458 Bericht: Spezielle analytisehe Methoden Bd. 198

Zur papierchromatographischen Trennung yon Oestrogenen aus Rinder- ham empfehien J . H. C o r ~ g A v E ~ und A. M. GAWlENOWSKI 1 Tri~thylenglykol als stationare Phase und o-Dichlorbenzol a]s mobile Phase. 1 1 H a m wird mit 50 ml konz. Schwefels~ure am RfickfluB gekocht und 24 Std mit 30 ml J~ther extralfiert. Die chemische Trennung der Oestrogene erfolgt naeh C. T. BE]~ und T. F. GALLAG- ~E~ 2. Nach Vertreibung des Athers wird der Rfickstand in wenig Benzol gelSst und nach S. KUSHINSKY 3 fiber eine Silieagel-S&ule mit einem Gradienten aus 250 ml Benzol und 250 ml Benzol-J~thylaeetat (I : 1) eluiert. Die ersten 200 ml des EIuats enthalten die Oestrogene und werden eingedampft. Ein Whatman-Streifen ~Nr. 1 yon 15• cm wird mit Methanol gewasehen, dureh eine 33~ LSsung yon Trii~thylenglykol in Methanol gezogen und zwischen Whatman-BSgen abge- lSscht. Die Oestrogene werden in methanoliseher LSsung aufgetragen und absteigend mit o-Dichlorbenzol, welches mit Triathylenglykol ges~ttigt ist, in etwa 4 Std chromatographiert.

1 j . Chromatogr. (Amsterdam) 8, 274--275 (1962). Dept. Biochem., Kansas State Univ., Manhattan, Kan. (USA). - - 2 j . biol. Chemistry 214, 335 (1954). -- 3 Nature (London) 182, 874 (i958). A. NI~A~w~

tiber die fluorimetrische Bestimmung yon Thiamin, Riboflavin, 4-Pyrid- oxins~ure und Nl-~ethylnicotinamid im Ham beriehtet P. D. ST~OV I. Die Bestimmung dieser vier Substanzen in 4- -5 Harnproben erfordert etwa 3 Std. Als Ger~te k5nnen Stufenphotometer vom Pulfrichtyp mit entsprechenden Ffltern und Elektrofluorimeter verwendet werden. - - Als haltbare Eichsubstanz fiir die Galvanometereinstellung und fiir Thiochrom in Isoamylalkohol, yon 4-Pyridoxin- sgurelacton und N1-Methylnicotinamid wird Chininsulfat (0,5ttg/ml) in 0,1 n Schwefelsgure empfohlen, ffir Lumiflavin in CHC1 seine wg~rige FluoresceinlSsung (0,5 ttg/ml). - - Der H a m wird in dunklen Glasgefi~l~en gesammelt, die je 0,5 g zer- kleinertes Thymol enthalten. -- .Die Bestimmung yon Thiamin im H a m erfolgt nach einer modifizierten Thiochrommethode 2. Man bringt in zwei Scheidetrichter (I ffir die Probe, I I ffir die Kontrolle) je 2 ml 30~ !~atronlauge, versetzt I mit 1 ml 2o/oiger Kalinmhexacyanoferrat(III)-15sung, I I mit 1 ml Wasser und mischt. Dann gibt man in jeden Scheidetrichter 1 ml mit Isoamylalkohol behandeltea Harn unter Sehiitteln, versetzt mit je 6 ml Wasser und 10 ml Isoamylalkohol. Man wendet die Triehter je 100mal urn. Die Bodenfliissigkeiten werden verworfen, die fO-bcrstgnde zur Fluorimetrie verwendet. Die Differenz yon Probe und Kontrolle ergibt den yon der Eichkurve abzulesenden Wert. -- Zur Bestimmung yon Ribo- ]lavin is~ H a m wird eine modifizierte Lumiflavinmethode vcrwendet 8:2 ml filtrier- ter Itarn, 3 ml Wasser und 5 ml 20~ Trichloressigsi~ure werden in einem gage - dorn-Glas 5 min auf ein siedendes Wasserbad gestellt. Nach Abkfihlen wird in einem Scheidetrichter mit 3 Anteilen yon je 5 ml Chloroform je 30mal geschfittelt. Die Unterschiehten werden entfernt, der ~berstand wird in einer Porzellansehale mit etwa 2 ml 30~ Natronlauge auf pH 13--14 gebracht, die Schale wird in eine Kristallisierschale mit Eiswasser gesetzt und 1 Std in 50 cm Entfernung mit ciner 1000 W-Lampe bestrahlt. Dann wird die Probe mit etwa 1,5 ml Essigsgure auf PH 3,0--4,0 anges~uert und unter 1Nachwasehen mit 5 ml Wasser in einen Scheide- triehter gebracht. Man sehfittelt mit 6 ml Chloroform 30m~l und verwendet den Chloroformauszug zur Fluorimetrie. Die Berechnung erfolgt nach einer Eichkurve. - - d~Pyridoxinsgurelacton im H a m wird nach einer vereinfachten Methode yon W. J . HTZFF und W. A. PE~LZWEIG 4 bestimmt. Man bringt ein mit Sehliffstopfen versehenes Probierglas mit 1 ml filtriertem H a m und 9 ml 10faeh verdfinnter Salzsi~ure auf 15 rain in ein siedendes Wasserbad. l~ach Abkiihlung wird 1 ml des Gemisehes mit 9 ml gesgtt., BodenkSrper enthaltender BoraxlSsung versetzt. Als Xontrolle dienen

1963 4. Analyse yon biologischem Material 459

i ml 10fach verdiinnter Harn q- 9 ml BoraxlSsung. Aus dem Unterschied der Finorescenzen yon Probe und Kontrolle wird nach einer Eichkurve die Laeton- konzentration ermittelt. Im Falle yon Pyridoxinbelastungen ist es zweckmi~l~iger, den H a m 2- -Smal starker zu verdiinnen. Zur Umrechnung des Lactons auf Pyrid- oxins~ure wird das Resultat mit 1,109 multipliziert. Die Eichkurve wird mittels Verdiinnungsreihen yon zweimal umkristallisiertem 4-Pyridoxins~urelacton kon- struiert, das naeh 4 bereitet wurde. -- Die Bestimmung vo~ N1-Methylnicotinamid im Ham stellt eine Vereinfachung des Verfahrens yon W. J . H u f f und W. A. P ~ L - zw]~tG 5 dar: 1 ml filtrierter, mit Wasser 5fach verdfinuter H a m wird in einem Pro- bierglas mit Scidiffs~opfen mit 0,5 ml Aceton und 0,2 ml 6 n Natronlauge verse~zt. Man schfittelt, setzt nach 5 rain 0,3 ml 6 n Salzs~m'e zu, stellt auf 2 rain in ein siedendes Wasserbad, l~tl3t abkiihlen und versetzt mit 1 ml 20~ KH~PO 4- Lesung und 7 ml Wasser. Die Kontrolle wird ebenso behandelt, nur wird anstatt Aceton 0,5 ml Wasser zugesetzt. Die fluorimetrisehe Differenz yon Probe und Kon- trolle ergibt den l~l-Methylnieotinamidgehalt der Probe auf einer Eichkurve, die mit der Reinsubstanz aufgestellt wurde. -- Die Genauigkeit der vier Methoden betragt d=10% . Zusi~tze yon 1/~g Thiamin, i #g Riboflavin, 2 #g Pyridoxins~ure- lacton oder 1 pg N~-~ethylnicotinamid (alle auf 1 ml nieht vorbehandelten ttarn) beeinflussen die Bestimmung der drei iibrigen Substanzen niche. - - Bei dot Bestim- mung yon N1-Methyhiieotinamid ist ein Zusatz yon 40 #g Thiamin ohne Einflul~ auf das Resultat, dagegen ffihrten Zus~tze yon 10 #g Pyridoxins~urelacton und 5 ~g Riboflavin zu vSllig gleicher ErhShung des Ausschiags bei Probe und Kontrolle, so dab im Endeffekt in den Proben die gleiohe Menge N1-Methylnieotin~mid mit und ohne Zusatz ohiger Substanzen gefunden wurde. Eine Belasttmg mit 50/~g Pyridoxin oder 5--10/~g Riboflavin ~indert die spontane Iq~-Methylnicotinamid-Ausscheidung im Tagesharn nieht. - - 1 mg Chlortetraeyelin-hydroehlorid auf 1 ml H a m verhin- dert die Bestimmung yon 4-Pyridoxinsaurelaeton. Lavomycetin (gleiehes Volumen einer gesatt. LSsung), 7500 E Penicillin und 12500 E Streptomycinsuffat (alle auf je 1 ml Harn) sind olme EinfluB.

1 Lab. Delo 8, Nr. 6, 37--42 (1962) [Russiseh]. Lehrst. f. Infehtionskrankheiten der ,,Kirov"-Militarmediz. Akademie, Leningrad (UdSSR). -- ~ Vgl. J~lVS~T, B. : Ree. Tray. ehim. Pays-Bas 55, 1046 (1936) und diese Z. 129, 309 (1949). -- a Siehe z.B. I(vnur R., T. W A r 1 6 2 u. H. IC~L~SCHYr~TT: Ber. Dtseh. Chem. Ges. 67, 1452 (1934); diese Z. 117, 292 (1939); 133, 389 (1951). -- ~ J. biol. Chem. 1~5, 345 (1944). -- ~ J. biol. Chem. 167, 157 (1947) ; vgl. diese Z. 171, 160 (1959/60). P. I-hAs

Die hIethodik der Bilirubinbestlmmung im BIutserum un~ersuchen L ~ . MA~KELOV und S. I. DOLGU~EV 1. Nach einem Vergleich verschiedener Methoden wurde eine Modifikation der Jendrassikschen 2 B~ethode ausgearbeitet. - - Prinzip. Bflirubin bildet mit diazotierter Suffanils~ure und Coffein eine rote, colorimetrier- bare Azoverbindung. - - Arbeitsweise. In ein bakteriologisches Probierglas bringt man 0,5 ml nicht hgmolysiertes klares Serum. Fiir die Anstellung der qualitativen Reaktion iiberschiehtet man mit 1 mlfrisch bereitetem (2) (s. u.) Trit t an der Grenz- flgche nach 1 rain ein roter Ring auf, so ist die direkte Reaktion ,,schnell", t r i t t e r nach 2 rain auf, so ist sie ,,langsam", t r i t t e r nach 10 rain auf, so ist sie ,,verzSgert". Tritt kein Ring auf, so ist die Reaktion ,,indirekt". -- Hierauf wird geschiittelt und mit 3,5 ml (1) (s. u.) versetzt. Die Bestimmung im Pulfrich-Photometer wird in 1 cm Schichtdicke bei 530 nm oder einem anderen Ger~t ausgef'uln't. Bei tier Bereehnung wird die 10fache Verdfinnung beriicksichtigt. Erhaltene Extlnktion • 6,35 ~ mg-~ :Bi]irubin. (Normalwert 0,2--0,9 mg-~ Palls kein Colorimeter zur Verfiigung steht, wird eine Standardskala aus Kobaltnitrat und 10~ Kupfersulfatlesung in den im Original angef'fihrten Mischungen hergestellt. - - Reagentien 1. Coffeinreagens.

Z. analyt. Chem., Bd. 198 30