseases, 3 renal insufficiencies, 2 with prostatic cysts, and 6 with miscellaneous
disorders. Of 9 dogs, more than one blood samples (up to four) were taken.
The 4 dogs that were treated with clopidogrel in experiment 2 were clinically healthy
Beagles owned by the Small Animal Clinic.
Sample collection
Blood samples were taken from the saphenous, cephalic or jugular vein using sterile
disposable needles (1.2 x 40 mm). Only gentle pressure was used to raise the vein to minimise
stasis potentially activating the platelets. Blood for impedance aggregometry was collected
into 4.5 mL plastic tubes covered with hirudinb, which has less influence on platelets than
citrate. Blood and anticoagulant were immediately thoroughly mixed by careful swaying.
IV Manuskript I
43
The samples were tested between 30 minutes and 3 hours after collection, as
recommended for human blood. During this period of time, the blood was stored at room
temperature and swayed carefully just before starting the measurement.
Test procedure and data analysis
The Multiplate® analyserc is an advancement of the whole blood aggregation by
Cardinal and Flower4.2 It has five channels for parallel testing which are assembled with
single-use test cells.11
The test was performed as recommended by the manufacturer. After pipetting 300 µl
of isotonic sodium chloride solution (prewarmed to 37 °C) into the test cell, 300 µl of hirudin-
anticoagulated blood was added. At the end of a three minute incubation time at 37 °C 20 µl
of agonist solution was added and the measurement started. The increase of electrical
resistance caused by platelets attaching on the surface of the sensors was recorded over 12
minutes and converted into arbitrary “aggregation units” (AU). Aggregation was quantified
by the area under the curve (AUC in AU*min) which depends on the velocity (AU/min) of
aggregation and maximal aggregation.2 Optimal agonist concentrations which were approved
in a previous study7 were used: 10 µmol/L ADPd, 5 µg/mL collagene, and 1 mmol/L AAf.
Aggregation curves were exported from the Multiplate® analyser to a computer on
which the spreadsheet software Microsoft Excel™ was installed. The resulting Excel file
provided aggregation units in intervals of 0.57 seconds. AUC values were calculated for the
different test times (6, 8, 10, 12 minutes) as described by the manufacturer by summarizing
the single aggregation values over time and dividing the sum by 60, following an instruction
IV Manuskript I
44
provided by the manufacturer. In addition, maximum aggregation values were generated from
the Excel files, i.e. the maximal values within a defined test time were chosen.
Statistical analysis
Data were tested for normal distribution using Kolmogorov-Smirnov test. All
examined parameters showed normal distribution. Results were expressed as arithmetic mean
and standard deviation. In addition, the following reference values were calculated based on
results of healthy dogs: 2.5%, 10%, 25%, 50% (median), 75%, 90%, and 97.5% quantiles.
Comparison of the results of normal dogs at different test times were performed with one-way
ANOVA (repeated measurements) and t-test for paired observations considering Bonferroni`s
correction. Comparison of results of normal dogs and clopidogrel-treated dogs at different test
times were performed with student`s t-test. Contingency tables for each agonist were
compiled including the numbers of increased, normal and decreased results at the 4 test times.
Evaluation of the contingency table in both experiments was performed with Chi square test.
P < 0.05 was considered significant. Statistical analysis was performed using SPSS 17.0
German.g
Results
Reference values that were calculated for the different agonists at the different test
times are presented in Tables 1 and 2. ANOVA revealed significant differences between
different test times for both AUC values and maximum aggregation values, independent
which agonist was used (P < 0.001). Post hoc analyses revealed significant differences
IV Manuskript I
45
between all test times for both parameters and all agonists, and thus even a significant
increase in maximum aggregation between test times 10 and 12 minutes. Chi square test did
not show significant differences between the different test times with regard to the number of
samples with AUC or maximal aggregation below, within and above the reference range for
any of the agonist (Figs. 1,2).
ADP- and AA-induced AUC and maximum aggregation values of clopidogrel treated
dogs were lower when compared to untreated healthy dogs at all test times (P < 0.001 (t test);
Figs. 3–6). Irrespectively of the test time, all AUC values of ADP-induced aggregation from
dogs treated with clopidogrel were below the reference range (Fig. 3). All maximal
aggregation values performed with the agonist ADP were below the reference range using a
test time of 6 or 8 minutes, respectively, but 1/8 value was within the lower limit when the
test time was prolonged to 10 and 12 minutes (Fig. 4). After induction with AA, reduced
values were also found for the majority of the AUC values (7/8 [6 minutes] or 6/8 [8, 10 and
12 minutes]) and part of the maximal aggregation values (5/8 [6 minutes] or 4/8 [8, 10 and 12
minutes]), without significant influence of the test time (P > 0.05, Chi square test) (Figs. 5, 6).
Discussion
The results of the present study indicate that test time significantly influences test
results of the Multiplate® analyser such as maximal aggregation. Therefore, reference values
must be established for the used test time. If test time-adjusted reference values are used, the
test time does not seem to have a significant influence on the sensitivity and specificity of
IV Manuskript I
46
measurements using the Multiplate® analyser. Therefore, a short test time of 6 minutes seems
appropriate and may even have a slightly superior sensitivity.
A test time of 6 min is recommended by the manufacturer for human blood samples
and in most of the human studies using the Multiplate® analyser this time setting has been
chosen.2,3,8,12 Deviating from this, Tòth et al.11 chose a test time of 5 minutes in their study. In
the available human and veterinary literature no studies could be found, which systematically
compared different test times with respect to the diagnostic accuracy. The results of the
present study seem therefore also of interest for the human medicine.
The reason for using a test time of 12 minutes for canine blood in the previous study
on canine sample material was to allow the aggregation curves to almost plateau.7 This may,
for example, allow to report true “maximum aggregation values”. The main reason to use a
standard test time of 6 minutes, which usually does not allow to finish aggregation reaction,
seems to be the reduced analysis time.
The main limitation of our study is the lack of a reference method in the first
experiment. Therefore, it is undefined whether the results below or above the reference range
actually represent true or false positive results. Therefore, we performed a second experiment
based on sample material from clopidogrel-treated dogs. Clopidogrel is a potent, non-
competitive inhibitor of the platelet ADP membrane receptor P2Y128 which irreversibly
inhibits the binding of ADP to its platelet membrane receptors. A significantly reduced ADP-
induced platelet aggregation was already described in dogs receiving clopidogrel at the
dosage which we administrated to the dogs in the present study.1 Therefore, it can be assumed
that all of the blood samples taken from treated dogs and measured with the agonist ADP
were below the reference values.
IV Manuskript I
47
The reduction of AA-induced aggregation in clopidogrel-treated dogs may be
surprising, but an influence of clopidogrel on arachidonic acid-induced aggregation was also
detected in human platelets.6,9 Although the inhibition is specific and does not significantly
affect cyclo-oxygenase (COX) or AA metabolism, clopidogrel can indirectly inhibit platelet
aggregation induced by agonists other than ADP by blocking the amplification of platelet
activation by released ADP. ADP binding is necessary for activation of the GPIIb/IIIa
receptor, which is necessary for linking different platelets together by fibrinogen to form the
platelet aggregate.10
In conclusion, the results of our study indicate that the influence of test time on the
validity of measurement results in canine whole blood aggregometry is minor, if
interpretation is performed based on test time-adjusted reference values. A reduction of test
time of canine plasma to 6 minutes – which corresponds to the recommendation in humans –
is possible and associated with at least the same validity as longer test times.
Sources and manufacturers
a. Clopidogrel AbZ 75 mg, AbZ-Pharma GmbH, Blaubeuren, Germany.
b. Thrombin Inhibitor blood collection tube 4.5 ml suited for Sarstedt® system, Dynabyte®
Informationssysteme GmbH; Munich, Germany
c Dynabyte Informationssysteme GmbH, Munich, Germany.
d. ADPtest, Dynabyte Informationssysteme GmbH, Munich, Germany.
e. COLtest, Dynabyte Informationssysteme GmbH, Munich, Germany.
f. ASPItest, Dynabyte Informationssysteme GmbH, Munich, Germany.
g. SPSS Inc., Chicago, USA.
IV Manuskript I
48
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IV Manuskript I
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cardiovascular patients using two whole blood platelet function assays. PFA-100 and
Multiplate]. Haemostaseologie 27:155–160.
IV Manuskript I
50
Table 1
Reference values of area under the curve (AUC; AU*min) values measured with the
Multiplate® analyser in 83 healthy dogs at different test times using different agonists.
agonist test time (Min) mean standard
deviation Quantiles
2.5 10 25 50 75 90 97.5
ADP 10 µmol/l
6 965 ± 228 498 681 797 972 1135 1309 1384
8 1479 ± 344 831 1035 1259 1485 1718 1988 2112
10 2022 ± 466 1241 1415 1648 2055 2346 2696 2931
12 2352 ± 577 1167 1548 1907 2393 2741 3139 3443
Collagen 5 µg/ml
6 1060 ± 174 662 845 937 1084 1169 1298 1378
8 1706 ± 265 1050 1379 1514 1739 1861 2060 2219
10 2402 ± 367 1490 1945 2113 2425 2640 2878 3134
12 2810 ± 436 1751 2275 2459 2836 3082 3332 3691
Arachidonic acid
1 mmol/l
6 879 ± 282 417 500 633 898 1091 1288 1450
8 1346 ± 422 630 770 978 1355 1681 1937 2192
10 1837 ± 572 857 1032 1348 1819 2257 2602 3024
12 2137 ± 687 997 1200 1557 2089 2580 3054 3630
IV Manuskript I
51
Table 2
Reference values of maximal aggregation (AU) values measured with the Multiplate®
analyser in 83 healthy dogs at different test times using different agonists.
agonist test time (Min) mean standard
deviation Quantiles
2.5 10 25 50 75 90 97.5
ADP 10 µmol/l
6 139 ± 32.0 78.6 96.7 115 140 160 183 200
8 151 ± 34.7 93.0 106 125 153 176 197 220
10 157 ± 35.5 96.3 111 128 159 186 203 226
12 160 ± 36.0 97.0 112 130 163 188 208 232
Collagen 5 µg/ml
6 172 ± 26.5 108 139 153 173 190 205 224
8 191 ± 30.2 121 152 169 193 213 226 253
10 201 ± 32.7 128 161 177 203 222 238 266
12 205 ± 33.8 129 165 179 205 226 243 271
Arachidonic acid
1 mmol/l
6 127 ± 38.9 52.7 73.4 96.8 126 155 177 208
8 137 ± 44.5 56.7 74.9 101 137 167 196 228
10 143 ± 44.6 61.1 85.1 108 141 178 203 237
12 146 ± 46.6 61.7 86.1 110 143 178 204 258
IV Manuskript I
52
a)
b)
c)
Fig. 1
Distribution of increased, normal and decreased area under the curve (AUC) results measured
with the Multiplate® analyser in 134 samples from 117 dogs with various diseases at 4
different test times. Measurements were performed with the agonists ADP (a), collagen (b)
and arachidonic acid (AA) (c).
IV Manuskript I
53
a)
b)
c)
Fig. 2
Distribution of increased, normal and decreased maximal aggregation results measured with
the Multiplate® analyser in 134 samples from 117 dogs with various diseases at 4 different
test times. Measurements were performed with the agonists ADP (a), collagen (b) and
arachidonic acid (AA) (c).
IV Manuskript I
54
0
500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
6 8 10 12Test time (minutes)
AUC
(AU
xmin
)
Fig. 3
Influence of test time on area under the curve (AUC) values (individual values, mean ±
standard deviation) of ADP-induced impedance aggregometry using the Multiplate® analyser
in 83 samples of healthy dogs and 8 samples from clopidogrel-treated dogs (reference values
are highlighted in grey)
IV Manuskript I
55
6 8 10 12Test time (minutes)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
Max
imal
agg
rega
tion
(AU
)
Fig. 4
Influence of test time on maximum aggregation values (individual values, mean ± standard
deviation) of ADP-induced impedance aggregometry using the Multiplate® analyser in 83
samples of healthy dogs and 8 samples from clopidogrel-treated dogs (reference values are
highlighted in grey)
IV Manuskript I
56
0
500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
6 8 10 12Test time (minutes)
AUC
(AU
xmin
)
Fig. 5
Influence of test time on AUC values (individual values, mean ± standard deviation) of
arachidonic acid-induced impedance aggregometry using the Multiplate® analyser in 83
samples of healthy dogs and 8 samples from clopidogrel-treated dogs (reference values are
highlighted in grey)
IV Manuskript I
57
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
Max
imal
agg
rega
tion
(AU
)
6 8 10 12Test time (minutes)
Fig. 6
Influence of test time on maximum aggregation values (individual values, mean ± standard
deviation) of arachidonic acid-induced impedance aggregometry using the Multiplate®
analyser in 83 samples of healthy dogs and 8 samples from clopidogrel-treated dogs
(reference values are highlighted in grey)
V Manuskript II
58
Platelet function in dogs with inflammatory diseases
M. Abid, K. Kalbantner, R. Mischke*
Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 9, D-30559
Hannover, Germany
V Manuskript II
* Corresponding author. Tel.: +49 511 9536200
E-mail adress: [email protected] (R. Mischke)
V Manuskript II
59
Abstract. The aim of this study was to examine the influence of inflammatory diseases on
primary haemostasis in dogs. Six different parameters were used for testing platelet function
in 25 dogs with bacterial or protozoal infections: capillary bleeding time, automatic platelet
function analysis (PFA 100, collagen/ adenosine diphosphate [ADP] and collagen/epinephrine
cartridges), turbidimetric platelet aggregation, impedance aggregometry using a multiple
electrode aggregometer, platelet count and haematocrit. Results of the 25 diseased dogs were
compared to the control group and additionally classified into two subgroups based on
criteria of systemic inflammatory response syndrome (SIRS) (groups “SIRS” and
“NonSIRS”) and compared among each other. The following findings were observed in dogs
with inflammatory diseases when compared to the control group: a significantly prolonged
closure time of the automatic platelet function analyser measured with both cartridges (e.g.
Col/ADP: 83 [55–301] s vs. 65 [47–99]; median [minimum–maximum]; P < 0.0001 ); a
significant decrease in maximal aggregation of the turbidimetric aggregometry induced with
adenosine diphosphate (ADP) (e.g. 40 µmol/L: 45.2 ± 26.8 % vs. 67.3 ± 21.8; mean ± SD; P
= 0.003) and collagen; a partly (conc 5 µg/mL) significant increase of collagen-induced
impedance aggregometry and significant suppression of arachidonic acid-induced impedance
aggregometry. A higher collagen-induced impedance aggregation was the only significant
differences between subgroups “SIRS” and “NonSIRS”.
The results of the present study indicate that, although individual tests indicate
enhanced platelet aggregation, most of the in vitro tests revealed a normal or minor to
moderately reduced functionality. The reduced aggregability may partly indicate that platelets
are already activated.
Keywords: platelet function, bacterial infection, protozoal infection, platelet aggregation,
SIRS, dog
V Manuskript II
60
Introduction
Inflammatory and infectious diseases are a frequent cause of thrombocytopenia in
dogs (Grindem et al., 1991; de Laforcade et al., 2003), but can also be associated with aquired
platelet function disorders. Different studies in dogs with certain infections investigated
platelet function mainly using only one individual method that often was the turbidimetric
aggregometry (Corona et al., 2004; Brandão et al., 2006). Other methods of primary
haemostasis that were studied included the capillary bleeding time (CBT) in dogs with
leishmaniosis (Moreno et al., 1998). In addition, the platelet function analyser was tested in an
experimental canine model of endoxemia (Yilmaz et al, 2005). The majority of these studies
on experimentally induced and naturally occurring inflammatory diseases revealed a decrease
in platelet function in vitro (Jacobs et al., 1986; Harrus et al., 1996; Valladares et al., 1998).
However, individual studies showed an increase of maximal aggregation in dogs with
heartworm infection (Boudreaux et al., 1989). Studies on human patients suffering from
sepsis also revealed contradictory results for the turbidimetric aggregometry (Gawaz et al.,
1997; Yaguchi et al., 2004).
Infectious diseases can effect primary haemostasis via different pathomechanisms
including an early and systemic activation of platelets, followed by agglutination and
consumption caused by binding of circulating immunocomplexes or complexes of clotting
factor A (an adhesive matrix molecule of gram positive bacteria) with fibrinogen and
antibodies (Loughman et al., 2005). Endotoxin can directly impair platelet function by
binding on platelet membranes (Saba et al., 1984; Salden and Bas, 1994) and by modification
of platelet receptors (Nystrom et al., 1994).
V Manuskript II
61
Regardless of aetiology, every severe and/or progressed inflammatory process can
lead to a distinct systemic reaction of the body of the patient. A systemic inflammatory
response syndrome (SIRS) indicates a severe, possibly life-threatening state that is often
associated with haemostatic disorders and requires a rapid therapeutic intervention (Hopper
and Bateman, 2005).
The aim of this study was to examine the influence of inflammatory diseases caused
by bacterial and protozoal infections on platelet function in dogs using different global tests
and specific methods including a novel impedance aggregometer. The results were compared
with those of a healthy control group and, additionally, the values of patients with and without
SIRS were compared.
Materials and methods
Study design
Platelet function of 25 dogs with different inflammatory diseases and a control group
of 27–69 clinically healthy dogs were tested by following methods: capillary bleeding time,
automatic platelet function analysis using the platelet function analyser PFA-100,
turbidimetric platelet aggregation according to Born, impedance aggregometry using the
Multiplate® analyser, platelet count and haematocrit. Due to heterogeneity of inflammatory
diseases, dogs were additionally classified into two groups based on criteria of systemic
V Manuskript II
62
inflammatory response syndrome (SIRS) (group “SIRS” and “NonSIRS”) and subgroups
were compared among each other.
The experimental protocol was approved by the competent ethics committee of the
responsible national agency (Lower Saxony State Office for Consumer Protection and Food
Safety, reference number 07A 514).
Animal selection
All dogs used in this study were patients of the Small Animal Clinic, University of
Veterinary Medicine Hannover. Selection criteria were the presence of a local or systemic
inflammatory disease caused by bacterial or protozoal infections, no treatment with any drug
influencing platelets and no other primary diseases. The inflammatory diseases included
abscesses (n=6; 2 at lateral thoracic wall, 2 at cervical region, 1 at the back, 1 at the
abdominal wall), leptospirosis (n=3), leishmaniasis (n=3), prostatitis (n=3), pyometra (n=3),
bronchopneumonia (n=3), pancreatitis (n=2), peritonitis (n=1) and sepsis (n=1).
The subgroup “SIRS” (n=15) included all animals fulfilling the criteria for a systemic
inflammatory response syndrome, i.e. 2 or more of the following findings were given: heart
rate > 120/min, respiratory rate > 20/min, rectal temperature < 38°C or > 39°C, white blood
cell count > 18.000 or < 5.000 (Hauptman et al., 1997). Group “NonSIRS” (n=10) included
all other animals. Group “SIRS” included dogs with abscesses (n=4), leptospirosis (n=2),
leishmaniasis (n=1), prostatitis (n=2), pyometra (n=1), bronchopneumonia (n=3), pancreatitis
(n=1) and sepsis (n=1). Group “Non-SIRS” included dogs with abscesses (n=2), leptospirosis
V Manuskript II
63
(n=1), leishmaniasis (n=2), prostatitis (n=1), pyometra (n=2), pancreatitis (n=1) and
peritonitis (n=1).
There were 15 bitches, three of them neutered and 10 male dogs, including a neutered
one. Age ranged from nine months to twelve years, with a median of 5 years and 10 months.
Following breeds were represented: four mongrels, two German Shepherds, two Beagles, two
Golden Retrievers and one of each of the following breeds: Airedale Terrier, Bracke, Small
Munsterlander, Border Collie, Gordon Setter, Briard, Entlebucher Mountain Dog, American
Staffordshire Terrier, Alano, Rhodesian Ridgeback, Hovawart, French Mastiff, Labrador
Retriever, Norfolk Terrier, Doberman and American Cocker Spaniel.
The control group consisted of clinically healthy, private-owned dogs of different
gender, age and breed. Their number varied between the different methods (capillary
bleeding: n = 47, PFA-100: n = 41, turbidimetric method: n = 27, impedance aggregometry: n
= 65, platelet count and haematocrit = 69).
Blood sample collection
Blood samples were taken from the saphenous, cephalic or jugular vein using sterile
disposable needles (1.2 x 40 mm). Gentle pressure was used to raise the vein to minimise
stress for the platelets. Blood was collected into several plastic tubes (Sarstedt): a) 3,8 mL
tubes covered with buffered citrate solution (0.129 mol/L trisodium citrate/citric acid buffer
solution pH 5.5) used for the platelet function analyser PFA-100, b) 10 mL tubes containing 1
mL of 0.11 mol/L citrate solution (one part for nine parts of blood) for preparation of platelet
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64
rich plasma (PRP) required for the turbidimetric aggregometry, c) 4,5 mL hirudin-coated
tubes (Dynabyte Medical) for impedance aggregometry measurements by Multiplate
Analyzer and d) 1,3 mL tubes covered with EDTA for blood count. Blood and anticoagulant
were immediately thoroughly mixed by careful swaying. Platelet function analysis was
performed between 30 minutes and 3 hours after blood sample collection, as recommended
for human blood. During this period of time, blood was stored at room temperature and
swayed carefully just before starting the measurement.
For the preparation of PRP whole blood was centrifugated at 250 x g for 15 min at
room temperature. Platelet count of the separated supernatant was measured using an
automatic blood cell counter (ADVIA 120, Siemens Healthcare Diagnostics) and, if
necessary, diluted or concentrated to 150 x 10³ platelets/µL. Part of the plasma was converted
in 1.3 ml plastic tubes and centrifugated again for ten min at 16,000 x g to achieve platelet
free plasma (PFP).
Capillary bleeding time
Capillary bleeding time (CBT) was measured according to the method described by
Nolte et al. (1997). The non-anaesthetized dogs were brought in lateral position and two
punctures were set on the lateral side of a front toe close to the edge of the horny skin of the
pad using a sterile semi-automatic blood lancet (Softclix II, Roche Diagnostics). While steady
pressure was maintained, the occurring blood drops were dabbed off carefully every 15 s until
the bleeding stopped and average bleeding time was calculated from the two parallel
punctures.
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65
Platelet function analyzer (PFA-100)
The platelet function analyzer PFA-100 (Siemens Healthcare Diagnostics) aspirates
whole blood under constant vacuum (40 mmHg) through a capillary to a membrane coated
with collagen and adenosine-5’-diphosphate (CADP cartridge) or collagen and epinephrine
(CEPI cartridge). This membrane has a central aperture on which the platelets form a
thrombus. The time required to completely close this aperture is reported as ‘closure time’ (in
s; maximal testing time: 300 s) and the consumption of blood as ‘total volume’ (in µL).
Measurements were performed as recommended by the manufacturer.
Turbidimetric platelet aggregation
The turbidimetric method according to Born (1962) was measured using an
aggregometer with four channels and computer-based curve analysis (APACT 4, Rolf Greiner
Biochemica) and is based on the recording of the changes in optical density after adding
agonists to PRP with a standardized platelet count (in this study: 150 x10³/µL). Every
channel was calibrated by using two standards. The first standard (100% aggregation,
corresponding to the light transmission of PFP) was achieved by adding 20 µL isotonic NaCl
to 200 µL PFP, the second standard (0% aggregation) was prepared by adding 20 µL isotonic
NaCl to 200 µL PRP. After incubation of 200 µL PRP for 2 min at 37 °C, aggregation was
induced by adding 20 µL platelet agonist containing solutions (Dynabyte) to achieve final
concentrations of 10, 20 or 40 µmol/L adenosine-5’-diphosphate (ADP) or 10, 20, 40 µg/mL
collagen. The maximum aggregation was recorded over 12 min and calculated automatically.
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66
Impedance aggregometry
Impedance aggregometry measured with the Multiplate® analyser (Dynabyte GmbH)
was performed as recommended by the manufacturer (i.e., incubation of 300 µl isotonic
sodium chloride solution and 300 µl blood over 3 min and addition of 20 µl agonist solution)
with exception of the test time (12 min instead of 6 min). Three different aggregation
inducing agonists (Dynabyte GmbH) were used in the following final concentrations: 5, 10
and 20 µmol/L ADP, 3, 5 and 10 µg/mL collagen and 0.5 and 1 mmol/L arachidonic acid
(AA). Of the different parameters provided by the machine, the ‘area under the curve’ (AUC)
value (in aggregation units [AU]*min) was reported.
Haematocrit and platelet count
Haematocrit, whole blood and PRP platelet counts were measured automatically using
a blood cell counter (ADVIA120, Siemens Healthcare Diagnostics). The instrument detects
platelets and red blood cells using a double angle laser light scattering procedure after
isovolumetric sphering and calculates haematocrit based on red blood cell count and mean
cell volume.
Statistical analysis
Data were tested for standard normal distribution using Kolmogorov-Smirnov test.
Reference values were calculated based on 2.5% and 97.5% quantiles of the control group.
Group comparisons of parameters with normal distribution (impedance aggregometry, the
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67
turbidometric method, capillary bleeding time, haematocrit and platelet count) were
performed with unpaired Student’s t tests. Owing to the censored data delivered by the
platelet function analyzer PFA-100, normal distribution could not be tested/was not present
and Mann-Whitney U test was used for group comparison. Measurements with a result of >
300 s were set to 301 s for statistical analysis. P–values < 0.05 were considered significant.
Statistical analysis was performed using SPSS 16.0 German (SPSS Inc.).
Results
There was no significant difference between the capillary bleeding time of the dogs
with inflammatory diseases and healthy dogs (Table 1). When compared to the reference
values, more dogs (6/25) had a shorter CBT than prolonged (3/25). Dogs with shortened CBT
included 2 patients with abscesses, two with prostatitis, one with pyometra and one with
bronchopneumonia, dogs with prolonged CBT included both dogs with pancreatitis and one
with leptospirosis.
A significantly prolonged PFA-100 closure time compared to the control group
measured with both CADP and CEPI cartridges was observed in dogs with inflammatory
diseases. Total volume was only significantly increased when using the CADP test cells. In
nearly half of the dogs (12/25), results (closure time and total volume) obtained with the
collagen/ADP cartridge exceeded the reference range. The 12 dogs with prolonged closure
time (CADP cartridge) included all 3 dogs with leishmaniosis, 2/3 dogs with leptospirosis, the
two dogs with pancreatitis, the dog with sepsis and the dog with peritonitis, but only 1/6 dogs
with abscesses, 1/3 dogs with prostatitis, and 1/3 dogs with pyometra. 7/12 patients with
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prolonged closure time (CADP cartridge) had anaemia and/or thrombocytopenia. Dogs with
prolonged closure time (CADP cartridge) and normal haematocrit and platelet count included
one dog each with the following diagnoses: leptospirosis, leishmaniosis, pyometra, prostatitis,
and peritonitis.
Dogs with inflammatory diseases also showed a significantly reduced maximal
aggregation of turbidimetric platelet aggregation using different concentrations of ADP and
collagen. In addition, AUC values of AA-induced whole blood aggregation were significantly
lower in dogs with inflammatory diseases. Only whole blood aggregation induced by 5 µg/mL
collagen showed a slightly higher AUC values in dogs with inflammatory diseases. Platelet
count was not different between normal dogs and dogs with inflammatory disorders, but
haematocrit values were considerably lower.
In view of platelet function tests, the only significant difference between the
subgroups was a higher AUC value in whole blood aggregometry induced with 5 µg/ml
collagen in dogs with SIRS. Dogs with SIRS had also significantly lower platelet counts and
haematocrit values (Table 1).
Discussion
The results of our study indicate that dogs with inflammatory diseases have a
moderately impaired platelet function although individual tests (collagen-induced impedance
aggregometry) indicate hyperaggregability. The minor to moderate changes are not expressed
by changes of the capillary bleeding time that can be regarded as a global test of primary
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haemostasis and may be a consequence of the heterogeneous patients and low sensitivity of
the test. Although the method undertakes some effort to standardize blood flow in the
puncture area (Nolte et al., 1997), the result is influenced by a wide range of possible
influencing factors resulting in a high inaccuracy of the method. Factors influencing the result
include factors of the animals (blood pressure, thickness of skin, vessel-wall structure and
distribution of capillaries) as well as technical aspects (amount of circulation promoting salve,
pressure applied when performing the puncture). The animal-derived factors can vary
between different breeds and individuals (Thomas et al., 1979; Forsythe et al., 1989).
In contrast to our study, Moreno et al. (1998) found a prolonged CBT in dogs naturally
infected with leishmania. In this study, dogs naturally infected with leishmania showed a
prolonged capillary bleeding time (mean 93.0 sec) when compared to healthy control dogs
(mean 143.0 sec; p = 0.02) (Moreno et al., 1998). However, the result that dogs with
leishmaniosis with increased creatinine values (> 1.5 mg/dL) had significantly longer CBTs
when compared to patients with normal creatinine values might indicate that the prolongation
is partially due to renal failure. This can also explain the discrepancy to the present study on a
heterogenous group of inflammatory diseases, because renal failure is a common finding in
leishmaniasis but does not obligatorily occur in other inflammatory diseases.
Closure times of PFA-100 were prolonged in dogs with inflammatory diseases,
regardless of the presence of SIRS, using the CADP and CEPI cartridge. This indicates a
reduced function of platelets to form an aggregate under high shear rates and is well in
confirmation with the results of platelet aggregation (under low shear rates). In confirmation
with these results, after a shortened closure time in the initial phase of 30 minutes, prolonged
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closure times of CADP and CEPI cartridges were found in dogs suffering from
experimentally induced endotoxemia (Yilmaz et al., 2005). Whereas our two dogs with
pancreatitis had prolonged closure times, a human study on mild acute pancreatitis patients
detected shortened closure times for both cartridge types and concluded a an increased
adhesiveness and aggregation (Mimidis et al., 2004). This discrepancy can probably be
explained by a difference in the severity of the disease and possibly by a difference in the
stage of disease.
Significance of measurements using the CEPI cartridge are limited in individual
canine blood samples, because the reference range exceeds the upper measurement range of
300 s as a consequence of the limited sensitivity of canine platelets towards epinephrine
(Callan and Giger, 2001; Mischke and Keidel, 2003; Nielsen et al., 2007), that is confirmed
in the present study. Nevertheless, group comparison revealed a significant increase of the CT
measured with the CEPI cartridge in dogs with inflammatory diseases.
Interpretation of the test results of the platelet function analyser have always to be
performed with additional consideration of the platelet count and haematocrit values. Both
parameters influence significantly the test result (Callan and Giger, 2001; Mischke and
Keidel, 2003). Therefore the changes of the platelet function analyser which were found by
Yilmaz et al. (2005) following experimentally induced endotoxemia do not necessarily reflect
the damaging properties of endotoxin on platelet function, but may be mainly a consequence
of the remarkable parallel decrease of platelet count.
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71
Our dogs with inflammatory diseases had significantly lower haematocrit values (39.7
± 8.3 % vs. 47.9 ± 4.1) and the tendency towards lower platelet counts (242 ± 117 vs. 294 ±
88 x 103/µL). Nevertheless, the influence of the haematocrit in our study seems to be limited,
because only minor changes were observed between haematocrit values of 40 and 48 %
(Callan and Giger, 2001), which represent the lower reference range of haematocrit in dogs.
These values are probably associated with very similar blood flow conditions and blood cell
distribution within the vessel, these factors are regarded as pathomechanisms for the
alterations of the results of the platelet function analyser in anaemic individuals (Dietrich et
al., 1995; Mischke and Keidel, 2003). The influence of platelet count seems also limited,
because only 6/25 dogs with inflammation had platelet counts below the reference range,
whereas changes of the platelet count within the reference range do not significantly influence
the test result (Mischke and Keidel, 2003).
In addition, increase of von Willebrand factor (vWF) concentration, which was not
measured in our patients but was probably increased in most of our dogs due to its role as an
acute phase reactant, adversely affects (i.e. shortens) closure time of the platelet function
analyser and, thereby, can mask impaired platelet function. Homoncik et al. (2000) detected
an 85 % increase of the vWF level after endotoxin injection to healthy humans which was
associated with a 38 and 47 % decrease of the CT measured by the CADP and CEPI cartridge,
respectively.
Decreased measurement signals of turbidimetric platelet aggregometry in dogs with
inflammatory diseases using agonists ADP and collagen are well in confirmation with the
results of several studies examining the influence of certain infections including leishmaniosis
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72
and ehrlichiosis on platelet aggregation (Harrus et al., 1996; Corona et al., 2004; Brandão et
al., 2006). Similarly, dogs with experimentally induced acute pancreatitis showed a reduced
platelet aggregation using the turbidimetric method (Jacobs et al., 1986; Lukaszyk et al.,
1989). An increased platelet aggregation was only observed in the early phase after induction
of pancreatitis (Lukaszyk et al., 1989). Studies on human patients with sepsis mainly revealed
concordant results, i.e. decreased platelet aggregability (Saba et al., 1984; Yaguchi et al.,
2004; Woth et al., 2011). Yaguchi et al. (2004), for example, observed a decrease in platelet
aggregation in all septic patients (n=47) compared to controls, regardless of the agonist used.
Variable causes for platelet functional disorders in dogs with infectious diseases in
general and for decreased platelet aggregation in particular include damage of platelet
membrane receptors by infectious agents such as Leishmania, which also causes an immune-
mediated process (Corona et al., 2004). Anti-platelet antibodies could be identified in dogs
with infectious diseases such as leishmaniosis and ehrlichiosis and are supposed to interact
with platelet membrane glycoproteins (Harrus et al., 1996; Terrazzano et al., 2005; Dircks et
al. 2009).
Measurements of P-selectin expression indicate increased expression under
inflammatory conditions (Yeo et al., 1993; Moritz et al., 2005). P-selectin is a component of
α-granules and is expressed on the platelet surface after granule secretion (Mickelson, 1996).
This activation may lead to a refractory state regarding in vitro induction of platelet
aggregation by agonists (Moritz et al., 2005). These platelets appear to be hypofunctional in
in vitro aggregation assays and may contribute to the decreased signals of agonist-induced
platelet aggregation. Other authors also mention “exhausted platelets”, which represent
V Manuskript II
73
platelets after reversible interaction with vascular or intravascular substances in or near the
pancreas, or interaction of platelets with some circulating inhibit remain in the circulation
(O’Brien, 1978; Jacobs et al., 1986).
Endotoxin binding to platelets can impair platelet function via different
pathomechanisms including reduced mean adrenoreceptor density on the platelet membrane
causing reduced platelet responsiveness by epinephrine, reduced platelet conformational
changes, and an impaired calcium metabolism (Saba et al., 1984 ; Nystrom et al., 1994).
Gram positive bacteria also influence platelets, because adhesive matrix molecules such as
clotting factor A forms complexes with fibrinogen and antibodies which induce platelet
agglutination (Loughman et al., 2005).
Low platelet count can not only affect the analysis of the platelet function analyser,
but may also cause reduced agonist-induced platelet aggregation (Hanke et al., 2010). The
adjustment of platelet count in the turidimetric assay excludes a significant contribution of
platelet count to the significantly reduced test results of the turbidimetric assay in the present
study. In contrast, platelet count may have influenced the results of the impedance method,
but these differed significantly dependent on the agonist used making a significant influence
unlikely. In addition, thrombocytopenia was rare among the patients in the current study.
It has been suggested that there may be a general shift of platelet functionality under
inflammatory conditions/sepsis from haemostasis towards other functions (esp. within
inflammation) like vascular healing (Yaguchi et al., 2004). α-granules contain, beside
coagulation factors and adhesion proteins, growth factors, one of them is the vascular
endothelial growth factor (VEGF) (Maloney et al., 1998). Sepsis causes an alteration in α-
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74
granule content manifested in an increased release of VEGF. That suggests a redistribution of
platelet function from hemostasis to tissue repair and vascular healing (Yaguchi et al., 2004).
The remarkable decrease of AA-induced whole blood aggregation, which we detected
in dogs with inflammatory diseases, regardless of the presence of SIRS is well in
confirmation with the observations made in a study by Lundahl et al. (1996) which revealed a
decreased capability of fibrinogen binding in response to AA in human intensive care patients
(among others patient with sepsis) and with observations made in a study by Yaguchi et al.
(2004) in human septic patients. In this study, the most severe sepsis-induced inhibition of the
turbidimetric platelet aggregation of approximately 50 % from the values of the reference
group, was seen for cycclooxygenase pathway induced with AA. AA is metabolized by COX-
1 to PGH2 which in high concentrations has inhibitory effects on platelet function (Quinn,
2005). Because inflammation is associated with an increased release of AA followed by an
increased production of prostaglandins, the further addition of AA may lead to much higher
concentration of PGH2 in the platelet than under physiological conditions.
Interestingly, collagen-induced whole blood aggregation, in contrast to collagen-
induced turbidimetric aggregation, was partly increased in dogs with inflammatory diseases
and in dogs with SIRS. Our observation is, however, in accordance with observations made in
a human study by Whitworth et al. (1989), who used ADP and collagen for inducing
aggregation in both turbidimetric and impedance measurements in patients with endotoxemia.
While collagen-induced aggregation was increased in impedance aggregometry, it was
decreased in the turbidimetric method. The discrepancy to other agonists may reflect the
specific activation mechanism of collagen after binding to the platelet collagen receptor
V Manuskript II
75
(adhesion). The fact that this phenomenon was only observed in impedance aggregometry
may indicate the role of other blood cells that are also influenced by inflammatory processes
and interaction between platelets and leukocytes or red blood cells, that are probably the main
reason for the discrepancies between the results of the turbidimetric method on PRP and
whole blood aggregometry on whole blood. In a current study, an increased number of
platelet-neutrophil aggregates were observed in dogs with SIRS (Dircks et al., 2011).
Unexpectedly, SIRS and Non-SIRS animals did not have systematic significant
differences which may be possible due to the heterogenous composition of patients included
in both groups. In a human study, platelet aggregation was more severely altered in patients
with severe sepsis than in those with uncomplicated sepsis (Yaguchi et al., 2004).
Conclusion
The results of the present study indicate that inflammatory diseases caused by bacterial
and protozoal infections have an inhibitory effect on platelet function in dogs. Significant
alterations of primary haemostasis are mainly associated with systemic infectious diseases
and less frequently observed in local processes (abscesses), but the presence of SIRS does not
seem to have a significant impact on the severity of the alterations.
Conflict of interest statement
None of the authors has any financial or personal relationships that could
inappropriately influence or bias the content of the paper.
V Manuskript II
76
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V Manuskript II
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V Manuskript II
80
Table 1 Different parameters of primary haemostasis (mean ± standard deviation or median, minimum-maximum) in dogs with various inflammatory diseases (n=25) in comparison to a healthy controls (n =27–65). Additional comparison of the dogs with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) (n=15) and dogs without SIRS (n=10).
Parameter Units Reference range
1 Control Group
2 Inflam. diseases
Stat. com- parison
(1,2)
3 SIRS
4 NonSIRS
Stat. com- parison
(3,4)
Capillary bleeding time sec 45–124.5 74.4 ± 21.3
74.5 ± 46.5 0.988 74.6
± 52.7 74.5
± 41.5 0.998
Platelet function analysis
(PFA-100)
CADPa
CTb sec 47–98 65 (47–99)
83 (55–301) < 0.001 75
(55–301) 123
(57–301) 0.255
CADP TVc µL 231–303 263
(231–303) 300
(161–870) 0.025 297 (230–870)
314 (161–870) 0.846
CEPId
CT sec 73–301 152 (73–301)
301 (92–301) 0.013 301
(108–301) 301
(92–301) 0.531
CEPI TV µL 279–871 474
(278–871) 618
(140–872) 0.355 757 (300–872)
582 (140–871) 0.505
Maximum aggregation
(Turbidimetric aggregometry)
ADPe
40 µmol/L % 32.8 –118 67.3 ± 21.8
45.2 ± 26.8 0.003 41.0
± 19.5 51.6
± 35.8 0.461
ADP 20 µmol/L % 24.6–95.9 59.1
± 21.9 46.4
± 24.2 0.066 42.6 ± 17.5
52.1 ± 32.3 0.466
ADP 10 µmol/L % 19.7–78.7 49.0
± 16.5 36.3
± 21.1 0.025 32.7 ± 17.2
41.8 ± 26.3 0.358
Collagen 40 µg/mL % 36.2–92.9 75.4
± 15.4 58.2
± 23.3 0.004 51.6 ± 13.3
67.3 ± 31.2 0.213
Collagen 20 µg/mL % 43.8– 119 80.9
± 19.2 66.9
± 23.8 0.034 62.7 ± 11.9
72.8 ± 34.5 0.448
Collagen 10 µg/mL % 51.8 - 111 79.4
± 14.0 70.7
± 24.3 0.131 69.2 ± 14.4
72.8 ± 34.9 0.785
Area under the curve
(Impedance aggregometry)
ADP 20 µmol/L AU*min 1248–3380 2240
± 473 2221
± 1033 0.932 2221 ± 1177
2220 ± 831 0.997
ADP 10 µmol/L AU*min 1492–3483 2380
± 498 2285
± 1103 0.683 2301 ± 1319
2261 ± 735 0.931
ADP 5 µmol/L AU*min 662–3502 2193
± 623 2095 ± 983 0.644 2251
± 1147 1860 ± 653 0.290
Collagen 10 µg/mL AU*min 1568–3821 2650
± 482 3003
± 1200 0.165 3374 ± 1144
2446 ± 1108 0.056
Collagen 5 µg/mL AU*min 1691–3480 2750
± 416 3236
± 1113 0.043 3640 ± 1077
2630 ± 905 0.023
Collagen 3 µg/mL AU*min 1234–3622 2619
± 563 3066
± 1111 0.065 3279 ± 1192
2746 ± 945 0.248
AAf
1 mmol/L AU*min 1005–3493 2103 ± 654
1495 ± 848 < 0.001 1545
± 929 1419 ± 751 0.725
AA 0,5 mmol/L AU*min 727–2973 1975
± 650 1334 ± 778 < 0.001 1349
± 758 1311 ± 849 0.907
V Manuskript II
81
Continuation Table 1
Parameter Units Reference range
1 Control Group
2 Inflam. diseases
Stat. com- parison
(1,2)
3 SIRS
4 NonSIRS
Stat. com- parison
(3,4)
Platelet count 10³/µL 139–580 294 ± 88
242 ± 117 0.051 217
± 124 279
± 101 0.199
Haematocrit (%) 40.2–55.6 47.9 ± 4.1
39.7 ± 8.3 < 0.001 37.8
± 7.6 42.6 ± 8.8 0.159
a collagen/ADP cartridge; b closure time; c total volume; d collagen/epinephrine cartridge; e adenosine diphosphate; f arachidonic acid; g Kruskal-Wallis test; h significant t-test between groups
V Manuskript II
82
Table 2 Numer of decreased, normal (within reference values), and increased values of different parameters of primary haemostasis in dogs with various inflammatory diseases (n=25). Additional comparison of the dogs with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) (n=15) and dogs without SIRS (n=10).
a collagen/ADP cartridge; b closure time; c total volume; d collagen/epinephrine cartridge; e adenosine diphosphate; f arachidonic acid
Parameter
Inflammatory diseases (n=25)
SIRS (n=15)
NonSIRS (n=10)
↓ = ↑ ↓ = ↑ ↓ = ↑
Capillary bleeding time 6 12 3 3 6 2 3 6 1
Platelet function analysis
(PFA-100)
CADPa
CTb 0 13 12 0 10 5 0 3 7
CADP TVc 2 11 12 1 8 6 1 3 6
CEPId
CT 0 25 0 0 15 0 0 10 0
CEPI TV 1 23 1 0 14 1 1 9 0
Maximum aggregation
(Turbidimetric aggregometry)
ADPe
40 µmol/L 6 14 0 3 9 0 3 5 0
ADP 20 µmol/L 5 15 0 3 9 0 2 6 0
ADP 10 µmol/L 4 15 1 3 9 0 1 6 1
Collagen 40 µg/mL 3 15 1 1 10 0 2 5 1
Collagen 20 µg/mL 3 16 0 1 10 0 2 6 0
Collagen 10 µg/mL 3 15 1 1 10 0 2 5 1
Area under the curve
(Impedance aggregometry)
ADP 20 µmol/L 6 17 2 5 8 2 1 9 0
ADP 10 µmol/L 6 16 3 5 7 3 1 9 0
ADP 5 µmol/L 2 21 2 2 11 2 0 10 0
Collagen 10 µg/mL 4 14 7 1 9 5 3 5 2
Collagen 5 µg/mL 2 12 11 1 5 9 1 7 2
Collagen 3 µg/mL 0 16 9 0 8 7 0 8 2
AAf
1 mmol/L 9 16 0 5 10 0 4 6 0
AA 0,5 mmol/L 6 18 1 3 11 1 3 7 0
Platelet count 6 19 0 6 9 0 0 10 0
Haematocrit 11 14 0 8 7 0 3 7 0
VI Übergreifende Diskussion
83
VI Übergreifende Diskussion
Mit der vorliegenden Arbeit konnte ein weiterer Beitrag zur Optimierung des
Multiplate® Aggregometers für seinen Einsatz in der Veterinärmedizin geleistet werden. Dies
ist insofern von klinischem Interesse, als dass die Vollblutaggregometrie entscheidende
Vorteile gegenüber der bisher gängigen Messung der Thrombozytenfunktion im PRP hat. So
entfällt die mit der Zentrifugation einhergehende Zellschädigung und artifizielle Veränderung
der Plättchenvolumen-Verteilung. Neben der damit verbundenen Zeitersparnis kann die
Aggregation außerdem in einem physiologischen Milieu stattfinden, da alle Blutbestandteile
vorhanden sind (DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Auch die Messung von
ikterischen und lipämischen Proben, die im PRP zu erheblichen Problemen führt, ist mit dem
Impedanzaggregometer ohne Weiteres möglich (RAND et al. 2003).
Bereits zuvor wurde von KALBANTNER et al. (2010) die Eignung des Gerätes zur
Messung von Hundeblut geprüft. Dabei wurden Referenzwerte etabliert, verschiedene
Antikoagulantien getestet und optimale Konzentrationen der verschiedenen Agonisten
ausgearbeitet. Im methodischen Teil der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus der
Parameter „Messzeit“ überprüft. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Messzeit einen
signifikanten Einfluss auf die Messergebnisse des Multiplate® Aggregometers hat. Dies gilt
sowohl für die AUC als auch für die maximale Aggregation sowie für alle verwendeten
Agonisten. Die in dieser Studie verwendeten Agonisten wurden in den zuvor in der Studie
von KALBANTNER et al. (2010) eruierten optimalen Konzentrationen von 10 µmol/L ADP,
5 µg/mL Kollagen und 1 mmol/L AS verwendet. Diese Konzentrationen induzierten eine
maximale Aggregation bei minimalen interindividuellen Schwankungen. Da sich in der
Studie zeigte, dass die Agonisten Ristocetin und „Thrombin-Rezeptor aktivierendes Peptid 6“
(TRAP-6) keine zuverlässige Aggregation beim Hund induzieren konnten, wurde auf den
Einsatz dieser Agonisten verzichtet.
Aufgrund des Einflusses der Messzeit auf die Ergebnisse ist es notwendig,
Referenzwerte für die jeweilige Messzeit und den jeweiligen Parameter zu erstellen. Beim
Einsatz von an die Messzeit angepassten Referenzwerten scheint die Messzeit dann keinen
signifikanten Einfluss auf die Sensititvität und Spezifität der Messungen zu haben. Daher
VI Übergreifende Diskussion
84
kann eine kurze Messzeit von 6 min als ausreichend angesehen werden und weist offenbar
sogar eine geringfügig höhere Sensitivität auf.
Der Hersteller empfiehlt eine Messzeit von 6 min für humane Blutproben und dieser
Empfehlung wird in den meisten der humanmedizinischen Studien auch nachgekommen
(CALATZIS 2007; MUELLER et al. 2007; VON PAPE et al. 2007; CAN et al. 2010).
Abweichend davon wählten TÓTH et al. (2006) in ihrer Studie eine Messzeit von 5 min. Es
konnten weder in der human- noch in der veterinärmedizinischen verfügbaren Literatur
Studien gefunden werden, die systematisch verschiedene Messzeiten im Hinblick auf die
diagnostische Genauigkeit verglichen haben. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie
scheinen demnach auch für die Humanmedizin von Interesse.
Die in der früheren Studie von KALBANTNER et al. (2010) verwendete Messzeit von
12 min für canine Blutproben diente dazu, den Aggregationskurven das Erreichen eines
Plateaus zu ermöglichen. Dies macht es u.a. möglich, die wahre maximale Aggregation zu
ermitteln. Ein reduzierter Zeitaufwand scheint der Hauptgrund für die Anwendung einer 6-
minütigen Messzeit zu sein, die in der Regel die Aggregationsreaktion nicht zum Abschluss
kommen lässt.
Eine Einschränkung unserer methodischen Studie ist das Fehlen einer
Referenzmethode im ersten Teil des Experiments. Dadurch konnte nicht abschließend geklärt
werden, ob die ober- oder unterhalb des Referenzbereiches liegenden Ergebnisse wahr oder
falsch positiv sind. Aus diesem Grund haben wir ein zweites Experiment basierend auf
Probenmaterial von Clopidogrel-behandelten Hunden durchgeführt. Clopidogrel ist ein
potenter, nicht-kompetitiver Antagonist des thrombozytären ADP-Rezeptors P2Y12, der die
Bindung von ADP an seinen Plättchenmembranrezeptor irreversibel hemmt (MUELLER et
al. 2007).
Bereits zuvor wurde eine signifikant reduzierte ADP-induzierte
Thrombozytenaggregation bei Hunden beschrieben, die Clopidogrel in der von uns
verabreichten Dosierung erhielten (BRAINARD et al. 2010). Daher war anzunehmen, dass
alle Proben der behandelten Hunde, die mit dem Agonisten ADP gemessen wurden, unterhalb
des Referenzbereichs liegen, wie es auch in unserer Studie der Fall war. Die verminderte AS-
induzierte Aggregation der Clopidogrel-behandelten Hunde mag auf den ersten Blick
VI Übergreifende Diskussion
85
überraschend erscheinen, doch konnte derselbe Effekt auch bei humanen Thrombozyten
beobachtet werden (EDER et al. 2007; PENZ et al. 2010).
Obwohl die Hemmung der Aggregation durch Clopidogrel rezeptorspezifisch ist und
sich nicht deutlich auf die COX oder den AS-Metabolismus auswirkt, kann Clopidogrel
indirekt auch die durch andere Agonisten induzierte Aggregation hemmen, indem es die
Amplifikation der Thrombozytenaktivierung durch freigesetztes ADP blockiert. Die Bindung
von ADP ist notwendig, um die Aktivierung des GPIIb/IIIa-Rezeptors zu induzieren, der die
Vernetzung der Thrombozyten untereinander durch Fibrinogenbrücken ermöglicht (SIESS
1989).
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse des ersten methodischen Teils unserer
Studie, dass der Einfluss der Messzeit auf die Aussagekraft der Messergebnisse der
Vollblutimpedanzaggregometrie bei Hunden gering ist, sofern die Interpretation der
Ergebnisse basierend auf Referenzwerten erfolgt, die spezifisch für die einzelne Messzeit
etabliert wurden. Die Verkürzung der Messzeit für Hundeblut auf 6 min – wie für humanes
Blut empfohlen - scheint daher möglich und geht mit einer mindestens gleichwertigen
Aussagekraft gegenüber längeren Messzeiten einher.
Das Multiplate® Aggregometer war auch Bestandteil des zweiten Teils der
vorliegenden Arbeit. Da die Untersuchungen zur Optimierung der Messzeit und zum Einfluss
entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion parallel stattfanden, wurde im
klinischen Teil eine Messzeit von 12 min vorerst beibehalten. Die Ergebnisse des zweiten
Teils dieser Arbeit zeigen, dass Hunde mit entzündlichen Erkrankungen oft eine mäßig
beeinträchtigte Thrombozytenfunktion aufweisen, auch wenn einzelne Tests ein gesteigertes
Aggregationsvermögen aufzeigten (Kollagen-induzierte Impedanzaggregometrie). Diese
geringfügigen bis moderaten Veränderungen wurden jedoch nicht im Rahmen der kapillären
Blutungszeit erfasst, die als Globaltest der primären Hämostase angesehen werden kann. Dies
ist vermutlich auf die Heterogenität der Patienten und die niedrige Sensitivität des Tests
zurückzuführen. Zwar erfolgt bei der Methode eine weitestgehende Standardisierung des
Blutflusses im Punktionsgebiet (NOLTE et al. 1997), doch werden die Ergebnisse durch eine
Bandbreite weiterer möglicher Faktoren beeinflusst, die zu einer relativ hohen
Messungenauigkeit der Methode führen. Zu diesen Faktoren gehören zum einen Tier-
abhängige Faktoren (Blutdruck, Hautdicke, Gefäßwandbeschaffenheit und Verteilung der
VI Übergreifende Diskussion
86
Kapillaren), die von Rasse zu Rasse und Hund zu Hund variieren können (THOMAS et al.
1979; FORSYTHE u. WILLIS 1989), und zum anderen technische Aspekte (Menge an
hyperämisierender Salbe, angewendeter Druck beim Setzen der Punktionen).
MORENO et al. (1998) beobachteten im Gegensatz zu unserer Studie eine verlängerte
kapilläre Blutungszeit bei Hunden mit Leishmaniose. Natürlich infizierte Hunde zeigten dabei
eine signifikant längere Blutungszeit (Mittelwert 93,0 sec) im Vergleich zur Kontrollgruppe
(143,0 sec, p = 0,02). Die signifikant längere Blutungszeit bei an Leishmaniose erkrankten
Hunden mit erhöhten Kreatininwerten (> 1,5 mg/dL) verglichen mit Patienten mit normalen
Kreatininwerten lässt jedoch vermuten, dass die Verlängerung zumindest teilweise durch ein
Nierenversagen bedingt war. Während Nierenversagen eine häufige Begleiterscheinung der
Leishmaniose ist, tritt es nicht zwangsläufig auch im Rahmen anderer entzündlicher
Erkrankungen auf. Dies erklärt die abweichenden Resultate unserer Studie, in der eine
größere Bandbreite an inflammatorischen Erkrankungen vertreten war.
Die Verschlusszeiten des Plättchenfunktionsanalysegerätes PFA-100 waren bei den
Hunden mit entzündlichen Erkrankungen für beide Messzelltypen verlängert, was eine
beeinträchtigte Fähigkeit der Thrombozyten zur Bildung eines Aggregates unter hohen
Scherkräften nahelegt. Dies steht in Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen der
Thrombozytenaggregation (unter niedrigen Scherkräften) und den Ergebnissen einer Studie,
die nach einer verkürzten Verschlusszeit (in den ersten 30 min) eine verlängerte
Verschlusszeit der CADP- und CEPI-Messzellen bei Hunden mit experimentell induzierter
Endotoxämie darlegen (YILMAZ et al. 2005). Während die zwei Hunde mit Pankreatitis in
unserer Studie eine verlängerte Verschlusszeit aufwiesen, konnte bei Patienten mit einer
milden akuten Pankreatitis in einer humanmedizinischen Studie eine verkürzte Verschlusszeit
für beide Messzelltypen festgestellt werden, die auf ein erhöhtes Adhäsion- und
Aggregationsvermögen der Plättchen zurückgeführt wurde (MIMIDIS et al. 2004). Diese
abweichenden Resultate können wahrscheinlich durch den unterschiedlichen Schweregrad
und möglicherweise auch durch ein unterschiedliches Stadium der Erkrankung erklärt
werden.
Die Aussagekraft der Ergebnisse von einzelnen Hundeblutproben bei Messungen mit
der CEPI-Messzelle ist eingeschränkt, da der Referenzbereich für Hundeblut die maximale
Messzeit von 300 s aufgrund der geringen Sensitivität caniner Thrombozyten für Epinephrin
VI Übergreifende Diskussion
87
überschreitet (CALLAN u. GIGER 2001; MISCHKE u. KEIDEL 2003; NIELSEN et al.
2007), was in unserer Studie bestätigt werden konnte. Dennoch zeigte der Gruppenvergleich
eine signifikant verlängerte Verschlusszeit bei Hunden mit entzündlichen Erkrankungen im
Fall der CEPI-Messzelle.
Bei der Interpretation der Messergebnisse des PFA-100 müssen immer auch der
Hämatokrit und die Thrombozytenzahl der Probe berücksichtigt werden. Beide Parameter
haben einen signifikanten Einfluss auf die Messergebnisse. So konnten CALLAN und GIGER
(2001) bei Hundeblutproben mit einer Thrombozytenzahl von < 100 x103/µL eine
Verlängerung der Verschlusszeit bei beiden Messzelltypen beobachten, die bei < 50 x103/µL
besonders deutlich ausgeprägt war. Eine Studie von MISCHKE und KEIDEL (2003) zeigte,
dass bereits ein Abfall des Hämatokrits von 40 % auf 30 % eine signifikante Verlängerung
der Verschlusszeit und Erhöhung des Gesamtvolumens verursacht. Aus diesem Grund
spiegeln die in der Studie von YILMAZ et al. (2005) beobachteten verlängerten
Verschlusszeiten bei Hunden mit experimentell induzierter Endotoxämie nicht zwangsläufig
die Schädigung der Thrombozytenfunktion durch Endotoxine wider, sondern sind wohl
hauptsächlich auf den deutlichen, zeitgleichen Abfall der Thrombozytenzahl zurückzuführen.
Die Hunde mit entzündlichen Erkrankungen in unserer Studie hatten einen signifikant
erniedrigten Hämatokrit (39,7 ± 8.3 % vs. 47,9 ± 4,1 % bei der gesunden Kontrolle) und eine
tendenziell erniedrigte Thrombozytenzahl (242 ± 117 vs. 294 ± 88 x 103/µL). Dennoch
scheint der Einfluss des Hämatokrits in unserer Studie begrenzt zu sein, da nur geringe
Unterschiede der PFA-100-Ergebnisse zwischen Hämatokritwerten von 40 und 48 %
beobachtet werden konnten (CALLAN u. GIGER 2001), die sich im unteren Referenzbereich
für Hunde bewegen. Diese Werte führen wahrscheinlich zu keinen bedeutenden
Veränderungen der Blutflussbedingungen und Verteilung der Blutzellen im Gefäß, welche als
entscheidende Faktoren der Pathomechanismen anzusehen sind, die eine Änderung der
Ergebnisse des PFA-100 bei anämischen Patienten verursachen (DIETRICH et al. 1995;
MISCHKE u. KEIDEL 2003). Auch die Thrombozytenzahl scheint in unserer Studie nur
einen begrenzten Einfluss gehabt zu haben, da lediglich 6 von 25 Hunden mit Entzündungen
eine Thrombozytenzahl unterhalb des Referenzbereichs aufwiesen und Schwankungen der
Thrombozytenzahl innerhalb des Referenzbereichs keinen signifikanten Einfluss auf die
Messergebnisse haben (MISCHKE u. KEIDEL 2003).
VI Übergreifende Diskussion
88
Ein weiterer Faktor, der im Rahmen der automatischen Plättchenfunktionsanalyse von
Interesse ist, ist die vWF-Konzentration, die bei unseren Patienten zwar nicht erfasst wurde,
aber wahrscheinlich aufgrund der Rolle des vWF als Akute-Phase-Protein bei den meisten
Hunden erhöht war. Die damit verbundene Verkürzung der Verschlusszeit kann – umgekehrt
zur Thrombozytopenie und Anämie – zur Maskierung einer beeinträchtigten
Thrombozytenfunktion führen, d.h. zu falsch negativen/normalen Werte trotz erworbener
Thrombozytenfunktionsstörung. So konnten HOMONCIK et al. (2000) nach einer Endotoxin-
Injektion bei gesunden Menschen einen 85 %igen Anstieg der vWF-Konzentration feststellen,
der mit einer 38 bzw. 47–%igen Verkürzung der Verschlusszeit bei der CADP- bzw. CEPI-
Messzelle einherging.
Die von uns gemessene erniedrigte ADP- und Kollagen-induzierte maximale
Aggregation der turbidimetrischen Aggregometrie bei Hunden mit entzündlichen
Erkrankungen bestätigt die Ergebnisse verschiedener Studien, die den Einfluss bestimmter
Infektionserkrankungen wie Leishmaniose und Ehrlichiose auf die Thrombozytenaggregation
untersucht haben (HARRUS et al. 1996a; CORONA et al. 2004; BRANDAO et al. 2006).
Ebenso zeigten Hunde mit experimentell induzierter akuter Pankreatitis eine reduzierte
Thrombozytenaggregation im Rahmen der turbidimetrischen Aggregometrie (JACOBS et al.
1986; LUKASZYK et al. 1989). Lediglich in der frühen Phase nach der induzierten
Pankreatitis konnte eine erhöhte Plättchenaggregation beobachtet werden (LUKASZYK et al.
1989). Auch Studien aus der Humanmedizin berichten von übereinstimmenden Ergebnissen
im Sinne eines beeinträchtigten Aggregationsvermögen der Thrombozyten bei Patienten mit
Sepsis (SABA et al. 1984; YAGUCHI et al. 2004; WOTH et al. 2011). So konnten
YAGUCHI et al. (2004) beispielsweise eine im Vergleich zur Kontrollgruppe erniedrigte
Thrombozytenaggregation bei allen septischen Patienten (n=47), unabhängig vom
verwendeten Agonisten beobachten.
Eine mögliche Ursache für die Thrombozytenfunktionsstörung bei Hunden mit
Infektionserkrankungen im Allgemeinen und eine beeinträchtigte Thrombozytenaggregation
im Speziellen ist die Beschädigung der thrombozytären Membranrezeptoren durch infektiöse
Erreger wie Leishmanien, die darüber hinaus einen immunvermittelten Prozess induzieren
(CORONA et al. 2004). Anti-Plättchen-Antikörper konnten bei Hunden mit
Infektionskrankheiten wie Leishmaniose und Ehrlichiose identifiziert werden und stehen im
VI Übergreifende Diskussion
89
Verdacht mit den Membranglykoproteinen der Thrombozyten zu interagieren (HARRUS et
al. 1996; TERRAZZANO et al. 2006; DIRCKS et al. 2009).
Messungen der P-Selektin-Expression auf der Thrombozytenoberfläche zeigten eine
erhöhte Expression unter inflammatorischen Bedingungen (YEO et al. 1993; MORITZ et al.
2005). P-Selektin ist ein Bestandteil der α-Granula und wird nach der Degranulation auf der
Thrombozytenoberfläche exprimiert (MICHELSON 1996) und somit ein Marker für die
Plättchenaktivierung. Die im Rahmen entzündlicher Prozesse gesteigerte Aktivierung der
Thrombozyten führt wohlmöglich zu einem refraktären Zustand bezüglich einer Induktion der
Thrombozytenaggregation durch Agonisten in vitro (MORITZ et al. 2005). Diese
Thrombozyten erscheinen bei in vitro Aggregationsmessungen hypofunktional und könnten
dadurch für die erniedrigten Ergebnisse der Agonist-induzierten
Thrombozytenaggregationsmessung verantwortlich sein. Andere Autoren berichten von
„erschöpften Thrombozyten“, bei denen es sich um Plättchen handelt, die nach einer
reversiblen Interaktion mit vaskulären oder intravaskulären Substanzen im oder in der Nähe
des Pankreas oder nach einer Interaktion mit einem nicht näher definierten zirkulierenden
Inhibitor in der Zirkulation verbleiben (O’BRIEN 1978; JACOBS et al. 1986).
Die Bindung von Endotoxinen kann über verschiedene Pathomechanismen zu einer
Beeinträchtigung der Thrombozytenfunktion führen. So induzieren Endotoxine zum einen
eine reduzierte mittlere Adrenorezeptoren-Dichte auf der Plättchenmembran, die ein
vermindertes Ansprechen der Thrombozyten auf Epinephrin verursacht und zum anderen
bewirken sie eine herabgesetzte Konformationsänderung und einen beeinträchtigten
Kalziummetabolismus (SABA et al. 1984; NYSTROM et al. 1994). Grampositive Bakterien
können Thrombozyten über adhäsive Matrixmoleküle wie den ClF A beeinflussen, indem
dieser Komplexe mit Fibrinogen und spezifischen Antikörpern bildet, die eine
Thrombozytenagglutination induzieren (LOUGHMAN et al. 2005).
Niedrige Thrombozytenzahlen beeinflussen nicht nur die Messungen mit dem PFA-
100, sondern können ebenso eine verminderte Agonist-induzierte Thrombozytenaggregation
verursachen (HANKE et al. 2010). Die Einstellung der Plättchenzahl im PRP für die
turbidimetrische Aggregometrie schließt eine Beteiligung der Thrombozytenzahl an den
signifikant erniedrigten Messergebnissen bei dieser Methode aus. Im Gegensatz dazu kann die
Thrombozytenzahl die Ergebnisse der Impedanzaggregometrie theoretisch zwar durchaus
VI Übergreifende Diskussion
90
beeinflussen (MENGISTU et al. 2009), doch scheint dies unwahrscheinlich, da nicht bei allen
Agonisten signifikante Unterschiede festgestellt werden konnten. Außerdem wiesen nur
wenige Patienten in der vorliegenden Studie eine Thrombozytopenie auf.
YAGUCHI et al. (2004) vermuteten eine allgemeine Verschiebung der
Thrombozytenfunktion unter inflammatorischen bzw. septischen Bedingungen von der
Hämostase in Richtung anderer Funktionen wie z.B. Gefäßheilung. Die α-Granula enthalten
neben Gerinnungsfaktoren und Adhäsionsproteinen, auch Wachstumsfaktoren, zu denen u.a.
auch der vascular endothelial growth factor (VEGF) gehört (MALONEY et al. 1998). Im
Rahmen einer Sepsis kommt es zu Veränderungen in der Zusammensetzung des α-Granula-
Inhaltes, die sich in einer erhöhten Freisetzung von VEGF manifestieren. Dies lässt eine
Umorientierung der Plättchenfunktion von der Hämostase hin zur Gewebereparatur und
Gefäßheilung vermuten (YAGUCHI et al. 2004).
Die auffallende Verminderung der AS-induzierten Vollblutaggregation bei Hunden
mit entzündlichen Erkrankungen bestätigt Beobachtungen, die sowohl in einer Studie von
LUNDAHL et al. (1996) gemacht wurden, bei der ein vermindertes Fibrinogen-
Bindungsvermögen der Plättchen von Intensivpatienten (u.a. mit Sepsis) gezeigt werden
konnten als auch in einer Studie von YAGUCHI et al. (2004) mit septischen Menschen. In
dieser Studie konnte die stärkste Sepsis-induzierte Hemmung der turbidimetrischen
Thrombozytenaggregation um bis zu 50 % bezogen auf die Kontrollgruppe bei der AS-
induzierten Aggregation gemessen werden. AS wird über die COX-1 in PGH2 metabolisiert,
das in hohen Konzentrationen einen inhibitorischen Effekt auf die Thrombozytenfunktion hat
(QUINN 2005). Da es im Rahmen von Entzündungsprozessen zu einer gesteigerten
Freisetzung von AS gefolgt von einer gesteigerten Prostaglandinproduktion kommt, kann die
weitere Zugabe von AS während der Aggregometrie eine wesentlich höhere PGH2-
Konzentration in der Umgebung des Thrombozyten als unter physiologischen Bedingungen
verursachen.
Interessanterweise war die Kollagen-induzierte Aggregation im Vollblut im Gegensatz
zur Kollagen-induzierten turbidimetrischen Aggregation teilweise bei Hunden mit
entzündlichen Erkrankungen und bei Hunden mit SIRS signifikant erhöht. Diese Beobachtung
steht in Übereinstimmung mit den Ergebnissen einer humanmedizinischen Studie von
WHITWORTH et al. (1989), die für die Messung von Proben endotoxämischer Patienten
VI Übergreifende Diskussion
91
ADP und Kollagen zur Aggregationsinduktion bei beiden Methoden verwendeten. Während
die Kollagen-induzierte Aggregation der Impedanzaggregometrie erhöht war, zeigte sich bei
der turbidimetrischen Aggregometrie eine erniedrigte Aggregation. Die Diskrepanz zu den
anderen Agonisten spiegelt möglicherweise den spezifischen Aktivierungsmechanismus von
Kollagen nach Bindung an den thrombozytären Kollagenrezeptor wider. Die Tatsache, dass
dieser Effekt nur bei der Impedanzaggregometrie beobachtet werden konnte, lässt die
Beteiligung anderer Blutzellen vermuten, die ebenso durch entzündliche Prozesse beeinflusst
werden. Einer der Hauptgründe für die abweichenden Ergebnisse der Messung im PRP und
um Vollblut könnte demnach in der Interaktion der Thrombozyten mit Leukozyten oder
Erythrozyten liegen. In einer aktuellen Studie konnte eine erhöhte Anzahl von Thrombozyten-
Neutrophilen-Aggregaten bei Hunden mit SIRS nachgewiesen werden (DIRCKS et al. 2011).
Überraschenderweise gab es keine systematischen signifikanten Unterschiede
zwischen den Gruppen „SIRS“ und „NonSIRS“, was wohlmöglich auf die heterogene
Zusammensetzung der Patienten in beiden Gruppen zurückzuführen ist. In einer
humanmedizinischen Studie konnte gezeigt werden, dass die
Thrombozytenaggregationhemmung bei Patienten mit ernster Sepsis stärker ausgeprägt war
als bei solchen mit unkomplizierter Sepsis (YAGUCHI et al. 2004).
Die Ergebnisse des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit zeigen zusammenfassend,
dass entzündliche Erkrankungen, die durch bakterielle und protozoische Infektionen
hervorgerufen wurden, einen inhibitorischen Effekt auf die Thrombozytenfunktion von
Hunden haben. Signifikante Veränderungen der primären Hämostase sind hauptsächlich mit
systemischen Infektionserkrankungen assoziiert und seltener bei lokalen Prozessen, wie z.B.
Abszessen, zu beobachten. Das Vorliegen eines SIRS scheint jedoch keinen signifikanten
Einfluss auf die Ausprägung der Veränderungen zu haben. Weiterführende Untersuchungen
unter Einbeziehung größerer Zahlen von Patienten mit definerten Infektionserkrankungen in
verschiedenen Stadien und zusätzlicher Berücksichtigung von Entzündungsparametern wären
lohnend.
VII Zusammenfassung
92
VII Zusammenfassung
Monia Abid (2011)
Thrombozytenfunktionsdiagnostik bei Hunden mit inflammatorischen Erkrankungen
und Optimierung der Messzeit des Multiplate® Aggregometers
Im ersten Teil dieser Dissertation wurde der Einfluss der Messzeit auf die
Referenzwerte und die Aussagekraft der Ergebnisse des Multiplate® Aggregometers, einem
relativ neuen Impedanzaggregometer, bei Hunden untersucht. Da es für den Einsatz in der
Humanmedizin entwickelt wurde, fand kürzlich in einer vorangegangenen Studie eine
Evaluierung des Gerätes für Hundeblut statt, bei der eine Messzeit von 12 min verwendet
wurde, die von der Empfehlung des Herstellers (6 min für humanes Blut) abweicht. Basierend
auf Blutproben von 83 klinisch gesunden Hunden wurden Referenzwerte für verschiedene
Messzeiten (6, 8, 10 und 12 min) für die Parameter „area under the curve“ (AUC) und
maximale Aggregation ermittelt. Die Messergebnisse von 134 Proben von 117 Hunden mit
diversen Erkrankungen und 8 Proben mit verminderter Thrombozytenfunktion aufgrund einer
Behandlung mit dem Plättchenaggregationshemmer Clopidogrel wurden zu den
verschiedenen Messzeiten ausgewertet und in erniedrigt, normal und erhöht eingeteilt. Zum
Einsatz kamen drei verschiedene aggregationsinduzierende Agonisten in ihren optimalen
Konzentrationen: Adenosindiphosphat (ADP, 10 µmol/L), Kollagen (5 µg/mL) und
Arachidonsäure (AS, 1 mmol/L). Es konnte eine signifikante Erhöhung der maximalen
Aggegations- und AUC-Werte bei den gesunden Kontrollen mit steigender Messzeit
beobachtet werden. Mittels Chi-Quadrat Test ergaben sich für keinen Agonisten signifikanten
Unterschiede zwischen den verschiedenen Messzeiten in Bezug auf die Anzahl der erhöhten
und erniedrigten Messergebnisse bei den Patientenproben. Alle Proben der mit Clopidogrel
behandelten Hunde, die mit dem Agonisten ADP gemessen wurden, wiesen erniedrigte AUC-
Werte bei allen Messzeiten auf. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Messzeit einen
signifikanten Einfluss auf die maximalen Aggregations- und AUC-Werte hat, der Einfluss auf
die Sensitivität der Messergebnisse von Hundeblut bei diesem Gerät aber begrenzt ist.
VII Zusammenfassung
93
Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, den Einfluss entzündlicher
Erkrankungen auf die primäre Hämostase beim Hund zu untersuchen. Dazu wurden sechs
verschiedene Parameter zur Untersuchung der Thrombozytenfunktion bei 25 Hunden mit
bakteriellen und protozoischen Infektionen verwendet: kapilläre Blutungszeit, automatische
Plättchenfunctionsanalyse (PFA 100: Kollagen/ADP [CADP] und Kollagen/Epinephrin
[CEPI] Messzellen), turbidimetrische Thrombozytenaggregation (mit Agonisten ADP und
Kollagen), Impedanzaggregometrie (mit Agonisten ADP, Kollagen und AS) mit einem
multiplen Elektrodenaggregometers, Thrombozytenzahl und Hämatokrit. Die Ergebnisse der
25 erkrankten Hunde wurden mit denen der Kontrollgruppe verglichen. Darüber hinaus
wurden die erkrankten Tiere basierend auf Kriterien des systemischen inflammatorischen
Response-Syndroms (SIRS) in zwei Untergruppen eingeteilt (Gruppe „SIRS“ und
„NonSIRS“) und miteinander verglichen.
Im Vergleich zur Kontrollgruppe ergab sich bei den Hunden mit entzündlichen
Erkrankungen eine signifikant verlängerte Verschlusszeit der automatischen
Plättchenfunktionsanalyse bei beiden Messzelltypen (z.B. CADP: 83 [55–301] sec vs. 65 [47–
99] sec; Median [Minimum–Maximum]; P < 0,0001). Dabei wiesen 12 der 25 Hunde eine
verlängerte Verschlusszeit auf (Kol/ADP-Messzelle), darunter alle Hunde mit Leishmaniose,
2/3 Hunden mit Leptospirose, alle Hunde mit Pankreatitis, der Hund mit Sepsis und der Hund
mit Peritonitis, aber nur 1/6 Hunden mit Abszessen, 1/3 Hunden mit Prostatitis und 1/3
Hunden mit Pyometra. 7 der 12 Patienten mit verlängerter Verschlusszeit (CADP-Messzelle)
litten unter einer Anämie und/oder eine Thrombozytopenie. Es konnte eine signifikante
Verminderung der maximalen Aggregation der erkrankten Hunde bei der ADP- und
Kollagen-induzierten turbidimetrischen Aggregometrie beobachtet werden (z.B. 40 µmol/L
ADP: 45,2 ± 26,8 % vs. 67,3 ± 21,8; Mittelwert ± Standardabweichung; P = 0,003). Des
Weiteren ergab sich bei den Tieren mit entzündlichen Erkrankungen eine zum Teil signifikant
erhöhte Kollagen-induzierte (5 µg/mL Kollagen) und signifikant erniedrigte AS-induzierte
Aggregation im Rahmen der Impedanzaggregometrie. Der einzige signifikante Unterschied
zwischen den Untergruppen „SIRS“ und „NonSIRS“ zeigte sich in einer höheren Kollagen-
induzierten Impedanzaggregation der „SIRS“-Gruppe.
Die Ergebnisse des zweiten Teils dieser Arbeit zeigen, dass die meisten in vitro
Methoden eine normale oder geringgradige bis moderate Beeinträchtigung der
VII Zusammenfassung
94
Thrombozytenfunktion aufzeigen, auch wenn einzelne Tests eine gesteigerte
Thrombozytenaggregation erkennen lassen. Das reduzierte Aggregationsvermögen könnte
neben schädigenden Einflüssen der Infektionen teilweise auch zum Ausdruck bringen, dass
die Thrombozyten bereits in vivo aktiviert wurden.
VIII Summary
95
VIII Summary
Monia Abid (2011)
Measurement of platelet function in dogs with inflammatory diseases and optimization
of test time of the Multiplate® analyser
In the first part of this study the influence of test time on reference values and on the
validity of measurement results of the Multiplate® analyser, a relatively new impedance
aggregometer, in canine blood was determined. As designed for human medicine, the device
was recently evaluated for canine blood in a previous study using a test time of 12 min which
deviates from the recommendation of the manufacturer (6 min for human blood). Based on
blood samples of 83 healthy dogs, reference values for different test times (6, 8, 10 and 12
min) were established for maximum aggregation and area under the curve (AUC) values. The
results of 134 samples of 117 dogs with various diseases and 8 samples with reduced platelet
function owing to treatment with the platelet aggregation inhibitor clopidogrel were
calculated at the different test times and classified as decreased, normal or increased. Three
different aggregation inducing agonists in their optimal concentrations were used: adenosine
diphosphate (ADP, 10 µmol/L), collagen (5 µg/mL) und arachidonic acid (AA, 1 mmol/L).
Maximum aggregation and AUC values increased significantly in the healthy control group
with increasing test time. Chi-square test did not show significant differences between the
various test times with regard to the number of increased and decreased measurement result of
the patients for any agonists. All samples of dogs treated with clopidogrel and measured with
the agonist ADP revealed decreased AUC values at any time point. The results of our study
indicate that test time significantly influences absolute maximum aggregation and AUC
values, but has limited influence on sensitivity of measurement results of canine blood using
the investigated instrument.
The aim of the second part of our study was to examine the influence of inflammatory
diseases on primary haemostasis in dogs. Six different parameters were used for testing
platelet function in 25 dogs with bacterial or protozoal infections: capillary bleeding time,
automatic platelet function analysis (PFA 100: collagen/ADP [CADP] and
VIII Summary
96
collagen/epinephrine [CEPI] cartridges), turbidimetric platelet aggregation (with agonists
ADP and collagen), impedance aggregometry (with agonists ADP, collagen and AA) using a
multiple electrode aggregometer, platelet count and haematocrit. Results of the 25 diseased
dogs were compared to the control group and additionally classified into two subgroups
based on criteria of systemic inflammatory response syndrome (SIRS) (groups “SIRS” and
“NonSIRS”) and compared among each other.
Compared to the control group, a significantly prolonged closure time of the automatic
platelet function analyser measured with both cartridges (e.g. CADP: 83 [55–301] sec vs. 65
[47–99] sec; median [minimum–maximum]; P < 0.0001) was observed in dogs with
inflammatory diseases. There were 12 of the 25 dogs with prolonged closure time
(collagen/ADP cartridge) which included all dogs with leishmaniosis, 2/3 dogs with
leptospirosis, all dogs with pancreatitis, the dog with sepsis and the dog with peritonitis, but
only 1/6 dogs with abscesses, 1/3 dogs with prostatitis, and 1/3 dogs with pyometra. 7/12
patients with prolonged closure time (CADP cartridge) had anaemia and/or
thrombocytopenia. There was a significant decrease in maximal aggregation of the
turbidimetric aggregometry induced with ADP (e.g. 40 µmol/L: 45.2 ± 26.8 % vs. 67.3 ±
21.8; mean ± SD; P = 0.003) and collagen in dogs with inflammatory diseases. Furthermore, a
partly (conc 5 µg/mL) significant increase of collagen-induced impedance aggregometry and
significant suppression of AA-induced impedance aggregometry was observed in these dogs.
A higher collagen-induced impedance aggregation of groupe “SIRS” was the only significant
differences between subgroups “SIRS” and “NonSIRS”.
The results of the present study indicate that, although individual tests indicate
enhanced platelet aggregation, most of the in vitro tests revealed a normal or minor to
moderately reduced functionality. The reduced aggregability may partly indicate that platelets
are already activated.
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X Tabellarischer Anhang
119
X Tabellarischer Anhang
Tab. A1: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) von 83 klinische gesunden
Hunden gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer Messzeit von 6, 8, 10 und
12 min. Zum Einsatz kamen die Agonisten Adenosindiphosphat (ADP, 10 µmol/L), Kollagen
(5 µg/mL) und Arachidonsäure (AS, 1 mmol/L).
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
1 891 1373 1896 2209 1167 1861 2607 3048 948 1443 1967 2278 2 753 1147 1564 1819 937 1454 2003 2284 866 1313 1787 2070 3 1363 2119 2945 3448 1226 2012 2895 3435 413 623 852 995 4 978 1521 2126 2502 1119 1804 2553 3005 1088 1682 2326 2713 5 901 1375 1883 2186 880 1380 1929 2199 818 1247 1717 2004 6 1214 1872 2576 2999 1077 1667 2314 2682 1124 1708 2346 2739 7 617 934 1275 1481 660 1026 1423 1636 605 918 1258 1463 8 732 1125 1537 1790 1040 1671 2357 2770 907 1435 2029 2377 9 665 1031 1431 1671 680 1163 1701 2017 652 1014 1401 1628 10 1142 1695 2286 2646 1104 1805 2564 2957 1090 1660 2260 2611 11 1122 1713 2333 2702 1229 1951 2717 3142 603 932 1271 1469 12 1386 2047 2731 3133 1179 1878 2640 3103 575 888 1226 1424 13 937 1485 2077 2423 942 1521 2132 2459 1014 1559 2128 2456 14 862 1361 1910 2248 860 1422 2061 2441 913 1433 1995 2345 15 941 1373 1809 2063 1180 1851 2575 2961 801 1195 1595 1831 16 972 1519 2123 2487 1142 1826 2543 2956 1162 1811 2524 3840 17 1049 1631 2244 2606 887 1536 2273 2683 1033 1603 2195 2542 18 974 1499 2056 2393 1087 1750 2436 2809 956 1522 2153 2548 19 808 1267 1769 2076 846 1360 1917 2222 858 1361 1922 2279 20 994 1498 2052 2393 1278 2010 2788 3232 451 725 1010 1170 21 919 1515 2163 2539 1164 1892 2677 3141 658 1062 1491 1737 22 690 1091 1518 1763 1033 1747 2544 2969 524 845 1194 1388 23 1516 2270 3065 3547 1349 2060 2808 3255 1149 1691 2245 2571 24 1208 1854 2529 2934 1274 2062 2896 3325 587 909 1266 1484 25 903 1282 1648 1862 1064 1668 2292 2648 956 1380 1791 2031 26 856 1330 1838 2136 984 1584 2243 2553 473 757 1064 1245 27 851 1279 1707 1951 928 1467 2043 2374 1165 1813 2497 2904 28 715 1111 1530 1776 1041 1763 2575 3073 942 1508 2128 2511 29 280 426 582 783 708 1313 2007 2402 750 1158 1603 1872 30 974 1481 2018 2327 1108 1689 2281 2590 1288 1897 2445 2718 31 1131 1718 2358 2754 1131 1808 2578 2976 1325 2020 2772 3230 32 1344 2003 2674 3068 1378 2141 2960 3460 1437 2194 2988 3457 33 1157 1735 2352 2731 834 1389 1999 2361 1391 2170 3028 3560
X Tabellarischer Anhang
120
Fortsetzung 1 Tab. A1:
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
34 1137 1762 2420 2813 1099 1708 2367 2767 1039 1539 2028 2301 35 667 1020 1405 1637 819 1321 1860 2134 572 906 1273 1493 36 749 1179 1642 1914 956 1574 2236 2604 637 976 1328 1522 37 765 1169 1589 1835 1119 1810 2534 2954 1108 1633 2137 2429 38 1148 1716 2320 2685 1099 1735 2424 2836 1340 2032 2752 3179 39 950 1473 2022 2354 873 1408 1993 2338 1013 1584 2170 2511 40 728 1134 1561 1806 1245 2005 2822 3269 575 808 1011 1113 41 932 1410 1926 2229 954 1474 2013 2322 658 1023 1423 1661 42 1207 1871 2532 2900 1104 1837 2610 2919 472 690 897 1011 43 947 1479 2055 2406 1105 1765 2482 3074 1152 1768 2420 2805 44 1338 2051 2801 3250 1252 2022 2835 3315 1164 1829 2542 2970 45 778 1190 1620 1156 962 1524 2120 2479 892 1355 1821 2089 46 992 1516 2065 1265 1429 2200 3019 3516 1332 1964 2628 3026 47 797 1260 1729 3397 908 1514 2189 2602 692 1153 1639 1919 48 855 1298 1752 2942 875 1378 1913 2237 898 1312 1685 1883 49 675 1015 1374 2430 1330 2059 2830 3296 538 882 1268 1499 50 1032 1548 2069 1989 825 1407 2047 2442 502 751 1004 1156 51 851 1296 1775 1525 857 1394 1966 2315 956 1461 1989 2304 52 1002 1526 2084 2426 1169 1752 2352 2704 1060 1594 2150 2478 53 981 1527 2114 2473 1017 1676 2398 2833 844 1306 1789 2072 54 1330 2046 2750 3143 1155 1885 2643 3082 633 989 1348 1557 55 652 989 1344 1553 1252 1931 2624 3033 906 1347 1792 2045 56 741 1169 1631 1907 844 1368 1931 2269 735 1082 1424 1621 57 1066 1674 2322 2708 1077 1714 2391 2803 1091 1685 2309 2683 58 817 1259 1758 2075 937 1556 2212 2599 965 1502 2052 2365 59 951 1461 1999 2320 1301 2055 2852 3337 1116 1690 2257 2580 60 991 1596 2252 2651 982 1660 2373 2799 576 980 1427 1703 61 1175 1764 2346 2680 1010 1785 2643 3157 460 691 933 1072 62 828 1264 1726 2005 939 1497 2083 2430 746 1187 1684 1992 63 1135 1726 2344 2711 947 1526 2157 2545 1000 1492 1977 2250 64 990 1524 2062 2362 1175 1926 2713 3187 577 892 1209 1402 65 1304 2031 2779 3213 923 1563 2292 2750 655 962 1265 1437 66 1216 1887 2604 3035 1084 1739 2432 2856 585 978 1424 1701 67 1007 1575 2206 2602 1125 1775 2472 2901 1451 2102 2755 3155 68 1250 1965 2710 3148 1016 1676 2423 2890 867 1329 1819 2110 69 1168 1812 2511 2941 1294 2070 2915 3444 1178 1824 2562 3005 70 599 931 1287 1498 641 1037 1466 1721 499 790 1106 1293 71 1120 1712 2350 2741 978 1522 2096 2434 1128 1681 2258 2608 72 804 1267 1778 2098 912 1444 2035 2403 1185 1803 2455 2858 73 985 1544 2158 2540 1152 1800 2511 2956 981 1536 2149 2530 74 703 1040 1368 1545 1367 2221 3147 3710 777 1125 1469 1671
X Tabellarischer Anhang
121
Fortsetzung 2 Tab. A1:
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
75 773 1144 1496 1680 1117 1842 2644 3145 1288 1963 2664 3073 76 1357 2045 2754 3174 1143 1857 2616 3067 912 1408 1921 2218 77 1312 1964 2636 3036 1204 1856 2523 2913 696 1082 1489 1732 78 1068 1609 2170 2507 1014 1700 2430 2870 497 738 984 1129 79 1113 1718 2359 2743 1374 2330 3420 4113 771 1165 1568 1806 80 994 1485 1983 2266 1306 2097 2949 3474 361 555 751 767 81 955 1414 1876 2147 1139 1767 2425 2825 1525 2310 3137 3638 82 786 1182 1572 1787 1152 1803 2494 2904 1034 1582 2164 2511 83 487 820 1237 1511 938 1494 2113 2500 769 1189 1648 1924
X Tabellarischer Anhang
122
Tab. A2: Ergebnisse der „maximalen Aggregation“ (AU) von 83 klinische gesunden
Hunden gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer Messzeit von 6, 8, 10 und
12 min. Zum Einsatz kamen die Agonisten ADP (10 µmol/L), Kollagen (5 µg/mL) und AS (1
mmol/L).
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
1 131,6 141,0 153,4 156,0 185,3 205,9 216,0 219,4 133,5 145,1 149,6 152,3 2 105,8 115,1 121,5 126,0 138,8 152,3 158,3 160,5 123,0 132,8 136,9 141,0 3 200,6 225,8 240,0 244,1 204,4 238,5 259,9 270,8 51,8 57,4 64,5 70,5 4 144,8 163,9 177,8 182,6 180,8 204,0 219,0 226,9 160,5 176,3 186,4 192,8 5 127,1 141,1 145,9 148,9 134,6 149,3 160,1 165,8 115,1 128,3 137,3 142,5 6 178,9 193,1 203,6 208,1 157,1 177,4 188,6 193,5 156,0 174,4 185,3 192,0 7 84,4 92,6 99,4 105,0 97,9 107,6 115,1 116,6 85,5 91,1 100,5 103,1 8 107,3 113,6 120,4 124,1 169,5 188,3 200,3 205,9 137,6 160,1 174,0 177,4 9 98,3 107,6 118,5 124,5 122,6 145,9 159,0 166,9 96,8 106,5 111,8 115,5 10 147,4 161,6 171,4 176,6 186,8 207,8 218,3 220,5 157,1 165,0 171,0 171,4 11 158,3 173,6 176,6 180,4 193,5 211,9 222,0 223,5 90,0 94,9 97,5 98,3 12 180,8 193,5 196,9 197,3 184,9 208,5 223,5 229,1 85,9 92,6 97,5 100,1 13 145,9 161,3 170,6 171,4 156,4 171,0 174,0 175,1 145,9 161,6 163,1 164,6 14 133,5 149,3 160,9 165,4 147,4 171,8 187,5 195,4 138,8 155,3 165,0 170,6 15 121,1 124,5 124,5 125,3 179,6 198,0 209,3 213,4 109,1 114,4 114,8 116,6 16 145,9 164,6 176,3 180,4 184,5 200,6 204,4 205,1 173,6 195,8 208,1 265,1 17 156,4 170,6 176,3 177,0 166,5 197,6 216,0 222,0 154,1 166,5 168,8 168,8 18 142,9 154,1 162,0 167,3 177,8 193,1 195,8 196,1 149,3 170,6 186,0 190,1 19 122,6 135,0 147,4 151,9 137,6 152,6 161,6 164,6 133,9 151,1 168,4 175,1 20 136,1 149,3 162,8 166,9 196,5 214,9 223,1 224,3 72,0 80,3 82,1 82,9 21 156,8 179,6 186,0 187,1 193,5 214,9 228,8 232,5 106,1 120,4 122,6 122,6 22 108,8 117,8 121,9 122,3 183,0 217,1 230,6 232,5 82,5 96,4 99,8 100,9 23 203,6 221,3 227,6 234,0 193,1 207,8 214,1 215,3 146,6 158,6 158,6 161,3 24 173,3 188,6 193,5 197,3 213,4 231,0 240,8 241,5 107,3 119,6 127,9 131,6 25 110,3 110,3 110,3 110,3 164,6 176,3 178,5 178,5 120,0 122,3 126,4 131,6 26 124,9 141,0 145,5 146,6 159,4 179,6 189,8 192,8 75,4 84,0 90,0 91,9 27 120,0 122,3 122,6 124,5 144,8 158,6 166,1 171,0 175,9 189,8 196,1 197,3 28 106,9 116,3 120,0 120,4 189,0 219,0 238,1 245,6 149,3 168,4 182,6 186,8 29 47,3 49,9 54,0 55,9 152,6 187,5 203,3 204,0 108,8 121,1 130,1 133,5 30 136,5 147,4 154,9 155,6 161,3 167,3 168,8 169,1 177,4 178,1 178,1 178,1 31 158,3 175,5 188,3 193,5 181,5 198,4 210,4 215,6 186,0 205,5 217,9 219,8 32 181,9 189,0 190,9 191,6 205,9 225,0 236,6 243,4 204,4 221,6 227,6 228,0 33 157,1 170,3 178,9 184,9 147,4 164,6 177,0 181,1 208,5 231,4 252,8 259,5 34 169,1 182,6 188,3 189,4 163,1 181,5 191,3 209,9 153,8 163,9 164,6 165,0 35 94,1 104,6 113,6 114,8 133,1 148,1 154,9 156,4 90,4 99,8 107,6 110,3 36 114,8 127,1 133,9 134,3 164,3 182,3 189,8 192,4 93,8 97,9 100,5 101,3 37 111,8 118,5 120,8 121,1 187,1 202,9 207,0 207,4 150,8 154,1 155,3 157,1
X Tabellarischer Anhang
123
Fortsetzung 1 Tab. A2:
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
38 154,5 165,8 175,5 178,1 169,1 189,0 200,6 202,5 186,4 201,8 205,1 209,3 39 141,0 153,0 159,4 163,1 142,9 159,4 170,3 170,6 154,5 165,4 167,3 167,6 40 107,6 119,3 124,1 124,5 201,0 225,8 236,6 238,9 60,8 60,8 60,8 61,5 41 130,9 142,9 148,9 153,4 141,0 151,1 154,1 154,5 97,9 109,9 116,6 121,9 42 183,0 191,3 192,4 192,4 195,8 216,8 223,1 223,5 62,3 63,4 63,4 63,4 43 141,4 158,6 166,5 172,5 175,9 197,6 205,5 211,9 165,8 182,6 186,0 187,9 44 194,3 208,5 214,9 217,5 208,1 226,0 232,5 233,6 177,4 195,8 204,8 206,3 45 111,4 120,0 124,9 125,3 153,4 165,0 171,0 173,3 127,5 133,1 133,1 133,5 46 140,3 154,4 157,1 157,9 207,4 225,8 237,0 240,0 172,9 182,6 190,5 192,0 47 126,4 134,6 134,6 135,0 158,3 183,4 195,8 201,0 123,0 136,5 138,8 139,9 48 121,1 127,5 130,1 130,1 137,6 145,5 154,5 157,5 121,1 121,1 121,1 121,1 49 92,3 100,9 104,3 106,5 197,3 214,5 222,0 225,4 90,0 103,1 112,5 114,8 50 142,1 148,1 148,9 149,3 151,5 175,1 186,8 189,9 70,5 71,3 74,3 75,8 51 120,4 131,3 140,3 144,0 145,1 157,5 166,5 170,3 136,9 147,4 150,8 153,8 52 140,3 154,1 162,0 166,9 161,3 168,8 170,6 171,4 146,3 154,5 160,1 160,1 53 144,4 160,9 171,0 176,3 175,1 198,0 208,1 211,5 126,4 135,4 138,0 138,4 54 196,5 204,8 204,8 204,8 198,0 212,6 216,0 216,4 96,8 102,4 102,8 103,9 55 91,9 97,9 102,0 102,8 184,5 195,0 197,3 198,4 122,6 127,1 127,1 127,5 56 111,8 126,4 133,1 136,5 139,1 154,1 162,4 165,0 97,1 99,4 99,4 101,3 57 164,6 178,9 186,0 186,4 173,3 185,6 195,0 200,3 161,6 173,6 179,6 181,5 58 118,9 132,8 148,9 154,9 165,0 183,8 187,5 187,9 144,8 155,6 157,9 157,9 59 136,5 149,3 154,5 156,0 204,0 220,1 229,5 232,9 160,1 163,5 163,5 163,9 60 159,8 181,5 188,6 192,0 178,9 201,0 203,6 204,8 104,3 122,3 131,3 134,3 61 163,1 169,1 169,1 169,5 201,4 234,8 246,0 247,9 63,4 68,3 70,1 70,9 62 117,4 129,8 133,1 136,1 149,3 163,5 168,4 169,5 114,4 133,9 147,0 151,5 63 160,1 171,4 177,8 178,1 154,1 173,3 183,0 187,5 137,6 140,6 140,6 141,0 64 147,8 154,1 154,5 154,5 200,6 219,4 224,6 225,8 87,4 91,1 91,5 95,3 65 197,3 210,0 213,0 213,4 162,8 195,8 216,4 225,8 88,9 89,6 89,6 90,8 66 179,6 199,1 206,3 209,6 177,8 191,3 202,1 203,6 100,1 120,0 132,0 138,4 67 148,1 171,4 186,0 192,0 172,5 192,0 202,5 208,5 183,0 186,4 187,5 187,9 68 191,6 208,1 212,3 212,3 172,1 201,0 219,4 228,0 124,5 137,3 140,6 143,6 69 171,8 190,9 202,9 210,4 204,8 232,9 247,5 255,8 176,3 197,3 210,4 214,9 70 88,5 97,1 101,6 105,8 105,8 117,8 124,5 126,0 76,9 87,0 91,5 93,4 71 159,0 175,5 185,3 190,1 148,5 159,4 164,3 164,6 150,4 160,1 165,8 168,8 72 122,3 139,1 151,5 156,8 139,5 160,5 173,6 178,9 166,9 179,6 189,4 195,8 73 147,4 168,4 180,4 188,3 171,8 192,8 209,3 217,1 147,4 166,9 180,0 184,1 74 95,6 96,0 96,0 96,4 225,4 254,3 267,0 269,6 100,1 100,5 100,5 100,9 75 104,6 106,1 106,1 106,1 190,1 218,3 234,4 241,1 183,8 196,9 199,5 199,9 76 189,8 199,1 201,8 204,0 190,1 209,6 218,6 218,6 135,8 143,3 147,0 147,4 77 179,6 189,8 192,4 193,1 180,0 187,9 190,1 190,5 104,6 112,9 117,4 119,6 78 148,5 157,1 160,9 163,1 183,4 201,8 210,0 212,3 67,5 69,4 71,6 73,5 79 162,8 177,8 184,9 187,1 247,5 291,0 323,3 337,5 107,6 13,6 115,9 117,4
X Tabellarischer Anhang
124
Fortsetzung 2 Tab. A2:
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
80 135,0 141,0 143,3 143,3 211,1 233,6 246,8 253,1 51,8 56,6 57,0 51,4 81 127,9 130,9 131,3 132,8 171,4 181,5 189,0 193,5 212,3 229,1 238,1 244,1 82 111,0 112,5 112,5 113,3 176,6 190,9 198,4 199,1 146,6 160,9 167,3 168,4 83 78,0 106,9 127,5 139,5 145,1 169,1 181,1 190,5 112,9 135,3 133,5 135,8
X Tabellarischer Anhang
125
Tab. A3: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) von 117 Hunden (134 Proben)
mit verschiedenen Erkrankungen gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer
Messzeit von 6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kamen die Agonisten ADP (10 µmol/L),
Kollagen (5 µg/mL) und AS (1 mmol/L).
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
1 1376 1581 1745 1818 2123 3237 4348 4983 2306 3343 4455 5150 2 1186 1800 2527 3005 1436 2157 2914 3373 1550 2315 3128 3620 3 803 1379 1567 1765 757 1392 1629 1872 233 358 402 443 4 725 1064 1409 1612 630 1028 1469 1680 1245 1950 2733 3214 5 1572 2408 3307 3862 1673 2672 3724 4307 2002 2920 3816 4347 6 1023 1549 2092 2406 985 1619 2278 2653 601 904 1203 1370 7 1967 2962 4005 4638 1483 2429 3443 4042 1112 1642 2226 2595 8 741 1226 1762 2068 821 1459 2142 2438 795 1373 2083 2537 9 1149 1758 2406 2764 1152 1899 2729 3142 641 929 1233 1417 10 930 1464 2031 2375 919 1527 2161 2540 837 1306 1795 2086 11 981 1539 2165 2558 796 1304 1856 2194 669 1005 1369 1592 12 1057 1606 2205 2577 1153 1818 2546 2984 1133 1754 2413 2810 13 816 1262 1735 2016 886 1474 2142 2529 775 1194 1645 1917 14 804 1200 1617 1857 679 1140 1633 1873 191 310 452 529 15 433 631 839 960 1416 2191 2991 3436 1228 1876 2559 2970 16 798 1266 1773 2083 467 735 1025 1193 675 1042 1449 1694 17 828 1255 1704 1975 1004 1600 2218 2553 1002 1475 1959 2236 18 864 1389 1948 2283 770 1296 1880 2223 675 1060 1485 1728 19 736 1200 1712 2016 956 1576 2236 2554 877 1409 2001 2363 20 956 1451 1970 2274 1193 1829 2447 2787 1235 1878 2549 2951 21 798 1205 1627 1871 1150 1815 2512 2912 742 1144 1587 1859 22 39 90 181 243 173 295 445 547 392 634 915 1100 23 498 726 946 1068 893 1413 1972 2201 263 389 516 584 24 232 331 426 472 189 328 478 519 638 960 1308 1517 25 1293 1879 2453 2786 911 1615 2379 2834 660 988 1334 1540 26 61 95 136 154 167 276 388 429 954 1512 2130 2510 27 1303 1956 2660 3086 1725 2689 3716 4341 1184 1760 2384 2755 28 1467 2240 3032 3510 1160 1868 2641 3084 1434 2144 2901 3365 29 1095 1670 2226 2533 750 1317 1914 2225 364 553 757 874 30 451 702 954 1095 700 1137 1579 1771 215 337 473 552 31 1959 2985 4035 4618 1716 2859 4138 4932 1820 2811 3831 4484 32 714 1098 1498 1717 919 1622 2385 2708 720 1131 1589 1855 33 998 1572 2198 2588 1212 2005 2843 3314 1161 1826 2514 2922 34 993 1427 1784 1936 705 1215 1777 2020 1237 1865 2507 2885 35 937 1404 1888 2182 643 1080 1563 1756 715 1121 1557 1820 36 782 1261 1779 2093 807 1468 2226 2641 608 973 1373 1600 37 1030 1601 2194 2548 968 1554 2193 2582 593 895 1198 1374
X Tabellarischer Anhang
126
Fortsetzung 1 Tab. A3:
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
38 1039 1690 2375 2764 982 1731 2536 3009 1084 1763 2493 2932 39 1256 1940 2598 2958 442 758 1103 1292 1098 1668 2269 2613 40 457 725 1007 1167 751 1263 1817 2053 1774 2638 3524 4065 41 258 374 494 562 1057 1885 2809 3335 299 447 615 718 42 1200 1835 2489 2873 1425 2141 2897 3344 582 984 1435 1699 43 26 43 66 69 401 882 1606 2076 242 393 571 675 44 181 352 572 681 578 1292 2228 2848 223 393 603 722 45 340 532 732 843 284 477 699 810 233 378 547 649 46 102 147 191 205 70 107 142 153 150 242 343 397 47 896 1403 1934 2234 482 888 1343 1575 856 1362 1912 2237 48 940 1392 1873 2162 1229 1981 2776 3256 472 749 1064 1259 49 1630 2531 3509 4121 2010 3109 4293 4980 1537 2314 3134 3629 50 1443 2195 2972 3437 1120 1921 2822 3245 1070 1619 2181 2503 51 633 980 1320 1484 999 1558 2137 2427 579 901 1215 1390 52 924 1372 1853 2138 825 1304 1840 2164 900 1382 1899 2217 53 597 749 910 1000 1482 2317 3221 3704 1529 2226 2888 3268 54 1281 1932 2582 2957 987 1702 2493 2921 519 758 1016 1166 55 302 490 696 812 437 766 1071 1190 227 342 474 551 56 788 1290 1835 2163 695 1332 2075 2464 402 652 937 1113 57 1516 2326 3231 3803 1994 2994 3960 4508 332 506 695 803 58 1177 1870 2577 2973 1445 2347 3316 3833 1275 1857 2371 2651 59 1477 2168 2814 3176 1274 2022 2817 3255 1564 2364 319 3547 60 735 1139 1575 1846 1213 1991 2819 3307 248 413 595 695 61 1408 2230 3143 3720 1213 1935 2724 3154 1280 1965 2716 3183 62 772 1157 1547 1773 896 1550 2190 2478 354 559 779 909 63 1392 2243 3211 3827 774 1374 2069 2455 872 1310 1763 2033 64 1017 1574 2123 2427 1033 1732 2461 2847 515 780 1067 1242 65 1257 1989 2765 3236 1163 1855 2588 2958 138 202 272 309 66 742 1159 1599 1861 957 1634 2417 2892 813 1237 1704 1989 67 493 766 1038 1187 729 1153 1560 1755 278 427 585 675 68 587 911 1236 1412 961 1552 2175 2496 261 393 536 617 69 682 960 1223 1368 1719 2652 3638 4174 442 661 883 1011 70 802 1069 1281 1388 1020 1743 2514 2953 404 525 641 703 71 611 948 1278 1462 737 1256 1790 2061 371 566 778 902 72 375 670 1021 1233 290 516 787 954 365 565 793 933 73 858 1328 1824 2120 844 1328 1837 2060 870 1308 1775 2057 74 1291 1798 2244 2483 1331 2084 2881 3362 192 304 425 494 75 860 1336 1836 2138 738 1160 1608 1849 494 795 1127 1324 76 760 1209 1629 1838 852 1400 1972 2293 162 249 345 396 77 1051 1669 2345 2758 1038 1619 2251 2638 1028 1628 2278 2670 78 837 1382 1955 2290 992 1730 2564 3060 200 339 502 594 79 1801 2833 3895 4542 1833 2980 4211 4926 418 657 917 1071
X Tabellarischer Anhang
127
Fortsetzung 2 Tab. A3:
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
80 1196 1836 2463 2817 1050 1740 2470 2897 1075 1694 2337 2714 81 1376 2082 2810 3256 1149 1881 2721 3258 982 1499 2014 2303 82 958 1479 2006 2305 1073 1743 2456 2890 473 675 888 1014 83 1179 1793 2410 2761 1705 2795 3989 4726 546 870 1217 1429 84 1320 2133 3010 3541 1490 2376 3273 3791 1183 1835 2533 2965 85 1346 2255 3318 3980 1597 2615 3749 4449 1323 2128 3033 3598 86 1382 2222 3124 3667 1905 3159 4493 5306 1271 1991 2761 3231 87 921 1496 2081 2415 1110 1991 2939 3509 687 1055 1450 1692 88 834 1290 1760 2036 837 1426 2077 2472 836 1303 1812 2123 89 1070 1588 2135 2455 1162 1792 2419 2781 624 888 1152 1304 90 499 742 992 1140 1529 2437 3400 3990 517 786 1075 1248 91 749 1128 1509 1726 1139 1762 2379 2731 900 1361 1833 2103 92 701 1142 1620 1916 768 1359 2008 2408 293 461 644 749 93 992 1577 2218 2615 1126 1848 2641 3134 503 883 1334 1623 94 1052 1619 2205 2544 1116 1807 2558 3022 999 1510 2038 2346 95 338 582 844 999 1656 2859 4173 4972 452 727 1035 1227 96 733 1163 1609 1863 1177 1987 2853 3374 555 846 1166 1358 97 1044 1726 2519 3034 654 1073 1572 1896 317 481 661 765 98 2072 3092 4145 4772 2622 3974 5329 6122 1084 1874 2761 3311 99 700 1095 1512 1750 1082 1750 2463 2891 543 785 1028 1821
100 1660 2614 3643 4284 1533 2450 3443 4044 1007 1601 2240 2626 101 512 796 1085 1247 742 1318 1933 2293 302 469 650 755 102 1825 2756 3762 4381 2365 3575 4854 5634 1754 2549 3330 3773 103 1029 1590 2147 2459 934 1559 2317 2848 562 882 1219 1420 104 765 1312 1923 2292 1028 1845 2704 3204 616 998 1407 1648 105 441 698 1004 1198 989 1605 2302 2749 400 620 877 1037 106 870 1358 1869 2183 1230 1953 2711 3165 782 1186 1615 1874 107 194 309 426 486 661 1117 1616 1922 162 301 476 586 108 140 265 416 505 397 788 1261 1563 638 935 1240 1417 109 624 951 1260 1426 788 1304 1851 2182 336 522 713 819 110 779 1223 1707 2003 931 1555 2223 2626 354 584 843 997 111 417 675 932 1070 1093 1913 2772 3275 172 284 417 499 112 566 867 1188 1378 1124 1843 2588 3031 501 752 1024 1187 113 1437 2078 2695 3032 1432 2271 3147 3672 339 514 706 818 114 306 527 799 973 747 1329 2015 2453 243 388 555 656 115 1633 2577 3506 4037 1816 3159 4672 5620 757 1146 1570 1829 116 710 1136 1585 1855 886 1479 2097 2457 488 776 1097 1290 117 502 774 1065 1241 1850 2854 3806 4347 418 653 915 1076 118 1142 1941 2844 3425 1438 2521 3742 4522 331 523 747 887 119 1249 1846 2473 2849 1781 2750 3714 4271 916 1431 2000 2345 120 394 652 934 1104 464 865 1275 1501 348 551 780 920 121 1766 2723 3733 4342 2123 3431 4811 5668 789 1222 1699 1997 122 480 743 1024 1195 633 1123 1669 2012 738 1127 1554 1819 123 1544 2401 3287 3807 1014 1622 2260 2645 556 894 1273 1506
X Tabellarischer Anhang
128
Fortsetzung 3 Tab. A3:
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
124 1361 2094 2883 3362 1376 2283 3306 3940 569 896 1250 1461 125 480 739 1016 1186 1003 1625 2315 2741 606 998 1446 1728 126 873 1440 2069 2466 949 1807 2825 3488 356 585 847 1011 127 902 1507 2162 2560 1244 2272 3448 4183 632 1023 1477 1769 128 363 566 793 929 484 848 1259 1506 338 554 805 960 129 1764 2653 3602 4181 2040 3268 4649 5518 2003 3060 4208 4917 130 555 876 1199 1376 683 1173 1735 2091 914 1432 2017 2388 131 94 134 173 188 396 651 935 1107 490 791 1132 1342 132 469 787 1130 1332 603 1118 1712 2080 873 1354 1887 2220 133 746 1112 1456 1634 1464 2397 3417 4047 630 834 1030 1134 134 965 1418 1826 2037 1154 1909 2753 3283 257 446 720 917
X Tabellarischer Anhang
129
Tab. A4: Ergebnisse der „maximalen Aggregation“ (AU) von 117 Hunden (134 Proben)
mit verschiedenen Erkrankungen gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer
Messzeit von 6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kamen die Agonisten ADP (10 µmol/L),
Kollagen (5 µg/mL) und AS (1 mmol/L).
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
1 213,4 213,4 213,4 213,4 320,3 320,3 320,3 327,0 283,9 304,5 323,3 333,4 2 162,0 186,4 222,4 235,5 197,6 210,0 218,3 224,3 210,4 224,6 233,6 235,9 3 112,1 112,9 112,9 113,3 116,3 123,0 128,3 128,3 28,5 28,5 28,5 28,5 4 97,9 97,9 99,4 102,8 105,0 120,8 129,8 132,8 187,5 213,8 225,4 232,9 5 244,6 247,5 261,0 269,3 272,3 393,3 299,6 302,6 261,0 264,0 264,0 266,6 6 143,6 152,6 154,9 155,3 172,5 184,9 187,5 190,1 85,1 87,0 87,0 87,8 7 271,5 289,5 300,0 302,3 251,6 279,8 293,3 298,5 145,1 157,5 173,3 180,8 8 130,1 146,3 155,6 159,4 167,6 190,5 195,8 196,9 139,9 186,4 212,6 219,8 9 164,3 181,5 187,9 187,9 199,1 223,1 245,6 249,8 90,0 93,4 98,3 101,6 10 145,5 156,8 164,6 168,8 163,1 176,3 181,9 183,4 126,4 138,0 140,6 143,3 11 146,3 168,4 185,3 193,9 133,5 150,8 160,5 165,0 90,8 99,8 107,3 111,8 12 147,4 163,9 175,5 180,8 178,5 199,1 213,8 221,6 169,1 181,5 190,9 193,9 13 118,9 133,5 136,1 138,8 151,9 179,3 196,5 204,4 113,3 123,8 130,5 133,5 14 106,9 115,1 121,5 121,5 122,6 136,5 141,4 142,1 31,1 36,4 42,8 78,8 15 55,5 57,8 60,8 63,8 213,0 225,4 228,0 228,0 175,1 190,1 196,9 199,5 16 123,4 138,8 148,9 154,1 73,9 79,5 83,3 85,9 98,6 11,4 118,1 121,9 17 116,6 123,8 129,4 133,5 163,1 173,3 176,6 177,0 131,3 135,4 137,3 138,0 18 141,0 156,0 162,0 162 138,0 157,9 169,5 169,9 103,1 115,5 122,6 123,0 19 121,5 138,0 150,8 156,8 165,8 183,0 191,3 193,1 139,5 159,0 174,0 88,1 20 134,6 144,4 148,1 148,9 177,4 181,1 181,1 181,5 174,8 186,8 192,0 193,9 21 112,1 117,8 121,1 121,1 180,0 196,1 198,8 199,1 109,5 120,4 129,4 135,4 22 9,0 19,5 32,3 37,9 31,9 36,8 49,5 57,8 63,8 72,0 87,0 95,3 23 65,6 65,6 65,6 66 139,9 153,0 160,9 163,1 36,4 36,4 36,8 37,5 24 29,6 29,6 29,6 30,4 35,6 41,6 44,3 44,6 87,0 94,9 100,9 104,6 25 166,9 167,6 167,6 167,6 184,5 208,9 220,5 223,5 90,8 96,0 99,8 102,0 26 10,9 10,9 13,5 13,9 28,5 31,9 33,0 34,1 147,0 168,8 181,9 148,9 27 177,8 192,4 203,3 210 261,0 183,9 295,1 298,1 158,6 169,9 181,1 181,1 28 211,9 222,8 227,6 229,9 187,9 209,6 225,8 229,1 191,6 208,5 219,0 224,3 29 165,0 165,0 165,0 165 149,5 167,3 169,9 170,6 51,8 55,9 59,6 61,5 30 68,3 72,4 73,1 74,3 119,3 127,1 127,5 127,9 31,5 36,8 40,9 43,5 31 280,5 295,5 303,4 305,3 295,5 346,9 375,0 387,0 267,8 291,8 299,6 301,9 32 107,3 111,8 114,8 115,5 183,4 210,4 220,5 220,5 109,1 123,4 133,5 135,0 33 154,1 169,5 184,9 191,3 213,8 232,1 242,3 244,9 179,6 192,8 198,0 198,4 34 128,3 128,3 128,3 128,6 135,0 154,1 163,5 166,1 175,5 180,0 183,8 184,1 35 127,5 136,5 140,3 144 114,4 132,8 140,6 142,9 108,0 119,6 127,1 131,6 36 125,3 142,9 150,0 152,3 167,3 203,6 223,1 229,5 95,3 107,6 118,1 124,5 37 156,0 166,9 169,5 176,6 155,3 175,9 184,5 188,6 84,4 86,6 86,6 87,8
X Tabellarischer Anhang
130
Fortsetzung 1 Tab. A4:
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
38 171,4 192,8 194,6 195,4 196,1 222,4 231,0 232,1 178,9 200,3 211,5 214,1 39 181,5 198,0 198,0 198 80,6 95,3 99,0 99,0 156,8 167,3 171,8 172,1 40 72,4 78,4 81,4 83,3 132,4 152,6 159,8 160,5 240,0 247,5 254,6 259,1 41 31,9 33,8 35,3 39,8 214,5 248,6 269,6 274,1 38,6 46,1 49,9 54,0 42 172,1 184,9 187,5 187,9 195,0 208,9 217,9 220,5 104,3 121,1 132,0 133,5 43 4,1 6,8 7,5 8,6 103,1 171,0 237,8 268,1 39,4 46,9 52,5 54,0 44 40,9 54,8 69,4 73,5 163,9 237,0 288,8 303,8 40,9 54,4 63,8 70,1 45 54,4 55,5 58,5 61,9 50,6 59,6 67,1 68,3 38,3 43,9 51,0 53,3 46 14,6 14,6 14,6 15 11,6 12,4 12,4 12,4 24,4 26,6 30,4 31,9 47 136,9 149,3 151,1 151,9 104,6 124,5 131,3 131,6 135,8 149,3 158,6 162,0 48 124,5 132,0 139,5 142,1 201,0 220,1 228,0 229,9 72,0 85,9 92,6 97,5 49 240,0 266,3 286,9 296,3 296,3 324,4 343,1 351,4 213,0 227,3 236,3 239,6 50 203,3 217,9 222,4 224,6 209,3 243,0 264,0 269,6 151,9 156,8 160,5 160,5 51 96,8 99,4 99,4 99,4 153,8 163,1 166,1 166,1 90,4 91,9 91,9 91,9 52 120,8 132,0 138,8 142,5 126,8 144,4 157,5 163,5 129,0 143,3 151,1 154,5 53 102,0 102,0 102,0 102,8 224,6 246,4 262,1 265,5 199,1 199,1 199,1 199,9 54 180,0 187,1 187,1 190,5 186,4 214,9 232,9 237,4 66,8 70,5 75,4 76,5 55 47,6 56,6 59,6 61,5 91,5 95,6 95,6 95,6 31,1 34,9 39,4 42,8 56 132,8 148,9 157,9 160,5 158,3 197,6 222,8 230,3 63,8 76,9 83,6 90,0 57 213,4 243,8 268,1 279,8 279,8 285,4 285,4 285,4 46,9 52,9 55,1 56,6 58 185,6 202,1 202,9 203,3 240,0 268,5 280,1 282,8 174,0 174,0 174,0 174,0 59 202,5 202,5 202,5 202,9 201,4 220,5 229,5 232,5 223,1 228,0 228,0 228,8 60 108,8 120,0 127,9 134,3 209,3 230,3 237,0 239,6 43,5 49,9 53,3 54,8 61 215,6 246,8 267,4 280,9 191,3 215,3 231,4 237,0 184,1 203,3 218,6 224,6 62 109,5 109,9 112,2 114,4 178,1 187,5 187,5 187,9 55,5 60,8 64,9 66,4 63 218,3 259,5 285,4 299,6 154,9 183,4 207,8 216,8 120,8 126,8 130,1 132,8 64 155,3 159,8 159,8 159,8 189,8 203,6 209,3 209,3 71,6 78,8 85,1 88,5 65 195,8 214,5 223,9 228,4 185,6 202,1 210,0 212,3 17,6 19,5 20,3 20,3 66 114,4 121,5 127,1 130,5 171,4 209,3 232,9 240,4 111,8 126,0 136,9 139,1 67 74,3 79,1 79,1 79,1 120,4 121,5 121,5 121,9 40,5 43,5 46,1 48,4 68 91,9 93,0 93,4 93,8 159,0 172,9 178,5 179,3 36,8 39,8 41,3 43,5 69 81,4 81,4 81,4 81,4 252,8 274,1 282,0 286,1 60,8 63,0 63,8 64,5 70 97,5 97,5 97,5 98,6 190,1 214,1 220,5 221,3 56,6 56,6 56,6 56,6 71 93,8 96,4 96,4 96,8 139,1 151,1 152,3 153,0 53,3 58,9 61,5 64,5 72 73,1 91,5 104,6 107,3 56,6 71,3 81,4 86,6 52,9 61,5 67,1 70,9 73 127,1 138,8 142,1 145,5 130,1 141,8 145,9 146,3 119,3 127,9 135,4 137,6 74 162,4 162,4 162,4 163,1 202,5 221,3 228,4 231,4 30,0 33,4 36,8 37,5 75 128,3 138,4 145,5 148,5 112,9 124,5 129,4 130,5 79,5 91,1 97,1 99,4 76 121,9 129,4 129,4 130,1 145,5 160,1 163,9 165,0 22,1 25,9 29,3 30,0 77 163,1 185,3 195,8 199,5 154,9 172,1 184,5 189,0 158,6 178,5 187,9 191,6 78 141,8 162,0 163,9 165 190,5 225,4 246,8 256,9 35,6 43,1 48,0 49,9 79 279,8 300,4 304,1 309,8 304,1 339,4 354,8 359,3 62,6 71,3 76,5 77,6
X Tabellarischer Anhang
131
Fortsetzung 2 Tab. A4:
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
80 179,6 181,9 181,9 182,3 182,6 204,4 208,5 208,5 169,5 181,1 183,4 184,5 81 193,5 203,6 208,9 216,4 189,0 224,3 250,1 263,3 144,0 147,8 147,8 148,1 82 142,9 149,3 151,1 151,5 180,8 196,5 204,4 208,9 57,0 58,5 62,6 64,1 83 169,5 175,5 176,3 176,6 285,8 325,9 347,3 356,3 86,6 94,9 103,1 104,6 84 212,6 242,3 252,0 254,3 242,3 255,8 255,8 256,1 174,4 192 202,1 206,3 85 227,6 284,6 312,8 316,5 265,5 306,4 330 334,1 211,9 244,9 266,3 272,6 86 225,8 249,0 259,5 261,4 340,9 368,3 382,5 387,0 192,4 210,8 223,5 226,1 87 157,1 167,6 167,6 167,6 230,6 262,9 272,3 274,1 98,3 109,1 115,5 118,1 88 123,8 132,4 135,8 136,5 154,9 176,6 188,6 193,1 124,9 140,3 148,1 152,3 89 142,5 152,3 156 157,1 173,3 179,6 179,6 180,4 80,3 80,3 80,3 80,3 90 69,0 70,1 73,1 75,4 245,3 265,9 278,6 284,3 71,6 78,8 85,9 87,4 91 104,6 109,5 109,5 109,9 173,6 178,1 178,1 178,1 125,6 134,3 135,4 135,4 92 118,1 130,9 139,9 145,5 154,9 175,9 190,1 195,0 43,5 50,3 53,3 54,8 93 156,4 174,8 186,4 193,5 190,5 216 231,4 236,6 91,9 120 135,4 141,0 94 154,5 165,0 166,9 166,9 182,3 205,9 220,1 223,1 139,9 148,1 149,6 151,1 95 61,9 72,8 76,1 79,5 315,4 359,6 379,9 388,5 72,0 82,9 92,3 96,4 96 116,3 124,5 128,3 128,3 213,8 239,6 247,5 249,0 76,9 87,8 94,1 96,8 97 175,1 210,0 238,5 254,3 105,8 130,9 149,6 162,0 45,4 49,1 52,9 54,8 98 280,1 296,3 300,0 300,8 373,5 385,9 386,6 387,0 204,0 240,0 259,1 268,1 99 105,8 116,3 119,3 119,6 179,3 196,9 205,5 207,4 68,3 69,8 70,5 111,0
100 254,3 282,4 301,5 310,9 242,3 273,8 286,9 289,5 157,1 176,3 183,8 185,6 101 78,4 82,5 82,9 82,9 150,4 172,1 175,5 175,9 45,4 49,1 53,3 54,0 102 252,4 276,8 292,1 297,4 327,8 354,4 367,1 371,6 220,5 228,4 228,4 229,9 103 154,9 162,0 162,0 162 163,9 188,3 238,9 268,5 86,3 93,4 97,9 99,4 104 141,8 165,8 176,7 181,1 218,6 241,5 244,1 245,3 103,1 111,4 117,4 119,3 105 66,4 80,3 93,0 98,3 159,4 186,0 209,3 222,0 57,8 67,1 78,0 80,3 106 133,5 141,8 149,6 155,6 196,9 210,0 219,0 220,5 108,8 118,9 124,5 127,5 107 30,4 34,5 34,5 35,5 119,6 137,6 145,1 149,6 31,5 45,0 54,8 57,4 108 32,3 40,9 45,0 47,3 96,4 124,5 141,8 148,9 80,6 85,9 87,0 88,5 109 92,6 93,4 93,4 94,1 136,9 153,0 157,5 159,8 49,9 54,0 55,1 55,1 110 117,4 133,1 141,0 144 166,5 184,1 191,3 193,9 59,6 70,1 75,4 78,8 111 69,0 74,3 74,3 74,6 216,0 241,5 243,8 244,5 28,9 34,5 39,8 44,3 112 81,4 88,1 93,0 95,3 194,3 210,4 212,3 212,6 67,9 73,5 79,5 82,5 113 181,5 183,8 183,8 184,1 226,9 244,5 249,8 252,8 47,3 51,4 56,3 57,4 114 54,4 70,1 83,3 90,4 144,4 182,3 204,8 213,4 38,3 44,6 50,6 54,8 115 260,6 270,0 270,0 270 343,5 409,1 444,8 458,6 107,6 114,8 123,4 128,3 116 114,0 125,6 128,3 132 159,8 173,3 175,9 176,6 75,8 87,4 94,1 95,6 117 74,3 79,9 85,1 10,4 286,9 288,4 288,4 288,4 61,1 71,3 77,3 82,1 118 206,6 241,9 269,3 283,5 283,9 327,4 361,1 376,5 49,1 58,1 69,0 72,4 119 163,1 174,8 179,6 184,1 269,6 276,0 276,0 276,4 136,9 153,8 166,1 167,0 120 69,8 76,9 82,1 85,9 105,0 119,3 119,3 119,3 52,5 61,5 68,3 71,6 121 256,9 280,9 288,8 290,6 342,8 383,3 405,0 412,1 114,8 129,0 140,3 148,5 122 70,9 76,9 83,3 87 126,8 147,4 159,8 412,1 104,6 114,4 126,0 129,0 123 231,0 249,8 251,3 252 164,6 177,8 182,6 168,0 89,6 101,6 111,0 117,0
X Tabellarischer Anhang
132
Fortsetzung 3 Tab. A4:
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 6 8 10 12 6 8 10 12 6 8 10 12
124 196,5 217,5 228,4 232,1 235,5 275,6 299,6 307,5 86,6 96,4 102,8 106,1 125 70,1 74,6 81,8 87,8 163,5 186,8 203,3 209,3 101,6 120,4 132,4 140,3 126 147,0 170,3 185,6 195,8 214,1 267,4 307,1 322,9 58,9 69,4 78,8 83,6 127 161,3 180,4 188,6 195,8 262,9 315,4 246,9 359,6 98,3 120,4 135,0 145,1 128 54,0 61,5 66,8 69 93,8 110,3 119,3 122,6 54,8 67,5 74,3 80,6 129 242,3 261,4 275,3 282,8 319,5 371,6 407,3 420,8 282,0 314,3 336,4 348,4 130 89,6 93,0 93,0 93,4 124,5 149,3 168,4 175,9 138,0 156,8 174,8 183,4 131 15,4 15,4 15,4 15,4 66,8 77,6 84,0 86,6 79,1 90,4 102,0 107,3 132 85,9 94,1 99,8 100,9 129,4 157,9 176,3 181,9 127,9 145,5 158,3 165,4 133 103,9 104,3 104,3 105 246,0 277,1 296,3 305,6 73,1 73,1 73,1 73,1 134 129,0 130,1 130,1 130,9 197,3 227,6 251,6 262,1 45,4 63,4 91,1 103,9
X Tabellarischer Anhang
133
Tab. A5: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) von 8 Proben Clopidogrel-
behandelter Hunde gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer Messzeit von
6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kam der Agonist ADP (10 µmol/L).
Probe Nr. Dosierung 6 min 8 min 10 min 12 min 1 4 mg/kg 184 334 516 612 2 3 mg/kg 379 656 984 1160 3 4 mg/kg 316 550 835 993 4 4 mg/kg 282 485 735 872 5 2 mg/kg 301 513 761 889 6 2 mg/kg 299 494 712 823 7 2 mg/kg 232 416 637 752 8 2 mg/kg 310 540 820 965
Tab. A6: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) von 8 Proben Clopidogrel-
behandelter Hunde gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer Messzeit von
6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kam der Agonist AS (1 mmol/L).
Probe Nr. Dosierung 6 min 8 min 10 min 12 min 1 4 mg/kg 323 516 753 877 2 3 mg/kg 422 644 886 1016 3 4 mg/kg 372 602 850 972 4 4 mg/kg 407 661 950 1100 5 2 mg/kg 207 341 493 565 6 2 mg/kg 97 156 218 246 7 2 mg/kg 320 482 654 737 8 2 mg/kg 196 315 444 500
X Tabellarischer Anhang
134
Tab. A7: Ergebnisse der maximalen Aggregation (AU) von 8 Proben Clopidogrel-
behandelter Hunde gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer Messzeit von
6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kam der Agonist ADP (10 µmol/L).
Probe Nr. Dosierung 6 min 8 min 10 min 12 min 1 4 mg/kg 38,6 46,9 56,3 60,0 2 3 mg/kg 70,1 85,9 99,8 107,3 3 4 mg/kg 58,5 73,9 88,9 96,8 4 4 mg/kg 51,8 63,8 79,5 84,0 5 2 mg/kg 53,6 65,3 73,9 77,6 6 2 mg/kg 52,1 58,5 64,5 68,6 7 2 mg/kg 45,0 57,0 67,1 70,1 8 2 mg/kg 55,9 73,9 83,3 88,5
Tab. A8: Ergebnisse der maximalen Aggregation (AU) von 8 Proben Clopidogrel-
behandelter Hunde gemessen mit dem Multiplate® Aggregometer nach einer Messzeit von
6, 8, 10 und 12 min. Zum Einsatz kam der Agonist AS (1 mmol/L).
Probe Nr. Dosierung 6 min 8 min 10 min 12 min 1 4 mg/kg 48,0 62,3 71,6 74,6 2 3 mg/kg 60,8 64,9 73,5 82,5 3 4 mg/kg 59,6 67,5 72,8 73,9 4 4 mg/kg 66,8 76,9 85,1 89,6 5 2 mg/kg 34,5 42,0 45,5 45,8 6 2 mg/kg 16,9 17,3 19,1 22,1 7 2 mg/kg 42,8 46,1 50,6 50,6 8 2 mg/kg 32,3 36,0 36,8 37,1
X Tabellarischer Anhang
135
Tab. B1: Signalement, Diagnose und Gruppenzugehörigkeit der 25 Hunde mit entzündlichen
Erkrankungen.
Hund Nr. Rasse
Alter (Jahre; Monate)
Geschlecht Diagnose Gruppe
1 Airedale Terrier 3;9 w Abszess NonSIRS 2 Beagle 1;1 w Leptospirose SIRS 3 Bracke 12;3 m Prostatitis NonSIRS 4 Kleiner Münsterländer 1;5 m Prostatitis SIRS 5 Border Collie 8;2 w Pyometra SIRS 6 Gordon Setter 0;9 w Abszess SIRS 7 Deutscher Schäferhund 2;8 m Abszess SIRS 8 Golden Retriever 7;0 m Leptospirose SIRS 9 Briard 1;1 w Bronchopneumonie SIRS 10 Mischling 1;0 mk Bronchopneumonie SIRS 11 Mischling 5;9 wk Leishmaniose NonSIRS 12 Beagle 3;8 w Abszess SIRS 13 Entlebucher Sennenhund 6;1 w Leishmaniose SIRS 14 Mischling 9;0 m Sepsis SIRS 15 Am. Staffordshire Terrier 1;0 w Leptospirose NonSIRS 16 Alano 8;0 m Abszess SIRS 17 Mischling 7;6 wk Bronchopneumonie SIRS 18 Rhodesian Ridgeback 7;1 wk Leishmaniose NonSIRS 19 Hovawart 0;11 m Abszess NonSIRS 20 Bordeaux-Dogge 7;11 m Prostatitis SIRS 21 Labrador 8;6 w Peritonitis NonSIRS 22 Golden Retriever 9;8 w Pyometra NonSIRS 23 Norfolk Terrier 9;11 m Pankreatitis SIRS 24 Dobermann 1;4 w Pyometra NonSIRS 25 Am. Cocker Spaniel 5;10 w Pankreatitis NonSIRS w = weiblich; m = männlich; wk = weiblich kastriert; mk = männlich kastriert
X Tabellarischer Anhang
136
Tab. B2: Befunde (rektale Körpertemperatur, Leukozytenzahl, Herz- und Atemfrequenz,
Allgemeinbefinden) der 25 an entzündlichen Erkrankungen leidenden Hunde, auf deren
Grundlage die Einteilung in die Gruppen „SIRS“ und „NonSIRS“ stattfand.
AF = Atemfrequenz, FA = Futteraufnahme, HF = Herzfrequenz, na = nicht angegeben, obB = ohne besonderen Befund, T = Temperatur, WBC = white blood cells (Leukozyten)
Hund Nr. Erkrankung T
(°C) WBC
(10³/µL) HF
(/min) AF
(/min) Allgemein-befinden
1 Abszess 40,6 15,6 obB obB gut 2 Leptospirose 37,5 3,2 120 obB reduziert 3 Prostatitis 38,0 21,7 60 obB apathisch 4 Prostatitis 39,2 24,9 obB obB reduziert 5 Pyometra 39,2 39,5 110 Polypnoe reduziert 6 Abszess 39,2 15,0 130 obB gut 7 Abszess 40,7 19,4 88 obB reduziert 8 Leptospirose 39,2 19,0 110 obB reduziert 9 Bronchopneumonie 39,9 25,5 130 Polypnoe gut 10 Bronchopneumonie 40,7 21,9 88 80 apathisch 11 Leishmaniose 37,3 7,8 obB obB gut, keine FA 12 Abszess 40,4 22,0 130 Polypnoe reduziert 13 Leishmaniose 39,5 4,4 96 obB ruhig 14 Sepsis 38,4 31,7 na Polypnoe apathisch 15 Leptospirose 38,2 37,3 96 obB matt 16 Abszess 40,6 22,4 na Dyspnoe reduziert 17 Bronchopneumonie 39,7 28,6 na Polypnoe gut 18 Leishmaniose 38,4 15,4 116 obB matt 19 Abszess 38,5 11,5 90 obB gut 20 Prostatitis 39,1 13,2 84 96 apathisch 21 Peritonitis 38,7 25,5 90 obB gut 22 Pyometra 38,5 31,4 obB obB gut, keine FA 23 Pankreatitis 38,7 18,7 132 40 apathisch 24 Pyometra 38,7 11,7 108 obB reduziert 25 Pankreatitis 38,2 3,2 90 obB matt, keine FA
X Tabellarischer Anhang
137
Tab. B3: Signalement der 69 klinisch gesunden Hunde und deren Verwendung bei den
verschiedenen Methoden.
Hund Nr. Rasse Alter
(Jahre; Monate) Geschlecht Methode
1 Deutsch Langhaar 4;0 w A,E,F 2 Mischling 7;4 mk A,D,E,F 3 Mischling 6;4 wk A,D,E,F 4 Deutsch Kurzhaar 2;2 mk A,D,E,F 5 NSDT-Retriever 2;0 wk A,D,E,F 6 Australian Shepherd 1;11 W A,D,E,F 7 Beagle 8;0 mk A,D,E,F 8 Leonberger 1;10 M A,D,E,F 9 Jack Russel Terrier 5;5 mk A,D,E,F 10 Mischling 2;11 w A,D,E,F 11 Weimaraner 1;0 m D,E,F 12 Franz. Bulldogge 1;1 m A,D,E,F 13 Boxer 6;9 m A,D,E,F 14 Mischling 3;4 m A,D,E,F 15 Mischling 4;10 w A,D,E,F 16 Boxer 1;9 m D,E,F 17 Labrador 2;0 wk A,B,D,C,E,F 18 Labrador 2;10 mk A,B,E,F 19 Mischling 8;0 mk B,C,D,E,F 20 Deutsche Wachtel 7;5 m A,B,C,D,E,F 21 Shar Pei 3;5 mk A,B,C,D,E,F 22 Bolonka Zwetna 1;0 m B,C,D,E,F 23 Dalmatiner 7;7 w B,C,D,E,F 24 Flatcoated Retriever 1;10 m B,C,D,E,F 25 Lagotto Romagnolo 1;9 m B,D,E,F 26 Mischling 5;0 mk B,C,D,E,F 27 Labrador 1;3 w B,C,D,E,F 28 Golden Retriever 3;1 w B,D,E,F 29 Berner Sennenhund 3;4 wk B,C,E,F 30 Mischling 5;0 mk B,C,D,E,F 31 Australian Shepherd 1;0 w B,C,D,E,F 32 Husky 11;11 wk B,C,D,E,F 33 Golden Retriever 7;0 w B,C,D,E,F 34 Husky 9;6 m B,C,D,E,F 35 Labrador 3;4 wk B,C,D,E,F 36 Irish Wolfhound 4;1 wk B,D,E,F 37 Mischling 9;0 mk B,C,D,E,F 38 Flatcoated Retriever 1;1 m B,C,D,E,F
X Tabellarischer Anhang
138
Fortsetzung Tab. B3:
Hund Nr. Rasse Alter
(Jahre; Monate) Geschlecht Methode 39 Mischling 5;4 m B,C,D,E,F 40 Deutsch Drahthaar 1;6 m B,C,D,E,F 41 Rottweiler 1;7 m A,B,D,E,F 42 Beagle 8;0 mk A,D,E,F 43 Labrador 1;6 w A,D,E,F 44 Mischling 4;6 mk A,D,E,F 45 Labrador 3;2 w A,D,E,F 46 Mischling 1;6 mk A,D,E,F 47 Mioritic 4;5 wk A,D,E,F 48 NSDT-Retriever 1;6 wk A,D,E,F 49 Golden Retriever 8;0 m A,D,E,F 50 Australian Shepherd 1;7 wk A,D,E,F 51 Labrador 8;11 m A,B,C,D,E,F 52 Deutsch Drahthaar 1;8 m A,B,C,D,E,F 53 Australian Shepherd 4;4 mk A,B,D,E,F 54 Dobermann 1;2 m A,B,D,E,F 55 Dobermann 5;6 m A,D,E,F 56 Dobermann 1;4 m A,B,D,E,F 57 Malinois 5;0 m A,B,D,E,F 58 Deutscher Schäferhund 1;8 m A,B,D,E,F 59 Dobermann 2;9 wk A,B,D,E,F 60 Dobermann 2;9 w A,B,D,E,F 61 Dobermann 5;6 w A,B,C,D,E,F 62 Deutscher Schäferhund 8;2 w A,C,D,E,F 63 Deutscher Schäferhund 2;4 w A,C,D,E,F 64 Deutscher Schäferhund 2;4 m A,B,C,D,E,F 65 Labrador 2;0 m A,B,C,D,E,F 66 Golden Retriever 9;0 mk A,B,D,E,F 67 Deutscher Schäferhund 3;10 w A,B,D,E,F 68 Malinois 3;0 w A,B,E,F 69 Deutscher Schäferhund 1;4 w A,B,D,E,F
A = kapilläre Blutungszeit, B = PFA-100, C = turbidimetrische Aggregometrie, D = Impedanzaggregometrie, E = Thrombozytenzahl, F = Hämatokrit, NSDT = Nova Scotia Duck Tolling, m = männlich, , mk = männlich kastriert, w = weiblich, wk = weiblich kastriert
X Tabellarischer Anhang
139
Tab. B4: Ergebnisse der Messung der kapillären in-vivo Blutungszeit bei 25 Hunden mit
entzündlichen Erkrankungen.
Hund Nr. Messung 1 (sec)
Messung 2 (sec)
Mittelwert (sec)
1 75 75 75 2 165 180 172,5 3 30 45 37,5 4 45 60 52,5 5 - - - 6 30 45 37,5 7 - - - 8 90 120 105 9 30 45 37,5 10 - - - 11 90 90 90 12 90 75 82,5 13 - - - 14 30 60 45 15 65 95 80 16 55 50 52,5 17 65 55 60 18 60 - 60 19 25 30 27,5 20 10 10 10 21 100 105 102,5 22 15 10 12,5 23 165 165 165 24 120 105 112,5 25 150 145 147,5
X Tabellarischer Anhang
140
Tab. B5: Ergebnisse der Messung der kapillären in-vivo Blutungszeit bei 47 klinisch
gesunden Hunden.
Hund Nr. Messung 1 (sec)
Messung 2 (sec)
Mittelwert (sec)
1 60 90 75 2 75 105 90 3 60 90 75 4 45 60 52,5 5 45 45 45 6 60 60 60 7 105 75 90 8 45 45 45 9 90 105 97,5 10 45 45 45 11 60 75 67,5 12 60 45 52,5 13 75 60 67,5 14 45 60 52,5 15 105 120 112,5 16 105 120 112,5 17 60 90 75 18 75 105 90 19 90 105 97,5 20 60 45 52,5 21 60 60 60 22 90 105 97,5 23 75 90 82,5 24 60 75 67,5 25 105 90 97,5 26 75 75 75 27 90 60 75 28 45 45 45 29 90 90 90 30 75 105 90 31 45 60 52,5 32 60 75 67,5 33 105 105 105 34 120 135 127,5 35 105 120 112,5 36 75 60 67,5 37 75 75 75 38 60 60 60 39 90 75 82,5 40 60 60 60 41 75 60 67,5 42 45 45 45 43 75 60 67,5 44 60 60 60 45 90 105 97,5 46 45 60 52,5 47 60 60 60
- nicht durchgeführt
X Tabellarischer Anhang
141
Tab. B6: Ergebnisse der Messung mit dem PFA-100 bei 25 Hunden mit entzündlichen
Erkrankungen. Zum Einsatz kamen Messzellen mit einer Kollagen/ADP-Beschichtung
(COL/ADP) und mit einer Kollagen/Epinephrin-Beschichtung (COL/EPI).
Hund Nr. COL/ADP COL/EPI
VZ (sec)
GV (µL) VZ (sec) GV
(µL) 1 57 234 >300 618 2 262 584 >300 821 3 >300 618 133 339 4 80 297 >300 765 5 65 279 224 468 6 55 257 177 455 7 61 246 112 300 8 75 336 268 872 9 68 230 157 339 10 57 248 >300 588 11 152 402 216 870 12 83 300 >300 817 13 199 440 >300 757 14 126 375 >300 783 15 111 318 >300 546 16 153 420 >300 765 17 63 257 108 331 18 134 347 >300 621 19 67 252 92 290 20 73 247 121 318 21 102 310 >273 687 22 64 262 >300 512 23 >245 870 >266 871 24 265 161 > 300 140 25 >241 870 >175 871
VZ = Verschlusszeit; GV = Gesamtvolumen
X Tabellarischer Anhang
142
Tab. B7: Ergebnisse der Messung mit dem PFA-100 bei 41 klinisch gesunden Hunden. Zum
Einsatz kamen Messzellen mit einer Kollagen/ADP-Beschichtung (COL/ADP) und mit einer
Kollagen/Epinephrin-Beschichtung (COL/EPI).
Hund Nr. COL/ADP COL/EPI
VZ (sec) GV (µL) VZ (sec) GV (µL) 1 52 239 301 679 2 56 248 301 663 3 57 253 109 364 4 69 266 234 573 5 56 255 199 578 6 69 276 301 789 7 72 303 152 474 8 56 257 174 479 9 72 289 119 372 10 72 266 301 796 11 59 252 112 367 12 74 298 274 871 13 82 289 301 802 14 57 239 94 292 15 66 284 115 391 16 47 244 76 318 17 65 274 285 869 18 48 242 151 449 19 59 263 301 832 20 55 259 110 374 21 57 273 301 864 22 55 252 99 343 23 68 255 144 387 24 70 273 147 456 25 78 263 301 708 26 62 258 301 705 27 59 231 96 288 28 70 268 113 351 29 77 288 272 758 30 56 242 91 316 31 74 275 301 582 32 99 269 73 278 33 56 251 102 320 34 77 277 301 737 35 67 272 301 800 36 52 247 105 349 37 75 291 121 392 38 69 303 301 854 39 57 258 261 592 40 78 281 81 313 41 64 256 90 338
VZ = Verschlusszeit; GV = Gesamtvolumen
X Tabellarischer Anhang
143
Tab. B8: Ergebnisse der maximalen Aggregation (%) gemessen mittels turbidimetrischer
Aggregometrie bei 25 Hunden mit entzündlichen Erkrankungen. Zum Einsatz kamen die
Agonisten ADP und Kollagen in verschiedenen Konzentrationen.
Hund Nr. ADP Kollagen
40 µmol/L
20 µmol/L
10 µmol/L
40 µg/mL
20 µg/mL
10 µg/mL
1 56,5 82,5 37,8 82,8 106,7 91,3 2 33,3 58,6 39,9 48,1 50,6 80,9 3 60,6 57,1 52,4 99,6 118,1 128 4 32,8 32,1 44,3 66,5 62,3 74,9 5 36,6 49,9 43,4 56,4 75,4 71,6 6 65,4 68 46,8 59,2 73 93,8 7 52,6 56,2 23,8 46 71,2 58,4 8 6,6 21,4 0,2 - - - 9 31,4 19,6 32 60,6 64,4 78,4 10 74,8 31,8 24,9 64,8 77,2 69,8 11 3,1 4,7 5,6 74,3 49,5 55,2 12 - - - - - - 13 17,7 21,7 16,3 - - - 14 34,5 37,1 41,1 21,2 40,2 39 15 - - - - - - 16 51,8 50,8 16 40,4 49 59,4 17 54,2 64,4 63,1 44,4 59,3 60,8 18 26,7 29,6 28,6 27,8 34,7 32,5 19 86,6 84,6 42,2 79,6 85,6 84,6 20 - - - 59,8 66,6 73,8 21 88,8 63,8 53,5 74,7 73,1 90,8 22 - - - - - - 23 - - - - - - 24 85,1 81,7 93,2 89,5 92,6 79,4 25 5,3 12,9 20,8 10,4 22 20,9
- nicht durchgeführt
X Tabellarischer Anhang
144
Tab. B9: Ergebnisse der maximalen Aggregation (%) gemessen mittels turbidimetrischer
Aggregometrie bei 27 klinisch gesunden Hunden. Zum Einsatz kamen die Agonisten ADP
und Kollagen in verschiedenen Konzentrationen.
Hund Nr. ADP Kollagen
40 µmol/L
20 µmol/L
10 µmol/L
40 µg/mL
20 µg/mL
10 µg/mL
1 62,5 64,7 44,4 87,9 66,1 72,3 2 50,3 38,7 54,2 49,8 49,4 67,8 3 70,5 37,0 20,7 76,9 97,1 120,7 4 40,6 27,8 23,8 83,6 75,8 86,6 5 70,8 53,9 49,8 91,2 91,9 71,9 6 79,4 91,8 47,0 75,7 90,0 81,4 7 53,8 58,7 23,1 66,7 78,2 68,7 8 70,9 22,5 22,7 83,4 83,2 86,2 9 55,6 32,5 56,5 74,0 76,2 80,3 10 45,3 43,0 53,7 81,8 61,8 91,2 11 128,8 83,3 54,6 87,4 101,6 72,4 12 97,8 81,3 72,8 78,2 127,4 96,1 13 67,0 78,5 60,7 68,9 68,2 74,1 14 77,3 86,6 50,8 85,1 73,6 90,7 15 91,9 75,7 68,7 85,8 105,8 79,8 16 76,1 66,1 39,0 89,2 67,5 68,3 17 70,2 75,8 61,4 85,0 100,4 71,5 18 79,7 62,0 79,0 75,9 89,8 93,1 19 102,8 98,7 78,3 81,6 97,5 86,3 20 51,5 35,5 49,3 92,3 68,8 84,0 21 73,9 76,8 53,8 62,5 77,4 82,1 22 55,7 38,3 45,6 76,9 86,0 84,3 23 29,0 43,5 49,8 48,8 52,0 60,0 24 47,4 61,0 46,0 67,4 85,2 89,4 25 38,5 58,2 54,9 57,4 70,8 65,5 26 77,1 76,3 43,4 93,3 100,3 73,5 27 53,5 28,8 19,1 27,8 40,0 46,3
- nicht durchgeführt
X Tabellarischer Anhang
145
Tab. B10: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) gemessen mit dem Multiplate®
Aggregometer bei 25 Hunden mit entzündlichen Erkrankungen. Zum Einsatz kamen die
Agonisten ADP, Kollagen und AS in verschiedenen Konzentrationen.
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 20
µmol/L 10
µmol/L 5
µmol/L 10
µg/mL 5
µg/mL 3
µg/mL 1
mmol/L
0,5 mmol/
L 1 2423 2558 2141 1168 2194 1719 1592 1988 2 1006 812 1089 1223 1190 1371 551 599 3 2069 1861 1364 2683 2892 2871 953 2244 4 1825 2290 2497 2746 3060 2929 1311 501 5 4046 4542 3245 4780 4926 4832 1071 950 6 3269 3256 3503 3177 3258 2794 2303 1935 7 3155 2761 2827 4333 4726 4443 1429 1062 8 3644 3541 4131 3703 3791 3775 2965 3025 9 2944 3667 3231 5553 5306 5319 3231 2344 10 1204 1140 1064 3911 3990 3556 1248 1686 11 2734 3034 2592 1321 1896 1899 765 771 12 2047 2183 2184 3462 3165 2611 1874 1543 13 3098 3425 2546 3210 4522 3785 887 1009 14 2528 2560 2687 2549 4183 3730 1769 1459 15 367 929 818 2038 1506 2262 960 593 16 2636 2782 2778 4195 3930 3986 2824 2061 17 586 520 563 3736 3547 2979 535 761 18 1652 1911 1881 2339 3288 3077 2312 2439 19 2637 2122 1671 4056 4002 4107 1021 1190 20 1069 773 898 1995 2571 1326 906 1015 21 3163 2895 2982 2596 2362 2898 2194 1019 22 3097 3290 1641 4522 4061 4395 144 198 23 269 266 525 2030 2433 1751 269 289 24 2359 2509 2266 2275 2365 2618 2073 2265 25 1699 1499 1242 1461 1736 1611 2179 402
X Tabellarischer Anhang
146
Tab. B11: Ergebnisse der „area under the curve“ (AU*min) gemessen mit dem Multiplate®
Aggregometer bei 65 klinisch gesunden Hunden. Zum Einsatz kamen die Agonisten ADP,
Kollagen und AS in verschiedenen Konzentrationen.
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 20
µmol/L 10
µmol/L 5
µmol/L 10
µg/mL 5
µg/mL 3
µg/mL 1
mmol/L 0,5
mmol/L 1 2254 2209 2272 3137 3048 3083 2278 2175 2 1904 1819 1778 2574 2284 2121 2070 1683 3 3416 3448 3828 3302 3435 2949 995 1086 4 2405 2502 2569 2560 3005 2676 2713 2759 5 2145 2186 2242 2399 2199 2111 2004 1808 6 2710 2999 2917 2893 2682 3342 2739 2446 7 1258 1481 1313 1174 1636 1689 1463 1589 8 1865 1790 1003 2605 2770 2608 2377 2147 9 1751 1671 1725 1780 2017 1805 1628 1714 10 2454 2646 2179 2726 2957 2896 2611 2834 11 2360 2702 2533 2839 3142 3265 1469 2434 12 2670 3133 2309 3007 3103 3218 1424 1570 13 2198 2423 2440 2412 2459 2830 2456 2338 14 2481 2248 2040 2522 2441 2379 2345 2082 15 1914 2063 1984 3017 2961 2694 1831 2463 16 2431 2606 1534 3048 2683 3103 2542 2942 17 1733 2076 1672 2027 2222 2113 2279 1844 18 2158 2393 2061 2573 3232 2544 1170 1305 19 2238 2539 2722 2994 3141 2862 1737 1995 20 1229 1763 2039 2484 2969 2713 1388 1174 21 3361 3547 3327 3501 3255 3500 2571 2694 22 3091 2934 1159 3499 3325 3309 1484 631 23 1665 1862 1819 2457 2648 2558 2031 1416 24 1861 2136 2104 2389 2553 2346 1245 2005 25 1840 1951 1570 2408 2374 2027 2904 2275 26 1869 1776 700 2476 3073 2899 2511 2710 27 2399 2327 2631 2775 2590 3042 2718 2911 28 2676 2754 2953 2563 2976 2423 3230 2219 29 3174 3068 2805 3023 3460 1757 3457 2615 30 2264 2731 2445 2613 2361 2741 3560 3007 31 2626 2813 2848 3717 2767 3622 2301 2764 32 1446 1637 1721 2121 2134 1853 1493 934 33 1829 1914 1929 2023 2604 2585 1522 1667
X Tabellarischer Anhang
147
Fortsetzung Tab. B11:
Hund Nr.
ADP Kollagen AS 20
µmol/L 10
µmol/L 5
µmol/L 10
µg/mL 5
µg/mL 3
µg/mL 1
mmol/L 0,5
mmol/L 34 1860 1835 1901 2835 2954 2546 2429 2907 35 2393 2685 2489 2693 2836 2971 3179 2931 36 2450 2354 2078 2362 2338 2277 2511 2799 37 1820 1806 1674 3359 3269 3322 1113 1102 38 2237 2900 2456 2766 3074 3184 1011 1973 39 2560 2426 2511 2637 2704 2917 2478 2834 40 2312 2406 2405 3027 2919 2964 2805 2954 41 1554 1872 1949 2430 2479 2123 2089 1991 42 2449 2388 2544 3228 3516 1572 3026 2725 43 1989 1996 1502 2356 2602 2620 1919 832 44 1868 2010 591 2307 2237 2599 1883 1909 45 1702 1590 1116 3389 3296 780 1499 1117 46 2254 2367 2217 1899 2442 1479 1156 779 47 1889 2069 1972 2204 2315 2146 2304 2301 48 2747 2473 2479 2363 2833 2809 2072 1552 49 2810 3143 2560 2663 3082 2954 1557 831 50 2113 1907 2007 2832 2269 2571 1621 1471 51 1745 2075 2094 2064 2599 2272 2365 2023 52 2268 2651 2705 2754 2799 2441 1703 2034 53 2748 2680 1835 4013 3157 3622 1072 910 54 1831 2005 1911 2146 2430 2187 1992 1392 55 2575 2711 2526 2397 2545 2278 2250 1624 56 2171 2362 2157 2839 3187 3062 1402 1575 57 2727 3213 3031 2856 2750 3378 1437 1728 58 2354 3035 2544 2616 2856 2876 1701 1748 59 2560 2602 3186 2403 2901 3005 3155 1558 60 2788 3148 3175 2511 2890 2693 2110 2264 61 2618 2941 2906 2791 3444 3112 3005 2366 62 1498 1498 1378 1833 1721 1594 1293 1291 63 2532 2741 2692 3014 2434 2805 2608 1861 64 1899 2098 1998 2702 2403 2469 2858 2167 65 2575 2540 2790 2312 2956 2932 2530 2589
X Tabellarischer Anhang
148
Tab. B12: Thrombozytenzahl (x10³/µL) und Hämatokrit (%) der 25 Hunde mit
entzündlichen Erkrankungen.
Hund Nr. Thrombozyten-zahl Hämatokrit
1 377 45,7 2 51 45,3 3 456 40,6 4 346 34,3 5 352 27,5 6 330 42,0 7 243 42,3 8 115 27,0 9 355 47,4 10 257 42,7 11 330 36,4 12 130 37,1 13 76 37,1 14 78 38,0 15 147 46,9 16 384 32,0 17 233 41,0 18 178 44,8 19 220 53,0 20 258 49,2 21 248 43,4 22 379 38,0 23 42 24,2 24 230 54,0 25 223 23,4
X Tabellarischer Anhang
149
Tab. B13: Thrombozytenzahl (x10³/µL) und Hämatokrit (%) von 69 klinisch gesunden
Hunden.
Hund Nr. Thrombozyten-zahl Hämatokrit
1 309 48,9 2 231 45,9 3 420 51,6 4 126 45,6 5 257 47,9 6 354 42,4 7 248 47,5 8 217 45,8 9 330 43,3 10 143 49,5 11 337 52,1 12 264 46,5 13 368 45,2 14 338 50,6 15 267 46,9 16 172 48,8 17 361 48,9 18 266 50,2 19 256 48,1 20 237 43,4 21 293 46,4 22 237 50 23 413 40,2 24 277 41,8 25 349 45,6 26 235 42 27 341 49,4 28 375 44,4 29 288 46 30 293 54,5 31 307 42,7 32 433 42,4 33 432 43,5 34 281 43 35 288 48,8 36 169 43,9
X Tabellarischer Anhang
150
Fortsetzung Tab. B13:
Hund Nr. Thrombozyten-zahl Hämatokrit
37 331 41,8 38 362 50 39 249 50,8 40 356 43,6 41 254 47,2 42 318 51 43 308 48,7 44 217 51,3 45 659 45,8 46 216 55 47 196 51,8 48 282 49,3 49 469 40 50 307 42,7 51 324 44,5 52 279 48,2 53 252 50,5 54 230 52,2 55 264 57,4 56 254 52 57 287 54,4 58 172 55 59 267 50,1 60 322 51 61 301 48,8 62 195 48,7 63 234 50,6 64 241 54,6 65 210 44 66 554 41,4 67 252 55 68 270 51,8 69 313 50,6
XI Danksagungen
151
XI Danksagungen
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Reinhard Mischke für die Überlassung des interessanten Themas, die stets engagierte Betreuung und die unermüdlichen Hilfestellungen beim Anfertigen dieser Arbeit. Herrn Prof. Dr. I. Nolte danke ich für die Möglichkeit der Durchführung meiner Versuche in der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Ich bedanke mich bei allen Mitarbeitern des Labors, insbesondere Herrn Dirk Menzel, für die freundliche Hilfe bei der Durchführung der Laborarbeit und die Beantwortung vieler Fragen. Darüberhinaus möchte ich mich bei allen anderen Mitarbeitern der Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover bedanken, die mir bei der Entnahme der Blutproben behilflich waren. Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, Martina und Faouzi Abid, meinem Bruder Benjamin Abid und meiner Großmutter Gisela Rauchholz, die durch ihren fortwährenden liebevollen Beistand und ihre finanzielle Unterstützung diese Arbeit erst ermöglicht haben. Ich danke besonders meinen Mitdoktoranden Jan-Wighard Minde, Jette Schönig, Christina Witten, Annika Pukropski und Elisabeth Döderlein, die wohl in manchen Momenten die einzigen Menschen waren, die Situationen nachempfinden konnten und für gegenseitiges Bemitleiden, aber auch Motivation zur Verfügung standen. Weiterhin gilt mein Dank meinen Freundinnen Annika Ferkau, Lisa Homburg, Melanie Gundlach, Svenja Lösken, Lisa Krahn, Verena Reupke, Caro Gietz, Britta Lövenich, Birke Großheim und Katrin Schaper dafür, dass es sie gibt und dass sie, ob nun am Telefon oder persönlich, immer ein offenes Ohr für mich hatten. Last but not least danke ich meiner Hündin Maja, die mich gezwungen hat, mindestens drei Mal am Tag den Schreibtisch zu verlassen.