1%. HaM~: Uber die Mineralstoffe des S~ugetiermuskels. II 95

Uber die Mineralstoffe des S~iugetiermuskels

I I . Mitteilung

Der Bindungszustand yon Magnesium, Calcium, Zink, Eisen and Phosphat im Muskel post mortem

Von

l~EINER ltAMM

Mitteilung au8 dem Chemisch-physikalischen Institut der Bundes]orschungsanstalt ]iir Fleischwirtscha/t, Kulmbach*

(Eingegangen am 12. Februar 1959)

In frfiheren Versuchen 1 wurde nachgewiesen, dal3 das im Rindermuskel yon Natur aus enthaltene Calcium die I-Iydratation des Gewebe-EiweiBes stark beeinflugt. Ein teilweiser Austausch des Musket-Calcinms gegen Natr ium oder Kalium mit Hilfe yon Kationenaustauseher (Lewatit S 100) bedingt eine betr~ehthche IIydratat ions- zunahme des Muskelgewebes. Inwieweit auch das in geringerer Menge im Muskel vorhandene Zink an dieser Hydratationsbeeinflussung beteiligt ist, konnte nicht entschieden werden, da es gleichzeitig mit dem Calcium ausgetauscht wird. Die Austauseherversuche ergaben, dab die Bindungsfestigkeit der mehrwertigen Metalle im Muskel in der I~eihenfolge Mg < Ca, Zn < Fe zunimmt und dab die Bindung yon Mg, Ca und Zn bei p~ 7 wesentlich fester ist als bci p~ 5,5.

Da die Austauscherversuche mit dem Homogenat des gesamten Gewebes dureh- gef/ihrt warden, lieB sich nicht feststellen, in weleher Weise sieh die gebundenen Kationen auf die verschiedenen Substanzgruppen des Muskels verteilen. I m Itinblick abet auf die Bedeutung, welehe das Calcium und m6glicherweise aueh andere Muskel- metalle ftir die Hydra ta t ion des Gewebes haben, w/ire es wiehtig, die molare Ver- teilung der Kationen auf die verschiedenen Fraktionen des Muskels zu kennen.

In der Literatur finder sich zu diesem Thema die vor kurzem erschienene At- belt yon HASSELBACH 2 fiber die Bindung yon Kationen an das Myosin und das Actin des Kaninchenmuskels unmittelbar nach dem Tode und im rigor mortis. Diese Untersuehung bezieht sich jedoeh lediglich auf Calcium and Magnesium; sie 1/~gt die Bindung der Metalle an 16sliehe Proteine und an Nichtprotein-Substanzen unber/iek- siehtigt und gibt keinen AufsehluI3 fiber die Menge an freien, dissoziierten Kationen. Es erschien uns daher notwendig, das Problem des Bindungszustandcs yon Magne- siren, Calcium, Zink und Eisen im Muskel post mortem zu bearbeiten. Hierbei war aueh die Frage nach der Verteilung des Phosphats im Muskel yon Interesse, da Phosphorverbindungen in Wechselwirkung mit den Muskelkationen stehen k6nnen. Um nieht die mit der Entwicklung des rigor mortis verbundenen biochemisehen Ver- ~nderungen zu erfassen, wurde hier ebenso wie bei der friiheren Untersuehung der Muskel ffinf Tage nach dem Schlaehten des l~indes (Lagerung bei + 2 ° C) analysiert. Die Kationenbindung wurde beim nat/irlichen p~-Wert des Muskels (etwa 5,5) und bei p~ 7,0 untersucht.

Ffir die Verteilung der Kationen im Muskel kommen folgende fiinf MSgliehkeitea in Betraeht: 1. Bindung an strukturelle, wasserunl6sliehe Proteine (Actin, Myosin,

* Fraulein HEDWlG BB~mu danke ich fiir ihre geschickte und fleiBige Mitarbeit. 1 H~tMM, I~.: Diese Z. 107, 423 (1958). 2 HASSELBAC~, W. : Biochim. biophys. Acta 25, 562 (1957).

7*

96 R. HAMM:

Aetomyosin, Tropomyosin, Bindegewebe); 2. Bindung an wasserlSsliche Proteine; 3. Bindung an wasserlSsliehe Nichtprotein-Substanzen; 4. Bindung an Nichtprotein- substanzen (z. B. Nucleotide), die ihrerseits an strukture]le Proteine gebunden sind; 5. frei dissoziiert.

Zur Ermit t lung der verschiedenen Bindungsarten bedienten wir uns der Kom- binat~on yon drei Methoden: 1. Ersch5pfende Extrakt ion des Muskels mit Wasser; 2. Ultra filtration; 3. Behandlung mit Kationenaustauseher (Na+-Form).

Die naeh ersehSpfender w/iBriger Extrakt ion im Gewebe verbleibenden Kationen stellen die an die strukturellen Muskelproteine gebundene Fraktion dar. Es w£re mSglicb, daI~ diese Kationen nicht nur unmittelbar an Eiwei~ gebunden, sondern auch fiber strukturgebundene Nichtprotein-Substanzen (Nucleotide) mit den struk- turellen Proteinen verknfipft sind. Die yon uns benutzte Methode gestattet es nieht, zwischen diesen beiden Bindungsarten zu unterscheiden. Durch einstfindige Aus- tauscher-Behandlung des w£firigen Mnskelextraktes sowohl als aueh des Ultra- filtrates dieses Extraktes li~l~t sieh die Menge an frei dissoziierten oder sehr locker gebundenen Kationen bestimmen. Der Vergleich des Austausches im Muskelextrakt mit dem Austauseh in seinem Ultrafiltrat bietet zugleich eine Kontrolle ffir eine etwaige, dutch die Ultrafiltrationstechnik bedingte Beeinflussung des Kation- Protein-Komplexes. Die Differenz zwischen der im Ultrafiltrat enthaltenen Gesamt- menge an Metall und derjenigen an ionisiertem Meta]l ergibt die an die wasser- 15slichen Nichtprotein-Verbindungen gebundene Kationenmenge, w~hrend sich das an die wasserlSslichen Proteine gebundene Metall aus der Differenz zwisehen den im Muskelextrakt insgesamt gebundenen Kationen und den ultrafiltrierbaren gebundenen Kationen erreehnet.

Die Problematik der Austauseher-Methodik und ihrer Auswertung haben wit bereits frfiher erSrtert 1. Wie die Untersuchungen zahlreicher Autoren erwiesen haben, ist die Ionenaustausehteehnik auf die Messung der relativ sehwachen Erd- alkalikomplexe ausgezeiehnet anwendbar ~. Dies gilt besonders fiir die im Muskel gegebene Ionenst£rke und Wasserstoffion-Konzentration. Bei der Messung der Metallion-Konzentration nach Ultrafiltration wird angenommen, daI~ diese Konzen- tration gleich derjenigen in Gegenwart des Proteins ist. t t ier sind -- ~hnlich wie bei der Methode der Gleiehgewichtsdialyse - - zwei Fehlerquellen mSg]ich. Es kann infolge des Donnan-Effektes zu einer Asymmetrie in der Verteilung der Metallionen kommen. Zweitens kSnnen Faktoren, wie Denaturierung durch Filtrationsdruek, Adsorption des Proteins durch die Membran oder Ungleiehm~tBigkeit der PorengrSl~e das Resultat beeinflussen 3. Durch die Kombination der Austauscher- mit der Ultra- filtrationstechnik besteht jedoch, wie bereits erw~hnt, die MSglichkeit, das Ausmal~ soleher stSrender Effekte zu kontrollieren.

Methodik

Unt~rsuchungsmater~al Der yon Fett und Bindegewebe befreite Muskel (M. longissimus dorsi) 5--7 j~hriger Kiihe der

Handelsklassen B und C gelangte 5 Tage nach dem Schlachten (Lagerung bei + 2°C unter sterilen Bedingungen) zur Untersuchung. In dem Ausgangsmaterial wurden die Gehalte an H20, Stickstoff, Magnesium, Calcium, Zink, Eisen und Phosphor sowie der pH-Wert ermittelt.

1 ttA~M, t~. : Zit. S. 95, Anm. 1. * SC~VBnRT, J. : Methods of Biochem. Analysis 3, 247 (1956). 8 Hvo~ns, R., u. J. M. KLoTz: Methods of Biochem. Analysis 3, 272 (1956).

(Jber die Mineralstoffe des S~ugetiermuskels. I I 97

ErsehSp/ende Extraktion des Muskels mit Wasser i

100 g des im Fleischwolf zerkleinerten Muskels wurden mit 100 ml Eiswasser ohne (tIomogenat- p~ 5,5) oder mit dem zur Einstellung des Homogenats auf p~ 7 notwendigen Menge an NaOIt 30 sec in einem Blendor (Starmix) zerkleinert. Nach 30 rain Riihren bei 0 ° C wurde die Mischung bei 18 000 U/rain und 0°C zentrifugiert. I)er Zentrifugenriiekstand wurde in 100 ml Eiswasser (bzw. verd. NaOtt) aufgeschl/~mmt, 30 rain bei 0 ° C gerfihrt und wiederum zentrifugiert. Diese Behand- lung wurde noch viermal wiederholt. Insgesamt wurden somit 6 Extraktionen vorgenommen. In den einzelnen Extrakten wurden I-I20 , Gesamt-N, gest -N (nach F/~llung des Proteins mit Trichlor- essigs/~ure) und Aschegehalt bestimmt. Der ffinfte Extrakt war bereits praktisch frei yon gel5sten Substanzen.

In dem farblosen Riickstand der Extraktion wurden nach W/~gung tI~O, Stickstoff, Mg, Ca, Zn, Fe und P bestimmt.

Austauscher-Behandlung der w~ifirigen Muskelextrakte

Die experimentellen ]3edingungen wurden so gewihlt, dab die Resultate dieser Versuche mit denen der friiheren Untersuchung am Gewebehomogenat vergleichbar sind.

Der im Fleisehwolf zerMeinerte Muskel wurde mit 100% seines Gewichts an Eiswasser ver- setzt, welches im Fall der Versuche bei io~ 7 die zur p~-Einstellung notwendige NaOtt-Menge enthielt. Die Mischung wurde 60 see im Blendor (Starmix) zerkleinert und dann bei 18000 U/rain und 0 ° C zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde durch reine Glaswolle filtriert. Im Zentrifugat wurden Wasser, Gesamt-N, Rest-N, Mg, Ca, Zn, Fe, gebundener und anorganieher P bestimmt.

50 ml des Zentrifugates wurden mit 5 g Kationenaustauscher Lewatit S 100 [Na+- Form (Fa. Buyer, Leverkusen) ~] versetz~ und d~mit 1 Std (in einigen Versuchen auch 15 Std) bei 0 ° C geriihrt. Der Muskelextrakt wurde sodann vom Austauscher dureh mehrfaches Dekantieren mit H~O abgetrennt, der Anstauscher quantitativ in sine schmale Austauschsiule fibergefiihrt und mehrmals gewaschen. Die yon dem Lewatit gebundenen Kationen wurden durch dreimaliges Behandeln mit je 6 ml 5 n-HC1 eluiert. Nach jeder der drei Elutionen wurde mit 15 ml Wasser n~chgewasehen. Diese Waschwiisser wurden mit den Eluaten vereinigt. Im Gesamt-Eluat wurden 3/ig, Ca, Zn und Fe bestimmt.

Ultra/iltration der w~iflrigen Muslcelextra]cte

Hierfiir beniitzten wir den gleiehen Extrakt wie er fiir die Austauscherversuche hergestellt wurde. S~mtliehe Filtrationen erfolgten unter Stiekstoff-Uberdruck in einem Ultrafiltrationsgerit aus V2A-Stahl (Hersteller: Membranfiltergesellsehaft G5ttingen). Die verwendeten Filter bezogen wit yon der gleiehen Firm~. 50 ml des Muskelextraktes wurden zun~chst zur Abtrenuung gr5berer Teilehen durch sin Membranfilter ,,rein" unter dem Druck yon 4 kg/cm 2 vorfiltriert. Dieses Filtrat wurde sodann unter Verwendung des Ultrafeinfilters ,,Lg. 60" bei 8 kg/cm 2 Druck und 0 ° C ultra- filtriert. In dem eiweil3freien Filtrat wurden It20, Mg, Ca, Zn, Fe, Gesamt-P und anorg~nischerP bestimmt.

Austauscher-Behandlung der Ultra]iltrate

20 ml des Ultrafiltrates (klar und v611ig farblos) wurden mit 2 g Na+-Lewatit 1 Std bei 0 ° C ger/ihrt. Dekantieren, Auswasehen und Eluieren des Austauschers geschahen in der gleichen Weise wie es oben fiir den Mnskelextrakt beschrieben wurde. Im Eluat des Austausehers wurden Mg, Ca, Zn und Fe bestimmt.

Bestimmung von Magnesium, Calcium, Zink und Eisen

Magnesium, Calcium and Eisen wurden nach einer frfiher beschriebenen 3/Iethode 8 ermittelt. Zink konnte nur im frisehen und extrahierten Muskel sowie im w~grigen Muskelextrakt mittels der friiher benfitzten komplexometrisehen Methods 3 bestimmt werden. In den saueren Elu~ten der Austauseher jedoeh wurde die komplexometrische Zinkbestimmung dureh den sehr hohen ~{agnesium-grbersehuf] empfindlich gest5rt. Wir bedienten uns daher einer photometrisehen

Um Einflug yon Fremdionen auf die Bindung der Muskelkationen zu vermeiden, wards hier nicht, wie sonst iiblieh, mit 0,1 m-KC1-L6sung, sondern mit Wasser extrahiert. Unter den an- gewendeten Versuchsbedingungen werden damit etwa die gleiehen Mengen an wasserl5sliehen Proteinen extrahiert wie mit 0,1 m-KC1, n~mlich bei lO~ 7 30% des gesamten Muskeleiweil3es.

2 Die Vorbeh~ndlung des Austauschers war bereits friiher ( H A ~ , R. : Zit. S. 95, Anm. 1) besehrieben worden.

HA~M, R.: Biochem. Z. 327, 149 (1955); zit. S. 95, Anm. 1.

98 R. H ~ :

])i thizon-Methode (,,Mischfarben-Verfahren") 1, die auch durch hohe Mg~+-Konzentrationen nicht gest6rt wird. Hierbei nahmen wir ffir jede Versuehs-Serie eine neue Eichkurve auf. Wie Tab. I zeigt, bes teht bei der Analyse yon Muskel und w~I~rigen G..ewebsextrakten eine befriedigende

Ubereinst immung zwischen dem Tabelle 1. Vergleich der komplexometrischen Zinkbestimmung

mit der Dithizon-Methode

Material

Muskel I . . . . . Muskel I I . . . . . Muskelextrakt I . . Muskelextrakt I I . . Muskelextrakt I I I Muskelextrakt I V . . Muskelextrakt V . .

GehaR an Zn bei der

Komplexometr.- Dithizon- ]~[ethode Methode

in ~g #g

132 125 147 151

94 89 97 100

330 344 220 222

37 38

II bez. a. I

i n %

95 103

95 103

! 104 101 103

komplexometrischenVerfahren und der Dithizon-Methode.

Bestimmung von gebundenem und ,,anorganisehem" Phosphat

In allen FMlen wurde Phosphat nach der Methode yon ALLE~ ~ photometrisch best immt.

a) Anorganisehes Phosphat. Das anorganische Phospha t wurde aus der enteiweiBten LSsung (vgl. u.) nach L o ~ A ~ 3 als NH4FIgPO4 ge- f~llt. Hierzu wurden 1--2 ml der zu untersuchenden L6sung mit l ml 10%iger Trichloressigsgure (TCA) in der KMte versetzt. Die eiweil~- freie LSsung wurde in ein Zentri-

fugenglas filtriert, das 2 ml des Magnesiumcitratreagenses und 1 ml 10%iges Ammoniak enthie]t. Der Fil terr i ickstand wurde dreimal mit 3 ml 3°/oiger TCA gewaschen und die Waschfliissigkeit mi t dem Fi l t ra t vereinigt. Nach Stehen fiber Nacht wurde der Niederschlag abzentrifugiert, mi t 5 m l 1°/o igem Ammoniak gewaschen und in 0,5 ml konz. Schwefels~ure gel6st.

b) Gesamt.Phosphat. Der gesamte Phosphatgehal t von Geweben und Ex t rak ten wurde nach Veraschung mit H~SO4--H~02 best immt.

c) An strukturelle Proteine gebundene~ Phosphat. Der Gehalt des erseh6pfend mit Wasser extrahier ten Gewebes an Phospha t (best immt nach nasser Veraschung) ergibt die an das struk- turelle MuskeleiweiB gebundene Phosphatmenge. Ein Teil dieses Phosphats ist ,,s~ure]abil" gebunden (vgl. u.).

d) An 15sliche Proteine ~est gebundenes Phosphat. Im Fi l t ra t des enteiweiBten ~uske lex t rak ts wurde das Phosphat nach Veraschen mi t H2SO4--H~O~ best immt. Die Differenz zwischen dem

Tabelle 2. Ein]lufl der Tri- chloressigsi~uremenge au/ den Gehalt des enteiweiflten Mus- kelextraIcts an anorganischem Phosphat. (Muskcl : H20 =

1 :1 )

12%ige TCA an- pro 1 ml orgalfiseher

~iuskelextrakt P pro 1 ml in Extrakt ml ~g

0,2 338/338 0,5 355/360 1,0 443/444 2,0 443/443 5,0 443/443

Tabelle 3. Ein/lufi der Tri- chloressigsSure]~onzentration

au] den Gehalt des entei- wei/3ten Muskelextralcts (1 : 1) an anorganischem Phosphat. Eiwei~f~llung: 1 ml TCA pro i ml Muskelextrakt. Ge-

samt-P in 1 ml Muskel- ex t rakt : 900 #g

an- Konzentrat ion organischer

der TCA P pro 1 ml in Extrakt % ~g

3 484 6 497

12 568

Gesamtphosphat im Ex t rak t und dem mit TCA nicht fallbaren Phospha t ergibt die an wasser- 16sliche Proteine £est gebundene Phosphatmenge.

e) An 15sliche Proteine locker gebundenes Phosphat. Da der Gehalt an anorganischem Phospha t im Ultrafi l t rat stets etwas geringer ist als im entsprechenden enteiweiBten Ext rak t , so muB ein bes t immter Bruchteil des an die wasserl6slichen Proteine gebundenen Phosphats dutch die Wirkung yon TCA ab- gespalten worden sein. Die Menge dieses ,, s~uretabil" gebundenen Phosphats ergibt sieh somit aus der Differenz zwischen dem Phos- phatgehal t des enteiweiltten Ex- t raktes und demjenigen des Ultra- filtrates.

]) An wasserl6sliche Nichtproteinsubstanzen gebundenes Phosphat. Die Differenz yon Gesamt- phosphat und anorganischem Phospha t im Ultrafi l trat ergibt die an niedermolekulare Substanzen gebundene Pbosphatmenge.

1 SA~D~LL, E. B.: Colorimetric determinations of traces of metals S. 619. New York: Interscience Publ. Inc. 1950.

2 ALLE~, t~. J. L. : Biochem. J. 34, 858 (1940). L o ~ A ~ , K. : Biochem. Z. 194, 308 (1928).

Ober die Mineralstoffe des S/~ugetiermuskels. I I 99

g) Enteiweifiung. Bei allen Me~hoden zur Best immung des anorganischen Phosphats in biolo- gisehen Flfissigkeiten muB zunachst eine EnteiweiBung vorgenommen werden. Da man ungeaehtet der vielen Verfahren zur Phosphatbes t immung in der Li tera tur fiber eine kritisehe Bem%eilung der EnteiweiBungstechnik nur wenig finder, sahen wir uns genStigt, diese Frage ffir den speziellen Fall des Muskelextraktes n~her zu priifen. Wie dig Werte der Tab. 2 und 3 erkennen lassen, ist die Menge des anorganischen Phosphats im TCA-Fil trat abh~ngig yon Menge und Konzentra t ion an zugesetzter TCA. Sic n immt mit steigender TCA-Menge und -Konzentrat ion zu. DiGs beruht n icht darauf, dab dureh das gefifllte NH,Mg POe organisch gebundenes Phospha t mitgerissen wird (Tab. 4, I), sondern ist ausschlieBlich dureh die mit steigender TCA-Konzentrat ion zunehmende Abspal tung von Phospha t aus seiner Bindung an wasserlSsliche Muskelproteine bedingt (Tab. 4).

Tabelle 4. Ein/lu[3 der Trichloressigsiiurekonzentration au/ die Bindung yon Phosphat an Eiwei/3. EiweiBfi~llung: 1 ml TCA pro 1 ml w/~BrigemMuskelextrakt (1 : 1). Gesamt-P in 1 ml Muskel- ex t rak t : 875/~g. (A): P in der sauren L6sung der NH4MgPQ-Fiil lung. (]3): P naehVerasehen der

NH~MgPO~-F~llung mit H~SO4--H~02

Behandlung

I NHaMgPO4-Fi~llung im TCA-Fil trat (A) . . . . . . . . NH4MgPO4-F~Ilung im TCA-Fil trat (B) . . . . . . . .

I I Zentr i fugat der NH4MgPO4-F~llnng (nach Veraschen mit H2SO~--H202) . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

I I I TCA-FMlung (nach Veraschen mi t H2S04--H20~) . . . . IVI+IIZr III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

P je ml Extrakt bei einer Konzentration der TCA yon

a% 6% 12%

~g #g ~g I

433 437 473 433 437 470

258 258 258 175 171 137 866 866 868

Damit wurde also bei allen 3 Arbeitsnachweisen 99% des Gesamtphosphors erfagt. Gibt man mehr als 1 ml 12°/oige TCA zu 1 ml Muskelextrakt, so wird kein weiteres anorganisehes Phospha t mehr abgespal~en; alles ,,s&urelabile" Phospha t dfirfte damit freigesetzt sein. Dieser Versuch zeigt, dab es yon der Menge des angewendeten EiweiBfitllungsmittels abh/~ngt, wieviel anorganisches Phospha t man bes t immt und dab es wichtig ist, yon Fall zu Fall die Fiillungs- bedingungen kritisch zu prfifen. Der Zusatz yon 1 Volumenteil 12°/o iger TCA zu einem Volumen- teil Muskelextrakt (1 :1 ) reicht aus, um mit Sicherheit alles ,,s/~ure- labile" Phospha t abzuspalten. Dieses liegt dann ausschlieBlich in anorganischer Form vor (Tab. 4, II). Ein Freisetzen des F aus seiner Bindung an niedermolekulare Sub- s~anzen wird durch ErhShung der TCA-Konzentrat ion nicht bedingt.

Sonstige Bestimmungen In Geweben, Zentr ifugaten und

Fi l t ra ten wurden der pH-Wert (elektrometrisch) sowie die Gehalte an H~O, Asche und Sticks~off in der tiblichen Weise ermittelt . In den Flfissigkeiten wurde ferner der Reststickstoff nach EiweiBf/~llung mi t TCA (15 ml 15%ige TCA pro 5 ml Zentrifugat) best immt.

Tabelle 5. Beispiel /iir die Zusammensetzung wiiflriger Muskelextrakte. (Muskeh Wasser = 1 : 1)

Bestandteile

Wasser . . . . . . . . . . m g Asche . . . . . . . . . . m mg Protein-N . . . . . . . . m mg Nichtprotein-N . . . . . . m mg Anorganischer P . . . . . m mg Gebundener P . . . . . . m mg Magnesium . . . . . . . . m mg Calcium . . . . . . . . . m rag Zink . . . . . . . . . . . m mg Eisen . . . . . . . . . . m mg

Gehalt je 100 ml Extrakt bei einer Extrahierung bei

p~ 5,5 p~ 7,0

94,8 93,4 570 814 481 661 215 231

35,5 41,0 44,4 47,6 10,92 10,05

0,93 0,50 0,65 0,78 1,47 1,38

E r g e b n i s s e

W i e T a b . 5 ze ig t , w i r d die M i n e r a l z u s a m m e n s e t z u n g y o n w/ iBr igen Muske l - e x t r a k t e n (1 : 1) s t a r k v o m p ~ - W e r t bee in f luBt , be i w e l c h e m die E x t r a k t i o n vor -

100 R. I-IA~:

genommen wird. Bei h6herem pi~-Wert (7,0) werden trotz der grSBeren Menge an gel6stem Protein nieht mehr, sondern weniger Ca und Mg extrahiert als bei nied- rigerem p~-Wert (5,5). Man kann sehon aus diesen Werten erkennen, dab die Bindung

bestimmter Metalle an die Tabelle 6. Kationenaustausch im wiiflrigen Muskelextrakt

( Beispiel)

Bestandte i l

Magnesium . C a l c i u m . . . Zink . . . . Eisen . . . .

Austausch bezogen au f die Gesamtmenge an Ka t ion bei einer Ex t r ak t i on bei

p~ 5,5 [ 1o~ 7,0

a n d einer Dauer des Austausches yon

1 Std in %

98,5 83,0 36,4

15 Std in %

97,2 83,0 36,4

1 Std in %

8 ,2 o

15 St4 in %

87,5 0 0 0

struktnrellen Muskelproteine mit steigendem p~-Wert zu- nimmt.

Die starke Wirkung des pi~-Wertes auf die Kationen- bindung an die wasserl6sliehen Muskelproteine wird aus Tab.6 deutlich. Im Gegensatz zum Ansatz bei p~ 5,5 werden bei pH 7,0 Calcium und Magnesium so fest gebunden, dab sie nicht ausgetauseht werden. Wit wie- sen sehon fr/iher nach, dab solche Untersehiede nicht auf

einer p~-Abh&ngigkeit der Austanscherkapazit&t beruhen 1. Es ist interessant, dag im Gegensatz zu den Verh~ltnissen im Gewebehomogenat 1- verl/tngerte Austauscher- behandlung keine Zunahme des Kationenanstausches bewirkt.

Aus Tab. 7 ist zu ersehen, dag die Menge an austauschbarem Kation durch Ultrafiltration nicht wesentheh ver£ndert

Tabelle 7. Kationenaustausch im wiifirigen Muskelextrakt und im Ultra]iltrat des gleichen Extraktes. Dauer des Austausches 1 Std Ex-

~raktion und Austausch bei Io~ 7,0.

Bestandte i l

Magnesium.. Calcium . . . Zink . . . . Eisen . . . .

Austausch bezogen auf die Gesamtmenge an Kation in

]]xtrakt UltrafiItrat in in % %

84,0 84,3 0 0 7,5 7,3 0 0

wird. Daraus duff geschlossen werden, dab die Ultrafiltration als solche die Kationen- bindung nicht beeinflugt. Andererseits zeigt dieser Versueh, dab das im unfiltrier- ten Muskelextral~t ausgetauschte Kation nicht etwa im Sinne einer Gleiehgewichts- reaktion (Massenwirkungsgesetz) aus einer mehr oder weniger festen Bindung an Pro- tein freigesetzt wurde, sondern yon rome- herein in ultrafiltrierbarer Form, also nicht an EiweiB gebunden, vorliegt.

Tab. 8 zeigt, wie sich Magnesium, Cal- cium, Zink und Eisen prozentual auf die versehiedenen Bindungsarten im Muskel verteilen. Diese und die in den folgenden

Tabellen angegebenen Werte ergaben sich aus der Analyse des Dorsalmuskels dreier verschiedener Tiere. Zu diesen Werten ist der mittlere Fehler angegeben.

Tab. 9 gibt die molars Verteilung der Kationen auf dig einzelnen Bindungs- Fraktionen an, w&hrend Tab. 10 die Gehalte der strukturellen und wasserlSslichen Proteins an Mg, Ca, Zn und Fe enth/ilt.

Hinsichtlich der prozentualen Verteilung der Kationen und ihrer Bindungs- festigkeit l&Bt sich folgendes sagen. Die Bindung an dig strukturellen Proteine nimmt in der I~eihenfolge Mg < Ca < Zn < Fe zu. Nut ein geringer Bruchteil des Magne- siums und Calciums ist an die wasserl6slichen Proteins gebunden. Zink hingegen ist mit einem Viertel seiner Gesamtmenge an 16sliche Proteine geknfipft, Eisen infolge seiner Bindung an H/~mproteine zu einem noch gr6Beren Prozentsatz (etwa 2/a ). Von

t ItA~tM, 1~. : Zib. S. 95, Anm. 1.

tJber die Mineralstoffe des Si~ugetiermuskels. II 101

den wasserl6sliehen, niedermolekularen Substanzen werden Magnesium, Calcium, Zink und Eisen in unterschiedlicher Menge gebunden.

Dureh pg-ErhShung yon 5,5 auf 7,0 wird die Bindung des Magnesiums und Calciums an strukturelle wie an 16sliche Proteine betr/~ehtlich, diejenige des Zinks und des Eisens hingegen nur unwesentlich erh6ht. Fas t das gesamte Zink und Calcium

Tabelle 8. Die prozentuale Verteilung yon Magnesium, Calcium, Zink und Eisen au/ die versehiedenen Bindungsarten im Muskel

Bestandtei l

• g . . . . . C& . . . . .

Z n . . . . .

F e . . . . .

1V[g . . . . . C~ . . . . .

Z n . . . . . F e . . . . .

gebunden un strukturelle

Substanz

%

gebunden an gebunden an wasserl6sliche

wasserl6sliehe niedermoleku- Proteine lare Substanzen

% %

bei p~ 5,5: 11±1 6 0 ± 2 6 3 ± 1 28~=3

2 ~ 1 3 ~ i

~24 6 5 i 3

0 ± 0 4 ~ 1

<1 7~-2

bei p~ 7,0 : 3 1 ± 1 80:L 1 6 6 ~ 1 3 0 ~ 3

6 ± 1 7 :~2

284-2 604-3

4 ± 1 1 2 ± 2 4 ~ 2

1 0 ~ 2

ionisiert oder sehr locker gebunden

%

87=t=1 334- 1 1 3 + I 0~-0

594- 1 1 ± 1 2=c2 0 ± 0

befinden sich nun in undissoziiertem Zustand, aber auch die Dissoziation des Magne- siums ist bedeutend vermindert.

Die pH-Steigerung f/ihrt bei allen Kationen zu einer erh6hten Komplexbildung mit wasserlSslichen niedermolekularen Substanzen.

Tabelle 9. Die molare Verteilung von Magnesium, Calcium, Zink und Eisen au/ die verschiedenen Bindungsarten im Muskel

davon sind gcbunden an

100 g N:uskel wasserl6sliche [ ionisiert oder enthal ten strukturelle wasserl6sliche niedermoleku- I sehr locker

Substanz Proteine lare Substanzen [ gebunden

/~ mol ~ mol /~ mol ~ mol I /~ tool

bei p~ 5,5: 1000 Mg. 110 20 0 i 870 100 Ca. 60 3 4 33 50 Zn 32 ~12 <0,5 I 6 60 t o . . . 39 4 I._.________2___o

looo ~,~g. . . 100 C a . . . 50 Z n . . . 60 Fe . . .

bei p~ 7,0: 310 80 33 18

60 7

14 36

40 12 2 6

590 1 1 0

Berficksichtigt man die pro Gramm Protein gebundene Menge an Kat ion (Tab. 10), so ergibt sich ein etwas anderes Bild, als es die prozentnale Verteilung (Tab. 8 u. 9) zeigt. Dank seiner relativ hohen Konzentrat ion im Muskel ist das Magnesium trotz der grogen prozentualen Austauschbarkeit in gr6Berer molarer Menge pro Gewichts- einheit an strukturelles und 16sliches Protein gebunden als Calcium und Zink. Wie

102 R. HAMM:

sieh aus den W e r t e n von Tab. 10 ergibt , s ind bei be iden un te r sueh ten pH-Wer ten die 16slichen Pro te ine e rheb l i ch / i rmer an Magnes ium und Calcium als die s t rukture l len . Ff i r Zink hingegen is t kein s ignif ikanter Untersch ied in der Bindung an die beiden P ro t e ina r t en festzustel len, w/ihrend d e r Eisengehal t in den 15slichen Pro te inen natfir- lich (Myoglobin !) sehr viel h6her is t als in dem s t rukture l len MuskeleiweiB.

Tabelle 10. Gehalt der strukturellen und der wasserl6slichen Proteine des Muslcels an Magnesium, Calcium, Zinlc und Eisen

Art des Prote ins

s t r u k t u r e l l . . . wasserl6slich. .

s t r u k t u r e ] l . . . wasserl6slieh..

pH

5,5

Pro te in bez. a. gesamtes

Muskeleiweig in %

754-3 2 5 4 - 3

704-1 304- 1

~[g

# mol

6,7 4- 0,6 4,5 4- 1,5

24,4 4- 2,4 10,4 4- 2,4

1 g Pro te in enth~It gebunden an

Ca Zn # mol /~ mol

4,0 ± 1,0 2,0 4- 0,1 0,6 4- 0,1 2,1 ± 0,1

6,5 ± 0,7 1,9 4- 0,1 1,0 4- 0,4 2,4 4- 0,2

Fe # tool

1,0 4- 0 7,9 4- 3

1,1 ± 0 5,4 ± 0,2

Zusammenfassend lassen sich auf Grund unserer Versuehe folgende Reihen im Sinne s te igender Ka t i onenb indung aufstel len:

ProzentuMe Verteilung: Struktureiweig bei Struk~ureiweiB bei L6sliches Eiweig bei LSsliches Eiweig bei Niedermol. Subst. bei Niedermol. Subst. bei

# mol/Gramm Protein Sgruktureiweig bei Struktureiweifl bei L6sliches Eiweil~ bei

p~ 5,5 : Mg ~ Ca, Zn < Fe Io~ 7,0 : Mg ~ Zn < Ca < Fe p~ 5,5 : Mg < Ca ~ Zn ~ Fe loi~ 7,0 : Mg < Ca ~ Zn ~ Fe pH 5,5 : Mg < Zn < Ca < Fe p~7,0:Mg, Z n < t r e < C a

lax 5,5 : Ire < Zn < Ca < Mg p ~ 7 , 0 : F e < Z n < C a ~ N g p H S , 5 : C a < Z n < M g < F e

LSsliches EiweiB bei lax 7,0 : Ca < Zn < Fe < Mg.

Die prozentua le Ver te i lung des Phospha t s auf die verschiedenen Bindungsa r t en i s t aus Tab. 11 zu ersehen. E in Dr i t t e l des Gesamtphospha t s l iegt als anorganisches P h o s p h a t vor, w~hrend jcweils ein Viertel an die s t ruk ture l len Muskelprote ine und an

Tabelle 11. Prozentuale Verteilung dee Phosphats au] die verschiedenen Bindungsarten im Muskel

Art des Phospha t s

gebunden an strukturelle Substanz . . . . . . . . . . . . . . fest (s/~urestabil) gebunden an wasserl6sliche Proteine . . . . . . locker (s~urelabil) gebunden an wasserl6sliehe Proteine . . . . . gebunden an wasserl6sliche niedermolekulare Substanzen . . . . ionisiert (anorganisches Phosphat) . . . . . . . . . . . . . .

P h o s ~hat bei

pH 5,5 p~ 7,0 in in % %

25 ± 3 14 2

24 35

2 6 ± 3 14 2

25 33

wasserl6sliche n icdermolekulare Subs tanzen gebunden ist. E t w a cin Siebentel des Phospha t s is t , ,s~urestabi l" an die wasserl6slichen Muskelprote ine gcbunden und nur e twa 2 % liegen , ,s/iurelabil" gebunden im w/~grigen E x t r a k t vor. Eine Erh6hung des p~-Wer t e s yon 5,5 auf 7,0 h a t kcinc Ver/~nderung der Phospha tve r t e i lung zur Folge.

Be t r ach t e t m a n die yon der Gewichtseinhei t P ro te in gebundene molare Mengc an P, so ergibt sich ein andercs Bi ld der Vcr te i lung (Tab. 12). t t i e rnaeh wird yon dem

Uber die Mineralstoffe des Saugetiermuskels. II 103

wasserlSslichen Muskeleiweil3 etwa doppelt soviel Phosphat gebunden wie von den strukturellen Proteinen. Dieser Befund gilt fiir beide der untersuchten p~-Werte. Der Anteil des an die wasserlSsliehen Proteine ,s£urelabil" gebundenen Phosphats ist allerdings bei pR 7~0 etwas hSher als bei pR 5,5.

Tabelle 12. Phosphatgehalt der strukturellen und wasserl6slichen Proteine des Muskels

Art der B indung

gebunden an strukturelle Substanz . . . . . . . . . . . . . . fest (s/~urestabil) gebunden an wasserlSsliche Proteine . . . . . . locker (s/~urelabfl) gebunden an wasserlSsliche Proteinc . . . . .

je g Pro te in gebundenen Phosphor bei

p~ 5,5 p~ 7,0 in in tool p mol

97=~0 110=~5 180 165 17 32

Diskussion

Calcium und Magnesium. Ihre Beziehung zum rigor mortis. Die Frage der Bindung von Calcium und Magnesium an Proteine und ihre Beeinflussung durch den p~-Wert wurde bereits frfiher diskutiert 1. Die in den vorliegenden Versuchen auf Grund des Kationenaustausches im w/~Brigen Muskelextrakt erhaltenen Werte fiir die Menge an leicht austauschbarem Magnesium und Calcium im Muskel stimmen ffir beide pH- Werte (5,5 und 7) grSBenordnungsm/iBig mit den l%esultaten fiberein, die wir friiher bei Austauscherbehandlung des gesamten Gewebes erhielten 2. Dies bedeutet, dab die nach 1 Std Lewatit-Behandlung austauschbaren Erdalkalien des Gewebes mit Wasser extrahiert werden kSnnen. Die Tatsache, dab im w~Brigen Muskelextrakt nach 15 Std Austauscherbehandlung nicht mehr Kationen ausgetauscht werden als nach 1 Std l%eaktion, beweist, dab der frfiher gefundene, mit zunehmender Aus- tauschzeit ansteigende Austausch yon Kationen im Gewebe darauf beruht, dab hierbei Kationen aus ihrer Bindung an strulcturelle Muskelproteine freigesetzt werden. Wir folgerten dies bereits aus der Tatsache, dab der znnehmende Kationenaustausch zu einer ttydratationssteigerung der Muskelsubstanz fiihrt.

Auffallend ist der geringe Calciumgehalt der wasserlSslichen Proteinfraktion, die im wesentlichen Myoalbumin, Myogene, Muskelenzyme und Globulin X enth£1t. Auch der Magnesiumgehalt dieser Fraktion ist erheblich niedriger als in den struk- turellen Muskelproteinen (Tab. 10). MSglicherweise stehen diese Unterschiede im Mineralgehalt mit den vSllig verschiedenen physiologischen Funktionen der beiden Proteinfraktionen im Zusammenhang. Es w~re ferner denkbar, dab die ffir die Erd- alkalibindung erforderlichen sterischen Voraussetzungen in der Struktur der Faser- proteine giinstiger sind als in den 15slichen Proteinen.

Hinsichtlich des Gehaltes der strukturellen Proteine (Actin, Myosin, Acto- myosin, Tropomyosin, Bindegewebsproteine) an Magnesium und Calcium ist es interessant, unsere l%esultate mit denen von HASS]~LBACH 3 ZU verg]eichen. Dieser Autor fand, dab im totenstarren Muskel (p~ etwa 5,5) etwa 30% des Gesamt- Calciums strukturgebunden vorliegen. Das ist die H~lfte des yon uns gefundenen Betrages. Nun ist aber darauf hinzuweisen, dab der Gehalt an Gesamt-Calcium in

1 HAMM, 1%.: Zit. S. 95, Anm. 1; diese Z. 106, 281 (1957). - - t tA~ , 1%, u. 1%. G~Au: Diese Z. 108, 280 (1958).

2 HAM~, R. : Zit. S. 95, Anm. 1. a H~SSELBAC~, W. : Zit. S. 95, Anm. 2.

104 R. I~MM:

dem von HASS~,L]3ACI~ untersuchten Kaninchenmuskel mit 200/~mol/100 g Gewebe doppelt so hoeh ist wie der Calciumgehalt der yon uns verwendeten Rindermuskeln. Die bedeutenden jahreszeitlichen Schwankungen im Muskel-Calcium des I~indes haben wir bereits erSrtert 1. Es ist jedoeh bemerkenswert, dab die yon HASSELBACI~ ge- fundene Menge des an das strukturelle MuskeleiweiB gebundencn Calciums mit 5,7/~mol/g Protein yon der gleichen GrSBenordnung ist wie der yon uns gefundene Betrag. Die yon I:[ASSELBAC~I angegebenen Mengen an Gesamtmagnesium (950 ¢tmol pro 100 g Muskel), an prozentual gebundenem Magnesium (10%) and an #mol Mg pro g Strukturprotein (7,7) stehen ebenfalls in guter l~bereinstimmung mit unseren Resultaten. Dies erscheint uns nicht selbstverst/indlieh, da Tierart, Lagerungsdauer des Muskels und Extraktionsbedingungen bei beiden Arbeiten unterschiedlich waren.

Ein Vergleich unserer Untersuchung mit derjenigen HASSELBAClCIs ist auch im tlinbliek auf den Chemismus der rigor mortis reeht aufschluBreich. Wir vertraten bisher 2 die Anffassung, dab die hohe Wasserbindung, die der Muskel unmittelbar nach dem Schlachten besitzt, auf einer Wechselwirkung zwischen ATP und den Erd- alkalien des Muskels beruht. Wir nahlnen an, dab letztere teilweise durch ATP komplex gebunden sind und daher keine dehydratisierende Wirkung auf das Gewebe austiben k6nnen. Mit dem postmortalen Abbau des ATP werden die Erdalkalien aus ihrer Komplexbindung freigesetzt (AMP und IMP haben wesentlich niedrigere Assoziationskonstanten als ATP) und stehen nun ftir eine Bindung an das Muskel- eiweiB zur Verfiigung. Durch den festen Einbau der Erdalkalien in die Protein- struktur erfghrt das Gewebe jenen Zustand geringer IIydratat ion, der ffir den rigor mortis so typisch ist.

Diese Auffassung fanden wir dureh das Studium der postmortalen J~nderung der Proteinladung gestiitzt 3. Austauscherversuche schlieBlich ergaben, dab ein partieller Austausch des Calciums gegen Natr ium oder Kalium eine bedeutende ErhShnng der Muskelhydratation zur Folge hat 4. Da ein Entzug des gesamten austauschbaren Magnesiums ohne EinfluB auf die Muskelhydratation blieb, folgerten wir, dab das Muskelmagnesium ohne Bedeutung f/it die Muskelhydratation sei und dement- sprechend die postmortalen Vorgi~nge aussehlieBlich das Calcium und vielleicht aueh das Zink betr/ifen. Ebenso ffihrten wir die wasserbindungserhShende Wirkung von Polyphosphaten auf eine Eliminierung des Muskelcalciums zurfick.

Unsere Vorstellung yon der Rolle des Calciums wird jedoch durch die Versuche von HASSELBACK nicht best/~tigt. Dieser Autor fand, dab im frischen Muskel 10 ttmol/g strukturelles Protein gebunden sind. Nach Eintr i t t des rigor sind es nur noch 5/,mol. Diese Abnahme der Ca-Bindung ist nut teilweise auf die postmortalc pi~-Abnahme yon 7 auf 5,5 zurfickzufiihren. Wir stellten n~mlich in unseren Ver- suchen (Tab. ]0) lest, dab auch bei pI~ 7 im gelagerten Muskel eine Calciumbindung von nur 6,5 #mol/g Strukturprotein vorliegt. Es t r i t t also offensichtlich keine post- mortale Zunahme der Calciumbindung ein. Darfiber, dab das im gelagerten Muskel gebundene Calcium f/Jr dessen I-Iydratation yon Bedeutung ist, besteht indessen nach unseren fr/iheren Austauschversuchen kein Zweifel. Auch BOZLEI~ land, dab eine selektive, partielle Extrakt ion von strukturgebundenem Calcium die Hydrata t ion des Gewebes erh6ht 5. Entgegeu unserer Anschauung yon der Rolle des Calciums bei

1 HAMM, R. : Fleischwirtsch. 8, 266, 340 (1956). 2 HAMM, R. : Diese Z. 107, 1 (1958). Dtsch. Lebensmitt.-Rdsch. 54, 5 (1958); Biochem. Z. 328,

309 (1956); Fleischwirtsch. 10, 80 (1958). HAMM, R. : Diese Z. 109, 227 (1959).

4 HAMM, R. : Zit. S. 95, Anna. 1. 5 BozLEI~, E. : J. gen. Physiol. 38, 735 (1955).

Uber die Mineralstoffe des S~ugetiermuskels. II 105

Hydratationseffekt der Polyphosphate fand BOZLER 1, daB sieh Calcium mit Poly- phosphat nicht aus dem Muskel extrahieren l~Bt.

Wenden wir uns nun dem Vergleieh der ffir die Magnesiumbindung gefundenen Resultate zu. Nach HASS~LBAC~ 2 wird die Magnesiumbindung an das strukturelle MuskeleiweiB dutch den Eintritt des rigor mortis nieht ver~ndert. Das ist fiber- rasehend, da ja gleichzeitig der p~-Wert stark sinkt und naeh unserer vorliegenden Untersuchung der pR-Wert einen starken EinfluB auf die Magnesiumbindung hat. Vergleicht man die yon HASSELBACH ermittelte Mg-Bindung im frisehen Gewebe mit derjenigen eines gelagerten Muskels, dessen p~i-Wert auf den des frisehen Muskels (p~ 7) eingestellt wurde (Tab. 10), so ergibt sich ffir den Muskel bei rigor bzw. post rigor eine welt hShere Magnesiumbindung (fiber das Doppelte) als ffir den frisehen Muskel. Es liegt nahe, die erhShte Bindung auf einem Freiwerden des Magnesiums aus dem ATP-Komplex infolge ATP-Abbaues zur/iekzuffihren. Dies erseheint um so wahrscheinlicher als ein Teil des gebundenen Magnesiums selektiv durch Polyphosphat aus dem Muskel extrahiert werden kann 1. Eine solehe ioartielle Magnesiumextraktion erh6ht die Quellf/~higkeit des Gewebes 1. Polyphosphate seheinen ein st/trkeres MagnesiumbindungsvermSgen zu besitzen als der yon uns benutzte Kationen- austauseher. Dutch Behandlung mit Lewatit n/trnlich ]/~Bt sieh gebundenes Magne- sium aueh naeh langdauernder Einwirkung nicht oder nur sehr geringffigig dem homogenisierten Gewebe entziehen 3.

Es ist bekannt, dab ATP nieht nut mit Ca ++, sondern aueh mit Mg++-Ionen starke Komplexe bildet 4 und dab alas KomplexbildungsvermSgen mit Mg ++ bei enzymati- schen Phosphorylierungsreaktionen (Glykolyse) 5 und bei der Muskelkontraktion G eine t~olle spielt.

Wit fanden frfiher 8, dab unmittelbar naeh dem Tode des Tieres nur etwa 50 % des insgesamt im Rindermuskel anwesenden Magnesiums leieht austausehbar, also dissoziiert oder sehr locker gebunden sind. Bei Eintritt des rigor morris erhSht sieh dieser Wert auf 80--90%. Da nach HASS~L~AC~ 2 die Magnesiumbindung an das strukturelle EiweiB im frisehen Muskel trotz des hohen pK-Wertes nieht hSher ist als im rigor-Muskel, so muB ein Teil des Magnesiums in anderer Weise gebunden sein. Daffir kommt in erster Linie der Mg-ATP-Komplex in Frage. DaB ATP nur etwa 40 % des Gesamtmagnesiums zu binden vermag, ist verst/~ndlieh; die ATP-Konzentration im Gewebe (4--5 .10 -a tool) reicht nieht aus, uin alles Magnesium (9.10 -a #tool) zu binden.

Unsere Versuchsergebnisse und ihr Vergleieh rnit denen yon HASSELBACK k6nnen somit als eine Stfitze ffir die yon uns vertretene Theorie der postmortalen tIydrata- tionsabnahme und der Wirkung anorganiseher und organischer Polyphosphate auf die Wasserbindung und Quellung des Muskels angesehen werden. Unsere bisherigen Vorstellnngen mfissen jedoch insofern korrigiert werden, als offensiehtlich nieht die

1 BOZLEI~, E. : Zit. S. 104, Anm. 5. 2 HASSXLB_a_CH, W. : Zit. S. 95, Anm. 2.

HAng, 1~. : Zit. S. 95, Anm. 1. 4 ~ I ~ T E L L , A. E., u. G. SCHWXRZENBACH: tIelv, chim. Act~ 39, 653 (1956). - - SCRWA~ZE~'-

BACH, G., u. G. GANDEREGG: Helv. chim. Acta 40, 1129 (1957). - - WALAAS, E. : Acta chem. seand. ll, 1082 (1957).

5 GHE~S, K. : Biochim. biophys. Acta 8, 424 (1952). - - RAAFLAUB, J. : Helv. chim. Acta 14, 304 (1956).

G EIOH~oR~r, G. L., J. C. BA~LA~ U. D. H. B~sctr : The chemistry of the coordination compounds New York: Reinhold Publ. Corp 1956.

106 R. I-I)~MM :

Weehselwirkung zwischen Calcium und ATP, sondern zwisehen Magnesium und ATP (bzw. anorganischem Polyphosphat) der entscheidende Faktor ist 1. Wir sind zur Zeit mit weiteren Untersuchungen zur Kl~rung dieser Frage beschtiftigt.

Bei pI~ 7 sind 10--14% des gesamten Muskelealciums an wasserlSsliehe, nieder- molekulare Substanzen gebunden (Tab. 8). Mindestens 90% des ultrafiltrierbaren Calciums sind bei diesem p~-Wert nieht dissoziiert. Die Calcium-Bindung durch Adenosinmonophosphat und Glucosephosphate ist nur unbedeutend ~. Anorganisehes Phosphat vermag zwar im Gegensatz zu frfiheren Literaturangaben 15sliche, un- dissoziierte Komplexe zu bilden a, aber das Gleiehgewicht liegt weir auf der Seite des dissoziierten Anteils. So werden in einer Ca ++- und POt - - - - Ionen enthaltenden LSsung bei pI~ 7,5 mindestens 85 % des Calciums raseh ausgetauscht ~. MSglicherweise aber sind die Verhi~ltnisse im Muskelextrakt nicht mit denen in einfaehen Modellsystemen vergleichbar. Es ist z .B. bekannt, daft die LSslichkeit yon Calciumphosphat im Harn durch die ,,einsalzende" Wirkung yon Fremdionen (Na+, K +, Cl-, SOt - - ) wesentlich hSher ist als normal t. Schlieftlich w~re es denkbar, dait kolloides Calciumphosphat das Ultrafilter passiert hat 5. Die Frage, in welcher Bindungsform das Calcium im Ultrafiltrat vorliegt, ist jedenfalls noch ungekl~rt.

Die gleichen Erwiigungen gelten ffir die Bindung des Magnesiums an ultra- filtrierbare Substanzen. Der prozentuale Anteil dieser Fraktion ist zwar nur gering (Tab. 8), die bei PH 7 gebundene molare Menge hingegen wesentlich grSfter als die yon Calcium (Tab. 9).

Es sei betont, dab w i r e s ftir nicht zul£ssig halten, die ultrafiltrierbaren, rasch austausehbaren Erdalkalien (und Zink) ohne weiteres als frei dissoziiert zu betrachten. Wir bezeichneten sie daher ausdrficklich als ,,dissoziiert oder sehr locker gebunden". Wir wiesen bereits friiher 2 darauf hin, dab die Austausehertechnik nur bei An- wendung einer Gleichgewichtsmethode zur Bestimmung yon Ionenaktivithten geeignet ist und dab der Anwcndung einer solchen Methode auf Muskelextrakte vor- l~ufig noch Schwierigkeiten entgegenstehen.

Zinlc. Auf die Frage der Bindung yon Zink an Proteine gingen wir bereits a. a. O. ~ ein. In den vorliegenden Versuchen ist es auffallend, daI~ dcr Zinkgehalt der wasser- 15slichen Muskelproteine im Vergleieh zum Caleiumgehalt relativ hoch ist (Tab. 10). MSglicherweise ist dieses Zink vor allem in der Enzymfraktion enthalten, da be- st immte Enzyme bekanntlich Zink in sehr fester Bindung einsehlieften kSnnen% Strukturelle und 15sliche Muskelproteine enthalten etwa die gleiehe Zinkmenge pro Gewichtseinheit Eiweift gebunden. Bei pI~ 5,5 binder das strukturelle Muskeleiweift halb so viel Zinkmolekeln wie Caleiummolekeln und doppelt soviel wie Eisen. Es ist erstaunlich, daft die mSgliche physiologische Bedeutung des Muskelzinks bisher yon den Muskelphysiologen noeh nieht diskutier~ wurde, dies um so mehr, als fiber die Wirkung zugesetzter Zinkionen einige Untersuehungen vorliegen; so z. B. fiber den

1 Die yon uns festgestellte (HAM~, R. : Zit. S. 95, Anm. 1) enge Korrelation zwischen Calcium- bindungsvermOgen yon Anionen und ihrer Wirkung auf die Wasserbindung des Muskels bleibt auch so verst~ndlich, d~ fiir die Wirkung der Anionen ~uf die Caleiumdissoziation etwa die gleiehen relativen Unterschiede bestehen wie ffir ihre Wirkung auf die Magnesiumdissoziation.

2 HAMM, R. : Zit. S. 95, Anm. 1. HAMM. R. : Diese Z. 104, 245 (1956). - - BJm~lZUM, ~I. : Kgl. danske Vidensk. Selsk. mat.-fys.

!Yledd. 81, Nr. 7, 1 (1958). VERMEVL~, C. W., E. S. Lvo~ u. U. G. U. MILLEI~: J. Urol. 79, 596 (1958).

5 Die Ultrafiltrate waren vSllig klar. 6 WEITZ~L, G.: Angew. Chem. 68, 566 (1956).

Uber die Mineralstoffe des Si~ugetiermuskels. II 107

EinfluB yon Zn ++ auf die Aktivitgt der Myosin-ATP-ase 1 oder fiber den Effckt yon Zink bei der Muskelerschlaffung 2.

Im Gegensatz zu den Erdalkalien ist der mit der vorliegenden Untersuchungs- methodik gefundene Anteil an ionisiertem oder schr locker gebundenem Zink erheb- lich geringer als wir ihn bei der Austauscherbehandlung von Gewebehomogenat fanden 8. Bemerkenswert ist vor ahem, dag wir hier im Gegensatz zu den frfiheren I~esultaten nur einen verh/iltnism/~Big geringen EinfluB des pH-Wertes auf die Bin- dung yon Zink an 15sliche und strukturelle Proteine feststellten. Wir prtiften diesen Befund durch einen zus/itzlichen Versuch, bei dem wir zungchst den Muskel bei p~ 7 mit Wasser extrahierten. Ein Tell dieses Extrakts wurde bei dem gleichen pH-Wert (7,0) der Austauscherbehandiung unterworfen, ein weiterer Tell wurde mit tiC1 auf pE 5,5 eingestellt und dann mit Lewatit gerfihrt. Wie Tab. 13 zeigt, nimmt, wie zu erwarten, durch die pH-Senkung der Austausch des Calciums bedeutend zu; auch der des Magnesiums wird noch weiter erhSht. Der Austausch yon Zink hingegen bleibt unver/~ndert. Das ist insofern etwas fiberraschend, als in manchen der bisher unter- suchten Zink-Protein-Systeme die Zinkbindung stark pmabhi~ngig isO. So z. B. ist der Zn-Insulin-Komplex bei p~ 7 betr~chtlich stabiler als bei pH 5.

Tabelle 13. EinJlufl des p~-Wertes au/ die Bindung yon Magnesium, Calcium und Zinlc an die wasserlSslichen Mus]celproteine

Behandlung

Extraktion und Austausch bei p~ 7,0 . . . . . . . Gleicher Extrakt, Austausch bei p~ 5,5 . . . . . .

Aus~ausch bezogen auf die Gesamtmenge an Kation im Extrakt (1 Std Austausch) bei

3{g Ca

in in % %

85,2 0 92,8 63,7

Zn in %

4,0 4,2

Unsere l~esultate sprechen daffir, dab die Bindung des Zinks an die wasserlSs- lichen Muskelproteine sich yon der an die strukturellen Proteine unterscheidet. Die Assoziation mit den 15slichen Proteinen ist im p~-Bereieh 5--7 unabh/~ngig veto p~-Wert. Entsprechend unseren friiheren Versuchen mit Gewebehomogenaten scheint dagegen die Bindung an die strukturellen Proteine yore pi~-Wert abh~ngig zu sein. Bei loll 5,5 ist ein Teil der Ionen, der bei pH 7 nieht austausehbar ist, so sehwach vom StruktureiweiB gebunden, dab er gegen Na + raseh ausgetauseht wird. Die Bindung ist jedoch nieht locker genug, um eine Extraktion dieses Zink-Anteils mit Wasser zu erm6gliehen. Eine eingehendere Untersuchung der Zinkbindung im Muskel ist noeh im Gange.

Die an die wasserl6sliehen niedermolekularen Substanzen gebundene Zinkmenge ist abhgngig yore pH-Wert. Sowohl die prozentuale als aueh die absolute Menge des in dieser Weise gebundenen Zinks ist wesentlieh kleiner als die entsprechenden, ffir Calcium geltenden Werte (Tab. 8 u. 9).

Eisen. ~bereinstimmend mit unscren frfiheren Versuehen mit Gewebehomogenat crgibt aueh die vorliegende Arbeit, dab alles Eisen des Muskels in nicht ionisierter Form vorliegt. Von dem an die wasserlSslichen Muskelproteine gebundenen Eisen (etwa 60 % des Gesamteisens) dfirfte der gr6Bte Tell im Myoglobinmolekfil eingebaut

1 GILMOVR, G., u. M. GRIFFIT~S: Arch. Bioehem. 72, 302 (1957). 2 EDWArd, K. A. P. : Acta physiol, seand. Suppl. 42, No. 145, 36 (1957); 43, 275 (1958). 3 HAMM, R. : Zit. S. 95, Anm. 1. 4 HAT,Las-M6LLER, K., K. PET~SE~r U. I. SC~T,Ie~TK~i)LL: Ugeskr. Laeg. 52, 1761 (1951).

108 R. HAMM: Uber die Mineralstoffe des Sgugetiermuskels. I I

sein. Nach SC~API~A u. DnnYFus 1 allerdings enthglt der Rattenmuskel nur 20 % des Gesamtdsens als Hgmineisen. M6glicherweise ist dieser Anteil bei den verschiedenen Tierarten unterschiedlich.

Fast ein Drittel des Muskeleisens ist an die strukturellen Proteine gebunden. ~be r die Art dieser Bindung und die physiologische Fnnktion dieser Eisen-Fraktion scheint nichts bekannt zu sein. Ebensowenig lgl]t sich vorerst fiber die Art der Eisen- bindung in der wasscrl6slichen, ultrafiltrierbaren Fraktion sagen.

Die Bindung des Eisens sowohl an die strukturellen a]s auch an die wasserlSslichen Muskelproteine ist im Bereich pH 5--7 unabhgngig vom pg-Wert.

Phosphat. Die Molaritgt des Gesamtphosphors betrggt im frischen Muskel etwa 6 - - 7 . ]0 -2. Die yon uns gefundene Menge des an die strukturellen Mnskelproteine gebnndenen Phosphats (97 #mol/g Protein) s t immt mit der yon HASSELBACH 2 im Kaninchenmuskel gefundenen Phosphatbindung (100 #mol/g Struktnrprotein) gut fiberein. Nach HASS~LBAC~ sind hiervon nnr 15 % mit Perchlorsgure abspaltbar. Das restliche ,,sgurestabile" Phosphat ist nicht nur an EiweiB a, sondern auch an Lipoide 4 gebunden. Der yon wasserlSslichen Proteinen gebundene ,sgurelabile" Anteil des gebundenen Phosphats (9--16% des insgesamt gebundenen Phosphate) ist yon gleicher GrSl~enordnung wie bei dem Struktureiwei$. Das an niedermolekulare, wasserlSsliehe Substanzen gebundene Phosphat wird wohl vor allem in Form yon Inosinmonophosphat und Glucosephosphorsgureester vorliegen.

Zusammen/assung 1. I m 5 Tage gelagerten Rindermuskel wurde der Bindungszustand yon Magne-

sium, Calcium, Zink, Eisen und Phosphat bei p~ 5,5 und p~ 7,0 ermittelt. Es wurden die Bindung an strukturelles und wasserl6shches Muskeleiweil~, die Bindung an wasserlSsliche niedermolekulare Substanzen sowie der in dissoziiertem oder sehr locker gebundenem Zustand vorliegende Anteil bestimmt. Dabei wurden folgende Methoden angewendet: a) Behandlung yon w~$rigen Ext rak ten mit Kationen- austauscher, b) Ultrafiltration, c) erschSpfende wgSrige Extrakt ion des Muskcl- gewebes.

2. Die strukturellen Proteine enthalten pro Gewichtseinheit wesentlich mehr Erd- alkahen als die wasserlSslichen Proteine. Die Menge an gebundenem Zink ist bei beiden Proteinarten etwa die gleiche.

3. Ffir strukturelle wie ffir wasserlSsliche Proteine ist die Bindung yon Erd- alkalien bei pH 7 wesentlJch grSSer als bei pg 5,5.

4. Strukturelle und wasserlSsliche ~¢[uskelproteine unterscheiden sich in der pE-Abhgngigkeit dcr Zinkbindung.

5. I m p~-Bereich 5--7 enthglt der Muskel kein dissoziiertes Eisen. Fast ein Drittel des Gesamteisens ist an strukturelle Proteine gebunden.

6. Bei pH 7 sind sgmtliche der untersuchten Metalle zu einem kleinen Anteil an wasserlSshche, niedermoleknlare Substanzen gebunden. Dieser Anteil ist bei den versehiedenen Metallen unterschiedlich.

7. Die wasserlSslichen Muskelproteine enthalten pro Gewichtseinheit etwa doppelt soviel Phosphat gebunden wie die strukturellen Proteine. Die Verteilung des Phos-

1 SegAeinx, G., u. J. C. D~EYFus: J. Biol. 141 155 (1957).- Bull. Soc. Chim. biol. 82, 265 (1951).

2 ttASSELBAe~, W. : Zit. S. 95, Anm. 2. a BUCKTAL, F. , A. DEUTSCH, G. C~. KNAPPELS U. A. ~¢[UIVCH-PETEBSEN : Arch. Phys io l . scand .

24, 368 (1952). 4 LAaTttA, !NT. : Hung. Acta Physiol. 1, 341 (1948).

PART~A~ u. NEMITZ : Bedeutung des Wassers ffir Hitzeinaktivierung des Apyrasesystems 109

phats auf die verschiedenen Bindungsarten ist im pti-Bereich 5,5--7 unabhiingig vom p~-Wert.

8. Auf Grund einer Diskussion der vorliegenden und frfiheren l~esultate wird gefolgert, dab ffir die postmortale Abnahme der Mnskelhydratation die J~nderung der Magnesiumbindung von Bedeutung ist.

Bedeutung des Wassers fiir die Hitzeinaktivierung des Apyrasesystems der Muskulatur

Von

W. PARTMA~ und G. N~:MITZ

Mitteilung aus der Bundes/orschungsanstalt /iir Lebensmittel/rischhaltung, Karlsruhe

Mit 3 Textabbildungen

(Eingegangen am 16. Januar 1959)

An anderer Stelle hatten wir gezeigt, dab das Apyrasesystem der Karpfenmusku- latur mit normalem Wassergehalt gegen hShere Temperaturen wesentlich empfind- ]ieher ist als das gleiche System in gefriergetroekneter Karpfenmuskulatur mit einem Wassergehalt yon 3,4% 1. Es war deutlieh geworden, dab die gemessene Hitzeinakti- vierung im wesentlichen auf einer Denaturierungsreaktion beruht, die sieh vermutlieh am fibrill/~ren Muskelprotein Myosin abspielt. W~hrend diese Reaktion in Abh/~ngig- keit v o n d e r Einwirkungszeit der Temperatur bei der Muskulatur mit normalem Wassergehalt das Bild eines einheit]iehen, nach der ersten Ordnung verlaufenden Vorganges bietet, weist sie im gefriergetroekneten Material zwei Reaktionsabsehnitte auf. Die zuni~chst groBe geaktionsgesehwindigkeit geht bei geringem Wassergehalt innerhalb einer Minute in eine wesentlich langsamere fiber, l~eaktionskinetische Kriterien sprechen daffir, dab der erste Abschnitt die eigentliche Denaturierungsreak- tion darstellt, die plStzlieh zum Erliegen kommt oder zumindest stark verlangsamt wird.

In der vorliegenden Untersuehung wird geprfift, ob die plStzliche Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit dadurch bedingt ist, dab in dem gefriergetrockneten Material nicht mehr genfigend Wasser ffir den ungehinderten weiteren Ablauf der Reaktion zur Verffigung steht. Zur Entseheidung dieser Frage wird gefriergetroeknete Musku]atur auf versehiedene Wassergehalte eingestellt nnd die ttitzeinaktivierung des Apyrasesystems der verschiedenen Proben unter denselben Temperatur-Zeit- Bedingungen gemessen.

Wenn der Mangel an Wasser der limitierende Faktor ffir die Hitzeempfindliehkeit des Systems ist, ergeben sieh grunds~tzlieh zwei MSglichkeiten ffir ihreAbh/tngigkeit yore Wassergehalt :

1. Die Stabilit~t gegen Erhitzung kann kontinuierlich mit Abnahme des Wassergehaltes - - angefangen yore normalen Wassergehalt des Gewebes - - zunehmen.

2. die Zunahme der Stabilit~t erfolgt erst yon einem bestimmten niedrigeren Wassergehalt an. Die Entscheidung zugunsten einer dieser beiden M6gliehkeiten dfirfte interessante

Aussagen fiber die Rolle des Wassers bei Denaturierungsvorggngen gestatten und u. U. auch Gesiehtspunkte ffir die Diskussion fiber das sog. ,,gebundene Wasser" in biologisehen Systemen liefern.

1 NEMITZ, G., u. W. PARTMA~: Diese Z. 109, 121 (1959). Z. Lebensmitt.-Untersuch., :Band 110 8